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CONDIÇÕES MICROBIOLÓGICAS E AVALIAÇÃO DA
PASTEURIZAÇÃO EM AMOSTRAS DE LEITE
COMERCIALIZADAS NO MUNICÍPIO DE PIRACICABA-SP
R
ICARDO PINHEIRO DE SOUZA OLIVEIRA
Dissertação apresentada à Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de
São Paulo, para obtenção do título de Mestre em
Ciências, Área de Concentração: Ciência e
Tecnologia de Alimentos.
P I R A C I C A B A
Estado de São Paulo – Brasil
Maio-2005
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CONDIÇÕES MICROBIOLÓGICAS E AVALIAÇÃO DA
PASTEURIZAÇÃO EM AMOSTRAS DE LEITE
COMERCIALIZADAS NO MUNICÍPIO DE PIRACICABA-SP
RICARDO PINHEIRO DE SOUZA OLIVEIRA
Engenheiro Agrônomo
Orientador: Prof. Dr. CLÁUDIO ROSA GALLO
Dissertação apresentada à Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências,
Área de Concentração: Ciência e Tecnologia de
Alimentos.
P I R A C I C A B A
Estado de São Paulo - Brasil
Maio-2005
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Oliveira, Ricardo Pinheiro de Souza
Condições microbiológicas e avaliação da pasteurização em amostras de leite
comercializadas no município de Piracicaba / Ricardo Pinheiro de Souza Oliveira. - -
Piracicaba, 2005.
81 p. : il.
Dissertação (mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2005.
Bibliografia.
1. Análise de alimento 2. Bactéria 3. Contaminação de alimento 4. Higiene de
alimento 5. Indústria de alimento 6. Leite – Qualidade 7. Microbiologia de alimento
8. Pasteurização I. Título
CDD 637.1277
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
DEDICATÓRIA
À minha família (Carlos, Zenilda e Dudu) pelo
incentivo
compreensão,
amor
e por serem a maior razão da minha felicidade e existência.
D
EDICO
`A Priscilla de Barros Rossetto, pela
paciência,
inspiração,
carinho
e amor.
O
FEREÇO
“Os pescadores sabem que o mar é perigoso e a tormenta, terrível. Mas
este conhecimento não os impede de lançar-se ao mar”
Van Gogh
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Cláudio Rosa Gallo, pela oportunidade, ensinamentos, orientação, amizade e
confiança na realização deste trabalho e pelo enorme exemplo profissional;
Ao Prof. Dr. Ernani Porto pelo apoio, incentivo e sugestões, além da grande amizade;
Às técnicas Cecília Nogueira, Denise Baptista e Rosalina Ocangne, pela ajuda na
realização deste trabalho e pela confiança que sempre depositaram em mim;
Ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos da ESALQ/USP pela contribuição com os
materiais utilizados;
À Prof
a
Dr
a
Marília Oetterer, pelo incentivo e confiança na minha capacidade em realizar o
mestrado;
À Prof
a
Dr
a
Gilma Lucazechi Sturion, pela grande contribuição nas correções do meu
trabalho;
À Dr
a
Maria Fernanda (ITAL) pela grande ajuda e sugestões no trabalho;
Às bibliotecárias, Bia e Midiam pelo constante apoio e preocupação com o meu trabalho;
À Lia pela atenção e auxílio nas traduções;
Às secretárias Gislaine, Márcia e Regina pela amizade e atenção;
Aos amigos e companheiros do curso de Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos;
v
Ao Eduardo Moita e família pela fiel amizade, respeito, carinho e incentivo;
À tia Célia e o “zio” Vittorio pelo carinho, incentivo e preocupação, apesar da distância;
À minha família paulistana e baiana pelo apoio, carinho e compreensão.
MUITO OBRIGADO!
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS............................................................................................. ix
LISTA DE TABELAS............................................................................................. xi
RESUMO ................................................................................................................ xii
SUMMARY............................................................................................................. xiv
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1
1.1 Objetivos .............................................................................................................. 2
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 3
2.1 A importância e a qualidade do leite.................................................................... 3
2.2 Etapas críticas para a contaminação do leite........................................................ 4
2.3 Contaminantes comuns do leite ........................................................................... 4
2.3.1 Bactérias aeróbias mesófilas ............................................................................. 5
2.3.2 Bactérias aeróbias termófilas e psicrotróficas................................................... 6
2.3.3 O grupo coliforme............................................................................................. 7
2.3.3.1 Coliformes totais............................................................................................. 7
2.3.3.2 Coliformes fecais............................................................................................ 8
2.3.3.3 Escherichia coli.............................................................................................. 9
2.3.4 Staphylococcus coagulase positiva ................................................................... 9
2.3.5 Salmonella......................................................................................................... 13
2.4 Inovação nos métodos de análise microbiológica................................................ 15
2.4.1 O sistema SimPlate
®
para coliformes totais e E. col ........................................ 15
2.4.2 Kits rápidos para detecção de Salmonella......................................................... 16
2.4.2.1 O kit 1-2 Test da BioControl.……………………………………………… 16
2.4.2.2 O kit Salmonella Rapid Test da Oxoid…………………………………….. 17
vii
2.5 Tratamentos térmicos utilizados no leite.............................................................. 17
2.5.1 Pasteurização e sua importância........................................................................ 17
2.5.2 Pontos críticos de controle no leite pasteurizado .............................................. 19
2.6 Classificação do leite ........................................................................................... 21
Leite Tipo A............................................................................................................... 21
Leite Tipo B ............................................................................................................... 21
Leite tipo C................................................................................................................. 22
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 23
3.1 Amostragem......................................................................................................... 23
3.2 Metodologia ......................................................................................................... 23
3.3 Preparo das amostras............................................................................................ 24
3.4 Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos, termófilos e
psicrotróficos.............................................................................................................. 25
3.5 Número Mais Provável de coliformes totais e fecais........................................... 26
3.6 Numero Mais Provável de coliformes totais e E. coli pelo sistema SimPlate
®
... 28
3.7 Análise estatística................................................................................................. 29
3.8 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva ................................................ 29
3.9 Análise de Salmonella.......................................................................................... 32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 33
4.1 Padrões microbiológicos...................................................................................... 33
4.2 Contagem total de aeróbios mesófilos, termófilos e psicrotróficos..................... 34
4.2.1 Aeróbios mesófilos ........................................................................................... 36
4.2.2 Aeróbios psicrotróficos..................................................................................... 39
4.2.3 Aeróbios termófilos........................................................................................... 40
4.3 NMP de coliformes totais .................................................................................... 41
4.3.1 Análise de coliformes totais por tubos múltiplos.............................................. 44
4.3.2 Análise de coliformes totais pelo método SimPlate
®
........................................ 44
4.4 Número Mais Provável (NMP) de coliformes fecais........................................... 46
4.4.1 Análise de coliformes fecais por tubos múltiplos ............................................. 48
4.4.2 Análise de E. coli pelo método SimPlate
®
........................................................ 49
viii
4.5 Comparação entre os métodos tubos múltiplos e SimPlate
®
............................... 52
4.6 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva ................................................ 54
4.7 Detecção de Salmonella....................................................................................... 57
4.8 Condições microbiológicas gerais das amostras de leite pasteurizado analisadas 58
4.9 Eficácia da pasteurização ..................................................................................... 65
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 71
LISTA DE FIGURAS
Página
1 Fluxograma de beneficiamento do leite pasteurizado, evidenciando os
pontos críticos de controle parcialmente eficaz (PCC2) e o totalmente eficaz
(PCC1). Observam-se pontos importantes de contaminação (■), pontos de
contaminação pouco importantes (▲), pontos de possível multiplicação de
microrganismos (+) e pontos de destruição térmica (x)
.........................................................................................................................
20
2 Pasteurização no laboratório em banho-maria a 62,8ºC/30’............................ 24
3 Preparo de diluições em série ......................................................................... 25
4 Procedimento para o plaqueamento e a contagem total de mesófilos,
termófilos e psicrotróficos ............................................................................ 26
5 Procedimento para a estimativa do NMP de coliformes totais e fecais ........ 27
6 Teste confirmativo para coliformes totais em CVBLB a 35ºC e
confirmativo para coliformes fecais a 45ºC em caldo EC ............................ 28
7 Placas de SimPlate® mostrando teste positivo para coliformes totais (cor
púrpura) e E. coli (azul fluorescente) ............................................................
29
8 Preparo para a contagem e o isolamento de Staphylococcus coagulase
positiva .......................................................................................................... 30
9 Colônias típicas de Staphylococcus coagulase positiva em meio BPA
.........................................................................................................................
31
10 Procedimento para a análise de Salmonella usando o kit 1-2 test da
Biocontrol ..................................................................................................... 32
x
11
Médias das contagens de mesófilos, termófilos e psicrotróficos, antes e após
a pasteurização (past) em laboratório
......................................................................
36
12 Médias do NMP de coliformes totais encontradas para as amostras de leite
pasteurizado tipos A, B, C e leite cru analisadas antes da pasteurização no
laboratório e após a mesma ............................................................................
43
13 Médias do NMP de coliformes fecais (45ºC) obtidas pela técnica dos tubos
múltiplos e de E. coli pelo método SimPlate
®
, encontradas para as amostras
de leite tipos A, B, C e leite cru analisadas antes da pasteurização no
laboratório e após a mesma .............................................................................
48
14
Dispersão dos resultados das contagens (NMP) de coliformes totais em leite
tipos A, B, C e cru obtidos pelos métodos NMP (tubos múltiplos) e
SimPlate
®
....................................................................................................... 53
15
Dispersão dos resultados das contagens (NMP) de coliformes fecais/E. coli
em leite tipos A, B, C e cru obtidos pelos métodos NMP (tubos múltiplos) e
SimPlate
®
........................................................................................................ 54
16
Porcentagens de amostras de leite pasteurizado tipo A acima e dentro dos
limites microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002) ........................................ 60
17
Porcentagens de amostras de leite pasteurizado tipo B acima e dentro dos
limites microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002) ........................................ 61
18
Porcentagens de amostras de leite pasteurizado tipo C acima e dentro dos
limites microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002) .........................................
62
19
Porcentagens de amostras de leite tipo pasteurizado acima e dentro dos
limites microbiológicos da ANVISA (Brasil, 2001) ......................................
63
20
Médias das reduções logarítmicas conseguidas pela pasteurização realizada
no laboratório para as amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C e leite
cru .................................................................................................................. 67
LISTA DE TABELAS
Página
1 Padrões microbiológicos para o leite tipo A, B e demais tipos.......................... 34
2 Padrões microbiológicos para o leite tipo A, B e C............................................ 34
3 Padrões microbiológicos para leite pasteurizado (todos os tipos)....................... 34
4. Contagens totais de aeróbios mesófilos, termófilos e psicrotróficos pelo
método convencional (PCA) em amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C e
leite cru, obtidas no comércio de Piracicaba, antes e após a pasteurização em
laboratório............................................................................................................ 35
5 Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais pelo método convencional
(tubos múltiplos) e Simplate®, obtido em amostras de diferentes tipos de leite
coletados no comércio de Piracicaba antes e após pasteurização em
laboratório........................................................................................................... 42
6 Número Mais Provável (NMP) de coliformes à 45ºC pelo método
convencional (tubos múltiplos) e E. coli pelo Simplate® encontrado em
amostras de leite obtidas no comércio de Piracicaba antes e após
pasteurização em laboratório.............................................................................. 47
7 Resumo das comparações estatísticas entre os métodos NMP (tubos
múltiplos) e SimPlate® para contagem de coliformes totais e fecais/E. coli
nas amostras de leite tipos A, B, C e cru........................................................... 53
8 Contagens de Staphylococcus coagulase positiva obtidas em amostras de leite
adquiridas no comércio local de Piracicaba antes e após pasteurização em
laboratório...........................................................................................................
55
9 Amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C em desacordo com os padrões
microbiológicos estabelecidos pelo DIPOA (Brasil, 2002)............................... 58
10 Eficácia da pasteurização (log) realizada no laboratório, das amostras de leite
tipos A, B, C e cru obtidas no comércio de Piracicaba...................................... 66
CONDIÇÕES MICROBIOLÓGICAS E AVALIAÇÃO DA
PASTEURIZAÇÃO EM AMOSTRAS DE LEITE
COMERCIALIZADAS NO MUNICÍPIO DE PIRACICABA-SP
Autor: RICARDO PINHEIRO DE SOUZA OLIVEIRA
Orientador: Prof. Dr. CLÁUDIO ROSA GALLO
RESUMO
O leite é um dos alimentos mais completos da natureza e sua importância é
baseada em seu elevado valor nutritivo, como riqueza de proteínas, vitaminas, gordura,
sais minerais e a alta digestibilidade. Esses fatores são relevantes para considerá-lo um
excelente meio de cultura para a maioria dos microrganismos. A pasteurização é
necessária e tem a finalidade de eliminar os microrganismos patogênicos, além de
diminuir ao máximo o número de microrganismos em geral, mas alguns deles ainda
podem sobreviver ao tratamento térmico aplicado. O objetivo do presente trabalho foi
avaliar a condição microbiológica e a eficácia da pasteurização industrial do leite tipos
A, B, C e as condições microbiológicas do leite cru, através da enumeração de bactérias
aeróbias mesófilas, termófilas e psicrotróficas, Staphylococcus coagulase positiva,
determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e fecais e pesquisa
de Salmonella spp. em 30 amostras de leite comercializado no município de Piracicaba-
SP. Com base na legislação do DIPOA (Brasil, 2002) os resultados mostraram que
44,4% das amostras de leite tipo A apresentaram-se fora do padrão microbiológico para
aeróbios mesófilos. Para coliformes totais e fecais, o mesmo leite apresentou 66,7% e
xiii
55,6% das amostras respectivamente, em desacordo com a legislação vigente. No leite
tipo B, nenhuma amostra esteve fora do padrão microbiológico em relação a aeróbios
mesófilos. Já para coliformes totais e fecais, 33,3% das amostras estiveram em
desacordo com a legislação em vigor. O leite tipo C foi o que apresentou resultado mais
satisfatório, pois ao contrário do que se esperava, nenhuma amostra esteve fora do
padrão em relação às análises microbiológicas realizadas no presente trabalho. O leite
cru analisado apresentou valores elevados para todas as análises microbiológicas
realizadas. Não foram encontradas amostras contaminadas com Salmonella spp. em
todas as amostras de leite analisadas. O maior valor encontrado para Staphylococcus
coagulase positiva foi 1,1 x 10
2
UFC/mL, portanto, longe da dose infectiva, mas esse
fato não deixa de ser preocupante, já que o leite é um ótimo substrato para bactérias.
Após a pasteurização (62,8ºC/30’) realizada no Laboratório de Microbiologia de
Alimentos, do Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição, da ESALQ, todas
as amostras novamente analisadas para os parâmetros microbiológicos citados, se
mostraram em acordo com a legislação nacional vigente (Brasil, 2002). Os resultados
encontrados na presente pesquisa podem ser indicativos de prováveis falhas do binômio
tempo/temperatura durante a pasteurização industrial; matéria-prima excessivamente
contaminada; higienização e sanificação deficientes das linhas de produção ou
contaminação pós-pasteurização.
MICROBIOLOGICAL CONDITIONS AND ASSESSMENT OF
PASTEURIZATION IN MILK SAMPLES COMMERCIALIZED IN
PIRACICABA-SP
Author: RICARDO PINHEIRO DE SOUZA OLIVEIRA
Adviser: Prof. Dr. CLÁUDIO ROSA GALLO
SUMMARY
Milk is one of the most valuable of all foods in nature and its importance is
based on its high nutritive value. Milk is rich in proteins, vitamins, fat, mineral salts, and
high digestibility. These factors are relevant for it to be considered an excellent culture
medium for most microorganisms. Pasteurization is necessary and its main purpose is to
eliminate pathogenic microorganisms, in addition to reducing to the maximum the
number of microorganisms in general. However, some of them may still outlive the
thermal treatment applied. The aim of this project was to evaluate the microbiological
conditions and efficiency of the industrial pasteurization of type-A,-B and-C milk, and
the microbiological conditions of raw milk, through the number of mesophillic,
thermophilic and psychrotrophic aerobe bacteria, Staphylococcus positive coagulase,
through the determination of the Most Probable Number (MPN) of total and fecal
coliforms, and also through the research on Salmonella spp. in 30 samples of milk
commercialized in Piracicaba-SP. Based on DIPOA legislation (Brazil, 2002), the results
showed that 44.4% of the type-A milk samples did not meet the microbiological
standard for mesophillic aerobe for total and fecal coliforms, 66.7% and 55.6% of the
same milk samples, respectively, were not in accordance with the present legislation. For
xv
the type-B milk, no sample failed to meet the microbiological standard in relation to
mesophillic aerobes. However, for total and fecal coliforms, 33.3% of the samples were
in disagreement with the present legislation. Type-C milk was the one presenting the
best result. All samples were in accordance with the microbiological analysis performed
in this work. The raw milk examined showed high values for all microbiological
analyses. No infected samples with Salmonella spp. were found in the analyzed milk
samples. The greatest value found for Staphylococcus positive coagulase was 1.1 x 10
2
UFC/mL, thus, far from the infective dose, although somewhat concearning since milk is
considered na excellent environment for the infestation of bacteria. After the
pasteurization (62.8ºC/30’) performed in the Food Microbiology Laboratory, of the
Agroindustry, Foods and Nutrition Department, ESALQ/USP, all samples that analyzed
again, based on the microbiological parameters mentioned above, met the national
legislation in force (Brazil, 2002). The results found in the research may be an indication
of probable failures regarding time/temperature during the industrial pasteurization;
infected raw-material; defecient sanitation of product lines or post-pasteurization
contamination.
1 INTRODUÇÃO
O leite é um alimento que possui um perfeito balanço de nutrientes,
fornecendo ao homem macro e micronutrientes indispensáveis ao crescimento,
desenvolvimento e manutenção da saúde. Como fonte de proteínas, lipídeos,
carboidratos, minerais e vitaminas, torna-se um dos alimentos mais vulneráveis a
alterações físico-químicas e deterioração por microrganismos. Estes contaminantes
podem causar modificações físico-químicas e organolépticas, que limitam a durabilidade
do leite e seus derivados, além de problemas econômicos e de saúde pública (Freitas et
al., 2002; Lopez & Stamford, 1997; Souza & Cerqueira, 1996).
