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CLÁUDIA LEMOS MOURA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS
BRUTOS DAS ESPÉCIES VEGETAIS Miconia rubiginosa e Pfaffia
glomerata EM MICRORGANISMOS DA CAVIDADE BUCAL
Dissertação de mestrado apresentada à
Universidade de Franca como exigência
parcial para obtenção do título de mestre em
Promoção de Saúde.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Helena
Vinhólis Cury.
FRANCA
2006
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CLÁUDIA LEMOS MOURA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS BRUTOS DAS
ESPÉCIES VEGETAIS Miconia rubiginosa e Pfaffia glomerata EM MICRORGANISMOS
DA CAVIDADE BUCAL
Presidente: ______________________________________________
Nome: Profa. Dra. Adriana Helena Vinhólis Cury.
Instituição: Universidade de Franca.
Titular 1: ______________________________________________
Nome:
Instituição:
Titular 2: ______________________________________________
Nome:
Instituição:
Franca, ___/___/___
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DEDICO este trabalho a todos que direta ou indiretamente
colaboraram para sua realização.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me dado esta oportunidade;
aos meus pais, irmãos, avós, tias, e ao Lucas por todo amor e paciência,
principalmente nos momentos em que precisei me ausentar para realizar este trabalho;
à minha professora, orientadora e amiga Profa. Dra. Adriana Helena Vinhólis
Cury, por todo tempo dedicado não só a este trabalho, mas também por sempre me estender as
mãos, e estar disposta a me ajudar;
aos Profs. Wílson Roberto Cunha, Carlos Henrique Gomes Martins, Márcio Luís
de Andrade e Silva, Niegi Araçari Jacometti Cardoso e José Eduardo Zaia, que colaboraram
para a realização deste trabalho;
e ainda, aos estagiários Tatiane e Éverton, que tiveram tanta paciência auxiliando-
me nos experimentos.
... valeu a pena!
Cláudia Lemos Moura
RESUMO
MOURA, Cláudia Lemos. Avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos brutos das
espécies vegetais Miconia rubiginosa e Pfaffia glomerata em microrganismos da cavidade
bucal. 2006. 71f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) – Universidade de Franca,
Franca.
Estudos sobre atividade biológica de extratos e substâncias isoladas de espécies do gênero
Miconia têm demonstrado resultados significativos, como atividade tripanocida, analgésica,
antifúngica, antitumoral e antimicrobiana. Ainda no Brasil, várias espécies do gênero Pfaffia,
família Amaranthaceae, são utilizadas em substituição ao ginseng, sendo conhecidas como
“ginseng-brasileiro” e fáfia, onde as espécies são: Pfaffia glomerata, Pfaffia eresinoides e
Pfaffia paniculata. Das atividades já avaliadas de espécies de Pfaffia destacam-se: atividade
antitumoral; analgésica; tripanocida; antiinflamatório; efeito estimulante no desempenho
sexual de ratos machos; atividade depressora do sistema nervoso central e efeito amnésico.
Até o presente momento não existem trabalhos com estas plantas relacionando-as a atividade
antimicrobiana frente a microrganismos da cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo
verificar a atividade antimicrobiana de extratos brutos de Miconia rubiginosa e Pfaffia
glomerata em microrganismos da cavidade bucal pelo método de difusão em ágar e pelo
método de diluição em caldo para determinação da Concentração Inibitória Mínima. Foram
utilizados extratos hexânico, diclorometânico e etanólico de M. rubiginosa e o extrato
etanólico de P. glomerata. Utilizou-se como controle positivo o Digluconato de Clorexidina.
Para a análise estatística foi utilizado o teste de ONE-WAY ANOVA para o método de
difusão em ágar e para se comparar às médias entre as concentrações, foi utilizado o teste de
Tukey. Os resultados demonstraram, pelo método de difusão em ágar, que todos os extratos
apresentaram atividade antimicrobiana na maioria dos microrganismos avaliados, sendo que
as médias dos halos de inibição variaram de 8,33 mm a 22,67 mm. Pelo método de diluição
em caldo, os extratos apresentaram atividade antimicrobiana com uma CIM que variou de 60
a 300 µg/mL. A ação antimicrobiana observada nos extratos sugere seu uso como adjuvante
no controle da cárie dental.
Palavras-chave: Atividade antimicrobiana; Pfaffia glomerata; Miconia rubiginosa;
microrganismos; Odontologia.
ABSTRACT
MOURA, Cláudia Lemos. Antimicrobial activity evaluation of the crude extracts from
Miconia rubiginosa and Pfaffia glomerata against oral pathogens. 2006. 71f. Dissertação
(Mestrado em Promoção de Saúde) – Universidade de Franca, Franca.
Studies of biological activities from extracts and substances isolated from species of the
Miconia have demonstrated significant results, as trypanocidal activity, analgesic, fungicide,
antitumoral and antimicrobial. In Brazil, several species of the genus Pfaffia, family
Amaranthaceae, are used in substitution to the ginseng, being known as Brasilian-Ginseng
and “fafia”. Among these species that are known as Brazilian ginseng are: Pfaffia glomerata,
Pfaffia eresinoides and Pfaffia paniculada. Many activities were already report as:
antitumoral, analgesic, trypanocidal and anti-inflammatory. Nevertheless there are not studies
about such plants related to antimicrobial activity against oral pathogens. This work had as
objective to verify the antimicrobial activity of crude extracts from Miconia rubiginosa
(hexane, methynichoride and ethanol) and Pfaffia glomerata (ethanol and hexane) against oral
pathogens by using both the agar diffusion and dilution methods to determine the MIC. A
solution of Digluconate of Chlohrexidine was used as positive control. For the statistical
analysis it was used the test ONE-WAY ANOVA for the agar diffusion method and the
averages between the concentrations, were compared by using the Tukey test.
The obtained results by using the agar diffusion method showed that, all the extracts had
presented antimicrobial activity in the majority of the oral pathogens, and that the averages of
inhibition halos ranged from 8.33mm to 22.67mm. Also, the extracts showed antimicrobial
activity when they were evaluated by the dilution method and the MIC values ranged from 60
to 300µg/mL. The antimicrobial effect observed to the extracts suggests their use as an
adjuvant in the control of dental decay.
Key words: Antimicrobial activity; Pfaffia glomerata; Miconia rubiginosa; microorganisms;
Dentistry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –
Miconia rubiginosa
18
Figura 2 –
Pfaffia glomerata
26
Figura 3 –
Exsicata de Miconia rubiginosa
38
Figura 4 – Exsicata de P. glomerata depositada no Hebárium da
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
(USP)
39
Figura 5 –
Inóculo sendo colocado sobre a camada base
44
Figura 6 –
Obtenção de poços
45
Figura 7 –
Preparo do inóculo
47
Figura 8 –
Comparação do inóculo com a escala de Mc Farland
47
Figura 9 –
Colunas são distribuídas do número 1 ao 12 e as linhas da letr
a
A à H
48
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Espécies de Miconia que foram submetidas a ensaios
biológicos em nossos laboratórios.
20
Quadro 2 – Espécies de Miconia estudadas e substâncias isoladas. 21
Quadro 3 – Compostos isolados de espécies de Pfaffia. 25
Quadro 4 – Microrganismos, procedência, morfotipos e meios de
cultura utilizados na avaliação da atividade
antimicrobiana.
40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Comparação dos resultados das médias da atividade
antimicrobiana pelo método de difusão em ágar (Técnica
do Poço) das diferentes concentrações dos extratos
hexânico, etanólico e diclorometânico da M. rubiginosa e
etanólico da P. glomerata em microrganismos da
cavidade bucal.
54
Tabela 2 Resultado da determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) em µg/mL dos extratos hexânico,
etanólico e diclorometânico da M. rubiginosa e dos
extratos hexânico e etanólico da P. glomerata em
microrganismos da cavidade bucal.
56
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
# Método de Microdiluição em Caldo
* Método de Difusão em Agar
ATCC
American Type Culture Collection
BHI Caldo Brain Heart Infusion
BHIa Brain Heart Infusion Agar
CIM
Concentração Inibitória Mínima
DMSO Dimetil Sulfóxido
GTF
Glucosiltransferase
GTFs
Glucosiltransferases
MH Caldo Mueller-Hinton
Mha Mueller-Hinton Agar
HA
Hidroxiapatita
spp. Subespécie de Microrganismos
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Caldo Tryptic Soy Broth
UFC Unidade de Colônia
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 14
1.1 BIOFILME DENTAL E CÁRIE DENTAL................................................................ 14
1.2 CONTROLE DO BIOFILME ..................................................................................... 16
1.3 FITOTERAPIA............................................................................................................ 16
1.4 Gênero Miconia ........................................................................................................... 18
1.5 Gênero Pfaffia ............................................................................................................. 23
2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................. 27
3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 37
4.1 EXTRATOS ................................................................................................................ 37
4.1.1 Vegetal Miconia rubiginosa ........................................................................................ 37
4.1.2 Vegetal Pfaffia glomerata............................................................................................ 38
4.2 MICRORGANISMOS INDICADORES..................................................................... 39
4.3 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS...................................................................... 40
4.4 MANUTENÇÃO DOS MICRORGANISMOS INDICADORES .............................. 43
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ........................................... 43
4.6 MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR: Técnica do Poço ........................................... 44
4.7 MÉTODO DE DILUIÇÃO EM CALDO: Técnica de microdiluição em placa.......... 46
4.8 PREPARO DO INÓCULO.......................................................................................... 47
4.9 PROCEDIMENTO...................................................................................................... 48
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................................... 49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 50
CONCLUSÕES...................................................................................................................... 58
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 59
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 BIOFILME DENTAL E CÁRIE DENTAL
O contato contínuo do ser humano com uma imensa variedade de espécies
microbianas ao longo de sua existência faz com que a cavidade bucal, assim como outras áreas do
corpo, abriguem, mesmo em condições normais, centenas de espécies diferentes de
microrganismos entre estes, fungos, vírus, bactérias e protozoários. Estes microrganismos entram
em contato com o ambiente bucal desde os primeiros dias de vida do recém-nascido, podendo aí,
se instalarem ou simplesmente serem eliminados. Esta microbiota presente na cavidade bucal da
maioria dos indivíduos, conhecida como microbiota indígena, tem com o hospedeiro que a abriga
uma relação de equilíbrio biológico estável. A presença da microbiota indígena na cavidade bucal
é benéfica para a proteção do indivíduo, pois previne a colonização de espécies mais patogênicas,
além de ser fundamental no desenvolvimento de órgãos e tecidos de defesa do organismo
(LOESCHE, 1993).
