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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DANIELA VALCARENGHI
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA CRÔNICA DO POLÍMERO QUITOSANA
FERRO(III) SOLÚVEL
Itajaí – 2006
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1
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
DANIELA VALCARENGHI
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA CRÔNICA DO POLÍMERO QUITOSANA
FERRO(III) SOLÚVEL
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Clóvis Antonio
Rodrigues.
Itajaí - abril, 2006
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AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA CRÔNICA DO POLÍMERO QUITOSANA
FERRO(III) SOLÚVEL
Daniela Valcarenghi
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e
aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas
da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Orientador
__________________________________________________________
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Doutor Clóvis Antonio Rodrigues-Orientador
Presidente (UNIVALI)
______________________________________
Doutora Maria Ester Pereira (UFSM)
Membro
______________________________________
Doutora Márcia Maria de Souza (UNIVALI)
Membro
Itajaí (SC), 27 de abril de 2006.
3
Dedicatória
Dedico este trabalho aos que dele participaram desde
o princípio:
Deus, por permiti-lo;
Meus pais, Aide e Zulmara pelo exemplo de vida;
Ao cúmplice e esposo Mario, pela compreensão por
tanta ausência;
Às irmãs Carolina e Joana sempre presentes, apesar
da distância.
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Clóvis Antônio Rodrigues, pela orientação e exemplo de dedicação;
À Cris Bürger pelas sugetões pertinentes, orientações e amizade;
À amiga “Romelinha” por estar sempre pronta para ajudar;
A amiga Tathy por estar caminhando junto em mais essa etapa;
Ao Piazinho pela paciência......
A amiga Juli pela consulta técnico-científica e principalmente pela amizade de ontem,
hoje e sempre.
5
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA CRÔNICA DO POLÍMERO QUITOSANA
FERRO(III) SOLÚVEL
Daniela Valcarenghi
Abril / 2006
Orientador: Dr. Clóvis Antônio Rodrigues
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas
Número de páginas: 86
A hiperfosfatemia é uma conseqüência nos pacientes em estágio final de falência renal
crônica. O tratamento do aumento do fósforo sérico exige, entre outros procedimentos,
o uso de adsorventes orais de fosfato. No presente trabalho foram avaliados os efeitos
da administração crônica do polímero Quitosana-Ferro(III) solúvel sobre
comportamento, ganho de peso corporal, parâmetros bioquímicos, hematológicos,
anatomopatologia e deposição de ferro, em ratos Wistar machos e fêmeas. Os animais
foram tratados durante 90 dias, divididos em três grupos os quais receberam, salina
(grupo controle), 50 mg/kg de Quitosana-Ferro(III) solúvel e 100 mg/kg do polímero, por
via oral respectivamente.
Água e ração foram fornecidos ad libitum. Um grupo satélite
(alguns animais do grupo I e III) foi mantido em observação por mais 30 dias após o
término do tratamento. Os resultados mostraram que a administração crônica do
polímero não causa efeitos sobre o sistema nervoso autônomo e sistema motor e tônus
muscular, avaliados pelas observações comportamentais. O tratamento não alterou o
ganho de peso dos animais tratados em relação ao grupo controle. Os parâmetros
bioquímicos e hematológicos não foram alterados com a administração do polímero,
sugerindo ausência de toxicidade devido a permanência do ferro no complexo. A
análise macroscópica, peso e deposição de ferro nos órgãos não sofreram alterações
significativas em relação ao grupo controle demonstrando a segurança do polímero. Na
avaliação do grupo satélite, os resultados foram similares aos anteriores. Esses
achados experimentais sugerem que o polímero Quitosana-Ferro(III) solúvel poderá ser
testado,
em testes pré-clínicos e clínicos de maior complexidade e, futuramente,
introduzido como opção de adsorvente oral de fosfato para o tratamento da
hiperfosfatemia em pacientes renais crônicos.
Palavras-chave: Quitosana-ferro(III) solúvel. Toxicidade. Hiperfosfatemia.
6
CHRONIC TOXICOLOGY AVALIATION OF SOLUBLE IRON (III)
CHITOSAN
Daniela Valcarenghi
April / 2006
Advisor: Dr. Clóvis Antônio Rodrigues
Area of Concentration: Natural products and bioactive synthetic substances
Number of Pages: 86
Hyperphosphatemia is a common problem in patients with chronic renal failure,
particularly in those who have reached end-stage renal diseased. The main methods of
achieving control of the increased of phosphate are reduction of dietary intake, reduction
of gastrointestinal absorption by use of binding agents and removal by dialysis. In this
study, we evaluated the effects of chronic administration of soluble chitosan iron (III) (90
days) on comportamental behavior, body weigth, biochemical and hematological
parameters and anatomopathologycal and iron depositions, in male and female Wistar
rats. The animals were separeted in three groups that received saline (control), 50
mg/kg soluble iron(III) chitosan, and the last one 100 mg/kg of the complex. Commercial
chow and water were offered ad libitum during the treatment. The adsorbent was diary
administrated by gavage. A satelite group (some animals) were maintened in
observation for more 30 days to verify the increase or reversibility of toxic effects. The
results showed that the chronic administration doesn’t cause effects on comportamental
bahavior. Significant differences were not observed in the analyzed parameters,
between the control group and the groups that received the polymer. The results
showed no obvious indication of toxicity in any group receiveing soluble iron(III)-chitosan
in terms of clinical signs, food intake, gain weigth, hematology and serum biochemistry.
Iron determinations shows that this metal does’t accumulates in vital organs, suggesting
the complex stability. These result suggest the soluble QTS-Fe(III) polymer would be
tested in complex clinical tests and may be, in the future, a new phosphate binder.
Key-words: Soluble iron (III) chitosan. Toxicity. Hyperphosphatemia.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Efeito do complexo Quitosana-Ferro(III) solúvel (50-100mg/kg) sobre
o peso corporal dos animais fêmeas tratadas durante 90 dias e
grupo satélite
45
Figura 2
Efeito do complexo Quitosana-Ferro(III) solúvel (50-100mg/kg) sobre
o peso corporal dos animais machos tratados durante 90 dias e
grupo satélite
46
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Valores obtidos a partir das observações comportamentais nos
animais após administração do complexo Quitosana-Ferro(III)
solúvel
44
Tabela 2
Determinação sérica de glicose de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
47
Tabela 3
Determinação sérica de uréia de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
48
Tabela 4 Determinação sérica de creatinina de fêmeas e machos tratados
com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
49
Tabela 5
Determinação sérica de sódio de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
50
Tabela 6
Determinação sérica de potássio de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
50
Tabela 7
Determinação sérica de cálcio de fêmeas tratados com Quitosana-
Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
51
Tabela 8
Determinação sérica de fósforo de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
52
Tabela 9
Determinação sérica de ALT de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
54
Tabela 10
Determinação sérica de AST de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
54
Tabela 11
Determinação sérica de proteínas totais de fêmeas e machos
tratados com Quirosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
55
Tabela 12
Determinação sérica de colesterol total de fêmeas e machos
tratados com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
56
Tabela 13
Determinação sérica de triglicerídeos de fêmeas e machos tratados
com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
57
Tabela 14
Determinação sérica de ferro de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
58
Tabela 15
Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos
tratados com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 30 dias
60
Tabela 16
Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos
tratados com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 60 dias
61
Tabela 17
Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos
tratados com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias
62
Tabela 18
Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos
do grupo satélite
63
Tabela 19 Peso relativo dos órgãos de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite
67
Tabela 20
Determinação da quantidade de ferro nos órgãos de animais fêmeas
e machos tratados com Quitosana-
Ferro(III) por 90 dias e grupo
satélite
68
9
LISTA DE ABREVIATURAS
1,25 (OH)
2
- 1,25 dihidroxicalcitriol ou calcitriol ou forma ativa da vitamina D
25, (OH) D- 25 hidroxicalcitriol
ALT- Alanina aminotransferase
Al(OH)
3
- Hidróxido de alumínio
AST- Aspartato aminotransferase
ATP- Adenosina trifosfato
CaCO
3
- Carbonato de cálcio
CHCM – Concentração de Hemoglobina Corpusclar Média
EROS- Espécies reativas de oxigênio
GTP- Guanosina trifosfato
HCM- Hemoglobina Celular Média
HDL- Lipoproteína de densidade alta
HTGL- Lipase triglicerídeo hepática
IDL- Lipoproteína de densidade intermediária
IRC- Insuficiência renal crônica
LCAT- Lecitina colesterol aciltransferase
NAD+- Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada
NADH- Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
PTH- Hormônio da paratireóide ou paratormônio
QTS-Fe(III)solúvel- Quitosana-Ferro(III- solúvel
VCM- Volume Corpuscular Médio
TIBC- Capacidade total de ligação de ferro
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................12
2 OBJETIVOS................................................................................................................15
2.1 Objetivo Geral:..............................................................................................15
2.2 Objetivos Específicos: .................................................................................15
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................................16
3.1 Homeostase do fósforo e Hiperfosfatemia:...............................................16
3.2 Adsorventes de fósforo: ..............................................................................21
3.2.1 Adsorventes que contém Cálcio:.......................................................................21
3.2.2.1 Carbonato de Cálcio: .......................................................................................22
3.2.1.2 Acetato de Cálcio: ............................................................................................22
3.2.1.3 Alginato de Cálcio:...........................................................................................23
3.2.1.4 Cálcio
α
αα
α
-cetoglutarato: ....................................................................................23
3.2.2 Adsorventes que contém Alumínio: ..................................................................24
3.2.3 Adsorventes que contém Lantânio:...................................................................24
3.2.4 Adsorventes que contém Nicotinamida:...........................................................25
3.2.5 Adsorventes que contém Sevelamer:................................................................25
3.2.6 Compostos que contém ferro: ...........................................................................26
3.3 Ferro e toxicidade do ferro:.........................................................................29
4 MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................................34
4.1
Metodologia:..................................................................................................34
4.1.1 Polímero QTS-Fe(III) solúvel: .............................................................................34
4.1.2 Animais: ...............................................................................................................34
4.2
Ensaios Toxicológicos:................................................................................35
4.2.1 Toxicologia crônica:............................................................................................35
4.2.2 Observações comportamentais:........................................................................36
4.2.3 Parâmetros bioquímicos: ...................................................................................36
4.2.4 Parâmetros hematológicos: ...............................................................................38
4.3.5 Análise anatomopatológica dos órgãos: ..........................................................40
4.2.6 Análise de ferro nos órgãos:..............................................................................40
11
4.2.7 Análise estatística ...............................................................................................41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................42
5.1 Observações comportamentais ..................................................................43
5.2 Parâmetros bioquímicos..............................................................................46
5.3 Parâmetros hematológicos..........................................................................59
5.3 Análise anatomopatológica dos órgãos ....................................................66
5.4 Análise de ferro nos órgãos ........................................................................67
6 CONCLUSÕES...........................................................................................................70
REFERÊNCIAS..............................................................................................................71
ANEXO A.......................................................................................................................86
12
1 INTRODUÇÃO
A retenção de fosfato é um problema comum em pacientes com doença renal,
particularmente naqueles em estágio final desta patologia e continua sendo um desafio
para os nefrologistas clínicos (AMIN, 2002). O controle do fosfato sangüíneo é o
principal alvo no tratamento do hiperparatireoidismo secundário, e também parece
estar associado à problemas cardiovasculares de pacientes hiperfosfatêmicos
(HERGESELL; RITZ, 1999; SLATOPOLSKY; LIAPIS; FINCH, 2005).
A restrição de fósforo na alimentação e a remoção do mesmo pela hemodiálise
não são suficientes para restaurar a homeostase deste íon. A redução da absorção
intestinal de fosfato com o uso de adsorventes orais do mesmo é freqüentemente o
tratamento primário para diminuir fosfatemia em pacientes com doença renal
(LOGHMAN-ADHAM, 2003). Apesar do tratamento por meio de restrição alimentar, por
diálise e pelo uso de agentes que se ligam ao fósforo, a hiperfosfatemia se mantém
persistente em alguns pacientes. Verificou-se que 39% dos pacientes em diálise
continuavam com os níveis séricos de fósforo superiores à 6,5 mg/dL (BLOCK et al.,
1998).
O hidróxido de alumínio foi o primeiro adsorvente utilizado para remoção de
fosfato, formando complexos independentemente dos níveis de pH. Contudo, o
acúmulo de alumínio nos ossos e desenvolvimento de encefalopatias resultaram na
restrição do seu uso. A toxicidade foi mais evidente em pacientes que faziam uso
prolongado deste adsorvente (BLEYER, 2003).
Os complexos contendo cálcio têm sido utilizados historicamente como
adsorventes de fosfato, mas recentemente estão sendo substituídos devido ao risco de
desenvolvimento de hipercalcemia (RITZ; HERGESELL, 2001). O dilema decorrente
dos efeitos colaterais de hipercalcemia de adsorventes de fosfato contendo cálcio e dos
efeitos tóxicos dos compostos contendo alumínio, conduzem à pesquisas de
desenvolvimento de novos adsorventes de fósforo visando melhorar a qualidade de
vida do paciente renal (LOGHMAN-ADHAM, 2003).
Estudos sugerem que os compostos férricos complexam o fosfato da dieta e
possuem potencial clínico como adsorventes orais de fosfato (OKADA et al., 1983;
13
HSU; PATEL; YOUNG, 1999a; HERGESELL; RITZ, 1999b). Estes compostos de ferro
têm sido estudados, principalmente devido a baixa toxicidade quando comparada aos
compostos de alumínio e de cálcio (KURODA et al., 1995).
A quitosana, produzida industrialmente por desacetilação da quitina obtida das
cascas de crustáceos, apresenta capacidade de formar complexos polímeros com
metais, devido ao par de elétrons livres no nitrogênio. Esta característica tem propiciado
o uso da quitosana como suporte aos compostos metálicos adsorventes de fosfato
(JING et al., 1997).
A capacidade de adsorção de fosfato pelo complexo Quitosana-Ferro(II) foi
avaliada anteriormente em experimentos in vitro mostrando vantagens com relação ao
sulfato básico, mas com aumento na concentração de ferro sérico devido à parcial
solubilidade do mesmo (JING et al., 1997).
Estudos realizados pelos pesquisadores do NIQFAR demonstraram que a
quitosana complexada com o ferro(III) e reticulada com glutaraldeído (QTS-Fe(III)R) é
eficiente na redução do fosfato no soro de ratos hiperfosfatêmicos, mantendo normais
as concentrações séricas de cálcio e ferro após a administração do polímero
(VALCARENGHI; SANDRI, 1999; BÜRGER et al., 2001). Estes dados apresentam o
complexo QTS-Fe(III) solúvel como uma alternativa no tratamento da hiperfosfatemia
em pacientes com falência renal crônica.
Estudos toxicológicos preliminares realizados por Piazza e Palaoro (2000),
demonstraram que a DL
50
(dose letal média)
da QTS-Fe (III) solúvel é cerca de 57
vezes maior do que a dose utilizada por Valcarenghi e Sandri (1999), no tratamento de
animais fêmeas hiperfosfatêmicos. A administração do complexo durante 15 dias, não
produziu alterações no ganho de peso dos animais, e em parâmetros bioquímicos como
glicose, ferro e colesterol. Além disso, com o tratamento, não ocorreu deposição de
ferro em órgãos vitais. Entretanto, no tratamento sub-crônico (30 dias) observou-se
alterações nos parâmetros bioquímicos e deposição de ferro em alguns órgãos como
baço e fígado (PIAZZA; PALAORO, 2000).
Esses achados experimentais em animais sugerem a necessidade de um estudo
referente à toxicidade crônica, para identificar possíveis alterações nos parâmetros
bioquímicos, hematológicos, deposição de ferro nos órgãos alvo e a persistência ou
14
reversibilidade dos efeitos tóxicos. Se presentes, somente após a conclusão destes
estudos, o polímero QTS-Fe(III) solúvel poderá ser testado, em testes pré-clínicos e
clínicos de maior complexidade e, futuramente, introduzido como opção de adsorvente
oral de fosfato para o tratamento da hiperfosfatemia em pacientes renais crônicos.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar os possíveis efeitos tóxicos crônicos decorrentes da administração do complexo
QTS-Fe(III) solúvel em ratos machos e fêmeas.
2.2 Objetivos Específicos:
2.2.1. Observar os efeitos da administração do complexo QTS-Fe(III) solúvel através do
teste hipocrático.