O Brasil apresenta grande potencial no consumo e na produção de lácteos.
Apresenta uma das maiores taxas de crescimento na produção e vem participando do
mercado exterior de forma incipiente. Apresenta também área disponível e uma
diversidade de sistemas de produção viáveis. Além disso, devem-se considerar as boas
relações diplomáticas com os principais mercados importadores, como os do Oriente
Médio e Norte da África, possuindo uma cultura exportadora de agronegócio mundial
(FNP, 2004).
No Brasil, apesar do desenvolvimento tecnológico atingido em certos
laticínios, persistem ainda em nível de produção de leite, graves problemas que
depreciam a matéria-prima, que impedem o seu beneficiamento para consumo “in
natura” ou tornam o produto beneficiado impróprio para o consumo humano, mesmo
nas regiões onde a pecuária leiteira é tradicional (Fonseca, 1998; Freitas et al., 2002;
Nader Filho et al., 1997).
2
A higiene e o controle do leite, assim como dos produtos lácteos, têm como
objetivo básico assegurar a inocuidade. A presença de taxas suficientemente altas de
certos microrganismos e suas toxinas constituem as causas mais freqüentes de problemas
sanitários, além de grandes perdas econômicas.
Os procedimentos higiênicos dispensados durante a obtenção e a manutenção
do leite até sua entrada no estabelecimento de beneficiamento determinaram o tipo e a
quantidade desses contaminantes. A saúde do rebanho leiteiro, as boas práticas durante a
ordenha, a conservação do leite em baixa temperatura até o momento do processamento
são fundamentais para evitar o desenvolvimento dos microrganismos responsáveis pela
sua deterioração. Estes cuidados são essenciais para fabricação de bons produtos
derivados, já que o leite é utilizado como matéria-prima (Ponsano et al., 1999).
Atualmente, o leite utilizado pela indústria deve ser de altíssima qualidade
para se obter o máximo de rendimento na produção de produtos lácteos e também
aumentar o tempo de vida útil; portanto, o estabelecimento de normas e padrões oficiais
tem levado as indústrias a implantarem sistemas que garantam a qualidade de seus
produtos.
1.1 Objetivos
O presente trabalho teve como objetivos:
• Avaliar as condições microbiológicas e de pasteurização em amostras de
leite comercializadas no município de Piracicaba-SP;
• Avaliar o método SimPlate
®
em comparação com o método convencional
(NMP - tubos múltiplos) para enumeração de bactérias do grupo coliforme em amostras
de leite pasteurizado tipos A, B, C e leite cru;
• Avaliar a eficácia da pasteurização realizada no Laboratório de
Microbiologia de Alimentos do Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição
da ESALQ/USP.
.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A importância e a qualidade do leite
Tendo em vista a importância do leite sob os aspectos nutricionais,
econômicos, sociais e de saúde pública, a qualidade desse produto tem merecido a
atenção de inúmeros pesquisadores em todo o mundo. A higiene leiteira, ou seja, a
produção de leite limpo e sadio, tem por objetivo oferecer um produto com valor
nutricional, não comprometendo a saúde humana. É inexistente uma barreira entre
higiene e profilaxia, pois a profilaxia é a ciência que trata dos meios de impedir a
eclosão e a transmissão de doenças; a higiene é a primeira medida a ser adotada ao se
fazer profilaxia (Garcia et al., 2000).
A contaminação do leite inicia-se na fazenda, durante ou após a ordenha,
devido à ineficiência de higienização de utensílios e do homem, além de doenças do
rebanho. Não se deve esquecer que as dificuldades de transporte, falhas no processo de
beneficiamento e a estocagem podem interferir diretamente sobre a qualidade do leite.
Dessa forma, para que seja mantida a qualidade do leite é preciso produzí-lo, pasteurizá-
lo e comercializá-lo de maneira correta, de acordo com os parâmetros técnicos
estabelecidos pela legislação. Nos últimos anos, um número crescente de laticínios e
cooperativas vem remunerando o produtor de leite de acordo com a qualidade da
matéria-prima fornecida para a indústria (Franco & Landgraf, 1996; Garcia et al., 2000).
Apesar dos padrões impostos pela legislação, verifica-se uma situação
preocupante, pois não há uma realização diária das análises físico-químicas, enzimáticas
e microbiológicas em algumas mini e micro-usinas de beneficiamento no Estado de São
Paulo, o que impossibilita a avaliação da qualidade do leite destinado para o consumo
4
humano. Esse fator inviabiliza a rápida identificação e imediata correção das prováveis
falhas no processo de beneficiamento. Até mesmo nas grandes usinas de beneficiamento,
subordinadas à fiscalização diária e permanente do Serviço de Inspeção Federal, podem
surgir problemas relativos à qualidade do leite pasteurizado (Nader Filho et al., 1997).
Vale notar que o comércio informal de leite é uma grande ameaça à saúde
pública. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), dezesseis doenças
bacterianas e sete viróticas são veiculadas pelo produto comercializado nessas
condições, dentre elas, a tuberculose e gastroenterites, conseqüentes da baixa qualidade
do leite (Agnese, 2002).
2.2 Etapas críticas para a contaminação do leite
As etapas de ordenha e armazenamento do leite até que seja entregue na
indústria são críticas para sua contaminação, que é extremamente variável. A grandeza e
a diversidade da população contaminante variam consideravelmente e estão intimamente
associadas à origem do leite (Harvey & Hill, 1989; Pelczar et al., 1996).
A ordenha, preferencialmente mecânica, deve ocorrer dentro dos mais
criteriosos padrões sanitários. Mesmo em condições ótimas, o leite apresentará uma
carga microbiana que deve ser mantida constante, evitando a multiplicação da mesma no
leite (Ajzental, 1994).
Segundo Bramley & Mckinnon (1990), os níveis de contaminação no ar e o
volume de ar que passa no interior dos equipamentos incorporam ao leite uma
quantidade muito baixa de microrganismos, em torno de < 5 UFC/mL de leite produzido
e <1 esporo de Bacillus.
2.3 Contaminantes comuns do leite
Quando o leite é proveniente de animais sadios e obtido em condições
higiênicas adequadas, o número de microrganismos é baixo, sendo predominantes
Micrococcus, Streptococcus e Corynebacterium, além de lactobacilos saprófitas do
úbere e canais galactóforos (Jay, 1996).
5
Normalmente, a microbiota contaminante do leite é composta por bactérias,
enquanto as leveduras e fungos são mais raros de serem encontrados (Lima, 1998).
Dentre os contaminantes estão as bactérias láticas, coliformes, Micrococcus,
Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, esporos de Clostridium e bastonetes Gram-
negativos (Jay, 1996). Em condições adequadas de manipulação e armazenamento,
predomina a flora Gram-positiva (Jay, 1998).
2.3.1 Bactérias aeróbias mesófilas
Os mesófilos incluem um grupo de microrganismos capazes de se
multiplicarem numa faixa de temperatura entre 20 e 45
o
C, tendo uma temperatura ótima
de crescimento a 32
o
C e, portanto, encontrando nas temperaturas ambientes de países de
clima tropical, condições ótimas para o seu metabolismo (Franco & Landgraf, 1996).
Esse grupo é muito importante, por incluir a maioria dos contaminantes do
leite, tanto deterioradores como patógenos. É considerado um bom indicador de
qualidade microbiológica, sendo a contagem microbiana em placa realizada para se
avaliar as condições higiênicas na qual o produto foi processado (Jay, 1996; Teixeira et
al., 2000).
Contagens microbianas elevadas de mesófilos no leite pasteurizado podem
indicar uma matéria-prima excessivamente contaminada ou permanência em
temperatura de abuso, manipulação inadequada, equipamentos da planta de
processamento não adequadamente sanitizados e pasteurização deficiente (Rogick,
1987;Vieira, 1976).
O método de contagem de microrganismos em placas pode ser utilizado para
contagem de grandes grupos microbianos, como aeróbios mesófilos, psicrotróficos,
termófilos, variando-se apenas a temperatura e o tempo de incubação.
O meio de cultura mais utilizado na metodologia convencional é o Agar
Padrão para Contagem (PCA) (Hajdenwurcel, 1998). Esta contagem detecta o número
de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas (35-37ºC), presentes em forma
vegetativa ou também esporulada (Hayes, 1995).
6
2.3.2 Bactérias aeróbias termófilas e psicrotróficas
As bactérias termófilas são definidas como aquelas cuja temperatura ótima de
crescimento situa-se entre 55 e 65ºC, como máximo, para algumas espécies, podendo
atingir entre 75 e 90ºC e o mínimo em torno de 35ºC. O leite cru, normalmente, contém
poucas bactérias termófilas, embora com capacidade de se desenvolverem no leite
quando mantido a temperaturas elevadas, podendo atingir grande número destes
microrganismos no produto. Essas bactérias constituem problema no leite pasteurizado
quando algumas porções são mantidas, por algum tempo, entre 50 e 70ºC (Silveira,
1998).
O termo psicrotrófico tem confundido os microbiologistas desde o começo do
século XX. Outros termos são usados, tais como: psicrófilos, psicrófilos facultativos,
tolerantes ao frio ou psicrotolerantes (Gounot, 1986). Segundo Collins (1981), de acordo
com as normas da International Dairy Federation, os psicrotróficos foram definidos
como sendo os microrganismos que podem crescer à 7ºC ou menos, independente da
temperatura ótima de crescimento. Esse grupo é extremamente importante em produtos
que são conservados ou armazenados em condições de refrigeração por períodos longos
(1 a 4 semanas). O problema torna-se ainda mais sério quando se considera que o uso
intensivo da refrigeração, desde a fazenda até a residência do consumidor, pode
provocar uma gradativa seleção para esse grupo. Tem-se observado que um grande
número de espécies, consideradas restritamente mesófilas, já estão sendo incluídas
também entre os psicrotróficos (Santana, 2001; Silveira, 1998).
A refrigeração do leite após a ordenha e sua conservação em baixas
temperaturas (4ºC), condiciona o desenvolvimento da microbiota e pode impedir o
crescimento de microrganismos mesófilos. Esse tratamento térmico logo após a
obtenção do leite, tem ampliado consideravelmente o período de tempo em que se
armazena o leite até a sua pasteurização, ocasionando uma redução no número de
bactérias mesófilas, embora possa se observar um crescimento de microrganismos
psicrotróficos, que posteriormente podem causar perdas econômicas (Santana, 2001;
Wendpap & Rosa, 1997).
7
Os microrganismos psicrotróficos encontrados no leite são em sua maioria
Gram-negativos, provenientes do meio ambiente e equipamentos de ordenha. Os Gram-
positivos também estão presentes, porém em menor quantidade. Os psicrotróficos Gram-
positivos mais freqüentes no leite cru resfriado pertencem aos gêneros Micrococcus,
Bacillus e Arthrobacter. Mesmo quando presentes em pequenas quantidades no leite,
podem causar alterações decorrentes de multiplicação com degradação de seus
componentes. Apesar de serem facilmente destruídos pela pasteurização, suas enzimas
proteolíticas e lipolíticas são termorresistentes e promovem alterações físicas e
organolépticas no leite e seus derivados mesmo após o tratamento térmico (Andrade et
al., 1998; Santana, 2001; Santos, 1999).
O microrganismo psicrotrófico encontrado com maior freqüência em leite
refrigerado cru e pasteurizado é do gênero Pseudomonas, por apresentar melhor
capacidade de crescimento em ambiente refrigerado do que outras bactérias Gram-
negativas (Santos, 1999; Sorhaung & Stepaniak, 1997).
Em um estudo de freqüência de psicrotróficos em leite e ambiente de ordenha
observou-se que em leite cru, 81,62% dos mesófilos são microrganismos psicrotróficos,
dos quais 63,35% são proteolíticos e 64,14% são lipolíticos. Em outra pesquisa, foi
observado que alguns gêneros de coliformes são considerados psicrotróficos,
representando 10-20% da microbiota isolada de leite cru estocado entre 5-7ºC (Bramley
& Mckinnon,1990; Muir,1996; Santos ,1999).
2.3.3 O grupo coliforme
Os coliformes estão muito difundidos e podem ser detectados em vários tipos
de alimentos, mas não indicam, necessariamente, uma contaminação de origem fecal, no
sentido de envolver contato direto ou indireto com fezes. A presença destes
microrganismos em leites crus é freqüentemente atribuída às práticas precárias de
higiene durante a ordenha e nas etapas subseqüentes (Moreno et al., 1999).
De acordo com Oliveira & Caruso (1996), testes para organismos coliformes
em leite têm a finalidade de avaliar as condições sanitárias de produção, determinar a
8
presença de infecções do úbere causada por certas espécies deste grupo e também avaliar
a eficiência da pasteurização, já que o grupo de microrganismos coliformes totais e
fecais é considerado indicador das condições higiênicas da produção e beneficiamento
do leite pasteurizado.
A utilização do grupo coliforme como indicador das condições higiênico-
sanitárias em alimentos, é prática estabelecida há muitos anos. Dos agentes bacterianos,
os coliformes são internacionalmente considerados microrganismos indicadores da
segurança microbiológica de alimentos (Bonassi, 1984; Frazier & Westhoff, 1993;
Nascimento et al., 1991; Rogick, 1987; Vanderzant & Splittstoesser, 1992).
2.3.3.1 Coliformes totais
O grupo dos coliformes totais compreende principalmente os gêneros
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Encontram-se bactérias originárias
do trato gastrintestinal de humanos e outros animais de sangue quente, como também
diversos gêneros e espécies de bactérias não entéricas. Portanto, a enumeração em água
e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal do que a
enumeração de coliformes fecais ou E. coli (Silva et al., 1997).
O grupo de microrganismos coliformes totais é restrito ao trato gastrintestinal
de humanos e animais homeotérmicos. Este grupo inclui bactérias aeróbias e anaeróbias
facultativas, Gram-negativas, não esporogênicas, com capacidade de fermentar a lactose
com produção de gás num período de 48 horas a 35
o
C (Siqueira, 1995; Vanderzant &
Splittstoesser, 1992).
2.3.3.2 Coliformes fecais
Os coliformes fecais também são coliformes totais que continuam
fermentando a lactose, com produção de gás quando incubados a 44-45,5
0
C (Vanderzant
& Splittstoesser, 1992). Neste grupo, são incluídas além da E. coli, espécies de
Enterobacter e Klebsiella, embora algumas cepas dos gêneros Enterobacter e Klebsiella,
9
podem não ter origem entérica (Hajdenwurcel, 1998).
2.3.3.3 Escherichia coli
Dentro do grupo dos coliformes fecais, a E. coli é a melhor indicadora de
contaminação fecal direta ou indireta conhecida até o momento. Nas fezes humanas e de
animais, cerca de 95% dos coliformes existentes são Escherichia coli (Hajdenwurcel,
1998; Silva et al., 2000).
A presença dessa bactéria tem um significado importante, uma vez que
existem linhagens patogênicas, com base nos fatores de virulência, manifestações
clínicas e epidemiológicas para o homem e animais (Franco & Landgraf, 1996).
2.3.4 Staphylococcus coagulase positiva
Os estafilococos apresentam-se na forma de cocos Gram-positivos, isolados ou
agrupados em cachos, pares e tétrades. São anaeróbios facultativos, com maior
crescimento sob condições aeróbias, não esporogênicos, produtores usuais de catalase e
imóveis. São bactérias mesófilas apresentando temperatura de crescimento na faixa de
7
o
C a 47,8
o
C, mas as enterotoxinas são produzidas entre 10 e 46
o
C, com ótimo entre
40
o
C e 45
o
C. As bactérias deste gênero são tolerantes a concentrações de 10 a 20% de
NaCl e a nitratos. Crescem em valores de atividade de água inferiores aos considerados
mínimos para as bactérias não-halófilas. O valor mínimo de atividade de água (Aa)
considerado é de 0,86, no entanto, em condições ideais, o desenvolvimento é possível
em Aa de 0,83. Esse microrganismo cresce na faixa de pH entre 4 e 9,8, com ótimo entre
6 e 7 (Franco e Ladgraf, 1996; Vanderzant & Splittstoesser, 1992).
Segundo Pereira et al. (2000), os estafilococos foram inicialmente observados
por Kock, em 1878, a partir de material purulento; cultivado em meios líquidos por
Pasteur, em 1880, e, a primeira publicação que versou sobre estes microrganismos, em
forma de cocos, e sua constância em abscessos agudos e crônicos, tiveram lugar na
Escócia, nos idos de 1881. Foi também como decorrência destes estudos que passaram a
10
receber a denominação de Staphylococcus uma vez que, quando observados
microscopicamente, apresentavam-se sob forma de grãos arranjados ou dispostos como
cachos de uvas.
Atualmente o gênero Staphylococcus é composto por cerca de 27 espécies,
sendo que algumas são freqüentemente associadas a uma ampla variedade de infecções
de caráter oportunista, em seres humanos e animais. Entre elas se destacam, em
patologia humana, as espécies: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus haemolyticus. Tradicionalmente, os
estafilococos são divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase
negativos. Essa divisão é baseada na capacidade de coagular o plasma sanguíneo, que é
uma propriedade considerada, há muito tempo, como importante marcador de
patogenicidade dos estafilococos. Entre os coagulase positivos, Staphylococcus aureus
representa a espécie geralmente envolvida em infecções humanas (Trabulsi et al., 1999).
Staphylococcus aureus é o agente mais comum de infecções patogênicas, além
de causar vários tipos de intoxicações, seja na vigência de um processo infeccioso ou
não. Este microrganismo pode ser encontrado em várias partes do corpo, como fossas
nasais, garganta, intestinos e pele. O número de portadores nasais do germe varia de
30% a 50%, sendo mais elevado entre as pessoas que trabalham em hospitais (Trabulsi
et al., 1999).
