( PDF ) Avaliação da utilização de nitrato por cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato(brs) em efluente contedo sulfato

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

AVALIAÇÃO DA UTILIZAÇÃO DE NITRATO POR

CULTURA MISTA ENRIQUECIDA COM BACTÉRIAS

REDUTORAS DE SULFATO (BRS) EM EFLUENTE

CONTENDO SULFATO

Uberlândia

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

AVALIAÇÃO DA UTILIZAÇÃO DE NITRATO POR

CULTURA MISTA ENRIQUECIDA COM BACTÉRIAS

REDUTORAS DE SULFATO (BRS) EM EFLUENTE

CONTENDO SULFATO

Sandra Mara Santana Rocha

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química da Universidade Federal de Uberlândia

como parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de Mestre em Engenharia Química, área

de concentração em Pesquisa e Desenvolvimento

de Processos Químicos.

Uberlândia - MG

2006

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FICHA CATALOGRÁFICA

Elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação

R672a

Rocha, Sandra Mara Santana, 1977-

Avaliação da utilização de nitrato em efluentes contendo sulfato e cul-

tura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS) / Sandra

Mara Santana Rocha. - Uberlândia, 2006.

159f. : il.

Orientador: Vicelma Luiz Cardoso.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Uberlândia, Progra-

ma de Pós-Graduação em Engenharia Química.

Inclui bibliografia.

1. Engenharia química - Teses. 2. Sulfetos - Teses. 2. Nitratos - Teses.I.

Cardoso, Vicelma Luiz. II. Universidade Federal de Uberlândia. Program

de Pós-Graduação em Engenharia Química. III. Título.

CDU: 66.0

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-

GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE

UBERLÂNDIA COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

MESTRE EM ENGENHARIA QUÍMICA,

EM 17/02/2006

BANCA EXAMINADORA:

________________________________

Profa. Dra. Vicelma Luiz Cardoso

Orientadora (PPG-EQ/UFU)

________________________________

Prof

. Dr

. Magali Christe Cammarota

Corientadora(Escola de Química/UFRJ)

________________________________

Prof

. Dr

. Miriam Maria de Resende

(PPG-EQ/UFU)

________________________________

Prof. Dr. Eloízio Júlio Ribeiro

(PPG-EQ/UFU)

Dedico este trabalho aos meus pais

Expedito e Wilma, e a todos o

ami

os que me deram apoio

incentivo nesta etapa tão important

da minha vida, especialmente a

Danylo e Demian, companheiros d

longa data.

AGRADECIMENTOS

 A Deus por sua bondade e misericórdia, por minha vida, pela oportunidade, pela

força e pela paz interior, sem as quais seria impossível dar seguimento a esta etapa tão

importante e tão gratificante;

 À Profª. Vicelma Luiz Cardoso pela orientação, pela total dedicação e confiança

durante toda minha trajetória na Engenharia Química, pelos ensinamentos e pela amizade;

 Á Profª. Eliana Flávia Camporese Sérvulo e Magali Christie Cammarota pela co-

orientação, colaboração e incentivo ao longo deste projeto;

 À CAPES pela oportunidade a mim concedida de fazer parte do programa de

pós-graduação e pelo apoio financeiro, sem o qual este projeto pessoal não poderia ser

realizado;

 À Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro pelo

fornecimento da cultura microbiana empregada neste trabalho. .

 Aos amigos e parceiros do Núcleo de Bioquímica, especialmente ao Cristian

Bolner, à Patrícia Vieira e Rafael Vieira.

 Aos alunos de iniciação científica, Hamiltom Passos e Ricardo, pela ajuda nos

experimentos e atividades do laboratório que muito contribuíram para o êxito deste trabalho;

 À amiga Cynara Reis Aguiar pela parceria, pelo apoio, pelas horas mais

divertidas, pelo incentivo nas horas mais difíceis.

 Aos amigos Aderjane, Aline, Danylo, Demian, Lucas, Poliana, Reimar e Vanessa

por serem pessoas especiais nesta etapa da minha vida, pela amizade e ajuda sempre que

precisei. À vocês agradeço parte do resultado deste trabalho e de vocês levarei e guardarei a

mais sincera amizade;

 Ao Cláudio Duarte pela elaboração do programa utilizado na otimização do

planejamento experimental e pelo esclarecimento das dúvidas;

 Ao Édio José pela ajuda e colaboração nos assuntos relacionados à informática e

tudo quanto precisei na minha longa jornada na Engenharia Química.

 Aos técnicos e funcionários da FEQUI pela ajuda indispensável;

 Aos professores João Jorge Damasceno, Luiz Cláudio Oliveira, Carla Hori,

Márcia Gonçalves, Lucienne Lobato, Marcos Barrozo pelo aprendizado obtido nas disciplinas

por eles ministradas;

 Ao professor Eloízio Júlio Ribeiro pelo incentivo, pelo carinho e atenção. Ao

professor Ubirajara Coutinho Filho pelas correções, críticas e sugestões ao meu trabalho e

pela ajuda sempre disponível. À profa. Miriam Maria de Resende e a pelas sugestões e

correções que muito contribuíram para finalização do trabalho;

 Aos amigos Roberta Dantas, Juliana Lira, José Carlos Freitas, Cíntia Siqueira,

pelos vários momentos de descontração, pela amizade, pelo companheirismo, sem os quais

seria difícil seguir esta caminhada;

 Aos meus pais Wilma Santana Rocha e Expedito da Silva Rocha pelo apoio

incondicional, pelo incentivo, pelo amor, que mesmo distantes sempre se fizeram presentes

durante todo este período. A eles agradeço a minha educação, a minha alegria, a minha vida.

A minha irmã Silmara, que onde quer que esteja sei que sempre me ajudou;

 A Alex Ander pelo seu apoio que mesmo de longe me incentivou e me ajudou a

vencer mais esta etapa da minha vida.

 A todos que colaboraram para o bom desenvolvimento deste trabalho.

SUMÁRIO

Índice de Figuras ................................................................................................................................ i

Índice de Tabelas................................................................................................................................ iv

Resumo ............................................................................................................................................. vi

Abstract ............................................................................................................................................. vii

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS......................................................................... 1

CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................ 5

2.1 – EFLUENTES RICOS EM SULFATO...................................................................................... 5

2.1.1 – Efluente Proveniente de Usina de Açúcar e Álcool ............................................... 5

2.1.2 – Efluente de Curtumes ............................................................................................. 6

2.1.3 – Efluente de Celulose e Papel ................................................................................... 8

2.1.4 – Água de Produção de Petróleo................................................................................. 8

2.1.4.1 – Características da Água de Produção .................................................... 10

2.2 – BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA........................................................................................ 12

2.3– BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO (BRS) ................................................................ 14

2.3.1 – Caracterização ......................................................................................................... 16

2.3.2 – Crescimento............................................................................................................. 18

2.3.3 – Cultivo ..................................................................................................................... 19

2.3.4 – Ciclo do Enxofre e Redução Desassimilativa do Sulfato........................................ 21

2.4 – SULFETO DE HIDROGÊNIO ............................................................................................... 26

2.4.1 – Identificação e Classificação ................................................................................... 27

2.4.2 – Propriedades Físico Químicas ................................................................................. 28

2.4.3 – Informações Toxicológicas ..................................................................................... 28

2.4.3.1 – Efeitos a uma única superexposição ou a uma exposição repetida ......... 29

2.4.4 – Problemas Relacionados à Presença do Sulfeto ...................................................... 30

2.4.4.1 – Biocorrosão............................................................................................... 31

2.5– TÉCNICAS PARA MINIMIZAR A PRODUÇÃO DE SULFETO ......................................... 34

2.6– BACTÉRIAS REDUTORAS DE NITRATO (BRN) ............................................................... 35

2.6.1 – Caracterização ......................................................................................................... 38

2.6.2 – Crescimento............................................................................................................. 39

2.6.3 – Cultivo ..................................................................................................................... 39

2.6.4 – Ciclo do Nitrogênio e Desnitrificação do nitrato..................................................... 39

CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................ 43

3..1 – CULTURA MICROBIANA .................................................................................................... 43

3.2 – MEIOS DE CULTIVO.............................................................................................................. 43

3.2.1 – Efluente Sintético .................................................................................................... 43

3.2..2 –Meio para o Cultivo de Bactérias Redutoras de Sulfato.......................................... 45

3.2.3 – Meio para o Cultivo de Bactérias Heterotróficas Anaeróbias ................................. 46

3..2.4 – Meio para o Cultivo de Bactérias Redutoras de Nitrato......................................... 47

3.3 – ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA AO CARBONO..................................... 48

3.4 – PREPARO DO INÓCULO ....................................................................................................... 49

3.5 – TESTES PRELIMINARES....................................................................................................... 50

3.5.1 – Teste de Sensibilidade da Cultura Microbiana ao Nitrato....................................... 50

3.5.2 – Concentração de Sulfato.......................................................................................... 50

3.5.3 – Concentração de Carbono........................................................................................ 50

3.6 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL.................................................................................... 51

3.6.1 – Avaliação da Produção de H

S................................................................................ 55

3.6.2 – Análise Estatística das Respostas ............................................................................ 56

3.7- INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE CARBONO NA GERAÇÃO DE H

S................ 59

3.8 – EFEITO DA ADIÇÃO INTERMITENTE DE NITRATO NA BIOGÊNESE DE H

S .......... 59

3.9 – CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE SULFETO EM PRESENÇA E AUSÊNCIA DE NITRATO 61

3.10 – METODOLOGIA ANALÍTICA ............................................................................................ 61

3.10.1 – Sulfeto Total .......................................................................................................... 62

3.10.2 – Sulfato.................................................................................................................... 62

3.10.3 – Nitrato.................................................................................................................... 63

3.10.4 – Nitrito .................................................................................................................... 63

3.10.5 –QUANTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA ........................................................... 64

3.10.5.1 – Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) ............................................. 64

3.10.5.2 – Bactérias Anaeróbias........................................................................ 64

3.10.5.3 – Bactérias Redutoras de Nitrato (BRN) ............................................. 64

CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 66

4.1 – ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA ................................................................ 66

4.2 – TESTE DE PRELIMINARES................................................................................................... 68

4.2.1 – Teste de Sensibilidade da Cultura Microbiana ao Nitrato..................... 68

4.2.2 – Efeito da concentração de Sulfato ......................................................... 69

4.3 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................................... 70

4.3.1 – Análise estatística das respostas .............................................................................. 70

4.3.1.1 – Produção de H

S................................................................................. 70

4.3.1.2 - Bactérias Redutoras de Sulfato ........................................................... 77

4.3.1.3 - Bactérias Heterotróficas Anaeróbias................................................... 83

4.3.1.4 – Consumo de Sulfato............................................................................ 89

4.3.1.5 – Consumo de Nitrato ........................................................................... 94

4.3.1.6 – Resumo dos Resultados do Planejamento .......................................... 98

4.4 – ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE CARBONO NA PRODUÇÃO DE

S .......................................................................................................... ................. 100

4.5 – EFEITO DA ADIÇÃO INTERMITENTE DE NITRATO NA BIOGÊNESE DE H

S........ 101

4.6 – CINÉTICA DE PRODUÇAO DE SULFETO COM OU SEM ADIÇÃO DE NITRATO.... 112

4.6.1 – Consumo de Nitrato................................................................................................. 113

4.6.2 – Crescimento Microbiano ......................................................................................... 114

4.6.3 – Produção de Sulfeto................................................................................................. 120

4.6.3.1 – Modelo proposto cinética da produção de sulfeto sem adição de

nitrato................................................................................................................. 122

4.6.3.2 – Modelo proposto para a cinética com adição nitrato.................... 126

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES........................................................................... 129

5.1 – CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 129

5.2 – SUGESTÕES PARA TRABALHOS POSTERIORES ............................................................... 130

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 131

APÊNDICE A ........................................................................................................................... 140

APÊNDICE B ........................................................................................................................... 157

APÊNDICE C ........................................................................................................................... 158

APÊNDICE D ........................................................................................................................... 159

APÊNDICE E....................................................................................................................................... 160

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1 – Representação esquemática da interação interespécies em bioreatores

anaeróbios............................................................................................................................ 14

Figura 2.2 – Interações das bactérias redutoras de sulfato .................................................. 15

Figura 2.3 – Bactérias redutoras de sulfato da espécie Desulfobacter postgatei................. 18

Figura 2.4 – Esquema representativo da redução desassimilativa do íon sulfato................ 20

Figura 2.5 – Ciclo do enxofre na natureza........................................................................... 22

Figura 2.6 – Ciclo Biológico do Enxofre ............................................................................ 23

Figura 2.7 - Possível rota para a redução desassimilativa do sulfato. ................................. 25

Figura 2.8 – Processo eletroquímico d corrosão ................................................................. 32

Figura 2.9 –Garciella nitratireductens, isolada de poços de petróleo no Golfo do México 38

Figura 2.10 – Ciclo do Nitrogênio na Natureza................................................................... 42

Figura 3.1 – Esquema do Planejamento Composto Central................................................ 52

Figura 3.2 – Translação da superfície de resposta da origem para o ponto estacionário. ... 58

Figura 3.3 – Distribuição das etapas com o tempo de operação.......................................... 60

Figura 4.1 – Superfície de resposta para a produção de sulfeto em função das

concentrações de nitrato e sulfato........................................................................................ 75

Figura 4.2 – Superfície de resposta para a produção de sulfeto em função das

concentrações de carbono e sulfato ..................................................................................... 75

Figura 4.3 – Superfície de resposta para a produção de sulfeto em função das

concentrações de carbono e nitrato...................................................................................... 76

Figura 4.4 - Superfície de resposta para número de BRS em função das concentrações

de nitrato e carbono ............................................................................................................. 80

Figura 4.5 - Superfície de resposta para número de BRS em função das concentrações

de sulfato e carbono............................................................................................................. 81

Figura 4.6 - Superfície de resposta para número de BRS em função das concentrações

de nitrato e sulfato ............................................................................................................... 81

Figura 4.7- Superfície de resposta para número de bactérias heterotróficas anaeróbias

em função das concentrações de sulfato e carbono ............................................................. 87

Figura 4.8- Superfície de resposta para número de bactérias heterotróficas anaeróbias

em função das concentrações de carbono e nitrato.............................................................. 87

Figura 4.9 - Superfície de resposta para número de bactérias heterotróficas anaeróbias

em função das concentrações de sulfato e nitrato................................................................ 88

Figura 4.10 - Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das

concentrações de carbono e sulfato ..................................................................................... 91

Figura 4.11 - Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das

concentrações de nitrato e sulfato........................................................................................ 92

Figura 4.12 - Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das

concentrações de nitrato e carbono...................................................................................... 92

Figura 4.13 - Superfície de resposta para o consumo de nitrato em função das

concentrações de sulfato e carbono ..................................................................................... 96

Figura 4.14 – Superfície de resposta para o consumo de nitrato em função das

concentrações de nitrato e sulfato........................................................................................ 97

Figura 4.15 – Superfície de resposta para o consumo de nitrato em função das

concentrações de carbono e nitrato...................................................................................... 97

Figura 4.16 – Variação da concentração de nitrato durante a primeira etapa experimental 103

Figura 4.17 – Numero de bactérias heterotróficas anaeróbias com o tempo de operação .. 105

Figura 4.18 – Concentração do consumo de nitrato em função do tempo de operação

após adição de 1000mg/L.................................................................................................... 106

Figura 4.19 – Concentração e consumo de nitrato em função do tempo de operação na

terceira etapa........................................................................................................................ 108

Figura 4.20 Concentração e consumo de nitrato em função do tempo de operação após

adição de nutrientes e nitrato............................................................................................... 109

Figura 4.21 – Evolução da concentração de nitrato durante as quatro etapas..................... 110

Figura 4.22 – Variação da concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias para as

quatro etapas........................................................................................................................ 111

Figura 4.23 – Perfil do consumo de nitrato ......................................................................... 114

Figura 4.24 – Cinética do crescimento do consórcio microbiano em efluente sintético na

ausência de nitrato ............................................................................................................... 116

Figura 4.25 – Concentração de BRN,BRS e

BHA com o tempo de operação na cinética

com adição de nitrato........................................................................................................... 117

Figura 4.26 – Produção de sulfeto e consumo de sulfato para os cultivos do consórcio

microbiano realizado com e sem adição de nitrato.............................................................. 121

Figura 4.27 – Evolução da concentração de BRS, consumo de sulfato e produção de H

S 125

iii

Figura 4.28 – Evolução do comportamento do consumo de nitrato e crescimento de

BRN .................................................................................................................................... 127

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 2.1 – Concentração de alguns constituintes de amostras de vinhaça proveniente

da Usina São Martinho, Guariba, SP (2003) ....................................................................... 6

Tabela 2.2 – Dados típicos de parâmetros medidos em efluentes brutos de curtumes com

processos convencionais completos e distribuição por etapas básicas ou macro-etapas

do processo (matéria prima: peles bovinas salgadas; dados em kg/t pele).......................... 7

Tabela 2.2 – Geração de efluentes líquidos no processamento de couro ............................ 9

Tabela 2.3 – Dados Termodinâmicos de algumas reações bioquímicas realizadas por

BRS...................................................................................................................................... 19

Tabela 3.1 – Composição química do efluente sintético..................................................... 44

Tabela 3.2 – Composição química do meio Postgate E ...................................................... 45

Tabela 3.3: - Composição química do meio fluido ao Tioglicolato.................................... 46

Tabela 3.4: - Composição química do Meio para BRN ...................................................... 47

Tabela 3.5: - Composição química da solução de elementos traço..................................... 48

Tabela 3.6: - Composição química da solução salina redutora ........................................... 49

Tabela 3.7: Variáveis do processo....................................................................................... 54

Tabela 3.8– Matriz do planejamento................................................................................... 55

Tabela 4.1 – Aclimatação da cultura microbiana a diferentes concentrações de carbono .. 67

Tabela 4.2 – Teste de sensibilidade da cultura microbiana ao nitrato................................. 69

Tabela 4.3 – Efeito d concentração de sulfato no crescimento das BRS............................. 69

Tabela 4.4 – Resultados da produção de sulfeto, em diferentes condições experimentais . 71

Tabela 4.5 – Resultados da regressão múltipla para produção de sulfeto........................... 72

Tabela 4.6 – Concentração das BRS para cada condição experimental.............................. 77

Tabela 4.7 – Resultados da regressão múltipla para a quantificação de BRS..................... 79

Tabela 4.8 – Concentração de BHA em diferentes condições experimentais..................... 83

Tabela 4.9 – Resultados da regressão múltipla da quantificação de BHA.......................... 85

Tabela 4.10 – Consumo de sulfato nas condições experimentais estudadas....................... 89

Tabela 4.11 - Resultados da regressão múltipla para a concentração de sulfato

consumido............................................................................................................................ 90

Tabela 4.12 – Resultados do consumo de nitrato, nas condições de cada experimento...... 94

Tabela 4.13 – Resultados da regressão múltipla para o consumo de nitrato....................... 95

Tabela 4.14 – Resumo dos pontos de maximização e minimização das respostas ............. 99

Tabela 4.15 – Valores finais dos testes realizados em distintas concentrações de carbono 100

Tabela 4.16 – Resultados obtidos na primeira etapa após cinco adições de 500 mg/L de

nitrato a cada 2 dias ............................................................................................................. 101

Tabela 4.17 – Resultados obtidos na segunda etapa, com adição de 1000mg/L de

carbono ................................................................................................................................ 104

Tabela 4.18 – Resultados experimentais após adição de nutrientes.................................... 106

Tabela 4.19 – Resultados experimentais da quarta etapa.................................................... 109

Tabela 4.20 – Taxa de consumo de nitrato em função do tempo em cada etapa do

experimento ......................................................................................................................... 112

Tabela 4.21 – Resultados obtidos nas análises de monitoramento do consumo de nitrato

durante a cinética com adição de nitrato ............................................................................. 113

Tabela 4.22 - Concentração dos microrganismos presentes no consórcio microbiano

durante a cinética de produção de sulfeto em presença e ausência de nitrato..................... 119

Tabela 4.23 – Monitoramento de sulfato e de sulfeto durante os estudos cinéticos com e

sem adição de nitrato........................................................................................................... 120

Tabela 4.24 - Parâmetros do modelo para a cinética de formação de BRS decomposição

de sulfato e produção de H

S............................................................................................... 124

Tabela 4.25 – Parâmetros do modelo para a cinética de formação de BRN e consumo de

nitrato................................................................................................................................... 127

RESUMO

Este trabalho avaliou a redução da produção de sulfeto em um efluente sintético rico em

sulfato. Foi empregada uma cultura mista, isolada da água de produção de petróleo de

Carmópolis - SE, enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS). Inicialmente, a

cultura microbiana foi aclimatada a concentrações crescentes de Carbono (0,1 - 5 g/L),

podendo-se observar crescimento em todas as concentrações testadas. Foi realizado um

planejamento composto central (PCC) para estudar a influência das concentrações de sulfato,

carbono e nitrato na redução da produção de sulfeto em condição de anaerobiose. Foram

avaliadas como respostas a produção de sulfeto; o crescimento de bactérias anaeróbias e

bactérias redutoras de sulfato; o consumo de sulfato e nitrato. Com a otimização do processo

de produção de sulfeto, empregando-se a técnica de superfície de resposta, obteve-se os

pontos de minimização da produção de sulfeto. Os resultados da otimização para a

minimização da produção de sulfeto mostraram que a razão SO

: C: NO

de 3,6: 1: 5,1,

levam a uma mínima produção de sulfeto (8,2 mg/L). Foi estudada a influência da

concentração de carbono na produção de sulfeto, para as condições de otimização de sulfato e

nitrato, comprovando-se através deste estudo que a concentração de carbono não oferece

grande influência na produção do sulfeto. Também foi feito um estudo do comportamento da

cultura microbiana perante a entrada intermitente de nitrato em tempos pré-estabelecidos,

onde se notou que a taxa de consumo de nitrato só foi significativa quando havia um número

maior de bactérias anaeróbias, uma maior concentração de nitrato e quando se adicionou

nutrientes e fontes de carbono. Este fato deve ter ocorrido devido a presença de Bactérias

Redutoras de Nitrato (BRN) na cultura microbiana. Os dados da condição de otimização

foram então avaliados em duas cinéticas de produção de sulfetouma na presença de nitrato e

outra na ausência do mesmo.

Palavras-chave: nitrato, produção de sulfeto, bactérias redutoras de nitrato e bactérias

redutoras de sulfato.

vii

ABSTRACT

This work analyzed the decrease of sulfite production in a sulfate rich synthetic effluent. A

mixed culture was used, isolated from the water used in petroleum production in Carmópolis,

Sergipe State, Brazil, enriched with sulfate reducing bacteria (SRB). Initially, the microbial

culture was acclimated to rising concentrations of Carbon, (0.1 - 5.0 g/L), and growth could

be observed in all tested concentrations. A Central Composite Design was used to study the

influence of the concentrations of sulfate, carbon and nitrate on the decrease of sulfite

production in anaerobic condition. The response parameters evaluated were the sulfite

production, the growth of anaerobic and sulfate reducing bacteria and the consumption of

sulfate and nitrate. The minimization points for the sulfite production were obtained with the

process optimization using the response surface methodology. The results from the

optimization for minimization of sulfite production showed that the point of SO

: C: NO

de 3,6: 1: 5,1, lead to a minimum sulfite production (8.2 mg/L). The influence of carbon

concentration on the sulfite production was studied for the optimized conditions of sulfate and

nitrate, proving through this study that the concentration of carbon does not have substantial

influence on the production of sulfite. Another study was carried out about the behavior of the

microbial culture with intermittent addition of nitrate at pre-established intervals, and it could

be observed that the rate of nitrate consumption was only significant when there was a larger

number of anaerobic bacteria, a larger concentration of nitrate and when nutrients and carbon

source had been added to the medium. This must have happened due to the number of Nitrate

Reducing Bacteria (NRB) present in the microbial culture. The data from the optimized

conditions were then evaluated in two kinetics of sulfite production, one in the presence and

the other in the absence of nitrate.

Key words: nitrate, sulfite production, nitrate reducing bacteria, sulfate reducing bacteria.

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

O tratamento anaeróbio de efluentes contendo altas concentrações de sulfato

apresenta problemas relacionados principalmente à geração de sulfeto. O sulfeto é a forma de

enxofre energeticamente mais estável e, sob condições anaeróbias, é altamente reativo,

corrosivo e tóxico (COLLERAN et al., 1994). Por conseguinte, o tratamento anaeróbio pode

ocasionar diversos problemas físico-químicos (corrosão, odores, aumento na concentração da

Demanda Química de Oxigênio (DQO) no efluente) e/ou biológicos (toxicidade, inibição),

devido à produção de sulfeto de hidrogênio.

Efluentes deste tipo são gerados em vários processos industriais, como por exemplo,

na exploração e produção de petróleo, e naqueles que fazem uso de ácido sulfúrico ou de

matérias-primas ricas em sulfato (indústrias de fermentação e pesqueira), ou ainda naqueles

que empregam compostos reduzidos de enxofre, tais como sulfeto (curtume, polpeamento

Kraft), sulfito (indústria de papel sulfite) e tiossulfato (branqueamento de papel) (LENS et

al.,1995). Segundo Lima et al. (2000), quanto maior a disponibilidade de matéria orgânica

para metabolização microbiana, maior a produção de sulfeto para um mesmo tempo de

retenção hidráulica.

Este é um dos problemas cruciais dos sistemas offshore de exploração de petróleo,

que empregam a injeção de água do mar no interior dos reservatórios, com a finalidade de

estimular a saída do petróleo, técnica denominada de recuperação secundária de petróleo. A

produção primária do petróleo recupera menos de 30% do óleo presente no interior de um

reservatório. Contudo, o uso da água do mar, que contém quantidades apreciáveis de sulfato,

em torno de 3 g/L, propicia a geração de altos teores de sulfeto por ação microbiana, o que

favorece sobremodo a corrosão dos materiais metálicos (THOMAS, 2004)

Os microrganismos podem participar ativamente no processo de corrosão, causando

a dissolução do metal quer direta ou indiretamente, através do seu metabolismo. Quando a

corrosão do material metálico se processa sob a influência de microrganismos, ela é

denominada de corrosão microbiologicamente induzida (CMI) (KERESZTES, FELHOSI &

KÁLMÁN, 2001).

Atualmente, os processos de biocorrosão são reconhecidos como a maior fonte de

problemas e falhas estruturais que afetam uma grande variedade de indústrias, como a

petrolífera,

a celulósica e de pasta de papel, a de geração elétrica (por via térmica, hidroelétrica ou

nuclear), a alimentar, entre outras (VIDELLA, 2003).

Os custos derivados de problemas com corrosão metálica, de acordo com avaliação

realizada nos Estados Unidos da América pela U.S. Federal Highway Administration

(FHWA), representam aproximadamente 4,2% do PIB, o que corresponde a cerca de US$ 276

bilhões anuais (U.S. FEDERAL HIGHWAY ADMINISTRATION, 2002). Estima-se que

aproximadamente 20% do total da corrosão sejam decorrentes da CMI (FLEMMING, 1996).

No Brasil, segundo avaliação realizada pela Associação Brasileira de Corrosão, os custos

relacionados à corrosão são de aproximadamente US$ 15 bilhões por ano, representando 3%

do PIB (www.abraco.org.br).

A indústria do petróleo se destaca como uma das que mais são afetadas pelos

fenômenos corrosivos, em virtude da vultuosa quantidade de material metálico utilizado,

muitas vezes recobrindo grandes extensões de difícil acesso. A corrosão de estruturas

metálicas, incluindo plataformas offshore, oleodutos e gasodutos, tem sido fonte de

preocupação e, por conseguinte, foco de inúmeros estudos com a finalidade de prevenir

possíveis rupturas das tubulações. Os vazamentos e/ou derrames de fluidos, além do problema

econômico intrínseco, pode ser a causa de impactos ambientais catastróficos, em decorrência

da contaminação do solo e/ou água em grandes proporções.

Dentre os vários microrganismos reconhecidamente envolvidos em casos de CMI, as

bactérias redutoras de sulfato (BRS) são consideradas os principais microrganismos

anaeróbios envolvidos (JAVAHERDASHTI, 1999). As BRS são bactérias heterotróficas que

normalmente utilizam uma fonte de carbono orgânica e obtêm energia a partir da redução do

íon sulfato. Como resultado dessa redução, ocorre a produção de sulfetos, bissulfetos e gás

sulfídrico (H

S), potenciais agentes da corrosão anaeróbia do ferro (GONZÁLEZ et al.,

1998). O crescimento das BRS, principalmente por ocorrer invariavelmente associado à

produção de H

S, pode causar conseqüências adversas tanto nos processos industriais como

no ambiente. Na indústria petrolífera, a geração de gás sulfídrico é denominada de

acidificação biogênica ou souring biogênico. O gás sulfídrico, devido a sua alta toxicidade e

corrosividade, causa problemas tanto para a saúde dos seres vivos quanto de ordem

operacional, como a corrosão de tubulações, o plugueamento de poços, podendo inclusive

concorrer para o aumento do conteúdo de H

S no óleo e gás produzidos, o que representa uma

redução drástica dos seus valores econômicos.

Uma alternativa que vem sendo cada vez mais explorada no controle da atividade de

BRS e, conseqüentemente, da geração de H

S biogênico, de modo a prevenir a corrosão

microbiologicamente induzida, tem sido a aplicação de nitrato (NEMATI et al., 2001). O uso

de nitrato, em substituição aos biocidas normalmente empregados, representa não só ganhos

econômicos, mas a redução das agressões ao ambiente.

A tecnologia da exclusão biocompetitiva pela utilização do nitrato permite estimular

seletivamente a microbiota presente em sistemas de injeção de água do mar e reservatórios de

petróleo (HITZMAN et al., 1998). Neste caso, há o favorecimento da atividade das bactérias

redutoras de nitrato (BRN), o que em conseqüência reduz o metabolismo das BRS e, por

conseguinte, implica em decréscimo do souring biogênico (MAXWELL et al., 2003).

Segundo esses autores, a presença de nitrato estimula a atividade das BRN, por ser seu

metabolismo energeticamente mais favorável do que o consumo de sulfato pelas BRS. Por sua

vez, a atividade mais intensa das BRN resulta na redução do suprimento de ácidos orgânicos,

impedindo o desenvolvimento das BRS. Pode ainda ocorrer a atividade concomitante de

espécies de BRN que apresentam a capacidade simultânea de oxidação de sulfeto (BRN-OS),

ocasionando a remoção de sulfeto e a elevação do potencial redox do sistema, o que resulta no

estabelecimento de condição imprópria para o crescimento das BRS (JENNEMAN E

GERVETZ, 1999).

Neste contexto, o objetivo geral deste estudo foi avaliar o potencial de aplicação de

nitrato para redução da geração de H

S em sistemas anaeróbios constituídos de cultura mista

enriquecida com Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS).

Os objetivos específicos foram:

•Aclimatar uma cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS) através de

cultivos sucessivos em meio sintético (meio Postgate E) com concentrações crescentes de

carbono (ácidos orgânicos de cadeia curta), variando de 0,1 a 5 g/L;

•Selecionar as melhores condições operacionais através do planejamento composto central

(PCC), avaliando a influência das concentrações de carbono, de sulfato e de nitrato sobre a

redução da geração de sulfeto e o consumo de nitrato;

•Avaliar a geração de H

S, o consumo de nitrato e sulfato e a formação de nitrito em sistemas

com adição intermitente de nitrato;

•Avaliar a cinética de biogênese de sulfeto, consumo de nitrato e crescimento de bactérias

redutoras de sulfato (BRS), bactérias redutoras de nitrato (BRN) e bactérias heterotróficas

anaeróbias (BHA) nas condições de otimização, com e sem adição de nitrato.

2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 EFLUENTES RICOS EM SULFATO

Efluentes industriais ricos em sulfato são gerados em vários processos como, por

exemplo, naqueles que fazem uso de ácido sulfúrico ou de matérias-primas ricas em sulfato

(fermentação), ou ainda de compostos reduzidos de enxofre, tais como sulfeto (curtume,

polpeamento Kraft), sulfito (indústria de papel sulfite), e tiossulfato (branqueamento de papel)

(LENS et al., 1995), e na indústria de petróleo, na fase de extração e produção.

2.1.1 - EFLUENTE PROVENIENTE DE USINA DE AÇÚCAR E ÁLCOOL

Os resíduos líquidos resultantes da fabricação do açúcar e álcool são: água de

lavagem da cana-de-açúcar, água condensada dos evaporadores, água das colunas

barométricas, restilo, água de lavagem dos pisos e equipamentos, água de refrigeração e água

de descarga de caldeiras.

As destilarias de álcool ou aguardente produzem, como principal resíduo, a vinhaça.

Este material, que recebe diversas denominações regionais (restilo, vinhoto, caldas, vinhote,

tiborna, coxixi ou garapão), tem sido há longo tempo uma constante preocupação dos órgãos

responsáveis pelo controle da poluição (BRAILE & CAVALCANTI, 1993).

A composição da vinhaça depende de vários fatores, sendo os mais importantes a

natureza e composição da matéria-prima e a operação do aparelho térmico de destilação. O

estudo sobre a composição da vinhaça iniciou-se com a fermentação de mel final com

Almeida em 1952 (apud BRAILE & CAVALCANTI, 1993). Ficando evidente tratar-se de um

material líquido orgânico, constituído em média por 93% de água, com 75% dos constituintes

sólidos sendo de origem orgânica.

Novos dados a respeito da composição de vinhaças foram apresentados em 1973 por

Glória e seus colaboradores (apud BRAILE & CAVALCANTI, 1993). Apesar das vinhaças

derivadas de mosto de melaço, mosto misto e mosto de caldo diferir bastante na concentração

de enxofre expresso na forma de sulfato (Tabela 2.1), esta concentração média se encontra

próxima a 4,43 kg/m

(Centro de Ciências Agrárias- UFSCAR, 2005)

Tabela 2.1 - Concentração de alguns constituintes de amostras de vinhaça proveniente da

Usina São Martinho, Guariba, SP (2003).

Fonte:

Centro de Ciências Agrárias- UFSCAR, 2005

2.1.2 - EFLUENTE DE CURTUMES

O Brasil é o segundo maior produtor mundial de couros, com uma produção anual de

32,5 milhões de peles. Os Estados Unidos detêm a medalha de ouro neste quesito, mantendo

há 5 anos a marca de 36 milhões de couros/ano. No Brasil, a produção vem aumentando

significativamente, contabilizando em 2002, 16 milhões de unidades de couro exportadas,

correspondentes ao montante de US$ 1,04 bilhões, conforme o Ministério do

Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior

(

http://www.francal.com.br/codigo/p_noticias-conteudo.asp?noticia_ID=1221,12/12/2005).

O processo de transformação de peles em couros é normalmente dividido em três

etapas principais, conhecidas por ribeira, curtimento e acabamento. O acabamento, por sua

vez, é usualmente dividido em “acabamento molhado”, “pré-acabamento” e “acabamento

final”.

As águas das operações de ribeira são fortemente alcalinas e esbranquiçadas (cal em

excesso) e contêm sebo, pêlos, tecido muscular, gordura e sangue, em suspensão. Em solução,

sais (principais ânions - sulfeto, sulfato, cloreto; principais cátions - sódio, cálcio, amônio),

proteínas e aminoácidos diversos; em menor quantidade, tensoativos (detergentes), aminas e

eventualmente alguns conservantes ou biocidas e inseticidas (produtos orgânicos).

Os efluentes líquidos provenientes das operações de píquel e curtimento contêm

principalmente sal (cloreto de sódio), ácidos minerais (sulfúrico, clorídrico), orgânicos

(láctico e fórmico), cromo e/ou taninos (orgânicos polifenólicos), proteínas e, eventualmente,

alguns fungicidas (orgânicos aromáticos) em pequenas quantidades. São águas turvas, de cor

Análise Química

M.O N P K Ca Mg S Cu Fe Mn Zn pH

( % ) (Kg/m

) (g/m

)

4,2 1,57 0,38 0,045 2,17 0,6 0,50 1,87 1,0 51 3,9 2,0

verde escuro (curtimento ao cromo) ou castanhos (curtimento por taninos), que apresentam

pH ácido, podendo ter altas concentrações de DQO e DBO, conforme o curtente utilizado.

As principais águas residuais das operações de acabamento molhado ou pós-

curtimento e de acabamento, normalmente apresentam alto teor de cromo (do enxugamento e,

por vezes, do recurtimento); sais diversos (da neutralização); cores diversas, devido aos

corantes utilizados (do tingimento), muitos à base de anilina ou azo-corantes, e temperatura

mais elevada. Outras operações destes três grupos de etapas não apresentam efluentes líquidos

ou estes são pouco significativos.

A Tabela 2.2 apresenta alguns valores médios ou faixas de valores para parâmetros

medidos nos efluentes brutos de curtumes.

Tabela 2.2 - Dados típicos de parâmetros medidos em efluentes brutos de curtumes com

processos convencionais completos e distribuição por etapas básicas ou macro-etapas do

processo (matéria-prima: peles bovinas salgadas; dados em kg/t pele)

Etapa Básica

Do Processo

Uso de

Água(m

/t)

Cromo

(Cr

)

Sulfeto

N Total

Cloreto

Sulfato

Óleos e

Graxas

Ribeira

7-25 2-9 9-14 120-150 5-20 5-8

Curtimento

1-3 2-5 0-1 20-60 30-50 1-2

Pós-curtimento

4-8 1-2 1-2 5-10 10-40 3-8

Acabamento

0-1 0-10 0-4 0-5 ---- --- ---

Total 12-37 3-7 2-9 10-17 145-220 45-110 9-18

fonte: grupo IUE 6, IULTCS, 2002

As cargas poluentes emitidas são significativas, sendo a fase de ribeira até a etapa

anterior ao curtimento, as responsáveis pela maior parte das cargas poluentes e tóxicas dos

efluentes de curtumes (Tabelas 2.2). Adicionalmente, o sulfeto, presente nos efluentes da

ribeira, é mais tóxico para o ser humano do que o cromo do curtimento, considerando que este

último está na sua forma trivalente.