2.2.2. Verificar o efeito da administração crônica do complexo QTS-Fe(III) solúvel sobre
o ganho de peso dos animais.
2.2.3. Determinar parâmetros bioquímicos e hematológicos que possam ser alterados
pela administração crônica do complexo QTS-Fe(III) solúvel.
2.2.4. Avaliar os efeitos da administração do complexo QTS-Fe(III)solúvel sobre órgãos
vitais de machos e fêmeas através da análise anatomopatológica.
2.2.5. Quantificar os níveis de ferro total em órgãos como: fígado, coração, baço, rins e
pulmões.
16
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Homeostase do fósforo e Hiperfosfatemia:
O fósforo, elemento essencial para o organismo, está envolvido em múltiplos
processos metabólicos e na transferência e armazenamento de compostos de alta
energia como adenosina trifosfato (ATP) e guanosina trifosfato (GTP) (HELICKSON;
PARHAM; TOBIAS, 1997; BLEYER, 2003; SCHUCKER; WARD, 2005).
As fontes de fósforo são alimentos, onde a forma orgânica de fósforo é
hidrolisada no trato gastrintestinal e absorvida como fosfato inorgânico. O fósforo pode
influenciar a absorção de minerais como cálcio, magnésio, ferro e zinco (BLEYER,
2003). A homeostasia deste eletrólito é efetuada principalmente pelos rins e em menor
grau, pelo intestino (LOGHMAN-ADHAM, 2003).
Aproximadamente 85% das 500 a 600g de fósforo presente no organismo
compõe a hidroxiapatita nos ossos. O fósforo restante encontra-se, na sua maior parte,
presente no fluido extracelular combinado com lipídios, proteínas, carboidratos e outras
substâncias orgânicas para desempenhar papéis importantes nos fosfolipídeos, ácidos
nucléicos, alguns constituintes das membranas e do citoplasma das células, e
compostos que são importantes no armazenamento e intercâmbio de energia
bioquímica (HENRY, 1999; ALBAAJ; HUTCHISON, 2003; SCHIAVI; KUMAR, 2004).
Segundo Sellares e Ramirez (2004), a denominação fósforo se refere ao elemento
inorgânico e o fosfato refere-se à espécie aniônica resultante da sucessiva dissociação
do ácido ortofosfórico, processo este controlado pelo pH. O fosfato inorgânico presente
na circulação está na forma de fosfato monohidrogênio (HPO
4
2-
) que é divalente e
fosfato dihidrogênio (H
2
PO
4
-
) que é monovalente (ALBAAJ; HUTCHISON, 2003).
A concentração sérica de fosfato é dependente da ingestão, da absorção
intestinal, da filtração e reabsorção renal e trocas dos reservatórios intracelulares e
ósseos (SCHIAVI; KUMAR, 2004). Em virtude disso, três órgãos principais estão
envolvidos na homeostase do fósforo: o intestino delgado, os rins e o tecido ósseo
(HENRY, 1999). Segundo White e Baxter (1994), o controle na concentração de fosfato
17
plasmático está ligado com o cálcio porque ambos estão depositados nos ossos. A
reabsorção óssea aumenta a concentração plasmática de cálcio e fósforo, assim como
a deposição ou ressorção óssea diminui a concentração sérica de ambos.
A absorção de cálcio e fosfato ocorre por processo de transporte ativo, no
duodeno e jejuno, e por difusão facilitada, no intestino distal. As concentrações de
fosfato sérico, assim como as de cálcio, são reguladas por vários fatores incluindo a
forma ativa da vitamina D, o hormônio da paratireóide (PTH ou paratormônio), a
calcitonina, e o hormônio do crescimento (WHITE; BAXTER, 1994).
A vitamina D é uma designação genérica para um grupo de esteróis,
estruturalmente semelhantes e solúveis em gordura, vários dos quais são vitalmente
importantes no metabolismo do cálcio e fósforo (HENRY, 1999). Segundo Dusso,
Thadani e Slatapolski (2004), a 1,25 (OH)
2
(1,25 dihidroxicalcitriol) ou calcitriol é a
forma hormonal da vitamina D. Este elemento é obtido da dieta ou da síntese endógena
na pele. A vitamina D decorrente da síntese cutânea ou absorvida no intestino é
transportada até o fígado ligada à albumina e à lipoproteínas. No fígado é hidroxilada,
passando para a forma de 25 hidroxicalcitriol (25, (OH) D). Essa é a mais importante
forma de vitamina D circulante e pode ser estocada como gordura ou no fígado. No rim
ocorre a ativação de 25, (OH) D e convertida à 1,25 (OH)
2
D. A produção de 1,25 (OH)
2
D está regulada por um mecanismo de “feedback” negativo e dependente da
necessidade de cálcio e fósforo na circulação.
A vitamina D atua no intestino, ossos e rins, facilitando a absorção intestinal de
cálcio e fósforo e induzindo uma proteína complexadora de cálcio específica no
intestino, a calbindina D. Nos rins, aumenta a reabsorção de cálcio e fósforo e além
disso, trabalha cooperativamente com o PTH para aumentar a reabsorção óssea pelo
aumento da atividade osteoclástica (KAPLAN; PESCE, 1996). A queda nas
concentrações séricas de cálcio no sangue estimula as glândulas paratireoidianas a
secretar PTH, que por sua vez aumenta a produção de 1,25 (OH)
2
D nos túbulos renais
proximais (HENRY, 1999).
O PTH é sintetizado nas glândulas paratireoideanas e age principalmente nos
ossos e rins, produzindo alguns efeitos como: estimulação dos rins na reabsorção ou
excreção de cálcio e fósforo e na liberação desses minerais dos ossos. O aumento da
18
concentração de fósforo, ou seja, a hiperfosfatemia, exerce um efeito estimulatório
direto na secreção do PTH e na proliferação das células paratireoideanas, tanto in vitro
como in vivo, levando ao hiperparatireoidismo (ALBAAJ; HUTCHISON, 2003). A ação
do PTH na absorção intestinal de fosfato é provavelmente puramente indireta, através
de seus efeitos sobre o metabolismo da vitamina D (HENRY, 1999). Segundo Malluche
e Mawad (2002), o PTH age nos ossos mobilizando cálcio e fósforo do fluido
extracelular, aumentando as concentrações séricas dos mesmos. Esses efeitos
precedem e presumivelmente medeiam as mudanças no transporte de cálcio e fósforo
nos rins e ossos (HENRY, 1999).
O PTH aumenta a concentração de cálcio por vários mecanismos tais como:
I- recuperação de cálcio e fosfato do osso (reabsorção óssea); II- aumento da
reabsorção de cálcio nos túbulos renais; III- facilitação da excreção de fosfato pela
inibição da sua reabsorção; IV- estimulação do rim na conversão da vitamina D inativa
(25-(OH)D
3
em ativa (1,25-(OH)
2
D
3
) (KAPLAN; PESCE, 1996).
A elevação do cálcio plasmático bloqueia a secreção de PTH por feedback
negativo. A concentração sérica de cálcio ionizado é a principal determinante da
secreção de PTH: a queda na concentração sérica de cálcio ionizado estimula a
secreção de PTH; ao contrário, um aumento da concentração de cálcio suprime a
secreção de PTH. Entretanto, outros íons, como o magnésio, influenciam a secreção de
PTH pela paratireóide (KAPLAN; PESCE, 1996).
A calcitonina é um peptídio secretado pelas células parafoliculares da tireóide,
hipófise, trato gastrintestinal e fígado. A secreção de calcitonina é estimulada pelo
aumento da concentração de cálcio no fluido extracelular e pela liberação de gastrina.
Contrariamente, a liberação de calcitonina é inibida pela hipocalcemia (WHITE;
BAXTER, 1994). De acordo Kaplan e Pesce (1996), a calcitonina está relacionada com
a homeostasia de fósforo e cálcio e a função gastrointestinal. A administração
intravenosa de calcitonina causa declínio nas concentrações séricas de cálcio e fósforo
demonstrando efeitos sobre os ossos e rins. Esse peptídio diminui a liberação do cálcio
e fósforo dos ossos para a circulação pela inibição de reabsorção óssea nos
osteoclastos (TORRES-MUÑOZ; ALLONSO; RAYA, 2004).
19
Outro fator relacionado à regulação da concentração de fosfato e cálcio sérico é
o hormônio do crescimento. Este é produzido em grande quantidade pela hipófise
anterior e tem como função primária estimular o crescimento dos tecidos ósseo e
cartilaginoso e também o aumento da reabsorção tubular renal de fosfato (KAPLAN;
PESCE, 1996).
A maior causa da retenção de fosfato e conseqüente hiperfosfatemia é a
diminuição da excreção renal desse íon (ALBAAJ; HUTCHISON 2003). Este efeito é
encontrado na falência renal crônica, particularmente quando a taxa de filtração
glomerular é reduzida para menos de 25% do normal. Além disso, o aumento da
concentração plasmática de fósforo pode ser devido ao uso de laxativos contendo
fosfato, enemas e uma alimentação rica do mesmo. Os enemas, bem como as soluções
de alimentação parenteral administradas aos pacientes com alterações na motilidade
gastrintestinal aumentam o tempo de contato da solução com a mucosa, com
conseqüente aumento da absorção de fosfato. A terapia citotóxica também leva à
hiperfosfatemia devido a morte celular e liberação de várias substâncias, inclusive o
fósforo (HELIKSON; PARHAM; TOBIAS, 1997). Também pode ocorrer após a
destruição celular massiva na terapia citotóxica de tratamento de tumores, ou injúria
tecidual (hipertermia, hipóxia), que resulta em hemólise e rabdomiólise (KAPLAN;
PESCE, 1996).
A retenção de fosfato é um problema comum em pacientes com falência renal
crônica, particularmente no estágio final da doença (LOGHMAN-ADAHAM, 2003). A
sintomatologia relacionada a hiperfosfatemia é multifatorial e inclui aquelas
relacionadas ao fósforo, bem como outros fatores incluindo hipernatremia e
desidratação. Um relatório prévio documentou características clínicas, incluindo
alteração mental e falência cardiorespiratória (HELIKSON; PARHAM; TOBIAS, 1997).
A hiperfosfatemia é um dos eventos iniciais na cascata de hiperparatireoidismo
secundário devido à estimulação direta na secreção do PTH (ALBAAJ; HUTCHISON,
2003). Um dos mecanismos responsáveis pela hipocalcemia encontrada na
hiperfosfatemia é a inibição da enzima renal 1-α-hidroxilase, que promove a diminuição
dos níveis de 1,25 (OH)
2
D
3
e a diminuição da absorção de cálcio no intestino
(LOCATELLI et al., 2002). Além disso, as altas concentrações de fosfato reduzem a
20
absorção de cálcio no estômago, prejudicando ainda mais a produção de 1, 25 (OH)
2
D
3
(KAPLAN; PESCE, 1996).
No passado, a hiperfosfatemia era tratada como um acontecimento benigno.
Esse panorama mudou abruptamente após a evidência de o aumento de fosfato podem
levar à riscos cardiovasculares (HERGESEL; RITZ, 2002; HAYDAR et al., 2004a;
LOMASHVILI et al., 2004b, RITZ; GROSS, 2005; COZZOLINO et al., 2005). A
mortalidade por doenças cardiovasculares é de dez a vinte vezes maior em pacientes
em estágio final de falência renal crônica do que na população em geral (PICTON;
FOLEY, 2000; LEVIN, 2003). Bro et al (2003), demonstraram que, após 22 semanas de
indução de falência renal em ratos, a área total de placa aórtica havia aumentado,
demonstrando um pronunciado efeito da insuficiência renal crônica (IRC) na progressão
de placas ateroscleróticas.
Um parâmetro importante da homeostase mineral é o produto cálcio-fósforo (Ca
x P), que se calcula multiplicando as concentrações séricas dos mesmos. Nos
indivíduos saudáveis, este produto raramente ultrapassa 45-50 mg
2
/dL
2.
Este parâmetro
é um dado importante porque as elevações no produto Ca x P estão associadas com
um risco significativo de calcificação extra-óssea (tecidos moles) e aumento da
mortalidade em pacientes renais crônicos (LOGHMAN-ADAHM, 2003).
A hiperfosfatemia associada à um produto Ca x P elevado tem sido vista como
um fator de risco importante para a calcificação cardíaca (MALUCHE; MAWAD, 2002;
QUERFELD, 2005, RITZ; GROSS, 2005). Está muito claro que a hiperfosfatemia pode
facilitar a calcificação de tecidos com sérias conseqüências clínicas (SLATOPOLSKI,
2003). A calcificação do tecido cardíaco tem sido reportada na autópsia de
aproximadamente 60% dos pacientes dialisados (ALBAAJ; HUTCHISON, 2003).
Estudos sugerem que pacientes com concentrações de fósforo superiores à 6,5 mg/dL
correm alto risco de morte cardiovascular (BLOCK et al., 1998). Assim, o controle do
fosfato é fundamental na prevenção de tal conseqüência (ELDER, 2004). Em presença
de hiperfosfatemia severa, a reposição de cálcio pode levar a calcificações extraósseas,
especialmente no túbulo renal (HELIKSON; PARHAM; TOBIAS, 1996). Além do risco
cardiovascular que os altos níveis de fosfato e PTH podem trazer, essas mudanças no
metabolismo podem suprimir enzimas reguladoras de lipoproteínas, incluindo a lipase
21
triglicerídeo hepática (HTGL), a lecitina colesterol aciltransferase (LCAT) e a
lipoproteína lipase, resultando em aumento da lipoproteína de densidade intermediária
(IDL) e diminuição da lipoproteína de alta densidade (HDL), agravando o risco de
doença cardiovascular (ALBAAJ; HUTCHISON, 2003).
O tratamento clínico convencional da hiperfosfatemia é composto por diversos
componentes importantes como: remoção do fosfato durante a diálise, intervenção na
dieta e terapia segura e eficaz com quelantes orais de fósforo contendo cálcio, alumínio
ou outros íons metálicos acompanhados ou não de calcitriol (SELLARES; RAMIREZ,
2004; SCHUCKER; WARD, 2005).
3.2 Adsorventes de fósforo:
Os adsorventes de fósforo são administrados nas refeições para que o fósforo
dos alimentos seja complexado e não seja absorvido. Alguns efeitos colaterais dos
adsorventes de fosfato incluem anorexia, dispepsia, constipação e diarréia (BLEYER,
2003). Segundo Albaaj e Hutchison (2003), as características ideais de um adsorvente
oral de fosfato são: alta afinidade por íons fósforo, rápida ligação ao mesmo, baixa
solubilidade, baixa ou nenhuma absorção sistêmica, atoxicidade e baixa dosagem.
3.2.1 Adsorventes que contém Cálcio:
A administração oral de sais contendo cálcio ocupam o primeiro lugar dos
adsorventes de fosfato (LOCATELLI et al., 2002). O uso destes tipos de adsorventes
em grande quantidade está associado à calcificação metastática progressiva
(SELLARES; RAMIREZ, 2004). Efeitos adversos a longo prazo dos adsorventes que
contém cálcio não são bem conhecidos. A calcifilaxia ou deposição de cristais de
fosfato de cálcio em tecido moles, é um efeito provável e é possível que estes
adsorventes agravem este quadro (ALBAAJ; HUTCHISON, 2003).
22
3.2.2.1 Carbonato de Cálcio:
O carbonato de cálcio oral (CaCO
3
) tem sido usado para controle da
hiperfosfatemia em pacientes com falência renal avançada e em hemodiálise crônica.
Para que tenha efeito, altas doses de carbonato de cálcio são necessárias, cerca de 3 a
12 g por dia (BRO et al., 1998). O carbonato de cálcio é administrado durante ou
depois das refeições, pois necessita de um meio ácido para ser convertido em sal
solúvel (cloreto de cálcio) (JANSSEN; KUY; TER WEE, 1996). A capacidade máxima de
adsorção desse composto é em pH 1,5 (estomacal), apresentando capacidade
adsorvente reduzida em pH neutro (LOGHMAN-ADHAM, 2003).
