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CRISTIANE DOMINGUES ROCHA
DETERMINAÇÃO DOS PONTOS CRÍTICOS DE CONTAMINAÇÃO POR
LEVEDURAS EM INDÚSTRIA DE REFRIGERANTES
Dissertação apresentada como requisito
parcial a obtenção do grau de Mestre em
Microbiologia. Curso de Pós Graduação
em Patologia, Parasitologia e Microbiologia,
Dept° Patologia Básica, Setor de Ciências
Biológicas e da Saúde da Universidade
Federal do Paraná.
Orientadora: Drª. Cristina Leise Bastos Monteiro
Co-orientadoras: Drª. Yanê Carvalho
Drª. Elisa Odebrecht
CURITIBA
2006
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AGRADECIMENTOS
À Dra. Cristina Leise Bastos Monteiro e à Professora Dra. Elisa Odebrecht pela
orientação e apoio na realização desta pesquisa.
À Dra. Yanê de Carvalho pela ajuda em todas as etapas da pesquisa.
À Dra. Marcia Regina Beux pela ajuda na qualificação do trabalho.
À Fábrica de Bebidas por ter cedido suas instalações nas etapas práticas da
pesquisa.
À Luciana Massolim Ramos Gaspar pelo apoio no trabalho realizado.
Aos colegas de mestrado pela amizade. Principalmente à colega Jannaina F.
Melo Vasco pelas sugestões e ajuda.
Aos meus pais, Gilberto e Maria Helena, pelo amor, carinho e por todos os
esforços dedicados a mim, por terem me ensinado a valorizar os estudos e por terem
possibilitado que eu chegasse aqui.
Ao meu marido Carlos Eduardo, pelo amor, incentivo e ajuda na realização
desta pesquisa.
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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E QUADROS ii
LISTA DE FIGURAS iii
RESUMO iv
ABSTRACT v
INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3
2.1
Produção de refrigerantes 3
2.2
Susceptibilidade microbiológica de refrigerantes 4
2.3
Técnicas para detecção de leveduras em refrigerantes 5
2.4
Métodos de identificação de leveduras 7
2.5
Principais leveduras deteriorantes encontradas em bebidas 7
2.6
Ocorrência principais fungos em bebidas 12
2.7
Higienização na indústria de refrigerantes 12
3. MATERIAL E MÉTODOS 15
3.1
Localização e caracterização da área experimental 15
3.2
Amostragens 15
3.3
Quantificação das leveduras contaminantes 18
3.4
Identificação morfológica 20
3.5
Identificação bioquímica 20
3.6
Determinação das propriedades das leveduras 22
3.7
Efeito inibitório de produtos químicos usados na higienização 23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 24
4.1
Freqüência e quantificação da contaminação por leveduras 24
4.2
Identificação das leveduras isoladas 28
4.3
Identificação bioquímica das leveduras isoladas 30
4.4
Relação dos gêneros encontrados com os pontos amostrados 32
4.5
Verificação da osmotolerância das cepas isoladas 33
4.6
Atividade inibitória de produtos químicos de higienização 34
5. Conclusões 36
6. Referências Bibliográficas 37
ANEXO 40
i
LISTA DE TABELAS E QUADROS
página
TABELA 1.
Amostragens dos pontos de análise referentes à Companhia
Produtora de Bebidas
16
TABELA 2.
Enumeração das contaminações por leveduras nas
amostras coletadas do mês de agosto de 2004 a julho de
2005
25
TABELA 3. Avaliação qualitativa das contaminações por leveduras nas
amostragens de equipamentos da linha de envase
coletadas do mês de agosto de 2004 a julho de 2005
25
TABELA 4. Aspectos fisiológicos e morfológicos das leveduras isoladas 28
TABELA 5. Características bioquímicas das leveduras isoladas 30
TABELA 6. Características bioquímicas das cepas padrão utilizadas na
pesquisa
30
TABELA 7. Identificação das leveduras isoladas ao nível de gênero 31
TABELA 8. Distribuição das leveduras isoladas nos 6 grupos de
identificação
32
TABELA 9. Verificação da prevalência dos gêneros nos pontos de
coleta
32
TABELA 10. Osmotolerância das leveduras isoladas 34
TABELA 11. Testes de Inibição dos Produtos Químicos 35
QUADRO 1. Esquema de amostragens realizadas na Companhia
Produtora de Bebidas
15
ii
LISTA DE FIGURAS
página
FIGURA 1.
Fluxograma da produção de refrigerantes 4
FIGURA 2.
Amostragem de água da tubulação do tanque de xarope
simples
17
FIGURA 3.
Amostragem com Swab dos equipamentos de envase
17
FIGURA 4.
Kit API 20 Aux 21
FIGURA 5.
Freqüência em porcentagem (%) da ocorrência de leveduras
nos pontos amostrados
26
FIGURA 6.
Freqüência de contaminação nos 3 sabores de refrigerantes
analisados
27
FIGURA 7.
Macromorfologia das leveduras isoladas na pesquisa em
meio Agar Batata Dextrose após 72 horas de crescimento
29
FIGURA 8.
Micromorfologia das leveduras isoladas na pesquisa através
da microscopia óptica de campo escuro no aumento de 600
vezes
29
FIGURA 9.
Inibição do crescimento das leveduras pela ação dos
desinfetantes
35
iii
RESUMO
Os refrigerantes são produtos alimentícios que possuem basicamente a
característica de fornecer calorias através de um sabor refrescante. A composição
química adocicada, a sua atmosfera gasosa, além da alta atividade de água e acidez
elevada, tornam estas bebidas passíveis de contaminação e posterior deterioração
por leveduras. Na indústria de refrigerantes é freqüente a detecção de leveduras nas
diferentes fases do processo, bem como no produto acabado o que acarreta perda
econômica e prejudica a imagem de quem os produziu. Com o objetivo de rastrear
pontos críticos de contaminação por leveduras em uma indústria de refrigerantes,
realizou-se a quantificação, e identificação de leveduras presentes nas matérias-
primas, fases do processo e produto acabado. Testes de inibição
para eleger o os
melhores agentes químicos de higienização nas indústrias destas bebidas também
foram realizados. Assim, foram analisadas através de identificação morfológica e
bioquímica 164 amostras de freqüência mensal no período de um ano, 30% delas
mostraram contaminação por leveduras. Verificou-se que a origem de grande parte da
contaminação do produto acabado é transmitida pelo ar ambiente, maquinários da
sala de envase, os vasilhames de vidro e as rolhas metálicas. Os gêneros de
leveduras encontrados com maior frequência foram Saccharomyces e Hansenula,
consideradas deteriorantes de bebidas. Na inibição das cepas de leveduras isoladas
os agentes químicos que revelaram melhores resultados possuíam pH básico, como a
soda cáustica e o hipoclorito de sódio.
Palavras-chave: Levedura; Refrigerante; Pontos críticos de contaminação; Produtos
químicos para higienização.
iv
ABSTRACT
Fresh drinks are food that basically brings calories with a fresh flavour. Their
sweet chemistry composition, pH about 4.3, atmosphere with carbonic gas, and the
high water, make these drinks passives of yeast contamination and subsequent
deterioration. In soft drink industry is common to detect yeasts on the different stages
of the process, as well as in the finished product. The consequence is the economic
loss of many hectoliters of these drinks, besides damaging the industries image.
Aiming to verify the critical yeast contaminated points during the fresh drink
production, was done the enumeration, isolation e properties analisys of the yeasts
that were present in the raw material, process stages and in the finished product
further the realization of inibition testes with chemical products to know the best
products to use in the hygienic works of these industries. Were 164 samples were
analised by morfological and biochemistry techniques in a monthly frequency of the
period one year, and the results were 30% of contaminated samples with yeasts.
According to the results obtained, it was possible to evidence that the yeast
contamination becomes of the environment air and the equipments of the filling room,
as well as the glass bottles and metallic caps. The genus more frequently found were
Saccharomyces and Hansenula that are spoil drink yeasts. The tests with chemical
solutions results that chemical agents like caustic soda and sodium hypochloryte have
to be the best choice to make the fresh drink industry sanitization.
Key-words: Yeast; Soft drink; Contamination critical points; chemical products for the
hygienic works
v
1
1. INTRODUÇÃO
Os refrigerantes são produtos alimentícios que possuem basicamente a
característica de fornecer calorias através de um sabor refrescante (ABIR, 2005).
A Portaria 544 do Ministério da Agricultura e Abastecimento, de 16 de
Novembro de 1998, definem este produto como uma bebida não alcoólica obtida pela
dissolução, em água potável, de suco, essências ou extratos vegetais e açúcar,
obrigatoriamente saturado com dióxido de carbono industrialmente puro (BRASIL,
1998). Na sua produção, são adicionados diversos aditivos como conservantes
(Sorbato de potássio e Benzoato de sódio), estabilizantes, acidulantes, corantes,
essências (guaraná, cola, limão, laranja), entre outros (ABIR, 2005).
As leveduras são microrganismos que podem ser detectadas no solo, ar, água
e alimentos, multiplicam-se em todas as bebidas não alcoólicas, com e sem CO
2
, A
composição química adocicada dos refrigerantes, o pH em torno de 4,3 e sua
atmosfera, oferecem condições favoráveis ao desenvolvimento destes fungos, sendo
muito freqüente a deterioração por leveduras (KREGER-VAN RIJ, 1970; TANIWAKI,
1999; ODEBRECHT, 2001).
Estudos mostram que a presença de leveduras como contaminantes em
refrigerantes é maior em relação aos fungos filamentosos e bactérias. Devido à sua
composição, contaminações por microrganismos patogênicos não ocorrem, pois estes
não suportam ambientes de elevada acidez e alta concentração de gás carbônico
(ODEBRECHT, 2001).
Na indústria de refrigerantes é frequente a detecção de leveduras nas
diferentes fases do processo, bem como no produto acabado, cuja conseqüência,
muitas vezes, representa a perda econômica de hectolitros desse tipo de bebida
(MISLIVEC et al., 1992).
A deterioração microbiológica clássica de refrigerantes geralmente ocorre de
quatro a seis semanas após a data de produção, ou seja, quando o produto já está
em fase de distribuição. As conseqüências da deterioração são a ocorrência de
sedimentação, floculação, presença de sabor e odor desagradável e finalmente um
aumento do nível de gás carbônico devido à fermentação que leveduras
contaminantes realizam (DOYLE, 2001).
2
Para que ações corretivas possam ser tomadas antes que ocorra a
deterioração do produto final, torna-se necessário rastrear pontos críticos de controle
de leveduras, presentes em pequenas quantidades durante o processamento dos
refrigerantes (JAY, 2000).
Dentro de uma indústria de refrigerantes, ocorre sempre a busca de
alternativas para garantir a vida de prateleira dentro das especificações, ou seja,
evitar as contaminações microbiológicas. As ferramentas utilizadas são os programas
de limpeza com o uso de detergentes adequados, os programas mestres de
sanitização, além do cumprimento das boas práticas de fabricação (MARTINEZ,
2004).