Além da carga poluidora inerente, caso certos cuidados operacionais não sejam

tomados, os efluentes líquidos dos curtumes que realizam a ribeira podem apresentar

problemas de odor devido à formação de gás sulfídrico, proveniente do sulfeto, o que pode

causar graves problemas de saúde para a população no entorno.

2.1.3 - EFLUENTE DE CELULOSE E PAPEL

Como um dos players do mercado globalizado, o setor de papel e celulose brasileiro

ocupa a

sétima posição mundial, com uma produção anual de 9,4 milhões de toneladas de

celulose, e é o 11º do mundo no ranking dos fabricantes de papel, com um volume de 8,2

milhões de toneladas de papel produzidas por ano.

(

www.bahiainvest.com.br/port/segmentos/papel.asp , acessado em 12/2005).

A produção de celulose é um processo que requer grandes quantid

ades de água e

gera, tam

bém, grande vazão de efluentes. Além dos volumes consideráveis de água e de

efluentes, algumas características químicas dos efluentes gerados na fabricação de celulose,

notadamente cor e compostos orgânicos clorados (AOX), são potenciais causadoras de danos

ambientais (

www.cetesb.sp.gov.br/Ambiente/producaolimpa/casos/caso07.pdf , acessado em

12/2005)

emprego do sulfato ou processo Kraft tem sido muito usado na fabricação de

celulose

ções alcalinas para dissolver a lignina e outras

partes nã

2.1.4-ÁGUA DE PRODUÇÃO DE PETRÓLEO

A água co-produzida representa a maior corrente dos efluentes gerados nas

atividade

ALI et al., 1998; THOMAS, 2004).

porque diminui o custo de fabricação devido a recuperação de produtos químicos e

calor, partindo da queima do licor-negro proveniente do cozimento. Por isso, os efluentes do

processo sulfato contêm pouca lignina e produtos químicos cozidos, porém são ricos em

sulfato (BRAILE & CAVALCANTI, 1993).

O processo sulfato, que utiliza solu

o celulósicas da madeira (a lignina é a substância que uni as fibras de celulose umas

às outras), tem a vantagem de produzir uma celulose de alta qualidade. O processo de digestão

pode ser obtido por cargas (intermitentes), produção direta ou indireta ou por produção direta

e contínua.

s de exploração, perfuração e produção de petróleo. A quantidade de água gerada

com óleo associado varia muito durante o processo de produção de petróleo. No início, um

campo produz pouca água, em torno de 5 a 15% da corrente produzida. Entretanto, à medida

que a vida econômica dos poços vai se esgotando, o volume de água pode aumentar

significativamente, correspondendo a uma faixa de 75 a 90% (HANG &VARADARAJ, 1996;

A produção excessiva de água é um problema sério nos campos de petróleo maduros,

isto é, nos campos que têm permanecido em

operação por um longo período de tempo.

Segundo

no estágio maduro, uma produção

excessiv

cialmente,

por sep

om a função de remover traços de

gás aind

s compostos

dissolvid

uitos produtos químicos dissolvidos e

microrga

consumo

humano, reinjetada em poços para sua utilização no processo de recuperação secundária ou

STEPHENSON (1991), o volume de água produzida em um campo maduro pode

exceder 10 vezes o volume de óleo produzido. Esta produção de água resulta numa coluna

hidrostática que dificulta a recuperação de óleo nos poços.

Visto que muitos campos de óleo e gás em regiões como as do Mar do Norte, África

Ocidental, Ásia Pacífica e Golfo do México têm alcançado,

a de água, esta se tornou uma das maiores preocupações no negócio de produção de

óleo e gás. Em média, para cada m

/dia de petróleo produzido são gerados de 3 a 4 m

/dia de

água. Há campos onde este número se eleva a 7 ou mais m

/dia (THOMAS, 2004).

A produção offshore primeiramente trata as misturas óleo/água por meio de

separação mecânica dos fluidos. Os fluidos produzidos (água/óleo/gás) passam, ini

aradores, que podem ser bifásicos ou trifásicos, atuando em série ou paralelo

(THOMAS, 2004). No separador bifásico ocorre a separação gás/líquido, enquanto que no

separador trifásico ocorre, também, a separação óleo/água.

Tipicamente, nas plataformas marítimas, a água proveniente dos separadores e

tratadores de óleo é enviada para um vaso degaseificador, c

a presentes no líquido. Em seguida a água passa por um separador água/óleo e

finalmente em um tubo de despejo. Depois da remoção da maior parte do óleo, a água

produzida é tipicamente descartada abaixo da superfície do mar.Todo o óleo recuperado

nessas etapas é recolhido em um tanque para sua recuperação (VIEIRA, 2003).

Os hidrociclones e os flotadores são os equipamentos de separação óleo/água mais

utilizados pela indústria do petróleo. Estes equipamentos não separam o

os na água de produção. A flotação, por exemplo, promove a recuperação do resíduo

d óleo através de separação gravitacional, enquanto que os hidrociclones propicia a aceleração

deste processo (FANG & LIN, 1988; FLANIGAN et al, 1989 BURKE et al., 1991;

RIVIERE& GARLAND, 1994; CASTRO et al., 1998).

Depois do reservatório de separação, a água, contendo ainda óleo na forma de gotas

microemulsionadas, precisa ser descartada junto com m

nismos. Esses produtos químicos e microrganismos representam um grande risco e

poluição ambiental marinha e terrestre (GUIDA & FRUGE, 1995; ZITHA, 1999).

Em muitos campos terrestres do mundo, áreas onshore, a água produzida pode ser

injetada em formações subterrâneas que já contenham águas não disponíveis para o

ainda de

lizados mostram que esse descarte pode ser feito sem

qualquer

As águas de produção contêm uma mi a complexa de materiais orgânicos e

ão das características do

reservatório e da localização, bem como da idade do poço, do tipo de óleo a ser extraído, e até

mesmo,

•

• s químicos utilizados durante a produção;

rrosão e incrustação, graxas e asfaltenos;

e suas

as e distribuição de peso molecular variam consideravelmente de campo

fase aquosa. Já o óleo solúvel pode apresentar dois subgrupos: os compostos

parcialm

água de produção. a concentração de sólidos dissolvidos totais (SDT) pode variar entre 100 a

scartada, após devido tratamento. Segundo STEPHENSON (1991) e THOMAS

(2004), a água produzida em muitas áreas onshore e offshore, localizadas em países tropicais,

é descartada diretamente no ambiente.

O descarte de tais volumes de resíduos no meio ambiente é preocupante devido ao

pouco conhecimento sobre seus constituintes e, sobretudo, sobre seus efeitos a médio e longo

prazo. Até o momento, os estudos rea

dano ao ambiente aquático, desde que haja a diluição adequada do efluente

(HANSEN & DAVIES, 1994; STROMGRENet al., 1995; UTVIK, 1999; THOMAS, 2004).

2.1.4.1 - CARACTERÍSTICAS DA ÁGUA DE PRODUÇÃO

stur

inorgânicos, cuja composição e quantidade variam em funç

do método de recuperação deste óleo. Em geral, a relação água/óleo aumenta com o

tempo (SEABRA, 1984; BURNS et al., 1999). Dentre os compostos que compõem as águas

produzidas encontram-se (STEPHSON, 1991; HANSEN & DAVIES, 1994; TELLEZ et al.,

2002):

Compostos de óleo dispersos e dissolvidos;

Minerais dissolvidos;

Produto

• Sólidos produzidos, incluindo produtos de co

• Microrganismos;

• Gases dissolvidos, incluindo CO

e H

Os compostos orgânicos ocorrem naturalmente na água de produção

quantidades relativ

para campo.

Óleo é o termo comumente aplicado para definir este material orgânico disperso ou

dissolvido. O óleo disperso consiste em pequenas gotas de óleo individuais que estão

suspensas na

ente solúveis e os compostos muito solúveis.

Os sãos constituem o principal grupo de compostos inorgânicos presentes na água

300.000 mg/L, sendo que a concentração de cloreto de sódio pode corresponder a até 80%

deste total (TELLEZ & KHANDAN, 1996).

Normalmente, os cátions presentes na água de produção são: Na

, K

, Ca

, Mg

, Sr

e Fe

; e os ânions são Cl

, SO

, CO

e HCO

, os quais afetam a capacidade de

tamponamento e a salinidade. A água produzida também pode conter traços de vários metais

pesados, tais como cádmio (Cd, cromo

(Cr), cobre(Cu), chumbo(Pb), mercúrio(Hg),

níquel(

problem

forma batelada ou contínua. Em tratamentos do tipo

batelad

NEMATI, 2001; THOMAS, 2004).

entos e/ou derrames de fluidos da indústria de

Ni), prta (Ag) e zinco (Zn), assim como traço de metais radioativos como potássio

), urânio

238

), tório

232

), ou rádio

226

Em relação aos metais radioativos, o risco ambiental associado à possível presença

desres compostos é praticamente nulo, já que estes apresentam concentrações extremamente

baixas (HANSEN & DAVIES, 1994)

Os produtos químicos são normalmente adicionados para tratar ou prevenir os

as operacionais que, em geral, ocorrem no processo e produção (STEPHENSON,

1991). A quantidade e o tipo de produtos químicos requeridos variam de plataforma para

plataforma, e podem ser utilizados de

a uma grande quantidade do produto é injetada no poço. Os produtos que devem ser

usados desta maneira são os inibidores de incrustação e de corrosão e biocidas. Já no

tratamento contínuo,esses produtos são adicionados de modo que seus níveis na corrente de

água produzida sejam inferiores o seu grau de toxicidade. Os produtos químicos que são

utilizados neste processo são floculantes, coagulantes, desestabilizadores de emulsão e

antiespumantes.

Diversos microrganismos, tais como bactérias, algas e fungos estão frequentemente

presentes nas águas produzidas. Estes microrganismos podem gerar, através de seus

metabolismos, substancias que dificultam a separação água/óleo e posterior tratamento desse

óleo.

Dentre as bactérias, destacam-se as bactérias redutoras de sulfato (BRS). Sua presença

tem sido observada constantemente em águas de produção e seu metabolismo gera

substancias de caráter corrosivo, como ácido sulfídrico (POSGATE, 1984; RABUS et al.

1996;

A água de produção é muito rica em sulfato, o que pode incidir em alta produção de

sulfeto pela atividade de BRS. O aumento da concentração de H

S pode resultar em riscos de

corrosão associados à falhas catastróficas dos materiais. Existe ainda, a preocupação com os

impactos ambientais gerados por vazam

petróle

No processo de conversão da matéria orgânica em condições de ausência de oxigênio

são utilizados aceptores de elétrons inorgânicos como

o, os quais levam à contaminação do solo, ar e/ou água, tanto pelos fluidos, como pelo

próprio H

Por isso, a corrosão microbiológica é responsável pela maioria dos processos de deterioração

nas linhas de água de injeção em instalações de recuperação secundária do petróleo (CRAVO,

2001)

2.2 - BIODEGRADAÇÃO ANAERÓBIA

−

(redução de nitrato),

−

(redução de sulfato), ou

(formação de metano) (ATLAS, 1981 apud VIEIRA, 2003).

Muitos pesquisadores têm demonstrado que benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX)

podem s

ser

ispensa a adição de nutrientes.

No que

simbióticas existentes, entre as numerosas espécies bacterianas

envolvid

er degradados em ecossistemas, em condição de anaerobiose (BOOPATHY, 2003).

Alcanos, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH) e alcenos também podem

degradados em condições anaeróbias (SUFLITA

et al., 2000).

O tratamento anaeróbio de efluentes oferece uma série de benefícios que superam as

poucas limitações. Dentre as vantagens está à baixa produção de lodo anaeróbio, que inclusive

pode permanecer ativo por vários meses independente de alimentação e, principalmente a

redução de custos, pois não requer aeração e, freqüentemente, d

concerne às limitações, podem ser citadas: partida lenta, a não ser que seja utilizado

um lodo previamente aclimatado e a geração de gás sulfídrico, um agente corrosivo e tóxico

para os seres vivos.

Na digestão anaeróbia, diversos grupos de microrganismos atuam interativamente na

conversão da matéria orgânica complexa em metano, gás carbônico, água, gás sulfídrico e

amônia, além de haver produção de novas células microbianas. As bases bioquímicas e as

complexas relações

as, ainda não foram totalmente elucidadas, mesmo porque envolveu a interação de

várias e distintas espécies microbianas (MCCARTY, 1982, apud VIEIRA,2003).

Os microrganismos que participam do processo de decomposição anaeróbia podem

ser divididos em quatro importantes grupos de bactérias, com comportamentos fisiológicos

distintos: bactérias fermentativas, bactérias acetogênicas, archeas metanogênicas e bactérias

redutoras de sulfato (BARTON, 1995).

PEECE,1996):

io e dióxido de carbono. Essa etapa é

mediad s denominadas hidrolíticas-fermentativas, representadas por

solúveis,

origina cetato, o H

e o CO

, com formação de mais acetato,

cetato ou da redução do dióxido de carbono pelo hidrogênio, produzem o

ais reduzida do carbono na natureza (VAZOLLER,1993). As

metano

e acordo com a composição dos substratos disponíveis, as diversas bactérias que

compõem o lodo anaeróbio seguirão diferentes vias metabólicas (BARBOSA, 1988). Um

modelo proposto por MCCARTY apresenta o processo de digestão anaeróbia e suas

interações, em três estágios principais (S

Hidrólise e Fermentação

A hidrólise dos carboidratos, proteínas e lipídeos originam açúcares, aminoácidos, ácidos

graxos de cadeias longas e álcoois, que por fermentação originam ácidos orgânicos voláteis,

principalmente o ácido acético, outros álcoois, hidrogên

a pela atividade de bactéria

a grande variedade de espécies, muitas anaeróbias estritas, como as do gênero

Clostridium,

e algumas facultativas, como as do gênero

Citrobacter, Enterobacter e Escherichia.

Acetogênese e Desidrogenação

Neste estágio participam 3 grupos bacterianos distintos: as bactérias acetogênicas, as

bactérias homoacetogênicas e as bactérias redutoras de sulfato (BRS), que serão detalhadas

posteriori

. As bactérias envolvidas, de uma forma geral, utilizam os intermediários

dos no estágio anterior como o a

e também de H

S (gás sulfídrico). Como exemplo de bactérias que compõem o grupo

das acetogênicas, as espécies:

Syntrophomonas wolfei e Syntrophobacter wolinii. Como

exemplo de espécies homoacetogênicas:

Clostridiumaceticum, Clostridium thermoaceticum e

Acetobacter woodii.

- Metanogênese

Este envolve um grupo de bactérias especiais, tidas como responsáveis pela fase

limitando processo, as archeas metanogênicas. Essas espécies bacterianas, através da

descarboxilação do a

metano, a forma gasosa m

gênicas são anaeróbias estritas, se desenvolvem somente em ambientes com baixo

potencial redox (< -300 mV) e utilizam substratos muito específicos para o crescimento e

produção do metano, tais como ácido acético, hidrogênio, dióxido de carbono, formiato,

metilaminas e metanol. Mas, somente o gênero

Methanosarcina apresenta capacidade de

utilizar quase todos estes substratos.

A figura 2.1 mostra uma representação esquemática da interação das varias espécies

envolvidas no processo de biodegradação em reatores anaeróbios.

Figura 2.1 - Representação esquemática da interação interespécies em bioreatores anaeróbios

As bactérias redutoras de sulfato (BRS) formam um grupo fisiológico de

to como aceptor final de elétrons

durante a respiração (BARTON & TOMEI, 1995). Essas bactérias fazem parte de um grupo

distinto

bactérias estão amplamente

distribuí

2.3 - BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO (BRS)

procariontes que têm a capacidade exclusiva de utilizar sulfa

de microrganismos presentes em uma grande variedade de ambientes anaeróbios

(KRUMHOLZ

et al., 2002; ODOM & SINGELTON, 1993).

Inicialmente pouca atenção foi dispensada às BRS, no entanto, pesquisadores

demonstraram interesse em descobrir suas interações com outras formas de vida e seus

processos metabólicos. Então, foi descoberto que essas

das na Terra e reconheceu-se que esses organismos desenvolvem papéis significantes

na natureza, em virtude do seu potencial para numerosas interações, conforme ressalta a

Figura 2.2. Uma característica marcante das BRS é a maneira pela qual o sulfato é

metabolisado ( BARTON & TOMEI, 1995).

As bactérias redutoras de sulfato foram descobertas por Beijerinck em 1895, que

descreveu a espécie

Spirillum desulfuricans. Logo sucederam-se estudos e pesquisas a

respeito destas bactérias e outros fatos marcantes na caracterização das BRS (POSTGATE,

1984).

al.

não metais, como concreto (GENTIL, 1996).

Nos últimos anos, as BRS vêm sendo reconhecidas por atuarem em vários processos,

tais como: corrosão microbiologicamente induzida, biodessulfurização e remediação

ambient

Na corrosão microbiologicamente induzida, o H

S produzido através do metabolismo

das BRS ataca as superfícies de metais empregados na construção de equipamentos e dutos, e

inclusive de

BRS

ASSOCIAÇÕES

COM ANIMAIS

TRATAMENTO

DE RESÍDUOS

BIOCORROSÃO

BIORREMEDIAÇÃO

CICLO DE

ENXOFRE

DECOMPOSIÇÃO

DE ALIMENTOS

TRANSFORMAÇÕES

GEOQUÍMICAS

PRODUÇÃO DE

COMBUSTÍVEIS

Figura 2.2 – Interações das bactérias redutoras de sulfato.

Fonte: BARTON & TOMEI, 1995.

ulfurização do petróleo e de

seus derivados. Os combustíveis fósseis apresentam, em sua composição, compostos

lfurados, em concentrações variáveis, que são muito prejudiciais à saúde humana e ao meio

ambiente

Por outro lado, as BRS podem ser empregadas na biodess

(emissão de SO

, formação da chuva ácida, redução da fertilidade do solo) e às

indústrias (corrosão de equipamentos). Para diminuir a concentração desses compostos o

petróleo é atualmente tratado na fase de refino e produção. A biodessulfurização anaeróbia é

uma opção mais atrativa do que a aeróbia, já que o produto final do processo (H

S) pode ser

facilmente recuperado por operações nas refinarias (VIEIRA, 2003).

O emprego das bactérias redutoras de sulfato também tem sido estudado para

aplicação na biorremediação de solos, águas subterrâneas e outros a

mbientes contaminados

por hidr

ARACTERIZAÇÃO

ulfato estão amplamente distribuídas em ambientes

terrestres e aquáticos. A presença de BRS com alta atividade metabólica é facilmente

reconhec

rmófilas Gram-negativas, Gram-positivas formadoras de

esporos

Desulfov

Os dois gêneros mais conhecidos de bactérias redutoras de sulfato são

Desulfovibrio

ocarbonetos de petróleo (ALVAREZ & DA SILVA, 2004; BOOPATHY, 2003;

KLEIKEMPER

et al., 2002; KARTHIKEYAN & BHANDARI, 2001; SUFLITA et al., 2000;

WIDDEL

et al., 1999; LOVLEY et al., 1996). Essas bactérias conseguem ter atividade

metabólica na presença de compostos reconhecidamente recalcitrantes e prejudiciais ao meio

ambiente.

2.3.1 – C

As bactérias redutoras de s

ida pelo enegrecimento da água ou dos sedimentos devido a precipitação do sulfeto

de ferro (FeS), e pelo odor característico de sulfeto de hidrogênio (H

S). Essas bactérias são

facilmente encontradas em ambientes marinhos, estuários, sedimentos e lagos salinos ou

hipersalinos, por conterem altas concentrações de sulfato. Porém, já foram encontradas BRS

ativas em ambientes não salinos e em água doce. Também é relatada a presença de BRS em

ambientes poluídos como em plantas de purificação anaeróbia, em alimentos deteriorados,

plantas de lodo, em águas de campos de exploração de óleo, ambientes contaminados com

hidrocarbonetos e com compostos halogenados, etc (POSTGATE, 1984; BARTON, 1995;

KLEIMKEMPER

et al., 2002).

As bactérias redutoras de sulfato podem ser classificadas em 4 grupos: mesófilas

Gram-negativas, eubactérias te

e arqueobactérias termófilas Gram-negativas (POSTGATE, 1984; BARTON, 1995).

As BRS mesófilas Gram-negativas não formadoras de esporos são as mais difundidas

na natureza. Dentre elas, cinco gêneros oxidam parcialmente compostos orgânicos a acetato

ibrio, Desulfobotulus, Desulfobulbus, Desulfohalobium e Desulfomicrobium.

Enquanto sete gêneros oxidam substratos orgânicos completamente a CO

: Desulfoarculus,

Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema

Desulfosarcina

(BARTON, 1995).

Desulfotomaculum, mas ao longo dos anos outros gêneros foram identificados

(Desulfobacter, Desulfonema, Desulfobulbus, etc.) (POSTGATE, 1984). O gênero

Desulfov

presentam mobilidade e outras são capazes de esporular. As

filament

etes ou vibrios. Desulfovibrios são propensos a pleomorfismos em culturas

velhas

ATE, 1984).

ue sobrevivem em temperaturas entre 50 e 65

principa

as redutoras de sulfato são

Gram-ne

ibrio é o mais conhecido, pois seus membros são geralmente fáceis de isolar e

purificar. Esse gênero inclui cinco espécies que não esporulam e têm flagelos polares

(BARTON & TOMEI, 1995).

As células de BRS apresentam morfologia bastante diversificada, podendo ser

esféricas, ovais, espirais, na forma de bastonetes ou de vibrios, com diâmetro variando de 0,4

a 3,0 µm. Algumas espécies a

osas (

Desulfonema) exibem um movimento deslizante (HOLT et al., 1994 apud

VIEIRA, 2003)

Os membros do gênero

Desulfovibrio são geralmente curvos e sigmóides, mas

existem exceções à regra como, por exemplo, a espécie

Desulfovibrio desulfuricans que têm a

forma de baston

ou adquirem a forma espiralada em ambientes inadequados ao crescimento

(POSTGATE, 1984).

A maioria dos desulfovibrios são monotríquios, apesar de serem conhecidas cepas de

Desulfovibrio desulfuricans sem flagelos. Algumas espécies de Desulfovibrio apresentam

duplo flagelo (POSTG

As bactérias do gênero

Desulfotomaculum são Gram-positivas formadoras de esporos

e incluem espécies que oxidam compostos orgânicos completa e incompletamente. Neste

gênero há espécies termófilas, q

lmente devido à formação de esporos (BARTON, 1995).

O gênero

Thermodesulfobacterium é parte do grupo das eubactérias termófilas e

Gram-negativas. Neste gênero há espécies que são nutricionalmente restritas e que não

oxidam completamente compostos orgânicos. As arqueobactéri

gativas, termófilas; são encontradas em áreas hidrotermais submarinas anaeróbias e

necessitam de sal e altas temperaturas para seu crescimento (BARTON, 1995).

A Figura 2.3 mostra a fotografia de uma colônia de bactérias redutoras de sulfato da

espécie

Desulfobacter postgatei.

Figura 2.3 - Bactérias redutoras de sulfato da espécie

Desulfobacter postgatei.

2.3.2 – CRESCIMENTO

As bactérias redutoras de sulfato são microrganismos estritamente anaeróbios.

Algumas podem crescer na ausência de sulfato, usando outro aceptor final de elétrons, como

nitrato e/ou nitrito, entretanto não podem crescer tendo o oxigênio como aceptor final de

elétrons.

Essas bactérias crescem lentamente se comparadas com outras espécies bacterianas,

como, por exemplo, as do gênero

Pseudomonas (POSTGATE, 1984). O crescimento de BRS

mesófilas é geralmente lento, levando de alguns dias a duas semanas a 30

C, de acordo com a

espécie. Já as termófilas crescem mais rapidamente; a 55

C, o crescimento leva de 12 a 18

horas. Uma razão para o crescimento lento é a geração de H

S - produto da respiração - que

diminui a taxa de crescimento que pode ser zero para altas concentrações de H

S. Esse

fenômeno pode ser devido à toxicidade intrínseca do H

S aos sistemas vivos, mas é mais

provável que seja decorrente da insolubilidade do ferro pela formação de FeS (POSTGATE,

1984).

O crescimento das culturas de

Desulfovibrio, em diferentes meios, é linear ao invés

de exponencial. É possível generalizar de forma qualitativa que os organismos produtores de

acetato, como a maioria das espécies dos gêneros

Desulfovibrio e Desulfotomacula, crescem

rapidamente, ocorrendo duplicação da concentração celular, a 30

C, em 3 a 6 horas. Os tipos

que utilizam acetato, como

Desulfobacter spp, crescem muito mais lentamente e,

normalmente, são incapazes de dobrar a massa celular em tempos inferiores a 20 horas

(POSTGATE, 1984).

2.3.3 – CULTIVO

Uma gama de substratos podem ser utilizados pelas bactérias redutoras de sulfato

como fonte de energia (doadores orgânicos de elétrons) para crescimento inclui lactato,

formiato, piruvato, malato, fumarato, colina e certos alcóois primários como metanol, etanol,

propanol e butanol, e até contaminantes ambientais (KRUMHOLZ

et al., 2002; ODOM &

SINGELTON, 1993). Algumas podem também utilizar alguns constituintes do petróleo como

os alcanos, tolueno, benzeno e hidrocarbonetos poliaromáticos (SOGIN

et al., 2003). Como

aceptor final de elétrons, utilizam o íon sulfato que pode ser substituído por tiossulfato,

tetrationato, sulfito ou metabissulfito (SÉRVULO, 1991). Em adição aos substratos orgânicos,

hidrogênio gasoso pode atuar como doador na cadeia de transporte de elétrons realizada por

Desulfovibrio. As principais reações bioquímicas realizadas com alguns desses substratos

estão apresentadas na Tabela 2.3 bem como a variação da Energia Livre de Gibbs (.∆Go), a

27oC, associada a cada uma delas.

Tabela 2.3 - Dados termodinâmicos de algumas reações bioquímicas realizadas por BRS.

Reação a 27

∆G

(KJ/mol)

−−−−

+++⇔+

322

SHCOCOOHSOAcetato

-12,41

−−−−

++⇔+

444 SCOAcetatoSOPiruvato

-331,06

−−−−

+++⇔+

2222 SOHCOAcetatoSOLactato

-140,45

−

−−

+⇔+

44 SHCOSOFormiato

-182,67

−−

++⇔+

2 SOHCOSOCH

+16,72

OHSSOH

44 +⇔+

−−

-123,98

Fonte: RIZZO & LEITE, 2004

A redução desassimilativa do sulfato é um tipo de metabolismo essencialmente

oxidativo, que ocorrre em condições de anaerobiose. O metabolismo pode ser dividido em

dois processos não oxidativos, catabolismo e transporte de elétrons, seguidos por um processo

oxidativo, a redução do sulfato, conforme é verificado observando-se a Figura 2.4, uma

moléculade ATP é gerada ao nível do catabolismo do substrato orgânico e uma molécula de

ATP é consumida na redução do íon sulfato. Desta forma se somente essas reações

ocorressem a nível celular, os microrganismos não poderiam apresentar crescimento. No

entanto, o que se observa é o crescimento dos microrganismos e a cadeia respiratória é o

sistema alternativo de fosforilação mais provável para a geração de ATP (POSTGATE, 1984).

Figura 2.4 - Esquema representativo da redução desassimilativa do íon sulfato

Fonte : RIZZO & LEITE, 2004

As BRS utilizam nitrogênio, orgânico ou inorgânico, para crescimento; algumas

linhagens podem fixar nitrogênio gasoso. Determinadas linhagens são também capazes de

crescer às custas de nitrato como aceptor final de elétrons. Barton (1995) isolou uma cepa de

Desulfovibrio sp capaz de usar nitrato, nitrito e 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) como fontes de

nitrogênio e aceptores de elétrons para crescimento.

Os metais são muito importantes como cofatores para muitas enzimas das BRS, por

isso devem estar presentes nos meios de crescimento. O ferro é essencial para a produção de

citocromos e produção de hidrogenases (enzima responsável pela oxidação do hidrogênio

molecular). Níquel e selênio são necessários para a atividade dessas enzimas.

Vários tipos de meios de cultura são utilizados para crescimento das BRS. Porém, o

meio mais comumente usado é o meio Postgate C, que tem a seguinte composição, por litro:

, 0.5 g; NH

Cl, 1.0 g; Na

, 4.5 g; CaCl

.2H

O, 0.06 g; MgSO

.7H

O, 2.0 g;

Extrato de leveduras, 1.0 g; FeSO

.7H

O, 0.004 g; Citrato de sódio, 0.3 g e Lactato de sódio

(ou outro doador de elétrons), 3.5 g. O potencial de redução do meio deve estar abaixo de 150

mV e o ambiente redutor pode ser obtido através do uso de 1mM de Na

S ou 1mM de

tioglicolato de sódio mais 1mM de ascorbato de sódio (BARTON, 1995).

As BRS podem ser encontradas tanto em ambientes ácidos (pH 4,0) (POSTGATE,

1984) como em ambientes alcalinos com pH até 9,5 (BARTON, 1995).

Diferentemente da maioria das bactérias anaeróbias, as BRS são capazes de

sobreviver na presença de quantidade limitada de oxigênio. Esta tolerância ao ar pode ser

atribuída a presença de catalase e superoxido dismutase (BARTON, 1995). Se a concentração

de oxigênio dissolvido em águas residuárias estiver entre 0,1 e 1,0 mg/L, as BRS serão

inibidas, mas conseguem sobreviver, permanecendo em estado latente. Em concentrações

acima de 1,0 mg/L, ocorre a inibição da redução do sulfato, em conseqüência do aumento do

potencial de oxi-redução do meio (SILVA, 2000).

Algumas substâncias também provocam a inibição da redução do sulfato, por

apresentarem estruturas análogas. Dentre elas destacam-se o selenato e os íons

monofluorofosfato que são os inibidores mais poderosos e mais específicos. O molibdato é

um inibidor, assim como o cromato, mas não da mesma forma que o selenato; este ânion inibe

as células de

Desulfovibrio formando um análogo instável do sulfato ativado, esgotando os

ATPs da célula. O efeito do molibdato nas BRS é relativamente específico e, por isso, é um

inibidor útil na redução do sulfato (POSTGATE, 1984). Segundo Barton (1995), o sulfeto de

hidrogênio em elevadas concentrações (16 mM H

S) inibe o crescimento das BRS.

2.3.4 – CICLO DO ENXOFRE E REDUÇÃO DESASSIMILATIVA DO SULFATO

Nos microrganismos geralmente associados aos processos de corrosão, o enxofre ou

seus compostos constituem parte importante do metabolismo e este, por sua vez, se relaciona

com o ciclo do enxofre na natureza. A Figura 2.5 apresenta o ciclo do enxofre na natureza.

Figura 2.5 - O ciclo do enxofre na natureza.

(Fonte:

www.ambientebrasil.com.br)

Dentro do grupo de bactérias relacionadas com o enxofre temos as bactérias

oxidantes (aeróbicas) e as redutoras (anaeróbicas). Entre as bactérias oxidantes encontramos

as pertencentes ao gênero

Thiobacillus, responsáveis pela corrosão devido à formação de

ácidos agressivos ao meio a partir da oxidação de enxofre ou compostos de enxofre tais como

sulfeto, sulfito, tiossulfato e politionatos a sulfato com a simultânea produção de ácido

sulfúrico.

As bactérias redutoras de sulfato são as únicas que têm a capacidade de utilizar o

sulfato como aceptor final de elétrons. Esse processo de respiração, que ocorre em condições

anaeróbias, é conduzido pelas BRS com o propósito de gerar compostos de alta energia para

reações de biossíntese envolvidas no seu crescimento e manutenção (BARTON, 1995).

Há milhões de anos, o enxofre presente na superfície da Terra está disponível na

biosfera na forma oxidada, como sulfato e óxidos de enxofre no solo, rochas, rios e mares.

Biologicamente, para incorporação das diferentes formas de enxofre em material celular, este

deve ser reduzido. A redução do sulfato, assim como a fixação do nitrogênio e a produção de

oxigênio biologicamente são considerados processos indispensáveis à vida no planeta. Sabe-

se que os animais não têm a capacidade de conduzir a reação de conversão de sulfatos em

sulfetos, sendo assim dependentes das plantas e dos microrganismos para seu suprimento de

enxofre reduzido. A redução do sulfato inorgânico a sulfeto, orgânico ou inorgânico, e a

subseqüente oxidação deste sulfeto a sulfato, é conhecida como

Ciclo do Enxofre (Figura 2.6).

Este ciclo é constituído de uma parte assimilativa e outra desassimilativa (BARTON, 1995).

SULFATO

Bactérias

oxidantes

ENXOFRE

Compostos

Orgânicos do Enxofre

Degradação

or animais

e bactérias

ÁCIDO SULFÍDRICO

Bactérias redutoras

Bactérias

redutoras

Síntese por

vegetais

Bactérias

oxidantes

CÉLULA -

ENXOFRE

SULFATO

SULFETO

ENXOF

Parte Assimilativa Parte Desassimilativa

Figura 2.6 – Ciclo biológico do enxofre.

Célula-enxofre indica o enxofre ligado a bactérias, fungos, animais e plantas. (1) Redução

assimilativa do sulfato por bactérias, fungos e plantas; (2) Morte e decomposição por

bactérias e fungos; (3) Excreção do sulfato por animais; (4) Assimilação do sulfeto por

bactérias (e algumas plantas); (5) Redução desassimilativa do sulfato; (6) Redução

desassimilativa do enxofre elementar; (7) Oxidação quimiotrófica e fototrófica do sulfeto; (8)

Oxidação quimiotrófica e fototrófica do enxofre.

Fonte: Adaptado de BARTON, 1995.

As plantas, os fungos e algumas espécies de bactérias usam o sulfato como sua única

fonte de enxofre, e para tanto, reduzem o átomo de enxofre do maior estado de oxidação para

o mais reduzido. Este processo é dito

redução assimilativa do sulfato, assim chamado, pois o

enxofre é assimilado, isto é, ele é incorporado nos organismos em aminoácidos (cisteína e

metionina) e vitaminas (tiamina, biotina, ácido pantotênico), que são constituintes de

proteínas e coenzimas, respectivamente. As bactérias redutoras de sulfato realizam tanto a

redução assimilativa como a redução desassimilativa do sulfato. Nesta última, o íon sulfato

age como agente oxidante para a assimilação da matéria orgânica, como ocorre com o

oxigênio na respiração aeróbia. De modo que, somente uma pequena quantidade do enxofre é

assimilada pelo organismo, sendo sua grande maioria liberada no ambiente como íon sulfeto,

normalmente convertido a H

S livre em meio aquoso. Este processo também é denominado de

respiração do sulfato (POSTGATE, 1984). Abaixo estão representadas as equações

correspondentes à redução do sulfato mediante oxidação total (2.1) ou parcial (2.2) da matéria

orgânica.

+ 2 CH

O → H

S + 2 CO

+ CH

COOH (2.1)

Uma grande variedade de compostos orgânicos pode ser assimilada pelas BRS,

variando desde ácidos graxos simples a hidrocarbonetos aromáticos complexos.

A etapa inicial na redução do sulfato corresponde à ativação deste íon pelo ATP

(trifosfato de adenosina) com formação de um composto orgânico de enxofre de alta energia,

a adenosina 5

’

-fosfosulfato (APS). Durante esta reação, que é catalisada pela enzima ATP-

sulfurilase, ocorre a substituição de dois resíduos de fosfato do ATP pelo sulfato. Em seguida,

o pirofosfato (PP

) é rapidamente convertido em fosfato inorgânico pela enzima pirofosfatase,

dependente de Mg

, Co

e Mn

, sendo inativada em aerobiose. Parece que a pirofosfatase

teria a função fisiológica de conservar ATP quando o microrganismo estivesse em condição

desfavorável, através da inibição da conversão de APS. A constante de equilíbrio da ATP-

sulfurilase não é favorável à formação de APS, sendo a reação conduzida neste sentido

somente pela hidrólise do PP

+ ATP ↔ APS + PP

(2.2)

+ H

O → 2 P

(2.3)

APS + 2 e

↔ AMP +

(2.4)

A segunda etapa é a redução da adenosina fosfosulfato a AMP (monofosfato de

adenosina) e sulfito pela ação da enzima APS-redutase.

Em seguida, o sulfito (SO

) é reduzido a sulfeto (S

) através de uma série de etapas

que são muito pouco conhecidas bioquimicamente. Historicamente, pensava-se que esse

processo de redução era causado por um “sistema de sulfito redutase”; no entanto, evidências

sugerem que o sulfito é reduzido a sulfeto por um ou dois mecanismos possíveis. Uma

hipótese é que a redução direta de sulfito a sulfeto ocorra sem a formação de nenhum

composto intermediário. Outra hipótese propõe a formação de dois intermediários, tritionato e

tiossulfato, sendo que a etapa final é a redução de tiossulfato a sulfito e a sulfeto (BARTON,

1995).

A possível rota da redução desassimilativa do sulfato, de acordo com Postgate

(1984), segue os passos apresentados na Figura 2.7. O sulfito é convertido a metabissulfito

), que é reduzido a tritionato (S

), passando por alguns intermediários como, por

exemplo, o ditionato, S

. Parte do tritionato é então convertido a tiossulfato (S

) e

parte é usada para regenerar o sulfito. Em seguida, o tiossulfato é reduzido a sulfeto, sendo

uma parte novamente convertida a sulfito. Entre os transportadores de elétrons envolvidos no

metabolismo das BRS tem-se: citocromos (b, c

), ferrodoxinas, flavodoxinas, NAD

e NADP

(MADIGAN

et al., 1997 apud VIEIRA, 2003).

As bactérias que conduzem a redução desassimilativa do sulfato fazem parte de um

grupo de quatorze gêneros de eubactérias. São eles:

Desulfovibrio, Desulfoarculus,

Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfobotulus, Desulfobulbus, Desulfococcus,

Desulfomicrobium, Desulfohalobium, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfosarcina,

sulfotomaculum, Thermodesulfobacterium

, e um gênero de arqueobactéria, Archaeoglobus

(BARTON,1995).

Figura 2.7 - Possível rota para a redução desassimilativa do sulfato.

Fonte: POSTGATE, 1984.

