ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
AVALIAÇÃO in vitro DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE
EXTRATOS DE Byrsonima spp E Alchornea spp: ESTUDO
COMPARATIVO ENTRE AS TÉCNICAS DE DILUIÇÃO
EM TUBOS E MICROPLACAS.
HELEN PIMENTA DE MORAES
ARARAQUARA – SP
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
AVALIAÇÃO in vitro DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
DE EXTRATOS DE Byrsonima spp E Alchornea spp: ESTUDO
COMPARATIVO ENTRE AS TÉCNICAS DE DILUIÇÃO
EM TUBOS E MICROPLACAS.
HELEN PIMENTA DE MORAES
ORIENTADORA: Profa. Dra. Taís Maria Bauab
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e
Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte
dos requisitos necessários para a obtenção do Título de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ARARAQUARA – SP
2006
ads:
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Moraes, Helen Pimenta
M827a Avaliação in vitro da atividade antibacteriana de extratos de Byrsonima
ssp E Alchornea ssp: Estudo comparativo entre as técnicas de diluição em
tubos e microplacas / Helen Pimenta Moraes. – Araraquara, 2006.
96 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós
Graduação em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Tais Maria Bauab
. 1. Byrsonima ssp. 2. Alchornea ssp. 3. Atividade antimicrobiana. I.
Bauab, Tais Maria, orient. .II. Título.
CDD: 616
CAPES:40300005
“O amor é o verdadeiro milagre da vida,
o sentimento mais profundo que se conhece
e o antídoto eficaz para todo sofrimento.”
(Joanna de Ângelis)
Aos meus pais, Hermes e
Dirce, pelo incentivo e amor
incondicional.
Ensinaram-me a ter paciência,
dignidade e força de vontade
para atingir os meus objetivos.
Obrigada pelo carinho,
confiança, e por tudo que
fizeram por mim.
Aos meus irmãos, Hemerson,
Hermes Junior e Diego, pelo
carinho e pelos bons momentos
que passamos juntos.
Ao Raphael, pelo amor,
dedicação, companheirismo e
apoio em todos os momentos.
Agradeço a Deus, por vocês existirem e fazerem parte da minha vida.
“Se te afeiçoas, assim, aos ideais de aprimoramento e
progresso, não te afastes do TRABALHO que renova,
do ESTUDO que aperfeiçoa, do PERDÃO que ilumina,
do SACRIFÍCIO que enobrece e da BONDADE que santifica...”
(Chico Xavier)
À Deus pelo seu amor, pela
oportunidade desta existência,
pela saúde, pela Sua presença
e proteção em todos os momentos.
“Se a criatura humana considerasse todas as bênçãos
de que desfruta no corpo,as concessões que lhe são
colocadas a disposição,ela somente teria razões
para agradecer, jamais para reclamar”.
(Joanna de Ângelis)
À Profa. Dra. Taís Maria Bauab,
pela orientação, incentivo, compreensão,
paciência e amizade durante os tempos
de convivência.
“O valor das coisas não está no
tempo que elas duram, mas na
intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos
inesquecíveis, coisas inexplicáveis
e pessoas incomparáveis”
(Fernando
Pessoa)
AGRADECIMENTOS
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho, pela amizade, incentivo e apoio,
meu sincero agradecimento.
Ao Prof. Dr. Luis Vitor Silva Sacramento, pela amizade, disponibilidade e paciência
cedidas no acompanhamento do projeto e estágio de docência. E por me fazer admirar
ainda mais o campo da Botânica e das Plantas Medicinais.
À Profa. Clarice Queico Fujimura Leite pela colaboração.
Ao Prof. Dr. Wagner Vilegas pela colaboração.
Ao Instituto de Química da UNESP, pelo fornecimento dos extratos vegetais.
Aos alunos do Instituto de Química da UNESP, que se esforçaram para fornecer os
extratos vegetais e colaboraram com seu conhecimento.
À Dra Miriam Sanommiya pela amizade, apoio e colaboração.
Aos amigos do Laboratório de Botânica da FCF, Angélica, Allynson, e Douglas pela força
e amizade.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia da FCF, Karina, Marina, Fábio, Célio,
Marcus Vinícius e Clesley pela amizade e colaboração.
Aos funcionários da FCF, Marisa, Ednéia, Silvia e Bernadete pela ajuda na realização dos
estudos e pela amizade.
Ao funcionário Francisco Carlos Rocatelli (Chico), pelas fotos e, aos demais funcionários
da SAEPE pelo auxílio.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia da FCF, Valéria e Gustavo, pela paciência e
colaboração na leitura dos testes.
Aos colegas do curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, UNESP, Maria
Carolina, Andréa, Arnóbio, Beatriz, Cinara, Cris, Cynthia, Daniele, Dani, Gisele, Greici,
Luana, Karen, Mara, Nelson, Ketylin, Priscila, Thiago, Tina, Traudi, Vanessa, pelos bons
tempos de convivência.
As amigas Cristina, Daniele, Luana e Mara por compartilharem todos os momentos
importantes durante esta etapa de nossas vidas. Obrigada pela amizade, incentivo e
companheirismo durante todo o tempo de convivência.
Aos Professores do Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, UNESP, pelos
conhecimentos transmitidos.
Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, pela
ajuda, paciência e disposição.
Á CNPq pela bolsa concedida.
S U M Á R I O
Página
LISTA DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XI
LISTA DE TABELAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XII
LISTA DE ABREVIATURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIII
RESUMO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1. INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2. REVISÃO DE LITERATURA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1. Espécies vegetais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1.1. Alchornea glandulosa Poepp. & Endl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1.2. Alchornea triplinervia (Spreng.) M. Arg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.3. Byrsonima crassa Niedenzu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.4. Byrsonima intermedia A. Juss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.5. Byrsonima basiloba Juss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2. Atividade antimicrobiana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.1. Microrganismos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4. MATERIAL E MÉTODOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.1. Extratos vegetais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.1.1. Obtenção e procedência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.1.2. Cinética de leitura espectrofotométrica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2. Amostras bacterianas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.2.1. Determinação da curva de crescimento bacteriano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.3. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pelo método de diluição em microplacas utilizando leitura
espectrofotométrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.3.1. Padronização da suspensão bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.3.2. Preparo das soluções contendo substâncias de referência para controle
negativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.3.3. Método de diluição em microplacas utilizando leitura espectrofotométrica. . . . 33
4.4. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pela técnica de diluição em microplaca utilizando resazurina como revelador. 36
4.4.1. Método de diluição em microplacas utilizando resazurina como revelador. . . . 36
4.5. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pela técnica de diluição em tubos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.5.1. Método de diluição em tubos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5. RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.1. Cinética de leitura espectrofotométrica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.2. Avaliação da atividade antibacteriana in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.2.1. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pela técnica de diluição em microplacas utilizando leitura espectrofotométrica 43
5.2.2. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pela técnica de diluição em microplaca utilizando resazurina como revelador. 51
5.2.3. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pelo método de diluição em tubos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
6. DISCUSSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
7. CONCLUSÕES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
9. ANEXOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Alchornea glandulosa Poepp. & Endl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2 Alchornea triplinervia (Spreng.) M. Arg. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3 Byrsonima crassa Niedenzu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4 Byrsonima intermedia A. Juss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
5 Byrsonima basiloba Juss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
6 Configuração esquemática do preparo da microplaca na determinação da
atividade antibacteriana e da CIM utilizando leitura espectrofotométrica. 35
7 Leitor de Microplacas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
8 Configuração esquemática do preparo da microplaca na determinação da
atividade antibacteriana e da CIM utilizando resazurina como revelador. 38
9 Esquema das diluições seriadas dos extratos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
10 Atividade antibacteriana do extrato de Alchornea glandulosa. . . . . . . . . 44
11 Atividade antibacteriana do extrato de Alchornea triplinevia. . . . . . . . . . 45
12 Atividade antibacteriana do extrato de Byrsonima crassa. . . . . . . . . . . . . 46
13 Atividade antibacteriana do extrato de Byrsonima intermedia.. . . . . . . . . 47
14 Atividade antibacteriana do extrato de Byrsonima basiloba. . . . . . . . . . . 48
15 Técnica de diluição em microplaca utilizando resazurina como revelador
para determinação da concentração inibitória mínima (CIM). . . . . . . . . . 53
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1
Absorbância dos extratos vegetais na concentração de 1000µg/mL e do
meio de cultura (CMH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
2 Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória
mínima (CIM), pela técnica de diluição em microplaca utilizando leitura
espectrofotométrica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3 Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória
mínima (CIM), pela técnica de diluição em microplaca utilizando
resazurina como revelador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 51
4 Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória
mínima (CIM), pela técnica de diluição em tubos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
A. glandulosa Alchornea glandulosa
A. triplinervia Alchornea triplinervia
B. crassa Byrsonima crassa
B. intermedia Byrsonima intermedia
B. basiloba Byrsonima basiloba
MeOH Metanólico
MeOH/H
2
0 Hidrometanólico
CHCl
3
Clorofórmico
CIM Concentração Inibitória Mínima
CMH Caldo Mueller Hinton
MHA Mueller Hinton Agar
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth
PBS Tampão fosfato de sódio
DMSO Dimetilsulfóxido
E. coli Escherichia coli
S. aureus Staphylococcus aureus
Y. enterocolitica Yersinia enterocolitica
A. hydrophila Aeromonas hydrophila
OMS Organização Mundial da Saúde
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
ATCC American Type Culture Collection
________________________________________
________________________________________
_________________________________
_________________________________
RESUMO
RESUMO
O Brasil apresenta uma grande diversidade de plantas medicinais, cuja utilização
pela população vem aumentando cada vez mais. Byrsonima (Malpighiaceae) e Alchornea
(Euphorbiaceae) que são plantas do Bioma-Cerrado do estado de São Paulo apresentam
compostos com grande potencial de atividade biológica, sendo entretanto, pouco
estudadas. A atividade antimicrobiana é uma etapa de extrema importância na
caracterização biológica de produtos naturais com potencial farmacológico. Nossos
objetivos foram investigar a atividade antibacteriana de extratos metanólicos e
clorofórmicos de Byrsonima spp. e Alchornea spp empregando as técnicas de diluição em
tubos e em microplacas com leitura espectrofotométrica e visual utilizando resazurina
como revelador. Foram utilizadas as bactérias: Escherechia coli, Staphylococcus aureus,
Yersinia enterocolitica e Aeromonas hydrophila. Nos ensaios em microplacas e em tubos
foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos vegetais testados à
concentração de 1000µg/mL a 31,25µg/mL. Objetivou-se também comparar a eficácia das
metodologias empregadas. Nosso estudo demonstrou maior atividade antibacteriana dos
extratos metanólicos tanto de Byrsonima quanto de Alchornea, ressaltando os dados
obtidos com B. crassa (MeOH) e B. basiloba (MeOH) que apresentaram acentuada
atividade antibacteriana frente aos diferentes microrganismos testados. As metodologias
empregadas foram eficazes para essa finalidade sendo as de diluição em microplacas mais
vantajosas, pelo emprego de pequenos volumes principalmente os de extratos vegetais que
são obtidos em pequenas quantidades. Dentre os dois métodos de microdiluição, a que
empregava leitura espectrofotométrica apresentou-se mais sensível, porém a de leitura
visual mostrou-se mais prática na leitura final e na interpretação dos resultados.
Palavras-chave: Byrsonima spp, Alchornea spp, atividade antimicrobiana, diluição em
microplacas, diluição em tubos.
2
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
ABSTRACT
ABSTRACT
Brazil presents a great diversity of medicinal plants, whose use by people increases
more and more. Byrsonima (Malpighiaceae) and Alchornea (Euphorbiaceae) are plants of
Bioma-Cerrado of the state of São Paulo and present composites with great potential of
biological activity, but, however, they are little studied. The antimicrobial activity is a
stage of extreme importance in the biological characterization of natural products with
pharmacological potential. Our objectives were to investigate the antibacterial activity of
methanolic and chlorophormic extracts of Byrsonima spp and Alchornea spp using the
techniques of dilution in tubes and in microplates with spectrophotometric and visual
readings using resazurin. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica
and Aeromonas hydrophila were tested. In the microplate and tubes assays, the minimum
innhibitory concentration (MIC) of plant extracts were tested in concentrations between
1000µg/mL and 31.25µg/mL. It was also compared the effectiveness of the methodologies
employed. Our study demonstrated greater antibacterial activity of methanolic extracts of
both Byrsonima and Alchornea, standing out the data obtained for B. crassa (MeOH) and
B. basiloba (MeOH), which presented accented antibacterial activity against the different
tested microrganisms. The methodologies employed were efficient for this purpose and the
microplate dilution assay is more advantageous, for the fact it uses smaller volumes,
mainly for those vegetal extracts that normally are obtained in small amounts. Amongst the
two methods of microdilution, the one that used spectrophotometric reading proved to be
more sensitive, however, the visual reading procedure was shown to be more practical in
the final reading and interpretation of the results.
Key-words: Byrsonima spp, Alchornea spp, antimicrobial activity, microplate dilution,
tubes dilution.
4
______________________________________________________________
______________________________________________________________
INTRODUÇÃO
1– INTRODUÇÃO
As plantas são mundialmente empregadas na medicina popular e apesar do uso
indiscriminado das mesmas, até hoje são escassos os estudos sobre as suas constituições
químicas e atividades biológicas (MONTOURO et al., 2005).
A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a sua
complexidade, estimando-se a existência de mais de 2 milhões de espécies distintas de
plantas, animais e microrganismos. O Brasil é o país com maior diversidade genética
vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas (GUERRA e
NODARI, 2004).
