( PDF ) Avaliação das propriedades farmacológicas de compostos imídicos cíclicos selecionados e da agmatina no sistema nervoso central

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AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS DE COMPOSTOS

IMÍDICOS CÍCLICOS SELECIONADOS E DA AGMATINA NO SISTEMA

NERVOSO CENTRAL

ITAJAÍ, 2005

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS DE COMPOSTOS

IMÍDICOS CÍCLICOS SELECIONADOS E DA AGMATINA NO SISTEMA

NERVOSO CENTRAL

Dissertação submetida à

Universidade do Vale de Itajaí

como parte dos requisitos para a

obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

LEONOR MAZZAMBANI

ITAJAÍ – 2005

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AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS DE COMPOSTOS

IMÍDICOS CÍCLICOS SELECIONADOS E DA AGMATINA NO SISTEMA

NERVOSO CENTRAL

LEONOR MAZZAMBANI

“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas, Área de Concentração em que foi realizado o trabalho,e aprovada em sua

forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale

do Itajaí”

Orientador

Coordenador do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas

Banca Examinadora:

Presidente

Nome do Membro da banca

AGRADECIMENTOS:

Este estudo tem a parceria de muitas mãos. Mãos de todas as pessoas que estiveram

envolvidas comigo neste período de atividades.

Agradeço imensamente estas pessoas que me ajudaram com suas experiências,

profissionalismo, dedicação, amizade, carinho e esperança.Também agradeço:

A equipe do Biotério da UNIVALI, da UFSC e da UFRS que sempre me forneceram os

animais com presteza e cooperação,

Ao professor Valdir Cechinel Filho e sua aluna Vânia, que sintetizaram os compostos,

A professora Cilene Lino de Oliveira da UFSC pela sua colaboração com os

experimentos da ansiedade,

A aluna Beatriz Moletta da UFRS pela análise histológica, sob a supervisão do Prof.

Dr. Ivan Izquierdo

Aos professores e funcionários da Farmácia Escola que sempre apoiaram e

estimularam toda esta trajetória,

A Amanda e a Débora, alunas da Iniciação Científica, que me ajudou nos

experimentos e contribuiu com sua amizade e dedicação,

A minha orientadora, que foi mais que orientadora em todos os momentos desta

dissertação,

Á Deus por ter me dado força para atingir meu objetivo,

À minha mãe e irmão por estarem comigo nos momentos que pensava em desistir.

O estudo da gramática não faz poetas. O estudo da harmonia não faz compositores.

O estudo da psicologia não faz pessoas equilibradas. O estudo das “ciências da

educação” não faz educadores. Educadores não podem ser produzidos. Educadores nascem.

O que se pode fazer é ajudá-los a nascer.”

Rubem Alves

RESUMO

A necessidade do desenvolvimento de novos fármacos, que sejam efetivos no

tratamento de algumas patologias ainda sem tratamento adequado, e que possam substituir os

existentes, sem muito ônus e dotados com menos efeitos colaterais, tem impulsionado a

comunidade científica a novas e incessantes pesquisas nesta área. O objetivo central deste

estudo foi o de verificar as possíveis propriedades farmacológicas das duas classes de

compostos, que possam indicar futuras aplicabilidades terapêuticas. Os estudos foram feitos

com camundongos Swiss Webster (25 a 35 g) e ratos albinos (250 a 300 g) com até 3 meses

de idade fornecidos pelo Biotério Central da UNIVALI. Foram utilizados os seguintes

modelos farmacológicos: modelo da ansiedade, o teste do labirinto em cruz elevado (TLCE);

o modelo de locomoção, o teste do campo aberto (TCA); modelos de convulsão induzida pelo

pentilenotetrazol (TPTZ) e pela estricnina (TEST); modelos de depressão como o teste do

nado forçado (TNF) e o teste da suspensão pela cauda (TSC) e modelo de memória como o

teste da esquiva inibitória (TEI). A agmatina foi utilizada (5-30 mg/kg e 20-40 µg/sítio) no

TCA e TEI, no TLCE, no TNF e TSC. Os compostos imídicos utilizados foram: N-

fenilmaleimida (NFM), 4-metil-N-fenilmaleimida (MeNFM), 4-nitro-N-fenilmaleimida

(NO

NFM), 3-dimetilamino-4-metil-fenilsuccinimida (1NFS) e 3-benzilamino-4-metil-

fenilsuccinimida (2NFS) os quais foram testados em todos os modelos animais descritos

acima. Nos testes de LCE, TCA, TSC e TNF os animais foram pré-tratados com os compostos

e avaliados comportalmente 30 min. após. Nos modelos de convulsão o tratamento com os

compostos ocorreu 60 min. antes dos testes e no modelo de memória os animais receberam os

tratamentos 15 min. pré e pós treinos (para medir aquisição e consolidação da memória

respectivamente) ou 15 min. pré-teste (para medir evocação). Num experimento adicional no

TLCE nos grupos de animais sofreram cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas-

guias para a infusão da agmatina nas seguintes regiões cerebrais: substância cinzenta

periaquedutal (SCP), na região hipocampal CA1 (CA1), no córtex entorrinal (CE) e na

amígdala (AMG). No TCA os animais tratados com a agmatina (em todas as doses utilizadas)

não tiveram os parâmetros comportamentais de crossing e rearing diferentes do controle.

Entretanto, no TLCE houve aumento do tempo e da freqüência de entradas nos braços abertos

(13,033)

= 2,433, p < 0,01 e (F

(15,077)

= 2,431, p < 0,01) em animais com infusão da agmatina

na SCP e CE respectivamente. A amina promoveu uma diminuição no tempo de imobilidade

(2,452)

= 210,41, p < 0,05) dos animais submetidos ao TNF e TSC (F

(2,458)

= 9,350, p < 0,05).

Além disso, a agmatina também reduziu a MLD dos animais prejudicando sua aquisição e

consolidação quando avaliada no TEI. No TCA os parâmetros crossing e rearing foram

diminuídos com NFM (F

(2,630)

= 82,745, p < 0,05); F

(2,630)

= 104,60, p < 0,05), NO

NFM

(2,627)

= 49,245, p < 0,05); F

(2,627)

= 61,199, p < 0,05), MeNFM (F

(2,648)

= 60,299, p < 0,05);

(2,616)

= 31,633, p < 0,05). O composto 1 NFS modificou o parâmetro somente na dose de 30

mg/kg (F

(2,604)

= 55,510, p < 0,05); F

(2,604)

= 28,385, p < 0,05) e o composto 2 NFS não

produziu alterações nos parâmetros. No TLCE NFM aumentou o tempo em que os animais

permaneceram nos braços abertos (F

(2,537)

= 10,831, p < 0,01) como também a freqüência de

entradas nestes braços (F

(2,530)

= 9,424, p < 0,01) no TLCE. O mesmo perfil farmacológico foi

observado com o composto 1 NFS (F

(2,552)

= 8,502, p < 0,05 e (F

(2,537)

= 4,719, p < 0,01) e 2

NFS (F

(2,548)

= 9,919, p < 0,05); F

(2,534)

= 4,995, p < 0,05). Nos modelos de depressão o

composto NO

NFM promoveu diminuição do tempo de imobilidade no TNF (F

(2,461)

24,484, p < 0,05). O mesmo ocorrendo com o composto 1 NFS no TSC (F

(2,537)

= 20,258, p <

0,05) e no TNF (F

(2,461)

= 39,460, p < 0,05). Na convulsão o composto NFM promoveu

aumento da latência para a crise convulsiva no TPTZ (F

(2,503)

= 188,16, p < 0,05) e no ACE

((F

(2,510)

= 20,527, p < 0,01). O mesmo perfil farmacológico foi obtido pelo composto

NFM (F

(2,522)

= 1001,7, p < 0,01; F

(2,516)

= 25,354, p < 0,01). Com relação a memória,

somente o composto imídico NO

NFM promoveu efeito amnéstico na memória de curta

duração na sua aquisição (p < 0,021). Os demais compostos não produziram quaisquer efeitos

em todas as etapas da memória estudadas. Os resultados em conjunto nos permitem concluir

que a agmatina exibe efeito ansiolítico sugerindo que as regiões cerebrais envolvidas no

processo são respectivamente a SCP e CE; efeito antidepressivo no TNF e TSC, efeito

amnéstico nas MCD e MLD modulando-a através das vias oxidonitrérgica e glutamatérgica.

Com relação aos compostos imídicos o efeito ansiolítico foi observado com o composto

NFM. O efeito antidepressivo foi detectado nos compostos NO

NFM no TNF, O efeito

anticonvulsivante foi observado com os compostos NFM, NO

NFM e MeNFM no TPTZ e

TEST. Somente o composto NO

NFM afetou a memória dos animais.

ABSTRACT

The need to develop new compounds which are effective in the treatment of some pathologies

for which there is still no appropriate treatment, and which can replace the existing ones,

without onus and with less side effects, has prompted the scientific community to carry out

new and untiring research in this area. The main objective of this study was to verify the

possible pharmacological properties of the two classes of compounds, which are promising

for future therapeutic application. For the studies, Swiss Webster Mice (25 to 35 g) and albino

rats (250 to 300 g), of up to 3 months of age, were used, supplied by the Central Bioterium of

UNIVALI. The following pharmacological models were used: the anxiety test; the elevated

plus-maze test (EPM); the locomotor activity test, the Open Field Test (OFT); antagonism of

pentylenetetrazole (APC) and strychnine induced convulsions (ASC); models of depression,

the forced swimming Test (FST), the tail suspension Test (TST), and memory tests such as

the inhibitory avoidance test (IAT). Agmatine was used (5-30 mg/kg and 20-40 µg/site) in the

OFT, IAT, in the EPM, in FST and TST tests. The imidic compounds were evaluated in all

models described above. For the EPM, OFT, TST and FST tests, the animals were pre-treated

with the compounds and were submitted to behavioral analysis 30 min later. In the APC and

ASC tests, the treatment occurred 60 min. before the tests and in the IAT, the animals

received the treatment 15 min. before and after training (to measure the acquisition and

consolidation of memory) or 15 min. prior to the test (to measure memory evocation). In an

additional experiment using the EPM test, groups of animals indergo stereotaxic surgery to

implant cannula for the infusion of agmatine in the following brain regions: periaqueductal

grey matter (PGM), CA1 region of the hyppocampus (CA1), entorhinal cortex (EC), and

amygdala (AMG). The agmatine, in all the doses used, did not alter the behavioral parameters

for crossing and rearing in the OFT when compared to control. However, it increased the

time, the number, and the frequency in the open arms (F

(13.033)

= 2.433, p < 0.01 and F

(15.077)

2.431, p < 0.01) of the EPM in animals with infusion of agmatine in PGM and EC,

respectively. The amina in the FST and TST decreased the time of immobility (F

(2.452)

210.41, p < 0.05; F

(2.458)

= 9.350, p < 0.05). In addition, agmatine reduced the long term

memory in the acquisition and consolidation in the IAT. The imidic compounds presented the

following results in the OFT: NFM (crossing (F

(2.630)

= 82.745, p < 0.05), rearing (F

(2.630)

104.60, p < 0.05), NO2NFM (F

(2.627)

= 49.245, p < 0.05), rearing (F

(2.627)

= 61.199, p < 0.05),

MeNFM (F

(2.648)

= 60.299, p < 0.05), rearing (F

(2.616)

= 31.633, p < 0.05), 1 NFS (F

(2.604)

55.510, p < 0.05), rearing (F

(2.604)

= 28.385, p < 0.05). The NFM imide increased the time in

which the animals remained in the open arms (F

(2.537)

= 10.831, p < 0.01) and increased the

frequency of entries to these arms (F

(2.530)

= 9.424, p < 0.01) in the EPM. The same

pharmacological profile was observed for the 1 NFS compound (F

(2.552)

= 8.502, p < 0.05 and

(2.537)

= 4.719, p < 0.01) and 2 NFS (F

(2.548)

= 9.919, p < 0.05); F

(2.534)

= 4.995, p < 0.05). In

the models of depression, the compound NO

NFM decreased time of immobility in the FST

(2.461)

= 24.484, p < 0.05). The same pharmacological profile was observed with compound

1 NFS in the TST (F

(2.537)

= 20.258, p < 0.05) and in the FST (F

(2.461)

= 39.460. p < 0.05).

Regarding convulsion, the compound NFM increased the latency for the convulsive crisis in

the APC (F

(2.503)

= 188.16, p < 0.05) and in the ASC (F

(2.510)

= 20.527, p < 0.01). The same

pharmacological profile was obtained by the compound NO2NFM (F

(2.522)

= 1001.7, p <

0.01; F

(2.516)

= 25.354, p < 0.01). Regarding memory, only the imidic compound NO

NFM

promoted an amnesic effect on the short term memory acquisition (p < 0.021). All other

compounds did not produce any effect on the stages of memory studied. Based on these

results, it can be concluded that agmatine has an anxiolytic effect in the EPM and that the

regions involved in the process are the entorhinal cortex and periaqueductal grey matter. It

has an antidepressant effect in the FST and TST, an amnesic effect on the short and long term

memories, and possible modulation of the memory by oxidenitrergic and glutamatergic

means. Regarding the imidic compounds, NFM exhibited an anxiolytic effect in the EPM,

NO2NFM exhibited an antidepressant effect in the FST. The NFM, NO2NFM and MeNFM

exhibited an anticonvulsant effect in the APC and ASC. NO2NFM was the only compound to

affect the memory of the animals tested.

SUMÁRIO

Pag

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 01

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................... 04

2.2

Agmatina........................................................................................................................ 05

2.2.1 Biosíntese.................................................................................................................... 05

2.2.2 Distribuição e armazenamento no organismo............................................................. 06

2.2.3 Liberação..................................................................................................................... 08

2.2.4 Ligação com receptores e propriedades farmacológicas............................................. 09

2.2.5 Propriedades farmacológicas da agmatina no SNC.................................................... 11

2.2.5.1 Efeito da agmatina sobre a memória........................................................................ 11

2.2.5.2 Efeito da agmatina sobre a convulsão...................................................................... 11

2.2.5.3 Efeito da agmatina sobre a depressão...................................................................... 12

2.2.5.4 Efeito da agmatina sobre a ansiedade...................................................................... 13

2.2.6 Toxicidade................................................................................................................... 13

2.3

Imidas cíclicas................................................................................................................ 13

2.3.1 Propriedades farmacológicas: atividade no SNC........................................................ 14

2.3.1.1 Atividade anticonvulsivante..................................................................................... 14

2.3.1.2 Atividade antipsicótica............................................................................................. 15

2.3.1.3 Atividade ansiolítica................................................................................................ 16

2.3.1.4 Atividade amnéstica................................................................................................. 16

2.3.1.5 Atividade antidepressiva.......................................................................................... 17

2.3.2 Toxicidade................................................................................................................... 17

3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 19

3.1

Objetivo geral................................................................................................................. 20

3.2

Objetivos específicos..................................................................................................... 20

4 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................. 21

4.1

Animais.......................................................................................................................... 22

4.2

Reagentes, solventes e fármacos de referência.............................................................. 22

4.3 Síntese de imidas cíclicas............................................................................................... 23

4.3.1.Síntese das maleimidas............................................................................................... 23

4.3.2 Síntese das succinimidas............................................................................................. 23

4.4 Ensaios farmacológicos.................................................................................................. 26

4.4.1 Modelo da locomoção e sedação, o Teste do Campo Aberto..................................... 26

4.4.2 Modelo da convulsão induzida por pentilenotetrazol (TPTZ).................................... 28

4.4.3 Modelo da convulsão induzida por estricnina (TEST)............................................... 29

4.4.4 Teste da ansiedade, o Labirinto em Cruz Elevado (TLCE)........................................ 30

Cirurgia-estereotáxica e implantação da cânula.......................................................... 32

Microinjeção intracerebral.......................................................................................... 34

Histologia.................................................................................................................... 35

4.4.5 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC) .................................................................... 36

4.4.6 Teste da Natação Forçada (TNF)................................................................................ 37

4.4.7 Teste da Esquiva Inibitória.(TEI)............................................................................ 39

4.5 Análise estatística........................................................................................................ 40

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 41

5.1

Resultados obtidos com a agmatina............................................................................... 41

5.1.1 Efeito da agmatina no modelo do Campo Aberto....................................................... 41

5.1.2 Efeito da agmatina na ansiedade, avaliada no TLCE................................................. 44

5.1.3 Efeito da agmatina na depressão, avaliada nos TNF e TSC ................................. 49

5.1.4 Efeito da agmatina na memória, avaliada no TEI....................................................... 52

5.2

Resultados obtidos com as imidas cíclicas.................................................................... 60

5.2.1 Efeito das imidas cíclicas na locomoção, avaliados através do TAC........................ 60

5.2.2 Efeito das imidas cíclicas na ansiedade, avaliados através do TLCE...................... 63

5.2.3 Efeito das imidas cíclicas na depressão, avaliados através do TSC e TNF............... 71

5.2.4 Efeito das imidas cíclicas na convulsão, avaliados através do TPTZ e

TEST..................................................................................................................................