Adsorventes contendo cálcio não são muito bem tolerados pelos pacientes, e a
aderência dos mesmos à este tratamento é pobre (MALLUCHE; WADA 2002). A
constipação é um problema comum no tratamento com adsorventes contendo
carbonato de cálcio. O uso de carbonato de cálcio deve ser acompanhado de
monitoramento da concentração plasmática de fosfato e cálcio, pois um fator limitante
do uso de carbonato de cálcio é a hipercalcemia, que pode levar a uma calcificação do
tecido vascular (SELLARES; RAMIREZ, 2004a; TAKAHASHI; TANAKA; NAKAMURA,
2004b). Goodman et al. (2000) demonstraram que doses de cálcio de 6,5 g/dia estão
associadas com o aumento risco de calcificação das artérias coronárias. Pruchnicki e
colaboradores (2002) demonstraram em estudos que doses únicas de adsorventes
orais contendo cálcio (carbonato e acetato) diminuem a absorção do ferro administrado
na forma de sulfato ferroso. A redução da absorção de ferro pode ser explicada por dois
mecanismos: a diminuição da solubilidade do ferro pelo aumento do pH gástrico ou a
formação de complexos insolúveis entre o ferro e o adsorvente.
3.2.1.2 Acetato de Cálcio:
Vários estudos mostraram que esse complexo tem muitas características para
ser complexador de fosfato. Por ser um sal mais solúvel, é facilmente dissolvido pelo pH
elevado e também se liga mais rapidamente ao fosfato (JANSSEN; KUY; TER WEE,
23
1996). Filho e colaboradores (2000), compararam o efeito hipercalcemiante do acetato
e carbonato de cálcio em pacientes hemodialisados e concluíram que quando o acetato
de cálcio é utilizado, o controle da hiperfosfatemia é atingido com menor administração
de adsorvente e com menor risco de hipercalcemia.
Choy, Lo e Ching (1998), demonstraram que o uso do acetato de cálcio quando
comparado ao carbonato de cálcio não diminui a incidência de hipercalcemia em
pacientes hemodialisados. Os autores sugerem que a alta solubilidade do acetato de
cálcio no pH alcalino do intestino deixa mais cálcio livre para absorção, levando ao
episódio de hipercalcemia. A dose de acetato de cálcio administrada para controlar o
fosfato deve ser o dobro da utilizada para o carbonato de cálcio. Além disso, o custo da
dose de acetato de cálcio é quatro vezes maior que o carbonato, tornando a rotina do
uso de acetato com custo-benefício inválido.
3.2.1.3 Alginato de Cálcio:
O alginato de cálcio é um ácido poliurônico natural, com diferentes
conformações, usado normalmente como aditivo não tóxico em alimentos. É utilizado
em pacientes que fazem hemodiálise devido a sua capacidade de complexar fosfato.
Adicionalmente, não leva à hipercalcemia porque apenas uma pequena quantidade de
cálcio é absorvida, e também não apresenta efeitos colaterais graves (PASLICK et al.,
1989).
3.2.1.4 Cálcio
α
αα
α
-cetoglutarato:
O α-cetoglutarato é outro adsorvente que contém cálcio. O α-cetoglutarato
análogo do ácido glutâmico, tem capacidade de complexar íons fosfato. Em um estudo
com pacientes dialisados, este complexo diminuiu a concentração sérica de fósforo. O
α-cetoglutarato tem sido usado como adsorvente oral de fosfato na Europa, mas ainda
não nos Estados Unidos da América. Apesar de custar dez vezes mais que o carbonato
de cálcio, o cálcio α-cetoglutarato exerce muitos efeitos metabólicos benéficos nos
24
pacientes com doença renal, o que justifica seu uso como adsorvente de fosfato
(LOGHMAN-ADHAM, 2003). BRO e sua equipe (1998) compararam a eficácia do cálcio
α-cetoglutarato versus carbonato de cálcio em pacientes renais crônicos, concluíndo
que o composto pode ser uma alternativa segura em pacientes em hemodiálie.
Entretanto, pelo alto custo da terapia, o cálcio α-cetoglutarato poderia ser usado
somente por um grupo seleto de pacientes.
3.2.2 Adsorventes que contém Alumínio:
Usualmente os adsorventes de fosfato contendo alumínio, como o hidróxido de
alumínio (Al(OH)
3
), são prescritos para controle de fósforo sérico (PASLICK et al.,
1989). Esses complexadores têm sido usados com sucesso no controle da
hiperfosfatemia em pacientes com falência renal crônica. Entretanto, o uso a longo
prazo pode ser complicado pelos efeitos tóxicos do acúmulo do alumínio no organismo
(KURODA et al., 1995). O trato gastrintestinal é relativamente impermeável ao alumínio
mas em certas circunstâncias, pode haver absorção aumentando a concentração sérica
e em alguns tecidos (LOGHMAN-ADHAM, 2003). Este acúmulo de alumínio está
associado a encefalopatia, osteopatia e anemia (YAMAGUCHI; BAXTER; MAEBASHI,
1999).
O mecanismo exato da toxicidade do alumínio ainda é desconhecido. Entretanto,
evidências demonstram que o acúmulo deste metal no organismo pode potencializar
eventos oxidativos e inflamatórios, levando ao dano tecidual. Um resumo de evidências
epidemiológicas e clínicas ligam o acúmulo de alumínio também à doenças
neurodegenerativas como a Doença de Alzheimer (CAMPBELL, 2002).
3.2.3 Adsorventes que contém Lantânio:
O lantânio é um metal raro e apenas traços são encontrados no corpo humano
(MALLUCHE; MAWAD 2002). O carbonato de lantânio é um adsorvente livre de cálcio e
alumínio que forma um complexo insolúvel com o fósforo no estômago. O carbonato de
25
lantânio contém um cátion trivalente que tem alta afinidade pelo fosfato. A dose
utilizada é de 225-3000 mg/dia e os efeitos adversos mais freqüentes são vômitos e
diarréia (HARRISON; SCOTT, 2004). Hutchison e colaboradores (2005) realizaram um
estudo comparativo entre o carbonato de lantânio e carbonato de cálcio. Ao final deste
experimento, o carbonato de lantânio mostrou uma significante redução na incidência
de hipercalcemia e no produto cálcio x fosfato. Estudos com o uso crônico mostraram
que elevados índices destes sais acumularam-se em órgãos como fígado, sendo a
princípio, hepatotóxico (LOGHMAN-ADAHAM, 1999; LOGHMAN-ADAHAM, 2003;
LOGHMAN-ADADHAM, 2004; SLATOPOLSKY; LIAPIS; FINCH, 2005). Segundo
Malluche e Mawad (2002), ratos com falência renal crônica apresentaram acúmulo
deste metal nos ossos depois de 12 semanas de administração oral. Estudos de
toxicidade a longo prazo com lantânio ainda são desconhecidos (QUERFELD, 2005).
3.2.4 Adsorventes que contém Nicotinamida:
Recentemente a nicotinamida, um metabólito do ácido nicotínico, demonstrou
controlar os níveis de fosfato em pacientes hemodialisados de forma semelhante aos
adsorventes que utilizam cálcio ou alumínio. Neste mesmo estudo, os níveis de PTH
diminuíram desde do início do tratamento e houve redução significante do mesmo
analito depois de 12 semanas de tratamento. A administração da nicotinamida também
demonstrou alguns efeitos adversos como desordens gastrintestinais (TAKAHASHI;
TANAKA; NAKAMURA, 2004).
3.2.5 Adsorventes que contém Sevelamer:
O sevelamer é um polímero catiônico de cloridrato de polialilamina, que
complexa ânions fosfato através de pontes de hidrogênio (HERGESELL; RITZ, 2002;
ALBAAJ; HUTCHISON, 2003; SWEARINGEN; ZHOROV; COHEN, 2004). O sevelamer
é comercializado com o nome de Renagel e o seu uso foi aprovado pelo FDA (Food
and Drug Administration) em 1998. A ingestão por duas semanas de Renagel diminui a
26
concentração de fosfato sérico comparado com o placebo. O colesterol sérico total e o
LDL colesterol também diminuíram (CHERTOW et al., 1997). Resultados semelhantes à
estes foram obtidos por Amin em 2002. Sesso e Ferraz (2003) relatam que esse
polímero promove redução de 30% nos níveis de LDL colesterol. Mas por possuir a
propriedade de reduzir as concentrações de colesterol, o sevelamer também pode
seqüestrar vitaminas e micronutrientes (HERGESELL; RITZ, 2002; ALBAAJ;
HUTCHISON, 2003).
Esse polímero oferece muitas vantagens frente aos agentes tradicionais no
controle da hiperfosfatemia em pacientes com falência renal em estágio final
(CHERTOW et al., 1997). Estudos realizados por Nagano, Miyata e Obana (2003),
demonstraram que o sevelamer inibiu o aumento progressivo das concentrações de
fósforo e PTH sem afetar os níveis de cálcio e 1,25 (OH)
2
D
3
em ratos com insuficiência
renal crônica. Desde a sua aprovação na Europa e Estados Unidos da América, este
polímero tem se mostrado eficaz no controle plasmáticos de cálcio e fósforo em
pacientes hemodialisados. Atualmente o sevelamer é o único adsorvente de fósforo
livre de cálcio com segurança clínica utilizado em adultos e crianças. Entretanto, o
monitoramento é necessário devido à possível indução de acidose metabólica
(QUERFELD, 2005). Devido ao alto custo do sevelamer, seu uso ainda é restrito
(LOCATELLI et al., 2002). A dose diária de sevelamer custa U$11,00,
aproximadamente sete vezes maior do que do acetato de cálcio (SELLARES;
RAMIREZ, 2004).
3.2.6 Compostos que contém Ferro:
Há várias décadas tem sido observado que a administração de ferro pode
resultar na redução sérica de fósforo em vários modelos animais (RITZ; HERGESEL,
2001). Estudos em humanos e animais indicam que compostos férricos podem
complexar o fosfato da dieta e alterar dramaticamente o metabolismo do mesmo (HSU;
PATEL; YOUNG, 1999a, YAMAGUCHI et al., 1999b).
Uma pequena parte do ferro pode ser liberada desses compostos e ser
sistemicamente absorvida. Isto não é tão indesejável, considerando que estes
27
pacientes desenvolvem uma deficiência funcional de ferro e necessitam de
suplementação, geralmente com alfa-epoietina (BESARAB et al., 2000).
A absorção intestinal do fósforo é inibida pela alta concentração de ferro da dieta,
resultando presumidamente, na formação de complexos no intestino (KURODA et al.,
1995). Em 1983, Okada e colaboradores verificaram que a administração intravenosa
de óxido de ferro complexado com açúcares em pacientes com anemia moderada à
severa, provocava hipofosfatemia. Esses dados estimularam os pesquisadores à
explorarem a possibilidade do uso de adsorventes de fosfato que contenham ferro
(HERGESELL; RITZ, 1999).
O complexo polimaltose férrica não iônica foi estudado em 32 pacientes renais
em hemodiálise para o tratamento da hiperfosfatemia, mostrando efeitos adversos
foram mínimos como o relato de fezes escuras (CHANG et al., 1999). Algum tempo
depois, a continuidade deste estudo mostrou que o complexo de polimaltose é menos
efetivo na redução de fosfato quando comparado aos adsorventes contendo cálcio
(LOGHAMN-ADHAM, 2003).
Outro sal de ferro estudado é o ferridrito sintético que tem uma grande
capacidade em adsorver fósforo. É facilmente sintetizado, pode ser usado como pó,
comprimido, cápsula ou suspensão. O ferridrito inibiu a absorção de fosfato em
experimentos preliminares com ratos (WEAVER et al., 1999). Entretanto, não está claro
se o ferridrito pode liberar o ferro e se esse possa ser absorvido (LOGHMAN-ADAHAM,
2003).
Hsu, Patel e Young (1999) testaram vários compostos férricos quanto a
habilidade em adsorver fosfato em ratos normais e nefrectomizados. Os compostos
testados foram citrato férrico de amônio, citrato férrico e cloreto de ferro, administrados
durante quatro semanas. Os três compostos reduziram a absorção de fosfato intestinal,
conforme determinado pela excreção do mesmo nas fezes.
O complexo ferro (III) sacarídio é resistente ao ácido, com alta capacidade de
complexar fosfato em relação ao hidróxido de ferro. Este complexo administrado em
animais normais na concentração de 1-8% durante 7 dias, mostrou queda significante
na excreção de fósforo, indicando a habilidade do complexo em reduzir a absorção
gastrintestinal do mesmo (YAMAGUCHI et al., 1999).
28
3.2.6.1 Quitosana ferro:
A quitosana é um polissacarídeo natural não tóxico produzido industrialmente
pela desacetilação da quitina da casca de crustáceos. Devido à boa adaptação
fisiológica é usada como aditivo alimentício, em medicamentos, etc. Por ela não ser
hidrolisada pelas enzimas digestivas no homem, e possuir estrutura química similar a
da celulose, pode ser usada como tipo de fibra dietética. A quitosana contém um par de
elétrons livres no nitrogênio e por isso apresenta a capacidade de formar complexos e
polímeros com metais (JING et al., 1997).
A quitosana, uma vez complexada com a forma ferrosa (II), tem a capacidade de
adsorver fosfato in vitro, sendo mais vantajosa quando comparada com o sulfato básico
de ferro. Essa capacidade de adsorção também mostrou-se maior quando comparado
ao hidróxido de alumínio. Esses efeitos da quitosana Fe(II) podem ser atribuídos à
insolubilidade devido à formação do complexo (JING; YAMAGUSHI, 1992).
Fagundes e Rodrigues (2001), mostraram que a quitosana complexada com o
ferro(III) e passando por processo de reticulação (QTS-Fe (III)-R), apresenta vantagens
quando comparada com a QTS-Fe (II), principalmente pela maior capacidade de
adsorção de fosfato. Estes estudos foram conduzidos em soluções aquosas diluídas de
fosfato.
O uso do polímero QTS-Fe(III) reticulada na adsorção de fosfato in vitro e in vivo
foi demonstrado por BÜRGER et al. (2001). In vitro, a capacidade de adsorção do
complexo foi de 23,6 mg de fosfato por grama de polímero e aproximadamente 16% do
ferro se dissociou do complexo. Experimentos in vivo mostraram o efeito da
administração do complexo em animais hiperfosfatêmicos. A redução do fosfato sérico
foi de 32,7% nos animais tratados com o complexo. Baxter et al. (2000) testaram
também a QTS-Fe(III) em animais alimentados com ração enriquecida com fósforo e
também obtiveram diminuição dos níveis do mesmo. A mínima liberação de ferro deste
composto confere ao mesmo uma opção para o tratamento da hiperfosfatemia em
pacientes com falência renal crônica (LOGHMAN-ADAHAM, 2003). Os primeiros
estudos toxicológicos utilizando o polímero quitosana ferro (III) solúvel durante trinta
29
dias, demonstraram alterações em alguns parâmetros bioquímicos e a deposição de
ferro nos órgãos dos animais tratados (PIAZZA; PALAORO, 2001).
A QTS-Fe(III) parece estar associada com uma menor liberação de ferro e pode
ter benefícios adicionais como diminuição dos níveis séricos de colesterol. Infelizmente,
estudos controlados em pacientes humanos ainda não foram realizados (LOGHMAN-
ADAHAM, 2003).
3.3 Ferro e toxicidade do ferro:
O ferro é um elemento essencial para todos o organismos vivos e está envolvido
em muitas funções fisiológicas no corpo (WEISS, 2002), entre as quais o transporte de
oxigênio e catálise de reações enzimáticas (LEE et al., 1998; CHUA-ANURSON, 1999).
O organismo humano possui aproximadamente 4,5 g de ferro, e destes,
aproximadamente 65% está complexado à hemoglobina, 10% constitui mioglobina,
citocromos e enzimas e 20-30% está estocado na forma de ferritina e hemossiderina
(CHUA-ANURSON et al., 1997; HENRY, 1999; FRAGA; OTEIZA, 2002; CRICHTON;
WARD, 2003).
A homeostase do ferro é estritamente regulada pelo nível de absorção intestinal,
e em indivíduos saudáveis é influenciada pelos estoques corporais do mesmo, pela
atividade da eritropoeiteina e pela hipóxia (HUANG, 2003; CRICHTON; WARD, 2003).
A absorção do ferro ocorre principalmente no duodeno na forma de heme ou na forma
livre como íon ferroso (II) (SILVA; HASHIMOTO,1999). Em condições normais acredita-
se que a absorção do ferro seja um processo ativo: entretanto, na ingestão maciça este
processo torna-se saturado e o ferro passa a ser absorvido através de gradiente de
concentração (GUERRA; FILHO, 2001).
A maior parte do ferro absorvido liga-se à transferrina para transporte no plasma.