Staphylococcus aureus é o principal agente responsável pela intoxicação
estafilocócica, que ocorre devido à ingestão de alimentos que apresentam toxina pré-
formada. Essas toxinas são chamadas enterotoxinas, sendo conhecidas cinco
imunologicamente distintas (A, B, C, D e E) (Franco & Landgraf, 1996).
De acordo com Bergdoll (1989), citado por Pereira et al. (1999), as
características físico-químicas das enterotoxinas estafilocócicas apresentam
similaridades entre si, que podem assim ser resumidas: constituem proteínas simples de
peso molecular situado entre 26.000 a 29.000 D e estruturadas em uma única cadeia
polipeptídica rica em lisina, tirosina e ácidos aspártico e glutâmico. No estado ativo, as
enterotoxinas resistem à ação de enzimas proteolíticas como pepsina, tripsina,
quimiotripsina, papaína e renina.
11
As enterotoxinas estafilocócicas apresentam também a propriedade de
termorresistência, o que constitui ponto crucial em controle de qualidade de alimentos,
uma vez que a enterotoxina pode persistir no produto final, após o processamento
térmico (Pereira et al., 1999).
O quadro clínico observado na intoxicação estafilocócica tem suas
características estabelecidas no vômito e diarréia. Náusea, calafrios, dores abdominais e
prostração ocorrem usualmente e o estado febril é de rara ocorrência. Os sintomas
clínicos se manifestam após um curto período de incubação (em média 4 horas),
apresentando durabilidade fugaz, com caráter geralmente não fatal, retratada por uma
fase aguda de início abrupto, mas auto-limitada e com restabelecimento do doente
observado em torno de 24 a 72 horas (Bergdoll, 1990a, citado por Pereira et al., 1999).
A dose tóxica mínima, em experimentos conduzidos com voluntários
humanos, foi relatada como sendo 0,05µg/Kg (3,5µg/homem de 70Kg), dose esta
suficiente para provocar vômito e diarréia (Bergdoll, 1990a, citado por Pereira et al.,
1999).
As células de Staphylococcus aureus apresentam alguns componentes de
superfície, assim como produzem várias substâncias extracelulares, que contribuem para
sua virulência, entre os quais a cápsula, peptidioglicano da parede celular, ácidos
teicóicos, proteína A, adesinas, hemolisinas e leucocidinas (Trabulsi et al., 1999).
Segundo Nervino (1997) citado por Zoli et al. (2002), vários alimentos já
foram envolvidos em surtos de intoxicação estafilocócica, entre eles carnes cozidas,
leite, cremes, tortas recheadas com creme, saladas de batata, atum, frango e presunto. A
falha na manipulação associada à conservação inadequada dos alimentos nos
estabelecimentos comerciais e nos domicílios foi a grande responsável pelos surtos.
Deve-se também levar em conta o cozimento ou descongelamento inadequado,
aproveitamento de sobras alimentares e utilização de equipamentos contaminados.
Alimentos submetidos a tratamento térmico após um período de manutenção em
condições que permitam o crescimento podem não apresentar células viáveis de S.
aureus, destruídas pelo calor, e mesmo assim conter toxinas estafilocócicas, que são
resistentes ao calor (Silva et al., 1997).
12
A contagem de S. aureus em alimentos é feita com a finalidade de relacionar
este microrganismo à saúde pública, para confirmar o envolvimento em surtos de
intoxicação alimentar, e para controlar a qualidade higiênico-sanitária dos processos de
produção de alimentos. Neste último caso, S. aureus serve como indicador de
contaminação pós-processo ou das condições de sanificação das superfícies destinadas
ao contato com alimentos (Silva et al., 1997).
As principais características utilizadas no isolamento de S. aureus são as
características seletivas, como habilidade de crescer na presença de 10% de NaCl, 0,01 a
0,05% de telurito de potássio, 0,2 a 0,5% de cloreto de lítio, 0,12 a 1,26% de glicina e 40
mg/L de polimixina, entre outras, e as características diferenciais, como a habilidade de
reduzir o telurito de potássio, produzindo colônias pretas, a habilidade para hidrolisar a
gema de ovo, por ação de lipases e/ou lecitinases, produzindo halos claros em redor das
colônias, a capacidade de utilizar o manitol e de crescer a 42-43
o
C em condições
seletivas, a atividade de coagulase e de termonuclease, entre outras (Trabulsi, et al.,
1999; Vanderzant & Splittstoesser, 1992).
Há vários meios disponíveis para a contagem direta em placas, combinando
uma ou mais características seletivas/diferenciais, como o Agar Manitol Sal, Agar
Vogel-Johnson, Agar Azida Gema de Ovo, Agar Fenolftaleína Fosfato de Polimixina,
entre outros (Silva et. al, 1997). Estes meios não devem ser utilizados para alimentos
onde seria possível a presença de células injuriadas, como alimentos desidratados ou
congelados, pois são considerados restritivos para a reparação de injúria. O Agar Baird-
Parker (BP) também é um meio muito utilizado para o isolamento de S. aureus.
Combina telurito de potássio (0,01%), glicina (1,2%) e cloreto de lítio (0,5%), como
agentes seletivos, e a redução do telurito e a hidrólise da gema de ovo, como
características diferenciais. O meio contém ainda 1% de piruvato de sódio, agente
eficiente na reparação de células injuriadas, tanto quanto da catalase, evitando o
acúmulo de peróxido de hidrogênio (tóxico para as células) produzido em condições
aeróbias, durante o crescimento e reparação (Vanderzant & Splittstoesser, 1992).
O Ágar BP pode ser utilizado para o plaqueamento direto de alimentos
processados ou “in natura”, tanto na enumeração com finalidades indicativas como na
13
enumeração com finalidades de saúde pública. Entretanto, o Agar BP não é capaz de
suprimir completamente o crescimento de competidores de S. aureus, particularmente
outras espécies não patogênicas do gênero Staphylococcus que produzem colônias
semelhantes, havendo necessidade de submeter à colônia típica, testes adicionais para
confirmação definitiva, como os testes de coagulase, termonuclease e catalase (Siqueira,
1995).
As colônias de Staphylococcus aureus, quando cultivadas no meio Agar
Baird-Parker, são negras, lustrosas, convexas. Possuem de 1 a 5 mm de diâmetro,
rodeados por halo de 2 a 5 mm de largura. A formação de colônias negras circundadas
por um halo é devido a redução do telurito a telureto, e a lipólise e proteólise da gema,
respectivamente (Franco & Landgraf, 1996; Siqueira, 1995).
Através da prova da coagulase verifica-se a capacidade de certos
microrganismos de coagularem o plasma, devido à produção de coagulase. S. aureus
produz grandes coágulos, podendo o plasma ser inteiramente coagulado. Na prova da
catalase verifica-se a presença ou ausência da enzima catalase no microrganismo. S.
aureus é catalase positivo (Siqueira, 1995).
2.3.5 Salmonella
O gênero Salmonella, descrito por Lignières em 1900, em homenagem ao
bacteriologista americano D.E. Salmon que, juntamente com Theobald Smith em 1894
isolaram a Salmonella choleraesuis, pertence à família Enterobacteriaceae (Le Minor,
1984).
As salmonelas têm a forma de bastonetes curtos, medindo de 0,7 - 1,5 x 2,0 -
5,0 micra. São bactérias Gram-negativas; não esporuladas; móveis por meio de flagelos
peritríquios (exceto S. gallinarum e S. pullorum); anaeróbias facultativas, mas que
podem crescer em meio comum na presença de oxigênio livre; produzem catalase;
utilizam o citrato como fonte de carbono (exceto S. typhi e S. paratyphi A); reduzem o
nitrato a nitrito; produzem ácido e gás a partir da glicose; geralmente produzem sulfeto
de hidrogênio em Agar Tríplice Açúcar-Ferro; fermentam o dulcitol, porém não
14
fermentam a sacarose, a salicina, o inositol, a rafinose, a amidalina e a lactose (Le
Minor, 1984; Oliveira, 1984; Pelczar et al., 1996).
As salmonelas são organismos mesófilos, com ótimo de crescimento no
intervalo de 35 a 37
o
C, evidenciando certo crescimento na faixa entre 5 e 47
o
C, embora
a velocidade do mesmo seja sensivelmente reduzida abaixo de 10
o
C (D’Aoust, 1989;
Doyle & Cliver, 1990; Roitman et al., 1988).
Segundo Frazier & Westhoff (1993), a Aa mínima para o crescimento da
bactéria varia com o tipo de alimento, mas em geral, é da ordem de 0,93 a 0,95. Outro
parâmetro de fundamental importância a se considerar é o pH. Geralmente, as
salmonelas crescem no intervalo de 4,5 a 9,0, com ótimo na faixa de 6,5 a 7,5. O pH
mínimo para o desenvolvimento varia com o sorotipo, temperatura de incubação, tipo de
ácido, composição do substrato e tensão de oxigênio, mas, de modo geral, em valores de
pH abaixo de 4,0 e acima de 9,0, as salmonelas são lentamente destruídas (D’Aoust,
1989; Doyle & Cliver, 1990; Roitman et al., 1988).
A busca de uma metodologia adequada e eficiente para detectar Salmonella
em alimentos tem sido constante para todos os profissionais que trabalham na pesquisa
desta bactéria. Apesar de nos últimos anos muitos métodos com tecnologias avançadas
terem sido desenvolvidos para diagnosticar Salmonella em alimentos, o método cultural
clássico, apesar de sua morosidade e labor, continua sendo amplamente utilizado em
laboratórios de monitoramento de Salmonella nas indústrias de alimentos e sua
eficiência representa confiabilidade nos resultados obtidos e a segurança no controle
desta bactéria (Giombelli, 2000).
O método tradicional para detecção de Salmonella em alimentos pode garantir
o isolamento desta bactéria mesmo em situações desfavoráveis, como por exemplo, em
alimentos com microbiota competidora. Ainda o isolamento e identificação de
Salmonella são um problema para indústria de alimentos, pois demora um longo tempo
para obtenção dos resultados, já que são necessários dois dias para as etapas de pré-
enriquecimento e enriquecimento seletivo, além de três dias para as etapas de isolamento
em ágar seletivo, identificação bioquímica e confirmação com testes sorológicos (Brasil,
1992; FDA, 1998; Giombelli & Silva, 2001).
15
2.4 Inovação nos métodos de análise microbiológica
A análise de leite e produtos lácteos, para se verificar quais e quantos
microrganismos estão presentes, é fundamental para que se conheça as condições de
higiene do alimento, e, conseqüentemente, os riscos que podem oferecer à saúde do
consumidor.
A análise microbiológica de leite e produtos lácteos era realizada empregando-
se metodologias desenvolvidas no início do século. O significativo desenvolvimento
tecnológico no setor alimentício, a implementação cada vez mais freqüente dos
conceitos de APPCC (Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle) e de Boas
Práticas de Fabricação (BPF), além da ampliação dos conhecimentos sobre os
microrganismos importantes em alimentos, estão indicando que os métodos
convencionais necessitam ser substituídos por métodos alternativos mais modernos,
mais adequados à constante busca pelo aumento da produtividade e da eficiência. Entre
os vários métodos alternativos atualmente disponíveis, merecem destaque os sistemas
denominados “prontos para uso”, que agilizam as análises microbiológicas, tornando-as
mais rápidas, precisas e com menor custo (Franco, 1998; Teixeira et al., 2000).
2.4.1 O sistema SimPlate
®
para coliformes totais e E. coli
O método SimPlate
®
para contagem de coliformes totais e E. coli é baseado na
tecnologia de substrato definido que correlaciona a presença de coliformes totais e E.
coli com a presença de beta-galactosidase e beta-glucoronidase, respectivamente. O
composto vermelho clorofenol b-D-galactopiranosídeo (CPRG), quando hidrolisado pela
enzima b-galactosidase, produz o composto vermelho clorofenol (CPR) que possui
coloração laranja a púrpura e o composto 4-metilumbeliferil b-d-glucoronídeo (MUG)
quando hidrolizado pela enzima beta-glucoronidase produz o 4-metilumbeliferona (4-
UM) que apresenta cor azul fluorescente quando exposto a UV a 365nm (Hajdenwurcel,
1998).
O número de cavidades coloridas (laranja a púrpura) em cada placa é
16
registrado como positivo para coliformes. As cavidades que fluorescem azul quando
expostas a comprimento de onda ultravioleta (365nm) são registradas como positivas
para E. coli. O número de cavidades positivas é convertido em Número Mais Provável
(NMP) de coliformes ou E. coli (Townsend et al., 1998).
2.4.2 Kits rápidos para detecção de Salmonella
Foram surgindo no mercado vários kits rápidos eficientes, merecendo destaque
o 1-2 Test e o Salmonella Rapid Test. Os dois kits permitem uma rápida e precisa
detecção da Salmonella.
2.4.2.1 O kit 1-2 Test da BioControl
O 1-2 Test da BioControl é um método rápido qualitativo para a detecção das
espécies móveis de Salmonella. Os resultados estarão disponíveis em 2 dias, o que
significa grande ganho de tempo, comparando com o método tradicional. Trata-se de um
método aprovado pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists
International) para utilização em todos os tipos de alimentos.
O princípio se baseia na observação da imobilização da Salmonella pelos
anticorpos polivalentes H (flagelar) contidos no meio de motilidade, com o
desenvolvimento de uma banda visual bem definida (imunobanda).
A unidade teste é composta por dois compartimentos: câmara de inoculação,
contendo caldo tetrationato-verde brilhante, e a câmara de motilidade, contendo um
meio de motilidade não seletivo à base de peptona. A comunicação entre os
compartimentos é vedada por um tampão, que deve ser removido antes da adição da
amostra. Durante a incubação do kit inoculado, a Salmonella contida no caldo
tetrationato-verde brilhante se move da câmara de inoculação para o meio de motilidade
para reagir com os anticorpos, formando a imunobanda.
17
2.4.2.2 O kit Salmonella Rapid Test da Oxoid
O Salmonella Rapid Test da Oxoid, é um método baseado no uso de 2 tubos
onde no tubo A encontram-se os meios de cultivo Lisina Ferro Cistina Vermelho Neutro
(indicador) e Rappaport Vassiliadis Modificado (seletivo). A enzima cistina-
disulfohidrase hidrolisa a cistina com fomação de ácido pirúvico, amônia e ácido
sulfídrico. O ácido sulfídrico se combina com o ferro formando o sulfeto de ferro de cor
preta, podendo passar para o compartimento inferior.
No tubo B estão presentes os meios de cultivo Verde Brilhante Modificado
(indicador) e Lisina Ferro Desoxicolato Modificado (seletivo). Neste tubo há a
descarboxilação da lisina com a formação de ácido sulfídrico que se combina com o
ferro, formando o sulfeto de ferro enegrecendo o compartimento inferior. A cor negra
pode passar para o compartimento superior. No compartimento superior, a Salmonella
não fermenta lactose (LAC) nem sacarose (SAC). Há a formação de compostos alcalinos
e o indicador do meio (vermelho fenol) se manifesta deixando o meio vermelho.
Como qualquer método rápido microbiológico, se der negativo, não tem o
microrganismo-alvo. Se der positivo (nos dois tubos ou em um tubo), confirmar com a
prova sorológica (Salmonella Látex Test), através de reação de aglutinação frente a um
anti-soro específico para Salmonella.
2.5 Tratamentos térmicos utilizados no leite
Dentre os vários processos industriais visando à conservação do leite
destacam-se: pasteurização, esterilização, evaporação, condensação, desidratação e
fermentações. No presente trabalho será dada ênfase à pasteurização.
2.5.1 Pasteurização e sua importância
A pasteurização do leite tem se constituído, de longa data, em valiosa arma na
prevenção de zoonoses disseminadas por esse alimento. Este processo de pasteurização,
18
mesmo quando eficiente na destruição dos agentes patogênicos, não é capaz de eliminar
todos os microrganismos presentes no produto (Ajzental et al., 1996).
A pasteurização do leite pode ser efetuada de várias maneiras ou processos,
utilizando-se dos mais variados tipos de equipamentos. Deve-se, no entanto ater aos
objetivos da pasteurização, que é a eliminação total dos microrganismos patogênicos
presentes no leite e a redução no número de microrganismos não patogênicos,
conhecidos como microbiota banal (Sbampato, 1998).
Segundo Souza & Cerqueira (1996) a eficiência do processo de pasteurização
relaciona-se com a destruição de quase toda a microbiota banal do leite (97%) e de
100% da flora patogênica, sem alterações da composição, equilíbrio físico-químico,
sabor e odor do produto. A despeito de estarem estabelecidos internacionalmente os
valores binômio temperatura-tempo de pasteurização, a variabilidade e a quantidade da
microbiota bacteriana do leite constituem-se de fatores capazes de influir na qualidade
do produto pasteurizado (Pelczar et al., 1996; Souza & Cerqueira, 1996).
O leite pasteurizado deve ser classificado quanto ao teor de gordura como
integral, padronizado a 3% (g/100g), semidesnatado ou desnatado, e, quando destinado
ao consumo humano direto na forma fluida, submetido a tratamento térmico na faixa de
temperatura de 72 a 75ºC durante 15 a 20s, em equipamento de pasteurização, dotado de
painel de controle com termo-registrador e termo-regulador automáticos, válvula
automática de desvio de fluxo, termômetros e torneiras de prova, seguindo-se de
resfriamento imediato até temperatura igual ou inferior a 4ºC e envase em circuito
fechado no menor prazo possível, sob condições que minimizem contaminações( Pelczar
et al., 1996).
Os processos de pasteurização, UHT e ultrafiltração originam produtos lácteos
livres de microrganismos patogênicos. Estes tratamentos térmicos garantem a ausência
de Salmonella, Campylobacter, Staphylococcus, Brucella, Yersinia, Shigella,
Pseudomonas, Listeria, Coxiella, Corynebacterum, Streptococcus, desde que as
tecnologias envolvidas para o processamento sejam rigorosamente cumpridas (Ajzental,
1994).