5.2.5 Efeito das imidas cíclicas na memória, avaliados através do TEI........................... 83

6 CONCLUSÃO.................................................................................................................. 92

6.1

Resultados da agmatina.................................................................................................. 93

6.2

Resultados das imidas cíclicas....................................................................................... 93

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 94

LISTA DE FIGURAS

Pag

Figura 1. Estrutura química da agmatina.......................................................................... 05

Figura 2. Metabolismo da agmatina..................................................................................... 07

Figura 3. Estrutura química da filantimida.......................................................................... 13

Figura 4. Campo aberto para camundongos......................................................................... 27

Figura 5. Campo aberto para ratos....................................................................................... 28

Figura 6. Convulsão induzida pelo PTZ e estricnina......................................................... 29

Figura 7. Labirinto em Cruz Elevado................................................................................. 32

Figura 8. Adaptação ao aparelho estereotáxico.................................................................. 33

Figura 9. Cirurgia-estereotáxica......................................................................................... 34

Figura 10. Microinjeção intracerebral.................................................................................. 35

Figure 11: Local da injeção do veículo ou da agmatina...................................................... 36

Figura 12. Teste da suspensão pela cauda............................................................................ 36

Figura 13. Teste do nado forçado......................................................................................... 37

Figura 14. Esquiva inibitória................................................................................................ 40

Figura 15. Efeito da agmatina no TCA................................................................................ 43

Tabela 1. Efeito da administração central da agmatina no TCA........................................ 44

Figura 16. Efeito da agmatina no TLCE.............................................................................. 46

Figura 17. Efeito da agmatina da injeção intracerebral no TLCE........................................ 47

Figura 18. Efeito da agmatina no TNF e TSC..................................................................... 51

Figura 19. Efeito da administração da agmatina na aquisição no TEI............................... 53

Figura 20. Efeito da administração da agmatina consolidação no TEI............................... 54

Figura 21. Efeito da administração da agmatina na evocação no TEI............................... 54

Figura 22. Efeito da administração da agmatina e do MK-801 na aquisição no TEI.......... 55

Figura 23. Efeito da administração da agmatina e do MK-801 na consolidação no TEI.... 56

Figura 24. Efeito da administração da agmatina, da L-NOARG e L-arginina na aquisição

e na consolidação no TEI....................................................................................................

Tabela 2. Efeitos das maleimidas (NFM, NO2NFM e MeNFM) no TAC.......................... 62

Tabela 3. Efeitos das succinimidas (1NFS e 2NFS) no TAC............................................ 63

Figura 25. Efeito do composto NFM no TLCE................................................................... 66

Figura 26. Efeito do composto NO2NFM no TLCE........................................................... 67

Figura 27. Efeito do composto MeNFM no TLCE.............................................................. 68

Figura 28. Efeito do composto 1NFS no TLCE................................................................... 69

Figura 29. Efeito do composto 2NFS no TLCE................................................................... 70

Tabela 4. Efeitos das maleimidas NFM, NO2NFM e MeNFM no TSC e TNF................ 72

Tabela 5. Efeitos das succinimidas 1NFS e 2NFS no TSC e TNF.................................... 73

Figura 30. Efeito anticonvulsivante da NFM no TPTZ e TEST....................................... .. 76

Figura 31. Efeito anticonvulsivante da NO2NFM no TPTZ e TEST.................................. 77

Figura 32. Efeito anticonvulsivante da MeNFM no TPTZ e TEST.................................. 78

Figura 33. Efeito anticonvulsivante da 1NFS no TPTZ e TEST......................................... 79

Figura 34. Efeito anticonvulsivante da 2NFS no TPTZ e TEST..................................... ... 80

Figura 35. Efeito da administração NFM sobre a aquisição, consolidação e evocação no

TEI......................................................................................................................................

Figura 36. Efeito da administração NO2NFM sobre a aquisição, consolidação e

evocação no TEI...............................................................................................................

Figura 37. Efeito da administração MeNFS sobre a aquisição, consolidação e evocação

no TEI..................................................................................................................................

Figura 38. Efeito da administração 1NFS sobre a aquisição, consolidação e evocação no

TEI.......................................................................................................................................

Figura 39. Efeito da administração 2NFS sobre a aquisição, consolidação e evocação no

TEI.......................................................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS

AGM: Agmatina

AMPA: Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico

AMG: Amígdala

ADC: Arginina decarboxilase

CA1: Área CA1 do hipocampo

CaMKII: proteína-quinase cálcio-calmodulina dependentes

CE: Córtex entorrinal

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CREB: proteína ligante de DNA responsiva ao AMPc (“cAMPA response element

binding protein”)

Dalton: DA

DAO: Diaminoxidase

DMSO: dimetil sulfóxido

GABA: ácido γ-aminobutírico

IL-10: Interleucina-10

L-NOARG: N-nitro-L-arginina

L-NAME: N

-nitro-L-arginina metil éster

LTP: Potenciação de longa duração (“long-term memory”)

MAPK: proteína-quinase ativável por mitógensos

MK-801: Maleato de dizocilpina

MCD: Memória de curta duração

MLD: Memória de longa duração

MAO: Monoamina oxidase

NMDA: N-Metil-D-Aspartato

NIQFAR: Núcleo de Investigação Químico-Farmacêutica

ODC: Ornitina decarboxilase

NO: Óxido nítrico

NOsintase: Óxido nítrico sintase

PAF: Fator de ativação plaquetário

PKA: Proteína-quinase dependentes do AMPc

5-HT

PKC: Proteínas-quinase cálcio dependentes

PKG: Proteína-quinase dependente do GMPc

PTZ: Pentilenotetrazol

5-HT

:Receptor serotoninérgico do tipo A

SAL: salina

SNC: Sistema Nervoso Central

SCP: Substância cinzenta periaquedutal

TCA: Teste do campo aberto

TEC: Teste do eletrochoque

TEST: Teste da convulsão induzida por estricnina

TEI: Teste da esquiva inibitória

TLCE: Teste do labirinto em cruz elevado

TNF: Teste nado forçado

TPTZ: Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol

TSC: Teste suspensão pela cauda

UNIVALI: Universidade do Vale de Itajaí

UFSC: Universidade Federal de Santa Catarina

UFRS: Universidade do Rio Grande do SUL

Via intraperitoneal: i.p.

INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

As patologias que envolvem o Sistema Nervoso Central (SNC) e o Sistema Nervoso

Periférico (SNP) necessitam do desenvolvimento de novos fármacos, que possam substituir os

existentes, com custos e efeitos colaterais e/ou adversos menores, e que tenham efeitos

terapêuticos mais eficazes.

Estas necessidades têm impulsionado a comunidade científica a novas e incessantes

pesquisas nesta área, sendo que muitos destes fármacos têm sua origem em produtos naturais

ou na síntese de moléculas orgânicas oriundas de protótipos naturais como os constituintes de

animais e plantas. As imidas cíclicas e a agmatina são substâncias que se enquadram nesse

aspecto e estudos promissores sobre os efeitos centrais de ambos os tipos de substâncias são

uma constante (REIS; REGUNATHAN, 1998).

A agmatina é uma poliamina que foi identificada por Kossel em 1910. Pensava-se até

então que era restrita a plantas, bactérias e invertebrados (REGUNATHAN; REIS, 1996), mas

estudos posteriores têm comprovado sua distribuição no soro e em vários tecidos de

mamíferos, inclusive no Sistema Nervoso Central (SNC) (RAASCH et al., 1995 a, b).

A distribuição dos neurônios contendo agmatina está correlacionada com a distribuição

dos α

-adrenoreceptores e receptores imidazólicos (RUGGIERO et al., 1995). Ambos os tipos

estão concentrados nas regiões do SNC que participam do controle visceral e neuroendócrino,

que processam emoções, dor, percepção e cognição (RAASCH et al., 2001).

Atualmente, a agmatina tem sido considerada como um novo neurotransmissor ou

neuromodulador (REIS; REGUNATHAN, 1998, 2000), pois é sintetizada, estocada em

neurônios regionalmente seletivos, acumulada através de processos de captação (SASTRE;

REGUNATHAN; REIS, 1997 a, b; REIS) e metabolizada pela arginina decarboxilase, além

de ser liberada isoladamente ou como co-tramsmissor (REGUNATHAN et al., 1995).

As imidas cíclicas são compostos derivados da reação entre os ácidos dicarboxílicos e

a amônia com liberação de uma molécula de água e que possuem diversas propriedades

farmacológicas, inclusive apresentando representantes do grupo usados terapeuticamente.

Com relação a atividades centrais já se utiliza terapeuticamente a etosuximida no tratamento

da epilepsia, além da buspirona no tratamento da ansiedade (NUNES, 1986).

Diversos trabalhos têm explorado as atividades centrais das imidas cíclicas. Derivados

da fenilsuccinimidas metasubstituídas e da N-aminofenilsuccinimida demonstraram forte ação

anticonvulsivante em convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) (LANGE et al., 1977

a, b). Os compostos 3-fenil-2,3-dimetilsuccinimida e seus derivados N-metilados

apresentaram efeito farmacológico em processos epiléticos induzidos não sendo detectados

efeitos hipnóticos colaterais (CORRÊA, 1997). Existem relatos de que algumas

arilpiperazinas N-substituídas atuam no sistema serotoninérgico com atividade antidepressiva.

Os compostos N-fenilmaleimidas, N-(4-nitro)-fenilmaleimida, N-fenetilftalimida, N-

fenilftaleimida, N-fenilcitraconimida e N-(4-hidroxi)-fenilmaleimida exibiram efeito

anticonvulsivante em modelo de convulsão induzida por PTZ (MATOS, 1999). A propriedade

antipsicótica foi estudada com produtos imídicos derivados da glutarimida ou da

tiosuccinamida e são eficazes em antagonizar receptores dopaminérgicos do tipo D

modelos animais de esquizofrenia (NEW et al, 1988; CORRÊA, 1997).

Até o presente momento, possíveis propriedades das imidas cíclicas inéditas

sintetizadas pelo grupo de pesquisadores do Núcleo de Investigação Químico-Farmacêutica

(NIQFAR) da UNIVALI e da agmatina foram pouco avaliadas sobre os parâmetros

comportamentais dos animais. Desta forma, a proposta central do presente estudo foi a de

verificar as possíveis propriedades farmacológicas das duas classes de compostos sobre o

SNC, que indiquem uma futura aplicabilidade na terapêutica de doenças neuropsiquiátricas

como depressão, ansiedade ou doenças neurodegenerativas como o Alzheimer, Parkinson,

entre outras.

OBJETIVOS

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

- Avaliar os efeitos da agmatina e de imidas cíclicas (maleimidas e succinimidas) sobre

o comportamento de roedores submetidos a diferentes testes.

3.2

Objetivos específicos

- Avaliar as propriedades ansiolíticas de compostos imídicos selecionados

administrados em animais e submetidos ao modelo para ansiedade, o teste do labirinto em

cruz elevado (TLCE);

- Avaliar as propriedades ansiolíticas da agmatina administrada perifericamente e

centralmente em animais submetidos ao modelo para ansiedade, o TLCE;

- Avaliar as propriedades antidepressivas de compostos imídicos selecionados e da

agmatina em animais através dos modelos para depressão: o teste da suspensão pela cauda e o

teste do nado forçado;

- Avaliar as propriedades anticonvulsivantes de compostos imídicos selecionados

através do modelo para convulsão, o teste do antagonismo de convulsões induzidas por

pentilenotetrazol e por estricnina;

- Avaliar os efeitos de compostos imídicos selecionados e da agmatina sobre a sedação

dos animais através do teste do “open-field”.

- Avaliar possíveis efeitos da agmatina e compostos imídicos selecionados sobre a

memória através do modelo da esquiva inibitória.

MATERIAIS E MÉTODOS

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss Webster com idades entre 2 a 3 meses e pesos

variando de 25 a 35g e ratos Wistar pesando entre 250 a 350 g.

Os animais foram criados e mantidos no Biotério Central da UNIVALI, UFSC e UFRS

em ambiente com ciclo claro/escuro de 12 horas e temperatura ambiente controlada (23 ± 1º

C). Água e alimentação foram fornecidas livremente, exceto durante os experimentos.

O número de animais que foi utilizado nos modelos farmacológicos variou entre 7 a 10

animais por experimento, seguindo-se critérios da literatura. Cada ensaio farmacológico

utilizou-se no mínimo 40 animais.

Antes de cada experimento os animais foram habituados às condições experimentais

no próprio laboratório por um período de pelo menos 1 h antes do início das atividades

(NAHAS, 1999).

O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da UNIVALI

(Parecer nº 119/2001).

4.2

Reagentes, solventes e fármacos de referência

Para os experimentos farmacológicos foram utilizados os seguintes fármacos e/ou

reagentes: agmatina, buspirona, cafeína, estricnina, fenobarbital, imipramina, L-arginina, L-

NOARG, MK801, pentilenotetrazol (Sigma, EUA), diazepam, haloperidol (Cristália, Brasil).

Os compostos imídicos utilizados foram: N-fenilmaleimida (NFM), 4-metil-N-fenilmaleimida

(MeNFM), 4-nitro-N-fenilmaleimida (NO

NFM), 3-benzilamino-4-metil-fenilsuccinimida

(1NFS) e 3-dimetilamino-4-metil-fenilsuccinimida (2NFS) Todos os compostos foram

sintetizados nos Laboratórios de Química do Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas

(NIQFAR) da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI).

Os compostos foram dissolvidos em solução de salina 0,9% e dimetil sulfóxido

(DMSO) no momento do teste. As demais substâncias (agmatina, buspirona, cafeína,

estricnina, fenobarbital, imipramina, L-arginina, L-NOARG, pentilenotetrazol, diazepam,

haloperidol) foram diluídas somente com solução salina 0,9%.

O fenobarbital, a buspirona, o haloperidol, a imipramina, o diazepam e a cafeína foram

utilizados como controles positivos.

4.3

Síntese de imidas cíclicas

Os compostos imídicos foram sintetizados nos Laboratórios de Química do NIQFAR,

sob supervisão dos professores Valdir Cechinel Filho e Rogério Corrêa, utilizando-se

procedimentos usuais descritos na literatura (CECHINEL FILHO, 1995; CECHINEL FILHO;

CORRÊA; CAMPOS, 2003).

4.3.1 Síntese das maleimidas

A síntese das maleimidas foi realizada como se segue:

Um Mol de p-toluidina foi adicionado a 1 Mol de anidrido malêico dissolvidos em

éter, onde formou-se o ácido. A este ácido, foi adicionado 4 Mol de anidrido acético + 0,5

Mol de acetato de sódio anidro, em banho-maria à 60-70º C com agitação esporádica durante

2 horas. A amina substituída foi obtida através da precipitação desta solução em água gelada e

recristalizada com hexano, formando a imida 4-metil-N-fenilmaleimida (Me-NFM).

4.3.2 Síntese das succinimidas

Reação de adição nucleofílica à dupla ligação imídica:

a) Síntese da N-fenilmaleimida

endimento da N-fenilmaleimida (NFM): 68%.

b) ese da 4-metil-N-fenilmaleimida

Rendimento da 4-metil-N-fenilmaleimida (MeNFM): 57,3%

N-fenilmaleimida

ácido

Éter

acetato de sódio anidro

anidrido acético

anidrido maleico + anilina

ácido maleâmico

Sínt

Éter

acetato de sódio anidro

anidrido acético

4-metil-N-fenilmaleimida

anidrido maleico + p-toluidina

ácido

ácido maleâmico

c) Síntese da 4-nitro-N-fenilmaleimida

Éter

acetato de sódio anidro

anidrido acético

anidrido maleico + nitro-anilina

ácido maleâmico

Rendimento da 4-nitro-fenilmaleimida (NO2NFM): 61%

a) Para a síntese da 3-dimetilamino-4-metil-N-fenilsuccinimida (1 NFS) utilizou-se:

Um Mol de 4-metil-N-fenilmaleimida dissolvida em acetonitrila, sendo adicionado 1

Mol de dimetilamina, aquecido por duas horas e agitado ocasionalmente. Posteriormente foi

evaporado o solvente para que a succinimida precipitasse.

b) Para a síntese da 3-benzilamino-4-metil-N-fenilsuccinimida (2 NFS) utilizou-se:

Um Mol de 4-metil-N-fenilmaleimida dissolvida em benzeno, sendo adicionado 1 Mol

de benzilamina, aquecido por duas horas e agitado ocasionalmente. Posteriormente foi

evaporado o solvente para que a succinimida precipitasse.

