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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
MARINÊS CONCEIÇÃO RIETH CORRÊA
Avaliação moluscicida das plantas Pterodon emarginatus Vogel 1837,
Magonia pubescens St. Hil, e Croton urucurana Baill 1864, sobre
Biomphalaria glabrata (Say, 1818) e cercaricida sobre Schistosoma
mansoni (Sambon, 1907)
Orientador:
Profº. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Dissertação de Mestrado
Goiânia – Goiás, 2006.
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Marinês Conceição Rieth Corrêa
Avaliação moluscicida das plantas Pterodon emarginatus Vogel 1837,
Magonia pubescens St. Hil, e Croton urucurana Baill 1864, sobre
Biomphalaria glabrata (Say, 1818) e cercaricida sobre Schistosoma
mansoni (Sambon, 1907)
Orientador:
Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Dissertação de Mestrado submetida ao PPGMT/IPTSP/UFG como
requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre na área de
concentração de Parasitologia.
Goiânia – Goiás, 2006
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Corrêa, Marinês Conceição Rieth.
C824a Avaliação moluscicida das plantas Pterodon
emarginatus Vogel 1837, Magonia pubescens St. Hil,
e Cróton urucurana Baill 1864, sobre Biomphlaria
glabrata (Say, 1818) e cercaricida sobre Schistosoma
mansoni (Sambon, 1907) / Marines Conceição Rieth
Corrêa. - Goiânia, 2006.
Xiii, 73 f. : il.
Orientador: José Clecildo Barreto Bezerra.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de
Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,
2006.
Bibliografia : f. 66-73.
1. Esquitosomose - Controle 2. Biomphalaria glabrata
- Controle 3. Schistosoma mansoni – Controle 4. Molus-
cicidas I. Bezerra, José Clecildo Barreto II. Universidade
Federal de Goiás. Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública III. Título.
CDU: 616.995.122
DEDICATÓRIA
Ao meu esposo, Euclides, pela dedicação,
incentivo e pelo companheirismo nos momentos difíceis
durante a realização deste trabalho.
Aos meus filhos, Mônia e Thomas, razão de
minha existência, dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Deus por me proporcionar oportunidades de aprendizado e
crescimento;
Ao meu marido, Euclides, pelo amor, dedicação, apoio e
companheirismo durante a realização deste projeto;
Aos meus filhos, Mônia e Thomas, pela compreensão e apoio
incessante;
Ao Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra, pela oportunidade dada,
sua amizade, incentivo, confiança e orientação deste trabalho;
Aos meus pais, irmãos e amigos, que me deram coragem para a
realização deste trabalho;
À Profª. Drª. Úrsula Kreisel, pela indicação valiosa dada ao início
desta trajetória;
Aos professores, Drª. Heloísa Helena Garcia da Silva e Dr. Ionizete
Garcia da Silva, do Laboratório de Bioatividade de plantas do IPTSP, por
cederem os extratos das plantas;
A todos os meus mestres, que contribuíram na minha formação e
realização dos meus créditos com êxito;
Aos professores, Dr. Marco Túlio A. García-Zapata, Dr. José Luiz
Barros de Araújo e Drª. Ana Maria de Castro, pelas sugestões construtivas
que foram fundamentais para a concretização do trabalho;
Às colegas de mestrado, Aline, Josyrene, Cirlane e Marina pela
amizade;
À amiga Zilma Dourado, pelo carinho;
Aos demais colegas de Mestrado, técnicos e funcionários do
IPTSP/UFG, pela colaboração durante a realização deste trabalho;
A todos que mesmo não citados aqui contribuíram, direta ou
indiretamente, para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO ...............................................................................................
vi
ABSTRACT ............................................................................................ viii
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................
x
LISTA DE TABELAS .............................................................................. xi
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................... xiii
INTRODUÇÃO ....................................................................................... 1
1. Epidemiologia ............................................................................ 1
2. O parasito ................................................................................. 5
3. Patologia ....................................................................................
6
4. Hospedeiro Intermediário ...........................................................
8
5. Ações e perspectivas no controle de Biomphalaria glabrata .........
10
JUSTIFICATIVA .....................................................................................
14
OBJETIVOS .......................................................................................... 16
ARTIGO I: Ação moluscicida do extrato das plantas Pterodon
emarginatus Vogel 1837, Magonia pubescens St. Hil, e Croton urucurana
Baill 1864, sobre fases do desenvolvimento biológico de Biomphalaria
glabrata (Say, 1818) ..............................................................................
17
ARTIGO II: Efeitos dos extratos de Pterodon emarginatus Vogel 1837,
Leguminosaea, Papilionoideae, Magonia pubescens St. Hil, Sapindaceae
e Croton urucurana Baill 1864, Euphorbiaceae, sobre Biomphalaria
glabrata (Say, 1818) infectada com Schistosoma mansoni (Sambon,
1907) e cercárias ...................................................................................
41
CONCLUSÕES FINAIS ..........................................................................
63
CONSIDERAÇÕES FINAIS .....................................................................
64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 66
RESUMO
Foram avaliadas, separadamente, em laboratório, as ações
moluscicida e cercaricida das plantas Pterodon emarginatus, Magonia
pubescens e Croton urucurana encontradas no Cerrado brasileiro, região
Centro-Oeste e em outras regiões brasileiras, onde a esquistossomose é
endêmica. Os extratos brutos etanólicos obtidos, com diluição em água,
foram testados sobre caramujos da espécie Biomphalaria glabrata,
hospedeiro intermediário de Schistosoma mansoni. A avaliação da
bioatividade foi feita a partir de uma concentração inicial de 100ppm sobre
caramujos adultos, sendo que aqueles que apresentaram mortalidade na
fase adulta tiveram suas concentrações diminuídas para 50, 25 e 12,5ppm
sucessivamente. Foi testado o efeito moluscicida sobre as fases do
desenvolvimento do caramujo, sobre as oviposições e sobre a eclosão das
massas ovígeras. Os extratos que não apresentaram bioatividade em
100ppm não tiveram suas concentrações reduzidas. O extrato de Pterodon
emarginatus não apresentou bioatividade sobre caramujos, oviposições,
eclosão de massas ovígeras e liberação de cercárias. Apresentou efeito
cercaricida cinco horas após o início do experimento, enquanto o grupo
controle sobreviveu por até 36 horas nas mesmas condições. O extrato de
Magonia pubescens apresentou 100% de bioatividade nas quatro
concentrações utilizadas e em todas as fases do desenvolvimento dos
caramujos exceto na eclosão das massas ovígeras. O efeito cercaricida foi de
100% nas concentrações de 100 e 50ppm, em quinze minutos, 100% para
25ppm, em 30 minutos, e 100% para 12,5ppm, em duas horas, enquanto o
grupo controle sobreviveu por até 36 horas nas mesmas condições. Com o
extrato de Croton urucurana a bioatividade foi de 26,6% na concentração de
100ppm, em 24 horas de exposição sobre caramujos adultos. Nas
concentrações de 50, 25 e 12,5ppm não se verificou bioatividade sobre
caramujos adultos, jovens, massas ovígeras e eclosão das massas ovígeras.
Verificou-se bioatividade com caramujos recém-eclodidos nas três
concentrações testadas, após 24 horas de exposição. Com cercárias, as
mortes foram observadas a partir de quinze minutos nas concentrações de
100 e 50ppm, duas horas para 25ppm e cinco horas para 12,5ppm, e no
grupo controle sobreviveram até 36 horas nas mesmas condições. Os
caramujos que sobreviveram aos extratos de P. emarginatus e C. urucurana
apresentaram pequeno aumento no número de desovas quando comparados
ao grupo controle.
PALAVRAS CHAVES: Biomphalaria glabrata, controle biológico,
Esquistossomose, plantas moluscicidas e Schistosoma mansoni.
ABSTRACT
The molluscicide and cercaricide action of the Pterodon
emarginatus plants, Magonia pubescens and Croton urucurana, found in the
Brazilian scrubland, center-west region and in other Brazilian regions where
the schistosomose is endemic, was evaluated separately in laboratories. The
brute etanolic extracto obtained, after the dilution in water, were tested over
the Biomphalaria glabrata snails, intermediary host of Schistosoma mansoni.