A taxa de redução microbiana do processo de pasteurização rápida (HTST)
19
para leite beneficiado em entrepostos, usinas (tipo C) e em granjas leiteiras (tipo A) foi
maior (p>0,05) do que a do leite submetido à pasteurização lenta (LTLT) em banho-
maria (integral/fazenda) (Souza & Cerqueira, 1996).
Segundo Furtado (1988) e Sbampato (1998), o leite pasteurizado pelo sistema
ejetor de vapor apresentou teores mais elevados de ácidos graxos livres, os glóbulos de
gordura apresentaram-se menos aglomerados, o soro apresentou menor perda de
gordura, além do maior rendimento de fabricação L de leite/ Kg de queijo, quando
comparado com a pasteurização pelo sistema HTST.
2.5.2 Pontos críticos de controle no leite pasteurizado
Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), é um sistema de
análise que identifica perigos específicos e medidas preventivas para seu controle,
objetivando a segurança do alimento, e contempla para a aplicação, nas indústrias sob
inspeção do SIF, também os aspectos de garantia de qualidade. Baseia-se na prevenção,
eliminação ou redução dos perigos em todas as etapas da cadeia produtiva. Constitui-se
de sete princípios básicos como a identificação do perigo; identificação do ponto crítico;
estabelecimento do limite crítico; monitorização; ações corretivas; procedimentos de
verificação e registros dos resultados (Franco & Landgraf, 1996; Hajdenwurcel et al.,
2002).
Os Pontos de Controle Críticos (PCC), definidos na análise, serão aqueles
pontos do processo onde a aplicação de uma medida de controle elimina ou reduz o
perigo a um nível aceitável, ou seja, onde não signifique um problema de saúde para o
consumidor. Uma boa análise de perigos nos facilitará determinar as etapas realmente
críticas para a inocuidade do produto, já que na prática o ideal é mantê-los em um
mínimo, de forma que possa dar a máxima atenção às medidas preventivas essenciais
para a inocuidade (Franco & Landgraf, 1996; Hajdenwurcel et al., 2002).
No momento da chegada do leite cru à indústria é imprescindível uma
criteriosa seleção deste produto, devendo o mesmo ser conservado em tanque de
estocagem a 5ºC ou menos. Como esta temperatura não é capaz de eliminar o perigo
20
microbiológico, mas apenas reduzí-lo a níveis aceitáveis, evitando a multiplicação da
maioria das bactérias patogênicas, a conservação do leite no tanque de estocagem é
considerada um ponto crítico de controle parcialmente eficaz (PCC2) (Figura 1). O
processo de pasteurização, por sua vez, é um ponto crítico de controle totalmente eficaz
(PCC1) (Figura 1), pois destrói as bactérias patogênicas, eliminando o perigo
microbiológico. O conhecimento de que a pasteurização não é capaz de eliminar todas as
toxinas, enzimas e esporos microbianos que podem estar presentes no leite cru leva a
propor que outros PCCs antes e após este tratamento térmico, devem ser controlados,
bem como a temperatura de refrigeração durante a estocagem do produto (Lopez &
Stamford, 1997).
Recepção
Seleção
Refrigeração
Padronização e
Homogeneização
Tanque de
estocagem
+
■
Tanque de
estocagem
+
■
Pasteurização
e Refrigeração
x
PCC 2
PCC 1
PCC 2
Envase▲
Câmara
frigorífica
+
PCC 2
Expedição
RecepçãoRecepção
SeleçãoSeleção
RefrigeraçãoRefrigeração
Padronização e
Homogeneização
Padronização e
Homogeneização
Tanque de
estocagem
+
■
Tanque de
estocagem
+
■
Tanque de
estocagem
+
■
Tanque de
estocagem
+
■
Pasteurização
e Refrigeração
x
Pasteurização
e Refrigeração
x
PCC 2
PCC 1
PCC 2
Envase▲Envase▲
Câmara
frigorífica
+
Câmara
frigorífica
+
PCC 2
ExpediçãoExpedição
Fonte: Lopez & Stamford, 1997
Figura 1 - Fluxograma de beneficiamento do leite pasteurizado, evidenciando os pontos
críticos de controle parcialmente eficaz (PCC2) e o totalmente eficaz (PCC1).
Observam-se pontos importantes de contaminação (■), pontos de
contaminação pouco importantes (▲), pontos de possível multiplicação de
microrganismos (+) e pontos de destruição térmica (x)
21
2.6 Classificação do leite
A classificação do leite elaborada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento - DIPOA (Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal),
através da Instrução Normativa nº51, de 18 de Setembro de 2002, estabelece:
Leite Tipo A
Produzido em granja leiteira, com rebanho acompanhado por veterinário do
Serviço de Inspeção. Deve ser pasteurizado e resfriado imediatamente após a ordenha,
que obrigatoriamente é mecânica. Imediatamente após a pasteurização o produto assim
processado deve apresentar teste qualitativo negativo para fosfatase alcalina e teste
positivo para peroxidase. O leite deve ser resfriado e transportado à temperatura de 4ºC.
O leite A pode ser dividido em:
- Leite Pasteurizado tipo A Integral;
- Leite Pasteurizado tipo A Padronizado;
- Leite Pasteurizado tipo A Semidesnatado;
- Leite Pasteurizado tipo A Desnatado;
Leite Tipo B
Produzido em estábulo leiteiro, com rebanho acompanhado por veterinário do
Serviço de Inspeção. Após a ordenha pode ser resfriado e transportado para ser
pasteurizado em usinas de beneficiamento ou entreposto-usina, num período de 3 horas
após a ordenha. Este prazo pode ser prolongado por mais 2 horas, desde que o leite tenha
sido resfriado à temperatura de 7
0
C. Imediatamente após a pasteurização, o produto
assim processado deve apresentar teste qualitativo negativo para fosfatase alcalina e
teste positivo para peroxidase.
O leite B pode ser dividido em:
- Leite cru Refrigerado tipo B;
- Leite Pasteurizado tipo B Integral;
22
- Leite Pasteurizado tipo B Padronizado;
- Leite Pasteurizado tipo B Semidesnatado;
- Leite Pasteurizado tipo B Desnatado.
Leite tipo C
O leite cru tipo C é transportado em vasilhame adequado e individual de
capacidade até 50 litros e entregue em estabelecimento industrial adequado até as 10:00
h do dia de sua obtenção, em temperatura ambiente. Após ser entregue em posto de
refrigeração de leite ou estabelecimento industrial adequado, é mantido em temperatura
igual ou inferior a 4ºC. Este leite, após sofrer refrigeração em posto de refrigeração,
permanece estocado no período máximo de 24 h, sendo remetido em seguida ao
estabelecimento beneficiador. Em um período máximo de 12 h, o leite é transportado
para outra indústria, visando processamento final, onde deve apresentar, no momento do
seu recebimento, temperatura igual ou inferior a 7ºC. Imediatamente após a
pasteurização, o produto assim processado deve apresentar teste negativo para fosfatase
alcalina e teste positivo para peroxidase.
O leite tipo C é dividido em:
- Leite cru tipo C;
- Leite cru Refrigerado tipo C;
- Leite Pasteurizado tipo C Integral;
- Leite Pasteurizado tipo C Padronizado;
- Leite Pasteurizado tipo C Semidesnatado;
- Leite Pasteurizado tipo C Desnatado.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostragem
As amostras de leite pasteurizado dos tipos A, B e C, foram obtidas em
diferentes pontos de venda no município de Piracicaba-SP. As coletas foram efetuadas
em estabelecimentos comerciais de pequeno, médio e grande portes, em diferentes
bairros com alternância a cada amostra. Foram coletadas 3 amostras para cada uma das 3
marcas de leite para cada tipo do produto. Essas amostras sofreram uma nova
pasteurização no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de
Agroindústria, Alimentos e Nutrição da ESALQ-USP, para se verificar a eficiência deste
tratamento térmico, quando comparado a pasteurização industrial aplicada às amostras
coletadas.
Também foi avaliada a qualidade microbiológica do leite cru, valendo
ressaltar que nos locais de coleta das amostras de leite pasteurizado, não é
comercializado o produto cru.
3.2 Metodologia
As amostras foram analisadas de acordo com a metodologia padrão descrita
por: Vanderzant & Splittstoesser, 1992 e Association of Official Analytical Chemists
(AOAC, 2000).
24
3.3 Preparo das amostras
As análises foram realizadas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos
do Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição da ESALQ-USP.
Foram analisadas 9 amostras de leite pasteurizado tipo A, 9 amostras de leite
pasteurizado tipo B, 9 amostras de leite pasteurizado tipo C e 3 amostras de leite cru,
totalizando 30 amostras.
Para todas as amostras foram realizadas análises microbiológicas para
contagem total de bactérias psicrotróficas, mesófilas, termófilas; coliformes totais e
fecais (NMP); coliformes totais e E. coli (SimPlate); contagem de Staphylococcus
coagulase positiva e análise para Salmonella. Após a retirada da alíquota necessária para
tais análises, procedeu-se a pasteurização do restante do leite de cada amostra. Essa
pasteurização foi realizada em banho-maria a 62,8ºC/30’ (Figura 2), e novamente todos
os parâmetros microbiológicos mencionados foram analisados. Tal procedimento teve o
objetivo de avaliar a eficácia do processo de pasteurização industrial que as amostras
haviam sofrido, bem como avaliar os efeitos benéficos de tal tratamento térmico nas
amostras de leite cru. Assim, foram analisadas 30+30, ou seja, um total de 60 amostras
de leite.
Figura 2 – Pasteurização no laboratório em banho-maria a 62,8ºC/30’
25
As amostras, ao chegarem ao laboratório, foram homogeneizadas na própria
embalagem para que os microrganismos se distribuíssem uniformemente. As
embalagens foram desinfetadas externamente com álcool etílico a 70%. Foram abertas e
transferidas para erlenmeyer esterilizado, a fim de facilitar o preparo das diluições e a
pasteurização no laboratório.
Foram utilizados 50mL de cada amostra de leite colocados em frascos
erlenmeyer previamente esterilizados, contendo 450mL de água peptonada 0,1%
esterilizada, obtendo-se assim, a diluição 10
-1
. A partir dessa diluição, foram feitas
diluições em série até a obtenção da diluição 10
-5
(Figura 3).
90 mL
H
2
O pept.
50 mL
450 mL H
2
O
peptonada
90 mL
H
2
O pept.
(10
-1
)
90 mL
H
2
O pept.
90 mL
H
2
O pept.
(10
-2
)(10
-3
)(10
-4
)(10
-5
)
10 mL 10 mL 10 mL 10 mL
90 mL
H
2
O pept.
50 mL
450 mL H
2
O
peptonada
90 mL
H
2
O pept.
(10
-1
)
90 mL
H
2
O pept.
90 mL
H
2
O pept.
(10
-2
)(10
-3
)(10
-4
)(10
-5
)
10 mL 10 mL 10 mL 10 mL
Figura 3 – Preparo de diluições em série
3.4 Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos, termófilos e
psicrotróficos
A partir das amostras sem diluição e das diluições 10
-1
,10
-2
,10
-3
, 10
-4
e 10
-5
realizou-se plaqueamento em profundidade em PCA (Agar Padrão de Contagem),
utilizado para contagem dos grupos microbianos, aeróbios mesófilos, psicrotróficos e
termófilos, com incubação a 35ºC/48h, 7ºC/10dias e 50ºC/48h, respectivamente (Figura
4). Transcorrido o tempo de incubação fez-se a contagem do número de colônias, com o
auxílio de um contador de colônias (Phoenix EC-589); multiplicou-se a média aritmética
das duplicatas pelo respectivo fator de diluição. Os resultados foram expressos em
UFC/mL de leite.
26
1 mL 1 mL
Estufa
35ºC / 48h
Estufa
50ºC / 48h
Incubadora
7ºC / 10 dias
10
-1
10
-2
1 mL 1 mL
10
-3
1 mL 1 mL
10
-4
1 mL 1 mL
10
-5
1 mL 1 mL
PCA
1 mL 1 mL
1 mL 1 mL
Estufa
35ºC / 48h
Estufa
50ºC / 48h
Incubadora
7ºC / 10 dias
10
-1
10
-2
1 mL 1 mL
10
-3
1 mL 1 mL
10
-4
1 mL 1 mL
10
-5
1 mL 1 mL
PCA
1 mL 1 mL
Figura 4 – Procedimento para o plaqueamento e a contagem total de mesófilos,
termófilos e psicrotróficos
3.5 Número Mais Provável de coliformes totais e fecais
De acordo com a metodologia de Vanderzant & Splittstoesser (1992),
alíquotas de 1mL das diluições 10
-1
,10
-2
,10
-3
foram transferidas para 10mL de Caldo
Verde Brilhante Lactose Bile(CVBLB 2%) em 3 séries de 5 tubos (contendo tubo de
Duhram) (Figura 5) que foram incubados por 24/48 horas a 35ºC para o teste
confirmativo de coliformes totais (Figuras 5 e 6). Após a incubação dos mesmos, foram
observados tubos que apresentaram produção de gás, dos quais com auxílio de alça
níquel-cromo foram retiradas alíquotas e transferidas para tubos com caldo EC
(contendo tubo de Duhram) e incubados por 24 horas a 45ºC para o teste confirmativo
de coliformes fecais (Figuras 5 e 6). Mediante a consulta à Tabela de Hoskins (1933)
citado por Peeler et al. (1992), foi calculado o Número Mais Provável de coliformes
totais e fecais por mililitro de leite para cada amostra.
27
Segundo a norma da ABNT (MB-3463 de 1991), há um ressalvo nessa técnica
para produtos lácteos, onde a prova presuntiva não é efetuada, sendo as inoculações
realizadas diretamente em CVBLB 2% que é um meio de cultivo bastante seletivo
devido à presença de verde brilhante e sais biliares. Portanto, o meio inibe o crescimento
de microrganismos Gram-positivos e oferece condições de desenvolvimento para
microrganismos mais adaptados às condições gastrintestinais, favorecendo o
crescimento de bactérias do grupo coliforme, que utilizam a lactose presente no meio
resultando na produção de gás.
Estufa
35ºC / 24-48h
Banho-maria
45ºC / 24h
10
-1
positivo
1 mL em cada tubo
CVBLB 2%
confirmativo
(C. totais)
EC
confirmativo
(C. fecais)
1 mL em cada tubo
10
-2
positivo
1 mL em cada tubo
10
-3
positivo
Estufa
35ºC / 24-48h
Banho-maria
45ºC / 24h
10
-1
positivo
1 mL em cada tubo
CVBLB 2%
confirmativo
(C. totais)
EC
confirmativo
(C. fecais)
1 mL em cada tubo
10
-2
positivo
1 mL em cada tubo
10
-2
positivo
1 mL em cada tubo
10
-3
positivo
Figura 5 – Procedimento para a estimativa do NMP de coliformes totais e fecais
28
Fonte: Hajdenwurcel, 1998
Figura 6 – Teste confirmativo para coliformes totais em CVBLB a 35ºC e confirmativo
para coliformes fecais a 45ºC em caldo EC
3.6 Numero Mais Provável de coliformes totais e E. coli pelo sistema SimPlate
®
As placas foram inoculadas usando diluições 10
0
e 10
-1
. Foi inoculado 1mL
das diluições no centro da placa e adicionados 9mL de meio de cultura específico para
coliformes totais e E. coli. As placas foram homogeneizadas e o excesso de meio de
cultura descartado; a seguir foram invertidas e incubadas a 35ºC por 24 horas. Após o
período de incubação, as cavidades das placas que apresentavam coloração de laranja à
púrpura eram contadas para a estimativa do NMP de coliformes totais. A seguir, as
placas eram expostas à luz UV(365nm) e as cavidades que apresentavam fluorescência
eram contadas para a estimativa do NMP de E. coli (Figura 7). O número de cavidades
positivas presentes no SimPlate
®
foi transformado em NMP de coliformes totais e
E.coli/mL de leite, através de consulta à Tabela própria do método.
29
Fonte: Hajdenwurcel, 1998
Figura 7 – Placas de SimPlate
®
mostrando teste positivo para coliformes totais (cor
púrpura) e E. coli (azul fluorescente)
3.7 Análise estatística
Para a análise estatística, as contagens foram transformadas em logarítmo de
base 10 (log X + 2). Foi utilizada análise de regressão linear simples para comparação
dos métodos de NMP (tubos múltiplos) e SimPlate
®
(SAS, 1996). A análise de regressão
é um sistema freqüentemente utilizado para descrever relação entre dois métodos
(McAllister et al., 1987). Para esta análise estatística, os critérios tradicionais de
equivalência entre os dois métodos são coeficiente angular próximo de 1,0; coeficiente
linear próximo de zero e coeficiente de correlação >0,9 (Matner et al., 1990).
3.8 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva
Para a detecção de Staphylococcus coagulase positiva foi utilizado o método
de contagem direta em placas, com semeadura em superfície e espalhamento com alça
de Drigalsky descrito por Vanderzant & Splittstoesser (1992).
30
A partir da amostra pura, alíquotas de 0,4 + 0,3 + 0,3mL, totalizando 1mL,
foram espalhadas. Também a partir da amostra pura, bem como das diluições 10
-1
e 10
-2
,
alíquotas de 0,1mL foram inoculadas e espalhadas com alça de Drigalsky (Figura 8).
Todas essas alíquotas foram espalhadas em meio Agar Baird-Parker (BPA), em placas
de Petri previamente preparadas. Após o espalhamento e secagem completa do inóculo,
as placas foram invertidas e incubadas a 35-37ºC/24-48h.
50 mL
450 mL H
2
O
peptonada
90 mL
H
2
O pept.
(10
-1
)
(10
-2
)
10 mL
0,4 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
Estufa
35ºC / 24-48h
Coloração
de Gram
Teste de
coagulase
BPA
50 mL
450 mL H
2
O
peptonada
90 mL
H
2
O pept.