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Determinar os pontos críticos de contaminação por leveduras em uma fábrica
de refrigerantes, conhecer quais são os gêneros mais freqüentes, bem como
determinar os produtos químicos que melhor inibem estes contaminantes.
Objetivos específicos
1. Determinar os pontos com maior contaminação.
2. Verificar quais os gêneros de leveduras predominantes
3. Verificar o efeito inibitório de produtos químicos usados na higienização frente às
cepas isoladas.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Produção de refrigerantes
Os primeiros relatos de consumo dos refrigerantes datam de 1886 quando
ainda eram comercializados em farmácias, e, nos dias atuais são bebidas apreciadas
e consumidas milhares por pessoas de todas as idades e classes sociais, (ABIR,
2005).
Os refrigerantes são bebidas não alcoólicas, sendo ótima fonte de glicídeos,
pois são elaborados a partir de uma mistura de água e açúcar. Essa mistura é
aquecida até atingir temperatura de 90ºC, sendo em seguida clarificada e resfriada
em um trocador de calor. A esta mistura adicionam-se aromas, sucos naturais ou
extratos vegetais, antioxidantes, acidulantes, corantes e conservantes. Após esta
etapa, a percentagem de açúcar (°BRIX) é corrigida, o xarope é transportado em
tubos de aço-inox, por impulsão de bombas, ao aparelho de mistura, sendo diluído e
homogeneizado com água potável e gás carbônico. Em seguida é enviado à
enchedora, onde ocorre o envasamento (EVANGELISTA, 1989).
Os vasilhames feitos de vidro para o envase de refrigerantes são retornáveis,
ou seja, após serem consumidos são devolvidos à fábrica produtora desta bebida. Ao
retornarem na unidade fabril, estas garrafas passam por um processo de limpeza
química e mecânica em uma máquina chamada de lavadora de garrafas, a qual trata-
se de uma série de tanques com solução cáustica aquecida e adicionada de aditivos
que possuem a propriedade de envolver o vasilhame interna e externamente
eliminando desta maneira a sujeira e contaminação microbiológica (ABIR, 2003).
As garrafas após lavagem sofrem enxágüe com água clorada e seguem
através de uma esteira para a sala de envase onde recebem a bebida pronta por uma
máquina enchedora. Após cheias, recebem um jato de água aquecida com pressão,
para retirada do oxigênio existente no espaço vazio correspondente à parte superior
da garrafa, através de um equipamento denominado HDE. Finalmente seguem pela
esteira automática até uma máquina chamada de arrolhador. Este equipamento
possui um funil metálico onde ocorre o abastecimento de rolhas metálicas que
descem por uma calha para serem posicionadas através de ar comprimido no bocal
das garrafas (ABIR, 2003).
4
FIGURA 1. Fluxograma da produção de refrigerantes
2.2 Susceptibilidade microbiológica de refrigerantes
As bebidas doces não alcoólicas carbonatadas (refrigerantes), são muito
susceptíveis a contaminações, pois representam uma fonte de nutrientes para
diversos tipos de microrganismos. O teor de carboidratos encontrados nessas
bebidas, provenientes de sacarose, glicose e frutose, encontram-se acima das
quantidades necessárias para o crescimento da maioria dos microrganismos
(SCHMIDT, 1994).
Os refrigerantes possuem um efeito seletivo sobre os microrganismos devido à
presença de gás carbônico, como também baixos teores de oxigênio. Os
microrganismos aeróbios são inibidos, sendo que conseguem crescer os
microaerofílicos e os facultativos (SCHMIDT, 1994). A presença de fungos
filamentosos torna-se assim inibida, pois estes microrganismos são aeróbios e não
conseguem multiplicar-se em refrigerantes devido à presença de gás carbônico e
baixo teor de oxigênio. Estes microrganismos podem desenvolver-se no gargalo da
garrafa de refrigerantes, quando houver presença de oxigênio desta região
(MISLIVEC et al, 1992).
Além do alto teor de açúcares e a carbonatação, estas bebidas possuem
valores de pH baixos que encontram-se na faixa de 2.4 a 3.5, de acordo com cada
tipo de bebida, de forma que somente microrganismos acidófilos ou ácido-tolerantes
Xaroparia
simples
Xaroparia
Composta
Linha
de
Envase
Encaixotadora
Armazenagem
Tratamento de
água
Água
de poço
Açúcar em
bags
Kits,
concentrados
e sucos.
Garrafas
e
rolhas
metálica
5
poderão crescer. Os refrigerantes de frutas cítricas contêm, além disso, óleos etéricos
que aumentam a seletividade devido ao seu efeito bactericida (ODEBRECHT, 2001).
As bactérias que ocorrem nos refrigerantes são as dos gêneros Lactobacillus e
Leuconostoc. Os Lactobacillus sintetizam ácido láctico, cujas consequências
representam uma modificação de sabor e aroma, e em refrigerantes claros podem
formar turvação. O Leuconostoc sintetiza um polissacarídeo chamado dextrano, que
pode tornar a bebida viscosa (ODEBRECHT, 2001).
Os principais microrganismos contaminantes de refrigerantes são as leveduras,
que sintetizam gás carbônico tornando o sabor da bebida alterado . A síntese de gás
carbônico pela levedura, tem como conseqüência a formação de pressão na garrafa
ou lata, o que pode ocasionar a explosão destas embalagens. Além deste metabólito,
estes microrganismos consomem açúcares e sintetizam álcool no refrigerante, e os
produtos secundários da fermentação conferem à bebida um sabor típico de
fermentação. Em bebidas claras pode-se observar primeiramente turbidez e
tardiamente a sedimentação, a partir de uma contagem de leveduras em torno de
100.000 células por mililitro de bebida (MISLIVEC et al, 1992).
Determinadas espécies de leveduras sintetizam enzimas, o que representa um
problema para as bebidas que contêm polpa de frutas. Na composição das
substâncias da polpa encontra-se a pectina que é degradada por enzimas
extracelulares das leveduras chamadas pectinases, cuja consequência é a
sedimentação de partículas, deixando o produto com turvação indesejável
(ODEBRECHT, 2001).
Refrigerantes deteriorados não possuem mais as características esperadas
pelo consumidor, sendo que as consequências serão reclamações por parte do
mesmo (ODEBRECHT, 2001).
2.3 Técnicas para detecção de leveduras em refrigerantes
A garantia da qualidade microbiológica deve iniciar no controle da água de
processo, que recebe tratamento prévio através de coloração e filtração por filtros
polidores. Toda matéria-prima e insumos utilizados como suco, açúcar, xarope, gás
carbônico, garrafas e rolhas devem também ser analisados. O mesmo deve ocorrer
com os equipamentos que entram em contato direto ou indireto com o refrigerante,
em cada setor (DOYLE et al, 2001).
6
Para detectar uma contaminação em estado inicial necessita-se de métodos
apropriados. A enumeração de fungos viáveis, em bebidas, usualmente é feita pela
técnica de espalhamento em superfície. No caso de água potável, bebidas e similares
recomenda-se também a técnica da membrana filtrante (MISLIVEC et al, 1992).
No entanto, através desse método podem ser analisados somente a água de
processo, o CO2, as garrafas e o produto acabado. Para amostras de açúcares,
xaropes, sucos, bem como de swabs de equipamentos deverá ser empregada a
técnica de inoculação em profundidade (USFDA, 1998).
A filtração em membrana é uma técnica que permite a inoculação de um
grande volume de amostra concentrando-a na superfície da membrana de
nitrocelulose de porosidade conhecida devido à filtração mecânica, sendo que o
volume frequentemente utilizado é de 100 mL. O resultado é quantitativo e os fatores
limitantes para emprego do método são as amostras turvas e/ou viscosas (SAMSON
et al, 1992).
Os microrganismos, com diâmetro superior aos poros, ficam retidos na
superfície da membrana, a qual é transferida para uma placa de Petri contendo meio
de cultura de interesse. Todos os nutrientes difundem pela membrana atingindo os
microrganismos que se encontram na superfície. Após a incubação, faz-se a
contagem das colônias desenvolvidas e calcula-se a concentração microbiana da
amostra (SAMSON et al., 1992).
A técnica "Pour-Plate", ou do inóculo em profundidade é uma técnica que
permite a inoculação de pequenos volumes de amostras (normalmente 1 a 5 mL),
portanto é um método quantitativo utilizado para amostras turvas ou viscosas. Cada
microrganismo que se encontra isolado na superfície ou misturado ao meio de cultura
dará origem à 1UFC (Unidade Formadora de Colônia) (HARRIGAN, 1998).
A indústria de refrigerantes além de realizar as análises microbiológicas da
matéria-prima, insumos e produto acabado, também realiza análises de
acompanhamento visual e sensorial. Estas análises chamadas de estabilidade do
produto que ocorrem no dia do envase, trinta dias, sessenta dias e noventa dias após
o envase, ocorrem com a intenção de investigar possíveis alterações nos produtos
devido à multiplicação microbiana (SILVA et al.,1997).
7
2.4 Métodos de identificação de leveduras
A identificação de leveduras provenientes de alimentos caracteriza-se por ser
uma difícil tarefa, pois as características das colônias e a morfologia microscópica não
são suficientes para se determinar um laudo confiável pelo pesquisador. Geralmente
é necessário se fazer o uso de testes bioquímicos e fisiológicos como a fermentação
de carboidratos, assimilação de padrões em diferentes fontes de carbono e nitrogênio
e o crescimento em várias temperaturas. Muitos sistemas simplificados têm sido
publicados na literatura, e métodos manuais e automáticos de identificação de
leveduras já se encontram disponíveis no comércio (HARRIGAN, 1998).
A classificação e identificação de leveduras é baseada nos métodos utilizados
para fungos filamentosos e bactérias. A sua classificação em famílias e gêneros é
baseada na morfologia de suas células vegetativas e esporos, caso sejam formados.
Devido à esporulação das leveduras ser um fato que nem sempre ocorre,
especialmente em culturas de laboratório, além de ser considerada uma tarefa difícil
reconhecer os diferentes tipos de esporos, uma alternativa criada por (BARNETT et
al, 1983a), entretanto utilizando a mesma classificação adotada por (KREGER-VAN
RIJ et al, 1980), requer a utilização de testes fisiológicos, considerados fáceis de se
aplicar.
Uma versão simplificada do sistema criado por BARNETT et al. (1983b)
encontra-se disponível comercialmente pelo BioMeriux Laboratory Products, o
sistema API, que trata-se de uma tira contendo meios de cultivo, incluindo um controle
negativo. As reações provocadas pelo crescimento ou a sua ausência são convertidos
em códigos numéricos, e as espécies correspondentes a um determinado número são
identificadas através de uma chave classificatória fornecida pelo sistema (BERGAN et
al., 1982).
