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Cintia Yumi Fugiwara
Estudo de algumas atividades biológicas do
extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua
Walker, 1855 (Lepidóptera, Saturniidae)
preparado após diferentes períodos de
armazenamento das cerdas
São Paulo
2006
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Cintia Yumi Fugiwara
Estudo de algumas atividades biológicas do
extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua
Walker, 1855 (Lepidoptera, Saturniidae)
preparado após diferentes períodos de
armazenamento das cerdas
Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo,
para a obtenção de título de
Mestre em Ciências, na Área de
Fisiologia Geral.
Orientadora: Ida S. Sano
Martins
São Paulo
2006
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Fugiwara, Cintia Yumi
Estudo de algumas atividades biológicas do
extrato de cerdas da lagarta Lonomia
obliqua Walker, 1855 (Lepidoptera,
Saturniidae) preparado após diferentes
períodos de armazenamento das cerdas.
pg...
Dissertação (Mestrado) – Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo.
Departamento de Fisiologia Geral.
1. Lonomia obliqua 2. armazenamento 3.
atividade biológica I. Universidade de São Paulo.
Instituto de Biociências. Departamento de
Fisiologia Geral.
Comissão Julgadora:
__________________________ __________________________
Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
__________________________ ____________________________
Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
____________________________
Prof(a). Dr(a).
Orientador(a)
“Aprender uma coisa significa entrar em
contato com um mundo do qual não se tem a
menor idéia. É preciso ser humilde para
aprender”.
Paulo Coelho
Aos meus pais Mituo e Atsuko Fugiwara,
por todas as oportunidades que me proporcionaram
e ao apoio emocional e financeiro
que contribuíram para realização desse trabalho.
Á Ida Sigueko Sano Martins,
por confiar no meu potencial
possibilitando a oportunidade de desenvolver este trabalho,
além da orientação, paciência e constante apoio.
“As coisas simples são as mais extraordinárias,
e só os sábios conseguem vê-las”.
Paulo Coelho
Às amigas
Fernanda Peixoto Barbosa Nunes,
Anita Mitico Tanaka-Azevedo,
Silvana Pinho de Oliveira,
Márcia Sassahara
Sandra Corrallo de Tomy,
Aline Artioli Machado Yamamura,
pelo apoio, amizade e constante incentivo.
“O homem que preserva seus amigos jamais é
dominado pelas tempestades da existência; tem
forças para ultrapassar as dificuldades e seguir
adiante”.
Paulo Coelho
AGRADECIMENTOS
Aos colaboradores deste trabalho: Roberto Henrique Pinto Moraes, Lab. de
Parasitologia, IBu; Irineu Lorini, EMBRAPA – Passo Fundo; Lisete Maria
Lorini, Carla Denise Tedesco, Universidade Federal de Passo Fundo;
Osvaldo Augusto Brazil Esteves Sant’Anna, Lab. de Imunoquímica, IBu;.
Aos pesquisadores Anita Mitico Tanaka-Azevedo, Sandra Corrallo de
Tomy, Luis Roberto de Camargo Gonçalves, Marcelo Larami Santoro, do
Lab. de Fisiopatologia, IBu; Kátia Cristina Bárbaro, Lab. de Imunopatologia,
IBu, por compartilharem seus conhecimentos, possibilitando a realização
das metodologias utilizadas.
À Carla Simone Seibert e Diva Danelle Spadacci Morena (pesquisadora do
Lab. de Fisiopatologia, IBu) por compartilharem seus conhecimentos,
auxiliando na correção dessa dissertação.
Aos funcionários de apoio do Laboratório de Fisiopatologia, Alice, Ângela,
Iracema, Juscelino, Neuceli, Neusa, Nicolau, Silvana, Terezinha, pelo
auxílio constante e pela amizade.
A todos os colegas do Lab. de Fisiopatologia que direta ou indiretamente
tornaram possível a execução deste trabalho.
Aos voluntários, que doaram sangue possibilitando o desenvolvimento
deste trabalho.
A CAPES pela concessão da bolsa e ao apoio do CNPq (processo nº
520929/99-3).
INDICE
I. INTRODUÇÃO
1. ORDEM LEPIDOPTERA 1
2. LEPIDOPTEROS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA 1
3. ACIDENTES CAUSADOS PELO GÊNERO Lonomia 3
4. Lonomia obliqua (LEPIDOPTERA, SATURNIIDAE) 5
4.1. CICLO DE VIDA 5
4.2. COMPORTAMENTO 6
4.3.INIMIGOS NATURAIS DA LAGARTA Lonomia obliqua 8
5. ATIVIDADE BIOLÓGICA DO EXTRATO DE CERDAS DA LAGARTA
Lonomia obliqua 10
6. ASPECTOS CLÍNICOS E TRATAMENTO DO ENVENENAMENTO COM A
Lonomia obliqua 13
6.1. ASPECTOS CLÍNICOS 13
6.1.1. Lonomia obliqua 13
6.1.2. Lonomia achleous 14
6.2. TRATAMENTO 15
7. PRODUÇÃO DO ANTIVENENO ANTI-LONÔMICO 16
II. OBJETIVO
1. OBJETIVO 19
III. MATERIAL E MÉTODOS
1. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE CERDAS DE Lonomia obliqua 20
2. DOSAGEM DE PROTEÍNA 21
3. DOSE MÍNIMA COAGULANTE 22
4. ATIVIDADE FIBRINOLÍTICA 22
5. ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA 23
6. ATIVIDADE HEMOLÍTICA INDIRETA 23
7. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DIRETA 24
8. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS ANTI-LONÔMICO EM
CAMUNDONGOS 25
9. DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPOS PELO MÉTODO
IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) 26
10. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA CONTENDO SDS 27
11. ANÁLISE ESTATÍSTICA 28
IV. RESULTADOS
1. DOSAGEM DE PROTEÍNA 29
2. DOSE MÍNIMA COAGULANTE 30
3. ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA 33
4. ATIVIDADE FIBRINOLÍTICA 35
5. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DIRETA 35
6. ATIVIDADE HEMOLÍTICA INDIRETA 36
7. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) 38
8. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) 39
V. DISCUSSÃO
43
VI. CONCLUSÕES
53
VII. RESUMO
54
VIII. ABSTRACT
56
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
58
ÌNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Número de acidentes humanos por contato com as lagartas
Lonomia no Brasil, relatados no período de 1986 a 1998 5
Tabela 2. Árvores descritas como fonte de alimentação da lagarta
Lonomia obliqua 8
Tabela 3. Atividades biológicas descritas nas toxinas das lagartas
do gênero Lonomia 13
Tabela 4.
Orientação terapêutica segundo classificação da gravidade
no envenenamento por Lonomia obliqua. 16
Tabela 5. Protocolo experimental para atividade hemolítica indireta. 23
Tabela 6. Protocolo experimental para atividade hemolítica direta 24
Tabela 7. Concentração de proteína dos extratos de cerdas de L. obliqua
dos lotes A, B e C 30
Tabela 8. Título de anticorpos dos camundongos imunizados com extrato
de cerdas não congeladas e congeladas por 6 meses dos lotes A, B e C 38
Tabela 9. Dados parciais da análise densitométrica, da eletroforese em gel
de poliacrilamida das amostras (0, 2, 4 e 6 meses) do extrato de cerdas
da lagarta L. obliqua (Lote A) expressos em porcentagem. 41
Tabela 10. Dados parciais da análise densitométrica, da eletroforese em gel
de poliacrilamida das amostras (0, 2, 4 e 6 meses) do extrato de cerdas
da lagarta L. obliqua (Lote B) expressos em porcentagem 41
Tabela 11. Dados parciais da análise densitométrica, da eletroforese em gel
de poliacrilamida das amostras (0, 2, 4 e 6 meses) do extrato de cerdas
da lagarta L. obliqua (Lote C) expressos em porcentagem 42
ÌNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema dos lepidópteros considerados de importância médica 2
Figura 2. Ciclo evolutivo da lagarta Lonomia obliqua 6
Figura 3. Comportamento gregário das lagartas Lonomia obliqua, agrupadas
no tronco da árvore 7
Figura 4. Comportamento solitário de lagarta Megalopyge albicolis 7
Figura 5. Enicospillus sp inimigo natural da lagarta Lonomia obliqua 9
Figura 6. Belvosia sp inimigo natural da lagarta Lonomia obliqua
9
Figura 7. Moreiria wiedemanni inimigo natural da lagarta Lonomia obliqua. 9
Figura 8. Lespesia affinis inimigo natural da lagarta Lonomia obliqua. 9
Figura 9. Alcaeorrhynchus grandis (Dallas) inimigo natural da lagarta
Lonomia obliqua 10
Figura 10 Hexamermis sp inimigo natural da lagarta Lonomia obliqua 10
Figura 11. Vírus LoobMNPV inimigo natural da lagarta Lonomia obliqua 10
Figura 12. Esquema de preparação das cerdas de L. obliqua, para produção
do extrato 21
Figura 13. Dose mínima coagulante (DMC) das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote A . 31
Figura 14. Dose mínima coagulante (DMC) das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote B 32
Figura 15. Dose mínima coagulante (DMC) das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote C 32
Figura 16. Atividade fosfolipásica das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses, do
lote A 34
Figura 17. Atividade fosfolipásica das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses, do
lote B 34
Figura 18. Atividade fosfolipásica das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses, do
lote C 35
Figura 19. Atividade hemolítica indireta das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote A 36
Figura 20. Atividade hemolítica indireta das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote B 37
Figura 21. Atividade hemolítica indireta das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote C 37
Figura 22. Perfil eletroforético do controle, do padrão e das amostras de 0,
2, 4 e 6 meses, do lote A 40
Figura 23. Perfil eletroforético do padrão e das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote B 40
Figura 24. Perfil eletroforético do padrão e das amostras de 0, 2, 4 e 6 meses,
do lote C 40
Figura 25. Representação das estruturas conformacionais das proteínas 44
I. INTRODUÇÃO
Introdução
I. INTRODUÇÃO
1. ORDEM LEPIDOPTERA
As borboletas e as mariposas pertencem à ordem lepidóptera e
apresentam hábitos diurno e noturno respectivamente. Essa ordem, dentro da
classe Insecta, é uma das que apresenta maior variedade de espécimes,
contendo mais de 165.000 espécies, mas ainda há muitas a serem identificadas,
particularmente entre as mariposas. Esses insetos são holometábolos, ou seja,
possuem desenvolvimento completo, o qual consiste em um ciclo biológico com
quatro fases: ovo, larva, pupa e fase adulta (Kawamoto & Kumada, 1984).
A maioria dos lepidópteros são considerados pragas na agricultura, pois no
estágio de larva são fitófagos. Apenas alguns lepidópteros que estão dentro da
subordem Ditrysia são considerados de importância médica (Moraes, 2003).
2. LEPIDÓPTEROS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA
Os lepidópteros considerados de importância médica podem causar danos
ao homem na forma adulta (lepidopterismo) ou na forma de larva (erucismo) o
que é mais comum (Pesce & Delgado, 1966). Dentro da subordem Ditrysia
existem três superfamílias com suas famílias e gêneros que estão listadas na
figura 1 (Fan, 2002).
Na maioria dos gêneros, o acidente com esses animais é causado no
estágio larval, com exceção do gênero Hylesia que causa lepidopterismo. Nesse
caso a mariposa solta as escamas que recobrem o corpo, que, em contato com a
pele, causam dermatite pápulo pruriginosa. Geralmente, o contato com as
lagartas causa dermatite urticante que, embora ocasione desconforto, não gera
maiores problemas (Haddad Jr. & Cardoso, 2003).
A espécie Premolis semirufa, do gênero Premolis, conhecida popularmente
como pararama, é responsável pelo acidente conhecido como pararamose.
Inicialmente essa espécie foi descrita nos seringais da Amazônia causando
acidentes por contato, principalmente nos membros superiores das pessoas que
trabalham com as seringueiras. O contato com as cerdas causa inflamação aguda
1
Introdução
e os pacientes poliacidentados podem apresentar inflamação crônica, causando
espessamento das membranas sinovial articular, podendo levar a deformidades
articulares, comuns às sinovites crônicas mono ou oligoarticulares, como na artrite
reumatóide (Costa, 2003). Nesse estado, as lesões tornam-se irreversíveis
comprometendo as funções do membro, com conseqüente aparecimento de
quadro de periartrite falangeana, um acidente ocupacional que pode causar danos
permanentes (Dias, 1986).
Figura 1. Esquema dos lepidópteros considerados de importância médica (Fan,
2002).
Outro gênero responsável por acidentes, com complicações mais graves,
pertence ao gênero Lonomia (família Saturniidae), cujo contato com a lagarta
pode ocasionar um quadro de síndrome hemorrágica (Kelen et al., 1995).