(10
-1
)
(10
-2
)
10 mL
0,4 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,1 mL
0,1 mL
0,1 mL
Estufa
35ºC / 24-48h
Coloração
de Gram
Teste de
coagulase
BPA
Figura 8 - Preparo para a contagem e o isolamento de Staphylococcus coagulase positiva
Para a contagem presuntiva utilizaram-se todas as placas contendo 20 a 200
colônias e com o auxílio de um microscópio estereoscópico foram contadas as colônias
típicas, ou seja, colônias pretas (devido a redução do telurito de potássio a telureto),
circulares, pequenas, com bordas perfeitas, lisas, convexas, rodeadas por uma zona
opaca e/ou um halo transparente (lecitinase positiva) (Figura 9). Eventualmente, as
colônias atípicas, porém suspeitas, também foram selecionadas para o teste de produção
de coagulase. Normalmente estas colônias são pretas, lustrosas, de forma irregular sem
halo opaco ou transparente, podendo ser colônias de S. epidermidis. Podem aparecer
31
colônias pequenas, pretas e sem halo de clarificação que são características de
Micrococos. Também leveduras e Bacillus, eventualmente podem crescer neste meio,
porém as colônias são pardo-escuras e brancas, respectivamente, não sendo nesse caso
selecionadas para a realização da prova de coagulase.
Fonte: Hajdenwurcel, 1998
Figura 9 – Colônias típicas de Staphylococcus coagulase positiva em meio BPA
Para o teste de coagulase, retirou-se a colônia típica ou suspeita do meio BPA
com o auxílio de uma alça níquel-cromo, inoculando-a em tubo estéril de hemólise com
0,5mL de coagu-plasma. A alçada das colônias típicas ou suspeitas de Staphylococcus
foi dissolvida, atritando a ponta da alça nas paredes do tubo inclinado em mais ou menos
45º. Os tubos foram incubados a 37ºC/4h (ou até no máximo 24 horas) procurando a
formação de coágulo, que caracteriza positividade da prova.
O cálculo da população de Staphylococcus coagulase positiva foi realizado
através da contagem em placas das colônias típicas ou suspeitas e selecionadas, as quais
apresentaram resultados positivos com coagulação do plasma sanguíneo.
32
3.9 Análise de Salmonella
Para a análise de Salmonella, (Figura 10) as amostras foram submetidas a um
pré-enriquecimento, onde foram pipetados 25mL de cada amostra de leite e transferidos
para um erlenmeyer contendo 225mL de caldo lactosado esterilizado. As amostras assim
diluídas foram homogeneizadas e incubadas a 37ºC por 24h.
Para a detecção de Salmonella spp. foi utilizado o kit rápido 1-2 Test, da
BioControl. Trata-se de um método aprovado pela Association of Official Analytical
Chemists (AOAC, 2000), qualitativo para detecção das espécies móveis de Salmonella.
Uma alíquota de 0,1mL da amostra pré-enriquecida em Caldo Lactosado foi
inoculada na câmara de inoculação. O “tip” presente na tampa da câmara de motilidade,
o qual forma um vão no gel, foi retirado para a adição da solução de anticorpos.
Posteriormente, o kit inoculado com a amostra foi incubado por 14-30 horas a 35
0
C,
para poder ser observada ou não a formação da imunobanda.
25 mL
Pré
enriquecimento
Estufa
35ºC / 24h
0,1 mL
225 mL
caldo
lactosado
1-2 Test
Estufa
35ºC / 14-30h
Observação
imunobanda
25 mL
Pré
enriquecimento
Estufa
35ºC / 24h
0,1 mL
225 mL
caldo
lactosado
1-2 Test
Estufa
35ºC / 14-30h
Observação
imunobanda
Figura 10 – Procedimento para a análise de Salmonella usando o kit 1-2 test da
Biocontrol
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Padrões microbiológicos
Os resultados de todas as análises realizadas foram comparados com os
padrões microbiológicos previstos pela legislação brasileira, para os diferentes tipos de
leite.
Os padrões microbiológicos do leite foram baseados no Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento, através do Regulamento de Inspeção Industrial e
Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA), aprovado pelo decreto n.30.691,
de 29/03/52; alterado pelo decreto n. 1.255 de 25/06/62 (Brasil, 1980). Esse padrão foi
usado no presente trabalho, para verificar as mudanças da legislação em comparação
com as legislações do DIPOA (Brasil, 2002) e ANVISA (Brasil, 2001), as quais estão
em vigor.
Os padrões microbiológicos para leite estabelecidos pelo Departamento de
Inspeção de Produtos de Origem Animal (DIPOA) encontram-se na Instrução Normativa
nº 51 de 18/09/02 (Brasil, 2002) e os da Agência Nacional de Vigilância Sanitária -
ANVISA, na Resolução RDC nº 12 de 02/01/01 do Ministério da Saúde (Brasil, 2001).
Os 3 padrões microbiológicos citados e que foram utilizados na presente
pesquisa para avaliação das condições microbiológicas das amostras de leite analisadas,
encontram-se nas Tabelas 1, 2 e 3.
34
Tabela 1. Padrões microbiológicos para o leite tipo A, B e demais tipos
Microrganismos Leite
A B Demais Tipos
Antes da
Past
Após Past Antes da
Past
Após Past Antes da
Past
Após Past
Contagem Total de
Mesófilos
(UFC/mL)
1,0x10
4
5,0x10
2
5,0x10
5
4,0x10
4
_ 1,5x10
5
Coliformes Fecais
(NMP/mL)
Ausência em 1mL 1 5
Salmonella (25mL) Ausência Ausência Ausência
Fonte: RIISPOA (Regulamento de Inspeção Industrial de Produtos de Origem Animal),
1980
Tabela 2. Padrões microbiológicos para o leite tipo A, B e C
Microrganismos Leite
A B C
Contagem padrão em
Placas (UFC/mL)
1,0 x 10
3
8,0 x 10
4
3,0 x 10
5
Coliformes Totais
(NMP/mL)
< 1 5 4
Coliformes Fecais
(NMP/mL)
Ausência 2 2
Salmonella (25mL) Ausência Ausência Ausência
Fonte: DIPOA (Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal), 2002
Tabela 3. Padrões microbiológicos para leite pasteurizado (todos os tipos)
Microrganismos Leite Pasteurizado
Coliformes a 45ºC (NMP/mL) 1 - 4
Salmonella (25mL) Ausência
Fonte: ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), 2001
4.2 Contagem total de aeróbios mesófilos, termófilos e psicrotróficos
Após a incubação a 35ºC/48h (mesófilos), 7ºC/10dias (psicrotróficos) e
50ºC/48h (termófilos) realizou-se a contagem de colônias para as amostras de leite
pasteurizado tipos A, B, C e leite cru antes e após a pasteurização em laboratório (Tabela
4). Também foi feita a média das contagens para os tipos de leite analisados e os valores
foram transformados (Log x+2) (Figura 11) para melhor visualização dos dados.
35
Tabela 4. Contagens totais de aeróbios mesófilos, termófilos e psicrotróficos pelo
método convencional (PCA) em amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C
e leite cru, obtidas no comércio de Piracicaba, antes e após a pasteurização
em laboratório
Amostras Mesófilos Mesof Past. Termófilos Termof
Past.
Psicrotróficos Psicrot
Past.
(UFC/mL)
A I 1 2,2 x 10
3
2,3 x 10
2
1,0 x 10
1
0 1,9 x 10
2
1,1 x 10
1
A I 2 2,9 x 10
3
8,0 x 10
2
0 0 1,6 x 10
2
6,0 x 10
1
A I 3 1,6 x 10
6
1,8 x 10
3
1,6 x 10
2
8,5 x 10
2
8,3 x 10
2
2,6 x 10
1
A II 4 1,9 x 10
3
1,9 x 10
2
2,5 x 10
1
1,3 x 10
1
2,7 x 10
2
0
A II 5 1,0 x 10
3
1,0 x 10
2
1,0 x 10
1
5 1,2 x 10
2
0
A II 6 2,6 x 10
2
7,0 x 10
1
3,6 x 10
1
1,9 x 10
1
2,4 x 10
2
0
A III 7 3,6 x 10
2
3,5 x 10
1
0 0 2,0 x 10
2
1,5 x 10
1
A III 8 1,7 x 10
2
6,1 x 10
1
1,0 x 10
1
0 1,3 x 10
2
0
A III 9 1,7 x 10
2
2,4 x 10
1
0 0 1,9 x 10
1
0
média 1,8 x 10
5
3,7 x 10
2
1,1 x 10
2
2,2 x 10
1
2,3 x 10
2
1,2 x 10
1
B I 1 1,1 x 10
4
4,5 x 10
3
1,5 x 10
1
0 1,6 x 10
2
0
B I 2 8,7 x 10
3
4,3 x 10
3
0 0 5,5 x 10
1
0
B I 3 1,6 x 10
4
1,5 x 10
3
0 0 7,4 x 10
2
0
B II 4 7,2 x 10
2
1,3 x 10
2
5 0 3,5 x 10
1
0
B II 5 95 x 10
2
7,5 x 10
1
1,0 x 10
1
5 6,0 x10
1
0
B II 6 9,1 x 10
2
1,0 x 10
2
1,5 x 10
1
1,0 x 10
1
1,2 x 10
2
0
B III 7 1,4 x 10
3
4,5 x 10
1
1,2 x 10
1
0 3,5 x 10
1
0
B III 8 1,4 x 10
3
6,5 x 10
1
1,5 x 10
1
0 1,2 x 10
1
5
B III 9 1,3 x 10
3
2,5 x 10
1
1,0 x 10
1
0 6,0 x 10
1
0
média 4,7 x 10
3
1,2 x 10
3
9,1 1,7 1,4 x 10
2
0,5
C I 1 3,0 x 10
3
8,3 x 10
2
0 0 2,1 x 10
3
1,6 x 10
2
C I 2 6,0 x 10
3
4,0 x 10
2
1,5 x 10
1
0 4,5 x 10
3
1,0 x 10
2
C I 3 8,7 x 10
3
6,1 x 10
2
1,0 x 10
1
0 1,1 x 10
3
1,3 x 10
2
C II 4 2,5 x 10
4
2,5 x 10
3
4,5 x 10
1
2,5 x 10
1
7,5 x 10
2
6,5 x 10
1
C II 5 1,3 x 10
4
1,8 x 10
3
1,0 x 10
1
0 5,5 x 10
3
9,0 x 10
1
C II 6 2,0 x 10
4
3,0 x 10
3
2,0 x 10
1
1,0 x 10
1
8,0 x 10
2
4,5 x 10
1
C III 7 4,0 x 10
2
3,5 x 10
1
1,3 x 10
2
7,0 x 10
1
1,1 x 10
2
1,0 x 10
1
C III 8 6,4 x 10
2
1,0 x 10
1
5,5 x 10
1
3,0 x 10
1
7,0 x 10
1
5
C III 9 7,6 x 10
2
1,5 x 10
1
6,5 x 10
1
3,5 x 10
1
4,5 x 10
1
3
média 8,6 x 10
3
1,0 x 10
3
3,9 x 10
1
1,9 x 10
1
1,6 x 10
3
6,8 x 10
1
Cru 1 5,8 x 10
7
7,1 x 10
2
1,5 x 10
1
1,0 x 10
1
1,1 x 10
2
0
Cru 2 9,1 x 10
7
8,0 x 10
2
5 5 6,5 x 10
3
0
Cru 3 2,5 x 10
6
3,3 x 10
3
4,0 x 10
1
3,0 x 10
1
8,5 x 10
3
5
média 5,1 x 10
7
1,6 x 10
3
2,0 x 10
1
1,5 x 10
1
5,0 x 10
3
1,7
A-B-C-Cru: tipos de leite
I-II-III: marca
Números: número de amostras
36
0
2
4
6
8
10
mesófilos mesófilos past termófilos termófilos past psicrotróficos psicrotróficos past
Aeróbios
Log x+2
A B C Cru
Figura 11 – Médias das contagens de mesófilos, termófilos e psicrotróficos, antes e após
a pasteurização (past) em laboratório
4.2.1 Aeróbios mesófilos
Nas amostras de leite do tipo A, as contagens de mesófilos (Tabela 4)
variaram de 1,7 x 10
2
a 1,6 x 10
6
UFC/mL, sendo que 4 (44,4%) amostras apresentaram
valores acima dos tolerados pelo Departamento de Inspeção de Produtos de Origem
Animal - DIPOA (Brasil, 2002) e 5 (55,6%) amostras acima dos padrões mencionados
pelo RIISPOA (Brasil, 1980).
Nas amostras de leite tipo B os valores encontrados nas contagens de
mesófilos variaram de 7,2 x 10
2
a 1,6 x 10
4
UFC/mL, portanto, nenhuma amostra
analisada apresentou contagens acima das toleradas pelos padrões do RIISPOA (Brasil,
1980) e do DIPOA (Brasil, 2002).
Nas amostras de leite tipo C, as contagens de mesófilos variaram de 4,0 x 10
2
a 2,5 x 10
4
UFC/mL, portanto, também nenhuma amostra apresentou irregularidade em
relação aos padrões citados anteriormente.
No caso da amostra AII5, em relação à contagem de microrganismos
mesófilos, vale destacar que a legislação DIPOA (Brasil, 2002) é menos exigente em
37
relação a que estava em vigência em 1980. Esta amostra não seria aprovada como foi
pela legislação em vigor.
Após a nova pasteurização no laboratório das amostras de leite tipos A, B e C,
somente uma amostra (11,1%) de leite tipo A apresentou valor acima do permitido pela
legislação, já que esta se encontrava muito contaminada quando foi obtida no comércio
(1,6 x 10
6
UFC/mL).
As 3 amostras de leite cru analisadas apresentaram contagens de mesófilos
entre 2,5 x 10
6
e 9,1 x 10
7
UFC/mL. Pelos valores citados na Tabela 1, tais amostras não
estariam satisfazendo as exigências para contagem de mesófilos em leite tipos A e B,
antes da pasteurização. No entanto, após a pasteurização (62,8ºC/30’) no laboratório, 2
(66,7%) atenderiam aos padrões DIPOA (Brasil, 2002) para leite pasteurizado tipo A e 1
(33,3%) atenderia aos padrões do mesmo órgão para leite pasteurizado tipo B. Se a
comparação fosse feita com os padrões RIISPOA (Brasil, 1980), as 3 amostras de leite
cru, após a pasteurização no laboratório, atenderiam as especificações para leite
pasteurizado tipo B.
No trabalho de Tavares (1996) os valores encontrados em 24 amostras de leite
pasteurizado tipo A analisadas variaram de 8,5 x 10
1
a 3,7 x 10
5
UFC de mesófilos/mL.
Em 36 amostras de leite pasteurizado tipo B os valores variaram de 1,8 x 10
4
a 5,2 x
10
6
UFC de mesófilos/mL e em 48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores
tiveram variação de 5,2 x 10
3
a 1,6 x 10
7
UFC de mesófilos/mL.
Nader Filho et al. (1997) observaram que de 28 amostras de leite pasteurizado
tipo A integral analisadas, 3 (10,7%) tiveram valores de mesófilos acima dos permitidos
pela legislação.
Na presente pesquisa, os percentuais de amostras em desacordo com os
padrões estabelecidos para a contagem de mesófilos em leite pasteurizado tipo A,
superaram os valores encontrados por Santos et al. (1999).
Os valores das contagens de mesófilos, realizadas por Freitas et al. (2002),
foram de 1,0 x 10
1
a 2,3 x 10
7
UFC/mL em 13 amostras de leite pasteurizado tipo A
integral, 1,0 x 10
1
a 2,5 x 10
7
UFC/mL em 13 amostras de leite pasteurizado desnatado,
1,0 x 10
1
a incontáveis em 31 amostras de leite pasteurizado tipo C, 9,2 x 10
5
a
38
incontáveis em 12 amostras de leite cru.
Nader Filho (1996) ao avaliar características microbiológicas das amostras de
leite pasteurizado tipo B, colhidas logo após o envase, em algumas usinas de
beneficiamento do Estado de São Paulo, subordinadas ao Serviço de Inspeção Federal
(SIF), observaram que 65% das amostras analisadas apresentavam-se fora dos padrões
legais.
Os percentuais de amostras acima dos padrões para a contagem de mesófilos
no leite tipo B, foram inferiores aos valores encontrados por Santos et al. (1999) e
Polegato (1999).
Wendpap & Rosa (1997) observaram que de 50 amostras de leite pasteurizado
tipo C, 8 (16%) estavam em desacordo com os padrões microbiológicos. Comparando
estes resultados à pesquisa de Wendpap & Rosa (1995), observa-se que houve queda da
qualidade microbiológica deste produto, visto que na ocasião 3% das unidades amostrais
apresentavam contagens microbiológicas acima dos padrões.
No trabalho de Leite et al. (2002) as contagens de bactérias aeróbias mesófilas
variaram entre 1,4 x 10
2
a 2,2 x 10
6
UFC/mL, das quais, apenas uma amostra
encontrava-se fora do valor limite aceitável para padrão de leite tipo C.
Na presente pesquisa, os percentuais de amostras em desacordo com os
padrões estabelecidos para a contagem de mesófilos em leite pasteurizado tipo C foram
inferiores aos valores encontrados por Wendpap & Rosa (1995), Wendpap & Rosa
(1997), Gonçalves & Franco (1998), Hoffman et al. (1999), Padilha & Fernandes (1999),
Polegato (1999), Santos et al. (1999), Leite Jr & Torrano (2000) e Freitas et al. (2002). A
média percentual encontrada por esses autores foi 39% de amostras de leite tipo C acima
dos limites impostos pela legislação.
Na pesquisa realizada por Vieira et al. (1995), foram encontradas contagens de
mesófilos acima de 6,8 x 10
6
UFC/mL em 8 amostras de leite cru.
Santos & Bergmann (2003) estudando amostras de leite cru transportadas em
temperatura ambiente, observaram que 57,6% apresentaram contagens de 7,0 x 10
6
,
enquanto Chung et al. (1984) observaram que em 56,4% das amostras que foram
deixadas por 3 horas à temperatura ambiente, antes da realização da análise, as
39
contagens estiveram acima de 4,0 x 10
6
UFC/mL.