O ferro restante é retirado de dentro da célula onde se combina com a proteína
apoferrina formando a ferritina. A ferritina também está presente nas células
parenquimatosas hepáticas e nas células reticulendoteliais da medula óssea, fígado e
baço. Nos casos em que a quantidade de apoferrina for insufuciente para fixar o ferro
30
restante, ele é depositado nos tecidos como pequenos grânulos de ferro, conhecidos
como hemossiderina (HENRY, 1999). Na talassemia e na hemocromatose, o excesso
de ferro é depositado nos tecidos e órgãos, especialmente baço, fígado e coração, na
forma de partículas ultrafinas de oxihidróxido de ferro (III) (WEBB; CHUA-ANURSON;
PIERRE, 1999).
O ferro sérico reflete principalmente a quantidade de ferro ligado à transferrina. A
transferrina sérica representa a quantidade máxima de ferro, referida também como
capacidade total de ligação do ferro (TIBC) (HENRY, 1999). Em casos de aumento do
mesmo, o elemento estará na forma não ligada à transferrina (NTBI) (CRICHTON;
WARD, 2003). A NTBI não ocorre somente em aumentos severos de ferro mas também
na hemocromatose hereditária heterozigota, talassemia, em pacientes hemodialisados
e etilístas (MARX; HIDER, 2002).
Estudos sobre a ingestão acidental de ferro em crianças revelaram que a dose
tóxica de 20 mg/kg traz efeitos leves como náuseas, vômitos e diarréia. A ingestão
acima de 60 mg/kg provoca manifestações significativas que requerem avaliação
clínica. As doses potencialmente letais situam-se entre 150 e 250 mg/kg (GUERRA;
FILHO, 2001). A toxicidade crônica do ferro pode estar associada à diversas condições
como aumento da absorção de ferro (hemocromatose genética), aumento da ingestão
de ferro e condições de diálise (WEBB et al., 1999a; WATTS; FORD; LEONOVA,
1999b; YAVUZ; ARICA; DENIZ, 2001; FRAGA; OTEIZA, 2002; CRICHTON; WARD,
2003).
A liberação do ferro de ligantes como a transferrina pode originar reações que
geram produtos tóxicos de oxigênio que causam danos às moléculas, mesmo em
pacientes com estoques normais ou diminuídos de ferro (MARX e HIDER, 2002). A
toxicidade mediada pelo ferro é atribuída ao Fe(II) , que reage com o oxigênio gerando
radicais livres causando morte celular (CHAMNONGPOL et al., 2002). Segundo Fraga e
Oteiza (2002) o íon Fe(II) tem a capacidade de reduzir o oxigênio a um radical
superóxido (O
2-
), reação que em organismos aeróbicos é realizada em níveis celulares
e extracelulares (Eq. 1). Tanto o íon ferrosso não quelado quanto as formas diferentes
de Fe(II) podem catalisar esta reação. Muitos agentes redutores (ascorbato, compostos
tióis, O
2-
, etc.) podem transformar o íon férrico em ferroso (Eq. 2), resultando na
31
produção do ânion superóxido a partir da molécula de oxigênio. Ainda moléculas de
superóxido podem dismutar, espontaneamente ou enzimaticamente, resultando numa
molécula de oxigênio e uma de peróxido de hidrogênio (Eq 3).
Fe
2+
+ O
2
→ Fe
3+
+ O
2
-
(Eq.1)
Fe
3+
+ A
-
red
→ Fe
2+
+ A
ox
(Eq.2)
O
2
-
+ O
2
-
+ 2H
+
→ O
2
+ H
2
O
2
(Eq.3)
O íon ferroso pode catalisar a decomposição de peróxidos, formando radicais
hidroxila do peróxido de hidrogênio (Eq.4) ou radicais alcóxi, se o substrato da reação
for um peróxido orgânico (LOOH) (Eq. 5). O radical hidroxila, um dos radicais gerados
nestas reações, é altamente reativo e capaz de interagir com várias biomoléculas como
açúcares, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, resultando em peroxidação e dano
tecidual (FRAGA; OTEIZA, 2002; LIU; HIDER, 2002).
H
2
O
2
+ Fe
2+
→
Fe
3+
+ OH
-
+ OH
•
(Eq.4)
LOOH + Fe
2+
→
Fe
3+
+ LO
-
+ OH
•
(Eq.5)
A administração em animais de ferro dextrana nas doses de 250, 500 e 1000
mg/kg foi estudada por Lucesolli e sua equipe (1999), com avaliação dos parâmetros de
estresse oxidativo e toxicidade do ferro após 20 horas da administração. O ferro total
determinado foi dez vezes maior do que valores fisiológicos. Os resultados mostraram
ainda que o excesso de ferro induz estresse oxidativo e modifica a função espermática
levando à disfunção do sistema reprodutor.
Um aumento dos estoques corporais de ferro tem sido relacionado à patogênese
de acidentes cardiovasculares como infarto do miocárdio (PONRAJ et al., 1999;
CLAYES et al., 2002; DAY et al., 2003). Usando camundongos como modelo, foi
demonstrado que a dieta contendo baixa quantidade de ferro reduz a formação de
lesões. Uma dieta com baixos níveis de ferro em animais deficientes de Apoliproteína-E
(proteína que remove o excesso de colesterol sanguíneo) leva à redução da expressão
32
de um proteína que está relacionada com o aumento de colágeno na lesão
aterosclerótica (LEE; CHIU; LEE, 2003).
Day e sua equipe (2003), examinaram o efeito da administração crônica de ferro
na resposta trombótica à injúria arterial, na produção vascular de espécies reativas de
oxigênio (EROS) e na vasoreatividade do endotélio, ou seja, três componentes da
função vascular que participam da patogênese da doença isquêmica vascular. O
principal achado foi que a administração crônica de ferro acelera a resposta trombótica
desencadeante da injúria arterial.
O metal ferro também pode estar envolvido em mecanismos que levam a muitas
doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (ZECCA et al., 2004). Esta
doença pode estar associada à agregação anormal da proteína beta-amilóide (Abeta)
que interage com metais como o ferro (CUAJUNGCO; FREDERICKSON; BUSH, 2005).
Outras evidências têm mostrado, que o ferro pode contribuir para o
desenvolvimento do câncer, tanto como iniciador como promotor do mesmo
(PAPANIKOLAOU; PANTOPOULOS, 2005). Isto é sugerido pela concentração de ferro
no cólon intestinal em pacientes portadores de câncer de intestino (HUANG, 2003).
Considerando que o fígado é o principal órgão de armazenamento de ferro,
muitos experimentos têm suportado a hipótese de que o aumento de ferro possa ser um
fator de risco para o tumor hepático. O acúmulo excessivo de ferro nos hepatócitos
pode causar injúria hepatocelular e levar ao desenvolvimento da fibrose, cirrose e
hepatoma (BONKOVSKY, 1991; PAPANIKOLAOU; PANTOPOULOS, 2005; RAMM;
RUDELL, 2005). Ou seja, quando os estoques de ferro se tornam em excesso nos
lóbulos hepáticos ocorre a fibrose que, se não tratada, desencadeia a cirrose hepática
(HALLIDAY; SEARLE, 1996).
Vários estudos revelaram um aumento do risco de câncer renal em pessoas que
trabalham em indústrias de ferro e de outros metais. Fundidores de ferro e aço têm
elevado risco de desenvolver câncer de estômago e pulmão (GARÇON et al., 2000;
HUANG, 2003). A exposição à partículas de óxido férrico também pode aumentar a
incidência de câncer de pulmão (BOUTIN et al., 1998; GARÇON et al., 2000; GOSSET
et al., 2003).
33
Okada (2003) mostrou que o ferro complexado com ácido nitrilotriacético e com
ácido etinildiaminodiacético é um potente mediadores da produção de radicais livres, e
que, depois da administração intraperitonial em ratos e camundongos, os mesmos
induziram necrose tubular aguda (levando à apoptose secundária) e câncer renal.
Apesar destas complicações relatadas na literatura referentes à toxicidade do
ferro, o mesmo, complexado a polímeros como a quitosana, tem sido estudado como
agente adsorvente oral de fósforo e futuramente pode ser empregado no tratamento da
hiperfosfatemia em pacientes renais crônicos.
34
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1
Metodologia:
4.1.1 Polímero QTS-Fe(III) solúvel:
O polímero QTS-Fe(III) solúvel foi preparado de acordo com o método descrito a
seguir:
A quitosana [grau de desacetilação igual a 0,76; peso molecular (Mv) 65 000,
determinado pela equação de Mark-Houniwink] foi obtida através da hidrólise básica da
quitina. A QTS-Fe(III)-CL (130 mg/kg de ferro) foi preparada e caracterizada pelos
métodos reportados na literatura (RATHKE; HUDSON, 1994; RODRIGUES et al.,
2000). A quitosana foi dissolvida em uma solução aquosa de Fe (NO
3
)
3
0,1 M por 4
horas. Um precipitado de cor laranja foi obtida após a adição de acetona. O sólido foi
filtrado e lavado com acetona para remover o excesso de Fe(NO
3
)
3
e finalmente seco
em vácuo. A concentração de final de ferro do polímero foi 131 mg de ferro/g de
polímero determinada espectrofotometricamente utilizando a 1,10-fenantrolina como
agente cromóforo (FAGUNDES; RODRIGUES; BERNARDI, 2001).
4.1.2 Animais:
Foram utilizados ratos da raça Wistar, Cepa UNIVALI, machos e fêmeas, com 3
meses de idade pesando aproximadamente 200 gramas (fêmeas) e 250 gramas
(machos), criados no Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI).
Posteriormente, os animais foram transferidos para o laboratório de pesquisa do Curso
de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, onde permaneceram em ambiente com
temperatura controlada (22 ± 2 °C), com ciclo claro/escuro de 12 horas durante todo o
tratamento. Água e ração foram fornecidas ad libitum
.
35
4.2
Ensaios Toxicológicos:
A toxicologia é o ramo da ciência que estuda as substâncias nocivas à saúde,
suas ações, seus sintomas, seus efeitos e seus contravenenos (BRITO, 1998). O termo
“tóxico” pode ser considerado como sinônimo prejudicial presente num efeito químico.
Além disso, as substâncias químicas podem ser preferencialmente efetivas em
pequenas concentrações. Em contraste, algumas substâncias podem apresentar
atividade seletiva em células provocando danos (LOOMIS, 1996).
A avaliação toxicológica compreende: a análise dos dados toxicológicos de uma
substância ou composto químico com o objetivo de classificá-lo toxicologicamente e, ao
mesmo tempo, fornecer informações a respeito da forma concreta de seu emprego,
bem como as medidas preventivas e curativas quando do seu uso inadequado (LARINI,
1999).
4.2.1 Toxicologia crônica:
Foram utilizados 60 (sessenta) ratos, agrupados em caixas com 5 (cinco)
animais. Os animais foram divididos em 3 grupos com 20 animais cada (10 machos e
10 fêmeas).
GRUPO I: Controle (salina)
GRUPO II : 50 mg/kg de QTS Fe(III) solúvel (6,5 mg/kg de ferro)
GRUPO III: 100 mg/kg de QTS Fe(III) solúvel (13,0 mg/kg de ferro)
GRUPO SATÉLITE: 10 animais (5 machos e 5 fêmeas) do grupo I + 10 animais do
grupo III (5 machos e 5 fêmeas).
O complexo foi administrado via oral sonda gástrica por um período de 90
(noventa) dias. O grupo satélite, foi mantido em observação e sem tratamento por mais
30 (trinta) dias para verificação da reversibilidade ou intensificação dos efeitos tóxicos.
As amostras foram colhidas após 12 horas de jejum e obtidas através de coleta
por ablação caudal após anestesia dos animais utilizando éter.
36
Após noventa dias de experimento, os animais (com exceção dos animais do
grupo satélite) foram sacrificados por asfixia em éter, sendo os órgãos internos
removidos para avaliação macroscópica e avaliação de peso. Posteriormente, os
órgãos foram congelados para determinação da deposição de ferro. Trinta dias após o
término do experimento, o mesmo procedimento foi adotado para os animais do grupo
satélite.
4.2.2 Observações comportamentais:
Foram avaliadas reações motoras e de comportamento através de observações
conforme tabela em anexo (ANEXO A).
Durante o experimento foram feitas obervações como: piloereção, ptose,
movimento de canto de gaiola, micção, defecação e contorções abdominais, e os dados
computados em fichas individuais para cada animal. Estas obervações foram realizadas
em tempos pré-determinados de cinco e trinta minutos, uma e vinte e quatro horas após
a administração diária do polímero ou salina.
As manifestações de ordem qualitativa foram anotadas por um método escores
baseados na intensidade dos sintomas, previamente estabelecido: escore zero
especifica nenhum sinal; um escore, efeito leve; dois escore, moderado; três escore,
intenso; e quatro escore o efeito é considerado efeito severo (CARLINI, 1972).
4.2.3 Parâmetros bioquímicos:
Durante os testes de toxicidade devem ser empregados estudos sobre as provas
bioquímicas, a fim de avaliar a integridade funcional dos distintos sistemas orgânicos.
Os parâmetros bioquímicos permitem a avaliação de todos os órgãos e funções do
organismo animal, especialmente a função renal e hepática (LARINI, 1999).
Após a coleta das amostras em tubo sem anticoagulante, as mesmas foram
centrifugadas a 5.000 rpm para separação do soro. A determinação sérica de
parâmetros bioquímicos como glicose, colesterol, triglicerídeos, transaminases
37
hepáticas (AST e ALT), uréia, creatinina, fósforo, ferro, proteínas totais e eletrólitos
foram realizados no início (alguns animais para controle inicial), trigésimo dia,
sexagésimo dia, nonagésimo e final do experimento (grupo satélite).
As dosagens de fósforo, uréia, creatinina, AST (aspartato aminotransferase),
ALT (alanina aminotransferase), glicose, colesterol, triglicerídeos e proteínas totais
foram realizadas por automação (Cobas Mira ROCHE) utilizando kits comerciais
(Wiener Rosário Argentina). As dosagens de sódio, potássio e cálcio empregaram
automação Iselab (DRAKE), enquanto o ferro foi processado manualmente com kit
comercial BIOSYSTEMS (Barcelona, Espanha).
A dosagem de fósforo foi realizada por método UV onde o mesmo reage em
meio ácido com o molibdato para formar um complexo fosfomolibdíco medido
espectrofotometricamente a 340 nm.
A determinação da creatinina empregou metodologia cinética, sem
desproteinização, onde reage com o picrato alcalino (reação de Jaffé) produzindo um
cromogênio vermelho quantificado a 500 nm.
A uréia foi detectada pelo método da urease a 304 nm, na qual o glutamato
desidrogenase converte α-cetoglutarato em glutamato com a oxidação simultânea do
NADH em NAD
+
.
As enzimas AST e ALT, foram determinadas a 340 nm pela adição de substratos
específicos, formando compostos que são diretamente dosados a partir da
desidrogenase, na reação de conversão do NADH para NAD
+
.
A glicose foi quantificadada pela reação com a glicose oxidase, gerando ácido
glicurônico e peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com um aceptor
de oxigênio, como a orto-dianisidina, fenilamina-fenazona (reagente de Trinder), em
reação catalisada pela peroxidase para formar a coloração vermelha que é medida a
505 nm.
A dosagem de triglicerídeos foi realizada pela hidrólise dos mesmos formando o
composto glicerol que é convertido em glicerolfosfato. A finalização da reação se dá
com a formação de um complexo com coloração vermelha lido em 505 nm.
A determinação do colesterol total tem como reação da hidrólise de ésteres de
colesterol, onde ocorre a formação de colesterol e ácidos graxos. O colesterol oxidado
38
pela oxidase forma peróxido de hidrogênio, que é determinado enzimaticamente pela
coloração vermelha quantificada a 505 nm.
As ligações peptídicas das proteínas totais reagem com o íon cúprico em meio
alcalino, formando um complexo de cor lilás com máximo de absorbância a 540nm, cuja
intensidade é proporcional à concentração de proteínas totais na amostra.
O ferro presente na amostra foi determinado pelo método onde o íon férrico
reage com o cromazurol B e com o cetilmetilamoniobromida (CTAB) formando um
complexo medido espectrofotometricamente em 626 nm.
A análise de sódio é baseada em uma membrana de vidro sensível à este íon.