Esquema geral da síntese das succinimidas

4-metil-NFM

aquecimento

benzeno

R H

R = dimetilamina (1 NFS), benzilamina (2 NFS)

Rendimento da dimetilamina (1 NFS): 37%

Rendimento da benzilamina (2 NFS): 22%

Todas as reações foram monitoradas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD),

para verificar o grau de pureza dos compostos, comparando com amostras padrão. Os dados

espectrais estiveram de acordo com as estruturas propostas, conforme descrito na literatura

(CECHINEL FILHO; CORRÊA; CAMPOS, 2003).

4.4 Ensaios Farmacológicos

4.4.1 Modelo de locomoção e sedação, o teste do campo aberto (TCA)

O teste do campo aberto (TCA) pode ser utilizado tanto para verificar os efeitos de

substâncias sobre a memória espacial e/ou efeitos sedativos sobre o sistema motor dos

animais. Substâncias estimulantes do SNC tendem a aumentar os parâmetros comportamentais

registrados no modelo enquanto que substâncias depressoras tendem a diminuí-los. A

tendência natural do animal em ambiente novo é a de explorá-lo, apesar do conflito com o

medo provocado pela novidade (MONTGOMERY, 1958).

Figura 4. Campo aberto para camundongos

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI)

(2001)

O aparato utilizado para os experimentos com os camundongos foi confeccionado em

madeira 30 X 30 X 15 cm com a frente de vidro para melhor visualizar os animais (Figura 4).

O interior do aparato era subdividido em 9 quadrantes. As dimensões podem variar conforme

o animal estudado (NAHAS, 1999). Já o aparato utilizado para os experimentos com ratos foi

confeccionado em acrílico transparente de forma circular, com o fundo também subdividido

em quadrantes (Figura 5).

O teste consiste na colocação do animal em estudo no aparato sendo a fuga evitada

pelas paredes circundantes. Durante a sessão de teste foi registrado o número de rearings

(levantamento do corpo sob as patas traseiras para exploração do ambiente) bem como o

número de crossing (cruzamento dos quadrantes) (MONTGOMERY, 1955).

Para os testes foram utilizados três grupos como controles, um grupo (controle

negativo) onde os camundongos (para o teste com imidas) e ratos (para o teste com agmatina)

receberam o veículo (salina) e dois controles positivos (haloperidol 2,5 mg/kg e cafeína 3

mg/kg), tanto para camundongos quanto para os ratos.

As doses utilizadas nos experimentos foram de 5, 15 e 30 mg/kg para a agmatina; 3,

10 e 30 mg/kg para o NFM; 6, 10 e 30 mg/kg para MeNFM e NO

NFM; 5, 15 e 30 mg/kg

para 1NFS e 2NFS, administradas intraperitonealmente. Os animais foram colocados no

aparato 30 min após a administração dos fármacos por 5 min.

Nos grupos de animais que receberam infusão de agmatina centralmente, a infusão foi

realizada e 5 min após foi realizado o TCA.

Figura 5. Campo aberto para ratos

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI) (2004)

4.4.2 Modelo da convulsão induzida por pentilenotetrazol (TPTZ)

O teste do PTZ é um dos mais utilizados para a seleção de drogas com ação

anticonvulsivante, justamente por sua simplicidade e eficácia (WADA, 1977). O PTZ é uma

substância que age nos canais de cloreto do receptor GABA

impedindo a ação inibitória

central do neurotransmissor GABA, bloqueando-o, o que leva à crise convulsiva do tipo

generalizada.

Durante o teste os camundongos foram pré-tratados intraperitonealmente com os

compostos nas doses de 10, 30 e 60 para NFM, NO

NFM e MeNFM e 5, 15 e 30 mg/kg para

1NFS e 2NFS, 30 min antes da indução da crise convulsiva. Após esse tempo receberam PTZ

(80 mg/kg, i.p.) sendo imediatamente transferidos para um recipiente de contenção de vidro,

onde foi cronometrado o tempo de latência para o aparecimento da primeira crise convulsiva e

durante 60 min e o número de óbitos até 24 h após a aplicação do PTZ (Figura 6).

Figura 6. Convulsão induzida pelo PTZ e estricnina

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI)

(2001)

Foi estabelecido como episódio convulsivo o aparecimento de espasmos mioclônicos

com no mínimo 5 s de duração, acompanhado pela perda do reflexo postural, taquicardia,

piloereção e outras modificações neurovegetativas exacerbadas (micção, salivação e

defecação). Dois grupos foram utilizados como controles, um controle negativo, onde os

animais receberam o veículo, no qual os compostos foram diluídos e outro (controle positivo),

onde os animais receberam fenobarbital (50 mg/kg), ambos administrados por via

intraperitoneal (i.p.).

4.4.3 Modelo da convulsão induzida por estricnina (TEST)

O antagonismo da convulsão induzida por estricnina (4,0 mg/kg) também é um modelo

utilizado para a seleção de drogas com ação anticonvulsivante.

A estricnina é um antagonista competitivo dos receptores de glicina localizados na

medula espinhal. Como antagonista competitivo, a estricnina promove a diminuição dos

efeitos inibitórios da glicina sobre o SNC acarretando numa crise convulsiva intensa que leva

os animais geralmente ao óbito.

A crise focal é um tipo de epilepsia parcial com características distintas da crise

generalizada. Os modelos agudos de crise focal incluem a aplicação tópica ou sistêmica de

compostos que interferem com o balanço neuroquímico responsável pela excitabilidade neural,

sendo a estricnina um desses compostos (TREIMAN; HEIMAMAN, 1997). Além das

alterações neurodegenerativas (induzidas por uma descarga simpática) observa-se no animal

uma crise tônica intensa e fatal com um espasmo extensor característico.

O modelo da estricnina nos fornece a informação que o composto e/ou substância que

nele for efetivo possui atividade anticonvulsivante por mecanismo distinto daqueles

observado no modelo do PTZ.

A metodologia do teste segue os mesmos padrões do teste TEST, usando os mesmos

controles negativos e positivos.

Os experimentos foram realizados em camundongos nas doses de 10, 30 e 60 para

NFM, NO

NFM e MeNFM e 5, 15 e 30 mg/kg para 1NFS e 2NFS.

4.4.4 Teste da ansiedade, o Labirinto em Cruz Elevado (TLCE)

O labirinto em cruz elevado (LCE) foi adaptado do modelo de Montgomery criado em

1955. Este pesquisador desenvolveu um labirinto elevado no qual a intensidade do medo

natural induzida poderia ser medida pela variação da proporção de exploração (comportamento

exploratório) entre os braços abertos e fechados.

Em 1985 foi validado farmacologicamente, etologicamente e fisiologicamente por

Pellow e colaboradores. Nesse teste, drogas com perfil ansiolítico como o diazepam,

clordiazepóxido e fenobarbital tendem a aumentar a exploração e o tempo de permanência nos

braços abertos, enquanto que, drogas com perfil ansiogênico como a picrotoxina, yoimbina,

anfetamina e cafeína tendem a diminuir esses parâmetros comportamentais (PELOW et al.,

1985; PELLOW; FILE, 1986; FILE, 1997).

O LCE é sensível aos efeitos de lesões neurotóxicas em neurônios serotoninérgicos e

aos efeitos de drogas ansiogênicas (PELLOW; FILE, 1986).

O LCE para camundongos consiste de dois braços abertos (30 X 5 X 25 cm) e dois

fechados (30 X 5 X 25 cm) em forma de cruz grega, os braços são conectados por uma área

central (5 X 5 cm), as paredes podem ser de acrílico transparente e o LCE deve estar a uma

altura de 45 cm do chão (Figura 7). O LCE para ratos com braços abertos media 50 X 10 cm

os braços fechados media 50 x 10 x 15 cm

. A área central media 10 x 10 cm

e estava a 70 cm

do chão.

No presente trabalho os experimentos foram realizados durante o dia em luz ambiente

(FILE, 1997; JONES; KING, 2001). Os animais que caiam do LCE eram excluídos do

experimento. Após o teste de cada animal, o LCE era limpo com solução de etanol a 10%.

As medidas comportamentais registradas foram: a freqüência de entradas e o tempo

despendido nos braços abertos e nos fechados. A frequência total de entradas é obtida pela

soma simples das freqüências de entradas nos braços abertos e nos fechados. Para análise

estatística dos dados e confecção dos gráficos a percentagem de entradas no braço aberto é

calculada dividindo-se a freqüência de entradas nos braços abertos pela frequência total de

entradas, e esse índice multiplicado por 100 (% FA = FA/FA + FF x 100). De maneira

semelhante é calculada a percentagem do tempo em que os animais permaneceram nos braços

abertos em relação ao somatório do tempo de permanência nos braços abertos e fechados,

sendo o quociente obtido multiplicado por 100 (RODGERS; COLE, 1994). Considerou-se

como entradas em um dos braços do LCE quando o animal colocou as quatro patas dentro do

respectivo braço.

Para realizar este experimento foram utilizadas 10 e 30 mg/kg de agmatina. Para os

compostos imídicos foram utilizadas 6, 10 e 30 mg/kg de NFM, NO

NFM e MeNFM e 5, 15

e 30 mg/kg de 1NFS e 2NFS administrados intraperitonealmente nos camundongos e 30 min

após foram colocados individualmente no LCE. Os animais foram colocados no centro do

aparelho com a cabeça voltada para um dos braços fechados e seu comportamento observado

por 5 min (PELLOW et al., 1985; FILE, 1997). Para avaliar a agmatina foram utilizados ratos

e camundongos.

Dois grupos foram utilizados como controles: um (controle negativo), onde os animais

receberam o veículo e outro (controle positivo), onde os animais receberam diazepam (0,75

mg/k) para o teste com camundongos e buspirona 2 mg/kg para o teste com ratos. Pellow e

colaboradores (1985) demonstraram que o diazepam aumentava o tempo e o número de

entradas nos braços abertos, sendo um potente ansiolítico e podendo ser utilizado como

controle positivo no LCE.

Figura 7. Labirinto em Cruz Elevado.

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI)

(2001)

Cirurgia-estereotáxica e implantação de cânulas

Para os experimentos de ansiedade, avaliando os efeitos da agmatina quando aplicada

centralmente foi necessário o procedimento da estereotaxia. Os ratos foram anestesiados com

uma mistura de ketamina (80 mg/kg, i.p.) e xilazina (75 mg/Kg, i.p.) e fixados no

equipamento estereotáxico. Uma vez verificada a perda total dos reflexos, procedeu-se à

tricotomia de toda a parte superior da cabeça do animal e posterior adaptação ao aparelho

estereotáxico (STOELTINGH, mod. 300, USA) (Figura 8 e 9).

Em seguida, foi realizado à assepsia da área com álcool iodado 10% e uma solução de

Xilocaina com adrenalina (2%) foi infundida subcutaneamente por todo o campo cirúrgico. A

calota craniana numa área de 3 a 4 mm posterior à sutura lambóide até 3 a 4 mm anteriores à

sutura coronariana foi exposta, através da remoção de uma área ovalada. O perósteo de toda a

região foi raspado. Em seguida, o crânio foi posicionado no aparelho estereotáxico de forma

que o bregma e o lambda ficassem situados em um mesmo plano horizontal.

Figura 8. Adaptação ao aparelho estereotáxico

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina

(UFSC) (2004)

Para o implante das cânulas na região CA1 da região dorsal do hipocampo (CA1),

amígdala (AMG), substância cinzenta periaquedutal (SCP) e córtex entorrinal (CE) as

coordenadas obedecidas, segundo Paximos e Watson (1986) foram as seguintes: 1.0 mm

acima da região CA1 da região dorsal do hipocampo (A= - 4.3, L= + 4.0, V= +2.0), AMG

(A=-2.3, L= + 4.5, V= +5.4), SCP (A= - 7.6, L= +1,9, V= - 2.0 mm) e CE (A=-2.3, L= + 4.5,

V= +5.4) e. Uma vez adaptada às cânulas bilateralmente nas regiões do hipocampo (CA1),

CE e AMG e unilateralmente para a SCP, o osso craniano foi seco e a área aberta preenchida

com uma prótese de polímero autopolimerisável que, ao endurecer, incorporou todas as peças

em uma sólida prótese.

Os experimentos foram conduzidos na Universidade Federal de Santa Catarina

(UFSC) no Laboratório de Bioquímica e Farmacologia com a cooperação da professora

Cilene Lino de Oliveira.

Figura 9. Cirurgia estereotáxica.

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)

(2004)

Microinjeção intracerebral

Foram utilizadas agulhas de 13 mm de comprimento e 0,3 mm de diâmetro, adaptadas

a partir de agulhas odontológicas, conectadas a microseringas (Hamilton, 10 µl), por um tubo

de polietileno para infusão de fármacos na SCP e 11,0 mm para as demais regiões escolhidas.

As agulhas possuíam 1,0 mm de comprimento a mais do que a cânula-guia de forma que o

fármaco fosse realmente microinjetada nas regiões estudadas. As seringas foram preenchidas

com água destilada e com solução de agmatina, separadas por uma bolha de ar.

Para a microinjeção, o animal foi mobilizado na altura do colo, com o auxílio de um

pano e, com alicate foi retirado o mandril adaptado à cânula durante o ato cirúrgico.

Com auxílio de agulhas odontológicas, usadas para desobstrução do canal dentário, as

cânulas-guias eram limpas. Posteriormente a agulha foi suavemente introduzida através da

cânula. Em cada animal foi injetado nas regiões em estudo. Ao final da injeção a agulha foi

deixada no local por 15 segundos adicionais (Figura 10).

Figura 10. Microinjeção intracerebral

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade Federal de Federal de Santa Catarina

(UFSC) (2004)

Histologia

Ao término de cada teste os animais foram sacrificados e em seguida foi infundida

uma solução de azul de Evans para demarcação do local da implantação das cânulas. Os

cérebros foram retirados e fixados em uma solução de formaldeído e cortados para análise

histológica (Figura 11). Os animais que não apresentaram a correta implantação da cânula nas

regiões em estudo foram desprezados na análise estatística dos ensaios comportamentais.

As análises histológicas foram realizadas no Laboratório de Bioquímica da UFRGS

pela acadêmica Beatriz Moletta, sob a supervisão do Prof. Dr. Ivan Izquierdo.

Periaquedutal

Amígdala Hipocampo C. Entorrinal

ACe

top

.64-7

CA3

CA2

CA1

ABL

AMe

Figure 11: Local da injeção do veículo ou da agmatina na substância cinzenta periaquedutal

(SCP), amígdala (AMG), hipocampo (CA1) e córtex entorrinal (CE). Os animais receberam a

injeção 5 min antes de serem colocados no LEC ou no Open Field. Abreveaturas: 3V =

terceiro ventrículo; ABL = amígdala, núcleo basolateral; CA1 = corno 1; CA2 = corno 2; CA3

= corno 3; ACe = amígdala, núcleo central; GD = giro dentado; DL = substância cinzenta,

dorsolateral; DM = substância cinzenta, dorsomedial; DR = núcleo dorsal da rafe; CE =

córtex entorrinal; FI = fimbria; HB = habenulae; HL = hipotálamo lateral; AMe = amígdala,

núcleo medial; TOP = trato óptico; SCP = substância cinzenta periaquedutal; SC = colículo

superior. As medidas representadas foram de acordo com o Atlas Paxinos e Watson de

cérebro de ratos (1986). Fonte: Laboratório de Bioquímica da Universidade Federal de Santa

Catarina (UFSC) (2004)

4.4.5 Teste da suspensão pela cauda (TSC)

O teste de depressão, o modelo de suspensão pela cauda foi desenvolvido por Steru e

colaboradores (1985) e vem sofrendo várias adaptações (VAUGEOIS et al., 1997;

ZOMKOWSKI et al., 2002). Da mesma forma que o teste do nado forçado, o modelo se baseia

na capacidade de imobilização dos animais frente a uma situação de difícil escape. Os animais

são pré-tratados com os compostos e submetidos a uma situação onde são suspensos através da

cauda e presos numa superfície plana levantada do chão. Como é impossível o escape, os

animais primeiramente desenvolvem movimentos desordenados e posteriormente (quando

aprendem que o escape é impossível) a imobilidade.

Figura 12. Suspensão pela cauda

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI)

(2004)

Os animais foram pré-tratados 30 min antes com os compostos e submetidos ao teste

(Figura 12). As doses utilizadas para o experimento foram 30 e 50 mg/kg para a agmatina; 5,

15 e 30 mg/kg para NFM, MeNFM, NO

NFM, 1NFS e 2NFS administradas

intraperitonealmente.

O procedimento experimental consistia em suspender os camundongos pela cauda, por

um período de 5 min, no qual foi registrado o tempo total de imobilidade para cada animal

(Figura 12). A redução do tempo de imobilidade foi considerada indicativo de atividade

antidepressiva (VAUGEOIS et al., 1997).

4.4.6 Teste do nado forçado (TNF)

O teste foi desenvolvido por Porsolt, Le Pichon e Jalfre (1977) e adaptado por Borsini,

Meli e Bornes (1986). Consiste em colocar os animais em um tanque de vidro contendo 19 cm

de água à temperatura de 25ºC, de modo que por mais que se esforcem, não conseguem fugir.