The evaluation of the bioactivity was done from the initial concentration of
100ppm over adult snails and those ones which died in the adult phase had
their concentrations reduced at 50, 25 and 12.5ppm successively. The
molluscicide effect was evaluated over the snails’ development phasis, over
the laying of eggs and over the ovigery masses hatching. The extracts that
did not show bioactivity on 100ppm did not have their concentrations
decreased. The P. emarginatus extract did not demonstrate bioactivity over
the snails, the laying of eggs, the ovigery masses hatching and the liberation
of cercaries. Showing the cercaricide effect five hours after the start of the
experiment, whereas the controlling group survived for 36 hours over the
same conditions. The M. pubescens extract demonstrated 100% of bioactivity
on the four concentrations utilized and in all the snails’ development phasis
with the exception of the ovigery masses hatching. The cercaricide effect was
100% on the 100 and 50ppm concentrations within fifteen minutes, 100%
on 25ppm within 30 minutes and 100% on 12.5ppm within two hours,
whereas the controlling group survived for 36 hours at the same conditions.
With the C. urucurana extract the bioactivity was of 26.6% on the 100ppm
concentration within 24 hours of an exposition over adult snails. On the 50,
25 and 12.5ppm concentrations it was not showed bioactivity over the adult
and young snails, the laying of eggs and the ovigery masses hatching. It was
presented bioactivity with newly-developed snails on the three
concentrations tested after 24 hours of exposition. With the cercaries the
deaths were observed from the fifteen minutes on the 100 and 50ppm
concentrations, two hours on 25ppm and five hours on 12.5ppm, and in the
controlling group they survived 36 hours at the same conditions. The snails
which survived to the P. emarginatus e C. urucurana extracts showed an
increasing on the laying of eggs number when compared to the controlling
group.
Key-words: Biomphalaria glabrata, biological control, schistosomiasis,
molluscicide plants, Schistosoma mansoni.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Mapa da distribuição geográfica da esquistossomose no
mundo ....................................................................................
4
Figura 2
Mapa da distribuição geográfica da esquistossomose no Brasil
4
Figura 3
Ciclo biológico de Schistosoma mansoni ...................................
6
Figura 4
Biomphalaria glabrata .............................................................
10
Figura 5
Oviposição de Biomphalaria glabrata no período de oito
semanas após exposição aos extratos de Pterodon emarginatus
e Croton urucurana (n= 15)
......................................................
31
Figura 6
Oviposição de Biomphalaria glabrata infectado com
Schistosoma mansoni no período de oito semanas de exposição
aos extratos de Croton urucurana e Pterodon emarginatus (n=
15)...........................................................................................
54
Figura 7
Oviposição de Biomphalaria glabrata infectados com
Schistosoma mansoni e não-infectados, no período de nove
semanas ..................................................................................
55
LISTA DE TABELAS
Tabela I Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata após
exposição a extratos a 100ppm da casca do caule das
plantas Pterodon emarginatus, Magonia pubescens e Croton
urucurana (n= 15) ................................................................
29
Tabela II Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata após
exposição a extratos a 100ppm da casca do caule das
plantas Pterodon emarginatus, Magonia pubescens e Croton
urucurana (n= 15) ................................................................
29
Tabela III Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata em
diferentes fases do ciclo biológico, submetidos aos extratos
de plantas em concentrações decrescentes (n= 15), no
período de 72 h de observação .............................................
31
Tabela IV Percentagem de eclosões de massas ovígeras de
Biomphalaria glabrata expostas por 24h em concentrações
decrescentes de extratos de plantas (n= 10)*, no período de
10 dias de observação .........................................................
32
Tabela V Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata
infectados com Schistosoma mansoni, sob concentrações
decrescentes de extratos de plantas (n= 15), no período de
48 h de observação ..............................................................
53
Tabela VI Ovoposição de Biomphalaria glabrata infectado com
Schistosoma mansoni no período de oito semanas de
exposição aos extratos de Pterodon emarginatus e Croton
urucurana (n= 15) ................................................................
54
Tabela VII Quantidade de cercárias liberadas por Biomphalaria
glabrata na presença de extratos de plantas, após 60
minutos de exposição à luz artificial ....................................
55
Tabela VIII Taxa de mortalidade (%) das cercárias expostas a
concentrações decrescentes de extratos de plantas (n= 15),
no período de 24 h de observação ........................................
56
LISTA DE ABREVIATURAS
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
WHO/OMS – Organização Mundial de Saúde
IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
mg _ miligrama
ml – mililitro
ppm – partes por milhão equivalente a mg/L
PPGMT – Programa de Pós-Graduação em Medicina tropical
UFG – Universidade Federal de Goiás
INTRODUÇÃO
A esquistossomose caracteriza-se como doença parasitária
transmissível e endêmica. Não é ordinariamente fatal ao homem, porém é
debilitante. No Brasil é provocada pelo trematódeo Schistosoma mansoni.
Pode evoluir desde formas assintomáticas até formas clínicas extremamente
graves, por isso vem sendo alvo de estudos, devido ao seu alto grau de
prevalência e infecção, principalmente em áreas endêmicas de regiões
tropicais e subtropicais, onde milhões de pessoas estão expostas ao risco de
contaminação (WHO 2002). Considerada a segunda maior doença tropical, é
superada apenas pela malária, devido à sua importância e repercussão
econômica e de saúde pública (Passos 1998).
Essa doença pode ser considerada característica de populações de baixo
poder econômico, que vivem em condições precárias de habitação, ou
rurais, onde há o contato freqüente e o uso direto da água sem tratamento
e sem sistema de esgoto.
A doença causada pelo S. mansoni é conhecida como xistossomose,
xistose, doença do caramujo, bilharziose, moléstia de Pirajá da Silva ou
ainda como barriga d’água (Cheever e Andrade 1967).
EPIDEMIOLOGIA
A esquistossomose afeta mais de 200 milhões de pessoas na África,
Ásia e América Latina, e mais de 600 milhões encontram-se em área
considerada de risco em mais de 76 países, onde já foram registrados casos
dessa parasitose. Ocorre em várias partes do mundo, principalmente na
região do Oriente próximo (Israel, Arábia Saudita, Iêmen, Iran, Iraque), em
grande parte da África (Egito, Líbia, Moçambique, Camarões, Nigéria, Angola,
etc), das Antilhas (Porto Rico, República Dominicana) e da América do Sul
(Venezuela e Brasil) (figura 1).
Nas Américas, iniciou-se em territórios coloniais juntamente com a
introdução da mão-de-obra escrava vinda da África e espalhou-se em áreas
com a presença de caramujos suscetíveis e condições ecológicas apropriadas
ao desenvolvimento do ciclo evolutivo do parasito (Rey 2001). No Brasil, ela
apresenta ampla distribuição, atingindo os estados do Norte (Pará e
Rondônia), integralmente as regiões do Nordeste, Sudeste e Sul, e ainda os
estados de Mato grosso, Goiás e Distrito Federal, na região Centro-Oeste
(figura 2). Portanto, no Brasil, ocorre do norte ao Centro Sul afetando de oito
a doze milhões de pessoas (Katz 1997). Segundo dados do Ministério da
Saúde, em 1997, cerca de 6,3 milhões de pessoas já estavam infectadas,
distribuídas em áreas endêmicas ou em focos isolados em municípios fora de
área endêmica, como no caso dos municípios de Formosa e Padre Bernardo,
ambos no estado de Goiás. Estes casos ocorrem em razão do deslocamento
das populações de áreas endêmicas, portadoras da parasitose, para quase
todos os estados brasileiros, podendo estes ser vistos como ponto de partida
para a formação de novos focos ou para transmissão ocasional em
localidades onde exista a presença do caramujo, Biomphalaria glabrata ou
outras espécies suscetíveis, como hospedeiros intermediários deste parasito.
As migrações humanas internas podem constituir um ponto
favorável à disseminação da parasitose. No âmbito das doenças infecciosas e
parasitárias, Lacaz (1972) enfatiza que não se tem dúvida de que os
movimentos migratórios, ligados a vários tipos de atividades humanas,
influem de modo decisivo na epidemiologia das doenças, alterando o quadro
epidemiológico das áreas receptoras, quando nas mesmas chegam doenças
antes inexistentes.
De todos os elementos do ambiente, a água tem papel fundamental,
pois, quando contaminada com as fases de vida livre do S. mansoni
(miracídios e cercárias), representa um veículo que possibilita a transmissão
tanto para o hospedeiro intermediário quanto para o hospedeiro definitivo.
Enquanto a maioria das parasitoses diminui de importância,
devido ao desenvolvimento econômico e melhoria nos métodos de controle, a
esquistossomose continua expandindo-se geograficamente, devido às
condições climáticas favoráveis e em função da extensão das zonas agrícolas
e das áreas irrigadas, que reúnem características que favorecem o
desenvolvimento da espécie S. mansoni, causadora da helmintíase no Brasil.
