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KATIA RODRIGUES NEVES
Avaliação da histologia óssea e cardiovascular em ratos urêmicos
paratireoidectomizados submetidos à dieta rica e pobre em fósforo
associada à infusão de paratormônio
Tese apresentada ao Departamento de Clínica Médica
da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Nefrologia
Orientadora: Dra Vanda Jorgetti
São Paulo
2004
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2
1. Introdução
Em 1960, Scribner
1
et al demonstraram que pacientes portadores de Doença
Renal Crônica (DRC) poderiam ser mantidos vivos através da hemodiálise intermitente.
Criou-se desde então a expectativa de que esses pacientes poderiam, uma vez que a
uremia fosse controlada, ter uma vida normal ou próxima do normal. Passaram-se os
anos e apesar dos avanços tecnológicos introduzidos no tratamento dialítico, a
comunidade científica continua a se deparar com uma elevada morbidade e mortalidade
nesses pacientes. Dentre as causas de mortalidade, as cardiovasculares representam
cerca de 50% dos óbitos
2
. Cerca de um terço das hospitalizações desses pacientes são
atribuídas a Doença Cardiovascular (DCV)
3
. As principais complicações
cardiovasculares são: hipertrofia ventricular esquerda (HVE), doença obstrutiva
coronariana (DAC) e insuficiência cardíaca
4
, muitas delas já presentes nesses pacientes
antes mesmo do início do tratamento dialítico
5
. Relata-se que 40% a 75% dos pacientes
que iniciam tratamento dialítico já têm manifestação de DCV e que a mortalidade
atribuída a essa complicação é 10 a 30 vezes maior que na população geral, mesmo
quando corrigida para fatores como sexo, raça e presença de Diabetes Mellitus (DM)
3,5
.
Trabalho de Levin et al mostrou que a HVE correlacionou-se inversamente com a
função renal. A freqüência de HVE detectada por ecocardiograma foi 27%, 31% e 45%
em pacientes com clearance de creatinina maior que 50, entre 25 e 50 e menor que 25
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3
ml/min, respectivamente
6
. Em 1974, pioneiramente, Lindner
7
et al descreveram uma
elevada freqüência de doença cardíaca e de mortalidade de causa cardíaca, sugerindo
que uma forma acelerada de aterosclerose acometeria essa população. Atualmente sabe-
se que a prevalência de ateroma nas artérias coronárias de pacientes com DRC é de
aproximadamente 30% (achados de autópsia)
8
. A evolução clínica após eventos
isquêmicos também é desfavorável, pois a mortalidade após infarto agudo do miocárdio
(IAM) nos pacientes com DRC não diabéticos é de 62,3% no primeiro ano, contrastando
com a da população não urêmica, que é de 10% a 15%
9
. Outra evidência importante é
que mesmo pacientes com discreta redução da função renal apresentam uma taxa
acelerada de progressão da DAC
10,11
.
Além da DAC, as modificações pós-estenóticas relacionadas à remodelação das
artérias, arteríolas e capilares miocárdicos, tanto em pacientes com DRC como em
animais urêmicos têm sido reconhecidas e analisadas
12
. Essas lesões podem estar
dissociadas das alterações decorrentes da hipertensão arterial e contribuem de forma
expressiva para a reduzida tolerância à isquemia, além de favorecer o desenvolvimento
de insuficiência cardíaca e arritmias. Esta elevada morbidade e mortalidade por DCV
pode ser atribuída a diversos fatores de risco cardiovascular que freqüentemente são
aditivos. Podemos dividi-los em: 1) Fatores de risco populacionais, 2) Fatores de risco
relacionados à terapia dialítica e 3) Fatores de risco relacionados à uremia.
4
1.a. Fatores de risco populacionais
Fatores tradicionais de risco cardiovascular para a população em geral (idade
avançada, sexo masculino, história familiar de DAC, hipertensão arterial, dislipidemia,
tabagismo, DM, menopausa e sedentarismo) estão presentes com freqüência elevada na
população de pacientes com DRC. A dislipidemia é elevada quando comparada à
população em geral; no entanto, o perfil lipídico varia dependendo da fração lipídica
alterada, da causa da insuficiência renal, do nível da função renal residual e da
população estudada
13
. A prevalência de elevados valores de lipoproteína de baixa
densidade (LDL - colesterol) é maior em pacientes cuja etiologia da DRC é a síndrome
nefrótica, nos pacientes tratados com diálise peritoneal, assim como nos transplantados
renais. Hipertrigliceridemia e baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL -
colesterol) são constantes nesses pacientes
13
. Por outro lado, a hipercolesterolemia nessa
população sofre o viés do impacto da desnutrição que, por sua vez, reduz o valor do
colesterol sérico. Existem trabalhos que não encontraram elevação de colesterol total e
de LDL - colesterol e evidenciaram curvas de mortalidade, para o colesterol total, em
forma de U. Assim, valores reduzidos de colesterol total associaram-se com aumento da
mortalidade. Este comportamento provavelmente reflete a presença de
hipoalbuminemia, outro fator de risco reconhecido por elevar a mortalidade nestes
pacientes
14,15
. Outro estudo que avaliou a relação entre fatores de risco tradicionais de
DCV em pacientes dialíticos mostrou que raça branca, idade avançada, sexo masculino,
5
DM e tabagismo eram fatores de risco independentes para mortalidade; no entanto,
hipertensão sistólica e colesterol elevado não se associaram a aumento de mortalidade
16
.
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) está presente em 80% dos pacientes em diálise
17
e é fator de risco para HVE, dilatação do ventrículo esquerdo, falência cardíaca e doença
cardíaca isquêmica; no entanto, hipotensão também é fator de risco de mortalidade
18
. A
presença de DM nos pacientes em diálise é elevada (42% dos casos novos de portadores
de DRC que iniciam tratamento dialítico são diabéticos)
3
; por sua vez, DM associa-se
com DAC mais extensa e severa
14
. Ajustando-se para idade e sexo, nota-se que pacientes
diabéticos em diálise têm taxas semelhantes de progressão de alterações
ecocardiográficas e de desenvolvimento de falência cardíaca de novo; no entanto, têm
taxas maiores de doença cardíaca isquêmica de novo, maiores índices de mortalidade
global e cardiovascular quando comparados a pacientes em diálise não diabéticos
19
.
1.b. Fatores de risco relacionados à terapia dialítica
Acredita-se que o procedimento hemodialítico não é aterogênico per se; contudo,
as alterações inflamatórias geradas por ele podem favorecer o desenvolvimento da DCV.
A circulação extracorpórea do sangue durante cada sessão de diálise atua como um
estímulo à produção de proteínas de fase aguda como a proteína C reativa (PCR)
20
e
esta, por sua, vez correlaciona-se com elevação de risco para DAC. Além disso, a
6
exposição de células mononucleares circulantes à membrana de diálise ou ainda a
exposição do sangue circulante a lipopolisacarídeos aumentam os níveis de citocinas
circulantes
21,22
. Também existe evidência que pacientes tratados com membrana de
celulose têm maior risco de morte por DAC quando comparados a pacientes tratados
com membrana biocompatível
23
. Estudo recente demonstrou um aumento significativo
de PCR em pacientes que dializavam com membrana de cuprofane quando comparado à
membrana de polissulfona. Além disso, o uso de dialisato ultrapuro associado à
membrana de cuprofane determinava um aumento semelhante de interleucina 6 (IL-6) e
PCR, sugerindo que o tipo de membrana e não a qualidade bacteriológica do dialisato é
que determinava a indução de proteínas da fase aguda durante a sessão de hemodiálise
24
.
Por outro lado, na população de pacientes em diálise peritoneal, a elevação da PCR tem
sido atribuída à bioimcompatibilidade das soluções de diálise peritoneal, ou ainda aos
componentes plásticos das bolsas que acondicionam o dialisato
25
.
Alterações hemodinâmicas próprias da hemodiálise (HD) podem contribuir para
isquemia miocárdica. Um exemplo destas alterações é a mudança do pH sanguíneo
(efeito Bohr sob a curva de dissociação da hemoglobina) levando a taquicardia, redução
do tempo de enchimento do ventrículo esquerdo, menor perfusão coronariana e
periférica. A taquicardia associada à anemia pode reduzir ainda mais a oferta de
oxigênio aos tecidos. O desequilíbrio entre oferta e demanda pode ser responsável não
só por eventos cardíacos durante a sessão de HD, como também por episódios de
isquemia silenciosa detectada nas monitorizações eletrocardiográficas ambulatoriais
26,27
.
Outro fator importante que contribui para a DCV é a necessidade de retirada rápida de
líquido extracelular com episódios freqüentes de hipotensão e possíveis distúrbios
7
hidroeletrolíticos. O uso de soluções de HD com baixas concentrações de cálcio reduz a
contratilidade cardíaca e pode predispor a episódios hipotensivos propiciando, portanto,
o aparecimento de arritmias e isquemia
28
.