O parâmetro observado é o tempo de imobilidade dos animais adquirido após o esforço

desprendido para sair do tanque.

Figura 13. Teste do nado forçado

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI)

(2004)

O animal é considerado imóvel quando se movimenta somente para evitar o

afundamento (Figura 13). Esse comportamento indica um estado de desesperança do animal,

após ter aprendido que a fuga é impossível (PORSOLT; Le PICHON; JALFRE, 1977).

Os compostos foram administrados intraperitonealmente nos camundongos nas doses

de 5, 15 e 30 mg/kg dos compostos imídicos e 30 e 50 mg/kg da agmatina e 30 minutos após

os mesmos foram submetidos aos testes durante 6 minutos.

Dois grupos foram testados como controle positivo (imipramina 30 mg/kg) e negativo

(salina).

4.4.7 Teste de memória: o modelo da esquiva-inibitória (TEI)

Trata-se de uma manipulação comportamental, onde o comportamento natural do

animal é inibido. Habitualmente, um animal ao ser colocado em ambiente novo procura

explorar este ambiente. Na esquiva inibitória, esse comportamento explorador é inibido, pela

aplicação de choques. Assim, a aprendizagem se manifesta através da inibição do

comportamento exploratório natural do animal.

O aparelho utilizado consiste de uma caixa automatizada medindo 50 cm de

comprimento, 25 cm de largura e 25 cm de altura, com a face frontal em vidro. Parte do

assoalho à esquerda na caixa, consiste de uma plataforma com 5 cm de altura. O restante do

assoalho é constituído de uma grade de barras de bronze, com 1 mm de diâmetro, espaçada 1

cm uma das outras, através da qual é possível aplicar uma diferença de potencial regulável de

0 a 1mA (Figura 14).

Nas sessões de treino os ratos foram colocados sobre a plataforma, cronometrando-se a

latência de descida completa do animal da plataforma (com as quatro patas na grade de

bronze), quando isto ocorreu o animal começa a levar os choques (0,4 Aº). O animal recebeu o

choque até subir de volta para a plataforma. Logo após o treino os animais receberam

intraperitonealmente os compostos a serem testados. Nas sessões de teste, os mesmos animais

(já treinados) foram recolocados sobre a plataforma e a latência para descida foi cronometrada.

Durante o teste houve omissão do choque.

Para o teste da aquisição da memória os compostos foram injetados

intraperitonealmente 15 min antes do treino na esquiva inibitória, nas doses de 10 mg/kg dos

compostos NFM, NO

NFM, MeNFM, 1NFS e 2NFS e de 5, 15 e 30 mg/kg da agmatina. Cada

animal era recolocado novamente na plataforma 1,5 h após o treino sem levar choque para ser

medido a memória de curta duração (MCD) e 24 h depois para a memória de longa duração

(MLD). Para a consolidação da memória os animais eram treinados e imediatamente após o

treino, eram injetados os compostos, aguardando 1,5 h para ser lido a MCD e 24 h após a

MLD. Na evocação da memória os compostos foram injetados 15 min antes do teste.

O tempo máximo permitido para cada animal permanecer sobre a plataforma era de 180 s, os

animais cuja diferença de latência ultrapassava este limite ficaram computados com este valor

(IZQUIERDO; NETO, 1985). A latência para a descida entre o teste e o treino foi considerada

como índice de retenção de memória.

Figura 14. Esquiva inibitória

Fonte: Lab. de Farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí

(UNIVALI) (2004)

Para demonstrar se a via glutamatérgica poderia estar envolvida nos efeitos da

agmatina, os animais foram tratados sistemicamente com um antagonista de receptores

NMDA, o maleato de dizocilpina (MK- 801) 0,1mg/kg, i.p. Para a via oxidonitrérgica foram

pré-tratados sistemicamente com um inibidor NOsintase, a L-NOARG (10 mg/kg, i.p.) e um

substrato da enzima NOsintase, a L-arginina (1,0 mg/kg, i.p.), 15 min antes da agmatina.

4.5 Análise estatística

Para os experimentos TCA, TPTZ, TEST, TLCE, TNF e TSC os dados obtidos foram

apresentados como as médias seguidas pelos respectivos EPMs. Os dados foram submetidos a

ANOVA e quando necessário aos testes pos hoc de Dunnett e Newman Kewls, utilizando-se o

software GraphPad INSTAT

utilizando o teste de Dunnett. Os resultados obtidos no TEI

foram apresentados como medianas seguidas dos intervalos interquatil (25 e 75).

Foi utilizado teste não paramétrico como o teste Mann-Whitney U pelo software SPSS

10.0. Valores de P menor do que 0,05 (P < 0.05) era indicativo de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Resultados obtidos com a agmatina

5.1.1 Efeito da agmatina sobre os parâmetros comportamentais no Teste do Campo

Aberto (TCA)

Como mostra a Figura 15 (A e B), neste modelo foi observado que a agmatina em todas

as doses utilizadas não modificou os parâmetros comportamentais (crossing e rearing) dos

animais quando comparado com o grupo controle negativo tratado com salina.

Também foram utilizados controles positivos para se comparar o efeito do composto

testado sobre a locomoção dos animais. Para tanto, foi administrada cafeína (um estimulante

do SNC) que aumentou o número de crossings (q = 3,088, p < 0,05) e o haloperidol (um

inibidor seletivo do receptor dopaminérgico D

) que reduziu este parâmetro (q = 14,087, p <

0,01). Foram usados os mesmos controles positivos para avaliar o comportamento exploratório

dos animais (rearing). Os resultados indicam que não houve modificação deste parâmetro

quando foi utilizada a cafeína como controle (q = 1,399, p > 0,05), enquanto que com o

haloperidol observou-se redução (q = 7,624, p < 0,01).

Lavinsky e colaboradores (2002) utilizaram o mesmo teste com o objetivo de verificar

se a deambulação poderia influenciar os resultados obtidos com a agmatina quando

administrada em ratos e avaliados sobre o LCE. Os autores demonstraram que o pré-

tratamento com a agmatina perifericamente não provoca modificações nos parâmetros

observados.

A agmatina também foi avaliada quando administrada centralmente. A Tabela 1 nos

mostra que a administração central de agmatina em regiões como CE, CA1, AMG e SCP não

interferiram nos parâmetros analisados no campo aberto.

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Número de crossing

Veic 5 15 30 Caf Hal

100

Veículo

Agmatina

Cafeína

Haloperidol

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Número de rearing

Veic 5 15 30 Caf Hal

Figura 15. Efeito da agmatina, cafeína e haloperidol sobre os parâmetros comportamentais crossing

(A) e rearing (B) no Teste do Campo Aberto. Os animais foram tratados intraperitonealmente com

salina, agmatina (5, 15 e 30 mg/kg, i.p.), cafeína (3 mg/kg, i.p.) e haloperidol (2,5 mg/kg, i.p.) 30 min

antes do teste. Cada coluna representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros

padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste

de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e

**p<0.01).

Tabela 1. Efeito da administração central da agmatina sobre os parâmetros

comportamentais crossings e rearings no Teste do Campo Aberto

Tratamento

(µg/kg)

Via de admin.

Crossings

(A)

Rearings

(B)

Veículo CA1

47 ± 1,14 28 ± 2,64

Agmatina (20µg/sítio)

CA1

52 ± 2,64 30 ± 1,98

Agmatina (40µg/sítio)

CA1

48 ± 2,74 34 ± 1,76

Veículo CE

28 ± 2,64 32 ± 1,64

Agmatina (20µg/sítio)

26 ± 1,28 30 ± 1,98

Agmatina (40µg/sítio)

34 ± 1,76 33 ± 2,16

Veículo AMG

57 ± 1,19 22 ± 1,09

Agmatina (20µg/sítio)

AMG

52 ± 2,14 26 ± 1,92

Agmatina (40µg/sítio)

AMG

61 ± 1,54 24 ± 1,18

Veículo SCP

33 ± 0,89 27 ± 1,19

Agmatina (20µg/sítio)

SCP

32± 2.14 32 ± 2,14

Agmatina (40µg/sítio)

SCP

29 ± 1,54 21 ± 2,54

Efeito da agmatina nos parâmetros crossing e rearing no Teste do Campo Aberto. Os ratos foram

tratados com salina e amatina (20 e 40 µg/sítio) 5 min antes do teste. Os dados foram submetidos a

análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes

comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0.01).

5.1.2 Efeito da agmatina sobre a ansiedade, avaliada no Teste do Labirito em Cruz

Elevada (TLCE)

A ansiedade humana se reflete nos distúrbios do comportamento como fuga, gestos

e/ou hipervigilância. Um estado similar pode ser observado na ansiedade animal. Quando um

animal é colocado em um ambiente não familiar ele passa a desenvolver uma série de

respostas comportamentais e fisiológicas como inibição do comportamento exploratório,

paralisação, aumento no batimento cardíaco, defecação e micção e fisiologicamente os níveis

de corticosterona encontram-se aumentados (TREIT, 1985; RODGERS; COLE, 1994).

Embora haja atualmente vários modelos animais de ansiedade, o LCE é sensível aos

efeitos de lesões neurotóxicas em neurônios serotoninérgicos e aos efeitos de fármacos

ansiogênicos e/ou ansiolíticas (PELLOW; FILE, 1986). Além disso, é amplamente utilizado

em pesquisas científicas para a validação de substâncias com esta propriedade.

Quando avaliada neste modelo a agmatina promoveu um aumento do tempo gasto nos

braços abertos quando comparado ao controle negativo em ratos (F

(13,033)

= 2,433, p < 0,01).

Com relação a esse parâmetro o efeito observado com a agmatina (30 mg/kg) foi superior ao

controle positivo buspirona (2 mg/kg), um ansiolítico bastante utilizado na clínica (Figura 16

A). Da mesma maneira, o tratamento com a agmatina promoveu aumento de forma

estatisticamente significante do número de freqüência de entradas nos braços abertos quando

comparado com o controle (F

(15,077)

= 2,431, p < 0,01) conforme mostra a Figura 16 B.

Por outro lado, os experimentos demonstraram que a agmatina também promoveu a

diminuição do tempo gasto nos braços fechados quando comparado ao controle negativo salina

(12,228)

= 2,433, p < 0,01) (Figura 16 C), da mesma forma que promoveu a redução da

frequência de entradas nos braços fechados (F

(12,211)

= 2,435, p < 0,01) (Figura 16 D).

Também no modelo do LCE procurou-se verificar os efeitos da agmatina administrada

centralmente. Para tanto, a poliamina foi infundida diretamente em regiões como a SCP, no

CE, AMG e CA1.

Os animais que receberam infusão da agmatina (40 µg/kg) nas regiões SCP e CE

tiveram aumento do tempo (Figura 17 A) e da freqüência de entradas nos braços abertos

(8,981)

= 2,325, p < 0,01; (F

(5,058)

= 2,350, p < 0,05)) (Figura 17 B). Também observou-se

redução do tempo de permanência e da freqüência nos braços fechados nessa estrutura (F

(22,360)

= 2,325, p < 0,01; (F

(5,088)

= 2,350, p < 0,05)) (Figura 17 C e D) e somente com a dose de 40

µg/kg no CE (Figura 17 C).

O efeito ansiolítico foi observado com a infusão do composto na SCP e,

surpreendentemente, não foram encontradas modificações comportamentais com a infusão na

amígdala, uma região totalmente caracterizada como substrato neuroanatômico da ansiedade

(SCHEEL-KRUGER; PETERSON, 1982; BLANCHARD et al., 1991; WANG; OCHIAL;

NAKAY, 1992; GOBERT et al., 2000).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços abertos (%)

Veic 10 30 Busp

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços abertos (%)

Veic 10 30 Busp

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços fechados

(%)

Veic 10 30 Busp

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços fechados

(%)

Veic 10 30 Busp

Figura 16. Efeito da agmatina (10 e 30 mg/kg, i.p.) e da buspirona (2 mg/kg, i.p.) sobre o tempo de

permanência (A) e a percentagem de freqüência nos braços abertos (B) e o tempo de permanência (C)

e a percentagem de freqüência (D) nos braços fechados do LCE em ratos. Cada coluna representa a

média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram

submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Os asteriscos indicam

diferenças significantes quando comparadas com o veículo (**p<0.01).

Tempo de permanência nos

braços abertos (s)

Veículo

gmatina

Hipocampo

Entorrinal

mígdala

Periaquedutal

Tratamento (

g/kg, i.c.)

20 40

20 40 20 40 20

Frequência de entradas

nos braços fechados (%)

Hipocampo

Entorrinal

migdala

Periaquedutal

Tratamento (

g/kg, i.c.)

20 40 20 40 20 40 20 40

100

Hipocampo

Entorrinal

mígdala

Periaquedutal

Tratamento (

g/kg, i.c)

20 40

20 40 20

Tempo de permanência nos

braços abertos (s)

Freqüência de entrada nos

braços fechados (%)

Hipocampo

Entorrinal

mígdala Periaquedutal

Tratamento (

g/kg, i.c.)

20 40 20 40

40 20 40

Figura 17. Efeito da agmatina (20 e 40 µg/kg,i. intracerebral) sobre o tempo de permanência (A) e a

percentagem de freqüência nos braços abertos (B) e o tempo de permanência (C) e a percentagem de

freqüência (D) nos braços fechados do LCE em ratos 5 min após o tratamento. Cada coluna representa

a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados

foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam

diferenças significantes quando comparadas com o veículo (**p<0.01).

Os resultados obtidos com a infusão central da agmatina e com sua administração

periférica sugerem seu efeito ansiolítico, bem como sua passagem através da barreira

hematoencefálica uma vez que administração sistêmica produz os mesmos efeitos que a

administração central. Além disso, o efeito ansiolítico é desprovido de sedação, ou

perturbações motoras dos animais uma vez que os parâmetros comportamentais observados no

TOF não se mostraram diferentes daqueles observados com os animais controles.

A escolha das áreas para infusão da agmatina foi baseada em trabalhos anteriores

descritos na literatura. Estas áreas são relacionadas direta ou indiretamente com os processos

de aversão natural, ansiedade e agressividade e, exibem significantes níveis de concentração

de receptores NMDA, além da atividade da NOsintase (SASTRE; REGUNATHAN; REIS,

1997 b). É conhecido que o receptor NMDA está envolvido em vários processos funcionais

como a aprendizagem e a memória (CARLSSON; CARLSSON, 1990), desenvolvimento

neural e plasticidade sináptica (MALENKA; NICOLL, 1993), dano neural após isquemia ou

hipoglicemia, epilepsia e outras doenças crônicas neurodegenerativas (NICOLETTI et al.,

1996), dor neuropática (CONN; PIN, 1997) e depressão (SULCER, 1983).

Estudos prévios mostraram que antagonistas do receptor NMDA localizados na SCP,

hipotálamo, AMG estão envolvidos em ações ansiolíticas em vários modelos experimentais,

como o LCE (MARTINEZ et al., 2002; MOLCHANOV; GUIMARÂES, 2002). Em relação

ao córtex entorrinal, muitos estudos o relacionam ao envolvimento com o processo de

memória, mas poucos com a ansiedade. O mesmo ocorre com a região hipocampal.

Há uma forte evidência que a periaquedutal é uma importante porção de integração dos

neurônios para o controle do estado de motivação do animal (KUBOTA; GABRIEL, 1995).

Em várias espécies a estimulação elétrica ou química da porção dorsal da periaquedutal

estimula postura de defesa com resposta neurovegetativa. Estudos mostraram que a

administração de microinjeções na SCP e hipocampo promoveram a abertura dos canais

bloqueados por antagonistas do receptor NMDA favorecendo a liberação das monoaminas

serotonina e noradrenalina (PILC et al., 2002).

A agmatina é um antagonista do receptor NMDA, se enquadrando nesta categoria

(GILAD; GILAD, 2000; GIBSON et al., 2002; ZHU et al., 2003).

As microinjeções de L-NOARG (inibidor da NOsintase) na periaquedutal, AMG e

hipocampo de ratos também demonstraram efeito ansiolítico no LCE (BRAISSANT et al.,

1999). Além disso, a administração sistêmica de antagonistas não seletivos da NOsintase como

a L-NAME e um antagonista seletivo como o 7-nitroindazole mostraram efeito ansiolítico

significativo medido pelo aumento no tempo gasto nos braços abertos no LCE (FARIA et al.,

1997; DUNN et al., 1998; YILDIZ et al., 2000). Inibidores da NOsintase também aumentam a

atividade GABAérgica, potencializando a ação ansiolítica (VOLKE et al., 1997).