Figura 1. Mapa de Distribuição da Esquistossomose no Mundo
(adaptado de Luís Rey 2001)
Figura 2. Mapa de Distribuição da Esquistossomose no Brasil
(adaptado de Luís Rey 2001
O PARASITO
Schistosoma mansoni, espécie que também ocorre no Brasil,
apresenta ciclo biológico complexo do tipo heteroxeno, formado por duas
fases parasitárias, ambas dependentes do meio aquático para o
desenvolvimento de suas fases larvais de vida livre, que se alternam com as
fases parasitárias (figura 3). São, portanto, parasitos que requerem dois
hospedeiros: um mamífero, como hospedeiro definitivo, habitualmente o
homem, e caramujos de água-doce, como hospedeiros intermediários.
Segundo Rey (2001), o caramujo será sempre do gênero Biomphalaria e deste
B. glabrata a principal espécie no Brasil.
As etapas evolutivas consistem no verme adulto (macho e fêmea), ovo,
miracídio, esporocistos I e II, cercária e verme adulto. O ciclo evolutivo do
parasito se completa, em condições favoráveis, em torno de 80 dias. No
homem, o ciclo é sexuado e o período decorrido entre a penetração das
cercárias e o encontro de ovos nas fezes é de cerca de 40 dias. No
caramujo, o ciclo é assexuado e também ocorre, aproximadamente, em 40
dias (Tavares-Neto 1998, 1999).
Cercária
Ovo
Ciclo Biológico de Schistosoma mansoni
Miracídio
Figura 3. Ciclo Biológico de Schistosoma mansoni (adaptado de Sônia Lopes
1998).
PATOLOGIA
Apresenta-se como uma doença crônica e sistêmica, pois após a
penetração ativa da cercária pela pele provocando dermatites e a circulação
por órgãos, como pulmões e coração, os esquistossômulos circulam nos
vasos sangüíneos, indo alojar-se no sistema porta-hepático, onde podem
completar seu desenvolvimento transformando em vermes adultos (Cheever,
Andrade 1967). Essa fase é conhecida como fase crônica que pode
permanecer com acentuada apatia, assintomática ou oligossintomática,
tanto em adultos como em crianças. Segundo Rey (2001), a gravidade da
doença leva em consideração a linhagem do parasito e a carga infectante, a
freqüência com que ocorrem as infecções, a idade e a vitalidade das
cercárias, as características do hospedeiro e seu meio, a ocorrência ou não
de outras infecções anteriores, o grau de imunidade desenvolvida, a carga
parasitária acumulada ao longo dos anos e o tempo de duração da infecção.
No sistema porta-hepático dá-se, então, o amadurecimento sexual
dos machos e o acasalamento necessário para que as fêmeas completem seu
desenvolvimento, vivendo nas veias do plexo hemorroidário. A partir desse
momento, macho e fêmea migram acasalados contra a corrente sangüínea
para seu habitat definitivo, que são as vênulas da parede do reto, do
sigmóide e do intestino grosso. Nesses locais, a fêmea fecundada começa a
oviposição, o que pode causar dificuldades no fluxo sangüíneo e extrusão
dos ovos para o tecido circundante. Também pode ocorrer inflamação
granulomatosa formada pelos ovos aderidos nos tecidos do hospedeiro
(Andrade, Bina 1983). Os ovos liberados no intestino juntam-se às fezes,
mas a maioria adere à parede do intestino, e também, pela veia porta,
alcançam o fígado. Nesse caso, pode aparecer a forma grave da doença,
causando hipertensão portal, hipertensão pulmonar, diarréias
sanguinolentas com dores abdominais, emagrecimento,
hepatoesplenomegalia e formas tumorais. Por isso, o S. mansoni produz uma
doença hepato-intestinal de grande importância médica podendo levar a
óbito caso não seja tratada com o uso de medicamentos apropriados.
Ainda pela ocasião da postura, os ovos podem ser arrastados pela
corrente sangüínea, juntamente com vermes adultos, para os pulmões,
desenvolvendo lesões como fibroses pulmonares, assim como atravessar a
submucosa e alcançar a luz do intestino, sendo eliminados com as fezes do
paciente. Existe registro na literatura de encontro de ovos na medula
espinhal, formando granulomas no tecido nervoso central, com ocorrência de
paraplegia (Bezerra et al. 1996).
HOSPEDEIRO INTERMEDIÁRIO
No Brasil, existem cerca de dez espécies de caramujos do gênero
Biomphalaria, sendo que apenas três apresentam interesse médico, por
liberarem cercárias em condições naturais: B. grabrata (Say, 1818); B.
tenagophila (d`Orbigny, 1838) e a B. straminea (Dunker, 1848). Em Goiás,
apresenta-se, no município de Padre Bernardo, um foco de esquistossomose
há mais de dez anos, tendo o caramujo B. straminea como hospedeiro.
Porém, destas três, B. grabrata é a que apresenta maior distribuição
geográfica, o que a torna a de maior referência em estudos (figura 4).
Biomphalaria glabrata, nome vulgar corondó, no Brasil, é um
caramujo de água-doce pertencente ao filo Mollusca, classe Gastropoda,
família Planorbidae, susceptível ao parasitismo por S. mansoni, com
relevância epidemiológica na transmissão da esquistossomose (Boffi 1979).
Habita águas rasas, estagnadas ou de fluxo lento, com quantidades
moderadas de matéria orgânica e com penetração de luz. Como também
podem estar presente em poças d`água distantes de rios, bem como em
represas para produção de energia e canais de irrigação destinados à
agricultura.
Os criadouros de B. glabrata podem ainda estar situados em áreas
de ocupação humana em cidades, vilas e assentamentos urbanos e rurais,
principalmente em locais onde as condições de higiene da população são
precárias (incompatíveis com as condições ideais de saúde), onde não há
rede de tratamento de esgoto, ou, que este seja lançado diretamente em rios
próximos das cidades. Em áreas rurais, geralmente, este caramujo habita
locais destinados à agricultura irrigada e ao cultivo de hortaliças,
representando um importante hospedeiro intermediário para S. mansoni
nessas regiões.
Em laboratório é utilizado para manutenção do ciclo de S. mansoni,
por apresentar capacidade de adaptar-se fisiologicamente com o parasito em
seu organismo, fornecendo-lhe substrato essencial à sua multiplicação
(Becker 1980).
Apresentam biologia adaptada para viver em regiões que podem
passar por períodos de seca ou estiagens, em estivação ou anidrobiose, por
suportar as condições desfavoráveis do meio. Em condições adequadas de
luz, temperatura, pH e salinidade, reproduzem-se durante o ano todo,
proliferando rapidamente no ambiente. São animais de grande fecundidade,
começando a oviposição ainda muito jovens, entre 40 e 60 dias após sair do
ovo (Rey 2001).
Figura 4. Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário de Schistosoma
mansoni (adaptado de http://imagens.google.com.br).
Ações e perspectivas no controle de B. glabrata
O caramujo B. grabrata tem sido alvo de bioensaios em
laboratórios onde se procuram resultados positivos com moluscicidas
naturais que possam combatê-lo, impedindo o desenvolvimento das fases
larvais (esporocistos) e as fases larvais de vida livre (cercárias e miracídios)
de S. mansoni. Estes experimentos vêm contribuir na busca do controle da
parasitose, por meio de produtos de baixo valor econômico e de fácil acesso
das populações de menor poder aquisitivo, e para que possam ser
produzidos nos países onde a esquistossomose for endêmica. Algumas
plantas apresentam substâncias capazes de interromper o ciclo evolutivo do
S. mansoni, pois são eficazes no controle dos caramujos e cercárias,
contribuindo, assim, como uma das inúmeras estratégias para se combater
infecções por parasitos (Carvalho et al. 1998; Rug, Ruppel 2000).
A Organização Mundial da Saúde (OMS 1983) recomenda a
procura de plantas dotadas de propriedades moluscicidas e que sejam
aplicáveis in natura na tentativa de provocar menor desequilíbrio ao meio
ambiente. O uso de moluscicidas naturais é simples e pouco dispendioso,
podendo constituir-se em uma técnica apropriada e recomendada para o
controle local do caramujo transmissor, minimizando a transmissão da
esquistossomose (Leyton et al 2005). O controle do caramujo constitui parte
relevante na interrupção do ciclo biológico dessa verminose (Bezerra et al.
2002).
A aplicação de moluscicidas no sentido de combater ou controlar o
caramujo transmissor da Esquistossomose tem uma longa história (Alcanfor
2001). Inicialmente empregou-se sulfato de cobre. Hoje, no entanto, os mais
empregados são a niclosamina ou Clonitralide e n-tritil-morfolina. Estes são
relativamente inertes para o homem, porém devem ser manipulados e
dosados com bastante critério, pois são perigosos para peixes e outros
animais vertebrados. Em vista disto, esses moluscicidas são mais indicados
para o emprego em canais de irrigação, onde não haja criação de peixes,
nem sejam empregados como bebedouros de animais. Estudos demonstram
que há uma tendência dos caramujos adquirirem resistência quando do uso
prolongado do moluscicida, principalmente ao Bayluscide (Leyton et al.