Villar et al. (1996) encontraram contagens de mesófilos (logUFC/mL)
variando de 4,26 a 5,61 com média de 4,88. Também as contagens encontradas por
Mutukumira et al. (1996) em 10 amostras de leite cru mantido à temperatura de 4ºC,
variaram de 6,2 x 10
3
a 7,8 x 10
7
UFC/mL. Em 98,4% das amostras encontraram-se
valores acima de 1,0 x 10
5
UFC/mL. No trabalho de Barros et al. (1999), 87% das
amostras mantidas sob a refrigeração tiveram valores de mesófilos dentro dos padrões
exigidos pela legislação.
Os valores encontrados no presente trabalho para as contagens de mesófilos no
leite cru, foram parecidos aos valores encontrados por Freitas et al. (2002).
Hoje, tanto os padrões da ANVISA (Brasil, 2001) como os do DIPOA (Brasil,
2002), não mencionam parâmetros microbiológicos para leite cru.
Nota-se uma certa coerência entre os % de amostras de leite pasteurizado tipo
A analisadas na presente pesquisa para mesófilos aeróbios e que se mostraram fora dos
padrões DIPOA (Brasil, 2002) com os resultados mencionados pelos trabalhos citados.
Em relação às amostras de leite pasteurizado tipos B e C, analisadas no presente
trabalho, se apresentaram em melhores condições microbiológicas para as contagens de
mesófilos aeróbios, uma vez que 100% delas estiveram em conformidade com os
padrões DIPOA (Brasil, 2002).
4.2.2 Aeróbios psicrotróficos
Atualmente não existe uma legislação referente a contagens de psicrotróficos
para leite, portanto, não existem muitos trabalhos enfocando esse grupo de
microrganismos.
No presente trabalho as contagens de psicrotróficos, considerando todas as
amostras analisadas (leite A, B, C e cru) variaram de 1,2 x 10
1
a 8,5 x 10
3
UFC de
psicrotróficos/mL.
Segundo Sorhaung & Stepaniak (1997) as alterações organolépticas e
estruturais de queijos, causadas por enzimas proteolíticas de psicrotróficos foram
40
encontradas quando as contagens desses microrganismos no leite estavam entre 2,0 x 10
6
a 2,0 x 10
8
UFC/mL. Pode se inferir que todas as amostras de leite analisadas neste
trabalho não deveriam ter alterações organolépticas devido a microrganismos
psicrotróficos, pois as contagens estiveram muito abaixo das mencionadas no trabalho
citado.
Na pesquisa de Tavares (1996) os valores encontrados em 24 amostras de leite
pasteurizado tipo A variaram de 1,1 x 10
2
a 5,9 x 10
3
UFC de psicrotróficos/mL. Em 36
amostras de leite pasteurizado tipo B os valores variaram de 1,2 x 10
2
a 4,6 x 10
4
UFC de
psicrotróficos/mL e em 48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores tiveram
variação de 1,2 x 10
2
a 3,4 x 10
5
UFC de psicrotróficos/mL. Tais contagens, de uma
forma geral, estiveram bem acima das encontradas na presente pesquisa.
Os psicrotróficos termodúricos constituem um importante grupo de
microrganismos que, além de multiplicarem-se bem a temperatura de refrigeração,
podem sobreviver à temperatura de pasteurização. Estes são classificados como Gram-
positivos formadores ou não de esporos, pertencentes principalmente ao gênero Bacillus
(Muir, 1996; Santos ,1999; Sorhaung & Stepaniak, 1997).
Normalmente, as enzimas proteolíticas (termoestáveis) produzidas por
psicrotróficos promovem quebra de proteínas, provocando alterações físicas e
organolépticas que comprometem o consumo e a produção de derivados do leite
(Santos,1999; Shah,1994).
4.2.3 Aeróbios termófilos
Assim como para os microrganismos psicrotróficos, não existe uma legislação
referente a contagens de microrganismos termófilos para leite, portanto, não existem
muitos trabalhos enfocando esse grupo de microrganismos.
No presente trabalho, as contagens de termófilos variaram de <10 a 1,6 x 10
2
UFC/mL. Não foi encontrada nenhuma referência bibliográfica atual a respeito de
termófilos em leite, talvez por não haver legislação recente que estipule a tolerância
desse grupo de microrganismos nesse substrato.
41
No trabalho de Tavares (1996) os valores encontrados em 24 amostras de leite
pasteurizado tipo A variaram de 2,0 x 10
1
a 3,8 x 10
3
UFC de termófilos/mL. Em 36
amostras de leite pasteurizado tipo B os valores variaram de 2,5 x 10
1
a 1,5 x 10
4
UFC de
termófilos/mL e em 48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores tiveram variação
de 5,0 x 10
1
a 2,3 x 10
5
UFC de termófilos/mL. Aqui também as contagens de termófilos
foram superiores às encontradas na presente pesquisa para o mesmo grupo de
microrganismos.
Nota-se que o maior valor encontrado na presente pesquisa em relação aos
microrganismos termófilos foi em uma amostra de leite tipo A enquanto no trabalho de
Tavares (1996) foi em leite tipo C.
É importante salientar que a legislação deveria também se preocupar com
outros tipos de bactérias que possam causar alterações organolépticas e
conseqüentemente perda nutricional do leite, como por exemplo, psicrotróficos e
termófilos.
4.3 NMP de coliformes totais
Na Tabela 5, estão representados os NMP de coliformes totais presentes nos
leites de diferentes marcas dos tipos A, B, C e cru, analisadas pelo método convencional
(tubos múltiplos) e SimPlate
®
. Também foi feita a média dos valores para os tipos de
leite analisados (Figura 12) para melhor visualização dos dados.
42
Tabela 5. Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais pelo método convencional
(tubos múltiplos) e Simplate
®
, obtido em amostras de diferentes tipos de leite
coletados no comércio de Piracicaba antes e após pasteurização em laboratório
Amostras Tubos Múltiplos
(NMP/mL)
Tubos Múltiplos
Past. (NMP/mL)
SimPlate
(NMP/mL)
SimPlate
Past.(NMP/mL)
A I 1 <2 <2 <2 <2
A I 2 2 <2 6 <2
A I 3 2,1 x 10
1
2 7,3 x 10
1
<2
A II 4 6 <2 8 <2
A II 5 4 <2 4 <2
A II 6 2 <2 2 <2
A III 7 4 <2 4 <2
A III 8 <2 <2 <2 <2
A III 9 <2 <2 <2 <2
média 4,3 0,2 1,1 x 10
1
0
B I 1 2,1 x 10
1
<2 3,2 x 10
1
<2
B I 2 7 <2 1,2 x 10
1
<2
B I 3 7,9 x 10
1
<2 9,6 x 10
1
<2
B II 4 <2 <2 <2 <2
B II 5 <2 <2 <2 <2
B II 6 <2 <2 <2 <2
B III 7 <2 <2 <2 <2
B III 8 2 <2 2 <2
B III 9 <2 <2 <2 <2
média 1,2 x 10
1
0 1,6 x 10
1
0
C I 1 <2 <2 <2 <2
C I 2 <2 <2 <2 <2
C I 3 <2 <2 <2 <2
C II 4 2 <2 2 <2
C II 5 <2 <2 <2 <2
C II 6 <2 <2 <2 <2
C III 7 <2 <2 <2 <2
C III 8 <2 <2 <2 <2
C III 9 <2 <2 <2 <2
Média 0,2 0 0,2 0
Cru 1 1,1 x 10
2
<2 2,6 x 10
1
<2
Cru 2 4,9 x 10
1
<2 2,2 x 10
1
<2
Cru 3 1,6 x 10
3
<2 7,4 x 10
2
<2
média 5,9 x 10
2
0 2,6 x 10
2
0
A-B-C-Cru: tipos de leite
I-II-III: marca
Números: número de amostras
43
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
tubos múltiplos tubos múltiplos past simplate simplate past
Métodos
Log x+2
A B C CRU
Figura 12 – Médias do NMP de coliformes totais encontradas para as amostras de leite
pasteurizado tipos A, B, C e leite cru analisadas antes da pasteurização no
laboratório e após a mesma
Vale lembrar que a menção < 2NMP/mL diz respeito à ausência de tubos
positivos, ou seja, nenhum dos tubos inoculados mostrou fermentação da lactose com
produção de gás. Assim, para o cálculo das médias e para a análise estatística dos dados,
a fim de estabelecer comparação entre os métodos NMP (tubos múltiplos) e Simplate
®
,
tais valores foram considerados como zero, ou ausência de coliformes/mL de leite.
Segundo a Instrução Normativa nº51, do Departamento de Inspeção de
Produtos de Origem Animal – DIPOA (Brasil, 2002), a tolerância para coliformes totais
no leite pasteurizado tipos A, B e C é <1, 5 e 4 NMP/mL, respectivamente. Atualmente a
RDC nº12 – ANVISA (Brasil, 2001) somente refere-se à tolerância de até 4 NMP de
coliformes a 45ºC/mL de leite pasteurizado.
44
4.3.1 Análise de coliformes totais por tubos múltiplos
As amostras de leite pasteurizado tipos A, B e C e do leite cru apresentaram
valores variando de <2 a 2,1 x 10
1
; <2 a 7,9 x 10
1
; <2 a 2 e 4,9 x 10
1
a 1,6 x 10
3
NMP de
coliformes totais/mL, respectivamente. Em relação ao leite tipo A, 6 (66,7%) amostras
estiveram fora dos padrões exigidos pelo Departamento de Inspeção de Produtos de
Origem Animal – DIPOA (Brasil, 2002). Para o leite tipos B e C, 3 (33,3%) amostras e
0(0,0%) amostras, respectivamente, estiveram fora dos padrões exigidos pelo DIPOA.
As 3 amostras de leite cru apresentaram valores elevados, mas vale salientar que não
existem parâmetros microbiológicos para o mesmo. Os valores encontrados como NMP
de coliformes totais/mL de leite cru foram muito superiores aos encontrados para as
amostras de leite pasteurizado, reforçando a importância da pasteurização do leite.
Enfatizando a importância da pasteurização do leite, basta verificar que tal processo
realizado no laboratório levou as amostras adquiridas de leite cru, a apresentarem
ausência de coliformes após o tratamento térmico.
Ao pasteurizar todas as amostras no laboratório, os valores diminuíram
drasticamente, permanecendo acima do padrão apenas uma amostra de leite tipo A e,
mesmo assim, com apenas 2NMP/mL. Devido a tal constatação, algumas hipóteses
podem ser levantadas em relação as amostras de leite pasteurizado adquiridas para a
presente pesquisa: matéria-prima excessivamente contaminada, pasteurização industrial
não adequada, condições de transporte, distribuição, armazenamento e comercialização
do leite nos pontos de venda inadequadas, o que teria permitido sobrevivência e
multiplicação bacteriana.
4.3.2 Análise de coliformes totais pelo método SimPlate
®
Pelo método SimPlate
®
, as amostras de leite pasteurizado tipos A, B e C e o
leite cru apresentaram contagens variando de <2 a 7,3 x 10
1
; <2 a 9,6 x 10
1
; <2 a 2 e 2,2
x 10
1
a 7,3 x 10
2
NMP de coliformes totais/mL, respectivamente. Em relação ao leite tipo
A, 6 (66,7%) amostras estiveram acima dos padrões exigidos pelo Departamento de
45
Inspeção de Produtos de Origem Animal (DIPOA). Para o leite tipos B e C, 3 (33,3%) e
0 (0,0%) amostras, respectivamente, estiveram acima dos padrões exigidos pelo DIPOA.
Nota-se que os mesmos percentuais de amostras consideradas fora dos padrões do
DIPOA (Brasil, 2002) para coliformes totais, quando se utilizou a metodologia
SimPlate
®
, foram encontrados para as mesmas amostras analisadas para coliformes
totais quando a metodologia utilizada foi a de tubos múltiplos. As 3 amostras do leite cru
também apresentaram valores elevados, embora os padrões para esse tipo de leite não
sejam mencionados pelos parâmetros citados no presente trabalho. As contagens de
coliformes totais/mL de leite cru foram superiores aos encontrados para as amostras de
leite pasteurizado, o que mostra a eficácia da pasteurização na destruição bacteriana.
Após a pasteurização de todas as amostras de leite no laboratório, os valores
não estiveram acima do padrão em nenhuma amostra analisada pelo sistema SimPlate
®
.
O número de amostras fora dos padrões na contagem de coliformes totais no
leite tipo A e no leite tipo B superaram os valores encontrados por Wendpap & Rosa
(1995), Santos et al. (1999), Leite Jr & Torrano (2000). Os valores encontrados por esses
pesquisadores variaram de 5 a 5,9 x 10
1
NMP coliformes totais/mL.
Na pesquisa de Freitas et al. (2002), das 37 amostras de leite pasteurizado
desnatado tipo B analisadas, 10 (27%) excederam o padrão microbiológico para
coliformes totais. Em relação ao leite pasteurizado tipo C, de 51 amostras analisadas, 10
(19,6%) excederam o limite para coliformes totais e as amostras de leite cru analisadas
apresentaram valores entre 5,1 x 10 e 7,9 x 10
2
NMP de coliformes totais/mL.
O número de amostras fora dos padrões na contagem de coliformes totais no
leite pasteurizado tipo C, encontrado no presente trabalho, foi inferior aos encontrados
por Wendpap & Rosa (1995), Nader Filho (1996), Wendpap & Rosa (1997), Gonçalves
& Franco (1998), Padilha & Fernandes (1999), Santos et al. (1999), Leite Jr & Torrano
(2000) e Freitas et al. (2002). Os valores encontrados por esses pesquisadores variaram
de 8 a 1,7 x 10
2
NMP/mL.
No trabalho de Tavares (1996) os valores encontrados em 24 amostras de leite
pasteurizado tipo A variaram de 0,36 a 29 NMP de coliformes totais/mL. Em 36
amostras de leite pasteurizado tipo B os valores variaram de 0,91 a >110 NMP de
46
coliformes totais/mL e em 48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores tiveram
variação de 0,36 a >110 NMP de coliformes totais/mL sendo, portanto, de uma forma
geral, superiores aos encontrados na presente pesquisa.
Os valores de NMP para coliformes totais, no leite cru, encontrados na
presente pesquisa foram superiores aos valores citados por Freitas et al. (2002), valendo
ressaltar que no presente trabalho foram utilizadas menos amostras.
Vieira et al. (1995), encontraram em relação a coliformes totais valores entre
4,5 x 10
1
e 1,2 x 10
3
NMP/mL em 8 amostras de leite cru. Tanto os padrões do DIPOA
(Brasil, 2002) e da ANVISA (Brasil, 2001) não citam parâmetros para leite cru.
4.4 Número Mais Provável (NMP) de coliformes fecais
Na Tabela 6, são apresentados os NMP de coliformes fecais (45ºC)
encontrados nas amostras de leites pasteurizados de diferentes marcas dos tipos A, B, C
e leite cru, analisadas pelo método convencional (tubos múltiplos) e de E. coli pelo
método SimPlate
®
. Nesta Tabela, o valor <2 foi considerado zero, tanto para o cálculo
das médias, como para a análise estatística, a fim de se estabelecer comparação entre os
métodos NMP (tubos múltiplos) e SimPlate
®
. Também foi feita a média dos valores para
os tipos de leite analisados (Figura 13) para melhor visualização dos dados.
47
Tabela 6. Número Mais Provável (NMP) de coliformes à 45ºC pelo método
convencional (tubos múltiplos) e E. coli pelo Simplate
®
encontrado em
amostras de leite obtidas no comércio de Piracicaba antes e após
pasteurização em laboratório
Amostras Tubos
Múltiplos
(NMP/mL)
Tubos Múltiplos
Past. (NMP/mL)
SimPlate
(NMP/mL)
SimPlate
Past.(NMP/mL)
A I 1 <2 <2 <2 <2
A I 2 2 <2 <2 <2
A I 3 2,8 x 10
1
<2 2,1 x 10
1
<2
A II 4 4 <2 2 <2
A II 5 4 <2 2 <2
A II 6 4 <2 2 <2
A III 7 <2 <2 <2 <2
A III 8 <2 <2 <2 <2
A III 9 <2 <2 <2 <2
média 4,7 0 3 0
B I 1 1,4 x 10
1
<2 1,0 x 10
1
<2
B I 2 6 <2 4 <2
B I 3 2,4 x 10
1
<2 1,7 x 10
1
<2
B II 4 <2 <2 <2 <2
B II 5 <2 <2 <2 <2
B II 6 <2 <2 <2 <2
B III 7 <2 <2 <2 <2
B III 8 <2 <2 <2 <2
B III 9 <2 <2 <2 <2
média 4,9 0 3,4 0
C I 1 <2 <2 <2 <2
C I 2 <2 <2 <2 <2
C I 3 <2 <2 <2 <2
C II 4 2 <2 2 <2
C II 5 <2 <2 <2 <2
C II 6 <2 <2 <2 <2
C III 7 <2 <2 <2 <2
C III 8 <2 <2 <2 <2
C III 9 <2 <2 <2 <2
média 0,2 0 0,2 0
Cru 1 4,6 x 10
1
<2 1,2 x 10
1
<2
Cru 2 2,2 x 10
1
<2 8 <2
Cru 3 9,2 x 10
2
<2 3,7 x 10
2
<2
média 3,3 x 10
2
0 1,3x 10
2
0
A-B-C-Cru: tipos de leite
I-II-III: marca
Números: número de amostras
48
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
tubos múltiplos tubos múltiplos past simplate simplate past
Métodos
Log x+2
A B C CRU
Figura 13 – Médias do NMP de coliformes fecais (45ºC) obtidas pela técnica dos tubos
múltiplos e de E. coli pelo método SimPlate
®
, encontradas para as amostras
de leite tipos A, B, C e leite cru analisadas antes da pasteurização no
laboratório e após a mesma
4.4.1 Análise de coliformes fecais por tubos múltiplos
As amostras de leite pasteurizado tipo A analisadas no presente trabalho
apresentaram valores de coliformes fecais variando de <2 a 2,8 x 10
1
NMP/mL. Tanto
para o Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal – DIPOA (Brasil,
2002), quanto para o RIISPOA (Brasil, 1980), 5 (55,6%) amostras estariam acima do
padrão estabelecido para coliformes fecais. Para a ANVISA (Brasil, 2001), 4 amostras
(14,8%) (1 do leite tipo A e 3 do tipo B) estariam com valores acima do tolerado, já que
esta legislação não utiliza a classificação para os tipos de leite pasteurizado.