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos,
muitos dos quais se constituem em modelos para síntese de um grande número de
fármacos. Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se impressionados pelo fato
desses produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase inacreditável de
diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas. Apesar
do aumento do estudo nesta área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das
plantas foram estudadas quanto a seu potencial medicinal (GUERRA e NODARI, 2004).
O uso indiscriminado de plantas sem qualquer conhecimento fitoquímico,
farmacológico e principalmente toxicológico é de grande preocupação para a saúde. Isto
acontece com a maioria das espécies vegetais consumidas pela população. A identificação
correta destas espécies, sua forma de uso, posologia e controle de qualidade também
constituem questões a serem resolvidas (BALLVÉ et al., 1995). Os efeitos gerados pelos
constituintes de uma planta no organismo vivo são verificados baseando-se nos
conhecimentos populares de uso repetitivo e tradicional. Sabe-se que os vegetais e frutas
possuem classes de agentes fitoquímicos com diversas ações terapêuticas, como efeitos
6
antioxidantes, antimutagênicos e até anticarcinogênico (KUSAMRAN et al., 1998). A
realização de estudos etnobotânicos possibilita o resgate e a preservação dos
conhecimentos populares, entretanto existe pouca informação quanto ao seu potencial de
risco à saúde (SIMÕES, 1999).
Especialmente nas últimas décadas, inúmeros esforços têm sido dirigidos para
conferir às plantas seu real papel e valor na terapia. O aumento do consumo dos
fitoterápicos tem aumentado gradativamente no Brasil. Para a Organização Mundial de
Saúde (OMS), as plantas medicinais seriam a melhor fonte de obtenção de fármacos para a
humanidade. A OMS estima que 80% das pessoas que vivem em países desenvolvidos
fazem uso da medicina tradicional, sendo que as plantas medicinais constituem um dos
principais componentes dos medicamentos, devendo, por isso, ser bem estudadas quanto a
sua segurança e eficácia (SANTOS et al., 1995). Para o tratamento de infecções comuns,
muitas plantas são utilizadas no Brasil na forma de extrato bruto, infusões ou emplastros,
sem nenhuma evidência científica de sua eficácia. Existem casos em que as preparações
utilizando extrato bruto são mais eficazes do que aquelas preparadas com qualquer de seus
princípios ativos isoladamente (CORDEIRO, 2005).
A vasta gama de informações sobre o uso de centenas de plantas como “remédios”
em todos os lugares do mundo, leva à necessidade de se desenvolver métodos que facilitem
a enorme tarefa de avaliar cientificamente o valor terapêutico de espécies vegetais. Como a
maior parte das plantas é ainda desconhecida do ponto de vista químico, bem como o saber
tradicional associado à flora útil, predominantemente em países em desenvolvimento, a
perda da biodiversidade e o acelerado processo de mudança cultural acrescentam um senso
de urgência em garantir o registro desse saber, inclusive científico (ELISABETSKY,
2004).
Segundo a OMS, plantas medicinais são todas aquelas silvestres ou cultivadas, que
7
se utilizam como recurso para prevenir, aliviar, curar ou modificar um processo fisiológico
normal ou patológico, ou utilizada como fonte de fármacos e de seus precursores.
Enquanto fitoterápicos são produtos medicinais acabados e etiquetados, cujos componentes
ativos são formados por partes aéreas ou subterrâneas de plantas, ou outro material vegetal,
ou combinações destes, em estado bruto ou em formas de preparações vegetais
(CORDEIRO, 2005). O desenvolvimento de um fitoterápico pode ser obtido com custos
menores que um fármaco sintético (YUNES e CALIXTO, 2001).
As plantas produzem um vasto número de substâncias naturais com potencial
antimicrobiano e imunomodulador na tentativa de se adaptarem às agressões do meio
ambiente. Essas substâncias podem ser isoflavonóides, indóis, fitoesteróis, polissacarídeos,
sesquiterpenos, alcalóides, glucanas, taninos, vitaminas e minerais que agem como
antioxidantes e coenzimas, além de muitas outras (WILLIAMS, 2001).
Segundo LIMA (2001) as substâncias antimicrobianas ou antibióticas representam
talvez o maior avanço da farmacoterapia nas últimas cinco décadas ou mais, com
progressos sem limites dentro da terapêutica medicamentosa. O referido grupo de
medicamentos condiciona, de forma efetiva, o efeito de espécies microbianas patogênicas e
oportunistas responsáveis pelas mais variadas patologias que tanto provocaram e provocam
a incapacidade prolongada ou óbito de seres humanos, sem restrição de faixa etária,
situação financeira ou estado de saúde do indivíduo atingido. Os antimicrobianos
constituem um grupo especial de agentes terapêuticos, geralmente produzidos e obtidos a
partir de organismos vivos. São substâncias que, em pequenas concentrações, devem
possuir atividade letal ou inibitória contra muitas espécies microbianas, prevenir o
desenvolvimento de microorganismos resistentes, ausência de efeitos indesejáveis ao
hospedeiro, estabilidade química, entre outras. A atividade antimicrobiana é um item
relevante na caracterização de extratos vegetais, dada a importância e o número bastante
8
grande de doenças infecciosas que acometem o homem (COWAN, 1999).
Segundo LIMA (2001) o conhecimento sobre determinadas espécies vegetais com
propriedades antimicrobianas tem sido revisto e ampliado, devido aos crescentes
problemas associados ao uso de diversos antibióticos. Em amplo estudo sobre plantas
medicinais fizeram uma avaliação concreta sobre a atividade antimicrobiana de extratos,
óleos essenciais e de substâncias obtidas de espécies vegetais contra bactérias Gram-
positivas, Gram-negativas e espécies fúngicas. Quanto ao potencial antibiótico destacaram-
se os resultados obtidos com óleos essenciais, alcalóides, cumarinas, triterpenos, citral,
mirceno, timol, xantanol, ácido caurêmico, entre outros que, em baixas concentrações,
exercem inibição sobre o crescimento de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas,
micobactérias, leveduras e fungos filamentosos, confirmando a grande importância que tais
produtos possuem como perspectivas para a produção de novos e eficientes produtos
farmacêuticos que possam ser usados na medicina para terapêutica de processos
infecciosos. De modo geral, os agentes antimicrobianos podem manifestar sua atividade
através de vários mecanismos: lesão da parede celular, alterações da permeabilidade
celular, alterações das moléculas de proteínas e ácidos nucléicos, inibição da síntese de
ácidos nucléicos.
Vários métodos são utilizados na determinação da atividade antimicrobiana “in
vitro”, sendo aplicados em estudos piloto na triagem de novas substâncias ativas. A técnica
de difusão em ágar e métodos de diluição em meio liquido são comumente utilizados para
a avaliação da atividade antimicrobiana de compostos químicos, entretanto, consomem
quantidades consideráveis de substância teste. Atualmente, técnicas espectrofotométricas
de diluição, desenvolvidas em microplacas, possibilitam a utilização de volumes reduzidos
na determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de produtos químicos que são
de grande valia quando se trata de produtos naturais, especialmente os de origem vegetal
9
que são extraídos em pequenas quantidades. Estas técnicas permitem a análise de vários
compostos e de uma ampla variedade de espécies bacterianas concomitantemente,
utilizando pequenos volumes de extratos, sendo ainda de baixo custo e apresentando
resultados reprodutíveis (CHAND et al., 1994; COWAN, 1999; DEVIENNE e RADDI,
2002).
Uma modificação proposta por FRANZBLAU et al., (1998), padronizada para
Mycobacterium sp em microplacas utilizando o corante Alamar Blue como revelador,
possibilita a leitura visual ao invés da leitura espectrofotométrica. Como alternativa, o
Alamar Blue tem sido substituído pela resazurina (sal sódico), uma vez que a resazurina é
o princípio ativo do Alamar Blue. Para tal o crescimento dos microrganismos é revelado,
pela demonstração da redução do meio com a resazurina que passa de azul para róseo,
permitindo uma análise visual do resultado (MONTEJANO et al., 2005 e PALOMINO et
al., 2002).
Diversos estudos botânicos, químicos, farmacológicos e ecológicos vêm sendo
realizados e cada vez mais demonstram e justificam a importância e o potencial da flora
brasileira. A constante necessidade de se descobrir novas drogas de origem natural leva a
um aumento no interesse pelos estudos sobre princípios ativos isolados de plantas com
atividade biológica. O Projeto temático – Programa Biota/Fapesp “Uso sustentável da
biodiversidade brasileira: prospecção químico-farmacológica em plantas superiores” visa
contribuir com a caracterização do Bioma-Cerrado do Estado de São Paulo. O grupo de
pesquisa é constituído por químicos, farmacêuticos, farmacólogos e botânicos que de
forma integrada trabalham para a caracterização bem como na preservação do Bioma-
Cerrado do Estado.
10
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
REVISÃO DE LITERATURA
2 - REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – Espécies vegetais
2.1.1 - Alchornea glandulosa Poepp. & Endl.
A espécie Alchornea glandulosa Poepp. & Endl. (Figura 1), é pertencente à família
Euphorbiaceae sendo popularmente conhecida como tapiá, tanheiro-de-folha-redonda,
tanheiro, maria-mole, iricurana, boleiro, araribá, bugé, tamanqueiro, tapiá-guaçú, tapiá-
mirim, caixeta, canela-raposa (LORENZI, 2000a), amor seco (COGENERO et al., 2003).
Apresenta sinonímia científica de Alchornea iricurana Casar. Apresenta-se como uma
planta dióica de 10-20m de altura, com tronco de 50-70cm de diâmetro. Folhas simples,
recurvadas nos bordos, de 8-16 cm de comprimento por 6-12 cm de largura. É uma árvore,
de caule tortuoso, que ocorre em florestas ciliares do Brasil (COGENERO et al., 2003).
Ocorre nos Estados do Rio de Janeiro, de Minas Gerais, até o Estado do Rio Grande do
Sul, principalmente na floresta pluvial da encosta atlântica e em menor freqüência na
floresta latifoliada da bacia do Rio Paraná. Planta perenifólia, heliófita, seletiva, higrófita,
pioneira, característica de beira de rios e planícies aluviais da floresta pluvial atlântica. É
particularmente freqüente nas formações secundárias como capoeiras e capoeirões. Ocorre
também na mata primária, principalmente nas beiradas e clareiras. Floresce pelo menos
duas vezes ao ano, durante os meses de maio a junho e outubro a novembro. Os frutos, por
conseguinte amadurecem em setembro até meados de outubro e dezembro a janeiro
(LORENZI, 2000a).
12
Figura 1: Alchornea glandulosa Poepp. & Endl.
Fonte: LORENZI, 2000a.
13
2.1.2 – Alchornea triplinervia (Spreng.) M. Arg.
A espécie Alchornea triplinervia (Spreng.) M. Arg. (Figura 2), pertencente à
família Euphorbiaceae e é popularmente conhecida como tanheiro, tapiá, boleiro, tanaeiro,
tapiá-guaçú, tapiá-guaçú-branco, tapiá-mirim, tapiá-vermelho, caixeta, jangada, pau-
jangada, algodoeiro, tapiaeiro, boleira, canela-raposa, tamanqueiro, pau-de-tamanco, pau-
do-tanho. Possui sinonímia científica de Antidesma tripinervium Spreng., Alchornea
nemoralis Mart., e Alchornea janeirensis Casar. Planta dióica de 15 a 30m de altura, com
tronco de 40 a 100cm de diâmetro. Folhas subcoriáceas, de 3 a 6 cm de comprimento
levemente pubescentes na face inferior sustentadas por pecíolo de 2 a 4cm de
comprimento. Ocorre da Bahia ao Rio Grande do Sul, na floresta pluvial da encosta
atlântica (LORENZI, 2000a; BRACA et al., 2002). Menos comuns nas demais florestas
pluviais do interior, desde o nível do mar até 1000m de altitude. Planta perenifólia,
heliófita, pioneira e praticamente indiferente às condições físicas do solo. É característica
da floresta pluvial atlântica que sofreu interferência do homem, sendo pouco comum nas
florestas clímaxes e abundante nas capoeiras. Produz anualmente moderada quantidade de
sementes, amplamente disseminadas por pássaros. Floresce anualmente durante os meses
de outubro e novembro (LORENZI, 2000a).
14
Figura 2: Alchornea triplinervia (Spreng.) M. Arg.
Fonte: LORENZI, 2000a.
15
2.1.3 – Byrsonima crassa Niedenzu (IK)
A espécie Byrsonima crassa Niedenzu (IK) (Figura 3), é pertencente à família
Malpighiaceae, sendo popularmente conhecida como murici-vermelho ou murici cascudo
(SILVA et al., 2001 e LOPES et al., 2001), e algumas partes integrantes são utilizados
como sucos, geléias e licores no Norte e Nordeste do Brasil. Este gênero produz
principalmente sulfonoglicolipídeos, esteróides, triterpenos, ésteres aromáticos,
aminoácidos e proanthocyanidinas. As folhas e cascas da Byrsonima crassa são utilizadas
na medicina popular brasileira no tratamento de gastrite, úlcera péptica, diarréia e até
mesmo em problemas cutâneos (SANNOMIYA et al., 2004; SANNOMIYA et al., 2005a).
Investigações fitoquímicas preliminares identificaram flavonóides com atividade
antioxidante em extratos polares das folhas destas espécies. Visto que a atividade
antioxidante está relacionada com a ação antiúlcera dos extratos das plantas, ensaios
biológicos com componentes puros podem contribuir para melhor entendimento dos
processos de cicatrização (SANNOMIYA, et al., 2004).
Figura 3: Byrsonima crassa Niedenzu
Imagem obtida do site: www.google.com Imagem obtida por scaneamento da planta
Autor da foto: Drª Miriam Sannomiya
16
2.1.4 - Byrsonima intermedia A. Juss.