O biofilme dental pode ser definido como uma película incolor composta por
diferentes espécies bacterianas, sustentadas por uma matriz de proteínas salivares, polissacarídeos,
células descamadas, leucócitos e restos alimentares e que conseqüentemente ocupam diferentes
nichos, dependendo de suas necessidades nutritivas e metabólicas (LOESCHE, 1993).
O mecanismo bacteriano do biofilme dental, na superfície do dente produz ácidos
orgânicos alterando o equilíbrio iônico dessa área, resultando na perda de cálcio do esmalte para
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
15
neutralizar o hidrogênio livre da saliva (desmineralização), com a volta do pH ao normal, a saliva
devolve cálcio ao esmalte, havendo a remineralização da estrutura dental (MARTA, 2002).
A permanência deste biofilme sobre o dente favorece a queda do pH nas áreas
mais internas do mesmo, o que propicia o início da lesão de cárie (MARTA, 2002).
A cárie é uma doença de caráter multifatorial, seu aparecimento depende da
interação de três fatores: o hospedeiro, a microbiota e a dieta (KEYES, 1960).
A noção de que a cárie dental é uma doença infecciosa e transmissível, foi
demonstrada primeiramente por Keyes (1960). Desde então, um grupo de bactérias
fenotipicamente similar, conhecido como Streptococcus do grupo mutans, tem sido indicado
como principal microrganismo responsável pela iniciação da cárie dental (LENANDER-
LUMIKARI; IHALIN; LAHTEENOJA, 2000).
Os Actinomyces viscosus têm propriedades acidogênicas menores, não
iniciando a cárie de esmalte, porém, exercem notável influência em superfície de cemento
radicular, por este ser menos mineralizado. Os Lactobacillus (L. acidophilus e L. casei),
pouco observados no biofilme dental devido à sua baixa capacidade de aderência, são
encontrados em áreas como fóssulas e fissuras, espaço interdental e, em maior proporção, nas
cáries profundas (FIGUEIREDO et al., 2004).
O conhecimento atual sobre a dinâmica da instalação e progressão da lesão de
cárie mostra que a falta do controle mecânico do biofilme e uma dieta inadequada são fatores
que estão diretamente relacionados a atividade da doença cárie.
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
16
1.2 CONTROLE DO BIOFILME
O controle mecânico consiste basicamente de uma escovação adequada
associada, com o uso do fio dental, podendo ainda em algumas situações, utilizar meios
químicos adjuvantes a essa terapia. Desta maneira com o objetivo de inibir ou diminuir à
formação do biofilme dental, diversos agentes químicos, têm sido avaliados (FIGUEIREDO
et al., 2004).
Em odontologia, o digluconato de clorexidina é o agente antiplaca mais
utilizado no controle do biofilme dental, sendo considerado “Padrão ouro”
( FIGUEREDO,2004).
A clorexidina é uma biguanidina com propriedades catiônicas. A molécula é
simétrica, com 2 anéis 4 cloro-fenil e 2 grupos etano pentanicos ligados por uma cadeia
central do hexametileno. Quimicamente é classificada como digluconato de clorexidina
( BELLINI, 1980).
A clorexidina foi introduzida há mais de trinta anos como um desinfectante
geral com largo espectro antibacteriano, para bactérias tanto gram positivas, como para gram
negativas. É uma molécula estável e a quantidade ingerida é excretada pelas vias normais
sendo que uma pequena percentagem retida no organismo não é tóxica.
A clorexidina, quando
em baixas concentrações, provoca lixiviação de substâncias de pequeno peso molecular, como
o potássio e fósforo exercendo efeito bacteriostático. Em altas concentrações a clorexidina é
bactericida (TURESKY, 1977), além disso, a clorexidina é uma substância que possui alta
substantividade e seu efeito residual é de aproximadamente 48 horas; após este período a flora
bacteriana retorna aos níveis preexistentes e a placa bacteriana inicia seu curso normal de
formação(LOE, 1970).
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
17
Portanto devido a sua ação antimicrobiana bem estabelecida, a clorexidina têm
sido utilizada como controle positivo em vários estudos laboratoriais e clínicos
(NASCIMENTO, 2001; FIGUEREDO,2004; COIMBRA, 2005; CUNHA, 2006).
Os efeitos adversos da clorexidina são descritos como pigmentação dental,
manchamento de restaurações, queimação na língua e alterações do paladar, sendo
proporcionais à dosagem e ao tempo de aplicação(CARVALHO, 1991).
A associação de plantas medicinais a dentifrícios ou a pastas dentais tem sido
uma proposta recente e muito estudada (MODESTO; LIMA; UZEDA, 2001).
Vários trabalhos têm sido realizados com extratos de plantas com o objetivo de
se avaliar a atividade antimicrobiana em microrganismos da cavidade bucal (DEVIENNE;
RADDI, 2002; BRAGA et al., 2004; COUTINHO et al., 2004; CUNICO et al. 2004; LEITÃO
et al., 2004; COIMBRA, 2005; YATSUDA et al., 2005; CUNHA, 2006).
Desta forma, agentes antimicrobianos oriundos de plantas podem levar ao
desenvolvimento de novos fármacos clinicamente importantes, sendo sugeridos como uma
proposta no auxílio de afecções bucais (CUNICO et al., 2004).
1.3 FITOTERAPIA
Há séculos o homem busca na natureza a cura para os males que o afligem,
principalmente nos vegetais. Os vegetais são considerados verdadeiros laboratórios
bioquímicos complexos que, dentre várias substâncias, sintetizam os princípios ativos
naturais. Além disso, a fitoterapia é uma terapêutica tradicional recomendada pela OMS
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
18
(Organização Mundial da Saúde) como forma de apoio às ações de atendimento primário a
saúde (COWAN, 1999).
No início do séc. XIX, com o desenvolvimento da química farmacêutica, as
plantas passaram a representar a primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de
medicamentos. Atualmente, apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos
processos biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos países industrializados são
originários de plantas (CUNICO et al., 2004).
O uso e a busca de fármacos e suplementos dietéticos derivados de plantas tem
aumentado recentemente. Farmacêuticos, botânicos, microbiologistas e químicos estudam
produtos naturais que poderiam ser usados no tratamento de doenças infecciosas. Hoje são
encontrados no mercado de 25 a 50% de fármacos derivados das plantas. Os curandeiros
tradicionais usaram por muito tempo plantas para impedir ou curar infecções. A medicina
ocidental está tentando aumentar seus sucessos. As plantas são ricas em uma grande variedade
de metabólitos secundários, como taninos, terpenóides, alcalóides, e flavonóides, que in vitro
demonstraram ter propriedades antimicrobianas (COWAN, 1999).
A grande vantagem destas plantas medicinais se baseia principalmente na
ausência de efeitos colaterais, presentes nos antiinflamatórios e anti-sépticos de uso
tradicional. Estes surgiram da tentativa de se sintetizar as substâncias presentes em plantas e
ervas de uso popular, porém, são agregadas outras substâncias à composição destes
medicamentos que acabam causando os temíveis efeitos adversos (XAVIER; RAMOS;
XAVIER FILHO, 1995), além de problemas associados ao uso intermitente de antibióticos,
principalmente àqueles relacionados a resistências de algumas linhagens de microrganismos a
vários medicamentos (SOUZA FILHO; ALVES, 2002).
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
19
A associação de plantas medicinais à prática odontológica é algo ainda muito
recente (BUFFON et al., 2001;KOO et al., 2002; PAIXÃO et al., 2002; COUTINHO et al.,
2004; BRITO; LIMA; ARAÚJO, 2006; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006).
1.4 Gênero Miconia
A Melastomataceae constitui-se em uma das famílias mais importantes da flora
neotropical, com cerca de 4200 a 5000 espécies pertencentes a 11 tribos e 185 gêneros
(RENNER, 1993; JOLY, 1996). Entre os gêneros que ocorrem no Brasil destaca-se o
Miconia, por ser o maior gênero com aproximadamente 1000 espécies, distribuídas ao longo
da América Tropical e especialmente concentradas nos Andes (WURDACK; RENNER,
1993; MARTINS et al., 1996). No Brasil estão representadas cerca de 250 espécies, das quais
53 ocorrem no Estado de São Paulo (MARTINS et al., 1996). Nenhuma análise botânica
abrangente surgiu desde a monografia de Cogniaux (1891). O gênero mostra grande
diversidade nos tricomas, anteras e morfologia das sementes, podendo ser caracterizado, entre
as demais da tribo Miconieae, por suas inflorescências terminais multifloras, cimosas, pétalas
arredondadas a obtusas no ápice (MARTINS et al., 1996). Segundo Judd (1989), estas
características são todas simplesiomórficas e por isso o gênero tem apresentado problemas
taxonômicos. Os trabalhos recentes relativos ao gênero limitaram-se, até agora, a
levantamento florísticos (WURDACK, 1962; PEREIRA, 1964; WURDACK, 1973; 1980;
BAUMGRATZ, 1980; 1982; 1984; MARTINS et al., 1996) ou de posicionamento tribal
(JUDD, 1986; WURDACK; RENNER, 1993).
