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1
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica
Área de Tecnologia Químico-Farmacêutica
Purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase por sistemas
micelares de duas fases aquosas contendo ligantes de afinidade
André Moreni Lopes
Dissertação para a obtenção do grau de
MESTRE
Orientador:
Prof. Dr. Adalberto Pessoa Júnior
São Paulo
2006
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Milhares de livros grátis para download.
2
André Moreni Lopes
Purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase por sistemas
micelares de duas fases aquosas contendo ligantes de afinidade
Comissão Julgadora
da
Dissertação para a obtenção do grau de Mestre
Prof. Dr. Adalberto Pessoa Júnior
Orientador/presidente
Profa. Dra. Cristina Northfleet de Albuquerque
1
o
. examinador
Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto
2
o
. examinador
São Paulo, 27 de Março de 2006.
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"Renda
"Renda"Renda
"Renda-
--
-se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei.
se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei. se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei.
se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei.
Não s
Não sNão s
Não se preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento"
e preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento"e preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento"
e preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento"
Clarice Lispector
“Longe se vai
“Longe se vai“Longe se vai
“Longe se vai
Sonhando demais
Sonhando demaisSonhando demais
Sonhando demais
Mas onde se chega assim
Mas onde se chega assimMas onde se chega assim
Mas onde se chega assim
Vou descobrir
Vou descobrirVou descobrir
Vou descobrir
O que me faz sentir
O que me faz sentirO que me faz sentir
O que me faz sentir
Eu, caçador de mim”
Eu, caçador de mim”Eu, caçador de mim”
Eu, caçador de mim”
Milton Nascimento
4
Ao meu Pai pela lição de amor, dignidade e responsabilidade, pelo
seu esforço...
e à maior e mais brilhante Professora que já tive, minha Mãezinha querida
que me ensinou dentre muitas coisas a matemática da vida e outras
faculdades, sobretudo o amor...
a eles, como tudo mais.
5
A orientação que recebi do Professor Adalberto foi muito importante para a
condução do trabalho, assim como a liberdade que ele deu para o desenvolvimento
das etapas do projeto. Além disso, a confiança e credibilidade depositadas foram
importantes para o meu crescimento científico. Desta forma, agradeço a atenção
dada desde quando eu era apenas um aluno de graduação realizando meus
estágios no Laboratório.
Também agradeço ao Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos
no qual desenvolvi boa parte das tentativas de síntese do composto estudado, em
especial à Andréia, Vanderson, Graça, Salomão, Sibila, Fávero e Marcos. Agradeço
também à Prof
a
Cristina Northfleet de Albuquerque pela orientação que recebi na
parte da interpretação do composto obtido nas tentativas de síntese.
Finalmente, agradeço o apoio financeiro proporcionado pela FAPESP.
6
Agradecimentos
É nesta parte que o texto costuma desenrolar mais fácil e com menos
formalidade. Quem dera o trabalho todo fosse escrito assim.
Valeu Carlotinha, pelo apoio e pela paciência. Graças à sua assistência na
parte prática e por todo o embasamento teórico pude finalizar este trabalho. A Prof
a
Carlota, além de ter participado de alguns dos ensaios, sugeriu muitas das idéias
aqui estudadas. Obrigado amiga, suas opiniões e críticas, muito mais críticas do que
qualquer outra coisa, foram importantes para enriquecer nosso trabalho. Cadê
aquele sorrizinho???
Minha querida Tatiane precisaria de uma página de agradecimentos.
Obrigado meu amor, você cuidou, zelou e me apoiou nesse ínterim da Pós.
Cyntia, companheira de Pré, Ginásio, Colegial, Cursinho, Graduação, Pós,
ufaaa... não acaba mais, será que a gente ainda vai trabalhar no mesmo
departamento, será que a gente vai casar??? Obrigado por me conduzir até aqui.
Aos meus grandes amigos: Diogo, Marião, Paulinha, Maria, Lucão, Naka,
Deine, Petit, sem eles nada disso seria possível. Obrigado por estarem por perto
mesmo estando tão longe, eu amo vocês.
Agradeço pela amizade sincera dos meninos lá da república, ao Samirrr e ao
Jabuti, que foram grandes companheiros. Pessoal é final de mês, vamos acertar a
conta!!!
Ao pessoal do Lab, de uma forma geral, em especial para Pérola, Helen,
Ângela, Luís, Ângelo, Ester, Marina, Priscila, Irene e Ricardo; aos Professores
Michele e T. Cris. Luís: valeu pelas aulinhas básicas de Termodinâmica! Ao Lab do
Professor João Carlos, Japônes e Raquel: obrigado pela amizade!
Agradeço calorosamente também: meus amigos Cubanos, Jorgito, Rolando y
Anita. Queridos: muchas gracias por esta amistad, muchas gracias por los
momentos mui agradables que pasé con usteds en Cuba.
Agradeço à Secretaria da Pós, em especial ao Jorge, Elaine e Majô, sempre
muito simpáticos, com exceção do Jorge claro! Obrigado pela prestação e eficiência
recebida. Ao Jorge, que contribuiu para a revisão deste material.
Sem grandes palavras para agradecer, aos meus pais e ao meu irmão, os
quais dedico este trabalho, além de tudo aquilo que conquistei. Obrigado! Mãe, findo
com a frase que marcou essa etapa: “Sempre há várias versões e imaginações de
como seriam as histórias dos grandes homens...”.
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS i
LISTA DE TABELAS iv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS vi
RESUMO viii
ABSTRACT ix
1. INTRODUÇÃO 01
1.1. Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas – SMDFA 07
1.2. Adição de Sais ao SMDFA 17
1.3. Enzimas 23
1.4. Enzima Glicose-6-Fosfato Desidrogenase – G6PD 27
2. OBJETIVOS 31
3. MATERIAIS E MÉTODOS 32
3.1. Materiais 32
3.2. Determinação da Concentração de G6PD 32
3.3. Determinação da Concentração de Cibacron Blue e de Procion Red 33
3.4. Determinação da Concentração Total de Proteínas 34
3.5. Determinação da Condutância Elétrica das Fases do SMDFA
Contendo Sais 34
3.6. Teste de Cromatografia em Camada Delgada 35
3.7. Efeito dos Tensoativos Não-Iônicos Triton X-114 e C
10
E
4
na
Atividade da G6PD 35
3.8. Efeito do Triton X-114 no Padrão de Absorção UV da
Coenzima NADP
+
/NADPH 36
3.9. Preparação do SMDFA 36
3.10. Construção das Curvas Binodais 38
3.11. Construção da Curva Binodal para o Sistema
Triton X-114/(NH
4
)
2
SO
4
39
3.12. Síntese do Tensoativo de Afinidade TX-114-Blue 40
3.13. Espectrometria de Absorção na Região do Infravermelho (IV) 42
3.14. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN-
1
H) 43
3.15. Rompimento e Preparação do Homogeneizado Celular de
S. cerevisiae 43
8
3.16. Estudos Cinéticos (K
M
e V
MAX
) e Termodinâmicos
(Ea, ∆G, ∆H e ∆S) 44
3.17. Metodologia de Análise dos Resultados 45
3.18. Teoria de Partição de Proteínas Hidrofílicas Baseada em
Interações por Volume de Exclusão – Cálculo Teórico do
Coeficiente de Partição 48
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 51
4.1. Influência do Efeito dos Tensoativos Triton X-114 e C
10
E
4
na
Estabilidade da G6PD 51
4.1.1. Avaliação do Efeito do Tensoativo Não-Iônico Triton X-114 na
Estabilidade da G6PD 51
4.1.2. Avaliação do Efeito do Tensoativo Não-Iônico C
10
E
4
na
Estabilidade da G6PD
53
4.2. Curva Binodal para o Sistema C
10
E
4
/Tampão 54
4.3. Partição da G6PD no Sistema C
10
E
4
/Tampão 56
4.4. Curva Binodal para o Sistema Triton X-114/Tampão 60
4.5. Partição da G6PD no Sistema Triton X-114/Tampão 62
4.6. Estudo da Partição na Ausência e Presença de G6PD em Sistemas
C
10
E
4
e Triton X-114 em Tampão Contendo Corantes Tipo Triazina
como Ligantes de Afinidade Livres em Solução 65
4.6.1. Partição dos Ligantes Cibacron Blue e Procion Red no Sistema
C
10
E
4
/Tampão 65
4.6.2. Partição da Enzima G6PD no Sistema C
10
E
4
/Tampão na Presença
dos Ligantes de Afinidade Cibacron Blue e Procion Red 66
4.6.3. Partição dos Ligantes Cibacron Blue e Procion Red no Sistema
Triton X-114/Tampão 73
4.6.4. Partição da Enzima G6PD no Sistema Triton X-114/Tampão
na Presença dos Ligantes de Afinidade Cibacron Blue e Procion Red 74
4.7. Síntese do Tensoativo de Afinidade TX-114-Blue 77
4.7.1. Identificação do Composto Obtido na Quarta, Quinta e Sexta
Tentativas de Síntese 83
4.7.2. Ensaios de Partição da G6PD em Sistema Contendo os
Compostos Obtidos na Segunda, Quarta e Quinta Tentativas de Síntese 87
4.8. Estudo da Partição da G6PD em Sistema
Triton X-114 Contendo Sais 92
4.8.1. Curva Binodal Obtida para o Sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
92
9
4.8.2. Estudos com o Sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
93
4.8.3. Estudos com o Sistema TX-114/Na
2
SO
4
100
4.9. Estudo da partição da G6PD proveniente do
homogeneizado de S. cerevisiae 102
4.10. Estudos dos Parâmetros Cinéticos (K
M
e V
MAX
) e
Termodinâmicos (Ea, ∆G, ∆H e ∆S) antes e após a
Purificação por SMDFA 106
5. CONCLUSÕES 113
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 116
7. APÊNDICES 128
Apêndice A 128
Apêndice B 129
Apêndice C 130
Apêndice D 131
Apêndice E 132
Apêndice F 133
Apêndice G 134
Apêndice H 134
Apêndice I 135
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Estrutura do monômero de um tensoativo.
03
Figura 02 Diversos tipos de geometria assumidos pelas micelas.
06
Figura 03 Representação esquemática baseada em Nikas et al. (1992)
de um sistema micelar de duas fases aquosas para o
tensoativo não-iônico Triton X-114.
08
Figura 04 Esquema da curva binodal de uma solução aquosa do
tensoativo C
10
E
4
.
09
Figura 05 Representação esquemática do comportamento esperado
para uma proteína em sistemas micelares de duas fases
aquosas contendo ligantes de afinidade em solução.
13
Figura 06 Representação esquemática do comportamento esperado
para uma proteína em sistemas micelares de duas fases
aquosas contendo tensoativos de afinidade em solução.
13
Figura 07 Estrutura química dos corantes derivados da triazina
Procion
Red HE-3B e Cibacron Blue F3GA, ambos inibidores da
G6PD.
15
Figura 08 Estrutura química da coenzima NADP
+
, a qual se liga a um
sítio específico na G6PD.
16
Figura 09 Esquema da reação catalisada pela G6PD.
28
Figura 10 Estrutura da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) de
L. mesenteroides (dímero).
29
Figura 11 Esquema do procedimento experimental para a extração
por SMDFA.
38
Figura 12 Rota sintética de obtenção do tensoativo de afinidade
TX-114-Blue.
42
Figura 13 Atividade da enzima G6PD após 1 hora de exposição a
diferentes concentrações de Triton X-114 a 19°C.
52
Figura 14 Atividade da enzima G6PD após 1 hora de exposição a
diferentes concentrações de C
10
E
4
a 15°C.
54
Figura 15 Curva binodal para o sistema C
10
E
4
/tampão, obtida
experimentalmente.
55
Figura 16 Comparação entre os valores de K
G6PD
obtidos no sistema
C
10
E
4
/tampão (quadrado) e os estimados pela teoria (linha
tracejada), em função do volume de exclusão (
φ
c
-
φ
d
).
59
11
Figura 17 Curva binodal para o sistema Triton X-114/tampão, obtida
experimentalmente.
60
Figura 18 Comparação entre os valores de K
G6PD
obtidos no sistema
Triton X-114/tampão e os estimados pela teoria.
Figura 19 Coeficientes de partição dos ligantes cibacron blue (barra
azul) e procion red (barra vermelha) obtidos no sistema
micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas.
65
66
Figura 20 Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas.
67
Figura 21 Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos
experimentalmente no sistema micelar C
10
E
4
/tampão
de duas fases aquosas.
68
Figura 22 Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas.
69
Figura 23 Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas.
Figura 24 Coeficientes de partição dos ligantes cibacron blue (barra
azul) e procion red (barra vermelha) obtidos no sistema
micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas.
71
72
Figura 25 Coeficientes de partição dos ligantes cibacron blue (barra
azul) e procion red (barra vermelha) obtidos no sistema
micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas, na presença
da G6PD, utilizando-se T = 19,5°C e concentração de C
10
E
4
de 2,5% (p/p).
72
Figura 26 Coeficientes de partição dos ligantes cibacron blue (barra
azul) e procion red (barra vermelha) obtidos no sistema
micelar Triton X-114/tampão de duas fases aquosas
utilizando-se T = 27,5°C.
74
Figura 27 Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos no
sistema micelar Triton X-114/tampão de duas fases
aquosas utilizando-se T = 27,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,071).
75
Figura 28 Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos no
sistema micelar Triton X-114/tampão de duas fases
aquosas utilizando-se T = 27,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,071) e
concentração de Triton X-114
de 1,5.
76
Figura 29 Coeficientes de partição dos ligantes cibacron blue (barra
azul) e procion red (barra vermelha) obtidos no sistema
micelar Triton X-114/tampão de duas fases aquosas.
77
Figura 30 Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos no
sistema micelar Triton X-114/tampão de duas fases
aquosas.
88
12
Figura 31 Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos no
sistema micelar TX-114/tampão de duas fases aquosas.
89
Figura 32 Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão.
90
Figura 33 Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão.
90
Figura 34 Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão.
91
Figura 35 Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas.
92
Figura 36 Curva binodal para o sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
à
temperatura de 20°C obtida experimentalmente com base
nos pontos de névoa.
92
Figura 37 a) Atividade da G6PD pura antes da partição por SMDFA
em função da concentração de substrato (G6P); b)
Atividade da G6PD pura após a partição por SMDFA obtida
na fase diluída do sistema (pobre em micelas) em função da
concentração de substrato (G6P).
107
Figura 38 Curvas correspondentes ao inverso dos valores das
atividades (1/V) da G6PD em função do inverso das
concentrações do substrato G6P (1/S).
108
Figura 39 Curvas correspondentes ao Log da atividade da G6PD em
função do inverso das temperaturas absolutas (1/T).
109
13
LISTA DE TABELAS
TABELA 01 Valores de absorbância a 340 nm obtidos para soluções de
Triton X-114 e soluções da coenzima NADP
+
/NADPH na
presença ou não de Triton X-114, por 1 hora a 19°C.
53
TABELA 02 Resultados experimentais da partição da G6PD em Sistema
C
10
E
4
/tampão, para diferentes concentrações de tensoativo
e temperatura.
57
TABELA 03 Valores de concentração de C
10
E
4
resultantes nas fases
concentrada (C
c
) e diluída (C
d
) de cada ensaio, obtidos com
base na curva binodal para o sistema C
10
E
4
/tampão.
58
TABELA 04 Resultados experimentais da partição da G6PD em sistema
Triton X-114/tampão, para diferentes concentrações de
tensoativo e temperatura.
62
TABELA 05 Valores de concentração de Triton X-114
resultantes nas
fases concentrada (C
c
) e diluída (C
d
) de cada ensaio,
obtidos com base na curva binodal para o sistema Triton X-
114/tampão, e os respectivos valores de
φ
c
-
φ
d
calculados.
64
TABELA 06 Ensaios prévios para o estudo da solubilização dos
componentes em sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
, submetido a
20°C, por 2 horas.
94
TABELA 07 Valores de condutância elétrica (mS) obtidos para as fases
concentrada e diluída dos ensaios D e E após a separação
de fases, a 25°C.
94
TABELA 08 Ensaios de separação de fases para o sistema
TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
.
95
TABELA 09 Estudo da partição da G6PD em sistema
TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
por 2 horas.
95
TABELA 10 Valores de condutância elétrica (mS) das fases concentrada
e diluída dos ensaios F, G e H, a 25°C.
96
TABELA 11 Estudo da partição da G6PD em sistema
TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
por 3 horas.
97
TABELA 12 Estudo da partição da G6PD em sistema
TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
por 5 horas, a 10°C.
99
TABELA 13 Valores de condutância elétrica (mS) obtidos para as fases
concentrada e diluída dos ensaios L e P, a 25°C.
99
TABELA 14 Ensaios de separação de fases para o sistema TX-
114/Na
2
SO
4
a 20°C, por 3 horas.
100
14
TABELA 15 Valores de condutância elétrica (mS) obtidos para as fases
concentrada e diluída dos ensaios A, B, C e D à
temperatura ambiente.
101
TABELA 16 Estudo da partição da G6PD em sistema TX-114/Na
2
SO
4
.
102
TABELA 17 Resultados de coeficiente de partição da G6PD (K
G6PD
) e de
proteínas totais (K
p
), balanço de atividade de G6PD
(BA
G6PD
), balanço de massa de proteínas totais (BM
P
),
rendimento de G6PD na fase diluída do sistema micelar
não-iônico (Y
G6PD
), seletividade (S) e fator de purificação
(f
p
), para o estudo de purificação de G6PD presente em
homogeneizado celular de S. cerevisiae e na forma pura.
103
TABELA 18 Valores de K
M
e V
MAX
determinados para a enzima G6PD
antes e após a purificação por SMDFA.
108
TABELA 19 Valores dos parâmetros termodinâmicos determinados para
a G6PD antes e após a purificação por SMDFA.
110
15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A
e
Atividade específica
A
e,c
Atividade específica na fase concentrada em micelas
A
e,i
Atividade específica na solução estoque de enzima, inicialmente adicionada
no sistema
BA
G6PD
Balanço de atividade da G6PD
Blue Cibacron Blue F3GA
BM Balanço de massa
BCA Ácido bicinconínico
BSA Albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumine)
C
c
Concentração de tensoativo na fase rica em micelas
C
d
Concentração de tensoativo na fase diluída, pobre em micelas
C
i
Concentração da solução estoque inicialmente adicionada no sistema
C
10
E
4
Tensoativo não-iônico óxido de n-deciltetraetileno
CMC Concentração micelar crítica
EV Volume de exclusão
f
p
Fator de purificação
G Energia de Gibbs
G6P Glicose-6-fosfato
G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
H Entalpia
IV Infravermelho
K
G6PD
Coeficiente de partição da G6PD
K
p
Coeficiente de partição da proteína
K
P
EV
Coeficiente de partição da proteína resultante das interações de volume de
exclusão
l
c
Comprimento da cadeia hidrocarbônica do tensoativo estendida
l
h
Comprimento da cabeça de polióxido de etileno estendido
NADP
+
β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada)
NADPH β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
pI Ponto isoelétrico
R Razão volumétrica entre as fases concentrada e diluída em micelas
R Constante universal dos gases
RMN-
1
H Ressonância magnética nuclear de próton
R
p
Raio hidrodinâmico da enzima
R
0
Raio da secção transversal de cada micela cilíndrica
16
Ѕ Entropia
Š Seletividade
SFDA Sistema de duas fases aquosas
SMDFA Sistema micelar de duas fases aquosas
T Temperatura
T
c
Temperatura crítica – temperatura mínima na qual se observa separação de
fases para um determinado sistema
T
NÉVOA
Ponto de névoa (cloud point)
TX-114 Tensoativo não-iônico polioxietileno p-t-octil fenol (Triton X-114)
TX-114-Blue Tensoativo de afinidade Triton X-114-Cibacron Blue
UV Luz ultravioleta
V
c
Volume da fase rica em micelas
V
d
Volume da fase diluída, pobre em micelas
V
i
Volume da solução estoque inicialmente adicionada no sistema
X
c
Concentração crítica de tensoativo
Y
G6PD,C
Rendimento de G6PD na fase concentrada em micelas
Letras gregas
φ
φφ
φ
c
Fração volumétrica de tensoativo na fase concentrada
φ
φφ
φ
d
Fração volumétrica de tensoativo na fase diluída
17
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo a purificação da enzima glicose-6-fosfato
desidrogenase pela tecnologia de extração líquido-líquido em Sistemas Micelares de
Duas Fases Aquosas (SMDFA). Estes sistemas são constituídos por soluções de
tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, o que
possibilita seletividade na partição da enzima de acordo com sua hidrofobicidade e
proporciona um ambiente ameno às biomoléculas. Foram estudados alguns dos
fatores que influenciam a partição da G6PD, como: tipo e concentração de diferentes
agentes tensoativos não-iônicos (C
10
E
4
e Triton X-114), temperatura e adição de
ligantes de afinidade (cibacron blue e procion red) e o efeito da adição dos sais
sulfato de amônio ((NH
4
)
2
SO
4
) e sulfato de sódio (Na
2
SO
4
). Estudou-se ainda a
síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Em todos os ensaios a enzima foi
recuperada preferencialmente na fase diluída, pobre em micelas, tanto em sistema
Triton X-114/tampão como para C
10
E
4
/tampão, no qual existe maior volume
disponível, resultando em valores de K
G6PD
inferiores a 1. A utilização dos ligantes de
afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos proporcionou um pequeno
aumento nos valores de K
G6PD
da enzima, porém com valores inferiores a 1. Os
sistemas Triton X-114/Sal não influenciaram a partição da enzima para a fase
micelar, apesar da existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases
destes sistemas. O efeito desempenhado pelo volume de exclusão foi dominante em
todos os sistemas estudados e, portanto, a enzima foi predominantemente excluída
para a fase aquosa, pobre em micelas. A tecnologia por SMDFA para a purificação
do homogeneizado celular de S. cerevisiae demonstrou ser eficiente em recuperar a
biomolécula alvo na fase aquosa, pobre em micelas, permitindo separar da presença
de biomoléculas ou mesmo de contaminantes com caráter hidrofóbico. Dessa forma,
o SMDFA pode ser empregado como uma possível etapa de purificação num
processo biotecnológico.
18
ABSTRACT
In this work, the use of two-phase micellar system was studied aiming at the
purification of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Usually, these
systems are constituted of micellar surfactants solutions and offer both hydrophobic
and hydrophilic environments, providing selectivity to the enzyme partitioning
according to its hydrophobicity. Some of the factors influencing the G6PD partition in
micellar systems were studied, such as: type and concentration of nonionic surfactant
agents (C
10
E
4
and Triton X-114), temperature, addition of affinity ligands (Cibacron
Blue and Procion Red) and the addition of the salts ammonium sulfate ((NH
4
)
2
SO
4
)
and sodium sulfate (Na
2
SO
4
). The synthesis of the affinity surfactant TX-114-Blue
was also studied. In all the assays the experiments, G6PD partitioned preferentialy to
dilute, micelle-poor phase, in which there is a higher volume available for the enzyme
to be, resulting in K
G6PD
values lower than 1. The use of affinity ligands in G6PD
partitioning in both C
10
E
4
and Triton X-114 systems provided some increase in the
K
G6PD
, however with values still lower than 1. Employing a methodology previously
described in the literature with some alterations, it was not possible to obtain the
affinity surfactant TX-114-Blue. The systems Triton X-114/salt have not shown a
significant influence on the enzyme partition to the micelle-rich phase, in spite of the
existence of an electrostatic potential difference between the phases of the systems.
The excluded-volume effect was dominant in all the systems studied and, therefore,
the enzyme predominantly excluded to the dilute, micelle-poor phase. The use of
Triton X-114 two-phase aqueous micellar systems to the purification of the
Saccharomyces cerevisiae cell homogenate was found to be efficient in the recovery
of G6PD in the dilute, micelle-poor phase, partially separating this target molecule
from other proteins and contaminants of hydrophobic character. Therefore, aqueous
two-phase micellar systems can be considered useful as a possible purification stage
in a biotechnology process.
19
1. INTRODUÇÃO
A produção em escala industrial de enzimas e outras biomoléculas de
interesse comercial e biotecnológico depende estritamente das técnicas adotadas
para a separação e/ou purificação. A sensibilidade térmica e a obtenção em baixas
concentrações, entre outros fatores, prejudicam a purificação industrial e levam à
utilização de técnicas de alto custo, tais como cromatografia de afinidade e de troca
iônica (CHAMPLUVIER, KULA, 1992; CHANG, CHASE, 1996; CHANG et al., 1995;
MCCREATH et al., 1995). Com isso, o custo de preparações enzimáticas eleva-se,
constituindo um obstáculo para o acesso a estes reagentes de grande aplicação nos
campos de pesquisa, terapia e diagnóstico. Assim, a pesquisa e o desenvolvimento
de técnicas mais econômicas e simplificadas para a purificação de enzimas e
biomoléculas apresentam grande interesse.
Dentre as técnicas atualmente estudadas para recuperação e/ou purificação
de enzimas, especial ênfase tem sido dada à extração líquido-líquido devido à sua
eficiência, versatilidade, baixo custo e facilidade de ampliação em escala. A extração
de moléculas em sistemas de duas fases líquidas imiscíveis, constituídas de uma
fase aquosa e de outra fase orgânica, é utilizada na purificação de antibióticos e
ácidos orgânicos (BELTER et al., 1988). A extração convencional aplicada em
indústria química, entretanto, consiste em sistemas água-solvente orgânico, de
forma que apresenta elevado risco de desnaturação protéica. Com a finalidade de
capitalizar os benefícios da extração líquido-líquido, fluidos aquosos complexos têm
sido utilizados nos processos de extração de biomoléculas (por meio dos chamados
sistemas de duas fases aquosas), pois desta maneira as duas fases formadas são
predominantemente aquosas e, portanto, amenas para as biomoléculas.
20
Em 1986, Albertsson propôs o uso dos sistemas de duas fases aquosas
(SDFA) para a purificação de proteínas e partículas de células. Desde então, a
extração em SDFA tem sido aplicada à purificação de produtos obtidos em células
animais, vegetais e microbianas na separação de vírus, organelas e ácidos
nucléicos. A extração tipo líquido-líquido passou a ser utilizada para a purificação de
enzimas devido ao grande potencial que os SDFA podiam oferecer, com a utilização
de polímeros em solução. Um fato importante para esse tipo de extração é que
algumas enzimas, como quimosina e endoglucanase, e outros componentes
celulares, como plasmídeos, já são purificados utilizando-se sistemas poliméricos de
duas fases aquosas (LORCH, 1999; KEPKA et al., 2004).
Proteínas podem ser purificadas em sistemas constituídos por duas fases
aquosas imiscíveis, em decorrência da partição diferenciada da molécula-alvo e
impurezas entre as fases líquidas. São fatores decisivos as propriedades de
superfície das proteínas, como carga elétrica e hidrofobicidade, além da massa
molecular (ASENJO, 1990; ALBERTSSON, 1986). O elevado teor de água das fases
formadas, 75 a 90% em massa, garante a manutenção das propriedades biológicas
das proteínas de interesse.
Dentre os diferentes tipos de sistemas de extração líquido-líquido, o Sistema
Micelar de Duas Fases Aquosas (SMDFA), constituído primariamente por moléculas
de tensoativos que tendem a formar micelas, oferece simultaneamente ambiente
hidrofóbico e hidrofílico, que permite seletividade na partição das biomoléculas. Além
disto, a extração mediada por micelas constitui procedimento rápido e simples, que
tem sido bastante estudado para proteínas de membranas, enzimas e receptores
(BORDIER, 1981; NÚNEZ-DELICADO et al., 1996).