A espécie Byrsonima intermedia A. Juss. (Figura 4), é pertencente à família
Malpighiaceae. É conhecida como muricizeiro, murici, murici-do-campo, baga-de-tucano
(LORENZI et al., 2002), cangiqueira (LORENZI, 2000b). Planta perene, arbustiva, muito
ramificada, nativa dos cerrados do Brasil. Propaga-se apenas por sementes (LORENZI,
2000b). É um arbusto de 1 a 4m de altura, muito ramificado de ramos ascendentes e eretos,
de base lenhosa com grande xilopódio. É encontrada principalmente em terrenos secos e
solos arenosos. As folhas são coriáceas, de 3 a 6cm de comprimento. As flores são
amarelas, com glândulas visíveis no cálice, reunidas em racemos terminais de 5 a 10cm de
comprimento. Os frutos são drupas globosas, de cor amarela, com cerca de 1cm de
diâmetro, contendo uma única semente. Os frutos, de sabor agridoce, são consumidos no
meio rural. Todas as partes desta planta são empregadas pelas populações para a resolução
de várias moléstias. O infuso de suas folhas é empregado contra diarréia, infecções
intestinais e como protetor da mucosa intestinal. Já o infuso de suas raízes é indicado para
feridas crônicas (chagas), afecções da boca e da garganta, por aplicação no local afetado
com algodão embebido. É também indicado para corrimento vaginal em banho de assento
2 a 3 vezes ao dia (LORENZI et al., 2002). É uma planta comum nos cerrados brasileiros e
se perpetua nestas áreas após o seu desbravamento e posterior transformação em pastagens.
Pode ser encontrada como indesejável também em beira de estradas, carreadores e terrenos
baldios. A casca dos ramos dessa planta é bastante espessa e rica em taninos, podendo ser
utilizada para curtir couro em curtumes (LORENZI, 2000b).
17
Figura 4: Byrsonima intermedia A. Juss.
Fonte: LORENZI, 2002.
18
2.1.5 – Byrsonima basiloba Juss.
A espécie B. basiloba Juss. (Figura 5), é pertencente à família Malphighiaceae,
sendo conhecida popularmente como murici e murici-do-campo. Mede cerca de 6 a 10m,
com tronco cilíndrico de 30 a 40cm de diâmetro. Folhas simples, coriáceas, glabras na face
superior e denso-tomentosas e prateadas na inferior, de 12 a 18cm de comprimento por 3 a
7cm de largura. Encontrada nos cerrados do Brasil Central. A madeira é indicada para uso
interno em construção civil e os frutos são avidamente consumidos por várias espécies da
fauna (LORENZI, 2000a). Seus frutos são maiores do que das outras espécies do gênero,
apresentam epicarpo fino e em função do mesocarpo rico em vitamina C, são utilizados na
alimentação humana, in natura ou na forma de refrescos, sorvetes e compotas (PEREIRA e
SILVEIRA, 2003). A árvore de pequeno porte e copa estreita é útil para arborização
urbana, principalmente para ruas estreitas. Pode também ser empregada em plantios
destinados à recomposição de áreas degradadas de preservação permanente. Planta
decídua, heliófita, seletiva xerófita, característica de terrenos altos do cerrado. Apresenta
dispersão ampla, porém irregular e descontínua, ocorrendo em baixa freqüência. É
encontrada tanto em formações primárias como secundárias. Produz anualmente grande
quantidade de sementes viáveis, amplamente disseminadas pela fauna. Floresce quase o
ano inteiro, porém predominando nos meses de verão. A maturação dos frutos, em
conseqüência, acontece também na maioria dos meses do ano, porém com maior
intensidade em abril a junho (LORENZI, 2000a). Análises cromatográficas dos extratos
polares de B. basiloba revelaram a presença de catequinas e flavonóides (FIGUEIREDO et
al., 2005).
19
Figura 5: Byrsonima basiloba Juss.
Fonte: LORENZI, 2000a.
20
2.2 – Atividade antimicrobiana
A história do desenvolvimento e uso de substâncias antimicrobianas na prática
médica antecedeu a descoberta de espécies microbianas, uma vez que Hipócrates (460-337
a.C.) recomendava a lavagem de ferimentos com vinho para impedir o processo infeccioso.
Documentos datados de 2.500 a 3.000 anos atrás, mostram que alguns povos como os
chineses e indianos, ainda primitivos, utilizava mofo, papa de soja e produtos correlatos
para o tratamento de lesões infectadas e processos inflamatórios (SANCHES, 2004).
Nas antigas civilizações, as doenças infecciosas eram associadas com ocorrências
naturais tais como o aparecimento de um cometa ou um evento místico e que poderiam
desagradar uma divindade, e as regras para evitar essas doenças eram a higiene e
quarentena porque se acreditava que a transmissão da doença era apenas por contato
(SARDI, 2004).
Desde o princípio das civilizações, os vegetais têm sido utilizados não só como
fonte alimentícia, como também medicamentosa. As diversas enfermidades têm sido
tratadas com chás (infuso, decocto, macerado), sucos, tinturas, banhos, cataplasmas e
ungüentos, preparados a partir de parte de plantas. A referida conduta terapêutica remonta,
principalmente, aos antigos povos da China, Egito, Ásia, e Roma, onde eruditos, com base
em seus conhecimentos classificaram numerosas espécies vegetais, com a respectiva
indicação do uso medicinal. Embora a presença de substâncias antimicrobianas nos
vegetais superiores não seja um fato recente, a busca das mesmas teve grande impulso após
a descoberta da penicilina (LIMA, 2001).
As plantas são possuidoras de várias vias metabólicas secundárias que dão origem a
compostos, incluindo alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, terpenos, poliacetilenos,
óleos, que por vezes são específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies, e cujas
funções, até pouco tempo, eram desconhecidas (LIMA, 2001).
21
Os extratos etanólicos de Apis mellifera tem sido estudado por apresentarem várias
atividades biológicas, tais como atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral,
antioxidante, um excelente anestésico local, e estimulador do sistema imunológico.
Acredita-se que as substâncias químicas isoladas e identificadas das amostras de própolis,
como flavonóides, ácidos aromáticos, ácidos terpênicos, compostos fenólicos estão
relacionadas com todas estas atividades biológicas (SILICI et al., 2005).
Várias espécies de Byrsonimas têm sido estudadas e avaliadas quanto à atividade
antimicrobiana.
Testes de atividade antimicrobiana realizada “in vitro” demonstraram que o extrato
de B. verbascifolia foi capaz de inibir o crescimento de Streptococcus faecalis,
Mycobacterium phlei, Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (MARTÍNEZ-VÁSQUEZ
et al., 1999; LOPES et al., 2001). O extrato B. crassifolia apresentou atividade
antimicrobiana contra Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi,
Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, S. epiderminis, Streptococcus pneumoniae e
Micrococcus luteus (MARTINÉZ-VÁSQUEZ, et al., 1999). O extrato de B. crassa
apresentou uma significante atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis, Bacillus
cereus, Shigella sp., Staphylococcus epiderminis, Proteus mirabilis, Salmonella sp.
Enterococcus faecalis e Candida albicans (SANNOMIYA et al., 2005a).
COGENERO et al. (2003) demonstraram atividade antimicrobiana moderada de A.
glandulosa para o extrato bruto metanólico frente aos microorganismos S. aureus
(CIM=250µg/mL) e Candida albicans (CIM=125µg/mL) e significativa para fração
alcaloidal frente a Bacillus subtilis (CIM=62,5µg/mL) e Candida tropicalis
(CIM=31,2µg/mL) utilizando o método de microdiluição em caldo Mueller-Hinton.
È possível isolar das plantas uma variedade de compostos químicos com
propriedades antimicrobianas e antifúngicas e este fato, nos últimos anos vêm despertando
22
um enorme interesse nos cientistas em conseguir produzir novas drogas antimicrobianas
mais seguras e potentes e totalmente eficazes contra patógenos resistentes (AHMAD e
BEG, 2001).
3.2.1 - Microrganismos
a) Escherichia coli
O gênero Escherichia compreende bacilos Gram negativos, sendo a Escherichia
coli a espécie de maior importânca prática. Escherichia coli é uma bactéria facultativa,
sendo considerada um dos habitantes mais comuns do trato intestinal (TORTORA et al.,
2000). A espécie E. coli é constituída por uma variedade relativamente grande de cepas
patogênicas. De fato, é isto o que acontece, uma vez que a E. coli pode causar infecções
urinárias, septicemias, meningites e outros tipos de infecção. Provavelmente nenhuma
outra espécie bacteriana é tão versátil em sua patogenicidade como a E. coli. Com relação
às infecções intestinais, pelo menos seis categorias de Escherichia coli são conhecidas: E.
coli enteroinvasora (EIEC), enterotoxigênica (ETEC), enteropatogênica (EPEC), entero-
hemorrágica (EHEC), enteroagregativa (EAggEC) e que adere difusamente (DAEC). Estas
raramente causam infecção extra-intestinal, que é causada por E. coli encontrada
normalmente no intestino e que pode se localizar em qualquer órgão ou tecido do corpo
humano. Entretanto três grupos de infecções são mais freqüentes: infecções urinárias,
meningite do recém-nascido e bacteremia (TRABULSI & ALTERTHUM, 2005).
b) Staphylococcus aureus
Os estafilococos são cocos Gram-positivos, que tendem a formar agrupamentos
semelhantes a cachos de uva. Os estafilococos são amplamente distribuídos na natureza e
23
fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas (TRABULSI & ALTERTHUM,
2005). Uma das espécies de maior importância entre os estafilococos é o Staphylococcus
aureus, denominado assim pela pigmentação amarela de suas colônias. Crescem
comparativamente bem sob condições de alta pressão osmótica e pouca umidade o que
parcialmente explica porque podem crescer e sobreviver nas secreções nasais, ambiente
externo e sobre a pele (TORTORA et al., 2000; SARDI, 20004).
S. aureus representa a espécie geralmente envolvida em infecções humanas, tanto de
origem comunitária quanto hospitalar. Essa espécie pode ser encontrada em várias partes
do corpo, como fossas nasais, garganta, intestinos e pele (TRABULSI e ALTERTHUM,
2005; SARDI, 2004; COWAN, 1999; MAHADY, 2005).
S. aureus produz muitas toxinas que contribuem para a patogenicidade da espécie,
aumentando sua habilidade de invadir o corpo e danificar tecidos. A infecção de cortes
cirúrgicos por S.aureus é um problema comum em hospitais; e a habilidade de desenvolver
resistência rapidamente aos antibióticos como penicilina contribui para seu perigo em
ambientes hospitalares. S. aureus produz a toxina responsável pela síndrome do choque
tóxico, uma infecção grave caracterizada por febre alta e vômitos, algumas vezes
ocasionando a morte (TORTORA et al., 2000).
c) Yersinia enterocolitica
O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriacea e apresenta-se na forma de
bacilos Gram-negativos, habitante do intestino de muitos animais domésticos, e
freqüentemente transmitidos na carne e no leite contaminados. A Y. enterocolitica é uma
das espécies que pode causar doenças tanto no homem quanto nos animais. Este
microrganismo apresenta a capacidade de crescer em temperaturas de refrigerador, de 4
o
C
à 10
º
C (TORTORA et al., 2000). As manifestações clínicas causadas por Y. enterocolitica
24
são na maioria das vezes entéricas, com dores abdominais e diarréia, que podem variar em
sua severidade, desde poucas evacuações até uma enterocolite com lesões ulcerativas
envolvendo o trato gastrintestinal. Este patógeno causa gastrenterite, onde apresenta
diarréia, febre, cefaléia e dor abdominal. Podem ainda causar infecções extra-intestinais
tais como: abcessos, conjuntivite, osteomielite, artrite e eritema nodoso. Esta espécie é um
microrganismo invasor e toxigênico (BAUAB & FALCÃO, 1991; TORTORA et al.,
2000).
d) Aeromonas hydrophila
O gênero Aeromonas compreende bacilos Gram-negativos, facultativos, portadores
das enzimas catalase e oxidase, fermentadores da glicose e de outros carboidratos e
geralmente se movimentam através de um flagelo polar. Esses microrganismos compõem a
família Aeromonadaceae. São comumente encontrados em águas de rios e lagos, em
suprimentos de água potável (mesmo clorada), em tanques de peixes, nos solos, em
verduras, leite e derivados e alimentos à base de peixe. As cobras, os peixes, os jacarés, as
rãs e alguns pássaros são os vertebrados mais comumente infectados ou portadores de
espécies de Aeromonas (BAUAB et al., 2003; TRABULSI & ALTERTHUM, 2005).
Aeromonas spp geralmente não são consideradas como microbiota normal em
humanos e, muito do interesse científico por esse grupo de microrganismos é devido à
associação destes, com infecções intestinais e extra-intestinais em humanos. As espécies de
Aeromonas podem ser responsáveis por bacteremias e septicemias. O trato gastrintestinal
parece ser a principal fonte de infecção podendo causar infecções cutâneas, meningite,
pneumonia, peritonite, infecções oculares, infecções do trato urinário entre outras, sendo
freqüentemente isoladas também a partir da pele e tecidos (BAUAB et al., 2003;
TRABULSI & ALTERTHUM, 2005).
25
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
OBJETIVOS
3 – OBJETIVOS
1. Avaliar a atividade antibacteriana dos extratos metanólicos (MeOH), clorofórmicos
(CHCl
3
) e hidrometanólicos (MeOH/H
2
O) de Byrsonima spp e Alchornea spp.
2. Avaliar a atividade antibacteriana dos extratos vegetais empregando a técnica de
diluição em microplacas.
2.1- Realizada com leitura espectrofotométrica.
2.2 – Realizada com leitura visual utilizando resazurina como revelador.
2.3 – Comparação de ambas as técnicas.
3. Avaliar a atividade antibacteriana dos extratos vegetais pela técnica de diluição em
tubos.