Entretanto, do ponto de vista químico, poucos estudos foram realizados com
espécies do gênero Miconia, e nestes predomina o isolamento de quinonas, cumarinas e
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
20
triterpenos. Estudos sobre atividade biológica de extratos e substâncias isoladas de Miconia
têm apresentado resultados significativos (Quadro 2). A quinona denominada Primina (1)
isolada de M. eriodonta apresentou atividade antimicrobiana e antitumoral (LIMA et al.,
1970). A substância denominada Miconidina (2), também isolada de M. eriodonta,
demonstrou atividade tripanocida (MARINI-BETTÓLO et al., 1971; SEPÚLVIDA-BOZA;
CASSELS, 1996). Triterpenos com estruturas semelhantes aos isolados de espécies de
Miconia também têm demonstrado atividade tripanocida (SEPÚLVIDA-BOZA; CASSELS,
1996). O extrato etanólico das folhas de M. ciliata possui atividade sedativa (HASRAT et al.,
1997), enquanto que o extrato metanólico da madeira de M. racemosa apresentou atividade
inibitória frente a dois clones de Plasmodium falciparum, resistentes a cloroquina e quinina
(ANTOUN; GERENA; MILHOUS, 1993). Estes resultados iniciais demonstram o potencial
emprego de espécies de Miconia no estudo para a busca de produtos naturais antiparasitários.
Recentes estudos com espécies de Miconia, incluindo Miconia rubiginosa (Figura 1)
realizados em nossos laboratórios, têm possibilitado o isolamento de vários triterpenos, bem
como resultados promissores em ensaios biológicos (Quadro 1).
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
21
Quadro 1 – Espécies de Miconia que foram submetidas a ensaios biológicos em nossos
laboratórios
ESPÉCIE
EXTRATO E SUBSTÂNCIAS
ATIVAS
ATIVIDADE
BIOLÓGICA
AVALIADA
REFERÊNCIAS
M. fallax
Extrato diclorometano das partes
aéreas
Triterpenos:
(ácido ursólico, oleanóico,
gypsogênico, oleanônico e
sumaresinólico)
tripanocida Cunha et al. (2003a)
M.
stenostachya
Extrato diclorometano das partes
aéreas
Triterpenos:
(ácido ursólico, oleanóico,
gypsogênico, oleanônico e
sumaresinólico)
tripanocida Cunha et al. (2003a)
M. fallax
Extrato etanólico das partes aéreas analgésica
Andrade e Silva
et al. (2002)
M. rubiginosa
Extratos hexano, diclorometano e
etanol das partes aéreas
analgésica
Spessoto et al.
(2003)
M.
stenostachya
M. rubiginosa
M. fallax
M. albicans
Extratos hexano, diclorometano e
etanol das partes aéreas
antifúngica
Celotto et al.
(2003a)
M. fallax
Extrato etanólico
Mistura de ácido ursólico e oleanóico
antitumoral Cunha et al. (2004)
M. ligustroides
Extratos hexano, diclorometano e
etanol das partes aéreas
analgésica Cunha et al. (2003b)
M.
stenostachya
M. rubiginosa
M. fallax
M. albicans
Extratos hexano, diclorometano e
etanol das partes aéreas
antimicrobiana
Celotto et al.
(2003b)
M. albicans
Extratos hexano, diclorometano e
etanol das partes aéreas
analgésica
Vasconcelos et al.
(2003)
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
22
Quadro 2 – Espécies de Miconia estudadas e substâncias isoladas
ESPÉCIE
PARTE DO
VEGETAL
ESTUDADA
EXTRATO
ANALISADO
SUBSTÂNCIAS
ISOLADAS
REFERÊNCIAS
M. eriodonta
raízes metanol 1, 2
Lima et al. (1970)
Marini-Bettòlo et al.
(1971)
M. albicans
madeira
Metanol
diclorometano
3-7,
11-12
Lowri (1968)
Macari; Emerenciano;
Ferreira (1990)
M. attenuathus
madeira Metanol 3-7 Lowri (1968)
M. laevigata
madeira Metanol 3-7 Lowri (1968)
M. prasina
madeira Metanol 3-7 Lowri (1968)
M. tamonea
madeira Metanol 3-7 Lowri (1968)
M. macroti
madeira Metanol 3-7 Lowri (1968)
M
stenostachya
folhas Metanol 13,14 Chan et al. (1992)
M.
macrothyrsa
madeira
folhas
Diclorometano
/metanol (1:1)
3-7,
8-10
Lowri (1968)
Golgher et al. (1994)
Figura 1 – Miconia rubiginosa
Fonte: www.bdf.fat.org.br
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
23
1.5 Gênero Pfaffia
No Brasil, várias espécies do gênero Pfaffia, família Amaranthaceae, são
utilizadas em substituição ao ginseng, sendo conhecidas como “ginseng-brasileiro” e fáfia.
Entre essas espécies são citadas: Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, Pfaffia eresinoides
Sprengel e Pfaffia paniculata (Mart.) Kuntze (SHIOBARA et al., 1992). A P. paniculata está
entre os maiores volumes de venda da indústria nacional de fitoterápicos (COMISSÃO DE
HOMEOPATIA E FITOTERAPIA DO SINDUSFARM-SP, 1995). A exemplo do ginseng, o
uso de Pfaffia tornou-se uma panacéia, sendo popularmente denominada “paratudo”, “suma”
ou “corango” (OLIVEIRA, 1986). Os produtos são, geralmente, rotulados como P. paniculata
ou ginseng-brasileiro e as indicações fornecidas pelos fabricantes são: “revigorante,
regenerador celular, indicado para o esgotamento físico e mental e falta de memória” ou
“indicado como auxiliar no tratamento de irregularidades circulatórias, estresse, anemia,
diabetes...” ou “indicado nos casos de fadiga física, intelectual e de indisposição em geral;
contribui no tratamento da fraqueza sexual”.
O termo ginseng pode se referir a muitas plantas diferentes, como o ginseng da
Coréia, Panax ginseng C. A. Meyer, Panax quinquefolium L., Panax trifolum L., Panax
zingiberensis C. Y. Wu e Feng e Eleutherococcus senticosus Maxim. Todas são espécies
muito semelhantes, pertencem à família Araliaceae, cujos rizomas e raízes são utilizados em
preparações classificadas como agentes adaptógenos, isto é, contêm substâncias com ação não
específica, normalizadora das funções do organismo (HOSTTETMANN; MARSTON, 1995).
Essas preparações têm origem na medicina chinesa, mas são comercializadas nos Estados
Unidos, e também no Brasil, como suplemento alimentar.
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
24
No entanto, enquanto a espécie Panax ginseng é provavelmente a mais popular
e bem conhecida planta medicinal documentada até hoje, os estudos sobre o gênero Pfaffia
são ainda, bastante escassos, se considerarmos a extensão de seu uso.
O gênero Pfaffia possui 27 espécies distribuídas no Brasil (TANIGUCHI et al.,
1997), sendo que a diferenciação das espécies não é simples e muitas vezes, são encontradas
no comércio substituições entre as espécies. A espécie P. paniculata, referida como substituta
do ginseng, também no Rio Grande do Sul, é um vegetal de rara ocorrência nesse Estado,
sendo nativas as espécies P. glomerata e P. tuberosa. De fato, em avaliações anteriores, foi
possível detectar que algumas amostras comercializadas como P. paniculata em Porto Alegre
(RS), possivelmente eram P. glomerata (DE PARIS et al., 1998). As principais características
morfológicas e micrográficas das raízes de P. glomerata e P. paniculata foram descritas e
estão em vias de publicação permitindo a identificação segura das mesmas (GOSMANN et
al., 2002). Do mesmo modo, são encontradas algumas diferenças interespecíficas na
composição química que podem definir perfis farmacológicos e toxicológicos distintos, além
de auxiliar, também, na diferenciação das espécies (TAKEMOTO et al., 1983; SHIOBARA et
al., 1992; 1993a).
Como apresentado no Quadro 3, os fafosídeos, saponinas nortriterpênicas
derivadas do ácido fáfico, e os ecdisteróides, em especial a ecdisterona, são encontrados em
espécies de Pfaffia. As saponinas do gênero Pfaffia não estão ainda caracterizadas do ponto de
vista da atividade biológica. Os fafosídeos A, B, C, D, E e F possuem potencial atividade anti-
tumoral e foram isoladas apenas P. paniculata (TAKEMOTO et al., 1983; NAKAI et al.,
1984).
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
25
Quadro 3 – Compostos isolados de espécies de Pfaffia
ESPÉCIE CONSTITUINTES QUÍMICOS
P. glomerata
Ácido famérico, ácido glomérico, ácido oleanólico,
ecdisterona, rubrosterona, -D-glicopiranosil-oleanolato
(SHIOBARA et al., 1993a)
P. iresinoides
Chikusetsusaponina Iva, ecdisterona, 25-O-?-D-
glicopironosil-ecdisterona, iresinosídeo, 25-O-?-D-
glicopiranosil-podecdisona B, polipodina B, pterosterona,
24-O-?-D-glicopiranosil, pterosterona (NISHIMOTO et al.,
1987; 1988)
P. paniculata
Ácido fáfico, alantoína, sitosterol, estigmasterol, fafosídeos
A, B, C, D, E, F (TAKEMOTO et al., 1983; NAKAI et al.,
1984; NISHIMOTO et al., 1984)
P. pulverulenta
Ácido fáfico, ácido pulvérico, ecdisterna, fafosídeo G,
pulverulactona, rubrosterona (SHIOBARA et al., 1992;
1993b)
Os relatos encontrados na literatura científica sobre as atividades
farmacológicas deste gênero versam basicamente sobre a planta na forma de pó, como extrato
bruto semi-puricado. Dentre as várias atividades já testadas podemos destacar: atividade
antitumoral do ácido fáfico e de fafosídeos (NAKAI et al., 1984; NISHIMOTO et al., 1984);
atividade analgésica (MAZZANTI; BRAGHIROLLI, 1994); efeito estimulante de extrato
fluido, v.o., no desempenho sexual de ratos machos (ARLETTI et al., 1999); efeito
antiinflamatório em modelos de inflamação em ratos (TANIGUCHI et al., 1997), atividade
depressora do sistema nervoso central e efeito amnésico (DE PARIS et al., 1998; 2000),
atividade analgésica e antiinflamatória (NETO et al., 2005) e atividade tripanocida (NETO et
al., 2004).