2.4 - SULFETO DE HIDROGÊNIO (H

O sulfeto de hidrogênio, ácido sulfídrico, ou também conhecido por gás sulfidrico, é

um gás com odor pungente, solúvel em água e etanol, podendo ser preparado pela ação de

ácidos minerais em sulfetos metálicos, geralmente ácido clorídrico com sulfeto de ferro II. Em

solução ácida o ácido sulfídrico é um agente redutor moderado.

Este ácido tem um papel importante em análises qualitativas tradicionais, por

precipitar com metais formando sulfetos insolúveis. O seu cheiro de “ovo podre” é

normalmente suficientemente característico, porém um teste de detecção adotado advém da

sua precipitação em soluções alcalinas de sais de chumbo, através da formação de um

precipitado preto. O ácido sulfídrico é muito venenoso, inclusive mais tóxico que o ácido

cianídrico, e em altas concentrações se torna inodoro, sendo rapidamente letal. O sulfeto de

hidrogênio, produto da decomposição ou de reação com ácidos, é altamente tóxico (50-100

ppm em ar) e pode se acumular em espaços limitados.

O ácido sulfídrico pode ser oxidado a enxofre elementar por exposição ao ar ou,

como é mais freqüente, por ação microbiana formando diferentes formas de enxofre, em

condição de aerobiose ou anaerobiose. O H

S pode ser gerado durante a decomposição

anaeróbia de produtos orgânicos por bactérias como

Escherichia coli, Proteus vulgaris e

Pseudomonas pycocyanea e bactérias redutoras de sulfato.

Este gás, através de uma série de reações, produz ácido, todavia indesejáveis, e que

além de agressivos ao concreto utilizado nas Estações de Tratamento de Esgotos (ETEs),

podem também causar odores desagradáveis e desconforto para as áreas residenciais próximas

(

http://www.recuperar.com.br/revistas.htm, 2005). O H

S também pode ser encontrado em

processos de produção e refino de petróleo, sistemas de esgoto, indústrias de papel, águas

subterrâneas e numa variedade de processos industriais. Locais onde haja estagnação de água

com quantidades variadas de matéria orgânica/nutrientes e em ambientes contaminados com

bactérias, estão sujeitos a processos de geração de H

O H

S encontrado em alguns campos de petróleo pode ser originado de várias fontes

e, na maioria das vezes, é resultante de processos de biodegradação como, por exemplo, a

decomposição de matéria orgânica vegetal e animal constituinte do petróleo. Este gás já foi

responsável por diversos acidentes, sendo alguns deles fatais, pois é extremamente tóxico,

corrosivo e inflamável, exigindo vigilância permanente e um plano de controle de emergência

específico (www.clickmacae.com.br).

Na indústria do petróleo, o H

S poderá estar presente nos reservatórios de petróleo e

nos campos

offshore, onde há injeção de água do mar, pela sua abundância e disponibilidade.

A água do mar, além de ser fonte de diversos grupos de bactérias, entre elas as BRS, é uma

fonte potencial de íons sulfato e de nutrientes para os microrganismos presentes na água de

formação. Adicionalmente, o gás sulfídrico pode ser proveniente de mecanismos de

dissolução de sulfetos minerais, da decomposição de compostos orgânicos sulfurados, etc.

Outra fonte de H

S tem sido atribuída à atividade de bactérias redutoras de sulfato, no interior

do reservatório.

A contaminação por BRS das instalações de superfícies de planta de processo e

tanques e também dos oleodutos, aliada as condições favoráveis ao seu desenvolvimento pode

resultar em produção de H

S. Condições do tipo: estagnação, anaerobiose (ausência de

oxigênio), presença de nutrientes (fontes de enxofre, como o sulfato presente na água

produzida e na água do mar) e temperatura adequada ao grupo de bactérias presentes no meio

favorecem o processo microbiológico. Este processo tende a ser mais intenso onde houver

acúmulo de material orgânico, como sedimentável e borras.

2.4.1 – IDENTIFICAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO

(

www.whitemartins.com.br)

• Nome químico: sulfeto de hidrogênio

• Sinônimo: Hidrogênio sulfuretado, gás malcheiroso, hidreto de enxofre, gás

sulfídrico, gás hepático, ácido hidrosulfúrico

• Fórmula molecular: H

Classificação Toxicológica: Gás irritante secundário

• Estabilidade: Estável

• Incompatibilidade (materiais a evitar): Amônia, bases, pentafluoreto de bromo,

trifluoreto de cloro, trióxido de cromo e calor, cobre (cobre pulverizado e ar), flúor, chumbo,

óxido de chumbo, mercúrio, ácido nítrico, trifluoreto de nitrogênio, sulfeto de nitrogênio,

compostos orgânicos, agentes oxidantes, difluoreto de oxigênio, borracha, sódio, umidade e

água.

• Produtos Passíveis de Risco Após a Decomposição: Decomposição térmica ou por

queima pode produzir dióxido de enxofre, enxofre e hidrogênio.

• Risco de Polimerização: Não ocorrerá.

2.4.2 - PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

(

www.whitemartins.com.br)

• Estado Físico: Gás

• Cor: Incolor

• Odor: Ovo podre

• Peso molecular: 34,08

• Densidade do Gás (ar = 1): a 15 °C e 1 atm: 1,189

• Densidade do Gás (água = 1): a 15,6 °C : 0,79

• Percentagem de Matéria Volátil em Volume: 100

• Solubilidade em Água, (V/V): a 20 °C e 1 atm: 38 kg/m

• Pressão do Vapor: a 15,6 °C: 229 psia

• Ponto de Ebulição, a 1 atm: -60,2 °C

• Ponto de Congelamento, a 1 atm: -82,9 °C

• Ponto de Fulgor (Método ou Norma): Gás inflamável

• Temperatura de Auto-Ignição: 260 °C a 1 atm

• Limite de Inflamabilidade no Ar, % em Volume:

Inferior: 4,3%

Superior: 46%

2.4.3 – INFORMAÇÕES TOXICOLÓGICAS

PERIGO: gás liqüefeito tóxico e inflamável, sob pressão. Pode ser fatal se inalado.

Pode formar misturas explosivas com o ar. Pode causar danos no aparelho respiratório e

sistema nervoso central. Pode causar irritação nos olhos. O gás nem sempre pode ser

detectado pelo odor. Sintomas podem se retardar. Equipamento autônomo de respiração deve

ser utilizado pela equipe de salvamento. Odor de ovo podre. (

www.whitemartins.com.br :

acessado em outubro de 2005)

Apesar do termo “gás”, o H

S, que é solúvel em água, poderá estar na forma

dissolvida, e em determinadas condições é liberado para a atmosfera, sob a forma de gás.

Este, se inalado, poderá causar danos à saúde dos seres vivos. Portanto, se o H

S está em

contato com água, esta também o conterá, liberando-o para a atmosfera.

Por ter densidade maior que a do ar, são esperadas concentrações mais elevadas nos

pontos mais baixos.

Exposição prolongada ao H

S poderá acarretar perda da sensibilidade ao odor, de

intensidade variável de acordo com a concentração do mesmo. Então, uma pessoa exposta ao

S pode pensar que a concentração do gás está diminuindo, quando na realidade poderá estar

aumentando. A susceptibilidade ao envenenamento pelo H

S varia de acordo com a

concentração e o tempo da exposição a este gás (

www.clickmacae.com.br acessado em

outubro de 2005).

Valor Limite de Tolerância (LTV): 8 ppm (NR-15). O Limite de Tolerância deve

ser utilizado como um guia no controle da saúde, e não como uma divisão entre concentrações

perigosas ou seguras.

2.4.3.1 EFEITOS A UMA ÚNICA SUPEREXPOSIÇÃO (AGUDA) OU A UMA EXPOSIÇÃO

REPETIDA (CRÔNICA):

Ingestão: É uma maneira muito pouco provável de exposição. Este produto é um gás

a pressão e temperatura normais, mas o congelamento dos lábios e da boca podem ocorrer

devido ao contato com o líquido.

Inalação: Pode ser fatal se inalado. Provoca parada respiratória por depressão das

atividades do sistema nervoso central. Efeitos da superexposição incluem dor de cabeça,

vertigem, tonteira, confusão mental, dor no peito, alterações olfatórias, inconsciência e morte.

Rinites, faringites, pneumonites, edema pulmonar e cianose podem ocorrer. A falta de

oxigênio pode causar a morte.

Contato com a pele: Causa irritação visível com vermelhidão local e inchação. O

líquido pode ser corrosivo e causar congelamento. A lesão criogênica é semelhante à

queimadura.

Contato com os olhos: Causa irritação e uma excessiva vermelhidão da conjuntiva.

Prolongada exposição ao vapor a baixa concentração pode causar conjuntivite dolorosa e

danos na córnea com vesiculação do epitélio da córnea.

Efeitos da superexposição repetida (crônica): A exposição repetida pode causar

náusea, vômitos, perda de peso, baixa pressão sangüínea persistente e perda do senso de

olfato.

Outros efeitos da superexposição: Algumas vezes os sobreviventes exibem

seqüelas neurológicas como: amnésia, tremedeira, neurastenia, distúrbio do equilíbrio ou um

comprometimento mais sério do cérebro e danos na cortical.

Condições clínicas agravadas pela superexposição: Respirar o vapor e/ou névoa

úmida pode agravar asma ou doença fibrótica pulmonar.

Informações laboratoriais com possível relevância para a avaliação dos riscos

para a saúde humana: Embora o sulfeto de hidrogênio não demonstre, repetida e prolongada

hipoxia maternal induzida por superexposição a outros asfixiantes químicos, tem produzido

toxidez embrio-fetal em animais de laboratório.

Carcinogenicidade: Sulfeto de hidrogênio não é considerado material carcinogênico

pelos órgãos NTP, OSHA, ou IARC.

2.4.4 - PROBLEMAS RELACIONADOS À PRESENÇA DE SULFETO

O principal problema frente à presença de sulfeto de hidrogênio produzido pelas

BRS nas áreas de produção devido as suas características é a corrosão nos tanques de

armazenamento e dutos. O risco de toxicidade inerente ao sulfeto de hidrogênio refere-se aos

limites de exposição TWA : média ponderada de tempo (Time Weighted Average) para este

composto que é de 10 ppm. Quando os níveis de sulfeto de hidrogênio atingem valores

superiores a estes, constituem um sério risco de toxicidade para os operários, gerando um

ambiente de trabalho pouco seguro e desagradável (mau cheiroso) (

www.aga.com.br).

Os problemas de corrosão são uma preocupação constante, manifestando-se através

de um severo ataque por

pitting, observado diretamente nas tubulações e indiretamente no

aumento dos custos de manutenção e nas paradas não programadas decorrentes desta

condição. Problemas decorrentes da biocorrosão:

• Substituição prematura de equipamentos com reflexos no custo industrial.

• Necessidade de projetos superdimensionados para suportar os efeitos da corrosão: por

exemplo, aumento nas espessuras, diâmetros, etc.

• Paralisação inesperada do equipamento causando transtornos no planejamento de

produção.

• Perda de um produto (por exemplo, se uma tubulação de um sistema hidráulico

desenvolve um vazamento devido a uma corrosão induzida, contaminando o produto).

• Perda de eficiência (por exemplo, produtos gerados pela corrosão diminuem a

velocidade de transferência de calor em um sistema de resfriamento)

(

http://www.engefac.com.br/corrosao.htm, acessado em outubro de 2005).

2.4.4.1 – BIOCORROSÃO

A corrosão é um fenômeno químico ou eletroquímico de superfície que resulta na

deterioração dos materiais, normalmente metálicos, tanto expostos a ambientes aquosos ou

ligeiramente úmidos (corrosão eletroquímica) quanto secos (corrosão química). Na natureza, a

corrosão química é menos freqüente do que a eletroquímica, estando envolvida em operações

onde as temperaturas são elevadas.

Na corrosão eletroquímica, a dissolução do metal efetua-se em regiões anódicas,

com liberação de elétrons que participam da reação no catodo, como mostra a figura 2.8.

Geralmente, estas reações envolvem a redução de oxigênio, em meios aerados com pH neutro

ou alcalino. Em condições ácidas, os prótons formados no anodo podem dar origem a

hidrogênio atômico e, posteriormente, a hidrogênio molecular, que pode ficar adsorvido à

superfície do material metálico, polarizando-o e, assim, reduzindo a velocidade do processo

corrosivo. Em ambientes anaeróbios, a corrosão envolve dissociação da água e redução dos

prótons no catodo (GENTIL, 1996).

Célula Eletrolítica

Figura 2.8 - Processo eletroquímico da corrosão

Os microrganismos estão amplamente distribuídos na natureza e apresentam

tendência a aderir às superfícies que ofereçam condições favoráveis ao seu desenvolvimento,

colonizando-as. O desenvolvimento das populações microbianas resulta na formação de

estruturas microbianas denominadas de biofilmes ou

biofouling. Os biofilmes são estruturas

complexas constituídas de agregados celulares embebidos em uma matriz polimérica

extracelular, resultante do metabolismo microbiano, contendo ainda matéria orgânica e

inorgânica e, principalmente, água (CHARACKLIS & MARSHALL, 1990;

LEWANDOWSKY

et al., 1995). A presença física do biofilme na superfície do metal e/ou

sua atividade metabólica conduz a importantes modificações da interface metal/solução,

formando uma barreira ao contato entre o metal e o líquido circundante. É por isso que deve-

se considerar que a corrosão microbiológica ocorre sobre uma superfície modificada, com

características físico-químicas e biológicas muito particulares e que poderia ser denominada

de biologicamente condicionada. Ignorar este fato e pretender interpretar um processo de

corrosão microbiológica com os mesmos parâmetros e considerações que um caso de corrosão

inorgânica pode conduzir a um fracasso total e inclusive a um agravamento dos problemas

que afetam o sistema em questão (VIDELA,2003).

A denominação corrosão microbiologicamente induzida (CMI) empregada para

expressar a participação dos microrganismos nos fenômenos da corrosão, pode induzir tratar-

se de um diferente tipo de ação. No entanto, a CMI na maioria dos casos promove a

aceleração da cinética das reações, sem alterar a natureza eletroquímica do processo corrosivo

(NAGIUB & MANSFELD, 2002; ORNEK

et al., 2002). Logo, na CMI também se tem um

processo de oxidação que leva a dissolução do metal (corrosão) na região anódica e,

simultaneamente, um processo catódico complementar, resultando na redução de algum

componente do meio através da reação catódica (VIDELA, 2003).

Os microrganismos participam do processo de corrosão de forma ativa, produzindo

substâncias corrosivas, originadas durante seu crescimento ou metabolismo, as quais podem

ser de natureza química diversa, como ácidos, álcalis, sulfeto entre outros, transformando um

meio originalmente inerte em agressivo. Pode também haver a criação de pilhas de aeração

diferencial como resultado do consumo desigual de oxigênio, devido à distribuição não

homogênea do biofilme ao longo da superfície metálica bem como pela formação de

tubérculos (VIDELA, 2003). As células de concentração de oxigênio podem se formar sobre

superfícies metálicas mesmo pela presença de microrganismos mortos, por exemplo,

biofilmes tratados com biocidas. Neste caso, os biofilmes não contribuirão na criação de

pilhas de aeração diferencial, mas promoverão uma barreira difusional ao oxigênio.

Em comparação com os ambientes secos, os ambientes aquosos são os mais

agressivos e que promovem maior corrosão das estruturas metálicas, uma vez que o

crescimento dos organismos vivos é extremamente dependente de água. Como conseqüência,

os ambientes marinhos constituem-se em um problema ainda mais sério, uma vez que a água

do mar além de microrganismos contém alta salinidade, e várias outras impurezas como sais,

gases dissolvidos e matéria orgânica (CRAVO, 2001).

Boa parte da corrosão marinha pode ser iniciada pela adesão e crescimento de

bactérias e outros organismos marinhos. As superfícies do metal em contato com sistemas

aquáticos representam os sítios da atividade microbiana. Em muitos casos, após uma semana

de contato com a água do mar, as superfícies do metal começam a apresentar aderência de

bactérias, protozoários e algas iniciando assim o processo de formação do biofilme (WALCH,

1991).

A corrosão induzida por microrganismos (CIM) tem recebido importante atenção

devido às perdas econômicas a ela atribuídas. Nos Estados Unidos uma larga porção das

perdas por corrosão ($300 bilhões por ano) são atribuídas a ação bacteriana . Entre os fatores

associados à ação bacteriana em superfícies metálicas estão incluídos:

•

Presença de sulfeto de hidrogênio (H

S) contido na água;

• Produção de H

S pelas bactérias redutoras de sulfato a partir de sulfato;

• Presença de bactérias oxidantes de enxofre (Thiobacillus ferrooxidans);

• Formação de sulfeto ferroso detectado como uma fase intermediária nos processos de

biocorrosão;

• Teor de oxigênio que é responsável por altas taxas de corrosão.

2.5. TÉCNICAS PARA MINIMIZAR A PRODUÇÃO DE SULFETO

O gás sulfídrico é gerado pela atividade de bactérias redutoras de sulfato (BRS) tanto

em ambientes anaeróbicos como aeróbicos (em condição anóxica). Por isso, são vários os

estudos desenvolvidos com o intuito de definir uma metodologia adequada, ainda não

existindo um método prático para impedir a redução microbiológica de sulfato. De acordo

com Speece (1996), algumas estratégias para o controle da toxicidade pelo sulfeto são:

elevação do pH para deslocamento significativo do H

S para HS

; limpeza e reciclo do gás

para o controle de sulfeto por meio de absorção em esponja de ferro ou pedaços de madeira

embebidos com FeCl

ou líquido alcalino; precipitação de sulfeto com sais de ferro (Fe

); inibição da atividade de BRS com molibdênio; precipitação de sulfeto com MgO;

controle do sulfeto com operação em duas fases (pré-tratamento para reduzir biologicamente

o sulfato, antes da etapa metanogênica). A inibição das BRS por molibdato, elementos de

transição e antibióticos é uma possibilidade, mas que na maioria dos casos não é aplicável em

maiores escalas devido ao custo (LENS et al.,1999). Até o presente momento a aplicação de

biocidas tem sido a forma de controle mais adotada, embora nem sempre satisfatória, quer

pelo custo quer pela eficiência alcançada (

Energy Institute, 2003; www.bio.ucalgary.ca,2004).

Na verdade, a seleção da estratégia a ser adotada depende basicamente da eficiência

pretendida.

Uma alternativa que vem sendo cada vez mais explorada no controle da atividade de

BRS, e conseqüentemente na remoção de H

S e redução da corrosão microbiológica, tem sido

a aplicação de nitrato. O seu uso em substituição aos biocidas, normalmente empregados,

representa não só ganhos econômicos, mas a redução das agressões ao ambiente. A aplicação

de nitrato favorece a atividade das bactérias redutoras de nitrato (BRN), o que em

conseqüência inibe o metabolismo das BRS e, por conseguinte, impede a geração de H

(MAXWELL

et al., 2003).

Segundo Maxwell

et al. (2003), a presença de nitrato estimula a atividade das BRN,

por ser seu metabolismo energeticamente mais favorável do que o consumo de sulfato pelas

BRS. Por sua vez, a atividade mais intensa das BRN resulta na redução das fontes

nutricionais, impedindo o desenvolvimento das BRS. Pode ainda ocorrer a atividade

concomitante de espécies de BRN que apresentam a capacidade simultânea de oxidação de

sulfeto (BRN-OS), ocasionando a remoção de sulfeto e a elevação do potencial redox do

sistema, o que resulta no estabelecimento de condição imprópria para o crescimento das BRS

(JENNEMAN & GERVETZ, 1999). Mesmo havendo a presença de sulfato e nitrato, o nitrato

será preferencialmente consumido propiciando o predomínio das BRN. Algumas espécies de

BRS são capazes de utilizar nitrato em substituição ao sulfato, portanto a presença de nitrato

não necessariamente levará à eliminação deste grupo microbiano, mas de qualquer forma o

objetivo será atingido, ou seja, haverá redução de sulfeto (POSTGATE,1984; MOURA

et al.,

1997; MAXWELL

et al., 2003; www.bio.ulcagary.ca,2004).

Não há dúvidas quanto à efetiva ação do nitrato na inibição seletiva das BRS e,

principalmente, no controle do sulfeto biogênico. Adicionalmente seu uso é mais vantajoso do

que o tratamento com biocidas, convencionalmente adotado. Entretanto o tratamento com

nitrato e/ou nitrito está condicionado ao custo, disponibilidade e, em especial, ao modo de

aplicação, uma vez que dependendo do sistema a ser tratado poderá ser necessária a adição de

outros sais e/ou biomassa exógena a fim de garantir a eficácia do processo biológico.

Comercialmente, o nitrato é aplicado na forma de sal de cálcio, sódio, potássio e

amônio (MCLNERNEY

et al., 1993; HAEGH, 2000; MAXWELL et al, 2003;). Estudos de

laboratório não mostraram diferenças apreciáveis na produção de sulfeto em função do sal

utilizado (MAXWELL

et al, 2003). Todavia, foi determinado um maior acúmulo de nitrito

quando NaNO

e KNO

foram empregados. De qualquer forma, a escolha do sal a ser

aplicado deverá também levar em consideração custo, disponibilidade no comércio e

problemas técnicos, como a tendência de formar incrustações. No campo, a dosagem de

nitrato, quando aplicado como sal de sódio, varia de 87 a 500 mg/L. Normalmente, este tipo

de tratamento requer adição contínua do ânion.

2.6 BACTÉRIAS REDUTORAS DE NITRATO ( BRN)

As Bactérias Redutoras de Nitrato incluem espécies anaeróbias e aeróbias, sendo

comumente encontradas em poços de petróleo, águas do mar e de produção, mas se

apresentam em baixas quantidades quando comparadas às outras espécies, o que dificulta

desta maneira sua proliferação (GARBOSSA, 2003).

A atividade das BRN é estimulada pela presença de nitrato, pois seu metabolismo é

energeticamente mais favorável que o consumo de sulfato pelas BRS (MAXWELL

et al.,

2003).

Por sua vez, a atividade mais intensa das BRN resulta no consumo das fontes

nutricionais, impedindo o desenvolvimento das BRS. Pode ainda ocorrer a atividade

concomitante de espécies de BRN que apresentam a capacidade simultânea de oxidação de

sulfeto (BRN-OS), ocasionando a remoção de sulfeto e a elevação do potencial redox do

sistema, o que resulta no estabelecimento de condição imprópria para o crescimento das BRS

(JENNEMAN & GERVETZ, 1999). De modo que, mesmo havendo a presença concomitante

de sulfato e nitrato, o nitrato será preferencialmente consumido propiciando o predomínio das

BRN.

Nitrato é a forma mais completamente oxidada do nitrogênio. Ele é formado durante

os estágios finais da decomposição biológica, tanto em estações de tratamento de água como

em mananciais de água natural. Sua presença não é estranha, principalmente em águas

armazenadas em cisternas em comunidades rurais. Nitratos inorgânicos, assim como o nitrato

de amônia, são largamente utilizados como fertilizantes. Baixas concentrações de nitrato

podem estar presentes em águas naturais. No entanto, um máximo de 10 ppm de nitrato

(nitrogênio) é permissível em água potável e nos aquários a quantidade de nitratos na maioria

das vezes aumenta mais ou menos rapidamente dependendo da nitrificação (GARBOSSA,

2003).

O nitrato, através da desnitrificação, pode ser reduzido a N

Muitas variedades de

bactérias heterotróficas são hábeis em desnitrificar efluentes em condições anóxicas

(

Pseudomonas, Paraccocus, Alcaligenes, Thiobacillus, Bacillus). Este processo ocorre na

presença de uma fonte de carbono que funciona como doador de elétrons, enquanto o NO

age como aceptor de elétrons na cadeia respiratória. Este conjunto de bactérias capazes de

utilizar o nitrato como aceptor final de elétrons recebe o nome de Bactérias Redutoras de

Nitrato.

É na etapa de desnitrificaçao biológica que ocorre a efetiva remoção biológica do

nitrogênio, em ambiente anóxico, caracterizado pela utilização do nitrogênio inorgânico, nas

formas de nitrito e nitrato, e sua conversão para as formas mais reduzidas, N

O, NO, N

Entretanto, a redução desassimilatória do nitrato a nitrogênio amoniacal na forma de íon

amônio (NH

) pode ocorrer no mesmo habitat, em que ocorre a desnitrificação, e até mesmo

gerar competição pelo NO

. Nesses processos desassimilatórios, o nitrogênio reduzido não

é utilizado pelas células (TIEDJE, 1994).

A desnitrificação ocorre em duas etapas, na primeira o nitrato é reduzido a nitrito, e

na segunda ocorre a redução do nitrito a nitrogênio gasoso (SURAMPALLI

et al., 1997).

2223

NONNONONO →→→→

−−

(2.5)

A redução desassimilatória do nitrato a nitrogênio amoniacal, conhecida como

RDNA (redução desassimilatória do nitrato a amônia), passa pelas seguintes etapas,

conforme ilustrado nas reações a seguir.

+−−

→→→→

4223

NHOHNONOHNONO (2.6)

A presença de um doador de elétrons é essencial para a redução do nitrato na

desnitrificação. O doador de elétrons é o material orgânico biodegradável, pois as bactérias

desnitrificantes, são em sua maioria heterotróficas.

Segundo Her e Huang (1995), os fatores que influenciam na eficiência da

desnitrificação são o tipo de fonte de carbono (estrutura química), peso molecular e a relação

C/N. Alguns Altas concentrações de substâncias tóxicas podem causar a inibição do processo.

No entanto, como as bactérias nitrificantes são mais sensíveis às substâncias tóxicas que as

desnitrificantes, se ocorrer a nitrificação, não ocorrerá problema com a desnitrificação

(GARBOSSA, 2003).

Diversos autores afirmam que a cinética de desnitrificação segue o modelo de

Monod. Entretanto, como na maioria dos casos a concentração de nitrato é muito maior que a

sua constante de saturação, a velocidade de desnitrificação independe da concentração de

substrato. Por este motivo, terá dependência de ordem zero (ROS, 1995, HENZE

et al,. 1997).

autores relatam que a melhor relação C/N encontra-se próxima a 1 e explicam que o

uso de uma relação C/N abaixo do ideal leva ao acúmulo de nitrito, devido a falta de doador

de elétrons implicar em impedimento da completa desnitrificação (HER & HUANG, 1995;

SANTOS et al., 2002).

2.6.1 CARACTERIZAÇÃO

As bactérias redutoras de nitrato estão completamente distribuídas em ambientes

terrestres e aquáticos, sendo facilmente encontradas em ambientes marinhos e poços de

petróleo. São bactérias facultativas anaeróbias autotróficas e heterotróficas, responsáveis pela

desnitrificação utilizando matéria orgânica como fontes de carbono e energia. A

desnitrificação ocorre principalmente com gêneros de organismos heterotróficos como

Achomobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Flavobaterium,

Lactobaillus, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas e Spirrillum.

Em ambiente anóxico, esses

organismos promovem a desnitrificaçao produzindo N

(METCALF & EDDY, 1991). As

nitrificantes autotróficas mais conhecidas são as Nitrobacter sp e Nitrossomonas sp, que

oxidam amônia a nitrito e nitrito a nitrato.

Atualmente, foram descobertos mais dois grupos de bactérias redutoras de nitrato, a

Petrobacter succinatimandens com metabolismo aeróbio, extraída de um poço de petróleo

situado no leste da Austrália e a

Garciella nitratireductens (figura 2.9) com metabolismo

anaeróbio, encontrada no Golfo do México. Como as demais bactérias redutoras de nitrato,

receberam pouca atenção das pesquisas cientificas a respeito de seu papel na biologia, não

obstante algumas destas bactérias foram usadas também para oxidar sulfatos

(

www.engineerlive.com:acessado em outubro de 2005).

Figura 2.9 -

Garciella nitratireductens, isolada de poços de petróleo no Golfo do México.

2.6.2 CRESCIMENTO

As bactérias redutoras de nitrato são microrganismos anaeróbios facultativos que

usam nitrato como aceptor final de elétrons. São inibidas por substâncias tóxicas e crescem na

presença de oxigênio dissolvido, mas nesta condição utilizam o oxigênio como aceptor final

de elétrons e não reduzem o nitrito nem o nitrato (GARBOSSA, 2003).

Esses microrganismos são sensíveis às condições ambientais, assim como a outros

fatores inibidores de crescimento. Para que o sistema biológico opere satisfatoriamente é

necessário atender alguns requisitos relativos ao pH, ausência de Oxigênio dissolvido,

temperatura, relação C/N adequada e baixas concentrações de substâncias tóxicas

(GARBOSSA, 2003).

VAN ANDELL & MARAIS (1999) comentaram que a desnitrificação aumenta com

a temperatura até um valor ótimo próximo a 40

C. Contudo, SURAMPALLI et al. (1997),

relataram que a faixa ótima se encontra no intervalo de 10 a 30

Diversos autores citam uma faixa ótima de pH para a desnitrificação, HENZE

et al.

(1997) relatam que esse valor fica entre 7 e 9; para SURAMPALLI

et al. (1997) o pH ideal se

encontra entre 6,5 e 8; VAN HAANDELL & MARAIS (1999) indicaram que a faixa ótima,

observada por diversos autores, está no intervalo de 7,0 a 7,5, e para pH menor que 6 e maior

que 8,5, há grande redução de atividade de desnitrificação.

2.6.3 CULTIVO

O meio conhecido para o crescimento das BRN é um meio mineral com a seguinte

composição (em g/L): 0,5 NH

Cl, 0,3 KH

, 0,4 MgCl

.6H

O, 0,5 KCl, 0,15 CaCl

.2H

0,85 NaNO

, 1 Na

, 0,1 extrato de lêvedo, 1mg/L resazurina e 10 mL/L de solução traço

de metais (DAVIDOVA et al., 2001)

2.6.4 CICLO DO NITROGÊNIO E DESNITRIFICAÇÃO DO NITRATO

Os animais obtêm nitrogênio para a elaboração das proteínas essenciais à vida a

partir dos vegetais ou de outras proteínas animais presentes nos alimentos, enquanto as

plantas sintetizam suas proteínas a partir de compostos nitrogenados inorgânicos que retiram

do solo e, até certo ponto, do nitrogênio livre na atmosfera.

O nitrogênio é um ametal do grupo V da tabela periódica, de símbolo químico N. É o

elemento mais abundante na atmosfera terrestre e está presente em todos os seres vivos.

Apresenta dois isótopos estáveis e forma o gás nitrogênio (N

), insípido, inodoro e incolor.

Por sua alta energia de ligação, o nitrogênio molecular não reage facilmente com outras

substâncias e, sob condições normais, é relativamente inerte à maioria dos reagentes

(www.tabelaperiodica.hpg.ig.com.br/n.htm, acessado em 12/2005).

Atribui-se a Daniel Rutherford a descoberta do nitrogênio em 1772, porque o

cientista foi o primeiro a publicar suas descobertas mas, na Grã-Bretanha, os químicos Joseph

Priestley e Henry Cavendish e, na Suécia, Carl Wilhelm Scheele, também descobriram o

elemento na mesma época. Lavoisier, o primeiro a reconhecer que se tratava de um elemento

químico independente e a identificá-lo em certos compostos minerais, deu-lhe o nome de

azoto (do grego

a, “sem”, e zoe, “vida”) em razão de sua incapacidade para manter a vida e

alimentar a combustão. O nome nitrogênio foi criado em 1790, por Jean-Antoine Chaptal,

após a descoberta de sua relação com o ácido nítrico

(

www.tabelaperiodica.hpg.ig.com.br/n.htm).

Entre os elementos, o nitrogênio é o sexto em abundância no universo. Constitui

cerca de 78% do volume atmosférico. Encontra-se nitrogênio livre em muitos meteoritos, nos

gases de vulcões, minas e em algumas fontes minerais, no Sol, em estrelas e nebulosas. Em

combinação com outros elementos, ocorre nas proteínas; no salitre do Chile (nitrato de sódio,

NaNO

), muito usado como fertilizante; na atmosfera, na chuva, no solo e no guano (adubo

natural formado a partir da decomposição dos excrementos e cadáveres de aves marinhas),

sob a forma de amônia e sais de amônio; e na água do mar, como íons de amônio (NH

nitrito (NO

¯) e nitrato (NO

¯).

Cerca de 10% do nitrogênio atmosférico que é trazido para o solo, sob a forma de

ou NH

, foi convertido a tais formas iônicas através de três processos diferentes (Figura

2.8).

• Os resíduos da combustão industrial, a atividade vulcânica e a queima de florestas

liberam compostos gasosos na atmosfera. Dentre eles está a amônia, que em contato com a

água da chuva é convertida em íon NH

e acaba por atingir o solo.

• Pode ocorrer a oxidação do N

, tanto pelo O

como pelo O

, na presença de energia de

raios ou radiação ultravioleta. Assim, alguns óxidos de nitrogênio são formados e originam o

quando em contato com a chuva, sendo transportados para o solo.

• Os oceanos lançam aerossóis no ar. Quando a água desses aerossóis evapora, os sais

permanecem em suspensão e são levados ao sabor dos ventos. Com as chuvas, alguns desses

sais podem ser depositados na terra como ocorre com o NO

. Esses processos recebem o

nome de "sais cíclicos" porque, normalmente, os sais são depositados em terras da faixa

costeira, retornando à sua origem, o mar (

www.ciagri.usp.br, 12/2005).

Além disso, o N

pode ser fixado pela indústria (processo de Haber-Bosch) ou por

organismos procariontes (fixação biológica). O processo industrial contribui com cerca de

15% do nitrogênio atmosférico colocado no solo, enquanto que o processo biológico se

encarrega de obter os 75% restantes. Portanto, a fixação biológica é de suma importância para

a nutrição nitrogenada dos solos (

www.ciagri.usp.br, 12/2005).

A matéria orgânica também é fonte de nitrogênio para o solo. Nela, o nitrogênio está

insolúvel, mas graças a atuação de organismos decompositores (fungos e bactérias) ele é

convertido em NH

, no processo conhecido como amonificação (Figura 2.10)

(http://www.ciagri.usp.br/~lazaropp/FisioVegGrad/MetNitro.htm#topico2).

Figura 2.10 – Ciclo do Nitrogênio na Natureza

Ainda considerando o ciclo do nitrogênio, é importante lembrar que o NH

presente

nos solos é, freqüentemente, convertido a NO

(Figura 2.8). O processo, conhecido pelo

nome de

nitrificação, que ocorre em duas etapas e conta com a atuação de bactérias

nitrificantes. Inicialmente, o NH

é convertido a NO

(nitrito) pela ação de bactérias do

gênero

Nitrosomonas. Em seguida, o NO

é convertido a NO

pelas bactérias do gênero

Nitrobacter.

Fechando o ciclo do nitrogênio, observamos que o nutriente pode ser perdido do

solo, conforme Figura 2.10, e estas perdas são devidas à

lixiviação ou à desnitrificação.

3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – CULTURA MICROBIANA

Foi utilizada uma cultura mista de bactérias anaeróbias enriquecida com BRS,

proveniente da água de produção de Carmópolis, Sergipe. O enriquecimento da cultura foi

obtido através de cultivos sucessivos em meio Postgate E (POSTGATE, 1984). A cultura

mista utilizada apresentava concentração celular da ordem de 10

NMP/mL, 10

NMP/mL e

NMP/mL, respectivamente para BRS, bactérias anaeróbias heterotróficas (BHA) e

bactérias redutoras de nitrato (BRN).

A cultura mista de bactérias anaeróbias enriquecida com BRS (cultura estoque) foi

mantida através de repiques mensais em meio Postgate E (POSTGATE, 1984), incubados a

± 1

3.2 – MEIOS DE CULTIVO

3.2.1 – EFLUENTE SINTÉTICO

O efluente foi desenvolvido a partir da modificação da composição do meio Postgate

E (POSTGATE, 1984) pela substituição da fonte de carbono lactato de sódio por ácidos

orgânicos (valérico, butírico, propiônico e acético) e supressão do agar-agar. A Tabela 3.1

apresenta a composição do efluente utilizado, apresentando as concentrações dos ácidos

orgânicos correspondentes à concentração de lactato apresentada na formulação original do

meio Postgate E.

O meio Postgate E (Tabela 3.2) foi utilizado como base no preparo do efluente

sintético visto que sua composição atende as necessidades nutricionais das Bactérias

Redutoras de Sulfato (BRS), e ainda por conter vários minerais normalmente constituintes da

água de produção, um efluente da indústria petrolífera.

Do mesmo modo, o lactato foi substituído pelos ácidos orgânicos de cadeia curta, uma

vez que estas substâncias, normalmente presentes em águas residuais da indústria petrolífera,

podem ser utilizadas como fonte de carbono pelas BRS (KLEIKEMPER

et al., 2002).

Tabela 3.1 – Composição Química do Efluente Sintético

Com

ostos Concentração (

/L)

Ácido acético* 0,625

Ácido propiônico* 0,514

Ácido butírico* 0,458

Ácido valérico* 0,425

0,5

Cl 1,0

CaCl

.2H

O 0,67

MgCl

.6H

O 1,68

1,0

FeSO

.7H

O 0,5

Extrato de Lêvedo 1,0

Ácido Ascórbico 0,1

*Concentração calculada com base na concentração de lactato existente

na formulação original do meio Postgate E.

A concentração de cada um dos ácidos orgânicos foi calculada com base na relação

molar do seu conteúdo em carbono, de tal modo a obter uma mistura contendo os quatro

ácidos em iguais proporções de carbono. No planejamento experimental a concentração de

ácido variava conforme a concentração de carbono adotada em cada experimento.

Exceto pelos ácidos orgânicos, os demais constituintes foram dissolvidos e

avolumados em água destilada, sob purga de nitrogênio, a fim de estabelecer condição de

anaerobiose. Após ajuste do pH a 7,0

± 0,1 com a adição de NaOH, a solução preparada foi

distribuída em frascos do tipo penicilina, os quais foram vedados com tampas de borracha e

lacrados e em seguida, foi feita a sua esterilização (121ºC /20 min.).

A mistura de ácidos, após ajuste do pH em 7,0 com NaOH, foi adicionada a cada

frasco de modo a estabelecer a concentração de carbono desejada.