2
Introdução
3. ACIDENTES CAUSADOS PELO GÊNERO Lonomia
A primeira referência sobre quadro hemorrágico decorrente do contato com
lagarta é do início do século (Alvarenga, 1912). Embora o agente causador não
tenha sido identificado, a descrição do quadro clínico era compatível com o
envenenamento por Lonomia, como mostra o seguinte relato:
“J.R.A., 36 anos, brasileiro, solteiro, nenhum antecedente mórbido.
Em 16 de dezembro do anno próximo passado, cerca de meio-dia, JRA
roçou a mão sobre um grupo de taturana, alojadas nas folhas de um
arbusto. Penetraram-lhe na pelle da eminencia tenar numerosas felpas da
larva.
Imediatamente após, o paciente mastigou fumo e deitou-o, de mistura com
a saliva, sobre o ponto offendido, produzindo-se allívio das dores, que
haviam apparecido ao mesmo tempo do accidente.
Cerca de dez minutos depois do accidente sobrevieram cephalalgia
intensa, rubor e intumescimento da mão no ponto offendido, faixa de
lymphangite da eminecia tenar à axila, com um ponto doloroso na prega do
cotovelo e adenite axilar.
Dia 17. Pela manhã, ao despertar-se, sentiu a bocca cheia de líquido: era
saliva carregada de sangue. A saliva que se ia accumulando na bocca, em
quantidade normal, vinha carregada de sangue das glandulas que a
secretam.
A primeira micção, nessa mesma manhã, deu urina de cor avermelhada e
as outras que se succederam, no correr do dia, eram fracamente
sanguinolentas.
Cerca de uma hora antes do accidente, trabalhava no pomar e com um
serrote de que se utilizava produziu uma levíssima excoriação da pelle.
Depois do contacto com os pellos da lagarta começou a surdir sangue por
esse ponto excoriado, durante por dois dias a pequena hemorragia...”.
Alvarenga, 1912.
3
Introdução
Na década de 60, na Venezuela, surgiram alguns pacientes que tiveram
contato com lagartas e apresentaram sangramentos. Assim, Arocha-Piñango
(1967) descreveu uma síndrome hemorrágica causada pelo contato com lagarta,
que foi classificada por Lemaire (1972) como sendo Lonomia achelous.
No Brasil, os primeiros relatos de acidentes por lagartas surgiram em 1982,
no Amapá e Ilha de Marajó. As ocorrências eram isoladas, e o agente
responsável foi identificado como Lonomia achelous (Fraiha et al., 1986), mesma
espécie observada nos acidentes ocorridos na Venezuela. Porém, a partir de
1989, os acidentes com lagartas assumiram proporções epidêmicas no Sul do
Brasil, principalmente no oeste de Santa Catarina, nas regiões próximas a
Chapecó, no norte do Rio Grande do Sul e na região de Passo Fundo (Fan, 2002;
Zanin et al.,2003).
Os pacientes acidentados por contato com essas lagartas apresentaram
distúrbios da coagulação, alguns com hemorragias graves e outros com
insuficiência renal (Duarte et al., 1990; Duarte et al., 1994; Duarte et al., 1996;
Fan & Duarte, 2003). Ao contrário da Região Norte do Brasil, onde os relatos
mostram que os acidentes ocorriam esporadicamente, os acidentes na Região Sul
apresentaram uma maior freqüência, passando a serem considerados problema
de saúde pública. Porém, as lagartas responsáveis pelos acidentes na Região Sul
do Brasil foram identificadas como Lonomia obliqua (Walker).
A tabela 1, mostra o aumento progressivo de acidentes registrados no
período de 1986 a 1998 provocados por lagartas pertencentes ao gênero Lonomia
no Brasil. Embora o maior número de acidentes continue ocorrendo ainda no Sul
do Brasil, é também observado um aumento de casos na Região Sudeste e
Centro-Oeste do Brasil (Fan & Duarte, 2003).
Além do Brasil, há ainda relatos de acidentes esporádicos com gênero
Lonomia na Guiana Francesa, Peru, Paraguai, Argentina e Colômbia (Arocha-
Piñango & Guerrero, 2001).
4
Introdução
Tabela 1. Número de acidentes humanos por contato com as lagartas Lonomia no
Brasil, relatados no período de 1986 a 1998.
UF/ano ..86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98* Total
AM/PA 26 -- -- -- -- -- -- -- -- -- 2 -- -- 28
SP -- -- 1 -- 1 1 -- 2 1 4 7 2 1 20
PR -- -- -- -- 2 4 2 2 4 6 2 40 32 92
SC -- -- -- -- 30 30 8 -- 32 75 90 170 230 665
RS -- -- -- 6 10 13 21 72 101 66 46 111 177 323
GO -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 1 -- -- --
TOTAL 26 -- 1 6 43 48 31 76 138 151 148 359 440 1129
(Fan & Duarte, 2003) *até março
4. Lonomia obliqua (LEPIDOPTERA, SATURNIIDAE)
4.1. Ciclo de vida
A espécie Lonomia obliqua, como todos os lepidópteros, apresenta
metamorfose completa, com ciclo constituído por quatro estágios: ovo, larva, pupa
e adulto (fig. 2). Muitas espécies têm mais de um ciclo de vida ao ano, quando as
condições são favoráveis. A estimativa do ciclo de vida da L. obliqua, feita com
exemplares coletados da natureza e mantidos em cativeiro, apresentou ciclo
médio igual a 6 meses (4-8 meses), como mostra trabalho de Lorini (1999).
Após o acasalamento, a fêmea faz a postura dos ovos nas folhas da
plantas, essa fase dura em média 31 dias. Após a eclosão dos ovos, as larvas
possuem seis estágios de desenvolvimento que vão do 1º ao 6º instar, com
duração média de 90 dias. No 6º instar, o último estágio larval antes da fase de
pupa, a lagarta pode atingir até 6 cm de comprimento. As lagartas param de se
alimentar um pouco antes de se transformarem em pupa, e habitualmente ficam
próximas à base do tronco das árvores. Algumas mudanças na coloração também
são observadas e o corpo adquire aspecto contraído. As pupas possuem
coloração castanha escura e ficam no solo entre as folhas secas, próxima a base
5
Introdução
do tronco. Essa fase de pupa dura em média 70 dias, mas esse período pode
variar de acordo com as condições climáticas (Lorini, 1999).
A fase adulta (mariposa) emerge da pupa, e vive em média 15 dias,
acasalando nesse período e reiniciando o ciclo. O macho e a fêmea apresentam
acentuado dimorfismo sexual, sendo o macho menor que a fêmea e de coloração
mais viva. A fase adulta é a única fase que possibilita fazer uma classificação de
forma mais precisa da espécie (Lorini, 1999).
OVOS
ADULTO
PUPA
LARVA
Figura 2. Ciclo evolutivo da lagarta Lonomia obliqua (foto de Moraes, R.H.)
4.2. Comportamento
As lagartas de Lonomia obliqua possuem hábitos gregários (fig. 3), que é
uma característica da família Saturniidae (Lorini, 1993; Moraes, 2003). Por outro
lado, as lagartas da família Megalopygidae (fig. 4), que causam acidentes menos
graves, ocasionando somente efeitos locais, são solitárias (Moraes, 2003).
As lagartas da espécie Lonomia obliqua vivem agrupadas (em média 50
exemplares ou mais), ficam no tronco das árvores durante o dia e durante a noite
6
Introdução
vão para as copas das árvores para se alimentarem. Durante a fase larval, que é
a única fase em que se alimentam de folhas, as lagartas, nos primeiros instares,
ficam na parte mais alta das árvores e, entre o 5° e 6° instar, já se posicionam
mais próximas à base das árvores, favorecendo assim a ocorrência dos acidentes
humanos nesta fase (Lorini, 1999; Moraes, 2003).
Os números de acidentes no Brasil começam a aumentar a partir do mês
de novembro, sendo que a maior incidência ocorre no verão, nos meses de
janeiro, fevereiro e março (Fan & Duarte, 2003).
As larvas da L. obliqua podem se alimentar de folhas de diversas plantas,
incluindo folhas de árvores frutíferas. Em seu habitat natural, nas matas nativas, a
Lonomia obliqua pode se alimentar de plantas como Alcornia (Tapiá). Com o
desmatamento para implantação da agricultura, essas lagartas se adaptaram
muito bem a outras árvores listadas na tabela 2 (Lorini, 1999; Moraes, 2002).
Figura 3. Comportamento
gregário de lagartas L. obliqua
(Saturniidae) (foto de Moraes,
R.H.)
Figura 4. Comportamento solitário
de lagarta Megalopyge albicolis
(Megalopygidae) (foto de Moraes,
R. H.
)
.
7
Introdução
Tabela 2. Árvores descritas como fonte de alimento da lagarta L. obliqua.
Nome científico Nome popular
Cedrella fissilis
Cedro
Erytrina crista-galli
Eritrina
Fícus carica
Figueira
Fícus elástica
Seringueira
Fícus subtiplinervia
Figueira-do-mato
Persea gratissima
Abacateiro
Platanus acerifolia
Plátano
Pyrus communis
Pereira
Prunus domestica
Ameixeira
Prunus pérsica
Pessegueiro
Psidium guayava
Goiabeira
Rollinia emarginata
Araticum
Tabebuia pulcherrima
Ipê
Lorini, 1999
4.3. Inimigos naturais da lagarta Lonomia obliqua
Na década de 90 o aumento do número de acidentes ocasionados no Sul
do Brasil pelas lagartas do gênero Lonomia, atingiram proporções epidêmicas, o
que levantou questões sobre as possíveis causas desta súbita epidemia. Até
então, os acidentes eram mais esporádicos e restritos à região Norte do Brasil, e
relacionados com as pessoas que faziam a extração de borracha (Kelen et al.,
1995). Uma das possibilidades consideradas foi a implantação da agricultura na
região, principalmente de milho e soja, além do desmatamento exagerado, que
certamente destruiu o habitat natural desses lepidópteros. A introdução de
agrotóxicos no meio ambiente, pode ter contribuído para a diminuição dos
inimigos naturais da lagarta L. obliqua, além de outros desequilíbrios ecológicos
(Kelen et al., 1995; Lorini, 1999).
Entre os inimigos naturais da lagarta Lonomia obliqua estão as vespas
pertencentes à espécie Enicospilus sp (Hymenoptera: Ichineumonidae) (fig. 5) e a
mosca da espécie Belvosia viedemanni (Díptera: Tachinidae) (fig 6,) que foram
8
Introdução
citadas como parasitóides por Lorini (1999). As moscas da espécie Moreiria
wiedemanni e Lespesia affinis (Díptera: Tachinidae), figura 7 e 8 respectivamente
foram identificadas como inimigos naturais de L. obliqua, sendo os insetos da
espécie Alcaeorrhynchus grandis (Dallas) figura 9, (Hemíptera: Pentatomidae)
considerados os seus predadores (Moraes, 2002).
Foram identificados também nematóides Hexamermis sp, (Nematoda:
Mermithidae) (fig.10), além de bactérias (Moraes, 2002) e vírus como o
LoobMNPV (Lonomia obliqua Multiplo Nucleopolyhedrovirus) (fig.11),
pertencentes ao grupo de vírus da poliedrose nuclear (NPV) que, de acordo com
o autor, podem funcionar como controle biológico para a lagarta L. obliqua (Wolff
et al., 2002).
Figura 6. Belvosia sp (fêmea)
(Díptera: Tachinidae)
(foto de Moraes, R. H.)
Figura 5. Adulto e pupário de
Enicospilus sp (Hymenoptera-
Ichneumonidae)
(foto de Moraes, R. H.)
Figura 8. Fêmea e pupário de
Lespesia affinis (Tawns,1927)
(Diptera-Tachinidae)
(foto de Moraes, R. H.)
Figura 7. Moreiria wiedemanni
(fêmea) (Diptera: Tachinidae)
(foto de Moraes, R. H.)
9
Introdução
1
2
Figura 9. Alcaeorrhynchus grandis
(Dallas) (Hemíptera: Pentatomidae).
Predador de L. obliqua vista dorsal
(1), vista ventral (2).
(foto de Moraes, R.H.)
Figura 10. Hexamermis sp
(Nematoda: Mermithidae)
(Moraes, R.H.)
1 2 3
Figura 11. Fotomicrografia de varredura (1), Fotomicrografia de
transmissão (2) e detalhe do poliedro (3) de LoobMNPV – Lonomia
obliqua Múltiplo Nucleopolyhedrovirus. ( Moraes, R. H.)
5. ATIVIDADE BIOLÓGICA DO EXTRATO DE CERDAS DA LAGARTA
Lonomia obliqua
Os primeiros estudos sobre as toxinas de Lonomia obliqua foram
realizados após o aparecimento dos primeiros casos no Sul do Brasil, nos finais
dos anos 80, pois os únicos trabalhos disponíveis eram sobre envenenamento por
10
Introdução
Lonomia achelous, na Venezuela e Norte do Brasil (Arocha-Piñango, 1967; Fraiha
et al., 1986; Kelen et al., 1995).