2005, Gasparoto et al. 2005). Este fator, combinado com o da longa
sobrevida do S. mansoni no homem, requer uma longa e cuidadosa aplicação
de moluscicidas sintéticos, o que tem causado problemas de toxicidade e
contaminação do meio ambiente, uma vez que não há especificidade de alvo,
atingindo não só o caramujo como também o plâncton e animais que
dependem dele para sua sobrevivência, inclusive, o próprio homem.
O ensaio para avaliação da atividade moluscicida natural, proposto
neste trabalho, assim como outros existentes, poderia constituir uma das
alternativas que complementaria a química tradicional no controle do
caramujo transmissor e no combate dos estágios evolutivos do S. mansoni,
pois é um teste de baixo custo operacional e recomendado pela OMS. No
entanto, existem muitos pré-requisitos para que uma planta possa ser
utilizada como moluscicida (Marston, Hostettman 1985; Hostettmann 1989;
Pinheiro, Cortez 2003). Estes dados justificam, portanto, pesquisas que
procurem moluscicidas que atuem diretamente sobre os caramujos e com
baixo impacto ecológico, que sejam tóxicos a todos os estágios de vida do
caramujo, que seja efetivo em baixas concentrações e não sofra modificações
quando em condições naturais, que não seja tóxico às plantações, não deixe
resíduo, e que seja inofensivo ao homem, aos animais domésticos e à vida
aquática não-alvo (Alcanfor 2001).
Diante desta perspectiva, estudos da bioatividade de produtos
naturais e da sua alteração sob o comportamento biológico de caramujos
infectados e não-infectados, têm apresentado resultados positivos em
experimentos de laboratório, onde um maior número de plantas deve ser
testado (Bezerra et al. 2002). Dessa forma, as interpretações obtidas sobre as
ações biológicas que as plantas exercem sobre o caramujo poderão conduzir
ao controle da doença em questão. Além disso, a flora brasileira passa por
processo acelerado de destruição, principalmente para implantação de
monoculturas. Tal atividade põe em risco de extinção espécies de uso
medicinal pela população (Guarim Neto, Morais 2003). Estudos sobre o efeito
de plantas na saúde humana e para o controle de parasitos estariam
promovendo o uso ordenado e a preservação dos produtos naturais.
JUSTIFICATIVA
Diante da importância do caramujo B. glabrata, hospedeiro
intermediário do S. mansoni, como fonte de infecção para o homem,
pesquisadores vêm investigando propriedades moluscicidas e larvicidas de
diferentes espécies de plantas para serem usadas nos programas de controle
integrado da esquistossomose. O controle dos planorbídeos, limitado
praticamente aos métodos físicos, biológicos e com produtos sintéticos,
apresenta até hoje inconveniências. Tem efeito transitório sobre caramujos,
atingindo indistintamente outros animais e plantas, sendo tóxico para os
aplicadores, além de serem empregados produtos de alto custo. Pode não ser
eficaz por um longo período de tempo, desaparecer rápido do meio devido a
mudanças climáticas, ocorrendo assim o repovoamento do local tratado
(Souza, Mendes 1991). Além disso, o uso deste moluscicida pode não atingir
todos os exemplares-alvo no meio aquático, bem como induzir alterações
comportamentais dos caramujos que tentarão sair da água ou estivar
(Sarquis et al. 1997; WHO 1997). Por esses motivos, o uso de moluscicida
sintético tem se limitado a situações excepcionais (Amaral, Porto 1994).
Procuram-se, nos extratos brutos da casca dos caules das plantas
P. emarginatus, M. pubescens e C. urucurana alternativas de controle do
caramujo transmissor e das cercárias de S. mansoni livres na água, visando
a interrupção do ciclo evolutivo antes do parasito entrar em contato com o
hospedeiro definitivo.
Nesse sentido, várias plantas vêm sendo testadas em laboratório, e
aquelas que apresentarem bioatividade poderão ser empregadas como
produtos alternativos complementares no combate futuro de parasitoses. As
espécies selecionadas, nesse bioensaio, são plantas que têm certa
importância florestal e medicinal com ampla distribuição em regiões do
Brasil onde a doença é endêmica.
Estas regiões apresentam um imenso potencial renovável para
produtos com fins terapêuticos como matéria-prima industrial (Vieira,
Martins 2000, Guarin Neto, Morais 2003). Apesar disso, as pesquisas de
substâncias ativas derivadas de plantas, no Brasil, ainda são muito
insipientes, e apenas 15 a 17% das espécies conhecidas foram analisadas
quanto às suas propriedades terapêuticas (Soeyarto 1996). Apesar de ter
havido, até os dias atuais, incrementos significativos desse percentual ainda
há, evidentemente, uma lacuna de conhecimento da flora brasileira a ser
preenchida. Nesse sentido, desenvolver ensaios por meio de experimentação
em laboratório de compostos naturais no controle de caramujos e de
parasitos, torna-se um desafio constante.
OBJETIVOS
1. Utilizar o sistema biológico B. glabrata – S. mansoni como modelo
experimental de estudos da ação de extratos naturais no controle da
esquistossomose.
2. Avaliar a atividade moluscicida das plantas P. emarginatus, M.
pubescens e C. urucurana sobre B. glabrata adultos, jovens, recém-eclodidos,
oviposição e eclosão de massas ovígeras.
3. Verificar a ação moluscicida e cercaricida das plantas P.
emarginatus, M. pubescens e C. urucurana sobre B. glabrata infectada com
miracídios de S. mansoni e sobre suas cercárias livres na água.
4. Estudar alternativas para minimizar o uso de produtos
sintéticos no controle de caramujos, pelo desenvolvimento de substâncias
naturais com propriedades moluscicidas.
Artigo 1
Ação moluscicida do extrato das plantas Pterodon emarginatus Vogel
1837, Magonia pubescens St. Hil, e Croton urucurana Baill 1864, sobre
fases do desenvolvimento biológico de Biomphalaria glabrata (Say,
1818).
RESUMO
Um dos meios recomendados atualmente para reduzir a
transmissão da esquistossomose é que esta se oriente em medidas
integradas de controle. Controlar o hospedeiro intermediário é considerado
imprescindível, destacando-se para esse fim o uso de medidas ambientais e
de substâncias naturais com ação moluscicida na perspectiva de
interromper o ciclo do planorbídeo na natureza. A obtenção de extratos
brutos etanólicos a partir das espécies Pterodon emarginatus, Magonia
pubescens e Croton urucurana proporcionou a realização de bioensaios com
Biomphalaria glabrata adultos e suas fases do desenvolvimento biológico
possibilitando determinar concentrações bioativas destas plantas em
laboratório. A partir dos extratos brutos das cascas dos caules foram
preparadas soluções-mãe de 100ppm para caramujos adultos, que foram
diluídas até se obterem as concentrações de 50, 25 e 12,5ppm para os
bioensaios com caramujos jovens, recém-eclodidos, oviposições e a eclosão
de massas ovígeras. O extrato de P. emarginatus apresentou efeito
moluscicida apenas sobre caramujos recém-eclodidos. Houve pequeno
aumento no número de massas ovígeras durante as oito semanas de
observação ao comparar com o grupo controle. O extrato de M. pubescens
apresentou 100% de bioatividade em quase todas as fases do
desenvolvimento dos caramujos (exceto eclosão), nas concentrações de 100,
50, 25 e 12,5ppm, em apenas doze horas após o início dos experimentos. O
grupo controle não apresentou taxa de mortalidade nas 72 horas de
observação. O extrato de C. urucurana apresentou baixo efeito moluscicida
em relação a M. pubescens. Sobre caramujos adultos, na concentração de
100ppm, foi de 26,6% doze horas após o início dos experimentos. Não foram
observadas mortes durante as 72 horas de observação. Nas concentrações
de 50, 25 e 12,5ppm não se observou bioatividade com as fases adultas e
jovens apenas com caramujos recém-eclodidos. As eclosões das massas
ovígeras deram-se de acordo com o padrão/grupo controle, entre nove e dez
dias quando expostas aos três extratos brutos testados. A bioatividade das
plantas sobre as reações comportamentais dos caramujos permitiu eleger a
espécie M. pubescens como promissora, podendo ser comparada aos
moluscicidas sintéticos pela eficácia em atuar em todas as fases do
desenvolvimento biológico dos caramujos.
PALAVRAS CHAVE: Biomphalaria glabrata, Croton urucurana,
Magonia pubescens, Pterodon emarginatus e Schistosoma.
ABSTRACT
One of the recommended ways to lessen the transmission of the
schistosomose currently is to have it based on integrated control measures.