3.2.2 – MEIO PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO

(BRS)

O crescimento, a manutenção e a quantificação das BRS foram realizados em meio

Postgate E (POSTGATE, 1984), cuja composição é apresentada na Tabela 3.2. Este meio,

conforme descrito por Postgate (1984), é indicado para seleção e contagem de BRS. Vieira

(2003) utilizou este meio para contagem de BRS, bem como alguns de seus constituintes no

enriquecimento de água de produção, a fim de favorecer a biodegradação anaeróbia de

contaminantes nela presentes por cultura mista de BRS.

O meio, após preparo e ajuste do pH a 7,8

± 0,1 com a adição de NaOH, foi

distribuído em frascos do tipo penicilina. De modo a garantir condição de anaerobiose, o

preparo do meio e a sua distribuição foram realizados sob purga de nitrogênio

e os frascos

foram vedados com tampas de borracha e lacrados. Em seguida, os meios foram esterilizados

a 1 atm por 20 minutos.

Tabela 3.2 – Composição Química do Meio Postgate E

Com

ostos Concentra

ão

)

0,5

Cl 1,0

CaCl

.2H

O 0,67

MgCl

.6H

O 1,68

1,0

FeSO

.7H

O 0,5

Ágar-agar 1,9

Extrato de Lêvedo 1,0

Ácido Ascórbico 0,1

Solução de Lactato de Sódio (50%) 3,5 mL/L

Solução de Resarzurina (0,025%) 4,0 mL/L

Fonte: POSTGATE, 1984.

No momento do uso, a cada frasco foi adicionada alíquota de solução estéril de

tioglicolato de sódio (12,4 g/L), na proporção de 0,1 mL para cada 10 mL de meio. Na

composição original do meio Postgate E consta 0,1 g de ácido tioglicólico. A substituição do

ácido tioglicólico por tioglicolato de sódio, a ser adicionado no meio estéril, foi proposta pela

PETROBRAS. A adição destas substâncias de caráter redutor tem por finalidade estabelecer

no meio potencial redox de 0 a –150 mV, necessário para o desenvolvimento das BRS

(NEVIUS et al., 2005). A resarzurina, presente na composição do meio, é usada como um

indicador para evidenciar se o meio está adequadamente reduzido. Uma coloração

ligeiramente rósea a incolor do meio indica seu estado de anaerobiose, enquanto o estado

oxidado é indicado pela cor roxa, tão mais intensa quanto maior a concentração de oxigênio

dissolvido.

3.2.3 – MEIO PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS

ANAERÓBIAS (BHA)

O meio fluido ao tioglicolato (MERCK) foi usado para a contagem das culturas de

BHA (Tabela 3.3).

Tabela 3.3 – Composição Química do Meio Fluido ao Tioglicolato

Com

ostos Concentração (

/L)

Peptona de Caseína 15,0

Extrato de Levedura 5,0

D(+)Glicose 5,5

L Cistina 0,5

Tioglicolato de Sódio 0,5

Resarzurina 0,001

A condição de anaerobiose foi garantida pela purga de nitrogênio durante todo o

preparo e distribuição do meio em frascos do tipo penicilina, vedados com tampas de borracha

e lacrados. Os meios foram posteriormente esterilizados a 1 atm por 20 minutos, em

autoclave.

3.2.4 – MEIO PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS REDUTORAS DE NITRATO

(BRN)

O meio nutritivo usado para a contagem de BRN foi o descrito por Davidova et al.

(2001), cuja composição está apresentada na Tabela 3.4.

Tabela 3.4 – Composição Química do Meio para Bactérias Redutoras de Nitrato

Compostos Concentração (g/L)

KCl 0,5

MgCl

O 0,4

0,3

Cl 0,5

1,0

CaCl

. 2H

O 0,15

NaNO

0,85

Extrato de levedura 0,1

NaHCO

5,0

Resazurina 0,001

Solução de elementos traço (Tabela 3.5) 10 mL

Fonte: DAVIDOVA et al., 2001.

Após ajuste do pH em 7,2 com solução de NaOH, o meio de cultura foi autoclavado a

121°C durante 15 minutos. Conforme anteriormente descrito, a condição de anaerobiose do

meio foi estabelecida através da purga com nitrogênio durante todo o seu preparo e

distribuição.

Tabela 3.5 – Composição Química da Solução de Elementos Traço

Compostos Concentração (g/L)

Acido nitriloacético (com pH ajustado para 6,0 com KOH) 2,0

MnSO

O 1,0

Fe(NH

)

(SO

)

.6H

O 0,8

CoCl

O 0,2

ZnSO

.7H

O 0,2

CuCl

.2H

O 0,02

MoO

0,02

SeO

0,02

3.3 – ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA AO CARBONO

A aclimatação foi realizada através de subcultivos da cultura microbiana em meio

Postgate E (Tabela 3.2), contendo concentrações crescentes de carbono orgânico (g/L): 0,1;

0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0, através da adição da mistura dos ácidos valérico, butírico,

propiônico e acético. Como mencionado no item 3.2.1, os ácidos orgânicos foram adicionados

em iguais proporções de carbono, e a concentração de cada um foi calculada com base na

relação molar do seu conteúdo em carbono.

Os testes de aclimatação foram conduzidos em frascos do tipo penicilina com 50 mL

de capacidade, contendo 40 mL de meio reacional. A relação volume de meio/capacidade do

frasco foi estabelecida com o propósito de ocupar o máximo do espaço útil do frasco,

minimizando a entrada de O

no sistema. A condição de anaerobiose foi ainda mais

assegurada com a purga do meio durante seu preparo e sua distribuição nos frascos, e por fim,

pela vedação dos frascos através de tampas de borracha e selos de alumínio.

Como inoculo foram utilizados 4 mL da cultura estoque (item 3.3), correspondendo a

proporção de 10% (v/v) em relação ao volume de meio. Após inoculação, os cultivos foram

incubados em estufa a 30

± 1ºC. Tão logo, era evidenciado o crescimento das BRS, 4 mL do

cultivo eram novamente transferidos para outro frasco contendo o meio com a subseqüente

concentração de carbono (mistura de ácidos).

No final do teste, também foi avaliado o crescimento da cultura em efluente sintético

(Tabela 3.1), ou seja, no meio Postgate E desprovido da principal fonte de carbono (lactato de

sódio), e suprido por ácidos orgânicos, em igual conteúdo de carbono. Todos os ensaios

foram realizados em triplicata.

3.4. – PREPARO DO INÓCULO

As concentrações de bactérias redutoras de sulfato, heterotróficas anaeróbias e

redutoras de nitrato foram determinadas na cultura estoque por contagem através da técnica de

número mais provável (NMP) (HARRISON JR., 1982) nos meios Postgate E (Tabela 3.2),

Fluido ao Tioglicolato (Tabela 3.3) e de Davidova et al (Tabela 3.4).

Para tanto, 4 mL da cultura aclimatada em efluente sintético contendo 1 g/L de

carbono, representado pela mistura de ácidos orgânicos (item 3.2.1), foram inoculados em 40

mL de novo efluente. O cultivo foi incubado em estufa a 30

±1

C por 4 dias.

Amostras de diferentes cultivos utilizados como inoculos foram microbiologicamente

analisadas. Com tal propósito, as amostras foram primeiramente submetidas a diluições

decimais sucessivas em solução redutora (Tabela 3.6) e, em seguida, semeadas nos meios

apropriados para o crescimento de BRS (Tabela 3.2), BHA (Tabela 3.3) e BRN (Tabela 3.4).

Após incubação a 30

±1

C por 28 dias, o crescimento das BRS foi visto através da formação

de precipitado preto, o das bactérias anaeróbias através da turvação e o das BRN pelo

desenvolvimento de coloração vermelho acastanhada e consumo de nitrato, nos respectivos

meios.

Tabela 3.6 – Composição Química da Solução Salina Redutora

Com

ostos Concentração (

/L)

Tioglicolato de Sódio 0,124

Ácido Ascórbico 0,1

Resazurina (solução 0,025% p/v) 4,0 mL

3.5 – TESTES PRELIMINARES

Alguns ensaios foram preliminarmente realizados para definir os valores das

concentrações de nitrato, sulfato e carbono a serem adotadas no planejamento experimental,

com a finalidade de minimizar a geração biogênica de sulfeto de hidrogênio.

3.5.1 – TESTE DE SENSIBILIDADE DA CULTURA MICROBIANA AO NITRATO

Este teste teve como propósito determinar o comportamento das BRS em diferentes

concentrações de nitrato (NaNO

), em relação à geração de H

S. A sensibilidade da cultura

microbiana foi avaliada para nitrato, em diferentes concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0

g NO

/L.

O crescimento das BRS foi visualizado através da formação do precipitado negro de

FeS, após uma semana de incubação em estufa .

3.5.2 – CONCENTRAÇÃO DE SULFATO

O comportamento da cultura foi avaliado nas concentrações de sulfato (Na

) no

nível inferior de 850 mg/L, central de 2000 mg/L e superior de 3150 mg/L. O nível inferior

foi escolhido baseado na quantidade de sulfato presente no efluente sintético, por já estar a

cultura aclimatada. A escolha do valor superior de 3150 mg/L foi feita tendo como premissa

avaliar a atividade microbiana numa concentração de sulfato ligeiramente superior à da água

do mar, de aproximadamente 2800 mg/L, estabelecendo uma concentração de número inteiro

no ponto central.

3.5.3 – CONCENTRAÇÃO DE CARBONO

O crescimento da cultura foi avaliado para as concentrações de carbono de 1000 mg/L

(nível inferior), de 3000 mg/L (nível central) e 5000 mg/L (nível superior). A concentração do

nível inferior de carbono contemplou a quantidade de carbono existente no meio Postgate E,

utilizado como base para o preparo do efluente sintético. O nível superior foi fixado com o

intuito de analisar a atuação das BRS e demais bactérias heterotróficas anaeróbias em maiores

concentrações de carbono, visto que a geração de H

S está diretamente relacionada com a

quantidade de carbono disponível.

Como fonte de carbono foi empregada uma mistura de ácidos orgânicos (acético,

butírico, propiônico e valérico), sendo as quantidades fixadas para cada experimento

calculadas de modo a obter iguais proporções de carbono para cada ácido, conforme

anteriormente descrito (item 3.2).

Neste estudo foi avaliado o crescimento das BRS nas diferentes condições, através de

observação visual dos cultivos após uma semana de incubação à temperatura de 30

±1ºC.

3.6 – PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Para a realização de experimentos que permitam obter dados significativos e

confiáveis, deve-se utilizar um método científico de planejamento. Além disso, quando o

problema envolve dados que podem conter erros experimentais, um modo adequado de

análise é por métodos estatísticos. Em qualquer análise experimental devem-se seguir duas

etapas: o planejamento experimental e a análise estatística dos dados, esta última dependente

do tipo de planejamento realizado (OLIVEIRA, 2004)

As vantagens do uso do planejamento experimental são (BARROS NETO

et al., 1995

apud OLIVEIRA, 2004):

 Redução do tempo de experimentação, pois permite a otimização do número de

experimentos;

 Redução dos custos relativos à execução dos ensaios, fato que está relacionado à

redução da quantidade de experimentos;

 Permite a avaliação e minimização do erro experimental;

 Permite uma otimização multivariada, e

 Não requer conhecimentos elevados em estatística.

O processo de produção de sulfeto envolve diversas variáveis, assim a análise e

planejamento dos experimentos são mais confiáveis utilizando técnicas estatísticas para esse

fim. A técnica de superfície de resposta, que tem como base o planejamento fatorial dos

experimentos, é de fundamental importância neste trabalho, pois permite verificar os efeitos

individuais e as interações entre as variáveis, a avaliação dos erros experimentais e de

regressão e o equacionamento empírico dos resultados em função das variáveis escolhidas

(BOX

et al., 1978).

O número de variáveis a serem estudadas aliadas à necessidade de obter uma

estimativa de parâmetros de uma superfície de segunda ordem e ainda, a redução do esforço

experimental, levaram à utilização do Planejamento Composto Central (PCC). O PCC é um

planejamento fatorial de 1

ordem aumentado por pontos adicionais para permitir a estimação

dos parâmetros de uma superfície de 2

ordem. Portanto, foi realizado um PCC composto por

um planejamento fatorial a dois níveis com três variáveis acrescido de duas réplicas no ponto

central e ainda 6 experimentos nos pontos axiais (

α), totalizando 16 experimentos.

-1 -1 -1

-1 -1 +1

-1 +1 -1

-1 +1 +1

+1 -1 -1

+1 -1 +1

+1 +1 -1

+1 +1 +1

0 0

0 0 0

Planejamento

Fatorial 2

Figura 3.1 – Esquema do planejamento composto central.

Neste planejamento experimental foram realizados experimentos para verificar a

influência de três variáveis no processo de redução na produção de sulfeto de hidrogênio por

uma cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato (BRS). As variáveis mais

significativas neste processo foram:

Pontos Axiais

2.K

Pontos Centrais

 X

– Concentração de sulfato ( SO

2 -

em mg/L);

 X

– Concentração de carbono (C em mg/L) e,

 X

– Concentração de nitrato (

−

em mg/L).

Como já mencionado, os valores destas variáveis foram obtidos através de testes

preliminares apresentados na seção 3.6 e por concentrações existentes na água do mar e meio

Postagate.

Os níveis das variáveis estudadas foram colocados na forma codificada

(adimensionalizada), utilizando as seguintes equações de codificação:

Equação geral:

()

−

(3.1)

sendo: Xn é o valor da variável no experimento na forma codificada;

X é o valor real da variável a ser calculado;

é o valor real da variável no ponto central;

é o valor real da variável no nível superior;

-1

é o valor real da variável no nível inferior.

- Concentração de

)/(15,1

)/(0,2)/(

LgLgSO

−

(3.2)

- Concentração de C:

(/)3,0(/)

2,0( / )

Cg L g L

−

(3.3)

- Concentração de

−

(

)

(

)

()

)/0,1

/5,1/

LgLgNO

−

(3.4)

O valor de

α = 1,287 foi calculado para que o PCC fosse ortogonal, isto é, um

planejamento onde a matriz de variância e covariância são diagonais e os parâmetros

estimados não são correlacionados entre si (BOX

et al., 1978).

O valor de

α, foi calculado através da seguinte equação:

1/4

⎛⎞

⎜⎟

⎝⎠

(3.5)

sendo ,

()

1/2

QGT G

⎡⎤

=+ −

⎣⎦

G = número de pontos fatoriais (G = 2

, se completo);

T = número de pontos adicionais no PCC; T = 2k + número de réplicas centrais.

Abaixo, na Tabela 3.7, estão relacionadas as variáveis do processo e seus respectivos

valores, de acordo com seus níveis: inferior, central e superior.

Tabela 3.7- Variáveis do processo.

NÍVEIS

Variáveis Descriminação

-1 0 +1

+ α

Sulfato –

(mg/L)

520 850 2000 3150 3480

Carbono- C (mg/L) 426 1000 3000 5000 5570

Nitrato –

−

(mg/L)

213 500 1500 2500 2730

Na Tabela 3.8, temos a matriz do planejamento apresentando os valores codificados

e reais das variáveis.

Tabela 3.8 – Matriz do planejamento

VARIÁVEIS CODIFICADAS VARIÁVEIS REAIS

Experimento

−

(mg/L)

C (mg/L)

−

(mg/L)

-1 -1 -1 850 1000 500

-1 -1 +1 850 1000 2500

-1 +1 -1 850 5000 500

-1 +1 +1 850 5000 2500

+1 -1 -1 3150 1000 500

+1 -1 +1 3150 1000 2500

+1 +1 -1 3150 5000 500

+1 +1 +1 3150 5000 2500

- α

0 0 520 3000 1500

+ α

0 0 3480 3000

1500

0 2000 0426

1500

0 2000 5570

1500

0 0

2000 3000 213

0 0

2000 3000 2730

0 0 0 2000 3000

1500

0 0 0 2000 3000

1500

3.6.1 – AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE H

Os experimentos foram realizados em frascos de 50 mL de capacidade, contendo:

 40 mL de meio com adição da concentração de nitrato e ajuste da concentração

de sulfato de acordo com o experimento (Tabela 3.8);

 mistura de ácidos orgânicos, de modo a estabelecer a concentração de carbono

definida em cada experimento (ITEM 3.2.1);

A fim de garantir condição de anaerobiose, os frascos foram vedados com tampas de

borracha e selos metálicos e, em seguida, esterilizados.

Como inóculo foi usada a cultura aclimatada (10% v/v), consistindo de um cultivo de

4 dias no efluente sintético contendo a mistura de ácidos orgânicos, na concentração total de

carbono de 1 g/L (item 3.4). Após inoculação os frascos foram incubados a temperatura

ambiente (28

C), sob agitação de 150 rpm. Decorridos 28 dias, foram realizadas análises

químicas (sulfeto, nitrito, sulfato e nitrato) e microbiológicas (BRS e BHA). As metodologias

analíticas utilizadas neste trabalho estão descritas no final deste capítulo (item 3.14)

Visando uma maior confiabilidade nos resultados obtidos, foram realizadas réplicas

para cada experimento, e também foi feito o controle abiótico nos experimentos centrais, de

modo a estimar e, caso necessário, desprezar as perdas naturais.

3.6.2 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS RESPOSTAS

A análise estatística dos dados foi feita utilizando o programa

Statistica 5.1

a partir

da análise de regressão múltipla, pelo método dos mínimos quadrados, para cada uma das

respostas, tendo como parâmetros os termos isolados, de interação e quadráticos das três

variáveis estudadas. A equação empírica de 2ª ordem proposta para representar cada uma das

respostas segue a seguinte forma:

Y =

+ aX

+ bX

+ cX

+ eX

+ fX

+ gX

+ hX

+ iX

+ jX

(3.6)

Sendo:

Y = resposta estudada;

= valor médio da resposta;

a, b, c,...j = constantes ou parâmetros da equação;

= Concentração de sulfato (mg/L);

= Concentração de carbono (mg/L);

= Concentração de nitrato (mg/L).

A esta equação foram aplicados os resultados obtidos e feita uma avaliação

estatística da estimação dos parâmetros através dos valores de t de Student para cada um,

sendo eliminados aqueles com nível de significância (p) superior a 10%, ou seja, as variáveis

relacionadas a estes são consideradas não relevantes quando p superior a 10%. Os parâmetros

não significativos foram eliminados, obtendo-se assim, uma equação que representa os efeitos

das variáveis na resposta que está sendo analisada e que determina qual das variáveis mais

afeta tal resposta. Pode-se, ainda, prever qual a melhor condição para o processo. O valor do

e a comparação entre F calculado e F tabelado foram utilizados para constatação da

significância ou não do modelo (FELIPE, 1999).

Com o objetivo de verificar o comportamento da resposta estudada, isto é, se ela

apresenta ponto de máximo, de mínimo ou não apresenta nem ponto de máximo e nem de

mínimo (ponto de sela) é necessário descobrir o ponto estacionário.

Os pontos estacionários são obtidos através da derivada da equação da resposta Y

pela variável X

, isto é:

... 0

YY Y

XX X

∂∂ ∂

====

∂∂ ∂

(3.7)

sendo, Y = b

+ x’b + x’Bx

bxbxBx b Bx

∂∂

⎡⎤

=++=+=

⎣⎦

∂∂

(3.8)

sendo b

o termo independente;

x’b são os termos de 1ª. ordem na função de resposta;

x’Bx é a contribuição quadrática.

Então, o ponto estacionário será dado por: x

= - (1/2) B

-1

b, onde B é a matriz (k x k),

onde a diagonal é composta pelos coeficientes dos termos quadráticos da equação e os termos

fora da diagonal são correspondentes aos coeficientes das interações divididos por 2 (ex: a

correspondem ao coeficiente da interação X

). A matriz b é uma matriz coluna

composta pelos coeficientes associados às variáveis isoladas (variáveis lineares).

O ponto estacionário (x

) pode ser:

 Um ponto onde a superfície atinge um máximo;

 Um ponto onde a superfície atinge um mínimo, ou

 Um ponto nem de máximo, nem de mínimo ⇒ Ponto de sela (“saddle point”).

Porém, podem existir problemas relacionados a estes pontos estacionários:

 Pode existir uma região de máximo e não um ponto de máximo;

 Pode ser que o ponto estacionário esteja fora da região experimental.

Para determinar a natureza desse ponto estacionário foi necessário fazer uma análise

canônica, que considera uma translação da superfície de resposta da origem (X

, X

, ... , X

) =

(0, 0, ... , 0) para o ponto estacionário x

(Figura – 3.2). Daí a função de resposta é formulada

em termos de novas variáveis, w

, w

, ... , w

Figura 3.2 – Translação da superfície de resposta da origem para o ponto estacionário.

Então, obtém-se a função de resposta em termos das novas variáveis:

Yy (3.9)

011 22

...

w w w

λλ λ

=+ + ++

sendo:

: é a resposta estimada no ponto estacionário e, λ

, λ

, ... , λ

são constantes.

Os sinais dos coeficientes de

λ e a grandeza dos mesmos ajudam a determinar a

natureza do ponto estacionário. A relação entre os valores de w e x também é importante, pois

indicam ao pesquisador quais são as regiões úteis para exploração.

λi < 0, com i = 1,2,...,k, quando os movimentamos em qualquer direção a partir do

ponto estacionário, teremos um decréscimo de Y, isto é, o ponto estacionário x

é um ponto de

resposta máxima da superfície ajustada. Se

λi > 0, o ponto estacionário x

é um ponto de

mínimo para a superfície ajustada e, se os

λ’s têm sinais diferentes, o ponto estacionário x

não é nem ponto de máximo, nem de mínimo.

Para obtenção dos pontos estacionários bem como a análise canônica dos dados para

cálculo dos pontos de maximização das respostas foi utilizado um algoritmo implementado no

software Maple V Release 4

(ver Apêndice A).

3.7 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE CARBONO NA GERAÇÃO DE H

Este estudo foi realizado em duas condições bastante distintas: o nível inferior

correspondendo ao valor otimizado pelo PCC e, para o nível superior, uma concentração bem

maior de modo a estimar a produção microbiana de sulfeto em efluentes contendo alta

concentração de carbono.

Os experimentos foram realizados em frascos de 50 mL de capacidade, contendo 40

do efluente sintético, constituído pelo meio Postgate sem lactato de sódio e agar-agar,

acrescido da mistura de ácidos orgânicos como fonte de carbono, nas concentrações em

carbono de 444 mg/L e 10.000 mg/L, e também adicionado de sulfato (1616 mg/L) e de

nitrato (2262 mg/L), ambos nas concentrações otimizadas no item anterior (3.6.2).

O inóculo, as condições operacionais e as quantificações químicas e microbiológicas

realizadas foram as mesmas descritas no item 3.6.1.

3.8 – EFEITO DA ADIÇÃO INTERMITENTE DE NITRATO NA BIOGÊNESE DE

Neste estudo foram utilizados 41 frascos de 50 mL de capacidade, contendo 40 mL do

efluente sintético (item 3.2.1). O preparo do inóculo e os procedimentos de inoculação e de

cultivo foram idênticos aos experimentos anteriormente realizados (item 3.4). Os

experimentos foram divididos em quatro etapas, num tempo total de 34 dias. Periodicamente,

amostras dos cultivos eram analisadas química e microbiologicamente, para quantificação de

nitrato, nitrito, sulfato, sulfeto, BRS, BHA e BRN. A descrição detalhada de cada etapa é dada

a seguir:

• Primeira etapa - Duração de 10 dias. Do dia de partida até o 10º dia foram

adicionados 500 mg/L de NO

(nitrato de sódio) nos 41 frascos, a cada dois dias. Nesta fase,

foram sacrificados 10 frascos, 2 a cada 2 dias, antes da adição de nitrato, para a realização das

análises químicas e microbiológicas.

• Segunda etapa – Duração de 20 dias. Teve início no 10º dia de operação (fim da

primeira etapa) com a adição da mistura de ácidos orgânicos, na concentração de 1000 mg/L

de carbono, nos 31 frascos remanescentes da etapa anterior, de tal modo a restabelecer a

condição inicial em termos de conteúdo de carbono. Nesta fase, foi sacrificado um total de 10

frascos, dois a dois em dias pré-determinados, finalizando 30 dias após o início do processo.

• Terceira etapa – Duração de 10 dias. Teve início na metade da segunda etapa

(20º dia), 20 dias a partir do início do processo. Esta etapa consistiu em adicionar nutrientes

nos 21 frascos provenientes da segunda etapa, através da retirada de parte do seu conteúdo

(50% v/v) e injeção de igual volume do meio Postgate (Tabela 3.2 ), a fim de favorecer a

atividade da cultura microbiana. Foram sacrificados 11 frascos, dos quais um no primeiro dia,

logo após a adição dos nutrientes, para avaliar a nova condição reacional, as concentrações

iniciais de nitrato, nitrito, sulfato, sulfeto e de microrganismos, considerando a diluição do

meio e a entrada de impurezas advindas da adição do meio Postgate.

• Quarta etapa - Duração de 10 dias. Esta etapa teve início na metade da terceira

etapa, mais precisamente no 24º dia de operação total. Foram utilizados 10 frascos nas

condições da etapa anterior, onde foi feita nova adição de 500 mg/L NO

a cada dois dias, de

modo a estabelecer procedimento idêntico ao efetuado na primeira etapa. Analogamente, os

frascos foram sacrificados dois a dois, para o estudo do comportamento da cultura

microbiana, que foi feito através da análise das mesmas determinações quantitativas

realizadas nas etapas anteriores.

A Figura 3.3 apresenta o cronograma das etapas, que permite observar que no

decorrer de uma etapa, outra já tinha início.

0 10203040

(

dias

)

apa

Figura 3.3 – Distribuição das etapas com o tempo de operação.

3.9. CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE SULFETO EM PRESENÇA E AUSÊNCIA DE

NITRATO

O estudo estatístico do planejamento experimental permitiu otimizar alguns

parâmetros para minimizar a geração de H

S. Com os valores estatisticamente definidos foi

realizada a cinética para avaliar a acidificação biogênica na presença de nitrato. Para tanto, o

experimento foi conduzido em frascos lacrados de 50 mL de capacidade, contendo o efluente

sintético, constituído do meio Postgate, desprovido de lactato e agar-agar, e enriquecido com

1616 mg/L de sulfato, 444 mg/L de carbono (mistura de ácidos orgânicos) e com 2262 mg/L

de nitrato (NaNO

Foi utilizado um total de 24 frascos, que foram inoculados simultaneamente com 10%

(v/v) de um cultivo de quatro dias de cultura microbiana previamente aclimatada, conforme

descrição dada no item 3.4. Logo após a inoculação, um dos frascos foi sacrificado para

determinação dos valores iniciais dos seguintes parâmetros: sulfeto, nitrato, nitrito, BRS,

BHA e BRN. Posteriormente, em períodos pré-determinados, dois a dois, os frascos foram

sendo sacrificados para a coleta de amostras para análises químicas e microbiológicas. O

processo foi monitorado ao longo de 28 dias.

Um estudo cinético também foi realizado nas mesmas condições operacionais acima

descritas, mas sem adição de nitrato, a fim de obter dados experimentais para uma apreciação

abalizada da tecnologia adotada.

3.10. – METODOLOGIA ANALÍTICA

Os métodos analíticos empregados para quantificação de determinados grupos

bacterianos na cultura microbiana utilizada e, durante o monitoramento dos experimentos do

planejamento experimental, do teste de produção de sulfeto com adição intermitente de nitrato

e da cinética de produção de sulfeto de hidrogênio na presença e ausência de nitrato estão

descritos a seguir.

3.10.1 – SULFETO TOTAL

A concentração de sulfetos totais foi determinada através da adaptação do método

colorimétrico para dosagem de gás sulfídrico (JACOBS

et al., 1957; APHA, 1992).

Com o auxílio de uma seringa, 1 mL de amostra era introduzida em um frasco do

tipo penicilina vedado com tampa de borracha e lacre metálico. Em seguida, era adicionado

igual volume de ácido clorídrico concentrado com o intuito de solubilizar os compostos de

sulfeto insolúveis. O frasco era então aquecido em banho a 70

C por 10 minutos.

O gás sulfídrico formado, pela reação do sulfeto presente com o ácido clorídrico, era

coletado através de purga de gás inerte (nitrogênio) em dois lavadores de gás acoplados em

série, cada um contendo 10 mL de solução de hidróxido de cádmio. Neste caso, se evidencia a

formação de sulfeto de cádmio pelo aparecimento de precipitado amarelo, cuja intensidade da

coloração está relacionada à concentração de sulfeto presente na amostra.

Para a dosagem do sulfeto, ao conteúdo combinado dos dois borbulhadores,

adicionava-se 0,6 mL de ácido aminosulfúrico e transferia-se para balão volumétrico de 25

mL. Após a adição de 2 gotas de indicador cloreto férrico, completava-se o volume com água

destilada e deixava-se em repouso por 30 minutos.

As leituras das absorbâncias foram feitas em espectrofotômetro da marca Genesys,

no comprimento de onda de 670 nm. Determinava-se a concentração de sulfeto através da

curva de calibração anteriormente preparada com diluições de uma solução-mãe preparada

com Na

S. 9H

O p.a., da marca Vetec. A curva de calibração encontra-se no Apêndice B

deste trabalho.

3.10.2 – SULFATO

A determinação do sulfato foi feita utilizando-se o kit de dosagem Sulfaver da marca

HACH, conforme sugerido por Vieira (2003).

Os íons sulfato reagem com o bário contido no kit de dosagem, formando um

precipitado de sulfato de bário. A turbidez do meio é proporcional à quantidade de sulfato

presente na amostra. A leitura foi realizada em espectrofotômetro da marca Genesys, no

comprimento de onda de 450 nm. A curva de calibração encontra-se no Apêndice C deste

trabalho.

3.10.3 - NITRATO

A concentração de nitrato foi determinada através da adaptação do método

colorimétrico descrito nas normas do Instituto Adolfo Lutz (1985).

Para tanto, um volume de 50 mL da amostra distribuído em uma cápsula de

porcelana de 150 mL de capacidade deveria ser evaporado até a secura, em estufa a 100

Em seguida, adicionava-se 1mL da solução de ácido fenoldissulfônico, preparada pela fusão

de 25 g de fenol, 150 mL de ácido sulfúrico p.a.. e 75 mL de ácido sulfúrico fumegante (15%

de SO

) em capela. Misturava-se, com auxílio de um bastão de vidro, o ácido e o resíduo

aderido a parede interna da cápsula. Lavava-se com pequena porção (10 mL) de água

destilada e adicionava-se, sob agitação, 5 mL da solução de hidróxido de sódio 12 N até

desenvolvimento de uma cor amarela estável. Transferia-se para um balão volumétrico de 50

mL, lavando-se a cápsula. Nos casos em que a coloração amarela era muito intensa, fazia-se

diluições maiores. A leitura da coloração amarela em espectrofotômetro a 400 nm era

utilizada para determinar a quantidade de nitrogênio nítrico correspondente, usando uma

curva padrão estabelecida. A curva padrão encontra-se no

Apêndice D deste trabalho. Para

cada ensaio era feito um branco para zerar o espectrofotômetro, usando o mesmo

procedimento com água destilada no lugar da amostra.

3.10.4 - NITRITO

A concentração de nitrito foi determinada através do método colorimétrico descrito

nas normas do Instituto Adolfo Lutz (1985).

Transferia-se 50 mL da amostra para balão volumétrico, adicionava–se 1 mL da

solução de ácido sulfanílico (8g de ácido sulfanílico, 750mL de água e 250 mL de ácido

acético glacial, os reagentes devem ser colocados nesta ordem, e a solução deve ser preparada

em capela) e 1 mL de solução de

∝ - naftilamina ( 5 g de ∝ - naftilamina dissolvida em

150mL de água quente, adiciona-se 250 mL de ácido acético glacial e completa-se o volume

para 1L, e filtra-se através de uma camada de algodão). Agitava-se e deixava-se em repouso

na ausência de luz por 15 minutos. Media-se a coloração vermelha desenvolvida em

espectrofotômetro a 520 nm e determinava a quantidade de nitrogênio nitroso correspondente

usando a curva padrão previamente estabelecida. A curva d padrão encontra-se no

Apêndice

deste trabalho. Ema cada ensaio era feito um branco para zerar o espectrofotômetro, usando

o mesmo procedimento com água destilada no lugar da amostra.

3.10.5 – QUANTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA

3.10.5.1 – BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO (BRS)

A quantificação das bactérias redutoras de sulfato foi feita pela técnica do número

mais provável (NMP) (HARRISON JR., 1982) utilizando meio Postgate.

A quantificação foi feita após incubação a 30

±1

C por 28 dias. O crescimento das

BRS foi visto através da formação de precipitado negro de FeS, que resulta da reação de H

gerado através do seu metabolismo com o FeSO

.7H

O presente no meio Postgate.

3.10.5.2 – BACTÉRIAS ANAERÓBIAS

Este grupo de bactérias foi quantificado pela técnica do número mais provável

(NMP) (HARRISON JR., 1982) utilizando meio fluido ao tioglicolato (MERK), após

diluições decimais sucessivas em solução redutora. O procedimento de inoculação foi o

mesmo utilizado para as bactérias redutoras de sulfato.

Após inoculação, os frascos foram incubados a 30

± 1

C por 28 dias. O crescimento

dessas bactérias foi observado através da turvação do mei

3.10.5.3 – BACTÉRIAS REDUTORAS DE NITRATO

Este grupo de bactérias foi quantificado pela técnica do número mais provável

(NMP) (HARRISON JR., 1982) utilizando meio mineral ( Tabela 3.4) e o pH ajustado para

7.2. A determinação do crescimento celular foi feito após incubação a 30

± 1

C, sob luz fria,

por 28 dias, através da formação de uma coloração vermelho acastanhado, coloração

característica de algumas espécies de BRN, e através do monitoramento do consumo de

nitrato em alguns frascos.

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 – ACLIMATAÇÃO DA CULTURA MICROBIANA

A cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de sulfato utilizada neste trabalho

foi inicialmente aclimatada, conforme descrito na seção 3.3. Este procedimento foi feito com

o intuito de adaptar as espécies presentes às concentrações crescentes de ácidos orgânicos

(acético, propiônico, butírico e valérico), e assim selecionar os microrganismos

potencialmente capazes de produzir sulfeto a partir de ácidos orgânicos de cadeia curta, como

os presentes nas águas de formação (MYRH, 2003).

A Tabela 4.1 apresenta o crescimento de BRS em efluente sintético (item 3.2.1),

composto do meio Postgate E (POSTGATE, 1984) e diferentes concentrações iniciais de

carbono. O critério estabelecido para aumento da concentração de carbono foi o crescimento

intenso da cultura, portanto, em caso positivo transferia-se a cultura para novo meio com

conteúdo maior de carbono. O crescimento foi observado pelo escurecimento do meio

reacional, como conseqüência da formação de precipitado negro de FeS, em geral, uma

semana após incubação a 30

± 1

A presença de ácidos orgânicos não teve efeito inibitório a atividade metabólica das

BRS até a concentração de 5,0 g de carbono/L, durante todo o período de aclimatação.

Adicionalmente, o rápido e intenso crescimento evidenciado pode ser atribuído a presença de

um número considerável de espécies de BRS capazes de utilizar um ou mais ácidos como

fonte de carbono e/ou a transformação destes compostos em substâncias prontamente

assimiláveis por outros microrganismos existentes na cultura.

Tabela 4.1 – Aclimatação da cultura microbiana a diferentes concentrações de carbono

Concentração de carbono

(g/L)

Crescimento

0,1 + + +

0,5 + + +

1,0 + + +

2,0 + + +

3,0 + + +

4,0 + + +

5,0 + + +

+ crescimento positivo – observado pela formação de precipitado negro de FeS.

Cada experimento foi realizado em triplicata.

Terminada a fase de adaptação da cultura aos ácidos orgânicos, foi feita a total

supressão da fonte de carbono do meio Postgate E mais facilmente assimilável (lactato de

sódio). Neste caso, foi observado que a cultura não só suportou a total ausência do lactato

mas, sobretudo, foi capaz de crescer utilizando apenas o carbono proveniente dos ácidos como

principal fonte de carbono. As BRS têm a capacidade de consumir ácidos orgânicos (fórmico,

acético, propiônico, butírico, lático, pirúvico, graxos), hidrocarbonetos, glicerol, etanol, fenóis

e benzoatos (POSTGATE, 1984).

Considerando que a adição de ácidos orgânicos não foi prejudicial ao crescimento

das BRS, o qual normalmente era máximo em menos de 5 dias, e ainda que 1 g/L de carbono

é uma concentração satisfatória para favorecer a produção de H

S, foi definido para inoculo o

cultivo de 4 dias da cultura aclimatada em efluente sintético contendo exclusivamente a

mistura de ácidos orgânicos de cadeia curta. Muitos destes cultivos foram analisados para

quantificação das populações de bactérias redutoras de sulfato (BRS), bactérias heterotróficas

anaeróbias (BHA) e bactérias redutoras de nitrato (BRN). Estes grupos microbianos

prevalecem nas condições ensaiadas, e são referendados como responsáveis pelo aumento/

decréscimo do

souring em reservatórios (ENERGY INSTITUTE, 2003). Os valores médios

da quantificação celular do inóculo foram 1,8 x 10

NMP/mL , 9,5 x 10

NMP/mL e 1,1x10

para BRS, BHA e BRN respectivamente.

Esses resultados são procedentes, pois a população de BRS apresenta espécies

estritamente anaeróbias, enquanto no grupo das BHA podem coexistir espécies facultativas e

anaeróbias, ambas com capacidade de se desenvolver em condição de anaerobiose. Ressalta-

se que o meio Postgate é um meio específico para BRS, que na maioria das vezes não

encontram as condições nutricionais mínimas para crescimento em outros meios de cultura,

como por exemplo no meio fluido ao tioglicolato, que é indicado para o cultivo de BHA.

Tem-se ainda que as BRS apresentam metabolismo mais lento comparativamente às outras

bactérias heterotróficas anaeróbias. Em conseqüência, a presença de um consórcio microbiano

anaeróbio em meio não específico para BRS, ocasionará o esgotamento rápido da fonte de

carbono pelas outras bactérias presentes, impedindo a proliferação das BRS.