A partir de 1995 foram publicados os primeiros estudos sobre as atividades
do extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua. Kelen et al. (1995), através de
experimentos in vitro e in vivo em ratos, avaliaram a ação das toxinas presentes
no extrato de cerdas de L. obliqua, correlacionando com o quadro clínico dos
pacientes. Observaram que a injeção i.d. (intra-dérmica) do extrato bruto induziu
incoagulabilidade sanguínea nos ratos, por consumo de fibrinogênio. Este quadro
era semelhante ao observado no envenenamento humano, monstrando que o rato
é um bom modelo animal para o estudo da fisiopatologia deste envenenamento.
Nesta época, já se sabia que substâncias pro-coagulantes contidas nas cerdas
poderiam ser responsáveis pelos distúrbios hemostáticos. Assim, Donato et al.
(1998) verificaram a presença de componentes com atividade procoagulante no
extrato, um ativador de protrombina e de fator X da coagulação sanguínea. Reis
et al. (1999, 2001a) isolaram um ativador de protrombina do extrato de cerdas que
foi denominado Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease). Esta
proteína é uma serinoprotease dependente de Ca
2+
, de 69 kDa de massa
molecular, que não mostrou semelhança com outros ativadores de protrombina
conhecidos em toxinas animais (Reis et al., 2001a, b). Recentemente, uma
proteína com atividade de fator Xa, de aproximadamente 21 kDa, foi purificada e
parcialmente caracterizada (Lilla et al., 2005).
Seibert et al. (2003) através de estudos in vitro, demonstraram que o
extrato bruto hemolisa os eritrócitos humanos e de ratos Wistar, na presença de
fosfatidilcolina exógena. Esta atividade, presente em outras toxinas animais, é
comumente denominada de atividade hemolítica indireta e é causada por
fosfolipase A
2
(Doley & Mukherjee, 2003; Fletcher et al., 1990; Grotendorst &
Hessinger, 1999; Kelen et al., 1960-62; Santoro et al, 1999; Shukla & Hanahan,
1982; Slotta & Borchert, 1954; Toyama et al., 2003; Watala & Kowalczyk, 1990).
Mais recentemente Seibert et al., 2006 purificaram e caracterizaram uma
fosfolipase A
2
que induz hemólise indireta. Também foi relatada a atividade
hemolítica direta do extrato bruto, causada por atividade proteolítica do extrato na
membrana dos eritrócitos, principalmente sobre a banda 3, uma proteína integral
da membrana eritrocitária (Seibert et al., 2003; Seibert et al., 2005).
11
Introdução
A presença de atividade fibrinogenolítica no extrato bruto de cerdas de L.
obliqua foi relatada por Veiga et al. (2003). Essa atividade também foi descrita e a
enzima purificada e caracterizada na hemolinfa da espécie L. achelous (Arocha-
Piñango et al., 1981; Amarant et al., 1991). De acordo com Arocha-Piñango et al
(1981, 2003), a hemolinfa e o extrato das cerdas da lagarta L. achelous possuem
as mesmas atividades.
Há controvérsias em relação à atividade fibrinolítica do extrato de cerdas
da L. obliqua, pois o trabalho de Fritzen et al. (2003) mostrou que, para haver
atividade fibrinogenolítica, induzindo a degradação da cadeia A-α do fibrinogênio,
era necessário altas concentrações de extrato bruto e um longo período de
incubação. Além disso, não se observou ativador de plasminogênio e nem
atividade fibrinolítica na placa de fibrina.
Várias atividades já foram descritas, purificadas e caracterizadas no
extrato, hemolinfa e secreções de Lonomia achelous, tais como: do tipo plasmina
ou Lonomina II (Amarant et al., 1991; Arocha-Piñango et al., 1981), do tipo
uroquinase ou Lonomina I e protease de fator XIII ou Lonomina V (Arocha-
Piñango et al., 1973; Arocha-Piñango & Pepper, 1981; Guerrero et al., 1997a, b;
Guerrero et al., 1999; Arocha-Piñango et al., 2000), inibidor de fator V ou
Lonomina VI:i e ativador de fator V ou Lonomina VI:a (Lopez et al., 2000), ativador
direto de protrombina ou Lonomina III e atividade do tipo fator Xa ou Lonomina IV
(Guerrero & Arocha-Piñango, 1992), atividade do tipo calicreína ou Lonomina VII
(Arocha-Piñango & Pepper, 1981). Entretanto, com relação à Lonomia obliqua
ainda há muito a ser estudado. Dentre as atividades biológicas presentes nas
toxinas dessa lagarta estão relacionados, ativador de protrombina ou Lopap (Reis
et al., 1995; Reis et al., 2001a, b), ativador de fator X (Donato et al., 1998),
atividade do tipo fator Xa (Lilla et al., 2005), atividade fibrinogenolítica (L. obliqua
α-fibrinogenase) ou Lonofibrase (Veiga et al., 2003; Pinto et al., 2004; Pinto
et al.,
2006), fosfolipase do tipo A
2
(Seibert et al., 2006). Na tabela 3, estão
apresentadas as principais atividades descritas para o extrato de cerdas ou
hemolinfa das lagartas do gênero Lonomia.
12
Introdução
Tabela 3. Atividades biológicas descritas nas toxinas das lagartas do gênero
Lonomia
Atividades Biológicas
Lonomia achelous Lonomia obliqua
Atividade do tipo plasmina (Lonomina II) Ativador de protrombina (Lopap)
Atividade do tipo uroquinase (Lonomina I) Ativador de fator X
Atividade proteolítica de fator XIII
(Lonomina V)
Atividade fibrinogenolítica
(Lonofibrase)
Inibidor de fator V (Lonomina VI:i) Atividade do tipo fator Xa
Ativador de protrombina (Lonomina III) Fosfolipase do tipo A
2
Atividade do tipo fator Xa (Lonomina IV)
Ativador de fator V (Lonomina VI:a)
Atividade do tipo calicreína (Lonomina VII)
Atividade proteolítica da matriz extracelular
(Lonomina VIII)
6. ASPECTOS CLÍNICOS E TRATAMENTO DO ENVENENAMENTO COM A
Lonomia obliqua
6.1. Aspectos Clínicos
6.1.1. Lonomia obliqua
O quadro de envenenamento pela lagarta L. obliqua se manifesta após o
contato acidental com as cerdas da lagarta. O paciente acidentado apresenta
quadro local que permanece até 12 horas após o contato, que também é
observado no erucismo causado por outros lepidópteros. As manifestações locais
iniciam-se precocemente com dor do tipo queimadura, edema, hiperemia, prurido
e adenopatia regional. Muitas vezes, é possível observar lesões puntiformes,
eritematosas, características do contato das cerdas das lagartas do grupo
Saturniidae. Entretanto, em acidentes por lagartas L. obliqua, além das
manifestações locais, observam-se também alterações sistêmicas caracterizadas
13
Introdução
principalmente por distúrbios hemostáticos. Nos pacientes, são observados
equimose, petéquia, hematúria, gengivorragia, hematoma pós-punção e epistaxe,
além de manifestações gerais como cefaléia, náuseas, vômitos e tontura. Os
pacientes apresentam distúrbios de coagulação que estão relacionados ao
consumo de fibrinogênio e fator V no plasma, diminuição da atividade de fator XIII,
plasminogênio e α-2 antiplasmina, bem como atividade de proteína C reduzida
(Zannin et al.,2003; Fan & Duarte, 2003; Kelen et al., 1995).
Os pacientes acidentados com L. obliqua podem desenvolver insuficiência
renal aguda. Casos já descritos relatam que os pacientes, após o contato com as
lagartas, apresentaram oligúria severa e até anúria (Duarte et al., 1990; Fan et al.,
1998; Gamborgi et al., 2005).
Os distúrbios de coagulação observados em envenenamento humano e
experimental estão relacionados principalmente ao ativador de protrombina e ao
ativador de Fator X presentes no extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua.
As alterações da coagulação são também observadas em ratos (Kelen et al.,
1995; Reis et al., 2001) e coelhos (Prezoto et al., 2002), entretanto a hematúria
que é relatada com freqüência em acidentes humanos (Duarte et al., 1990; Kelen
et al., 1995), não ocorre em animais experimentais. Em ratos é evidente a
hemólise intravascular (Seibert et al., 2004) causada pela fosfolipase e fator
hemolítico direto do extrato (Seibert et al., 2003; Seibert et al., 2005; Seibert et al.,
2006).
6.1.2. Lonomia achelous
Pacientes humanos que têm contato acidental com a lagarta L. achelous,
apresentam sintomas parecidos aos observados nos acidentes por L. obliqua
(Kelen et al., 1995).
Na descrição dos casos clínicos dos acidentes em humanos por L.
achelous, os pacientes apresentaram, nos exames laboratoriais, tempo de
protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPA) e tempo
de trombina (TT) prolongados com diminuição dos níveis de fibrinogênio,
plasminogênio, fator V e fator XIII. Os níveis de fator VIII, fator de von Willebrand
e dos produtos de degradação da fibrina(ogênio) (PDF), se apresentaram
14
Introdução
elevados. Em relação ao número de plaquetas e aos níveis de fator X, fator IX,
fator XI, fator XII e antitrombina III, não foi observada nenhuma alteração (Arocha-
Piñango et al, 1992).
Marval et al. (1999) mostraram que, no envenenamento experimental de
coelhos, esses animais apresentaram alterações nos tempos de TP, TTPA, TT e
lise na placa de fibrina, com diminuição nos níveis de fibrinogênio, plasminogênio
e fator XIII, porém sem alterações nos níveis de fator II, X e V.
6.2. Tratamento
A orientação terapêutica é feita de acordo com a classificação da gravidade
do envenenamento (tabela 4), Fan & Duarte, 2003.
A administração de soro antilonômico é indicada para os pacientes com
tempo de coagulação alterado; para os que apresentam apenas manifestações
locais, não são utilizados soro antilonômico, mas apenas tratamento sintomático,
como mostra a tabela 3. Estudos recentes sobre a eficácia do soro anti-lonômico
mostraram que a administração de 3 ampolas de soro foi tão eficiente quanto a
administração de 5 ampolas, para reverter o quadro de incoagulabilidade (Caovilla
et al, 2004). Assim, o soro é a única terapia eficaz para reverter os distúrbios
hemostáticos observados no envenenamento por L. obliqua. O mais importante é
que, a partir da utilização do antiveneno, não houve mais nenhum relato de óbito
por envenenamento com L. obliqua (Rocha-Campos et al, 2001).
15
Introdução
Tabela 4. Orientação terapêutica segundo a classificação do grau de gravidade
no envenenamento por L. obliqua.
Gravidade Manifestações Tratamento
LEVE -Local: dor, edema, eritema Sintomático
MODERADO
-Local: presente ou ausente
-Tempo de Coagulação: alterado
-Sangramento: ausente ou presente em
pele/mucosa
Sintomático
+
SALon 5 amp
GRAVE -Local: presente ou ausente
-Tempo de Coagulação: alterado
-Sangramento: presente em vísceras
Sintomático
+
SALon 10 amp
Fan & Duarte, 2003
SALon (Soro antilonômico)
O soro antilonômico é produzido no Instituto Butantan a partir do extrato de
cerdas da lagarta da espécie L. obliqua (Dias-da-Silva et al., 1996), para o
tratamento dos acidentes causados por essa espécie, mas o mesmo se mostrou
eficaz também para o tratamento dos pacientes acidentados possivelmente com a
lagarta L. achelous, na Colômbia.
Embora o uso de agentes antifibrinolíticos seja preconizado para o
tratamento do envenenamento por L. achelous, onde a hemorragia parece estar
relacionada a enzimas que degradam fator XIII e proteínas que ativam a fibrinólise
(Arocha-Piñango et al., 1992), o mesmo não é recomendado para L. obliqua, pois
neste caso as manifestações de sangramento estão relacionadas à coagulopatia
de consumo induzida pela presença de enzimas procoagulantes (Zannin et al.,
2003).
7. PRODUÇÃO DO ANTIVENENO ANTI-LONÔMICO
No início, quando os acidentes com L. obliqua surgiram nos arredores de
Passo Fundo, os pacientes eram admitidos no Hospital São Vicente de Paulo, em
Passo Fundo-RS. Durante o período de dezembro de 1989 a fevereiro de 1994,
155 pacientes foram admitidos e dentre esses, 4 pacientes foram a óbito, sendo 3
por hemorragia cerebral e um por hemorragia pulmonar (Kelen et al., 1995). Uma
16
Introdução
outra característica marcante em alguns desses pacientes era o desenvolvimento
da insuficiência renal aguda, responsável pelo encaminhamento dos pacientes
para o tratamento de hemodiálise (Duarte et al., 1990; Duarte et al., 1994).