_________________________________________________________INTRODUÇÃO
26
Uma avaliação cuidadosa dos dados obtidos até o presente momento indica
que, embora existam estudos pré-clínicos para P. paniculata e mesmo estudos clínicos para P.
glomerata, a eficácia e a segurança de seu uso ainda não estão plenamente definidas. Não há
critérios publicados para a padronização e controle de qualidade dos produtos comerciais,
como por exemplo, a definição da substância ativa ou compostos marcadores. Também, a
substituição do ginseng por Pfaffia spp. não parece ser adequada, visto que a sua constituição
química é diferente e que as propriedades biológicas das espécies de Pfaffia precisam ser
melhor avaliadas.
Desta forma, o uso racional de P. glomerata (Figura 2) com finalidade
terapêutica ainda depende do conhecimento aprofundado de suas propriedades farmacológicas
e do desenvolvimento de tecnologia de produção e controle de qualidade. Sendo assim, não
existem trabalhos com esta planta relacionando-se a atividade antimicrobiana em
microrganismos da cavidade bucal.
F
Figura 2 – Pfaffia glomerata
Fonte: www.fm2.fieldmuseum.org
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
27
2 REVISÃO DA LITERATURA
Como já foi dito anteriormente, pela ausência de trabalhos com as plantas
Miconia rubiginosa e Pfaffia glomerata, a revisão da literatura neste trabalho, portanto, se
baseia em alguns estudos com extratos de outras plantas medicinais, avaliando-se sua
atividade frente a microrganismos da cavidade bucal (PEREIRA et al., 2004; BUFFON et al.,
2001), como a própolis, a Calendula officinalis, a Arnica montana, entre outras (KOO et al.,
2002; FIGUEIREDO et al., 2004).
A própolis é um material resinoso complexo produzido por abelhas domésticas
e é responsável pela segurança dos favos de mel, especialmente de encontro aos
microrganismos (BOSIO et al., 2000). A composição química da própolis de Apis meleira e
suas propriedades biológicas antioxidante, antimicrobiana, antiinflamatória, hepatoprotetora e
antitumoral atraíram a atenção dos investigadores (BANSKOTA et al., 2001). É composta de
50% de resina, 30% de bálsamo do vegetal, 10% de óleos essenciais aromáticos, 5% de pólen
e 5% de diversas substâncias, incluindo restos orgânicos, mas esta composição varia de
acordo com a fonte vegetal (BURDOCK, 1998). O mecanismo da atividade antimicrobiana da
própolis é complexo e poderia ser atribuído à atividade in vitro dos ácidos cinâmicos
principalmente dos flavonóides pinocembrina, galangina, e pinobanksina (CASTALDO;
CAPASSO, 2002). A atividade antimicrobiana foi observada frente a Staphylococcus aureus
(KROL et al., 1993; FERNANDES JÚNIOR et al., 1995; 1997; 2001; 2003; SFORCIN et al.,
2000); Streptococcus pyogenes (DRAGO et al., 2000; SFORCIN et al., 2000); Streptococcus
mutans (KOO et al., 2002); bactérias anaeróbias da cavidade oral humana (SANTOS et al.,
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
28
2002); Salmonella, e em microrganismos variados incluindo o Mycobacterium (BANSKOTA
et al., 2001). A atividade antibacteriana da própolis no crescimento do S. aureus foi mais
elevada quando os extratos etanólicos eram preparados em solução hidroalcoólica contendo
60% a 80% de etanol (FERNANDES JÚNIOR et al., 2003).
Um dos trabalhos iniciais com própolis foi realizado por Ikeno, Ikeno e
Miyazawa (1991), que citaram o fato da própolis ser um produto resinoso coletado pelas
abelhas, importante na defesa da colméia e que apresenta efeitos sobre o crescimento e a
atividade da glucosiltransferase (GTF) dos S. sobrinus, S. mutans e S. cricetus in vitro, e sobre
as cáries dentais em ratos infectadas com S. sobrinus. O exame bioquímico consistiu em
examinar a influência da própolis na composição da dieta através da medição do nível de
amilase no soro e no tecidos, e a concentração da glicose no soro. A própolis teve atividade
antimicrobiana contra S. sobrinus, S. mutans e S. cricetus, e inibiu tanto a síntese do glucano
insolúvel em água, quanto à atividade da glucosiltransferase.
Koo et al. (2000a; 2002) comprovaram algumas das afirmações acima, sendo
que no primeiro trabalho eles avaliaram os extratos etanólicos inibindo a atividade da mistura
da substância enzimática GTF de diferentes regiões do Brasil. Os autores observaram que os
extratos mais ativos foram os das regiões de Minas Gerais e Rio Grande do Sul. No estudo
posterior os mesmos autores avaliaram os efeitos de distintos grupos químicos encontrados na
própolis sobre a atividade de enzimas de GTF na solução e na superfície de grânulos salivares
revestidos de hidroxiapatita (HA). Trinta compostos, incluindo flavonóides, derivados de
ácido cinâmico, e terpenóides foram testados quanto à sua habilidade de inibir GTFs do S.
mutans e do S. sanguinis. As flavonas e os flavonóis foram potentes inibidores da atividade de
GTF na solução. Poucos efeitos foram notados em enzimas insolubilizadas. Os derivados do
ácido cinâmico promoveram atividades biológicas insignificantes.
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
29
Desde então, vários trabalhos foram sendo realizados com o objetivo de se
avaliar as propriedades da própolis (MANARA et al., 1999; BUFFON et al., 2001; GEBARA;
LIMA; MAYER, 2002; PINHEIRO; SIMIONATO; ODA, 2003; BRITO; LIMA; ARAÚJO,
2006).
Gebara, Lima e Mayer (2002) investigaram a atividade antimicrobiana da
própolis contra bactérias periodontopatogênicas (ATCC) através de testes in vitro. As cepas
bacterianas testadas foram: Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica,
Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Capnocytophaga
gingivalis e Fusobacterium nucleatum. Todos os patógenos periodontais e microrganismos
superinfectantes testados foram sensíveis ao extrato de própolis testado.
Além de testarem as propriedades isoladas do extrato da própolis, trabalhos
foram realizados associando-se tanto o extrato de própolis como outros extratos a produtos já
comercializados (PINHEIRO; SIMIONATO; ODA, 2003; BRITO; LIMA; ARAÚJO, 2006).
Pinheiro, Simionato e Oda (2003) avaliaram a ação antibacteriana do cimento ionomérico
associado a 5% de extrato de própolis, a 1% de solução alcoólica ou à antibióticos
(metronidazol, ciprofloxacina e cefaclor – 1% de cada) em S. mutans. Os três grupos com
cimento associado a 5% de própolis, a 1% e a 1% de solução alcoólica não apresentaram
diferença estatisticamente significante entre eles, porém os maiores halos de inibição foram
encontrados no grupo em que se associou o cimento ionomérico com 5% de própolis.
Os estudos em relação ao extrato de própolis foram se alastrando cada vez
mais, dando início a testes com concentrações diferentes, substâncias isoladas e comparações
com outros extratos, além de inúmeras bactérias, para que se analisasse a exata ação em cada
tipo de bactéria. Vargas et al. (2004) avaliaram a atividade do extrato hidroalcoólico de
própolis a 50% contra bactérias Gram-positivas (Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,
Nocardia asteróides e Rhodococcus equi) e Gram-negativas (Escherichia col., Salmonella sp.,
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
30
Proteus mirabilis e Pseudonomas aeruginosa). Os autores utilizaram como controle, meios
acrescidos de 5% de álcool etílico e 5% de solução salina. Os isolados foram considerados
sensíveis ao extrato de própolis quando não ocorreu crescimento bacteriano na placa. O
extrato avaliado demonstrou atividade antimicrobiana por inibir o crescimento de 67,7% das
bactérias testadas; 92,6% das bactérias Gram-positivas e 42,5% de bactérias Gram-negativas,
sendo considerado capaz de exercer ação antibacteriana efetiva contra a maioria das espécies
testadas.
A maior parte dos trabalhos relacionados à própolis indicaram o poder de
inibição em bactérias cariogênicas. Leitão et al. (2004) realizaram um trabalho onde havia o
ideal de inibição da atividade cariogênica do Streptococcus mutans, utilizando tanto o extrato
de própolis verde, quanto o extrato de Baccharis dracunculifolia DC (Asteraceae), uma planta
nativa e que dá origem à própolis verde. Ambos os extratos apresentaram atividade inibitória
semelhantes.
Figueiredo et al. (2004) compararam a ação antimicrobiana dos extratos de
cravo da índia (Syzygium aromaticum), sálvia (Salvia officinalles) e própolis na microbiota da
placa dental supragengival e saliva não estimulada de 25 indivíduos com periodontite crônica.
Os autores utilizaram como controles a clorexidina 0,12% e a água destilada. As maiores
médias de tamanho de halos de inibição foram obtidas com a clorexidina, seguida da própolis,
cravo-da-índia e sálvia. Além disso, os extratos também demonstraram atividade
antimicrobiana significativa e exibiram maior ação na microbiota da placa dental
supragengival quando comparada a microbiota da saliva.
Brito, Lima e Araújo (2006) estudaram os efeitos da própolis em Odontologia,
através do índice de placa. Foram selecionados alunos em faixa etária de 12 anos, sendo 3
meninas e 7 meninos que foram divididos em dois grupos, sendo (1) controle e (2) estudo, foi
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
31
utilizado a própolis em forma de dentifrício. Os autores observaram diminuição no índice de
placa, e conseqüente prevenção da doença periodontal.