4. Comparar a efetividade dos métodos de diluição em microplacas com as de diluição
em tubos na determinação da concentração inibitória mínima (CIM).
5. Contribuir com a avaliação do potencial biológico do Bioma-Cerrado do Estado de
São Paulo.
27
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
MATERIAL E MÉTODOS
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1– Extratos vegetais
4.1.1 – Obtenção e procedência
Foram utilizados extratos brutos metanólicos (MeOH) e clorofórmicos (CHCl
3
) de
folhas de Alchornea glandulosa, Alchornea triplinervia, Byrsonima crassa, Byrsonima
basiloba e Byrsonima intermedia sendo também utilizado o extrato hidrometanólico
(MeOH/H
2
O) da última espécie citada, obtidos no Laboratório de Química Orgânica do
Instituto de Química – Unesp – Araraquara, coordenado pelo Prof. Dr. Wagner Vilegas.
As folhas da Alchornea glandulosa foram coletadas na ESALQ-USP, município de
Piracicaba, São Paulo, por Tamara Regina Calvo e pelo Prof. Jorge Tamashiro (IB-
UNICAMP-SP). A identificação também foi realizada pelo Prof. Jorge Tamashiro. Uma
exsicata de número 132828 foi depositada no herbário da Universidade de Campinas -
UNICAMP-SP.
As folhas de Alchornea triplinervia foram coletadas no Horto Florestal-UNESP,
município de Botucatu, São Paulo, pelos pós-graduandos Tamara Regina Calvo e Luís
Fernando Rolim de Almeida (IB-UNESP-Botucatu-SP). Amostras das plantas foram
identificadas pelo Prof. Jorge Tamashiro (IB-UNICAMP-SP). Uma exsicata de número
14873-BOTU foi depositada no Herbário Irina Delanova de Gemtchujnicov -UNESP-
BOTUCATU.
As folhas de Byrsonima crassa foram coletados na estrada do Brejinho de Nazaré
município de Porto Nacional, estado de Tocantins pela prof
a
. Dr
a
. Clélia Akiko Hiruma-
Lima (IBB-UNESP-Botucatu). A identificação foi feita pelo Dr. Eduardo Ribeiro dos
Santos e catalogadas com o número de exsicata 3377. Foram depositadas no herbário da
29
Universidade do Tocantins.
As folhas de B. intermedia foram coletadas por Luís Fernando Rolim de Almeida
(IBB-UNESP-Botucatu, SP) no município de Pratânia-SP e identificadas no Instituto
Biociências de Botucatu. Uma exsicata de número 24164 encontra-se depositada no
Herbário Irina Delanova De Gemtchujnicov - UNESP-BOTUCATU.
As folhas de B. basiloba foram coletadas por Luís Fernando Rolim de Almeida
(IBB-UNESP-Botucatu, SP) no município de Pratânia-SP e identificadas por Campos, C.J
no Instituto Biociências -Botucatu. Exsicata de número 24163 encontra-se
depositada no Herbário Irina Delanova De Gemtchujnicov - UNESP-BOTUCATU.
4.1.2 – Cinética de leitura espectrofotométrica
Observando-se os extratos vegetais a serem testados (Byrsonima crassa, Byrsonima
intermedia, Byrsonima basiloba, Alchornea glandulosa, e Alchornea triplinervia), foi
verificado que todos apresentavam coloração verde acentuada. Então, foi necessário avaliar
a absorção de cada amostra em espectrofotômetro num intervalo de leitura de 400 a
655nm, para a determinação do comprimento de onda possivelmente absorvível
(interferente).
Realizou-se um espectro de varredura destes extratos na concentração de 1000µ
g/mL, utilizando-se como branco a água Milli-Q. Observou-se também a absorbância do
meio de cultura (Caldo Mueller-Hinton), por apresentar coloração amarelada.
Estas análises permitiram avaliar o melhor comprimento de onda que deveria ser
utilizado nas leituras de absorbância para a determinação da CIM dos extratos, sem a
interferência da cor dos extratos vegetais e do meio de cultura, como resumido na tabela 1.
30
4.2 – Amostras bacterianas
Foram utilizadas as cepas de referência Escherichia coli ATCC 10536 e
Staphylococcus aureus ATCC 6538; a cepa de Yersinia enterocolítica O8 (Ye 2707)
sabidamente patogênica pertencente ao Laboratório de Microbiologia da FCF (BAUAB &
FALCÃO, 1991) e a cepa de Aeromonas hydrophila O34 (Ae 14) isolada de fezes
diarréicas humanas, portadora de diversos marcadores de virulência e também pertencente
ao Laboratório de Microbiologia da FCF (BAUAB et al., 2003).
4.2.1 - Determinação da curva de crescimento bacteriano
As cepas bacterianas foram repicadas do estoque para tubos contendo meio Tryptic Soy
Broth (TSB) e incubadas durante 24 horas a 37
º
C. Uma alíquota dessa cultura foi
transferida pra tubos contendo solução salina 0,9% até obter-se turvação equivalente ao
valor 0,5 da escala de McFarland. Com auxílio de alça de Drigalsky, 0,1mL dessa mistura
foi plaqueada em Tryptic Soy Agar (TSA) e incubada a 37
o
C por 24h. Outra alíquota da
mistura foi submetida à leitura em espectrofotômetro a 600nm e do restante, 0,1mL foi
diluído em série em 10 tubos contendo cada um 1mL de tampão fosfato (PBS). De cada
tubo contendo a diluição da suspensão de microorganismos, 0,1mL foi semeado em placa
contendo TSA com auxílio de alça de Drigalsky e posteriormente foram incubadas a 37
o
C.
Após incubação de 24 horas as placas contendo o crescimento bacteriano foram
submetidas à contagem quanto ao número de colônias formadas. Com o número de
colônias obtido e corrigindo-se a respectiva diluição de cada tubo, foi determinado o
número de células contidas no tubo com a qual foi realizada a leitura espectrofotométrica.
Assim, determinou-se um número de bactérias/mL de meio de cultura com uma respectiva
leitura da absorbância a 600nm.
31
4.3- Determinação da atividade anJtibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pelo método de diluição em micJroplacas utilizando leitura
espectrofotométrica (DEVIENNE, 2000 ; ELLOF, 1998; MIGLIATO, 2005;
GABRIELSON, 2002).
4.3.1 – Padronização da suspensão bacteriana
A suspensão bacteriana foi padronizada adicionando-se uma cultura de 24h, em um
tubo contendo solução salina estéril até atingir uma turvação igual à suspensão do tubo 0,5
da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 x 10
8
UFC/mL) segundo descrito por
Sanches (2004). A seguir foi realizada a leitura espectrofotométrica a 600nm (item 4.3) e a
absorbância de 0,10 a 0,15 corresponde a 1,5 x 10
8
UFC/mL. Posteriormente, foi realizada
uma diluição 1/10 em tubo tipo eppendorf, obtendo-se uma suspensão de 1,5 x 10
7
UFC/mL.
4.3.2 - Preparo das soluções contendo substâncias de referência para o controle
negativo (SANCHES, 2004)
A penicilina foi utilizada como controle para Staphylococcus aureus. Preparou-se
uma solução de 5mg/mL (solução A: 1mg em 200 µL de água destilada), e em seguida esta
solução foi diluída 1/100 em água destilada (solução B: 0,05mg/mL), e por fim a solução B
foi diluída 1/10 em caldo Mueller-Hinton (CMH), obtendo-se uma concentração final de 5
µg/mL.
A solução de tetraciclina foi utilizada para controle de Escherichia coli. Foi
preparada através da diluição de 5mg da respectiva droga em 200µL de água destilada
32
(solução A). Esta por sua vez, foi diluída 1/100 em água destilada (solução B), e a solução
B foi diluída em 1/10 em CMH, obtendo uma concentração final de 5µg/mL.
A gentamicina foi utilizada para controle de A. hydrophila e Y. enterocolitica. Esta
solução foi preparada através da diluição de 10µL da respectiva droga em 2000µL de água
destilada (solução A). Retirou-se 100µL da solução A, e adicionou-se em 200µL de CMH
(solução B), obtendo uma concentração final de 25µg/mL.
4.3.3 – Método de diluição em microplacas utilizando leitura espectrofotométrica
Os extratos vegetais foram preparados em solução-estoque de 1000µg/mL em
CMH e adicionou-se 5% de DMSO. Aos orifícios das microplacas (96 orifícios) das linhas
de A a G das colunas de 1 a 12 foram adicionados 100µL de Caldo Mueller–Hinton
(CMH). A seguir, os orifícios da linha B a G da coluna 1 adicionou-se 100µL da solução-
estoque dos extratos vegetais. Após a homogeneização, 100µL das misturas contidas nos
orifícios da coluna 1 de B a G foram transferidos para a coluna 2 de B a G e assim
sucessivamente até a coluna 5, que após homogeneização foram retirados e desprezados
100µL. Dessa maneira obteve-se um volume final
de 100µL nesses orifícios da microplaca com as concentrações finais dos extratos vegetais
de 500, 250, 125, 62,5, 31,25 µg/mL (orifícios controle dos extratos). Aos orifícios da
coluna 7 da linha de B a G foram adicionados 100µL das soluções-estoque dos extratos
vegetais, sendo a homogeneização idêntica aos da coluna 1 da linha B a G. Nos orifícios
da linha H de 1 a 6 foram adicionados 100µL da solução do agente antimicrobiano
preparado segundo o item 4.3.1 (controle negativo), e aos orifícios da linha H de 7 a 12
adicionou-se 100µL de CMH (controle positivo).
Subseqüentemente foi adicionado 10µL da suspensão bacteriana de 10
7
UFC/mL (item
33
4.3.2) em cada orifício, exceto nos orifícios controle do extrato (linha B a G, coluna 1 a 5)
e nos orifícios da linha A de 1 a 12 (branco). Uma das microplacas foi submetida à leitura
no leitor de microplacas a 595nm. A outra foi incubada à 37ºC por 24 horas. Após este
período de incubação, essa segunda microplaca foi submetida à leitura no leitor de
microplacas a 595nm. A inibição do crescimento bacteriano foi evidenciada pela ausência
de crescimento no meio, sendo considerada determinada a CIM a menor concentração do
extrato vegetal capaz de inibir o crescimento de 90% das cepas. Cada extrato foi testado
em triplicata na mesma microplaca e cada teste realizado em 2 microplacas.
A Figura 6 esquematiza o preparo das microplacas para a realização do teste de
atividade antibacteriana, e a figura 7 demonstram o leitor de microplacas Elisa utilizado na
realização do teste.
34
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
100
µ
L CMH (Branco)
100
µ
L CMH + 100
µ
L Extrato vegetal
(Controle dos extratos)
100
µ
L CMH + 100
µ
L extrato vegetal
+ 10
µ
L bactéria
100
µ
L solução de antibiótico + 10
µ
L de Bactéria
(Controle Negativo)
100
µ
L CMH + 10
µ
L de Bactéria
(Controle Positivo)
Figura 6: Configuração esquemática da microplaca na determinação da atividade
antibacteriana e da CIM utilizando leitura espectrofotométrica.
35
Figura 7: Leitor de microplacas
4.4 - Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
pela técnica em microplaca utilizando resazurina como revelador (COLLINS e
FRANZBLAU, 1997; PALOMINO et al., 2002; MONTEJANO, 2005;
GABRIELSON, 2002).
A suspensão bacteriana foi utilizada segundo item 4.3.1 e as soluções para o
controle negativo segundo item 4.3.2.
4.1– Método de diluição em microplacas utilizando resazurina como revelador
Segundo PALOMINO et al. (2002) e MONTEJANO, (2005) a resazurina é um
corante (fenoxazin-3-ona) indicador de óxido-redução, que tem sido utilizado para avaliar
a viabilidade e contaminação bacteriana e para testar a atividade antimicrobiana.
36
Os extratos vegetais foram preparados em solução-estoque de 4000µg/mL em
CMH e adicionou-se 5% de DMSO.
Em uma microplaca estéril de 96 orifícios, foi depositado 200µL de água destilada
estéril nos orifícios de A a H das colunas 1 e 12, como indicado na Figura 8, para evitar a
evaporação durante a incubação na estufa.
A seguir, os orifícios de A a H da coluna 11 receberam 100 L de CMH, os da coluna 10
de A a D 200µL do meio, os da linha A colunas de 2 a 9 receberam 150 L e as demais
linhas, B a H de 2 a 9 receberam 100µL.
Os orifícios da linha A de 2 a 9 e os da linha B de 2 a 9 receberam respectivamente
50 e 100µL das soluções-estoque dos extratos vegetais. Após a homogeneização, 100µL
das misturas contidas nos orifícios da linha B de 2 a 9 foram transferidas para a linha C de
2 a 9 e assim sucessivamente até a linha H de 2 a 9, que após homogeneização foram
retirados e desprezados 100µL. Por último, adicionou-se em todos os orifícios da
microplaca, com exceção da linha A de 2 a 9 e da coluna 10 de A a D, 100µL da suspensão
bacteriana preparada como apresentado no item 4.3.1. Dessa maneira obteve-se um volume
final de 200µL em cada orifício com as concentrações finais dos extratos vegetais de 1000,
500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,62µg/mL. Nos orifícios da coluna 11 de A a D foram
adicionados 100µL da solução do agente antimicrobiano preparado segundo o item 4.3.2
(controle negativo), e aos orifícios da coluna 11 de E a H adicionou-se 100µL de CMH
(controle positivo).
A solução de resazurina foi preparada na concentração de 0,0005g/5mL de água
destilada estéril. Adicionou-se nos orifícios A-11 e E-11, 30µL de resazurina (V/V), e
procedeu-se a incubação da microplaca a 37°C até o desenvolvimento de cor rósea no
orifício E-11. Foi então adicionado 30µL de resazurina (V/V) nos demais orifícios, sendo a
37
microplaca reincubada a 37°C de 2 a 8h, mantendo-as até 24h para a confirmação dos
resultados. Após esta incubação, foi realizada a leitura visual final.