Uma diferença de potencial elétrica é gerada quando esta membrana separa duas
soluções com diferentes concentrações de sódio. Esta diferença de potencial é
proporcional a diferença de concentração dos íons sódio entre as duas soluções. Como
uma das soluções é a solução eletrolítica interna do eletrodo e portanto possui uma
concentração de sódio constante e conhecida, pode-se determinar a concentração de
íon na amostra. O mesmo princípio é utlilizado para a determinação de potássio e cálcio
(BURTIS; ASHWOOD, 1998).
4.2.4 Parâmetros hematológicos:
Avaliações hematológicas como contagem total de leucócitos e eritrócitos,
diferencial leucocitária, determinação de hemoglobina, hematócrito, índices
hematimétricos e plaquetas foram realizadas nos mesmos tempos que a determinações
bioquímicas.
Um dos procedimentos mais importantes em qualquer avaliação hematológica é
o exame cuidadoso dos elementos figurados do sangue. Essa avaliação inclui a
quantificação de cada elemento celular e o exame microscópico meticuloso da
morfologia celular. A maioria dos distúrbios hematológicos pode ser identificada por
anormalidades específicas desses resultados, sendo que na identificação de outros
estados patológicos o sangue muitas vezes pode fornecer informações diagnósticas
valiosas (LEE et al., 1998).
39
Após a coleta das amostras de sangue em tubos contendo EDTA como
anticoagulante, foram analisados pela automação CELL DYN 3000 (ABOTT) os
seguintes parâmetros hematológicos: contagem de leucócitos total e diferencial,
contagem de eritrócitos e plaquetas, determinação da hemoglobina e hematócrito e
índices hematimétricos. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada utilizando
contador manual e microscópio óptico na análise de lâminas confeccionadas com
esfregaço sangüíneo e coradas com corante hematológico.
Na automação para a determinação da concentração de hemoglobina, o sangue
foi diluído numa solução de ferrocianeto de potássio e cianeto de potássio. O
ferrocianeto oxida as hemoglobinas até hemiglobina, e o cianeto fornece íons cianetos
até formar cianeto de hemiglobina (HiCN) que é lida em 540 nm e comparada com uma
solução padrão de HiCN (HENRY, 1999). O hematócrito foi medido indiretamente como
produto do volume corpuscular médio (Volume Corpuscular Médio) multiplicado
hematimetria. O VCM (Volume corpuscular médio) é o volume do eritrócito médio,
sendo calculado com base no hematócrito e eritrócitos totais. O HCM (Hemoglobina
celular média) é o conteúdo (peso) de hemoglobina do eritrócito médio; esse índice é
calculado a partir da concentração de hemoglobina e eritrócitos totais. O CHCM
(Concentração de hemoglobina corpuscular média) é a concentração média de
hemoglobina num determinado volume de eritrócitos compactados. Esse indicador é
calculado com base na concentração de hemoglobina e hematócrito (FISCHBACH,
2002; HENRY, 1999). Os eritrócitos e plaquetas foram medidos pelo método da
Impedância Elétrica, onde as células, ao passarem por uma abertura através da qual
flui uma corrente, provoca alterações elétricas que são computadas como pulsos de
voltagem e correspondem às hemácias e plaquetas. Os leucócitos são determinados
por um detector fotossensível que mede a dispersão da luz com uma tecnologia
chamada Dispersão Polarizada Multiangular. O sangue foi diluído em solução que
mantém os leucócitos num estado próximo ao natural, mas que torna os eritrócitos
transparentes ao laser. São efetuadas quatro medidas simultâneas de dispersão de luz
em cada leucócito para identificação e contagem dos mesmos (HENRY, 1999).
Na contagem diferencial de leucócitos em esfregaço sanguíneo foi utilizada
coloração pelo método de May Grünwald-Giemsa, que é uma mistura de eosinato de
40
azul de metileno (May-Grünwald) e a mistura de azur-eosina (Giemsa). Neste método
os elementos estruturais coram-se de acordo com a afinidade de pH entre corante e
estrutura celular. O corante azul de metileno (básico) cora estruturas celulares ácidas e
a eosina cora estruturas básicas. O princípio deste método baseia-se na visualização
de núcleo e citoplasma, onde o núcleo tende a se corar com o corante de azul de
metileno e o citoplasma se cora com eosina (LIMA et al., 1992; HENRY, 1999).
4.3.5 Análise anatomopatológica dos órgãos:
Os animais foram sacrificados no final do tratamento por asfixia em éter. Foi
realizado um exame anatomopatológico do trato gastrintestinal, uma vez que a
administração por gavagem pode causar alterações na mucosa do esôfago e o próprio
ferro pode ter ação corrosiva direta sobre a superfície da mucosa. Da mesma forma
foram analisados órgãos vitais como rins, fígado, baço, coração e pulmões. Após a
retirada, os órgãos foram lavados com soro fisiológico a 0,9%, enxutos em papel toalha,
e pesados individualmente. Os respectivos pesos dos órgãos e possíveis alterações
macroscópicas foram anotados e expressos em forma de tabelas.
4.2.6 Análise de ferro nos órgãos:
Os órgãos não foram analisados individualmente devido ao pequeno tamanho
dos mesmos. Assim a análise foi feita com o de pool dos órgãos e os resultados foram
corrigidos para 1 grama de órgão (peso seco). Após a realização das análises
anatomopatológicas descritas anteriormente, os órgãos foram secos durante uma noite
à 80
o
C e em seguida pesados. As amostras foram solubilizadas em HNO
3
6M com
aquecimento a 150
o
C para solubilizar o ferro associado às proteínas (LEE et al.,
1998b). O ferro foi determinado espectrofotometricamente utilizando a 1,10-fenantrolina
como agente cromóforo.
41
4.2.7 Análise estatística:
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) e foram avaliados
estatisticamente através da análise de variança de uma via (ANOVA) seguida pelo teste
de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnet, Tukey e de Student quando
apropriado. Valores de p≤ 0,05 foram considerados como significantes.
42
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Depois de aproximadamente duas décadas com poucas opções aprovadas para
o tratamento da hiperfosfatemia, pesquisas estão se voltando para o desenvolvimento
de novos adsorventes orais de fosfato. O melhor entendimento dos riscos que se tem
associados ao uso de adsorventes contendo cálcio, como aumento da calcificação
vascular e cardíaca, estimulam a pesquisa de adsorventes livres de cálcio. Os efeitos
adversos associados ao uso de adsorventes que contém alumínio também instigam os
pesquisadores a desenvolver quelantes livres deste metal (LOGHMAN-ADAHAM, 1999;
LOGHMAN-ADAHAM, 2003).
Muitos compostos contendo metais como o ferro têm demonstrado excelente
capacidade de complexação ao fósforo e com poucos efeitos adversos (LOGHMAN-
ADAHAM, 2003; SELLARES; RAMIREZ, 2004). Estes produtos são promissores no
tratamento da hiperfosfatemia, mas as informações disponíveis são ainda muito
restritas (SELLARES; RAMIREZ, 2004).
Bürger e colaboradores (2001) demonstraram o efeito da QTS-Fe(III) reticulada
na redução dos níveis de fosfato em animais hiperfosfatêmicos. A administração aguda
do complexo foi realizada por Piazza e Palaoro (2001), onde foi determinada a dose
letal média do polímero e seus efeitos sobre parâmetros bioquímicos e deposição de
ferro em órgãos alvo.
O presente trabalho, avalia o efeito crônico (90 dias) da administração do
polímero QTS-Fe(III)-solúvel em animais normais analisando parâmetros como: análise
de comportamento através do teste hipocrático, efeito no ganho de peso,
determinações bioquímicas e hematológicas, anatomopatologia e dosagem de ferro nos
órgãos.
Cabe salientar que as doses de QTS-Fe(III)-solúvel empregada nestes
experimentos de 50mg/kg/dia e 100mg/kg/dia (6,5 e 13,0 mg de ferro) estão acima da
dose de QTS-Fe(III)-reticulada considerada efetiva no tratamento de ratos com
hiperfosfatemia induzida, conforme relatada por Bürger et al (2001). Estas doses
também não provocaram nenhuma morte em camundongos em estudos sobre os
43
efeitos tóxicos agudo e subcrônicos (30 dias) com a quitosana-Fe(III)-solúvel conforme
descrito por Piazza e Palaoro (2001).
Outro dado importante está relacionado com a quantidade de composto
contendo ferro que equivale a concentração empregada em um adulto de 70kg
(BAXTER, et al., 2000). Neste estudo a quantidade de QTS-Fe(III)-solúvel corresponde
a 3,5 a 7,0g diariamente, sendo que estes valores foram muito inferiores àqueles
empregados por Baxter et al. (2000), de 60g/dia para a quitosana/sulfato de ferro,
240g/dia para os sais de ferro empregados por Hsu e colaboradores (1999) e mesmo
inferiores aos utilizados por Weaver e equipe (1999) que forram 5,0, 10,0 e 20,0g/dia
para a ferrihidrita.
Os resultados obtidos nas diversas avaliações realizadas neste estudo são
apresentados a seguir.
5.1
Observações comportamentais:
Os resultados são obtidos em escore e as manifestações que devem ser
observadas estão relacionadas com:
- Sistema motor e tônus muscular (writhing – movimento de contração do abdômen e
extensão dos membros posteriores indicando irritabilidade na cavidade abdominal, trem
posterior levantado, paralisia e resposta ao toque);
- Sistema nervoso autônomo (ptose, piloereção, secreções lacrimais, salivação,
alterações gastrointestinais e urinárias);
- Estado consciente e disposição (movimento de canto de gaiola) (CARLINI, 1972).
Durante todo o tratamento, não foram observados tais efeitos e o escore 0 (zero),
que significa nenhum sinal, foi atribuído a todas as manifestações avaliadas nos
animais. Assim as tabelas, durante o tratamento, apresentam os mesmos dados, não
havendo necessidade de apresentá-las num todo. Desta forma, a tabela 01 abaixo,
representa os escores obtidos das observações comportamentais. Estes dados
demonstram que a administração do complexo não causa efeitos sobre o estado
44
consciente e disposição, atividade e coordenação do sistema motor e tônus muscular,
reflexos e atividade do sistema nervoso autônomo.
Tabela 01: Valores obtidos a partir das observações comportamentais nos animais
após administração do complexo Quitosana-Ferro(III) solúvel, variação imposta pelo
tempo de 5 e 30 minutos, 1 e 24 horas.
Parâmetros
avaliados
Sexo Dose mg/kg 0 à 5
minutos
30 minutos 1 hora 24 horas
Pêlos
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Ptose
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Movimento de
canto de gaiola
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Micção
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Defecação
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Contorções
abdominais
Fêmeas
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Pêlos
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Ptose
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Movimento de
canto de gaiola
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Micção
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Defecação
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Contorções
abdominais
Machos
Controle
50
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
45
5.2
Efeito do complexo Quitosana-Ferro(III) solúvel (50-100mg/kg) sobre o
ganho de peso corporal de fêmeas e machos e grupo satélite:
As figuras 01 e 02 representam o efeito do tratamento sobre o ganho de peso
dos machos e fêmeas, respectivamente. Tanto nos grupos de machos quanto nos
grupos de fêmeas não foram observadas significâncias estatísticas na variação do peso
dos animais quando comparados com grupo controle. O mesmo perfil foi observado no
grupo satélite. Os resultados demonstram que a administração do polímero não
interfere no processo de alimentação dos animais tratados em relação ao grupo
controle. Durante todo o tratamento os animais não foi observado recusa de água e
alimento. Da mesma forma não foram observadas mortes relacionadas à administração
do polímero.
Os resultados mostram que o ganho de peso dos animais durante o tratamento
está relacionado somente com o consumo de alimento e de água. Entretanto, os
resultados aqui apresentados estão em discordância com aqueles relatados por
Palaoro e Piazza (2001), que utilizaram QTS-Fe(III) solúvel e atribuíram redução do
peso nos camundongos tratados devido à viscosidade do polímero que permanecia
mais tempo em meio estomacal .
Figura 01: Efeito do complexo Quitosana-Ferro(III) solúvel sobre o ganho de peso
corporal dos animais fêmeas tratadas durante 90 dias e grupo satélite. Cada coluna
corresponde a média dos experimentos de cada grupo com os respectivos desvios-
padrão n=5-10.
30 60 90 120
0
25
50
75
Controle
QTS-Fe(III) 50mg/kg
QTS-Fe(III) 100mg/kg
Satélite
Tratamento (dias)
Pe
so
(g)
46
Figura 02: Efeito do complexo Quitosana-Ferro(III) solúvel sobre o ganho de peso
corporal dos animais machos tratados durante 90 dias e grupo satélite. Cada coluna
corresponde a média dos experimentos de cada grupo com os respectivos desvio-
padrão n=5-10.
5.2 Parâmetros bioquímicos:
Os exames bioquímicos identificam muitos componentes do sangue e servem
como dispositivos de triagem para identificar lesões em órgãos alvo (FISCHBACH,
2002). Segundo Larini (1999), os parâmetros bioquímicos permitem avaliação de todos
os órgãos e funções do organismo animal. As tabelas que seguem abaixo representam
as dosagens bioquímicas de machos e fêmeas, realizadas no trigésimo, sexagésimo e
nonagésimo dias de tratamento e após observação do grupo satélite. Os dados das
determinações bioquímicas e hematológicas antes do início do tratamento são para
controle e foram similares aos apresentados durante o tratamento, não sendo
apresentados nas tabelas.
A glicemia nos animais tratados e do grupo satélite não difere estatisticamente
dos animais controle ao longo do tratamento com o complexo QTS-Fe(III)-solúvel
(tabela 02). Os dados obtidos indicam aparente manutenção do metabolismo de
carboidratos, sendo que a concentração sanguínea de glicose é controlada por um
sistema de feedback entre fígado, ilhotas pancreáticas e tecidos que respondem aos
30 60 90 120
0
50
100
150
Controle
QTS-Fe(III) 50mg/kg
QTS-Fe(III) 100mg/kg
Satélite
Tratamento (dias)
Peso (g)
47
hormônios envolvidos neste sistema, os quais são liberados no sentido de manter a
homeostasia da glicose (RANG; DALE; RITTER 2001). Em condições normais, o teor
de glicose plasmática mantém-se dentro de limites bastante estreitos. Hormônios como
a insulina, reduzem a taxa glicêmica, enquanto que a adrenalina, noradrenalina,
glucagon, glicocorticóides, hormônio adrenocorticotrófico e o hormônio do crescimento
atuam antagonicamente elevando a glicemia. Em condições patológicas ou sobrecarga
do sistema regulatório pode ocorrer um desequilíbrio destes fatores levando ao estado
de hiper ou hipoglicemia (HENRY, 1999).
Resultados semelhantes aos aqui relatados foram encontrados por Baxter et al
(2000), avaliando o efeito da ração contendo QTS-Fe(III) nos níveis de fosfato de ratos
hiperfosfatêmicos.
Tabela 02: Determinação sérica de glicose de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
GLICOSE (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
70,0 ± 9,9 72,5 ± 6,5 81,0 ± 7,7 79,5 ± 3,1
1
QTS-Fe(III) 50
72,5 ± 10,9 87,0 ± 8,5 85,0 ± 9,7
*
QTS-Fe(III)) 100
65,0 ± 12,1 79,0 ± 7,2 82,0 ± 4,8 80,0 ± 4,7
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
68,0 ± 13,0 87,5 ± 10,4 79,5 ± 8,7 81,0 ± 3,0
1
QTS-Fe(III) 50
82,0 ± 12,4 79,0 ± 10,4 72,5 ± 6,1
*
QTS-Fe(III) 100
70,0 ± 10,0 76,0 ± 10,3 80,0 ± 12,0 74,0 ± 4,3
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão.Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=4-8), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
A avaliação da função renal dos animais tratados em relação ao grupo controle
foi analisada através das dosagens de uréia, creatinina, eletrólitos (sódio, potássio e
cálcio e fósforo). Na insuficiência renal, seja ela aguda ou crônica, os produtos finais do
metabolismo do hidrogênio são acumulados aumentando os níveis de nitrogênio não
protéico, e que reflete no aumento da uréia e creatinina (HENRY, 1999).
48
A tabela 03 mostra que as dosagens plasmáticas de uréia não são
estatisticamente diferentes nos animais tratados e grupo satélite dos animais que não
receberam o polímero. A uréia é produto final do catabolismo protéico, filtrada pelos
glomérulos e excretada na urina, embora 40-70% seja reabsorvida por difusão passiva.