Paralelamente estudos com a própolis, vêm sendo realizados procurando
avaliar também atividades de várias outras plantas, buscando conceitos culturais de
tratamento e prevenção, estabelecendo a real importância do trabalho fitoterápico junto a
comunidades carentes. Observando a utilidade de determinado fitoterápico de uso
odontológico, Dnunes et al. (1999) procuraram enfocar plantas que possuíssem atividade
terapêutica comprovada e passível de utilização em Odontologia. Alguns exemplos são
Curcuma longa L., Anacarrdium occidentale L. e Matricaria recudita L., com ação
antinflamatória; Spilanthes acmela e Cymbopogon citratus, com ação analgésica; Brassica sp.
e Malagueta capsicum, Gingiber officinal, com ação revulsiva; Lippia aff. alnifolia, Lippia
sidoides, Myracrodruom urundeuva e Tabebuia avellanadae, com ação antibiótica;
Symphytum officinale, Aloe sp. e Rosamarinus offiicinalis, com ação cicatrizante; Ocimum
gratissimun, Cróton zenhtneri e Punica granatum L., com ação anti-séptica; Mentha
puleegium, Mentha piperita, Eucaliptos citriodora e Hyptis suaveolens, com ação béquica
(para tratar tosse); Spondias mombin, com ação sobre o herpes; Peumus boldus, Coriandrus
saturem L., Petroselinum sativum e Matrícaria camomila, com ação nos distúrbios
gastrintestinais.
Saeki et al. (1989) também investigaram a ação antimicrobiana de 15
substâncias naturais, incluindo a lisozima do ovo, em Streptococcus sp., Actinomyces sp.,
Actinobacillus sp., Bacteroides sp., Captocytophaga sp., Eikenella sp., Fusobacterium sp. e
Propionibacterium sp. Entre as substâncias naturais testadas, o hinokitiol foi o maior inibidor
das bactérias estudadas. O óleo da casca da canela, os extratos de papua-mace e o óleo do
broto do cravo, em extratos de condimento foram também inibitórios contra muitas bactérias.
A lisozima do ovo branco exibiu ação antimicrobiana nas bactérias à doença periodontal.
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
32
Osawa et al. (1990) testaram extratos medicinais e seus constituintes quanto à sua atividade
antibacteriana em espécies periodontopatogênicas, incluindo as espécies Actinobacillus,
Capnocytophaga, Fusobacterium, Eikenella e Bacteroides. Os óleos essenciais de duas
plantas Mosla chinensis e Pogostemon cablin e cinco terpenóides, hinokitiol, timol, carvacrol,
álcool patchuli e pogostone, mostraram atividade antibacteriana. Todas os compostos foram
ativos para as espécies de Bacteróides, sendo o hinokitiol o melhor agente inibidor. Segundo
os autores, estes compostos poderiam ser agentes eficazes na prevenção do crescimento de
periodontopatógenos.
Saeki et al. (1993) testaram a atividade antimicrobiana de diversas substâncias
naturais, tais como extrato de papua-mace, extrato de Baccharis dracunculifolia, extrato de
chá preto, extrato de Raspderry, flavona aromatizada, clorofila cobre, extrato de clorofilina
sódica em 35 espécies bacterianas, dentre elas as de interesse odontológico. Os autores
concluíram que o uso do extrato de papua-mace, de chá verde flavona aromatizada e clorofila
cobre, poderiam ser efetivos na redução de periodontopatógenos e na prevenção de halitose.
Alguns outros autores procuraram avaliar a ação de extratos de plantas em
bactérias resistentes a antibióticos, como Nascimento et al. (2000), que avaliaram a atividade
antimicrobiana de extratos de Achillia millifolium, Syzygium aromaticum, Melissa officinalis,
Ocimun basilucum, Psidium guajava, Punica granatum, Rosmarinus officinalis, Salvia
officinalis, Syzygum joabolanum e Thymus vugaris (mil-folhas, cravo-da-índia, erva cidreira,
manjericão, goiaba, romã, alecrim, sálvia, jambolão e tomilho respectivamente) e os
fitofármacos (ácido benzóico, ácido cinâmico, eugenol e farnesol). Além disso, os possíveis
efeitos sinérgicos da associação entre antibióticos e extratos vegetais foram estudados. O
maior potencial antimicrobiano foi verificado para os extratos de cravo e jambolão, inclusive
com maior atividade sobre os microrganismos resistentes a antibióticos (83,3%). Os extratos
de sálvia e de mil-folhas não apresentaram nenhuma atividade antimicrobiana. A associação
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
33
de antibióticos e extratos vegetais ou fitofármacos mostrou que em alguns casos, ocorreu
sinergismo, possibilitando que antibióticos já ineficazes apresentassem ação sobre estas
bactérias. Os resultados obtidos com a Pseudomonas aeruginosa foram de particular interesse,
já que ela foi inibida pelos extratos de cravo, jambolão, romã e tomilho.
Pereira et al. (2001) avaliaram em estudo comparativo a atividade
antimicrobiana do extrato de Punica granatum linn (romã) através do teste de difusão em
ágar, em bactérias predominantes na formação da placa supragengival, e potencialmente
cariogênicas: S. mitis, S. mutans e o S. sanguis. Todas as bactérias apresentaram-se sensíveis
frente ao extrato de romã.
Katsura et al. (2001) isolaram o bakuchiol a partir das sementes de Psoralea
corylifolia, uma árvore nativa da China de uso na medicina tradicional. Neste estudo, à
atividade antimicrobiana em alguns microrganismos foi avaliado. O crescimento celular do
Streptococcus mutans foi inibido dependentemente da concentração de bakuchiol onde este
foi completamente inibido em concentrações 20 µg/ml de bakuchiol. O bakuchiol mostrou
efeitos bactericidas em todas as bactérias testadas: S. mutans, S. sanguis, S. salivarius,
Streptococcus sobrinus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus
acidophilus, L. casei, L. plantarum, A. viscosus e P. gingivalis. Além disso, o bakuchiol foi
também efetivo contra as células de S. mutans aderentes em glucano insolúvel em água na
presença de sacarose e inibiu a redução de pH no meio de cultura. Assim, os autores
sugeriram que o bakuchiol seria um composto útil para o desenvolvimento de agentes
antimicrobianos.
Já Modesto, Lima e Uzeda (2001) avaliaram e compararam o efeito
antimicrobiano de três dentifrícios infantis, concentrados e diluídos até 1/128 grupos, na
microbiota de bebês. Verificaram que o dentifrício contendo xilitol, lactoperoxidase, glicose
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
34
oxidase e lactoferrina e o com xilitol e extrato de Calendula officinalis não apresentaram
efeito antimicrobiano, independentemente da concentração e da origem do inóculo.
Pessini et al. (2003) selecionaram extratos de 13 plantas utilizadas na medicina
popular brasileira e avaliaram a atividade antimicrobiana dos mesmos. As seguintes espécies
foram selecionadas: Arctium lappa, Tanacetum vulgare, Erythrina speciosa, Psidium guavata,
Mikania glomerata, Spilanthes acmella, Lippia Alba, Achillea millefolium, Piper regnellii,
Eugenia uniflora, Punica granatum, Sambucus canadensis e Plantago major. Os testes de
susceptibilidade antimicrobiana foram realizados através da CIM frente aos seguintes
microrganismos: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudonomas aeruginosa ATCC 15442,
Bacillus subtilis ATCC 6623, e Staphylococcus aureus ATCC 25923 e em RPMI-1640 para
fungos (Candida albicans, C. Krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis). A bioautografia foi
realizada com os extratos aplicados em placas. Zonas de inibição indicaram a presença do
composto ativo.
Almeida et al. (2003) avaliaram a atividade antimicrobiana de cinco produtos
fitoterápicos: Água de Rabelo (Laboratório Rabelo Ltda.), Malvatricin (Laboratório Daudt de
Oliveira), Mel Rosado (ADV), Fitogargarejo (Farmácia Homeopática), Apis Flora (Senip) e
Óleo de copahyba (IBRAN), já introduzidos no mercado frente aos seguintes microrganismos,
S. mutans, S. sobrinus, S. sanguis e L. casaram. Foi observado que o Malvatricin apresentou
os maiores halos de inibição, frente a toda a linhagem, bem como, os maiores espectros de
inibição.
Braga et al. (2004) avaliaram o efeito inibitório de extratos de plantas do Horto
Botânico I do Centro de Pesquisas Universitário de Lavras (Unilavras), contra o S. mutans.
Assim sobre o meio de cultura Brain Heart Infusion – Ágar, inoculado com S. mutans, foram
depositados extratos etanólicos de 32 plantas entre elas, Calendula officinalis, Cotyledon
orbiculata, Cynara scolymus, Punica granatum, Copaifera langsdorffii, Syzygium
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
35
aromaticum, Moringa oleifera, Salvia officinalis e Rosmarinus officinalis, previamente
selecionadas com base em informações que sugeriram potencial de atividade antibiótica,
sendo o controle positivo a clorexidina a 0,12%. Observou-se que os extratos de Copaifera
langsdorffii, Moringa oleifera e Punica granatum proporcionaram a formação de halos de
inibição para o S. mutans, o que sugeriu potencial para controle desta bactéria. Os outros
extratos não apresentaram atividade antimicrobiana.
Kooning, Agyare e Ennison (2004) em um trabalho com os extratos de
Aframomum melegueta, Piper guineese, Xylopia aethiopica, Zingiber officinale, realizaram
teste antimicrobiano em microrganismos como S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa,
C. albicans e A. niger. Esses extratos foram ativos contra as bactérias Gram-negativas,
positivas e fungos.