21
Agentes tensoativos são moléculas anfifílicas compostas por uma porção
hidrofílica, região da molécula que possui afinidade pela molécula de água e que é
denominada de "cabeça polar", ou simplesmente "cabeça", e uma porção
hidrofóbica, região da molécula que não possui afinidade pela molécula de água e
que é denominada de "cauda apolar", ou simplesmente "cauda" (Figura 01). Os
tensoativos podem ser classificados em: (a) iônicos, que possuem cabeça
positivamente carregada ou negativamente carregada; (b) não-iônicos, possuindo
cabeça polar capaz de realizar ligações de hidrogênio com a água; e (c)
zwitteriônicos, possuindo cabeça caracterizada por um dipolo. Dodecil sulfato de
sódio (SDS), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), polioxietileno p-t-octil fenol
(Triton X-114) e dioctanoilfosfatidilcolina (C
8
-lecitina) são exemplos de tensoativos
aniônico (carregado negativamente), catiônico (carregado positivamente), não-iônico
e zwitteriônico, respectivamente (ISRAELACHVILI, 1991).
Figura 01 – Estrutura do monômero de um tensoativo, em que pode ser visualizada
a porção da cabeça polar de caráter hidrofílico e que possui afinidade pela água, e a
porção da cauda apolar de caráter hidrofóbico e que não possui afinidade pela água.
Adaptado: http://www.cca.ufes.br/nepal
As moléculas tensoativas em solução aquosa podem exibir diversos tipos de
comportamento, dependendo da concentração e características da solução. Em
soluções com concentração de tensoativo abaixo da concentração micelar crítica
ar
água
interface
Cabeça polar
Cauda apolar
22
(CMC), específica para cada tensoativo, as moléculas deste deslocam na interface
ar-água, projetando suas caudas apolares em direção à fase ar de forma a minimizar
o contato com a água. Este fenômeno explica a terminologia inglesa “surfactant”
(surface-active agent). A maioria dos tensoativos apresenta solubilidade mínima na
fase aquosa, devido ao caráter hidrofóbico do grupo apolar. Por outro lado, em
soluções com concentrações de tensoativos superiores à CMC, além da adsorção
na interface as moléculas destes formam agregados conhecidos como micelas, nos
quais as caudas hidrofóbicas se associam no interior, minimizando o contato com a
água, e as cabeças polares permanecem na periferia das micelas, maximizando seu
contato com a água (CHEVALIER, ZEMB, 1990; TANFORD, 1980).
A formação de micelas reflete um balanço complexo de várias forças
intermoleculares, que incluem interações de van der Waals, eletrostáticas, estéricas,
hidrofóbicas e ligações de hidrogênio (TANFORD, 1980; ISRAELACHVILI, 1991). O
efeito hidrofóbico associado às caudas apolares constitui a principal força atrativa. A
força repulsiva contrária é resultado das interações estérica (existente entre as
cabeças hidratadas de tensoativos não-iônicos) e eletrostática (existente entre as
cabeças, possuindo cargas idênticas) associadas às cabeças hidrofílicas. O
processo de micelização é resultado do balanço entre estas forças atrativas e
repulsivas (KAMEI, 2001a).
O efeito hidrofóbico é governado pelo ganho em entropia que ocorre quando o
contato entre as caudas apolares e as moléculas de água é minimizado. Apesar de
haver perda de entropia translacional das moléculas de tensoativo com a formação
de micelas, ocorre aumento significativo da entropia translacional das moléculas de
água que rodeiam as caudas hidrofóbicas. Esse aumento de entropia das moléculas
23
de água tem maior efeito pois as moléculas de água encontram-se em maior
quantidade (TANFORD, 1980).
Micelas são entidades dinâmicas formadas pela agregação não-covalente de
monômeros de tensoativos e podem ser esféricas, cilíndricas ou planas (discos ou
bicamadas) (Figura 02). A forma e o tamanho das micelas podem ser modificados
trocando a estrutura química do tensoativo, bem como variando as condições da
solução, que incluem temperatura, concentração do tensoativo, composição dos
tensoativos (em caso de sistemas mistos), força iônica e pH (RANGEL-YAGUI et al.,
2004).
Sabe-se que tensoativos, de uma forma geral, são capazes de se ligarem a
proteínas. Em solução contendo uma proteína e um tensoativo iônico, a
desnaturação da proteína pode ocorrer como resultado de interações eletrostáticas e
hidrofóbicas (CARDAMONE et al., 1994). Neste sentido, os monômeros do
tensoativo iônico se ligam primariamente por interações eletrostáticas aos resíduos
de aminoácidos de carga oposta na superfície da proteína (ligação sítio-específica),
que induz expansão da estrutura terciária que, por sua vez, permite maior interação
das caudas apolares das moléculas do tensoativo com o interior apolar da proteína
(ligação cooperativa, não-específica) (RANGEL-YAGUI et al., 2003). Proteínas
hidrofílicas, como a G6PD, são capazes de se ligarem cooperativamente a
tensoativos iônicos, o que resulta em alterações conformacionais e até mesmo
desnaturação completa.
24
Figura 02 - Diversos tipos de geometria assumidos pelas micelas, dependendo do
tipo e concentração de tensoativo, temperatura, força iônica e pH. FONTE:
http://www.chemsoc.org/chembytes/ezine/2003/hargreaves_jul03.htm
Existem evidências consideráveis de que proteínas hidrofílicas, em geral,
interagem muito pouco com tensoativos não-iônicos e, portanto, não são
desnaturadas e nem incorporadas nas micelas desses tensoativos (GODDARD,
ANANTHAPADMANABHAN, 1993). Com base nisto, tensoativos não-iônicos, como
Triton X-114 e C
10
E
4
, são preferidos em relação às outras classes de tensoativos
(iônicos, zwitteriônicos) para a utilização em SMDFA. Entretanto, interações
hidrofóbicas não específicas entre tensoativos não-iônicos e proteínas podem
ocorrer em determinados casos. A BSA (Bovine Serum Albumine), por exemplo,
possui um “bolso apolar” na sua superfície capaz de acomodar 2 ou 3 moléculas de
tensoativos não-iônicos da série dos Tritons (GODDARD,
ANANTHAPADMANABHAN, 1993). Makino et al. (1973) investigaram a ligação do
Triton X-100 à BSA e identificaram quatro áreas principais de ligação hidrofóbica ao
tensoativo na proteína.
Bicamada
Sistema
hexagonal
Cilíndrica
Esférica
25
1.1. Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas - SMDFA
Os SMDFA exploram o fato de que algumas moléculas de tensoativo, sob
certas condições, são capazes de se separar espontaneamente em duas fases
aquosas, ainda que imiscíveis, sendo que proteínas e outras biomoléculas podem se
distribuir de forma desigual entre estas fases (LIU et al., 1998).
De um modo mais específico, uma solução aquosa de tensoativo não-iônico é
capaz de se separar macroscopicamente em duas fases, com o aumento da
temperatura, resultando num ambiente rico em micelas e outro pobre em micelas.
Como a concentração do tensoativo em ambas as fases excede a concentração
micelar crítica (CMC), micelas estão presentes tanto na fase superior quanto na fase
inferior (LIU et al., 1996). Ambas as fases contêm micelas cilíndricas, as quais
podem ser modeladas como micelas formadas por um corpo cilíndrico terminado em
duas micelas esféricas nas extremidades (VAN DEN BROEKE et al., 2006;
ROOSMALEN et al., 2004; PUVVADA, BLANKSCHTEIN, 1990; ZOELLER et al.,
1997). Contudo, as micelas presentes na fase micelar (rica em micelas) são maiores
(mais alongadas) e mais numerosas do que as presentes na fase pobre em micelas.
A distinção no ambiente físico-químico das duas fases formadas é a base da
utilização dos sistemas que envolvem processos de extração de materiais biológicos
(LIU et al., 1996). A Figura 03 apresenta um esquema do SMDFA.
O êxito desse sistema depende da habilidade em manipular a composição
das fases, influenciando no coeficiente de partição da molécula de interesse e na
seletividade. Existem muitas possibilidades para manipular a composição do sistema
de forma a obter fases com características diferenciadas, como por exemplo: (a)
escolha dos agentes tensoativos e de sua concentração; (b) escolha do tampão e da
26
força iônica; e (c) modificação química do tensoativo ligado à molécula com
afinidade à biomolécula-alvo (XU et al., 2003).
O fenômeno de separação de fases pode ser representado por uma curva em
forma de sino, denominada de curva binodal ou curva de coexistência, com
concavidade para cima ou para baixo dependendo da separação de fases ser
induzida pelo aumento ou pela diminuição da temperatura, respectivamente. A curva
binodal, desta forma, representa o limite, em função da temperatura e da
concentração de tensoativo, no qual a solução micelar se separa em duas fases
macroscópicas (NIKAS et al., 1992). Certos tensoativos não-iônicos, como os
derivados de óxido de polietileno, apresentam o fenômeno de separação de fases
induzido por aumento de temperatura (MITCHELL, 1983). Conseqüentemente, a
curva de coexistência possui concavidade voltada para cima e o sistema exibe um
ponto crítico inferior.
Figura 03 – Representação esquemática baseada no trabalho de Nikas et al. (1992)
de um sistema micelar de duas fases aquosas para o tensoativo não-iônico Triton X-
114. O sistema exibe uma única fase a baixas temperaturas; com o aumento da
temperatura, se separa em uma fase rica em micelas (fase concentrada) que
coexiste com uma fase pobre em micelas (fase diluída).
Particularmente, a separação de fases de uma solução do tensoativo não-
iônico C
10
E
4
(óxido de n-decil tetraetileno) resulta em uma fase superior rica em
Fase pobre
em micelas
Fase rica
em micelas
Solução micelar
homogênea
Aumento da
temperatura
27
micelas (fase concentrada) e uma fase inferior pobre em micelas (fase diluída). A
separação de fases do tensoativo não-iônico Triton X-114, por sua vez, resulta em
uma fase inferior rica em micelas (fase concentrada) e uma fase superior pobre em
micelas (fase diluída), como representado na Figura 03. Em ambos os casos,
entretanto, as duas fases são predominantemente aquosas, sendo compostas por
no mínimo 80% (p/p) de água (KAMEI, 2001a).
A Figura 04 representa um esboço da curva binodal do SMDFA para o
tensoativo não-iônico C
10
E
4
. Considerando-se que a curva binodal para este sistema
apresenta concavidade para cima, o ponto mínimo é denominado "ponto crítico
inferior", caracterizado pela temperatura crítica (T
c
) e pela concentração crítica de
agente tensoativo (X
c
), ambas destacadas no ponto crítico da curva binodal.
Figura 04 – Esquema da curva binodal de uma solução aquosa do tensoativo C
10
E
4
baseada no artigo de Liu et al. (1996). C
d
= concentração do tensoativo na fase
pobre em micelas; C
c
= concentração do tensoativo na fase rica em micelas; V
c
=
comprimento do segmento de reta da linha de amarração (tie-line) compreendido
entre C
d
e o valor da concentração total do tensoativo no sistema antes da
separação das fases (neste caso 4,12%) e cujo valor é proporcional ao volume da
fase rica em micelas; V
d
= comprimento do segmento de reta da linha de amarração
compreendido entre C
c
e o valor da concentração total do tensoativo no sistema
antes da separação das fases (neste caso 4,12%) e cujo valor é proporcional ao
volume da fase pobre em micelas.
Concentração de C
10
E
4
(%) p/p
Região Bifásica
Região
Monofásica
Ponto
Crítico
2%
18,8
“Tie-Line”
4,12%
C
d
C
c
V
d
V
c
T
°
°°
°
C
28
Considerável interesse tem sido verificado na utilização desses sistemas
micelares para a purificação e concentração de compostos como albumina,
bacteriófagos, antibióticos, colesterol oxidase, lisozima e outras enzimas, vitaminas
lipossolúveis e outros compostos orgânicos (CHENG-KANG, WEN-DA, 1998;
BORDIER, 1981; RAMELMEIER et al., 1991; SANCHEZ-FERRER et al., 1994; LIU
et al., 1998; LEE, SU, 1999; SIVARS, TJERNELD, 2000; TANI et al., 1998; CHIANG,
1999; QUINA, HINZE, 1999; SIRIMANNE et al., 1998; KAMEI et al., 2002c,
RANGEL-YAGUI et al., 2004).
O trabalho pioneiro que mostrou a possibilidade de extração de proteínas por
sistemas micelares, utilizando-se o tensoativo não-iônico Triton X-114, foi o de
Bordier, em 1981. Soluções aquosas de Triton X-114 se separam em duas fases
quando a temperatura é aumentada acima de 20°C. O trabalho desse autor mostrou
que as proteínas hidrofílicas eram encontradas predominantemente na fase pobre
em micelas enquanto que as proteínas com caráter hidrofóbico se encontravam na
fase rica em micelas. Posteriormente, Minuth et al. (1996) realizaram a purificação
da enzima colesterol oxidase em somente duas etapas, SMDFA seguido de
cromatografia de troca-iônica, obtendo um fator de purificação de 160 e recuperação
enzimática total de 80%. De forma semelhante, a enzima piruvato oxidase foi
altamente extraída na fase rica em tensoativo em extração mediada por micelas
(TANI et al., 1997).
O sistema possui inúmeras vantagens em relação às técnicas existentes de
purificação de biomoléculas, tais como:
• Proporciona meio favorável e ameno aos materiais biológicos, sendo que,
dependendo do tipo e concentração do tensoativo, a temperatura de extração
29
é de aproximadamente 20°C (BORDIER, 1981; LIU et al., 1995; SIRIMANNE
et al., 1998);
• Possui a habilidade de concentrar, além de proteínas, diferentes tipos de
compostos como íons metálicos, compostos orgânicos e bacteriófagos
(SAITOH, HINZE, 1995; LIU et al., 1998; QUINA, HINZE, 1999);
• Possui baixo custo, utilizando a princípio somente um composto químico para
a separação das fases e em baixas concentrações (QUINA, HINZE, 1999;
SIRIMANNE et al., 1998);
• É um método seguro, pois não utiliza compostos inflamáveis e explosivos
(SAITOH, HINZE, 1995);
• Gera resíduos de fácil manuseio (SAITOH, HINZE, 1995; SIRIMANNE et al.,
1998);
• Possibilita o controle e a otimização da partição de biomoléculas pelo ajuste
das características das micelas, como tamanho e forma, pela variação da
temperatura, da concentração do tensoativo e da adição de sais (LIU et al.,
1998);
• É de fácil ampliação de escala (LIU et al., 1995; PRYDE, 1986);
• Pode ter a seletividade da partição melhorada com a utilização de ligantes de
afinidade livres ou acoplados ao tensoativo, que podem ser específicos à
biomolécula-alvo, ou pela mistura de agentes tensoativos iônicos com não-
iônicos (LIU et al., 1998);
• Permite que a análise das amostras seja feita por diferentes técnicas, sem
causar interferência, como: cromatografia líquida, eletroforese, testes de
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), dentre outras (QUINA,
HINZE, 1999; SIRIMANNE et al., 1998);
30
• A separação do produto das moléculas de tensoativo após a purificação pode
ser facilitada pelo fato de as micelas serem auto-associativas (ou colóides de
agregação). Por exemplo, o produto pode ser separado dos monômeros por
ultrafiltração (LIU et al., 1995).
Quando comparado ao sistema polimérico de duas fases aquosas
(BOLOGNESE et al., 2005; TEOTIA et al., 2004; ABBOTT et al., 1990, 1991, 1992;
ALBERTSSON, 1986), o SMDFA apresenta uma série de características únicas e
desejáveis, incluindo a natureza auto-associativa das micelas, que permite o controle
e a otimização da partição por meio do ajuste das características micelares, como
tamanho e forma (LIU et al., 1996). É um processo mais simples que o SDFA, pois
para realizá-lo a princípio são necessários apenas dois componentes, água e
agente tensoativo.
Como mencionado anteriormente, a seletividade na partição de proteínas em
SMDFA pode ser otimizada pela presença de ligantes de afinidade (SAITOH et al.,
2004; GUZMAN et al., 1989; QUINA, HINZE, 1999). Se o ligante de afinidade isolado
apresentar partição direcionada para uma das fases do sistema, existe a
possibilidade deste influenciar a partição da proteína-alvo sem necessidade de
ligação covalente do ligante ao tensoativo (KRONER et al., 1982). É desejável,
portanto, que o ligante de afinidade particione de maneira desigual entre as fases de
um sistema micelar de duas fases aquosas e influencie a partição da proteína-alvo
para a mesma fase à qual ele migra, como esquematizado na Figura 05.
31
Figura 05 - Representação esquemática do comportamento esperado para uma
proteína em sistemas micelares de duas fases aquosas contendo ligantes de
afinidade em solução. O ligante deve influenciar a partição da proteína-alvo para a
mesma fase para a qual ele migra preferencialmente.
De maneira semelhante, se o ligante de afinidade for ligado covalentemente à
molécula de tensoativo, o tensoativo de afinidade resultante influenciará a partição
da proteína-alvo para a fase rica em micelas, isto é, fase concentrada, como
esquematizado na Figura 06.
Figura 06 - Representação esquemática do comportamento esperado para uma
proteína em sistemas micelares de duas fases aquosas contendo tensoativos de
afinidade em solução. O tensoativo de afinidade influenciará a partição da proteína-
alvo para a fase rica em micelas.
Tensoativo
de Afinidade
Proteína
Fase Concentrada
Rica em Micelas
Fase Diluída
Pobre em Micelas
Ligante de
Afinidade
Proteína
Fase C
oncentrada
Rica em Micelas
Fase Diluída
Pobre em Micelas
32
A partição de afinidade é baseada na interação específica entre a molécula-
alvo e o ligante de afinidade. Essa interação resulta em um complexo biomolécula-
ligante de afinidade que pode apresentar partição seletiva para uma das fases do
sistema e deixar substâncias e proteínas contaminantes na outra fase (XU et al.,
2003).
Os corantes derivados da triazina, Procion Red HE-3B e Cibacron Blue F3GA
(Figura 07), são amplamente utilizados como ligantes de afinidade para purificação
de desidrogenases (CHAMPLUVIER, KULA, 1992; CHANG et al., 1995; KRONER et
al., 1982; WANG et al., 1992). Estes corantes apresentam estruturas químicas que
lhes permitem mimetizar as coenzimas NAD(P)
+
(Figura 08) e a molécula de ATP,
devido à presença de partes hidrofóbicas, grupos carregados e alta flexibilidade
(KOPPERSCHLÄGER, 1994). De acordo com Kroner et al. (1982), estas
substâncias são apresentadas como inibidores competitivos da G6PD, com valores
de constantes de inibição (K
i
) de 18 µM (0,014 mg/g) e 20-50 µM (0,029-0,074 mg/g)
para cibacron blue e procion red, respectivamente. Portanto, a utilização de cibacron
blue e procion red como ligantes de afinidade para a G6PD em SMDFA apresenta-
se como uma alternativa interessante para otimização da purificação desta enzima.
O baixo custo de corantes de triazina possibilita que estes compostos substituam as
coenzimas em técnicas de purificação por afinidade (DEAN et al., 1986).
33
Procion Red HE-3B
Cibacron Blue F3GA
Figura 07 – Estrutura química dos corantes derivados da triazina Procion Red HE-
3B e Cibacron Blue F3GA, ambos inibidores da G6PD.
Os corantes de triazina podem ser combinados a algumas enzimas por
ligação não polar, mas o mecanismo ainda não está claro. Todas desidrogenases e
quinases apresentam um sítio de ligação nucleotídico o qual normalmente combina-
se com as coenzimas, como NAD
+
, NADP
+
e ATP (TJERNELD et al., 1987). O
corante Cibacron Blue F3GA, de uma forma geral, liga-se mais facilmente a enzimas
NAD
+
dependentes, como lactato desidrogenase (LDH) ou G6PD. O Procion Red
HE-3B, por sua vez, apresenta maior afinidade por enzimas dependentes de NADP
+
(LIN, ZHU, 1996).
+
-
-
+
+
+
-
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
34
Figura 08 – Estrutura química da coenzima NADP
+
, a qual se liga a um sítio
específico na G6PD.
Embora existam vários trabalhos a respeito da utilização dos compostos
citados (corantes derivados da triazina) como ligantes de afinidade em técnicas
cromatográficas (CHAMPLUVIER, KULA, 1992; CHANG et al., 1995; TAKAHASHI et
al., 2000) e até mesmo na purificação de G6PD por sistemas poliméricos de duas
fases aquosas (KRONER et al., 1982; WANG et al., 1992), a utilização de ligantes
livres ou ligados a tensoativos para purificação de enzimas por SMDFA ainda é
muito pouco explorada.
Estudos prévios com os corantes de triazina como ligantes de afinidade livres
em SMDFA demonstraram que estes não influenciam de forma significativa a
partição da G6PD (RANGEL-YAGUI, 2003). Desta forma, no presente trabalho, foi
estudado o efeito da ligação covalente entre o ligante de afinidade cibacron blue e
tensoativo não-iônico na partição da G6PD em SMDFA.
H
N
O
NH
2
H
H
O
OHOH
O
P
O
O
P
O
-
O
O CH
2
-
O
N
N
N
N
NH
2
H
CH
2
H
H
OROH
H
O
+
H
N
O
NH
2
H
H
O
OHOH
O
P
O
O
P
O
-
O
O CH
2
-
O
N
N
N
N
NH
2
H
CH
2
H
H
OROH
H
O
+
OH
35
1.2. Adição de Sais ao SMDFA
A adição de sais a um sistema micelar de duas fases aquosas resulta em
interações eletrostáticas com as moléculas de água mais fortes que as pontes de
hidrogênio que ocorrem entre a cabeça polar dos tensoativos e a água. Assim, as
moléculas de água são direcionadas preferencialmente para a solvatação dos íons
provenientes do sal e as moléculas anfifílicas interagem mais entre si do que na
ausência do sal. Então, para tensoativos derivados de polióxido de etileno a
separação de fases ocorre em temperatura mais baixa, já que a água interage mais
com o sal dissociado no meio do que com os monômeros do tensoativo,
conseqüentemente, o ponto de névoa (cloud point) diminui (CARALE, 1993;
ZOURAB et al., 1991).
A composição do sal é outra variável de suma importância na partição de
moléculas em SMDFA. Diferenças significativas no coeficiente de partição das
proteínas podem ocorrer em função do tipo de sal. Isto significa que diferentes íons
podem apresentar diferentes afinidades pelas duas fases (HARRIS et al., 1994;
UMAKOSHI et al., 1996; COSTA et al., 1998). Por exemplo, em um sistema não
micelar como PEG/Fosfato, os sais de fosfato têm maior afinidade pela fase inferior
do sistema de duas fases, os sais de lítio têm maior afinidade pela fase superior
(PEG) e o NaCl tem afinidade similar pelas duas fases. Os sais que possuem
distribuição diferenciada entre as fases são importantes para o sistema, pois podem
gerar diferença de potencial eletrostático entre as fases. Neste sentido, a partição
dos íons fosfato para a fase inferior cria um potencial elétrico com carga negativa
nesta fase que força a partição das macromoléculas ou células carregadas
negativamente para a fase superior. Com o aumento da concentração de NaCl, o
efeito da distribuição desigual dos íons fosfato pode ser reduzido ou eliminado.
36
Portanto, a mudança na composição iônica pode influenciar significantemente o
coeficiente de partição de uma molécula (HARRIS, 1992).
A adição de sais neutros (aqueles provenientes da neutralização total de um
ácido ou de uma base, que na sua fórmula não aparece H
+
e nem OH
-
), tal como
NaCl, em um sistema PEG/Dextrana diminui o coeficiente de partição das proteínas
carregadas negativamente e aumenta o coeficiente de partição das proteínas
carregadas positivamente. A magnitude do efeito apresenta-se na seguinte ordem:
SO
4
-2
< F
-
< Cl
-
< I
-
e NH
4
+
< Na
+
< K
+
(CASCONE et al., 1991; HUDDLESTON et al.,
1991; SCHMIDT et al., 1996).
Nos estudos de partição da vancomicina (um antibiótico glicopeptídeo) em
sistema de duas fases aquosas, foi mostrado que o coeficiente de partição aumenta
com a adição de sais. No sistema PEG/Fosfato, o coeficiente de partição aumentou
de 4 para 120 quando 8,8% de NaCl foi usado, enquanto que com a mesma
concentração de NaCl em sistema PEG/Dextrana o coeficiente de partição
aumentou de 1,55 para 5 (LEE, SANDLER, 1990). Nos estudos realizados com
taumatina (um edulcorante) o coeficiente de partição também aumentou com a
adição de NaCl. Quando foi feita a adição de 8,8% de NaCl no sistema PEG-
6000/Fosfato o coeficiente de partição desta proteína aumentou significativamente
(K = 0,53 para K = 33 ou 62 vezes) (CASCONE et al., 1991). Segundo Lahore et al.
(1995), em experimentos utilizando sistema PEG-3350/Fosfato, o valor de K
aumentou de 1,1 para 35 quando foi adicionado 5,8% de NaCl. Para o sistema PEG-
3350/Sulfato a adição de 8,8% de NaCl promoveu um aumento no valor de K de
0,32 para 33.
É bem conhecido que determinados íons afetam as ligações de solutos
carregados em membranas. Seus efeitos têm sido muito investigados na avaliação
37
de variação na solubilidade de solutos carregados em água ou em suas distribuições
entre o meio aquoso e solventes orgânicos (COLLINS, WASHABAUGH, 1985;
LONG, MCDEVIT, 1952). Em relação a sistemas biológicos, também têm sido
investigados os fenômenos de desenovelamento de proteínas e ácidos nucléicos e
dissociação de complexos macromoleculares pela ação de íons (HIPPEL,
SCHLEICH, 1969; ARAKAWA, TIMASHEFF, 1985; SCHRIER, SCHRIER, 1967;
ALTEKAR, 1977; DAMODARAN, KINSELLA, 1981, 1983; SIHAG, DEUTSCHER,
1983; HATEFI, HANSTEIN, 1969; NANDI, EDELHOCH, 1984; WETLAUFER et al.,
1964; KUHARSKI, ROSSKY, 1984).
Íons da série de Hofmeister originalmente foram classificados a partir da sua
capacidade de precipitar misturas de albumina. Estes íons apresentam utilidades
diversas, que incluem efeito gradativo na estruturação ou desnaturação de
macromoléculas biológicas (COLLINS, WASHABAUGH, 1985). Um efeito similar tem
sido observado com a adição de sal em enzimas liofilizadas (RU et al., 2000). A
característica mais estudada nos íons desta série é sua capacidade em alterar a
estrutura da água, uma vez que têm a propriedade de modificar as ligações naturais
da estrutura da mesma, tendo efeito similar ao aumento da temperatura ou da
pressão (LI et al., 1998). Desta forma, como os íons alteram a formação natural das
pontes de hidrogênio, as moléculas de água se ordenam de forma diferente ao redor
de cada íon. Assim, pode-se classificar o íon como mais (menos) hidratado quanto
mais (menos) moléculas de água se organizam ao seu redor.