4.2– TESTE PRELIMINARES

4.2.1 – TESTE DE SENSIBILIDADE DA CULTURA MICROBIANA AO NITRATO

Para verificar o efeito do nitrato no crescimento da cultura microbiana, esta foi

cultivada na presença de diferentes concentrações de nitrato (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 3,0 g/L).

A Tabela 4.2 mostra a resposta da cultura microbiana às diferentes concentrações de

nitrato, após uma semana de incubação a 30

± 1

Pode-se observar que aparentemente não houve alteração do metabolismo das BRS

pela adição de nitrato até a concentração de 1,0g/L. E não houve crescimento de BRS nas

concentrações a partir de 1,5 g/L , sendo que nas concentrações de 2,0 e 3,0 g/L, o cultivo

apresentou, ao final do período de incubação, coloração vermelho acastanhado indicando

crescimento das BRN presentes no consócio microbiano.

A fim de determinar a ação do nitrato nas concentrações de 1,5; 2,0 e 3,0 g/L,

alíquotas de 1 mL de cada um dos três cultivos foram transferidas para 10 mL de meio

utilizado para repique de BRN. Após 15 dias de incubação sob luz fria, foi observado um

intenso avermelhamento dos novos cultivos, indicativo da atividade metabólica das BRN. Por

conseguinte, pode-se concluir que o nitrato estimula o desenvolvimento de BRN em

concentrações iguais ou superiores a 1,5g/L.

Tabela 4.2– Teste de Sensibilidade da Cultura Microbiana ao Nitrato.

Concentração de Nitrato (

/L) Crescimento

0,1 + + +

0,5 + + +

1,0 + + +

1,5 - - -

2,0 - - -*

3,0 - - - *

* observou-se que o meio ficou castanho avermelhado, coloração característica das BRN

4.2.2 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SULFATO

A fim de avaliar o comportamento da cultura em diferentes concentrações de sulfato,

cultivou-se a mesma em diferentes concentrações, iniciando com uma concentração de 850

mg/L, que é a concentração do meio Postgate, concentração a qual os microrganismos já

estavam adaptados. Esta concentração foi aumentada, de forma a observar a máxima

concentração de sulfato que permitiria o crescimento das BRS. Com este teste comprovou-se

que o sulfato estimulava o crescimento das BRS, havendo precipitação de FeS em todas as

concentrações estudadas. A diferença observada foi em relação ao tempo para crescimento da

cultura. Notou-se que o tempo de incubação era menor para maiores concentrações de sulfato.

Tabela 4.3– Efeito da Concentração de Sulfato no crescimento das BRS..

Concentração de Sulfato (g/L) Crescimento Tempo (dias)

0,5 + + + 4

0,85 + + + 4

1,0 + + + 2

2,0 + + + 2

3,0 + + + 1

4,0 + + + 1

4.3 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Conforme descrito no Capítulo 3, uma vez definidos os valores das concentrações de

nitrato, sulfato e carbono, foram realizados os 16 experimentos propostos pela matriz do

planejamento adotada (Tabela 3.8).

4.3.1 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DAS RESPOSTAS

A otimização do processo visando controlar a produção de sulfeto foi realizada em

relação às variáveis: concentração de Sulfato (SO

), concentração de Carbono (C) e

concentração de Nitrato (

), e pela análise das variáveis resposta: concentração de

bactérias heterotróficas anaeróbias e de bactérias redutoras de sulfato, consumo de sulfato e

nitrato, e geração de H

−

S e nitrito.

A partir dos resultados obtidos para as respostas analisadas, efetuou-se, para cada

uma das respostas, uma regressão múltipla, tendo como fatores os termos isolados, as

interações e os quadráticos das três variáveis estudadas.

Nos testes controles realizados para avaliação das perdas abióticas, não foram

detectados microrganismos e, por conseguinte, não houve consumo de sulfato e/ou nitrato e

nem produção de sulfeto e/ou nitrito.

4.3.1.1 – PRODUÇÃO DE H

A Tabela 4.4 apresenta os valores médios da produção de sulfeto nas diferentes

condições propostas no planejamento experimental.

Tabela 4.4 – Resultados da produção de sulfeto, em diferentes condições experimentais.

Exp.

( mg/L)

−

( mg/L)

Produção de

S (m

/L)

1 850 1000 500

44,3

± 4,4

850

1000 2500

15,3

± 1,5

850

5000 500

50,1

± 5,0

850

5000 2500

18,7

± 1,9

5 3150 1000 500

56,3 ± 5,6

3150

1000 2500

33,4 ± 3,3

3150

5000 500

85,6 ± 8,6

3150

5000 2500

53,2 ± 5,3

9 520 3000 1500

27,2 ± 2,7

10 3480 3000

1500

57,0 ± 5,7

11 2000 426

1500

22,8 ± 2,3

2000

5570

1500

26,3 ± 2,6

2000

3000 213

74,0 ± 7,4

2000 3000

2730

10,3 ± 1,0

2000 3000 1500

23,8 ± 2,4

2000 3000 1500

22,4 ± 2,2

Foi observado que a variação das concentrações de Sulfato (X

), Carbono (X

) e

Nitrato (X

) resultou em cerca de 10 a 86 mg/L de sulfeto produzido (Tabela 4.4).

Comparando os resultados verifica-se que mantendo constantes as concentrações de sulfato e

carbono (experimentos 13 e 14) e aumentando a concentração de nitrato (2730 mg/L) se

obtém um expressivo decréscimo (7,2 vezes) da quantidade de sulfeto formado, equivalente a

um percentual de redução de 86,1%. A redução da quantidade de gás sulfídrico produzido

relacionada com o aumento da concentração de nitrato também foi comprovada nos demais

experimentos (1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8). Evidentemente, a geração de H

S teve

correspondência direta com a quantidade de sulfato presente e, em menor grau, com a

concentração de carbono.

Nos experimentos realizados com a concentração de nitrato constante (9 e 10; 11 e

12) pode ser evidenciado que a geração de gás sulfídrico foi muito mais influenciada pela

variação de sulfato do que de carbono. Através destas comparações nota-se que a

concentração de carbono tem pouca influencia no sulfeto produzido e que sua inibição está

diretamente relacionada com a quantidade de nitrato adicionado.

Após a realização da regressão múltipla no programa

Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

S = 24,0370 + 12,227X

+ 5,5596X

– 17,47X

+ 10,481X

– 0,111X

+ 10,493X

4,988X

+ 0,648X

– 1,498X

(4.1)

A Tabela 4.5 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da produção de

sulfeto

Tabela 4.5 – Resultados da regressão múltipla para a produção de sulfeto

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

Constante (β

)

23,96

0,000033

( )

12,23

0,000118

0,016698

( )

−

- 17,47

0,000007

( )

10,48

0,003905

( )

−

1049

0,003878

( .C)

4,99

0,054217

= 0,95 F

= 28,28 F

(0,01) = 5,80

Nesta regressão foram eliminados os parâmetros com nível de significância do teste t

de Student superiores a 10%, sendo as variáveis relacionadas a estes consideradas não

relevantes. Assim, foram desprezados o termo quadrático da concentração de carbono (X

) e

as interações concentração de sulfato/concentração de nitrato (X

) e concentração de

carbono /concentração de nitrato (X

Analisando a Tabela 4.5, constatam-se as variáveis que influenciam na produção de

S. Esta tabela mostra que altas concentrações de nitrato proporcionam menores

concentrações de H

O coeficiente de correlação (R

) de 0,95 indica um ajuste adequado dos dados

experimentais na resposta produção de H

S frente à equação empírica proposta, ou seja, 95%

da variabilidade dos dados foram explicados pela equação.

O resultado de F calculado (Fc) foi superior ao F tabelado (F

) para um nível de

significância de 1%. Esta comparação pode ser interpretada através de um teste de hipótese. A

hipótese de nulidade (H

) diz que o modelo não é significativo, ou seja, todos os parâmetros

são iguais a zero. A hipótese alternativa (H

) afirma que o modelo é significativo. O resultado

do teste F mostrou que se pode rejeitar H

no nível de significância de 1%, ou seja, tem-se

uma confiança de 99% de que o modelo é significativo.

Após a eliminação dos parâmetros não significativos, obteve-se a seguinte equação:

S = 23,583 + 12,227X

+ 5,559X

– 17,470X

+ 10,481X

+10.493X

4,988X

(4.2)

Analisando esta equação, pode-se observar pelos coeficientes das variáveis X

, X

que a concentração de nitrato (X

) é a única que influencia significativamente na redução

da produção de H

S, pois apresenta sinal negativo. Logo, um aumento da concentração de

nitrato, acarretará no decréscimo da produção de sulfeto. Por outro lado, as variáveis que

representam as concentrações de sulfato (X

) e carbono (X

) possuem sinal positivo, de forma

que seu aumento sempre favorecerá a produção de sulfeto; porém o maior valor encontrado

para X

indica que a concentração de sulfato será preponderante.

A partir da equação completa (Eq. 4.1) foi utilizado um algoritmo obtido no software

Maple V release4, para calcular as coordenadas do ponto estacionário para a produção de

S. Sendo elas:

= -0,8034;

= 0,8060;

= 0,9148.

Este ponto estacionário está dentro da região experimental.

As coordenadas do ponto estacionário e os respectivos

λ’s (λ

= - 0,7267; λ

10,5069;

= 11,0828) referentes à produção de H

S indicam que esta resposta possui um

ponto de sela.

Ainda usando o algoritmo no

software Maple V release 4, foram calculados os X’s

correspondentes à minimização da resposta para a produção de H

S, utilizando a forma

canônica Y = Y

- λ

+ λ

. Para minimizar a resposta os termos λ

e λ

devem ser zerados e, então, deve-se buscar valores para w

tal que Y seja o menor possível.

Sendo o

próximo de zero, pode-se dizer que se determinou uma região quase estacionária

na direção do eixo da concentração de SO

. Sendo os valores λ

positivos, ao

movimentar-se em qualquer direção no eixo correspondente a partir do ponto estacionário,

ocorrerá um acréscimo na concentração. Feito isto, tem-se a Equação 4.1 na forma canônica e

as seguintes variáveis codificadas para o ponto de otimização:

S= 68,84 – 0,7267W

+10,51 W

+ 11,08 W

(4.3)

= -0,335;

= -1,280;

= 0,7615.

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4), obtêm-se os valores reais

das concentrações das variáveis:

= 1616 mg/L de SO

;

= 444 mg/L de C;

= 2262 mg/L de NO

Como forma de ilustrar os efeitos das variáveis na produção de H

S pela cultura mista

enriquecida com bactérias redutoras de sulfato pela adição de nitrato, estão apresentadas

abaixo as superfícies de resposta relacionando as variáveis duas a duas com a resposta.

A Figura 4.1 mostra que baixos valores da concentração de carbono na região próxima

ou abaixo do ponto central para a concentração de sulfato resultam em pequena produção de

sulfeto.

Figura 4.1 – Superfície de resposta para produção de sulfeto em função das concentrações de

nitrato e sulfato.

A Figura 4.2 apresenta as variáveis que mais influenciaram na minimização da

produção de H

S. Nota-se que o efetivo controle da geração de H

S é estabelecido para altos

valores de nitrato e valores de sulfato abaixo do ponto central.

Figura 4.2 – Superfície de resposta para a produção de sulfeto em função das concentrações

de carbono e sulfato

Analisando a Figura 4.3 observa-se que para valores da concentração de carbono

próximos à menor concentração empregada (próximo ao -

α) e para maiores concentrações de

nitrato (acima do ponto central) a produção de H

S é menor. Os resultados das tendências de

minimização da produção de H

S estão de acordo com o ponto de mínimo obtido pela

otimização.

Figura 4.3 – Superfície de resposta para a produção de sulfeto em função das concentrações

de carbono e nitrato.

A partir dos valores codificados das variáveis X

, X

e X

no ponto de mínimo e

utilizando a Equação 4.2, determinou-se que a concentração de H

S neste ponto foi de

8,83 mg/L. Comparando este valor com a concentração de H

S no experimento 14 do PCC,

no qual obteve-se 10,28 mg/L, verifica-se que os resultados foram bem próximos. Este fato

era esperado, devido aos valores das concentrações das variáveis do processo no ponto de

otimização estarem próximos aos valores correspondentes ao experimento 14, com relação às

concentrações de sulfato e nitrato, apesar de estar distante do valor de concentração de

carbono. Porém, analisando-se os experimentos 11 e 12 verifica-se que um aumento da

concentração de carbono superior a 13 vezes (de 426 para 5570 mg/L) promove um aumento

de apenas 15,3% na produção de H

S e, conforme indicado pela Equação 4.2, este parâmetro

é o que menos contribui para a variação da produção de H

Analisando os resultados experimentais, as superfícies de resposta e a Equação 4.2, é

notório que a variável X

é a que influencia mais significativamente na minimização da

produção de H

S. A fim de comprovar a importância da adição de nitrato na inibição da

geração de H

S, foi realizado o teste 14 do PCC na ausência de nitrato, sem alterar as demais

concentrações e nas mesmas condições. Após 28 dias de incubação, observou-se uma maior

produção de sulfeto (224 mg/L) comparativamente ao experimento com nitrato (10,3 mg/L),

ressaltando a ação efetiva do nitrato na prevenção ou controle da produção de sulfeto.

4.3.1.2 – BACTÉRIAS REDUTORAS DE SULFATO

A Tabela 4.6 mostra os resultados, em valores médios, da concentração de BRS para

os experimentos definidos pelo planejamento experimental (item 3.6).

Pela Tabela 4.6 pode se observar que em todas as condições testadas houve

diminuição da população de BRS. Porém, nenhuma das condições testadas levou à inativação

total deste grupo microbiano.

Conforme previsto, o crescimento das BRS apresentou relação com a quantidade de

carbono e, sobretudo, com a quantidade de sulfato. Além disso, de modo análogo à geração de

sulfeto, o aumento da concentração de nitrato resultou no decréscimo da concentração de BRS

(experimentos 1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8); o maior percentual de redução (90%) também sendo

determinado para o par de experimentos 13 e 14.

Tabela 4.6 – Concentração de bactérias redutoras de sulfato para cada condição experimental

Exp.

( mg/L)

C( mg/L)

−

( mg/L)

BRS (NMP/mL)

1 850 1000 500

4,0 x 10

± 0

2 850 1000 2500

9,0 x 10

± 0

3 850 5000 500

5,0 x 10

± 2,0 x 10

4 850 5000 2500

1,0 x 10

± 1 x 10

5 3150 1000 500

6,4 x 10

± 0

6 3150 1000 2500

3,3 x 10

± 5,0 x 10

7 3150 5000 500

8,0 x 10

± 1,0 x 10

8 3150 5000 2500

4,3 x 10

± 0

9 520 3000 1500

2,4 x 10

± 0

10 3480 3000 1500

5,0 x 10

± 1,0 x 10

11 2000 426 1500

2,2 x 10

± 1,0 x 10

12 2000 5570 1500

3,0 x 10

± 0

13 2000 3000 213

7,0 x 10

± 0

14 2000 3000 2730

7,0 x 10 ± 0

15 2000 3000 1500

2,0 x 10

± 0

16 2000 3000 1500

1,8 x 10

± 4,0 x 10

Na repetição do experimento 14, sem adição de nitrato, a concentração final de BRS

foi de 2,3x10

NMP/mL. Nesta condição, também foi máxima a concentração de gás

sulfídrico, produto resultante do metabolismo desassimilativo do sulfato, realizado pelas BRS.

Os resultados obtidos demonstram a capacidade do nitrato em inibir o metabolismo

de algumas espécies de BRS, já que conforme anteriormente citado, na presença de nitrato,

algumas espécies de BRS passam a obter energia através da respiração anaeróbica do nitrato,

isto é, usando como aceptor final de elétrons o nitrato ao invés do sulfato (BARTON, 1995;

DALSGAARD,1994).

De acordo com a literatura, a inibição da geração de H

S e do crescimento das BRS,

pela adição de nitrato, depende de uma combinação de fatores (ENERGY INSTITUTE,

2003). Alguns pesquisadores, inclusive, sugerem que o efeito de inibição de crescimento das

BRS, pela aplicação de íons nitrato, de fato resulta da formação de íons nitrito, um agente

oxidante, através da elevação do potencial redox do meio/ambiente.

Pelo tratamento dos dados por regressão múltipla no programa

Statistica 5.1 foi

obtida a equação a seguir:

BRS = 209,01 + 127,34X

+ 42,161X

– 194,189X

+ 88,651X

+ 22,24X

+ 97,71X

18,250X

+ 3,250X

– 18,250X

(4.4)

A Tabela 4.7 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da

quantificação de bactérias redutoras de sulfato, onde foram eliminados os parâmetros não

significativos. Assim, foi desprezado o termo quadrático da concentração de carbono (X

), e

as interações concentração de sulfato/concentração de carbono (X

), concentração de

sulfato/concentração de nitrato (X

) e concentração de carbono/concentração de nitrato

Tabela 4.7 – Resultados da regressão múltipla para a quantificação de BRS.

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

Constante (β

)

224,729 0,000005

(SO

)

127,345 0,000008

(NO

) -194,189 0,000000

(SO

) 88,656 0,002356

(NO

) 97,712 0,001227

= 0,96 F

= 54,95 F

(0,01) = 5,64

A Tabela 4.7 mostra que a concentração de nitrato é a variável de maior relevância

na redução das BRS, sendo que altas concentrações de nitrato proporcionam menores

números de BRS.

O coeficiente de correlação de 0,96 indica que foi feito um bom ajuste dos dados ao

modelo. Além disso, o resultado de F calculado (Fc) foi superior ao F tabelado (F

) para um

nível de significância de 1% comprovando que o modelo é significativo.

Após a eliminação dos parâmetros não significativos e o reajuste dos dados, obteve-

se pelo

software Statistica 5, a seguinte equação do modelo ajustado:

BRS = 224,729 + 127,34X

+ 42,161X

– 194,189X

+ 88,656X

+ 97,712X

(4.5)

A partir da equação completa (Eq. 4.4) e utilizando um algoritmo do software Maple

release 4 , foram calculadas as coordenadas do ponto estacionário para contagem de BRS:

( SO

) = - 0,710;

( C ) = -0,254;

( NO

) = 0,982.

O ponto estacionário e os respectivos valores de

λ (λ

= 19,9067; λ

= 89,8652 e λ

89,8652), referentes à concentração de BRS, indicam que esta resposta possui um ponto de

mínimo.

Ainda utilizando o algoritmo do

software Maple V release 4, foi possível identificar as

seguintes coordenadas deste ponto de mínimo:

(SO

) = - 0,710;

( C ) = -1,280;

(NO

) = 0,982.

Empregando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4), obtêm-se os valores reais

das concentrações das variáveis:

= 1180 mg/L de SO

;

= 444 mg/L de C;

= 2482 mg/L de NO

Para ilustrar os efeitos das variáveis na quantificação das BRS, estão apresentadas

abaixo as superfícies de resposta relacionando as variáveis duas a duas com a resposta.

As Figuras 4.4, 4.5 e 4.6 apresentam as superfícies de resposta mostrando a influência

das variáveis duas a duas com a resposta de quantificação de BRS.

Figura 4.4 - Superfície de resposta para número de BRS em função das concentrações

de nitrato e carbono.

Analisando a Figura 4.4, observa-se que para baixas concentrações de carbono,

abaixo do ponto central e concentrações de nitrato próximas a 2500 mg/L (ponto +1) o

número de BRS é mínimo.

Figura 4.5 - Superfície de resposta para número de BRS em função das concentrações

de sulfato e carbono.

Analisando a Figura 4.5, observa-se que o número de BRS diminui para

concentrações de sulfato entre o ponto de 1000 e 200 mg/L (-1 e -0,487) e para baixas

concentrações de carbono.

Figura 4.6

- Superfície de resposta para número de BRS em função das concentrações de

nitrato e sulfato.

Analisando a Figura 4.6, observa-se que o número de BRS diminui para

concentrações de nitrato próximas a 2500 mg/L (ponto +1) e concentrações de sulfato um

pouco abaixo do ponto central.

Este trabalho visa reduzir a produção de H

S, assim, faz se necessário também

avaliar a redução no número de BRS na cultura utilizada. Analisando a Equação 4.5 e as

superfícies de resposta, nota–se que a variável que mais influenciou no número de BRS foi a

concentração de nitrato. Este resultado também pode ser afirmado nos testes preliminares, em

que altas concentrações de nitrato inibiram o crescimento das BRS, favorecendo o

desenvolvimento das BRN. Por outro lado, observou-se que a variável que menos contribuiu

para a quantificação de BRS foi a concentração de carbono.

Resolvendo numericamente a Equação 4.5, com os valores das variáveis codificadas

, X

, e X

determinados pela otimização para redução da produção de H

S, determinou-se o

número de BRS igual a 47 NMP/mL, valor inferior aos obtidos experimentalmente (Tabela

4.5). As menores concentrações de BRS foram detectadas nos experimentos (2, 4 e 14),

realizados com os valores máximos de nitrato (2500-2750 mg/L), mesmo havendo uma

grande variação das concentrações de carbono (1000 a 5000 mg/L) e de sulfato (850 a 2000

mg/L).

Nos experimentos (13, 14 e 15/16) conduzidos sem variação das concentrações de

sulfato (2000 mg/L) e carbono (3000 mg/L), a concentração de BRS foi inversamente

proporcional ao aumento de nitrato (213 a 2730 mg/L), ou seja, quanto maior a concentração

de nitrato adicionada menor o número de BRS. Comportamento idêntico é evidente para os

pares 1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8, sendo a quantidade de nitrato necessária para redução da carga

microbiana dependente das concentrações de carbono e sulfato e da relação entre ambos; mas,

em especial, da concentração de sulfato.

Por fim, quando não houve variação das concentrações de carbono (3000 mg/L) e

nitrato (1500 mg/L), experimentos 9 e 10, o aumento da concentração de sulfato de 520 para

3480 mg/L favoreceu o crescimento microbiano. O mesmo pode ser observado para os pares 1

e 3; 2 e 4; 5 e 7; 6 e 8, mostrando que a quantidade de nitrato para obtenção das maiores

reduções da concentração de BRS esteja condicionada principalmente à concentração de

sulfato.

Esses resultados mostram que a concentração de NO

é a variável de maior

relevância na inibição do crescimento das BRS, enquanto o teor de carbono pouco interfere,

em concordância com a equação ajustada do modelo (Equação 4.5).

4.3.1.3 – BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS ANAERÓBIAS (BHA)

A Tabela 4.8 apresenta a matriz do planejamento (item 3.6) mostrando como resposta

a concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias para diferentes concentrações de nitrato,

sulfato e carbono.

Tabela 4.8 – Concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias (BHA) em diferentes

condições experimentais

Exp. SO

( mg/L) C ( mg/L)

−

( mg/L)

BHA

(NMP/mL)

1 850 1000 500

2,1 x 10

± 0,1 x 10

2 850 1000 2500

3,0 x 10

± 0

3 850 5000 500

6,4 x 10

± 0

4 850 5000 2500

9,0 x 10

± 0

5 3150 1000 500

1,1 x 10

± 0

6 3150 1000 2500

2,1 x 10

± 1,0 x 10

7 3150 5000 500

4,0 x 10

± 0

8 3150 5000 2500

7,0 x 10

± 0

9 520 3000 1500

7,5 x 10

± 0

10 3480 3000 1500

4,0 x 10

± 0

11 2000 426 1500

2,4 x 10

± 0,5 x 10

12 2000 5570 1500

3,3 x 10

± 5,0 x 10

13 2000 3000 213

2,1 x 10

± 0,1 x 10

14 2000 3000 2730

1,1 x 10

± 0

15 2000 3000 1500

5,0 x 10

± 2,0 x 10

16 2000 3000 1500

4,0 x 10

± 0

No que concerne às bactérias heterotróficas anaeróbias (BHA) pode-se observar um

comportamento distinto comparativamente as BRS. Em todos os experimentos ocorreu

aumento do número de BHA, em geral, prevalecendo nas maiores concentrações de nitrato.

Esses resultados indicam ser o nitrato favorável ao crescimento das BHA, possivelmente

devido à presença das bactérias redutoras de nitrato (BRN). Este grupo bacteriano apresenta

espécies facultativas e que, portanto, são capazes de crescer em condição de anaerobiose.

Neste caso, estas bactérias realizam a oxidação da matéria orgânica utilizando o nitrato como

aceptor final de elétrons, com excreção de nitrito. Em determinadas condições, algumas

espécies podem também reduzir o nitrito via hidroxilamina a íon amônio. Existem ainda as

bactérias que convertem o nitrato em nitrogênio gasoso (JENNEMAN, 1999).

Segundo Stott (2005), em ambientes onde são encontrados tanto sulfato quanto

nitrato, e ambos os grupos de bactérias (BRS e BRN) estão presentes, as BRN serão

predominantes. Isto decorre das diferenças de cada metabolismo. Para as BRS, cerca de 10%

da matéria orgânica consumida, simultaneamente a redução desassimilativa do sulfato, é

transformada em biomassa, enquanto que aproximadamente 35% da matéria orgânica

consumida pelas BRN, acoplada a redução do nitrato, gera biomassa (ENERGY INSTITUTE,

2003). Por sua vez, o crescimento mais rápido das BRN acarretará em consumo mais rápido

das fontes de carbono por estas, reduzindo a sua disponibilidade para as BRS. Assim sendo,

haverá maior produção de biomassa de BRN, desde que não haja limitação de nutriente.

As BRN também podem concorrer para inibição do metabolismo das BRS através da

geração de nitrito. Este anion possui a capacidade de elevar o potencial redox (Eh) do

meio/ambiente, estabelecendo condição desfavorável para a atividade metabólica das BRS

(MADIGAN, 1988). Outra possibilidade pode decorrer da reação do nitrito com o gás

sulfídrico, que resulta na oxidação química do sulfeto e, por conseguinte, na elevação do Eh

do ambiente (HITZMAN, 1994).

Após a realização da regressão múltipla no programa

Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

BHA = 3,798x10

–3,270x10

+ 1,434x10

+ 3,010x10

–1,630x10

–

9,741x10

+ 1,349x10

– 1,539x10

– 3,439x10

+ 1,249x10

(4.6)

A Tabela 4.9 a seguir apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da

quantificação de bactérias heterotróficas anaeróbias.

Nesta regressão foram eliminados os parâmetros com nível de significância superior

a 10%. Assim, foram desprezados os termos: concentração de carbono (X

) e as interações

sulfato/carbono(X

) e sulfato/nitrato (X

Tabela 4.9 - Resultados da regressão múltipla da quantificação de bactérias heterotróficas

anaeróbias.

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

Constante (β

)

3,798x10

0,000471

0,003479

(NO

) 3,011x10

0,000017

(SO

)

-1,630x10

0,012548

(C)

-9,741x10

0,096225

(NO

)

1,349x10

0,030082

(C.NO

) 1,249x10

0,018333

= 0,92

= 18,554 F

(0,01) = 5,80

A Tabela 4.9 apresenta as variáveis que influenciam na concentração de BHA. O

coeficiente de correlação (R

) determinado (0,92) indica que 92% da variabilidade dos dados

foram explicados pela equação.

O resultado de F calculado (Fc) foi superior ao F tabelado (F

) para um nível de

significância de 1%. O resultado do teste F mostrou que o modelo apresenta 99% de

confiança.

Após a eliminação dos parâmetros não significativos, obtém-se a seguinte equação:

BHA10

-9

= 3,798+1,434X

+3,0X

–1,630X

–0,9741X

+1,349X

+1,249X

(4.7)

Empregando a equação completa (Eq. 4.6) e utilizando um algoritmo (software

Maple V release 4),

foram calculadas as coordenadas do ponto estacionário para a

concentração de BHA:

= 0,0168;

= 0,0164;

= -1,1214.

Estes pontos estacionários estão dentro da região experimental e, junto com os

respectivos valores de

λ (-1,643*10

; -1,129*10

e 1.517*10

), referentes à concentração de

BHA, indicaram que esta resposta possui um ponto de sela.

Ainda usando o algoritmo do

software Maple V release 4, calculou-se os valores de

X correspondentes à maximização da resposta para o crescimento de BHA, utilizando a forma

canônica Y = Y

- λ

+ λ

. Para maximizar a resposta os termos λ

e λ

foram zerados e, atribuiu-se um valor para w

tal que Y fosse o maior possível. Substituindo

os valores de

λ na equação canônica, obtém-se:

Y = 65,77 – 1,64*10

- 1,13*10

+ 1,52*10

(4.8)

As variáveis codificadas no ponto de otimização, consideradas as premissas acima

delineadas, são:

= -0,013;

= 1,13;

= 1,279.

Utilizando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4), obtém-se os valores reais

das concentrações para cada uma das variáveis:

= 1993 mg/L de SO

;

= 5260 mg/L de C;

= 2779 mg/L de NO

Para ilustrar os efeitos das variáveis com relação ao número de BHA, estão

apresentadas nas Figuras 4.7, 4.8 e 4.9 as superfícies de resposta relacionando as três

variáveis, duas a duas, com a resposta.

Figura 4.7- Superfície de resposta para número de bactérias heterotróficas anaeróbias em

função das concentrações de sulfato e carbono.

Observa-se que para concentrações de carbono próximas de 5000 mg/L (ponto + 1) e

concentrações de sulfato próximas do ponto central, o número de BHA aumenta.

Figura 4.8: Superfície de resposta para número de bactérias heterotróficas anaeróbias em

função das concentrações de carbono e nitrato.

Analisando a Figura 4.9, observa-se que altas concentrações de nitrato e concentrações

próximas ao ponto central de sulfato aumentam o número de BHA.

Figura 4.9

- Superfície de resposta para número de bactérias heterotróficas anaeróbias

em função das concentrações de sulfato e nitrato.

A Tabela 4.8 mostra que a condição do experimento 14 foi a mais favorável ao

crescimento de BHA. Em contrapartida, neste experimento foi detectado o menor número de

BRS (Tabela 4.6). Conforme previsto, altas concentrações de nitrato induziram o maior

crescimento de BRN, causando a inibição das BRS.

Nas condições experimentais (1 e 2; 3 e 4; 5 e 6; 7 e 8; 13 e14) onde as concentrações

de sulfato e carbono foram mantidas constantes, constata-se que o aumento da concentração

de BHA foi diretamente proporcional ao aumento de nitrato.

Nos experimentos onde apenas a concentração de carbono foi variada, as respostas

foram muito diferenciadas em função da concentração de nitrato. Em baixos valores de nitrato

(500 mg/L) e sulfato (850 mg/L), o crescimento de BHA foi estimulado pelo aumento da

quantidade de carbono (par 1 e 3), mas na concentração de sulfato de 3150 mg/L (par 5 e 7),

um aumento substancial da concentração de carbono promoveu menor elevação do número de

células. Para altos valores de nitrato (2500 mg/L), a concentração celular foi tanto maior

quanto maior a adição de carbono, não sendo afetada pelo aumento da quantidade de sulfato

de 850 para 3150 mg/L (pares 2 e 4; 6 e 7). Comparando as concentrações de BHA

correspondentes aos experimentos (9 e 10; 11 e 12) fica patente a relevância das

concentrações de carbono e nitrato para o crescimento deste grupo, enquanto a quantidade de

sulfato é pouco representativa. Esses resultados estão em consonância com a Equação 4.7.

4.3.1.4 – CONSUMO DE SULFATO

A Tabela 4.10 apresenta as concentrações de sulfato consumido nas condições do

planejamento experimental.

Tabela 4.10 – Consumo de sulfato nas condições experimentais estudadas

Exp.

(mg/L)

C (mg/L)

−

(mg/L)

Sulfato consumido

(

mg/L

)

1 850 1000 500 126,1

850

1000 2500 45,2

850

5000 500 142,6

850

5000 2500 53,2

5 3150 1000 500

159,2

3150

1000 2500

93,9

3150

5000 500

242,7

3150

5000 2500

152,4

9 520 3000 1500

79,7

10 3480 3000

1500

162,1

11 2000 426

1500

65,4

2000

5570

1500

75,5

2000

3000 213

210,8

2000 3000

2730

28,9

2000 3000 1500

69,2

2000 3000 1500

65,4

Após a realização da regressão múltipla no programa

Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

cons.

= 69,884 + 34,222X

+ 15,867X

– 49,502X

+ 29,639X

– 0,8192X

+ 29,005X

– 14,6875X

+ 1,8375X

– 4,1875X

(4.9)

A Tabela 4.11 apresenta os resultados obtidos para a regressão múltipla da

concentração de sulfato, na qual foram eliminados os parâmetros com nível de significância

superior a 10%. Assim, foram desprezados o termo quadrático da concentração de carbono e

as interações concentração de sulfato/concentração de nitrato e concentração de carbono

/concentração de nitrato.

Tabela 4.11 – Resultados da regressão múltipla para a concentração de sulfato consumido

Fatores Parâmetros

Nível de

significância (p)

Constante (β

)

69,3049

0,000033

( SO

) 34,224

0,000148

0,017523

(NO

)

-49,5022

0,000008

(SO

)

29,6388

0,0504373

(NO

)

29,0049

0,004953

( SO

.C) 14,6875

0,502226

= 0,95 F

= 27,108 F

(0,01) = 5,80

A Tabela 4.11mostra as variáveis que influenciam no consumo de sulfato e o valor

do coeficiente de correlação (R

), que indica que 95% da variabilidade dos dados foram

explicados pela equação.

Após a eliminação dos parâmetros não significativos, obtém-se a seguinte equação:

cons

= 69,884 + 34,222X

+ 15,867X

– 49,502X

+ 29,639X

+ 29,005X

-14,6875X

(4.10)

As coordenadas do ponto estacionário para o consumo de sulfato, calculadas a partir

da equação completa (Eq. 4.9) e pelo uso do algoritmo do

software Maple realese 4, são:

= -1,118;

= 1,630;

= 0,771.

As coordenadas do ponto estacionário e os respectivos valores de

λ (-2,762; 27,361e

30,227), referentes ao consumo de SO

, indicam que esta resposta possui um ponto de Sela.

Substituindo os valores dos λ na equação canônica, tem-se:

Y = 70,80 – 2,763 W

+ 27,36W

+ 30,226W

(4.11)

Utilizando o algoritmo do

software Maple realese 4, foram calculadas as

coordenadas deste ponto de mínimo, sendo elas:

( SO

) = -0,322;

( C ) = -1,280;

( NO

) = 0,783.

Aplicando as equações de codificação (3.2), (3.3) e (3.4), obtém-se os valores reais

das concentrações das variáveis

=1629 mg/L de SO

;

= 444 mg/L de C;

= 2283mg/L de NO

As Figuras 4.10, 4.11 e 4.12 ilustram através das superfícies de resposta os efeitos das

variáveis no consumo de sulfato.

Analisando a Figura 4.10, observa-se que o consumo de sulfato é mínimo para baixas

concentrações de carbono e de sulfato um pouco abaixo do ponto central do planejamento.

Figura 4.10 - Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das concentrações

de carbono e sulfato.

De acordo com as Figuras 4.11 e 4.12, houve um baixo consumo de sulfato para

concentrações de sulfato abaixo do ponto central e altas concentrações de nitrato.

Figura 4.11 – Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das concentrações

de nitrato e sulfato.

Figura 4.12 – Superfície de resposta para o consumo de sulfato em função das concentrações

de nitrato e carbono.

O maior efeito da concentração de nitrato, mostrado na Equação 4.10 do modelo

ajustado, pode ser explicado pelo favorecimento da atividade das BRN, visto ser o seu

metabolismo energeticamente mais favorável do que o consumo de sulfato pelas BRS. A

redução microbiana anaeróbica do nitrato fornece 3 vezes mais energia que a redução

desassimilativa do sulfato. Mesmo havendo presença de sulfato, o nitrato será

preferencialmente consumido, propiciando o domínio das BRN e, conseqüentemente, inibindo

o metabolismo das BRS, impedindo assim a geração de H

S a partir da redução de

sulfato.(POSTGATE, 1984 MOURA et al., 1997; MAXWELL, 2003;

www.bio.ulcagary.ca.2004)

O menor consumo de sulfato foi observado no experimento 14, no qual verificou-se

também a menor produção de H

S (Tabela 4.3), menor quantidade de BRS (Tabela 4.5) e

maior número de BHA (Tabela 4.7). Esse comportamento comprova que a produção de H

S e

o consumo de sulfato estão relacionados com a atividade das BRS. Neste experimento

verifica-se também uma alta concentração de nitrato para valores de concentração de sulfato e

de carbono no ponto central.

Analisando os pares de experimentos, onde os valores de duas variáveis foram

mantidos constantes, no ponto central, e a outra variável teve seu valor alterado nos seus

limites, nota-se que para:

•

par 11 e 12 (aumento da concentração de carbono) - consumo de sulfato aumenta

cerca de 15%;

•

par 14 e 13 (redução da concentração de nitrato) - aumento de 629%;

•

par 9 e 10 (aumento da concentração de sulfato) - aumento superior a 100%.

Estes resultados confirmam as indicações dadas pelos gráficos das superfícies de

resposta, bem como os resultados da Tabela 4.10 e os da Equação 4.10 do modelo ajustado, o

qual define ser principalmente a variável X

relacionada com o maior consumo de sulfato.

Substituindo as variáveis codificadas no ponto de otimização de mínima produção de

S no modelo ajustado da equação de consumo de sulfato (Equação 4.10), obtém-se o valor

de 22,48 mg/L. O consumo de sulfato no experimento 14 foi de 28,9 mg/L, que está muito

próximo ao valor da otimização para minimização do consumo de sulfato. Na reprodução do

experimento 14 na ausência de nitrato houve o consumo de 630 mg/L de sulfato, um valor

bem superior ao determinado no teste original, provando assim que as BRS não consomem

sulfato na presença de nitrato, quer seja por consumirem preferencialmente nitrato, quer seja

pela indisponibilidade da fonte de carbono em virtude do metabolismo mais intenso das BRN.

4.3.1.5 – CONSUMO DE NITRATO

A Tabela 4.12 apresenta os resultados do consumo de nitrato nas condições de cada

experimento do planejamento.