O receptor 5-HT

se localiza no córtex entorrinal, hipocampo, amígdala e hipotálamo e

pela analogia com a baixa ansiedade mostrada pelos animais sem os receptores 5-HT

administração de antagonistas do receptor 5-HT

exercem efeitos positivos em modelos

baseados na atividade exploratória, como o LCE (KELLEY et al., 2003; BOURIN;

HASCOET, 2003; PRUT; BELZUNG, 2003). A agmatina inibe este receptor, potencializando

a ação ansiolítica (LORING, 1990; REIS; YANG; MILNER, 1998; RAASCH et al., 2001).

Além disso, Millan (2003) propõe que a ligação com α

-adrenoreceptores pré-

sinápticos liberam serononina. A agmatina possui ação agonista nestes receptores, favorecendo

a liberação de serotonina (PILETZ et al., 1996 a, b; SANTOS et al., 2003; ONAL et al., 2003),

potencializando o efeito ansiolítico da agmatina.

O efeito farmacológico ansiolítico da agmatina, observado no presente trabalho pode

estar relacionado à inibição competitiva de todas as isoformas da NOsintase pela inibição

catalítica da sua atividade ou por gerar um bloqueio não competitivo do receptor NMDA ou

por bloquear o receptor 5-HT

ou pela ação agonista com os receptores α

-adrenoreceptores

pré-sinápticos

Os resultados do presente estudo confirmam os trabalhos anteriores (LAVINSKY et

al., 2002) sobre o efeito da agmatina, como também sugere que a agmatina exibe seu efeito

ansiolítico modulando regiões centrais como a periaquedutal e o córtex entorrinal.

5.1.3 Efeito da agmatina na depressão, avaliada nos Testes do Nado Forçado (TNF) e no

Teste Suspensão pela Cauda (TSC)

Os modelos para se avaliar a ação antidepressiva buscam uma semelhança

comportamental entre homem e animais. Modelos de estresse são utilizados amplamente no

estudo de substâncias com propriedades antidepressivas.

O TNF foi desenvolvido por Porsolt, Le Pichon e Jalfre (1977) para avaliar possíveis

ações antidepressivas por não requerer treinamento sofisticado e é barato.. Está relacionado

com as sintomatologias da depressão maior (unipolar), principalmente a anedonia e a

desesperança.

O teste TSC foi modificado por Stéru e colaboradores em 1985 e utilizado para avaliar

possíveis ações de substâncias naturais ou sintéticas. O teste avalia o tempo de imobilidade do

animal mantido suspenso pela cauda. A redução deste parâmetro indica atividade

antidepressiva (VAUGEOIS et al., 1997).

No presente estudo, para ambos os testes como controle positivo foi utilizado a

imipramina, um antidepresseivo tricíclico usado na terapia da depressão (SULCER, 1983). A

dose utilizada foi de 30 mg/kg.

Nos TNF administrada intraperitonealmente, a agmatina (30 e 50 mg/kg) promoveu

uma diminuição no tempo de imobilidade quando comparado com o controle negativo salina

somente com a dose de 30 mg/kg (F

(2,452)

= 210,41, p < 0,05), demonstrando um perfil

antidepressivo (Fig. 18 A). O mesmo perfil foi demonstrado no TSC, onde a agmatina

também produziu diminuição do tempo de imobilidade (F

(2,458)

= 9,350, p < 0,05) (Fig. 18 B).

A serotonina é um dos neurotransmissores envolvidos no processo de depressão sendo

que a terapia antidepressiva usada atualmente é baseada no aumento de seus estoques ou na

inibição de sua degradação (FRASER, 1997; MILLAN, 2003; GREEN; MacGREGOR, 2002;

HARRO, 2002).

A via serotoninérgica possui neurônios que se projetam até o CE, AMG, hipotálamo e

CA1 do hipocampo que podem ser ativados por estímulos ansiogênicos como stress e medo

condicionado (MIURA; QIAO; OHTA, 2002). A agmatina também está localizada nestas

regiões (OTAKE et al., 1998; YANG; REIS, 1999; WANG et al., 1995, 2002).

O óxido nítrico modula a neurotransmissão por suas ações anterógrada e retrógrada,

aumentando a liberação de serotonina e noradrenalina (MILLAN, 2003; TAO; POO; 2001).

Realmente, a agmatina inibe a NOsintase contribuindo com a formação de serotonina (RUIZ-

DURÁNTEZ et al., 2002; REGUNATHAN; PILETZ, 2003).

A estimulação dos heteroreceptores α

–adrenérgicos pré-sináptico liberam

noradrenalina nas estruturas corticolímbica (MILLAN; GOBERT; LEJEUNE, 2000). A

agmatina possui ação agonista nestes receptores, favorecendo a liberação de noradrenalina

(PILETZ et al., 1996 a, b; SANTOS et al., 2003; ONAL et al., 2003).

A inibição da MAO-A provoca a liberação da noradrenalina e serotonina na fenda

sináptica (NOWAKOWSKA; CHODERA, 1997). A agmatina diminui a atividade enzimática

da MAO-A, consequentemente aumenta a concentração de noradrenalina (RAASCH et al.,

1999 a; MacCINNES; HANDLEY, 2001, 2002).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de imobilidade

(s)

Veic 30 50 Imip

100

200

Veículo

Agmatina

Imipramina

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de imobilidade

(s)

Veic 30 50 Imip

100

150

Figura 18. Efeito da agmatina (30 e 50 mg/kg, i.p.) e da imipramina (30 mg/kg, i.p.) no Teste do Nado

Forçada (A) e no Teste Suspensão pela Cauda (B). Cada coluna representa a média de 8-10 animais e

as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos a análise de

variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (*p<0.05

e **p<0.01) quando comparadas ao controle.

Os receptores imidazólicos I

são receptores envolvidos na depressão e estão

aumentados em pacientes deprimidos. Os receptores imidazólicos se ligam aos α

–

adrenérgicos pré-sináptico com efeito inibitório na liberação de noradrenalina. O tratamento

com antidepressivos tricíclicos e agmatina regulam os sítios de ligação destes receptores

favorecendo a liberação de noradrenalina (GARCIA-SEVILLA et al., 1998; GARCIA-

SEVILLA; ESCRIBA; GUIMON, 1999; MOLDERINGS et al., 2000 a, b; HALARIS;

PILETZ, 2003; ARICIOGLU; ALTUNBAS, 2003).

Antagonistas do receptor NMDA favorecem a liberação da serotonina (PILC et al.,

2003 a) e a agmatina, por ser um antagonista do receptor NMDA, favorece a liberação de

serotonina, possuindo ação antidepressiva (GILAD; GILAD, 2000; GIBSON et al., 2002;

ZHU et al., 2003).

O efeito antidepressivo da agmatina pode estar relacionado com a sua ação agonista

endógena dos receptores imidazólicos I

nos receptores α

-adrenérgicos, ou por inibir a

formação do óxido nítrico, ou pela inibição da MAO-A ou por sua ação antagonista nos

receptores NMDA.

Os resultados encontrados no presente estudo confirmam os resultados obtidos por

ZOMKOWSKI et al. (2002), com relação ao efeito antidepressivo da agmatina nos dois

modelos testados (TNF e TSC).

5.1.4 Efeito da agmatina na memória, avaliada no Teste da Esquiva Inibitória (TEI)

No presente estudo procurou-se estudar o efeito da agmatina sobre a memória da

esquiva inibitória, avaliando separadamente as memórias de curta duração (MCD) e na

memória de longa duração (MLD) nas suas várias fases (aquisição, consolidação e evocação).

Verificou-se que, nos experimentos com os tratamentos pré–treino, a agmatina foi amnéstica

para a MLD somente na dose de 30mg/kg, sem alterar a MCD, sugerindo um efeito seletivo no

processo de aquisição da MLD (Figura 19). Esse efeito seletivo sobre a MLD perdurou no

processo de consolidação (Figura 20). Com o tratamento realizado imediatamente após o

treino, a agmatina nas doses de 15 e 30 mg/kg e não na dose de 50 mg/kg marcadamente

prejudicou a consolidação da MLD (p < 0,001) no TEI e em experimentos com a

administração realizada 15 minutos antes do teste, a agmatina não alterou nenhum dos dois

tipos de memória, sugerindo não participar dos processos de evocação tanto da MLD quanto

da MCD (Figura 21).

Recentemente, Stewart e McKay (2000) demonstraram que a agmatina prejudica a

aquisição da memória no modelo de medo contextual quando administrada

intraperitonealmente sugerindo, que a modulação dos receptores NMDA por poliaminas é

importante nesse modelo.

Dados adicionais sobre o papel da agmatina na memória foram obtidos também por

McKay e colaboradores (2002). Eles estudaram os efeitos da agmatina administrada

sistemicamente, usando o water maze como modelo de memória e verificaram que o

tratamento com a agmatina prejudica a evocação.

Baseado nestes dados este estudo deu continuidade às pesquisas sobre as MCD e

MLD, avaliando os efeitos da agmatina sobre a memória no TEI, relacionando seus efeitos

com os sistemas glutamatérgico e oxidonitérgico.

Figura 19. Efeito da administração intraperitoneal da salina e da agmatina (5, 15 e 30 mg/kg) 15

minutos antes do treino (aquisição) sobre a latência da Esquiva Inibitória, nas memórias de curta

duração (barras claras) e de longa duração (barras escuras) testados respectivamente 1,5 e 24 h após a

sessão de treino. Os dados são expressos como medianas, seguido dos intervalos interquativos.

Asteriscos denotam significâncias estatísticas (p<0.05) comparadas com os controles. N= 10-13. Teste

de Mann-Whitney.

Figura 20. Efeito da administração intraperitoneal da salina e da agmatina (5, 15 e 30 mg/kg)

imediatamente após o treino (consolidação) sobre a latência da Esquiva Inibitória, nas memórias de

curta duração (barras claras) e de longa duração (barras escuras) testados respectivamente 1.5 e 24 h

após a sessão de treino. Os dados são expressos como medianas, seguido dos intervalos interquatil.

Asteriscos denotam significâncias estatísticas (p<0.001) comparados com os controles. N= 10-13.

Teste de Mann-Whitney

Figura 21. Efeito da administração intraperitoneal da salina e da agmatina (5, 15 e 30 mg/kg) 15

minutos antes do teste (evocação) sobre a latência da Esquiva Inibitória, nas memórias de curta

duração (barras claras) e de longa duração (barras escuras) testados respectivamente 1.5 e 24 h após a

sessão de treino. Os dados são expressos como medianas, seguido dos intervalos interquatil. N= 10-13.

Teste de Mann-Whitney

Com relação à via glutamatérgica (Figura 22 e 23) foi verificado que o tratamento

com injeção intraperitoneal com antagonista não competitivo do receptor NMDA, o MK801

(0,1 mg/kg) promoveu um déficit estatisticamente significativo (p < 0,05) tanto no processo de

aquisição (Figura 22) quanto no processo de consolidação (Figura 23) das MCD e MLD na

esquiva inibitória. Entretanto, o tratamento com agmatina foi amnéstico somente na MLD e,

interessantemente o pré-tratamento com MK-801 (0,1 mg/kg) potencializou o efeito amnéstico

da agmatina nas duas fases do processo da memória (aquisição e consolidação) estendendo e

ampliando então, as hipóteses sugeridas em trabalhos anteriores de que a agmatina exerça seu

efeito amnéstico através de uma modulação dos receptores de glutamato do tipo NMDA,

localizados principalmente na região hipocampal e para-hipocampal, e essenciais nos processos

de aprendizagem e memória.

Figura 22. Efeito da administração intraperitoneal da agmatina (30 mg/kg) e do MK801 (0,1mg/kg)

na aquisição (15 min antes do treino) das memórias de curta duração (barras claras) e longa duração

(barras escuras) testados respectivamente 1.5 e 24h após a sessão de treino. Os dados são expressos

como medianas, seguido dos intervalos interquatil. Asteriscos denotam significâncias estatísticas

(p<0.05) comparados com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney

Figura 23. Efeito da administração intraperitoneal da agmatina (30 mg/kg) e do MK801 (0,1mg/kg)

na consolidação (imediatamente após o treino) das memórias de curta duração (barras claras) e longa

duração (barras escuras) testados respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de treino. Os dados são

expressos como medianas, seguido dos intervalos interquatil. Asteriscos denotam significâncias

estatísticas (p<0.05) comparados com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney

Com relação à via oxidonitrérgica, os resultados novamente estendem os achados na

literatura de que inibidores da NOsintase produzem prejuízo cognitivo nos animais em vários

modelos de memória, não só em mamíferos como também em outras classes de animais

(ANAGOSTARAS et al., 1999). Os resultados obtidos (Figura 24 A e B) demonstraram que a

N-nitro-L-arginina 10 mg/kg (L-NOARG) promoveu um efeito amnéstico estatisticamente

significante, tanto na aquisição quanto na consolidação das MCD e MLD. Esse efeito foi

revertido pelo pré-tratamento com a L-arginina, o substrato natural da NOsintase na síntese do

óxido nítrico. Igual perfil farmacológico foi encontrado quando se utilizou o pré-tratamento

da L-arginina seguido da administração da agmatina, ou seja, uma significativa reversão do

efeito amnéstico na aquisição e consolidação da MLD. Além disso, quando L-NOARG e

agmatina foram utilizadas concomitantemente, foi observado a potencialização do efeito

amnéstico de forma sinérgica das duas classes de tratamentos utilizados na aquisição da MCD

e MLD, mas somente na consolidação da MLD.

Figura 24. Efeito da administração intraperitoneal da agmatina (30mg/kg), da L-NOARG (10

mg/kg) L-arginina (100 mg/kg) na aquisição (A) e na consolidação (B) das memórias de curta duração

(barras claras) e longa duração (barras escuras) testados respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de

treino. Os dados são expressos como medianas, seguido dos intervalos interquativos. Asteriscos

denotam significâncias estatísticas (p<0.05) comparados com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-

Whitney

Muitas evidências têm apontado a formação hipocampal como região necessária ao

processo de aprendizagem e memória (MAREN, 1998). Os efeitos dos antagonistas do

receptor NMDA sobre a memória sugerem que a atividade desses receptores é um

componente necessário da plasticidade associativa (aquisição) requerida para a subseqüente

expressão de um comportamento (YOUNG; BOHENEK; FANSELOW, 1994). Lesões na

formação hipocampal têm sido mostradas como responsáveis por déficits na memória se

forem feitas imediatamente após sessões de treinamento (ANAGOSTARAS et al., 1999). No

hipocampo, a presença da agmatina em pequenas vesículas no axônio sugere que a amina é

liberada nessa região. Além disso, o fato de os axônios das células hipocampais piramidais

conterem glutamato, também indicam que a agmatina e o L-glutamato sejam co-transmissores

e, portanto, liberados juntos durante a ativação dessas células (REIS; YANG; MILNER,

1998).

O efeito da agmatina sobre a consolidação da memória pode resultar da capacidade

que a poliamina possui em antagonizar os receptores NMDA (McKAY et al., 2002). Esta

hipótese é baseada em outros estudos, os quais mostraram que antagonistas competitivos e

não competitivos de receptores NMDA prejudicam a memória (ZHANG; BAST; FELDON,

2001). Evidências do envolvimento de receptores NMDA em processos de consolidação são

fortemente baseadas em achados experimentais que demonstraram que a infusão de agonistas

de ácido glutâmico exerce sobre a memória efeitos exatamente opostos aos efeitos dos

antagonistas, ou sejam, facilitam a memória. Na tarefa de esquiva inibitória, especificamente,

a infusão de glutamato em regiões como a amígdala, o septo medial e o hipocampo

imediatamente após a sessão de treino promovem a facilitação da memória (IZQUIERDO;

MEDINA, 1997; CASTELLANO; CESTARI; CIAMEI, 2001). Isto indica que os receptores

NMDA estão envolvidos nas primeiras fases do processamento da memória pós-treino, ou

seja, naquela na qual o processo de consolidação ocorre.

O efeito amnéstico da agmatina administrada antes do treino mostrou que os

processos bioquímicos nos quais ela possa estar atuando como moduladora (por exemplo, a

neurotransmissão glutamatérgica através dos receptores NMDA) são também necessários para

aquisição da MLD da esquiva inibitória em ratos. Isto é compatível com muitos achados

experimentais que demonstraram que alguns mecanismos NMDA-dependentes medeiam a

aquisição da memória em vários modelos animais (MORRIS et al., 1986, MORRIS; DAYS,

2001; XU et al., 2001). Izquierdo e colaboradores (1997) demonstraram que a aquisição da

memória da esquiva inibitória é totalmente dependente da atividade dos receptores NMDA.

Maren e Baudry (1995) demonstraram que a atividade dos receptores NMDA é imprescindível

para a aquisição da memória no modelo de medo contextual. Tais resultados também podem

ser transferidos a modelos de memória como o labirinto aquático, o water maze (MORRIS;

DAYS, 2001) entre outros. Os resultados encontrados ampliam os achados na literatura sobre a

modulação da agmatina no sistema NMDA-glutamato, o que é demonstrado quando a co-

administração do MK801 potencializa o seu efeito amnéstico.