A gravidade desse envenenamento foi um dos fatores que estimularam os
pesquisadores a estudar melhor o envenenamento e encontrar um tratamento
eficaz, diminuindo assim o índice de mortalidade. Em 1994, o soro antilonômico
produzido no Instituto Butantan, que mostrou ser eficaz na neutralização das
atividades do extrato das cerdas de L. obliqua, foi introduzido como tratamento
para esses acidentes. Hoje, o tratamento preconizado para estes acidentes é o
antiveneno isolado do soro de cavalos imunizados com extrato de cerdas da
lagarta Lonomia obliqua (Fan, 2002; Caovila & Barros, 2004).
Para a produção do soro antilonômico, o extrato de cerdas é utilizado como
antígeno, que é injetado em cavalos (via subcutânea) com reforços semanais, até
a detecção de títulos de anticorpos adequados (Dias-da-Silva et al., 1996; Rocha-
Campos et al., 2001).
Dias-da-Silva et al. (1996) observaram que, com pequenas quantidades de
extrato, havia produção de anticorpos de longa duração e que os cavalos
sensibilizados eram re-estimulados de forma eficiente, com dose reforço de
antígeno, mesmo após um ano do primeiro contato com o antígeno.
As lagartas utilizadas para a produção do soro são procedentes das
regiões onde a incidência dos acidentes é maior, como Passo Fundo (RS),
Chapecó (SC) e arredores. As lagartas capturadas nessas regiões são enviadas
vivas para o Instituto Butantan, onde os extratos são preparados imediatamente
após as cerdas serem retiradas, conforme Dias-da-Silva et al. (1996). Os extratos
são congelados e armazenados a -20ºC e utilizados para imunizações de cavalos
para produção do soro anti-lonômico.
Um dos maiores problemas da obtenção do extrato para o Instituto
Butantan, tem sido conseguir uma quantidade grande de exemplares de lagartas
no mesmo período, que seja representativo da espécie, possibilitando a inclusão
das possíveis variáveis que ainda não são conhecidas. Além disso, o envio de
poucas lagartas, encontradas periodicamente, acarreta em alto custo de
transporte. Recentemente, as poucas empresas aéreas que faziam o transporte,
têm se recusado a fazê-lo, alegando os riscos que o transporte destes animais
17
Introdução
poderia acarretar. Atualmente o transporte tem sido feito por via rodoviária, o que
tem aumentado o tempo de transporte, o estresse das lagartas e a conseqüente
perda das mesmas.
Uma alternativa provável seria a possibilidade de congelar as cerdas
retiradas das lagartas, mesmo que em pequena quantidade, e armazená-las por
um período até se obter uma quantidade representativa para preparar o extrato.
Para isso, é fundamental que se tenha conhecimento se as propriedades
principais do extrato não serão alteradas pelos processos de congelamento e
armazenamento.
18
II. OBJETIVO
Objetivo
II. OBJETIVO
O extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua utilizado para produção de
antivenenos é preparado com cerdas que são cortadas e processadas em
seguida. Frequentemente as lagartas são capturadas em pequena quantidade e
não são enviadas ao Instituto devido ao alto custo do transporte. Por causa do
processo de desenvolvimento das lagartas a alternativa mais viável para otimizar
a utilização das mesmas seria o armazenamento a baixa temperatura das cerdas
coletadas. Todavia, não existem relatos na literatura sobre as alterações que o
congelamento e armazenamento das cerdas podem causar nas atividades
biológicas do extrato.
Assim, o objetivo deste estudo foi comparar a atividade biológica do extrato de
cerdas da Lonomia obliqua preparado com cerdas não congeladas, e congeladas
a –20º C, em diferentes tempos de armazenamento, para avaliar a utilização
desses extratos na pesquisa e na produção de soro.
19
III. MATERIAL E MÉTODOS
Material e métodos
III. MATERIAL E MÉTODOS
1. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE CERDAS DE Lonomia obliqua
Para o preparo de cada lote foram utilizadas cerca de 400 lagartas de
Lonomia obliqua de 5º e 6º instar, provenientes de Passo Fundo (RS).
As lagartas foram anestesiadas com CO
2
, e suas cerdas dorsais e laterais
foram cortadas bem próximas à base. Essas cerdas foram separadas em 4 partes
iguais: 1 parte dessas cerdas foi utilizada no mesmo dia para preparação do
extrato; as outras 3 partes de cerdas foram congeladas e os extratos foram
preparados após 2, 4 e 6 meses de congelamento a -20º C, como mostrado no
esquema da figura 12.
Resumidamente, o extrato foi preparado a partir das cerdas cortadas e
maceradas em tampão PBS gelado (pH 7,4). A solução foi centrifugada a 2100g
por 5 min e o sobrenadante foi separado, filtrado, aliquotado e congelado a –20º C
(Dias-da-Silva et al., 1996).
Para este estudo foram preparados 3 lotes de extrato (A, B e C), sendo o
lote A preparado com cerdas de animais coletados em 2002 e lotes B e C de
animais coletados em 2003. De cada lote de extrato foram preparadas 4 amostras
diferentes de extratos, com cerdas cortadas e separadas da seguinte maneira:
1-Cerdas recém cortadas, não congeladas (amostra 0).
2-Cerdas cortadas e congeladas por 2 meses a –20º C (amostra 2).
3-Cerdas cortadas e congeladas por 4 meses a –20º
C (amostra 4).
4-Cerdas cortadas e congeladas por 6 meses a –20º C (amostra 6).
20
Material e métodos
Figura 12. Esquema de preparação das cerdas de L. obliqua, para a produção do
extrato.
TESTES REALIZADOS COM OS 3 LOTES DE EXTRATO:
2. DOSAGEM DE PROTEÍNA
Antes de iniciar os testes de atividades, foi determinada a concentração de
proteína de cada amostra de extrato dos lotes A, B e C. Para isso foi utilizado o
método de Lowry et al. (1951) modificado (Markwell et al., 1978). Nesse método,
o nitrogênio das ligações peptídicas reage com o cobre, do mesmo modo que na
reação de biureto e os resíduos de tirosina e triptofano reagem com o reagente
Folin-Ciocalteau.
21
Material e métodos
Para esse método foi utilizada curva padrão de albumina, e as
determinações de concentração protéica dos extratos foram feitas em triplicatas.
3. DOSE MÍNIMA COAGULANTE (DMC)
A dose mínima coagulante (DMC) é definida como a menor quantidade de
proteína do extrato capaz de coagular o plasma em 60 segundos. Para determinar
a DMC foi utilizado plasma humano normal, citratado, utilizando-se o método de
Theakston & Reid (1983). O extrato foi diluído progressivamente (1:1, 1:2, 1:4,
1:8, 1:16, 1:32; 1:64; 1:128) e as concentrações de proteínas utilizadas variaram
de 3,52 a 450,0 µg/mL. Para este teste, cerca de 100 µL de plasma humano
normal foi colocado num tubo de vidro e mantido em banho-maria a 37º C, onde
foi adicionado 50 µL do extrato de cerdas e 50 µL de CaCl
2.
A mistura foi
homogeneizada e então foi determinado o tempo de coagulação. Foram
realizadas 8 (n=8) dosagens por amostra.
4. ATIVIDADE FIBRINOLÍTICA
A atividade fibrinolítica foi determinada segundo o método de Granelli-
Piperno & Reich (1978). Foram preparadas 7,5 mL de solução de agarose 2%, em
tampão Tris 20 mM pH7,5 (contendo NaCl 100 mM, MgCl
2
0,7 mM e CaCl
2
1,66
mM), e 7,5 mL de solução de fibrinogênio bovino, 3 mg/mL, diluído com tampão
Tris 20 mM (pH 7,5). As duas soluções foram colocadas no banho-maria a 40º C.
Na solução contendo agarose, foi adicionado 5 mL de trombina bovina (Sigma) 20
U/mL. As duas soluções foram rapidamente homogeneizadas e colocadas em
uma placa de petri de 15 cm de diâmetro, contendo 0,5 mL de CaCl
2
, disposta
sobre nivelador, para polimerizar. Após a polimerização, foram recortados
pocinhos onde as amostras foram aplicadas.
Nos pocinhos, foram aplicados 30 µL (54 µg) de extrato de cerdas de L.
obliqua, 30 µL de PBS (pH 7,4) como controle negativo e 30 µL de plasmina como
controle positivo. As placas foram mantidas a 37º C por 18 horas, e as áreas de
lise foram medidas com paquímetro.
22
Material e métodos
5. ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA
Para a determinação da atividade fosfolipásica foi utilizado o método
descrito por Lobo de Araújo & Radvanyi (1987) e modificado por Santoro et al.
(1999).
O extrato foi diluído em série (1:1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32). Em uma cubeta
de espectrofotômetro 15 µL de extrato diluído foi adicionado a 1,5 mL de reagente
contendo NaCl 100 mM, CaCl
2
10 mM, Triton X 100 7 mM, lecitina de soja
0,265%, vermelho fenol 98,8 µM (pH 7,6). A solução foi homogeneizada e inserida
em um espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro (558 nm) acoplado ao programa
Swift II de reação cinética. A atividade enzimática foi registrada por 6 minutos e os
resultados foram expressos como a diminuição da inclinação máxima da curva em
absorbância/minuto.
6. ATIVIDADE HEMOLÍTICA INDIRETA
Para medir a atividade hemolítica indireta foram utilizados eritrócitos
humanos. O sangue foi coletado em solução de Alsever (1:1) e mantido em
repouso por 7 dias a 4º C. Após esse período, os eritrócitos foram lavados 3
vezes (7 minutos a 165 g) com PBS (pH 7,4) e ressuspensos na mesma solução
a fim de conter 0,5 x 10
8
/mL de eritrócitos. Foi preparada solução de lecitina
contendo 120 µl de lecitina (1 mg/mL) (Sigma), 500 µl de CaCl
2
(0,01 M) e 380 µl
de salina. As reações foram realizadas conforme o protocolo apresentado na
tabela 5.
Tabela 5. Protocolo experimental para atividade hemolítica indireta.
Tubos Eritrócitos Água PBS Lecitina Extrato
Hemólise espontânea
200 µl
---
100µl 100 µl
---
100% hemólise
200 µl 200 µl
--- --- ---
Tubo teste
200 µl
--- ---
100 µl 100 µl
Branco Amostra --- ---
200µl 100 µl 100 µl
23
Material e métodos
Os tubos foram incubados por 1 hora a 37º C, e a reação foi interrompida
pela adição de 2 mL de PBS gelado em cada tubo, com exceção do tubo de 100%
de hemólise, no qual foi adicionado o mesmo volume de H
2
O destilada gelada. As
amostras foram então, centrifugadas por 7 min a 165g. A leitura do sobrenadante
foi realizada em espectrofotômetro Ultrospec 2100, em comprimento de onda de
412 nm. A concentração de proteína do extrato bruto utilizado foi de 100 µg/mL,
que induz 50% de hemólise em eritrócitos humanos (Seibert et al, 2003).
A porcentagem de hemólise foi determinada pela seguinte fórmula:
Hemólise (%)=
Abs.Tubo teste - Σ hem. espont. e branco do extrato x 100 Abs.
100% hemólise
7. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DIRETA
Para a determinação da atividade hemolítica direta foram também
utilizadas hemácias humanas, preparadas conforme descrito anteriormente para a
atividade hemolítica indireta. A diferença entre as duas metodologias é que, para
a atividade direta, não utilizamos a lecitina e o seu volume foi substituído por PBS,
como pode ser observado na tabela 6.
Tabela 6. Protocolo experimental para atividade hemolítica direta.
Tubos Eritrócitos Água PBS Extrato
Hemólise espontânea
200 µl
---
200 µl
---
100% hemólise
200 µl 200 µl
--- ---
Tubo teste
200 µl
---
100 µl 100 µl
Branco Amostra --- ---
300 µl 100 µl
Após colocar as amostras nos tubos conforme esquema da tabela 6, elas
passaram pelo mesmo processo descrito anteriormente, para a atividade
hemolítica indireta. Ou seja, foram incubadas a 37º C por 1 hora, a reação foi
interrompida, as amostras centrifugadas e o sobrenadante foi utilizado para leitura
da hemoglobina a 412 nm.
24
Material e métodos
8. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS ANTI-LONÔMICO EM
CAMUNDONGOS
Para a produção de anticorpos foram utilizados camundongos da linhagem
BALB/c fêmeas, que foram imunizados com extrato bruto de cerdas de Lonomia
obliqua.
Foram utilizados 2 grupos para cada lote e 1 grupo controle, formando um total
de 7 grupos, sendo que para cada grupo foram usados 4 animais (n=4), com
exceção do grupo controle onde foram utilizados apenas 3 animais (n=3):
a) Grupo 1 (controle) que não recebeu antígeno;
b) Grupo 2 e 3 que receberam extrato de cerdas do lote A (0 e 6 meses
respectivamente);
c) Grupo 4 e 5 que receberam extrato de cerdas do lote B (0 e 6 meses
respectivamente);
d) Grupo 6 e 7 que receberam extrato de cerdas do lote C (0 e 6 meses
respectivamente).