A manutenção da cor azul nos orifícios foi interpretada como ausência de crescimento
bacteriano e o desenvolvimento de cor rosa, como presença de crescimento bacteriano. A
CIM foi definida como a menor concentração de extrato vegetal capaz de inibir o
crescimento de 90% das cepas, ou seja, a menor concentração de extrato vegetal capaz de
impedir a mudança de cor de azul para rosa.
Cada extrato foi testado em duplicata e o mesmo teste foi repetido três vezes em
semanas consecutivas.
A
BC
D
E
FG
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
200
µ
L de CMH
100
µ
L CMH + 100
µ
L extrato vegeta l + 100
µ
L bactéria
100
µ
L solução de antibiótico + 100
µ
L de Bactéria (C ontrole Nega tivo)
100
µ
L CMH + 100
µ
L de Bactéria (Controle Positivo)200
µ
L de Água Destilada
150
µ
L de CMH + 50
µ
L de extrato veg etal
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
200
µ
L de CMH
100
µ
L CMH + 100
µ
L extrato vegetal +
100
µ
L bactéria
100
µ
L solução de antibiótico + 100
µ
L de Bactéria
(Controle Negativo)
100
µ
L CMH + 100
µ
L de Bactéria (Controle Positivo)
200
µ
L de Água Destilada
150
µ
L de CMH + 50
µ
L de extrato vegetal
Figura 8 - Configuração esquemática da microplaca na determinação da atividade
antibacteriana e da CIM utilizando resazurina como revelador.
38
4.5 - Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
pela técnica de diluições em tubos (CHAND et al, 1994; MOREIRA et al., 2003;
NCCLS M7–A6, 2003)
A suspensão bacteriana foi utilizada segundo item 4.3.1 e as soluções para o
controle negativo segundo item 4.3.2.
4.5.1 – Método de diluição em tubos
Os extratos vegetais foram preparados em solução-estoque de 2000µg/mL em água
destilada estéril e quando necessário adicionou-se 5% de DMSO. Foram preparadas séries
de 7 tubos contendo 1mL de caldo Muller-Hinton (MHB). Ao 1° tubo adicionou-se 1mL
da solução-estoque do extrato vegetal. Após a homogeneização, 1mL a mistura contida no
1° tubo foi transferida para o 2° tubo e assim sucessivamente até o 6° tubo que após
homogeneização foi retirado e desprezado 1mL. Dessa maneira obtivemos um volume
final de 1mL em cada tubo com as concentrações finais dos extratos vegetais a 1000; 500;
250; 125; 62,5; 31,25µg/mL. O 7° tubo representou o controle do crescimento bacteriano e
o 8° tubo o controle de inibição de crescimento bacteriano. Subseqüentemente foi
adicionado em cada tubo 100µL da suspensão bacteriana de 10
7
UFC/mL padronizados
segundo item 4.3.1.
Os tubos foram incubados em estufa a 36°C±1°C, por 24 horas e posteriormente
observados visualmente. Os que se apresentaram turvos, indicaram crescimento bacteriano
e os límpidos, inibição do crescimento. Para a determinação da CIM, bem como a turbidez
de alguns extratos antes mesmo da adição da suspensão bacteriana, uma alçada de cada
tubo foi semeada em forma de estrias em placas contendo Muller-Hinton Agar (MHA).
Estas placas foram incubadas 36°C±1°C por 24 horas e após a incubação foram observadas
39
quanto à ocorrência ou não de crescimento bacteriano, confirmando assim a ação
bactericida ou bacteriostática dos extratos vegetais. Cada extrato foi testado em triplicata.
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
Solução 1000 500 250 125 62,5 31,25 Controle Controle
Estoque Positivo Negativo
Figura 9: Esquema das diluições seriadas dos extratos. As diferentes concentrações
estão expressas em µg/mL.
40
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
RESULTADOS
5 - RESULTADOS
5.1 – Cinética de leitura espectrofotométrica
Foi realizado um espectro de varredura nos comprimentos de onda dentro do
visível, para avaliar a absorção dos extratos vegetais e do caldo Mueller–Hinton.
Pela cinética de leitura espectrofotométrica foi possível observar que o Caldo
Mueller-Hinton não apresentou absorção em nenhum dos comprimentos de onda testados
no visível, ou seja, não interfere na leitura das amostras. Já os extratos vegetais
apresentaram absorção em todos os comprimentos de onda, devido a sua coloração
acentuada, com exceção do extrato de Byrsonima crassa (CHCl
3
).
A partir destes dados houve a necessidade de estabelecer novos critérios para a
análise dos resultados obtidos no leitor de microplacas. O comprimento de onda escolhido
para a determinação da CIM foi o de 595nm como segue na tabela 1.
42
Tabela 1: Absorbância dos extratos vegetais na concentração de 1000µg/mL e do
meio de cultura (CMH).
AMOSTRAS
COMPRIMENTO DE
ONDA (nm)
ABSORBÂNCIA
Byrsonima crassa
(MEOH)
595 1,290
Byrsonima crassa
(CHCl
3
)
595 0,025
Byrsonima basiloba
(MEOH)
595 0,625
Byrsonima basiloba
(CHCl
3
)
595 0,873
Byrsonima intermedia
(MEOH/H2O)
595 0,822
Byrsonima intermedia
(MEOH)
595 0,858
Byrsonima intermedia
(CHCl
3
)
595 1,319
Alchornea triplinervia
(MEOH)
595 0,209
Alchornea triplinervia
(CHCl
3
)
595 0,648
Alchornea glandulosa
(MEOH)
595 0,487
Alchornea glandulosa
(CHCl
3
)
595 0,352
Caldo Mueller-Hinton (CMH) 595 0,026
5.2. Avaliação da atividade antibacteriana in vitro
5.2.1. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) pela técnica de diluição em microplacas com leitura espectrofotométrica.
A atividade antibacteriana e a CIM dos extratos vegetais testados podem ser
observados através da leitura espectrofotométrica no comprimento de onda a 495nm. O
43
valor da CIM preconizado pelo NCCLS (National Committee For Clinical Laboratory
Standars) frente a bactérias de crescimento aeróbico é descrito como a menor concentração
de um agente antimicrobiano que impede o crescimento visível de um microrganismo em
testes de sensibilidade.
Os valores das CIMs estão apresentados nas figuras 10 a 14 no período de
incubação de 24hs, e revelam os perfis de susceptibilidade ou resistência aos extratos
vegetais testados frente às cepas de referência E. coli (ATCC 10536), S aureus (ATCC
6538), Y. enterocolitica O8 (Ye 2707) e A. hydrophila O34 (Ae 14).
Figura 10: Atividade antibacteriana dos extratos de Alchornea glandulosa.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
500 250 125 62.5 31.25 Controle
positivo
Concentração ( µg/mL )
Absorbância
44
Figura 11: Atividade antibacteriana dos extratos de Alchornea triplinervia.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
500 250 125 62.5 31.25 Controle
positivo
Concentração ( µg/mL )
Absorbância
45
Figura 12: Atividade antibacteriana dos extratos de Byrsonima crassa.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
500 250 125 62.5 31.25 Controle
positivo
Concentração ( µg/mL )
Absorbância
46
Figura 13: Atividade antibacteriana dos extratos de Byrsonima intermedia.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
500 250 125 62.5 31.25 Controle
positivo
Concentração ( µg/mL )
Absorbância
47
Figura 14: Atividade antibacteriana dos extratos de Byrsonima basiloba.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
500 250 125 62.5 31.25 Controle
positivo
Concentração ( µg/mL )
Absorbância
48
Tabela 2: Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória
mínima (CIM), pela técnica de diluição em microplaca com leitura
espectrofotométrica.
Bactérias
Extratos
Concentração inibitória mínima (µg/mL)
E. coli S. aureus
Y.
enterocolitica
A.
hydrophil
a
A. glandulosa (MeOH) > 500 31,25 > 500 > 500
A. glandulosa (CHCl
3
) > 500 62,5 > 500 > 500
A. triplinervia (MeOH) > 500 62,5 31,25 > 500
A. triplinervia (CHCl
3
) > 500 125 125 > 500
B. crassa (MeOH) 250 125 125 62,5
B. crassa (CHCl
3
) > 500 250 250 125
B. intermedia (MeOH) 500 250 250 250
B. intermedia (MeOH/H
2
O) > 500 250 250 250
B. intermedia (CHCl
3
) > 500 > 500 250 500
B. basiloba (MeOH) 500 31,25 500 250
B. basiloba (CHCl
3
) > 500 62,5 250 500
Estes resultados representam as médias das triplicatas.
Os extratos (MeOH) e (CHCl
3
) de A. glandulosa não apresentaram atividade
antibacteriana frente E. coli, Y. enterocolitica, e A. hydrophila nas concentrações testadas
sendo indicado na concentração > 500µg/mL. Entretanto, os extratos (MeOH) e (CHCl
3
)
de A. glandulosa apresentaram atividade antibacteriana frente S. aureus com CIM de
31,25 e 62,5µg/mL respectivamente.
Os extratos de A. triplinervia (MeOH) e (CHCl
3
) não apresentaram atividade
antibacteriana frente E. coli e A. hydrophila nas concentrações testadas. A. triplinervia
(CHCl
3
) apresentou CIM de 125µg/mL frente as cepas S. aureus e Y. enterocolitica. A.
triplinervia (MeOH) apresentou atividade antibacteriana frente a S. aureus e Y.
49
enterocolitica com CIM de 62,5 e 31,25µg/mL respectivamente.
O extrato de B. crassa (MeOH) apresentou atividade antibacteriana com CIM de
250, 125, 125 e 62,5µg/mL respectivamente para E. coli, S. aureus, Y. enterocolitica e A.
hydrophila. O extrato de B. crassa (CHCl
3
) não apresentou atividade antibacteriana frente
a E. coli, entretanto, apresentou CIM de 250, 250 e 125µg/mL frente as demais bactérias
testadas.
O extrato de B. intermedia (MeOH) apresentou CIM de 500µg/mL frente a E. coli e
250µg/mL frente as demais cepas de S. aureus, Y. enterocolitica e A. hydrophila
respectivamente. A B. intermedia (MeOH/H
2
O) não apresentou atividade antibacteriana
frente a E. coli nas concentrações testadas, contudo apresentou CIM de 250µg/mL para S.
aureus, Y. enterocolitica e A. hydrophila. O extrato de B. intermedia (CHCl
3
) não
apresentou atividade antibacteriana frente E. coli e S. aureus nas concentrações testadas,
mas apresentou CIM de 250 e 500µg/mL para Y. enterocolitica e A. hydrophila.
O extrato de B. basiloba (MeOH) apresentou atividade antibacteriana de 500µg/mL
frente a E. coli e Y. enterocolitica, mas para A. hydrophila e S. aureus apresentou CIM de
250µg/mL e 31,25µg/mL respectivamente. O extrato de B. basiloba (CHCl
3
) não
apresentou atividade antibacteriana frente a E. coli nas concentrações testadas, mas
apresentou CIM de 500µg/mL frente A. hydrophila, 250µg/mL frente Y. enterocolitica, e
62,5µg/mL frente a S. aureus.
50
5.2.2. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) através da técnica de diluição em microplaca utilizando resazurina como
revelador.
Os valores das CIMs obtidos pela técnica de diluição em microplacas utilizando
resazurina como revelador são demonstrados na tabela 3.
Tabela 3: Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória
mínima (CIM), pela técnica de diluição em microplaca utilizando resazurina como
revelador.
Bactérias
Extratos
Concentração inibitória mínima (µg/mL)
E. coli S. aureus
Y.
enterocolitica
A. hydrophila
A. glandulosa (MeOH) > 1000 500 > 1000 1000
A. glandulosa (CHCl
3
) > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
A. triplinervia (MeOH) > 1000 250 > 1000 > 1000
A. triplinervia (CHCl
3
) > 1000 1000 > 1000 > 1000
B. crassa (MeOH) 500 125 500 125
B. crassa (CHCl
3
) > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
B. intermedia (MeOH) > 1000 125 > 1000 500
B. intermdia (MeOH/H
2
O) > 1000 250 > 1000 500
B. intermedia (CHCl
3
) > 1000 1000 > 1000 > 1000
B. basiloba (MeOH) > 1000 250 > 1000 1000
B. basiloba (CHCl
3
) > 1000 1000 > 1000 > 1000
Estes resultados representam as médias das triplicatas.
A atividade antibacteriana e a CIM dos extratos vegetais testados são
interpretadas pela manutenção da cor azul (ausência de crescimento bacteriano) e
desenvolvimento da cor rósea (presença de crescimento bacteriano). Assim a CIM é
51
definida como a menor concentração do extrato vegetal capaz de impedir a mudança da cor
azul para a rosa.
O extrato de B. crassa (MeOH) apresentou CIM de 500, 125, 500 e 125µg/mL para
E. coli, S. aureus, Y. enterocolitica, A. hydrophila respectivamente, enquanto que o extrato
(CHCl
3
) desta mesma planta não apresentou atividade antibacteriana nas concentrações
testadas sendo indicado na concentração >1000µg/mL.
O extrato de B. intermedia (MeOH) apresentou CIM de 125 e 500µg/mL para S.
aureus e A. hydrophila respectivamente, sendo que a B. intermedia (CHCl
3
) apresentou
CIM=1000µg/mL. O extrato de B. intermedia (MeOH/H
2
O) apresentou CIM de 250 e 500
µg/mL para S. aureus e A. hydrophila respectivamente.