1.c. Fatores relacionados à uremia
Os fatores de risco anteriormente mencionados (tradicionais) e aqueles
relacionados ao tratamento dialítico não explicam totalmente a elevada freqüência de
eventos cardiovasculares presentes nos pacientes com DRC. Outros eventos
relacionados à uremia passam a ter significado expressivo
15, 29
. A anemia é um achado
quase universal nesses pacientes e é fator de risco para DCV (desenvolvimento de
insuficiência cardíaca de novo ou a sua recorrência, assim como maior mortalidade
cardíaca)
30
. Relata-se que a correção parcial da anemia com o uso de eritropoetina reduz
a HVE nos pacientes em tratamento conservador e em diálise
31
.
A desnutrição é freqüente nesses pacientes atingindo 10% a 54% dos pacientes
em hemodiálise
32
. Classicamente a albumina é usada como índice de avaliação do estado
nutricional, sobretudo porque o déficit da sua síntese associa-se à reduzida ingestão
protéica. Além disso, a hipoalbuminemia correlaciona-se fortemente com maior risco de
mortalidade tanto por todas as causas, como por causas cardiovasculares. Essa
associação também é observada na população em geral
33,
34
. Contudo, recentemente,
8
tem-se descrito que a hipoalbuminemia pode estar associada à inflamação. A albumina é
uma proteína negativa de fase aguda e os seus níveis guardam relação inversa com
marcadores inflamatórios como a PCR e com a Interleucina-6
33,
35
, portanto parte da
correlação entre hipoalbuminemia e mortalidade se deve ao processo inflamatório
presente nos pacientes com DRC. Fatores trombogênicos também contribuem para
aumentar a mortalidade por DCV desses pacientes e tem-se descrito elevação de
fibrinogênio tanto nos pacientes sob tratamento conservador como nos dialisados
36,37
.
O estresse oxidativo também deve ser considerado como importante determinante de
risco para DCV, desnutrição, amiloidose secundária à DRC e de piora da anemia em
pacientes em tratamento conservador e em diálise. Define-se estresse oxidativo como
dano tecidual decorrente do desequilíbrio entre a geração excessiva de compostos
oxidantes e a redução dos mecanismos de defesa, representados pela diminuição dos
compostos antioxidantes
38
. A geração de compostos oxidados constitui-se em etapa
importante do processo de inflamação e reparo tecidual; portanto, representa um
mecanismo de defesa contra a invasão de microorganismos e de células malignas, assim
como do processo de cicatrização e remodelação. Por outro lado, a ativação crônica e
inadequada do processo oxidativo, presente na uremia, determina lesão celular e
tecidual
38, 39
. Outra associação importante é aquela entre o estresse oxidativo e a
inflamação. Essa inter-relação é complexa, podendo a inflamação atuar tanto como
causa como conseqüência do estresse oxidativo. Descreve-se que o aumento da secreção
da mieloperoxidase (secundária à ativação de células polimorfonucleares) pode
contribuir para DCV através da disfunção endotelial uma vez que atenua o relaxamento
9
do músculo liso vascular óxido nítrico dependente
40
. Outra alteração relacionada ao
estresse oxidativo é a hiperhomocisteinemia. Os mecanismos envolvidos são variados e
incluem efeitos pró-oxidantes, como a redução da vasodilatação óxido nítrico
dependente, além de promoção da trombose e bloqueio da fibrinólise
41
. A
hiperhomocisteinemia também tem sido descrita como importante fator de risco para
eventos coronarianos (fatais e não fatais)
42
. Valores plasmáticos de homocisteína
superiores a 14 μmol/L ocorrem em 90% dos pacientes portadores de DRC
43
, quando
comparados a 5% na população geral e aproximadamente 35% dos pacientes com
DAC
44
. A hiperhomocisteinemia tem sido descrita como fator de risco independente
para DCV tanto na população geral como em pacientes portadores de DRC
45
.
Atualmente, tem sido dada especial atenção ao papel da inflamação crônica no
desenvolvimento da aterosclerose e de eventos coronarianos. Acredita-se que a
inflamação resulte de processos que induzam a disfunção vascular endotelial, levando a
produção de citocinas, tromboxane e fatores de crescimento, além do acúmulo de
macrófagos e linfócitos T nas lesões ateroscleróticas
46
. Um dos marcadores deste
processo inflamatório é a PCR. Outros fatores descritos são o Amilóide A, a
Interleucina-6 e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), a homocisteína
(comentada anteriormente), o fibrinogênio, e o fator de necrose tumoral alfa (TNF -α)
47
.
Vários estudos têm mostrado uma forte associação entre elevadas concentrações de PCR
e risco coronariano, sobretudo em pacientes com IAM prévio e angina instável. A PCR
também têm sido descrita como importante preditor de IAM fatal
48
. Estudo que
envolveu pacientes em hemodiálise revelou que elevações de PCR correlacionaram-se
10
com perfil lipídico aterogênico, além de mostrarem-se fortes preditores de óbito
decorrente de eventos cardiovasculares
49
. Os mecanismos pelo qual a PCR determina
lesão vascular são variados, sendo que a mesma pode envolver-se diretamente na
aterotrombogênese. Descreveu-se a presença de PCR na célula endotelial onde induziu a
expressão de moléculas de adesão como a E-selectina, a VCAM-1 (molécula de adesão
da célula vascular) e a ICAM-1, além de atuar como fator quimiotático para monócitos
através da indução de MCP-1. Outro achado é que a PCR opsoniza o LDL e facilita a
sua entrada nos macrófagos. Também se tem descrito a lesão celular através da ativação
da via clássica do complemento, disfunção da célula endotelial via redução da síntese do
óxido nítrico e sensibilização da célula endotelial à destruição citotóxica mediado pelo
linfócito T (CD4+)
50
.
Postula-se também, que o soro urêmico contenha outras substâncias tóxicas que
afetam adversamente o sistema cardiovascular. O paratormônio (PTH) é uma destas
toxinas
51, 52, 53
, assim como o fósforo
54
e o cálcio.
O hiperparatireoidismo secundário (HPTH), e, conseqüentemente, o aumento
crônico dos níveis do PTH, é um achado comum na DRC. A função primária das
glândulas paratireóides é manter a homeostasia do cálcio (Ca). A hipocalcemia, a
hiperfosfatemia, o metabolismo alterado do metabólito ativo da vitamina D (calcitriol), a
resistência óssea à ação do PTH, o reduzido clearance e catabolismo renal do PTH
55
têm
sido implicados no desenvolvimento e perpetuação do HPTH. A hipocalcemia deve-se
principalmente à redução da absorção intestinal de Ca por déficit de calcitriol
52
. Outro
mecanismo implicado é a resistência óssea aos efeitos calcêmicos do PTH
56
. A
11
hiperfosfatemia tem um efeito estimulatório direto sobre as glândulas paratireóides
57
gerando aumento da secreção do PTH, assim como proliferação celular
55, 58
. Efeito
indireto da hiperfosfatemia ocorre graças a inibição da atividade da 1-α hidroxilase
(presente na célula tubular renal proximal) com conseqüente redução da síntese do
calcitriol
59
e através do efeito físico-químico, gerando precipitação de sais de fosfato de
cálcio e hipocalcemia subseqüente.
O HPTH faz parte de uma complicação freqüentemente observada na DRC, que é
a Osteodistrofia renal (OR). A OR representa todas as alterações esqueléticas presentes
nos pacientes com IRC. As alterações ósseas da OR são divididas em doença de alta
remodelação, representada pela Osteíte fibrosa (OF), que nada mais é que a
manifestação óssea do HPTH, e as doenças de baixa remodelação, como a osteomalácia
(freqüentemente relacionada a intoxicação por Alumínio e déficit de Vitamina D) e a
Doença Adinâmica. A OF caracteriza-se por aumento do número de osteoclastos e
osteoblastos, fibrose medular e taxas elevadas de formação óssea. A doença de baixo
remanejamento, por sua vez, define-se histologicamente por taxas de formação óssea
reduzidas associadas a diminuição dos números de osteoblastos e osteoclastos
60
.
Preconiza-se, para manutenção de uma adequada remodelação óssea, evitando-se assim
as doenças de baixo e alto remanejamento, que os valores de PTH sejam mantidos entre
2 a 3 vezes a taxa normal , fosfatemia entre 3,5 e 5,5 mg/dl e a calcemia entre 8,4 e 9,5
mg/dl
61
. Todavia, para o sistema cardiovascular, os valores acima referidos podem ser
maléficos, contribuindo para o desenvolvimento da DCV nesses pacientes
53
.