A agmatina, quando administrada antes da sessão de teste não produziu qualquer

efeito sobre a evocação da memória de esquiva inibitória em nenhuma das duas modalidades

estudadas aqui, a MLD e a MCD. Entretanto, estudos recentes têm mostrado antagonistas de

receptores para o glutamato do tipo NMDA, AMPA ou receptores metabotrópicos quando

infundidos na região CA1 do hipocampo, ou no córtex entorrinal bloquearam a evocação da

memória de esquiva inibitória em ratos (BARROS et al., 2000) sugerindo que em tais regiões o

próprio glutamato é necessário para o processo.

A agmatina pode induzir de forma concentração dependente um bloqueio nos canais

iônicos do receptor NMDA (REIS; REGUNATHAN, 2000). O efeito dela quando estudado

em culturas de células piramidais do hipocampo é seletivo para os receptores NMDA e não

afeta a estabilidade de receptores AMPA ou kainato (YANG; REIS, 1999).

Desta forma, este efeito seletivo da agmatina somente em receptores NMDA pode

explicar em parte a sua ineficácia em interferir no processo de evocação da MCD e da MLD,

uma vez que este processo requer mecanismos bioquímicos muito semelhantes ao que o

cérebro utiliza nos processo de aquisição e consolidação da memória (SUSAN-SARA, 2000;

BARROS et al., 2000).

Outra questão analisada neste estudo foi o papel da agmatina como potencial inibidor

da síntese de óxido nítrico (STEWART; McKAY, 2002). Interessantemente, a agmatina é um

inibidor de todas as isoformas de NOsintases (GALEA et al 1996). A inibição ocorre de

forma dose dependente com o substrato da NOsintase, a L-arginina. Vários estudos têm

apontado o papel do óxido nítrico como um dos “mensageiros retrógrados” no processo de

potenciação de longa duração (LTP) e memória, participando respectivamente na manutenção

dos sistemas (IZQUIERDO; McGAUGH, 2000) e, os inibidores do óxido nítrico bloqueiam

não só a formação da memória como também da LTP (BLOKLAND et al., 1999). Os

resultados confirmam e estendem os achados na literatura. A administração da L-NOARG

inibidor a síntese de óxido nítrico produziu o efeito amnéstico tanto na MLD quanto na MCD

da esquiva inibitória e que foi revertido com o pré-tratamento com a L-arginina, sugerindo

que seu efeito também possa estar relacionado com a inibição de óxido nítrico.

De uma forma geral os resultados obtidos até o momento sobre os efeitos da agmatina

nas MCD e MLD indicam que se processam de forma independente. Além disso, a agmatina

pode estar modulando a memória da esquiva inibitória através das vias oxidonitrérgica e

glutamatérgica, entretanto estudos posteriores serão necessários para a melhor compreensão

desses processos de modulação.

5.2 Resultados obtidos com as imidas cíclicas

Os resultados a seguir referem-se aos efeitos das duas classes de imidas cíclicas,

maleimidas e succinimidas quando testadas em modelos farmacológicos (alguns deles já

vistos anteriormente) utilizados na seleção de substâncias psicotrópicas.

5.2.1 Efeito das imidas cíclicas sobre os parâmetros comportamentais no Teste do

Campo Aberto (TCA)

As Tabelas 2 e 3 representam os resultados das imidas cíclicas no TCA. Nestes

experimentos foram utilizados a cafeína (3 mg/kg) e o haloperidol (2,5 mg/kg) como

controles positivos. O haloperidol foi usado por diminuir a movimentação dos animais e a

cafeína por exercer um efeito oposto devido as suas propriedades psicoestimulantes (De

SOUZA et al., 2003).

Os compostos imídicos NFM e NO

NFM tiveram um mesmo perfil farmacológico

produzindo diminuição dos parâmetros comportamentais do modelo, o número de

cruzamentos (crossings) e o número de atividades exploratórias (representadas pelos

rearings) quando comparado ao controle negativo salina. No que diz respeito ao número de

crossing, o tratamento com o composto NFM promoveu a redução deste parâmetro de

maneira dose-dependente (F

(2,630)

= 82,745, p < 0,05) (Tabela 2 A). Da mesma forma que nos

cruzamentos, o tratamento com o composto NFM promoveu uma redução da atividade

exploratória (rearing) nas doses utilizadas (F

(2,630)

= 104,60, p < 0,05) conforme mostra a

Tabela 2 B. Com relação ao número de cruzamentos, o tratamento com o composto NO

NFM

promoveu a redução deste parâmetro de maneira dose-dependente quando comparado com o

controle negativo salina (F

(2,627)

= 49,245, p < 0,01) (Tabela 2 A). O tratamento também

promoveu redução parâmetro rearing de maneira dose-dependente quando comparado ao

controle negativo (F

(2,627)

= 61,199, p < 0,05) (Tabela 2 B).

O composto imídico MeNFM promoveu alterações estatisticamente significativas nos

dois parâmetros comportamentais analisados. Em relação ao número de cruzamentos a

redução deste parâmetro ocorreu de maneira dose-dependente quando comparado com o

controle negativo salina (F

(2,648)

= 60,299, p < 0,01) (Tabela 2 A). Da mesma forma que o

número de rearing (F

(2,616)

= 31,633, p < 0,05) conforme mostra a Tabela 2 B.

Observou-se que com o tratamento com o composto 1NFS houve modificação

estatisticamente significante na atividade locomotora e exploratória dos animais somente na

dose de 30 mg/kg (F

(2,604)

= 55,510, p < 0,05 e F

(2,604)

= 28,385, p < 0,01) (Tabela 3 A e B).

Nas doses de 5 e 15 mg/kg não houve diminuição da atividade locomotora e exploratória dos

animais. O composto 2NFS não produziu alterações nos parâmetros analisados (crossing e

rearing) quando comparado com o controle negativo (Tabela 3 A e B).

Com relação aos efeitos dos compostos sobre a atividade motora pode-se sugerir que

os compostos aqui testados exibem um perfil farmacológico semelhante ao haloperidol

podendo ter alguma atividade como agentes antipsicóticos se testados em modelos animais

específicos para neurolépticos.

New e colaboradores (1988) em um trabalho bem conduzido com imidas cíclicas com

propriedades neurolépticas, mostraram que a afinidade dos compostos imídicos testados por

eles com os receptores D

, assim como as suas habilidades em reverter a estereotipia induzida

pela apomorfina e a catalepsia induzida por neuroléptico, era dependente das propriedades de

lipofilicidade e das características eletrônicas dos substituintes situados no anel imídico.

De fato, o composto maleimídico MeNFM foi o composto mais lipofílico de sua classe

e com efeito mais pronunciado do que o haloperidol. No entanto, com as succinimidas a

lipossolubilidade

parece não exercer tanta influência na atividade, embora o composto 2NFS seja mais

lipofílico que sua base 1NFS, não foi observado quaisquer efeitos no modelo utilizado.

Tabela 2. Efeitos das maleimidas (NFM, NO2NFM e MeNFM) sobre os parâmetros

comportamentais (crossing) e (rearing) do Teste no Campo Aberto.

Tratamento

(mg/kg)

Crossing

(A)

Rearing

(B)

Veículo – 0,0

NFM – 3,0

NFM – 10,0

NFM – 30,0

Cafeína - 3,0

Haloperidol – 2,5

62,67 ± 2,34

39,12 ± 2,72 **

17,37 ± 4,65 **

17,12 ± 3,81 **

77,75 ± 3,45 **

13,40 ± 1,70 **

39,91 ± 1,48

17,25 ± 2,54 **

1,55 ± 0,86 **

0,77 ± 0,36 **

44,25 ± 4,41

14,9 ± 2,16 **

Veículo – 0,0

NFM – 6,0

NFM – 10,0

NFM – 30,0

Cafeína – 3,0

Haloperidol – 2,5

62,67 ± 2,34

36,16 ± 2,50 **

27,27 ± 3,80 **

12,88 ± 2,90 **

77,75 ± 3,45 *

13,4 ± 1,70 **

40,88 ± 1,46

12,53 ± 2,08 **

2,1 ± 1,02 **

1,45 ± 0,56 **

44,25 ± 4,41

14,9 ± 2,16 **

Veículo – 0,0

MeNFM – 6,0

MeNFM – 10,0

MeNFM – 30,0

Cafeína – 3,0

Haloperidol – 2,5

59,87 ± 2,52

36,75 ± 5,31 **

36,5 ± 6,03 **

22,5 ± 3,33 **

77,75 ± 3,45 **

13,4 ± 1,70 **

39,4 ± 1,86

15,25 ± 3,03 **

12,25 ± 4,19 **

2,62 ± 1,41**

44,25 ± 4,41

14,9 ± 2,16 **

Efeito das maleimidas NFM (3, 10 e 30 mg/kg), NO2NFM e MeNFM (6, 10 e 30 mg/kg) nos

parâmetros crossing e rearing no Teste do Campo Aberto. Os animais foram tratados com salina e os

composto 30 min antes do teste. Cada coluna representa os erros padrões da média (EPM). Os dados

foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam

diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01). N = 8-10 animais.

Tabela 3. Efeitos das succinimidas (1NFS e 2NFS) sobre os parâmetros comportamentais

crossing e rearing do Teste no Campo Aberto.

Tratamento

(mg/kg)

Crossing

(A)

Rearing

(B)

Veículo – 0,0

1NFS – 5,0

1NFS – 15,0

1NFS – 30,0

Cafeína – 3,0

Haloperidol - 2,5

45,00 ± 1,77

8,88 ± 3,98

41,12 ± 3,28

22,55 ± 3,49 **

77,75 ± 3,45 **

13,4 ± 1,70 **

21,50 ± 2,14

30,66 ± 2,74

20,75 ± 3,03

1,22 ± 0,99 **

44,25 ± 4,41 **

14,90 ± 2,16

Veículo – 0,0

2 NFS – 5,0

2 NFS – 15,0

2 NFS – 30,0

Cafeína – 3,0

Haloperidol - 2,5

45,00 ± 1,77

36,44 ± 2,85

44,33 ± 3,42

35,44 ± 3,17

77,75 ± 3,45 **

13,40 ± 1,70 **

21,50 ± 2,14

24,88 ± 3,40

25,66 ± 3,90

21,22 ± 2,65

44,25 ± 4,41 **

14,90 ± 2,16

Efeito das succinimidas 1NFS e 2NFS (5, 15 e 30 mg/kg) nos parâmetros comportamentais crossing e

rearing no Teste do Campo Aberto. Os animais foram tratados com salina e os composto 30 min antes

do teste. Cada coluna representa os erros padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos à

análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes

comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01). N = 8-10 animais.

5.2.2 Efeito das imidas cíclicas na ansiedade, avaliadas através do Teste do Labirinto em

Cruz Elevado (LCE)

A propriedade ansiolítica é talvez, a mais explorada com relação às propriedades

centrais de compostos imídicos cíclicos, principalmente após os excelentes resultados

terapêuticos da buspirona e suas vantagens aos benzodiazepínicos e barbitúricos no tratamento

dos vários tipos de ansiedade (MALINKA, et al., 1999; KOSSAKOWSKI; HEJCHMAN,

2003).

Os resultados descritos abaixo são decorrentes dos experimentos realizados com os

compostos em estudo no modelo de ansiedade animal, o LCE em camundongos.

O composto imídico NFM aumentou o tempo em que os animais permaneceram nos

braços abertos de forma estatisticamente significante na dose de 30 mg/kg quando comparado

com o controle negativo (F

(2,537)

= 10,831, p < 0,01) (Figura 25 A). Da mesma forma o

composto também aumentou a freqüência de entradas nestes braços nas doses de 10 e 30

mg/kg, sendo estatisticamente significante na dose de 30 mg/kg (F

(2,530)

= 9,424, p < 0,01)

(Figura 25 B). Por outro lado o composto diminuiu o tempo que o animal permaneceu nos

braços fechados na dose de 30 mg/kg (F

(2,530)

= 9,415, p < 0,01), bem como o número de

entradas (F

(2,530)

=7,425, p < 0,01) como está demonstrado na Figura 25 C e D.

O tratamento com o composto NO

NFM não promoveu alteração dos parâmetros

observados quando comparado com os controles negativos (Figura 25 A, B, C e D). O mesmo

perfil farmacológico do composto NO

NFM foi observado com o composto MeNFM (Figura

26 A, B, C e D).

O composto 1NFS promoveu aumento do tempo gasto nos braços abertos (30 mg/kg)

estatisticamente significante quando comparado com o controle negativo (F

(2,552)

= 8,502, p <

0,05) conforme mostra a Figura 28 A. O mesmo ocorreu com o número de entradas (F

(2,537)

4,719, p < 0,01) (Figura 28 B). O composto não alterou o tempo e o número de entradas no

braço fechado.

Finalmente, o composto 2NFS promoveu aumento do tempo gasto nos braços abertos

de forma estatisticamente significante quando comparado com o controle negativo na dose de

30 mg/kg (F

(2,537)

= 10,831, p < 0,05) conforme mostra a Figura 29 A. O composto também

aumentou de forma significativa o número de entradas nas doses de 5 e 30 mg/kg (F

(2,534)

4,995, p < 0,01) (Figura 29 B).

Também diminuem a frequência de entradas nos braços fechados nas doses de 5 e 30

mg/kg (F

(2,536)

= 5,259, p < 0,01) (Figura 29 D).

Vale ressaltar que com o controle positivo diazepam foi observado claramente o seu

efeito ansiolítico confirmando os trabalhos de Pellow e colaboradores (1985).

Os resultados em conjunto sugerem, que do grupo de maleimidas testadas, somente o

composto NFM exibiu perfil ansiolítico, enquanto que, as succinimidas, 1NFS e 2NFS são

ansiolíticas, havendo uma predominância de efeitos do grupo base sobre o grupo modificado.

Com relação as maleimidas, o composto mais lipossolúvel e com maior probabilidade

de atravessar a barreira hematoencefálica (MeNFM) não exibiu qualquer efeito.

Parece que nos compostos testados a adição dos grupamentos NO

e CH

interferem na

atividade ansiolítica uma vez que, o composto-mãe NFM exibe tal propriedade.

As imidas cíclicas vêm despertando muito interesse por parte dos pesquisadores, pois a

buspirona é bastante utilizada como ansiolítico. Seu mecanismo de ação baseia-se na redução

da neurotransmissão de R - 5-TH

por agir como agonista parcial nos receptores pré-

sinápticos, terapeuticamente, sua ativação resulta em diminuição da ativação dos neurônios

serotoninérgicos (5-HT). Entretanto, são necessários dias ou semanas para que a buspirona

produza seu efeito farmacológico e é ineficaz no controle dos episódios de pânico (LUCKI,

1992).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços abertos (s)

Veic 6 10 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços abertos (%)

Veic 6 10 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços fechados (s)

Veic 6 10 30 DZP

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços fechados

(%)

Veic 6 10 30 DZP

100

Figura 25. Efeito do composto NFM (6-30 mg/kg, i.p.) e do diazepam (0,75 mg/kg, i.p.) sobre o tempo

de permanência (A) e a percentagem de frequência (B) nos braços abertos, tempo de permanência (C) e

percentagem de frequência (D) nos braços fechados do LCE. Cada coluna representa a média de 8-10

animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos à

análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes

comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços abertos (s)

Veic 6 10 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços abertos (%)

Veic 6 10 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços fechados (s)

Veic 6 10 30 DZP

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços fechados

(%)

Veic 6 10 30 DZP

100

Figura 26. Efeito do composto NO2NFM (6-30 mg/kg, i.p.) e do diazepam (0,75 mg/kg, i.p.) sobre o

tempo de permanência (A) e a percentagem de frequência (B) nos braços abertos, tempo de

permanência (C) e percentagem de frequência (D) nos braços fechados do LCE. Cada coluna

representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os

dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos

indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços abertos (s)

Veic 6 10 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços abertos (%)

Veic 6 10 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços fechados (s)

Veic 6 10 30 DZP

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços fechados

(%)

Veic 6 10 30 DZP

100

Figura 27. Efeito do composto MeNFM (6-30 mg/kg, i.p.) e do diazepam (0,75 mg/kg, i.p.) sobre o

tempo de permanência (A) e a percentagem de frequência (B) nos braços abertos, tempo de

permanência (C) e percentagem de frequência (D) nos braços fechados do LCE. Cada coluna

representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os

dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos

indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços abertos (s)

Veic 5 15 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços abertos (%)

Veic 5 15 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços fechados (s)

Veic 5 15 30 DZP

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços fechados

(%)

Veic 5 15 30 DZP

100

Figura 28. Efeito do composto 1NFS (5-30 mg/kg, i.p.) e do diazepam (0,75 mg/kg, i.p.) sobre o

tempo de permanência (A) e a percentagem de frequência (B) nos braços abertos, tempo de

permanência (C) e percentagem de frequência (D) nos braços fechados do LCE. Cada coluna

representa a média de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os

dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos

indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços abertos (s)

Veic 5 15 30 DZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços abertos (%)

Veic 5 15 30 SZP

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência

nos braços fechados (s)

Veic 5 15 30 DZP

100

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Frequência de entradas

nos braços fechados

(%)

Vei 5 15 30 DZP

100

Figura 29. Efeito do composto 2NFS (5-30 mg/kg, i.p.) e do diazepam (0,75 mg/kg, i.p.) sobre o

tempo (A) e a percentagem de freqüência (B) nos braços abertos e o tempo (C) e a percentagem de

freqüência (D) nos braços fechados do LCE. Cada coluna representa a média de 8-10 animais e as

barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos a análise de

variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes

comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

5.2.3 Efeito das imidas cíclicas na depressão, avaliadas no Teste da Suspensão pela

Cauda (TSC) e no Teste do Nado Forçado (TNF)

A depressão tem sido considerada atualmente como o grande “mal do século” tirando

do mercado de trabalho milhares de indivíduos (D’AS; DUMAN, 2002). Apesar de anos de

estudo, as bases biológicas da depressão e o preciso mecanismo da eficácia dos

antidepressivos permanece desconhecido. Estudos atuais têm focado modificações das

concentrações de neurotransmissores bem como, a população de seus receptores (DUMAN et

al., 2000). Os resultados desses estudos refletem na realidade observada entre a necessidade da

administração crônica dos antidepressivos, embora seus efeitos sobre as sinapses (inibição da

MAO e inibição da recaptação) ocorram imediatamente (MANJII; DREVETS; CHARNEY,

2001).