Loguercio et al. (2005) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato de
Syzygum joabolanum em 17 bactérias humanas Gram-positivas e Gram-negativas, dentre elas
algumas bactérias de interesse odontológico. Colocaram quatro discos de papel sendo o
primeiro com antimicrobiano comercial e os demais embebidos em 25 mL do extrato, de
solução salina ou de etanol. O extrato inibiu o crescimento de 100% das bactérias testadas.
Não houve inibição significativa de crescimento nos tratamentos com solução salina ou
etanol. Conforme os resultados deste estudo, o extrato testado apresentou atividade
antimicrobiana frente às amostras testadas, sem diferença de sensibilidade entre
microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.
Sendo assim despertou-se o interesse em conhecer se há atividade
antimicrobiana no extrato de Miconia rubiginosa e Pfaffia glomerata em microrganismos
orais, uma vez que já foram realizados somente estudos demonstrando a ação analgésica da
Miconia rubiginosa (SPESSOTO et al., 2003), e de outras espécies de Pfaffia (P. iresioides,
P. panculata, P. pulverulenta), como atividade antitumoral (NAKAI et al., 1984;
___________________________________________REVISÃO DA LITERATURA
36
NISHIMOTO et al., 1984), atividade analgésica (MAZZANTI; BRAGHIROLLI, 1994),
atividade antiinflamatória (TANIGUCHI et al., 1997), e atividade depressora do sistema
nervoso central (DE PARIS et al., 1998; 2000), não havendo ainda estudos com essas plantas
em Odontologia.
___________________________________________________________OBJETIVOS
37
3 OBJETIVOS
• Avaliar a atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar,
pela técnica do poço em três concentrações (100, 200, 300 mg/mL) dos
extratos de Miconia rubiginosa e Pfaffia glomerata frente aos
microrganismos da cavidade bucal;
• Determinar a CIM através do método de diluição em caldo pela técnica
de microdiluição em placa dos extratos de Miconia rubiginosa e Pfaffia
glomerata frente aos microrganismos da cavidade bucal.
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
38
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 EXTRATOS
Os extratos das plantas Miconia rubiginosa e Pfaffia glomerata foram
fornecidos pelos Professores Doutores Márcio Luís de Andrade e Silva e Wílson Roberto
Cunha, do grupo de pesquisa em Química da Universidade de Franca.
4.1.1 Vegetal Miconia rubiginosa
O vegetal Miconia rubiginosa (Figura 3) foi coletado numa região de cerrado
próximo à Rodovia Tancredo Neves (Franca/SP – Claraval/MG) e classificado pela Prof. Dra.
Ângela Borges Martins do Instituto de Botânica da UNICAMP.
As partes aéreas do vegetal foram secas e estabilizadas em estufa de ar
circulante (40°C) e trituradas até a forma de pó em moinho de facas. O pó resultante do
vegetal M. rubiginosa (1,2 kg) foi extraído através de maceração com hexano, diclorometano
e posteriormente com etanol, fornecendo 4,4 g; 12,0 g; 15,4 g; de extratos, respectivamente.
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
39
Figura 3 – Exsicata de Miconia rubiginosa
Fonte: www.bdf.fat.org.br
4.1.2 Vegetal Pfaffia glomerata
O vegetal Pfaffia glomerata (Amaranthaceae) (Figura 4) foi coletado no Sítio
Nova Esperança, região de cerrado próxima à Cidade de Ribeirão Corrente – SP. O vegetal foi
originalmente trazido da Cidade do Rio de Janeiro e identificado pelo Prof. Dr. Hermógenes
de Freitas Leitão do Instituto de Botânica da UNICAMP.
As raízes do vegetal foram secas e estabilizadas em estufa de ar circulante
(40°C) e trituradas até a forma de pó em moinho de facas. O pó resultante do vegetal P.
glomerata (1,6 kg) foi extraído através de maceração com hexano e posteriormente com uma
mistura hidroalcoólica 7:3 v/v (etanol: água).
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
40
4.2. MICRORGANISMOS INDICADORES
Para a determinação da atividade antimicrobiana foram utilizadas cepas padrão
provenientes da “American Type Culture Collection” (ATCC): Enterococcus faecalis (ATCC
4082), Streptococcus salivarius (ATCC 25975), S. sanguinis (ATCC 10556), S. mitis (ATCC
49456), S. mutans (ATCC 25175), S. sobrinus (ATCC 33478), Lactobacillus casei (ATCC
11578) e Candida albicans (ATCC 28366) (Quadro 4).
Figura 4 – Exsicata de P. glomerata
depositada no Herbárium da
Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto (USP)
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
41
Quadro 4 – Microrganismos, procedência, morfotipos e meios de culturas utilizados na
avaliação da atividade antimicrobiana
Microrganismo/Cepas
Padrão ATCC
Morfotipo
Meio de Cultura
Inoculo
Meio de Cultura
Teste
Enterococcus faecalis
ATCC 4082
Coco Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Streptococcus salivarius
ATCC 25975
Coco Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Streptococcus sanguinis
ATCC 10556
Coco Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Streptococcus mitis
ATCC 49456
Coco Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Streptococcus mutans
ATCC 25175
Coco Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Streptococcus sobrinus
ATCC 33478
Coco Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Lactobacillus casei
ATCC 11578
Bacilo Gram-positivo
BHI*
TSB
#
BHIa*
TSB
#
Candida albicans
ATCC 28366
Levedura Gram-positivo
MH
*
TSB
#
MHa*
TSB
#
BHI: Caldo Brain Heart Infusion; BHIa: Brain Heart Infusion ágar; MH: Caldo Mueller-
Hinton; MHa: Mueller-Hinton ágar; * Método de difusão em ágar; # Método de diluição em
caldo.
4.3 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS
Brain Heart Infusion – BHI (Merck)
Utilizado para pesquisa de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composição:
Infusão de cérebro bovino…………………………………...……….200,0 g
Infusão de coração................................................................................250,0 g
Proteose peptona....................................................................................10,0 g
Dextrose...................................................................................................2,0 g
Cloreto de sódio.......................................................................................5,0g
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
42
Fosfato dissódico.....................................................................................2,5g
Preparação:
Foram dissolvidos 37,0 g do pó Brain Heart Infusion em 1000,0 mL de água
destilada, o qual foi homogeneizado e autoclavado por 20 minutos a 120°C.
Brain Heart Infusion Ágar – BHIa (Merck)
Utilizado para pesquisa de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composição:
Infusão de cérebro bovino..............................................................200,0 g
Infusão de coração.........................................................................250,0 g
Proteose peptona..............................................................................10,0 g
Dextrose.............................................................................................2,0 g
Cloreto de sódio.................................................................................5,0 g
Fosfato dissódico...............................................................................2,5 g
Ágar..................................................................................................15,0 g
Preparação:
Foram dissolvidos 52,0 g do pó Brain Heart Infusion ágar em 1000 mL de água
destilada, o qual foi homogeneizado e autoclavado por 20 minutos a 120°C.
Mueller-Hinton – MH (Merck)
Utilizado para pesquisa de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composição:
Infusão de carne bovina.................................................................300,0 g
Peptona ácida..................................................................................17,5 g
Amido...............................................................................................1,5 g
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
43
Preparação:
Foram dissolvidos 21,0 g do pó Mueller-Hinton em 1000,0 mL de água
destilada, homogeneizada e autoclavada a 120°C por 20 minutos.
Mueller-Hinton ágar – MHa (Merck)
Utilizado para pesquisa de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composição:
Infusão de carne bovina.................................................................300,0g
Peptona ácida...................................................................................17,5g
Amido................................................................................................1,5g
Ágar..................................................................................................17,0g
Preparação:
Foram dissolvidos 38,0 g do pó Mueller-Hinton em 1000,0 mL de água
destilada, homogeneizada e autoclavada a 120°C por 20 minutos.
Tryptic Soy Broth - TSB (Merck)
Utilizado para pesquisa de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composição:
Peptona de Caseína.........................................................................17,0 g
Peptona de soja.................................................................................3,0 g
Glicose..............................................................................................2,5 g
Cloreto de sódio................................................................................5,0 g
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
44
Fosfato de potássio...........................................................................2,5 g
Preparação:
Foram dissolvidos 30,0 g do pó de Tryptic Soy Broth em 1000,0 mL de água
destilada, o qual foi homogeneizado e autoclavado por 20 minutos a 120
o
C.
Tryptic Soy Ágar - TSA (Merck)
Utilizado para pesquisa de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Composição:
Peptona de Caseína........................................................................15,0 g
Peptona de soja................................................................................5,0 g
Cloreto de sódio...............................................................................5,0 g
Ágar................................................................................................15,0 g
Preparação:
Foram dissolvidos 40,0 g do pó de Tryptic Soy Broth em 1000,0 mL de água
destilada, o qual foi homogeneizado e autoclavado por 20 minutos a 120
o
C.
4.4 MANUTENÇÃO DOS MICRORGANISMOS INDICADORES
Os microrganismos foram mantidos congelados a – 20ºC no meio Tryptic Soy
Broth (TSB) contendo glicerol.
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Para avaliação da atividade antimicrobiana pelo método da difusão em ágar pela
técnica do poço foram utilizados os extratos hexânico, etanólico e diclorometânico de
Miconia rubiginosa, e o extrato etanólico de Pfaffia glomerata. Para determinação da CIM foi
utilizado o método da diluição em caldo, pela técnica de microdiluição em placa dos extratos
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
45
hexânico, etanólico e diclorometânico de Miconia rubiginosa, e os extratos etanólico e
hexânico de Pfaffia glomerata
4.6 MÉTODO DE DIFUSÃO EM ÁGAR: Técnica do Poço
Realizou-se avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos obtidos das
plantas Pfaffia glomerata e Miconia rubiginosa, pelo método de difusão em ágar, pela técnica
do poço preconizada por Grove e Randall (1955) em placas com camada dupla, ou seja,
camada base e camada seed de meios adequados, em triplicata. A camada base foi obtida com
25,0 mL de meio de cultura BHIa esterilizado em placa de Petri 25x50 mm esterilizada. Após
a solidificação foram adicionados 12,5 mL de meio de cultura BHIa esterilizado e resfriado a
cerca de 50
o
C ao qual foi incorporado o inóculo. O inóculo foi preparado através da
transferência de culturas de 24 horas de microrganismos indicadores para um tubo de ensaio
com tampa de rosca contendo 2,5 mL de caldo BHI. Preparou-se o inóculo a uma
concentração de 10
8
células/mL por comparação do inóculo das bactérias com a escala 0,5 de
Mc Farland, enquanto que o inóculo preparado de C. albicans foi comparado com a escala 1,0
Mc Farland. Verteu-se então o inóculo no tubo de ensaio contendo 12,5 mL de BHIa,
formando a camada seed (Figura 5).