12
Efeitos do HPTH na função cardíaca já foram descritos em 1961 por Selye et al
51
e Lehr et al
52
. A calcificação extraóssea observada em urêmicos resulta, em parte, da
combinação de disfunção da glândula paratireóide, do metabolismo alterado da vitamina
D e de distúrbios dos íons divalentes. A calcificação cardíaca é achado comum em
pacientes dialíticos, sendo encontrada em cerca de 60% desses pacientes quando
submetidos a autópsia. Os depósitos de cálcio são encontrados no sistema de condução,
nas válvulas mitral e aórtica, nas pequenas artérias assim como nas artérias coronárias
62,
63
. Os danos ao tecido cardíaco secundários às calcificações favorecem o aparecimento
de anomalias na condução, estenose e/ou refluxo valvular, desenvolvimento de
insuficiência cardíaca congestiva e óbito
62, 63, 64, 65, 66
. Vários estudos apontam o HPTH
como um fator decisivo na elevada morbidade e mortalidade por DCV nos pacientes
com DRC. Tanto o PTH quanto o calcitriol aumentam a quantidade de Ca nas células
musculares lisas de vasos e de cardiomiócitos, alterando o metabolismo oxidativo e
afetando a pressão e a contratilidade cardíaca. Estes eventos deixam o coração
criticamente dependente de oxigênio e, portanto, mais susceptível à isquemia
67
. O PTH
também tem um papel permissivo no desenvolvimento de fibrose cardíaca, e que
aparentemente é independente da pressão arterial. A presença de fibrose parece
relacionar-se à disfunção diástólica e às arritmias presentes nesses pacientes
68
. Quando
se estuda a relação entre PTH e mortalidade, os dados são escassos. Um único estudo
prospectivo que examinou a associação entre PTH e mortalidade encontrou que valores
elevados desse hormônio, no início do tratamento dialítico, conferiram maior sobrevida
aos pacientes, quando comparados a pacientes com valores reduzidos de PTH. Este
aparente paradoxo poderia ser explicado por fatores nutricionais
69
, ou seja, pacientes
13
com PTH baixo poderiam estar seriamente desnutridos, o que reduziria a sua sobrevida.
Uma outra hipótese seria que os valores de PTH no início do tratamento dialítico
refletiram a evolução da doença renal; ou seja, pacientes com PTH baixo seriam aqueles
nos quais a doença que levou à perda da função renal teria evolução mais aguda, não
permitindo o desenvolvimento do HPTH
70
. Entretanto um estudo recente de Block et al
demonstrou que valores de PTH acima de 600 pg/mL se correlacionaram positivamente
com aumento da mortalidade tanto por todas as causas como especificamente por causas
cardiovasculares assim como com uma maior freqüência de hospitalizações relacionadas
a fraturas
71
.
O controle do fósforo sérico (P) tem sido reconhecido há muitos anos como um
fator essencial no tratamento de pacientes com IRC
72
. Na DRC avançada, a excreção de
P é insuficiente para remover a quantidade de P absorvido diariamente da dieta. Além
disso, o tratamento dialítico corrige parcialmente os níveis séricos do P. Como
conseqüência, a hiperfosfatemia é um achado freqüente nesses pacientes
73
. A
importância do controle do P classicamente era atribuída ao seu papel na patogênese do
HPTH
74
; contudo, outros distúrbios secundários à retenção do P têm sido descritos.
Estudo de Block et al mostrou que a hiperfosfatemia está presente em cerca de 50% dos
pacientes em diálise e que níveis de fósforo sérico maiores que 6,5mg/dl aumentam a
mortalidade decorrente de complicações cardiovasculares. O mesmo efeito foi detectado
em relação ao produto cálcio X fósforo (Ca X P)
71,73
. Outra observação importante é que
a hiperfosfatemia pode estar associada à progressão da DRC
75
. Além da hiperfosfatemia,
as medidas adotadas para controlá-la, como o uso de sais de cálcio, têm sido implicadas
14
na elevação da mortalidade cardiovascular, no desenvolvimento de calcificação visceral
e vascular periférica, descritas nos pacientes com DRC
68
. Estas observações são
consistentes com a hipótese de que o pobre controle dos níveis de fósforo nos pacientes
portadores de DRC favorece o desenvolvimento de calcificação coronariana e,
conseqüentemente, de maior risco de óbito
76
. Estudo de Ribeiro et al mostrou elevada
prevalência de calcificação valvar (detectado por ecocardiografia) em pacientes em
diálise quando comparados a controles. A calcificação do anel mitral também era
siginificativamente maior nos pacientes com elevado produto Ca X P (71+/- 19 mg
2
/dl
2
)
63
.
O mecanismo exato através do qual a hiperfosfatemia aumenta a mortalidade não
é conhecido, mas a calcificação vascular (arterial) parece estar envolvida. A calcificação
vascular é atualmente descrita como um processo ativo e regulado por células que
podem, mediante certos estímulos, diferenciarem-se, adquirindo fenótipo de
osteoblastos. Essas células são capazes de sintetizar proteínas reguladoras da
mineralização tais como a osteopontina, osteocalcina, fosfatase alcalina e colágeno tipo
I. Uma variedade de estímulos tem sido descrita como capaz de induzir ou modular a
transformação fenotípica de célula muscular lisa de vasos em células com fenótipo de
osteoblasto, e, conseqüente mineralização in vitro. O P provavelmente induz calcificação
vascular não apenas por mecanismos indiretos, mas também por ação direta sobre sítios
específicos. Estudo de Jono et al
77
demonstrou que, in vitro, o P era capaz de determinar
uma mudança fenotípica nas células musculares lisas de vasos transformando-as em
células com capacidade de mineralização e que essa transformação fenotípica estava
associada a atividade do cotransportador sódio fósforo (Pit-1). Essa ativação leva a
15
formação local de cristais de apatita, em células que normalmente não mineralizam.
Descreveu-se também a indução, estimulada pelo P, do Cbfa-1 (Core biding factor-1),
fator determinante da diferenciação osteoblástica, na célula muscular lisa de vasos
Ref da
Fig 1
. Uma outra via (indireta) cogitada para a indução da calcificação vascular secundária
à hiperfosfatemia seria através da secreção excessiva do PTH
54,61,68
.
16
A figura 1 demonstra esse mecanismo de ação, ou seja, de que forma o P poderia
influenciar o Cbfa-1, fazendo com que essa célula adquirisse fenótipo de osteoblasto,
passando a mineralizar.
Figura 1: Mecanismo de ação: Mineralização da célula muscular lisa vascular via P
NOTA: Adaptado de: Giachelli et al Am J Kidney Dis. 2001;38 (Suppl 1):S34-
37. O mecanismo proposto de mineralização envolve o aumento do transporte de P
secundário à hiperfosfatemia ou por estímulo do fator de crescimento (PDGF) levando
ao aumento do P intracelular. Por mecanismo ainda não estabelecido, o aumento do P
intracelular ativa vias de sinalização que eleva a expressão de 1) genes osteogênicos
(Cbfa-1) e conseqüente produção de osteopontina e osteocalcina 2) redução da expressão
de genes específicos da célula muscular lisa e 3) estimula a secreção de moléculas
capazes de funcionarem com fatores de nucleação mineral (fosfatase alcalina, matriz
extracelular, proteínas ligadoras de Ca e vesículas da matriz). O efeito final é o aumento
da susceptibilidade à calcificação vascular.
Hi
p
erfosfatemia
Vesic. matriz
Matriz extracelular
rica colágeno
Prot. ligadoras de Ca:
Osteocalcina, Osteopontina
Fosfatase alcalina
17
Marchais et al descreveram também que a hiperfosfatemia associa-se a padrão
de circulação hiperdinâmica, com aumento do trabalho cardíaco, além de reduzida
relação parede - lúmen da artéria carótida comum, resultando em elevado estresse da
parede arterial em pacientes portadores de DRC
78
. O mecanismo aventado pelos autores
seria que a hiperfosfatemia, de forma indireta, através do PTH, poderia aumentar o
cronotropismo e o inotropismo das células cardíacas, ou ainda que a hiperfosfatemia
facilitaria calcificação da camada média das artérias, ou mesmo que o PTH determinaria
a ativação de fibroblastos levando a fibrose intersticial.
A doença cardíaca isquêmica não aterogênica também é encontrada
freqüentemente em pacientes portadores de DRC e a sua patogênese tem sido associada
aos distúrbios do metabolismo mineral. Descrição de Amann et al, estudando ratos
urêmicos, mostrou redução da densidade de capilar no miocárdio, assim como, aumento
na relação lúmen – parede de pequenas arteríolas intramiocárdicas, eventos estes
revertidos pela paratireoidectomia e independentes da pressão sangüínea
79, 80
. Outro
estudo demonstrou que coração de ratos urêmicos submetidos à dieta rica em fósforo
apresentava importante aumento da espessura da parede das arteríolas quando
comparado ao de ratos alimentados com dieta pobre em fósforo
81
.
Outro ponto a ser destacado é o papel do cálcio nas lesões cardiovasculares de
pacientes portadores de DRC. O uso freqüente de quelantes de fósforo contendo cálcio,
assim como o uso do calcitriol pode ter como conseqüência elevação da carga de cálcio
oferecida, podendo levar a calcificação cardiovascular. Por outro lado, a presença de
hipocalcemia também é descrita como maléfica. Estudo de Foley et al encontrou em 443
18
pacientes seguidos por 41 meses, que hipocalcemia crônica estava fortemente associada
à mortalidade elevada tanto em pacientes tratados com HD, quanto nos tratados com
diálise peritoneal
82
. Entretanto, Block et al, analisando um número elevado de pacientes
em hemodiálise, demonstrou que a hipercalcemia aumentou significativamente a
mortalidade geral (por todas as causas) assim como a mortalidade de causa
cardiovascular e a freqüência de hospitalizações
71
, sendo esses achados independentes
de idade, sexo, raça, presença de DM, níveis de P e de PTH.
Tem se descrito que a depleção de vitamina D pode estar associada com a
calcificação de coronárias, fenômeno este recentemente descrito como exuberante em
coração de pacientes portadores de DRC
83
. Todavia, sabe-se também que o excesso de
Vitamina D favorece calcificações, denotando assim um mecanismo complexo da ação
da vitamina D, ora favorecendo, ora inibindo a calcificação
84
.