Diversas etapas para o entendimento da depressão têm sido vencidas com estudos

focalizando a regulação de vias de sinalização e plasticidade celular (D’AS; DUMAN, 2002).

Desta forma, por tratar-se de uma doença neuropsiquiátrica de fundamental importância, a

pesquisa de compostos com atividade antidepressiva também é uma constante nos laboratórios

do mundo inteiro.

Os resultados descritos a seguir referem-se aos dados obtidos com os compostos

imídicos avaliados nos modelos de depressão, o TNF e o TSC.

O TNF é um dos mais utilizados e mais aceito na seleção de compostos com

propriedades antidepressivas (PORSOLT; Le PICHON; JALFRE, 1977) enquanto que o TSC

trata-se de um modelo mais recente (VAUGEOIS et al., 1997). Ambos os testes se baseiam no

comportamento e imobilidade do animal após a exposição de uma situação e a analogia é feita

com os sintomas dos pacientes com depressão maior.

Com relação aos compostos em estudo (Tabela 4), o composto NFM promoveu

diminuição do tempo de imobilidade dos animais quando comparado com o controle negativo

no TSC (F

(2,536)

= 21,428, p < 0,05) (Tabela 4 A). O mesmo perfil farmacológico foi observado

no TNF (F

(2,,461)

= 8,276, p < 0,05) (Tabela 4 B). Por outro lado, o composto NO

NFM

produziu aumento do tempo de imobilidade no TSC (Tabela 4 C) e no TNF (F

(2,461)

= 24,484, p

< 0,05) (Tabela 4 D). O composto MeNFM aumentou o tempo de imobilidade no TSC (F

(2,519)

= 28,111, p < 0,05) e no TNF (F

(2,458)

= 11,537, p < 0,05) (Tabela 4 E e F).

Tabela 4. Efeitos das maleimidas NFM, NO2NFM e MeNFM nos Testes Suspensão

pela Cauda e Teste do Nado Forçado.

Tratamento

(mg/kg)

Suspensão pela Cauda

(A)

Nado Forçado

(B)

Veículo – 0,0

NFM – 5,0

NFM – 15,0

NFM – 30,0

Imipramina – 30,0

92,70 ± 7,29

151,44 ± 11,57 **

142,33 ± 8,97 *

134,60 ± 13,80 **

44,60 ± 7,19 **

111,33 ± 10,66

173,87 ± 7,52

97,70 ± 13,96

122,80 ± 9,18 **

112,80 ± 3,20 **

Veículo – 0,0

NO2NFM – 5,0

NO2NFM –15,0

NO2NFM – 30,0

Imipramina – 30,0

110,61 ± 6,99

124,53 ± 11,04

145,50 ± 10,39 *

152,69 ± 9,94 **

44,60 ± 7,19 **

111,33 ± 9,94

37,87 ± 10,30 **

39,60 ± 5,51 **

118,80 ± 9,09

112,80 ± 3,20 **

Veículo – 0,0

MeNFM – 5,0

MeNFM – 15,0

MeNFM – 30,0

Imipramina – 30,0

115,92 ± 6,75

123,25 ± 10,21

166,83 ± 9,37 **

172,91 ± 11,55 **

44,60 ± 7,19 **

11,33 ± 10,66

64,22 ± 16,04 *

84,30 ± 6,65

150,70 ± 9,99 *

112,80 ± 3,20 **

Efeito das maleimidas NFM (10, 15 e 30 mg/kg), NO2NFM (5, 15 e 30 mg/kg) e MeNFM (5, 15 e 30

mg/kg) nos TSC e TNF. Os animais foram tratados com salina e os composto 30 min antes do teste.

Cada coluna representa os erros padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos a análise de

variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes

comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0.01).

Das succinimidas testadas, o composto 1NFS exibiu perfil antidepressivo no TSC

(2,537)

= 20,258, p < 0,05) e no TNF (F

(2,461)

= 39,460, p < 0,05) (Tabela 5 A e B) de forma

estatisticamente significante. Já com o composto 2 NFS o tratamento dos animais promoveu

aumento do parâmetro no TNF com todas as doses utilizadas (F

(2,452)

= 11,600, p < 0,05) não

alterando o comportamento dos animais no TSC. Em todos os modelos de depressão

utilizados no presente trabalho o controle positivo imipramina (30 mg/kg), um antidepressivo

tricíclico de referência para o tratamento farmacológico da depressão, produziu o mesmo

efeito obtido anteriormente por Porsolt, Bertin e Jalfre (1978) no TNF. (Tabela 5 B). Somente

a succinimida 1NFS na dose de 30 mg/kg promoveu um perfil farmacológico superior a

imipramina.

Tabela 5. Efeitos das succinimidas 1NFS e 2NFS nos Testes Suspensão pela Cauda e

no Teste do Nado Forçado.

Tratamento

(mg/kg)

Suspensão pela cauda

(A)

Nado Forçado

(B)

Veículo – 0,0

1NFS – 5,0

1NFS – 15,0

1NFS – 30,0

Imipramina – 30,0

129,30 ± 6,81

124,44 ± 8,38

82,10 ± 15,10 **

28,37 ± 9,19 **

44,60 ± 7,19 **

147,80 ± 9,44

183,37 ± 7,89 *

101,90 ± 5,96 **

66,22 ± 7,86 **

112,80 ± 3,20 **

Veículo – 0,0

2NFS – 5,0

2NFS – 15,0

2NFS – 30,0

Imipramina – 30,0

108,63 ± 8,53

101,16 ± 9,19

110,75 ± 10,04

114,81± 9,55

44,60 ± 7,19 **

147,80 ± 9,44

87,00 ± 3,07 **

97,70 ± 5,05 **

108,20 ± 10,88 **

112,80 ± 3,20 **

Efeito das succinimidas 1NFS (5, 15 e 30 mg/kg) e 2NFS (5, 15 e 30 mg/kg) nos TSC e TNF. Os

animaisforam tratados com salina e os composto 30 min antes do teste. Cada coluna representa os

erros padrões da média (EPM). Os dados foram submetidos a análise de variância ANOVA seguido do

teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p<

0,05 e **p<0.01).

Os efeitos biológicos das maleimidas e compostos relacionados são estudados há

muitos anos. As maleimidas apresentaram uma importante atividade analgésica e

antiespasmódica, quando testadas em diversos modelos experimentais “in vivo” e “in vitro”.

A introdução de grupos elétron-doadores no anel aromático tais como 4-OCH

3,4 (OCH

)

4-CH

aumentou a atividade analgésica. Ao contrário, a introdução de 4-Cl, um átomo

elétron-sacador, diminuiu a atividade analgésica, indicando que parâmetros eletrônicos podem

estar envolvidos na atividade observada e que, grupos elétron-doadores aumentam o efeito

(CECHINEL FILHO, 1995; ANDRICOPULO, 1998 a, b; BUZZI; CORRÊA; CECHINEL

FILHO, 2003).

Com relação as maleimidas utilizadas, os parâmetros eletrônicos parecem não estar

envolvidos com o efeito dos compostos nos testes de depressão, uma vez que grupos

sacadores e doadores de elétrons estão respectivamente presentes nos compostos NO2NFM e

MeNFM e ambos apresentaram o mesmo perfil farmacológico. Por outro lado, as

succinimidas em trabalhos anteriores apresentaram em geral, atividade antimicrobiana,

antiespasmódica e analgésica inferior aquelas observadas para as correspondentes maleimidas

(CECHINEL FILHO; CORRÊA; CAMPOS, 2003). No presente trabalho, com relação à

atividade antidepressiva, ambos os grupos mostraram efeitos bastante semelhantes. Isto

sugere que os efeitos antidepressivos dos compostos são mediados por mecanismos distintos

daqueles observados para os efeitos analgésicos. A possível relação entre a atividade

analgésica e antidepressiva está na observação de que vários agentes com comprovada

propriedade antidepressiva têm sido utilizados terapeuticamente na redução de processos

dolorosos intensos (DUMAN; NAKAGAWA; MALBERG, 2001).

Além disso, é sabido que a serotonina e as monoaminas como a noradrenalina e

dopamina, todas envolvidas no processo de depressão, também o são, com relação a

modulação da dor.

5.2.4 Efeito das imidas cíclicas na convulsão, avaliadas no Teste da Convulsão Induzida

por Pentilenotetrazol (TPTZ) e Convulsão Induzida pela Estricnina (TEST)

As Figuras 30, 31 e 32 referem-se, respectivamente, aos resultados obtidos no TPTZ e

TEST, após o tratamento com os compostos imídicos NFM, NO

NFM, MeNFM, 1NFS e

2NFS e/ou controles negativos e positivo. Como controle positivo foi utilizado o fenobarbital,

que é muito usado na terapêutica convulsiva.

Com relação as maleimidas, no TPTZ o composto NFM promoveu aumento da latência

para a crise convulsiva de forma estatisticamente significante e dose-dependente quando

comparado com o controle negativo (F

(2,503)

= 188,16, p < 0,05) conforme mostra a Figura 30

A. O mesmo perfil farmacológico foi observado no TEST ((F

(2,510)

= 20,527, p < 0,01) (Figura

30 B).

O composto NO

NFM também promoveu aumento da latência para a crise convulsiva

nas doses de 30 e 60 mg/kg quando comparado com o controle (F

(2,522)

= 1001,7, p < 0,01)

(Figura 31 A). Já no TEST o composto NO

NFM aumentou a latência para a crise convulsiva

de forma estatisticamente significante e dose-dependente (F

(2,516)

= 25,354, p < 0,01) (Figura

31 B).

A maleimida NO2NFM no TEST demonstrou possuir ação anticonvulsivante superior

ao controle positivo fenobarbital nas doses utilizadas. Já a maleimida MeNFM foi superior nas

doses de 30 e 60 mg/kg.

O composto MeNFM promoveu aumento da latência para a crise convulsiva de forma

estatisticamente significante nas doses 30 e 60 mg/kg quando comparado com o controle

negativo respectivamente nos dois modelos testados (F

(2,515)

= 1764,3, p < 0,01); F

(2,519)

33,137, p < 0,01) (Figura 32 A e B).

Com relação aos compostos succinimídicos não promoveram efeito significativo em

aumentar a latência para a crise convulsiva nos dois modelos aqui utilizados (Figura 33 A e B;

34 A, B).

O TPTZ e TEST são testes utilizados para a seleção de fármacos com ação

anticonvulsivante por serem modelos simples e muito eficazes. Como anteriormente relatado,

o PTZ é uma substância que age nos canais de cloreto do receptor GABA

bloqueando e

impedindo a ação inibitória central do neurotransmissor GABA, provocando crise convulsiva

tônica clônica generalizada. A estricnina é um antagonista competitivo dos receptores de

glicina que age promovendo a diminuição dos efeitos inibitórios da glicina sobre o SNC

acarretando uma crise convulsiva intensa que leva os animais geralmente ao óbito (De

SOUZA et al., 2003).

Epilepsia é uma condição neurológica relativamente comum afetando de 0,4 a 1% da

população mundial (cerca de 100 milhões de pessoas). Os fármacos antiepiléticas

convencionais fenobarbital, primidona, fenitoína, carbamazepina, valproato, e

benzodiazepínicos são abundantemente distribuídos, mas a eles são atribuídos uma grande

quantidade de efeitos adversos e/ou colaterais. Também há um significante grupo de pacientes

(20 a 30%) que são resistentes ao tratamento farmacológico, restando a neurocirurgia como

única opção de terapia. Durante a década passada vários novos fármacos foram aprovados para

o uso: felbanato, fosfenitoína, gabapentina, lamotrogina, oxcarbamazepina, tiagabina,

topiramato, vigabatrina e zonisamida. E, atualmente, encontram-se em processo de aprovação

drogas como: pregabalina, remacemida, rufinamida, licarbazepina, retigabina (MALAWSKA;

2003; MALAWSKA; SCATTURIN, 2003).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

a convulsão (s)

Veic 10 30 60 Feno

1000

2000

3000

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 10 30 60 Feno

100

200

300

Figura 30. Efeito anticonvulsivante da imida NFM (A e B) (10-60 mg/kg, i.p.) e do fenobarbital (50

mg/kg, i.p.) sobre a Convulsão Induzida por PTZ (A) e Estricnina (B). Cada coluna representa a média

de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram

submetidos à análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças

significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 10 30 60 Feno

1000

2000

3000

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 10 30 60 Feno

100

200

300

Figura 31. Efeito anticonvulsivante da imida NO2NFM (10-60 mg/kg, i.p.) e do fenobarbital (50

mg/kg, i.p.) sobre a Convulsão Induzida por PTZ (A) e Estricnina (B). Cada coluna representa a média

de 8-10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram

submetidos à análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças

significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 10 30 60 Feno

1000

2000

3000

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 10 30 60 Feno

100

200

300

Figura 32. Efeito anticonvulsivante da imida MeNFM (10-60 mg/kg, i.p.) e do fenobarbital (50

mg/kg, i.p.) sobre a Convulsão induzida por PTZ (A) e Estricnina (B). Cada coluna representa a média

de 8-10 experimentos e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram

submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças

significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 5 15 30 Feno

1000

2000

3000

4000

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 5 15 30 Feno

100

200

Figura 33. Efeito anticonvulsivante da imida 1NFS (5-30 mg/kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/kg,

i.p.) sobre a Convulsão Induzida por PTZ (A) e Estricnina (B). Cada coluna representa a média de 8-

10 experimentos e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram

submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças

significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 5 15 30 Feno

1000

2000

3000

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Tempo de latência para

convulsão (s)

Veic 5 15 30 Feno

100

200

Figura 34. Efeito anticonvulsivante da imida 2NFS (5-30 mg/kg, i.p.) e do fenobarbital (50 mg/kg,

i.p.) sobre a Convulsão Induzida por PTZ (A) e Estricnina (B). Cada coluna representa a média de 8-

10 experimentos e as barras verticais indicam os erros padrões da média (EPM). Os dados foram

submetidos a análise de variância ANOVA seguido do teste de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças

significantes comparadas com o grupo veículo (* p< 0,05 e **p<0,01).

Os fármacos antiepiléticos pertencem a diferentes classes de compostos químicos. Os

elementos estruturais mais comuns em ordem de geração clinicamente efetivos são os

derivados da hidantoína, oxazolidinadionas, succinimidas e glutarimidas podendo ser definidas

como um sistema de nitrogênio heteroatômico ligado a um ou dois anéis fenil a pelo menos

um grupo carbonila (WONG; DEFINA; ANDREWS, 2003; MALAWSKA, 2003).

Muitos trabalhos indicam que a presença de pelo menos uma unidade aril, um ou dois

átomos doadores de elétrons e/ou um grupo NH em um arranjo espacial especial, parecem ser

necessários para a estrutura de um fármaco anticonvulsivante (CAMERMAN; CAMERMAN,

1980).