Os íons da série de Hofmeister são classificados quanto a sua atuação na
estrutura da água e propriedade de estabilizar proteínas de duas formas (COLLINS,
WASHABAUGH, 1985): os íons cosmotrópicos (exemplos: sulfato, fosfato, cloreto)
38
aumentam a estrutura da água e estabilizam proteínas enquanto os caotrópicos
(exemplos: tiocianato, perclorato) decrescem a estrutura da mesma e desestabilizam
as proteínas, deixando o meio aquoso menos hidrofóbico. Isto explica o decréscimo
do poder de solubilidade da água pela ação de íons cosmotrópicos que aumentam a
partição de solutos em solventes orgânicos, enquanto o oposto é observado para
íons caotrópicos. No caso de agregados micelares na presença de sais, além do
efeito de solvatação dos íons, que altera a CMC (concentração micelar crítica) e que
pode ou não alterar o número de agregação (número de monômeros de tensoativo
que constituem cada micela) (ANACKER, GHOSE, 1963; SUDHÖLTER,
ENGBERTS, 1979; SCHOTT et al., 1984; TONOVA, LAZAROVA, 2005), também
observa-se a ligação direta de íons às micelas (QUINA, CHAIMOVICH, 1979;
ROMSTED, 1984; BROCHSZTAIN et al., 1990) afetando a organização e a
interação eletrostática entre os grupos cabeça polar. O grau de ligação de íons a
tensoativos carregados e zwitteriônicos aumenta com o tamanho e a polarizabilidade
do íon (QUINA, CHAIMOVICH, 1979; ROMSTED, 1984; BROCHSZTAIN et al.,
1990). Isto está de acordo com a tendência de decréscimo da CMC (ANACKER,
GHOSE, 1963; SUDHÖLTER, ENGBERTS, 1979; SCHOTT et al., 1984).
Estudos da interação de íons com bicamadas fosfolipídicas mostraram que os
íons da série de Hofmeister se ligam em fosfolipídios zwitteriônicos (BAGLIONI et al.,
1990; ALMEIDA et al., 1994), e que ânions monovalentes interagem mais que
cátions monovalentes (TOCANNE, TEISSIE, 1990). Foi ainda proposto que a ligação
de íons da série de Hofmeister ao grupo cabeça polar causa liberação da água de
hidratação (TATULIAN, 1993).
Com relação à partição de solutos em micelas e bicamadas, é bem conhecido
que a adição de íons da série de Hofmeister à fase aquosa afeta a ligação de
39
espécies carregadas (LEE, SCHREIER, 1993). Como a partição de solutos em
bicamadas e micelas é uma conseqüência das afinidades relativas dos solutos nos
meios aquosos e menos polares, variações no coeficiente de atividade do soluto em
água, promovidas por agentes externos, devem induzir variações no teor de ligação
destas moléculas às micelas ou bicamadas.
Se se considerar a água como estrutura agregada, em que existe um
ordenamento em camadas mais internas dos agregados, poder-se-á explicar o fato
de íons menores serem mais fortemente hidratados em função também de em tais
íons haver densidade de carga, o que cria uma espécie de ordem local nos
agregados. Normalmente, íons monovalentes com baixa densidade de carga
(exemplos: H
2
PO
4
-
, HSO
4
-
, I
-
, K
+
, Cs
+
, etc) que apresentam interação mais fraca com
a água do que a interação “água-água”, isto é a interação de dipolo entre as
moléculas de água, são caotrópicos. Estes íons isoladamente carregados
comportam-se como moléculas hidrofóbicas, associando as interações de tensões
superficiais na estrutura da água, que ocorrem não apenas com a interação de carga
mas também pela interação de van der Waals (interação independente de carga).
Em contrapartida, os íons menores são cosmotrópicos, ou seja, são “estruturadores”
da água (exemplos: SO
4
-2
, HPO
4
-2
, Mg
+2
, etc), e assim, exibem interação mais forte
com as moléculas de água do que a interação “água-água” (MULLER, 1988).
A solubilidade das proteínas é determinada, fundamentalmente, pela estrutura
primária, que define a relação espacial entre os aminoácidos na estrutura
tridimensional e sua interação com a água. Por outro lado, características do meio,
tais como pH, concentração de sais e constante dielétrica do solvente, interferem na
solubilidade. A variação da carga líquida de uma proteína tem implicações na sua
solubilidade. No ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a
40
carga global da proteína é nula, a solubilidade é menor do que em outros valores de
pH. As proteínas apresentam também alteração da solubilidade em função da
concentração de sais.
Muitas proteínas globulares são insolúveis em água e tornam-se cada vez
mais solúveis com a adição de sal até certas concentrações limitantes, que
dependem da proteína e do tipo de sal escolhido. Este efeito é chamado de “salting-
in”; acredita-se que os íons adicionais (positivos e negativos) presentes em solução
interagem com os grupos carregados das moléculas de proteína, atenuando a
interação entre elas. Desse modo, o efeito eletrostático de íons em soluções salinas
diluídas é um fator adicional para o aumento da solubilidade das proteínas. Quando
a concentração de sal atinge valores elevados, resulta em aprisionamento das
moléculas de água para solvatação dos íons, assim as moléculas de água
ordenadas em torno das regiões hidrofóbicas da proteína se tornam escassas e
essas regiões ficam expostas, podendo interagir e se agregar entre si. Tal efeito,
conhecido como “salting-out”, ocorre com sais di ou trivalentes ((NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4
,
por exemplo) que competem com a proteína por moléculas de água para a
solvatação. Conseqüentemente, as interações proteína-proteína tornam-se mais
fortes que as interações proteína-solvente, a proteína sofre agregação e precipita.
Como cada proteína precipita em uma faixa de concentração salina característica, o
salting-out pode ser empregado para separar proteínas.
De fato, esta técnica costuma ser etapa inicial de processos de purificação de
proteínas. O sal mais utilizado é o sulfato de amônio ((NH
4
)
2
SO
4
) devido à sua
solubilidade, que permite obter soluções muito concentradas. Além disso, este sal,
por razões desconhecidas, estabiliza a estrutura nativa das proteínas, o que
possibilita que elas precipitem sem sofrer desnaturação (MARZZOCO, TORRES,
41
1999; KABIR et al., 2003; PESSOA-JR, KILIKIAN, 2005; INOUE et al., 2004; HEY et
al., 2005).
A adição de sais, mesmo que em concentrações milimolares, pode influenciar
a partição de moléculas eletricamente carregadas. Embora os sais se distribuam
quase que igualmente entre as fases, existem pequenas, mas significativas,
diferenças nos coeficientes de partição de diferentes íons, o que cria uma diferença
de potencial elétrico entre as fases que, por sua vez, pode direcionar a partição de
moléculas biológicas carregadas (SARUBBO et al., 2000).
Desta forma, com a adição de sais em SMDFA contendo os tensoativos não-
iônicos Triton X-114 e C
10
E
4
é possível que ocorra aumento na partição da proteína-
alvo para a fase concentrada (rica em micelas) por efeito de salting-out, o que
consistiria em nova alternativa para a otimização da purificação da enzima G6PD em
SMDFA.
1.3. Enzimas
As enzimas são geralmente proteínas globulares que variam em massa
molecular de aproximadamente 10.000 a muitos milhões de Daltons. As enzimas
funcionam como agentes catalíticos específicos a uma reação particular; reduzem a
energia de ativação, sem aumentar a temperatura e a pressão no interior da célula,
atuando em uma substância específica denominada substrato. Algumas consistem
inteiramente de proteínas, a maior parte consiste de uma porção protéica chamada
apoenzima e uma região não-protéica chamada cofator. Juntos, a apoenzima e o
cofator formam a holoenzima (enzima completa). O cofator pode ser um íon metálico
(ex.: Mg
+2
, Zn
+2
) ou uma molécula orgânica complexa. As coenzimas são compostos
que podem auxiliar as enzimas pela admissão de átomos removidos de substrato ou
42
pela doação de átomos requeridos pelo substrato. Algumas atuam como carreadores
de elétrons, removendo-os do substrato e doando-os a outras moléculas em reações
subseqüentes. Muitas coenzimas são derivadas de vitaminas, duas das mais
importantes coenzimas no metabolismo celular são a Nicotinamida Adenina
Dinucleotídeo (NAD
+
) e a Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADP
+
)
(TORTORA et al., 2000).
Até recentemente admitia-se que todos os catalisadores biológicos (enzimas)
fossem protéicos. Entretanto, há pouco mais de uma década foram caracterizadas
certas reações celulares que têm como catalisadores determinadas moléculas de
RNA, as quais apresentam um comportamento semelhante às proteínas
enzimáticas, obedecendo também à cinética de Michaelis-Menten. Seu emprego nas
reações metabólicas, entretanto, está restrito a alguns casos especiais
(MARZZOCO, TORRES, 1999).
As enzimas desempenham importante papel funcional em alimentos e
medicamentos, assim como em sistemas biológicos. O uso crescente desses
catalisadores em processos industriais deve-se à alta sensibilidade e especificidade,
bem como ao avanço das pesquisas em genética, somados à tecnologia de
processos fermentativos, na área de produção de enzimas (HALL, 1996). A
utilização de enzimas em escala industrial é de fundamental importância, devendo
ser analisada, no entanto, a relação custo/benefício.
A especificidade enzimática é baseada, em grande parte, na estrutura
tridimensional altamente ordenada que se justapõe aos grupamentos específicos
dos aminoácidos de tal modo a formar sítios estereoespecíficos de ligações com
substrato e cofatores. Esta estrutura terciária é mantida principalmente por um
grande número de ligações não covalentes fracas, conferindo à enzima uma
43
estrutura macromolecular muito delicada (SEGEL, 1979). A atividade catalítica da
enzima depende da integridade da sua conformação molecular nativa. Esta atividade
geralmente se perde caso a enzima seja desnaturada ou dissociada em
subunidades (quando possuir estrutura quaternária) (LEHNINGER et al., 1995).
A velocidade da maioria das reações químicas aumenta com a elevação da
temperatura, a qual proporciona maior energia cinética às moléculas de reagente e,
conseqϋentemente, maior número de colisões por unidade de tempo. Para reações
enzimáticas, no entanto, a elevação além de determinada temperatura reduz
drasticamente a velocidade de reação. Este decréscimo é devido à desnaturação da
enzima, ou seja, a perda de sua estrutura tridimensional (configuração terciária)
característica. A desnaturação de uma enzima envolve a ruptura de ligações de
hidrogênio e de outras ligações não-covalentes que leva à perda de atividade
catalítica (TORTORA et al., 2000).
Na maioria dos casos a solubilidade de uma enzima aumenta com a
temperatura, dentro de uma faixa de 0 a 40-50°C. Quando as estruturas secundárias
e terciárias de uma proteína são alteradas, os grupos hidrofóbicos interagem e
reduzem a hidratação da molécula. Essas interações hidrofóbicas levam à
agregação seguida de coagulação e precipitação. Em baixas temperaturas pode
também ocorrer, em alguns casos, desestabilização das proteínas, isto quando o
principal fator de estabilização da estrutura terciária de uma enzima for devido às
interações hidrofóbicas. Esta interação é mais fraca quando submetida a baixas
temperaturas. Pode-se ainda observar que, em alguns casos, baixas temperaturas
provocam dissociação de subunidades de oligômeros protéicos e desestabilizam a
proteína (HALL, 1996).
44
A quantidade de calor necessária para desnaturar uma enzima varia de
acordo com a estrutura da molécula, pois esse processo depende também do pH,
força iônica do meio e presença de outros componentes como os agentes
tensoativos. Em valores de pH extremos, por exemplo, a quantidade de calor
necessária para desnaturar uma enzima é diminuída, assim como em valores de pH
próximos ao pI. Portanto, dado que a estrutura nativa de uma enzima é importante
para sua funcionalidade, é fundamental trabalhar com valores de temperatura em
que a enzima permaneça estável (HALL, 1996).
A maioria das enzimas apresenta valor de pH ótimo, no qual sua atividade é
caracteristicamente máxima. Acima ou abaixo deste valor de pH, a atividade
enzimática, e portanto a velocidade de reação, diminui. Quando a concentração de
íons H
+
(pH) no meio varia, a estrutura tridimensional das proteínas é alterada.
Variações extremas no pH podem causar desnaturação enzimática (TORTORA et
al., 2000).
O custo das enzimas depende dos métodos físicos e químicos usados em sua
produção. Critérios de qualidade como pureza, atividade e estabilidade interferem de
modo decisivo sobre o custo final e, portanto, a escolha da biomolécula de interesse
(por exemplo uma enzima) pode ser otimizada analisando-se e modificando-se cada
um deles em particular. De maneira geral, os processos de produção variam muito e
enzimas que são comercializadas com vendas anuais acima de 10.000 toneladas
custam entre US$5.00 e US$30.00 por quilograma. Quando as vendas estão
limitadas abaixo de uma tonelada, são negociadas a US$50,000 por quilograma;
enzimas terapêuticas podem custar até US$5,000 por grama (SAID, PIETRO, 2004).
45
1.4. Enzima Glicose-6-Fosfato Desidrogenase – G6PD
A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, G6PD (D-glicose-6-fosfato: NADP
- oxidorredutase, EC 1.1.1.49), é uma proteína intracelular encontrada em células de
animais, vegetais e microorganismos. A G6PD é de grande importância para a
sobrevida das células, uma vez que é responsável pela manutenção de um nível
adequado da coenzima NADPH na forma reduzida (SEVERO, 1979), e participa da
regulação do ciclo das pentoses (proporciona uma forma de efetuar a combustão
total da glicose, independentemente do ciclo do ácido cítrico). A enzima, classificada
como oxidorredutase, é a primeira do processo oxidativo da via pentose-fosfato, que
converte a glicose-6-fosfato a 6-fosfoglucono-δ-lactona, utilizando NADP
+
ou NAD
+
e
gera pentoses para a síntese de nucleotídeos, assim como NADPH/NADH para a
utilização em biossínteses redutivas e proteção contra estresse oxidativo, como
esquematizado na Figura 09 (COSGROVE et al., 1998; ÖZER et al., 2001;
ROWLAND et al., 1994).
A deficiência enzimática de G6PD corresponde a uma das enzimopatias mais
freqüentes em humanos, resultando de mais de 90 mutações genéticas diferentes
(CHIM et al., 2001; OZMEN et al., 2004). Em Hong Kong e no sul da China, 4 a 6%
da população masculina são deficientes em G6PD. A deficiência da enzima causa
anemia hemolítica após exposição a estresse oxidativo, ou devido à certas infecções
como hepatite (CHIM et al., 2001; KRZELJ et al., 2001).
Essa enzima também apresenta grande interesse como reagente analítico,
sendo utilizada em vários ensaios quantitativos, incluindo a determinação de
atividade de creatina-quinase para diagnóstico de doenças cardíacas e de músculo
esquelético, medidas de concentração de hexoses e marcador de
enzimaimunoensaios (LOJUDICE et al., 2001). Como biossensor, a G6PD pode
46
monitorar rapidamente a concentração de glicose-6-fosfato no sangue com menor
custo e consumo de tempo do que os métodos tradicionais, como cromatografia e
espectroscopia (BASSI et al., 1999). A G6PD também pode ser usada de forma
eficiente e precisa para identificar e quantificar moléculas de glicose liberadas após
hidrólise do amido em sucos, mesmo na presença de pedaços de frutas, compostos
coloridos, elevadas concentrações de sacarose e outros tipos de polissacarídeos
(CHATEL et al., 1996). Além disso, a G6PD pode ser empregada para a
determinação de glicose em sistema de reator em fluxo contínuo, pois o NADPH
formado pela reação enzimática pode ser facilmente detectado
espectrofotometricamente ou fluorometricamente (MORI et al., 1999; FREY et al.,
1999). Essa enzima pode, ainda, detectar baixíssimos níveis de estreptavidina e
biotina por ensaios de bioluminescência em reações de hibridização de DNA, sem
perda da atividade enzimática (TEROUANNE et al., 1989; BALAGUER et al., 1989).
Glicose-6-fosfato + NADP
+
6-fosfoglucono-δ-lactona + NADPH + H
+
Figura 09 – Esquema da reação catalisada pela G6PD: A glicose-6-fosfato é
oxidada a 6-fosfoglucono-δ-lactona, enquanto que a coenzima NADP
+
é reduzida.
Na maioria das espécies, a G6PD (Figura 10) apresenta subunidade com
massa molar de 50-60 kDa, correspondendo a aproximadamente 500 resíduos de
aminoácidos. Essa enzima normalmente aparece na forma de dímeros ou
tetrâmeros (ROWLAND et al., 1994), sendo que as G6PD provenientes de
G6PD
(enzima)
(Substrato)
(Coenzima)
(Produtos)
G6PD
47
Leuconostoc mesentedoides e Saccharomyces cerevisiae, utilizadas neste trabalho,
são dímeros (COHEN, ROSEMEYER, 1969; ZAITZEVA et al., 1997), enquanto que
a humana constitui-se em equilíbrio dímero-tetrâmero (ROWLAND et al., 1994). O
pH ótimo de atividade da enzima G6PD é aproximadamente 7,8 e o ponto isoelétrico
4,6 (OLIVE, LEVY, 1971; ISHAQUE et al., 1974; ROWLAND et al., 1994;
COSGROVE et al., 1998).
Figura 10 - Estrutura da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) de L.
mesenteroides (dímero). O substrato G6P e a coenzima NADP
+
aparecem ligados a
seus sítios específicos (VOUGHT et al., 2000).
De acordo com alguns catálogos comerciais (SIGMA
®
, por exemplo) a G6PD
pode ser obtida de diversas fontes, tais como a levedura de panificação, Torula,
Bacillus stearothermophillus, Leuconostoc mesenteroides, adrenais de bovinos e
eritrócitos humanos.
A purificação industrial da enzima G6PD tem sido feita através de processos
de múltiplas etapas, os quais envolvem técnicas de alto custo, como cromatografia
de afinidade e de troca iônica (CHAMPLUVIER, KULA, 1992; CHANG, CHASE,
1996; CHANG et al., 1995; MCCREATH et al., 1995). Portanto, o custo desta enzima
como reagente analítico é elevado, o que torna bastante interessante a pesquisa de
novas estratégias mais simples e econômicas para sua purificação. O
G6P
(Substrato)
NADP
+
(Coenzima)
48
desenvolvimento de tecnologia própria para produção, extração e purificação de
G6PD é de grande importância para o Brasil, visto que toda enzima consumida no
país é importada.
49
2. OBJETIVOS
Estudar de forma teórica e prática novas alternativas para a purificação da
enzima G6PD, por meio da utilização de Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas
(SMDFA). Para que o objetivo proposto fosse alcançado, os seguintes objetivos
específicos foram estabelecidos:
• Estudar a partição da G6PD pura em SMDFA composto pelo tensoativo
C
10
E
4
e SMDFA composto pelo tensoativo Triton X-114, na presença ou
não de ligantes de afinidade livres em solução;
• Sintetizar o tensoativo de afinidade, por meio da ligação covalente do
cibacron blue ao tensoativo não-iônico Triton X-114;
• Construir diagramas de fases para os sistemas micelares estudados;
• Estudar a partição da G6PD pura em SMDFA contendo o tensoativo de
afinidade sintetizado;
• Estudar a partição da G6PD pura em SMDFA contendo o tensoativo Triton
X-114, na presença dos sais (NH
4
)
2
SO
4
e Na
2
SO
4
;
• Testar uma condição pré-estabelecida e verificar a partição da enzima
pura proveniente de homogeneizado celular de Saccharomyces
cerevisiae. Comparar o rendimento de extração e coeficiente de partição
obtido para a G6PD na forma pura, com o obtido para a enzima
proveniente do homogeneizado celular de S. cerevisiae;
• Estudar os parâmetros cinéticos e termodinâmicos da G6PD antes e após
a purificação em sistema selecionado.
50
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
O tensoativo não-iônico óxido de n-deciltetraetileno (C
10
E
4
) foi adquirido da
Nikko Chemicals (Japão), a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) de L.
mesenteroides, a glicose-6-fosfato (G-6-P) e o fosfato de
β
-nicotinamida adenina
dinucleotídeo (
β
-NADP
+
) foram todos obtidos da Sigma (EUA). Todos os outros
reagentes utilizados foram de grau analítico. Todas as soluções foram preparadas
em tampão de Mcllvaine pH 7,2, consistindo de 16,4 mM de fosfato de sódio
dibásico e 1,82 mM de ácido cítrico. Foi utilizada água purificada por sistema
Millipore tipo Milli-Q. Para evitar contaminação com detergentes, toda a vidraria
utilizada nos experimentos foi lavada em banho de hidróxido de sódio 1 M em
solução alcoólica a 50%, seguido de um banho de ácido nítrico 1 M, enxaguada
abundantemente com água Milli-Q e, finalmente, seca em estufa a 90°C.
3.2. Determinação da Concentração de G6PD
A determinação da concentração da glicose-6-fosfato desidrogenase em
solução aquosa, contendo ou não tensoativo, foi baseada no ensaio enzimático
(BERGMEYER, 1983), com algumas alterações devido às condições dos
experimentos de partição. Desta forma, o tampão Mcllvaine foi utilizado ao invés de
tampão Tris-HCl e a temperatura foi reduzida de 37°C para 15°C para prevenir a
ocorrência de turbidez/separação de fases durante a medida de atividade. A
concentração de G6PD foi considerada proporcional à atividade enzimática medida,
determinando-se a velocidade de formação de NADPH, o qual absorve em
comprimento de onda UV de 340 nm (coeficiente de extinção molar E = 6.220 M
-1
cm
-
1
). As quantidades de cada reagente na cubeta, para a leitura de absorbância, foram:
51
600 µL de tampão McIlvaine pH 7,2; 15 µL de solução glicose-6-fosfato 250 Mm; 5
µL de solução de NADP
+
131 mM e 20 µL de amostra contendo G6PD a ser
determinada. O aumento de absorbância foi acompanhado por sessenta segundos
logo após adição da amostra, em aparelho espectrofotométrico Beckman DU-640.
Uma unidade de G6PD (U) foi definida como a quantidade de enzima que catalisa a
redução de 1 µmol de NADP
+
por minuto, nas condições de ensaio.
3.3. Determinação da Concentração de Cibacron Blue e de Procion Red
A concentração dos ligantes de afinidade cibacron blue e procion red foi
determinada por medida espectrofotométrica de absorbância em espectrofotômetro
Beckman DU-640. Para determinação do comprimento de onda a ser utilizado, uma
varredura do espectro visível foi realizada, sendo encontrado um pico de
absorbância em λ = 611 nm para cibacron blue e um pico em λ = 515 nm para
procion red. Dessa forma, foram construídas curvas de calibração de absorbância
(λ
max
) em função da concentração de cada ligante em solução aquosa. Nas análises
de concentração de cibacron blue e procion red em soluções contendo C
10
E
4
ou
Triton X-114 (fase concentrada e diluída do sistema de duas fases aquosas), foi
considerada a interferência do tensoativo por intermédio da medida de absorbância
de soluções de tensoativos de concentração igual à da amostra a ser determinada.
Esse valor foi então subtraído do valor obtido para a amostra contendo ligante de
afinidade.
As curvas de calibração de absorbância (λ
max
) em função da concentração
dos corantes podem ser visualizadas no Apêndice A.
52
3.4. Determinação da Concentração Total de Proteínas
A concentração total de proteínas no sistema, antes e após a separação de
fases, foi determinada pelo método de BCA (ácido bicinconínico) (SMITH et al.,
1985). Este método baseia-se na reação das ligações peptídicas e cadeias laterais
dos aminoácidos cistina, cisteína, triptofano e tirosina com o Cu
2+
em solução
alcalina, reduzindo-o a Cu
+
. O Cu
+
, por sua vez, forma um complexo solúvel em
água com duas moléculas de BCA, de cor púrpura, que absorve fortemente a 562
nm. Portanto, em tubo de ensaio foram adicionados 50 µL da amostra contendo
proteínas e 1 mL do reagente de BCA na proporção de 1:50, preparado a fresco pela
mistura de solução de sulfato cúprico (CuSO
4
.5H
2
O) a 4% com solução constituída
de 1% de BCA sódico, 0,16% de tartarato de sódio, 0,4% de hidróxido de sódio
(NaOH) e de 0,95% de bicarbonato de sódio (pH 11,25, ajustado com NaOH). O
tubo foi incubado a 37°C por trinta minutos. Após este período, o tubo foi resfriado à
temperatura ambiente e a absorbância da solução lida a 562 nm em
espectrofotômetro Beckmann DU-640, utilizando-se água deionizada como branco.
A concentração total de proteínas na amostra foi então obtida a partir de curva de
calibração (Apêndice B) construída com base em soluções de albumina de soro
bovino (BSA) com concentrações variando de 20 a 2.000 mg/L.
3.5. Determinação da Condutância Elétrica das Fases do SMDFA Contendo
Sais
A condutância de cada fase obtida após a separação das fases por SMDFA
foi determinada em condutivímetro MPC 227 (METTLER TOLEDO). A calibração do
aparelho foi feita por meio de leitura de solução padrão de 12,88 mS/cm e ar
ambiente. As amostras de cada fase concentrada e diluída em micelas foram
53
diluídas para um volume total de 3 mL previamente à realização das medidas de
condutância elétrica.
3.6. Teste de Cromatografia em Camada Delgada
O ensaio em cromatografia por camada delgada se deu por meio da utilização
de placa de alumínio revestida de sílica gel (Sílica gel 60 F
254
, MERCK) em câmara
saturada com o solvente acetato de etila. As amostras foram gotejadas num mesmo
volume nas placas de sílica a fim de se avaliar o deslocamento das bandas
referentes a cada amostra. O ensaio foi realizado à temperatura ambiente;
posteriormente, a leitura da camada delgada se deu por luz UV, pois o Triton X-114
apresenta em sua estrutura um anel aromático que absorve ultravioleta (ver
Apêndice I).
3.7. Efeito dos Tensoativos Não-Iônicos Triton X-114 e C
10
E
4
na Atividade da
G6PD
Os sistemas foram preparados em tubos de ensaio de 10 mL, pela adição de
G6PD e tensoativo (Triton X-114 e C
10
E
4
) nas quantidades desejadas em tampão
Mcllvaine, resultando num sistema de massa total de 1 g. O ensaio enzimático de
G6PD é bastante sensível, por isso foi utilizada uma concentração de apenas
0,0068% (p/p) de enzima. Os componentes do sistema micelar foram acrescentados
por pesagem e o sistema homogeneizado em agitador orbital
(Barnstead/Thermolyne, modelo 400110) a 8 rpm. Posteriormente, o sistema foi
transferido para um banho termorregulado, com valor de temperatura previamente
ajustado abaixo do ponto de turvação de cada tensoativo estudado, ou seja, 19°C
para o Triton X-114 e 15°C para o C
10
E
4
, e mantido em repouso por uma hora. Após
54
este período, foram coletadas amostras e foi realizada a análise de atividade
enzimática. Para o cálculo do balanço de atividade ou atividade residual em cada
sistema, determinou-se ainda a atividade enzimática na solução estoque de enzima
pura em tampão (sem ser submetida ao sistema com tensoativo). Os experimentos
foram feitos em triplicata e calcularam-se os respectivos desvios-padrões e
intervalos de confiança.
3.8. Efeito do Triton X-114 no Padrão de Absorção UV da Coenzima
NADP
+
/NADPH
Para a determinação do efeito do Triton X-114 no padrão de absorção UV da
coenzima NADP
+
/NADPH, foram preparados sistemas com 2, 4 e 8% (p/p) do
tensoativo estudado e 0,655 mM da coenzima. O estudo foi realizado para coenzima
na forma oxidada (NADP
+
), na forma reduzida (NADPH) e soluções de Triton X-114,
sem a presença da coenzima. Os sistemas foram estocados a 19°C por um período
de uma hora e, em seguida, as amostras foram lidas a 340 nm. Todos os ensaios
foram feitos em duplicata.