Figura 5 – Inóculo sendo colocado
sobre a camada base
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
46
Após a solidificação da camada seed, os poços foram obtidos pela remoção de
ágar, com um dispositivo metálico contendo cilindros de 4mm de diâmetro, a cerca de 25 mm
da borda e eqüidistantes entre si a uma distância de 40 mm, esterilizado em autoclave
(Figura 6).
Figura 6 – Obtenção de poços
Uma vez feitos, os poços foram preenchidos com 40 µL dos extratos das
plantas, sendo que para M. rubiginosa foram utilizados os extratos hexânicos,
diclorometânicos e etanólicos, e para P. glomerata utilizou-se o extrato etanólico, a serem
testados nas concentrações de 100, 200 e 300 mg/mL em sentido horário. Para cada placa foi
também confeccionado um poço que foi preenchido com o controle positivo (Digluconato de
Clorexidina a 0,12% – Periogard
) e em outro o controle negativo (Dimetil Sulfóxido –
DMSO).
Após esses procedimentos, as placas foram pré-incubadas à temperatura
ambiente por duas horas para difusão das substâncias antes do início do desenvolvimento de
cepas indicadoras como preconizado por Muller (1966). Depois da pré-incubação, as placas
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
que continham S. mutans, S. sobrinus, S. sanguinis, S. mitis e L. case,i foram incubadas em
microaerofilia pelo sistema de chama de vela e a C. albicans, E. faecalis e S. salivarius em
aerobiose a 37
o
C por 24-48 horas. Decorrido o período de incubação, a zona de inibição foi
avaliada pela mensuração do halo de inibição ao redor do poço incluindo o seu diâmetro em
mm.
4.7 MÉTODO DE DILUIÇÃO EM CALDO: Técnica de microdiluição em placa
Para determinação da CIM, foram preparadas soluções dos extratos brutos das
plantas contendo 1 mg/mL em dimetil sulfóxido. Em seguida, prepararam-se as seguintes
soluções:
- solução mãe 1: foram transferidos 500 µL de cada uma das soluções dos
extratos anteriormente citados para tubos de ensaio contendo 500 µL do
Tryptic Soy Broth (TSB);
- solução mãe 2: foram transferidos 500 µL de cada uma das soluções dos
extratos preparadas anteriormente para tubos de ensaio contendo 2.500 µL
do TSB;
- solução mãe 3: foram transferidos 500 µL de cada uma das soluções dos
extratos preparadas anteriormente para tubos de ensaio contendo 4.500 µL
do TSB .
Como controle positivo foi utilizada solução de Digluconato de Clorexidina na
concentração de 1 mg/mL, proveniente da farmácia de manipulação Drogafarma.
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
48
4.8 PREPARO DO INÓCULO
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, foram transferidas culturas
de 24 horas dos microrganismos indicadores, desenvolvidos no meio TSA adicionado de
5,0% de sangue de carneiro, para tubos contendo TSB (Figura 7).
Figura 7 – Preparo do inóculo
Padronizou-se o inóculo fazendo a comparação deste com o tubo 0,5 e 1,0 da
escala Mc Farland (Figura 8), de modo a fornecer um inóculo de 10
8
UFC/mL.
Figura 8 – Comparação do inóculo co
m
a escala de Mc Farland
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
49
4.9 PROCEDIMENTO
Todo procedimento foi feito em capela de fluxo laminar, com os cuidados
necessários: as vidrarias, ponteiras e os meios de cultura foram previamente esterilizados.
Utilizaram microplacas esterilizadas com 96 orifícios. Cada orifício recebeu inóculo, TSB e
amostra das soluções dos extratos brutos preparadas, de tal maneira que o volume final em
cada orifício foi de 100 µL (Figura 9).
Foram avaliadas amostras das soluções em diversas concentrações, que
variaram de 0,078 µg/mL a 300 µg/mL de TSB . Determinou-se, então, a menor concentração
de cada amostra capaz de inibir o crescimento dos microrganismos indicadores.
Figura 9 – Colunas são distribuídas do número 1 ao 12 e
as linhas da letra A à H
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
50
Para os controles positivos, as concentrações avaliadas variaram de 0,0115
µg/mL a 5,9 µg/mL de TSB. Também foram realizados os seguintes controles: controle de
esterilidade do caldo (TSB); controle das culturas (que devem apresentar crescimento
microbiano devido à ausência de agentes antimicrobianos); controle da esterilidade do anti-
séptico e controle de esterilidade das amostras.
As microplacas foram seladas com parafilme e incubadas a 37
o
C por 24-48
horas. Após o período de incubação, foram adicionados em cada orifício 30 µL de resazurina
(Sigma) preparado em solução aquosa (0,01%) para as bactérias. Este sistema revelador
permite a observação imediata, sendo que a cor azul representa ausência de crescimento
microbiano e a cor vermelha sua presença. A levedura C. albicans foi revelada utilizando-se
cloreto trifeniltetrazólio (Merck) preparado em solução aquosa (0,7%). As microplacas foram
reincubadas por 30 minutos. Após este período, as microplacas foram observadas e
analisadas. A ausência de cor nos orifícios foi interpretada como microrganismo sensível ao
extrato testado (ausência de crescimento microbiano). Os experimentos foram realizados em
triplicata.
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados dos ensaios biológicos pelo método de difusão em ágar, pela
técnica do poço foram submetidos a analise estatística seguindo o modelo ONE-WAY
ANOVA. Para comparação das médias entre as diferentes concentrações para cada extrato
bruto das plantas testadas foi utilizado o teste post hoc de Tukey. O nível de significância para
todo o teste estatístico foi α = 0,05 (ZAR, 1999).
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Espécies dos gêneros Miconia e Pfaffia vêm sendo estudadas e algumas
atividades foram atribuídas às mesmas como: atividade analgésica, tripanocida,
antimicrobiana, antinflamatória e antifúngica (ARLETTI et al., 1999; ANDRADE E SILVA
et al., 2002; CUNHA et al., 2003; CELOTTO et al., 2003;; NETO et al., 2005, NETO et al.,
2004; CUNHA,2006).
Recentemente, pesquisas sobre a ação antimicrobiana de algumas plantas
medicinais têm sido desenvolvidas em microrganismos da cavidade bucal (BUFFON et al.,
2001;KOO et al., 2002b; PAIXÃO et al., 2002; COUTINHO et al., 2004; COIMBRA , 2005;
BRITO; LIMA; ARAÚJO, 2006; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006; CUNHA, 2006).
Porém não existe até o presente momento, trabalho na literatura que
correlacione os extratos de M. rubiginosa e P. glomerata e atividade antimicrobiana na área
de odontologia.
As concentrações utilizadas no presente estudo, 100, 200 e 300 mg/mL, foram
definidas com base em trabalhos anteriores do grupo (COIMBRA, 2005; CUNHA, 2006;
ALVES, 2006). Os métodos utilizados neste trabalho foram: o método de difusão em ágar
pela técnica do poço, e o método de diluição em caldo pela técnica de microdiluição em placa,
métodos estes também selecionados por outros autores para avaliação da atividade
antimicrobiana em microrganismos da cavidade bucal (LENTZ et al., 1998, NASCIMENTO,
2000; KOO et al., 2000a; 2002b; KATSURA, 2001; MODESTO, 2001; PEREIRA et al.,
2001; GEBARA; LIMA; MAYER, 2002; CELLOTTO, 2003a; 2003b; CUNICO et al., 2004;
COIMBRA, 2005; CUNHA, 2006;).
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
52
De acordo com os dados apresentados na tabela 1 ( pg. 54) podemos observar
que houve atividade dos extratos frente a maioria dos microrganismos, pelo método de
difusão em ágar.
O extrato hexânico de M. rubiginosa não apresentou diferenças
estatisticamente significante entre as três concentrações frente aos microrganismos avaliados.
Em relação a este mesmo extrato observou-se que este não apresentou atividade frente ao
microrganismo L .casei (Tabela 1).
Observou-se ainda que o extrato etanólico de M. rubiginosa apresentou
diferença estatisticamente significante quando se comparou as concentrações 200 e 300
mg/mL com a concentração de 100 mg/mL, frente aos microrganismos S. salivarius, S.
sanguinis, S mutans e S. sobrinus (Tabela 1).
Ainda na tabela 1, em relação ao extrato diclorometânico da M. rubiginosa,
pôde-se observar que não houve diferença estatisticamente significante entre as concentrações
frente aos microrganismos avaliados, com exceção do L. casei, pois em relação a este
microrganismo o extrato não apresentou atividade.
Para o extrato etanólico da P. glomerata observou-se que não houve atividade
frente ao E. faecalis, S. salivarius, S. mutans, C. albicans e L. casei. Para os microrganismos
S. anguinis, S. mitis e S. sobrinus houve atividade, porém sem diferença estatisticamente
significantes entre as três concentrações.
Como já foi dito anteriormente pela ausência de relatos na literatura quanto a uma
possível atividade antimicrobiana em microrganismos da cavidade bucal com esses extratos
ficou difícil realizar comparações com outros trabalhos, devido às diferentes substâncias
encontradas em cada planta.