Sendo: grupo 0 = cerdas não congeladas
grupo 6 = cerdas congeladas por 6 meses
Todos os grupos, com exceção do grupo controle, receberam 40 µg de extrato
de cerdas em (200 µL). A primeira dose foi administrada com adjuvante
incompleto de Freund e 31 dias após, recebeu um reforço sem adjuvante. Os
animais foram submetidos a uma sangria, via plexo ocular, 41 dias após a
primeira inoculação. Para a separação do soro, o sangue foi incubado a 37º C,
por 60 minutos, para formação do coágulo, e em seguida centrifugado por 5
minutos a 1200 g; o soro sobrenadante separado, congelado e armazenado a
-20º C.
25
Material e métodos
9. DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPOS PELO MÉTODO
IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
O título de anticorpos anti-lonômico foi determinado através da técnica de
ELISA.
Foram utilizadas placas de poliestireno Polysorp. Para sensibilização das
placas, 100 µL de uma solução contendo 10 µg/mL de extrato bruto, diluído em
tampão alcalino de baixa força iônica (tampão carbonato pH 9,6), foi colocada em
cada poço da placa. As placas foram incubadas por 18 horas a 4º C, em câmara
úmida. Após este período, elas foram submetidas a 3 lavagens sucessivas, com
PBS contendo Tween 20 a 0,05%. A seguir, em cada poço foi adicionado 200 µL
de solução bloqueadora contendo tampão carbonato pH 9,6 e leite em pó (Molico)
5%. Em seguida, a placa foi incubada por 1hora, a 37º C, em câmara úmida. Após
esse período, foram feitas 3 lavagens. Em cada poço foi adicionado 100 µL do
soro de BALB/c, imunizado com extrato de cerdas não congeladas e congeladas
por 6 meses dos lotes A, B e C, diluído 1/50 em tampão de incubação (tampão de
lavagem contendo leite em pó (Molico) 3%). Foi feita nova incubação por 2 horas
a 37º C , em câmara úmida. Após 3 lavagens sucessivas, de 5 minutos cada uma,
as placas foram incubadas por 1 hora, a 37º C, com o respectivo conjugado
enzimático (soro anti-Ig-G total anti-camundongo marcado com peroxidase),
diluído 1:1000 com o tampão de incubação. Foram feitas mais 3 lavagens de 5
minutos cada e a reação foi revelada pela adição de 100 µL da mistura
cromógena mais substrato da enzima (1 mg de ortofenilendiamina/mL em tampão
citrato 0,2 M (pH 5,0), contendo água oxigenada 0,06%).
A reação foi interrompida pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico 8 N em
cada poço. A intensidade da reação foi determinada pela leitura da absorbância,
utilizando-se comprimento de onda de 492 nm em um leitor de microplacas
SpectraMax 190. O título de anticorpos foi definido como a recíproca da diluição
máxima de soro, capaz de resultar em uma leitura da absorbância em 492 nm
maior que 0,100.
26
Material e métodos
10. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA CONTENDO SDS
Para analisar as proteínas dos extratos nos diferentes tempos de
congelamento, foi realizada eletroforese pelo método de Laemmli (1970), em gel
de poliacrilamida 12%.
Para a preparação do gel de poliacrilamida, utilizou-se quantidade
adequada de solução estoque de acrilamida 30% e bis-acrilamida 0,8%, tampão
Tris 0,375 M (pH 8,8), SDS 0,1%, Temed 0,05% e persulfato de amônio 0,05%.
Após a adição dos dois últimos reagentes, a solução foi imediatamente colocada
entre duas placas de vidro, separadas por um espaçador de 1 mm de espessura.
Para formar os poços para aplicação da amostra, foi utilizado um pente de 1 mm
de espessura com 10 canaletas. Ao extrato foi adicionado tampão de amostra
(Tris 0,05 M (pH 6,8), SDS 1%, glicerol 10% e azul de bromofenol 0,004%) para a
forma não reduzida e para forma reduzida foi adicionado ao tampão de amostra
(2β-mercaptoetanol 0,5%). As amostras foram previamente fervidas por 5
minutos; o volume aplicado variou de 10 a 15 µL/canaleta e a concentração de
proteína do extrato foi de 1 µg de proteína por canaleta. O tampão de corrida
utilizado foi Tris-glicina (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% pH8,3). A corrida
foi realizada em sistema Mighty Small II SE250/SE260, com voltagem constante
de 100 V e 30 mA por placa (fonte BIO RAD modelo PowerPac 1000), até as
amostras atingirem a extremidade inferior do gel. Os géis foram corados por prata
utilizando-se método descrito por Blum et al. (1987). Foi utilizado padrão de peso
molecular BIO RAD Broad Range (205 kDa a 6,5 kDa).
Para a análise densitométrica foi utilizado o programa total Lab e a análise
foi feita nos géis das amostras não congeladas (0) e congeladas por 2, 4 e 6
meses, dos lotes A, B e C. Para comparar as amostras nos diferentes tempos de
congelamento o parâmetro usado na análise densitométrica foi a % de banda.
27
Material e métodos
11. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise estatística, foi utilizada análise de variância (ANOVA), e para
comparação das médias, o teste de Turkey. As análises foram realizadas no
programa Graphpad Instat, sendo consideradas estatisticamente significativas as
diferenças com p<0,05.
28
IV. RESULTADOS
Resultados
IV. RESULTADOS
1. DOSAGEM DE PROTEÍNA
Na tabela 7 estão apresentados os valores da concentração de proteínas
do extrato bruto, preparado com cerdas não congeladas e congeladas em
diferentes tempos de armazenamento.
Os lotes A e C apresentaram resultados semelhantes nas amostras 0 e 4
meses, enquanto que o lote B apresentou uma aparente redução de quantidade
de proteína a partir de 2 meses de congelamento. Como as dosagens das
proteínas foram feitas em triplicata, a análise estatística foi realizada com os 3
lotes (A, B e C), para avaliar as alterações ocorridas nas amostras de 0, 2, 4 e 6
meses de congelamento.
No lote A, observamos que houve diminuição significativa (p<0,05), na
concentração protéica apenas nas amostras com 6 meses de congelamento.
No lote B, observamos diminuição significativa (p<0,05), a partir do quarto
mês, que se manteve no sexto mês.
No lote C, houve redução da concentração protéica nas amostras com 6
meses de congelamento e essa diferença foi significativa comparada com as
amostras de cerdas não congeladas e congeladas por 2 meses (p<0,05).
Assim, com 6 meses de congelamento verificamos redução significativa
(p<0,05) da concentração protéica, quando comparado à amostra de cerdas não
congeladas nos lotes A, B e C.
29
Resultados
Tabela 7. Concentração média de proteína dos extratos de cerdas da Lonomia
obliqua preparados com cerdas não congeladas e com cerdas congeladas em
diferentes tempos de armazenamento.
Tempo
congelamento
(meses)
Lote A
(mg/mL)
Lote B
(mg/mL)
Lote C
(mg/mL)
0 2,8 ± 0,27 2,2 ± 0,31 2,2 ± 0,073
2 2,5 ± 0,30 1,9 ± 0,12 2,3 ± 0,032
4 2,8 ± 0,19 1,7* ± 0,12 2,1 ± 0,094
6 1,8* ± 0,15 1,8* ± 0,15 1,9* ± 0,067
*p<0,05 comparação estatística com cerdas não congeladas
2. DOSE MÍNIMA COAGULANTE (DMC)
Nas figuras 13, 14 e 15 estão apresentados, respectivamente, os
resultados da dose mínima coagulante das amostras dos lotes A, B e C dos
extratos de cerdas da lagarta Lonomia obliqua.
No lote A (fig. 13), o extrato das cerdas congeladas por 2, 4 e 6 meses
apresentou diminuição significativa (p<0,05) da sua atividade procoagulante, em
relação às cerdas não congeladas. Além disso, entre as cerdas congeladas por 2
e 4 meses, não houve diferença de atividade, porém, após 6 meses, uma redução
significativa (p<0,05) foi observada em relação a 2 e 4 meses de congelamento.
No lote B (fig. 14), não houve diferença significativa de atividade
procoagulante entre os extratos de cerdas não congeladas e o de cerdas
congeladas por 2 meses. Entretanto, as cerdas congeladas por 4 e 6 meses
apresentaram redução significativa de atividade (p<0,05) em relação às cerdas
não congeladas. Comparando a atividade procoagulante das cerdas congeladas
por 4 e 6 meses não apresentou diferença estatística significativa entre eles.
No lote C (fig. 15), houve redução significativa da atividade procoagulante
nos extratos com cerdas congeladas por 2, 4 e 6 meses em relação às cerdas
não congeladas. Porém, não houve diferença significativa da atividade entre as
amostras congeladas por 2, 4 e 6 meses.
30
Resultados
Assim, observamos que o lote A e C apresentaram redução de atividade
procoagulante com as cerdas congeladas (2, 4 e 6 meses), enquanto que no lote
B a redução de atividade ocorreu com cerdas congeladas somente a partir de 4
meses.
Lote A
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0246
Tempo (meses)
ug/ mL
*
**
Figura 13. Dose mínima coagulante (DMC) dos extratos de cerdas da L. obliqua
preparadas com cerdas não congeladas (0 meses) e cerdas congeladas por 2, 4 e
6 meses, do lote A. Os testes estatísticos, foram feitos em relação às cerdas não
congeladas (0). Os resultados correspondem à média ± e.p.m de 8 amostras por
grupo * p<0,05. Lote A são de animais coletados em 2002.
31
Resultados
Lote B
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0246
Tempo (meses)
ug/mL
* *
Figura 14. Dose mínima coagulante (DMC) dos extratos de cerdas da L. obliqua
preparadas com cerdas não congeladas (0 meses) e cerdas congeladas por 2, 4 e
6 meses, do lote B. Os testes estatísticos, foram feitos em relação às cerdas não
congeladas (0). Os resultados correspondem à média ± e.p.m de 8 amostras por
grupo * p<0,05. Lote B são de animais coletados em 2003.
Lote C
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0246
Tempo (meses)
ug/mL
*
*
*
Figura 15. Dose mínima coagulante (DMC) dos extratos de cerdas da L. obliqua
preparadas com cerdas não congeladas (0 meses) e cerdas congeladas por 2, 4 e
6 meses, do lote C. Os testes estatísticos, foram feitos em relação às cerdas não
congeladas (0). Os resultados correspondem à média ± e.p.m de 8 amostras por
grupo * p<0,05. Lote C são de animais coletados em 2003.
32
Resultados
3. ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA
Nas figuras 16, 17 e 18 estão apresentados os resultados da atividade
fosfolipásica das diferentes amostras dos lotes A, B e C dos extratos de cerdas da
Lonomia obliqua, respectivamente.
Nos lotes A e C (fig. 16 e 18) houve diminuição significativa (p<0,05) da
atividade fosfolipásica dos extratos preparados com cerdas congeladas por 2, 4 e
6 meses; entretanto, no lote B (fig. 17) não houve redução significativa da
atividade com as cerdas congeladas por 2 meses, quando comparado com cerdas
não congeladas. Neste lote, a diminuição significativa da atividade fosfolipásica,
foi observada apenas nos extratos das cerdas congeladas por 4 e 6 meses, sendo
a atividade fosfolipásica após 6 meses de congelamento significativamente maior
do que o extrato de cerdas congeladas por 4 meses.
Os lotes A e C apresentaram comportamento semelhante, quando
comparados com extrato de cerdas não congeladas e congeladas. Nestes lotes, o
congelamento por 2 meses ou mais apresentou redução da atividade
fosfolipásica, enquanto que, o lote B só apresentou redução desta atividade no
extrato preparado com cerdas armazenadas por 4 meses ou mais.
33
Resultados
Lote A
0,00
3,00
6,00
9,00
12,00
15,00
0246
Tempo (meses)
U/ mg
*
*
*
Figura 16. Atividade fosfolipásica dos extratos de cerdas da lagarta Lonomia
obliqua, preparado com cerdas não congeladas (0 meses) e cerdas congeladas
por 2, 4 e 6 meses, do lote A. Os resultados correspondem à média ± e.p.m. de 9
amostras por grupo.* p<0,05.
Lote B
0,00
3,00
6,00
9,00
12,00
15,00
0246
Tempo (meses)
U/m
g
*
*
Figura 17. Atividade fosfolipásica dos extratos de cerdas da lagarta Lonomia
obliqua, preparado com cerdas não congeladas (0 meses) e cerdas congeladas
por 2, 4 e 6 meses, do lote B. Os resultados correspondem à média ± e.p.m. de 9
amostras por grupo.* p<0,05.