No leite tipo B, 3 (33,3%) amostras analisadas estiveram em desacordo com a
legislação do DIPOA (Brasil, 2002) e RIISPOA (Brasil, 1980). Os valores variaram de
<2 a 2,4 x 10
1
NMP/mL.
Os valores obtidos para leite tipo C variaram de <2 a 2NMP/mL, portanto de
acordo com os padrões tolerados para coliformes fecais estabelecidos pelos órgãos
mencionados.
49
As amostras de leite cru apresentaram valores elevados nas 3 amostras
analisadas, com variação entre 4,6 e 9,2 x 10
2
NMP de coliformes fecais/mL. Ao serem
pasteurizadas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos da ESALQ/USP, todas as
amostras apresentaram valores <2 NMP/mL de coliformes fecais, confirmando o
benefício deste tratamento térmico na redução da carga bacteriana.
4.4.2 Análise de E. coli pelo método SimPlate
®
Pelo método SimPlate
®
, o leite tipo A apresentou valores que variaram de <2 a
2,1 x 10
1
NMP de E.coli/mL, sendo que 4 (44,4%) amostras analisadas apresentaram-se
fora do padrão imposto pelo RIISPOA (Brasil, 1980) e pelo Departamento de Inspeção
de Produtos de Origem Animal – DIPOA (Brasil, 2002). Quando comparado aos
padrões da ANVISA (Brasil, 2001), 3 amostras (11,1%) (1 do leite tipo A e 2 do tipo B)
analisadas estiveram acima do valor preconizado, embora esta legislação não mencione
os tipos de leite, classificando apenas como leite pasteurizado.
Para o leite tipo B, 3 (33,3%) amostras analisadas na presente pesquisa
apresentaram-se em desacordo à legislação do RIISPOA (Brasil, 1980) e do
Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal – DIPOA (Brasil, 2002). Os
valores encontrados variaram de <2 a 1,7 x 10
1
NMP de E.coli/mL.
Os valores encontrados para as amostras de leite tipo C analisadas variaram de
<2 a 2 NMP de E.coli/mL sendo que nenhuma amostra esteve acima dos padrões
previstos na legislação brasileira. Ao se realizar a pasteurização no laboratório de
microbiologia de alimentos, todas as amostras, inclusive as de leite cru, apresentaram
valores <2 NMP de E.coli/mL.
A presença de coliformes fecais acima dos limites estabelecidos pela
legislação em muitas das amostras analisadas serve de alerta para o risco que a
população está sujeita ao consumir leite pasteurizado. Cabe lembrar que a pasteurização
do leite foi estabelecida para melhorar suas qualidades nutricionais evitando exposição
ao calor excessivo da fervura e eliminando os microrganismos patogênicos acaso
presentes.
50
A presença de coliformes fecais acima dos limites estabelecidos pela
legislação evidencia riscos quanto a presença de patógenos intestinais. Tais riscos devem
servir como alerta aos órgãos fiscalizadores, para que melhores práticas de fabricação
sejam implementadas, bem como melhor monitoramento de pontos críticos e de controle
seja efetuado, a fim de que a população que consome tais produtos, não fique exposta a
riscos de toxinfecções alimentares.
O número de amostras de leite tipo A e do tipo B analisadas no presente
trabalho que se mostraram acima dos padrões legais quanto à enumeração de coliformes
fecais, superaram os valores encontrados por Santos et al. (1999).
Nader Filho et al. (1997) revelaram que em 140 amostras de leite pasteurizado
tipo A integral, processado por mini e micro-usinas, 19 (13,5%) estavam acima do limite
em relação aos coliformes fecais.
Na pesquisa de Tavares (1996) não foram encontrados coliformes fecais em
24 amostras de leite pasteurizado tipo A analisadas. Em 36 amostras de leite
pasteurizado tipo B os valores variaram de 0,3 a 2,8 NMP de coliformes fecais/mL e em
48 amostras de leite pasteurizado tipo C os valores tiveram variação de 0,36 a 24 NMP
de coliformes fecais/mL.
Neste trabalho, os percentuais de amostras de leite pasteurizado tipos A e B
que estiveram fora dos padrões estabelecidos pela legislação vigente, quanto a
coliformes fecais, superaram os encontrados por Santos et al. (1999) e Leite Jr &
Torrano (2000).
O número de amostras fora dos padrões na contagem de coliformes fecais no
leite pasteurizado tipo C encontrado na presente pesquisa foi inferior aos determinados
por Wendpap & Rosa (1995), Nader Filho (1996), Wendpap & Rosa (1997), Hoffman et
al. (1999), Padilha & Fernandes (1999), Santos et al. (1999), Leite Jr & Torrano (2000) e
Freitas et al. (2002). Os valores encontrados por esses pesquisadores variaram de 7,0 a
6,8 x 10
1
NMP/mL.
No trabalho de Vieira et al. (1995), foi detectada a presença de coliformes
fecais em 8 amostras de leite cru. Os valores estavam entre 2,8 x 10
1
e 9,4 x 10
2
51
NMP/mL Tanto os padrões do DIPOA (Brasil, 2002) e da ANVISA (Brasil, 2001) não
citam parâmetros para leite cru.
Catão & Ceballos (2001) evidenciaram elevada contaminação por coliformes
totais e fecais em amostras de leite cru e pasteurizado. Das 30 amostras analisadas, 10
(33,3%) apresentaram contaminação por coliformes totais e 3 (10%) para coliformes
fecais acima dos padrões vigentes.
Em 511 análises realizadas em leites tipos A, B e C, 94 (18,4%) amostras de
leite tipo C apresentaram-se acima do limite máximo preconizado para coliformes totais.
Em relação aos coliformes fecais, 65 (12,7%) amostras estiveram com contagens acima
do limite para o leite tipo C (Santos , 1999).
Segundo Leite Jr. & Torrano (1997) a variação sazonal evidencia as maiores
ocorrências médias mensais para coliformes totais e fecais em leite. Para coliformes
totais, as maiores médias, ocorreram no mês de abril, início do período chuvoso
atingindo 8,9 x 10
1
NMP/mL. Para coliformes fecais, as maiores médias foram
verificadas no mês de junho, mês com elevada precipitação pluviométrica, atingindo
valores de 2,3 x 10
1
NMP/mL.
Considerando os padrões estipulados pelo RIISPOA (Brasil, 1980) para leite
pasteurizado tipo C, das 30 amostras analisadas por Souza & Cerqueira (1996), 2 (6,6%)
continham números de coliformes fecais superiores aos estabelecidos pela referida
regulamentação.
Wendpap & Rosa (1997) analisando o leite pasteurizado tipo C
comercializado em Cuiabá, verificaram que, das cinco marcas avaliadas, quatro
apresentaram contagens elevadas de coliformes totais e fecais, que deveriam ter sido
eliminados durante o processamento térmico. Do total de 50 amostras analisadas, 15
(30%) estiveram em desacordo aos padrões legais para coliformes totais e 9 (18%)
amostras para coliformes fecais. Comparando estes resultados à pesquisa de Wendpap &
Rosa (1995), referentes às mesmas determinações, observa-se que 20 (40%) unidades
amostrais apresentaram coliformes totais e 6 (12%) amostras coliformes fecais, acima
dos padrões legais vigentes.
52
Normalmente o leite tipo C é considerado um produto de baixa qualidade, já
que a matéria-prima possui deficiência higiênico-sanitária na sua produção.
Barros et al. (1999), ao analisarem 38 amostras de leite tipo C provenientes de
pequenas fazendas, observaram que 6 (15,8%) apresentavam contagens microbiológicas
elevadas para coliformes fecais.
Freitas et al. (2002), ao analisarem 51 amostras de leite do tipo C, verificaram
que 17 (33,3%) amostras excederam aos padrões microbiológicos em relação a
coliformes fecais.
Leite et al. (2002) observaram que, das 20 amostras de leite tipo C analisadas,
13 (65%) amostras apresentaram contaminações por coliformes totais com valores
variando de 4 a 2,4 x 10
3
NMP/mL. Quanto aos coliformes fecais, obteve-se um
resultado de 7 (35%) amostras contaminadas, com valores que variaram de 9 a 2,4 x 10
3
NMP/mL, estando, portanto, em condições inaceitáveis.
4.5 Comparação entre os métodos tubos múltiplos e SimPlate
®
Para a enumeração de coliformes totais e fecais, o coeficientes de correlação
entre os métodos avaliados foram considerados bons (Tabela 7, Figuras 14 e 15).
Townsend & Naqui (1998) explicam que o NMP do SimPlate
®
utiliza o
mesmo príncipio matemático que o NMP convencional pela técnica dos tubos múltiplos,
porém é mais preciso devido ao grande número de cavidades disponíveis nas placas
SimPlate
®
. Assim, o NMP determinado por SimPlate
®
é altamente correlacionado com
métodos de contagens de colônias. Os dados obtidos no presente trabalho reforçam a
afirmativa de que o coeficiente de correlação encontrado entre NMP dos tubos múltiplos
e do SimPlate
®
, bem como os valores de intercepto e inclinação foram satisfatórios.
Dessa maneira, pode-se aceitar que, para coliformes totais, 92,89 % dos
resultados obtidos por tubos múltiplos podem ser relacionados com os dados gerados por
SimPlate
®
. Da mesma forma, para coliformes fecais, 97,11% dos resultados dos tubos
múltiplos podem ser relacionados com os dados do SimPlate
®
. Esta alta correlação deixa
53
claro que os coliformes fecais estimados pela técnica dos tubos múltiplos se referiam
quase que exclusivamente a E. coli, que é a bactéria coliforme fecal detectada pela
técnica do SimPlate
®
.
Barancelli (2002) ao realizar análise estatística para comparação desses dois
métodos para coliformes totais, encontrou em 27 amostras analisadas, coeficiente de
correlação 0,95, coeficiente angular 0,93 e coeficiente linear 0,36. Em comparação com
a presente pesquisa, os valores foram semelhantes.
Tabela 7. Resumo das comparações estatísticas entre os métodos NMP (tubos múltiplos)
e SimPlate
®
para contagem de coliformes totais e fecais/E. coli nas amostras
de leite tipos A, B, C e cru
Medida
de performance
Tubos múltiplos x
SimPlate (Totais)
Tubos múltiplos x
SimPlate (Fecais/E. coli)
Coeficiente de correlação 0,9289 0,9711
Coeficiente angular 0,9015 0,8110
Coeficiente linear 0,0761 0,038
Número de amostras 30 30
y = 0,9015x + 0,0761
R
2
= 0,9289
0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
0 0,7 1,4 2,1 2,8 3,5
Tubos múltiplos
Simplate
Figura 14 – Dispersão dos resultados das contagens (NMP) de coliformes totais em leite
tipos A, B, C e cru obtidos pelos métodos NMP (tubos múltiplos) e
SimPlate
®
54
y = 0,811x + 0,038
R
2
= 0,9711
0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
0 0,7 1,4 2,1 2,8 3,5
Tubos múltiplos
Simplate
Figura 15 - Dispersão dos resultados das contagens (NMP) de coliformes fecais/E. coli
em leite tipos A, B, C e cru obtidos pelos métodos NMP (tubos múltiplos) e
SimPlate
®
4.6 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva
Os resultados obtidos para as contagens de Staphylococcus coagulase positiva
para leite tipos A, B, C e cru, encontram-se na Tabela 8. A legislação não prevê um
parâmetro aceitável para este grupo de bactérias para o leite, mas estabelece limites para
outros alimentos que situam-se entre 10
2
e 10
3
UFC/g ou mL. Isso, provavelmente, se
deve ao fato de que na literatura é citado que valores normalmente acima de 10
6
UFC de
S. aureus são normalmente necessários para a detecção de enterotoxinas no alimento.
55
Tabela 8. Contagens de Staphylococcus coagulase positiva obtidas em amostras de leite
adquiridas no comércio local de Piracicaba antes e após pasteurização em
laboratório
Amostras Staphylococcus coag. positiva
(UFC/mL)
Staphylococcus coag. positiva Past
(UFC/mL)
A I 1 1,0 x 10
1
0
A I 2 0 0
A I 3 1,1 x 10
2
0
A II 4 3,0 x 10
1
0
A II 5 1,1 x 10
1
0
A II 6 0 0
A III 7 0 0
A III 8 0 0
A III 9 0 0
média 1,8 x 10
1
0
B I 1 0 0
B I 2 0 0
B I 3 8,0 x 10
1
0
B II 4 0 0
B II 5 0 0
B II 6 0 0
B III 7 0 0
B III 8 0 0
B III 9 0 0
média 8,9 0
C I 1 1,0 x 10
1
0
C I 2 2,0 x 10
1
0
C I 3 1,0 x 10
1
0
C II 4 2,0 x 10
1
0
C II 5 0 0
C II 6 0 0
C III 7 3,0 x 10
1
0
C III 8 0 0
C III 9 0 0
média 1,0 x 10
1
0
Cru 1 3,0 x 10
1
0
Cru 2 4,0 x 10
1
0
Cru 3 1,1 x 10
2
0
média 6,0 x 10
1
0
A-B-C-Cru: tipos de leite
I-II-III: marca
Números: número de amostras
56
Na presente pesquisa foram analisadas amostras de leite pasteurizado tipos A,
B e C, e que, por sofrerem esse tipo de tratamento térmico, não poderiam apresentar
bactéria potencialmente patogênica, como Staphylococcus aureus e/ou Staphylococcus
coagulase positiva.
Embora o maior valor encontrado tenha sido de 1,1 x 10
2
UFC/mL e, portanto,
longe da dose infectiva, preocupa o fato por ser o leite considerado um ótimo substrato
para bactérias. Portanto, quando submetido a condições inadequadas de tempo e
temperatura, pode permitir uma rápida multiplicação das mesmas. Assim, o risco de
Staphylococcus potencialmente patogênicos atingirem níveis elevados e produção de
toxinas em condições inadequadas, poderia levar a casos de intoxicação no caso de
ingestão de tais amostras.
As amostras de leite cru analisadas e que apresentaram altas contaminações
bacterianas, mostrando-se em condições higiênico-sanitárias insatisfatórias, após a
pasteurização, apresentaram reduções elevadas das bactérias e eliminação de patógenos,
como os Staphylococcus coagulase positiva, colocando-as em condições satisfatórias
para o consumo humano, mostrando o grande benefício trazido pela pasteurização do
leite.
Outro fato preocupante, é que a detecção desse grupo de bactérias evidencia
falhas no processo de pasteurização, uma vez que essas bactérias são destruídas por esse
processo. Após a pasteurização das amostras de leite no laboratório (62,8ºC/30’)
nenhuma delas apresentou Staphylococcus coagulase positiva.
Ao examinar os resultados da Tabela 8, nota-se que 44,4% das amostras de
leite tipo A analisadas apresentaram Staphylococcus coagulase positiva, bem como
11,1% das amostras de leite tipo B e 55,6% das amostras de leite tipo C.
As gôndolas dos estabelecimentos comerciais, nas quais as amostras de leite
tipos A, B e C analisadas nos presente trabalho foram adquiridas, mostraram uma
variação de temperatura entre 7 e 8ºC. Tais valores de temperatura demonstram boas
condições de armazenamento do leite durante a comercialização. Entretanto, nada pode
ser afirmado a respeito das condições durante a distribuição do produto, uma vez que
essa fase não foi monitorada.
57
Na literatura, o leite aparece como alimento envolvido em surtos de
toxinfecções alimentares. Os dados obtidos no presente trabalho, com detecção, embora
em números baixos de Staphylococcus coagulase positiva, nas amostras de leite tipos A,
B e C, adquiridos no comércio de Piracicaba, alertam para potencial risco de intoxicação
alimentar, caso condições adequadas de comercialização não sejam seguidas.
No trabalho de Leite et al. (2002) não foi observada a presença de
Staphylococcus coagulase positiva em leite integral pasteurizado tipo C.
Wendpap & Rosa (1997) também não encontraram Staphylococcus coagulase
positiva em 5 marcas de leite tipo C, em um total de 50 amostras analisadas.
No entanto, das 511 amostras de leite pasteurizado analisadas por Santos et al.
(1999), 167 amostras foram submetidas à pesquisa de Staphylococcus coagulase
positiva, sendo que 24 (14,4%) destas apresentaram resultado positivo assim
distribuídos: 1 amostra de leite pasteurizado tipo A, 5 de tipo B, 16 do tipo C e 2
amostras de leite desnatado. A variação do número desses microrganismos obtida em
NMP/mL, foi: tipo A (0,36), tipo B (0,3 a 9,3), tipo C (0,3 a 4,4) e desnatado (de 0,76 a
2,1). Tais valores são inferiores aos detectados na presente pesquisa, onde para as
amostras de leite tipo A os valores variaram entre <10 a 1,1 x 10
2
UFC/mL; as do tipo B
entre <10 a 8,0 x 10
1
UFC/mL e as do tipo C entre <10 a 3,0 x 10
1
UFC/mL.
4.7 Detecção de Salmonella
Em nenhuma das amostras de leite analisadas no presente trabalho foi
detectada a presença de Salmonella em 25mL, atendendo, portanto, as legislações em
vigor, ou seja, a Resolução RDC nº12 da ANVISA (Brasil, 2001) e a Instrução
Normativa nº51 do DIPOA (Brasil, 2002).
A incidência real de Salmonella nas toxinfecções alimentares é desconhecida,
uma vez que pequenos surtos não são freqüentemente relatados para as autoridades de
saúde pública (Giombelli & Silva, 2001).
No trabalho de Wendpap & Rosa (1997) não foi encontrada Salmonella em 5
marcas de leite tipo C, em um total de 50 amostras analisadas.