Tabela 4.12 – Resultados do consumo de nitrato, nas condições de cada experimento.

Exp.

( mg/L)

C( mg/L)

−

( mg/L)

Nitrato consumido

(

)

1 850 1000 500 484,8

850

1000 2500 1964,2

850

5000 500 481,5

850

5000 2500 2105,9

5 3150 1000 500

475,9

3150

1000 2500

2038,6

3150

5000 500

487

3150

5000 2500

2209,9

9 520 3000 1500

1094,2

10 3480 3000

1500

1103,2

11 2000 426

1500

932,4

2000

5570

1500

1307,7

2000

3000 213

192,8

2000 3000

2730

2010,9

2000 3000 1500

1023,7

2000 3000 1500

1077,7

Após a realização da regressão múltipla no programa

Statistica 5.1, obteve-se a

seguinte equação:

cons = 998,97 + 16,83X

+ 71,05X

+ 771,63X

+ 84,36X

+ 96,34X

+ 85,36X

5,50X

+22,72X

+ 38,15X

(4.12)

Na Tabela 4.13, encontram-se os resultados da regressão múltipla para as variáveis

que influenciam no consumo de nitrato. Analisando esta tabela, constata-se que altas

concentrações de nitrato influenciam sensivelmente o consumo deste ânion pelos

microrganismos. O coeficiente de correlação (R

) obtido (98%) indica que a variabilidade dos

dados foi explicada pela equação.

Tabela 4.13 – Resultados da regressão múltipla para o consumo de nitrato

Fatores Parâmetros

Nível de

Significância (p)

Constante (β

)

998,9683

0,000000

0,026036

(NO

)

771,6341

0,000000

(SO

)

84,3611

0,056250

(C)

96,3452

0,03381

(NO

)

85,3573

0,05388

= 0,98 F

= 165,16

(0,01) = 5,64

De modo a eliminar as variáveis com nível de significância do teste t de Student

superior a 10%, foram desprezadas a variável linear X

, a variável quadrática X

e todas as

interações. A equação ajustada pode ser definida como segue:

cons = 998,97 + 71,05X

+ 771,63X

– 84,36X

– 96,34X

+ 85,36X

(4.13)

Utilizando a equação completa (Eq. 4.12) e aplicando o

software Maple V release 4,

foram calculadas as coordenadas do ponto estacionário para o consumo de NO

= 0,5169;

= 0,5493;

= -4,711.

O ponto estacionário e os respectivos valores de

λ (λ

= 67,355; λ

= 85,090 e λ

113,617), referentes ao consumo de NO

, indicam que esta resposta possui um ponto de

mínimo.

Ainda utilizando o algoritmo do software

Maple V release 4 , foi possível identificar

as coordenadas do ponto de mínimo, sendo elas:

(SO

) = 0,013;

(NO

) = -1,280.

Os valores reais das concentrações das variáveis obtidos a partir das equações de

codificação (3.2), (3.3) e (3.4) são:

=2015 mg/L de SO

;

= 2226 mg/L de C;

= 220mg/L de NO

As Figuras 4.13, 4.14 e 4.15 mostram as superfícies de resposta relacionando as

variáveis ao consumo de nitrato.

Analisando a Figura 4.13, observa-se que para concentrações de carbono e sulfato

próximas do ponto central do planejamento, o consumo de nitrato é mínimo. Para obter altos

consumos de nitrato devem ser utilizadas altas concentrações de nitrato (+

α), independente da

concentrações de sulfato e carbono (Figuras 4.14 e 4.15)

Figura 4.13- Superfície de resposta para o consumo de nitrato em função das concentrações de

sulfato e carbono.

igura 4.14- Superfície de resposta para o consumo de nitrato em função das concentrações

de nitrato e sulfato.

Figura 4.15

- Superfície de resposta para o consumo de nitrato em função das

concentrações carbono e nitrato.

O nitrato foi usado neste planejamento para inibir o crescimento das BRS e, desta

forma, minimizar a produção de H

S. Apesar do ponto encontrado pelo algoritmo ser ponto de

mínimo, o interessante seria a condição de maior consumo de nitrato, a fim de garantir a

premissa deste estudo.

Os maiores consumos de nitrato (2010-2200 mg/L) foram obtidos nas condições dos

experimentos 4, 6, 8 e 14, onde foram usadas altas concentrações de nitrato (2500-2700 mg/L)

e variadas concentrações de sulfato (850-3400 mg/L) e carbono (1000-5500 mg/L).

Considerando o consumo de nitrato superior a 80% e, que nestas condições, a concentração de

BRS foi baixa enquanto a de BRN foi alta, pode-se presumir que a redução do nitrato foi

decorrente da atividade metabólica de BRN.

A análise dos experimentos aos pares, de modo a contemplar a alteração de apenas

uma das três variáveis, entre os seus valores limites, enquanto as demais são mantidas

constantes, permite fazer as seguintes considerações:

• par 9 e 10 (aumento da concentração de sulfato) – pequena variação do consumo de nitrato;

• par 11 e 12 (aumento da concentração de carbono) – aumento de 40% no consumo de

nitrato;

• par 13 e 14 - ( aumento da concentração de nitrato)

Esses resultados vem confirmar as observações das superfícies de resposta (Figuras

4.13, 4.14 e 4.15), bem como os resultados da Tabela 4.12 e da equação do modelo ajustado

(Equação 4.13), que indica ser o consumo de nitrato diretamente dependente da variável X

(concentração de nitrato)

seguido de um pequeno efeito da variável X

(concentração de

carbono)

e que a variação na concentração de sulfato, dentro da faixa experimental estudada,

não foi significativa.

4.3.1.6 – RESUMO DOS RESULTADOS DO PLANEJAMENTO

Na Tabela 4.14 estão relacionados os pontos de minimização e maximização

das respostas: produção de H

S, concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias (BHA),

concentração de bactérias redutoras de sulfato (BRS), consumo de nitrato e consumo de

sulfato.

Pode-se observar que altas concentrações de nitrato favoreceram a atividade das

BHA, inibindo o crescimento das BRS e, conseqüentemente, diminuindo o consumo de

sulfato e a produção de sulfeto. Os pontos de otimização para a minimização de produção de

S, de consumo de sulfato e de número de BRS, estão bastante próximos, indicando que o

crescimento de BRS está relacionado com a redução do sulfato e conseqüente produção de

S. Nota-se também que a seqüência de eventos é característica da atividade de BRN,

fazendo crer que grande parte da população de BHA é formada por BRN.

Tabela 4.14 – Resumo dos pontos de maximização e minimização das respostas

Variável

Concentração de

(mg/L)

Concentração de

C (mg/L)

Concentração de

(mg/L)

Produção de H

(mínimo)

1616 444 2262

Concentração de BRS

(mínimo)

1180 444 2482

Concentração de BHA

(máximo)

1993 5260 2779

Consumo de nitrato

(

mínimo

)

2015 2226 220

Consumo de sulfato

(mínimo)

1629 444 2283

As Equações 4.2, 4.5, 4.10 e 4.13 dos modelos ajustados mostram que a

concentração de carbono, pelo menos dentro dos limites considerados, não tem efeito

expressivo nas respostas, de modo que, tanto em altas como em baixas quantidades de

carbono, o consumo de nitrato foi alto, ainda que a produção de sulfeto, o crescimento de

BRS e o consumo de sulfato tenham sido baixos.

As Equações 4.2, 4.5 e 4.10 mostram que altas concentrações de sulfato

favorecem o crescimento das BRS, o consumo de sulfato e, portanto, a produção de sulfeto, o

que é contra-indicado quando o propósito é a redução da geração de sulfeto. Atualmente, este

é um problema crucial da indústria petrolífera já que o

souring biogênico é a causa de uma

série de fenômenos, podendo-se citar: a redução da produtividade dos poço; o aumento do

custo de produção, em função da necessidade do uso de materiais mais nobres e resistentes

nas operações; a redução da qualidade dos hidrocarbonetos produzidos; entre outros (KANE,

1997).

A reprodução do teste 14, na ausência de nitrato, conduziu a um aumento do

crescimento das BRS, consumo de sulfato e produção de sulfeto.. A escolha do teste 14 para

100

reprodução teve como critério selecionar a condição de menor produção de H

S, e que ainda

fosse próxima da condição de otimização encontrada pelo software para a redução na

produção de sulfeto.

4.4. ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE CARBONO NA

PRODUÇÃO DE H

Este experimento foi realizado visando verificar a influência da concentração de

carbono em duas condições bastante distintas: valor otimizado no PCC (444 mg/L) e um valor

bem superior (10000 mg/L), de forma a simular uma condição com alta concentração de

carbono. As concentrações de sulfato e nitrato foram estabelecidas de acordo com a

otimização realizada para a minimização da produção de sulfeto, sendo 1616 mg/L e 2262

mg/L, respectivamente.

A Tabela 4.15 mostra as determinações químicas e microbiológicas dos testes

realizados nas duas diferentes concentrações de carbono, após 28 dias de incubação.

Tabela 4.15 – Valores finais dos testes realizados em distintas concentrações de carbono

Conforme observado no planejamento experimental, a concentração de carbono

pouco influenciou na produção de H

S, isto significa que efluentes com cargas orgânicas bem

distintas podem ser tratados com as mesmas condições de concentração de nitrato visando

obter menor produção de sulfeto.

O consumo de nitrato, diretamente proporcional à quantidade de carbono, em

conformidade com o aumento da população de BHA, e a detecção de nitrito são um indício da

presença de BRN. Experimentos realizados com água de formação mostraram que só houve

redução dos níveis de sulfeto quando a aplicação de nitrato foi realizada na presença de uma

população de BRN (DAVIDOVA

et al., 2001). Segundo os autores, o controle da geração de

S biogênico através da aplicação do nitrato depende principalmente da presença de uma

Carbono

(mg/L)

residual

(mg/L)

BRS

(NMP/mL)

BHA

(NMP/mL)

444

377,1 196 1570 8,2 30 9,5 x 10

10000

40,3 40 1600 0,0 0,0 1,1 x 10

101

população ativa de BRN. Esta observação dá respaldo à suposta presença de uma população

de BRN no consorcio microbiano utilizado neste trabalho.

A quantidade de nitrato adicionada foi suficiente para controlar a geração de H

S nas

duas condições testadas. Inclusive, foi capaz de praticamente eliminar a população de BRS.

Como já mencionado, algumas espécies de BRS podem alterar respiração

desassimilativa do sulfato pela do nitrato quando concentrações ilimitadas tanto de sulfato

quanto de nitrato estão presentes

(DUNSMORE, et al. 2004). Neste trabalho, tal fato não

ocorreu visto que aliada à ausência de crescimento, não houve consumo de sulfato e,

logicamente, também não ocorreu geração de H

4.5. EFEITO DA ADIÇÃO INTERMITENTE DE NITRATO NA BIOGÊNESE DE H

Neste estudo foi avaliado o comportamento da cultura microbiana em cultivos

conduzidos com adições intermitentes de nitrato. Os experimentos foram realizados em quatro

etapas, num período total de 34 dias, conforme descrito no Capítulo 3 (item 3.8).

A Tabela 4.16e a Figura 4.17 mostram os resultados obtidos para concentração

residual de nitrato durante a primeira etapa do teste, com duração de 10 dias.

Tabela 4.16 - Resultados obtidos na primeira etapa após cinco adições de 500 mg/L de nitrato,

a cada 2 dias

Tempo

(dias)

residual

(mg/L)

consumido

(mg/L)

residual

(mg/L)

Taxa de

consumo de

(mg/L.dia)

0 --- 0 0

1600

± 20

0 ----

± 0

500

90 ± 10 1590 ± 23

0 250

± 2

450

86 ± 8 1585 ± 25

0 238

140

± 3

410

100 ± 10 1603 ± 10

0 227

270

± 5

370

88 ± 15 1593 ± 15

0 216

480

± 15

290

95 ± 7 1607 ± 5

0 202

* A determinação da concentração de nitrato residual foi feita antes da adição de nova carga.

O consumo de nitrato foi total nos primeiros dois dias, seguido de um gradual

decréscimo que refletiu em acúmulo de nitrato nos reatores, ao longo do tempo de operação.

102

Este comportamento pode estar relacionado à formação de algum intermediário metabólico

capaz de inibir a atividade das BRN.

Não houve equivalência entre as concentrações de nitrato consumido e de nitrito

formado. A menor quantidade de nitrito residual pode ser atribuída à sua posterior redução

com formação de amônia, ou ainda à conversão do nitrato em gás nitrogênio ou em óxido

nitroso, por atividade das bactérias desnitrificantes (ENERGY INSTITUTE, 2003). A

desnitrificação ocorre por ação microbiana, na presença de matéria orgânica e em ambientes

desprovidos de oxigênio, havendo formação de nitrito, óxido nítrico (NO) e óxido nitroso

O), como metabólitos intermediários. A proporção dos produtos da desnitrificação

depende dos microrganismos desnitrificantes e das condições ambientais. Na verdade, o

nitrato pode estar presente indefinidamente em um sistema, caso a redução do nitrato ou a

desnitrificação não ocorra.

Ao longo do período experimental, o nitrito sempre foi detectado e em quantidades

semelhantes, em torno de 90 mg/L, possivelmente devido à redução do nitrito a N

Por outro

lado, o acúmulo de nitrato no meio pode ser atribuído à inibição da enzima

nitrato redutase

(NR) pela presença de nitrito

e de compostos nitrogenados reduzidos como a amônia. A

enzima NR está envolvida na redução de nitrato em nitrito que, em seguida, pode ser reduzido

à amônia pela enzima

nitrito redutase (NiR).

Analogamente ao sucedido nos experimentos anteriormente realizados, não foi

detectada a presença de BRS ao final da primeira etapa, apesar da sua concentração inicial de

1,8 x 10

NMP/mL. Estes resultados, aliados à ausência de consumo de sulfato e produção

de H

S, demonstram a inibição das BRS pela aplicação de 500 mg/L nitrato, em pulsos. Por

outro lado, a concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias, inicialmente de 9,5 x 10

NMP/mL, atingiu 2,7 x 10

NMP/mL. Provavelmente, o aumento do número de BHA foi

decorrente do desenvolvimento das BRN. O crescimento das BHA em detrimento das BRS

denota a competição das duas populações microbianas pelo substrato, conforme referido por

alguns autores (GARBOSSA, 2003) Neste caso, as bactérias continuam ativas apesar de haver

a prevenção da produção de H

De acordo com Reinsel

et al. (1996), 0,71 mg de nitrato foram rapidamente

reduzidos por população microbiana nativa, suprimindo a redução do sulfato. O nitrito foi

percebido em concentrações proporcionais às adicionadas de nitrato. A adição de nitrito foi

mais efetiva no controle do

souring do que glutaraldeído, se bem que o tratamento por

aplicações em pulsos tenha sido melhor do que de forma contínua. A partir destes resultados,

os autores concluíram que o nitrito foi o principal agente responsável pela inibição das BRS.

103

A inibição do crescimento de BRS pela formação de nitrito também é descrita pela empresa

norueguesa Statoil que faz uso da aplicação de nitrato em poços de produção há vários anos

A taxa de consumo de nitrato sofreu gradativamente pequenos decréscimos durante

os dez dias de operação, conforme mostra a Tabela 4.16. A taxa média de consumo de nitrato

nos dez dias de operação foi de 216 mg/L.dia.

Observa-se na Figura 4.16 que as concentrações de nitrato, consumido e residual,

apresentaram variação exponencial com o tempo de operação. De modo que, visando estudar

as causas da redução no consumo de nitrato, foi dado prosseguimento ao experimento.

0246810

o(dias)

200

400

600

800

1000

1200

(mg/L)

(res. + cons.)

residual

consumido

Figura 4.16. Variação da concentração de nitrato durante a primeira etapa experimental.

A etapa seguinte teve como finalidade avaliar se o consumo de nitrato, ou seja, o

crescimento das BRN, foi limitado pela eventual depleção da fonte de carbono. Assim, após o

décimo dia de operação, teve início a segunda etapa com a adição 1000 mg/L de carbono aos

sistemas, voltando desta maneira o meio reacional à condição inicial em termos de

concentração de carbono. A Tabela 4.17 mostra os resultados obtidos após a correção da

concentração de carbono.

Observa-se que do décimo ao décimo quinto dia, isto é, decorridos 5 dias da adição

de carbono, o consumo de nitrato se manteve inalterado. Porém, ocorreu uma brusca redução

no número de bactérias heterotróficas anaeróbias de 2,7 x 10

para 2,1 x 10

NMP/mL

(Figura 4.17). Este comportamento pode estar relacionado à readaptação dos microrganismos

às novas condições de cultivo visto que, logo a seguir, houve um aumento gradual do

consumo de nitrato. A concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias condiz com o valor

104

definido pelo planejamento experimental, da ordem de 10

NMP/mL (Tabela:4.8).

Observando a Figura 4.17, verifica-se a tendência do crescimento das BHA, em conformidade

com o aumento do consumo de nitrato (Tabela 4.17), apesar do aumento do teor de nitrito.

A redução da concentração de nitrito entre o décimo e o décimo sétimo dia, sem

consumo de nitrato, provavelmente está relacionada à redução parcial do nitrito a NH

ou sua

desnitrificação, com geração de N

, que continua ocorrendo devido a instabilidade do mesmo

Tabela 4.17 – Resultados obtidos na segunda etapa, com adição de 1000 mg/L de carbono.

Tempo

(dias)

residual

(mg/L)

consumido

(mg/L)

Taxa de

consumo

de NO

(mg/L.dia)

480*

± 15

----

95*±7 1607*±5

0 ----

500

± 10 0 ± 10 50±10 1600 ± 20

0 0

450

± 8 30 ± 8 53 ± 10 1590 ± 23

0 3,5

390

± 8 60 ± 8 97 ± 12 1585 ± 25

0 8,5

302

± 5 88 ± 5 96 ± 10 1603 ± 10

0 13

112

± 3 101 ± 5 190 ± 5 1593 ±14

0 19

Valores referentes ao último dia da primeira etapa, e iniciais da segunda etapa.

0 5 10 15 20 25 30 35

Tem

(

)

1000000

10000000

100000000

1000000000

10000000000

100000000000

1E+01

eróbios

(

Figura 4.17- Número de bactérias heterotróficas anaeróbias com o tempo de operação.

105

Nesta etapa também não houve consumo de sulfato e produção de sulfeto. Estes

resultados em associação à ausência de crescimento de BRS, confirmam a intoxicação destas

bactérias pelo nitrito. Neste caso, não se confirma a possibilidade das BRS em sobreviver

mesmo em ambientes com aplicação do nitrato, já que algumas apresentam a capacidade de

realizar a respiração do nitrato (DUNSMORE, 2004). Sturman (2001) estudou os íons nitrito

para controlar o H

S em poços de óleo e gás, pois este produto é mais reativo do que o nitrato

e, portanto, apresenta eficácia superior na inibição das BRS e da geração de H

S. Seu

mecanismo de ação não se baseia na competição microbiana como o nitrato, mas sim em

mudanças químicas como, por exemplo, pela elevação do Eh do meio, estabelecendo um

ambiente desfavorável para as BRS.

A Figura 4.18 apresenta a concentração de nitrato e respectivo consumo com o tempo

de operação, do décimo quinto ao trigésimo dia, quando foi realizada adição de 1000 mg/L de

carbono. Observa-se comportamento distinto ao da primeira etapa, já que o consumo de

nitrato ocorre numa velocidade inferior (Figuras 4.16 e 4.18). Após o vigésimo quinto dia de

operação, a taxa de consumo de nitrato apresenta um aumento, provavelmente em função da

readaptação dos microrganismos às novas condições reacionais. No entanto, os valores de

taxa de consumo de nitrato foram sempre muito inferiores aos determinados na primeira etapa

(Tabelas 4.16 e 4.17).

15 20 25 30 35

Tempo (dias)

100

200

300

400

500

600

Concentração N

/L)

15 20 25 30 35

100

200

300

400

500

residual

consumido

Figura 4.18: Concentração e consumo de nitrato em função do tempo de operação,

após adição de 1000 mg/L

106

Considerando que o baixo consumo de nitrato e aumento da concentração de nitrito

poderia estar relacionado à limitação de nutrientes e não da fonte de carbono, no vigésimo dia

de operação, ainda na segunda etapa, foi feita a substituição em alguns dos reatores de 50%

do volume do meio reacional por igual volume do meio Postgate, a fim de promover o

enriquecimento do cultivo. A Tabela 4.18 mostra os resultados após adição de nutrientes.

Tabela 4.18 – Resultados experimentais após adição de nutrientes

Tempo

(dias)

residual

(mg/L)

consumido

(mg/L)

294

± 15

----

± 8 1230*± 12

± 5 240 ± 20 101 ± 10 1200 ± 10

± 3 14 ± 5 105 ± 12 1235 ± 12

± 4

102 ± 10 1230 ± 12

± 4

100 ± 12 1233 ± 10

± 2

100 ± 10 1229 ± 12

*Valores obtidos após adição do meio Postgate, estabelecendo o início da terceira etapa.

Pode-se observar que, após adição de nutrientes, o consumo de nitrato aumentou

sensivelmente em dois dias de operação. Concomitantemente, foi verificado o crescimento

das bactérias heterotróficas anaeróbias, sua concentração variando de 1,1 x 10

NMP/mL,

referente ao vigésimo dia, a 2,4 x 10

NMP/mL no vigésimo quarto dia. Por sua vez, as BRS

não apresentaram crescimento e não houve consumo de sulfato, nem produção de sulfeto,

apesar da adição de nutrientes e da conseqüente diluição dos constituintes do meio reacional.

As BRS não foram detectadas nem mesmo ao final do período operacional.

A partir do vigésimo quarto dia não ocorreu mais consumo de nitrato e sua

concentração final estabilizou em torno de 40 mg/L. A concentração de nitrito se manteve

também estável em torno de 100 mg/L até o trigésimo dia, e o número de BHA diminuiu para

4,7 x 10

NMP/mL. Este comportamento deve estar relacionado à formação de intermediários

metabólicos de efeito tóxico para o metabolismo das bactérias redutoras de nitrato

(GARBOSSA, 2003). Provavelmente, a continuação dessa etapa pode finalizar com a morte

da biomassa.

107

A Figura 4.19 apresenta a concentração de nitrato e respectivo consumo com o

tempo de operação após a adição de nutrientes. A taxa de consumo de nitrato foi acentuada

nos dois primeiros dias, isto é, logo após a adição de nutrientes, mostrando que o meio

reacional apresentava limitação de sais minerais e/ou vitaminas.

Alguns metais são componentes de enzimas, portanto, para atividade metabólica dos

microrganismos são necessários em pequenas concentrações, por isso sendo denominados

oligoelementos. Estes metais participam diretamente do processo catalítico ou podem ajudar a

manter a conformação estrutural nativa da enzima.

A adição de extrato de lêvedo aos meios de cultura é realizada com o intuito de

permitir ou estimular o crescimento microbiano, pois este contém vitaminas, principalmente

do complexo B, que são necessárias como constituintes ou precursores de enzimas e

coenzimas, além de aminoácidos e outras substâncias estimulantes.

20 22 24 26 28 30 32

Tem

o(di

100

150

200

250

300

350

Concentração de NO

(mg/L)

20 22 24 26 28 30 32

residual

consumido

Figura 4.19 - Concentração e consumo de nitrato em função do tempo de operação na terceira

etapa.

A quarta e última etapa deste teste foi realizada para avaliar o comportamento da

cultura microbiana frente a uma nova injeção de nitrato, visto a baixa concentração deste

ânion no meio reacional. Deste modo, a partir do vigésimo quarto dia de operação foi

reiniciada a adição intermitente de nitrato, a cada dois dias, durante 10 dias. A Tabela 4.18

mostra os resultados desta última etapa do estudo.

108

A adição de nitrato promoveu o aumento do seu consumo, e a conseqüente elevação

da concentração de nitrito, não obstante a taxa de consumo de nitrato tenha sido praticamente

constante no decorrer do processo. Além disso, a concentração inicial de bactérias

heterotróficas anaeróbias de 2,4 x10

NMP/mL, no vigésimo quarto dia, aumentou para 2,7 x

NMP/mL no trigésimo quarto dia. Logo, o aumento do número de BHA pode ser

atribuído ao crescimento das BRN devido ao consumo de nitrato e a geração de nitrito,

produto resultante do metabolismo de algumas espécies deste grupo microbiano. Este fato

pode ser confirmado pela redução da concentração de bactérias anaeróbias observada na

terceira etapa, quando os experimentos foram conduzidos em condições semelhantes exceto

pela não adição de nitrato.

Nesta etapa também não houve crescimento de BRS e, evidentemente, não foram

determinadas alterações no consumo de sulfato e na produção de sulfeto.

Tabela 4.19- Resultados experimentais da quarta etapa, com adição intermitente de

nitrato de 500 mg/L a cada dois dias

Tabela 4.19- Resultados experimentais da quarta etapa

Tempo

(dias)

residual

(mg/L)

consumido

(mg/L)

Taxa de

consumo de

(mg/L.dia)

*40

± 5

*105 ± 5 *1235 ± 12

0 ----

212

± 15 328 ± 127 ±10 1220 ± 10

0 164

266

± 20 446 ± 134 ± 8 1210 ± 15

0 193

374

± 25 392 ± 140 ± 12 1200 ± 12

0 197

395

± 21 479 ± 142 ± 10 1220 ± 10

0 206

495

± 38 400 ± 153 ± 7 1200 ± 10

0 208

* Valores referentes ao vigésimo quarto dia da terceira etapa, e correspondentes ao início da quarta etapa.

A Figura 4.20 mostra a variação do consumo de nitrato e a respectiva concentração

residual após adição única de nutrientes e intermitente de nitrato em função do tempo de

operação, do vigésimo quarto ao trigésimo quarto dia.

109

24 26 28 30 32 34 36

EMP

(

)

24 26 28 30 32 34 36

100

200

300

400

500

600

Concentração de NO

(mg/L)

residual

Consumido

Figura 4.20 - Concentração e consumo de nitrato em função do tempo de operação

após adição de nutrientes e nitrato.

A concentração residual de nitrato aumentou durante todo o tempo de operação

enquanto o consumo de nitrato se manteve praticamente constante, em torno de 400 mg/L, a

partir do segundo dia de operação (Tabela 4.19 e Figura 4.20). Um comportamento distinto

foi observado na primeira etapa, quando o sistema também foi conduzido com injeção

intermitente de nitrato (Tabela 4.16 e Figura 4.16). Naquela condição, o consumo de nitrato

foi decrescendo ao longo do tempo. As taxas de consumo de nitrato destas etapas também

foram diferenciadas, isto é, na primeira etapa a taxa diminui com o tempo e na quarta etapa se

manteve praticamente constante. Este fato pode estar relacionado à adaptação das bactérias a

altas concentrações de nitrato e às condições do meio reacional. Por outro lado, o valor médio

das taxas de consumo de nitrato foi igualmente de 200 mg/L.dia, para as duas etapas

realizadas com adição intermitente de nitrato. Vale ressaltar que o número de bactérias

heterotróficas anaeróbias ao final da primeira etapa (10º dia) e da quarta etapa (34º dia)

apresentaram a mesma ordem de grandeza (10

NMP/mL), indicando que o crescimento

celular possa ter atingido seu ponto de máximo.

A Figura 4.21 mostra a evolução da concentração de nitrato no meio reacional para

as 4 etapas desenvolvidas. Nota-se que a adição de nutrientes (terceira etapa) foi mais

importante para o aumento do consumo de nitrato do que a adição de carbono (segunda

etapa). Verifica-se também que houve consumo de nitrato nas etapas em que o nitrato foi

adicionado (primeira e quarta etapas), mostrando que as BRN mantiveram-se ativas durante

toda a operação.

110

0 4 8 1216202428323640

TEMPO(dias)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

CONCENT

O DE NO

(

/L)

adicionou

1000 mgC/L

Adição de

Nutrientes

Adiçãde de

(mg/L)

Figura 4.21 - Evolução da concentração de nitrato durante as quatro etapas.

A Figura 4.22 mostra a concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias em

função do tempo para as quatro etapas deste estudo. Observa-se que durante os dez primeiros

dias de operação (primeira etapa), em que ocorreu a adição intermitente de nitrato a cada dois

dias, houve um crescimento significativo de BHA. Provavelmente, as periódicas adições de

elevadas quantidades de nitrato tenham concorrido na aceleração do metabolismo das BRN.

Depois da adição de carbono no décimo dia, houve considerável morte celular, o número de

BHA permanecendo constante até o décimo quinto dia (segunda etapa). A adição de

nutrientes, através da substituição do meio reacional por igual volume de meio novo, resultou

na redução do número de microrganismos (20º dia); o suprimento de nutrientes estimulando o

crescimento celular (terceira etapa). Com a retomada da adição intermitente de nitrato, a

atividade metabólica das BHA foi favorecida, atingindo concentração celular semelllhante à

obtida ao final da primeira etapa. Assim pode se observar que nas etapas em que havia

nutriente e entrada intermitente de nitrato, o crescimento celular foi praticamente o mesmo.A

concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias, inicialmente de 9,5 x 10

NMP/mL e 1,1

x 10

NMP/mL na primeira e terceira etapas , respectivamente, atingiu 2,7x10

NMP/mL ao

final da quarta etapa.

111

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Tem

(

)

10000

100000

1000000

10000000

100000000

1000000000

10000000000

100000000000

1E+012

eróbios (N

Figura 4.22 – Variação da concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias para as quatro

etapas.

A Tabela 4.20 mostra os valores da taxa de consumo de nitrato e da concentração de

bactérias heterotróficas anaeróbias em cada etapa executada. Nota-se que a taxa de consumo

de nitrato foi maior quando o número de BHA era elevado, correspondendo às etapas onde foi

maior a concentração de nitrato ou houve suplementação de nutrientes e de carbono. De fato,

o consumo de nitrato deve ser atribuído mais especificamente às BRN, que são

microrganismos heterotróficos facultativos.

Os baixos valores de taxa de consumo de nitrato determinados para concentrações de

BHA da ordem de 10

NMP/mL, no vigésimo e trigésimo dia de operação da segunda etapa,

provavelmente foram ocasionados pelas altas concentrações de nitrato presentes no meio

reacional.

Tabela 4.20- Taxa de consumo de nitrato em função do tempo em cada etapa do experimento

Etapa

Tempo

(dias)

Concentração de

BHA

(NMP/mL)

Taxa de Consumo

Nitrato

(mg/Ldia)

0 9,5x10

0,0

Primeira

10 2,7x10

203,0

15 2,1x10

0,0

20 1,5x10

8,5

Segunda

30 7,0x10

19,0

112

20 1,1x10

0,0

24 2,4x10

63,5

Terceira

30 4,7x10

0,0

24 2,4x10

0,0

Quarta

34 2,7x10

208,0

4.6 - CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE SULFETO COM OU SEM ADIÇÃO DE

NITRATO

A cinética de produção de sulfeto de hidrogênio por uma cultura mista enriquecida

com BRS em efluente sintético foi realizada nas condições de otimização de mínima produção

de sulfeto, na presença ou ausência de nitrato, conforme descrito nas seções 3.12 e 3.13.

O estudo cinético teve como intuito comprovar a eficácia do uso do íon nitrato no

controle da geração de sulfeto através da indução seletiva das populações microbianas.

4.6.1 –CONSUMO DE NITRATO

A Tabela 4.21 mostra os dados referentes ao monitoramento do consumo de nitrato e

geração de nitrito após uma única injeção de nitrato de sódio.

Tabela 4.21 - Resultados obtidos nas análises de monitoramento do consumo de nitrato

durante a cinética com adição de nitrato

Tempo

(dias)

Residual

(mg/L)

Consumido

(mg/L)

Taxa de

Consumo de NO

(mg/Ldia)

Produção de

(mg/L)

2262

± 25

0 ---

1912

± 20

350 350

206 ± 9

1513

± 18

749 369,6

216 ± 10

113

1092

± 15

1170 382,7

203 ± 7

842

± 20

1420 367,9

201± 8

655

± 15

1607 346,8

184 ± 5

507

± 10

1755 325,3

175 ± 10

382

± 9

1880 305,5

167 ± 6

217

± 8

2045 276,8

153 ± 5

± 7

2185 239,4

125 ± 4

± 3

2231 204,8

102 ± 5

± 2

2247 176,5

96 ± 3

2,5

± 2

2259,5 154,6

88 ± 2

28 0

2262 127,2

72 ± 3

Ao longo de 28 dias, o nitrato adicionado foi gradativamente consumido, sendo

determinadas reduções superiores a 50% e 80%, respectivamente com 3 e 7 dias de operação.

Nos sete primeiros dias, as taxas de consumo de nitrato foram elevadas. Posteriormente, as

taxas apresentaram quedas acentuadas, provavelmente em conseqüência da baixa

disponibilidade de nitrato após o 9º dia. Fato que pode ser constatado na Figura 4.23. O

gráfico revela uma cinética de consumo de nitrato do tipo exponencial, indicando uma reação

de 1ª ordem em relação a sua concentração, ou seja:

d[NO

] = -k [NO

] ou [NO

] = [NO

]

inicial

-kt

d t

Do ajuste dos pontos experimentais a esta equação, obtém-se uma constante de

consumo de nitrato de 0,29 dia

-1

114

01020

Tempo (dias)

500

1000

1500

2000

2500

Concentração de Nitrato (mg/L)

Figura 4.23 – Perfil do consumo de nitrato.

4.6.2 – CRESCIMENTO MICROBIANO

As Figuras 4.24 e 4.25 apresentam o monitoramento das populações de bactérias

heterotróficas anaeróbias, redutoras de sulfato e redutoras de nitrato durante os estudos

cinéticos realizados sem e com adição de nitrato, respectivamente.

No consórcio microbiano empregado foi detectado um número inicial de BRN menor

que o das outras populações microbianas (BRS e BHA), cujas concentrações apresentavam a

mesma ordem de grandeza (Figura 4.24). Uma alta concentração de BRS era previsível por ter

sido o consórcio microbiano foi obtido a partir de vários subcultivos de amostra de água de

produção, onde já havia sido constatada a presença de BRS, em meio apropriado para o

crescimento destas espécies. Além disso, a composição do meio e a condição de anaerobiose

adotados nos subcultivos também eram próprias para atender às exigências necessárias ao

desenvolvimento das BHA.

A injeção de água do mar nos reservatórios situados em áreas

offshore, bem como as

condições nesses reservatórios permitem a existência de diferentes espécies microbianas na

água produzida, dentre elas, as pertencentes aos grupos das BRS, BHA e, inclusive, das

BRN(DAVIDOVA

et al., 2001; ECKFORD & FEDORAK, 2002, DUNSMORE et al., 2004).

Contudo, o baixo número de BRN, provavelmente, se deveu as condições pouco favoráveis ao

seu cultivo, já que o meio usado não continha sal de nitrato, ou ainda a inibição pelas

115

concentrações de H

S formado durante o enriquecimento do consorcio microbiano. Ademais,

as BRS são comumente encontradas em poços de petróleo, águas do mar e de produção, em

baixas quantidades quando comparadas às outras espécies, o que dificulta desta maneira sua

proliferação.

Na ausência de nitrato, não houve crescimento das BRN visto que a atividade

metabólica destas depende de nitrato/nitrito como aceptor de elétrons quando cultivadas em

condição de anaerobiose (Figura 4.24). Ao contrário, rapidamente foi notada a sua inativação,

provavelmente pela presença de H

S, produzido pelas BRS, e/ou outros produtos do

metabolismo das espécies ali presentes. No entanto, o crescimento, tanto das BRS quanto das

BHA, foi satisfatório, verificando-se um aumento significativo do número de ambas, logo nas

primeiras 24 h. Isto era previsível, já que a cultura tinha sido aclimatada de modo a estimular

o crescimento das BRS, que conforme anteriormente mencionado, também favorecem as

exigências nutricionais de outras bactérias heterotróficas anaeróbias. Estas duas populações

microbianas atingiram o máximo de crescimento ao redor de 8 horas, sendo o número das

BHA superior ao das BRS em 3 ordens de grandeza. Seguida à fase exponencial de

crescimento, nota-se uma rápida perda de viabilidade pelas células de BHA, enquanto as BRS

apresentam uma fase estacionária prolongada. Vários trabalhos fazem referência à

sobrevivência das células de BRS, mesmo das espécies que não são capazes de esporular, por

longos períodos (POSTGATE, 1984; BARTON, 1995; SERVULO, 2005).

01020

Tempo

(

dias

)

0x10

1x10

Concentração de BRN, BRS e anaeróbios (NMP/mL)



BRN



BRS



Anaeróbios

116

Figura 4.24 - Cinética do crescimento do consórcio microbiano em efluente sintético

na ausência de nitrato.

A adição de nitrato revelou comportamentos muito diferenciados das bactérias

presentes no consórcio microbiano (Figura 4.25). Conforme era de se prever, nas condições

de cultivo anteriormente otimizadas, ou seja, para redução da geração biogênica de H

S, as

células de BRN e BHA cresceram satisfatoriamente já nas primeiras 24 h. Não houve morte

de BRN, nem mesmo fase lag, comprovando que a composição do meio estava adequada para

atender suas exigências nutricionais básicas. O problema no experimento anterior foi apenas a

carência do ânion necessário para o metabolismo energético.

0 102030

Tempo

(

dias

)

1x10

Concent

ação de BRN e anae

óbios (NMP/mL)

0x10

2x10

4x10

6x10

8x10

1x10

Concentração de BRS (NMP/mL)



BRN



BRS



Anaeróbios

Figura 4.25 - Concentração de BRN, BRS e bactérias anaeróbias com o tempo de

operação na cinética com adição de nitrato.

Nesta condição, os perfis cinéticos destas duas populações (BHA e BRN)

microbianas foram semelhantes, com valores aproximados de velocidade específica de

crescimento e duração da fase exponencial, e curta fase estacionária. Contudo, novamente

houve uma prevalência do número de BHA.