34
Resultados
Lote C
0,00
3,00
6,00
9,00
12,00
15,00
0246
Tempo (meses)
U/mg
*
*
*
Figura 18. Atividade fosfolipásica dos extratos de cerdas da lagarta Lonomia
obliqua, preparado com cerdas não congeladas (0 meses) e cerdas congeladas
por 2, 4 e 6 meses, do lote C. Os resultados correspondem à média ± e.p.m. de 9
amostras por grupo.* p<0,05.
4. ATIVIDADE FIBRINOLÍTICA
Nenhuma amostra dos lotes A, B e C do extrato de cerdas de Lonomia
obliqua apresentaram atividade fibrinolítica sobre placa de fibrina agarose.
5. ATIVIDADE HEMOLÍTICA DIRETA
A atividade hemolítica direta não foi observada nas amostras de extratos
preparados com cerdas da lagarta L. obliqua não congeladas e com cerdas
congeladas nos diferentes tempos de congelamento, para os lotes A, B e C.
35
Resultados
6. ATIVIDADE HEMOLÍTICA INDIRETA
Os resultados da atividade hemolítica indireta das diferentes amostras dos
extratos do lote A, B e C estão representados nas figuras 19, 20 e 21,
respectivamente.
Não houve diferença significativa da atividade hemolítica indireta entre os
extratos preparados com cerdas não congeladas e congeladas por 2, 4 e 6
meses, como podemos observar nas figuras 19 (lote A), 20 (lote B) e 21 (lote C).
Lote A
0
20
40
60
80
0246
Tempo (meses)
% Hemólise
Figura 19. Atividade hemolítica indireta dos extratos de cerdas da lagarta L.
obliqua, preparados com cerdas não congeladas (0 meses) e com cerdas
congeladas por 2, 4 e 6 meses, do lote A. Os resultados correspondem à média ±
e.p.m. de 7 amostras por grupo.
36
Resultados
Lote B
0
20
40
60
80
0246
Tempo (meses)
% Hemólise
Figura 20. Atividade hemolítica indireta dos extratos de cerdas da lagarta L.
obliqua, preparados com cerdas não congeladas (0 meses) e com cerdas
congeladas por 2, 4 e 6 meses, do lote B. Os resultados correspondem à média ±
e.p.m. de 7 amostras por grupo.
Lote C
0
20
40
60
80
0246
Tempo (meses)
% Hemólise
Figura 21. Atividade hemolítica indireta dos extratos de cerdas da lagarta L.
obliqua, preparados com cerdas não congeladas (0 meses) e com cerdas
congeladas por 2, 4 e 6 meses, do lote C. Os resultados correspondem à média ±
e.p.m. de 7 amostras por grupo.
37
Resultados
7. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Na dosagem dos títulos de anticorpos IgG anti-lonômico, produzidos nos
camundongos da linhagem BALB/c, não foram observadas alterações na
capacidade imunogênica dos extratos. Não foi observada também diferença
significativa em relação ao título de anticorpos produzidos pelos animais
imunizados com extratos preparados com cerdas não congeladas e extratos
preparados com cerdas congeladas por 6 meses.
Na tabela 8 estão os valores dos títulos de anticorpos obtidos dos extratos
preparados com cerdas não congeladas e cerdas congeladas por 6 meses dos
lotes A, B e C.
Tabela 8. Título de anticorpos dos camundongos da linhagem BALB/c,
imunizados com extrato de cerdas da lagarta L. obliqua (lote A, B e C) preparados
com cerdas não congeladas (0 meses) e extratos preparados com cerdas
congeladas por 6 meses (6 meses).
Lote Título de Anticorpos
0 meses
Título de Anticorpos
6 meses
A
12800
25600
B
25600
51200
C
51200
25600
38
Resultados
8. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ( SDS-PAGE)
Os perfis eletroforéticos dos extratos de cerdas da lagarta L. obliqua dos
lotes A, B e C, em diferentes tempos de armazenamento, em condições reduzidas
(com 2β-mercaptoetanol), estão apresentados nas figuras 22, 23 e 24,
respectivamente.
As massas moleculares das proteínas dos extratos das cerdas dos lotes A,
B e C nos diferentes tratamentos, em condições reduzidas, foram analisadas por
densitometria. O parâmetro utilizado para a comparação entre as bandas
protéicas foi porcentagem da densidade das bandas (% banda).
Na análise densitométrica foi possível diferenciar 21 bandas, porém nas
tabelas 9, 10 e 11 estão apresentadas apenas as bandas consideradas como as
prováveis proteínas relatadas na literatura, como o Lopap 69 kDa, ativador de
protrombina (Reis et al., 1999), proteína com atividade de fator Xa de
aproximadamente 21 kDa (Lilla et al., 2005), e proteína com atividade fosfolipase
de 15 kDa (Seibert et al., 2006).
Embora o perfil eletroforético do extrato de cerdas nos géis (figuras 22, 23
e 24) parece não apresentar diferenças em relação à intensidade das bandas, a
análise densitométrica mostrou diferenças sugestivas de degradação protéica
(tabela 9, 10 e 11).
As diferenças nas porcentagens de banda foram observadas nos 3 lotes
avaliados entre as amostras dos extratos com cerdas não congeladas (0) e com
cerdas congeladas por 6 meses. No lote A (tab. 9), foi observada redução de 34%
na porcentagem da banda 5 e de 22% e 24% nas bandas 18 e 19,
respectivamente. No lote B (tab. 10), esta diferença também ocorreu na banda 5
(39%) e na banda 17, (21%). No entanto, a maior redução da porcentagem da
banda 5 (60%), foi observada no lote C (tab. 11). Neste último lote houve redução
também da porcentagem nas bandas 4 (21%), 11 (30%), 12 (27%) e 16 (34%).
39
Resultados
Lote A
Lote B
200 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
31 kDa
21 kDa
14 kDa
6,5 kDa
200 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
31 kDa
21 kDa
14 kDa
6,5 kDa
0 2 4 6 C P 0 2 4 6 P
Figura 22- Perfil eletroforético das
proteínas dos extratos das cerdas
da lagarta L. obliqua do lote A em
condições reduzidas: 0 meses, 2
meses, 4 meses e 6 meses; C-
controle; P- padrão.
Figura 23- Perfil eletroforético
das proteínas dos extratos das
cerdas da lagarta L. obliqua do
lote B em condições reduzidas: 0
meses, 2 meses, 4 meses e 6
meses; P- padrão.
Lote C
200 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
31 kDa
21 kDa
14 kDa
6,5 kDa
024 6 P
Figura 24- Perfil eletroforético das
proteínas dos extratos das cerdas da
lagarta L. obliqua do lote C em
condições reduzidas: 0 meses, 2
meses, 4 meses e 6 meses; P- padrão.
40
Resultados
Tabela 9. Dados parciais da análise densitométrica da eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) das amostras de extrato das cerdas da lagarta
Lonomia obliqua (Lote A) expressos em porcentagem. Região das proteínas
procoagulantes- bandas 3 a 5 (Lopap - 69 kDa) e 14 a 16 (fator Xa – 21 kDa);
bandas 17 a 19 (Fosfolipase A
2
– 15 kDa).
Banda
Tempo de congelamento (meses)
(%)
Peso molecular
0 2 4 6
kDa
3 5.52 6.19 6.01 4.86
76,73
4 2.76 2.49 2.42 2.32
67,48
5 4.15 4.72 4.02 2.72
60,45
14 4.01 3.19 3.67 3.63
21,08
15 4.70 5.17 4.21 4.04
20,67
16 4.96 3.64 4.86 5.59
19,64
17 1.95 3.72 4.13 4.21
18,85
18 17.1 16.1 13.4 13.4
17,5
19 12.7 11.9 14.0 15.7
13,5
Tabela 10. Dados parciais da análise densitométrica da eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) das amostras de extrato das cerdas da lagarta
Lonomia obliqua (Lote B) expressos em porcentagem. Região das proteínas
procoagulantes- bandas 3 a 5 (Lopap - 69 kDa) e 12 a 14 (fator Xa – 21 kDa);
bandas 16 a 18 (Fosfolipase A
2
– 15 kDa).
Banda
Tempo de congelamento (meses)
(%)
Peso molecular
0 2 4 6
kDa
3 3,4 5,16 5,4 3,64 83,92
4 2,91 3,48 3,18 2,48 69,18
5 2,79 4,42 4,32 3,87 61,79
12 2,97 2,77 4,07 3,23 22,29
13 8,26 10,4 8,94 8,3 18,14
14 3,92 4,34 3,31 3,52 17,17
16 5,06 6,75 4,92 4,18 15,83
17 3,31 3,39 4,32 2,61 15,42
18 15,2 14,8 14,4 15,6 14,99
41
Resultados
Tabela 11. Dados parciais da análise densitométrica da eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) das amostras de extrato das cerdas da lagarta
Lonomia obliqua (Lote C) expressos em porcentagem. Região das proteínas
procoagulantes- bandas 3 a 5 (Lopap - 69 kDa) e 11 a 13 (fator Xa – 21 kDa);
bandas 16 a 18 (Fosfolipase A
2
– 15 kDa).
Banda
Tempo de congelamento (meses)
(%)
Peso molecular
0 2 4 6
kDa
3 4,6 5,13 5,94 4,41 80,26
4 3,24 3,27 3,15 3,91 67,01
5 3,99 4,38 3,54 6,39 58,7
11 3,34 3,24 2,54 4,35 28,2
12 2,14 2,21 2,29 2,72 21,63
13 9,57 8,18 9,82 7,66 17,81
16 6,25 4,3 4,44 4,14 15,54
17 2,8 3,15 2,85 2,49 15,19
18 13,37 16,6 15,1 15,5 14,74
42
V. DISCUSSÃO
Discussão
V. DISCUSSÃO
A dificuldade na obtenção de um número considerável de espécimes de
Lonomia obliqua, aliado ao custo no transporte destas, pode acarretar em fator
limitante para a preparação de soro anti-lonômico. Assim, decidimos realizar este
estudo para avaliar a viabilidade de congelamento das cerdas destes animais a
fim de facilitar a aquisição de matéria-prima para preparação do antiveneno.
Os nossos estudos mostram que o congelamento e o armazenamento das
cerdas da lagarta Lonomia obliqua por até 6 meses, pode alterar alguns
parâmetros do extrato, tais como: concentração das proteínas, a atividade
procoagulante e a atividade fosfolipásica. Por outro lado, nenhuma alteração foi
observada na atividade hemolítica indireta e na resposta imunogênica entre as
amostras de cerdas não congeladas e congeladas neste material. Além disso foi
verificada ausência da atividade fibrinolítica e atividade hemolítica direta.
Na dosagem de proteínas, verificamos que houve redução significativa da
concentração protéica das amostras preparadas com cerdas congeladas por 6
meses, quando comparada às amostras de cerdas não congeladas. Enquanto
que os lotes A e C apresentaram diminuição da concentração protéica no sexto
mês, o lote B apresentou redução desde o segundo mês de congelamento. Esta
redução da concentração de proteína pode estar relacionada com a degradação
das proteínas, através da quebra das suas ligações peptídicas, causada
provavelmente pelas enzimas presentes nas cerdas.
A dosagem bioquímica de proteínas também pode ser realizada através da
quantificação de anéis aromáticos por espectrofotometria em A280, pela
quantificação das ligações peptídicas por biureto ou ambos, pelos métodos de
Bradford ou Lowry (Boyer, 1986). Quando as proteínas são degradadas, ocorrem
quebras das ligações na estrutura primária da proteína (ligações covalentes).
Consequentemente, com a diminuição do número de ligações peptídicas,
diminuem o número de interações com o cobre, levando a diminuição da
absorbância, já que o método de Markwell et al.,1978 é um ensaio colorimétrico.
As proteínas possuem estrutura tridimensional, determinada pela
seqüência de aminoácidos, e que representa uma determinada conformação
espacial importante para a sua função. A estrutura tridimensional de uma proteína
43
Discussão
é única, e as forças mais importantes que a estabilizam são as suas interações
não covalentes (Lehninger et al., 1995).
As estruturas das proteínas (figura 25) podem ser descritas como:
1) estrutura primária que inclui todas as ligações covalentes entre os
aminoácidos, é definida pela seqüência dos aminoácidos unidos por ligações
peptídicas e pela localização das pontes de dissulfeto;
2) estrutura secundária são arranjos regulares e recorrentes no espaço, de
resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. As estruturas
mais conhecidas são: a estrutura em α-hélice e a conformação β;
3) estrutura terciária é o relacionamento espacial entre todos os aminoácidos em
um polipeptídio. A diferença entre estrutura secundária e terciária não é clara,
pois vários tipos diferentes de estrutura secundária são freqüentemente
encontrados no interior da estrutura tridimensional de uma proteína grande;
4) estrutura quaternária possui várias cadeias polipeptídicas, tem um nível de
estrutura a mais, e não especifica a relação espacial dos polipeptídios, ou
subunidades no interior de uma dada proteína (Lehninger et al, 1995).