A espécie B. basiloba apresentou atividade antibacteriana contra S. aureus
(CIM=250µg/mL) e contra A. hydrophila (CIM=1000µg/mL). A espécie B. basiloba
(CHCl
3
) apresentou CIM=1000µg/mL para S. aureus.
O extrato metanólico de A. glandulosa apresentou atividade antibacteriana contra S.
aureus (CIM=500µg/mL), enquanto que o extrato (CHCl
3
) não apresentou atividade nas
concentrações testadas sendo indicado na concentração >1000µg/mL.
Os extratos (MeOH) e (CHCl
3
) de A triplinervia apresentaram atividade
antibacteriana contra S. aureus, com CIM de 250 e 1000µg/mL respectivamente.
Na figura 15 é um exemplo do teste realizado utilizando resazurina como revelador.
Os orifícios em azul representam à ausência de crescimento bacteriano e os orifícios em
rosa representam crescimento bacteriano.
52
Figura 15: Técnica de diluição em microplaca utilizando resazurina como
revelador, para determinação da concentração inibitória mínima (CIM).
53
5.2.3. Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória mínima
(CIM) através da técnica de diluição em tubos.
A técnica de diluição em tubos realizada seguindo as normas da metodologia do
NCCLS M7-A6, demonstra os valores obtidos das CIMs na tabela 4.
Tabela 4: Determinação da atividade antibacteriana e da concentração inibitória
mínima (CIM), pela técnica de diluição em tubos.
Bactérias
Extratos
Concentração inibitória mínima (µg/mL)
E. coli S. aureus
Y.
enterocoliti
ca
A.
hydrophila
A. glandulosa (MeOH) >1000 500 1000 >1000
A. glandulosa (CHCl
3
) 1000 >1000 1000 >1000
A. triplinervia (MeOH) 1000 500 >1000 1000
A. triplinervia (CHCl
3
) >1000 >1000 >1000 >1000
B. crassa (MeOH) 1000 500 500 500
B. crassa (CHCl
3
) >1000 1000 1000 1000
B. intermedia (MeOH) >1000 500 1000 500
B. intermedia (MeOH/H
2
O) >1000 1000 1000 1000
B. intermedia (CHCl
3
) >1000 1000 >1000 1000
B. basiloba (MeOH) 500 250 1000 1000
B. basiloba (CHCl
3
) >1000 1000 >1000 >100
Estes resultados representam as médias das triplicatas.
No método de diluição em tubos a atividade antibacteriana dos extratos vegetais
avaliados foram realizados em triplicata para determinar a concentração inibitória mínima
(CIM).
54
O extrato metanólico de B. basiloba apresentou CIM de 500µg/mL frente a E. coli.
Os extratos de B. crassa (MeOH), A. glandulosa (CHCl
3
) e A. triplinervia (MeOH)
apresentaram atividade antibacteriana frente a E. coli com CIM de 1000µg/mL. Os demais
extratos não apresentaram atividade antibacteriana frente a E. coli nas concentrações
testadas sendo indicados na concentração >1000µg/mL.
Os testes realizados frente a S. aureus mostraram que o extrato metanólico de B.
crassa, B. intermedia, A. glandulosa, A. triplinervia inibiu o crescimento dos
microrganismos obtendo a CIM de 500µg/mL. Obteve-se um melhor resultado com o
extrato metanólico de B. basiloba apresentando uma CIM de 250µg/mL. Os demais
extratos testados frente a S. aureus como B. crassa (CHCl
3
), B. intermedia (CHCl
3
), B.
intermedia (MeOH/H
2
O), B. basiloba (CHCl
3
) apresentaram CIM de 1000µg/mL. Alguns
extratos não apresentaram atividade antibacteriana nas concentrações testadas sendo então
indicados na concentração >1000µg/mL sendo eles a A. glandulosa (CHCl
3
) e A.
triplinervia (CHCl
3
) pois não se pode afirmar que acima desta concentração o extrato
apresenta atividade antibacteriana.
Observa-se que os resultados obtidos frente à cepa Y. enterocolitica mostraram que
o extrato metanólico de B. crassa apresentou CIM de 500µg/mL, e os extratos de B. crassa
(CHCl
3
), B. intermedia (MeOH), B. intermedia (MeOH/H
2
O), B. basiloba (MeOH), A.
glandulosa (MeOH), A. glandulosa (CHCl
3
) apresentaram CIM de 1000µg/mL. Os demais
extratos não inibiram o crescimento do microrganismo nas concentrações testadas.
Os resultados obtidos para a técnica de diluição em tubos frente à cepa A.
hydrophila demonstram que os extratos metanólicos de B. crassa e B. intermedia
apresentaram CIM de 500µg/mL. Os extratos vegetais de B. crassa (CHCl
3
), B. intermedia
(CHCl
3
), B. intermedia (MeOH/H
2
O), B. basiloba (MeOH) e A. triplinervia (MeOH)
55
apresentaram CIM de 1000µg/mL. Os demais extratos não apresentaram atividade
antibacteriana nas concentrações testadas sendo indicadas como >1000µg/mL.
56
DISCUSSÕES
6. DISCUSSÃO
O bioma Cerrado é um complexo vegetacional com características peculiares e
variações fisionômicas dos seus componentes herbários. Com uma área de
aproximadamente 2 milhões de Km
2
o cerrado abrange cerca de 23% do território
brasileiro, ocupando grande parte do Planalto Central, sendo superado em tamanho apenas
pela Floresta Amazônica (RATTER et al., 1988). Apesar de sua elevada biodiversidade,
tem sido pouco valorizado em termos de conservação. O cerrado brasileiro é considerado
como um dos 25 ecossistemas do planeta, e muitas destas plantas encontradas nesse
ecossistema são usadas na medicina natural. Por outro lado, devido ao desconhecimento da
possível existência da ação tóxica, bem como de sua indicação adequada, as plantas
medicinais são muitas vezes utilizadas de forma incorreta, não produzindo o efeito
desejado (FELFILI et al., 2002). Visando a caracterização e o uso sustentável desse
Cerrado no território do Estado de São Paulo, é que vem sendo desenvolvido esse estudo,
uma vez que para a determinação do potencial biológico de produtos vegetais a
determinação da atividade bacteriana é uma etapa bastante importante. Além disso, tendo
em vista que bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos representam um desafio no
tratamento de infecções, é notória a necessidade de se encontrar novas substâncias com
propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a esses microrganismos.
As espécies vegetais desenvolveram ao longo de sua evolução, mecanismos de
defesa interagindo com o meio ambiente. As substâncias químicas produzidas são
empregadas em conseqüência da ativação de rotas específicas do metabolismo secundário
e constituem a maioria dos princípios ativos, por exemplo, óleos essenciais, alcalóides,
taninos e flavonóides, entre outras (KRIVENKO et al., 1996).
Um grande número de extratos de plantas foi estudado e apresentou atividade
58
antimicrobiana. A Salvia officinalis L., apresentou atividade antimicrobiana contra
Klebsiella, Enterobacter, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Morganella morganii
(PEREIRA et al., 2004). Extratos de Phyllanthus amarus apresentou atividade
antimicrobiana contra Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa,
Proteus mirabilis, Salmonella paratyphi e Staphylococcus aureus (SRIVASAN et al.,
2001). O extrato de folhas de Bryophyllum pinnatum Kurz (“Folha da Fortuna”)
demonstrou atividade antimicrobiana sobre bactérias Gram - positivas (SCHMITT et al.,
2003). Extrato de Azadiarachta indica, Cinnamomum cassia, Rumex nervosus, Ruta
graveolens, Thymus serpyllum e Zingiber officinale foram ativas contra Bacillus cereus
(ALZOREKY e NAKAHARA, 2003). Extratos de Caryophyllus aromaticus e Syzygyum
joabolanum aprensentaram um potencial antimicrobiano para os seguintes
microrganismos: Candida albicans, S. aureus, Salmonella choleraesuis, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, Proteus spp, entre outros, inclusive sobre os microrganismos
isolados de ambiente hospitalar e resistentes a antibióticos (NASCIMENTO et al., 2000).
Ainda que existam inúmeros trabalhos nessa área estudando a atividade
antimicrobiana de extratos vegetais, as plantas brasileiras são pouco estudadas. Dentre
essas espécies que ocorrem no Cerrado do Estado de São Paulo estão as Byrsonima spp e
Alchornea spp.
A família Malphighiaceae é constituída por aproximadamente 800 espécies
distribuídas em 60 gêneros sendo que, o Brasil concentra cerca de 50% das espécies. A
família contém exemplares que apresentam diferentes substâncias biologicamente ativas.
No Nordeste brasileiro ocorrem, várias espécies do gênero Byrsonima que são
principalmente conhecidas pela utilização de seus frutos na alimentação e pelo emprego
com fins medicinais. Espécies desse gênero são comumente empregadas como
antiasmáticas, contra febre e infecção da pele. Já foram isolados do gênero Byrsonima
59
alguns derivados flavonoídicos (B. vebascifolia), no entanto, são os triterpenos que
representam a classe de substâncias naturais de ocorrência mais freqüente no gênero
(MENDES et al., 1999).
Extratos de B. crassifolia apresentaram atividade bactericida e fungicida pelo
método de difusão em agar contra Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella typhi, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus
pneumoniae e Micrococcus luteus (MARTINÉZ- VÁSQUEZ, et al., 1999).
O extrato de B. crassa apresentou uma significante atividade antimicrobiana contra
Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Shigella sp., Staphylococcus epidermidis, Proteus
mirabilis, Salmonella sp. Enterococcus faecalis e Candida albicans quando testadas pelo
método clássico de difusão em agar e na determinação da CIM pelo método de diluição em
tubos (SANNOMIYA et al., 2005a).
MARTÍNEZ-VÁSQUEZ et al., (1999) e LOPES et al., (2001) demonstraram
atividade antimicrobiana do extrato de B. verbascifolia contra Streptococcus faecalis,
Mycobacterium phlei, Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis.
A investigação fitoquímica do gênero Byrsonima, ao longo do tempo, tem revelado
a presença de esteróides, triterpenos, ésteres aromáticos, aminoácidos, proantocianidinas,
flavonóides e catequinas. A análise fitoquímica das frações do extrato metanólico das
folhas de B. crassa revelou a presença de taninos e catequinas na fração aquosa, os quais
têm apresentado resultados significativos em estudos realizados com camundongos na
avaliação de disfunções gástricas e diarréicas. Na fração acetato de etila, além da presença
de flavonóides, foram isolados os seguintes compostos: amentoflavona, quercetina-3-O-a-
L-arabinopiranosídeo, quercetina-3-O-β-D-alactopiranosídeo. Derivados fenólicos, como
ácido gálico e galato de metila, foram isolados em quantidades significativas, sendo
comuns ao gênero, uma vez que também foram isolados de Byrsonima fagifolia. Segundo
60
os autores, esses compostos fenólicos têm despertado grande interesse em pesquisadores na
Europa, principalmente na Itália, onde alguns estudos em andamento têm demonstrado
importante atividade contra o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Alguns desses
compostos são comuns ao extrato metanólico de B. intermedia, em diferentes proporções
(CARDOSO, 2006).
Os resultados obtidos nesse estudo são condizentes com os da literatura uma vez
que pode-se observar atividade antibacteriana significativa para os extratos metanólicos de
B. crassa frente E. coli, S. aureus, Y. enterocolitica e A. hydrophila e também B. basiloba
frente a S. aureus e da B. intermedia frente S. aureus e A. hydrophila. Segundo a técnica
de diluição em microplacas utilizando leitura espectrofotométrica a B. crassa (MeOH)
apresentou CIM = 250μg/mL para E. coli, CIM = 125μg/mL para S. aureus e Y.
enterocolitica, e CIM = 62,5μg/mL para A. hydrophila. Na técnica de diluição em
microplacas utilizando revelador resazurina a B. crassa (MeOH) apresentou CIM =
500μg/mL para E. coli e Y. enterocolitica e CIM = 125μg/mL para S. aureus e A .
hydrophila. Na técnica de diluição em tubos B. crassa (MeOH) apresentou CIM =
1000μg/mL para E. coli e CIM = 500μg/mL para S. aureus, Y. enterocolitica e A .
hydrophila. Na comparação das metodologias utilizadas neste estudo os melhores
resultados foram estes apresentados acima com o extrato de B. crassa.
Os flavonóides são conhecidos por exercerem uma infinidade de propriedades
biológicas como antimicrobiana, antiviral, antiinflamatória, analgésica e antiúlcera
(SIMÕES, 1999). Assim, esta atividade observada para o extrato metanólico pode ser
atribuída à presença dos diferentes flavonóides isolados do extrato de Byrsonima. O estudo
fitoquímico das espécies em estudo está sendo realizado pelo laboratório de Química
Orgânica do Instituto de Química – Unesp – Araraquara, coordenado pelo Prof, Dr.
Wagner Vilegas.
61
A família Euphorbiaceae compreende aproximadamente 290 gêneros e 7.500 espécies
distribuídas em todas as regiões tropicais e subtropicais do globo, principalmente na
América e na África. No Brasil, ocorrem 72 gêneros e cerca de 1.100 espécies difundidas
em todos os tipos de vegetação. Espécies do gênero Alchornea têm sido usadas
popularmente como agente antidiarreico, antiinflamatório, anti-reumático e no tratamento
de hanseníase e doenças cutâneas. Estudos farmacológicos realizados em extratos brutos e
compostos isolados revelaram atividades antibacteriana, antiinflamatória, antiespasmódica,
antitripassonômica e antidiarreica (COGENERO et al., 2003). Estudos químicos realizados
com o gênero Alchornea descrevem o isolamento e a identificação de alcalóides
hexaidroimidazo-pirimidínicos e guanidínicos, como principais constituintes, além de
triterpenos, flavonóides e outros compostos fenólicos (COGENERO et al., 2003). Esses
mesmos autores demonstraram atividade antimicrobiana moderada de A. glandulosa para o
extrato bruto metanólico frente aos microorganismos S. aureus (CIM = 250 μg/mL) e
Candida albicans (CIM = 125μg/mL) e significativa para fração alcaloidal frente a
Bacillus subtilis (CIM = 62,5 μg/mL) e Candida tropicalis (CIM = 31,2 μg/mL). Segundo
URREA – BULLA et al., (2004) foram isolados do extrato etanólico das folhas de A.
glandulosa o galato de etila, ácido gálico, quercetina, kaempferol-3-O-L-ramnosídeo,
quercetina-3-O-L-ramnosídeo e miricetina-3-O-L-ramnosídeo. Na A. triplinervia, já foram
encontrados o ácido gálico, amentoflavona, β-D-glucogalina, galato de metila e
isocorilagina (BRACA et al., 2002).