Em virtude das associações entre HPTH, distúrbios dos íons divalentes e maior
mortalidade por DCV, é que postula-se uma mudança na forma atual de tratar o HPTH, a
hiper e hipofosfatemia, e a hipo e hipercalcemia destes pacientes
61, 85
. Por um lado,
sabe-se que para manter uma remodelação óssea adequada os níveis de PTH devem ser
mantidos entre 2 a 3 vezes o valor normal, ou seja, aproximadamente 200pg/ml; valor
que habitualmente sobrepõe a resistência óssea ao PTH. Níveis de PTH mais baixos
podem favorecer o desenvolvimento de Doença Adinâmica.
Para o aparelho cardiovascular, valores de PTH em torno de 60 pg/mL, ou seja,
dentro da normalidade, parecem ser mais adequados. A hipercalcemia, freqüentemente
detectada em pacientes recebendo tratamento com análogos da Vitamina D também é
19
deletéria, pois favorece calcificação. A hipocalcemia, a hiperfosfatemia e o aumento do
produto Ca X P, como já mencionado anteriormente, também podem elevar a
mortalidade por DCV. Os estudos desenvolvidos até o momento, não nos permitem
analisar o efeito isolado de um desses fatores porque, devido à DRC, eles estão alterados
concomitantemente. A hiperfosfatemia, por exemplo, cursa freqüentemente com
elevação dos níveis de PTH, e as intervenções terapêuticas podem promover a
calcificação vascular ou mesmo piorar a função renal ou a remodelação óssea.
Resta-nos, portanto dúvidas sobre qual seria o PTH ideal para o tecido ósseo e para
o aparelho cardiovascular. Será possível obtermos um valor de PTH que permita manter
uma remodelação óssea normal, com mínimo impacto para o aparelho cardiovascular?
Se mantivermos os níveis séricos de PTH dentro do valor normal, associados a
normocalcemia e normofosfatemia, poderemos atenuar as lesões cardiovasculares? Até o
momento, não foi realizado nenhum estudo que avaliasse o impacto de um dos fatores e
da manutenção dos níveis séricos de PTH dentro da concentração fisiológica (mantidos
constantes através do recurso da paratireoidectomia associada à infusão contínua de
PTH) simultaneamente sobre os tecidos ósseo e cardiovascular. Optamos por avaliar o
papel isolado do P. Dessa forma, buscando esclarecer essas dúvidas, desenvolvemos um
projeto de pesquisa que questiona:
1- A indução de hiperfosfatemia em animais com IRC, mantendo-se o PTH
dentro dos limites do normal, poderá resultar em calcificação cardiovascular
e/ou fibrose cardíaca?
2- Uma boa remodelação óssea será obtida com o PTH dentro dos limites
normais associada ao controle do P?
20
2. OBJETIVOS
Avaliar as alterações histológicas ósseas e cardiovasculares em modelo
experimental de uremia crônica, nefrectomia 5/6, em ratos paratireoidectomizados
submetidos à dieta rica e pobre em fósforo, associada à infusão de PTH.
21
3. MÉTODOS
3.a Modelo Experimental: Um total de 32 ratos machos da raça Wistar,
obtidos do Centro de Bioterismo da FMUSP com peso inicial entre 280 a 330g foram
usados nesse estudo. Esses animais foram colocados em gaiolas individuais no biotério
do LIM-16, com controle de iluminação (12 horas de luz e 12 horas de escuro),
temperatura (25
0
C) e humidade (25%). Foi oferecida (por uma semana) dieta controle
(Harlan-Teklad, Madison-WI/ USA), que continha 0,7% de fósforo, 0,7% de cálcio e
24% de proteína na quantidade de 15 a 20g/dia. Realizamos também a medida da
pressão caudal (TCP), utilizando o método auscultatório-oscilométrico. O acesso à água
foi ad libitum.
Após o período de adaptação de uma semana, os animais foram divididos em
quatro grupos (dois grupos estudo com seus respectivos controles). Os animais do grupo
1 (n=8) e os do grupo 3 (n=8) foram anestesiados com pentobarbital (50mg/Kg) por via
intraperitoneal (ip) e submetidos à paratireoidectomia (PTx) utilizando-se técnica de
microcirurgia (lupa cirúrgica para eletrocauterização). Após a PTx, os animais foram
deixados em recuperação por uma semana e receberam dieta controle adotando-se o
protocolo de pair- feeding (15 a 20g/dia), onde a quantidade de ração oferecida ao par de
animais era determinada pelo animal do par que ingeriu menos ração. Após esse período,
os animais foram novamente anestesiados, como descrito anteriormente, e
22
imediatamente antes da realização da nefrectomia 5/6 (Nx), foi colhido amostra de
sangue total através de punção retro-orbital, para a determinação imediata do Ca iônico
(Analisador de eletrólitos AVL-9140). Se o nível sanguíneo de Ca estivesse abaixo de
3,6 mg/dL (= 7,2 mg/dL de Ca total, considerado como adequadamente
paratireoidectomizado) esses animais eram então submetidos à Nx. Essa etapa consistia
na nefrectomia do rim direito seguida da ligadura de 2 a 3 ramos da artéria renal
esquerda. Simultaneamente à Nx, a atividade normal do PTH era restaurada através do
implante de uma minibomba osmótica (Alzet modelo: 2mL
4
, Alza Corp. Palo Alto, CA,
USA colocada na região subcutânea interescapular) permitindo a liberação constante de
PTH de rato (1-34 rat PTH na dose de 0,022/100g/h; da Sigma- Aldrich, St. Louis, MO,
USA)
86
. No 28
0
dia a mini- bomba foi substituída por uma nova mantendo-se as
mesmas taxas de infusão da bomba anterior. Esse implante foi realizado com o animal
anestesiado levemente com éter. A troca foi necessária, pois a vida útil de cada mini
bomba era de 28 dias.
Os animais do Grupo 2 (n=8) e os do grupo 4 (n=8) foram submetidos à sham
PTx e à sham Nx (controles sham) incluindo o implante de minibomba osmótica
contendo veículo (cisteína à 2% em solução salina, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO,
USA).
Imediatamente após a Nx os animais foram alimentados com dietas (Harlan-
Teklad, Madison-WI/ USA) idênticas em composição, com exceção do conteúdo de P,
sendo assim discriminados: Grupo 1 (PTx+Nx+LP) e 2 (sham+LP) receberam dieta com
reduzido teor de P (LP = 0,2% em P) e os grupos 3 (PTx+Nx+HP) e 4 (sham+HP)
receberam dieta com elevado teor de P (HP= 1,2% em P). Todas as dietas tinham o
23
mesmo conteúdo calórico, assim como de vitamina D, Cálcio (Ca=0,7%) e proteína
(24%). Foi adotado o protocolo de pair- feeding (15 a 20g/dia) com a monitorização da
ingestão da ração efetuada três vezes por semana, procurando-se manter a oferta de dieta
entre 15 e 20 g/dia/rato para todos os grupos. Foram também determinados
semanalmente o peso e a TCP de todos os animais.
Para podermos efetuar a análise dinâmica da histomorfométria óssea, os animais
receberam injeção ip de terramicina na dose de 25 a 30 mg/Kg nos dias 11
0
, 12
0
e 4
0
, 5
0
,
respectivamente, que antecederam a data do sacrifício.
Findo o período do experimento (8 semanas), os animais foram anestesiados com
pentobarbital (50mg/Kg ip) e submetidos à coleta de sangue através de punção aórtica,
além de se proceder a retirada do coração, segmento da artéria aorta, segmento da artéria
femoral esquerda, fêmur esquerdo e direito.
3 b. Análise bioquímica: Foi colhido sangue para determinação de
microhematócrito (Ht), separado soro e congelado para dosagens bioquímicas
posteriores. Determinado Ca iônico, P (método colorimétrico Labtest-Lagoa Santa,
MG/BR), Creatinina (Cr, método colorimétrico Heinegard-Tiderstrom modificado) e
PTH (rat PTH IRMA kit –Immutopics San Clemente, CA/USA. Valor normal para rato
Wistar com função renal normal: 42±4 pg/mL
87
).