2.5. Principais leveduras deteriorantes encontradas em bebidas
Leveduras são fungos unicelulares, eucarióticos, mononucleados, aclorofilados,
heterotróficos, de reprodução sexuada e assexuada, capazes de utilizar uma gama
variada de substratos como fontes de carbono, nitrogênio e energia (TRABULSI et al,
2000). Constituem um grande e diversificado grupo de microrganismos compostos por
8
milhares de espécies que podem ser detectados no solo, ar, água e alimentos
(MISLIVEC et al., 1992).
Segundo (BACK, 2000), as leveduras deteriorantes de bebidas não alcoólicas
são subdivididas em:
a) De Fermentação Rápida: Alta produção de metabólitos da fermentação em 48
horas
b) De Fermentação Lenta: Baixa formação de metabólitos de fermentação em 120
horas
c) Não Fermentadoras: Não realizam a fermentação.
d) Osmofílicas (Apresentam capacidade de crescimento em altas concentrações de
açúcar)
e) Formadoras de Película
a) Leveduras de fermentação rápida
• Saccharomyces cerevisae
Levedura que apresenta colônias brancas, de margens circulares e superfície
brilhosa. Suas células são geralmente esféricas a cilíndricas, ocorrendo sozinhas, em
pares ou em cadeias. Ascospóros podem ser formados após longa incubação em
meio Ágar - Extrato de Malte, apresentando pobre crescimento em Ágar Czapeck e
Ágar Malte acético.
Possuem extrema capacidade fermentativa, produzem enzimas extracelulares
como poli-galcturonase e proteases e apresenta comum ocorrência em alimentos mas
muito raramente, podem causar deterioração. Como contaminante, têm grande
ocorrência em bebidas como refrigerantes e sucos concentrados (PITT e HOCKING,
1997)
• Kloeckera apiculata
Apresentam colônias de margens circulares, de coloração marrom pálido. Suas
células são pequenas e elipsóides, formam botões terminais ocorrendo sozinhas ou
em pares. São também distinguíveis pela utilização peculiar de fontes de carbono. Em
culturas velhas são raramente produzidos ascospóros no meio Ágar - Extrato de
Malte, não apresentando crescimento em ágar Czapek e ágar malte acético (PITT e
HOCKING, 1997).
9
São leveduras fortemente fermentadoras, que produzem proteases
extracelulares, beta-glucosidade, acetoína, erythritol, sorbitol e etanol. São
encontradas em bebidas, principalmente em sucos de laranja concentrados (PITT e
HOCKING, 1997).
b) Leveduras de fermentação lenta
• Candida parapsilosis
Possuem colônias brancas, superfície fosca e quando vistas ao microscópio
estereoscópico apresentam finos filamentos. Suas células em Ágar - Extrato de Malte,
possuem formato elipsóide, ocorrem isoladas, aos pares ou em cadeias. Apresentam
fraco crescimento em Ágar Czapeck e Ágar Malte Acético (PITT e HOCKING, 1997).
• Torulopis holmii
São leveduras de aparência similar à Saccharomyces cerevisae, mas diferem
pelo não crescimento em ágar Czapeck ou a 37ºC. Suas colônias são brancas no
meio Ágar - Extrato de Malte, circulares e de margens lisas. Suas células apresentam-
se pequenas e elipsóides, reproduzem-se por brotamento irregular e ocorrem
sozinhas ou aos pares. Dão origem a ascospóros em condições adversas
(HARRIGAN, 1998).
Trata-se de uma levedura resistente a conservantes, sendo capaz de se
desenvolver em 400mg/Kg de ácido benzóico ou ácido sórbico em pH igual a 4.0,
tendo grande capacidade fermentativa de uma gama larga de açúcares e já foi isolada
de refrigerantes australianos deteriorados (HARRIGAN, 1998).
• Brettanomyces bruxellensis
São leveduras que apresentam células elipsoides com um exclusivo botão
terminal e que produzem ácido acético a partir da glucose em condições de
anaerobiose. Possuem propriedades bioquímicas que as permitem dar sabores
alterados a bebidas como cervejas, vinhos e refrigerantes devido a suas enzimas
extracelulares como pectinesterases e proteases (PITT e HOCKING, 1997).
10
c) Leveduras não fermentadoras
• Rhodotorula mucilaginosa
Apresenta colônias com margens circulares sendo na maioria das vezes
elipsóides. Seu aspecto é mucóide, de coloração pink a vermelha e possuem a
capacidade de crescer em ágar malte acético ou MY50G. Possui habilidade de
crescer em ambientes refrigerados, sendo que suas espécies já foram isoladas de
bebidas, podendo causar deterioração (HARRIGAN, 1998).
d) Leveduras osmofílicas
• Zygosaccharomyces bailii
Antes pertencentes ao gênero Saccharomyces, possuem colônias brancas,
quase hemisféricas, de superfície brilhosa. Suas células são largas, elipsóides que se
reproduzem por brotamento, caracteristicamente na região subapical ou em um
ângulo agudo da célula em sua porção longitudinal, ocorrendo sozinhas, aos pares ou
em curtas cadeias (PITT e HOCKING, 1997).
Ascospóros refratáveis são formados em Ágar - Extrato de Malte (MEA) ou
ágar malte acético. Apresenta capacidade de crescimento em presença de ácidos
fracos utilizados como conservantes que são o ácido sórbico, benzóico, acético e
propiônico, como também em ambiente com SO
2
(PITT e HOCKING, 1997).
Algumas medidas para se evitar a sua contaminação em produtos como
refrigerantes são quando possível, deve ser feita sua fabricação sem o uso de fontes
de nitrogênio ou carbono, além da utilização de sacarose ao invés da glicose, pois a
Zygosaccharomyces bailii não fermenta este primeiro açúcar (PITT e HOCKING,
1997).
• Zygosaccharomyces rouxii
Trata-se de uma levedura pertencente ao grupo dos hemiascomycetos, cujo
gênero era tratado como Saccharomyces. Apresentam colônias brancas de superfície
brilhosa em Ágar - Extrato de Malte, não apresentando crescimento em Ágar Czapeck
e Ágar Malte Acético. Ocorrem aos pares ou em grupamentos pequenos,
apresentando ascospóros quando presentes em ambientes de baixa atividade de
água e alta concentração de açúcares (PRIBYLOVA et al., 2003).
11
• Schizosaccharomyces pombe
Apresentam colônias pequenas de bordos lisos, circulares, brancas e
brilhantes. Suas células apresentam-se quando maduras elipsóides e algumas vezes
aparecem cicatrizes. Freqüentemente formam ascospóros, crescem muito
pobremente em meio Czapeck, tendo melhor crescimento em ágar malte acético a
37ºC e Ágar - Extrato de Malte. São caracterizadas por reproduzirem-se
vegetativamente por fissão lateral e por formarem ascas com 4 ascospóros (PITT e
HOCKING, 1997).
Trata-se de uma levedura osmofílica, sendo resistente a maioria dos
preservantes de alimentos, como o ácido benzóico, mas é relativamente incomum sua
presença como deteriorante em alimentos (PITT e HOCKING, 1997).
e) Leveduras formadoras de película
• Hansenula anomala
Produzem colônias brilhantes de cor bege ou branca com aspecto rugoso em
meio sólido e em meio líquido, formam uma película seca e escura. As células são
esféricas ou ovais com presença de “botões” e freqüentemente formam
pseudomicélio. Possuem células pequenas, ovaladas a alongadas, geralmente
isoladas e formadoras de película delgada. Fermentam a glicose, galactose,
sacarose, maltose, rafinose e sintetizam acetaldeído (SCHMIDT, 1994).
• Pichia membranaefaciens
Leveduras de células com margens convexas, irregulares, de superfície
granular. Suas colônias são brancas e podem ser facilmente distinguidas pela
formação de pequenos ascospóros no ágar malte acético em 7 dias. Esporos em
número de quatro por asco são liberados rapidamente. Apresenta sensibilidade ao
calor e apresenta atividade enzimática através das enzimas pectin-metil-esterases e
outras proteases extracelulares (VANDERZANT e SPLITTSTOESSER, 1999).
Possui grande associação com a contaminação de sucos concentrados e
refrigerantes, formando filmes sobre estas bebidas, apresentando ainda resistência a
conservantes (PITT & HOCKING, 1997).
12
2.6. Ocorrência principais fungos em bebidas
A Portaria 451/97 do Ministério da Saúde - Secretaria de Vigilância Sanitária
estabelecia os limites de 20 unidades formadoras de colônias (UFC) de bolores e
leveduras por mL da amostra (BRASIL, 1997). Entretanto, a partir de 2 de Janeiro de
2001, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária adotou a Resolução nº12 que aboliu
a contagem de bolores e leveduras das análises deste alimento, deixando o controle
higiênico a cargo das indústrias (MORAIS et al., 2003).
Em um experimento realizado por MORAIS et al. foram analisadas 100
amostras de refrigerantes, coletadas aleatoriamente, em estabelecimentos comerciais
do interior e capital do Estado de Minas Gerais, pela Vigilância Sanitária (VISA/MG),
no período de março a novembro de 2000.
As leveduras mais encontradas foram Zygosacharomyces rouxii, Rhodotorula
mucilaginosa e Criptococus albidus. A presença de Zygosacharomyces rouxii dentre
as leveduras isoladas é pertinente pois ela é considerada uma levedura osmofílica e
está frequentemente associada à deterioração de alimentos processados (MORAIS et
al., 2003).
Foi relatado a ocorrência de deterioração microbiológica em produtos
carbonatados com adição de suco de laranja em julho de 2001 em uma fábrica de
refrigerantes situada na Itália. Devido à alta pressão interna das garrafas, ocorreu a
explosão de algumas destas embalagens plásticas nos pontos de venda
(NDAGIJIMANA et al., 2004).
A presença de micélio visível, substância estranha à constituição normal dos
refrigerantes, independente de ser passível de germinação ou multiplicação, já pode
se constituir uma razão para a rejeição destes produtos. A constatação dos fungos em
alimentos é indicativa de má qualidade da matéria-prima ou falhas higiênicas ao longo
do processamento. É importante salientar que alguns fungos filamentosos e
unicelulares, provenientes de alimentos, podem causar infecções oportunistas em
pacientes imunocomprometidos e reações alérgicas em indivíduos saudáveis
(MISLIVEC et al.; 1992).