3.9. Preparação do SMDFA
Os SMDFA foram preparados à temperatura ambiente em tubos de ensaio de
10 mL, pela adição dos componentes nas respectivas etapas de estudo. Adicionou-
se G6PD pura ou homogeneizado celular de S. cerevisiae contendo G6PD nas
quantidades desejadas, tensoativo (Triton X-114 ou C
10
E
4
), ligante de afinidade
(cibacron blue ou procion red) e sal ((NH
4
)
2
SO
4
ou Na
2
SO
4
) em tampão Mcllvaine, o
que resultou num sistema de massa total de 3 g. Como mencionado anteriormente, o
ensaio enzimático de G6PD é bastante sensível e por isso foi utilizada uma
55
concentração de apenas 0,0068% (p/p) de enzima pura, prevenindo alterações nas
curvas binodais. Assim, para os ensaios com o homogeneizado celular de S.
cerevisiae contendo G6PD, foi adicionada ao sistema uma quantidade tal que
fornecesse a concentração aproximada da enzima pura. Os componentes do
sistema micelar foram adicionados por pesagem, o sistema foi homogeneizado em
agitador orbital (Barnstead/Thermolyne, modelo 400110) a 8 rpm e resfriado a 4°C
de modo a exibir uma única fase. Posteriormente, o sistema foi transferido para um
banho temorregulável, com valor de temperatura previamente ajustado ao desejado,
e mantido em repouso por três horas para separação de fases e equilíbrio das
mesmas. Após o repouso, mediram-se os volumes das fases concentrada e diluída e
amostras de cada uma foram coletadas cuidadosamente, utilizando-se seringa e
agulha. Com as amostras das fases concentrada e diluída realizaram-se análises de
concentração de G6PD (atividade enzimática), concentração de ligantes e medidas
de condutância elétrica. Cada experimento de partição da G6PD foi feito em triplicata
e os respectivos desvios-padrões e intervalos de confiança calculados. A Figura 11
apresenta esquematicamente o procedimento experimental de extração por SMDFA.
56
Figura 11 - Esquema do procedimento experimental para a extração por SMDFA. 1 -
Tubo de ensaio graduado contendo todos os componentes do sistema: tampão,
agente(s) tensoativo(s) e enzima – Sistema Monofásico; 2 - Incubação do tubo
contendo os componentes da extração à temperatura desejada (variação de ±
0,03
o
C) por determinado período de tempo (t
e
) de três horas, no banho
termorregulado; 3 - Tubo contendo as duas fases do sistema, coleta das fases com
auxílio de seringa e agulha – Sistema Bifásico; 4 - Amostras contendo as fases
concentrada (4a) e diluída (4b) para análises subseqüentes de atividade enzimática.
3.10. Construção das Curvas Binodais
Para melhor compreensão do comportamento da G6PD no SMDFA, é
importante conhecer a concentração de tensoativo não-iônico em cada uma das
fases do sistema. Portanto, foram determinadas as curvas binodais (ou curvas de
coexistência) para os sistemas C
10
E
4
/tampão e Triton X-114/tampão.
As curvas binodais de soluções aquosas tamponadas de C
10
E
4
ou Triton X-
114 foram determinadas de acordo com o método do “ponto de névoa” (cloud point)
descrito por Albertsson (1986) e modificado por Blankschtein et al. (1986). Este
método consiste em identificar visualmente a temperatura, T
NÉVOA
, na qual soluções
com concentrações conhecidas de tensoativo tornam-se turvas com a elevação da
temperatura. Deve-se ressaltar que o ponto de névoa das soluções micelares pode
t
e
= 3h
Tensoativos
Tampão
Enzima
1
2
Fase
Concentrada
(a)
Fase
Diluída (b)
Banho Termorregulado
4a
4b
T°C
3
4
Interfase
Interface
4a
4b
57
ser alterado pela adição de sais, álcoois, tensoativos não-iônicos e alguns
compostos orgânicos (ZULAUF, 1991; YAMAZAKI et al., 1991). Soluções contendo
diferentes concentrações de tensoativo
foram colocadas em um banho transparente
termorregulável. Inicialmente, cada solução foi resfriada a uma temperatura
suficientemente baixa para que o sistema apresentasse uma fase, clara e
homogênea. A partir desse ponto, a temperatura foi lentamente aumentada (de 0,02
em 0,02°C) até a turvação da solução. Esse procedimento foi realizado em triplicata
para cada valor de concentração e o ponto de névoa definido como a média dos três
valores de temperatura determinados. A curva binodal foi obtida traçando-se os
valores de T
NÉVOA
em função da concentração do tensoativo.
3.11. Construção da Curva Binodal para o Sistema Triton X-114/(NH
4
)
2
SO
4
Para o mapeamento da curva binodal do sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
, utilizou-
se procedimento semelhante ao empregado para determinação de curvas binodais
de sistemas poliméricos de duas fases aquosas (ALBERTSSON, 1986), o qual
baseia-se no fato de que a curva binodal representa a transição entre uma solução
transparente (monofásica) e uma solução turva (bifásica), visível ao olho nu. O
procedimento foi realizado em um tubo de ensaio com concentração previamente
conhecida de Triton X-114 adicionada em banho transparente termorregulável à
temperatura de 20°C. Então, adicionou-se solução de (NH
4
)
2
SO
4
de concentração
conhecida
(titulando a amostra) até que o sistema (solução) se tornasse turvo (cloud
point). As concentrações de Triton X-114 e (NH
4
)
2
SO
4
foram calculadas baseando-
se na concentração inicial do tensoativo e na massa adicionada da solução de sal.
As concentrações resultantes correspondem às coordenadas de um ponto na curva
binodal (ou ponto de névoa), que caracterizam a transição de um sistema bifásico
58
para o monofásico ou vice-versa. O sistema foi mantido sob agitação constante,
utilizando-se barra magnética e agitador magnético. Em seqüência, adicionou-se
água Milli-Q, gota a gota, até que a solução se tornasse límpida e as concentrações
de tensoativo e sal correspondentes recalculadas. O procedimento foi repetido até
se obter um número suficiente de pontos para caracterizar a curva binodal. Essa
curva foi obtida traçando-se os valores de concentração de tensoativo em função
dos valores de concentração de (NH
4
)
2
SO
4
correspondentes aos pontos de névoa a
20°C.
3.12. Síntese do Tensoativo de Afinidade TX-114-Blue
Para a reação de síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue foram
realizadas, na totalidade, seis tentativas. As quatro primeiras tentativas foram
baseadas na metodologia empregada por Garg et al. (1994), com adaptações.
Assim, 20 g (35,58 mM) do tensoativo Triton X-114 foram misturados com 2,24 g de
NaOH e 5 mL de água destilada, sendo a solução agitada por quinze minutos. Em
seguida, adicionaram-se 5 mL de água destilada e 0,66 g de cibacron blue à mistura,
mantendo-se sob agitação a 70-80°C por uma hora e, posteriormente, por cinco
horas, à temperatura ambiente. Em seguida, o tensoativo de afinidade foi
recuperado segundo proposto por Johansson e Joelsson (1985), com alterações: a
mistura reacional foi diluída para 50 mL com água deionizada, extraída com solvente
apolar (clorofórmio), e posteriormente rotaevaporada. O material seco obtido foi
dissolvido em água deionizada, adicionando DEAE celulose (~2,5 g de peso seco),
sob agitação, até que todo material fosse adsorvido na resina. O produto foi obtido
por meio de filtração a vácuo e eluição da DEAE com solução de KCl 4 M (30-35°C).
Ao material eluído foi adicionado sulfato de sódio anidro para remoção da água, o
59
produto final foi extraído com clorofórmio e então rotaevaporado. A identificação da
estrutura química foi determinada por meio de análises espectrométricas de
Ressonância Magnética Nuclear (RMN-
1
H) e de Infravermelho (IV) (Apêndices).
Deve-se ressaltar que a DEAE celulose utilizada na purificação do tensoativo de
afinidade foi previamente lavada com NaOH 0,1 M, depois lavada até a neutralidade
com tampão fosfato de sódio 0,1 M e finalmente lavada abundantemente com água
destilada.
A quinta tentativa de síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue foi
realizada conforme o procedimento descrito por Garg et al. (1994) e Johansson
(1984), com adaptações. Desta forma, 20 g (35,58 mM) do tensoativo Triton X-114
foram misturados com 0,2 g de NaOH, 0,6 g de cibacron blue e 30 mL de água
destilada, sendo a solução agitada por quinze minutos à temperatura de 80-90°C.
Em seguida, adicionaram-se mais 0,6 g de NaOH e 1,5 g de cibacron blue, em
agitação por mais quarenta minutos a 85°C. Após esse período de agitação,
adicionou-se mais 1 g de cibacron blue e a mistura de reação permaneceu em
agitação por doze horas, a 25°C. Após este período, o pH do meio reacional foi
ajustado para 6,6 com ácido acético (glacial) e a solução foi transferida para um funil
de separação de 1 L, juntamente com 150 mL de água destilada. Em seguida,
utilizando-se a técnica descrita por Johansson e Joelsson (1985), com alterações,
adicionaram-se aproximadamente 300 mL de clorofórmio, agitando fortemente o
meio de reação. A mistura permaneceu em repouso por aproximadamente vinte e
quatro horas para a separação das fases. Então, recuperou-se um volume da
interfase do sistema formado e misturou-se com 150 mL de água destilada e 300 mL
de clorofórmio. O sistema permaneceu em repouso por quinze minutos. Este mesmo
procedimento foi repetido três vezes, até que finalmente um volume da interfase foi
60
recuperado e rotaevaporado para a remoção de clorofórmio remanescente. A sexta
tentativa de síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue foi exatamente igual ao
procedimento adotado para a quinta tentativa, porém utilizando-se acetato de etila
ao invés de clorofórmio na etapa de extração do produto reagido.
O produto obtido foi diluído em tampão McIlvaine (pH 7,20). A Figura 12
ilustra a rota sintética para a obtenção do tensoativo de afinidade.
Figura 12 - Rota sintética de obtenção do tensoativo de afinidade TX-114-Blue.
3.13. Espectrometria de Absorção na Região do Infravermelho (IV)
Os espectros de absorção na região do Infravermelho foram obtidos em
espectrofotômetro Shimadzu – 470, utilizando-se dispersão em brometo de potássio
(KBr) e cela em cloreto de sódio (NaCl). As análises dos espectros de IV foram
realizadas no Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.
N
NN
O
O
NH
2
NH
N
H
N
H
Cl
N
NN
O
O
NH
2
NH
N
H
N
H
O
+
..
-
-
SO
3
-
SO
3
SO
3
Cl
-
H
2
O
+
+
Cibacron Blue F3GA
Triton X-114
TX-114-Blue
-
-
SO
3
-
SO
3
SO
3
(OCH
2
CH
2
)
8
-OH
8
(OCH
2
CH
2
)
Produtos
n
n
n ~ 8
OH + HCl
Produtos
61
3.14. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN-
1
H)
Os espectros de Ressonância Magnética Protônica foram efetuados em
espectrofotômetro BRUKER, modelo Advance DPX-300 MHz, do Laboratório de
Análise Instrumental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, utilizando-se
água deuterada (D
2
O), dimetil sulfóxido deuterado (DMSO-d
6
) e clorofórmio
deuterado (CDCl
3
), como solventes, e tetrametilsilano (TMS) como padrão de
referência interna.
3.15. Rompimento e Preparação do Homogeneizado Celular de S. cerevisiae
Para o rompimento das células de S. cerevisiae, 4 g de fermento prensado
comercial (Fleischmann ®) foram lavados com 50 mL de tampão Tris-HCl e
centrifugados por vinte e cinco minutos a 6°C e 3328xg, em centrífuga refrigerada
(JOUAN – BR 4i). Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e as células
ressuspensas em 10 mL de tampão Tris-HCl adicionado de cloreto de magnésio
(MgCl
2
) 5 mM, na presença de inibidores de proteases e estabilisadores: EDTA
(ácido etilenodiaminotetracético) 0,2 mM, β-mercaptoetanol 10 mM e ácido
aminocapróico 2 mM. As células em suspensão foram então rompidas por
tratamento em vórtice (Phoenix AP56, Araraquara) na presença de pérolas de vidro
(0,5 mm de diâmetro), mantendo-se a proporção de 5 mL de suspensão celular para
7,45 g de pérolas de vidro. O rompimento foi realizado durante o tempo total de doze
minutos, intercalando-se entre agitação e imersão em banho de gelo a cada trinta
segundos. As pérolas de vidro e parte dos fragmentos celulares foram removidas por
centrifugação a 3328xg e 6°C durante vinte e cinco minutos. Para maior remoção de
debris celulares, o sobrenadante obtido foi novamente centrifugado a 17000xg e 6°C
62
durante vinte e cinco minutos, de maneira que o sobrenadante resultante desta
centrifugação final consistiu no homegeineizado celular de S. cerevisiae. Essa
suspensão de células rompidas foi congelada a -60°C (ultrafreezer) em pequenos
volumes, utilizados conforme necessário para os estudos de purificação em
SMDFA.
3.16. Estudos Cinéticos (K
M
e V
MAX
) e Termodinâmicos (Ea, ∆G, ∆H e ∆S)
Os estudos cinéticos e termodinâmicos da G6PD foram realizados antes e
após a purificação por SMDFA. Para estes estudos, utilizou-se G6PD pura presente
na fase diluída (pobre em micelas) de sistema micelar de Triton X-114/tampão a 2%
submetido à separação de fases a 27
o
C, por três horas.
A determinação dos parâmetros cinéticos aparentes K
M
(constante de
Michaelis-Menten) e V
MAX
(velocidade máxima de reação enzimática) foi feita por
medida da atividade enzimática (Item 3.2.), utilizando-se as seguintes concentrações
de G6P (substrato): 5; 10; 25; 30; 50; 75; 150; 250; 300; 400 e 500 µM. Os valores
de K
M
e V
MAX
foram determinados pelo método de Lineweaver-Burk (LEHNINGER,
1995).
A determinação dos parâmetros termodinâmicos ∆G, ∆H e ∆S foi feita por
meio da atividade enzimática da G6PD (Item 3.2.), modificando apenas as
temperaturas de reação de atividade. A medida de atividade foi feita em diferentes
temperaturas, a saber: 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 e 90°C. Com base nos
resultados obtidos, os parâmetros termodinânicos foram calculados pela equação de
Arrhenius e Eyring (OWUSU et al., 1992).
63
3.17. Metodologia de Análise dos Resultados
Os resultados obtidos foram analisados inicialmente em termos de coeficiente
de partição de G6PD e dos ligantes de afinidade (cibacron blue ou procion red),
expressos na equação 01.
d
c
C
C
K = (equação 01)
em que C
c
e C
d
referem-se às concentrações de G6PD ou dos ligantes na fase
concentrada (c) e diluída (d), respectivamente. Tanto o coeficiente de partição da
enzima G6PD, K
G6PD
, quanto o coeficiente de partição das proteínas totais, K
P
, no
caso do estudo da extração da G6PD de S. cerevisiae, foram calculados nos
ensaios. Neste último caso, com os coeficientes de partição, o parâmetro
seletividade (Š) foi calculado de acordo com a seguinte equação:
Š
P
G6PD
K
K
=
(equação 02)
O balanço de atividade (BA) da G6PD e o balanço de massa (BM) dos
ligantes de afinidade bem como das proteínas totais foram calculados de acordo
com a equação:
BA ou BM =
100%
VC
VCVC
iiy,
ddy,ccy,
×
+
(equação 03)
em que C
y,c
, C
y,d
e C
y,i
referem-se às concentrações do componente y (G6PD,
ligantes de afinidade, ou proteínas totais) na fase concentrada (c), diluída (d) e na
solução estoque inicialmente adicionada ao sistema, respectivamente. V
c
, V
d
e V
i
são os volumes da fase concentrada (c), diluída (d) e da solução estoque
inicialmente adicionada ao sistema, respectivamente. No caso da G6PD, como a
determinação de concentração é feita por medida de atividade enzimática, foi
adotado o termo balanço de atividade (BA). A razão volumétrica entre as fases
formadas no sistema foi calculada segundo a equação:
64
d
c
V
V
R = (equação 04)
em que V
c
e V
d
são os volumes da fase concentrada (c) e diluída (d) do sistema de
duas fases formado, respectivamente.
Além do coeficiente de partição, a eficiência do sistema em partição da G6PD
também foi avaliada com base no valor de rendimento de G6PD na fase concentrada
rica em micelas (Y
G6PD,c
), sendo Y
G6PD,c
definido a seguir:
Y
G6PD,c
=
100%
VC
VC
iiG6PD,
ccG6PD,
×
(equação 05)
O fator de purificação (
p
f
) foi calculado de acordo com a seguinte equação:
ie,
ce,
p
A
A
f = (equação 06)
em que A
e,c
e A
e,i
correspondem aos valores de atividade específica na fase
concentrada rica em micelas e na solução estoque inicialmente adicionada ao
sistema, respectivamente, sendo a atividade específica definida por:
P
G6PD
e
C
C
A = (equação 07)
Cálculo dos valores de ∆G, ∆H, ∆S e Ea
As equações a seguir foram utilizadas nos cálculos da energia de ativação
(Ea), variação de energia livre de Gibbs (∆G), variação da entalpia da reação
enzimática (∆H) e variação da entropia (∆S), respectivamente:
TR
Ea
0
eAv
×
−
=
(equação 08)
em que v = velocidade da reação enzimática (U/mL), Ea = energia de ativação
(J/K.mol), A
0
= constante de Arrhenius ou fator de frequência, R = constante
universal dos gases (8,315 J/K.mol) e T = temperatura absoluta (K). Traça-se a
65
curva: ln v versus 1/T e, por regressão linear, obtém-se a equação de uma reta, da
qual se extrai o valor do coeficiente angular (b) e do coeficiente linear (a) da curva,
conforme a equação 09.
( )
T
1
balnv ×−= (equação 09)
Sabendo-se o valor do coeficiente angular (b), calcula-se a energia de
ativação (Ea), conforme a equação 10.
−=
R
Ea
b
(equação 10)
Para o cálculo dos parâmetros termodinâmicos: ∆G, ∆H, ∆S deve-se fixar uma
temperatura qualquer, de preferência na qual se realiza a determinação da atividade
enzimática da enzima (no caso deste estudo a temperatura utilizada foi de 15°C ou
288K). Calcula-se a variação de energia livre de Gibbs (∆G) pela Equação de Eyring
(equação 11):
×
×
×
×
=
TK
hv
Log
2,303
TR
∆G
B
(equação 11)
em que h = constante de Planck (3,978.10
-32
J.min) e K
B
= constante de Boltzman
(1,38.10
-23
J/K). Após determinado o valor de ∆G, calcula-se o valor de ∆H pela
equação 12 e o de ∆S pela equação 13.
(
)
TREa∆H ×−= (equação12)
(
)
T
∆G∆H
∆S
−
= (equação 13)
66
3.18. Teoria de Partição de Proteínas Hidrofílicas Baseada em Interações por
Volume de Exclusão – Cálculo Teórico do Coeficiente de Partição
O comportamento de uma proteína em um sistema de duas fases aquosas
pode ser caracterizado pelo coeficiente de partição, K
p
, definido a seguir:
dp,
C
cp,
C
p
K =
(equação 14)
em que C
p,c
e C
p,d
são as concentrações de proteína nas fases concentrada e
diluída, respectivamente.
Nikas et al. (1992) apresentaram uma formulação teórica para descrever e
estimar a partição de proteínas hidrossolúveis em SMDFA contendo micelas
cilíndricas e não carregadas. De acordo com esta teoria, assume-se que a partição
de proteínas hidrofílicas é governada primariamente por interações repulsivas
estéricas, do tipo “volume de exclusão” (EV). Apesar da diferença de tamanho das
micelas e de densidade de micelas entre as duas fases do sistema, o coeficiente de
partição micela/água em cada uma das fases do sistema de duas fases é o mesmo,
devido ao fato das proteínas hidrofílicas praticamente não interagirem com as
micelas de tensoativos não-iônicos não-carregadas.
Para aplicação da teoria, os ensaios de partição são realizados em
concentrações diluídas de proteínas (até aproximadamente 0,50 g/L). Desta forma, a
separação de fases da solução micelar praticamente não sofre alterações pela
presença da proteína. Esta observação explica o fato de que, como uma primeira
aproximação, o efeito da proteína na forma, tamanho e distribuição de tamanho das
micelas, bem como as interações proteína-proteína, é ignorado no cálculo de K
p
.
Além disso, as proteínas (hidrofílicas) são tratadas como esferas rígidas. As
moléculas de tensoativos que constituem as duas fases coexistentes são modeladas
67
sob condições de idealidade com relação ao solvente, no que diz respeito às
micelas. Nestas condições, as interações atrativas (tipo van der Waals) e as de
volume de exclusão existentes entre as micelas de tensoativo não-iônico cancelam-
se entre si. Portanto, as interações atrativas intermicelares são ignoradas e assume-
se que as micelas cilíndricas sejam interpenetráveis e polidispersas, que interagem
somente com proteínas adjacentes, pelo efeito estérico de volume de exclusão. O
efeito da existência de uma diferença de potencial eletrostático na interface do
sistema (devido à presença dos sais tampão) também não é considerado, pois se
acredita que o efeito de volume de exclusão seja dominante sobre qualquer outro
efeito. Considera-se ainda, no modelo, que os monômeros em solução não exerçam
nenhum efeito significativo na partição das proteínas, pois estão presentes em
baixas concentrações e a concentração é aproximadamente a mesma nas duas
fases. Com base nestas aproximações, foi modelado o coeficiente de partição de
proteínas hidrofílicas em sistemas micelares não-iônicos de duas fases aquosas e foi
obtida a seguinte equação (KAMEI et al., 2002b; LUE, BLANKSCHTEIN, 1996;
NIKAS et al., 1992):
+−−=
2
0
R
p
R
1)
d
φ
c
(φexp
EV
p
K (equação 15)
em que
φ
c
-
φ
d
são as frações volumétricas de tensoativo nas fases concentrada e
diluída, respectivamente, R
p
, é o raio hidrodinâmico da proteína e R
0
é o raio da
seção transversal de cada micela cilíndrica. De acordo com a equação (15), a
partição de proteínas hidrofílicas em sistemas micelares de duas fases aquosas é
governada primariamente por interações estéricas repulsivas do tipo volume de
exclusão (EV), as quais direcionam a proteína preferencialmente para a fase pobre
em micelas, na qual a mesma encontra maior volume livre (LUE, BLANKSCHTEIN,
68
1996). O raio hidrodinâmico da G6PD, calculado com base nas dimensões de seu
cristal isomorfo (ROWLAND et al., 1994), é de 68 Å. O raio da seção transversal das
micelas (R
0
) de C
10
E
4
foi estimado em 21 Å, baseando-se no modelo molecular de
micelização desenvolvido por Puvvada e Blankschtein (1990). Para o Triton X-114, o
raio da seção transversal das micelas (R
0
) foi calculado com base no trabalho de
Tanford (1980), considerando o comprimento da cadeia hidrocarbônica estendida (l
c
)
como sendo aproximadamente 8 Å e o comprimento da cabeça de polióxido de
etileno estendido (l
h
) como sendo aproximadamente igual a 22 Å. Com base no
trabalho de Nikas et al. (1992), se considera que R
0
= l
c
+ l
h
, dessa forma o valor de
R
0
é aproximadamente igual a 30 Å para as micelas de Triton X-114. O valor de
φ
c
-
φ
d
pode ser obtido a partir da curva binodal, uma vez que ambas as fases
apresentam massa específica de aproximadamente 1 g/mL e, portanto, as frações
de massa podem ser aproximadas como frações volumétricas.
69
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Influência do Efeito dos Tensoativos Triton X-114 e C
10
E
4
na Estabilidade
da G6PD
4.1.1. Avaliação do Efeito do Tensoativo Não-Iônico Triton X-114 na
Estabilidade da G6PD
O efeito do Triton X-114 na atividade residual (ou balanço de atividade) da
G6PD pode ser observado na Figura 13. Em concentrações de até 1% de Triton X-
114, a enzima mostrou-se estável, resultando em valores de atividade residual (AR)
de 100%. Nas concentrações de 1,5 a 3% (p/p), a atividade residual da enzima
apresentou um pico de superatividade e, a 2% de Triton X-114, obteve-se atividade
residual de 190%. Para concentrações maiores que 3% de tensoativo, observou-se
queda na atividade enzimática, provavelmente associada à desnaturação protéica.
No entanto, mesmo na presença de altas concentrações de Triton X-114 (8-10%),
obteve-se atividade da G6PD superior a 80%. O fenômeno de superatividade
observado deve estar relacionado à hipótese descrita por Savelli et al. (2000), de
que tensoativos ligariam-se a enzimas, causando mudança conformacional para
uma forma mais ativa, podendo o grupo hidrofílico do tensoativo determinar tal
função. Neste sentido, tensoativos iônicos se ligam às proteínas e alteram sua
atividade enzimática. Embora tensoativos não-iônicos em geral não modifiquem a
estrutura terciária das proteínas, acredita-se que o aumento da atividade enzimática
verificado neste trabalho deve ter ocorrido em função de algum tipo de interação
com o tensoativo, levando a uma mudança conformacional da G6PD. Novos estudos
referentes à interação entre a G6PD e o Triton X-114 devem ser conduzidos, a fim
de esclarecer essa hipótese.
70
Figura 13 - Atividade da enzima G6PD após uma hora de exposição a diferentes
concentrações de Triton X-114 a 19°C. As barras de erro correspondem a um
intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
Numa tentativa de explicar a superatividade, foi investigado o efeito do Triton
X-114, nas concentrações de 2, 4 e 8% (p/p), no padrão de absorção da coenzima,
na forma reduzida (NADPH) e oxidada (NADP
+
). Os resultados obtidos,
apresentados na Tabela 01, não mostraram alteração significativa no padrão de
absorção de NADP
+
/NADPH nas diferentes concentrações estudadas. É importante
destacar que o Triton X-114, mesmo em ausência da coenzima, apresentou leitura
de absorbância a 340 nm, por causa da presença de anel aromático em sua
estrutura química. Portanto, os valores de absorbância obtidos para NADP
+
na
presença de Triton X-114 expressam a absorção do tensoativo. O estudo realizado
não é suficiente para concluir que o Triton X-114 não afeta a conformação estrutural
ou mesmo o estado energético da coenzima. Pancera et al. (2002) investigaram o
efeito do PEG (polietilenoglicol) na atividade de G6PD e também observaram
superatividade. Estudos calorimétricos indicaram que as interações entre soluções
de PEG e NADP
+
são entalpicamente mais favoráveis do que as interações entre
tampão e NADP
+
, explicando assim o aumento da atividade enzimática. Devido à
similaridade existente entre a molécula de PEG e a cabeça de polióxido de etileno
0
50
100
150
200
0 2 4 6 8 10
[Triton X-114] (% p/p)
A R
G6PD
(% )
71
do Triton X-114, deve-se considerar a hipótese de que as interações entre Triton X-
114 e NADP
+
também sejam entalpicamente mais favoráveis que as interações entre
o tampão utilizado e NADP
+
na presença do tensoativo.
TABELA 01 - Valores de absorbância a 340 nm obtidos para soluções de Triton X-
114 e soluções da coenzima NADP
+
/NADPH na presença ou não de Triton X-114,
por uma hora a 19°C. Os erros apresentados correspondem a um intervalo de
confiança de 95% nos valores obtidos.
Portanto, pode-se concluir, que apesar de ter sido observada superatividade
enzimática na faixa de 1,5 a 3% (p/p) de Triton X-114, o tensoativo não-iônico
estudado é ameno à G6PD e adequado à técnica de SMDFA.