Neste trabalho demonstramos atividade antibacteriana dos extratos metanólicos de
A. glandulosa com diferentes valores nas técnicas utilizadas. Os ensaios com microplacas
utilizando resazurina como revelador apresentaram atividade antibacteriana com CIM =
500μg/mL para S. aureus e CIM = 1000μg/mL para A. hydrophila. Pela técnica de
diluição em microplacas utilizando leitura espectrofotométrica a A. glandulosa (MeOH)
62
apresentou CIM = 31,25μg/mL para S. aureus, não apresentando atividade antibacteriana
frente as outras cepas testadas. Na técnica de diluição em tubos apresentou CIM = 500
μg/mL para S. aureus.
Segundo Yunes e Calixto (2001), o solvente mais adequado para obtenção do
extrato bruto é o metanol, pois possibilita a extração de um maior número de compostos.
Esta afirmativa pode justificar nossos resultados nas três metodologias aplicadas onde, os
extratos metanólicos de Byrsonima e Alchornea, de um modo geral apresentaram maior
atividade antibacteriana contra os microrganismos testados. A literatura destaca algumas
classes de produtos naturais que possuem potencial atividade antimicrobiana, como é o
caso de triterpenos, flavonóides, alcalóides e fenólicos (SIMÕES, 1999).
Vários estudos de atividade antimicrobiana vêm sendo realizados com a utilização das
técnicas de diluição em microplacas e demonstram que esta é uma metodologia adequada
para tal finalidade com aspectos vantajosos como a utilização de pequenas quantidades de
produtos naturais e a possibilidade de se utilizar mais de um extrato, bem como diferentes
microrganismos num mesmo ensaio. Essas técnicas que determinam a concentração
inibitória mínima são quantitativas, pois possibilitam demonstrar qual a mínima
concentração do extrato necessária para inibir o crescimento bacteriano. Embora essas
técnicas sejam mais sensíveis, são mais trabalhosas quando realizadas manualmente, o que
impede a realização de um espectro maior de “screening” em um curto espaço de tempo
(SUFFREDINI et al., 2004; CHAND et al., 1994; DEVIENNE e RADDI, 2002;
MIGLIATO, 2005; HAMMER et al., 1998; COWAN, 1999; ALVES, 2006).
Em concordância com a literatura pode-se verificar que as técnicas de diluição em
microplacas são adequadas para tais ensaios enfatizando a grande vantagem de se utilizar
volumes reduzidos, principalmente em relação aos produtos de origem vegetal que
geralmente são extraídos em pequenas quantidades. Um dos poucos inconvenientes que
63
essas técnicas de microdiluição apresentam é em relação à leitura realizada em leitor de
microplacas que pode apresentar variação dada a sensibilidade do equipamento além do
custo para aquisição do mesmo. Neste sentido a modificação proposta por FRANZBLAU
et al., 1998 padronizada para Mycobacterium tuberculosis e que possibilita a leitura visual
ao invés da leitura espectrofotométrica, pela utilização do Alamar Blue, elimina essa
desvantagem na metodologia tornando-a de fácil leitura e conclusão.
Um dos objetivos desse estudo foi padronizar essa metodologia em nosso
laboratório para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas para as quais até então não era
empregada. O Alamar Blue vem sendo substituído pela resazurina, e foi este corante que
utilizamos no presente estudo, no qual podemos demonstrar que tal modificação foi viável,
pois a técnica permite análises visuais reprodutíveis e que facilitaram o trabalho na leitura
final.
Segundo a norma M7A6 (NCCLS, 2003) o método de diluição em caldo é utilizado
para avaliar quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um
determinado isolado bacteriano. A prova de sensibilidade por este método foi uma das
primeiras a serem desenvolvidas e ainda hoje serve como método de referência. Segundo
ELOFF (1998) a técnica alternativa mais amplamente utilizada em ensaios microbiológicos
é a de diluição seriada de extratos em tubos seguidos da adição do microrganismo, para
determinar a CIM usando turbidez como um indicador do crescimento. Essa técnica requer
grande quantidade de extratos não sendo útil em bioensaios para compostos
antimicrobianos.
De acordo com os resultados obtidos pela técnica de diluição em tubos verificou-se
que essa técnica é menos sensível do que os apresentados pelas técnicas de diluição em
microplacas, pois os valores da CIM foram bem maiores que os anteriormente citados. Isso
nos leva a supor que esta técnica poderia subestimar a atividade antimicrobiana de um
64
extrato vegetal e assim sugerimos que o ideal seria utilizá-la numa triagem de extratos
vegetais a fim de verificar sua possível atividade antimicrobiana.
Em uma recente revisão de artigos sobre atividade antimicrobiana de plantas
medicinais, RIOS e RECIO, (2005) afirmaram que o maior problema com as pesquisas
ainda continua sendo a falta de uniformidade nos critérios selecionados para avaliar tal
atividade. Isso freqüentemente leva a relevantes contradições entre os resultados obtidos
por diferentes grupos e mesmo para os mesmos autores estudando a mesma amostra com
diferentes métodos.
Em linhas gerais observou-se diferença entre os resultados obtidos nas técnicas
utilizadas, sendo que das três, a de diluição em microplacas utilizando leitura
espectrofotométrica foi a mais sensível, já que demonstrou valores de CIM menores para
os extratos vegetais para a maioria dos microrganismos testados. Entretanto, essa
metodologia pode apresentar alguns interferentes na leitura como uma possível
sedimentação do extrato ou da suspensão bacteriana e também com o objetivo de evitar
contaminação das microplacas, este ensaio foi realizado em duplicata. Já a mesma
metodologia com a utilização da resazurina e, portanto leitura visual, nos permite realizar
apenas uma microplaca por ensaio o que a torna vantajosa em relação a anterior.
Acreditamos que o presente trabalho tenha contribuído com a avaliação do
potencial biológico do Bioma-Cerrado do estado de São Paulo, pois, faz parte do projeto
temático Biota–Fapesp. Os dados obtidos nos permitem concluir que as espécies vegetais
estudadas apresentaram atividade antibacteriana significativa.
65
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
CONCLUSÕES
7. CONCLUSÕES
. Os extratos metanólicos de Byrsonima e Alchornea apresentaram maior atividade
antibacteriana quando comparados com os extratos clorofórmicos.
. A técnica de diluição em microplacas utilizando leitura espectrofotométrica
apresentou-se a mais sensível na determinação da CIM.
. A técnica de diluição em microplacas utilizando a resazurina mostrou-se
reprodutível, de fácil interpretação dos resultados e de fácil execução, podendo,
portanto ser ampliada a sua utilização para bactérias Gram-negativas e Gram
-positivas, além das micobactérias para a qual já vem sendo utilizada.
. As técnicas de diluição em microplacas mostraram-se mais sensíveis e mais
adequadas, por permitirem ensaios com pequenos volumes de extratos.
. A técnica de diluição em tubos apresentou-se menos sensível, quando comparada
com as de diluição em microplacas.
67
_________________________________________
_________________________________________
________________________________
________________________________
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, E. G. Avaliação in vitro da atividade antibacteriana de extratos brutos de Miconia
rubiginosa e Miconia fallax. Estudo comparativo de quatro técnicas de “screening”.
Franca, 2006. 110f. Dissertação (Mestrado em Ciências na Área de Química Biológica)
Universidade de Franca.
ALZOREKY, N. S.; NAKAHARA, K. Antibacterial activity of extracts from some edible
plants commonly consumed in Asia. J. Food Microbiol, v. 80, p. 223-230, 2003.
AHMAD, I; BEG, A. Z. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal
plants against multi-drug resistant human pathogens. J. Ethnopharmacol., v.74, p. 113-
123, 2001.
BALLVÉ, A. C.; SIQUEIRA, N. C. S.; MENTZ, L. A.; SILVA, G. A. de A. B.; DEUD
JOSÉ, K. F. Plantas medicinais de uso popular: atlas farmacognóstico. Canoas: Ed. da
ULBRA, 1995. 205p.
BAUAB, T. M.; FALCÃO, D. P. Experimental infection of mice with Yersinia strains
bearing or not bearing the virulence-associated pasmid. Contrib. Microbiol. Immunol., v.
12, p. 145-155, 1991.
BAUAB, T. M.; LEVY, C. E.; RODRIGUES, J.; FALCÃO, D. P. Niche-specificc
association of Aeromonas ribotypes from human and environmental origin. Microbiol.
Immunol., v. 47, n. 1, p. 7-16, 2003.
69
BRACA, A.; MENDEZ, J.; MENICHINI, F.; MORELLI, I. Constituintes of Alchornea
triplinervia (Euphorbiaceae). Biochem. Syst. Ecol., v. 30, n.11, p. 1109-1111, 2002.
CARDOSO, C. R. P. Atividade mutagênica e ativadora da resposta imune celular
induzidas por Byrsonima crassa Niedenzu e Byrsonima intermedia A. Juss.
(Malpighiaceae). Araraquara, 2006. 110f. Dissertação (Mestrado em Análises Clínicas)-
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade estadual Paulista, 2006.
CHAND, S.; LUSUNZI, I.; VEAL, D. A.; WILLIAMS, L. R.; KARUSO, P. Rapid
screening of antimicrobial activity of extracts and natural products. J. Antibiot., v. 47,
p.1295-1304, 1994.
COLLINS, L. A.; FRANZBLAU, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460
system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis
and Mycobcterium avium. Antimicrob. Agents Chemother., v. 41, n. 5, p. 1004-1009,
1997.
COGENERO, L. S.; IDE, R. M.; NAZARI, A. S. SARRAGIOTTO, M. H.; FILHO, B. P.
D.; NAKAMURA, C. V.; CARVALHO, J. E.; FOGLIO, M. A. Constituintes químicos de
Alchornea glandulosa (Euphorbiaceae). Quím. Nova, São Paulo, v. 26, n. 6, 2003.
CORDEIRO, C. H. G. Atividade biológica de gel dentifrício e enxaguatório bucal
contendo extratos vegetais. Araraquara, 2005. 116f. Dissertação (Mestrado em Ciências
Farmacêuticas)-Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista,
2005.
70
COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev., v. 12, n. 4,
p. 564-82, 1999.
DEVIENNE, K. F. Avaliação da atividade biológica in vitro de isocumarinas naturais e
semi-sintéticas obtidas de Paepalanthus bromelioides. Araraquara: 2000. 126f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Química, Universidade Estadual
Paulista.
DEVIENNE, K. F.; RADDI, M. S. Screening for antimicrobial activity of natural products
using a microplate photometer. Braz. J. Microbiol., v.33. p. 166-168, 2002.
ELISABETSKY, E. Etnofarmacologia como ferramenta na busca de substâncias ativas. In:
SIMÕES, C. M. O. et al. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto
Alegre: UFRGS, 2004. p. 91-103.
ELLOF, J. N. A. A sensitive an quick microplate method to determine the minimal
inhibitory concentration of plant extract for bacteria. Planta Medica, v. 64, p. 711-13,
1998.
FELFILI, J. M.; NOGUEIRA, P. E.; SILVA JUNIOR, M. C.; MARIMON, B. S.;
DELITTI, W. B. C. Composição florística e fitossociologia do cerrado sentido restrito no
município de Água Boa - MT. Acta bot. Bras.; v. 16, n 1, p.103-112, 2002.
71
FIGUEIREDO, M. E.; MICHELIN, D. C. SANNOMIYA, M. SILVA, M. A ; SANTOS,
L. C.; ALMEIDA, L. F. R.; BRITO, A R. M. SALGADO, H. R. N.; VILEGAS, W.
Avaliação química e anti-diarreica das folhas de Byrsonima cinera DC. (Malphighiaceae).
Rev. Bras. Ciênc. Farm., v. 41, p. 1-5, 2005
FRANZBLAU, S. G.; WITZIG, R. S.; MCLAUGHLIN, J. C.; TORRES, P.; MADICO,
G.; HERNANDEZ, A.; DEGNAN, M. T.; COOK, M. B.; QUENZER, V. K.;
FERGUSON, R. M.; GILMAN, R. H. Rapid, low- technology MIC determination with
clinical Mycobacterium tuberculosis isolates by using the microplate alamar blue assay. J.
Clin. Microbiol., v. 36, n. 2, p. 362-366, 1998.
GABRIELSON, J.; HART, M.; JARELOV, A.; KUHN, I.; MCKENZIE, D.; MOLLBY,
R. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for
quantification of microbial growth in microplates. J. Microbiol. Methods. v. 50, p. 63-73,
2002.
GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Biodiversidade: aspectos biológicos, geográficos, legais
e éticos. In: SIMÕES, C. M. O. et al. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento.
Porto Alegre: UFRGS, 2004. p. 13 – 14.
HAMMER, K. A.; CARSON, C. F.; RILEY, T. A. In-vitro activity essential oils, in
particular Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and tea tree oils products against Candida
spp. J. Antimicrob. Chemother., v. 42, p. 591-595, 1998.