2.7. Higienização na indústria de refrigerantes
A higienização divide-se em duas etapas definidas: a limpeza e a sanificação. No
que se refere à limpeza, o objetivo primordial é a remoção de resíduos orgânicos e
13
minerais aderidos às superfícies. A sanificação, objetiva eliminar microrganismos
patogênicos e reduzir o número de saprófitas ou alteradores a níveis considerados
seguros (ANDRADE e MACÊDO, 1996).
a) Agentes químicos utilizados na limpeza:
Entre as substâncias mais usadas como detergentes em indústrias de
refrigerantes está o Hidróxido de Sódio (NaOH) que provoca o deslocamento de
resíduos por saponificação. Em solução aquosa este agente está completamente
ionizado, gerando uma quantidade igual de íons hidróxido e moléculas de NaOH, por
isso 100% da alcalinidade liberada é ativa. As soluções de hidróxido de sódio são
aplicadas quando o procedimento de higienização é automático, onde não há contato
com os manipuladores.
São aplicadas principalmente na lavagem de garrafas de vidro onde suas
propriedades sanificantes são favoráveis ao processo de higienização (MAZZOLA et
al., 2003).
Outro agente detergente bastante utilizado é o ácido nítrico que previne o
acúmulo de depósitos minerais. Também, podem ser utilizados para a remoção
destes depósitos, oriundos de procedimentos de limpeza inadequados. Em termos de
ação química, os ácidos orgânicos fracos e inorgânicos reagem com os sais
insolúveis na água para torná-los solúveis, facilitando a remoção (ANDRADE e
MACÊDO, 1996).
Após a etapa da limpeza com agentes detergentes utiliza-se a etapa da
sanificação, com o objetivo de comercializar produtos em boas condições higiênico-
sanitárias. Na indústria de refrigerantes faz-se o uso de compostos químicos à base
de cloro e ácido peracético, além dos sanificantes físicos como o calor nas formas de
água quente, ar quente e vapor (ANDRADE e MACÊDO, 1996).
b) Mecanismos de ação de agentes sanificantes
O hipoclorito de sódio é amplamente utilizado em indústrias de bebidas na faixa
de 1 a 10%. Quando produtos clorados estão em solução aquosa, libera-se o ácido
hipocloroso, em sua forma não dissociada que apresenta ação germicida por meio da
inibição da via glicolítica dos microrganismos. O dióxido de cloro não se hidrolisa em
solução aquosa e a molécula inteira é considerada o agente ativo (ANDRADE e
MACÊDO, 1996).
14
O ácido peracético é largamente utilizado em indústrias de bebidas como
sanificante. É um produto constituído de uma mistura estabilizada de peróxido de
hidrogênio, ácido acético e um veículo estabilizante. É a grande capacidade de
oxidação dos componentes celulares que torna este ácido um excelente sanificante
(MARTINEZ, 2004).
A eliminação dos microrganismos pela ação do calor pode ser explicada pela
desnaturação protéica, inativação de enzimas, desorganização dos lipídeos celulares
e alteração do RNA e DNA (ANDRADE e MACÊDO, 1996).
15
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização e caracterização da área experimental
Esta pesquisa foi realizada na unidade fabril de uma Companhia Produtora de
Bebidas situada na região metropolitana de Curitiba (PR), que gentilmente cedeu
suas instalações e amostras da rotina do controle de qualidade, as quais foram
utilizadas para análise de dados, onde foram monitoradas pelo período de um ano 14
pontos de provável contaminação seu maquinário, matéria-prima e insumos utilizados
na fabricação de refrigerantes.
3.2 Amostragens
Os 14 pontos de contaminação amostrados foram designados por letras do
alfabeto, de A até Q, (Tabela 1). Foram realizadas amostragens mensais, durante um
ano, de agosto de 2004 até julho de 2005, e os meses designados por números, de 1
a 12. Os refrigerantes foram amostrados somente em quatro meses da pesquisa,
pois, sendo sua fabricação governada pela demanda os mesmos não são produzidos
mensalmente.
QUADRO 1. Esquema de amostragens realizadas na Companhia Produtora de
Bebidas
LOCAL DA FÁBRICA PONTO AMOSTRADO
•
DEPÓSITO DE AÇÚCAR
A. Áçúcar
•
XAROPARIA SIMPLES
B. Água de processo
C. Xarope simples
•
XAROPARIA COMPOSTA
D, E. Sucos concentrados
F. Xarope composto
•
CARBONATADOR
G. Gás carbônico
•
LAVADORA DE GARRAFAS
H. Água da lavadora
•
ESTEIRA DA SALA DE ENVASE
I. Garrafas lavadas
•
ENCHEDORA DE GARRAFAS
J. Bicos metálicos de enchimento
K. Ar ambiente
•
HDE (Jateador de água quente)
L. Saída metálica do HDE
•
ARROLHADOR
M. Peças do arrolhador
N. Rolha metálica
•
ENCAIXOTADORA
O,P,Q. Refrigerante engarrafado
16
TABELA 1 – Amostragens dos pontos de análise referentes à Companhia Produtora
de Bebidas
Código Especificação da Amostragem
A
Açúcar
B
Água de processo (água tratada, declorada)
C
Xarope simples (mistura de açúcar e água)
D*
Suco de laranja
E
Suco de limão
F
Xarope composto (mistura de xarope simples, concentrados, sais e suco de frutas)
G
Gás carbônico
H
Água da lavadora de garrafas
I
Garrafa de vidro lavada
J
Bico da enchedora de garrafas
K
Ar ambiente da sala de envase
L
Jateador de água para reduzir oxigênio no interior da garrafa (HDE)
M
Arrolhador de garrafas
N
Rolha metálica (tampa de alumínio da garrafa retornável de refrigerante)
O
Refrigerante sabor guaraná
P
Refrigerante sabor laranja
Q
Refrigerante sabor limão
*Obs Esta amostragem só ocorreu nos meses de produção de refrigerantes sabor laranja ou limão.
3.2.1) Amostragem em água e xaropes
A torneira de amostragem foi lavada com água e sabão e flambada, após
deixar escorrer o liquido por 5 segundos foram coletados 100 mLs da água ou xarope,
sempre próximo à chama em garrafa de coleta esterilizada. Esta foi mantida sob
refrigeração (+5ºC) até o momento da análise. (APHA, 1985) (Figura 2).
3.2.2) Amostragem em açúcar
O a superfície do saco plástico (500 Kg) contendo açúcar foi desinfetado com
álcool a 70%, com um calador de aço inóx esterilizado o saco foi perfurado e a
amostra de aproximadamente 50 g foi coletada. (SILVA, 1997).
17
FIGURA 2 - Amostragem de água da tubulação do tanque de xarope
simples
3.2.3) Amostragem dos sucos concentrados de laranja e limão
Aproximadamente 50 mL de suco foram coletados diretamente do tambor (500
L) com coletor de aço e próximo á chama do maçarico. (SILVA, 1997).
3.2.4) Amostragem do maquinário
Os equipamentos amostrados, ou seja, bicos metálicos da enchedora de
garrafas e do HDE; foram friccionados com um swab estéril, próximo à chama de um
maçarico e acondicionado no tubo de plástico protetor, até o momento da sua imersão
no diluente. (SILVA, 1997). (Figura 3).
FIGURA 3 - Amostragem com Swab dos equipamentos de envase
3.2.5) Amostragem em gás carbônico
A torneira de gás foi lavada e flambada. Desprezando-se o primeiro jato de
gás, este foi coletado em frasco coletor de vidro contendo solução salina a 0.85%
18
(estéril), pela imersão por 15 minutos da mangueira de silicone (estéril), acoplado ao
frasco. (SILVA, 1997).
3.2.6) Amostragem em garrafas de vidro lavadas
Foram coletadas 10 garrafas lavadas após a saída da lavadora de garrafas; o
bocal das garrafas foi fechado com papel alumínio e foram levadas as amostras para
análise (SILVA, 1997).
3.2.7) - Amostragem em rolhas metálicas
Foram coletadas 10 rolhas metálicas do interior da caixa metálica de
estocagem para o interior de saco plástico autoclavado; estas foram levadas
imediatamente para análise (SILVA, 1997).
3.2.8 - Amostragem de refrigerante acabado após envase
Foram coletadas 3 garrafas de refrigerante para cada sabor após a sua
lacração e codificação;
3.3 Quantificação das leveduras contaminantes
3.3.1 - Método placas de sedimentação
Para isolamento e contagem das leveduras contidas no ar utilizou-se o Método
placas de sedimentação. O ar da sala de envase foi amostrado distribuindo-se 20
placas de Petri contendo o meio ágar batata dextrose solidificado. Recomenda-se
analisar 0,3% do ar ambiente, assim o número de placas foi calculado pela fórmula:
Ambiente de 50 m² = 500.000 cm²
Placas com diâmetro de 10,0 cm = 0,007854 m
2
500.000 cm² x 0,003 (03%) = 1500 cm² de placas que é igual a 0,15 m²
0,15/0,007854 = 20 placas
Após 15 minutos de exposição as placas foram incubadas em estufa 27ºC por
72 horas. Após o período de incubação as colônias características de leveduras foram
quantificadas e realizada a média simples entre as 20 placas
19
3.3.2 - Técnica de filtração em membrana
Para água do processo, água da lavadora, gás carbônico, refrigerantes,
garrafas e rolhas metálicas o isolamento e quantificação das leveduras foi feito pela
metodologia de filtração em membrana de acetato de celulose (APHA,1985).
Para as amostras de água de processo, água da lavadora, foi realizada a
filtração de um volume de 100 mL.
Para as amostras de refrigerante nos sabores de guaraná e limão o volume
filtrado foi de 50mL, e para o de laranja ( que possui adição de polpa de fruta) foram
filtrados 5mL. (APHA, 1985)
As 10 garrafas coletadas e as 10 rolhas metálicas coletadas foram lavadas com
300mL de solução salina a 0,85%; destes 100 mL foram filtrados.
Filtração: O filtro de polissulfona esterilizado foi acoplado à base de
sustentação com sistema à vácuo; foi colocada a membrana de filtração (poros de
0,80 µm). A amostra foi filtrada com o cuidado de não deixar secar a membrana.
A membrana de celulose foi retirada e colocada sobre o meio de cultura as
colônias crescidas sobre a membrana foram enumeradas e realizadas a médias
simples entre as três placas por amostra (SILVA, 2001).
3.3.3 - Inoculação em ágar fundido (Pour-Plate)
Esta técnica foi utilizada para as amostras de açúcar, xaropes simples e
composto e suco de laranja e limão. 1mL da amostra, foi pipetado na placa de Petri,
20 mL do meio de cultura, fundido e resfriado a 45° C, foi adicionado, a mistura foi
homogeneizada por movimentos circulares
Para o açúcar Foram diluídos 25g da amostra para 225mL de solução salina a
0.85% (diluição 1:10);
As amostras do xarope simples e composto e dos sucos de laranja e limão
foram diluídas na proporção 1:10, através da homogeneização de 10mL da amostra
para 90mL de solução salina a 0.85% .