The action against the intermediary host is considered as indispensable; for
this purpose, it is essential the use of environmental measures and of
natural substances with molluscicide action with the intention of
interrupting the planorbid cycle in the nature. The obtention of brut etanolic
extracts from the species Pterodon emarginatus, Magonia pubescens and
Croton urucurana enabled the realization of the bioassays with adult B.
glabrata and its biological development phasis in which it was possible to
determine bioactive concentrations of these plants in the laboratory. From
the gross extracts of the caulis’s barks were prepared mother-solutions of
100ppm for adult snails, which were diluted in order to obtain the 50, 25
and 12.5ppm concentrations for the bioassays with the young snails, the
newly-developed ones, the laying of eggs and the ovigery masses hatching.
The P. emarginatus extract showed molluscicide effect only over the newly-
developed snails. There was an increasing at the ovigery masses number
during the eight weeks of observation when compared to the controlling
group. The M. pubescens extract demonstrated 100% of bioactivity in all the
snails’ development phasis (with exception of the hatching), on the
concentrations of 100, 50, 25 and 12,5ppm, only in twelve hours after the
start of the experiments. The controlling group did not present death rate
within the 72 hours of observation. The C. urucurana extract presented low
molluscicide effect in respect to the M. pubescens. Regarding the adult
snails, on the 100ppm concentration, it was of 26.6% twelve hours after the
start of the experiments. There were not observed deaths during the 72
hours of observation. On the 50, 25 and 12.5ppm concentrations, there was
not showed bioactivity with the adult and young phasis, only with newly-
developed snails. The ovigery masses hatching occurred according to the
standard/controlling group, between nine and ten days when exposed to the
three gross extracts tested. The bioactivity of the plants over the behavior
reactions of the snails permitted to elect the species M. pubescens as
promising, being comparable to the synthetical molluscicide due to its
efficacy in functioning over all the biological snails’ development phasis.
Key-words: Biomphalaria glabrata, Croton urucurana, Magonia pubescens,
Pterodon emarginatus and Schistosoma.
INTRODUÇÃO
Um dos elementos fundamentais para controlar a transmissão da
Esquistossomose seria o controle dos caramujos, hospedeiros intermediários
de S. mansoni, para interromper o ciclo de vida do parasito no ambiente.
Apesar de serem empregados extensamente, os moluscicidas
sintéticos podem ter eficácia reduzida por condições físico-químicas do
ambiente ou pelas atividades dos caramujos que reduzem parcial ou
completamente o contato com a substância, favorecendo assim sua
sobrevivência (Leyton et al. 2005). A quimioterapia tem-se mostrado valiosa
no combate a Esquistossomose. Considerando que a parasitose não confere
imunidade ao portador como medida profilática, há necessidade de se
eliminar o agente transmissor, mediante a aplicação de substâncias dotadas
de propriedades moluscicidas. A contínua utilização de produtos sintéticos
não seletivos, sem a devida rotatividade, pode causar desequilíbrio ecológico
mediante a eliminação de pequenos animais, explosão populacional de
algumas espécies pela falta de predadores, e ainda a perda da eficiência do
moluscicida mediante a seleção natural de caramujos mais resistentes a este
composto (Kloos, McCullough 1993; Pinheiro, Cortez 2003; Leyton et al.
2005).
O uso de plantas, com propriedades moluscicidas, pode
representar uma alternativa viável, por ser menos agressiva ao ambiente, ser
mais econômica e de fácil aplicação. São recursos renováveis e degradáveis,
não persistindo por muito tempo no ambiente. Ao contrário dos moluscicidas
sintéticos, a resistência a produtos naturais é um processo lento e a longo
prazo. Além disso, alguns extratos possuem atividades tão significantes
quanto os produtos industrializados (Alcanfor et al. 2001). Inúmeras plantas
vêm sendo testadas com o objetivo de encontrar a dosagem ideal somente
sobre o caramujo, suas fases do desenvolvimento e fases larvais do ciclo
evolutivo do S. mansoni (Amorin, Pessoa 1962; Mendes et al. 1984).
Diante da possibilidade de plantas do Cerrado ter função
moluscicida e fazerem parte de um quadro representativo das várias espécies
de plantas medicinais existentes no Brasil, onde a parasitose é endêmica,
foram selecionadas as espécies P. emarginatus, M. pubescens e C. urucurana
para serem testadas.
Assim, neste estudo, com o objetivo de encontrar a concentração
letal dos extratos sobre os caramujos e, visando a avaliação do potencial
moluscicida das espécies vegetais investigadas, realizaram-se os testes sobre
as fases do desenvolvimento biológico de Biomphalaria glabrata.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado no Setor de Parasitologia do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás
(UFG).
As cascas dos caules das espécies Pterodon emarginatus Vogel,
Magonia pubescens St. Hil, e Croton urucurana Baill, foram coletadas na
região de Alto Paraíso, Goiás, no mês de novembro de 2001. Este material
foi trazido ao Laboratório de Bioatividade de Plantas, seco em estufa de
ventilação forçada a 40°C, e, em seguida, moído até baixa granulometria, em
moinho de facas. Uma amostra do pó foi submetida à percolação com etanol,
por 72 horas, por duas vezes consecutivas, à temperatura ambiente, e o
produto filtrado e concentrado em evaporador rotativo, sob vácuo, obtendo-
se o extrato bruto.
A obtenção das soluções-teste se processou por diluição em água
dos extratos brutos de cada planta separadamente para cada concentração.
Foi preparada uma solução-mãe para o extrato de cada planta utilizada no
bioensaio. Utilizou-se 0,07mg de extrato e 700ml de água de
condicionamento, o que corresponde a 100ppm. Para o preparo da solução-
mãe, misturou-se o extrato na água de condicionamento, agitando bem e
utilizando-se a banheira de ultrasom, em seguida, para obter uma solução
homogênea.
A solução-mãe, realizada para cada extrato, foi testada
separadamente três vezes, sendo que, após a análise, aquelas que
apresentaram melhores resultados foram diluídas para 50, 25 e 12,5ppm.
Usando 350ml da solução-mãe, 100ppm, mais 350ml de água de
condicionamento obteve-se, uma solução de 50ppm. Para a solução de
25ppm usaram-se 175ml da solução mãe mais 525ml de água de
condicionamento. Por último, para 12,5ppm foram usados 87,5ml da
solução-mãe mais 612,5ml de água de condicionamento.
Os caramujos B. glabrata foram criados e mantidos no Biotério do
IPTSP/UFG. Eram mantidos em caixa de polietileno, de 30x20x35cm,
contendo cerca de 20 litros de água de condicionamento de caramujo do
reservatório próprio (água em repouso por vários dias, afim de que o cloro
evaporasse). A lavagem das caixas e troca de água foram realizadas
semanalmente. A temperatura ambiente variou entre 27 e 28°C. Os
caramujos eram alimentados com folhas de alface, couve e abóbora e ração a
base de proteínas, carboidratos, fibras e CaCO3, segundo Becker, Lamprecht
(1977). Para a obtenção das massas ovígeras, eram colocados pedaços de
isopor e coletadas semanalmente, antes da limpeza, contadas e depositadas
em caixas de polietileno para criação de caramujos adultos.
Os testes para atividade moluscicida foram realizados de acordo com
as normas de Organização Mundial de Saúde (O.M.S.) (WHO 1995). Consiste
basicamente na imersão do caramujo na solução aquosa do extrato sob
investigação na concentração de 100ppm. Eram considerados mortos os
exemplares que não apresentavam batimentos cardíacos ao serem
observados em microscópio estereoscópio, nem demonstravam qualquer
reação ao serem estimulados.
O bioensaio foi composto por três grupos experimentais de acordo
com os extratos das plantas testados: P. emarginatus, M. pubescens e C.
urucurana, em testes com B. glabrata adulto, com idade aproximada de três
meses e diâmetro de concha de 17 a 23mm, jovens com aproximadamente
30 dias e diâmetro de concha de 2 a 5mm, recém- eclodidos uma semana
após a eclosão, oviposição, massas ovígeras dois dias após a oviposição e
eclosão das massas ovígeras.
Para o bioensaio com a solução-mãe foram utilizados cinco
caramujos adultos em triplicata. Em cada recipiente utilizou-se 200ml da
solução onde os caramujos ficaram mergulhados por 24 horas recebendo
alimentação. Dentro do recipiente foi introduzida uma tela, pouco acima da
superfície da água, afim de que os mesmos permanecessem em condição de
aerobiose sem sair da água. Durante todo tempo foram observadas reações
comportamentais tais como: alimentação, movimentação, posição na concha,
posição no recipiente, acasalamento, oviposição, resposta reflexo ao ser
tocado e o número de caramujos vivos e mortos.