O nível plasmático é afetado pela função renal, conteúdo proteico da dieta e estado
geral de hidratação. Apesar dessas limitações, a concentração de uréia ainda é útil
como marcador de doença renal (MOTTA, 2003).
Tabela 03: Determinação sérica de uréia de fêmeas tratados com Quitosana-Fe(III)
solúvel por 90 dias e grupo satélite.
URÉIA (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
39,5 ± 9,9 30,5 ± 2,7 42,0 ± 5,1 42,0 ± 3,0
1
QTS-Fe(III) 50
35,0 ± 7,7 36,0 ± 8,4 41,0 ± 6,2
*
QTS-Fe(III)) 100
40,5 ± 6,0 30,0 ± 4,8 46,0 ± 4,4 45,5 ± 1,5
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
39,5 ± 4,6 32,5 ± 7,7 40,0 ± 7,8 42,0 ± 2,6
1
QTS-Fe(III) 50
36,0 ± 6,0 28,0 ± 6,0 28,0 ± 7,4
*
QTS-Fe(III) 100
35,0 ± 2,9 28,0 ± 4,9 36,5 ± 11,9 31,0 ± 6,2
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão.Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=4-6), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
A creatinina é um metabólito da creatina presente nos músculos para a liberação
de energia. A creatinina sérica pode ser usada como diagnóstico da causa de
insuficiência renal aguda (SOARES et al., 2002). Qualquer aumento na creatinina
sanguínea serve como indicador sensível de disfunção renal, já que a creatinina é
rapidamente removida do sangue e excretada (CHAMPE, 1996).
Os resultados das dosagens séricas de creatinina dos animais que receberam
QTS-Fe(III) nas doses de 50 mg/kg, 100 mg/kg e grupo satélite não foram
estatisticamente diferentes daqueles encontrados para os animais controle, conforme
mostrado na tabela 04. Resultados semelhantes foram relatados por Hsu, Patel e
49
Young, (1999), quando trataram ratos com citrato de ferro. Também em seres humanos,
os níveis de creatinina parecem não alterar-se pela administração de ferro. Foi
demonstrado que o tratamento de pacientes com 40 mg de óxido de
ferro/polissacarídeo (I.V.) diariamente durante 42 dias não modifica tal parâmetro
(OKADA et al., 1983). Baxter e sua equipe (2000) também relataram resultados
semelhantes aos deste trabalho no tratamento de ratos com ração contendo
quitosana/sulfato de ferro.
Tabela 04: Determinação sérica de creatinina de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
CREATININA (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
0,49 ± 0,01 0,46 ± 0,03 0,59 ± 0,05 0,45 ± 0,03
1
QTS-Fe(III) 50
0,58 ± 0,08 0,52 ± 0,05 0,65 ± 0,05
*
QTS-Fe(III)) 100
0,55 ± 0,09 0,50 ± 0,07 0,59 ± 0,05 0,52 ± 0,07
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
0,56 ± 0,05 0,40 ± 0,04 0,61 ± 0,16 0,40 ± 0,06
1
QTS-Fe(III) 50
0,61 ± 0,09 0,49 ± 0,09 0,70 ± 0,12
*
QTS-Fe(III) 100
0,50 ± 0,06 0,42 ± 0,07 0,55 ± 0,10 0,50 ± 0,04
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=4-8), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Os eletrólitos como sódio, potássio e cálcio são íons que existem nos fluidos
corpóreos. Os eventos metabólicos são afetados, em algum grau, pelas concentrações
relativas e absolutas desses eletrólitos. Além disso, os potenciais de membrana e o
funcionamento normal do tecido nervoso e muscular (incluindo o músculo cardíaco) são
regulados pelas diferenças de concentrações entre os eletrólitos do líquido intra e
extracelular (HENRY, 1999). As tabelas 05, 06 e 07 representam os resultados
relacionados a esses três analitos durante o tratamento com o complexo QTS-Fe(III)-
solúvel.
50
Tabela 05: Determinação sérica de sódio de fêmeas e machos tratados com Quitosana-
Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
SÓDIO (mmol/L)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
138,5 ± 2,1 139,0 ± 3,8 138,0 ± 5,7 140,0 ± 1,5
1
QTS-Fe(III) 50
139,0 ± 1,8 138,0 ± 2,1 143,0 ± 3,4
*
QTS-Fe(III)) 100
138,0 ± 1,8 138,0 ± 2,7 141,0 ± 3,5 139,0 ± 1,0
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
138,5 ± 1,4 137,0 ± 3,5 137,0 ± 3,5 137,0 ± 1,5
1
QTS-Fe(III) 50
140,0 ± 2,0 136,0 ± 3,2 138,0 ± 2,7
*
QTS-Fe(III) 100
136,0 ± 2,3 139,0 ± 2,4 139,0 ± 1,8 135,0 ± 1,4
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=4-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Tabela 06: Determinação sérica de potássio de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
POTÁSSIO (mmol/L)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
5,0 ± 0,3 5,1 ± 0,4 5,2 ± 0,4 4,6 ± 0,4
1
QTS-Fe(III) 50
5,5 ± 0,1 5,0 ± 0,4 5,1 ± 0,3
*
QTS-Fe(III)) 100
5,2 ± 0,2 5,0 ± 0,2 4,9 ± 0,1 5,1 ± 0,5
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
5,1 ± 0,2
5,1 ± 0,1 5,1 ± 0,3 4,9 ± 0,5
1
QTS-Fe(III) 50
4,9 ± 0,3 5,1 ± 0,3 5,1 ± 0,2
*
QTS-Fe(III) 100
5,0 ± 0,2 5,0 ± 0,2 4,9 ± 0,3 5,0 ± 0,1
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=4-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
51
Tabela 07: Determinação sérica de cálcio de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
CÁLCIO (mmol/L)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
1,17 ± 0,01 1,15 ± 0,07 1,19 ± 0,06 1,15 ± 0,02
1
QTS-Fe(III) 50
1,17 ± 0,01 1,12 ± 0,04 1,22 ± 0,08
*
QTS-Fe(III)) 100
1,18 ± 0,01 1,10 ± 0,03 1,22 ± 0,04 1,10 ± 0,04
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
1,19 ± 0,02 1,15 ± 0,09 1,16 ± 0,06 1,15 ± 0,02
1
QTS-Fe(III) 50
1,17 ± 0,04 1,13 ± 0,06 1,11 ± 0,02
*
QTS-Fe(III) 100
1,18 ± 0,04 1,17 ± 0,03 1,18 ± 0,05 1,14 ± 0,03
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Os valores encontrados para as dosagens séricas dos eletrólitos nos animais
tratados e grupo satélite, foi semelhante aqueles encontrados nos animais controle
(tabelas 05, 06 e 07). Estes resultados são muito relevantes, principalmente em relação
ao cálcio, já que o complexo é livre deste íon e não leva ao aumento da concentração
do mesmo. Valores normais de cálcio foram encontrados por BÜRGER e cols. em 2001
em animais hiperfosfatêmicos tratados com QTS-Fe(III) reticulada. Vale ressaltar que
hipercalcemia e outros efeitos adversos podem ser conseqüências do uso de
adsorventes orais que contém cálcio (CHOY; LO; CHENG, 1998; SELLARES;
RAMIREZ, 2004a; TAKAHASHI; TANAKA; NAKAMURA, 2004b).
Conforme relatado por Hsu, Patel e Youg (1999), o tratamento de ratos normais
com ração contendo sais de ferro durante 30 dias não afeta o metabolismo de cálcio.
Este mesmo comportamento foi relatado por Okada et al. (1983), quando humanos
foram tratados com doses diárias de 40mg de óxido de ferro/polissacarídeos durante 42
dias.
Kuroda e colaboradores (1995), relataram que os níveis de cálcio no soro de
pacientes com falência renal crônica não foram alterados quando estes pacientes
52
receberam tratamento com citrato de ferro e sódio associado a carbonato de cálcio e
hidróxido de alumínio.
Os rins também estão envolvidos na homeostase do fósforo (HENRY, 1999).
Assim, níveis elevados deste analito no plasma podem indicar lesão renal (WALLACH,
1999), uma vez que na falência renal a excreção de fósforo diminui resultando em um
aumento da concentração sérica do mesmo (BLEYER, 2003). Quando os níveis de
fósforo no soro dos animais que receberam o tratamento são comparados com o grupo
controle é possível observar que não existe diferença significativa entre eles, e que não
há redução dos níveis de fósforo durante o tratamento de animais normais. Na
determinação deste analito no grupo satélite foi observado o mesmo resultado. Desta
forma, o polímero utilizado no tratamento, descrito como adsorvente de fosfato em
condições de hiperfosfatemia, não interfere nas concentrações plasmáticas do fósforo
em condições fisiológicas normais (tabela 08).
Tabela 08: Determinação sérica de fósforo de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
FÓSFORO (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
5,3 ± 0,6 5,0 ± 0,4 5,4 ± 0,8 5,7 ± 0,2
1
QTS-Fe(III) 50
6,1 ± 0,5 5,0 ± 0,7 6,1 ± 0,5
*
QTS-Fe(III)) 100
5,2 ± 0,4 5,1 ± 0,3 5,5 ± 0,2 5,7 ± 0,1
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
5,3 ± 0,4 5,3 ± 0,7 5,4 ± 0,2 6,1 ± 0,2
1
QTS-Fe(III) 50
5,5 ± 0,6 4,3 ± 0,7 5,0 ± 0,3
*
QTS-Fe(III) 100
5,4 ± 0,2 5,0 ± 0,3 5,8 ± 0,4 5,9 ± 0,7
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Os resultados obtidos estão em discordância àqueles observados por Baxter et
al (2000), provavelmente devido à elevada quantidade de ferro recebida diariamente
(aproximadamente 140mg), bem acima daquela recebida pelos ratos neste experimento
53
(6,5 ou 13,0mg). Comportamento semelhante ao aqui observado foi relatado por Hsu,
Patel e Young (1999), em ratos normais alimentados com ração suplementada com 4,0
a 5,0% de sais de ferro durante quatro semanas. Quando ratos nefrectomizados foram
empregados no estudo foi observada drástica redução nos níveis de fósforo sérico
neste mesmo período.
O produto Cálcio x Fósforo (Ca x P) dos animais tratados variou de 22,4 à 24,7
mg
2
/dL
2
nas fêmeas e 19,3 à 28,3 mg
2
/dL
2
nos machos. Este parâmetro está dentro dos
limites esperados, uma vez que não houveram alterações nos níveis de fósforo e cálcio
as quais poderiam refletir no aumento do mesmo. Estes resultados são relevantes, pois
de acordo com Block et al. (1998), níveis de fósforo que excedem 5,5 mg/dL e produto
Ca x P superior a 52 mg
2
/dL
2
estão correlacionados com o aumento do risco de
mortalidade em pacientes dialisados.
Os níveis séricos de alguns analitos específicos refletem distúrbios na função
hepática. Algumas enzimas como a alanina aminotransferase (ALT/TGP) e aspartato
aminotransferase (AST/TGO) também são marcadores hepáticos e quando ocorrem
lesões ou necrose deste tecido, ou seja, quando há comprometimento hepatocelular, os
níveis séricos destas enzimas tornam-se elevados (GUIMARÃES et al., 1990; HENRY,
1999). Como demonstrado nas tabelas 09 e 10, não houve diferença significativa entre
os grupos tratados e o grupo controle nas dosagens de AST e ALT em machos e
fêmeas. Esses dados demonstram que o tratamento não interferiu na função hepática.
O mesmo resultado foi observado no grupo satélite.
54
Tabela 09: Determinação sérica dos níveis de ALT de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
ALT (U/mL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
52,0 ± 9,4 55,0 ± 10,7 46,0 ± 13,9 52,0 ± 8,0
1
QTS-Fe(III) 50
52,0 ± 9,3 47,0 ± 12,1 63,0 ± 10,5
*
QTS-Fe(III)) 100
52,5 ± 5,5 59,0 ± 5,5 54,0 ± 9,3 50,0 ± 5,0
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
75,0 ± 8,8 67,0 ± 7,8 68,0 ± 9,8 61,0 ± 10,0
1
QTS-Fe(III) 50
71,0 ± 6,7 61,0 ± 12,2 55,0 ± 15,8
*
QTS-Fe(III) 100
67,5 ± 6,6 80,0 ± 8,0 64,0 ± 10,7 60,0 ± 7,0
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Tabela 10: Determinação sérica dos níveis AST de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
AST (U/mL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
168,0 ± 26,0 180,0 ± 35,8 213,0 ± 50,7 137, ± 6,3
1
QTS-Fe(III) 50
218,0 ± 40,8 215,0 ± 22,5 242,0 ± 28,7
*
QTS-Fe(III)) 100
150,5 ± 26,8 190,0 ± 28,0 196,5 ± 59,2 132,0 ± 4,9
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
220,0 ± 30,3 238,0 ± 41,8 232,5 ± 60,9 198,0 ± 34,0
1
QTS-Fe(III) 50
172,5 ± 53,3 263,0 ± 41,8 184,0 ± 55,8
*
QTS-Fe(III) 100
190,0 ± 18,4 265,0 ± 49,4 200,0 ± 51,2 170,0 ± 26,0
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=4-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Mais de 90% de todas as proteínas são sintetizadas no fígado, por isso os níveis
séricos de proteínas totais e albumina também tornam-se importantes indicadores da
cronicidade e da intensidade das afecções hepáticas. Níveis diminuídos ou síntese
55
ineficaz são encontradas na doença hepática severa (WALLACH, 2000). A
determinação dos níveis de proteínas totais não foi significativa, nos animais que
receberam o tratamento assim como no grupo satélite como mostra a tabela 11.
Resultados semelhantes foram observados por Turbino-Ribeiro et al. (2003), quando
determinaram a concentração de proteínas totais e transaminases hepáticas no
tratamento de ratos com elevadas doses de ferro/dextrana.
Tabela 11: Determinação sérica de proteínas totais de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
PROTEÍNAS TOTAIS (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
6,0 ± 0,7 6,8 ± 0,4 6,6 ± 0,6 6,4 ± 0,6
1
QTS-Fe(III) 50
5,9 ± 0,4 6,7 ± 0,3 6,5 ± 0,5
*
QTS-Fe(III)) 100
5,8 ± 0,6 6,5 ± 0,5 6,8 ± 0,5 6,9 ± 0,4
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
5,3 ± 0,5 6,8 ± 0,6 6,4 ± 0,7 6,8 ± 0,4
1
QTS-Fe(III) 50
5,2 ± 0,6 6,0 ± 0,7 6,5 ± 0,9
*
QTS-Fe(III) 100
5,6 ± 0,5 6,8 ± 0,5 6,9 ± 0,7 6,4 ± 0,3
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão.Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
A hipocolesterolemia é de grande interesse na terapêutica uma vez que a
presença de altos níveis de colesterol circulante predispõe a maior risco de desenvolver
doenças arteriocoronarianas (GUYTON, 2002). Como o complexo administrado contém
ferro e o mesmo já está ligado à acidentes vasculares (DAY et al., 2003), é importante
avaliar o efeito deste sobre a colesterolemia e trigliceridemia. Os resultados mostram
não haver diferenças estatísticas significativas, nas dosagens séricas de colesterol total
e triglicerídeos dos animais tratados em relação ao grupo controle, assim como nos
animais do grupo satélite (tabelas 12 e 13). Estes resultados estão de acordo com
aqueles observados por Lee, Shiao e Pan (1999), no tratamento de ratos deficientes de
Apo-E com ração contendo ferro. A administração de ferro/dextrana (I.P.) em ratos tem
56
como resultado uma diminuição de colesterol quando comparado com o grupo controle.
Mas sem diferença significativa para triglicerídeos (TURBINO-RIBEIRO et al., 2003). Os
resultados encontrados neste estudo estão em desacordo com aqueles observados por
Baxter e colaboradores (2000), tratando ratos com ração contendo quitosana/sulfato de
ferro(III) e provocando aumento dos níveis de colesterol total. Por outro lado o
comportamento dos triglicerídeos presentes neste estudo assemelha-se muito ao
relatado pelos mesmos autores, isto é, não ocorre diferença significativa entre animais
tratados e controle.