3 c. Avaliação Histológica: Histomorfometria óssea - Foram retirados os
fêmures esquerdos e direito, fixados em álcool a 70% e processados como previamente
descrito
88
. Utilizando-se um micrótomo K Jung, obtivemos cortes de 5 μm e 10μm de
24
espessura da porção distal dos fêmures. As secções de 5μm foram coradas com azul de
toluidina a 0,1% (pH= 6,4), sendo que no mínimo 2 cortes não consecutivos foram
examinados para cada amostra. Os parâmetros estáticos, estruturais e dinâmicos de
formação e reabsorção óssea foram medidos na metáfise distal (aumento 250x), a
195μm da cartilagem de crescimento. Um total de 30 campos foram quantificados,
utilizando-se um software semi-automático de análise de imagens (Osteomeasure –
Osteometrics, Inc., Atlanta, GA, USA). A taxa de aposição mineral (MAR) foi
determinada a partir da distância entre duas marcações de terramicina, dividida pelo
intervalo de tempo entre as duas administrações de terramicina e foi expresso em μ/d. O
intervalo de mineralização (MLT) foi expresso em dias. A percentagem de superfície
com duplas marcações de terramicina do total da superfície trabecular (MS/BS) e a taxa
de formação óssea (BFR) completaram a análise dinâmica. Os índices
histomorfométricos estáticos incluíram as taxas de volume ósseo trabecular e do volume
osteóide para o volume ósseo (BV/TV e OV/BV respectivamente, expressos em
percentagem), assim como a espessura osteóide (O.Th), em μ. A percentagem de
superfície trabecular total foi usada para expressar as áreas de superfície de reabsorção
(ES/BS), da superfície osteóide (OS/BS), da superfície de osteoblasto (Ob.S/BS) e da
superfície de osteoclasto (Oc.S/BS). A espessura trabecular (TB.Th) e a separação
trabecular (Tb.Sp) foram expressos em μ. O número de trabéculas (Tb.N) foi expresso
em número por milímetros. Os índices histomorfométricos foram apresentados segundo
a nomenclatura recomendada pela American Society of Bone and Mineral Research
25
(ASBMR)
89
. A análise histomorfométrica foi realizada por observador sem
conhecimento dos grupos.
3 d. Avaliação Histológica: Histologia Cardiovascular: O coração foi retirado,
lavado em solução salina, pesado e seccionado para fixação. Foi efetuado também o
cálculo do peso do coração (HW) normatizado para 100 g de peso do animal
(HW/100gBW). Também foram retirados fragmento das artérias aorta e femoral
esquerda, que foram fixados em formol a 10% e posteriormente embebidos em parafina.
Seções transversais com espessura de 4 μm do coração, aorta torácica e da artéria
femoral foram corados com as técnica de von Kossa, Verhoeff, Picrosirius,
hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson. Análise histológica qualitativa para
determinação de calcificação e fibrose foi realizada por patologista sem conhecimento
dos grupos.
3 e. Comissão de Ética:
O projeto foi desenvolvido em acordo com as normas éticas da FMUSP e
previamente autorizado pela comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
(CAPPesq) sob N
0
de protocolo: 293/01.
26
3 d. Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão (MD±SE). A comparação
entre os grupos foi feita por one way ANOVA (pós-teste de Tukey), após teste para
normalidade de distribuição, e teste t não pareado com correção de Welch, quando
necessário. Utilizamos o software Prisma versão 3.03 (GraphPad Software, Inc., San
Diego, CA, USA). Análise de regressão logística stepwise foi feita para determinar quais
variáveis independentes influenciaram significativamente a variável dependente
(HW/100gBW, Cr e BV/TV). As variáveis independentes incluídas na análise foram
aquelas que se mostraram significantes ou próximas à significância na análise
univariada. Nessa etapa, utilizamos o software SPSS, versão 8.0 (SPSS, Inc. Chicago,
IL, USA). Foi considerado significativo valor de p < 0,05.
27
4. RESULTADOS
4 a. Peso, Ingestão , HW, HW/100gBW e TCP:
A tabela 1 e o anexo, gráfico1 resumem os dados gerais dos animais. A duração
da uremia e do tratamento com a dieta foi de 52 dias. O peso inicial dos animais foi
semelhante entre os grupos. Ao término do estudo, apesar do protocolo de pair feeding,
os animais do grupo PTx+Nx+HP tiveram um peso final menor que os demais grupos.
Comparado aos grupos sham os animais do grupo PTx+Nx+HP ingeriram uma
quantidade discretamente menor de dieta. O peso do coração foi semelhante entre os
grupos, porém quando se corrigiu o peso do coração para o peso do animal
(HW/100gBW) o mesmo foi significativamente maior no grupo PTx+Nx+HP do que em
qualquer outro grupo revelando a presença de hipertrofia miocárdica nesses animais. A
TCP inicial foi semelhante entre os grupos; no entanto após os 52 dias de uremia, os
animais submetidos à Nx (PTx+Nx+HP e PTx+Nx+LP) desenvolveram hipertensão
arterial, devendo-se entretanto ressaltar que os níveis pressóricos foram semelhante entre
os animais submetidos a Nx. Quando comparados aos animais controles (sham+HP e
sham+LP) os níveis de TCP foram significativamente maior nos animais submetidos à
Nx.
28
Tabela 1. Dados dos animais.
Peso
Inicial
(g)
Peso
Final
(g)
Ingestão
(g/dia)
HW
(g)
HW/100gBW TCP
(mm/Hg)
PTx+Nx+LP
307,9
(11,8)
416,9
(12,3)
17,19
(0,54)
1,31
(0,05)
0,32
(0,01)
141,6
Φ
(2,11)
sham+LP
310,3
(10,5)
432,3
(13,0)
17,59
(0,47)
1,21
(0,03)
0,28
(0,01)
114,9
(1,20)
PTx+Nx+HP
322,0
(10,0)
352,3*
(16,8)
15,77
#
(0,38)
1,25
(0,04)
0,36*
(0,01)
137,5
#
(1,31)
sham+HP
311,1
(13,2)
397,9
(8,8)
17,53
(0,40)
1,14
(0,03)
0,29
(0,01)
109,6
(1,13)
NOTA: Resultados entre parênteses = ± Erro padrão, HW = peso do coração; ∗ =
p < 0,05 PTx+Nx+HP vs. demais grupos; Φ = p < 0,05 PTx+Nx+LP vs. sham+HP e
sham+LP; # = p < 0,05 PTx+Nx+HP vs sham+HP e sham+LP.
29
4 b. Resultados bioquímicos:
A tabela 2 e o anexo, gráfico 1 e 2 mostram os resultados da análise bioquímica e
do Ht. Os animais do grupo PTx+Nx+HP apresentaram níveis de Ht menores que os
demais grupos. Os animais submetidos à Nx e que receberam dieta com teor elevado em
fósforo (PTx+Nx+HP) apresentaram hipocalcemia e hiperfosfatemia severas, além de
elevado produto Ca X P, mesmo na presença de hipocalcemia. Os animais submetidos à
Nx (PTx+Nx+HP e PTx+Nx+LP) desenvolveram insuficiência renal, mas aqueles que
ingeriram dieta com elevado teor de P (PTx+Nx+HP) tiveram níveis séricos de Cr
maiores que os animais que ingeriram dieta com teor reduzido de P (PTx+Nx+LP). A
infusão contínua do PTH 1-34 de rato normalizou os níveis séricos de PTH naqueles
animais previamente submetidos à PTx. Os animais controle que receberam dieta com
reduzido teor de P (sham+LP) apresentaram níveis significativamente menores de PTH
quando comparado aos demais grupos.
30
Tabela 2. Resultados do Ht e da análise bioquímica.
Ht
(%)
Cai
(mg/dL)
P
(mg/dL)
Ca xP
(mg
2
/dL
2
)
Cr
(mg/dL)
PTH
(pg/mL)
PTx+Nx+LP
42,9
(1,1)
4,75
(0,20)
5,65
(0,48)
52,09
(3,46)
0,59
Φ
(0,03)
114,9
(30,1)
sham+LP
42,9
(0,5)
4,87
(0,21)
4,43
(0,39)
41,97
(1,73)
0,32
(0,01)
10,5
+
(2,8)
PTx+Nx+HP
39,1*
(1,3)
2,44*
(0,22)
15,71*
(2,56)
67,79
#
(5,19)
1,09*
(0,15)
86,8
(20,3)
sham+HP
43,5
(0,5)
4,34
(0,35)
4,95
(0,33)
45,86
(2,46)
0,46
(0,03)
135,9
(28,6)
NOTA: Resultados entre parênteses = ±Erro padrão, ∗ = p < 0,05
PTx+Nx+HP vs. demais grupos; Φ = p < 0,05 PTx+Nx+LP vs. sham+HP e
sham+LP; # = p < 0,05 PTx+Nx+HP vs. sham+HP e sham+LP; + = p < 0,05
sham+LP vs. demais grupos.
31
4 c. Análise histológica: Histomorfometria óssea.
A tabela 3 e o anexo, gráfico 1 resumem os dados histomorfométricos. A.análise
dos parâmetros histomorfométricos ósseos evidenciou que a remodelação óssea
(turnover e arquitetura) normal não pôde ser conseguida nos animais que receberam
dieta rica em fósforo (PTx+Nx+HP, sham+HP). Nesses ratos, o volume ósseo (BV/TV)
foi menor e esse achado foi independente da presença de uremia. Chama atenção
também uma maior separação trabecular (Tb.Sp) e um menor número de trabéculas
(Tb.N) nos ratos que consumiram dieta rica em fósforo (PTx+Nx+HP, sham+HP),
evidenciando um efeito osteoporose-like da dieta rica em fósforo. Foi possível também
observar uma maior taxa de aposição mineral (MAR) nos ratos urêmicos que ingeriram
dieta com teor reduzido em fósforo (PTx+Nx+LP) quando comparados ao grupo
sham+LP e uma maior taxa de formação óssea (BFR/BS) em ratos urêmicos
(PTx+Nx+HP e PTx+Nx+LP). Apesar de não alcançar significância estatística quando
comparados aos demais grupos observamos também um maior tempo de mineralização
óssea (MLT) nos animais do grupo PTx+Nx+HP.