As colônias crescidas na superfície do ágar foram enumeradas e realizada a
média simples entre as 3 placas analisadas de cada amostra. Calculou-se o número
de unidades formadoras de colônias (UFC) por g ou mL da amostra, multiplicando-se
o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada
3.3.4 - Técnica de inoculação de swabs em caldo soro de laranja
20
Para os bicos metálicos da enchedora de garrafas e do HDE o isolamento e
contagem de leveduras foram efetuados mergulhando-se o swab que foi passado
pelas superfícies em meio de cultura.
Tubos de ensaio contendo 10 mL do meio de cultura Caldo soro de laranja
foram inoculados em triplicata. Nesta análise não foi efetuada a enumeração das
colônias e sim a determinação qualitativa através da turvação do meio indicando a
presença ou ausência de leveduras na amostra (ANDRADE e MACÊDO, 1996).
3.4 Identificação morfológica
3.4.1 - Avaliação das colônias
A morfologia colonial foi avaliada quanto ao: tamanho, forma, bordos, elevação,
superfície, consistência, cor, transparência e brilho.
3.4.2 - Microscopia em Campo Escuro
A partir das colônias isoladas foram preparadas lâminas com auxílio de uma
alça de Platina e como diluente solução salina a 0.85%. Visualizou-se as colônias em
microscópio óptico acoplado de um condensador cardióide e utilização da objetiva de
60 vezes (BRASIL, 1998).
Paralelamente à observação das colônias isoladas, foi realizada a comparação
da morfologia e bioquímica com cepas padrão adquiridas pelo laboratório Central da
empresa em estudo: Hansenula anomala: Cepa 70825; Kloeckera apiculata
Cepa
70285; Pichia membranaefaciens
Cepa 70367; Rhodotorula mucilaginosa
Cepa:70820; Zygosaccharomyces bailii Cepa 70492; Candida zeylanoides Cepa
70816; Saccharomyces cerevisae Cepa 70449T, todas fornecidas pelo .Instituto
André Tosello de Campinas - SP.
3.5 Identificação bioquímica
3.5.1 - Zimograma - Fermentação de fontes de carbono.
A capacidade de fermentação das leveduras isoladas e das cepas padrão foi
testada em tubo de ensaio contendo 10 mL de meio base, acrescido dos seguintes
açucares: Glucose, Galactose, Sacarose, Maltose, Lactose e Rafinose e um tubo de .
Durhan.
21
A partir de colônias, de cada uma das leveduras, recém isoladas em meio
Ágar-batata-dextrose, preparou-se uma suspensão equivalente à opacidade 2 da
Escala de McFarland.
Um volume de 100µL da suspensão das leveduras foi inoculado em 10 mL
meio de cultura, adicionado 1 mL de solução do indicador Púrpura de bromocresol e
incubadas a 27ºC por 120h (SCHMIDT, 1994);
Foi observada a turvação, viragem da coloração do indicador (acidificação do
meio), e formação de gás, sempre comparando-se o comportamento frente a um tubo
controle ( sem adição de açúcar ) (SCHMIDT, 1994).
Os resultados positivos e negativos foram comparada com às tabelas de
identificação de leveduras (ANEXO)
3.5.2 - Auxanograma, utilização de fontes de carbono
A utilização dos das fontes de carbono foi testada pelo Sistema API 20C AUX
da empresa BioMerieux. O kit API 20C AUX é composto de 20 cúpulas contendo meio
de cultura adicionado dos açucares: D glucose, Glicerol, Cálcio-2-ceto-gluconato, L-
Arabinose D-Xilose, Adonitol, Xilitol, D-Galactose, Inositol, D-Sorbitol, Metil-αD-
Glucopiranosido, N-Acetil-Glucosamina, D-Sacarose, D-Trealose, D-Melezitose, D-
Rafinose e um galeria testemunha sem fonte de carbono.
FIGURA 4. Kit API 20 Aux
As cúpulas foram inoculadas com 100µL de suspensão (equivalente à
opacidade 2 de McFarland) de leveduras obtidas de culturas jovens, e incubadas por
72 horas (+/-6horas) a 29ºC +/- 2ºC.
Observou-se o crescimento das leveduras e as cúpulas que apresentaram-se
mais turvas do que a testemunha indicaram reação positiva. A partir dos resultados
22
obtidos com as galerias foi realizada a comparação com o catálogo analítico
chegando-se às identificações (BERGAN, 1982).
3.6 Determinação das propriedades das leveduras
Paralelamente ao teste da fermentação de fontes de carbono, foi realizada a
análise das propriedades das leveduras (SCHMIDT, 1994) nos tubos contendo glicose
(substrato utilizado pela grande maioria dos gêneros de leveduras),
Foi observada a turvação, viragem da coloração do indicador (acidificação do
meio), formação de película e produção de gás.
A formação de película foi observada ao 5º dia de incubação, e o resultado foi
expresso como ausência ou presença de película sobrenadante. A produção de gás
carbônico foi observada através dos tubos de Durhan no 5º dia de incubação e
medida o tamanho da bolha de gás.
A velocidade de fermentação foi avaliada diariamente pelo diâmetro da bolha
de gás no tubo de Durhan. Para 100% de preenchimento com gás do tubo de Durhan
nos dois ou três primeiros dias de incubação, considerou-se levedura de fermentação
rápida. Preenchimento de 50 a 100% do tubo de Durhan em 5 dias de incubação foi
considerado levedura de fermentação média. Preenchimento de 1/3 do tubo de
Durhan em 5 dias de incubação coonsiderou-se levedura de fermentação lenta
(BACK, 2000).
3.6.1 - Determinação da osmotolerância
A osmotolerância, ou seja, a capacidade de tolerar as condições de alta
concentração de açúcares presente nas matérias-primas dos refrigerantes, assim
como no produto acabado, foi determinada em tubo de ensaio contendo 10 mL de
suco de limão ou laranja, xarope composto, xarope simples e o refrigerante produzido
no dia da coleta (SCHMIDT, 1994).
A partir das culturas das amostras recém isoladas em meio de cultura Ágar
batata dextrose, preparou-se uma suspensão com opacidade equivalente a 2 de
McFarland de cada uma das leveduras. Foram inoculados 100µL desta suspensão em
triplicata para os tubos de ensaio contendo as matérias-primas e refrigerantes, e estes
foram incubados a 27ºC por um período de 72h (SCHMIDT, 1994).
23
3.7 Efeito inibitório de produtos químicos usados na higienização
Foram testados os produtos: soda cáustica a 1%, hipoclorito de sódio a 8 ppm,
ácido nítrico a 1% e ácido per-acético a 0,5% comumente utilizados na higienização
das fábricas de refrigerantes (ANDRADE e MACÊDO, 1996).
A observação da inibição do crescimento das cepas identificadas na pesquisa
foi realizada com a técnica da difusão de soluções de produtos químicos em meio de
cultura sólido.
- As cepas de leveduras foram inoculadas em triplicata, com auxílio de uma
alça de Drigalski em placas de Petri contendo ágar batata solidificado.
- Com o uso de um cilindro de aço inox estéril de 0.5 cm de diâmetro, perfurou-
se o ágar obtendo-se um orifício onde foram depositados 0.1mL das soluções dos
produtos químicos testados
- As placas foram incubadas à 27ºC por um período de 72 horas. O halo de
inibição formado foi medido com auxílio de uma régua milimetricamente calibrada -
Marca MERCK (INCQS, 2001).
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Freqüência e quantificação da contaminação por leveduras
Das análises realizadas nos 14 pontos de amostragem, em 12 meses, (164 no
total), aproximadamente 30% das amostras (49') apresentaram-se contaminadas com
leveduras. A quantificação das leveduras foi realizada em cada ponto, conforme
dados da Tabela 2, assim como a análise de ausência ou presença destes
contaminantes nos maquinários de envase, (Tabela 3). A identificação dos pontos
contaminados foi feita, utilizando a seqüência de letras do alfabeto correspondendo
aos locais de amostragem e os números correspondendo ao mês em que foi
detectada a amostra contaminada.
Assim no açúcar, (A) foram registrados 5 episódios de contaminação: nos
meses de (outubro) 3, (novembro) 4, (janeiro) 6, (fevereiro) 7 e (abril) 9 resultando nos
códigos: A3, A4, A6, A7 e A9, O mesmo foi efetuado para os demais pontos de
amostragem
Através resultados obtidos (Figura 5), verificou-se que os pontos coletados que
apresentaram maior freqüência de contaminações durante o ano, foram o ar
ambiente, com 75% dos meses amostrados, os insumos e equipamentos da linha de
envase (Rolha metálica e arrolhador) com 50% de contaminação para os 12 meses
de amostragem.
O ar ambiente também deteve os maiores números na contagem de leveduras.
O ar atmosférico normalmente possui uma rica flora de microrganismos que
dispersam através das gotículas de água e grãos de poeira, sendo depositados na
superfície de equipamentos e materiais contidos no ambiente. A ausência de
mecanismos de filtração do ar nas dependências da fabrica acarreta a contaminação
deste e dos equipamentos dispostos no ambiente, como por exemplo o arrolhador
A presença de contaminação nas rolhas metálicas, pode ser explicado pois,
não passam por processo algum de desinfecção desde sua chegada na fabrica ou
durante seu armazenamento, e como tem contato direto com a bebida podem
provocar sua contaminação após o envase.
25
TABELA 2. Enumeração das contaminações por leveduras nas amostras coletadas do mês de agosto de 2004 a julho de 2005
Ponto de Coleta
UFC x a Diluição Encontrada
UFC/mL 1 Ago 2 Set 3 Out 4 Nov 5 Dez 6 Jan 7 Fev 8 Mar 9 Abr 10 Mai 11Jun 12 Jul
A. Açúcar ufc/g
<1,1 <1,1
5 x 10 4 x 10
<1,1
6 x 10 6 x 10
<1,1
3 x 10
<1,1 <1,1 <1,1
B. Água processo
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1
5 x 10
<1,1
7 x 10
<1,1
C. Xarope simples
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1
D. Suco de laranja - -
<1,1
- - -
<1,1
-
<1,1
- -
<1,1
E. Suco de limão -
<1,1
-
<1,1
- - -
<1,1
-
<1,1
- -
F. Xarope composto
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1
G. Gás carbônico
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1
H. Água da lavadora
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1
I. Garrafa vidro 3 x 10 2,5 x 10
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1 <1,1
3,2 x 10 5,5 x 10
<1,1 <1,1 <1,1
K. Ar ambiente ufc/m
2
/h 1,5 x 10
4
1,1x 10
4
1,9 x 10
3
7,6 x 10
3
<1,1
1,4 x 10
4
<1,1
1,7 x 10
5
<1,1
5,1 x 10
3
7,6 x 10
3
2,5 x 10
4
N. Rolha metálica 3,3 x 10
<1,1 <1,1 <1,1 <1,1
2,9 x 10 3,5 x 10
1
4,5 x 10 2,9 x 10
<1,1 <1,1
3,6 x 10
O Refrig. de guaraná 2,6 x 10 - - -
<1,1
1,6 x 10 - - - - 3,0 x 10 -
P. Refrig. de Laranja - - 2,5 x 10 - - - 4,3 x 10 - 3,5 x 10 - - 3,5 x 10
Q. Refrig. de Limão -
<1,1
- 3,3 x 10 - - - 2,5 x 10 - 3,9 x 10 - -
- : não amostrado neste mês
TABELA 3. Avaliação qualitativa das contaminações por leveduras nas amostragens de equipamentos da linha de envase
coletadas do mês de agosto de 2004 a julho de 2005
Ponto de coleta
Presença/ Ausência de Leveduras
Ago
Set
Out
Nov
Dez
Jan
Fev
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
J. Bico da Enchedora pres pres pres pres aus aus aus aus aus aus aus pres
L. HDE aus aus aus aus aus aus aus aus pres aus pres aus
M. Arrolhador pres aus aus aus pres pres pres aus pres aus pres aus
26
FIGURA 5. Freqüência em porcentagem (%) da ocorrência de leveduras nos pontos
amostrados
As garrafas de vidro retornáveis, mesmo após higienizadas, apresentaram-se
contaminadas (33% do período amostrado), revelando que a higienização, seja pelo
produto utilizado, temperatura do mesmo, ou tempo de contato da solução,
necessitam ser revistos.