Para cada bioensaio organizou-se o grupo controle com quinze
caramujos cada em recipientes com três litros de água de condicionamento e
dada a mesma alimentação.
Após 24 horas, os caramujos eram retirados da solução e lavados,
lentamente, em água corrente de condicionamento e transferidos para
condições padrão onde eram observados por mais 72 horas. Além das 72
horas de observação, os grupos foram mantidos no laboratório por mais oito
semanas para fazer o controle de oviposição (massas ovígeras).
As massas ovígeras foram coletadas semanalmente e transferidas para
caixas novas para criação de caramujos. A oviposição, por caramujo, após
oito semanas de exposição aos extratos de C. urucurana e P. emarginatus foi
analisada pela Análise de Variância Inteiramente Casualizada.
Para comparar as taxas de mortalidade de B. glabrata expostos aos
extratos de plantas a 100ppm de P. emarginatus, M. pubescens e C.
urucurana, utilizou-se Teste de Qui-Quadrado de Comparações de
Proporções (2x2) com Correção de Continuidade de Yates.
Dosagens
Após o bioensaio com a solução-mãe, os extratos de M. pubescens e
C. urucurana que apresentaram bioatividade tiveram suas concentrações
reduzidas. Ambos foram testados novamente nas concentrações de 50, 25 e
12,5ppm para caramujos adultos, jovens, recém-eclodidos e eclosão de
massas ovígeras. Os grupos ficaram mergulhados em recipientes separados
contendo 200ml da solução por 24 horas. Todos os grupos receberam
alimentação. Durante a exposição foram feitas observações das reações
comportamentais e contagem de caramujos vivos e mortos. Após 24 horas,
os exemplares eram lavados lentamente em água corrente de
condicionamento e colocados em recipientes maiores com água de
condicionamento, alimentação e observados por mais 72 horas.
As massas ovígeras foram coletadas em placas de isopor, no mesmo dia da oviposição, e colocadas na superfície
da água de uma caixa de polietileno. No segundo dia foram transferidas para placa de Petri contendo 15ml de
solução obtidas dos extratos de P. emarginatus, M. pubescens e C. urucurana nas concentrações de 50, 25 e
12,5ppm durante 24 horas. Após este tempo eram lavadas lentamente com água corrente de condicionamento,
transferidas para recipiente com água limpa e observadas por dez dias para verificar a ocorrência de eclosão.
RESULTADOS
A taxa de mortalidade dos caramujos, observada pela perda de
batimentos cardíacos e movimentos, demonstrou que após 24 horas em
exposição ao extrato bruto da casca do caule de P. emnarginatus, à
concentração de 100ppm, estes continuavam em atividade. Ao término das
72 horas de observação todos os exemplares continuavam vivos. Foi
registrado pequeno aumento no número de massas ovígeras durante as oito
semanas de observação quando comparados ao grupo controle (figura 5).
O extrato bruto do caule de M. pubescens apresentou 100% de
bioatividade em doze horas de exposição, em 100, 50, 25 e 12,5ppm, para
caramujos adultos, jovens e recém-eclodidos. Não apresentou efeito sobre a
eclosão das massas ovígeras. O tempo médio de vida dos caramujos expostos
às diferentes concentrações do extrato foi de doze horas.
O extrato bruto da casca do caule de C. urucurana apresentou
26,6% de taxa de mortalidade para caramujos adultos, após 24 horas de
exposição, à concentração de 100ppm. Durante as 72 horas de observação
não foram observadas mortes. Caramujos adultos que sobreviveram à
exposição apresentaram pequeno aumento no número de massas ovígeras
em relação ao grupo controle (figura 5). Sobre caramujos adultos e jovens, o
extrato não apresentou bioatividade nas concentrações de 50, 25 e 12,5ppm.
Apenas caramujos recém-eclodidos em contato com o extrato, foram
sensíveis nas concentrações de 50, 25 e 12,5ppm.
Na tabela I, pode-se comparar a taxa de mortalidade de caramujos
adultos em função do tempo, expostos aos diferentes extratos na
concentração de 100ppm. Houve diferença significativa ( = 124,6 para P<
0,001) entre as taxas de mortalidade dos caramujos expostos a essas
espécies de plantas. O extrato de P. emarginatus não acarretou mortalidade
na concentração testada e no período observado. O extrato de M. pubescens
propiciou a maior taxa de mortalidade dos caramujos já no período de 12 h,
enquanto que o extrato de C. urucurana acarretou mortalidade 24 h após a
exposição.
2
χ
Tabela I. Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata após exposição a
extratos, a 100ppm, da casca do caule das plantas Pterodon emarginatus,
Magonia pubescens e Croton urucurana (n= 15).
Extrato
Tempo de observação (h)
Pterodon
emarginatus
Magonia
pubescens
Croton urucurana Controle
12
0 100 0 0
24
0 - 26,6 0
36
0 - 0 0
Na tabela II e na figura 1, pode-se comparar o número de massas
ovígeras de caramujos adultos em função do tempo, expostos aos extratos de
P. emarginatus e C. urucurana à 100ppm. Não houve diferença significativa
(F
calc=
0,32 < F
0,05unilateral;3;28
= 2,95) na oviposição por caramujo comparando-
se a exposição à planta C. urucurana e à P.emarginatus entre si, nem entre
os extratos de plantas e seus controles. A presença dos extratos das plantas
estudadas não alterou significativamente a oviposição por caramujo.
Tabela II. Oviposição por caramujo, no período de oito semanas, após
exposição por 24 horas aos extratos de Pterodon emarginatus e Croton
urucurana (n= 15).
Semana de Oviposição/caramujo
Extratos
1
a
2
a
3
a
4
a
5
a
6
a
7
a
8
a
Total
Pterodon emarginatus
3,5 3,6 5,3 3,9 2,5 1,4 6,4 2,3 28,9
Controle-Pterodon
2,1 1,3 4,4 3,1 1,4 1,3 2,9 1,9 18,5
Croton urucurana
0,0 0,2 1,6 2 2,7 1,7 1,6 1,6 11,4
Controle-Croton
4,4 3,1 1,4 1,3 2,9 1,9 1,7 1,1 17,8
Total de posturas
10,0 8,2 12,7 10,3 9,6 6,3 12,6 6,8 76,6
Diminuição das concentrações / dosagens
Após o bioensaio com a solução-mãe verificou-se que, dois extratos
(M. pubescens e C. urucurana) apresentaram ação moluscicida sobre os
caramujos em suas diversas fases evolutivas. Na tabela III, podemos
comparar a taxa de mortalidade (%) dos caramujos em diferentes fases do
ciclo biológico, submetidos a extratos de plantas em concentrações
decrescentes (50, 25 e 12,5ppm) (n=15), no período de 72 horas de
observação.
O extrato de M. pubescens, nas três concentrações testadas,
apresentou bioatividade com 100% de mortalidade dos caramujos expostos
após 24 horas, conforme tabela III. O extrato de C. urucurana não
apresentou efeito moluscicida nas concentrações de 50, 25 e 12,5ppm nas
fases evolutivas testadas.
Os dois extratos não apresentaram efeito sobre a eclosão de
massas ovígeras, onde até o final do décimo dia, 100% já haviam eclodido.
Porém apresentaram 100% de mortalidade dos caramujos recém-eclodidos
dessas massas ovígeras, conforme tabela IV.
Em ambos os testes o grupo controle apresentou taxa de
mortalidade zero.
A tabela IV demonstra que não houve efeito, dos três extratos, nas
concentrações de 50, 25 e 12,5ppm sobre a eclosão de massas ovígeras.
Figura 5. Oviposição de Biomphalaria glabrata exposta aos extratos de
Pterodon emarginatus e Croton urucurana a 100ppm no período de oito
semanas (n= 15).
Tabela III. Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata em diferentes
fases do ciclo biológico, submetidos aos extratos de plantas em
concentrações decrescentes (n= 15), no período de 72h de observação.
Fase de vida dos caramujos
Extratos Concentração (ppm)
Adulta Jovem Recém-eclodida
50 100 100 100
25 100 100 100
Magonia pubescens
12,5 100 100 100
50 0 0 100
25 0 0 100
Croton urucurana
12,5 0 0 100
Controle 0 0 0 0
Tabela IV. Percentagem de eclosões de massas ovígeras de Biomphalaria
glabrata, expostas por 24h, em concentrações decrescentes de extratos de
plantas (n= 10)*, no período de 10 dias de observação.
Extratos Concentração (ppm) Efeito sobre massas
ovìgeras
Natimortos (%)
50 0 100
25 0 100
Pterodon emarginatus
12,5 0 100
50 0 100
25 0 100
Magonia pubescens
12,5 0 100
50 0 100
25 0 100
Croton urucurana
12,5 0 100
Controle 0 0 0
* Número de oviposição/caramujo.