Tabela 12: Determinação sérica de colesterol total de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
COLESTEROL TOTAL (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
89,5 ± 6,5 88,5 ± 15,5 97,0 ± 9,0 90,0 ± 12,2
1
QTS-Fe(III) 50
75,0 ± 12,2 79,0 ± 7,2 94,0 ± 13,2
*
QTS-Fe(III)) 100
80,0 ± 7,5 85,0 ± 6,6 89,0 ± 12,6 101,0 ± 5,8
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
85,5 ± 6,2 85,0 ± 11,4 99,5 ± 14,2 90,5 ± 4,0
1
QTS-Fe(III) 50
86,0 ± 4,7 84,0 ± 7,1 93,5 ± 5,9
*
QTS-Fe(III) 100
87,9 ± 10,9 96,0 ± 5,2 82,0 ± 13,2 92,0 ± 6,3
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-8), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
57
Tabela 13: Determinação sérica de triglicerídeos de fêmeas e machos tratados com
Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
TRIGLICERÍDEOS (mg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
57,0 ± 10,5 61,5 ± 7,3 65,5 ± 6,6 61,0 ± 4,5
1
QTS-Fe(III) 50
53,0 ± 8,2 59,0 ± 9,0 61,0 ± 6,7
*
QTS-Fe(III)) 100
52,0 ± 5,9 64,0 ± 8,0 66,0 ± 8,4 60,0 ± 4,6
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
70,0 ± 3,0 76,0 ± 12,5 67,0 ± 19,4 61,0 ± 9,7
1
QTS-Fe(III) 50
62,5 ± 6,4 70,5 ± 11,4 78,0 ± 9,0
*
QTS-Fe(III) 100
60,0 ± 10,2 71,0 ± 11,4 75,0 ±11,9 69,0 ± 3,5
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão.Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
Em seres humanos, o aumento dos níveis de ferro no fígado pode levar ao
desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (PIGEON et al., 2001). O ferro depleta
antioxidantes como as ubiquinonas promovendo a proliferação de células e agindo
como promotor do carcinoma nos hepatócitos (HUANG, 2003). As dosagens séricas de
ferro estão demonstradas na tabela 14.
58
Tabela 14: Determinação sérica de ferro de fêmeas e machos tratados com Quitosana-
Fe(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
FERRO (µ
µµ
µg/dL)
Fêmeas
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
145,0 ± 22,8 170,0 ± 33,2 199,0 ± 45,2 162,0 ± 9,8
1
QTS-Fe(III) 50
151,0 ± 24,5 173,0 ± 44,8 179,0 ± 55,5
*
QTS-Fe(III)) 100
158,0 ± 27,1 152,0 ± 30,8 235,0 ± 50,8 161,0 ± 12,7
1
Machos
Grupos 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Salina
125,0 ± 18,7 129,0 ± 37,1 150,0 ± 42,1 150,0 ± 26,0
1
QTS-Fe(III) 50
130,0 ± 14,9 149,0 ± 20,2 126,5 ± 17,1
*
QTS-Fe(III) 100
155,0 ± 20,0 135,0 ± 28,2 192,0 ± 41,9 169,0 ± 25,0
1
Os dados são expressos como média seguida do desvio padrão. Cada
grupo representa a média dos
animais tratados (n=3-7), seguida dos desvios padrão.
1
Grupo satélite. * (-).
A análise estatística revela que não há diferenças significativas entre os grupos.
Esses dados mostram que o complexo de QTS-Fe(III) é estável, ou seja, o ferro
permanece complexado ao polímero. Resultados semelhantes foram observados por
Bürger e colaboradores 2001, para a QTS-Fe(III) reticulada. Já Baxter e sua equipe
(2000), demonstraram que o tratamento com a ração contendo quitosana-ferro aumenta
os níveis séricos de ferro nos animais. Hsu, Patel e Youg (1999) utilizaram o complexo
citrato férrico como adsorvente de fosfato em animais azotêmicos e observaram
aumento nos níveis séricos de ferro. Pigeon et al (2001) relataram um aumento nos
níveis séricos de ferro em camundongos tratados com ração suplementada com 0,5 a
3,0% de carbonil-ferro durante oito semanas. A concentração sérica de ferro foi de
306µg/g no grupo controle e 4035µg/g para o grupo tratado com 3,0% de carbonil-ferro
nos dois meses iniciais do tratamento. Estes valores passaram, no final do tratamento,
para 558µg/g e 6720µg/g para controle e analisado, respectivamente.
Os resultados encontrados neste trabalho mostram que o polímero é mais
estável quando comparado aos dados relatados por Okada et al. (1983). Humanos
tratados com doses diárias de 40mg de óxido de ferro contendo açúcares durante 42
dias, apresentaram aumento nos níveis séricos de ferro de 27,8 para 84,1µg/dL após 14
59
dias de tratamento. Outro exemplo da estabilidade pode ser observado quando foi
comparado o valor da alteração dos níveis séricos de ferro de humanos tratados com
comprimidos contendo 85mg de ferro. Os resultados mostram que o ferro passa de
100µg/dL no início do tratamento para 240µg/gdL após 4 horas do tratamento
(PRUCHNICKI et al., 2002).
Resultados obtidos por Kirk, Heinecke e LeBoeuf (2001), mostraram que a
concentração de ferro no soro de ratos deficientes em Apo-E aumenta quando estes
animais recebem alimentação com suplementação de ferro, mostrando um efeito dose
dependente (284µg/dL e 473µg/dL). Considerando que o aumento da concentração
sérica de ferro pode ser causado pelo aumento da absorção intestinal do mesmo
(JENSEN, 2004), é de extrema importância a estabilidade do complexo férrico a ser
administrado.
5.3 Parâmetros hematológicos:
O hemograma constitui o meio mais direto e prático de se estudar os elementos
figurados do sangue periférico como as hemácias, os leucócitos e plaquetas. Estes
elementos celulares sofrem alterações, às vezes muito acentuadas, no decurso de
praticamente todas as moléstias. Efetivamente, tais alterações, quase sempre são
inespecíficas, comuns a um grande número de doenças (GUIMARÃES et al., 1990). Os
achados no hemograma fornecem informações diagnósticas valiosas sobre o sistema
hematológico e outros sistemas orgânicos, prognóstico, resposta ao tratamento e
recuperação (FISCHBACH, 2002).
As tabelas 15, 16, 17 e 18 mostram os parâmetros hematológicos, determinados
em animais machos e fêmeas, no trigésimo, sexagésimo e nonagésimo dias de
tratamento e grupo satélite.
60
Tabela 15: Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos tratados
com Quitosana-Fe(III) solúvel por 30 dias.
TRATAMENTO (mg/kg)
Fêmeas Machos
Parâmetros
analisados
Controle
QTS-Fe
(III) 50
QTS-Fe
(III) 100
Controle
QTS-Fe
(III) 50
QTS-Fe
(III) 100
Leucócitos (10
3
/µ
µµ
µL)
6,7 ±
1,6
5,6 ± 1,3 7,4 ± 1,1 7,0 ± 2.9 6,2 ± 1,1 6,4 ± 2,1
Hemácias
(10
6
/mm
3
)
6,3 ± 0,8 7,2 ± 0,4 7,0 ± 0,5 7,7 ± 0,7 7,7 ± 0,6 8,0 ± 0,4
Hemoglobina (g/dL)
11,5 ± 2,1 13,3 ± 0,7 12,7 ± 1,0 13,2 ± 2,0 13,8 ± 0,7 14,4 ± 0,4
Hematócrito (%)
35,5 ± 4,4 40,0 ± 2,17
39,3 ± 2,8 39,3 ± 4,1 41,4 ± 2,8 42,6 ± 2,5
VCM (fL)
55,8 ± 0,2 55,6 ± 1,4 55,1 ± 1,3 53,2 ± 0,4 53,5 ± 1,2 52,9 ± 0,5
HCM (pg)
18,2 ± 0,8 18,5 ± 0,5 18,5 ± 0,9 17,8 ± 0,9 17,9 ± 0,6 17,5 ± 0,4
CHCM (g/dL)
32,4 ± 1,20
33,0 ± 0,72
34,1 ± 1,6 33,4 ± 1,9 33,7 ± 0,8 33,5 ± 0,7
Plaquetas (10
3
/µ
µµ
µL)
654,0 ±
145,6
690,0 ±
102,6
658,0 ±
130,3
729,0 ±
141,3
588,0 ±
144,0
807,0 ±
101,0
Neutrófilos (%)
34,0 ± 1,2 37,0 ± 8,5 39,0 ± 5,9 41,0 ± 4,4 42,0 ± 4,1 40,0 ± 8,3
Linfócitos (%)
60,0 ± 6,3 57,0 ± 5,3 56,0 ± 5,8 54,0 ± 2,7 53,0 ± 4,7 53,0 ± 7,4
Eosinóflios (%)
3,0 ± 1,7 3,0 ± 1,0 2,0 ± 0,8 3,0 ± 0,4 2,0 ± 0,7 3,0 ± 0,4
Basófilos (%)
* * * * * *
Monócitos (%)
3,0 ± 0,6 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,3 2,0 ± 0,1 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,1
Os dados são expressos como Média ± Desvio Padrão de cada tratamento. n= 6-8 animais por grupo.
* (-). VCM (Volume Corpuscular Médio), HCM (Hemoglobina Corpuscular Mèdia), CHCM (Concentração
de hemoglobina Corpuscular Média).
61
Tabela 16: Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos tratados
com Quitosana-Fe(III) solúvel por 60 dias.
TRATAMENTO (mg/kg)
Fêmeas Machos
Parâmetros
Analisados
Controle
QTS-Fe
(III) 50
QTS-Fe
(III) 100
Controle
QTS-Fe
(III) 50
QTS-Fe
(III) 100
Leucócitos (10
3
/µ
µµ
µL)
5,0 ± 0,3 5,0 ± 0,8 4,2 ± 0,7 5,4 ± 1,5 5,2 ± 1,3 5,5 ± 1,1
Hemácias
(10
6
/mm
3
)
6,8 ± 0,3 6,6 ± 0,5 6,9 ± 0,4 7,7 ± 0,4 7,3 ± 0,5 7,0 ± 0,5
Hemoglobina (g/dL)
12,2 ± 0,7 12,4 ± 0,6 12,9 ± 0,8 13,4 ± 0,7 12,8 ± 0,8 12,2 ± 0,8
Hematócrito (%)
38,6 ± 2,3 37,2 ± 2,5 38,3 ± 2,8 40,5 ± 2,1 38,4 ± 2,7 39,3 ± 2,8
VCM (fL)
55,0 ± 4,3 55,4 ± 1,8 55,0 ± 1,0 52,2 ± 1,7 53,7 ± 0,8 52,4 ± 0,6
HCM (pg)
18,5 ± 1,6 18,5 ± 0,7 18,6 ± 0,4 17,6 ± 0,4 17,9 ± 0,3 17,7 ± 0,3
CHCM (g/dL)
32,6 ± 2,4 33,3 ± 0,6 33,9 ± 0,7 33,2 ± 0,2 33,3 ± 0,3 33,7 ± 0,7
Plaquetas (10
3
/µ
µµ
µL)
748,0 ±
73,7
709,0 ±
68,5
689,0 ±
73,1
726,0 ±
62,5
700,0 ±
82,4
739,0 ±
55,2
Neutrófilos (%)
56,0 ± 13,5
57,0 ± 8,5 61,0 ± 6,2 63,0 ± 6,9 60,0 ± 2,8 62,0 ± 7,3
Linfócitos (%)
37,0 ± 15,4
37,0 ± 9,5 33,0 ± 7,8 31,0 ± 0,7 34,0 ± 3,3 34,0 ± 6,6
Eosinóflios (%)
3,0 ± 0,7 3,0 ± 1,1 3,0 ± 1,2 3,0 ± 0,7 3,0 ± 0,7 2,0 ± 0,9
Basófilos (%)
* * * * * *
Monócitos (%)
4,0 ± 1,6 3,0 ± 1,2 3,0 ± 1,3 3,0 ± 1,3 3,0 ± 1,2 2,0 ± 1,4
Os dados são expressos como Média ± Desvio Padrão de cada tratamento. n= 6-8 animais por grupo.
*(-). VCM (Volume Corpuscular Médio), HCM (Hemoglobina Corpuscular Mèdia), CHCM (Concentração
de hemoglobina Corpuscular Média).
62
Tabela 17: Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos tratados
com Quitosana-Fe(III) solúvel por 90 dias.
TRATAMENTO (mg/kg)
Fêmeas Machos
Parâmetros
analisados
Controle
QTS-Fe
(III) 50
QTS-Fe
(III) 100
Controle
QTS-Fe
(III) 50
QTS-Fe
(III) 100
Leucócitos (10
3
/µ
µµ
µL)
4,0 ± 0,8 5,0 ± 0,8 4,1 ± 0,8 7,0 ± 0,8 5,6 ± 1,4 6,1 ± 0,9
Hemácias
(10
6
/mm
3
)
6,9 ± 0,5 7,1 ± 0,3 7,0 ± 0,5 7,4 ± 0,4 7,8 ± 0,2 7,8 ± 0,3
Hemoglobina (g/dL)
13,1 ± 0,9 13,1 ± 0,7 12,4 ± 1,3 13,0 ± 0,8 13,1 ± 0,6 14,0 ± 0,9
Hematócrito (%)
40,8 ± 3,3 40,3 ± 2,7 37,7 ± 4,0 40,2 ± 2,3 40,3 ± 2,5 42,9 ± 2,1
VCM (fL)
56,6 ± 5,1 56,3 ± 2,1 56,3 ± 1,6 53,6 ± 0,7 54,0 ± 1,1 53,5 ± 0,7
HCM (pg)
18,6 ± 0,5 18,3 ± 0,5
18,2 ± 0,3 17,5 ± 0,4 17,4 ± 0,7
17,3 ± 0,5
CHCM (g/dL)
32,5 ± 0,6 32,2 ± 0,6 32,4 ± 0,3 32,8 ± 0,6 32,1 ± 0,4 32,5 ± 0,6
Plaquetas (10
3
/µ
µµ
µL)
748,0 ±
90,9
747,0 ±
100,9
702,0 ±
143,1
774,0 ±
80,7
806,0 ±
89,0
763,0 ±
36,4
Neutrófilos (%)
46,0 ± 6,9 47,0 ± 6,3 42,3 ± 9,8 47,0 ± 7,4 46,0 ± 3,9 43,0 ± 4,9
Linfócitos (%)
46,0 ± 7,5 46,0 ± 6,5 50,0± 11,0
46,0 ± 6,4 49,0 ± 4,6 51,0 ± 7,2
Eosinóflios (%)
4,0 ± 1,7 3,0 ± 1,0 4,0 ± 2,2 3,0 ± 1,2 2,0 ± 1,2 2,0 ± 1,1
Basófilos (%)
* * * * * *
Monócitos (%)
4,0 ± 1,6 4,0 ± 2,0 4,0 ± 1,7 4,0 ± 0,3 3,0 ± 0,5 4,0 ± 0,8
Os dados são expressos como Média ± Desvio Padrão de cada tratamento. n= 9-10 animais por grupo.
*(-). VCM (Volume Corpuscular Médio), HCM (Hemoglobina Corpuscular Mèdia), CHCM (Concentração
de hemoglobina Corpuscular Média).
63
Tabela 18: Determinação dos parâmetros hematológicos de fêmeas e machos tratados
do grupo satélite.
TRATAMENTO (mg/kg)
Fêmeas Machos
Parâmetros
analisados
Controle
QTS-Fe
(III) 100
Controle
QTS-Fe
(III) 100
Leucócitos (10
3
/µ
µµ
µL)
5,4 ± 1,0 4,5 ± 0,8 5,4 ± 1,1 5,5 ± 0,7
Hemácias (
10
6
/mm
3
)
7,0 ± 0,1 6,8 ± 0,2 7,2 ± 0,5 7,5 ± 0,8
Hemoglobina (g/dL)
13,0 ± 0,7 12,9 ± 0,4 13,6 ± 1,0 13,2 ± 0,5
Hematócrito (%)
39,3 ± 0,8 38,0 ± 1,4 41,5 ± 1,7 43,9 ± 1,3
VCM (fL)
56,2 ± 1,1 54,2 ± 0,4 52,7 ± 2,8 51,9 ± 2,3
HCM (pg)
18,3 ± 1,0 18,1 ± 0,3 17,4 ± 0,2 17,3 ± 0,4
CHCM (g/dL)
31,3 ± 2,0 33,1 ± 0,7 32,9 ± 0,3 33,2 ± 0,8
Plaquetas (10
3
/µ
µµ
µL)
750,0 ±
69,8
745,0 ±
60,3
806,0 ±
13,8
815,0 ±
20,4
Neutrófilos (%)
54,0 ± 1,7 55,0 ± 1,0 66,0 ± 1,3 64,0 ± 1,6
Linfócitos (%)
37,0 ± 2,9 36,0 ± 1,1 26,0 ± 2,6 29,0 ± 1,2
Eosinóflios (%)
5,0 ± 0,4 5,0 ± 0,3 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2
Basófilos (%)
* * * *
Monócitos (%)
4,0 ± 0,9 4,0 ± 0,6 5,0 ± 0,8 4,0 ± 0,3
Os dados são expressos como Média ± Desvio Padrão de cada tratamento. n= 3-5 animais por grupo.