58
Também Freitas et al. (2002) e Santos et al. (1999), ao analisarem amostras de
leite pasteurizado não encontraram Salmonella em 25 mL do produto, mostrando que
tais amostras se encontraram em acordo com os padrões legais vigentes.
Leite et al. (2002), também não encontraram amostras do leite pasteurizado
tipo C contaminadas por Salmonella.
Hoffman et al. (1999), no entanto, detectaram a presença de Salmonella em
21,4% das 28 amostras de leite tipo C analisadas.
4.8 Condições microbiológicas gerais das amostras de leite pasteurizado analisadas
Na Tabela 9 são apresentados os números de amostras e as porcentagens de
leite A, B e C em desacordo com os padrões microbiológicos estabelecidos pela
legislação do DIPOA (Brasil, 2002), atualmente em vigor. A legislação imposta pela
ANVISA (Brasil, 2001) não menciona todos os parâmetros microbiológicos, portanto
não foi utilizada aqui, assim como os parâmetros do RIISPOA (Brasil, 1980), que não
estão mais em vigor.
Tabela 9. Amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C em desacordo com os padrões
microbiológicos estabelecidos pelo DIPOA (Brasil, 2002)
Tipos
de
Leite
Amostras
analisadas
Padrões Bacteriológicos Amostras
em
desacordo
Contagem
Padrão
Coliformes
Totais
Coliformes
Fecais
Salmonella
A 9 4 (44,4%) 6 (66,7%) 5 (55,6%) 0 15 (41,7%)
B 9 0 3 (33,3%) 3 (33,3%) 0 6 (16,7%)
C 9 0 0 0 0 0 (0%)
Observa-se na Tabela 9, que 41,7% das amostras de leite pasteurizado tipo A
estiveram em desacordo com os padrões microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002)
utilizados. Nas amostras de leite tipo B, 16,7% estiveram em desacordo com a legislação
citada. Já as amostras de leite tipo C analisadas, apresentaram os melhores resultados,
59
pois todas as amostras seriam aprovadas no caso de uma inspeção. Normalmente este
tipo de leite pode ser produzido em qualquer tipo de propriedade, com inspeção
periódica do rebanho. A ordenha normalmente é manual e o resfriamento do leite não é
obrigatório. Também, não há menção de tempo máximo entre ordenha e transporte para
o beneficiamento.
Há que se levar em conta que o maior índice de reprovação das amostras do
leite tipo A, tem como uma das causas a maior exigência da legislação em relação aos
outros tipos de leite. Porém, vale salientar que o consumidor pagou mais caro
(praticamente o dobro do preço) pelo leite do tipo A. O valor em reais (R$) do leite tipo
A varia nos estabelecimentos comerciais, mas em média o preço é R$ 1,90/litro. O leite
tipo C custa de R$ 0,80 a R$ 1,00. Pelo fato dos padrões microbiológicos para o leite C
serem menos rigorosos, teoricamente é mais fácil de se manter dentro dos padrões.
Ainda pode ser discutido que um leite tipo A rejeitado ou fora dos padrões não é
necessariamente um leite de pior qualidade microbiológica que um leite tipo C dentro
das normas. Mas de qualquer maneira, as pessoas estão comprando leite A esperando
uma qualidade superior e que não está sendo mantida, se forem observados os resultados
da presente pesquisa.
Ainda, existem especificações e medidas a serem adotadas para a obtenção de
um leite tipo A e que se forem rigorosamente seguidas, o produto irá atender as
exigências legais. Portanto, não se justifica que um % tão elevado de amostras de leite
pasteurizado tipo A não tenha se apresentado em acordo com os padrões
microbiológicos vigentes no país.
Em relação à contagem de bactérias mesófilas aeróbias, somente as amostras
do leite tipo A apresentaram valores acima dos tolerados, com 44,4% das amostras em
desacordo com os padrões estabelecidos pelo DIPOA (Brasil, 2002) e 55,6% em
desacordo com os padrões do RIISPOA (Brasil, 1980). Diferentemente do esperado, as
amostras de leite tipo C analisadas, mostraram-se em vários parâmetros microbiológicos,
em melhores condições do que amostras de leite tipos A e B (Figuras 16, 17 e 18).
Em relação às análises realizadas para a enumeração do número mais provável
de coliformes totais, 66,7% das amostras de leite pasteurizado tipo A, 33,3% das
60
amostras de leite tipo B e nenhuma das amostras de leite tipo C, estiveram em desacordo
com os padrões mencionados pelo Departamento de Inspeção de Produtos de Origem
Animal - DIPOA (Brasil, 2002) (Figuras 16, 17 e 18).
A enumeração de coliformes fecais mostrou que 55,6% das amostras de leite
A, 33,3% das amostras de leite B e nenhuma das amostras de leite C, estavam com
valores acima dos tolerados pelos padrões legais vigentes (Figuras 16, 17 e 18).
Figura 16 – Porcentagens de amostras de leite pasteurizado tipo A acima e dentro dos
limites microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002)
61
Figura 17 – Porcentagens de amostras de leite pasteurizado tipo B acima e dentro dos
limites microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002)
62
Figura 18 – Porcentagens de amostras de leite pasteurizado tipo C acima e dentro dos
limites microbiológicos do DIPOA (Brasil, 2002)
Os padrões estabelecidos pela ANVISA (Brasil, 2001) para coliformes fecais
(coliformes a 45ºC) em leite pasteurizado são bem mais tolerantes que os demais
mencionados. Vale notar que a ANVISA usa a classificação leite pasteurizado não
mencionando os tipos de leite, portanto, 4 (14,8%) amostras de leite pasteurizado, (1 do
leite tipo A e 3 do leite tipo B) (Figura 19) estariam em desacordo com os padrões da
ANVISA (Brasil, 2001).
63
Figura 19 – Porcentagens de amostras de leite tipo pasteurizado acima e dentro dos
limites microbiológicos da ANVISA (Brasil, 2001)
Observa-se que nenhuma amostra de leite analisada no presente trabalho, tanto
pasteurizado como cru, apresentou Salmonella em 25 mL, o que as coloca em acordo
com os três padrões utilizados (RIISPOA, ANVISA e DIPOA).
As amostras analisadas evidenciaram a necessidade de uma melhor orientação
e fiscalização da produção e comercialização principalmente do leite tipo A. A maioria
dos pesquisadores citados encontrou índices de contaminação maiores principalmente
em amostras de leite tipo C. Os resultados das análises microbiológicas encontrados no
presente trabalho para leite pasteurizado tipo C foram de um modo geral melhores,
quando comparados aos encontrados para leite pasteurizado tipos A e B.
Segundo Tavares (1996) as amostras de leite pasteurizado tipo A, mostraram
melhores condições higiênico-sanitárias em relação às dos tipos B e C, porém as
contagens de microrganismos mesófilos estiveram em altos percentuais acima dos
padrões normais de vigilância. Os leites tipos A e B apresentaram más condições
higiênico-sanitárias. Entre os leites tipos B e C observou-se diferenças em relação às
condições microbiológicas, sendo que em certas amostras a contaminação foi maior no
leite tipo B.
64
Apesar de algumas diferenças em relação aos percentuais de amostras de leite
pasteurizado que se apresentaram fora dos padrões microbiológicos vigentes, nota-se
que mesmo decorridos 9 anos após a pesquisa de Tavares (1996), a qualidade
microbiológica de leite pasteurizado comercializado em Piracicaba, continua deixando
muito a desejar.
Brandão & Reis Jr. (1995) reportam que em países desenvolvidos não se
admite que o leite, sendo um produto destinado principalmente às camadas sociais
consideradas de risco, seja obtido sem condições mínimas de higiene, estabelecidas pelo
governo. Esclarecem ainda que, em países desenvolvidos só existe leite tipo A e
defendem a mudança da legislação brasileira para eliminação dos leites tipos B e C, para
o surgimento de um novo tipo de leite A. Consideram inadmissível que no século XXI
ainda esteja sendo produzido leite tipo C.
Vale notar que em países subdesenvolvidos essa afirmação não pode ser
aplicada, pois as camadas pobres não teriam condições financeiras de consumir leite tipo
A. Nota-se que para produzir leite esterilizado não precisa utilizar leite tipo A, assim
como para os derivados do leite. Também é importante salientar que a qualidade de um
produto não pode ser resolvida somente pela legislação.
Na atualidade a ferramenta mais avançada para proteger os produtos
alimentícios de perigos microbiológicos, físicos e químicos é o sistema de análise de
perigos e pontos críticos de controle (HACCP). Com base científica, o sistema tem por
finalidade identificar perigos específicos e estabelecer medidas preventivas de controle
em toda a cadeia alimentar, envolvendo a produção primária, as indústrias, os
transportadores, os consumidores, os inspetores e fiscalizadores e os fornecedores de
produtos e serviços de qualquer natureza que se relacione com a segurança do alimento
(Freitas et al, 2002; Leite Jr & Torrano, 2000; Santos et al.,1999).
65
Torna-se evidente que problemas sanitários têm ocorrido na obtenção,
tratamento e conservação do leite e, portanto, devem ser implementadas medidas com
ações que possam identificar falhas no processo de obtenção do produto e maior rigor na
fiscalização pelos órgãos competentes. Devem também serem implantados programas de
qualidade que garantam um controle efetivo das condições higiênico-sanitárias das
indústrias durante todo o processo até a distribuição e comercialização, para obtenção de
um produto de melhor qualidade para a população.
4.9 Eficácia da pasteurização
A Tabela 10 mostra a eficácia da pasteurização, realizada no Laboratório de
Microbiologia de Alimentos da ESALQ-USP, em relação aos microrganismos aeróbios
mesófilos, termófilos e psicrotróficos. Também foi feita a média dos valores de reduções
logarítmicas para os tipos de leite analisados (Figura 20) para melhor visualização dos
dados.
66
Tabela 10. Eficácia da pasteurização (log) realizada no laboratório, das amostras de leite
tipos A, B, C e cru obtidas no comércio de Piracicaba
Amostras Mesófilos Termófilos Psicrotróficos
A I 1 0,97 0,77 1,17
A I 2 0,56 0 0,42
A I 3 2,95 0,72 1,47
A II 4 0,99 0,25 2,13
A II 5 0,11 0,23 1,78
A II 6 0,56 0,25 2,00
A III 7 0,99 0 1,07
A III 8 0,43 0,78 1,82
A III 9 0,82 0 1,02
média 1,03 0,41 1,43
B I 1 0,39 0,93 1,91
B I 2 0,30 0 1,45
B I 3 1,03 0 2,57
B II 4 0,74 0,54 1,27
B II 5 1,09 0,23 1,49
B II 6 0,95 0,15 1,78
B III 7 1,47 0,84 1,27
B III 8 1,32 0,93 0,84
B III 9 1,68 0,78 1,49
média 0,99 0,49 1,56
C I 1 0,56 0 1,11
C I 2 1,17 0,93 1,64
C I 3 1,15 0,78 0,92
C II 4 0,99 0,24 1,05
C II 5 0,85 0,78 1,77
C II 6 0,82 0,26 1,23
C III 7 1,03 0,26 0,97
C III 8 1,73 0,25 1,01
C III 9 1,65 0,26 0,97
média 1,11 0,42 1,19
Cru 1 4,91 0,15 1,75
Cru 2 5,05 0 3,51
Cru 3 2,88 0,12 3,08
média 4,28 0,09 2,78
A-B-C-Cru: tipos de leite
I-II-III: marca
Números: número de amostras
67
0
0,9
1,8
2,7
3,6
4,5
mesófilos termófilos psicrotróficos
Aeróbios
Log x+2
A B C Cru
Figura 20 – Médias das reduções logarítmicas conseguidas pela pasteurização realizada
no laboratório para as amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C e leite
cru
Pelos resultados apresentados na Tabela 10, fica claro que a pasteurização das
amostras de leite realizada no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do
Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição da ESALQ, reduziu todos os
grupos de microrganismos analisados. Assim, as reduções de microrganismos mesófilos
sofreram variações de 0,11 a 2,94 ciclos logarítmicos (leite tipo A), 0,38 a 1,68 (leite
tipo B), 0,55 a 1,72 (leite tipo C) e 2,87 a 5,05 (leite cru).
Para as contagens de microrganismos psicrotróficos as reduções variaram de
0,41 a 2,13 ciclos logarítmicos (leite tipo A), 0,84 a 2,57 (leite tipo B), 0,92 a 1,77 (leite
tipo C) e 1,17 a 3,51 (leite cru). Em face dessas reduções elevadas encontradas para
esses grupos microbianos, hipóteses como: falhas do binômio tempo/temperatura
durante a pasteurização industrial; matéria-prima excessivamente contaminada,
sanificação deficiente das linhas de produção, transporte e armazenamento em
temperaturas inadequadas, e/ou contaminação pós-pasteurização, podem ser levantadas
para as amostras de leite pasteurizado tipos A, B e C adquiridas no comércio do
município de Piracicaba.
68
Se essas amostras tivessem sido adequadamente processadas na pasteurização
industrial, provavelmente os termodúricos sobreviventes não seriam tão sensíveis a uma
segunda pasteurização. Portanto, devem ter sobrevivido microrganismos que deveriam
ter sido destruídos e provavelmente aumentaram em número após a pasteurização por
algum dos motivos expostos e foram eliminados significativamente durante a outra
pasteurização no laboratório. Até porque como já discutido anteriormente, a detecção de
prováveis patógenos, como por exemplo, Staphylococcus coagulase positiva em algumas
amostras de leite pasteurizado adquiridas no comércio deixa claro que ou aconteceram
falhas no processo de pasteurização, ou aconteceu recontaminação após o tratamento
térmico. Diante disso, vale mais uma vez lembrar da necessidade de uma fiscalização
maior e orientação para boas práticas de fabricação e monitoramento de pontos críticos e
de risco, para que a população não fique exposta a problemas de toxinfecções
alimentares, pela ingestão desse tipo de alimento.
Como era de se esperar, uma vez que a pasteurização exerce efeito marcante
sobre psicrotróficos e mesófilos, as reduções encontradas para os microrganismos
termófilos foram bem menores, com reduções variando de 0 a 0,92 ciclos logarítmicos
para as amostras de leite tipos A, B, C e cru.
5 CONCLUSÕES
1 O número de amostras acima do limite estabelecido pelo DIPOA (Brasil, 2002) para
microrganismos mesófilos do leite tipo A (44,4%), foi maior em relação às amostras
de leite tipos B (0,0%) e C (0,0%).
2 Embora sem padrões legais vigentes atualmente, as contagens de psicrotróficos (1,2 x
10
1
a 8,5 x 10
3
UFC/mL) e de termófilos (<10 a 1,6 x 10
2
UFC/mL), encontradas nas
amostras de leite pasteurizado tipos A, B, C e leite cru analisadas, foram baixas.
3 Utilizando-se a metodologia dos tubos múltiplos, 6 (66,7%) amostras de leite tipo A,
3(33,3%) amostras de leite tipo B e 0 (0,0%) amostras de leite tipo C, apresentaram
NMP de coliformes totais acima dos padrões estabelecidos pelo DIPOA (Brasil,
2002). Quando a metodologia SimPlate foi utilizada, os mesmos percentuais de
amostras analisadas foram encontrados como fora dos padrões do referido órgão.
4 Utilizando-se a metodologia dos tubos múltiplos, 5 (55,6%) amostras de leite tipo A,
3 (33,3%) amostras de leite tipo B e 0 (0,0%) amostras de leite tipo C, apresentaram
NMP de coliformes fecais acima dos padrões estabelecidos pelo DIPOA (Brasil,
2002). Quando a metodologia SimPlate
®
foi utilizada, 4 (44.4%) amostras de leite
tipo A, 3 (33,3%) amostras de leite tipo B e 0 (0,0%) amostras de leite tipo C,
apresentaram NMP de E. coli acima dos mesmos padrões para coliformes fecais.
5 A análise estatística feita para os valores de NMP (tubos múltiplos) e NMP
(SimPlate) mostrou uma alta correlação entre esses métodos, tanto para a
70
determinação de coliformes totais como de coliformes fecais e/ou E. coli.
6 Se os padrões microbiológicos da ANVISA (Brasil, 2001) forem considerados, o
número de amostras que apresentaram valores de coliformes a 45ºC e/ou E. coli,
acima dos valores máximos estabelecidos será bem menor, já que tal legislação é
menos exigente nesse quesito para leite pasteurizado. Assim, apenas 4 amostras (1
tipo A e 3 tipo B=14,8%) de todas as analisadas estariam com NMP de coliformes a
45ºC acima dos padrões, quando a metodologia utilizada foi a dos tubos múltiplos.
Se a metodologia considerada for a do SimPlate
®
, apenas 3 amostras (1 tipo A e 2
tipo B=11,1%) estariam com NMP de E.coli acima dos padrões da ANVISA (Brasil,
2001) para coliformes a 45ºC.
7 Embora as contagens de Staphylococcus coagulase positiva tenham sido baixas (0 a
1,1 x 10
2
UFC/mL) e bem abaixo da dose infectiva, 44,4% das amostras de leite tipo
A, 11,1% das amostras de leite tipo B e 55,6% das amostras de leite tipo C,
apresentaram-se contaminadas por essas bactérias, as quais deveriam ter sido
destruídas na pasteurização industrial..
8 Nenhuma amostra de leite analisada apresentou Salmonella em 25 mL, o que as
coloca em acordo com os padrões microbiológicos legais vigentes (ANVISA, 2001 e
DIPOA, 2002).
9 A pasteurização no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de
Agroindústria, Alimentos e Nutrição da ESALQ-USP mostrou-se eficiente,
principalmente na redução, em ciclos logarítmicos, dos microrganismos mesófilos e
psicrotróficos, para todas as amostras de diferentes tipos de leite analisadas. Após a
pasteurização no laboratório, todas as amostras se enquadraram nos padrões
microbiológicos legais vigentes no país, bem como não apresentaram bactérias
potencialmente patogênicas como as do grupo Staphylococcus coagulase positiva.
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