DISCUSSÃO
A elucidação dos componentes ativos presentes nas plantas, bem como seus mecanismos de ação vêm sendo
um desafio para pesquisadores empenhados no controle de doenças parasitárias como no caso da
Esquistossomose (Santos, Sant`Ana 2001). As plantas contêm inúmeros constituintes, e seus extratos, quando
testados, podem apresentar efeitos diversos sobre os caramujos. No estudo da atividade biológica de extratos
vegetais, foi importante a seleção de bioensaios para a detecção do efeito sobre o alvo em estudo. Os extratos
utilizados apresentam a vantagem de serem hidrossolúveis, simplificando o preparo da solução, diminuindo
custos e facilitando a aplicação futura em campo.
A atividade moluscicida do extrato de P. emarginatus na
concentração de 100ppm foi evidenciada somente sobre caramujos recém-
eclodidos. Nos experimentos sobre a oviposição foi apresentado um pequeno
aumento, porém não significativo no número de massas ovígeras por
caramujo, comparando-se ao grupo controle. Como observado neste estudo,
conclui-se que a presença do extrato na água não provocou mudanças na
reprodução do caramujo nem mesmo na semana do experimento, no sentido
de interromper a produção de massas ovígeras. Barbosa (1960), em
experimentos realizados com B. glabrata, mostrou que este caramujo,
quando ameaçado ou em condições de estresse, apresenta aumento na
postura de massas ovígeras para garantir a sobrevivência da espécie. A
aplicação do moluscicida na água poderia ter gerado um meio inadequado ao
caramujo, causando pequenas alterações em seus mecanismos fisiológicos.
Andrade et al (1974) e Costa, Grault (2004) realizaram trabalhos
mostrando a influência da alimentação sobre fecundidade e fertilidade de B.
glabrata, e o conseqüente aumento no número de massas ovígeras por
caramujo. Em experimento realizado por Vinaud et al (2001), estes
caramujos apresentaram aumento nas taxas de massas ovígeras quando
alimentados com ração padronizada. Porém, até o presente momento, não
foram encontrados na literatura resultados com extratos, nesse sentido,
apenas sobre inibição parcial como no bioesaio realizado por Souza et al
(1997), que utilizou extrato bruto da casca de Anacardium occidentale
(castanha-de-caju). Esta planta foi testada como moluscicida alternativo
sobre caramujos adultos, demonstrando diminuição na produção de massas
ovígeras. Souza et al (1997) encontraram uma média de massas ovígeras por
caramujo de 8,4 e no grupo controle de 14,53 por um período de trinta dias,
enquanto neste trabalho foi por um período maior, oito semanas.
Outro fator a considerar é que o número de massas ovígeras não foi
constante em todas as semanas, variando para mais ou para menos durante
os meses de março, abril e maio. O trabalho realizado por Souza et al (1997),
não apresenta os meses do ano em que foi efetuado. Em experimentos
desenvolvidos no laboratório do IPTSP/UFG onde foi realizado o presente
trabalho, tem-se observado que ocorre variação nas taxas de oviposição
conforme os meses do ano devido as influências de fatores ambientais.
Bezerra, Becker (1993), em bioensaios com B. glabrata,
demonstraram a ocorrência de alterações nas vias energéticas onde o
caramujo procura adaptar seu metabolismo às condições de estresse e
estivação. Este bioensaio demonstrou que o extrato utilizado interferiu de
algum modo nas estruturas reprodutivas estimulando a oviposição. E,
quando aplicado em doses insuficientes para causar a morte dos caramujos,
pode acarretar certo aumento populacional devido ao aumento na taxa de
oviposição, aumentando, assim, o risco de transmissão da esquistossomose
em regiões endêmicas.
O extrato bruto de M. pubescens foi eficaz como moluscicida em um
pequeno espaço de tempo. Levou apenas doze horas para causar 100% de
mortalidade nas concentrações de 100, 50, 25 e 12,5ppm sobre exemplares
adultos, jovens e recém-eclodidos de B. glabrata. Mendes et al (1984)
realizaram experimentos sobre o B. glabrata adulto confirmando efeito
moluscicida das espécies de Euphorbia splendes Bojer, Arthemisia verlotorum
Lamotte, Caesalpinia peltophoroides Benth, Cássia rugosa G. Don, Eclipta
Alba Hassk, Panicum maximum M., Rumex crispus L., Ruta graveolens L.,
Euphorbia pulcherrima Willd., Joannesia princeps Vell, Leonorus sibiricus L.,
Macrosiphonia guaranítica Muell, Nerium oleander L., Palicourea
nicotianaefolia Cham e Stryphnodendron barbatiman na concentração de
100ppm. Portanto, numa concentração bem maior que as encontradas neste
trabalho.
Pesquisa realizada com extratos da espécie Kielmeyera variabilis
Mart por Pinheiro, Cortez (2003) demonstraram a bioatividade desta sobre
exemplares adultos de B. glabrata na concentração de 12,5ppm. Barbosa,
Mello (1969) encontraram concentrações ainda menores para M. pubescens,
6,7ppm e 7,2ppm para B. glabrata e B. straminea, respectivamente,
comprovando a eficácia destas espécies como moluscicidas em
concentrações menores. Baixas concentrações, como apresentadas por estas
espécies, e por Euphorbia cotinifolia de 1,2 e 2,4ppm e A. occidentale de 1,4
ppm (Mendes et al. 1984) poderão contribuir para diminuir os custos do
controle de doenças parasitárias usando pequenas quantidades de extrato.
Silva et al (2004) realizaram ensaios com extrato etanólico de M.
pubescens sobre larvas do mosquito Aedes aegypti, encontrando efeito
larvicida na concentração entre 3,1 e 36,6ppm. Taninos foram identificados
como a substância química responsável pelo efeito larvicida. Segundo
Alcanfor et al (2001), em testes realizados com as plantas do Cerrado
Stryphnodendron adstringens e S. polyphyllum, foi a composição química,
rica em taninos, que apresentou efeito moluscicida sobre B. glabrata adulto.
Marston, Hostettmann (1985) em estudos realizados com as espécies
Krameria triandra, Hammamelis virginiana e Quercus demonstram que estas
plantas, ricas em taninos, apresentam efeito moluscicida nas concentrações
de 50, 100 e 200ppm, respectivamente, enfatizando que os taninos poderão
constituir uma classe promissora de produtos naturais com efeito tóxico.
O efeito moluscicida de plantas taníferas foi comprovado por
Schaufelberger, Hostettmann (1983) que, através da remoção do componente
químico, tanino, dos extratos, verificaram que os mesmos não apresentavam
bioatividade sobre caramujos. Alcanfor et al (2001), em observação realizada
em cortes histológicos da glândula digestiva de B. glabrata adulto, expostos
aos extratos de plantas ricas em taninos, demonstraram que houve
alterações na histofisiologia dos caramujos. Da Silva (1999) realizou estudos
cromatográficos com taninos presentes em extratos naturais, concluindo que
a maior atividade moluscicida apresentada estava relacionada à quantidade
de taninos condensados presentes na amostra. Sugeriu que este componente
desenvolve maior facilidade de penetração do extrato no tegumento do
caramujo. Outro componente químico encontrado por Leyton et al (2005),
presente na planta Lycopersicon esculentum, seria a presença de açúcar nas
moléculas dos glicoalcalóides esteroidais, o qual parece ser essencial para a
ação moluscicida do extrato.
Os resultados encontrados para o extrato bruto da casca do caule
da planta C. urucurana demonstraram baixo efeito moluscicida: apenas
26,6% de bioatividade para B. glabrata adulto, após 24 horas do contato com
o extrato à concentração de 100ppm. Em concentrações menores que
100ppm não se verificou bioatividade sobre caramujos adultos e jovens. Este
extrato mostrou-se eficaz apenas com caramujos recém-eclodidos das
massas ovígeras, após 24 horas de exposição, à concentração de 50ppm. A
maior sensibilidade aos extratos, pelos caramujos mais jovens, foi
demonstrada por Souza et al (1997), em testes com a espécie A. occidentale
sobre B. glabrata adulto, recém-eclodidos e massas ovígeras. Neste
experimento, os autores demonstraram que a substância química, oriunda
desta planta, o ácido anacárdico, apresentou efeito tóxico nas concentrações
de 2, 0,5 e 30ppm, respectivamente. Estes dados demonstram a necessidade
de experimentos no sentido de encontrar as concentrações ideais para
atingir cada fase do caramujo, que necessita de concentrações diferentes do
mesmo componente químico para sua eficácia.