32
Tabela 3. Variáveis Histomorfométricas do osso trabecular (fêmur distal).
BV/TV
(%)
OV/BV
(%)
O.Th
(µ)
OS/BS
(%)
ES/BS
(%)
ObS/BS
(%)
OcS/BS
(%)
Tb.Sp
(µ/m)
Tb.N
(/mm)
Tb.Th
(µ/m)
MS/BS
(%)
MAR
(µ/d)
BFR/BS
(µ
3
/µ
2
/d)
MLT
(d)
PTx+Nx+LP
24,72
(2,41)
0,83
Φ
(0,16)
2,12
(0,18)
10,78
(1,65)
13,83
(1,97)
7,33
(1,28)
4,33
(1,01)
178,7
(17,88)
4,39
(0,26)
55,56
(2,88)
4,47
(0,35)
1,17
Φ
(0,10)
0,05
Φ
(0,01)
4,34
(0,59)
sham+LP
26,77
(1,72)
0,34
(0,11)
2,05
(0,24)
5,47
(1,38)
10,37
(1,44)
2,69
(0,60)
3,16
(0,70)
161,8
(9,35)
4,53
(0,21)
58,17
(2,59)
3,10
(0,57)
0,78
(0,05)
0,02
(0,01)
6,28
(1,83)
PTx+Nx+HP
16,64*
(1,58)
2,31
(1,00)
3,04
(0,60)
17,12
(4,39)
13,04
(2,21)
10,57
(2,80)
3,72
(0,83)
309,3*
(51,54)
3,07*
(0,33)
55,06
(2,30)
5,88
(1,20)
1,17
(0,19)
0,08
Δ
(0,02)
11,82
(5,13)
sham+HP
16,99
#
(1,66)
0,62
(0,19)
2,16
(0,09)
6,72
(1,93)
11,86
(2,20)
4,26
(1,65)
3,84
(0,74)
250,6
#
(34,70)
3,58
#
(0,33)
47,76
+
(1,88)
3,32
(0,66)
0,76
(0,09)
0,03
(0,01)
6,41
(1,17)
NOTA: Resultados entre parênteses = ± Erro padrão; * = p < 0,05 PTx+Nx+HP vs. os grupos LP; # = p < 0,05 sham+HP vs.
os grupos LP ; Φ = p < 0,05 PTx+Nx+LP vs. sham+LP; Δ
= p < 0,05 PTx+Nx+HP vs. os grupos sham; + = p < 0,05
sham+HP vs. demais grupos.
33
4 d. Análise histológica qualitativa cardiovascular.
A eficácia da dieta rica em fósforo em induzir calcificação cardiovascular e
fibrose foi avaliada através de histologia qualitativa. As análises, no entanto, não
evidenciaram calcificações vasculares, tanto em artérias como miocárdio, o mesmo
ocorrendo com a fibrose.
34
4 e. Análise Univariada e Multivariada
A tabela 4 mostra os resultados da análise univariada, revelando que
HW/100gBW correlacionou-se fortemente com os níveis de P sérico (r = 0,76; p <
0,0001), com o produto Ca X P (r = 0,76; p < 0,0001) e com a Cr sérica (r = 0,75 ; p <
0,0001). Correlações fortes também foram detectadas entre a Cr e o P (r = 0,94; p<
0,0001) e entre a Cr e o produto Ca X P (r=0,81; p < 0,0001). O Ca sérico correlacionou-
se positivamente com o peso final, com a ingestão da dieta e com o Ht e negativamente
com o HW/100gBW, com a TCP, com a Cr sérica, com o P e com o produto Ca X P. O
volume trabecular (BV/TV) correlacionou-se com o Ca sérico e com o peso final e quase
alcançou o grau de significância estatística com o P e a Cr séricas.
35
Tabela 4. Análise Univariada
HW/100gBW TCP Ht Cr Cai P Ca x P BV/TV
Peso Final
-0,67
<0,001
0,45
<0,01
-0,71
<0,0001
0,70
<0,0001
-0,74
<0,0001
-0,69
<0,001
0,36
<0,05
HW/100gBW
0,56
<0,001
-0,32
=0,07
0,75
<0,0001
-0,76
<0,0001
0,76
<0,0001
0,76
<0,0001
HW
0,41
<0,01
Ingestão
-0,43
<0,05
0,63
<0,0001
-0,49
<0,001
-0,48
<0,01
TCP
0,54
<0,01
-0,39
<0,05
0,43
<0,05
0,56
<0,001
Ht
-0,61
<0,001
0,57
<0,001
-0,67
<0,0001
-0,55
<0,01
Cr
-0,84
<0,0001
0,94
<0,0001
0,81
<0,0001
-0,34
=0,06
Cai
-0,89
<0,0001
-0,76
<0,0001
0,52
<0,01
P
0,88
<0,0001
-0,29
=0,11
36
A tabela 5 mostra os resultados da regressão linear. Pode-se notar que
HW/100gBW foi dependente do P e da TCP. Além disso, a correlação entre Ht e a
hipertrofia miocárdica não alcançou significância estatística (p=0,059). Outro resultado
importante foi que os níveis de Cr foram dependentes dos níveis de P. Pode-se notar que
a correlação entre a TCP e a Cr quase alcançou significância estatística (p = 0,052). O
volume trabecular (BV/TV) foi dependente do Ca sérico e do P sérico. Apesar do Ca
sérico na correlação simples ter se associado a diversas variáveis, esses achados não se
mantiveram na regressão linear com exceção do volume trabecular (BV/TV).
Tabela 5. Análise multivariada dos preditores da hipertrofia miocárdica, da função
renal, e do volume ósseo trabecular.
B Índice de
Confiança
P
HW/100gBW
Ht
TCP
P
0,004
0,001
0,005
0; 0,008
0,0008; 0,0012
0,003; 0,007
0,059
0,03
0,00001
Cr
TCP
P
0,003
0,037
-0,001; 0,005
0,017; 0,057
0,052
0,002
BV/TV
Ca
P
6,9
0,93
2,87; 10,93
0,1; 1,72
0,002
0,03
37
5. DISCUSSÃO
Esse estudo mostrou que ratos com insuficiência renal crônica moderada que
receberam dieta rica em fósforo e mantidos com concentrações fisiológicas de PTH não
desenvolveram calcificação cardiovascular, apesar da presença de hiperfosfatemia
marcante, assim como elevação do produto Ca X P. Por outro lado, a hiperfosfatemia
associou-se ao desenvolvimento de hipertrofia miocárdica. Pudemos também demonstrar
que a disfunção renal foi agravada pela hiperfosfatemia. Outro resultado interessante foi
a associação entre a ingestão elevada de fósforo e o desenvolvimento de lesão óssea
osteoporose-like que por sua vez, foi agravada pela uremia.
Até o presente momento, não existem modelos animais de calcificação vascular
em ratos urêmicos. Nós desenhamos esse estudo visando avaliar se o fósforo poderia
induzir calcificação vascular in vivo. Em nosso modelo, não demonstramos a relação
entre hiperfosfatemia e calcificação vascular, complicação freqüente em pacientes
portadores de DRC em diálise
73, 90
. Há poucos estudos experimentais que avaliaram a
calcificação vascular em milieu urêmico. Ejerblad et al, induziram uremia em ratos com
e sem PTx, demonstrando calcificação arterial e morte espontânea após 36 semanas
91
.
Esses autores mostraram que as alterações arteriais foram dependentes do grau e da
duração da uremia, uma vez que, estas estavam presentes em apenas alguns animais,
especialmente aqueles com uremia severa. Os autores também destacaram que a PTx
38
preveniu o desenvolvimento da calcificação vascular, indicando que o
hiperparatireoidismo secundário pode ter desempenhado um papel importante no
aparecimento da calcificação vascular. Esses autores não demonstraram o efeito isolado
do P do restante das alterações metabólicas presentes na IRC. Em nosso estudo,
decidimos observar o papel isolado do fósforo, e assim propositadamente escolhemos
um período de observação mais curto, associado a níveis moderados de insuficiência
renal, visando minimizar os efeitos da anemia e da acidose metabólica. Além disso,
optamos por usar uma concentração fixa de PTH. Essa concentração foi considerada
fisiológica em outro estudo, pois corrigia a hipocalcemia que se seguia a PTx. Essa
concentração, entretanto, não permitiu a correção da hipocalcemia nos ratos
PTx+Nx+HP. Esse fato pode ter prevenido o aparecimento da calcificação extra óssea,
obscurecendo, dessa forma, o eventual fator pró calcificante dependente da
hiperfosfatemia. Sabemos que, na uremia, a ação calcemiante do PTH encontra-se
prejudicada, como conseqüência da chamada resistência óssea à ação do PTH. No
ambiente urêmico, portanto, os níveis do PTH considerados ideais são mais elevados,
sobretudo na presença de hiperfosfatemia.