No que tange ás BRS, o nitrato teve efeito inibitório acentuado provocando

acentuada morte celular nas primeiras 24 h, e a sua inativação total em pouco tempo. Existem

alguns relatos de que algumas espécies de BRS são capazes de sobreviver mesmo em

ambientes com aplicação de nitrato. Segundo alguns autores, isto seria possível através da

117

adaptação da respiração do sulfato pela do nitrato (DZIERZEWICZ, 1997; DUNSMORE,

2004). Segundo Dannenberg

et al. (1992), para algumas espécies de sulfato redutoras, a troca

respiratória (nitrato por sulfato) pode ocorrer quando concentrações ilimitadas tanto de sulfato

quanto de nitrato estão presentes, sugerindo haver uma competição pelo mesmo aceptor final

de elétrons (nitrato) entre BRS e BRN, quando ambas as espécies químicas estiverem

presentes no meio. Dunsmore (2004) obteve amônia a partir do cultivo da linhagem

Desulfovibrio (OP102), na ausência de sulfato, utilizando nitrato como aceptor final de

elétrons. A redução do nitrato ocorreu, mesmo na presença de sulfato, quando o nitrato estava

numa concentração mais baixa do que o íon sulfato. A redução microbiana do nitrato fornece

3 vezes mais energia que a redução microbiana do sulfato, de modo que, em ambientes onde

são encontrados tanto sulfato quanto nitrato, as BRN irão predominar (STOTT & RIZK,

2005). É neste contexto que se constata que o consumo do nitrato conduzirá a um crescimento

mais acentuado das BRN e, conseqüentemente, promoverá a depleção das fontes de carbono,

impedindo o desenvolvimento das BRS que apresentam metabolismo mais lento.

A aplicação de 0,5 mM de nitrato em coluna simulando um poço de petróleo com

injeção de água de produção garantiu o controle do

souring biogênico por cerca de 3 meses,

que segundo os autores foi devido a presença de nitrito (MYRH

et al., 2002). De acordo com

Reinsel

et al. (1996) já é reconhecida a eficácia do íon nitrito como agente antimicrobiano, o

que vem proporcionandoo seu uso, inclusive na indústria alimentícia.

Outra teoria, proposta por Sturman (2001), considera que a adição do nitrato

promove mudanças químicas, tornando o ambiente oxidante e, portanto, desfavorável ao

crescimento das BRS. Entretanto, já foi determinada a presença da enzima nitrito redutase em

espécies de BRS, sendo a expressão do gene mediada pela exposição destes organismos a

ambientes com nitrato (GREENE

et al., 2003). Esta é uma hipótese de mecanismo através do

qual as BRS se protegeriam da presença do nitrito, através de um mecanismo de

desintoxicação (DUNSMORE, 2004).

No experimento do planejamento composto central (PCC), realizado com adição de

nitrato, pode ser observado no ponto de mínima produção de sulfeto que a população de BRS

diminui e a de BHA aumenta, ratificando as observações feitas para a Figura 4.25. A análise

das concentrações celulares mostra que o aumento do número de BHA está diretamente ligado

ao aumento na concentração de BRN, e que neste mesmo período, a concentração das BRS

diminui até a sua completa inibição. Este resultado demonstra a eficácia do nitrato no

aceleramento do metabolismo das BRN, que inicialmente estavam em menor concentração do

que as outras duas populações, e também a capacidade das BRN em inibir as BRS. Esta pode

118

ser a explicação para a alta concentração de bactérias heterotróficas anaeróbias encontradas

no PCC, frente a grande concentração de nitrato e a baixa concentração de BRS. Ao final do

experimento, pode ser constatado que o decréscimo da concentração de nitrato resulta na

diminuição do número de BRN, por conseguinte, as bactérias anaeróbias diminuem e as BRS

voltam a crescer. Tal fato indica que o nitrato apenas inibe as BRS, possibilitando que na

ausência do mesmo retomem o crescimento, e ainda que as BRN só se apresentam em

números significativos frente a altas concentrações de nitrato ( Tabela 4.22).

Segundo McInerney

et al. (1993), o suprimento de nitrato, na ausência de uma

população de BRN, não foi capaz de reduzir os níveis de sulfeto, em experimentos realizados

com água de formação. A concentração do sulfeto só foi reduzida quando uma cultura

microbiana de BRN foi introduzida. Por isso, o sucesso da adição do nitrato para controle da

geração de H

S biogênico depende principalmente da presença de uma população ativa de

BRN (DAVIDOVA, 2001).

Tabela 4.22 Concentração dos microrganismos presentes no consórcio microbiano durante a

cinética de produção de sulfeto em presença e ausência de nitrato.

Tempo

(dias)

BRS

(NMP/mL)

BRN

(NMP/mL)

BHA

(NMP/mL)

sem NO

-7

com NO

-3

Sem

com NO

-3

sem NO

-7

com NO

-6

0,18

± 0,02 1.800 ± 200

1,1.10

0,11 ± 0

0,095

± 0,0 0,95 ± 0

0,41

± 0,02 700 ± 0

3 ± 0

0,93

± 0,02 7,7 ± 0,7

0,95

± 0,0 120 ± 20

93 ± 2

9,2

± 0,2 120 ± 10

2,2

± 0,1 22 ± 1

930 ± 20

410

± 20 15.000 ± 500

6,4

± 0,0 9,3 ± 0,2

2.100 ± 100

1.500

± 500 64.000 ± 0

± 2,0 0,73 ± 0,02

3.900 ± 0

9.300

± 200 110.000 ± 0

± 0,0 0,13 ± 0,02

4.300 ± 0

27.000

±700 180.000 ± 1000

± 2,0 0,022 ± 0,001

6.400 ± 0

40.000

±200 270.000 ± 700

180

± 20 0 ± 0

5.700 ± 700

30.000

± 0 300.000 ± 0

200

± 0,0 0 ± 0

2.100 ± 100

9.300

± 200 95.000 ± 0

119

230

± 20 0 ± 0

680 ± 20

640

± 0 9.200 ± 200

180

± 20 0 ± 0

95 ± 0

± 2 670 ± 40

230

± 10 0,030 ± 0

14 ± 1

9,3

± 0,2 220 ± 20

200

± 20 0,040 ± 0

1,2 ± 0,2

4,3

± 0 120 ± 10

4.6.3 – PRODUÇÃO DE SULFETO

Nos dois estudos cinéticos, com e sem a adição de nitrato, concomitantemente foi

realizado o monitoramento da produção de sulfeto de hidrogênio e do consumo de sulfato,

cujos dados estão apresentados na Tabela 4.23

Na Tabela 4.23 pode se observar que o consumo de sulfato não foi inferior a 3% em

28 dias, e a concentração de sulfeto foi menor que a encontrada nas condições de otimização

do PCC. Portanto, a adição de nitrato impediu o consumo de sulfato e, consequentemente, a

geração de sulfeto. Na verdade, o nitrato promoveu a das BRS (Figura 4.26).

Tabela 4.23 – Monitoramento de sulfato e de sulfeto durante os estudos cinéticos

com e sem adição de nitrato

(mg/L)

Tempo

(dias)

sem NO

com NO

sem NO

com NO

1600

± 25 1616 ± 15

0 0

1540

± 20 1591 ± 20 18 ± 2

1475

± 18 1595 ± 18 40 ± 5

1395

± 15 1588 ± 15 66 ± 7

1310

± 20 1593 ± 20 96 ± 9

1200

± 15 1590 ± 15 131 ± 10

120

1080

± 10 1588 ± 10 171 ± 10

980

± 10 1587 ± 10 205 ± 12

940

± 15 1582 ± 15 217 ± 13

920

± 12 1593 ± 12 224 ± 10

900

± 19 1597 ± 19 230 ± 15

895

± 22 1590 ± 22 234 ± 10

888

± 20 1585 ± 10 238 ± 12 3,5 ± 0,5

885

± 25 1570 ± 10 240 ± 10 6,0 ± 0,6

Na ausência de nitrato, foram determinados valores bem superiores de sulfato

consumido e de H

S gerado comparativamente aos obtidos com adição deste ânion (Figura

4.26 e Tabela 4.23). Entretanto, considerados o crescimento e a relação molar sulfato reduzido

Sulfeto produzido, tem-se que deveria ter havido consumo total do sulfato e a concentração de

sulfeto formado deveria ser maior. Provavelmente, isto foi devido à inibição das BRS pelo

sulfeto de hidrogênio. Dependendo da espécie e das condições operacionais, este gás dada a

sua solubilidade, e tóxico.Vale ressaltar que, após o 9º dia, a concentração de BRS se manteve

inalterada enquanto houve um declíneo do número de células viáveis de BHA. Logo, o

comportamento apontado para as BRS pode estar relacionado à falta de nutrientes ou da fonte

de carbono, ao invés de ser pela toxicidade do gás sulfidrico.

121

010203

51525

Tempo (dias)

400

800

1200

1600

200

600

1000

1400

Concent

ação de Sulfato e H

S (mg/L)

400

800

1200

1600

200

600

1000

1400



Sulfato com nitrato



Sulfato sem nitrato



S com nitrato



S sem nitrato

Figura 4.26 - Produção de sulfeto e consumo de sulfato para os cultivos do consórcio

microbiano realizado com e sem adição de nitrato.

Os coeficientes angulares determinados a partir das curvas de consumo de sulfato e

de produção de sulfeto (Figura 4.26) foram usados no cálculo das taxas de consumo, obtendo-

se de 82,5 mg SO

/L.dia e 27,1 mgH

S/L.dia respectivamente para os primeiros 7 dias. Os

valores obtidos são coerentes, pois resulta num quociente entre ambas de 3,0, confirmando

com o valor teórico esperado.

Considerando que a cinética de consumo de sulfato obedece a uma cinética de 1ª

ordem se determina o valor de 0,055 dia

-1

para a constante de consumo de sulfato, que é bem

inferior ao valor obtido para a constante de consumo de nitrato pelas BRN (0,29 dia

-1

). Este

resultado mostra que sob condições semelhantes de cultivo, as BRN na presença de nitrato

possuem um metabolismo mais rápido, comparativamente às BRS frente ao sulfato,

corroborando outros trabalhos.

Comparando as Tabelas 4.22 e 4.23, nota-se claramente a eficácia do nitrato na

inibição das BRS, desta forma inibindo o consumo de sulfato e também a produção de sulfeto.

Este trabalho demonstra que o nitrato apresenta potencialidade de uso no tratamento

biológico anaeróbio de efluentes com alto teor de sulfato, permitindo a redução do número de

BRS viáveis e, especialmente, da geração de H

S. No que concerne à indústria de petróleo, o

uso de nitrato é vantajoso pois, além de ser efetivo no controle do “souring” nos reservatórios

122

é menos tóxico do que os biocidas normalmente utilizados, facilitando o seu manuseio pelos

operadores e não oferecendo riscos à saúde dos seres vivos.

4.6.3.1 MODELO PROPOSTO PARA A CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE SULFETO

SEM ADIÇÃO DE NITRATO.

Usando os dados obtidos de experimentos em batelada para a produção de sulfeto

sem a adição de nitrato no meio – a concentração de sulfato, a cinética de crescimento das

BRS e a produção de H

S foram determinados. Para a modelagem trabalhou-se com as

equações adimensionalisadas, pois as unidades de medidas para a concentração de BRS e de

consumo de sulfato e formação de sulfeto eram diferentes e não foi possível a obtenção de

uma equação de calibração para que se fizesse a conversão de unidades. Portanto, o modelo

do tipo Monod utilizado para o crescimento torna-se:

máx

(4.14)

Sendo:

= Velocidade específica de crescimento

K = Constante de Saturação.

Um balanço de massa foi realizado para estabelecer a formulação matemática do

crescimento celular.

xKx

−==

µγ

(4.15)

O consumo do substrato destinado ao crescimento ou a reprodução é dado pela

equação (4.16) desprezando o termo ara a manutenção celular introduzido por Pirt (1975).

−=

(4.16)

(4.17)

123

e o modelo para a formação de H

S dado pela expressão do tipo de Luedeking & Piret

(Eq 4.18) que relaciona a velocidade especifica de formação de H

S com a velocidade

especifica de crescimento das BRS desprezando o termo independente do crescimento.:

(4.18)

sendo:

x*= (ln(x+x

)/x

) = adimensional do número mais provável de BRS [ - ]

S*= S/S

= concentração adimensional de SO

consumido [ - ]

P*= P/P

= concentração adimensional de H

S formado [ - ]

, P

, S

– condições iniciais.

As equações (4.14 - 4.18) adimensionalisadas descrevem a modelagem matemática

da produção de sulfeto via BRS e permitem simular condições para a formação de H

S no

efluente sintético (que simula água de produção), sem a adição de nitrato. Assim, pode se

prever em outras condições a produção de sulfeto como, por exemplo, variando a

concentração inicial de sulfeto ou de concentração da BRS.

A identificação paramétrica foi possível a partir dos resultados experimentais. Os

valores dos parâmetros foram obtidos por uma técnica de regressão não-linear, usando um

algoritmo de resposta múltipla (MARQUARDT ,1963). A integração do conjunto de equações

diferenciais para o cálculo dos parâmetros por ajuste dos dados experimentais foi realizada

com auxílio de um algoritmo de Runge-Kutta de quarta-ordem. A identificação paramétrica é

ilustrada por uma boa correlação, entre os valores experimentais e aqueles fornecidos pelo

modelo. O erro médio relativo dos parâmetros na regressão não-linear foi calculado, junto

com a soma dos quadrados dos resíduos, definida pela Equação (4.19), referida ao número de

dados:

()

exp

theor

SRS

−

∑

(4.19)

Os resultados obtidos para os parâmetros da cinética do modelo de Monod e das

equações de balaço para o consumo de sulfato, a produção de sulfeto e o crescimento celular

estão apresentados na tabela 4.24.

124

TABELA 4.24- Parâmetros do modelo para a cinética de formação de BRS, decomposição de

sulfato e produção de H



máx

-1

)

[-] K

[-] [-] m [-]

0,531x10

0,294x10

±0,354 0,854±0,121 0,682x10

-1

±0,426x10

-2

0,151±0,430x10

-2

SRS = 2,030x10

-1

– obtido pela aplicação da definição

aos dados experimentais.

A cinética da redução anaeróbia do sulfato nas condições do experimento é mostrada

na Figura 4.27. A velocidade específica máxima de crescimento foi de

máx =

5,310 d

-1

= 0,221

-1

, superior aos valores reportados na literatura. MOOSA et al. (2002) encontraram

máx =

0,061 h

-1

utilizando uma cinética de Contois, WIDDEL e PFENNING (1982) e

O’FLAHERTY

et al. (1998) encontraram valores de 0,063 e 0,068 h

-1

, respectivamente, para

velocidade de crescimento de

Dessulfotomaculum acetooxidans. Valores baixos de

máx

também foram reportados para BRS na literatura. Investigando a competição entre BRS e

bactérias metanogênicas, VISSER (1995) encontrou que

máx

variava entre 0,002 e 0,005 h

-1

Um valor de 0,013 h

-1

foi encontrado para a velocidade de crescimento de Desulfobacter

postgatei

por INGVORSEN et al. (1984). Estas variações podem ser atribuídas às diferentes

espécies de bactérias utilizadas e as várias condições utilizadas nos diversos trabalhos. No

caso deste trabalho em particular o crescimento celular foi realizado por contagem de

bactérias e não por massa seca o que justifica a grande diferença existente entre os valores de

máx

reportados

na literatura e o encontrado pelo modelo utilizado neste trabalho.

A constante de saturação (

) foi de 2,940 em grandeza adimensional, que

utilizando-se do valor da concentração inicial de sulfato assume o valor de 47,040 kg m

-3

Valores de

reportados na literatura para a bio-redução do sulfato variam entre 0,018 e

0,033 kg m

−3

(CHEN & HASHIMOTO, 1980). Estudando a redução do sulfato por uma

cultura mista de BRS em um UASB contínuo VISSER (1995) encontrou

de 0,033 kg m

−3

para um sistema de biomassa granular e 0,018 kg m

−3

para um sistema de células suspensas.

No crescimento de uma cultura pura de

Desulfobacter postgatei em reator tanque agitado

contínuo sobre limitação de sulfato INGVORSEN

et al. (1984) encontrou valores de Ks de

0,024 kg m

−3

enquanto

MOOSA et al. (2002) encontrou valores de K

variando de 0,027 a

0,125 kg m

−3)

. Como no caso anterior, os valores obtidos neste trabalho e os relatados na

125

literatura são muito diferentes como esperado, devido às diferentes condições de realização

dos experimentos.

Os valores of Y

x/sulfato

dados na literatura em (g biomassa/ g sulfato) não podem ser

comparados aos valores deste trabalho, pois o crescimento celular foi realizado por contagem

de bactérias.

0 5 10 15 20 25 30

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

BRS

modelo

Concentração de BRS adimensionalisada - (x*)

tempo (d)

Produção de H

S adimensionalisada -(P*)

Consumo de Sulfato adimensionalisado -

(S*)

Consumo de Sulfato

Modelo

modelo

Figura 4.27- Evolução da concentração de BRS, consumo de sulfato e produção de H

4.6.3.2 – MODELO PROPOSTO PARA A CINÉTICA COM ADIÇÃO DE NITRATO

Quando se tem a adição de nitrato ao meio simultaneamente das condições de

matéria orgânica da água do mar têm-se a inibição das BRS e o crescimento das BRN. Os

valores de crescimento de BRN e consumo de nitrato, obtidos experimentalmente para este

ensaio foram utilizados para obtenção de um modelo que permite descrever o comportamento

destas variáveis em outras situações.

Trabalhou-se com equações adimensionais, pois foi realizada a contagem de

bactérias e não a medida de massa seca. Para este experimento a cinética que melhor

conseguiu descrever o comportamento do crescimento das BRN segue um modelo de Contois

(1959) (CHEN & HASHIMOTO, 1980).

126

* SxK

máx

(4.20)

A equação utilizada para descrever o crescimento das BRS é dada pela equação do

balanço de massa (4.20).

xKx

−=

(4.21)

No caso da modelagem do consumo de Nitrato, como os dados obtidos

experimentalmente apresentavam um comportamento exponencial, optou-se por uma

modelagem mais simples para descrever este consumo. Neste caso, em particular trabalhou-se

com uma equação de primeira ordem para descrever o balanço de massa do substrato (nitrato)

no reator anaeróbio (4.21).

−=

(4.22)

com as variáveis adimensionalisadas dadas por:

x*= (ln(x+x

)/x

) = adimensional do número mais provável de BRN [ - ]

S*= S/S

= concentração adimensional de NO

consumida [ - ]

, S

– condições iniciais.

Os parâmetros para o crescimento celular foram obtidos pelo ajuste do modelo

descrito aos dados experimentais pela técnica de regressão não-linear, usando um algoritmo

de resposta múltipla de MARQUARDT (1963) e com o somatório dos quadrados dos resíduos

dados pela equação (4.19). O parâmetro

foi ajustado independentemente por um ajuste não

linear. Os valores obtidos estão apresentados na Tabela 4.24.

TABELA 4.25- Parâmetros do modelo para a cinética de formação de BRNe consumo de

nitrato.

máx

-1

)

[-] K

[-]

0,619

x10

± 0,181 x10

0,122

x10

±0,417

0,820 x10

-1

±0,346 x10

-2

0,241±0,651x10

-2

127

SRS = 1,983

Não foi possível uma comparação teórica entre os valores obtidos por esse modelo e

valores da literatura, uma vez que neste trabalho em particular o acompanhamento do

crescimento celular foi realizado por contagem celular. A Figura 4.28 apresenta o resultado

da aplicação do modelo proposto com os respectivos parâmetros ajustados para o consumo de

nitrato e o crescimento de BRN.

0 5 10 15 20 25 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Conc. de Nitrato

modelo

Concentração adimensional de nitrato (S*)

tempo (d)

Concentração adimensional de BRN (x*)

BRN

Modelo

Figura 4.28- Evolução do comportamento do consumo de nitrato e crescimento de BRN.

CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES

5.1 – CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se enunciar as seguintes

conclusões:

 Na etapa de aclimatação, a cultura mista enriquecida com bactérias redutoras de

sulfato cresceu satisfatoriamente utilizando carbono como fonte de energia, em concentrações

de até 5 g/L.

 No PCC, a menor produção de sulfeto foi de 10,3 mg/L, sendo as concentrações

de nitrato e sulfato as variáveis que mais influenciaram na redução da produção do sulfeto.

 A otimização do processo de minimização da produção de sulfeto foi obtida para

as seguintes condições: 1616 mg/L de sulfato, 444 mg/L de carbono e 2262 mg/L de nitrato,

resultando em 8,2mg/L de produção de sulfeto e 30 NMP/mL de BRS.

 Na reprodução de um dos experimentais do PCC (ensaio14), na ausência de

nitrato, obteve-se uma produção de 224mg/L de sulfeto e 2,3x10

NMP/mL de BRS, deixando

claro a influência da concentração de nitrato no crescimento das BRS e, conseqüentemente, na

produção de sulfeto.

 Os pontos de otimizações e as superfícies de resposta mostraram que altas

concentrações de nitrato favoreceram a atividade das bactérias anaeróbias, inibiram o

crescimento das BRS, e diminuíram o consumo de sulfato e a produção de sulfeto.

 Verificou-se que os pontos de otimização para a minimização de produção de

S, de consumo de sulfato e de número de BRS, são bastante próximos, significando que o

crescimento de BRS está relacionado com o consumo de sulfato e conseqüente produção de

• A concentração de carbono pouco influenciou na produção de H

S, significando

que efluentes com cargas orgânicas bem distintas podem ser tratados com as mesmas

condições de concentração de nitrato visando obter menor produção de sulfeto.

 Para valores maiores da relação C/N (carbono/nitrato), obteve-se uma menor

concentração de nitrito e nitrato residual, pois devido à presença do doador de elétrons

(carbono) garantiu-se uma maior desnitrificação.

 No estudo do comportamento da cultura microbiana perante a entrada

intermitente de nitrato no tempo pré-estabelecido de 48 horas pôde-se observar que:

129

 A taxa de consumo de nitrato só foi significativa quando havia um número maior

de bactérias anaeróbias, acima de 1x10

NMP/mL, uma maior concentração de nitrato e no

meio haviam sido adicionados nutrientes e fonte de carbono.

 Com a entrada intermitente de nitrato não houve crescimento de BRS e nem

produção de sulfeto ao longo de todo o experimento, mesmo durante o período em que não

havia entrada do mesmo.

 A adição de nutrientes foi mais importante para o aumento do consumo de

nitrato do que a adição de carbono. Nas etapas em que adicionou-se nitrato houve consumo do

mesmo, mostrando que as BRN mantiveram-se ativas durante toda a operação.

 Nas etapas em que havia nutriente e entrada intermitente de nitrato, o

crescimento celular foi praticamente o mesmo.

 Na ausência de nitrato naão houve crescimento das

 Na ausência de nitrato, não houve crescimento das BRN visto que a atividade

metabólica destas depende de nitrato/nitrito como aceptor de elétrons quando cultivadas em

condição de anaerobiose. E o crescimento tanto das BRS como das BHA foi satisfatório,

tendo um aumento significativo nas primeiras 24h./

 No cultivo nas condições de otimização, as células de BRN e BHA cresceram

satisfatoriamente nas primeiras 24h, não houve morte nem mesmo fase lag, comprovando que

a composição do meio estava adequada para atender suas exigências nutricionais básicas. O

nitrato teve efeito inibitório acentuado para as BRS provocando uma grande mortandade

celular nas primeiras 24h

 Oconsumo de nitrato conduziu a um crescimento mais acentuado das BRN,

promovendo uma depleção das fontes de carbono, impedindo o desenvolvimento das BRS que

apresentam metabolismo mais lento.

 Frente as baixas concentrações de nitrato no final dos experimentos, as BRN e as

BHA diminuem e as BRS voltam a crescer, indicando que o nitrato apenas inibeas BRS,

possibilitando que na ausencia do mesmo retomem o crescimento

 O nitrato apresenta potencialidade de uso no tratamento biológico de efluentes

com alto teor de sulfato, permitindo a redução do número de BRS e da geração de sulfeto de

hidrogênio.

130

5.2 – SUGESTÕES PARA TRABALHOS POSTERIORES

Após a conclusão deste trabalho, sugere-se para posteriores estudos:

 Estudar a redução da produção de sulfeto, na presença de nitrito.

 Testar a condição de otimização com outra cultura de microrganismos, por

exemplo, cultura de BRN.

 Verificar se, após a entrada intermitente de nitrato, as BRS voltam a se

desenvolver depois de um determinado tempo.

 Acompanhar o crescimento de BRN, durante um processo de entrada

intermitente de nitrato.

 Testar o processo em outros tipos de reatores e em maior escala.

 Estudar detalhadamente a modelagem do processo.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

‘

ALI, S.A.; DARLINGTON, L. W.; OCCAINTI, J. New Filtration Process Cuts Contaminants

from

Offshore Produced Water. Oil & Gas Journal, 1998.

ALVAREZ, P.J.J; DA SILVA, M.L.B. Enhanced anaerobic biodegradation of benzene –

toluene – ethylbenzene – xylene – ethanol mixtures in bioaugmented aquifer columns.

Applied and Environmental Microbiology

, v. 70, p. 4720-4726, 2004.

APHA, AWWA, WPCF. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater

. 18

edition, New York, 1992.

B. V. KJELLERUP, R. H. VEEH, P. SUMITHRARATNE, T. R. THOMSEN,

K. BUCKINGHAM-MEYER, B. FRØLUND AND P. STURMAN Monitoring of

microbial souring in chemically treated, produced-water biofilm systems using

molecular techniques Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Volume 32,

Number 4 Pages: 163 - 170 April 2005

BABOSA, R.A. 1998. Tratamento anaeróbio de esgoto sanitário em reator de fluxo

ascendente com leito de lodo. Rio de Janeiro: COPPE/UFRJ. 242p.Tese de Mestrado

em Engenharia Química.

BARROS NETO, B.; SCARMINO, I.S.; BRUNS, R.E. Planejamento e otimização de

experimentos. 2

. ed., Editora Unicamp, Campinas,1995.

BARTON, L. L., Sulphate-reducing bacteria

. Biotechnology Handbooks, v. 8, New York,

Plenun Express, 1995;

BARTON, L. L. & TOMEI, F.A. Characteristics and activities of sulfate-reducing bacteria.

In: Sulphate-reducing bacteria

. Biotechnology Handbooks, v. 8, New York, Plenun

Express, 1995;

BOOPATHY, R. Use of anaerobic soil slurry reactor for the removal of petroleum

hydrocarbons in soil. International Biodeterioration & Biodegradation

, v. 52, p. 161-

166, 2003a.

BOX, G. E. P. HUNTER, W. G., HUNTER, T.S. Statistics for Experimenters

. United States

of America and Canada, John Wiley & Sons, Inc., 1978.

BRAILE, P.M,; & CAVALCANTI, J.E.W.A..Manual de Tratamento de águas Residuárias

Industriais, CETESB, Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental, São Paulo

1993;

BURKE, N.E.; CURTICE, S.; LITTLE, C.T. ET AL. REMOVAL OF Hydrocarbons from

Oilfield Brines by flocculation with Carbon Dioxide. SPE 21046, 457-465, 1991.

BURNS, K.A.; CODI,S.; FURNAS, M ET AL. Dispersio an Rate of Produced Formation

Water Constiuents in an Australian Nothwest Shelf Shallow Water Ecosystem, 1999.

132

BURNS, K.A.; CODI, S.; LITLLE, CT. Rt al. Removal of Hydrocarbons from Oilfield Brines

by Flocculation with Carbon Dioxide. SPE 21046, 1991.

CASTRO, J.F.T.; BARROS, E.C. SHIOYA, N. H. Evolution of Produced Water Treatment in

Campos Basin. SPE 46580, p1-5,1998.

CHEN, Y. R., & HASHIMOTO, A. G. Substrate utilization kinetic model for biological

treatment processes.

Biotechnology and Bioengineering, 22, 2081–2095, (1980).

CHARACKLIS,W.G.; MARSHALL,K.C. 1990. Biofilms, New York, John Wiley & Sons,

INC. 796 p

COLLERAN, E.; FINNEGAN, S.; LENS, P., Anaerobic treatment of sulphate-containing

waste streams. Department of Microbiology, University College, Galway, Republic of

Ireland, 1994.

CRAVO Jr., W.B. Formação de Biofilme e Biocorrosao em superfícies metálica

. Qualificação

de doutorado - EQ/UFRJ, Rio de Janeiro., 2001.

DALSGAARD,T.E;THAMDRUP,B. Factors Controlling Anaerobic Ammonium Oxidation

With Nitrite in Marine sediments. Applied and Environmental Microbiology, V 68, N 8,

p 3802-3808, 2002.

DANNENBERG S, KRODER M, DILLING W, CYPIONKA, H (1992) Oxidation of H

organic compounds and inorganic sulfur compounds coupled to reduction of O

nitrate by sulfate-reducing bacteria. Arch Microbiol 158:93–99

DAVIDOVA, I.; HICXKS, M.S.; FEDORAK,P.M.; SUFLITA, J.M..The influence of nitrate

on microbial process in oil industry productions waters. Journal of industrial

microbiology e biotechnology,2001.

DUNSMORE, B. C.; WHITFIELD, T. B.; LAWSON, P. A. COLLINS M.D. Corrosion by

SulfateReducing Bacteria that Utilize Nitrate

- Corrosion 2004, Paper 04763, NACE

International, 2004.

DZIERZEWICZ, Z., B. CWALINA, E. CHODUREK, AND T. WILCZOK. 1997. The

relationship between microbial metabolic activity and biocorrosion of carbon steel.

Research in Microbiology, 148:785-793.

ECKFORD, R. E., AND P. M. FEDORAK. 2002. Planktonic nitrate-reducing bacteria and

sulfate-reducing bacteria in some western Canadian oil field waters. J. Ind. Microbiol.

Biotechnol. 29:83-92.

Energy Institute, 2003; www.bio.ucalgary.ca,2004

FANG, C. S,; LIN, J. H. Air Striping for Treatment of Produced Water. J. Petr. Tech., v 40,

n5, p.619-624,1998.

FELIPE, C.A.V. Influência das variáveis de processo na qualidade de sementes de soja

submetidas a secagem em leito deslizante e escoamentos concorrentes. Dissertação de

Mestrado – FEQUI/UFU, Uberlândia, 1999.

133

FLANIGAN, D. A.; SKILBECK, F.; STOLHAND et al. Use of low-shear pumps in

conjunction with hydrocyclones for improved performance in the cleanup of low-

pressure produced water. Society of Petroleum engineers (SPE) 19743, p. 413-

422,1989.

FLEMMING, H.-C. 1996. Economical and technical overview. In: Microbially Influenced

Corrosion of Materials. Heitz, E., Flemming, H.-C, and Sand, W. (eds), Berlin,

Springer-Verlag.

GARBOSSA, L.H.P. Desenvolvimento e avaliação de sistemas de leito fixo-reator misto

radial seguido de reator anóxico horizontal- para remoção de matéria e de nitrogênio de

esgoto sanitário. Dissertação de Mestrado, EESC/USP, São Carlos ,2003.

GENTIL, V. Corrosão

. 3

.ed, Rio de Janeiro, Livros Técnicos e Científicos, 1996, 345 p.

GONZÁLEZ, J.E.G., SANTANA, F.J.H., MIRZA-ROSCA, J.C. 1998. Effect of bacterial

biofilm on 316SS corrosion in natural seawater by eis. Corrosion Science, 40(12): 2141-

2154.

GREENE, E. A.; HUBERT, C; NEMATI,M.;JENNEMAN, G.E., AND G. VOORDOUW.

Nitrite reductase activity of sulphate-reducing bacteria prevents their inhibition by

nitrate-reducing, sulphide-oxidizing bacteria.

Environmental Microbiology, 5: 607-

2003

GUIDA, J.W.; FROGE, D.E. Improved Wastewater Treatment. Hydrocarbon Processing,

p.55-60,1995.

HAEGH, T. Fertilisers are increasing productivy not only on the farm, but also on offshore oil

reservoirs. Royal Society of Chemistry, chembytes e-zine, 2000.

HANG, J.S.; VARADARAJ, R. Colloid and Interface Science in the Oil Industry. J. Coolloid

and Interface Sci., v.1, p.535-539,1996.

HANSEN, B.R.; DAVIESS, S.R.H.; Review of Potencial Technologies for the Removal of

Dissolved Components from Produced Water. Chemical Engineering Research and

Design, 1994.

HARRISON, J.R., A.P. Microbial sucession and mineral leaching in a artificial coal spoil.

Applied and Environmental Microbiology

, n. 131, p. 68-76, 1982.

HENZE, M.; HARREMÕES ,P.;JANSEN J.L.G.; ARVIM,e.. Wastewater treatment.

Germany 1997.

HER, J. HUANG, J. Influence of carbon source and C/N ratio on nitrate/nitrite denitrifcation

carbon breakthough. Bioressource technology,1995.

HITZMAN, D.O.; SPERL, G.T.; SANDBECK, K.A.

Composition for reducing the amount of

and preventing the formation of hydrogen sulfide in an aqueous system, particulary in

an aqueous system used in oil field applications

. United States Patent Nº 5.750.392.

Data: 12 de Maio de 1998.

134

HOLT, J.G. et al. Bergey’s manual of determinative bacteriology

. 9

edition, editor John G.

Holt – in – Chief, Williams & Wilkins Baltimore, London, 1994.

INGVORSEN, K., ZEHNDER, A. J. B., & Jorgensen, B. B. Kinetics of sulphate uptake by

Desulfobacter postgatei. Applied an Environmental Microbiology, 47, 403–408, (1984).

INSTITUTO ADOLFO LUTZ- Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz v 1 3

ed São

Paulo 1985.

IPPC- Integrate Pollution Prevention and Control- Joint Research Centre – European

Commision. Reference document on best available techiniques for the tanning of hides

and skins. Sevilha,2003.

IULTCS- International Union of Leather |Technologist and Chemist Societies. Minutes of the

annual meeting of the IUE environment and waste commission- CTC Lyon, França,

2002.

JAVAHERDASHTI, R. 1999. A review of some characteristics of MIC caused by sulfate-

reducing bacteria: past, present and future. Anti-Corrosion Methods and Materials,

46(3): 173-180.

JACOBS, M. B.; BRAVERMAN, M. M; HCHEISER, S., “Ultramicrodetermina-tion of

Sulfides in air”. Anal Chem., v. 29, p 1349-1951, 1957.

JENNEMAN, G.E.;GEVERTZD. (1999). Identification, characterization and application of

sulfide-oxidizing bacteria in oil fields. Proceedings of the 8

International Symposium

on Microbial Ecology, Bell CR, Brylinsky M, Jhonson- green P (ed), Atlantic Canada

Society for Microbial Ecology, Halifax, Canada.

JONATHAN D. VAN HAMME, AJAY SINGH, AND OWEN P. Ward Recent Advances in

Petroleum Microbiology Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 67, No. 4,

p. 503-549, December 2003

KANE, R.D.; SURINCH,P. A field study of microbiological growth and reservoir souring,

corrosion 97. paper n 208, 1997.

KARTHIKEYA, R. & BHANDARI, A. 2001. Anaerobic biotransformation of aromatic and

polycyclic aromatic hydrocarbons in soil microcosms: a review. J hazard sbst ares 3:1-

KERESZTES, Z., FELHOSI, I.

& KÁLMÁN E. 2001. Role of redox properties of biofilms in

corrosion processes. Electrochimica Acta, 46: 3841-3849.

KLEIMKEMPER, J.;SCHROTH, M. H.; SIGLER, W.V.; SCHMUCKI, M.; BERNASCONI,

S.M.; ZEYER, J. Activity and diversity of sulfate-reducing bacteria in a petroleum

hydrocarbon-contaminated aquifer. Applied and Environmental Microbiology

, v. 68, p.

1516-1523, 2002.

135

KRUMHOLZ, L.R.; STEGER, J.L.; VINCENT, C.; BALLARD, J.D.

Desulfovibrio sp. genes

involved in the respiration of sulfate during metabolism of hydrogen and lactate.

Applied and Environmental Microbiology

, v. 68, p. 1932-1937, 2002.

LENS, P.; MASSONE, A.; ROZZI, A.; VERSTRAETE, W., “Effect of sulfate concentration

and scraping on aerobic fixed biofilm reactors”. Water Research, v. 29, n. 3, p. 857-870,

1995.

LEVANDOWSKY, Z., STOODLEY,P & ROE,F. 1995. Internal mass transport in

heterogeneous biofilms: recent advances. Corrosion, paper 222 Texas

LIMA, A. C. F. et al., “Anaerobic sulphate-reducing microbial process using UASB reactor

for heavy metals decontamination”. Environmental Technology, v. 22, p. 261-270,

2000.

LOVLEY, D.R.; COATES, J.D; ANDERSON, R.T.; WOODWARD, J.C.; PHILLIPS, E.J.P.

Anaerobic hydrocarbon degradation petroleum-contaminated harbor sediments under

sulfate-reducing and artificially imposed iron-reducing conditions. Environmental

Science Technology, v. 30, p. 2784-2789, 1996.

MADIGAN, M. T. Microbiology, Physiology and Ecology of Phototrophic Bacteria

. In:

Biology of Anaerobic Microorganisms. Edited by Alexander J.B. Zehnder, p. 39-111,

1988.

MARQUARDT, D. W. An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters. J.

Sot.

Indust. Appl. 11, 431-441, (1963).

MAXWELL, S.

et al., The simulation of nitrate-reducing bacteria NRB) in oil-field systems

to control sulphate-reducing bacteria (SRB), microbiologically influenced corrosion

(MIC) and reservoir souring - An introduction review. Energy Institute, London, 2003

MCINERNEY, M. J., K. L. SUBLETTE, V. K. BHUPARTHIARAJU, J. D. COATES, AND

R. M. KNAPP.

1993. Causes and control of microbially induced souring, p. 363-371. In

E. T. Premuzic, and A. Woodhead (ed.), Developments in petroleum science.

39. Microbial enhancement of oil recovery

recent advances. Proceedings of the

1992 International Conference on Microbial Enhanced Oil Recovery. Elsevier,

Amsterdam, The Netherlands.

METCALF & EDDY, INC., Wastewater Engineering: Tretment,

Disposal, Reuse, 3

ed.,

revised by G. Tchobanoglous and F.L. Burton, Mc Graw-Hill, New York, NY,1334 p.,

(1991).