Através destes dados sugere-se a necessidade da manutenção de um rigoroso
programa de limpeza e sanitização da linha de produção de bebidas, pois, as
leveduras podem se depositar continuamente nos equipamentos, e sua presença no
produto, só será detectada depois de período considerável de tempo, já no produto
acabado. (PITT & HOCKING, 1997).
A presença de leveduras contaminantes na matéria-prima não teve ocorrência
importante. No açúcar obteve-se em algumas amostragens números de UFCs , mas
apesar deste fato, não foi detectada a presença de leveduras no xarope simples
(etapa subsequente no processo do refrigerante), quer seja pela alta concentração de
açúcar ou pela elevada temperatura (90ºC) de preparação.
Nos xaropes compostos e sucos concentrados a presença de conservantes em
concentração elevada, inibe o crescimento microbiano, portanto não foi detectada
contaminação nestes pontos durante toda a pesquisa.
O refrigerante independente do sabor ou data de amostragem, apresentaram-
se sempre contaminados. Este fato está de acordo com os dados obtidos por Morais
et al. 2003, onde foram analisadas 100 amostras de refrigerantes PET 2 L, do Estado
de Minas Gerais e 13% das amostras foram condenadas como produtos em
75
50
50
42
42
33
17
17
0
0
0
0
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
%
1
Ar ambiente
2 Rolha metálica
3 Arrolhador
4 Açucar
5 Bico da enchedora
6 Garrafa
7 Água do produto
8 HDE
9 Água da lavadora
10 Gás carbônico
11 Suco de Laranja
12 Suco de limão
13 Xarope simples
14 Xarope composto
Pontos Amostrados
Porcentagem da Ocorrência das Leveduras
Leveduras
leveduras
27
condições higiênicas insatisfatórias apresentando contagens de bolores e leveduras
superiores à 20 UFC/mL.
Analisando os dados apresentados na figura 6, nota-se que o refrigerante
sabor laranja apresentou a maior predominância de contaminação por leveduras, o
que pode ser explicado por receber em sua composição suco concentrado, e polpa da
fruta o que o torna mais nutritivo e sujeito à contaminação. No refrigerante sabor limão
somente o suco clarificado (sem a polpa) é adicionado, e o refrigerante sabor guaraná
não contem suco de fruta na sua composição.
FIGURA 6 - Freqüência de contaminação nos 3 sabores de refrigerantes analisados
75 75
100
0
20
40
60
80
100
120
Limão Guaraná Laranja
Sabores dos Refrigerantes Analisados
Freqüêcia da Contaminação (%)
Limão
Guaraná
Laranja
Na água da lavadora, a temperatura em torno de 60° e seu teor de hidróxido de
sódio impedem a proliferação de microrganismos. E a ausência de contaminação no
gás carbônico, era esperada, pois não oferece condições de crescimento de
microrganismos.
28
4.2 Identificação das leveduras isoladas
a) Identificação morfológica
Os resultados obtidos com as 49 amostras contaminadas demonstraram 6
morfotipos (designadas pelos códigos: A2, I1, I2, K1, Q1 e O1). As colônias foram
analisadas quanto à sua cor, aspecto, tamanho, brilho e desenho de suas bordas e na
seqüência foram submetidas à análise de suas propriedades fisiológicas. (Tabela 4,
Figuras 7 e 8).
TABELA 4 – Aspectos fisiológicos e morfológicos das leveduras isoladas
Grupos
Película
Acidificação
Veloc. de
Fermentação
CO
2
no 5º
dia
Cor da
Colônia
Aspecto
da
Colônia
Pseudo -
micélio
Microscopia em
Campo Escuro
1
- + rápida 3cm branca
brilhante/
lisa
- células esféricas e
ovais, de 5-12
µ
m de
diâmetro, com vários
grânulos
2
+ + lenta 1cm branca
fosca/
granular
+ células cilíndricas,l
longas de 4 a 6
µ
m,
com poucos grânulos
3
+ + lenta 1cm bege
brilhante/
rugosa
+ células pequenas de 3
a 4
µ
m, ovaladas a
cilindricas com vários
grânulos
4
+ + rápida 2cm branca
brilhante/
lisa
- células médias de 5-8
µ
m de diâmetro,
elipsóides, com
brotamento sub-apical
5
- + rápida 2cm
marron
pálido
brilhante/
lisa
- células pequenas de
1,5- 3
µ
m de diâmetro,
elipsóides e apiculatas
com poucos grânulos
6
- - ausente ausente vermelha
brilhante/
lisa
- ovaladas,pequenas,1g,
brotamento apical
+: presença
- : ausência
A microscopia ótica das cepas revelou o tamanho aproximado, formato das
células, seu padrão de brotamento, presença de hifas, e confirmou a existência de 6
morfotipos dentre as 49 cepas isoladas.
Com base nestes dados, as 49 cepas isoladas resultaram nos seguintes
grupos, onde as leveduras estão designadas por códigos referentes ao seu
isolamento (Tabela 4).
29
FIGURA 7 - Macromorfologia das leveduras isoladas na pesquisa em meio Agar
Batata Dextrose após 72 horas de crescimento
(A): cepa I1, -Saccharomyces; (B): cepa K3 - Picchia; (C): cepa O6 -Hansenula; (D):
I2 - Zygosaccharomyces; (E): cepa A2 - Kloeckera; (F): cepa 17 - Rhodotorula.
FIGURA 8 - Micromorfologia das leveduras isoladas na pesquisa através da
microscopia óptica de campo escuro no aumento de 600 vezes
(A): cepa I1, -Saccharomyces; (B): cepa K3 - Picchia; (C): cepa O6 -Hansenula; (D): I2 -
Zygosaccharomyces; (E): cepa A2 - Kloeckera; (F): cepa 17 - Rhodotorula.
A
E
C
F
D
B
C
A
B
D
E
E
F
30
4.3 Identificação bioquímica das leveduras isoladas
As 49 cepas foram submetidas ao teste de crescimento em fontes de carbono
(Auxanograma) e fermentação de carboidratos (Zimograma). Os resultados obtidos
(Tabela 5) confirmaram a constituição dos 6 grupos de leveduras.
TABELA 5 Características bioquímicas das leveduras isoladas
ZIMOGRAMA AUXANOGRAMA
GRUPOS
D
-
Glucose
Galactose
Sacarose
Maltose
Lactose
Frutose
Rafinose
D
-
Glucose
Glicerol
2
-
ceto
-
Gluconato
Arabinose
D
-
Xilose
Adonitol
Xilitol
D-galactose
Inusitol
D- Sorbitol
Metil
-
piranosideo
N
-
acetil
-
Glicosamina
Celobiose
Lactose
Maltose
Sacarose
Trealose
Melezitose
Rafinose
Manose
1
+
+ +
+
- +
+
+
+
- - - - - + - + +
- - - +
+
+
+
+
-
2
+
+ +
+
- +
+
+
+
+
- - +
- + - + +
+
+
- +
+
+
- +
+
3
+
- +
+
- + -- +
+
- +
+
+
+
- - + +
+
+
- +
+
+
+
- +
4
- - - - - - +
+
+
- - +
- + - + - +
- - - - +
- - +
5
+
- - - - + - +
- +
+
- - - - - - - - +
- - - - - - -
6
- - - - - - - +
+
+
- - +
- + - + +
- +
- +
+
+
+
+
-
(Grupo 1):, -Saccharomyces; (Grupo 2): - Picchia; (Grupo 3): -Hansenula; (Grupo 4): I
Zygosaccharomyces; ou Candida(Grupo 4): - Kloeckera; (Grupo 5): - Rhodotorula.
TABELA 6 - Características bioquímicas das cepas padrão utilizadas na pesquisa
Cepas tipo
D
-
Galactose
Sacarose
Maltose
Lactose
Frutose
Rafinose
Hansenula anomala
1
+
+ +
+
- +
-
Kloeckera apiculata
2
+
- - - - +
-
Pichia membranaefaciens
3
+
+ +
+
- +
+
Rhodotorula mucilaginosa
4
- - - - - - -
Zygosaccharomyces bailii
5
+
- - - - +
-
Candida zeylanoides
6
- - - - - - -
Saccharomyces cerevisae
7
+
+ +
+
- +
+
1: Cepa 70825, 2: Cepa 70285 3: Cepa 70367 4: Cepa 70533 5: Cepa 70492
6: Cepa 70816 7: Cepa 70449T todas fornecidas pelo .Instituto André Tosello
31
Comparando-se os resultados obtidos com as tabelas de identificação
bioquímica (Anexo) e a descrição morfológica das principais leveduras deteriorantes
encontradas em bebidas (principais leveduras deteriorantes encontradas em bebidas,
paginas 13 à 17 da Revisão Bibliográfica) chegou-se à identificação ao nível de
gênero das leveduras encontradas na pesquisa. Para a identificação ser realizada até
o nível da espécie, uma nova pesquisa deveria ser executada com uma quantidade
maior de fontes de carbono, ou utilizando técnicas de biologia molecular.
Nos resultados obtidos com o uso do KIT API 20 C AUX (Auxanograma) e com
o Zimograma (Tabela 3), ocorreu uma divergência no resultado das 4 cepas do Grupo
4. Pelo KIT API 20 as cepas A3, A4, I2 e N2 foram identificadas como Candida sp,
mas o Zimograma e as características morfológicas, levaram a identificar estas
mesmas leveduras como Zygosaccharomyces sp.
Também nos testes de fermentação de carboidratos com as cepas padrão
observou-se que a cepa tipo do gênero Candida não apresentou nenhum resultado
positivo (Tabela 4), conflitando com os resultados positivos das cepas do Grupo 4 que
apresentaram igualmente capacidade fermentativa para os açúcares glicose e frutose.