Em geral, a eficácia dos anticonvulsivantes é devido a vários mecanismos como a

potencialização de mecanismos inibitórios centrais (GABAérgicos) ou inibição dos

mecanismos excitatórios centrais (glutamatérgicos). Além disso, tais compostos podem agir

inibindo a excessiva descarga da membrana via canais de Ca

, Na

ou K

. Muitos desses

agentes possuem múltiplas ações (mais de um dos mecanismos acima indicados) contribuindo

para as suas eficácias. Entretanto, nenhum deles é ideal para os diversos tipos de crises,

havendo a necessidade de várias associações com o uso crônico. Então, a pesquisa e a

descoberta de novos medicamentos anticonvulsivantes continua ser uma área promissora de

investigação em química medicinal (MALAWSKA, 2003).

Ácidos barbitúricos levaram a proposta de um modelo (de compostos) geral para

anticonvulsivantes compreendendo dois anéis aromáticos ou seu equivalente em uma

orientação espacial favorecida, e uma terceira região, usualmente uma uréia cíclica, contendo

um número de hidrogênio ligando os grupos funcionais. A colocação específica de grupos de

hidrogênio ligantes nessa região parece ser de menor importância do que o correto arranjo

conformacial dos elementos hidrofóbicos (WONG; DEFINA; ANDREWS, 2003).

Muitos dos fármacos clinicamente usados não têm sido ligados a um elemento de

recepção central um receptor através de testes de ligantes marcados. Entretanto, suas

efetividades podem ser conduzidas pela seleção “in vivo” com animais. Dois testes utilizados

para seleção de anticonvulsivantes são o Teste do Eletrochoque (TEC) e o Modelo da

Convulsão Induzida pelo PTZ (TPTZ). Esses testes são respectivamente específicos para

detectar compostos com atividade contra as crises generalizadas tônico-clônica (Grande Mal) e

crises generalizadas do tipo ausência (Pequeno Mal). A fórmula estrutural requerida de um

composto para o TEC parece ser a presença de um grupo hidrofóbico grande, o qual encontra-

se próximo a dois átomos doadores de elétrons. Para a atividade no TPTZ o grupo hidrofóbico

requerido pode ser de menor tamanho, porém também encontrar-se próximo a pelo menos dois

átomos doadores de elétrons (MALAWSKA, 2003).

Como de um modo geral, os compostos com atividade no TPTZ, tem seus mecanismos

de ação envolvendo a via GABAérgica. Tal estrutura requerida pode estar modulando de

alguma forma os receptores GABA em seus determinados sítios de ligação. Embora o fato

acima descrito seja levado em consideração, ele não se aplica aos compostos aqui em estudo.

Tanto compostos com átomos sacadores quanto doadores de elétrons aqui testados foram

efetivos no TPTZ. Desta forma, há a necessidade de modificações diferentes na estrutura geral,

resultando outros compostos para que seja realizado uma análise mais detalhada da estrutura-

atividade.

Muitos estudos com compostos imídicos estão sendo realizados. Stratford e Curley

(1983) sintetizaram uma série de imidas cíclicas aminometil-substituídas baseados na 2,5-

pirrolidinediona (X = CH2, sucinimida) e 2,4-imidazolidinediona (X = NH, hidantoína). Os

compostos foram designados baseados na interação potencial com o receptor do ácido gama-

aminobutírico (GABA) e avaliados a sua atividade anticonvulsivante. Todos os compostos

testados mostraram significante atividade anticonvulsivante nos TPTZ e no TEC em

camundongos.

Goehring e colaboradores (1990) pesquisaram benzilglutarimidas com promissores

resultados na atividade anticonvulsivante.

O Instituto de Química Geral na Universidade Tecnológica de Lodz, Polônia pesquisou

derivados da fenilsucinimida, onde constatou-se que dos 27 compostos analisados 12

apresentaram atividade no EC (KWIATKOWSKI; KAROLAK-WOJCIECHWSKA, 1993).

Jung e colaboradores (1998) avaliaram uma série de N-alkoxicarbonil-alfa-amino-N-

metilsuccinimida no TPTZ e TEC, sendo que, todos os compostos testados tiveram

significante atividade anticonvulsivante no TPTZ e não tiveram atividade no TEC. O

composto mais ativo no TPTZ foi o (S) N-etoxicarbonil-alfa-amino-N-metil-succinimida e a

ação farmacológica era dependente do grupo N-alkoxicarbonil.

A etosuximida é uma succinimida com ação anticonvulsivante usada mundialmente no

tratamento de convulsões. Atua bloqueando a corrente de cálcio por bloqueio direto do canal

T. É bem absorvida e possui meia-vida de 20-60 horas. Seus efeitos colaterais mais comuns

são distúrbios gastrointestinais e rashes cutâneo.

Em 1999 Stanislaw e colaboradores (1999) no Departamento de Farmacologia e

Toxicologia em Lublin (Polônia) demonstraram que o óxido nítrico participa na ação

anticonvulsivante da etosuximida.

A tetrametilsucinimida atua potencializando o ácido gama-aminobutírico (GABA)

(COULTER; HUGUENARD; PRINCE, 1990).

O Departamento Neuropediátrico do Hospital Roger Salengo, Lille (França) sintetizou

e testou derivados N-fenil-substituintes da filantemida no TPTZ e TEC, sendo que o composto

mais promissor nos dois modelos foi o 2-cloro-4-amino-N-fenil substituinte da filantemida.

Este composto atua no receptor GABA

e não possuindo ação nos receptores de NMDA

(VAMECQ et al., 2000).

Porcello, Smith e Huguenard (2003) testaram o composto U-92032, um antagonista do

canal de cálcio tipo T, e concluíram que esta succinimida reduz de maneira eficaz nas crises

convulsivas.

No presente trabalho as succinimidas testadas não promoveram os resultados

esperados e novas substituições devem ser realizadas e testadas.

5.2.5 Efeito das imidas cíclicas na memória, avaliadas pelo Teste da Esquiva Inibitória

(TEI)

As Figuras 35, 36, 37, 38 e 39 representam os resultados das imidas cíclicas NFM,

NFM, MeNFM, 1NFS e 2NFS e/ou controle negativo sobre a aquisição, consolidação e

evocação da memória de curta (MCD) e de longa duração (MLD) quando avaliadas no teste

da esquiva inibitória.

Conforme nos mostra a Figura 35 A, B e C nos experimentos realizados, o composto

imídico NFM não alterou as memórias MCD e MLD da esquiva inibitória em nenhuma de

suas etapas (aquisição, consolidação e evocação).

Já o composto imídico NO

NFM promoveu efeito amnéstico de maneira

estatisticamente significante na MCD (p < 0,021) e uma tendência a esse efeito na MLD no

processo de aquisição (Figura 36 A, B e C).

Também não foi encontrado alterações nos três parâmetros das MCD e MLD com o

tratamento dos animais com os compostos MeNFM (Figura 37 A, B e C).

O mesmo perfil farmacológico anteriormente mencionado, foi observado com o

tratamento dos animais com os compostos 1 NFS e 2 NFS (Figura 38 e 39).

Figura 35. Efeito da administração intraperitoneal do veículo e da imida NFM (A) sobre a aquisição

aquisição, (B) consolidação e (C) evocação nas MCD (barras claras) e MLD (barras escuras) testados

respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de treino (barras brancas). Os dados são expressos como

medianas, seguido dos intervalos interquativos. Asteriscos denotam significâncias estatísticas (p<0,05)

comparadas com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney.

Figura 36. Efeito da administração intraperitoneal do veículo e da imida NO2NFM (A) sobre a

aquisição aquisição, (B) consolidação e (C) evocação nas MCD (barras claras) e MLD (barras escuras)

testados respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de treino (barras brancas). Os dados são expressos

como medianas, seguido dos intervalos interquativos. Asteriscos denotam significâncias estatísticas

(p<0,05) comparadas com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney.

Figura 37.

Efeito da administração intraperitoneal do veículo e da imida MeNFM (A) sobre a

aquisição aquisição, (B) consolidação e (C) evocação nas MCD (barras claras) e MLD (barras escuras)

testados respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de treino (barras brancas). Os dados são expressos

como medianas, seguido dos intervalos interquativos. Asteriscos denotam significâncias estatísticas

(p<0,05) comparadas com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney.

Figura 38.

Efeito da administração intraperitoneal do veículo e da imida 1 NFS (A) sobre a aquisição

aquisição, (B) consolidação e (C) evocação nas MCD (barras claras) e MLD (barras escuras) testados

respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de treino (barras brancas). Os dados são expressos como

medianas, seguido dos intervalos interquativos. Asteriscos denotam significâncias estatísticas (p<0,05)

comparadas com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney.

Figura 39.

Efeito da administração intraperitoneal do veículo e da imida 2 NFS (A) sobre a aquisição

aquisição, (B) consolidação e (C) evocação nas MCD (barras claras) e MLD (barras escuras) testados

respectivamente 1,5 e 24 h após a sessão de treino (barras brancas). Os dados são expressos como

medianas, seguido dos intervalos interquativos. Asteriscos denotam significâncias estatísticas (p<0,05)

comparadas com os controles. N= 10-13. Teste de Mann-Whitney.

A memória é um processo biológico essencial aos indivíduos, pois permite sua

sobrevivência. Trata-se de uma função fisiológica neurológica e bioquímica que culmina na

retenção, armazenamento e evocação de um comportamento e/ou informação (IZQUIERDO,

2002).

O prejuízo da memória (amnésia) é um dos principais sintomas de várias doenças

neuropsiquiátricas e/ou neurodegenerativas (NICOLETTI et al., 1996).

O prejuízo cognitivo que acompanha as doenças centrais compromete o desempenho

(profissional, social, familiar, afetivo, etc) dos portadores de tais neuropatologias, o estudo de

substâncias que venham a contribuir com facilitação dos processos de memória é visto com

importância.

Os processos de memória também podem ser afetados por agentes psicotrópicos. Neste

sentido temos, por exemplo, o diazepam que é um excelente agente ansiolítico, mas que por

outro lado compromete também o desempenho do paciente com o aparecimento de prejuízo

na memória chamado amnésia anterógrada (IZQUIERDO, 2002). Desta forma, quando se faz

a seleção de substâncias psicoativas, é de efeitos das substâncias sobre os processos

cognitivos, primeiro nos animais e posteriormente nos seres humanos.

O processo de formação da memória pode ser dividido em aquisição, consolidação e

evocação. A aquisição é também chamada de aprendizagem, ou seja, é a apresentação da

informação. A consolidação é a fixação da informação adquirida. A evocação é também

chamada de recordação, ou seja, é o resgate das informações consolidadas (McGAUGH,

2000).

A principal região moduladora do processo de formação da memória é a região CA1

do hipocampo, que emite fibras excitatórias a uma região vizinha chamada subículo, que faz

sinapse com células do córtex entorrinal. O córtex entorrinal, por sua vez, emite axônios ao

giro dentado, que projeta para outra região chamada CA3, que fazem sinapses excitatórias

com as células piramidais de CA1 (IZQUIERDO; MEDINA, 1997).

Durante a formação da memória ocorrem processos de plasticidade sináptica no SNC

que resultam em aprendizagem. Essa plasticidade refere-se a alterações dos efeitos sobre os

neurônios pós-sinápticos causadas por mudanças na estrutura ou na bioquímica das sinapses.

Um dos processos plásticos relacionados com a memória é a LTP (CARLSON, 2002).

Ao longo dos anos demonstrou-se que a LTP compartilha inúmeras e importantes

características do aprendizado de novas memórias sendo apontado repetidamente pela grande

maioria dos estudiosos do assunto como um mecanismo de memória (BLISS;

COLLINGRIDGE, 1993). As características que a LTP possui elegendo-a como possível

mecanismo de memória são: indução rápida (aquisição); grande labilidade durante o período

pós indução (consolidação), em que ocorre seu estabelecimento perdurável e permite sua

manutenção, mantendo-se por longo período na ausência de estimulação; e por último,

expressão imediata da resposta quando é novamente aplicado o estímulo original (BLISS;

COLLINGRIDGE, 1993; IZQUIERDO, 1994).

Ainda faltam evidências mais diretas mostrando realmente a LTP como base da

memória. Porém, evidências circunstanciais são derivadas de três diferentes princípios: (1) o

processo da LTP ocorre em estruturas cerebrais envolvidos no processo da memória

(MAREN; BAUDRY, 1995); (2) camundongos mutantes com defeitos enzimáticos com

prejuízos nos fenômenos da LTP possuem também prejuízos de memória (GRANT; SILVA,

1994) e por último, existem atualmente vários experimentos farmacológicos mostrando uma

grande similaridade (3) entre a LTD e a memória, sendo esta, considerado no momento a

melhor evidência em favor da hipótese da LTP como um mecanismo de memória (BLISS;

COLLINGRIDGE, 1993).

Repetidamente, os sistemas de neurotransmissores envolvidos na LTP e formação da

memória são: sistema glutamatérgico (via receptores AMPA e NMPA), sistema

GABAérgicos (via receptores GABA

), sistema colinérgico (via receptores muscarínicos),

além do ácido araquidônico, óxido nítrico e fator de agregação plaquetária (IZQUIERDO,

2002). Para manter-se a LTP e as memórias há participação de mensageiros que ativam uma

rede de proteínas quinases dentre elas: PKG, CaMKII, PKC que mantém fosforilados os

receptores AMPA. Tardiamente há o envolvimento de fatores de transcrição nucleares e

mitocôndrias como o CREB, os quais são responsáveis pela síntese de proteínas responsáveis

pela manutenção do processo.

As memórias podem ser classificadas pelo tempo que duram em memória de curta

(MCD) e de longa duração (MLD). A MCD estende-se desde os primeiros segundos ou

minutos seguintes ao aprendizado, até 3-6 horas, quer dizer, o tempo que a memória de longa

duração leva para ser construída (McGAUGH, 2000).

No presente estudo procurou-se verificar o efeito dos compostos imídicos sobre as

diversas etapas da memória da esquiva inibitória, avaliando-se os processos de curta e longa

duração. Dos compostos estudados o composto imídico NO

NFM foi o único que exibiu

efeito sobre a memória, especificamente no processo de aquisição, inibindo o processo,

enquanto que os demais não interferiram com nenhuma das etapas das memórias (MCD e

MLD) dos animais experimentados. Embora, não tenhamos subsídios experimentais

suficientes para a afirmação, mas pode-se sugerir que o composto estaria afetando os sistemas

de neurotransmissores envolvidos no processo de aquisição, especificamente o sistema

GABAérgico, uma vez que o composto também foi eficaz em antagonizar a convulsão

induzida por PTZ, sugerindo uma ação agonística nesse sistema.

Com relação a imidas cíclicas o único trabalho descrito na literatura utilizando esquiva

inibitória foi realizado nesta Universidade por Ullmann e Berno (2000). Os pesquisadores

testaram várias succinimidas inéditas e comprovaram que os compostos imídicos N-(p-N’,

N’-imetilsulfamoilfenil)-8-oxabiciclo[2,2,1]hept-4-eno-3-metil[5,6-c]succinimida e N-(p-N’-

fenilsulfamoilfenil)-8-oxabiciclo[2,2,1]hept-4-eno-3-metil[5,6-c]succinimida agiam inibindo

tanto a memória de curta duração quanto a de longa, independente da dose usada

CONCLUSÕES

6 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos com a agmatina avaliada no presente trabalho permite concluir

que:

a) A agmatina promoveu efeito ansiolítico quando avaliada no TLCE e as regiões

cerebrais envolvidas no processo de ansiedade são respectivamente o córtex entorrinal e a

substância cinzenta periaquedutal.

b) A agmatina promoveu efeito antidepressivo quando testada nos modelos de

depressão, o teste do nado forçado e o teste da suspensão pela cauda, confirmando os

resultados ressaltados na literatura sobre tal propriedade.

c) A agmatina promoveu efeito amnéstico seletivo sobre a memória de longa duração

sem afetar as memórias de curta duração. O efeito amnéstico foi observado nos processos de

aquisição e consolidação e parece envolver as vias oxidonitrérgica e glutamatérgica.

Os resultados obtidos com os compostos imídicos no presente trabalho permitem

concluir que:

a) As maleimidas NFM, NO

NFM e MeNFM e a succinimida 1NFS promoveram

efeito sedativo e depressor quando avaliadas no modelo do Campo aberto.

b) A maleimida NFM e as succinimidas 1NFS e 2NFS promoveram efeito ansiolítico

quando avaliada no modelo LCE.

c) A maleimida NFM e a succinimida 1NFS promoveram efeito antidepressivo quando

avaliada no modelo do nado forçado e suspensão pela cauda.

d) As maleimidas NFM, NO

NFM e MeNFM promoveram efeito anticonvulsivante

quando avaliadas no modelo do antagonismo da convulsão induzida pelo pentilenotetrazol e

estricnina

e) Somente a maleimida NO

NFM promoveu efeito amnéstico na memória de curta

duração no processo de aquisição quando avaliada no modelo da esquiva inibitória.

Os resultados em conjunto permitem sugerir que a agmatina e os compostos imídicos

promoveram efeitos comportamentais específicos que os potencializam como candidatos a

possíveis medicamentos de ação central.

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