Figura 25. A figura mostra a representação das estruturas conformacionais das
proteínas (foto retirada do site www.icb.ufmg.br)
Em 1920 foram iniciados os principais estudos sobre as estruturas
protéicas, sua função e estabilidade, nessa época os métodos de estudos eram
mais limitados do que atualmente onde a cristalografia e raio-X possibilitaram
44
Discussão
melhor conhecimento sobre a estrutura. Verificou-se assim que existe uma
relação entre a estrutura da proteína e a atividade in vitro ou função que
desempenha in vivo (Franks, 2002).
O termo desnaturação aplica-se a processos que não envolvem ruptura de
ligação peptídica, mas que levam a mudança na estrutura tridimensional da
proteína que, por sua vez, está associada à perda da função (Hatley & Franks,
1989 a, b; Franks, 2002).
Os fatores que podem levar à desnaturação das proteínas são:
aquecimento, valores extremos de pH e alguns solventes orgânicos miscíveis tais
como água, etanol, acetona, substâncias em solução como uréia e substâncias
detergentes. Esses agentes representam um tratamento relativamente suave, já
que não quebram nenhuma ligação covalente na cadeia polipeptídica. Solventes
orgânicos, uréia e detergentes agem primariamente na ruptura de interações
hidrofóbicas; valores extremos de pH alteram carga líquida da proteína,
provocando repulsão eletrostática e rompimento de algumas pontes de hidrogênio
(Franks et al., 1988).
Em algumas proteínas a desnaturação em altas temperaturas promove
ruptura das pontes de dissulfeto ou intercâmbio de dissulfeto (particularmente em
pH alcalino), mas, geralmente, somente interações não covalentes são afetadas
pelo calor. Algumas enzimas podem ser inativadas por exposição ao frio, mas na
maioria dos casos elas podem ser reativadas, quando aquecidas adequadamente
(Hatley & Franks, 1989a; Hatley & Franks, 1989b, Franks, 2002).
Como podemos observar, o processo de desnaturação está intimamente
ligado à atividade biológica. No nosso caso, as condições de congelamento e
armazenamento das cerdas das lagartas provavelmente induziram a
desnaturação de algumas proteínas conforme os resultados obtidos para dose
mínima coagulante e atividade fosfolipásica, nas quais observamos reduções
significativas da atividade dos extratos preparados com as cerdas congeladas. No
lote A, a capacidade do extrato de coagular o plasma diminuiu nas amostras de 2
meses, mantendo-se constante até o quarto mês e, com 6 meses de
congelamento, houve uma nova redução de atividade, quando comparada com a
amostra do extrato de cerdas não congeladas (0 meses). Com relação à atividade
fosfolipásica as amostras apresentaram redução a partir de 2 meses, sofrendo
45
Discussão
redução progressiva com 4 e 6 meses de congelamento. No lote B, em relação a
atividade procoagulante, as amostras apresentaram redução de atividade no
quarto e sexto mês de congelamento, quando comparados às amostras de 0 e 2
meses, que tiveram comportamento semelhante. Em relação à atividade
fosfolipásica deste lote, as amostras apresentaram comportamento similar ao
observado para atividade coagulante. No lote C, as atividades procoagulante e
fosfolipásica apresentaram redução de atividade a partir do segundo mês de
congelamento que se manteve constante até o sexto mês, quando comparada à
amostra não congelada.
Essa diminuição de atividades pode estar relacionada com a desnaturação
de proteína devido ao congelamento das cerdas. Como mostram os trabalhos de
Hatley & Franks (1989a, 1989b); Franks, 2002; Cao et al. (2003) e Jiang & Nail
(1998), o processo de congelamento é capaz de desnaturar proteína, e reduzir as
atividades biológicas.
Não há estudos sobre os efeitos de diferentes condições de
armazenamento do extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua, porém, há
estudos que mostram a influência da temperatura sobre a estabilidade de
proteínas do veneno de serpentes (Kurth & Aurich, 1976; Munekiyo & Mackessy,
1998; Aung et al., 1999). Munekiyo & Mackessy (1998) estudaram os efeitos de
diferentes condições de armazenamento sobre a estabilidade do veneno, em
ensaios eletroforéticos, de toxicidade e atividade enzimática. De modo geral, foi
observado que o veneno da serpente Crotalus molussus molussus se apresentou
estável para a maioria das amostras, nas diferentes condições de
armazenamento, havendo variação somente entre os ensaios enzimáticos. Os
autores acreditam que a estabilidade do veneno das serpentes frente a diferentes
condições de armazenamento pode estar relacionada a estabilizadores ou
inibidores endógenos presentes na glândula e no veneno armazenado no lúmen.
Além das diferenças observadas entre as amostras (0, 2, 4 e 6 meses)
dentro de um mesmo lote, constatamos também que ocorreu uma variação entre
diferentes lotes (A, B e C). Esta diferença de comportamento pode ser explicada
por elas terem sido preparadas em épocas diferentes, ou mesmo, por estresse
das lagartas provocado pelo transporte. As amostras do lote A apresentaram
comportamento mais uniforme, com diminuição progressiva da atividade ao longo
46
Discussão
do tempo de congelamento das cerdas. O lote A foi processado em Passo Fundo,
onde foi preparado o extrato de cerdas não congeladas. Em seguida as cerdas
foram congeladas, transportadas para o Instituto Butantan e mantidas a -20ºC por
2, 4 e 6 meses, para posterior preparação do extrato. Por outro lado, as amostras
dos lotes B e C foram preparadas no Instituto Butantan sendo as lagartas
transportadas vivas até São Paulo, por via rodoviária. As lagartas permaneceram
no laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan, onde passaram por uma
triagem. As lagartas doentes foram separadas das lagartas sadias. As lagartas
sadias foram mantidas por dois a três dias em caixas de acrílico (“glove box”
adaptadas) medindo 120 x 60 x 60 cm, com tampa superior e aberturas circulares
teladas. As lagartas foram alimentadas com folhas de nêspera, e o
processamento das cerdas seguiu o mesmo tratamento do lote A. Os lotes B e C
apresentaram comportamento variável para atividade procoagulante e hemolítica,
sendo que o lote B apresentou diminuição desta atividade a partir do quarto mês
mantendo-se assim até o sexto mês. Já o lote C apresentou redução com 2
meses que se manteve nos meses seguintes. Além disso, em relação à atividade
fosfolipásica, as amostras dos lotes B e C apresentaram atividade
significativamente menor, quando comparadas à do lote A. Embora não tenha
sido feito nenhum trabalho para avaliar a influência do estresse sobre as toxinas
da lagarta, os nossos resultados indicam a possibilidade do estresse ser um fator
que interfire com as atividades destas proteínas.
Em relação à atividade hemolítica direta in vitro, não observamos esta
atividade em nenhuma das amostras nos diferentes lotes testados. Entretanto, os
estudos de Seibert et al. (2003) mostram claramente a presença dessa atividade
encontrada em várias preparações de extrato. A ausência de atividade hemolítica
direta nos três lotes pode estar relacionada a fatores como variação regional,
climática e alimentação, observada em muitas toxinas de animais (Gubensek et
al., 1974; Aragon & Gubensek, 1981; Glenn et al., 1982; Minton & Weinstein,
1986). Porém, não sabemos exatamente quais os fatores que podem influenciar
na sua expressão, pois não há nenhum estudo específico com as toxinas desta
lagarta.
A atividade hemolítica indireta não apresentou diferença significativa entre
as amostras de um mesmo lote e, mesmo entre os diferentes lotes. A substância
47
Discussão
responsável pela atividade hemolítica indireta é a fosfolipase A
2
(Seibert et al.,
2006). A fosfolipase A
2
é capaz de hidrolisar as fosfatidilcolinas e
fosfatidiletanolaminas exógenas (lecitina), com a liberação de ácido graxo e
formação de lisoderivados (lisolecitina). Esses compostos tensoativos alteram a
permeabilidade da membrana celular ocasionando hemólise, considerada indireta
(C
ONDREA
, 1979). A ausência de diferença significativa na atividade hemolítica
indireta, mesmo tendo sido observada diminuição importante da atividade
fosfolipásica, pode ser decorrente da metodologia utilizada para a determinação
da atividade. Foram utilizados 60 minutos de incubação das hemácias com o
extrato. Esse tempo longo de incubação, provavelmente, compensou a diferença
da quantidade de fosfolipase nas amostras de cerdas congeladas e que foi
suficiente para desestruturar a membrana celular e levar ao seu rompimento.
Em relação à atividade fibrinolítica, esta não foi observada nas nossas
amostras, corroborando os resultados descritos no trabalho de Fritzen et al.
(2003). Porém, Veiga et al. (2003), verificaram atividade fibrinogenolítica no
extrato bruto de cerdas de L. obliqua.
Os conhecimentos existentes sobre a biologia da lagarta Lonomia obliqua
não permitem ainda explicar as diferenças de atividades observadas neste
estudo, pois, não há estudos sobre a variação ontogenética, regional, climática,
ou mesmo alimentar, relacionado com atividades biológicas do extrato de cerdas.
Marval et al. (1999), verificaram em seus experimentos que alguns lotes de
hemolinfa (preparados com lagartas da Lonomia achelous no 3º e 4º instar), não
ativaram plasminogênio e não afetaram a atividade de fator XII em coelhos. Eles
atribuíram essas variações como sendo dependentes dos estágios de
desenvolvimento das lagartas de Lonomia achelous, relatando também a
dificuldade em determinar o estágio de desenvolvimento ou instar exato do animal
na coleta. Foi mencionada também a influência do estágio de desenvolvimento
sobre a atividade fibrinolítica direta e ativador de plasminogênio, observado
apenas em animais do 1º ao 3º instar (Arocha-Piñango & Guerreo, 1999).
Devemos salientar que em nosso trabalho, foram utilizadas lagartas no último
estágio de desenvolvimento (larvas de 5º e 6º instar), identificadas pelo
entomologista Roberto H. Moraes do laboratório de parasitologia do Instituto
Butantan. Porém, Veiga et al. (2003) que mostraram atividade fibrinolítica nos
48
Discussão
extratos de cerdas da L. obliqua, não referem o estágio das larvas utilizadas
dificultando assim uma conclusão definitiva.
É importante considerar que os métodos de preparação do extrato
utilizados por diferentes grupos não são iguais e todos eles apresentam uma
mistura complexa de várias proteínas que não estão relacionadas apenas com a
atividade tóxica das cerdas. Pelas características das cerdas destas taturanas
que não permitem a identificação de uma glândula especializada como a da
serpentes peçonhentas (Veiga et al., 2001), a extração das toxinas, sem o
preparo do macerado, ainda é inviável. Assim, possivelmente algumas diferenças
de atividades encontradas nos diferentes trabalhos podem ser ocasionadas por
diferenças na preparação do extrato. Não podemos deixar de considerar o fato de
que em Lonomia achelous, esta atividade fibrinolítica é bastante significativa e
parece ser uma das principais atividades no envenenamento humano, de tal
forma que, muitos pacientes acidentados por esta espécie foram tratados e
recuperados com anti-fibrinolíticos (Arocha-Piñango et al., 1992). Assim, parece
bastante evidente que existem diferenças de atividade entre Lonomia achelous e
Lonomia obliqua, principalmente relacionado com o sistema fibrinolítico.
O tratamento com antiveneno anti-lonômico foi iniciado no Brasil em 1994,
cerca de 5 anos após o início dos acidentes na região Sul, com a lagarta Lonomia
obliqua (Fan, 2002). Alguns tratamentos realizados com anti-fibrinolíticos, em
pacientes internados no Hospital São Vicente de Paulo em Passo Fundo-RS, não
apresentaram resultados satisfatórios (Fan, 2002), mostrando que possivelmente
para acidentes com L. obliqua a atividade fibrinolítica não é tão importante como
para L. achelous.
Embora não haja estudos sobre a influência desses fatores na composição
das toxinas do extrato que possam reforçar ou mesmo esclarecer os nossos
resultados, Marval et al. (1999) e Arocha-Piñango & Guerrero (1999)
mencionaram a possível participação ontogenética na composição das toxinas
presentes no extrato. Assim, as diferenças observadas na composição das
toxinas presentes no extrato, possivelmente, podem ser influenciadas por vários
fatores como variação individual, geográfica, sazonal e climática, alimentar, intra e
interespécies e ontogenética. Existem vários trabalhos mostrando a influência
desses fatores na composição e atividade do veneno de serpentes. Em relação à
49
Discussão
variação ontogenética, foram observadas diferenças quantitativas e qualitativas
na composição do veneno de filhotes e adultos de serpente (Bonilla et al., 1973;
Meier & Freyvogel, 1980; Lomonte et al., 1983; Gutierrez et al., 1990 e Furtado et
al., 1991). Foi mostrada também a influência da sazonalidade na composição do
veneno, que pode variar de acordo com a época do ano, levando a ausência de
duas frações letais nas amostras de inverno observadas por eletroforese (Bertand
& Vladesco, 1942 e Gubensek et al., 1974). Outro fator descrito foi a influência da
variação geográfica na composição do veneno (Glenn & Straight,1978; Aragon &
Gubensek, 1981; Glenn et al., 1982; Minton & Weistein, 1986 e Rodrigues et al.,
1998).