Devemos ressaltar também que o aporte de Ca para todos os grupos foi
semelhante, pois todas as dietas tinham a mesma concentração de Ca,e a quantidade
ingerida de dieta pelos grupos foi semelhante com exceção do grupo PTx+Nx+HP, que
ingeriu uma quantidade discretamente menor de dieta. A ausência de sobrecarga de Ca
nesses animais pode também ter representado um papel protetor para o desenvolvimento
de calcificação extra óssea. Pacientes em hemodiálise tratados com quelantes de fósforo
a base de cálcio, e com o cálcio que recebem do dialisato podem desenvolver sobrecarga
39
de cálcio e calcificação extra óssea. Modelos experimentais submetidos à sobrecarga de
cálcio por tempo prolongado e em vigência de insuficiência renal também desenvolvem
essa complicação.
Outro ponto a ser ressaltado é que parte da hipocalcemia do grupo PTx+Nx+HP
pode ter sido conseqüente à presença da hiperfosfatemia via mecanismo puramente
físico-químico, ou ainda por maior déficit na produção de calcitriol conseqüente à maior
lesão renal. Sabemos que, com a piora progressiva da função renal, ocorre também uma
redução da síntese de calcitriol, que por sua vez, determina menor absorção de Ca
intestinal. Além disso, a hiperfosfatemia inibe a síntese da 1 α hidroxilase, reduzindo
ainda mais a síntese do calcitriol. Entretanto, a comprovação de menores níveis de
calcitriol não pôde ser evidenciada nesse estudo.
Nos modelos animais sem insuficiência renal, a presença de calcificação vascular
associou-se à indução prévia de hiperlipidemia, à administração de nicotina, Warfarin ou
ainda a altas doses de VD, assim como à combinação desses fatores
92
. Dessa forma, a
calcificação detectada foi atribuída a outros fatores que não ao fósforo. Outro
determinante importante é o teor de cálcio e a proporção Ca/P na dieta. Esses estudos
demonstraram calcificação arterial utilizando-se dietas com elevadas proporções Ca/P ou
de Ca. Essas modificações provavelmente favoreceram a hipercalcemia. Devemos
lembrar que os níveis séricos de PTH em nosso estudo podem ter prevenido o
desenvolvimento da calcificação vascular, uma vez que, provavelmente, elevados níveis
de PTH sejam uma condição necessária para a presença da calcificação cardiovascular
ou extra-óssea, talvez conseqüente ao aumento do cálcio citosólico
93
. Os prováveis
40
fatores que contribuíram para que não observássemos calcificação vascular foram: o
modelo animal, uma vez que ratos provavelmente são mais refratários a desenvolverem
calcificação, a presença de hipocalcemia, a insuficiência renal moderada, o período curto
de observação (8 semanas) e, finalmente, a manutenção dos níveis de PTH dentro da
faixa fisiológica. Poderíamos também conjecturar que fatores inibidores da calcificação
vascular, mesmo na presença de um promotor reconhecido da calcificação, representado
pela hiperfosfatemia; poderiam ter prevenido o desenvolvimento da calcificação. Dentre
eles poderíamos lembrar a osteopontina (OPN). Essa fosfoproteína ácida tem sido
descrita como um potente inibidor da formação de cristais de apatita, assim como fator
estimulante da função osteoclástica. Assim, da mesma forma que a OPN pode ter
impedido a calcificação vascular, ela poderia ter atuado no tecido ósseo levando ao
desenvolvimento de lesão osteoporose like
94
. No entanto, não podemos confirmar esta
hipótese, pois não realizamos análise de OPN nesses tecidos.
Outro achado importante foi a hipertrofia miocárdica no grupo PTx +Nx+HP,
como evidenciado pelo maior HW/100gBW. Essa hipertrofia não se correlacionou com
os níveis de PTH. Achado semelhante foi descrito por Amann et al
95
, que encontrou
maior peso de ventrículo esquerdo em ratos nefrectomizados submetidos à dieta rica em
fósforo. Contudo, os autores também encontraram níveis de PTH mais elevados nesses
ratos, tornando difícil distinguir qual o papel do fósforo e do PTH no desenvolvimento
de hipertrofia miocárdica. Portanto, até o momento este é o único trabalho que
demonstrou que a hiperfosfatemia isolada associou-se ao desenvolvimento de hipertrofia
miocárdica. Isto pode ter ocorrido por um aumento desproporcional no conteúdo de
colágeno, resultando em fibrose miocárdica e alterações estruturais com remodelação do
41
miocárdio hipertrofiado. Contudo, nós não conseguimos demonstrar a presença de
fibrose miocárdica com as técnicas usadas. Talvez uma análise mais detalhada, como a
histomorfometria estereológica, seria necessária. Mesmo assim, essa hipertrofia
miocárdica induzida pelo fósforo poderia, por si só, ser outro fator agravante para a
elevada taxa de mortalidade cardiovascular descritas em pacientes portadores de DRC.
A progressão da insuficiência renal tem sido associada a vários fatores,
predominando entre eles os fatores glomerulares, hemodinâmicos, hipertensão arterial
sistêmica e a ingestão de proteínas e fósforo. Evidências experimentais tem sido
encontradas correlacionando os níveis de fósforo com a progressão da insuficiência renal
em ratos nefrectomizados
96
. No entanto, esses autores não empregaram o protocolo de
pair feeding e a ingestão protéica não foi controlada. Portanto, alguns dos efeitos
protetores poderiam ser explicados pela restrição protéica que acompanhou a restrição
do fósforo. Além disso, o PTH provavelmente diferiu entre os grupos submetidos à dieta
rica e pobre em fósforo. Outros estudos têm documentado o efeito adverso da dieta rica
em fósforo sobre a função renal. Acredita-se que a deposição de fosfato de cálcio
decorrente da hiperfosfatemia leve a lesão tecidual. Porém, não existem até o momento
estudos que tenham separado a influência do PTH na patogênese da disfunção renal. Em
nosso trabalho, utilizamos infusão fisiológica de PTH para restaurar os níveis de PTH
aos valores normais e, conseqüentemente, demonstrar que a disfunção renal pode ser
agravada pela hiperfosfatemia. Nós também demonstramos que quando a restrição de
fósforo foi estabelecida (mesmo com níveis constantes de PTH) houve proteção da
progressão da lesão renal. A piora da função renal aparentemente não se deve à
nefrocalcinose, visto que nós encontramos apenas calcificações esparsas nos animais
42
nefrectomizados (PTx+Nx+HP e PTx+Nx+LP , dados não mostrados). É provável que
nossos animais não desenvolveram nefrocalcinose devido aos níveis de PTH e ao fato de
não terem sido submetidos à dieta com teor elevado de cálcio. Cozzolino et al,
analisando o impacto de diferentes quelantes de fósforo sobre o tecido renal
97
encontraram uma maior deposição de cálcio tanto em animais não tratados (com
elevados níveis de fósforo e PTH) como em animais que receberam sais de cálcio (com
controle do fósforo e PTH, mas às custas de elevada carga de cálcio). Como em nosso
estudo, esses autores não puderam identificar a presença de calcificação vascular nos
animais e sugeriram que a indução de calcificação secundária a elevações do produto Ca
X P é dependente do tempo e do tecido estudado.
Analisando-se os efeitos ósseos da dieta rica em fósforo, encontramos em nossos
animais um menor volume trabecular. Além disso, detectamos perda de conectividade,
independente da uremia (PTx+Nx+HP e sham+HP), determinando uma lesão óssea
osteoporose like. Esse é o primeiro estudo experimental que avaliou a ação isolada da
hiperfosfatemia e da dieta rica em P através de histomorfometria óssea. Classicamente, o
papel da hiperfosfatemia e do P sobre o metabolismo ósseo tem sido descrito em
pacientes ou animais com função renal preservada, através de achados de densitometria
óssea, nos quais descreve-se uma redução da densidade mineral óssea e, portanto,
osteoporose. Esses estudos habitualmente apontam como causa determinante da redução
da densidade mineral óssea o reduzido aporte dietético de cálcio, em virtude da
substituição de alimentos contendo Ca por alimentos ricos em P; ou ainda pelo
desenvolvimento do hiperparatireoidismo secundário nutricional
98,99
. Em nosso modelo
pudemos constatar que as lesões ósseas estiveram dissociadas da presença de
43
hiperparatireoidismo secundário ou ainda da redução do aporte de dietético de Ca.
Quando analisamos os estudos em animais urêmicos, as informações são também
escassas e freqüentemente associadas à presença de hiperparatiroidismo secundário à
DRC. Szabó et al realizaram um estudo experimental que procurou avaliar se doses
fisiológicas de PTH ou calcitriol eram capazes de normalizar a função de osteoclastos e
osteoblastos em ratos urêmicos
100
. Esses autores viram que a administração de PTH e
calcitriol em doses fisiológicas aumentou os níveis séricos de cálcio, e não normalizou a
percentagem da superfície óssea recoberta por osteoclastos. Contudo, eles não puderam
determinar se a falta de resposta das células ósseas foi conseqüente à resistência ao PTH,
ao calcitriol ou ambos, ou a outro fator urêmico não identificado. Em nosso estudo, o
fósforo provavelmente foi um fator decisivo na patogênese da lesão óssea, mesmo na
ausência de hipocalcemia, uma vez que os animais que receberam dieta rica em fósforo e
que permaneceram com níveis séricos de cálcio normais (sham + HP) também
desenvolveram lesão óssea osteoporose-like. Bover et al também encontraram que a
uremia e o fósforo separadamente determinaram importantes efeitos na resistência óssea
ao PTH
101
. Nesse estudo, porém, a histomorfometria óssea não foi realizada. Nossos
resultados evidenciaram que a restauração dos níveis de PTH a valores fisiológicos não
foi capaz de normalizar a remodelação óssea. Uma possível explicação seria que a
hiperfosfatemia reduz a resposta óssea à ação do PTH, levando à lesão óssea.