MOOSA, S., NEMATI, M. & HARRISON, S. T. L. A kinetic study on anaerobic reduction of

sulphate, Part I: Efect of sulphate concentration,

Chemical Engineering Science, 57

2773 – 2780, (2002).

MOURA, I.; BURSAKOV, S.; COSTA, C.; MOURA,J.J.G. Nitrate and nitrite utilization in

sulfate-reducing bactéria.Anaerobe, 1997.

136

MYHR S, LILLEBO BL, SUNDE E, BEEDER J, TORSVIK T. Inhibition of microbial H

production in an oil reservoir model column by nitrate injection. Appl Microbiol

Biotechnol.58(3):400-408Dec2002

NAGIUB, A. & MANSFEL, F. 2002. Evaluation of microbiologically influenced corrosion

inhibition (MICI) with EIS and ENA. Electrochimica Acta, 47: 2319-02333

NEMATI, M.; JENNEMAN, G. E.; VOORDOUW, G.

Mechanistic Study of Microbial

Control of Hydrogen Sulfide Production in Oil Reservoirs.

Biotechnology and

Bioengineering, V. 74, Nº 5, 2001.

NEVIUS, B. A.; BAGWELL, C. E.; BRIGMON, R. L. 2004. Characterization of microbial

communities in TCE-contaminated seep zone sediments. Journal of the South Carolina

Academy of Science Journal of the South Carolina Academy of Science, 2(1): 25-29.

http://sti.srs.gov/fulltext/ms2005107/ms2005107.pdf. Acesso em dezembro de 2005.

OLIVEIRA, M. dos Santos. Flotação em coluna do rejeito remoído do processo de

concentração da apatita (Cap. III e IV). Dissertação de Mestrado. FEQUI/UFU,

Uberlândia, 2004, 131 p.

ODOM, J. M.; R. SINGELTON, Jr. The sulphate-reducing bacteria: comtemporary

perspectives. New York, Springer-Verlag, 1993.

O’FLAHERTY, V., MAHONEY, T., O’Kennedy, R., & Colleran, E. E*ect of pH on growth

kinetics and sulphide toxicity thresholds of a range of methanogenic, syntrophic and

sulphate-reducing bacteria. Process Biochemistry, 33, 1–15, (1998).

ORNEK, D.; WOOD,T.K.; HU,C.H. & MANSFELD,F.2002. Corrosion control using

regenerative biofilms (CCURB) on brass in different media. Corrosiom Science, 44:

2291-2302

PIRT, S. J. PRINCIPLES of microbe and cell cultivation. Oxford, UK: Blackwell Scienti7c

Publications, (1975).

POSTGATE, J. R, The sulphate-reducing bacteria

. 2

ed. Cambridge, London. New York –

Melbourne, Cambridge University Press, 1984;

RABUS, R.; FUKUI, M.; WILKES, H. et al. Degradative Capacities and 16S rRNA-Targeted

Whole-Cell Hybridization of Sulfate-Reducing Bacteria in an Anaerobic Enrichment

Culture Utilizing ALkylbenzenes from Crude Oil. Applied and Enviromental

Micribiology, 1996.

REINSEL,M.; STEWART,P; AND J.T. SEARS. Control of Microbial Souring by Nitrate,

Nitrite, or Gluteraldehyde Injection in a Sandstone Column", J. Ind. Microb., 17: 1128-

1136 (1996)

RIVIERE, L.; GARLAND, E. EXPERIENCE OF Produced Water-Treatment in the North

Sea. Marine Poll. Bull. V.29, n. 6-12, p. 312-316, 1994.

137

RIZZO, A.C.L.& LEITE, S.G.F. ISSN 0103-7374 Produção de sulfeto em reator do tipo

UASB e sua potencial aplicaçãona remoção de metais pesados de efluentes CETEM

2004.

ROS, M. Denitrification Kinetics in na activated sludge system. Water cience and technology,

1995.

SANTOS, S.G.; ONU, A.F.;FORESTI,E. Estudo comparativo entre três doadores de elétrons

(metanol, etanol e metano) no processo de desnitrificação, São Carlos, EESC- USP,

2002.

SCHURMAN, A; SCHROTH, M.H; SAURER, M; BERNASCONI, SM: ZEYER, J. (2001).

Nitrate-consuming process in a petroleum-contaminated aquifer quantified using push-

pull tests combined with

N isotope and acetylene- inhibition methods. Journal of

Contaminant Hydrology, 66: 59-77

SEABRA, P.N.C.; SANTIAGO, V.M.J. As Atividades de Perfuração e Produção de Petróleo

e o Meio Ambiente. Boletim Técnico Petrobrás, RJ,1984

SÉRVULO, E.F.C.; VIEIRA, D.S.; CAMMAROTA, M.C. Degradation potential and growth

of anaerobic bacteria in produced water. Environmental Techonology

, v.26, n° 8, p.

915-922, 2005.

SÉRVULO,E.F.C.(1991) Ação das bactérias Oxidantes e redutoras de enxofre sobre o xisto.

Rio de Janeiro: Instituto de Microbiologia/ UFRJ, 148 p Tese de doutorado.

SILVA, A.F.C. Avaliação da remoção biológica de sulfeto a partir de uma população

fotossintética anoxigênica. Dissertação de Mestrado – EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2000.

SOGIN, M.L.; DHILLON, A.; TESKE, A.; DILLON, J.; STAHL, D.A. Molecular

characterization of sulfate-reducing bacteria in the Guaymas Basin. Applied and

Environmental Microbiology, v. 69, no. 5, p. 2765-2772, 2003.

SPEECE, R.E. Anaerobic biotechnology

. 1

edição, Nashville, Archae Press, 394 p, 1996.

STHEPHENSON, M. T. Components of Produced Water: A Compilation of Results from

Several Industry Studies. SPE 23313, First Intl. Conf. Health, Safety and Envir. Hague,

Netherlands, 1991.

STOTT, J.; RIZK, T. Anti-Souring Control by Nitrate and Nitrite, A Literature Review.

CAPCIS Ref.: TR 4500 - Rev. 1, 02/2005.

STROMGREN, T.; SORSTROM, S. E.; SCHOU, L. et al. Acute Toxic Effects of Produced

Water in Relation to Chemical Comosition and Dispersion. Marine Environmrntal

Research, 1995.

STURMAN, P. J. Solving the Oilfield Souring Puzzle: Control of Downhole Hydrogen

Sulphide Production Using Nitrite, UK Corrosion, Paper 19, 2001.

138

SUFLITA, J. M.; KROPP, K.G.; DAVIDOVA, I.A. Anaerobic oxidation of

n – Dodecane by

an addition reaction in a sulfate-reducing bacterial enrichment culture. Applied and

Environmental Microbiology, v. 66, p. 5393-5398, 2000.

SURAMPALLI, R.Y., TYAGI,R.D.; SHEIBLE,O.K.;HEIDMAN,JA. Nitrification,

denitrification and phosphorus removal in sequential batch reactors. Bioresource

technology, 1997.

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater

, 20th edition, p. 4-99 a 4-

126, 1998.

TELLEZ, G.T.; KHANDAN,N. A BIOLOGICAL Field Treatment Process for Removing

Hydrocarbons from Oilfield roduced Waters. In The Ninth International Symposium of

Gas, Ol and Enviromenttal Biotechnology, Rio de Janeiro, 1996.

TELLEZ, G.T.; NIRMALAKHANDAM, N.; TORRESDEY-GARDEA, J.L. Performance

evaluation of an activated sludge system for removing petroleum hydrocarbons from

oilfield produced water. Advances in Environmental Research

, v. 6, p. 455-470, 2002.

TIEDJ, J.M. 1994. Microbia Diversity: of value to whom? ASM News, 6

524-525

THOMAS, J. E. Fundamentos da engenharia do petróleo

. Rio de Janeiro, Interciência:

PETROBRAS , 271 p., 2004.

UTVIK, T.I.R. Chemical Characterization of Produced Water from Four Offshore Oil

Production latforms in the North Sea. Chemosphere, 1999.

U.S. FEDERAL HIGHWAY ADMINISTRATION, 2002.

VAZOLLER, R.F. 1993. Características e Interações microbianas nos processos de

Tratamento biológico aeróbio e anaeróbio. In: II Curso de Processos Biológicos de

Tratamento de Resíduos, São Paulo. Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de

São Paulo . 18 p.

VIDELA, H. A., Corrosão Microbiológica,2

edição, 2003;

VIEIRA, D. S. Avaliação da biodegradação anaeróbia no tratamento de água de produção

Dissertação de Mestrado, EQ/UFRJ, Rio de Janeiro, 2003, 156 p.

VIEIRA, P. A. Avaliação da biodegradação de efluente contendo óleo diesel e gasolina

empregando culturas mistas. Dissertação de Mestrado, FEQUI/UFU, Uberlândia, 2004.

VISSER, A., The anaerobic treatment of sulphate containing wastewater. Ph.D. thesis.

Wageningen Agricultural University, Wageningen, The Netherlands, (1995).

WALCH,M. (1991) . Introduction: Microbiological influences on marine corrosion, MTS J ,

24 3-4.

139

WIDDEL, F. FUKUI, M.; HARMS, G.; RABUS, R.; SCHRAMM, A.; ZENGLER, K.;

BOREHAM, C.; WILKES, H. Anaerobic degradation of oil hydrocarbons by sulfate-

reducing and nitrate-reducing bacteria. Microbial Ecology of Oil Fields

, In: 8

International Symposium on Microbial Ecology, Canada, 1999.

WIDDEL, F.; RABUS, R. Anaerobic biodegradation of saturated and aromatic hydrocarbons.

Environmental Biotechnology

, v. 12, p. 259-276, 2001.

WIDDEL, F., & PFENNIG, N. Studies on dissimilatory sulphate-reducing bacteria that

decompose fatty acids.

Archives of Microbiology, 129, 395–400, (1981).

ZITHA, P.L.J.Well Treatment and Water Shutoff by olymers Gels. Delft University Press,

Netherlands, 1999.

www.abraco.org.br

www.aga.com.br

www.ambientebrasil.com.br

www.bahiainvest.com.br/port/segmentos/papel.asp

www.bio.ucalgary.ca,2004

www.cetesb.sp.gov.br/Ambiente/producao_limpa/casos/caso07.pdf

www.ciagri.usp.br

www.clickmacae.com.br

www.engefac.com.br/corrosao.htm

www.francal.com.br/codigo/p_noticias-conteudo.asp?noticia_ID=1221

www.recuperar.com.br/revistas.htm

www.ufscar.br/centrodecienciasagrarias.htm

http://www.recuperar.com.br/revistas.htm

www.whitemartins.com.br

www.tabelaperiodica.hpg.ig.com.br/n.htm

APÊNDICE A

ALGORITMO PARA MAXIMIZAÇÃO E MINIMIZAÇÃO DAS

RESPOSTAS DO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Pe:=proc();

restart;

lprint(`##################################################################`);

lprint(`Programa implementado em fevereiro de 2005 (Claudio Roberto Duarte)`);

lprint(`Este programa obtém os pontos de máximo, mínimo ou sela para um PE`);

lprint(`##################################################################`);

#Primeiramente obter a forma canônica para o modelo ajustado de ordem 2:

with(linalg):

lprint(`Digite o numero de variaveis de planejamento:`);

condvariaveis:=readstat(``);

if condvariaveis=2 then

lprint(`Entre com o valor do termo independente`);

t0:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1`);

t1:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X2`);

t2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1^2`);

t11:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X2^2`);

t22:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1X2`);

t12:=readstat(``);

A:=matrix(2,2,[t11,t12/2,t12/2,t22]):

charpoly(A,lambda):

lambda:=[eigenvals(A)]:

b:=matrix(2,1,[t1,t2]):

x0:=evalm(-0.5*inverse(A)&*b):

for i from 1 to 2 do X[i]:=x0[i,1] od:

#lprint('X1',X[1]);

#lprint('X2',X[2]);

#lprint('lambda[1]',lambda[1]);

#lprint('lambda'[2],lambda[2]);

y[0]:=t0+t1*X[1]+t2*X[2]+t11*X[1]^2+t22*X[2]^2+t12*X[1]*X[2]:

141

if lambda[1]*lambda[2]>0 then

if lambda[1]>0 then

lprint(`Este problema possui ponto de mínimo`);

lprint('X1',X[1]);

lprint('X2',X[2]);

fi;

if lambda[1]<0 then

lprint(`Este problema possui ponto de máximo`);

lprint('X1',X[1]);

lprint('X2',X[2]);

fi;

#Portanto a forma canônica ajustada é :

if lambda[1]*lambda[2]<0 then

lprint(`Este problema não possui ponto de máximo e nem de mínimo`);

lprint(`Você deseja máximizar [1] ou minimizar [2] a sua resposta:`);

condiaux:=readstat(``);

y:=y[0]+lambda[1]*w[1]^2 +lambda[2]*w[2]^2:

A:=matrix(2,2,[t11-lambda[1],t12/2,t12/2,t22-lambda[1]]):

m21:=1:

Mextra:=matrix(2,1,[m11,m21]):

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

#lprint('P1',P1);

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

m11linha:=solve(P1,m11):

#lprint('m11linha',m11linha);

m21linha:=1:

#lprint('m21linha',m21linha);

produto:=(m11linha^2+m21linha^2)^(0.5):

m11:=m11linha/produto: m21:=m21linha/produto:

A:=matrix(2,2,[t11-lambda[2],t12/2,t12/2,t22-lambda[2]]):

m22:=1:

Mextra:=matrix(2,1,[m12,m22]):

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

142

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

m12linha:=solve(P1,m12):

#lprint('m12linha',m12linha);

m22linha:=1:

produto:=(m12linha^2+m22linha^2)^(0.5):

m22:=m22linha/produto:

m12:=m12linha/produto:

#lprint('m11',m11);

#lprint('m12',m12);

#lprint('m21',m21);

#lprint('m22',m22);

Matrizm:=matrix(2,2,[m11,m12,m21,m22]):

transM:=transpose(Matrizm):

MatrizW:=matrix(2,1,[www1,www2]):

MatrizX:=matrix(2,1,[x1-X[1],x2-X[2]]):

Eq:=evalm(transM&*MatrizX):

#lprint('x1',x1);

#lprint('x2',x2);

#lprint('X[1]',X[1]);

#lprint('X[2]',X[2]);

#Como quero maximizar a resposta farei

if condiaux=1 then

if lambda[1]<0 then www1:=w1: www2:=w2: fi;

if lambda[1]>0 then www1:=w2: www2:=w1: fi;

w1:=0: cont:=0:

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w2:=i:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

assign(Resp[cont]): Ww2[cont]:=w2: Xx1[cont]:=x1: Xx2[cont]:=x2: unassign('x1'): unassign('x2'):

cont:=cont+1: od:

aux:=1:

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-1 and Xx2[i]<=1 then

if Xx1[i]>=-1 and Xx1[i]<=1 then

Vx1[aux]:=Xx1[i]:

143

Vx2[aux]:=Xx2[i]:

Vw2[aux]:=Ww2[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2 é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

aux:=aux+1:

fi;

od:

Maxw2:=(max(seq(Vw2[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

lprint(`O valor do w2 máximo em modulo é=`,Maxw2);

w2:=Maxw2: Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

assign(Resp[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

fi;

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=0:

unassign('Var1'): unassign('Var2'):

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-1..1,Var2=-1..1,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection =

ORTHOGONAL));

#Como quero mínimizarr a resposta farei

if condiaux=2 then

if lambda[1]>0 then www1:=w1: www2:=w2: fi;

if lambda[1]<0 then www1:=w2: www2:=w1: fi;

w1:=0: cont:=0:

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w2:=i:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

assign(Resp[cont]): Ww2[cont]:=w2: Xx1[cont]:=x1: Xx2[cont]:=x2: unassign('x1'): unassign('x2'):

cont:=cont+1: od:

aux:=1:

144

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-1 and Xx2[i]<=1 then

if Xx1[i]>=-1 and Xx1[i]<=1 then

Vx1[aux]:=Xx1[i]:

Vx2[aux]:=Xx2[i]:

Vw2[aux]:=Ww2[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2 é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

aux:=aux+1:

fi;

od:

Maxw2:=(max(seq(Vw2[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

lprint(`O valor do w2 máximo em modulo é=`,Maxw2);

w2:=Maxw2: Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1]},{x1,x2}):

assign(Resp[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

fi;

if condvariaveis=3 then

lprint(`Entre com o valor do termo independente`);

t0:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1`);

t1:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X2`);

t2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X3`);

t3:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1^2`);

t11:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X2^2`);

t22:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X3^2`);

t33:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1X2`);

t12:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X1X3`);

t13:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor referente ao termo X2X3`);

t23:=readstat(``);

lprint(`Entre com o valor do alpha de ortogonalidade`);

alpha:=readstat(``);

A:=matrix(3,3,[t11,t12/2,t13/2,t12/2,t22,t23/2,t13/2,t23/2,t33]):

print(evalm(A));

145

charpoly(A,lambda):

lambda:=[eigenvals(A)]:

b:=matrix(3,1,[t1,t2,t3]):

x0:=evalm(-0.5*inverse(A)&*b):

for i from 1 to 3 do X[i]:=x0[i,1] od:

y0:=t0+t1*X[1]+t2*X[2]+t3*X[3]+t11*X[1]^2+t22*X[2]^2+t33*X[3]^2+t12*X[1]*X[2]+t13*X[1]*X[3]+t23*

X[2]*X[3]:

#lprint('X1',X[1]);

#lprint('X2',X[2]);

#lprint('X3',X[3]);

#lprint('lambda[1]',lambda[1]);

#lprint('lambda'[2],lambda[2]);

#lprint('lambda'[3],lambda[3]);

if lambda[1]*lambda[2]>0 then

if lambda[2]*lambda[3]>0 then

if lambda[1]>0 then

lprint(`Este problema possui ponto de mínimo`);

lprint('X1',X[1]);

lprint('X2',X[2]);

lprint('X3',X[3]);

fi;

if lambda[1]<0 then

lprint(`Este problema possui ponto de máximo`);

lprint('X1',X[1]);

lprint('X2',X[2]);

lprint('X3',X[3]);

fi;

if lambda[1]*lambda[2]>0 and lambda[2]*lambda[3]<0 or lambda[1]*lambda[2]<0 and

lambda[2]*lambda[3]>0 then

lprint(`Este problema não possui ponto de máximo e nem de mínimo`);

lprint(`Você deseja máximizar [1] ou minimizar [2] a sua resposta:`);

condiaux:=readstat(``);

y:=y0+lambda[1]*w[1]^2 +lambda[2]*w[2]^2+lambda[3]*w[3]^2:

A:=matrix(3,3,[t11-lambda[1],t12/2,t13/2,t12/2,t22-lambda[1],t23/2,t13/2,t23/2,t33-lambda[1]]):

m31:=1:

Mextra:=matrix(3,1,[m11,m21,m31]):

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

146

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

#lprint('P1',P1);

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

#lprint('P2',P2);

assign(solve({P1,P2},{m11,m21})):

m11linha:=m11:

m21linha:=m21:

m31linha:=1:

#lprint('m11linha',m11linha);

#lprint('m21linha',m21linha);

#lprint('m31linha',m31linha);

produto:=(m11linha^2+m21linha^2+m31linha^2)^(0.5):

m11:=m11linha/produto: m21:=m21linha/produto: m31:=m31linha/produto:

#lprint('m11',m11);

#lprint('m21',m21);

#lprint('m31',m31);

A:=matrix(3,3,[t11-lambda[2],t12/2,t13/2,t12/2,t22-lambda[2],t23/2,t13/2,t23/2,t33-lambda[2]]):

m32:=1:

Mextra:=matrix(3,1,[m12,m22,m32]):

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

assign(solve({P1,P2},{m12,m22})):

m12linha:=m12:

m22linha:=m22:

m32linha:=1:

#lprint('m12linha',m12linha);

#lprint('m22linha',m22linha);

#lprint('m32linha',m32linha);

produto:=(m12linha^2+m22linha^2+m32linha^2)^(0.5):

m12:=m12linha/produto:

m22:=m22linha/produto:

m32:=m32linha/produto:

#lprint('m12',m12);

#lprint('m22',m22);

#lprint('m32',m32);

A:=matrix(3,3,[t11-lambda[3],t12/2,t13/2,t12/2,t22-lambda[3],t23/2,t13/2,t23/2,t33-lambda[3]]):

m33:=1:

Mextra:=matrix(3,1,[m13,m23,m33]):

Mat1:=evalm(A&*Mextra):

P1:=evalm(Mat1[1,1])=0:

P2:=evalm(Mat1[2,1])=0:

147

assign(solve({P1,P2},{m13,m23})):

m13linha:=m13:

m23linha:=m23:

m33linha:=1:

#lprint('m13linha',m13linha);

#lprint('m23linha',m23linha);

#lprint('m33linha',m33linha);

produto:=(m13linha^2+m23linha^2+m33linha^2)^(0.5):

m13:=m13linha/produto:

m23:=m23linha/produto:

m33:=m33linha/produto:

#lprint('m13',m13);

#lprint('m23',m23);

#lprint('m33',m33);

Matrizm:=matrix(3,3,[m11,m12,m13,m21,m22,m23,m31,m32,m33]):

lprint(`#####################################################################################

##################################`);

lprint(`A matriz m é:`);

print(evalm(Matrizm));

lprint(`#####################################################################################

###################################`);

transM:=transpose(Matrizm):

MatrizW:=matrix(3,1,[www1,www2,www3]):

MatrizX:=matrix(3,1,[x1-X[1],x2-X[2],x3-X[3]]):

Eq:=evalm(transM&*MatrizX):

#lprint('x1',x1);

#lprint('x2',x2);

#lprint('x3',x3);

#lprint('X[1]',X[1]);

#lprint('X[2]',X[2]);

#lprint('X[3]',X[3]);

#Como quero maximizar a resposta farei

if condiaux=1 then

auxpositivo:=sort([seq(lambda[i],i=1..3)]);

#Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo maximizar a resposta

if lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]> 0 then

if lambda[1]>0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

if lambda[2]>0 then www1:=w2: www2:=w1: www3:=w3: fi;

if lambda[3]>0 then www1:=w2: www2:=w3: www3:=w1: fi;

w2:=0: w3:=0: cont:=0:

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

148

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

readlibe(unassign):

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w1:=i:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont]): Ww1[cont]:=w1: Xx1[cont]:=x1; Xx2[cont]:=x2; Xx3[cont]:=x3; unassign('x1'):

unassign('x2'): unassign('x3'):cont:=cont+1: od;

aux:=1:

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-alpha and Xx2[i]<=alpha then

if Xx1[i]>=-alpha and Xx1[i]<=alpha then

if Xx3[i]>=-alpha and Xx3[i]<=alpha then

Vx1[aux]:=Xx1[i]:

Vx2[aux]:=Xx2[i]:

Vx3[aux]:=Xx3[i]:

Vw1[aux]:=Ww1[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2 é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

aux:=aux+1:

fi;

od;

Maxw1:=(max(seq(Vw1[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

lprint(`O valor do w máximo em modulo é=`,Maxw1);

w1:=Maxw1:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

unassign('Var1'): unassign('Var2'):

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var1'): unassign('Var3'): Var2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

149

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var2'): unassign('Var3'): Var1:=x1:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

r1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo maximizar a resposta

#Condição para que uma raíz lambda seja negativa e pretendo maximizar a resposta

if lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]< 0 then

#MatrizW:=matrix(3,1,[www1,www2,www3]):

if lambda[1]<0 then www1:=w3: www2:=w1: www3:=w2: fi;

if lambda[2]<0 then www1:=w1: www2:=w3: www3:=w2: fi;

if lambda[3]<0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

w3:=0: cont:=0: cont2:=0:

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w1:=i: cont2:=0:

for j from auxw1 to auxw2 by increw do w2:=j:

Resp[cont,cont2]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont,cont2]): Ww1[cont,cont2]:=w1: Ww2[cont,cont2]:=w2: Xx1[cont,cont2]:=x1;

Xx2[cont,cont2]:=x2; Xx3[cont,cont2]:=x3; unassign('x1'): unassign('x2'): unassign('x3'):

cont2:=cont2+1: od; cont:=cont+1: od;

aux:=1:

contador:=(auxw2-auxw1)/increw;

for i from 0 to (contador) do

for j from 0 to (contador) do

if Xx2[i,j]>=-alpha and Xx2[i,j]<=alpha then

if Xx1[i,j]>=-alpha and Xx1[i,j]<=alpha then

if Xx3[i,j]>=-alpha and Xx3[i,j]<=alpha then

Vx1[aux]:=Xx1[i,j];

Vx2[aux]:=Xx2[i,j]:

Vx3[aux]:=Xx3[i,j]:

Vw1[aux]:=Ww1[i,j]:

Vw2[aux]:=Ww2[i,j]:

#AuxWmax[aux]:=y0+lambda[1]*Ww1[i,j]^2 +lambda[2]*Ww2[i,j]^2+lambda[3]*Ww3[i,j]^2:

#lprint(`O valor de x1[`,aux,`] é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2[`,aux,`] é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor de x3[`,aux,`] é=`,Vx3[aux]);

150

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

#lprint(`O valor de vw1 é=`,Vw1[aux]);

codi:=i:

codj:=j:

aux:=aux+1:

fi;

od;

#lprint('codi',(codi-1));

#lprint('codj',(codj-1));

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

AuxWmax[i]:=y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2:

#lprint(`AuxWmax[`,i,`]é:`,AuxWmax[i]);

#lprint(`W1[`,i,`]`,AWW1[i]);

#lprint(`W2[`,i,`]`,AWW2[i]);

#lprint(`W3[`,i,`]`,AWW3[i]);

od;

#lprint(`O valor do lambda1`,lambda[1]);

#lprint(`O valor do lambda2`,lambda[2]);

#lprint(`O valor do lambda3`,lambda[3]);

valormaximoW:=max(seq(AuxWmax[i],i=1..(aux-1)));

lprint(`valor máximo da eq`,valormaximoW);

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

if valormaximoW=(y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2) then

if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then w1:=Vw1[i]: w3:=0: w2:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: w3:=0: fi;

lprint(`W1`,AWW1[i]);

lprint(`W2`,AWW2[i]);

lprint(`W3`,AWW3[i]);

fi;

od;

#AuxWmax[0]:=0:

151

#for i from 1 to (aux-1) do

#if AuxWmax[i]<= AuxWmax[i-1] then

#AuxWmax[i]:=AuxWmax[i-1]:

# if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=AWW2[i]: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[2]<0 then w1:=AWW1[i]: w3:=0: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[3]<0 then w1:=AWW1[i]: w2:=AWW2[i]: w3:=0: fi;

#lprint(`O valor do AuxWmax[i] máximo é=`,AuxWmax[i]);

#lprint(`O valor do w1 máximo é=`,w1);

#lprint(`O valor do w2 máximo é=`,w2);

# fi;

#od;

#lprint(`O valor maximo da eq é:`,AuxWmax[aux-1]);

#for j from 1 to (cont-2) do

#Maxw1[1]:=max(seq(Vw1[i],i=1..(aux-1)));

#Maxw2[1]:=max(seq(Vw2[i],i=1..(aux-1)));

#od;

#MAXw1:=max(seq( Maxw1[j],j=1..(aux-1)));

#MAXw2:=max(seq( Maxw2[j],j=1..(aux-1)));

lprint(`O valor do w1 máximo é=`,w1);

lprint(`O valor do w2 máximo é=`,w2);

Resposta[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resposta[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

unassign('Var1'): unassign('Var2'):

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var1'): unassign('Var3'): Var2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var2'): unassign('Var3'): Var1:=x1:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

r1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

152

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo maximizar a resposta

fi;

#*****************************************************************************************

***********************************

#Como quero mínimizar a resposta farei

#*****************************************************************************************

***********************************

if condiaux=2 then

auxpositivo:=sort([seq(lambda[i],i=1..3)]);

#Condição para que duas raízes lambda sejam positiva e pretendo minimizar a resposta

if lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]< 0 then

if lambda[1]<0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

if lambda[2]<0 then www1:=w2: www2:=w1: www3:=w3: fi;

if lambda[3]<0 then www1:=w2: www2:=w3: www3:=w1: fi;

w2:=0: w3:=0: cont:=0:

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

readlibe(unassign):

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w1:=i:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont]): Ww1[cont]:=w1: Xx1[cont]:=x1; Xx2[cont]:=x2; Xx3[cont]:=x3; unassign('x1'):

unassign('x2'): unassign('x3'):cont:=cont+1: od;

aux:=1:

for i from 1 to (cont-2) do

if Xx2[i]>=-alpha and Xx2[i]<=alpha then

if Xx1[i]>=-alpha and Xx1[i]<=alpha then

if Xx3[i]>=-alpha and Xx3[i]<=alpha then

Vx1[aux]:=Xx1[i]:

Vx2[aux]:=Xx2[i]:

Vx3[aux]:=Xx3[i]:

Vw1[aux]:=Ww1[i]:

#lprint(`O valor de x1 é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

aux:=aux+1:

fi;

153

fi;

od;

#Maxw1:=(min(seq(Vw1[i]^2,i=1..(aux-1))))^(0.5);

Maxw1:=(min(seq(Vw1[i],i=1..(aux-1))));

lprint(`O valor do w mínimo em modulo é=`,Maxw1);

w1:=Maxw1:

Resp[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont]):

Eqfinal:=t0+t1*x1+t2*x2+t3*x3+t11*(x1)^2+t22*(x2)^2+t33*(x3)^2+t12*(x1)*(x2)+t13*(x1)*(x3)+t23*(x2)*(

x3):

lprint(`O valor mínimo da resposta é `,Eqfinal);

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

unassign('Var1'): unassign('Var2'):

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var1'): unassign('Var3'): Var2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var2'): unassign('Var3'): Var1:=x1:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

r1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo minimizar a resposta

#Condição para que uma raíz lambda seja positiva e pretendo minimizar a resposta

if lambda[1]*lambda[2]*lambda[3]> 0 then

#MatrizW:=matrix(3,1,[www1,www2,www3]):

if lambda[1]>0 then www1:=w3: www2:=w1: www3:=w2: fi;

if lambda[2]>0 then www1:=w1: www2:=w3: www3:=w2: fi;

if lambda[3]>0 then www1:=w1: www2:=w2: www3:=w3: fi;

154

w3:=0: cont:=0: cont2:=0:

readlibe(unassign):

lprint(`Entre com a faixa para w:`):

lprint(`menor valor da faixa:`);

auxw1:=readstat(``);

lprint(`maior valor da faixa:`);

auxw2:=readstat(``);

lprint(`Entre com o incremento desejado:`):

increw:=readstat(``);

for i from auxw1 to auxw2 by increw do w1:=i: cont2:=0:

for j from auxw1 to auxw2 by increw do w2:=j:

Resp[cont,cont2]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resp[cont,cont2]): Ww1[cont,cont2]:=w1: Ww2[cont,cont2]:=w2: Xx1[cont,cont2]:=x1;

Xx2[cont,cont2]:=x2; Xx3[cont,cont2]:=x3; unassign('x1'): unassign('x2'): unassign('x3'): cont2:=cont2+1:

od; cont:=cont+1: od;

aux:=1:

contador:=(auxw2-auxw1)/increw;

for i from 0 to (contador) do

for j from 0 to (contador) do

if Xx2[i,j]>=-alpha and Xx2[i,j]<=alpha then

if Xx1[i,j]>=-alpha and Xx1[i,j]<=alpha then

if Xx3[i,j]>=-alpha and Xx3[i,j]<=alpha then

Vx1[aux]:=Xx1[i,j];

Vx2[aux]:=Xx2[i,j]:

Vx3[aux]:=Xx3[i,j]:

Vw1[aux]:=Ww1[i,j]:

Vw2[aux]:=Ww2[i,j]:

#AuxWmax[aux]:=y0+lambda[1]*Ww1[i,j]^2 +lambda[2]*Ww2[i,j]^2+lambda[3]*Ww3[i,j]^2:

#lprint(`O valor de x1[`,aux,`] é=`,Vx1[aux]);

#lprint(`O valor de x2[`,aux,`] é=`,Vx2[aux]);

#lprint(`O valor de x3[`,aux,`] é=`,Vx3[aux]);

#lprint(`O valor do vw2 é=`,Vw2[aux]);

#lprint(`O valor de vw1 é=`,Vw1[aux]);

codi:=i:

codj:=j:

aux:=aux+1:

fi;

od;

#lprint('codi',(codi-1));

#lprint('codj',(codj-1));

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

155

AuxWmax[i]:=y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2:

#lprint(`AuxWmax[`,i,`]é:`,AuxWmax[i]);

#lprint(`W1[`,i,`]`,AWW1[i]);

#lprint(`W2[`,i,`]`,AWW2[i]);

#lprint(`W3[`,i,`]`,AWW3[i]);

od;

#lprint(`O valor do lambda1`,lambda[1]);

#lprint(`O valor do lambda2`,lambda[2]);

#lprint(`O valor do lambda3`,lambda[3]);

valormaximoW:=min(seq(AuxWmax[i],i=1..(aux-1)));

lprint(`valor mínimo da eq`,valormaximoW);

for i from 1 to (aux-1) do

if lambda[1]<0 then AWW1[i]:=0: AWW2[i]:=Vw1[i]: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=0: AWW3[i]:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then AWW1[i]:=Vw1[i]: AWW2[i]:=Vw2[i]: AWW3[i]:=0: fi;

if valormaximoW=(y0+lambda[1]*AWW1[i]^2 +lambda[2]*AWW2[i]^2+lambda[3]*AWW3[i]^2) then

if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: fi;

if lambda[2]<0 then w1:=Vw1[i]: w3:=0: w2:=Vw2[i]: fi;

if lambda[3]<0 then w1:=Vw1[i]: w2:=Vw2[i]: w3:=0: fi;

lprint(`W1`,AWW1[i]);

lprint(`W2`,AWW2[i]);

lprint(`W3`,AWW3[i]);

fi;

od;

#AuxWmax[0]:=0:

#for i from 1 to (aux-1) do

#if AuxWmax[i]<= AuxWmax[i-1] then

#AuxWmax[i]:=AuxWmax[i-1]:

# if lambda[1]<0 then w3:=0: w1:=AWW2[i]: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[2]<0 then w1:=AWW1[i]: w3:=0: w2:=AWW3[i]: fi;

# if lambda[3]<0 then w1:=AWW1[i]: w2:=AWW2[i]: w3:=0: fi;

#lprint(`O valor do AuxWmax[i] mínimo é=`,AuxWmax[i]);

#lprint(`O valor do w1 mínimo é=`,w1);

#lprint(`O valor do w2 mínimo é=`,w2);

# fi;

#od;

#lprint(`O valor mínimo da eq é:`,AuxWmax[aux-1]);

#for j from 1 to (cont-2) do

156

#Maxw1[1]:=max(seq(Vw1[i],i=1..(aux-1)));

#Maxw2[1]:=max(seq(Vw2[i],i=1..(aux-1)));

#od;

#MAXw1:=max(seq( Maxw1[j],j=1..(aux-1)));

#MAXw2:=max(seq( Maxw2[j],j=1..(aux-1)));

lprint(`O valor do w1 mínimo é=`,w1);

lprint(`O valor do w2 mínimo é=`,w2);

lprint(`O valor do w3 mínimo é=`,w3);

Resposta[cont]:=solve({Eq[1,1]=MatrizW[1,1],Eq[2,1]=MatrizW[2,1],Eq[3,1]=MatrizW[3,1]},{x1,x2,x3}):

assign(Resposta[cont]):

lprint(`O valor de x1 é=`,x1);

lprint(`O valor de x2 é=`,x2);

lprint(`O valor de x3 é=`,x3);

Var1:=x1:

Var2:=x2:

Var3:=x3:

unassign('Var1'): unassign('Var2'):

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var2=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var1'): unassign('Var3'): Var2:=x2:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(Var2)+t13*(

Var1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var1=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

unassign('Var2'): unassign('Var3'): Var1:=x1:

Eqextra:=t0+t1*Var1+t2*Var2+t3*Var3+t11*(Var1)^2+t22*(Var2)^2+t33*(Var3)^2+t12*(Var1)*(x2)+t13*(Va

r1)*(Var3)+t23*(Var2)*(Var3):

print(plot3d(Eqextra,Var2=-alpha..alpha,Var3=-

alpha..alpha,style=PATCHCONTOUR,axes=BOXED,projection = ORTHOGONAL));

fi; #Finaliza a Condição para que duas raízes lambda sejam negativa e pretendo minimizar a resposta

fi;

end;

157

APÊNDICE B

CURVA PADRÃO DE SULFETO

Curva de Sulfetos

y = 81,487x

= 0,9906

0 0,1 0,2 0,3 0,4

Absorbância (670 nm)

H2S Corrigido

(microg/mL)

S (m

/L) Absorbância (670 nm)

2,148

0,051

6,443

0,131

10,739

0,270

12,888

0,311

15,036

0,448

19,331 0,252

21,479 0,277

23,627 0,288

25,775 0,296

30,071

0,357

158

APÊNDICE C

CURVA PADRÃO DE SULFATO

y = 131.27x - 17.101

= 0.9737

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

Absorbância (450 nm)

Sulfato (mg/L)

Sulfato (m

/L) Absorbância (450 nm)

10 0,214

20 0,288

30 0,380

40 0,413

50 0,518

60 0,539

70 0,693

159

APÊNDICE D

CURVA PADRÃO DE NITRATO

Curva de nitrato

y = 3,7077x

= 0,9974

00,511,5

absorbancia

Nitrato (Mg/L)

Nitrato

(

)

Absorbância

(

880 nm

)

0 0

0,055 0,1

0,126 0,4

0,263 1

0,416 1,5

0,528 2

0,681 2,5

0,772 3

1,053 4

1,385 5

160

APÊNDICE E

CURVA PADRÃO DE NITRITO

Curva de Nitrito

y = 0,5569x

= 0,9906

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Absorbancia

Nitrito (mg/L)

Nitrato

(

)

Absorbância

(

880 nm

)

0 0

0,103 0,05

0,198 0,1

0,217 0,15

0,409 0,2

0,724 0,4

0,877 0,5

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