4.1.2. Avaliação do Tensoativo Não-Iônico C
10
E
4
no Efeito na Estabilidade da
G6PD
A Figura 14 apresenta os resultados da análise da atividade residual (ou
balanço de atividade) da G6PD na presença do C
10
E
4
. Conforme a figura, a enzima
mostrou-se bastante estável frente ao tensoativo estudado e, em concentrações de
até 6% (p/p), valores de atividade superiores a 90% foram obtidos. Apesar de
observar-se perda de atividade com o aumento da concentração do tensoativo,
aproximadamente 85% da atividade da G6PD ainda pôde ser mantida nas
concentrações mais altas de tensoativos testadas, 8 e 10% (p/p).
Concentração de Triton X-114 % (p/p)
0 2 4 8
Ausência de
coenzima
0,00
0,117 ± 0,001
0,124 ± 0,008
0,091 ± 0,01
NADP
+
0,00
0,157 ± 0,010
0,166 ± 0,020
0,144 ± 0,06
NADPH 00,620
0,620 ± 0,130
0,660 ± 0,130
0,605 ± 0,06
72
Figura 14 - Atividade da enzima G6PD após uma hora de exposição a diferentes
concentrações de C
10
E
4
a 15°C. As barras de erro correspondem a um intervalo de
confiança de 95% nos valores obtidos.
Pode-se concluir que o tensoativo não-iônico C
10
E
4
é ameno à enzima G6PD
e não apresenta elevado grau de ligação à biomolécula, e adequado para aplicação
de purificação por SMDFA. O fato da ligação tensoativo C
10
E
4
- enzima ser fraca é
importante para aplicação do modelo teórico apresentado, uma vez que o mesmo só
considera interações do tipo volume de exclusão entre proteínas e micelas.
4.2. Curva Binodal para o Sistema C
10
E
4
/Tampão
A Figura 15 apresenta a curva binodal para o tensoativo C
10
E
4
/tampão obtida
experimentalmente. Essa curva representa o limite no qual a solução micelar se
separa em duas fases macroscópicas, em função da temperatura e da concentração
do tensoativo (NIKAS et al., 1992).
A curva binodal obtida para o sistema C
10
E
4
/tampão está conforme as curvas
descritas na literatura (NIKAS et al., 1992; RANGEL-YAGUI et al., 2004; KAMEI et
al., 2002c). A diferença existente entre os trabalhos consiste em um deslocamento
da curva no eixo das ordenadas, devido à utilização de C
10
E
4
de diferentes lotes, ou
então de uma pequena variação do leitor de temperatura utilizado nos experimentos.
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10
[C10E4] (% p/p)
AR
G6PD
(%)
73
Figura 15 - Curva binodal para o sistema C
10
E
4
/tampão, obtida experimentalmente.
Cada ponto na curva corresponde a um ponto de névoa, caracterizando a transição
do sistema monofásico para o sistema de duas fases aquosas (bifásico). A linha
paralela ao eixo das abscissas representa uma linha de amarração (tie line), sendo
C
c
e C
d
as concentrações de tensoativo nas fases superior e inferior,
respectivamente, do sistema submetido à separação de fases na temperatura
correspondente à linha de amarração. As barras de erro correspondem a um
intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
A presença de impurezas provenientes da síntese do tensoativo também
pode resultar em alteração nos valores dos pontos de névoa. O perfil da curva,
entretanto, deve permanecer constante para um dado tensoativo. A curva obtida
nesse sistema é caracterizada pela concavidade para cima, apresentando ponto
crítico inferior. Para determinada temperatura, pode ser traçada uma linha de
amarração no diagrama de fases, como apresentado na Figura 15 pela linha
paralela ao eixo das abscissas. Para tal temperatura, qualquer solução de C
10
E
4
cuja
concentração corresponda a um ponto na linha de amarração apresenta separação
de fases, resultando em uma fase concentrada de composição C
c
(% p/p) e uma
fase diluída de composição C
d
(% p/p). O que difere de acordo com a concentração
inicial de tensoativo adicionada ao sistema é o volume de cada fase. Como ambas
18,5
19,0
19,5
20,0
20,5
0 2 4 6 8
[C
10
E
4
] (% p/p)
Sistema Bifásico
Sistema Monofásico
C
c
C
d
T°C
“tie-line” (linha de amarração)
74
as fases apresentam massa específica de aproximadamente 1 g/mL, as
porcentagens de C
10
E
4
em massa são aproximadamente iguais às porcentagens
volumétricas. Assim, o valor de
φ
c
–
φ
d
corresponde ao comprimento da linha de
amarração dividido por 100 (para a conversão de porcentagem em fração
volumétrica), ou seja, (
φ
c
–
φ
d
) = (C
c
- C
d
)/100.
A linha de amarração pode ser caracterizada pela razão volumétrica entre as
fases (R = V
c
/V
d
), sendo que o segmento de reta da linha de amarração que une os
pontos referentes à concentração inicial da solução e a concentração da fase diluída
é proporcional ao volume da fase concentrada (V
c
), e o segmento de reta da linha de
amarração que une os pontos referentes à concentração inicial da solução e a
concentração da fase concentrada é proporcional ao volume da fase diluída (V
d
).
Em conformidade com a teoria de partição de proteínas em sistemas
micelares não-iônicos de duas fases aquosas e com a análise da Figura 15, para
uma determinada proteína hidrofílica (R
p
constante) e um dado tensoativo (R
o
constante), verificou-se que a elevação da temperatura de extração (T°C) causa
aumento no efeito de volume de exclusão (
φ
c
-
φ
d
), conseqüentemente, diminuição do
coeficiente de partição (K
p
).
4.3. Partição da G6PD no Sistema C
10
E
4
/Tampão
A partição da G6PD em sistema C
10
E
4
/tampão foi estudada para diferentes
concentrações de tensoativo e temperaturas. Os resultados de coeficiente de
partição (K
G6PD
) e balanço de atividade (BA
G6PD
) obtidos nos ensaios realizados
estão apresentados na Tabela 02.
75
TABELA 02 – Resultados experimentais da partição da G6PD em Sistema
C
10
E
4
/tampão, para diferentes concentrações de tensoativo e temperatura. K
G6PD
corresponde ao coeficiente de partição, BA
G6PD
corresponde ao balanço de atividade
e R corresponde à razão volumétrica entre as fases. Os erros apresentados
correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
Ensaio [C
10
E
4
] (%p/p) T (
°
°°
°
C)
R (V
c
/V
d
)
K
G6PD
BA
G6PD
(%)
1 1,50 19,10 0,26 0,63 ± 0,03 105 ± 11
2 1,50 19,50 0,24 0,44 ± 0,05 098 ± 13
3 2,50 19,50 0,60 0,44 ± 0,02 097 ± 03
4 2,50 20,00 0,49 0,41 ± 0,02 115 ± 15
De acordo com a Tabela 02, os resultados de balanço de atividade (BA
G6PD
)
foram de aproximadamente 100% para todos os ensaios realizados; assim a G6PD
apresenta-se estável nos sistemas de duas fases aquosas contendo o tensoativo
não-iônico C
10
E
4
, sem perda significativa de atividade enzimática. Portanto, o
tensoativo C
10
E
4
pode ser empregado para a purificação da enzima, uma vez que ele
não apresenta efeito desnaturante à proteína. Como previsto, os valores de K
G6PD
obtidos nos ensaios para todas as condições testadas foram inferiores a 1,
demonstrando o comportamento da enzima hidrofílica que, conseqϋentemente, não
é atraída hidrofobicamente para a fase rica em micelas não-carregadas, fase
concentrada do sistema. De outra forma, a enzima apresenta partição preferencial
para a fase diluída do sistema, região pobre em micelas, onde encontra maior
volume disponível. Com base nos resultados de K
G6PD
, pode-se destacar que com o
aumento da temperatura do sistema ocorre uma diminuição no valor de K
G6PD
obtido.
Para a comparação dos resultados experimentais obtidos de K
G6PD
apresentados na Tabela 02 com o modelo matemático proposto por Nikas et al.
(1992) (equação 15) é fundamental conhecer o valor de
φ
c
-
φ
d
para cada ensaio
obtido. Como mencionado no Item 4.2., o valor de
φ
c
-
φ
d
pode ser obtido a partir da
76
curva binodal, uma vez que a temperatura de separação de fases é conhecida. A
Tabela 03 mostra os valores de concentração de C
10
E
4
resultantes nas fases
concentrada e diluída de cada ensaio, obtidos com base na curva binodal para o
sistema C
10
E
4
/tampão, e os respectivos valores de
φ
c
-
φ
d
calculados.
TABELA 03 – Valores de concentração de C
10
E
4
resultantes nas fases concentrada
(C
c
) e diluída (C
d
) de cada ensaio, obtidos com base na curva binodal para o sistema
C
10
E
4
/tampão, e os respectivos valores de
φ
c
-
φ
d
calculados.
φ
c
e
φ
d
correspondem
às frações volumétricas de tensoativos nas fases concentrada e diluída,
respectivamente.
Ensaio [C
10
E
4
] (%p/p) T (
°
°°
°
C)
C
c
(%p/p)
C
d
(%p/p)
(
φ
φφ
φ
c
-
φ
φφ
φ
d
)
1 1,50 19,10 4,00 0,80 0,032
2 1,50 19,50 5,50 0,50 0,050
3 2,50 19,50 5,50 0,50 0,050
4 2,50 20,00 6,80 0,30 0,065
Como pode ser observado, na Tabela 03, os valores de
φ
c
-
φ
d
aumentam
conforme o aumento da temperatura de extração nos sistemas, pois a fração
volumétrica de tensoativo na fase concentrada do sistema aumenta. Esse efeito
pode ser melhor visualizado analisando-se a curva binodal obtida com o tensoativo
C
10
E
4
(Figura 15). Com base nos valores de
φ
c
-
φ
d
obtidos, calcularam-se os
coeficientes de partição aplicando a teoria de volume de exclusão apresentada no
Item 3.17.
A Figura 16 apresenta a comparação entre os valores de K
G6PD
obtidos
experimentalmente e os obtidos com base na teoria. Pode-se observar uma
correlação quantitativa entre os valores obtidos experimentalmente e os estimados
pela teoria. Possivelmente, um dos fatores que pode ter influenciado na diferença
77
entre os valores experimentais e os obtidos teoricamente é que a G6PD é uma
proteína globular, porém com formato elipsoidal (ROWLAND et al., 1994), sendo que
no modelo teórico as proteínas são aproximadas como esferas rígidas. Além disso,
as interações proteína-proteína e proteína-micela, e a diferença de potencial
eletrostático presente na interface do sistema, são desconsideradas, uma vez que
são simplificadas para facilitar o tratamento matemático.
Figura 16 – Comparação entre os valores de K
G6PD
obtidos experimentalmente no
sistema C
10
E
4
/tampão (quadrado) e os estimados pela teoria (linha tracejada), em
função do volume de exclusão (
φ
c
-
φ
d
) obtido. As barras de erro correspondem a um
intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos experimentalmente.
A partição da enzima G6PD para fase diluída (pobre em micelas) está
intimamente relacionada ao aumento da diferença de fração volumétrica de
tensoativo entre as fases concentrada e diluída (
φ
c
-
φ
d
), refletida pelo aumento da
temperatura no sistema.
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
(fc - fd)
K
G6PD
(
φ
φφ
φ
c
-
φ
φφ
φ
d
)
78
4.4. Curva Binodal para o Sistema Triton X-114/Tampão
A Figura 17 apresenta a curva binodal para o tensoativo Triton X-114/tampão
obtida experimentalmente.
Figura 17 - Curva binodal para o sistema Triton X-114/tampão, obtida
experimentalmente. Cada ponto na curva corresponde a um ponto de névoa,
caracterizando a transição do sistema monofásico para o sistema de duas fases
aquosas (bifásico). A linha tracejada representa que foi considerada, para efeito de
cálculo no volume de exclusão, a fase diluída (pobre em micelas) como sendo
aproximadamente 0% (p/p) de Triton X-114. As barras de erro correspondem a um
intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
A curva binodal para o Triton X-114 obtida experimentalmente, apresentada
na Figura 17, mostra-se de acordo com a obtida por Tani et al. (1997), os quais
observaram o mesmo decaimento do T
NÉVOA
nas concentrações mais baixas de
tensoativo, a partir de 0,5% (p/p) de Triton X-114, aproximadamente. Não se obteve,
uma curva em forma de sino com concavidade para cima, como a observada por
Ramelmeier et al. (1991). É provável que a diferença entre as curvas binodais se
deva às impurezas do tensoativo Triton X-114, que podem causar alteração nos
valores dos pontos de névoa. No entanto, para os testes de partição (G6PD e os
ligantes cibacron blue e procion red), foi considerada, para efeito de cálculo no
19
21
23
25
27
29
31
33
0 2 4 6 8 10 12
[Triton X-114] (% p/p)
Sistema Bifásico
Sistema Monofásico
T°C
79
volume de exclusão, a fase diluída (pobre em micelas) com aproximadamente 0%
(p/p) de Triton X-114. A diferença existente entre os trabalhos também pode ser
justificada pelo fato de ter sido utilizado Triton X-114 de diferentes lotes. Além disso,
o comprimento da cadeia de óxido de etileno do Triton X-114 consiste em uma
distribuição estatística ((OCH
2
CH
2
)
n
, com n~8). A curva obtida nesse sistema, assim
como para o C
10
E
4
, também apresenta um ponto crítico inferior.
Em conformidade com a teoria de partição de proteínas em sistemas
micelares não-iônicos de duas fases aquosas e com a análise da Figura 17, para
uma determinada proteína hidrofílica (R
p
constante) e um dado tensoativo (R
o
constante), verificou-se que a elevação da temperatura de extração (T) causa
aumento no efeito de volume de exclusão (
φ
c
–
φ
d
) e, conseqüentemente, diminuição
do coeficiente de partição (K
p
).
80
4.5. Partição da G6PD no Sistema Triton X-114/Tampão
A partição da G6PD em sistema Triton X-114/tampão foi estudada para
diferentes concentrações de tensoativo e temperaturas. Os resultados de coeficiente
de partição (K
G6PD
) e balanço de atividade (BA
G6PD
) obtidos estão apresentados na
Tabela 04.
TABELA 04 – Resultados experimentais da partição da G6PD em sistema Triton X-
114/tampão, para diferentes concentrações de tensoativo e temperatura. K
G6PD
corresponde ao coeficiente de partição, BA
G6PD
corresponde ao balanço de atividade
e R corresponde à razão volumétrica entre as fases. Os erros apresentados
correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
Ensaio
[Triton X-114]
(%p/p)
T (
°
°°
°
C)
R (V
c
/V
d
)
K
G6PD
BA
G6PD
(%)
1 1,50 26,96
0,23 0,40 ± 0,01 95 ± 5
2 2,00 26,96 0,39 0,41 ± 0,01 98 ± 5
3 1,50 27,50 0,21 0,38 ± 0,06 98 ± 3
4 2,00 30,00 0,28 0,25 ± 0,11 94 ± 12
De acordo com a Tabela 04, os resultados de balanço de atividade (BA
G6PD
)
foram de aproximadamente 100% para todos os ensaios realizados, assim a G6PD
apresenta-se estável nos sistemas de duas fases aquosas contendo o tensoativo
não-iônico Triton X-114, sem perda significativa de atividade enzimática. Os valores
de K
G6PD
obtidos nos ensaios para todas as condições testadas foram inferiores a 1,
confirmando o caráter hidrofílico da enzima que, conseqüentemente, não é atraída
hidrofobicamente para a fase rica em micelas não-carregadas, fase concentrada do
sistema. De outra forma, a enzima é particionada preferencialmente para a fase
diluída do sistema, região pobre em micelas, onde encontra maior volume
disponível. Estatisticamente, não se pode considerar que com o aumento da
81
temperatura o coeficiente de partição da proteína foi menor, embora os resultados
apontem esta tendência, em conformidade com a teoria do volume de exclusão.
Para a comparação dos resultados experimentais obtidos de K
G6PD
apresentados na Tabela 04 com o modelo matemático proposto por Nikas et al.
(1992) (equação 15) é fundamental conhecer o valor de
φ
c
-
φ
d
para cada ensaio
obtido. Como mencionado no Item 4.4., o valor de
φ
c
-
φ
d
pode ser obtido a partir da
curva binodal, uma vez que a temperatura de separação de fases é conhecida. A
Tabela 05 mostra os valores de concentração de Triton X-114, resultantes nas fases
concentrada e diluída de cada ensaio, obtidos com base na curva binodal para o
sistema Triton X-114/tampão, e os respectivos valores de
φ
c
-
φ
d
calculados.
Como pode ser observado na Tabela 05, o valor de
φ
c
-
φ
d
aumenta conforme
o aumento da temperatura de extração nos sistemas, pois a fração volumétrica de
tensoativo na fase concentrada do sistema aumenta. Esse efeito pode ser melhor
visualizado analisando-se a curva binodal obtida com o tensoativo Triton X-114. Com
base nos valores de
φ
c
-
φ
d
obtidos, calculou-se os coeficientes de partição
aplicando-se a teoria de volume de exclusão apresentada no Item 3.17. Conforme a
Figura 18, pode-se observar uma correlação quantitativa entre os valores obtidos
experimentalmente e os estimados pela teoria.
82
TABELA 05 – Valores de concentração de Triton X-114
resultantes nas fases
concentrada (C
c
) e diluída (C
d
) de cada ensaio, obtidos com base na curva binodal
para o sistema Triton X-114/tampão, e os respectivos valores de
φ
c
-
φ
d
calculados.
φ
c
e
φ
d
correspondem às frações volumétricas de tensoativos nas fases concentrada
e diluída, respectivamente.
Ensaio
[Triton X-114]
(%p/p)
T (
°
°°
°
C)
C
c
(%p/p)
C
d
(%p/p)
(
φ
φφ
φ
c
-
φ
φφ
φ
d
)
1 1,50
26,96°C
06,50 ~ 0,00 0,065
2 2,00
26,96°C
06,50 ~ 0,00 0,065
3 1,50
27,50°C
07,10 ~ 0,00 0,071
4 2,00
30,00°C
10,50 ~ 0,00 0,105
Possivelmente, um dos fatores que podem ter influenciado na diferença
quantitativa entre os valores experimentais e os obtidos teoricamente é que a G6PD
é uma proteína globular, porém com formato elipsoidal (ROWLAND et al., 1994),
uma vez que para o modelo teórico as proteínas são aproximadas como esferas
rígidas. Além disso, as interações proteína-proteína e proteína-micela, e a diferença
de potencial eletrostático presente na interface do sistema, são ignoradas, pois são
simplificadas para facilitar o tratamento matemático. O Triton X-114 apresenta-se
como uma polidispersão (com n ~ 8), por isso, é possível acreditar que a dificuldade
em se calcular o R
0
deste tensoativo não-iônico foi o principal fator que levou à
diferença observada. A Figura 18 apresenta a comparação entre os valores de K
G6PD
obtidos experimentalmente e os calculados com base na teoria.
A partição da enzima G6PD para fase diluída (pobre em micelas), refletida
pela diminuição do valor de K
G6PD
, está intimamente relacionada ao aumento da
diferença de fração volumétrica de tensoativo entre as fases concentrada e diluída
(
φ
c
-
φ
d
), refletida pelo aumento da temperatura no sistema. Conseqüentemente,
83
quanto menor o espaço disponível para a enzima na fase concentrada, menor o
valor de K
G6PD
.
Figura 18 – Comparação entre os valores de K
G6PD
obtidos experimentalmente no
sistema Triton X-114/tampão (quadrado) e os estimados pela teoria (linha tracejada),
em função do volume de exclusão (
φ
c
-
φ
d
) obtido. As barras de erro correspondem a
um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos experimentalmente.
4.6. Estudo da Partição de G6PD em Sistemas C
10
E
4
e Triton X-114 em Tampão
Contendo Corantes Tipo Triazina como Ligantes de Afinidade Livres em
Solução
4.6.1. Partição dos Ligantes Cibacron Blue e Procion Red no Sistema
C
10
E
4
/Tampão
Foi estudada a partição dos ligantes cibacron blue e procion red,
separadamente em sistema C
10
E
4
/tampão, na ausência da enzima G6PD. A
concentração de ligante utilizada foi de 0,005 mg/g, de maneira a não provocar
alterações na curva binodal e ainda resultar em valores adequados de absorbância
nas determinações da concentração de ligante nas fases obtidas. A concentração de
C
10
E
4
utilizada foi de 2,5% (p/p), à temperatura de 19,5°C, resultando em uma fase
concentrada e uma diluída (R = V
c
/V
d
= 0,60). A Figura 19 apresenta os valores de
coeficiente de partição dos ligantes cibacron blue e procion red (K
ligante
) no sistema
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 0,11
(fc- fd)
K
G6PD
(
φ
φφ
φ
c
-
φ
φφ
φ
d
)
84
C
10
E
4
/tampão. O balanço de massa fechou em 100%, considerando-se o erro
experimental.
Conforme a Figura 19, observa-se que ambos os corantes derivados da
triazina particionaram preferencialmente para a fase concentrada rica em micelas e
resultaram em coeficientes de partição superiores a 1 (K
cibacron blue
= 9,52 e K
procion red
= 8,07).
Figura 19 – Coeficiente de partição dos ligantes cibacron blue (barra azul) e procion
red (barra vermelha) obtidos experimentalmente no sistema micelar C
10
E
4
/tampão de
duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C e concentração de C
10
E
4
de 2,5% (p/p).
As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores
obtidos.
O comportamento dos corantes em SMDFA deve-se às estruturas químicas
dessas moléculas (Figura 07) que, apesar de serem hidrossolúveis, apresentam
diversos anéis aromáticos hidrofóbicos. A combinação de grupamentos hidrofóbicos
com porções terminais carregadas confere certo caráter anfifílico a estas moléculas.
4.6.2. Partição da Enzima G6PD no Sistema C
10
E
4
/Tampão na Presença dos
Ligantes de Afinidade Cibacron Blue e Procion Red
O estudo da partição da enzima G6PD foi realizado em sistema
C
10
E
4
/tampão, na presença dos ligantes de afinidade cibacron blue e procion red,
0
2
4
6
8
10
12
cibacron blue procion red
K
ligante
cibacron blue procion red
85
separadamente. Utilizaram-se as mesmas condições do experimento de partição dos
ligantes (0,005 mg/g de ligante, 2,5% (p/p) de C
10
E
4
e temperatura de 19,5°C). É
importante destacar que, conforme a estequiometria da reação enzima-ligante, os
dois corantes foram adicionados em excesso. Foi conduzido também um
experimento de partição da G6PD em sistema C
10
E
4
/tampão na ausência de ligantes
de afinidade, afim de que se pudesse avaliar o efeito da interação enzima-ligante no
coeficiente de partição. A concentração utilizada de G6PD não interferiu na curva
binodal, assim o efeito de volume de exclusão foi mantido constante utilizando as
mesmas condições empregadas no experimento contendo os ligantes de afinidade
(2,5% (p/p) de C
10
E
4
e temperatura de 19,5°C), correspondendo a um valor de
φ
c
-
φ
d
de 0,050. As Figuras 20 e 21 apresentam os valores de balanço de atividade e
coeficiente de partição (K
G6PD
), respectivamente, no sistema C
10
E
4
/tampão na
presença ou na ausência dos corantes estudados.
Figura 20 – Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,050) e concentração de C
10
E
4
de 2,5%, na ausência de ligantes de afinidade
(barra branca), com cibacron blue (barra azul) e com procion red (barra vermelha).
As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores
obtidos.
Conforme a Figura 20, foram obtidos balanços de atividade da G6PD de
aproximadamente 100% para todos os experimentos realizados. Os ensaios
realizados na presença dos corantes apresentaram balanço superior ao ensaio na
0
20
40
60
80
100
120
140
sem ligante cibacron blue procion red
BA
G6PD
(%)
sem ligante cibacron blue procion red
86
ausência do ligante, isto é, aproximadamente 120%. Como o valor do balanço de
atividade de aproximadamente 120% foi obtido na presença dos ligantes, pode-se
afirmar que se adicionou uma concentração de substrato nas determinações de
atividade enzimática suficientemente alta para anular o efeito inibidor exercido pelos
corantes estudados.
Como pode ser observado na Figura 21, os coeficientes de partição da G6PD
(K
G6PD
) obtidos na presença dos ligantes de afinidade e também na ausência dos
ligantes não apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Portanto, os
ligantes livres não contribuíram para o aumento no coeficiente de partição da G6PD.
Os valores de K
G6PD
obtidos na ausência de ligante, na presença de cibacron blue e
na presença de procion red foram 0,44, 0,47 e 0,49, respectivamente.
Figura 21 – Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,050) e concentração de C
10
E
4
de 2,5%, na ausência de ligantes de afinidade
(barra branca), com cibacron blue (barra azul) e com procion red (barra vermelha).
As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores
obtidos.
De acordo com a teoria mencionada no Item 3.17., a partição de enzimas em
sistemas micelares não-iônicos de duas fases aquosas contendo ligantes de
afinidade livres em solução é regida por interações do tipo volume de exclusão e
interações de afinidade. As interações estéricas do tipo volume de exclusão
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
sem ligante cibacron blue procion red
K
G6PD
sem ligante cibacron blue procion red
87
apresentam efeito significativo na partição de proteínas em sistemas micelares de
duas fases aquosas (LIU et al., 1996; KAMEI et al., 2002c; RANGEL-YAGUI et al.,
2003a) e atuam direcionando a proteína preferencialmente para a fase a qual
apresenta maior volume livre, isto é, para a fase diluída do sistema.
Com a finalidade de minimizar o efeito do volume de exclusão no coeficiente
de partição e possivelmente aumentar o seu valor, foram realizados novos ensaios
em condições que apresentaram menor efeito de volume de exclusão. Para esses
ensaios, a temperatura estudada foi de 19,1°C, fornecendo
φ
c
-
φ
d
= 0,032 e,
portanto, um efeito de exclusão menor do que o observado nos ensaios anteriores. A
concentração de C
10
E
4
utilizada foi de 1,5% (p/p), resultando em R = V
c
/V
d
= 0,26. A
concentração dos corantes cibacron blue e procion red foi a mesma (0,005 mg/g).
Na Figura 22 estão apresentados os valores de K
G6PD
obtidos em sistema
C
10
E
4
/tampão com
φ
c
-
φ
d
= 0,032.
Figura 22 – Coeficiente de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,1°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,032) e concentração de C
10
E
4
de 1,5%, na ausência de ligantes de afinidade
(barra branca), com cibacron blue (barra azul) e com procion red (barra vermelha).
As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores
obtidos.
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
sem ligante cibacron blue procion red
K
G6PD
sem ligante cibacron blue procion red
88
O resultado apresentado na Figura 22 mostra pequeno incremento,
estatisticamente significativo, no coeficiente de partição da G6PD na presença dos
ligantes de afinidade, com valores de K
G6PD
de 0,72, face a K
G6PD
= 0,63 sem os
ligantes de afinidade. Com isso, pode-se afirmar que a contribuição das interações
de afinidade no valor de K
G6PD
foi reduzida, de maneira que mesmo em sistemas
com baixos valores de
φ
c
-
φ
d
, isto é, menor efeito do volume de exclusão, o aumento
no coeficiente de partição da proteína devido à presença dos ligantes de afinidade
foi muito pequeno. Os valores de balanços de atividade obtidos para estes ensaios,
apresentados na Figura 23, foram de aproximadamente 100%, considerando o erro
experimental.