Diante dos resultados obtidos pelo método de difusão em ágar, as duas espécies
vegetais avaliadas apresentaram potencial antimicrobiano para a maioria dos microrganismos
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
53
indicadores. Apesar disso, nenhum extrato se destacou perante outro como mais ativo, de
acordo com a análise estatística. O método de difusão em ágar, por sofrer influência de
algumas variáveis como: composição do meio de cultura, presença de enzimas bacterianas,
densidade do inóculo, difusibilidade do extrato no meio de cultura, pois é possível que a
baixa polaridade dos compostos diminua a velocidade de difusão destes no ágar, gerando um
halo de inibição proporcionalmente menor em relação ao controle que é mais polar
(VIRTUOSO et al., 2005), estabilidade do extrato usado, temperatura e período de incubação
das placas, por isso não é prudente ter este método como conclusivo.
Neste trabalho o controle positivo utilizado foi o digluconato de clorexidina. Os
resultados obtidos com os extratos não foram comparados com o mesmo, pois estamos nos
referindo a uma substância pura (clorexidina), que não pode ser comparada a um extrato
bruto (mistura complexa).
Portanto sendo o método de difusão em ágar um teste qualitativo, optou – se por
utilizar método de diluição em caldo para determinação da CIM, que consiste em um teste
quantitativo.
__________________________________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
54
Tabela 1 – Comparação dos resultados das médias da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar (Técnica do Poço) das
diferentes concentrações dos extratos hexânico, etanólico e diclorometânico da M. rubiginosa e etanólico da P. glomerata em
microrganismos da cavidade bucal
Microrganismos
(ATCC)
Extratos
Concentra
ções
(mg/mL)
E.
faecalis
(4082)
S.
salivarius
(25975)
S.
sanguinis
(10556)
S.
mitis
(49456)
S.
mutans
(25175)
S.
sobrinus
(33478)
C.
albicans
(283366)
L.
casei
(11578)
100
11,33±0,58 11,00±0,00 10,33±0,58 10,00±0,00 9,67±0,58 9,33±0,58 8,33±0,58 0,00±0,00
200
11,67±0,58 10,67±0,58 11,33±0,58 10,00±0,00 10,33±1,52 9,33±0,58 9,33±0,58 0,00±0,00
300
12,67±0,58 11,00±0,00 11,33±0,58 10,33±0,58 11,00±0,00 9,67±0,58 9,33±0,58 0,00±0,00
M. rubiginosa
Hexânico
Controle +
15,67±1,15 18,00±0,00 17,33±0,58 17,00±1,73 22,67±1,52 21,33±0,58 18,33±1,15 29,33±0,58
100
0,00±0,00
13,67±0,58
b
9,33±0,58
b
12,00±1,00
12,67±0,58
b
13,67±0,58
b
14,00±1,00 10,00±0,00
200
0,00±0,00
15,33±0,58
a
13,67±1,52
a
13,00± 0,00
17,33±1,52
a
16,67±0,58
a
14,33±1,52 10,33±0,58
300
0,00±0,00
16,00±1,00
a
15,33±0,58
a
14,00±1,00
18,67±0,58
a
17,33±0,58
a
15,00±1,00 10,67±0,58
M. rubiginosa
Etanólico
Controle +
15,67±1,15 18,00± 0,00 17,33±0,58 17,00±1,73 22,67±1,52 21,33±0,58 18,33±1,15 29,33±0,58
100
8,33±1,15 12,67±0,58 10,00±1,00 9,33±0,58 11,33±0,58 10,00± 0,00 13,33±2,08 0,00±0,00
200
8,33±0,58 13,00±1,00 9,33±0,58 9,00±1,00 11,67±0,58 11,00±/0,00 13,33±2,08 0,00±0,00
300
8,67±0,58 13,67±0,58 10,67±0,58 8,67±0,58 12,00±1,00 11,00±/0,00 14,00±1,73 0,00±0,00
M. rubiginosa
Diclorometânico
Controle +
15,67±1,15 18,00± 0,00 17,33±0,58 17,00±1,73 22,67±1,52 21,33±0,58 18,33±1,15 29,33±88,00
100
0,00±0,00 0,00±0,00 9,67±0,58 9,33±0,58 0,00±0,00 9,00± 0,00 0,00±0,00 0,00±0,00
200
0,00±0,00 0,00±0,00 10,33±1,15 12,00±0,00 0,00±0,00 10,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00
300
0,00±0,00 0,00±0,00 11,67±0,58 12,33±0,58 0,00±0,00 9,33±0,58 0,00±0,00 0,00±0,00
P. glomerata
Etanólico
Controle +
15,67±1,15 18,00± 0,00 17,33±0,58 17,00±1,73 22,67±1,52 21,33±0,58 18,33±1,15 29,33±0,58
Controle positivo (+) – Periogard® 0,12%; Letras/Cores distintas indicam diferenças estatisticamente significante entre as concentrações
para cada extrato, de acordo com o teste de Tukey (α= 0,05).
_________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
55
De acordo com a tabela 2, todos os extratos apresentaram atividade
antimicrobiana sendo que a CIM variou entre 60 e 300µg/mL, mesmo os que não
apresentaram atividade pelo método de difusão em ágar.
Coimbra (2005) encontrou situação semelhante, onde observou que, pelo
método da difusão em ágar (técnica do poço), as substâncias (-)-cubebina e (-)-hinoquinina
não apresentaram atividade antimicrobiana, porém, no método de microdiluição para
determinar a CIM, houve inibição do crescimento dos microrganismos indicadores.
Bandeira et al (1999) também encontraram resultados semelhantes uma vez
que justificaram este fato relacionando a atividade antimicrobiana no método de difusão em
ágar, à dificuldade de difusão das substâncias testadas no meio de cultura. O método da
microdiluição para a determinação da CIM é usado para concluir o desempenho de todos os
outros métodos utilizados para testes de susceptibilidade antimicrobiana (ANDREWS et
al.,2001).
Ainda na tabela 2 observou-se que todos os extratos de M. rubiginosa
apresentaram resultados semelhantes entre si frente à maioria dos microrganismos avaliados.
Pôde-se observar ainda que o E.faecalis e o L.casei apresentaram maior
resistência, frente a todos os extratos avaliados, seguido do S.mutans, microrganismos estes
responsáveis pelo início da cárie dental, e que os extratos apresentaram maior atividade frente
ao S. mitis e S. sanguinis.
_________________________________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
56
Tabela 2 – Resultado da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) em µg/mL dos extratos hexânico, etanólico e diclorometânico
da M. rubiginosa e dos extratos hexânico e etanólico da P. glomerata em microrganismos da cavidade bucal
M.
rubiginosa
P.
glomerata
Controle +
Extratos
(µg/mL)
Microrga-
Nismos
Hexânico Etanólico Diclorometânico Hexânico Etanólico Clorexidina
S. salivarius (25975) 80 90 90 200 90 0,3688
E. faecalis (4082) 200 200 200 300 200 1,475
S. sanguinis (10556) 80 80 80 200 70 0,7375
S. mutans (25175) 200 200 200 90 200 0,7375
S. sobrinus (33478) 100 100 90 70 90 0,1844
L .casei (11578) 200 200 200 300 200 0,3688
C. albicans (28366) 90 90 100 200 100 2,95
S. mitis (49456) 60 70 70 80 60 0,7375
Controle positivo (+) – Digluconato de clorexidina 1mg/mL, proveniente da farmácia de manipulação drogafarma.
________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
57
Em estudos de atividade antimicrobiana de extratos brutos de espécies vegetais, o
potencial antimicrobiano muitas vezes, não se deve a uma única substância, mas sim, a um
conjunto dessas substâncias. Um extrato bruto de uma espécie vegetal que possui efeito
bactericida satisfatório, poderia não necessitar ,portanto, de processos de isolamento de
substâncias ativas, reduzindo etapas químicas e conseqüentemente custos financeiros. Isto,
viabilizaria uma possível utilização como fitoterápico ( CUNHA, 2006). Por outro lado,
geralmente os compostos presentes em menor proporção na planta são os que apresentam
melhores efeitos biológicos.
Sendo assim os químicos orgânicos têm realizado estudos separando, purificando e
analisando substâncias puras produzidas por esses vegetais, por exemplo, o uso da quinina
em lugar de extratos de quina e da digoxina ou digitoxina em lugar de extratos de Diditalis.
Estes foram impostos pelas vantagens relativas a reprodutividade dos efeitos, pela
constância da composição, maior eficácia, segurança e mesmo pela qualidade dos produtos,
visto a maior facilidade em se estabelecer especificações para uma substância única em
relação a uma mistura complexa de substâncias ( SCHENKEL, 2000).
Por este motivo há necessidade de um trabalho com análise de extratos mais
ampla, onde se obtém extratos purificados, frações e finalmente, os compostos puros. Neste
sentido, torna-se indispensável à análise da potência das frações e das substâncias puras em
relação à sua concentração (CECHINEL FILHO et al., 1998) bem como suas atividades
bactericída e bacteriostática.
_________________________________________________________CONCLUSÕES
58
CONCLUSÕES
Através dos resultados obtidos pôde-se chegar às seguintes conclusões:
• Todos os extratos avaliados apresentaram atividade antimicrobiana frente
à maioria dos microrganismos pelo método de difusão em ágar (técnica
do poço).
• Pela técnica de microdiluição em placa todos os extratos apresentaram
atividade antimicrobiana frente aos microrganismos avaliados. Os
extratos demonstraram ser mais eficientes frente ao S. mitis, S. sanguinis.
________________________________________________________REFERÊNCIAS
59
REFERÊNCIAS
ALMEIDA, R. V. D.; PADILHA, W. W. N.; DRUMOND, M. R. S.; CASTRO, R. D.
Avaliação da atividade antimicrobiana de cinco produtos fitoterápicos e de uma solução à
base de quinosol, tirotricina e tintura de malva frente aos microrganismos formadores de
biofilme dentário. ago. 2003. Disponível em:
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