72
KRIVENKO, V. V.; POTEBNIA, G. P.; LOIKO, V. V. Experience in treating digestive
organ disease with medicinal plants. Urach Delo, v. 3, p 76-78, 1989.
KUSAMRAM, W. R.; TEPSWAN, A.; KUPRADINUM, P. Antimutagenic And
anticarcinogenic potentials of some thai vegetables. Mut. Res., v.402, p. 247-258, 1998.
LIMA, E. O. Plantas e suas propriedades antimicrobianas: uma breve análise histórica. In:
YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. (Orgs.). Plantas medicinais: sob a óptica da química
medicinal moderna. Chapecó: ARGOS, 2001. p. 483-501.
LOPES, A.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. N. Antiviral and antimicrobial activities of
Colombian medicinal plants. J. Ethnopharmacol. v. 77, p. 189-196, 2001.
LORENZI, H.; MATOS, F. .J. ABREU. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas.
Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2002. p. 324.
LORENZI, H. Árvores Brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas
nativas do Brasil. 3. ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2000a. v. 1. p. 97, 98, 232.
LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas e tóxicas. 3. ed.
Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2000b. p. 458.
73
MAHADY, G. B. Medicinal plants for the prevention and treatment of bacterial infections.
Current Pharmaceutical Design, v. 11, n. 19, p. 2405-2427, 2005.
MARTÍNEZ – VASQUÉS, M.; GONZÁLEZ – ESQUINCA, A. R.; CAZARES, L. L.;
MORENO, G. M. N.; GARCÍA-ARGÁEZ, A. N. Antimicrobial activity of Byrsonima
crassifolia (L.) H. B. K. J. Ethnopharmacol. v. 66, p. 79-82, 1999.
MENDES, C. C.; CRUZ, F. G.; DAVID, J. M. Triterpenos esterificados com ácidos graxos
e ácidos triterpênicos isolados de Byrsonima microphylla. Quím. Nova, v. 22, n. 2, p. 185-
188, 1999.
MIGLIATO, K. F. Syzygium cumini (L.) Skeels – Jambolão: estudo farmacognóstico,
otimização do processo extrativo, determinação da atividade antimicrobiana do
extrato e avaliação da atividade anti-séptica de um sabonete líquido contendo o
referido extrato. Araraquara, 2005. 179f. Dissertação (Mestrado em Ciências
Farmacêuticas)-Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista,
2005.
MONTEJANO, H. A.; GERVALDO, M.; BERTOLOTTI, S. G. The excited-states
quenching of resazurin and resorufin and resorufin by p- benzoquinones in polar solvents.
Dyes and Pigments, n. 64, p. 117-124, 2005.
74
MONTOURO, P.; SANNOMIYA, M.; PIACENTE, S.; PIZZA, C.; BRITO, A. R. M. S.;
VILLEGAS, W. Aplication of liquid chromatography eletrospray ionization tandem mass
spectrometry to the analysis of polyphenolic compounds from na infusion of Byrsonima
crassa Niedenzu. Rap. Commun. In Mass Sprectr., v.19, n.16, p. 2244-2250, 2005.
MOREIRA, N. M.; DEL PINO, F. A. B.; VENDRUSCOLO, C. T. Estudo da produção de
biopolímeros via enzimática através de inativação e lise celular e com células viáveis de
Beijerinckia sp. 7070. Ciênc. Tecnol. Alim., v. 23. n. 2. 2003.
NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C. Atividade de extratos
vegetais e fitofármacos sobre bactérias resistentes a antibióticos. Braz. J. Microbiol., v.
31, n.4, p. 247-256. 2000.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS).
Metodologia dos testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição para
bactérias de crescimento aeróbico. Norma Aprovada 6 ed. Brasília, DF: ANVISA, 2003.
(NCCLS Document M7-A6, v. 23, n. 2, 2003).
PALOMINO, J. C.; MARTIN, A.; CAMACHO, M.; GUERRA, H.; SWINGS, J.;
PORTAELS, F. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for
detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents
Chemother. v. 46. n. 8, p. 2720-2722, 2002.
75
PEREIRA, R. S.; SUMITA, T. C.; FURLAN, M. R.; JORGE, A. O. C. Atividade
antibacteriana de cepas isoladas de infecção urinária. Rev. Saúde Pública, v. 38, n. 2,
2004.
PEREIRA, K. B. D.; SILVEIRA, C. E. Caracterização morfo-anatômica do endocarpo e da
semente de Byrsonima basiloba Juss. (Murici-de-Ema, Malphighiaceae). In:
CONGRESSO NACIONAL DE BOTÂNICA, 54., 2003, Belém. Anais... Belém-PA,
Brasil.
RATTER , J. A., DARGIE, T. C. D. An analysis of the floristic composition of 26 cerrado
areas in Brazil. Edinburgh J. Bot. v 49, p. 235-250, 1992.
RIOS, J. L.; RECIO, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. J.
Ethnopharmacol., v. 100, p. 80-84, 2005.
SANCHES, A. C. C. Estudo farmacognóstico das cascas de Stryphnodendron
obovatum Benth., atividade antioxidante, antimicrobiana e da ação cicratizante dos
seus extratos. Araraquara, 2004. 214f. Dissertação (Mestrado em Ciências
Farmacêuticas)-Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista,
2004.
SANNOMIYA, M.; RODRIGUES, M. C.; COELHO, R. G.; SANTOS, L. C.; HIRUMA-
LIMA, C. A.; BRITO, A. R.. M. S.; VILEGAS, W. Application of preparative high-speed
counter-current chromatography for the separation of flavonoides from the leaves of
Byrsonima crassa Niedenzu (IK). J. Chromatogr. A, p.47-51, 2004.
76
SANNOMIYA, M.; MICHELIN, D. C.; RODRIGUES, C. M.; SANTOS, L. C.;
SALGADO, H. R. N.; HIRUMA-LIMA, C. A.; BRITO, A. R. S. M.; VILEGAS, W.
Byrsonima crassa Niedenzu (IK): antimicrobial activity and chemical study. Rev. Ciênc.
Farm. Básica Apl.,v. 26, n.1, p.71-75, 2005a.
SANNOMIYA, M.; FONSECA, V. B.; SILVA, M. A.; ROCHA, L. R. M.; SANTOS, L.
C.; HIRUMA-LIMA, C. A.; BRITO, A. R. M. S.; VILEGAS, W. Flavonoids and
antiulcerogenic activity from Byrsonima crassa leaves extracts. J. Ethnopharmacol., v.
97, p. 1-6, 2005b.
SANTOS, P. R. V.; OLIVEIRA, A. C. X., TOMASSINI, T. C. B. Controle microbiógico
de produtos fitoterápicos. Rev. Farm. Bioq. Univ. São Paulo, v.31, p.35-38, 1995.
SARDI, J. C. O. Isolamento e identificação de Bactérias patogênicas de biofilmes
bucais de pacientes hospitalizados. Araraquara, 2004, 136f. Dissertação (Mestrado em
Análises Clínicas)-Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista,
2004.
SCHMITT, A. C.; ALMEIDA, A B. P. F.; SILVEIRA, T. A. IWAKURA, C. T.,
MENDES, K. F.; SILVA, M. C. Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro da planta
Bryophyllum pinnatum Kurz (“Folha-da-fortuna”) colhida em Várzea Grande, Mato
Grosso/Brasil. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, n. 1, p. 55-58, 2003.
77
SILICI, S., KOÇ, N.A., AYANGIL, D., ÇANKAYA, S. Antifungal activities of propolis
collected by different races of honeybees against yeast isolated from patients with
superficial mycoses. J. Pharmacol. Sci.,v. 99, p. 39-44, 2005.
SILVA, S. R.; SILVA, A. P.; MUNHOZ, C. B.; SILVA JR, M. C.; MEDEIROS, M. B.
Guia de plantas do cerrado utilizadas na Chapada dos Veadeiros. Brasília: Ed. WWF,
2001, 58p.
SIMÕES, C. M. O. et al. (Org.) Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre:
UFRGS, 1999. 821p.
SRINIVASAN, D.; NATHAN, S.; SURESH, T.; PERUMALSAMY, P. L. Antimicrobial
activity of certain Indian medicinal plants used in folkloric medicine. J. Ethnopharmacol.
v. 74, p. 217-220, 2001.
SUFFREDINI, I. B.; SADER, H. S.; GONÇALVES, A. G.; REIS, A. O.; GALES, A. C.;
VARELLA, A. D.; YOUNES, R. N. Screening of Antibacterial Extracts from Pants Native
to the Brazilian Amazon Rain Forest and Atlantic forest. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 37,
n 3, p. 379-384. 2004.
TELLES, M. A. S.; MOSCA. A. A avaliação da técnica de microdiluição em placas para
determinação da concentração inibitória mínima da isoniazida em cepas de Mycobacterium
tuberculosis. Rev Inst. Adolfo Lutz., v. 59, n°1/2, p. 15-19, 2000.
78
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6.
ed. Porto Alegre:
Artmed, 2000. p. 807.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005. p.
697.
URREA-BULLA, A.; SUAREZ, M. M.; MORENO-MURILLO, B.; Biological activity of
phenolic compounds from Alchornea glandulosa. Fitoterapia, v.75, p. 392-394, 2004.
WILLIAMS, J. E. Review of antiviral and immunomodulating properties of plants of the
Peruvian rainforest with a particular emphasis on Unã de Gato and Sangre de Gadro.
Altern. Med. Rev., Saindpoint, v. 6, n 6, p. 567-579, 2001.
YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B.; Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal
moderna. Chapecó: Argos, 2001. 523p.
79
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
ANEXOS
ANEXO
1. Materiais utilizados
1.1 . Materiais e Equipamentos
Espectrofotômetro UV-Visível– Ultrospec III (Pharmacia LKB)
Leitor de microplacas ELISA (Multiskan Ascent, Labsystems Research Tech. Div.,
Helsinki, Finland)
Fluxo Laminar VLFS-12 (VECO)
Autoclave (PHOENIX)
Estufa de incubação Modelo 002 CB (FANEM)
Estufa de Secagem (ORION)
Balança analítica e semi analítica (GEHAKA)
Placas de petri para meios de cultura, PIREX
Tubos de ensaio, PIREX
Erlenmeyer, PIREX
Provetas, PIREX
Alça de Drigalski, HEXIS
Cabo de Kole com alça, HEXIS
Bico de Bunsen
Tubos tipo eppendorf, CORNING
Estante para tubos de ensaio
Bastão de vidro
Ponteiras para micropipetadores, CORNING
Micropipetadores Nichipet Ex ( NICHIRYO)
Microplacas 96 Wells de fundo em U (CORNING)
1.2– Reagentes e outros
Mueller Hinton Broth (DIFCO)
Mueller Hinton Agar (DIFCO)
Tryptic Soy Broth (DIFCO)
Tryptic Soy Agar (DIFCO)
Solução salina 0,9%
Tampão Fosfato (PBS)
Dimethyl sulfoxide (SIGMA-ALDRICH)
Resazurina (ALDRICH)
2. Meios de Cultura
2.1. Preparo dos meios de cultura desidratados
Foram preparados de acordo com as recomendações do fabricante.
a) O caldo Mueller-Hinton (CMH) desidratado foi preparado através da reidratação
do meio de cultura, suspendendo 21g em 1 litro de água Milli-Q e acertando o pH final em
7,4 a 25ºC. Em seguida, o meio foi esterilizado em autoclave por 15 minutos a 121ºC.
b) Mueller Hinton Agar (MHA) desidratado foi preparado através da dissolução de
38g do meio de cultura em 1 litro de água Milli-Q. Procedeu-se sua esterilização em
autoclave por 15 minutos a 121°C. Em seguida foi distribuído em placas de petri estéreis
no interior do fluxo laminar.
c) Tryptic Soy Agar (TSA) desidratado, foi preparado através de uma reidratação
de 40g do meio de cultura em 1 litro de água Milli-Q, e aquecendo-se ligeiramente até sua
completa dissolução e acertando o pH final para 7,3+/- 0,2 a 25ºC. Procedeu-se
esterilização em autoclave por 15 minutos a 121ºC.
d) O Tryptic Soy Broth (TSB) desidratado, foi reidratado suspendendo-se 30gramas
do meio de cultura em 1 litro de água Milli-Q, aquecendo-se ligeiramente para a completa
dissolução e acertando o pH final para 7,3+/- 0,2 a 25ºC. Procedeu-se esterilização em
autoclave por 15 minutos a 121ºC.
Após a esterilização dos meios, estes foram mantidos por 24h a 37ºC para o teste de
esterilização. Posteriormente foram armazenados a 4+/-1ºC (geladeira).
3. Soluções e reagentes de uso geral
a) Solução Salina 0,9%
Foi preparada uma solução de salina estéril para a padronização da suspensão
bacteriana. Utilizou-se 0,9% de NaCl solubilizado em água Milli-Q. Esta solução foi
autoclavada por 15 minutos a 121ºC e posteriormente mantida a 4+/- 1ºC (geladeira).
b) Tampão fosfato (PBS) pH 7,2
- NaCl.............................8g
- KCl............................0,2g
- Na
2
PO
4
....................1,44g
- KH
2
PO
4
...................0,24g
- H
2
O........qsp.......1000mL.
Dissolver os componentes em água Milli-Q até completa dissolução. Esta
solução foi autoclavada por 15 minutos a 121ºC e posteriormente mantida a 4+/-1ºC
(geladeira).
c) Solução de resazurina
A solução foi preparada na concentração de 0,0005g de resazurina em 5mL de água
destilada estéril. Esta solução foi mantida a 4+/-1°C (geladeira) com validade de 5 dias.
d) DMSO (Dimetilsulfóxido)
A solução foi utilizada na proporção de 5% em água destilada.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