É interessante destacar que o coeficiente de partição dos ligantes também
variou com a diminuição da diferença de concentração de tensoativo entre as fases
concentrada e diluída do sistema (
φ
c
-
φ
d
). Como previsto, os coeficientes de partição
de cibacron blue e procion red obtidos no sistema C
10
E
4
/tampão com (
φ
c
-
φ
d
=
0,032) (Figura 24) foram inferiores aos obtidos com
φ
c
-
φ
d
= 0,050 (Figura 19).
Porém, foram superiores a 1 (K
cibacron blue
= 3,73 e K
procion red
= 3,78) e os resultados
foram estatisticamente os mesmos para os dois ligantes estudados.
89
Figura 23 – Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,1°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,032) e concentração de C
10
E
4
de 1,5%, na ausência de ligantes de afinidade
(barra branca), com cibacron blue (barra azul) e com procion red (barra vermelha).
As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores
obtidos.
Uma provável explicação para a pequena influência dos ligantes de afinidade
cibacron blue e procion red livres em solução na partição da G6PD em sistema
C
10
E
4
/tampão é que essas moléculas estejam pouco acessíveis para a ligação com
a enzima. Devido às estruturas químicas desses corantes e ao caráter anfifílico, já
mencionados, provavelmente estes interagem com as moléculas de tensoativo C
10
E
4
podendo se alocar na “interface” entre as porções polares de óxido de etileno e as
caudas apolares da micela, de maneira a dificultar a formação do complexo enzima-
ligante. Daí a idéia da síntese de tensoativos de afinidade, por intermédio da ligação
covalente dos corantes de triazina à cabeça polar de um tensoativo não-iônico, com
a finalidade de reverter tal quadro.
Deve-se considerar ainda que não somente o perfil de partição da G6PD pode
ser alterado pela presença do ligante, mas o perfil de partição do ligante também
pode ser alterado pela presença da enzima, como pode ser observado comparando
as Figuras 19 e 25, sendo que esta última apresenta os resultados do coeficiente de
partição dos ligantes a 19,5°C na presença da enzima G6PD.
0
20
40
60
80
100
120
140
sem ligante cibacron blue procion red
BA
G6PD
(%)
procion red sem ligante cibacron blue
90
Figura 24 – Coeficiente de partição dos ligantes cibacron blue (barra azul) e procion
red (barra vermelha) obtidos experimentalmente no sistema micelar C
10
E
4
/tampão de
duas fases aquosas, na presença da G6PD, utilizando-se T = 19,1°C e concentração
de C
10
E
4
de 1,5% (p/p). As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança
de 95% nos valores obtidos.
Figura 25 – Coeficiente de partição dos ligantes cibacron blue (barra azul) e procion
red (barra vermelha) obtidos experimentalmente no sistema micelar C
10
E
4
/tampão de
duas fases aquosas, na presença da G6PD, utilizando-se T = 19,5°C e concentração
de C
10
E
4
de 2,5% (p/p). As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança
de 95% nos valores obtidos.
Neste sentido, além do aumento no coeficiente de partição da G6PD
observado na presença dos ligantes de afinidade, uma diminuição no coeficiente de
partição destes últimos ocorreria devido à ligação na G6PD, a qual particiona
preferencialmente para a fase diluída do sistema. Se o ligante interagir com a
enzima em sítio específico de difícil acesso (não localizado na superfície), a
0
2
4
6
8
10
12
cibacron blue procion red
K
ligante
cibacron blue procion red
0
1
2
3
4
5
cibacron blue procion red
K
ligante
cibacron blue procion red
91
possibilidade de que a partição do ligante seja mais influenciada pela presença da
enzima é maior do que a possibilidade de que o inverso ocorra.
4.6.3. Partição dos Ligantes Cibacron Blue e Procion Red no Sistema Triton X-
114/Tampão
Foi estudada a partição dos ligantes cibacron blue e procion red,
separadamente, em sistema Triton X-114/tampão, na ausência da enzima G6PD. A
concentração de ligante utilizada foi de 0,005 mg/g, de maneira a não provocar
alterações na curva binodal e ainda resultar em bons valores de absorbância nas
determinações da concentração de ligante nas fases obtidas. A concentração de
Triton X-114 utilizada foi de 1,5% (p/p), à temperatura de 27,5°C, para a separação
de fases, resultando em R = V
c
/V
d
= 0,27. A Figura 26 apresenta os valores de
coeficiente de partição (K
ligante
) dos ligantes cibacron blue e procion red no sistema
Triton X-114/tampão. O balanço de massa fechou em 100%, considerando-se o erro
experimental.
Pela observação da Figura 26, nota-se que ambos os corantes do tipo triazina
migraram preferencialmente para a fase concentrada, rica em micelas, resultando
em coeficientes de partição superiores a 1 (K
cibacron blue
= 12,32 e K
procion red
= 11,45),
porém sem diferença estatística entre os valores obtidos. O comportamento dos
corantes no sistema Triton X-114/tampão é semelhante ao observado no sistema
C
10
E
4
/tampão, como previsto.
92
Figura 26 – Coeficiente de partição dos ligantes cibacron blue (barra azul) e procion
red (barra vermelha) obtidos experimentalmente no sistema micelar Triton X-
114/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 27,5°C e concentração de
Triton X-114
de 1,5% (p/p). As barras de erro correspondem a um intervalo de
confiança de 95% nos valores obtidos.
4.6.4. Partição da Enzima G6PD no Sistema Triton X-114/Tampão na Presença
dos Ligantes de Afinidade Cibacron Blue e Procion Red
O estudo da partição da enzima G6PD foi realizado em sistema Triton X-
114/tampão, na presença dos ligantes de afinidade cibacron blue e procion red,
separadamente. Utilizou-se as mesmas condições do experimento de partição dos
ligantes (0,005 mg/g de ligante, 1,5% (p/p) de Triton X-114
e temperatura de 27,5°C).
Conforme a estequiometria da reação enzima-ligante, os dois corantes foram
adicionados em excesso. Um experimento de partição da G6PD em sistema Triton
X-114/tampão na ausência de ligantes de afinidade foi realizado para a comparação
do efeito da interação enzima-ligante no coeficiente de partição. A concentração de
G6PD utilizada não interfere na curva binodal, assim o efeito de volume de exclusão
foi mantido constante utilizando as mesmas condições empregadas no experimento
contendo os ligantes de afinidade, correspondendo a um valor de
φ
c
-
φ
d
de 0,071.
As Figuras 27 e 28 apresentam os valores de balanço de atividade e coeficiente de
partição (K
G6PD
), respectivamente, no sistema Triton X-114/tampão na presença ou
na ausência dos corantes estudados.
0
5
10
15
20
cibacron blue procion red
K
ligante
cibacron blue procion red
93
Figura 27 – Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar Triton X-114/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T =
27,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,071) e concentração de Triton X-114
de 1,5%, na ausência de
ligantes de afinidade (barra branca), com cibacron blue (barra azul) e com procion
red (barra vermelha). As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança
de 95% nos valores obtidos.
Conforme a Figura 27, foram obtidos balanços de atividade da G6PD de
aproximadamente 100% para todos os experimentos realizados. Os ensaios
realizados na presença dos ligantes apresentaram balanço superior ao ensaio na
ausência do ligante, isto é, aproximadamente 105% para o cibacron blue e 118%
para o procion red, porém sem diferença estatística significativa entre os dois. Com
base nestes resultados, pode-se afirmar que a G6PD apresenta-se estável nos
sistemas de duas fases aquosas contendo o tensoativo Triton X-114, sem perda de
atividade catalítica. Os coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos na
presença dos ligantes de afinidade e na ausência dos ligantes não apresentaram
diferença estatisticamente significativa (Figura 28). Os valores de K
G6PD
obtidos na
ausência de ligante, na presença de cibacron blue e na presença de procion red
foram 0,38, 0,45 e 0,43, respectivamente.
0
20
40
60
80
100
120
140
sem ligante cibacron blue procion red
BA
G6PD
(%)
procion red sem ligante cibacron blue
94
Figura 28 – Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar Triton X-114/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T =
27,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,071) e concentração de Triton X-114
de 1,5%, na ausência de
ligantes de afinidade (barra branca), com cibacron blue (barra azul) e com procion
red (barra vermelha). As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança
de 95% nos valores obtidos.
Diferentemente do observado em sistemas C
10
E
4
/tampão, o coeficiente de
partição dos ligantes de afinidade não diminuiu na presença da enzima G6PD no
sistema Triton X-114/tampão, com K
cibacron blue
= 11,8 e K
procion red
= 11,4, conforme
pode ser verificado nas Figuras 26 e 29. Isto é, para estes ensaios a concentração
dos ligantes de afinidade na fase concentrada do sistema não apresentou diferença
significativa entre os valores obtidos devido à presença da enzima G6PD, como o
observado para os ensaios com o sistema C
10
E
4
/tampão. Para este último sistema,
verificou-se tendência na diminuição da concentração de ligantes na fase
concentrada, devido à presença de G6PD na fase diluída.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
sem ligante cibacron blue procion red
K
G6PD
cibacron blue procion red
95
Figura 29 – Coeficiente de partição dos ligantes cibacron blue (barra azul) e procion
red (barra vermelha) obtidos experimentalmente no sistema micelar Triton X-
114/tampão de duas fases aquosas, na presença da G6PD, utilizando-se T = 27,5°C
e concentração de Triton X-114
de 1,5% (p/p). As barras de erro correspondem a um
intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
Essa observação da diminuição de ligantes na fase concentrada em micelas
constitui-se um fator negativo pois reduziria o efeito de afinidade exercido por estes
ligantes nesta fase concentrada, já que o objetivo é otimizar a purificação da G6PD
com o uso dos ligantes nesta fase.
4.7. Síntese do Tensoativo de Afinidade TX-114-Blue
Para a síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue foram realizadas, no
total, seis tentativas. As quatro primeiras tentativas foram baseadas na metodologia
empregada por Garg et al. (1994), com adaptações, conforme descrito no Item 3.12,
em que o tensoativo TX-114 foi misturado com NaOH e água destilada, sob agitação
por quinze minutos. Em seguida adicionou-se água destilada e cibacron blue. O pH
foi ajustado para 6,50-7,00 com ácido acético glacial e a solução agitada
constantemente por seis horas à temperatura ambiente.
Na primeira tentativa de síntese, após a etapa de eluição com KCl 2,00 M, a
recuperação do material foi ínfima, o que não possibilitou caracterização por análises
espectrométricas de RMN-
1
H e de IV. A baixa quantidade de produto obtido na
0
4
8
12
16
20
cibacron blue procion red
K
ligante
cibacron blue procion red
96
primeira tentativa de síntese estaria relacionada provavelmente à ligação do produto
à resina DEAE, já que se observou baixa recuperação na etapa de eluição.
Provavelmente, a afinidade da porção hidrofóbica do tensoativo pela resina é
bastante forte, o que dificultou a eluição por força iônica.
Desta forma, na segunda tentativa, a etapa com a DEAE foi eliminada. O
material foi recuperado na fase orgânica, após extrações sucessivas em sistema
clorofórmio/água, com obtenção de massa final baixa, aproximadamente 0,0748 g
(rendimento de 0,62%) e de aspecto azul escuro. Com base nas análises dos
espectros de RMN-
1
H e IV, ficou nítido o baixo grau de pureza do produto obtido,
devido à presença de muitos sinais indesejados no espectro de RMN-
1
H e bandas
relativamente largas no espectro de IV, que indicaram presença de compostos de
partida e/ou subprodutos. Uma alíquota da massa seca obtida foi testada nos
ensaios de partição da G6PD, conforme Item 4.7.2.
Devido ao baixo grau de pureza obtido, aliado ao fato de não ter sido
observada diferença no coeficiente de partição da G6PD na presença do composto
obtido, uma nova tentativa de síntese foi realizada reinserindo a etapa de purificação
com DEAE celulose, porém com modificações. Acredita-se que a etapa de
purificação com DEAE seja um procedimento importante para a remoção de TX-114
e o cibacron blue que não reagiram. É esperado que o TX-114-Blue permaneça
ligado na resina durante a lavagem com água destilada, enquanto os compostos de
partida sejam removidos. Acredita-se, ainda, que com a eluição com solução de KCl,
o produto final se desligue da resina podendo posteriormente ser recuperado na fase
orgânica do sistema clorofórmio/água. Dessa forma, na etapa da DEAE, aumentou-
se a força iônica da solução de KCl para 4,00 M e realizou-se a eluição com a
solução aquecida (30-35°C). A amostra obtida apresentou aspecto mais azul que
97
àquela obtida na primeira tentativa de síntese, porém obteve-se novamente
rendimento muito baixo, não suficiente para a realização das análises
espectrométricas e ensaios de partição da G6PD.
Assim, foi realizada uma quarta tentativa de síntese, aumentado a quantidade
de reagentes de partida e incorporando-se sugestões do Professor Hans-Olof
Johansson, da Universidade de Lund, Suécia, que visitou o Laboratório no período
de 15 de Novembro a 22 de Dezembro de 2004. O grupo de pesquisa da
Universidade de Lund tem ampla experiência no trabalho com cibacron blue como
ligante de afinidade em sistemas de duas fases aquosas, principalmente ligado
covalentemente a polímeros.
Assim, a quantidade inicial de todos os reagentes foi aumentada quatro vezes
e, após calibração do pH, a mistura reacional foi aquecida por uma hora à
temperatura de 70-80°C. Após esse período, a mistura reacional permaneceu à
temperatura ambiente por mais cinco horas. Para a eluição da DEAE novamente
utilizou-se solução de KCl 4 M (30-35°C) e o produto final foi recuperado por
extrações sucessivas em clorofórmio. Este procedimento resultou na metodologia
descrita no Item 3.12. O produto final obtido foi um óleo azul escuro, com aspecto
bastante homogêneo e viscoso. A quantidade de massa obtida foi alta, em relação
às tentativas de síntese prévias, aproximadamente 11,02 g (rendimento de 23,42%).
As análises de RMN-
1
H e IV realizadas sugerem que não houve a ligação entre as
moléculas do tensoativo TX-114 e corante cibacron blue. Além disso, o grau de
pureza obtido foi baixo, o que demonstra presença de moléculas não reagidas
(produtos de partida) no produto final, como pode ser observado no Item 4.7.1.
As principais limitações das tentativas iniciais foram a utilização da resina
DEAE, em que provavelmente o produto permaneceu aderido, e a baixa quantidade
98
inicial dos reagentes de partida, que resultou em baixo rendimento. Na quarta
tentativa destaca-se que mesmo com o aumento na quantidade dos reagentes de
partida, observou-se baixo grau de pureza do produto obtido, com base nas análises
espectrométricas de RMN-
1
H e IV. Ressalta-se, ainda, para todas as tentativas de
síntese, o elevado grau de impureza do corante cibacron blue, o que pode acarretar
em baixo rendimento em produto final.
A idéia de uma nova tentativa de síntese do tensoativo de afinidade TX-114-
Blue (quinta tentativa) surgiu após a revisão do trabalho de Johansson (1984) a
respeito da síntese de PEG-Blue. O procedimento descrito utiliza maior quantidade
de reagentes de partida, maior período de reação com agitação constante
(aproximadamente vinte e quatro horas), elevada temperatura (acima de 80°C) e
supressão da etapa de purificação em resina DEAE celulose. O fator tempo na
realização da síntese é um ponto muito importante, uma vez que é necessário tempo
suficiente para que ocorra a ligação covalente entre os compostos TX-114 e
cibacron blue. Além disto, o tempo de reação associado a elevadas temperaturas
permite maior interação entre as moléculas de tensoativo e corante. Desta forma,
resolveu-se seguir o procedimento descrito por esse autor com algumas adaptações,
já que tal técnica foi descrita para a síntese de PEG-Blue.
A quinta síntese foi realizada conforme metodologia descrita no Item 3.12. O
tensoativo Triton X-114 foi misturado com NaOH, cibacron blue e água destilada,
sob agitação a 80-90°C. Essa mistura de reação permaneceu em agitação por uma
noite, a 25°C. Posteriormente, o pH da mistura foi ajustado para 6,6 com ácido
acético glacial e com adição de água destilada. Em seguida, adicionou-se
clorofórmio (para a quinta tentativa) ou acetato de etila (para a sexta tentativa),
agitando o meio de reação. A mistura permaneceu em repouso por
99
aproximadamente vinte e quatro horas para a separação das fases. Então,
recuperou-se a interfase do sistema e misturou-se esse volume com água e solvente
(clorofórmio), que permaneceu em repouso. Este procedimento foi repetido durante
três vezes, até que finalmente a interfase foi recuperada e rotaevaporada.
Para a realização da quinta tentativa de síntese, contou-se com a participação
e sugestões do pesquisador Jorge Sánchez Romeu, do Centro de Ingeniería
Genética y Biotecnología do Departamento de Desarrollo (CIGB), de Cuba, que
visitou o Laboratório no período de 25 de março a 15 de abril de 2005.
O produto obtido na quinta tentativa de síntese, recuperado na interfase do
sistema clorofórmio-água, foi uma emulsão de tonalidade azul clara, com aspecto
bastante uniforme e viscoso, resultado da agitação dos componentes do sistema,
diretamente realizada no funil de separação. A interfase foi centrifugada a 2.205xg
por cinco minutos, o que resultou na formação de um precipitado de aspecto azul
claro e geliforme (ainda uma emulsão) e um sobrenadante constituído
provavelmente de água com corante não reagido. Realizou-se um ensaio prévio com
uma alíquota desse precipitado, adicionando clorofórmio, e notou-se que esse
material era insolúvel. Então, adicionou-se solução de NaCl ao precipitado de forma
que o material foi solubilizado. Com a presença do NaCl, a água contida na emulsão
provavelmente interagiu de forma preferencial com os íons dissociados na mistura e,
portanto, pode ter causado desidratação dos grupos cabeça polar do TX-114,
resultando em quebra da emulsão. Em seguida o material foi filtrado a vácuo para a
retirada do NaCl que não se dissolveu, e, depois, ao material filtrado foi adicionado
clorofórmio, sendo esse novamente colocado em funil de separação, nessa etapa,
sem agitação.
100
Realizaram-se dois ensaios, antes de submeter o material novamente à
separação. No primeiro, tentou-se solubilizar o TX-114 em clorofórmio, constatando-
se que era possível; no segundo, adicionou-se cibacron blue em clorofórmio,
verificando-se que não era possível, pois o corante solubilizou-se apenas em água.
Dessa maneira, considerou-se que a fase aquosa contivesse o corante de partida e
subprodutos da reação, e que a fase orgânica contivesse o produto de interesse TX-
114-Blue mais moléculas de tensoativo que não reagiram. Diante disto, optou-se por
manter o material adicionado ao funil de separação em repouso por trinta minutos.
Posteriormente, recuperou-se a fase clorofórmio e nesta fase foi adicionado Na
2
SO
4
anidro para a retirada de água remanescente. Em seguida, realizou-se filtração a
vácuo para a remoção do Na
2
SO
4
em excesso. Por fim, o sistema foi rotaevaporado
para a remoção do clorofórmio.
Para a sexta tentativa de síntese contou-se com as sugestões da Professora
Doutora Cristina Northfleet de Albuquerque, que além de ter vasta experiência na
área de síntese de fármacos, participou da banca de qualificação deste trabalho. A
Profa. Cristina sugeriu que nas etapas de extração com solvente se substituisse
clorofórmio pelo acetato de etila, que é menos apolar que o primeiro e poderia
influenciar na redução da formação de emulsão durante a etapa de extração por
água/solvente.
O produto obtido na quinta tentativa de síntese foi submetido a análises de
RMN-
1
H e IV (ver Apêndice). O produto obtido da sexta tentativa de síntese também
foi analisado por RMN-
1
H e por cromatografia em camada delgada (com acetato de
etila). Entretanto, o espectro de RMN-
1
H obtido foi extremamente parecido com o da
quinta tentativa de síntese e, portanto, não considerado neste trabalho. Dessa
forma, os ensaios de partição com os prováveis tensoativos de afinidade TX-114-
101
Blue (segunda, quarta e quinta tentativas de síntese) foram realizados e comparados
com os ensaios efetuados sem e com o ligante livre em solução (Item 4.7.2.).
4.7.1. Identificação do Composto Obtido na Quarta, Quinta e Sexta Tentativas
de Síntese
Os espectros de RMN-
1
H do TX-114, cibacron blue e do composto obtido na
quarta e quinta tentativas de síntese estão apresentados nos Apêndices.
As análises espectrométricas de RMN-
1
H do composto obtido, e dos
reagentes de partida TX-114 e cibacron blue, analisados separadamente, sugerem
que não houve a ligação covalente entre a molécula do tensoativo TX-114 com o
cibacron blue. Ressalta-se que o grau de pureza foi baixo, indicado por subprodutos
da reação nos espectros obtidos. Além disto, o cibacron blue utilizado contém
aproximadamente 45% de impurezas, o que constitui um fator negativo na síntese
do tensoativo de afinidade. O espectro de RMN-
1
H do TX-114 apresenta um singleto
na região de δ = 3-3,5 ppm, característico de grupo OH. Para o composto obtido, TX-
114-Blue, a análise de RMN-
1
H mostra apenas um sinal nessa mesma região (de 3-
3,5 ppm), o que indica perda deste grupo devido a uma provável ligação entre
algumas moléculas de tensoativo e cibacron blue. O sinal observado na leitura do
espectro do TX-114-Blue sugere que o grau de pureza do composto obtido não foi
alto, pois pode indicar presença de tensoativo não reagido. Com a análise do
espectro de RMN-
1
H do cibacron blue, pode-se destacar a presença de prótons dos
anéis aromáticos na região de δ = 7-9 ppm que, apesar de terem sido observados,
apresentaram baixa intensidade, talvez pelo fato do ligante apresentar alto grau de
impureza. Destaca-se que quando o solvente utilizado é água deuterada (D
2
O) pode
ocorrer o mascaramento de alguns sinais do corante, devido à troca de hidrogênio
102
por deutério nos grupamentos amina, o que dificulta, em parte, a interpretação do
espectros.
Na análise de RMN-
1
H do composto obtido na quinta tentativa de síntese,
utilizou-se o solvente dimetil sulfóxido deuterado (DMSO-d
6
) para evidenciar os
prótons ligados ao nitrogênio (NH). O espectro obtido não evidenciou o singleto
referente ao grupo OH (região de 3-3,5 ppm), o que pode indicar que o grupo OH do
tensoativo desapareceu devido à possível ligação covalente de algumas moléculas
ao cibacron blue. Segundo o mesmo espectro, foi evidenciado singleto na região de
δ = 8,29 ppm, característico de grupo NH presente no corante. Tal sinal, entretanto,
não se constitui fator decisivo para confirmação da ligação entre os compostos, já
que este grupo não é perdido após a síntese.
Na análise do espectro de IV do TX-114-Blue pode-se observar a banda
intensa presente na região de 1.245 cm
-1
que é referente ao estiramento C-O de fenil
alquil éter, característica do composto formado. A provável ausência do estiramento
C-Cl (região de 800 cm
-1
) no espectro de IV do TX-114-Blue também deve ser
ressaltada, pois o corante isolado apresenta esse grupo; e com a possível formação
da ligação entre o corante e o tensoativo o mesmo é alterado para C-O. De acordo a
literatura (PAVIA et al., 1996), a banda característica do grupo OH situa-se
aproximadamente em 3.500 cm
-1
, porém o grupamento amina (NH
2
) situa-se na
mesma região. Com a análise do espectro de IV do TX-114-Blue não ficou claro qual
tipo de grupamento foi evidenciado, o que reforça a idéia do baixo grau de pureza do
produto obtido, e também da possibilidade de não ter ocorrido a ligação covalente
entre o tensoativo TX-114 e o ligante de afinidade cibacron blue. Mesmo
considerando que algumas moléculas de tensoativo e corante tenham se ligado
103
covalentemente, a concentração destas moléculas reagidas deve ter sido muito
baixa, não sendo interpretadas nos ensaios de espectrometria.
Uma possível hipótese seria que, durante a etapa de síntese do tensoativo de
afinidade, o grau de ligação covalente entre o cibacron blue e o TX-114 tenha sido
muito baixo. Além disto, parte do corante não reagido pode ter sido solubilizado nas
micelas de TX-114 formadas, devido à interações com as cabeças de polióxido de
etileno. Na etapa de purificação que envolveu extrações sucessivas com clorofórmio,
pode ter ocorrido então a formação de emulsão contendo cibacron blue, estabilizada
pelas moléculas de tensoativo Triton X-114.
Após os estudos espectrométricos do composto obtido na quarta tentativa de
síntese, realizou-se também a verificação do ponto de névoa (cloud point) para o
mesmo. Acredita-se que o tensoativo de afinidade TX-114-Blue apresente um ponto
de névoa mais alto do que o TX-114 livre no sistema. A ligação covalente do
cibacron blue ao TX-114 resulta em monômeros com um grupamento cabeça polar
carregado. Portanto, a repulsão eletrostática deve dificultar o crescimento micelar, o
que causa aumento do ponto de névoa ou aumento de temperatura. No entanto, não
foi verificada a elevação da temperatura de turvação do sistema que continha o
composto obtido. Obteve-se o mesmo T
NÉVOA
observado para o tensoativo livre, o
que é mais um indício da não ocorrência da ligação requerida entre o tensoativo
não-iônico TX-114 e o corante cibacron blue.
A análise de cromatografia em camada delgada com acetato de etila como
solvente, realizada para as amostras do tensoativo TX-114, solução de cibacron
blue/tampão e os produtos das tentativas de síntese, quinta e sexta tentativas,
mostraram não haver ocorrido a ligação covalente entre os reagentes. Pelas bandas
obtidas pode-se avaliar o deslocamento do material na placa cromatográfica, sendo
104
o tensoativo amplamente deslocado ao longo da placa em relação ao corante
cibacron blue que não apresentou deslocamento. Desta maneira, a quinta e sexta
tentativas de síntese apresentaram o mesmo padrão de deslocamento,
aparentemente o mesmo que o do tensoativo TX-114 puro (Apêndice I). Tal
resultado demonstra que possivelmente as moléculas do corante podem ter sido
solubilizadas com as moléculas do TX-114, e que na verdade o composto obtido
seria um ligante livre, ou seja, uma mistura de tensoativo com corante. Ou então,
que a quantidade de material sintetizado (TX-114-Blue) foi muito reduzida, de
maneira que a maior parte do produto da síntese seria composta pelos reagente de
partida, Triton X-114 e corante.
Foi realizada análise de mudança de tonalidade da mistura Triton X-
114/corante livre, utilizando-se a mesma metodologia empregada para a
cromatografia em camada delgada. Este ensaio foi realizado porque no primeiro
experimento de cromatografia em camada delgada nota-se que os produtos da
reação são mais escuros que o corante livre (Apêndice I). Uma das hipóteses seria
que as condições impostas à síntese desencadeariam algum tipo de reação e assim
justificaria a mudança de cor. Com base no resultado obtido, notou-se que a
coloração da mistura entre o tensoativo e o corante não foi a mesma da obtida com
o composto da síntese, nem mesmo do corante livre. Este resultado mostra ser uma
possível reação entre os reagentes, entretanto a quantidade de material sintetizado
e a pureza são extremamente reduzidas. Portanto, propõe-se a necessidade de
estudos futuros, por meio de novas estratégias associando a otimização do processo
metodológico, bem como um processo de purificação da matéria prima e do produto
final, para que se aumente o grau de pureza do produto TX-114-Blue.