Confirmando a nossa hipótese, Bover et al
101
, estudando ratos urêmicos,
demonstraram que a resposta calcêmica à infusão de PTH estava prejudicada em ratos
alimentados com dieta rica em P. Em modelos cujos animais tiveram as paratireóides
preservadas, a sobrecarga de P levou a hipocalcemia e conseqüente hiperparatireoidismo
44
secundário. Como nossos ratos tinham níveis séricos de PTH fixos o achado final foi a
perda de massa óssea provavelmente pela menor eficiência do PTH em manter uma
adequada remodelação óssea.
O mecanismo pelo qual o P reduz a resposta óssea à ação do PTH é
desconhecido. Uma provável explicação seria a atuação do P no sistema
RANK/RANKL/OPG (receptor ativador do fator nuclear κB/ ligante do receptor
ativador do fator nuclear κB/ osteoprotegerina). Conforme já descrito
102
, os osteoblastos
estimulam a diferenciação dos osteoclastos através da expressão em sua membrana do
RANKL. Este último, ao interagir com o RANK presente no precursor do osteoclasto
leva à diferenciação do último. Esta interação é modulada pela OPG que, ao se ligar ao
RANK, impede sua atuação. Sabe-se que o PTH estimula a formação de RANKL e,
portanto, a ativação do osteoclasto. O P poderia atuar nesse sistema impedindo a ação do
PTH e conseqüentemente a remodelação óssea. Esta teoria poderia ser eventualmente
confirmada através da avaliação da expressão de RANKL e OPG no tecido ósseo desses
animais.
Outro ponto a ser ressaltado é o papel que a apoptose da célula óssea induzida
pelo P pode ter representado na patogênese da lesão óssea (diminuição do volume
trabecular e perda da conectividade óssea), osteoporose like presente nos animais que
ingeriram dieta rica em P, sobretudo nos hiperfosfatêmicos. Sabemos que o esqueleto é
continuamente renovado e que a taxa de formação óssea é determinada pelo número de
osteoblastos. Se ocorre aumento da apoptose dos osteoblastos, esse fato contribuiria para
reduzir o número de osteoblastos e conseqüentemente reduzir a massa óssea. Sabemos
45
também que a apoptose do osteoblasto é fator determinante da remodelação óssea
normal e que a sua exacerbação está implicada na patogênese de diversas doenças
osteometabólicas, incluindo a osteoporose
103,
104
. Osteoblastos em cultura na presença de
elevadas concentrações de P sofrem apoptose que aumenta quanto maior for a
concentração de P no meio e com o tempo de exposição ao P. Sabe-se também que o
bloqueio da ação do cotransportador sódio P previne a apoptose do osteoblasto. O
aumento do P intracelular desencadeia uma profunda perda do potencial de membrana
da mitocôndria sugerindo que esse elemento ativa o programa de morte celular
105
.
Poderíamos então conjecturar que a sobrecarga de P, sobretudo com o desenvolvimento
de hiperfosfatemia em nosso modelo poderia ter exacerbardo a apoptose das células
osteoblásticas determinando a lesão óssea vista em nossos animais. Entretanto, estudos
posteriores são necessários para confirmar esta hipótese.
46
6. CONCLUSÕES
A hiperfosfatemia não induziu calcificações vasculares (arterial) quando o PTH
permaneceu dentro da faixa fisiológica. Apesar de não termos demonstrado a presença
de calcificação vascular, não pudemos descartar efeitos adversos da hiperfosfatemia
sobre o leito vascular (arterial).
A hipertrofia miocárdica detectada relacionou-se de forma marcante com a
hiperfosfatemia, além disso, essa hipertrofia não pode ser atribuída à hipertensão
arterial, à ação do PTH ou mesmo à anemia.
A hiperfosfatemia favoreceu a piora da função renal. Sendo essa ação
independente do PTH.
A hiperfosfatemia propiciou o desenvolvimento de lesão óssea osteoporose-like
com perda de conectividade óssea, independente da presença de insuficiência renal.
A reposição fisiológica do PTH não foi capaz de corrigir a remodelação óssea
sendo essa agravada pela hiperfosfatemia.
Nossos achados corroboram a importância do controle do fósforo para a redução
da morbidade e mortalidade descrita nos pacientes com insuficiência renal crônica. O
mecanismo molecular da ação da hiperfosfatemia sobre órgãos alvo merece ser avaliado
em estudos posteriores.
47
7. ANEXOS
7.a Gráficos
LEGENDA: Gráfico 1. A: Animais submetidos à nefrectomia (HP ou LP) tiveram
pressão caudal (TCP) maior que os animais controles. Não houve diferença estatística na
TCP entre os animais nefrectomizados (PTx+Nx+HP e PTx+Nx+LP). B: Apenas os
animais PTx+Nx+HP tiveram maior peso do coração corrigido para o peso do animal
(HW/100gBW) denotando a presença de hipertrofia miocárdica. C: Animais submetidos
à nefrectomia desenvolveram insuficiência renal, mas aqueles que ingeriram dieta rica
em fósforo tiveram uma perda de função renal maior do que os que ingeriram dieta
pobre em fósforo. D: Animais que ingeriram dieta rica em fósforo tiveram um menor
volume trabecular (BV/TV), sendo esse achado independente da uremia. # = p<0,05,
PTx+Nx (HP ou LP) vs sham (HP ou LP); * = p<0,05, PTx+Nx+HP vs todos os outros
grupos; θ = p<0,05 PTx+Nx+LP vs sham (HP ou LP); Δ = p<0,05, HP vs LP.
LEGENDA: Gráfico 2. A: Animais controle que ingeriram dieta pobre em fósforo
tiveram menor nível de paratormônio (PTH). Animais submetidos à nefrectomia e à
paratireoidectomia tiveram níveis semelhantes de PTH, permitindo análise isolada da
hiperfosfatemia. B: PTx+Nx+HP apresentaram menores níveis de Cálcio iônico (Ca i),
C: PTx+Nx+HP apresentaram maiores níveis de fósforo (P). D: PTx+Nx+HP
apresentaram maiores níveis de produto Ca X P (Ca X P). + = p<0,05, PTx+Nx+LP vs
todos os grupos, * = p<0,05, PTx+Nx+HP vs todos os grupos.
48
Gráfico1: TCP, Cr, HW/100gBW e BV/TV
s
h
am
+
HP
PT
x
+
Nx
+
HP
s
h
am
+
L
P
PTx+
Nx
+
L
P
0
50
100
150
#
#
TCP (mmHg)
s
h
a
m
+H
P
PTx+Nx+HP
sham+L
P
P
T
x+Nx+
LP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
HW/100gBW
s
ham
+H
P
P
T
x+Nx+HP
sham+
L
P
P
Tx
+Nx+
LP
0.0
0.5
1.0
1.5
*
φ
Cr (mg/dL)
A
B
C
s
h
am+HP
P
Tx+Nx+HP
sham
+L
P
PTx+N
x+
LP
0
10
20
30
Δ
Δ
BV/ TV (%)
D
49
sh
a
m+HP
PTx+Nx+HP
s
h
am+LP
PTx
+
Nx+LP
0
100
200
+
PTH (pg/mL)
sham+HP
PT
x+
N
x+
H
P
sham+LP
PTx+Nx+LP
0
10
20
*
P (mg/dL)
AB
C
sham+HP
PT
x
+Nx+HP
sh
am+LP
PTx
+
Nx+LP
0
25
50
75
100
#
*
Ca x P product (mg
2
xdL
2
)
D
sham
+
H
P
P
T
x+
Nx
+HP
s
ha
m+
L
P
P
Tx+Nx+LP
0.0
2.5
5.0
7.5
*
Ca i (mg/dL)
Gráfico 2: PTH, Ca i, P e Produto Ca x P
50
7.b Cópia da carta da CAPESQ
51
7.c Artigo aceito para publicação
Cópia do e-mail da aceitação do artigo para publicação e cópia do artigo.
Para: [email protected]
Data: 29/06/2004 14:16
Assunto: [Sem assunto]
RE: KI-00145-2004.R2 - ADVERSE EFFECTS OF HYPERPHOSPHATEMIA
ON
MYOCARDIAL HYPERTROPHY, RENAL FUNCTION AND BONE IN RATS
WITH
RENAL FAILURE
Dear Dr. Neves:
The file on your revised manuscript is now complete. Therefore,
your manuscript is accepted for publication in Kidney
International and will be scheduled for publication in the next
available issue.
You should receive the page proofs for your article within
approximately 3 months. Please correct the proofs and return
them per instructions that will accompany the proofs. Otherwise,
it will be necessary to return the proofs to the printer with
only those corrections made by the editorial office.
My thanks for having submitted your work to Kidney
International.
Sincerely yours,
Saulo Klahr, M.D.
For the Editors
52
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