Devido ao KIT API 20 C AUX ser limitado a 20 açúcares e ter como cepas
padrão, na sua grande maioria, leveduras relacionadas à área clínica, concluiu-se que
este kit não é apropriado para identificação de leveduras ligadas a contaminação de
alimentos, optou-se então, pela identificação dos grupos de leveduras, resultante do
zimograma. (Tabela 7)
TABELA 7 – Identificação das leveduras isoladas ao nível de gênero
GRUPOS
AUXANOGRAMA ZIMOGRAMA
1
Saccharomyces Saccharomyces
2
Pichia Pichia
3
Hansenula Hansenula
4
Candida Zygosaccharomyces
5
Kloeckera Kloeckera
6
Rhodotorula Rhodotorula
Assim as 49 cepas de leveduras isoladas nas matérias primas, insumos e
maquinários da fábrica de refrigerantes, distribuíram-se da seguinte forma entre os
gêneros identificados (Tabela 8), sendo o gênero Saccharomyces o mais
32
representativo entre os 6 identificados, e os gêneros Picchia e Kloeckera contendo
somente um exemplar :
TABELA 8. Distribuição das leveduras isoladas nos 6 grupos de identificação
GRUPO 1:
A4, B2, I1, I3, I4, J1, J4, K4, K5, K6, K7, K8, K9, L1, L2, M1,
M3, M4, M5, M6, N1, N3, N5, N6, O3, P3, P4, Q2, Q3,
Saccharomyces;
GRUPO 2
K1
Picchia;
GRUPO 3:
A1, A5, B1, J2, J3, K2, K3, N4, P1, P2, O1
Hansenula;
GRUPO 4
A3, I2, N2, O2
Zygosaccharomyces;
GRUPO 5
A2
Kloeckera;
GRUPO 6
J5, M2, Q1
Rhodotorula
4.4 Relação dos gêneros encontrados com os pontos amostrados
Após a identificação dos gêneros de leveduras isolados, foi realizada a correlação da
ocorrência destas leveduras nos pontos amostrados. (Tabela 9)
TABELA 9- Verificação da prevalência dos gêneros nos pontos de coleta
Gênero da
levedura
Ponto de Coleta
Saccharomyces
Garrafa vidro (2x); Rolha metálica (3x); Bico da
Enchedora (3x); Arrolhador (5x); HDE (2x); Ar ambiente
(7x); Água do processo; Açúcar; Garrafa de vidro (1x);
Refrig. de Laranja (1x); Refrig. de Limão (2x); Refrig. de
guaraná (1x) .
Pichia
Ar Ambiente (1x)
Hansenula
Ar Ambiente (2x);Bico da Enchedora (2x); Rolha
metálica (1x); Açúcar(2x); Água do processo; Refrig. de
Laranja (2x); Refrig. de guaraná (1x).
Zygosaccharomyces
Garrafa de vidro (1x); Açúcar (1x); Rolha metálica (1x);
Refrig. de guaraná (1x); Refrig. de Laranja (1x)
Kloeckera
Açúcar (1x)
Rhodotorula
Refrig. de Limão (1x); Bico da Enchedora (1x);
Arrolhador (1x).
33
(1x): Uma ocorrência da cepa da levedura no ponto de amostragem
(2x): Duas ocorrências da cepa da levedura no ponto de amostragem
(3x): Três ocorrências da cepa da levedura no ponto de amostragem
A partir da análise dos dados (Tabela 8 e 9), observou-se que o gênero
predominante no ar ambiente e, consequentemente nos maquinários de envase, foi a
levedura Saccharomyces frequentemente detectada no ar. Dados da literatura
confirmam que esta levedura tem grande ocorrência nos ambientes de produções de
alimentos e bebidas e torna-se um problema para indústrias de bebidas, pois
apresenta extrema capacidade fermentativa (PITT & HOCKING, 1997)
O gênero Zygosaccharomyces que teve ocorrência nos refrigerantes acabados
é bastante comum em indústrias de alimentos e bebidas, e estudos já revelaram que
possui capacidade de deteriorar refrigerantes armazenados em latas (PITT e
HOCKING, 1997). Sítios comuns de proliferação nas indústrias são além das
tubulações de enchimento, as válvulas de diafragma, medidores de pressão e porção
final de filtros esterilizantes. Também podem ocorrer em óleos lubrificantes e podem
infectar os produtos através de aerossóis formados pela movimentação das máquinas
(THOMAS e DAVENPORT, 2001).
Outro gênero com ocorrência no ar ambiente, maquinários de envase e
refrigerante foi a Hansenula, que no produto acabado pode causar deterioração
formando uma película delgada (SCHMIDT, 1991).
A ocorrência da levedura Rhodotorula que foi detectada no refrigerante de
limão já foi isolada de bebidas, e pode causar deterioração (HARRIGAN, 1998).
4.5 Verificação da osmotolerância das cepas isoladas
Com a intenção de confirmar os resultados obtidos, foram realizados testes de
osmotolerância das leveduras isoladas na pesquisa frente às matérias-primas e
produto acabado.
Analisando os resultados da Tabela 10, verificou-se que em 100% das
inoculações de leveduras no xarope simples, houve crescimento, fato já esperado
devido à sua composição muito rica em carboidratos e por não possuir conservantes
em sua formulação. Assim pode-se verificar que a alta temperatura a que esta
formulação é submetida (90° C) é o fator determinante da sua esterilização, e não a
sua osmolaridade.
34
Nas inoculações feitas nos xaropes compostos não houve crescimento de
leveduras, confirmando-se a inibição pela ação dos conservantes que contém
formulação.
TABELA 10. Osmotolerância das leveduras isoladas
LARANJA LIMÃO GUARANÁ
Grupo
Controle
Xarope
simples
Suco
Xarope
composto
Refrig.
Xarope
simples
Suco
Xarope
composto
Refrig
Xarope
simples
Xarope
composto
Refrig
1
aus pres pres aus pres pres aus aus pres pres aus pres
2
aus pres pres aus pres pres aus aus pres pres aus pres
3
aus pres pres aus pres pres aus aus pres pres aus pres
4
aus pres pres aus pres pres pres aus pres pres aus pres
5
aus pres pres aus pres pres aus aus pres pres aus aus
6
aus pres aus aus aus pres aus aus aus pres aus aus
(Grupo 1):, -Saccharomyces; (Grupo 2): - Picchia; (Grupo 3): -Hansenula; (Grupo 4):-
Zygosaccharomyces; ou Candida(Grupo 4): - Kloeckera; (Grupo 5): - Rhodotorula.
O suco de laranja possibilitou o crescimento de leveduras de todos os gêneros
identificados com exceção de Rhodotorula, devido ao seu rico conteúdo em
carboidratos (suco e polpa).
No suco de limão, o gênero Zygosaccharomyces, considerado osmotolerante
possuindo a capacidade de crescer em ambientes de altas concentrações de sais
e/ou açúcares, o que a transforma em um dos maiores problemas para as indústrias
de alimentos - sucos de frutas, concentrados e bebidas em geral sendo estes dois
últimos produtos comumente atingidos por esta espécie contaminante (PRIBYLOVA,
2003).
Estudos realizados com esta levedura demonstraram que esta resistência a
preservantes é devida a sua exposição a níveis baixos de conservantes assim como
em linhas de enchimento que sofreram assepsia imperfeita. Estes são fatores que
levam estas leveduras a criarem adaptação e capacidade de se desenvolver depois
em altas concentrações destes conservantes (HARRIGAN, 1998).
Para os produtos acabados, em todos os sabores houve crescimento das
leveduras isoladas com exceção do gênero Rhodotorula, fato que pode ser explicado
pela sua baixa capacidade fermentativa (PITT e HOCKING, 1997).
35
4.6 Atividade inibitória de produtos químicos de higienização
As 6 cepas representantes dos gêneros encontrados na amostragem foram
testadas frente aos produtos de desinfecção, (Tabela 11 )
TABELA 11 - Testes de Inibição dos Produtos Químicos
Ac. Per -
acético 0,3%
Ác. Nitrico
1%
Soda
Cáustica
1%
Hipoclorito
de Sódio 8
ppm
Levedura em Teste Diâmetro do halo de inibição (cm)
Hansenula anomala
1
1 0,5 2,5 3
Kloeckera apiculata
2
1,5 0,5 2 2,5
Pichia membranaefaciens
3
1 1 2,5 2,5
Rhodotorula mucilaginosa
4
1,5 1 2,5 2
Zygosaccharomyces bailii
5
1 0,2 2 2
Saccharomyces cerevisae
7
1,5 0,5 3,5 3,5
1: Cepa 70825, 2: Cepa 70285 3: Cepa 70367 4: Cepa 70533 5: Cepa 70492
6: Cepa 70816 7: Cepa 70449T todas fornecidas pelo Instituto André Tosello
FIGURA 9. Inibição do crescimento das leveduras pela ação dos desinfetantes
(a)- formação de halo de inibição da cepa Rhodotorula mucilaginosa
4
frente ao hipoclorito de
sódio a 8PPM, (b)- pequena formação de halo de inibição da cepa de Zygosaccharomyces bailii
5
frente ao ácido nítrico a 1%.
O teste de inibição de crescimento das leveduras, frente aos produtos
utilização na desinfecção de fábricas de bebidas, revelou que os produtos de
basicidade elevada revelou maior ação inibitória em comparação aos produtos de
acidez elevada. Relata-se que muitas espécies de leveduras crescem em condições
bastante estritas como ambientes de anaerobiose, além de ambientes líquidos de
acidez elevada (PITT & HOCKING, 1997).
a b
36
5. CONCLUSÕES
1. Os pontos de amostragem que apresentaram maior contaminação foram o ar
ambiente, rolha metálica garrafa de vidro e maquinários de envase
2. Foram identificados na pesquisa 6 gêneros de leveduras: Saccharomyces,
Pichia, Hansenula, Zygosaccharomyces, Kloeckera, Rhodotorula
3. Os gêneros de leveduras encontrados em maior quantidade e freqüência nas
análises realizadas foram Saccharomyces e Hansenula, que estiveram presentes
repetidamente no ar ambiente, equipamentos de envase e produto acabado.
4. Os produtos químicos de basicidade elevada foram os mais eficientes no teste de
eficiência na inibição de leveduras in vitro.
Sugestões finais
Os dados levantados na pesquisa possuem importância para indústrias
produtoras de refrigerantes, que podem minimizar suas contaminações por leveduras
através do monitoramento freqüente dos pontos críticos de contaminação do produto
acabado, que são o ar ambiente, maquinários e equipamentos de envase. Uma fonte
importante de contaminação, que não passa por processo de desinfecção, são as
rolhas metálicas, assim sugere-se sua devida desinfeção.