105
4.7.2. Ensaios de Partição da G6PD em Sistema Contendo os Compostos
Obtidos na Segunda, Quarta e Quinta Tentativas de Síntese
Nesse item, estudou-se o efeito de afinidade no coeficiente de partição da
G6PD e balanço de atividade, utilizando inicialmente os produtos da segunda e
quarta tentativas de síntese (2ºTX-114-Blue e 4ºTX-114-Blue, respectivamente). As
condições para os ensaios foram 2% (p/p) de Triton X-114 a 26,96°C,
conseqüentemente, com um efeito de volume de exclusão (
φ
c
-
φ
d
) = 0,065. As
amostras do 2ºTX-114-Blue e 4ºTX-114-Blue foram adicionadas ao sistema nas
concentrações 0,02 mg/g e 0,0216 mg/g, respectivamente, o que correspondeu em
absorbância a 0,005 mg/g de cibacron blue. Estes ensaios foram comparados, nas
mesmas condições, com a partição da G6PD sem o ligante cibacron blue e na
presença do ligante livre (0,005 mg/g) em solução. Foram realizados também
ensaios com duas vezes a concentração do 4ºTX-114-Blue (3,00 mg/g) e ensaios
com o 4ºTX-114-Blue puro a 2% (p/p). Com base na Figura 30, os valores de K
G6PD
obtidos nos ensaios mostram que o efeito esperado pela presença dos tensoativos
de afinidade no sistema, ou seja, direcionar a partição da G6PD para fase rica em
micelas, não foi observado. Por outro lado, o ensaio utilizando o 4ºTX-114-Blue foi o
que mostrou maior K
G6PD
(de aproximadamente 0,46)
em relação aos outros ensaios.
É importante destacar que mesmo na ausência das amostras de síntese e do
cibacron blue, o coeficiente de partição da G6PD foi de aproximadamente 0,41,
próximo ao valor obtido com o 4ºTX-114-Blue. Portanto, a contribuição destas
amostras não foi suficiente para elevar consideravelmente o coeficiente de partição
da enzima estudada para a fase micelar; nem mesmo suficiente para apresentar
efeito considerável no coeficiente de partição da enzima G6PD, em relação à
ausência de ligante ou com o ligante livre.
106
A baixa contribuição dada por estas amostras provavelmente deve-se à
dificuldade da promoção da ligação covalente entre o tensoativo TX-114 e o corante
cibacron blue.
Figura 30 – Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar Triton X-114/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T =
26,96°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,065) e concentração de Triton X-114
de 2%, na ausência de
ligantes de afinidade (barra branca), na presença de cibacron blue livre 0,005 mg/g
(1), 2ºTX-114-Blue 0,002 mg/g (2), 4ºTX-114-Blue 0,0216 mg/g (3), 4ºTX-114-Blue 3
mg/g (4) e com 4ºTX-114-Blue puro a 2% (5). As barras de erro correspondem a um
intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
Os balanços de atividade obtidos nos ensaios foram iguais ou superiores a
100%, com base no tratamento estatístico efetuado, como pode ser observado na
Figura 31, com exceção do ensaio realizado com o 4ºTX-114-Blue a 0,0216 mg/g,
que apresentou balanço de atividade de aproximadamente 80%. Entretanto, este
valor ainda é relativamente alto e com baixo efeito desnaturante na G6PD. É
importante destacar que, para o ensaio contendo 3 mg/g de TX-114-Blue, o BA
G6PD
obtido foi muito superior a 100% (aproximadamente 170%), apresentando
superatividade enzimática. O fenômeno observado pode estar relacionado à
sobrecarga de TX-114-Blue adicionado ao sistema, já que é conhecido o efeito de
interação entre o tensoativo não-iônico TX-114 e a G6PD (Item 4.1.1).
0,2
0,3
0,4
0,5
Sem
ligante
1 2 3 4 5
K
G6PD
107
Figura 31 – Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar TX-114/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 26,96°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,065) e concentração de TX-114
de 2%, na ausência de ligantes de afinidade
(barra branca), na presença de cibacron blue livre 0,005 mg/g (1), 2ºTX-114-Blue
0,002 mg/g (2), 4ºTX-114-Blue 0,0216 mg/g (3), 4ºTX-114-Blue 3 mg/g (4) e com
4ºTX-114-Blue puro a 2% (5). As barras de erro correspondem a um intervalo de
confiança de 95% nos valores obtidos.
Foi estudada também a adição do 4ºTX-114-Blue em sistema C
10
E
4
/tampão.
As condições do ensaio foram 2% (p/p) de C
10
E
4
, para os ensaios com ligante livre
(0,005 mg/g), 4ºTX-114-Blue (0,0216 mg/g, equivalente a 0,005 mg/g de cibacron
blue) e 2,5% (p/p) de C
10
E
4
para o ensaio sem ligante. A temperatura utilizada foi de
19,5°C, com um efeito de
φ
c
-
φ
d
= 0,050.
Como se pode observar na Figura 32, o valor de K
G6PD
para o 4ºTX-114-Blue,
por si só, não contribuiu para o aumento do coeficiente de partição da enzima
estudada (K
G6PD
= 0,39), quando comparado com os ensaios sem o ligante que
apresentou K
G6PD
= 0,44 e com o ligante livre no sistema com K
G6PD
= 0,35.
Os resultados de K
G6PD
não demonstraram diferença significativa entre os
valores obtidos; entretanto, os valores K
G6PD
obtidos foram inferiores a 1, o que
reflete a partição da enzima preferencialmente para a fase diluída (fase pobre em
micelas) do sistema C
10
E
4
/tampão. Dessa forma, é muito pouco provável que a
G6PD tenha interagido com a amostra 4ºTX-114-Blue, de maneira que o efeito
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Sem
ligante
1 2 3 4 5
BA
G6PD
(%)
108
causado pelo volume de exclusão foi maior que o efeito desempenhado pelo
composto derivado da síntese. Tal composto não demonstrou nenhuma influência na
partição da G6PD para a fase concentrada em micelas.
Figura 32 – Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,050) e concentração de C
10
E
4
de 2% para o ligante livre 0,005 mg/g e o quarto
TX-114-Blue 0,0216 mg/g, e 2,5% no ensaio sem ligante (barra branca). As barras
de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
Figura 33 – Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,050) e concentração de C
10
E
4
de 2% para o ligante livre 0,005 mg/g e o quarto
TX-114-Blue 0,0216 mg/g, e 2,5% no ensaio sem ligante (barra branca). As barras
de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
A Figura 33 ilustra os valores de BA
G6PD
obtidos experimentalmente. Os
balanços de atividade obtidos nos ensaios apresentaram valores de
aproximadamente 81, 94 e 97%.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
ligante livre TX-114-Blue sem ligante
K
G6PD
TX-114-Blue sem ligante ligante livre
0
20
40
60
80
100
120
ligante livre TX-114-Blue sem ligante
BA
G6PD
(%)
TX-114-Blue sem ligante ligante livre
109
O efeito da amostra de TX-114-Blue oriunda da quinta tentativa de síntese
também foi estudado no coeficiente de partição da G6PD e no balanço de atividade.
As condições para os ensaios foram 2% (p/p) de C
10
E
4
, para os ensaios com o
ligante livre (0,005 mg/g), 5ºTX-114-Blue (0,06 mg/g, equivalente a 0,005 mg/g de
cibacron blue), e 2,5% (p/p) de C
10
E
4
para o ensaio sem ligante. A temperatura
utilizada foi de 19,5°C, conseqüentemente, com um efeito de volume de exclusão (
φ
c
-
φ
d
) = 0,050. Com base na Figura 34, os valores de K
G6PD
obtidos nos ensaios
mostram que o efeito esperado pela presença da amostra derivada da síntese no
sistema, ou seja, direcionar a partição da G6PD para fase micelar, não foi
observado. O coeficiente de partição em presença de 5ºTX-114-Blue, K
G6PD
= 0,30,
foi semelhante ao obtido com ligante livre, K
G6PD
= 0,35, e sem ligante, K
G6PD
= 0,44.
Portanto, a amostra da quinta síntese não apresentou qualquer efeito no coeficiente
de partição da enzima G6PD em relação à ausência de ligante ou com o ligante livre.
Figura 34 – Coeficientes de partição da G6PD (K
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,050), ligante livre 0,005 mg/g e TX-114-Blue 0,06 mg/g. As barras de erro
correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
A Figura 35 ilustra os valores de BA
G6PD
obtidos experimentalmente. Os
balanços de atividade obtidos nos ensaios apresentaram valores de
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
ligante livre TX-114-Blue sem ligante
K
G6PD
TX-114-Blue
110
aproximadamente 100%, com exceção do ensaio com o ligante livre, que resultou
em BA
G6PD
de aproximadamente 80%.
Figura 35 – Balanços de atividade da G6PD (BA
G6PD
) obtidos experimentalmente no
sistema micelar C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas utilizando-se T = 19,5°C (
φ
c
-
φ
d
= 0,050), ligante livre 0,005 mg/g e TX-114-Blue 0,06 mg/g. As barras de erro
correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores obtidos.
4.8. Estudo da Partição da G6PD em Sistemas Triton X-114 Contendo Sais
4.8.1. Curva Binodal Obtida para o Sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
Figura 36 – Curva binodal para o sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
,
à temperatura de
20°C, obtida experimentalmente com base nos pontos de névoa que caracterizam a
transição do sistema bifásico para o sistema monofásico ou vice versa.
A Figura 36 ilustra a curva binodal obtida para o sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
a
20°C, e representa a transição do sistema monofásico para o bifásico ou vice e
0
20
40
60
80
100
120
140
ligante livre TX-114-Blue sem ligante
BA
G6PD
(%)
ligante livre
TX
-
114
-
Blue
sem ligante
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 0,1 0,2 0,3 0,4
[Triton X-114] mol/L
[(NH
4
)
2
SO
4
] mol/L
Sistema Bifásico
Sistema Monofásico
111
versa. De acordo com a curva, ao se iniciar um ensaio com uma concentração fixa
de tensoativo, numa dada temperatura, e adicionar (NH
4
)
2
SO
4
, o sistema se turvará
com determinada concentração de sal adicionado. Cada ponto da Figura 36
representa um ponto de névoa obtido e a curva média destes pontos corresponde à
curva binodal. A curva obtida não contribuiu significantemente para o planejamento
dos ensaios de partição, uma vez que nem todos os ensaios foram realizados a
20°C. No que diz respeito à utilização de sais, a construção de um diagrama de
fases tridimensional envolvendo não somente as concentrações de TX-114 e
(NH
4
)
2
SO
4
, mas também a temperatura de névoa, implicaria em complexidade
adicional que não consiste no escopo deste estudo prévio.
4.8.2. Estudos com o Sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
Inicialmente, estudou-se o efeito do sulfato de amônio (NH
4
)
2
SO
4
na partição
da G6PD contendo o tensoativo não-iônico Triton X-114.
Com base na curva obtida (Item 4.8.1), realizaram-se alguns ensaios com
concentrações de TX-114 correspondendo a sistemas monofásicos, conforme a
Tabela 06. Para esses ensaios, portanto, os sistemas não turvavam e
conseqüentemente não se separaram em duas fases. Com estes ensaios pôde-se
estudar o comportamento dos componentes do sistema, período de agitação para
homogeneização e o aspecto final do sistema (como formação ou não de
precipitado).
112
TABELA 06 – Ensaios prévios para o estudo da solubilização dos componentes em
sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
, submetido a 20°C, por duas horas.
Ensaio
[TX-114]
(mol/L)
[(NH
4
)
2
SO
4
]
(mol/L)
Aspecto
A 0,32 0,10 Homogêneo e transparente
B 0,31 0,10 Homogêneo e transparente
C 0,14 0,11 Homogêneo e transparente
D 0,20 0,25 Homogêneo e transparente
E 0,15 0,13 Homogêneo e transparente
Os ensaios D e E foram posteriormente submetidos à temperatura de 25°C.
Nessa condição, houve turvação dos sistemas. Após a separação das fases por
centrifugação a 1.125xg, 25°C, foram realizadas medidas de condutância, as quais
estão apresentadas na Tabela 07. Notou-se que após a centrifugação a fase
superior era diluída e a fase inferior, que correspondia à fase rica em micelas, era
predominantemente viscosa. Ambas as fases apresentaram aspecto transparente.
TABELA 07 – Valores de condutância elétrica (mS) obtidos para as fases
concentrada e diluída dos ensaios D e E após a separação de fases a 25°C.
Ensaio*
Fase concentrada
(fase micelar)
Fase diluída
D 40,00 mS 60,00 mS
E 20,00 mS 27,00 mS
* leituras correspondentes a amostras diluídas dez vezes.
Com base na Tabela 07, a fase diluída apresentou maior potencial elétrico
que a fase concentrada, o que indica a predominância do sal nessa fase. Porém, a
diferença de condutância elétrica entre as fases formadas nos ensaios D e E foi
baixa e provavelmente insuficiente para influenciar por salting-out a partição da
G6PD para a fase micelar.
113
Com o intuito de aumentar a diferença de potencial elétrico entre as fases do
sistema, variou-se a concentração de (NH
4
)
2
SO
4
de 0,36 a 1 mol/L. A Tabela 08
mostra os ensaios realizados, com a composição de cada sistema, temperatura e
razão volumétrica entre as fases concentrada e diluída (R). Destaca-se que a razão
volumétrica obtida nesses ensaios permitiu coletar seguramente as amostras das
respectivas fases, o que diminuiu o risco de contaminação de uma fase por outra,
com exceção do ensaio H que teve R = 0,20. Realizou-se também a partição da
G6PD, ensaios I, J e K, e, como se pode observar na Tabela 09, a enzima não
apresentou atividade na fase micelar, isto é, a enzima foi recuperada totalmente na
fase diluída do sistema. O balanço de atividade da G6PD foi de aproximadamente
135%, o que representa estabilidade em presença do TX-114 e do (NH
4
)
2
SO
4
. Cabe
ressaltar que estudos prévios demonstraram superatividade de G6PD na presença
de TX-114 (LOPES et al., 2004), assim como mencionado anteriormente no Item
4.1.1.
TABELA 08 – Ensaios de separação de fases para o sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
por
duas horas.
Ensaio [TX-114] (mol/L) [(NH
4
)
2
SO
4
] (mol/L)
R (V
c
/V
d
) T(°C)
F 0,15 0,36 1,00 25,50
G 0,15 0,54 0,54 25,50
H* 0,14 1,00 0,20 26,00
* foi observada inversão de fases nesse ensaio.
TABELA 09 – Estudo da partição da G6PD em sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
por duas
horas.
Ensaio
[TX-114]
(mol/L)
[(NH
4
)
2
SO
4
]
(mol/L)
R
(V
c
/V
d
)
K
G6PD
BA (%)
T(°C)
I 0,15 0,62 0,42 0,00 138 26,00
J* 0,15 0,60 0,45 0,00 131 26,00
K 0,14 0,89 0,41 0,00 132 25,50
* após duas horas a amostra foi centrifugada a 1.125xg por cinco minutos;
114
Verificou-se a inversão de fases nos ensaios H e K, de maneira que a fase
concentrada (rica em micelas) deslocou-se para o topo do sistema e a fase diluída
para o fundo. A inversão de fases se deve ao aumento na concentração de sulfato
de amônio nos sistemas, que torna a densidade da fase diluída maior que a da fase
micelar. Tal fenômeno observado ocorre também em outros tipos de sistemas como,
por exemplo, EOPO (comercialmente chamado de Breox, copolímero composto por
50% de óxido de etileno e 50% de óxido de propileno) com citrato de amônio. Uma
vez que a fase superior é a fase concentrada em micelas, a dificuldade para coleta
dessa fase é maior do que quando o inverso ocorre. Nas condições estudadas,
verificou-se que a fase superior rica em micelas era muito viscosa e em menor
volume do que a fase diluída.
Com o objetivo de avaliar a diferença de potencial elétrico entre as fases dos
sistemas F, G e H, mediu-se a condutância elétrica das fases. A Tabela 10
apresenta os valores obtidos. Destaca-se o ensaio H, que apresentou a maior
diferença na condutância elétrica, sendo a condutância da fase diluída duas vezes
maior do que a da fase concentrada em micelas.
TABELA 10 – Valores de condutância elétrica (mS) das fases concentrada e diluída
dos ensaios F, G e H, a 25°C.
Ensaio
Fase concentrada
(fase micelar)
Fase diluída
Inversão de
fases
F* 45,00 mS 065,00 mS não
G* 51,00 mS 091,00 mS não
H** 80,00 mS 176,00 mS sim
* amostras diluídas dez vezes;
** amostras diluídas vinte vezes.
Com base no resultado de condutância elétrica do ensaio H, foram
conduzidos novos ensaios a fim de testar o efeito de salting-out na partição da
115
G6PD em sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
. Os resultados obtidos estão apresentados na
Tabela 11, correspondendo aos ensaios L, M, N e O, nos quais estudou-se a
partição da G6PD em diferentes temperaturas. O ensaio L, apesar de ter
apresentado diferença de potencial eletrostático relativamente alta entre as duas
fases (semelhante ao ensaio H), não influenciou a partição da enzima G6PD para a
fase micelar. Este resultado sugere que as interações por volume de exclusão
presentes no sistema tenham maior influência na partição da G6PD do que a
diferença de potencial eletrostático existente entre as duas fases. A fim de aumentar
a diferença de potencial eletrostático, elevou-se a concentração de sal para 1,20
mol/L (ensaios M, N e O). Durante a preparação desses sistemas o período de
agitação foi prolongado, devido à dificuldade de solubilizar os componentes em altas
concentrações. Mesmo assim, visualmente, os tubos apresentaram presença de
pequenas quantidades de tensoativo que não se solubilizou. Posteriormente, estes
sistemas foram submetidos à separação de fases, nas respectivas temperaturas, por
três horas.
TABELA 11 - Estudo da partição da G6PD em sistema Triton X-114/(NH
4
)
2
SO
4
, por
três horas.
Ensaio
[TX-114]
(mol/L)
[(NH
4
)
2
SO
4
]
(mol/L)
K
G6PD
BA (%)
R
(V
c
/V
d
)
T(°C)
L 0,14 1,00 0,00 130 0,20 26,00
M 0,15 1,20 0,90 192 0,18 26,50
N 0,15 1,20 1,20 173 0,18 10,00
O 0,15 1,20 0,00 170 0,18 ~ 0,00
Para os resultados de coeficiente de partição (K
G6PD
), destacam-se os obtidos
nos ensaios M e N, que apresentaram valores de aproximadamente 1,
116
considerando-se o erro experimental. Desta forma, a recuperação de G6PD na fase
micelar foi maior que em todos os ensaios previamente realizados, os quais
forneceram K
G6PD
< 1. Tais resultados, entretanto, são inconclusivos, uma vez que o
sistema final apresentou em sua constituição presença de tensoativo não
solubilizado. Com base nessas observações não se pode considerar o sistema
totalmente homogêneo antes da separação de fases. Em contrapartida, pode ser
que o efeito de salting-out presente nos ensaios M e N tenha atuado na partição da
G6PD para a fase micelar. Os valores de balanço de atividade obtidos para os
ensaios foram superiores a 100%, o que indica estabilidade da enzima nos sistemas,
e ainda superatividade enzimática. Notou-se que altas concentrações de TX-114,
aliadas a temperaturas mais baixas (10°C e 0°C), resultaram em fases de topo ricas
em tensoativo, transparentes, muito viscosas e de pequeno volume, e em fases
diluídas turvas, de maior volume e pouco viscosas.
Para tentar contornar a dificuldade encontrada na solubilização dos
compostos, realizaram-se novos ensaios de partição da G6PD, à temperatura de
10°C (ensaios P, Q, R e S), aumentando-se o período de agitação para
aproximadamente uma hora e trinta minutos. No entanto, no ensaio P observou-se o
mesmo fenômeno dos ensaios M e N: presença de tensoativo não solubilizado. Após
agitação, os sistemas foram submetidos à separação de fases por cinco horas. Os
resultados de partição da G6PD obtidos estão apresentados na Tabela 12. Destaca-
se o ensaio P, que apresentou o mesmo valor de K
G6PD
que o ensaio M (0,90). O
resultado confirma o aumento da partição da G6PD para a fase micelar. No entanto,
por esse sistema apresentar precipitado de tensoativo, não se considerou o
resultado obtido conclusivo, mas sim uma indicação da possibilidade de efeito de
salting-out na partição da G6PD.
117
TABELA 12 – Estudo da partição da G6PD em sistema Triton X-114/(NH
4
)
2
SO
4
, por
cinco horas, a 10°C.
Ensaio
[TX-114]
(mol/L)
[(NH
4
)
2
SO
4
]
(mol/L)
K
G6PD
BA (%)
R
(V
c
/V
d
)
P 0,15 1,20 0,90 197 0,20
Q 0,14 1,10 0,00 133 0,26
R 0,14 1,18 0,00 145 0,16
S 0,13 1,20 0,00 156 0,10
Nos ensaios R e S reduziu-se a concentração de TX-114 mantendo
praticamente a mesma concentração de sal utilizada nos ensaios anteriores (1,20
mol/L). Nos ensaios R e S não se observou precipitação do tensoativo, mesmo com
1,20 mol/L de sulfato de amônio; porém, obteve-se K
G6PD
igual a 0 nos dois ensaios.
Nestes ensaios, além do sal usado não ter influenciado a partição da enzima para a
fase micelar, o volume da fase concentrada diminuiu, o que gerou dificuldade no
momento de coleta das amostras, principalmente da fase concentrada em micelas,
que era muito viscosa e, neste caso, com reduzido volume.
TABELA 13 – Valores de condutância elétrica (mS) obtidos para as fases
concentrada e diluída dos ensaios L e P.
Ensaio*
Fase concentrada
(fase micelar)
Fase diluída
L 062,00 mS 155,00 mS
P 120,00 mS 213,00 mS
* leituras correspondentes a amostras diluídas quarenta vezes.
A Tabela 13 mostra a diferença de condutância elétrica obtida entre as fases
concentrada e diluída nos ensaios L e P. Esses ensaios foram conduzidos em
diferentes temperaturas para a separação das fases (L a 26°C e P a 10°C); apesar
de ter sido criado uma diferença de potencial elétrico entre a fase micelar e a fase
118
diluída de aproximadamente 95 mS para os ensaios L e P, esta não foi suficiente
para o aumento do K
G6PD
. O efeito contrário ao salting-out desempenhado pelo
volume de exclusão foi dominante neste tipo de sistema.
4.8.3. Estudos com o Sistema TX-114/Na
2
SO
4
Após os estudos de partição da G6PD com o sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
,
estudou-se o efeito do Na
2
SO
4
na partição dessa mesma enzima, em presença do
tensoativo não-iônico Triton X-114.
A Tabela 14 mostra a composição dos sistemas estudados. Esses ensaios
tiveram como objetivo fornecer dados para posterior estudo da partição da G6PD,
como a razão volumétrica entre as fases formadas (R), aspecto das fases (formação
de precipitado, inversão de fases, viscosidade) e a temperatura de partição.
TABELA 14 – Ensaios de separação de fases para o sistema TX-114/Na
2
SO
4
, por
três horas.
Ensaio
[TX-114]
(mol/L)
[Na
2
SO
4
]
(mol/L)
R
(V
c
/V
d
)
T(°C)
Inversão
de Fases
A 0,13 0,68 0,24 26,00
sim
B 0,13 0,70 0,21 26,00
sim
C 0,15 0,45 0,20 10,00
não
D 0,15 0,51 0,27 10,00
sim
Para todos os ensaios, com exceção do C, foi observada inversão das fases,
assim como nos ensaios anteriores utilizando o sulfato de amônio. Determinou-se
também, para esses ensaios, a diferença de potencial elétrico entre as fases
concentrada e diluída obtidas. Dessa forma, escolheram-se para os ensaios de
partição da G6PD as condições experimentais utilizadas no ensaio B, que
apresentou maior diferença de condutância elétrica entre a fase micelar e a fase
119
diluída, aproximadamente 95 mS. Os resultados de condutância obtidos podem ser
visualizados na Tabela 15.
TABELA 15 – Valores de condutância elétrica (mS) obtidos para as fases
concentrada e diluída dos ensaios A, B, C e D à temperatura ambiente.
Ensaio*
Fase concentrada
(fase micelar)
Fase diluída
A 36,64 mS 114,4 mS
B 21,54 mS 118,4 mS
C 72,00 mS 0055,54 mS
D 88,40 mS 0088,80 mS
* leituras correspondentes a amostras diluídas quarenta vezes.
O estudo da partição da G6PD foi conduzido em duas temperaturas
diferentes, 10°C e 25°C, a fim de se avaliar o efeito na partição da enzima bem
como na separação das fases dos sistemas. Nas concentrações estudadas, não se
observou precipitação de TX-114 ou de sal. No entanto, destaca-se como dificuldade
a baixa fração volumétrica obtida para a fase concentrada de cada ensaio,
aproximadamente 0,20, o que, por sua vez, acarretou em grande dificuldade para
coleta da amostra e maior probabilidade de contaminação da fase concentrada pela
fase de fundo, diluída. Os resultados obtidos e a composição dos ensaios podem ser
visualizados na Tabela 16.
Os estudos de partição da G6PD nesses sistemas resultaram em K
G6PD
igual
a 0 para todos os ensaios realizados. Pode-se inferir, então, que a enzima foi
totalmente recuperada na fase diluída do sistema. O balanço de atividade da enzima
foi superior a 100% para todos os ensaios realizados, de forma semelhante aos
ensaios anteriores realizados com (NH
4
)
2
SO
4
(Item 4.8.2).
120
Semelhantemente ao observado no sistema TX-114/(NH
4
)
2
SO
4
, o sistema TX-
114/Na
2
SO
4
foi incapaz de influenciar a partição da enzima G6PD para a fase
micelar; o efeito de salting-out não foi observado ou, se houve tal efeito, não foi
suficiente para superar o efeito contrário de exclusão pelo volume.
TABELA 16 – Estudo da partição da G6PD em sistema Triton X-114/Na
2
SO
4
.
Ensaio
[TX-114]
(mol/L)
[Na
2
SO
4
]
(mol/L)
R
(V
c
/V
d
)
K
G6PD
BA (%)
T(°C)
E 0,13 0,70 0,18 0,00 150,00 25,00
F 0,15 0,68 0,17 0,00 145,00 10,00
O efeito de salting-out na enzima G6PD nos sistemas Triton X-114/Sais não
foi observado. É possível que o grau de hidrofobicidade desta enzima não seja tão
alto como o de outras enzimas. Desta forma, é possível que para se obter o efeito
esperado, a concentração de sal presente nos experimentos deveria ser superior às
testadas nas condições de estudo.
4.9. Estudo da partição da G6PD proveniente do homogeneizado de S.
cerevisiae
Neste estudo foi realizada a partição do homogeneizado celular de S.
cerevisiae contendo G6PD em um sistema micelar de duas fases aquosas (Triton X-
114/tampão), de forma a promover a partição de proteínas com caráter mais
hidrofóbico para a fase inferior rica em micelas não-carregadas. Neste sistema, as
proteínas hidrofílicas, como a G6PD, particionam preferencialmente para a fase
superior, pobre em micelas, na qual existe maior volume livre disponível. Portanto,
proteínas hidrofílicas migram para a fase superior do sistema por efeito de volume
121
de exclusão e podem ser separadas de outras biomoléculas na fase diluída do
sistema (NIKAS et al., 1992; LUE, BLANKSCHTEIN, 1996).
A Tabela 17 apresenta os resultados obtidos para a purificação de G6PD
presente em homogeneizado celular de S. cerevisiae e G6PD na forma pura por
SMDFA.