Nas serpentes, o veneno tem função importante na alimentação (Hayes,
1991). A função do veneno é auxiliar na apreensão da presa, cuja dieta varia com
a idade. Os jovens preferem pequenos ectotérmicos (anuros, lagartos) e os
adultos, da maioria das espécies, se alimentam quase exclusivamente de
endotérmicos (pássaros e roedores). As propriedades biológicas do veneno
auxiliam na imobilização e posterior morte da presa, portanto, a proporção e a
composição do veneno, assim como o comportamento e a dieta, contribuem para
o sucesso da predação (Hayes, 1991).
Ao contrário das serpentes, cujo veneno é produzido em um sistema
secretor, e possui uma finalidade de defesa e alimentação, pouco se sabe sobre
as toxinas das lagartas. Ainda não sabemos se há algum tecido especializado
para produção das toxinas, qual a função dessas toxinas para a lagarta, e os
fatores que podem influenciar na sua composição. Assim, as variações de
atividades observadas nos extratos de cerdas da Lonomia ainda são pouco
compreendidas.
O perfil eletroforético do extrato de cerdas das amostras 0, 2, 4 e 6 meses,
aparentemente não apresenta diferenças na intensidade das bandas protéicas.
Entretanto, ao quantificarmos as porcentagens das bandas observamos
diferenças sugestivas de degradação de proteína, alterando assim seu peso
molecular e levando ao aparecimento de novas bandas ou mesmo sobreposição
das bandas já existentes. Porém, o grande número de proteínas presentes no
extrato bruto de cerdas da lagarta L. obliqua, é um fator que interfere em uma
análise mais detalhada dos géis. As bandas, muitas vezes próximas umas das
50
Discussão
outras, dificultam uma marcação mais precisa e, além disso, há dificuldade em
identificar as proteínas que estão sendo degradadas, pois ao serem quebradas as
mesmas geram fragmentos que podem se sobrepor a outras bandas. Este
processo de degradação protéica pode estar contribuindo na redução das
atividades biológicas avaliadas.
Em relação à resposta imunológica, os extratos preparados com cerdas
não congeladas e com cerdas congeladas por 6 meses, inoculados nos
camundongos não apresentaram diferença significativa em relação a produção de
anticorpos. Os anticorpos anti-lonômico, produzidos com cerdas não congeladas
e congeladas até 6 meses, reconheceram igualmente, por ELISA, tanto o extrato
de cerdas não congeladas como o congelado por 6 meses. Assim, optamos por
utilizar o extrato de cerdas não congelado para sensibilização das placas. Os
resultados mostraram que, mesmo com atividade biológica reduzida, o extrato
preparado com cerdas congeladas por 6 meses foi capaz de induzir resposta
imune, e os anticorpos foram capazes de reconhecer tanto o extrato controle
(preparado com cerdas não congeladas), como o extrato que sofreu desnaturação
(preparado com cerdas congeladas por 6 meses). Estes resultados já eram
esperados, pois a imunogenicidade de um antígeno nem sempre está relacionada
à sua atividade biológica, tanto que substâncias inativadas podem continuar
sendo excelentes imunógenos com capacidade de produzir anticorpos
específicos. Rangel-Santos & Mota (2000), em um estudo sobre os efeitos do
aquecimento sobre toxicidade e atividade imunogênica e imunossupressiva do
veneno de Crotalus durissus terrificus, observaram que a desnaturação por
aquecimento das proteínas do veneno diminuíram sua toxicidade e atividade
imunossupressora, mas não afetaram a atividade imunogênica, ou seja, não
houve diferença significativa nos níveis de anticorpos dosados por ELISA entre a
amostra controle e a desnaturada por aquecimento. Estes resultados sugerem
que, apesar da desnaturação, alguns epítopos mantiveram a habilidade de
estimular células imunes a produzir anticorpos. O mesmo foi observado em nosso
trabalho, com perda parcial de atividade procoagulante e fosfolipásica do extrato
congelado por 6 meses, sem contudo interferir na produção de anticorpos.
Avaliação comparativa da eficácia desses anticorpos “in vivo” será feita
futuramente.
51
Discussão
Dessa forma, os nossos resultados mostraram que a desnaturação foi
capaz de alterar a estrutura protéica, através da quebra das ligações covalentes e
não covalentes, levando a modificação do peso molecular e conformação
estrutural. Conseqüentemente, ocorreu perda de atividade biológica, porém a
imunogenicidade não foi alterada.
Os mecanismos de desnaturação ou estresse por congelamento podem
levar à diminuição de atividade biológica de um produto, pela ação da baixa
temperatura, formação de gelo, concentração do soluto associado a cristalização
de água, cristalização eutética dos solutos dos tampões resultando em mudança
de pH (Cao et al., 2003). Esses estresses por congelamento, no nosso caso,
devem estar atuando sobre as cerdas congeladas da Lonomia obliqua antes do
preparo do extrato, pois o extrato preparado e congelado por um tempo longo (até
6 meses) não tem apresentado alteração da sua atividade (observação pessoal).
52
VI. CONCLUSÕES
Conclusões
VI. CONCLUSÕES
Os estudos comparativos realizados com os extratos preparados com cerdas
frescas e congeladas por 2, 4 e 6 meses mostraram que:
1) O congelamento e armazenamento das cerdas a –20ºC desnaturou
algumas proteínas, diminuiu algumas atividades biológicas (pro-coagulante
e fosfolipásica) do extrato das cerdas da lagarta Lonomia obliqua,
mostrando que, para a caracterização dessas atividades é recomendável a
preparação do extrato com cerdas não congeladas.
2) O congelamento e armazenamento das cerdas a –20ºC não alterou a
resposta imunogênica dos extratos. Os extratos preparados com cerdas
não congeladas e congeladas por 6 meses, apresentaram resultados
equivalentes em camundongos, sugerindo a viabilidade do uso do extrato
preparado com cerdas congeladas para a produção do soro anti-lonômico
em cavalos, para fins terapêuticos.
3) Além desses efeitos do congelamento e armazenamento das cerdas na
atividade dos extratos, os nossos estudos evidenciaram ausência de
algumas atividades como a fibrinolítica e hemolítica direta nos três lotes de
extratos preparados, mostrando que vários fatores podem influenciar nas
características biológicas do extrato. Verificamos que o estresse do
transporte das lagartas também pode afetar a qualidade do extrato.
Desta forma, é fundamental adquirir mais conhecimentos sobre a mariposa
Lonomia obliqua , que ainda são muito escassos. É importante um estudo
mais controlado avaliando os efeitos da variação geográfica, climática,
alimentar, ontogenética, intra e inter-específica, etc. na composição do extrato
das cerdas, além de aperfeiçoar a metodologia da preparação do extrato das
cerdas.
53
VII. RESUMO
Resumo
VII. RESUMO
A síndrome hemorrágica induzida por contato com as cerdas da lagarta
do gênero Lonomia pode causar distúrbios hemostáticos, com consumo de
alguns fatores de coagulação. Os primeiros acidentes com Lonomia foram
descritos na Venezuela, em 1967; no Norte do Brasil, foram relatados alguns
casos no início da década de 1980. A partir de 1989, na região Sul do Brasil,
principalmente na zona rural de Passo Fundo (RS) e Chapecó (SC), surgiram
vários casos de acidentes por contato com essas lagartas. Atualmente estes
acidentes continuam ocorrendo com maior freqüência nesta região, com
algumas notificações esporádicas em outras partes do Brasil, principalmente na
região Central. Inicialmente os casos graves de acidentes com lagartas
Lonomia foram tratados com antifibrinolíticos e infusão de glóbulos vermelhos,
principalmente na Venezuela e no Brasil. Em 1994, um antiveneno específico
que neutraliza os efeitos biológicos dos extratos das cerdas foi produzido no
Instituto Butantan. Desde então, o tratamento para estes envenenamentos tem
sido a soroterapia com antiveneno produzido com extrato das cerdas das
lagartas originárias da região de maior ocorrência de acidentes.
O objetivo deste estudo foi avaliar a estabilidade de algumas atividades
do extrato preparado com as cerdas frescas, sem congelar (0) e com as cerdas
congeladas e armazenadas por 2, 4 e 6 meses a -20ºC. Todas as cerdas
utilizadas foram de lagartas no 5º e 6º instar.
Assim, para esta finalidade, foram preparados três lotes (A, B e C) de
extrato de cerdas de taturanas provenientes da região de Passo Fundo (RS).
Para cada lote foram separadas 4 amostras de cerdas que foram processadas
sem congelar (0), e congeladas por 2, 4 e 6 meses.
Observamos que a atividade coagulante dos extratos dos lotes A e C
foram reduzidas nas cerdas congeladas por 2 meses ou mais (p<0,05), mas a
atividade do lote B reduziu apenas após 4 meses. Resultados semelhantes
foram observados com a atividade fosfolipásica que reduziu nos extratos
preparados com cerdas congeladas por 2 meses ou mais nos lotes A e C e
após 4 meses ou mais no lote B (p<0,05). Entretanto, o armazenamento não
afetou a atividade hemolítica indireta ou a imunogenicidade em nenhum dos
lotes. Por outro lado, a atividade hemolítica direta e atividade fibrinolítica não
54
Resumo
foram observadas em nenhum dos três lotes preparados. O perfil eletroforético
dos extratos em SDS-PAGE, após diferentes períodos de congelamento, não
mostraram alterações evidentes, mas a análise densitométrica das amostras
indicaram degradação proteica além da desnaturação associadas com a
redução da atividade biológica. Os nossos resultados indicam que o
congelamento das cerdas por 2 meses ou mais reduzem a atividade pro-
coagulante e fosfolipásica do extrato. Entretanto, os extratos preparados com
as cerdas congeladas podem ser usados para produção de antiveneno visto
que o congelamento das cerdas não afeta a qualidade do anticorpo produzido.
Futuramente serão realizados testes de soro neutralização para verificar a
eficácia desses anticorpos in vivo.
55
VIII. ABSTRACT
Abstract
VIII. ABSTRACT
Contact with Lonomia obliqua caterpillar bristles may cause a
consumptive hemostatic disturbance. The first human accident caused by
Lonomia was described in Venezuela, in 1967. Thirty six cases were reported in
Northern Region of Brazil by a retrospective study between 1978 and 1982, but
since 1989 a high incidence of hemorrhagic syndrome, caused by contact with
L. obliqua caterpillars has also been reported in Southern Brazil, mainly in rural
areas around Passo Fundo (RS) and Chapecó (SC). The occurrence of such
accidents has spread to central regions of Brazil and some sporadic
notifications have been reported in other regions of South America. Initially,
severe human accidental contact with L. obliqua caterpillars was treated with
antifibrinolytics drugs and infusion of packed red cells in Venezuela and Brazil.
Since 1994, nonetheless, a specific antivenom that neutralizes the biological
effects of the bristle extract has been produced by Butantan Institute, using
bristles obtained from caterpillars collected in areas of large prevalence.
Thereafter, antivenom therapy has been used successfully in Brazil.
Taking into account that biological activities of extracts used for
antivenom production may decrease during the storage period of bristles, the
aim of this study was to compare their stability, using extracts prepared from
fresh (without freezing) and frozen bristles stored for 2, 4 and 6 months at -
20ºC. Bristles were from caterpillars in instars 5 and 6. Three batches of bristle
extract (A, B and C) were prepared from caterpillars collected in Passo Fundo
area (RS); each batch of bristles were pooled, and used immediately or stored
for 2, 4 and 6 months at -20°C, before being used for extract production.
Our results showed that the clotting activity of extracts of batches A and
C were decreased in bristles frozen for 2 months or longer (p <0.05), while it
was reduced in samples frozen for 4 months or longer in batch B. Similarly,
phospholipase A
2
activity was reduced in extracts prepared with bristles frozen
for 2 months or longer in batches A and C, and for 4 months or longer in batch
B (p <0.05). On the other hand, storage affected neither the hemolytic activity
evaluated indirectly, nor immunogenicity in samples of different batches.
Additionally, direct hemolytic activity and fibrinolytic activity were not detected in
any sample of the three batches. Electrophoretic protein profile of extract
56
Abstract
batches on SDS-PAGE did not show evident alterations, but the densitometric
analyses of samples indicated degradation and denaturation, which could be
associated with the reduction of biological activities. Our results indicate that
freezing bristles for two months or longer decrease both procoagulant and
phospholipase A
2
activities of the extract. However, extracts prepared from
frozen bristles can be used for antivenom production, since freezing affected
neither the quantity nor quality of produced antibodies. Experiments will be
accomplished to verify the effectiveness of these antibodies in vivo.
57
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Refêrencias Bibliográficas
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