Além da monitorização, devem ser realizados procedimentos de higienização
com produtos químicos de basicidade elevada, que possuem maior ação inibitória
frente às leveduras deteriorantes.
37
6. Referências Bibliográficas
ANDRADE,N.J.; MACÊDO, J.A.B. Higienização na indústria de alimentos. São
Paulo: Livraria Varela LTDA, 1996, p.29, 30, 55, 95.
APHA -. Standard methods for the examination of water and wastewater. 16 ed.
American Public Health Association Ed. Washington, D.C. 1985. p1224-1227.
ABIR - Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de Bebidas Não
Alcoólicas. Condições de higiene das embalagens de bebidas. Disponível em:
http://www.abir.org.br/article.php3/id_article=107
Acesso em 28 nov.2005
BACK, W. Farbatlas und Handbuch der Getränkebiologie. Teil II. Nürnberg:
Fachverlag Hans Carl, 2000, p.25, 44.
BARNETT, J. A.; ,R.W. and YARROW, D. Yeasts: characteristics and
identification. Cambridge: Cambridge University Press, p.441, 445, 449, 453, 455,
457, 459, 461, 463, 1983a.
BARNETT,J.A.; PANKHURST, R.J. A key for identifying yeasts based on
physiological tests. Amsterdam: Holland Publishing Company,1974. 273p.
BERGAN,T. ;HOLLUM, A.B. ;VANGDAL,M. Evaluation of Four Commercial
Biochemical Test Systems for Identification of Yeasts. Lyon: Nouvelle, p.217-222,
1982.
BRASIL .Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Portaria n.º 451, de 19 de
setembro de 1997.Diário Oficial da União, Brasília. nº182-Seção 1, , de 22 de
setembro de 1997, p.21005-21012.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 12, de 2 de
janeiro de 2001-Diário Oficial da União, Brasília. Seção 1,p. 45-53, de 10 de janeiro
de 2001.
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento.Portaria nº 544 de novembro
de 1998. Diário Oficial da União, Brasília. nº-Seção1, de 17 de novembro de 1998,
p.11003-11009.
DUFFUS, J. H; CAMPBELL, I.;. Yeast a practical approach. 1
nd
Ed. Oxford: Oxford
University Press, 1988, p. 1-6.
38
DOYLE, M.; BEUCHART, L.; MOTEVILLE, T.J. Food Microbiology, Fundamentals
and frontiers. 2
nd
Ed. Washington: ASM Press, 2001, p.36-38.
EVANGELISTA , J. Tecnologia de Alimentos. 2ª ed.São Paulo: Livraria Atheneu
Editora, 1989,p.189-192.
HARRIGAN, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology.3.ed. San Diego :
Academic Press, p.351-359,1998.
INCQS -Instituto Nacional de Controle de Qualidade e Saúde. Manual da qualidade:
método para avaliação das atividades bacteriostática e fungistática de saneantes e
substâncias preservativas. Rio de Janeiro, 2001. p. 9 (Método 65.3210.006).
JAY, J. M. Modern Food Microbiology. 6
th
Ed. New York: Van Nostrand Rheinhold,
2000, p. 168-171.
KONEMAN, E.; ALLEN, S.D. ;JANDA, W.M; SCHRECKENBERGER, P.C.; WINN,
W.C. Diagnóstico Microbiológico. Buenos Aires: Panamericana, 1999, p:955-958.
KREGER-VAN RIJ, N.J.W. The Yeasts: a taxonomic study. Amsterdam. Elsevier,
1980, 1028p.
MARTINEZ, R. Sanitizantes, Bioseguridad y Vida de Anaquel. Ver. Quimica Rosmar,
2004, p. 1-4,
MAZZOLA, P.,G.;MARTINS.A.M.S; PENNA,T.C.V. Determination of decimal reduction
time (D-Value) of chemical agents used in hospital: Brazilian Journal of
Microbiology. 34:33-34, 2003.
MISLIVEC. P.B.; BEUCHAT, L.R.; COUSIN, M.A. Yeasts and Molds. In:
VANDERZANT, C.; SPLITTSTOESSER, D.F. editor. Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods. 3.ed. Washington: APHA; ,1992,
p.239,243.
MORAIS,V.A. D.; MADEIRA, J.E.G.C; DIAS, E.C.; BONCOMPAGNI, A.C.;
GONÇALVES, R.C.P.; CARVALHO, E. Avaliação microbiológica de amostras de
refrigerantes comercializados no Estado de Minas Gerais. Revista do Instituto
Adolfo Lutz, 62(1): 1-4,2003.
NDAGIJIMANA,M.; BELLETTI,N.; LANCIOTTI, M.E.; GARDINI, F. Effect of Aroma
Compounds on the Microbial Stabilization of Orange-based Soft Drinks. Journal of
Food Science, 69: 20-24, 2004.
ODEBRECHT, E. Microbiologia cervejeira: desenvolvimento de meios de cultura
para quantificação de bactérias microaerofílicas deteriorantes obrigatórias, São
Paulo: USP, 2001. 190p. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) – Universidade
de São Paulo, 2001.
PITT, J.I.; HOCKING, A D. Fungi and Food Spoilage. 2.ed.Maryland: Aspen
Publishers Inc., 1999, p.29-52.
39
PRIBYLOVA, L.; DE MONTIGNY,J.; POTIER ,S.; SYCHROVÁ, H. Physiological
Properties of the Osmotolerant Yeast Zygosaccharomyces rouxii. Microbiol Methods,
55:481-4842, 2003.
SAMSON, R.A; HOCKING, A. D.; PITT, J.I.; KING, A. D. Moderns Methods in Food
Mycology. J. Food Mycol., Amsterdan: Elsevier, 1992, p.388.
SCHMIDT, H. J. Moderne Mikrobiologie in Erfrischugsgetränkebetrieben und
Brauerein. Brauwelt, v. 4, 1994, p. 116 – 119.
SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A, SILVEIRA, N.F.A. Manual de métodos de análise
microbiológica de alimentos. São Paulo:Varela,1997, p. 22-27.
TANIWALKI, M.H.; IAMANAKA, B.T.; BANHE, A .A comparision of culture media to
recorver fungi from flour and tropical fruit, pulp.J. Food Mycol.2, 1999, p.291-302.
THOMAS, D.S.; DAVENPORT ,R.R. Zygosaccharomyces bailii- A Profile of
Caracteristics and Spoilage Activies. Food Microbiol.2:,2001, p.157-169.
TRABULSI, L.R. ALTERTHUM, F., CANDEIAS, J.A.N.; GOMPERTZ, O. F..
Microbiologia. 3ª ed . São Paulo: Atheneu, 2000, p. 59-61.
USFDA -AOACI - United States Food And Drug Administration & Association Of
Official Analytical Chemists International - Bacteriological Analytical Manual. 8
th
ed.
Gaithersburg: AOAC International , 1998, p. 129-137.
VANDERZANT, C., SPLITTSTOESSER, D. F. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 4
th
Ed. Washington: American Public Health
Association,1999
ANEXO
ZIMOGRAMA AUXANOGRAMA
D
-
Glucose
Galactose
Sacarose
Maltose
Lactose
Rafinose
D-Glucose
Galactose
Sacarose
Maltose
Celobiose
Trealose
Lactose
Rafinose
Melezitose
D-Xilose
Arabinose
Glicerol
Inusitol
2
-
ceto
-
Gluconato
Brettanomices bruxellensis
+
-
+
+
- - + - +
+ - +
- v +
- - v - v
Candida parapsilosis
+
v - - - - + +
+
+ - +
- - +
+ - +
- v
Hansenula anomala
+
v +
v - +
+ v +
+ +
+
- +
+
v v +
- v
Kloeckera apiculata
+
- - - - - + - - - +
- - - - - - - - +
Pichia membranaefaciens
v - - - - v + - - - - - - - - v - v v v
Rhodotorula mucilaginosa
- - - - - - + v +
+ v +
- +
+
+ v v v -
Zygosaccharomyces bailii
+
- v - - v + v v v - v - v - v - v - v
Saccharomyces cerevisae
+
- +
v - +
+ v +
v - v - +
v - v v - v
Zygosaccharomyces rouxii
+
- v v - - + - v + - v - - - - - v - v
Schizosaccharomyces pombe
+
- +
+
- +
+ - +
+ - - - +
- - - v - v
Torulopsis holmii
+
+
+
- - v + +
+
- - +
- +
- - - v - v
+ positivo; - negativo; v = variável
Tabela adaptada do original BARNETT e PANKAHURST, 1974, para leveduras
contaminantes de refrigerantes.
ZIMOGRAMA AUXANOGRAMA
Leveduras encontradas em
bebidas.
D Galactose
Glucose
Lactose
Maltose
Rafinose
Sacarose
Arabinose
Celobiose
Galactose
Inusitol
Lactose
Maltose
Melezitose
Rafinose
Sacarose
Sorbitol
Trealose
D
-
Xilose
D-Glucose
Brettanomices bruxellensis
v
+
+
+ v +
- +
+
- +
+
+
v +
- +
- -
Brettanomices naardenensis
-
+
- - - - - +
+
- - v - - - - +
+
-
C. boidinii
+
- - - - - - - v
- - - - - - - - +
-
C. famata
-
v - - v v v +
+
- v +
+
+
+
v +
+
+
C. intermedia
+
+
- v v +
- +
+
- +
+
+
+
+
+
+
+
-
C. latiscondens
-
+
- - +
+
- - -
- - - - +
+
- - - +
C. parapsilosis
+
+
- - - - - - +
- - +
v - +
v +
+
+
Cryptococcus albidus
-
- - - - - v +
v
+
v +
+
+
+
v +
+
-
Pichia anomala
v
+
- v v +
- +
v
- - +
v v +
- +
v +
P. minuta
+
+
- - - - - +
-
- - - - - - - +
+
-
P. membranaefaciens
-
- - - - - - - -
- - - - - - v - v v
Rhodotorula glutinis
-
- - - - - +
+
+
v - +
+
+
+
v +
+
v
Saccharomyces cerevisae
v
+
- v v v - - -
v v v v v v - v - v
S. cerevisae uvarum
+
+
- + +
+
- - -
+
v +
+
+
+
- v - v
S. kluyveri
+
+
- - +
+
- - v
+
- +
+
+
+
v +
- -
Torulaspora delbrueckii
v
+
- v v v - - -
v v v v v v v +
- v
T. delbrueckii rosei
-
+
- - +
+
- - -
- - v - +
+
- +
- v
Zygosaccharomyces bailii
-
+
- - v v - - v
- - - - v v - v - +
Z. florentinus
v
+
- v +
+
- - v
- - v v +
+
+
+
- v
Z. microellipsoides
+
+
- - +
+
- - +
- - - - +
+
v - - +
Z. rouxii
-
+ - v - - - - v
+
+
v - - v v v v +
+ positivo; - negativo; v = variável
Tabela adaptada do original BACK, 2000 (Tabela 59.1)
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