TABELA 17 – Resultados de coeficiente de partição da G6PD (K
G6PD
), razão
volumétrica entre as fases (R), proteínas totais (K
p
), balanço de atividade de G6PD
(BA
G6PD
), balanço de massa de proteínas totais (BM
P
), rendimento de G6PD na fase
diluída do sistema micelar não-iônico (Y
G6PD
), seletividade (Š) e fator de purificação
(f
p
), para o estudo de purificação de G6PD presente em homogeneizado celular de
S. cerevisiae e na forma pura.
Parâmetros de
Extração
Analisados
Sistema TX-114/Tampão
2,00% (p/p) de TX-114 a
27°C, contendo o
homogeneizado
Sistema TX-114/Tampão
2,00% (p/p) de TX-114 a
27°C, contendo a G6PD
pura
R
0,25 0,39
K
G6PD
0,35 ± 0,02 0,41 ± 0,01
K
p
0,50 ± 0,07 -
BA
G6PD
100% 98% ± 5
BM
P
91% ± 4 -
Y
G6PD
92% ± 2 100% ± 5
Š 0,70 -
f
p
1,00 -
Conforme a Tabela 17, os ensaios com o homogeneizado de S. cerevisiae
mostram que a enzima G6PD migrou preferencialmente para a fase superior do
sistema, com um coeficiente de partição K
G6PD
= 0,35. É importante destacar que a
maior parte das proteínas também migrou preferencialmente para a fase diluída do
sistema, com um coeficiente de partição de proteínas totais K
p
= 0,50. Apesar de ter
sido obtido um valor de K
p
inferior a 1, o mesmo foi superior ao K
G6PD
, o que mostra
que houve partição preferencial de determinadas proteínas, de caráter hidrofóbico,
122
para a fase concentrada em micelas. O fator de purificação obtido foi de 1 e a
seletividade Š = 0,70. O valor de seletividade inferior a 1 ocorreu, pois nesse sistema
a G6PD migra preferencialmente para a fase diluída do sistema de forma mais
acentuada que o total de proteínas. Nesse sentido, para o sistema Triton X-
114/tampão, quanto menor o valor de Š, mais seletivo é o processo. Balanços de
atividade de G6PD e de massa de proteínas totais de 100% e 91%,
respectivamente, foram obtidos nesse estudo de purificação. Portanto, não ocorreu
desnaturação da G6PD nas condições empregadas. O rendimento de G6PD na fase
diluída também foi calculado, fornecendo resultado de Y
G6PD
= 92%.
Como pode ser observado na Tabela 17, o mesmo comportamento foi obtido
para a G6PD pura, ou seja, partição preferencial para a fase diluída do sistema, a
qual apresenta maior volume disponível para a enzima. O coeficiente de partição
para a G6PD pura (K
G6PD
= 0,41) foi maior do que para a do homogeneizado celular
(K
G6PD
= 0,35). Essa pequena diferença entre os valores de K
G6PD
obtidos pode estar
relacionada à influência da presença de diversas outras proteínas e outros
componentes celulares provenientes do homogeneizado celular. Essa diminuição no
coeficiente de partição da G6PD pode ser explicada pela presença de proteínas e
outros contaminantes na fase concentrada, o que aumentaria o efeito de volume de
exclusão da enzima G6PD para a fase pobre em micelas.
Outro dado importante foi que a presença do homogeneizado celular causou
alteração na curva binodal referente ao sistema estudado. Tal fato pode ser
comprovado pelo valor de R obtido (0,25), sendo que a curva binodal que
caracteriza o sistema TritonX-114/tampão na temperatura utilizada indica um R de
0,39 para essa condição. Efeito semelhante já foi observado em sistema
C
10
E
4
/C
10
TAB/tampão, como descreveu Rangel-Yagui (2003).
123
Portanto, tanto a G6PD presente no homogeneizado celular de S. cerevisiae
como a enzima pura apresentaram partição preferencial para a fase superior do
sistema, pobre em micelas de Triton X-114, devido ao efeito do volume de exclusão,
que é proporcionado pela fase inferior rica em micelas. As proteínas totais também
apresentaram partição preferencial para a fase diluída pobre em micelas.
O sistema de purificação com o homogeneizado celular de S. cerevisiae
estudado foi eficiente em recuperar a biomolécula-alvo na fase pobre em micelas, o
que permite separar da presença de biomoléculas hidrofóbicas contaminantes. Esse
sistema pode ser otimizado também empregando o processo de purificação em duas
etapas, partindo-se até mesmo de um homogeneizado mais impuro. Uma das
alternativas seria, por exemplo, como proposto por Rangel-Yagui et al. (2003), um
primeiro estágio constituído pelo sistema micelar não-iônico (Triton X-114) de duas
fases aquosas e um segundo de sistema micelar misto (Triton X-114/C
10
TAB),
também de duas fases aquosas. Uma vantagem de se trabalhar com um tensoativo
não-iônico como o Triton X-114 em etapas de purificação seria o baixo custo desse
tipo de tensoativo quando comparado ao C
10
E
4
. Dessa maneira, o primeiro estágio
serviria para favorecer a partição das proteínas mais hidrofóbicas para a fase rica
em micelas não-carregadas e as proteínas hidrofílicas, como a G6PD, para a fase
pobre em micelas, na qual existe maior volume disponível. Em seqüência, essa fase
diluída, pobre em micelas, seria coletada e a partir dela um novo sistema seria
preparado, ou seja, um sistema micelar misto de duas fases aquosas (Triton X-
114/C
10
TAB). Esse sistema misto seria constituído por micelas positivamente
carregadas e que deveriam influenciar o perfil de partição de proteínas carregadas.
Especificamente a enzima G6PD, que possui uma carga global negativa em pH
124
neutro, deve ser atraída eletrostaticamente para a fase concentrada rica em micelas
positivamente carregadas.
4.10. Estudos dos Parâmetros Cinéticos (K
M
e V
MAX
) e Termodinâmicos (Ea, ∆G,
∆H e ∆S) antes e após a Purificação por SMDFA
Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram determinados antes e após
a purificação da enzima G6PD por SMDFA, para avaliar possíveis alterações que o
processo de SMDFA possa causar nas características da enzima pura.
Na Figura 37 são apresentados os valores de atividade enzimática (U/mL) da
G6PD em função da concentração do substrato (G6P), obtidos para a enzima na
forma pura. A Figura 37a apresenta os resultados de atividade enzimática para a
enzima pura antes da partição por SMDFA. A Figura 37b, os resultados de atividade
enzimática após a partição por SMDFA obtidos na fase diluída do sistema (pobre em
micelas) a qual apresenta maior atividade enzimática em relação à fase concentrada
(rica em micelas). A condição de partição estudada correspondeu a 2% de Triton X-
114 a 27°C.
a)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 50 100 150 200 250 300
[G6P] uM
Atividade da G6PD (U/mL)
125
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 100 200 300 400
[G6P] uM
Atividade da G6PD (U/mL)
b)
FIGURA 37 – a) Atividade da G6PD pura antes da partição por SMDFA em função
da concentração de substrato (G6P); b) Atividade da G6PD pura após a partição por
SMDFA obtida na fase diluída do sistema (pobre em micelas) em função da
concentração de substrato (G6P).
O objetivo destes experimentos foi estimar as constantes cinéticas K
M
(constante de Michaelis-Menten) e V
MAX
(velocidade máxima de reação) para o
sistema enzimático estudado. Neste item, a cinética da glicose-6-fosfato
desidrogenase foi pesquisada pelo método das atividades iniciais, de acordo com o
modelo cinético de Michaelis-Menten. A variação da velocidade da reação frente à
concentração de substrato segue parcialmente o modelo cinético de Michaelis-
Menten, cuja equação apresenta uma hipérbole retangular da variação da
velocidade de reação enzimática em função da concentração de substrato (BAILEY,
OLLIS, 1986). Para a obtenção das constantes cinéticas K
M
e V
MAX
, aplicou-se o
método de linearização proposto por Lineweaver-Burk, que consiste de um gráfico
onde os eixos são compostos pelo inverso da atividade em função do inverso da
concentração do substrato. Os gráficos obtidos podem ser visualizados na Figura 38.
126
y = 13,158x + 0,3032
R
2
= 0,9939
0
0,5
1
1,5
2
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
1/S (uM)
1/V (U/mL)
y = 13,228x + 0,2878
R
2
= 0,9954
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
1/S (uM)
1/V (U/mL)
a) b)
FIGURA 38 – Curvas correspondentes ao inverso dos valores das atividades (1/V)
da G6PD em função do inverso das concentrações do substrato G6P (1/S). a) G6PD
pura antes da partição por SMDFA; b) G6PD pura após a partição por SMDFA
obtida na fase diluída, pobre em micelas.
Utilizando-se do método de linearização, acima representado, determinou-se
as constantes cinéticas relacionadas à G6PD pura antes e após a purificação por
SMDFA, apresentadas na Tabela 18.
TABELA 18 – Valores de K
M
e V
MAX
determinados para a enzima G6PD antes e
após a purificação por SMDFA.
Parâmetros
Cinéticos
G6PD pura
antes da purificação
G6PD pura após a
purificação (fase diluída)
K
M
(µM) 43,40 46,00
V
MAX
(U/mL) 03,30 03,50
A velocidade de reação máxima (V
MAX
) é sempre proporcional à concentração
do complexo enzima-substrato; observa-se que os valores de V
MAX
obtidos nos
ensaios antes e após a purificação por SMDFA não apresentam diferença
estatisticamente significativa. A constante de Michaelis-Menten (K
M
) tem um
interesse particular, pois seu valor indica a afinidade que uma enzima apresenta
pelo seu substrato, no caso estudado, da G6PD pela G6P. O mesmo pode ser
observado para o valor de K
M
obtido nos ensaios, que demonstra que não houve
diferença entre os valores antes e após o processo de purificação. Assim, com base
nestes resultados de K
M
(Tabela 18), pode-se considerar que o método de
127
purificação utilizando o tensoativo não-iônico Triton X-114 nas condições
empregadas não influencia na especificidade da enzima G6PD. E, ainda, o processo
de purificação por micelas de Triton X-114 pode ser empregado na
separação/purificação de G6PD, mantendo as características catalíticas desta
enzima.
Para comparação do desempenho catalítico da enzima G6PD, antes e após a
purificação por SMDFA, determinou-se a energia de ativação (Ea) pelo método de
Arrhenius, por meio de determinação da atividade enzimática da G6PD em
diferentes temperaturas (Figura 39).
a)
b)
FIGURA 39 – Curvas correspondentes ao logarítimo da atividade da G6PD em
função do inverso da temperatura absoluta (1/T). a) G6PD pura antes da purificação
por SMDFA; b) G6PD pura após a purificação por SMDFA obtida na fase diluída do
sistema (pobre em micelas).
y = -337,31x + 1,387
R
2
= 0,9878
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,0027 0,0029 0,0031 0,0033
1/T(K)
Log da Atividade da G6PD
y = -598,04x + 2,5286
R
2
= 0,9601
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,0029 0,003 0,0031 0,0032 0,0033 0,0034
1/T(K)
Log da Atividade da G6PD
128
Em seguida, foram calculados ∆G, ∆H e ∆S conforme descrito por Owusu et
al. (1992). Os valores obtidos por estes parâmetros estão apresentados na Tabela
19.
TABELA 19 – Parâmetros termodinâmicos determinados para a G6PD antes e após
a purificação por SMDFA.
Parâmetros Termodinâmicos
Enzima
G6PD
∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/kmol) ∆S (kJ/kmol) Ea (kJ/kmol)
Antes da
purificação
- 10,75 9,05 0,06 11,45
Após a
purificação
(fase diluída)
- 12,10 4,00 0,05 06,45
A variação da energia livre de Gibbs (∆G) indica a espontaneidade da reação
catalisada sob as condições de temperatura e pressão constantes (15°C ou 288K e
1 atm). Conforme os valores obtidos, o parâmetro ∆G variou para a reação
catalisada pela G6PD antes e após a purificação por micelas de Triton X-114 nas
condições empregadas. Essa variação de mais de 1,30 kJ/mol indica que para o
ensaio após a purificação na fase diluída, pobre em micelas do tensoativo Triton X-
114, o processo se torna irreversível. Ambos valores obtidos para este parâmetro
são negativos, o que indica ser um processo exergônico, isto é, energeticamente
favorável e que ocorre com adição de energia externa ao sistema. As propriedades
termodinâmicas são relacionadas por meio da constante de equilíbrio (k) e, para
reações endotérmicas, como neste caso, esta constante aumenta de valor com o
aumento da temperatura de processo. Em sistemas biológicos, por exemplo, deve-
se considerar a presença de compostos de “alta energia”, cuja hidrólise promove a
formação de grande quantidade de energia livre, que é utilizada pelas células para
129
exercer suas funções. Dentre estes compostos estão o fosfoenolpiruvato, cujo valor
de ∆G padrão é -61,90 kJ/mol, o ATP de -30,50 kJ/mol e o substrato utilizado na
reação catalítica estudada, a glicose-6-fosfato (G6P), cujo ∆G padrão é de -13,80
kJ/mol. Os valores negativos apresentados, denominados de potencial de
transferência de grupos fosfato, são medidas da tendência dos grupos fosforilados
em transferir seus grupos fosfatos para a água. Desta forma, o ATP com -30,50
kJ/mol possui maior tendência de transferir grupos fosfatos que a G6P com -13,80
kJ/mol (VOET et al., 1984).
A variação da entalpia (∆H) no sistema corresponde ao calor liberado ou
absorvido na transformação (pressão constante). No estudo realizado, o valor positivo
obtido neste parâmetro antes e após a purificação por micelas de Triton X-114 indicou
que a reação catalítica é uma reação endotérmica, ou seja, o calor da reação é extraído
das vizinhanças na transformação dos substratos em produtos sob condições de
temperatura e pressão constantes (CASTELLAN, 1986).
Os valores de ∆H e ∆S obtidos no estudo são maiores que zero e podem ser
considerados elevados para sistemas biológicos, o que significa que a reação é
espontânea à temperatura utilizada.
Sob condições fisiológicas a energia de ativação das moléculas reagentes é
insuficiente para superar a energia de ativação que separa os reagentes dos
produtos. Isto equivale a dizer que com as condições empregadas, a transformação
da G6P em 6-fosfogluconato utilizando somente a energia contida em suas
moléculas seria improvável. Neste caso, a enzima G6PD é utilizada para aumentar a
velocidade da reação pela redução da energia de ativação proporcionada pelo uso
destes catalisadores biológicos. No entanto, cabe ressaltar que esta diminuição da
energia de ativação da reação ocorre devido o mecanismo da reação catalisada ser
130
diferente do mecanismo daquela onde não estão presentes catalisadores, sendo que
para este caminho a energia de ativação necessária é inferior.
Nos testes realizados, observou-se que houve diminuição do valor da energia
de ativação (Ea), energia necessária para alcançar o estado de transição dos
reagentes ao produto. A energia de ativação obtida para a G6PD antes da partição
foi aproximadamente o dobro do valor obtido para a G6PD na fase diluída do
sistema. Este baixo valor de energia de ativação obtido na fase pobre em micelas
indica que a reação enzimática ocorre facilmente, ou seja, necessita de pouca
energia para alcançar o estado de transição.
O ensaio realizado não é suficiente para concluir que o tensoativo não-iônico
Triton X-114 não afeta a conformação estrutural ou mesmo o estado energético da
enzima G6PD. Ressalta-se, como mencionado no Item 4.1.1., que estudos
calorimétricos indicam ser mais favoráveis interações entre soluções de
polietienoglicol e NADP
+
do que as interações entre tampão e NADP
+
. Devido à
semelhança ao PEG, deve-se considerar que o Triton X-114 interagindo com NADP
+
ou mesmo com G6PD proporcione uma reação entalpicamente mais favorável do
que com tampão. Isto deve aumentar a atividade enzimática desta enzima em
presença da coenzima NADP
+
e, conseqüentemente, reduzir a energia de ativação
obtida no ensaio após o processo de purificação. Tal fato pode ser observado com
base no valor de entalpia (∆H) obtido para o ensaio após a purificação, que
apresentou redução de mais que a metade em relação ao processo antes da
purificação. Esta queda de entalpia indica que a reação nesta etapa de purificação é
entalpicamente mais favorável, ou seja, mais espontânea que a etapa sem o
processo por SMDFA.
131
5. CONCLUSÕES
Apesar de ter sido observada a superatividade da enzima em determinadas
concentrações de Triton X-114 (1,50-3,00% (p/p)), os dois tensoativos não-iônicos
estudados, Triton X-114 e C
10
E
4
, não degradam a G6PD e, portanto, são adequados
à aplicação em SMDFA para a purificação desta biomolécula.
Em todos os ensaios realizados, a G6PD foi recuperada preferencialmente na
fase diluída, tanto em sistema Triton X-114/tampão como em C
10
E
4
/tampão, na qual
existe maior volume disponível, sendo excluída da fase rica em micelas, fato
comprovado pelos valores de coeficientes de partição inferiores a 1. A expulsão da
G6PD da fase rica em micelas, refletida pela diminuição do valor de K
G6PD
, está
relacionada ao aumento da diferença de fração volumétrica de tensoativo entre a
fase superior e inferior (
φ
c
-
φ
d
). Como esta diferença aumenta com a elevação da
temperatura, o valor de K
G6PD
diminuiu com o aumento da temperatura.
A teoria baseada em interações do tipo volume de exclusão, desenvolvida por
Nikas et al. (1992), foi utilizada para estimar o coeficiente de partição da G6PD em
SMDFA C
10
E
4
/tampão e também para Triton X-114/tampão. Os valores de K
G6PD
estimados pela teoria apresentaram correlação quantitativa com os valores obtidos
experimentalmente, demonstrando a aplicabilidade da teoria no direcionamento de
estratégias de purificação de biomoléculas.
Os estudos de partição dos ligantes cibacron blue e procion red nos sistemas
Triton X-114/tampão e C
10
E
4
/tampão de duas fases aquosas mostraram que estes
compostos apresentam partição preferencial para a fase rica em micelas. A estrutura
química dos corantes confere propriedades tensoativas, com isso eles devem
interagir com as moléculas de tensoativo Triton X-114 ou de C
10
E
4
, podendo se
posicionar na “interface” entre as cabeças polares de óxido de etileno e as caudas
132
apolares da micela, dificultando a formação do complexo enzima-ligante. A utilização
destes ligantes de afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos
proporcionou pequeno aumento nos valores de coeficiente de partição da proteína-
alvo, porém com valores de K
G6PD
ainda inferiores a 1.
Foi investigada a influência dos compostos derivados da síntese na partição
da G6PD em SMDFA. Não foram observadas diferenças significativas no coeficiente
de partição da G6PD na presença das amostras obtidas das sínteses realizadas. A
não contribuição dada pelas amostras de síntese deve-se possivelmente à
dificuldade de promover a ligação covalente entre o Triton X-114 e o corante
cibacron blue. Ou então, na reduzida quantidade de TX-114-Blue obtido associada
ao baixo grau de pureza do produto. Portanto, faz-se necessário o estudo de novas
estratégias para otimização da metodologia empregada, bem como a escolha do
processo de purificação do material final, a fim de se aumentar o grau de pureza do
TX-114-Blue.
Foi também estudada a utilização dos sais sulfato de amônio ((NH
4
)
2
SO
4
) e
sulfato de sódio (Na
2
SO
4
) em SMDFA. Os sistemas Triton X-114/Sal, entretanto, não
influenciaram a partição da G6PD para a fase rica em tensoativos. Apesar da
existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases dos sistemas Triton
X-114/Sal, tal efeito não foi suficiente para influenciar a partição da enzima para a
fase concentrada em micelas.
O sistema estudado, que visou analisar os parâmetros cinéticos e
termodinâmicos da enzima G6PD utilizando-se o processo de purificação por
SMDFA, demonstrou não diminuir a atividade catalítica desta enzima. Pode-se
considerar que o método de purificação utilizando o tensoativo não-iônico Triton X-
114 nas condições empregadas não degrada a atividade da enzima G6PD. E, ainda,
133
o processo de purificação por micelas não-iônicas de Triton X-114 pode ser
empregado na separação/purificação de G6PD, mantendo as características
catalíticas desta enzima.
O sistema de purificação por SMDFA aplicado no estudo da enzima
intracelular G6PD proveniente de homogeneizado celular de S. cerevisiae pode ser
empregado como uma primeira etapa de separação de enzimas hidrofílicas e
hidrofóbicas. Etapas subseqüentes, utilizando sistemas mistos (como por exemplo
C
10
E
4
/CTAB) ou mesmo o uso de moléculas de afinidade (ligantes de afinidade),
poderiam ser utilizadas a fim de otimizar a purificação/separação da biomolécula de
interesse de outras contaminantes.
134
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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dehydrogenases using trianize dyes in PEG/phosphate systems. Chemical
Engineering Science, v.47, n.1, p.113-121, 1992.
WETLAUFER, D.B.; COFFIN, R.L.; MALIK, S.K.; STOLLER, L. Nonpolar group
participation in denaturation of proteins by urea + guanidinium salts: model
compound studies. Journal of the American Chemical Society, v.86, n.3,
p.508-514, 1964.
YAMAZAKI, M.; OHSHIKA, M.; ITO, T. Phase-separation of Triton X-100 micelle
solution induced by osmotic-stress. Biochimica et Biophysica Acta, v.1063,
p.176-177, 1991.
146
7. APÊNDICES
Apêndice A
Curva de calibração de absorbância em função da concentração de cibacron blue
obtida experimentalmente. As barras de erro correspondem a um intervalo de
imprecisão de 5% na metodologia empregada.
Curva de calibração de absorbância em função da concentração de procion red
obtida experimentalmente. As barras de erro correspondem a um intervalo de
imprecisão de 5% na metodologia empregada.
y = 17,47x
R
2
= 0,992
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,02 0,04 0,06
C (mg/mL)
Abs (611 nm)
y = 36,11x
R
2
= 0,997
0
0,5
1
1,5
2
0 0,02 0,04 0,06
C (mg/mL)
Abs (515 nm)
147
Apêndice B
Curva de calibração da concentração total de proteínas obtida pelo método de BCA.
As barras de erro correspondem a um intervalo de confiança de 95% nos valores
obtidos.
y = 902,8x - 77,5
R
2
= 1,0
0
500
1000
1500
2000
2500
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Abs (562 nm)
[proteínas] (mg/L)
148
Apêndice C
Espectro de RMN-
1
H obtido para o tensoativo TX-114. Solvente: CDCl
3
/ Padrão de
referência interna: TMS. RMN-
1
H – δ (ppm): 7,14 (d, 2H, Ar-H, J = 8,60 Hz); 6,72 (d,
2H, Ar-H, J = 8,53 Hz); 3,90 (t, 2H, CH
2
, J = 3,78 Hz), 3,73 (t, 2H, CH
2
, J = 3,88 Hz);
3,59–3,41 (m,12H, CH
2
); 3,21 (s, 1H, OH); 1,59 (s, 2H, CH
2
); 1,23 (s, 6H, CH
3
); 0,60
(s, 9H, CH
3
).
δ = deslocamento químico (ppm)
Ar = anel aromático
s = singleto
d = dupleto
t = tripleto
m = multipleto
J = acoplamento (Hz)
(OCH
2
CH
2
)
8
-OH
Triton X-114
n
n ~ 8
149
Apêndice D
Espectro de RMN-
1
H obtido para o corante cibacron blue. Solvente: D
2
O/Padrão de
referência interna: TMS. RMN-
1
H - δ (ppm): 7,89–6,85 (m, 17H, Ar-H). Os prótons do
grupo NH e NH
2
não estão evidenciados no espectro, provavelmente porque a água
deuterada promove a troca de hidrogênio por deutério.
δ = deslocamento químico (ppm)
Ar = anel aromático
m = multipleto
N
NN
O
O
NH
2
NH
N
H
N
H
Cl
-
-
SO
3
-
SO
3
SO
3
Cibacron Blue
150
Apêndice E
Espectro de RMN-
1
H obtido para o quarto tensoativo de afinidade TX-114-Blue.
Solvente: CDCl
3
/ Padrão de referência interna: TMS. RMN-
1
H - δ (ppm): 7,09 (d, 2H,
Ar-H, J = 8,00 Hz); 6,64 (d, 2H, Ar-H, J = 8,06); 3,91 (m, 2H, CH
2
)*; 3,66 (m, 2H,
CH
2
)*; 3,51-3,40 (m, 12H, CH
2
); 1,53 (d, 2H, CH
2
, J = 6,92 Hz); 1,17 (d, 6H, CH
3
, J =
6,87); 0,54 (d, 9H, CH
3
, J = 7,43 Hz). *Considerou-se os sinais em questão como
multipletos devido à baixa definição do padrão de acoplamento, provavelmente
devido à baixa pureza do produto de partida.
δ = deslocamento químico (ppm)
Ar = anel aromático
d = dupleto
m = multipleto
J = acoplamento (Hz)
N
NN
O
O
NH
2
NH
N
H
N
H
O
-
-
SO
3
-
SO
3
SO
3
8
(OCH
2
CH
2
)
TX-114-Blue
n
n ~ 8
151
Apêndice F
Espectro de RMN-
1
H obtido para o quinto tensoativo de afinidade TX-114-Blue.
Solvente: DMSO-d
6
/Padrão de referência interna: TMS. RMN-
1
H - δ (ppm): 8,29 (s,
1H, NH); 7,23 (d, 2H, Ar-H, J = 8,68 Hz); 6,81 (d, 2H, Ar-H, J = 8,62); 4,01 (t, 2H,
CH
2
, J = 4,00 Hz); 3,70 (t, 2H, CH
2
, J = 4,62 Hz); 3,54 (t, 2H, CH
2
, J = 4,55 Hz); 3,39
(t, 2H, CH
2
, J = 4,96 Hz); 1,65 (s, 2H, CH
2
); 1,27 (s, 6H, CH
3
).
δ = deslocamento químico (ppm)
Ar = anel aromático
s = singleto
d = dupleto
t = tripleto
J = acoplamento (Hz)
N
NN
O
O
NH
2
NH
N
H
N
H
O
-
-
SO
3
-
SO
3
SO
3
8
(OCH
2
CH
2
)
TX-114-Blue
n
n ~ 8
152
Apêndice G
Espectro de IV obtido para o tensoativo TX-114. Cela: NaCl.
Apêndice H
Espectro de IV obtido para o tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Cela: NaCl. IV
(NaCl): 3475 (νN-H, NH
2
ou νO-H)*; 3035 (νC-H sp
2
, Ar); 2865 (νC-H sp
3
, CH
3
), 1610
(νC=O); 1581 e 1475 (νC=C, Ar); 1454 (δN-H, amina 2ª); 1351 (νC-N); 1245 e 1065
(νC-O, fenil alquil éter), 828 (δC-H
Fora do plano
, Ar). *Não está claro qual tipo de
grupamento foi lido (νN-H ou νO-H), provavelmente devido à baixa pureza do
produto de partida.
ν = estiramento
Ar = anel aromático
sp = orbital molecular
δ = deformação
(OCH
2
CH
2
)
8
-OH
Triton X-114
n
n ~ 8
νO-H
νO-H ou
νN-H
153
Apêndice I
Cromatografia em camada delgada utilizando acetato de etila como solvente. A
figura mostra o deslocamento das bandas nas amostras testadas através de luz UV.
Cromatografia em camada delgada utilizando acetato de etila como solvente. A
figura mostra a diferença nas cores dos reagentes de partida e do composto obtido
na síntese.
Triton
X-114
6ª tentativa
de síntese
Mistura
dos
componentes
Cibacron
Blue
Cibacron
Blue
Triton
X-114
6ª
síntese
5ª
síntese
Cibacron
Blue
Triton
X-114 +
corante
Composto
de síntese
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