* (-). VCM (Volume Corpuscular Médio), HCM (Hemoglobina Corpuscular Mèdia), CHCM (Concentração
de hemoglobina Corpuscular Média).
Os leucócitos se relacionam a diversas funções de defesa e de reparação do
organismo. Apresentam importante papel na remoção de antígenos invasores, bem
como na produção de anticorpos (GUIMARÃES, 1990). Podem ser esperados padrões
específicos de resposta leucocitária em vários tipos de doenças (FISCHBACH, 2002). A
contagem diferencial de célula refere-se à enumeração e classificação dos leucócitos
encontrados no esfregaço sangüíneo. O estudo quantitativo de leucócitos inclui: medida
da concentração total e contagem diferencial dos tipos de células brancas do sangue.
Um objetivo do estudo dos leucócitos é ajudar a estabelecer um diagnóstico. Mais
64
freqüentemente, pode ser útil juntamente com outros dados clínicos e laboratoriais
(HENRY, 1999).
Os resultados da contagem de leucócitos totais encontrados nos animais
tratados em relação ao grupo controle mostram que não há diferenças estatísticas
significantes. O mesmo foi observado para o grupo satélite. A contagem diferencial de
leucócitos também não demonstrou diferenças estatísticas significantes quando os
grupos tratados com QTS-Fe(III) solúvel foram comparados com o grupo controle.
Quando essa comparação foi feita através de outro teste estatístico, observou-se
significância. Houve uma mudança do predomínio celular para neutrófilos (%), pois nas
dosagens do trigésimo dias o tipo celular predominante foi linfócito (%) para todos os
grupos. No tempo de 60 e 90 dias e 120 dias, este perfil se modificou e a porcentagem
celular predominante foi de células neutrofílicas. De acordo com Harkness e Wagner
(1999), animais como os ratos da raça Wistar possuem aproximadamente de 65 – 85%
de linfócitos e 9 – 34% de neutrófilos em condições fisiológicas normais. Essa mudança
no perfil leucocitário pode ser uma resposta ao tipo de procedimento utilizado para a
coleta das amostras sangüíneas, ou seja, uma resposta inflamatória. Todo trauma,
cirurgia ou queimadura induz uma resposta inflamatória. Os neutrófilos são
considerados componentes essenciais da resposta inflamatória, desencadeando
mecanismos de defesa no organismo contra agentes infecciosos (JULIO, 1999;
FISCHBACH, 2002). Uma investigação mais complexa a respeito do processo
inflamatório, seria a dosagem de algumas citocinas. As citocinas podem regular as
funções dos neutrófilos, ativando-os ou inibindo-as ou retardando a morte celular
programada o que permite a estas células continuar atuantes por um maior período de
tempo (SMITH, 1994).
As células vermelhas, através do seu principal componente, a hemoglobina, tem
como função vital o transporte do oxigênio para os tecidos, e a sua diminuição ou
deficiência, quase sempre, se traduz por anemia (GUIMARÃES et al., 1990). A
concentração de hemoglobina do sangue pode estar diminuída como conseqüência de
hemólise ou hemorragia, ou como resultado da disfunção da formação de sangue na
medula óssea (LEE et al., 1998). O hematócrito de uma amostra de sangue consiste na
relação entre o volume dos eritrócitos e o volume do sangue integral. Os índices
65
eritrocíticos (VCM, HCM e CHCM), introduzidos por Wintrobe para a determinação do
diâmetro, conteúdo e concentração de hemoglobina nos eritrócitos, vêm se mostrando
úteis na caracterização morfológicas das anemias. A avaliação da série eritocítica não
apresenta diferença estatística nos animais tratados em relação ao controle e também
no grupo satélite, sendo que, a anemia, ou diminuição, para um nível subnormal, da
concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, ou hematócrito, é uma condição
comum, constituindo-se freqüentemente numa complicação de outras doenças
(HENRY, 1999). Estes resultados estão em desacordo com aqueles relatados por
Okada e colaboradores (1983), no tratamento de pacientes com óxido de
ferro/polissacarídeo, que observaram um aumento do hematócrito e hemoglobina após
7 dias de tratamento (40 mg/dL I.V.). Lee e cols. (1999) também observaram aumento
no hematócrito no tratamento de ratos deficientes em apo-E tratados com ração
contendo ferro. Hsu, Patel e Young, 1999 relataram que o hematócrito foi maior em
ratos azotêmicos tratados com compostos férricos quando comparado ao grupo
controle, mostrando a liberação do ferro dos compostos. Contrariamente, isto não foi
observado nos animais que receberam o polímero QTS-Fe(III)- solúvel conforme aqui
apresentado.
As plaquetas têm função de homeostase, manutenção da integridade vascular, e
no processo de coagulação do sangue. Após um dano vascular, as plaquetas do
sangue rapidamente aderem ao subendotélio exposto com o fator de von Willebrand
plasmático servindo como uma “cola” (HENRY, 1999). Valores aumentados de
plaquetas são encontrados em doenças mieloproliferativas e trombocitoses reativas.
Valores diminuídos são encontrados quando a produção plaquetária está diminuída, na
destruição periférica aumentada e uso de certas drogas (SOARES et al., 2002). Os
valores plaquetários dos animais que receberam o polímero QTS-Fe(III) solúvel não
foram estatísticamente diferentes em relação aos animais do grupo controle, assim
como no grupo satélite.
66
5.3 Análise anatomopatológica dos órgãos:
Os testes de toxicidade prolongada envolvem a avaliação patológica grosseira de
todos os animais em teste. Além disso, durante e experimento, todos os animais são
usualmente sacrificados e uma completa autópsia é realizada (LOOMIS, 1996).
A autópsia é um exame minucioso do animal após a morte. Sua importância está
em verificar o peso e o estado geral dos órgãos e/ou a causa da morte em comparação
ao grupo controle. No término do experimento deve-se pesar órgãos principais como:
fígado, rins, coração, baço entre outros. O peso dos órgãos pode servir como índice útil
da toxicidade, porém, se deve observar com prudência a interpretação dos dados
(BRITO, 1998).
A partir da avaliação macroscópica dos órgãos alvo, não foram observadas
alterações como manchas, sangramento ou mesmo até necrose desses tecidos. Como
citado na metodologia, após a análise macroscópica os órgãos foram pesados e os
dados estão expressos nas tabelas abaixo.
Considerando que não houve alteração no peso corporal dos animais durante o
tratamento, foi realizado o pero relativo dos órgãos (g/g peso corporal). O peso relativo
dos órgãos foi obtido pelo peso do órgão (g) divido pelo peso corporal do animal (g),
multiplicado por 100. A tabela 19 mostra o efeito do tratamento sobre o peso relativo
dos órgãos em machos e fêmeas sendo que os resultados não demonstram
significância em ambos sexos em relação ao grupo controle, assim como no grupo
satélite. Estes resultados estão de acordo com os resultados encontrados por
Valcarenghi e Sandri (1999) e Piazza e Palaoro (2001) em estudos que utilizaram
derivados de quitosana contendo ferro no tratamento de ratos e camundongos,
mostrando a segurança do material quando administrado por diferentes períodos de
tratamento.
67
Tabela 19: Peso relativo dos órgãos de fêmeas e machos tratados com Quitosana-
Ferro(III) solúvel por 90 dias e grupo satélite.
Tratamento
Fêmeas
Órgão (g) Salina QTS-Fe(III) 50
QTS-Fe(III)
100
Grupo satélite
Salina
Grupo satélite
QTS-Fe(III)
100
Baço
0,25
± 0,03 0,23 ± 0,04 0,24 ± 0,02 0,25 ± 0,02 0,26 ± 0,03
Coração
0,42 ±0,02 0,42 ± 0,03 0,38 ±0,02 0,41 ± 0,03 0,40 ±0,02
Fígado
4,29 ± 0,34 4,16 ± 0,48 3,82 ± 0,53 4,00 ± 0,50 4,04 ± 0,60
Pulmões
0,96 ± 0,08 0,83 ± 0,06 0,91 ± 0,10 0,94 ± 0,08 0,99 ± 0,09
Rins
1,02 ± 0,08 0,97 ± 0,07 0,95 ± 0,08 0,99 ± 0,10 1,02 ± 0,11
Machos
Baço
0,15
± 0,15 0,19 ± 0,03 0,14 ± 0,05 0,18 ± 0,06 0,16 ± 0,06
Coração
0,35 ± 0,05 0,35 ± 0,09 0,28 ± 0,16 0,31 ± 0,09 0,33 ±0,08
Fígado
3,68 ± 0,73 4,07 ± 0,33 3,48 ± 0,6 4,60 ± 0,49 4,80 ± 0,54
Pulmões
0,73 ± 0,12 0,68 ± 0,13 0,71 ± 0,15 0,72 ± 0,15 0,75 ±0,12
Rins
0,82 ± 0,16 0,76 ± 0,07 0,76 ± 0,11 0,83 ± 0,10 0,84 ± 0,09
Os dados são expressos como Média ± Desvio Padrão de cada tratamento. n= 3-10 animais por grupo.
5.4 Análise de ferro nos órgãos:
Os principais sítios de estoque de ferro são o fígado, baço, pele e medula óssea;
mas também pode haver acúmulo no, coração, sistema endócrino, cérebro e fígado (LI,
AISEN e HINDMARSH, 2004). Descobertas recentes sugerem que a concentração de
ferro no fígado é o pivô para o desenvolvimento da lesão e disfunção não só no fígado
como no coração e outros órgãos. Em pacientes com altos níveis de ferro pode-se
encontrar nos miócitos (células do miocárdio) um número significativo de pigmentos de
ferro corados com Azul da Prússia (JENSEN, 2004). Garçon et al. (2000) demonstraram
níveis de citocinas altos em animais expostos à Fe
2
O
3
e assumiram que esses
poluentes são capazes de gerar um reação inflamatória e a produção de radicais livres
nos pulmões, podendo levar ao desenvolvimento de tumor. A exposição in vivo à
partículas de Fe
2
O
3
resultou em aumento da produção de MDA (malonadialdeído)
68
sugerindo a indução da lipoperoxidação nos pulmões (GARÇON et al., 2001). Segundo
LI e colaboradores (2004), um melhor entendimento de como o ferro está acumulado
pode proporcionar novas informações sobre as relações entre a sua deposição nos
órgãos e a sua toxicidade.
A quantidade de ferro nos órgãos dos animais machos e fêmeas tratados por 90
dias e os animais do grupo satélite são mostradas na tabela 20. De modo geral, não
ocorreram alterações significativas na quantidade de ferro nos órgãos estudados,
evidenciando que o complexo quitosana-ferro(III) solúvel é bastante estável, não
ocorrendo acúmulo deste metal nestes órgãos sugerindo que o mesmo não é liberado
do polímero.
Tabela 20: Determinação da quantidade de ferro nos órgãos de animais fêmeas e
machos tratados do grupo satélite e tratados com Quitosana-Ferro(III) solúvel por 90
dias e grupo satélite.
Tratamento
Fêmeas
Órgão (g) Salina QTS-Fe(III) 50
QTS-Fe(III)
100
Grupo satélite
Salina
Grupo satélite
QTS-Fe(III)100
Baço
1
3480
2
2626 3215 3150 2910
Coração
329 310 321 322 311
Fígado
290 360 415 321 337
Pulmões
428 359 334 362 400
Rins
267 290 300 302 312
Machos
Baço
2679
2
2385 2679 3115 3050
Coração
324 267 334 305 329
Fígado
348 290 415 399 400
Pulmões
267 238 241 332 298
Rins
353 337 334 299 340
1-pool dos órgãos dos animais (peso seco); 2-µg Fe g
-1
, n= 5-10 animais por grupo.
Os valores encontrados neste estudo estão em discordância com aqueles
observados por Piazza e Palaoro (2001) em estudos sobre a toxicologia aguda e sub-
69
crônica de camundongos tratados com QTS-Fe(III) solúvel. Estes autores observaram
um aumento nos níveis de ferro em alguns órgãos, especialmente baço e fígado. Esta
discordância pode estar relacionada ao polímero utilizado no experimento que, apesar
de conter uma quantidade menor de ferro era mais viscoso, portanto permanecia mais
tempo no estômago o que provocava o desprendimento do ferro do complexo em meio
ácido, conforme verificado em estudo in vitro do polímero QTS-Fe(III)-reticulado
relatados por Bürger e colaboradores (2001).
A estabilidade deste material frente à liberação do ferro pode ser comparada com
estudos relatados por Kirk, Heinicke e LeBoeuf, (2001), que trataram ratos deficientes
em Apo-E com ração suplementada com 0,02 e 2,0% de ferro durante 24 semanas. A
deposição de ferro nos órgãos já nas seis semanas iniciais apresentou-se aumentada
significativamente em fígado, revelando 243µg/g e 3227µg/g respectivamente, em
0,02% 2,0% de ração suplementada. Após 24 meses, a quantidade de ferro depositada
foi ainda maior ficando em 406µg/g e 5593µg/g para a ração com 0,02% e 2,0%,
respectivamente. O mesmo foi observado em órgãos como coração e pâncreas .
Também quando comparado com trabalhos reportados por Pigeon et al. (2001),
o polímero aqui utilizado é mais seguro. Eles observaram um aumento significativo da
concentração de ferro no fígado de camundongos tratados com ração suplementada
com 0,5 a 3,0% de carbonilferro durante oito semanas. Experimentos revelaram que a
alimentação de ratos com ração suplementada em ferro teve como conseqüência um
aumento na quantidade de ferro nos órgãos analisados (fígado e coração) (LEE et al.,
1999; 2003).
70
6 CONCLUSÕES
- A administração crônica do polímero demonstra através das observações
comportamentais que o mesmo não causa efeitos sobre o estado consciente e
disposição, atividade e coordenação do sistema motor e tônus muscular, reflexos e
atividade do sistema nervoso autônomo.
- Os animais dos grupos tratados tiveram ganho de peso semelhante aos
animais do grupo controle e este está relacionado somente com o consumo de alimento
e água. Não houve recusa de água ou alimento e não houveram mortes relacionadas
ao tratamento.
- O tratamento crônico com QTS-Fe(III) solúvel não intefere nas dosagens de
uréia, creatinina, sódio, potássio, cálcio e fósforo, demonstrando a manutenção da
função renal. A manutenção dos níveis plasmáticos de fósforo demonstram que não
ocorre adsorção do mesmo em condições fisiológicas normais.
- A função hepática foi avaliada através das dosagens das transaminases séricas
(AST e ALT) e proteínas totais. A manutenção dos níveis destes analitos durante o
tratamento informa preliminarmente que o polímero não é hepatotóxico.
- As dosagens séricas de ferro dos animais tratados não foram alteradas com o
tratamento crônico. Isto demonstra a estabilidade do complexo uma vez que não há
liberação do mesmo do polímero.
- Os parâmetros hematológicos não são alterados com a administração do
complexo QTS-Fe(III) solúvel, salvo a diferencial leucocitária nas dosagens de 60 e 90
e 120 dias, explicada pela reação inflamatória.
- A partir da avaliação macroscópica dos órgãos alvo não foi observado
alterações como manchas, sangramentos ou até mesmo necrose destes tecidos. A
quantificação de ferro no fígado, coração, baço, rins e pulmões nos animais tratados, foi
semelhante aos animais controle demonstrando a estabilidade do material uma vez que
não ocorre acúmulo deste metal.
- Os resultados da avaliação dos parâmetros do grupo satélite foi similar aos
resultados do tempo anteriores.
71
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86
ANEXO A
OBSERVAÇÕES COMPORTAMENTAIS
GRUPO:
DOSE:
SEXO:
DATA:
Parâmetros
avaliados
0 à 5
minutos
30 minutos
1 hora 24 horas
Pêlos
Ptose
Mov. Canto
gaiola
Defecação
Contorcões
abdominais
Morte
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