Nos experimentos realizados neste trabalho sobre massas ovígeras
de B. glabrata, os extratos das espécies P. emarginatus, M. pubescens e C.
urucurana não demonstraram bioatividade. A eclosão ocorreu até dez dias
após a oviposição pelos caramujos nas diversas concentrações testadas.
Leyton et al (2005) testaram soluções obtidas de extratos aquosos “a frio” e
“a quente” da planta Lycopersicon esculentum concluindo que as mesmas
não foram ativas na eclosão das massas ovígeras que ocorreu nove e dez dias
após a oviposição. Os mesmos autores testaram soluções de concentração de
50 até 200ppm, preparadas a partir de extratos etanólico e metanólico desta
planta, demonstrando que ambas não apresentaram bioatividade sobre
massas ovígeras.
A baixa suscetibilidade de massas ovígeras, quando expostas às
concentrações que foram ativas em caramujos adultos, também foi relatada
por Lema (1970), com a planta Phytolacca dodecandra, por Rouquayrol et al
(1973), com a planta Pithecelobium multiflorum, por Pereira et al (1974,
1978), com a planta A. occidentale e Euphorbia cotinifolia e por Mendes et al
(1984, 1986), com diferentes espécies de plantas. Pereira, Souza (1974), em
testes com extratos a partir da folha da planta E. cotinofolia, demonstraram
que a bioatividade sobre a eclosão de massas ovígeras ocorreu com
concentrações aproximadamente 20 vezes superiores àquelas eficazes em
caramujos adultos (2,4ppm) para 48ppm para massas ovígeras. Rouquayrol
et al (1973), em testes com a planta P. multiflorum, determinaram que a
bioatividade do extrato sobre B. glabrata foi de 3 e 4,9ppm, enquanto sobre
massas ovígeras ocorreram em concentrações maiores, 13 e 21ppm.
Segundo Lema, Yau (1974), a baixa suscetibilidade das massas ovígeras aos
moluscicidas é devida, provavelmente, aos altos pesos moleculares das
substâncias químicas presentes nos extratos, impedindo sua penetração
através da membrana gelatinosa das mesmas.
Os extratos de P. emarginatus e C. urucurana, à concentração de
100ppm, não demonstraram provocar alterações sobre o sistema reprodutor
dos caramujos, no sentido de impedir a produção de massas ovígeras. A
espécie P. emarginatus, extrato que não apresentou efeito moluscicida à
100ppm com caramujos adultos, também não inibiu o processo de produção
de massas ovígeras que tiveram continuidade durante a semana de
exposição ao produto. Não foram encontrados, na literatura, registros de
aumento no número de massas ovígeras, como os encontrados neste
trabalho.
O atraso na produção de massas ovígeras, observado para
caramujos expostos ao extrato de C. urucurana, foi registrado por Ré,
Kawano (1987), em bioensaio com extratos da planta Laurus nobilis sobre B.
glabrata adulto e embriões. Demonstraram que a presença do extrato não
impediu que caramujos realizassem oviposição, apenas houve certo atraso
para o início em relação ao grupo controle.
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, percebe-se que não
houve diferença significativa na produção de massas ovígeras por caramujo,
se comparada a exposição à planta C. urucurana e à P. emarginatus entre si,
nem entre os extratos de plantas e seus controles. A presença dos extratos
das plantas estudadas não alterou significativamente a oviposição por
caramujo.
Os extratos P. emarginatus (sem efeito moluscicida), M. pubescens
(100% de mortalidade) e C. urucurana (26.6% de mortalidade), à
concentração de 100ppm com caramujos adultos, apresentaram 100% de
bioatividade sobre caramujos recém-eclodidos. Ré, Kawano (1987)
constataram que caramujos jovens, devido ausência da concha, são mais
sensíveis a produtos químicos em relação a caramujos adultos.
De modo geral, pode-se considerar que houve diferença significativa
entre as taxas de mortalidade dos caramujos expostos a essas espécies de
plantas. O extrato de M. pubescens propiciou a maior taxa de mortalidade
dos caramujos já no período de 12 h, enquanto que o extrato de C.
urucurana acarretou mortalidade 24 h após a exposição. O extrato de P.
emarginatus não acarretou mortalidade na concentração testada e no
período observado.
Em reunião realizada no Rio de Janeiro, em 1987, sobre
moluscicidas naturais, pesquisadores brasileiros consensuaram que um
extrato vegetal, para ser considerado ativo, deve matar 90% dos caramujos
adultos na concentração entre 20ppm e 100ppm para o vegetal bruto
(Mendes et al. 1984).
Inúmeros trabalhos apresentam plantas com alta taxa de
mortalidade para caramujos, em baixas concentrações, podendo ser
comparadas com moluscicidas sintéticos. Portanto, seria necessário o
desenvolvimento de pesquisas, na tentativa de encontrar novas substâncias
ativas nestas plantas, para ampliar os programas de controle da
esquistossomose e incentivar a preservação da flora brasileira, associando-se
medidas de saneamento dirigidas às regiões de risco. Para isto, será
necessária a continuidade de testes com outros seres vivos aquáticos, a fim
de se precisar melhor o impacto do uso de tais extratos em condições
naturais.
Artigo 2
Efeitos dos extratos de Pterodon emarginatus Vogel 1837, Magonia
pubescens St. Hil e Croton urucurana Baill 1864, sobre Biomphalaria
glabrata (Say, 1818) infectada com Schistosoma mansoni (Sambon,
1907) e cercárias.
RESUMO
A esquistossomose é uma doença endêmica que acomete milhões
de pessoas em todo o mundo. É causada por parasitos do gênero
Schistosoma, sendo observada no Brasil a espécie S. mansoni. As formas de
controle da doença são extensamente estudadas e há na diversidade da flora
brasileira, inúmeras plantas com efeitos moluscicida e cercaricida (Carvalho
et al. 1998). O uso de substâncias naturais com efeitos moluscicidas poderia
integrar os sistemas de controle local da esquistossomose no sentido de
diminuir custos e causar menor impacto ecológico possível. Foram testados
os extratos de P. emarginatus em 100ppm, M. pubescens e C. urucurana em
100, 50, 25 e 12,5ppm sobre B. glabrata adultos infectados e sobre cercárias
de Schistosoma mansoni. O extrato de P. emarginatus não apresentou
bioatividade e o de M. pubescens foi eficaz nas quatro concentrações
utilizadas sobre os caramujos e sobre as cercárias. O extrato de C.
urucurana apresentou 100% de bioatividade em 100 e 50ppm e 40% em
25ppm. Em 12,5ppm, este não foi eficaz no período de 72 horas. As quatro
concentrações testadas apresentaram bioatividade sobre cercárias. As
soluções utilizadas não atuaram no desenvolvimento dos esporocistos, pois
não impediram a formação e a liberação de cercárias. Isto demonstra que
seria necessário o uso por um período prolongado e com monitoramento
para interromper o ciclo biológico do parasito. Estudos sobre a toxicidade de
plantas no metabolismo dos caramujos infectados deveriam ser estimulados
para uma possível aplicação em campo visando o controle dos hospedeiros
intermediários do parasito Schistosoma mansoni.
Palavras chave: Biomphalaria glabrata, esquistossomose, planta
moluscicida, Schistosoma mansoni.
ABSTRACT
The schistosomose is an endemic disease that attacks millions of
people around the world. It is caused by the parasite Schistosoma, being
observed in Brazil the species S. mansoni. The ways of controlling this
disease are vastly studied and there were in the Brazilian flora diversity
several plants with molluscicide and cercaricide effect (Carvalho et al. 1998).
The usage of natural substances with molluscicide effect could integrate the
systems of schistosomose local control in order to reduce costs and cause
less possible ecological impact. The extracts were tested on concentrations of
100 ppm the P. emarginatus extract; 100, 50, 25 and 12.5ppm the Magonia
pubescens extracts, Croton urucurana over infected adult B. glabrata and
Schistosoma mansoni cercaricides . The P. emarginatus extract did not
present bioactivity. The M. pubescens extract was efficient on the four
concentrations utilized over the snails and cercaries. The C. urucurana
extract showed 100% of bioactivity on 100 and 50ppm and 40% on 25ppm.
On 12.5ppm it was not efficient within 72 hours. The four concentrations
tested showed bioactivity over the cercaries. The mixtures used did not
actuate over the development of the sporocystes because they did not impede
the formation and liberation of the cercaries. That fact demonstrates that it
would be necessary the usage for a longer period and with monitoring in
order to interrupt the biological cycle of the parasite. Further studies would
be stimulated about those plants’ toxicity over the infected snails’
metabolism for a possible field application, objectifying the control of the
intermediate hosts on the Schistosoma mansoni parasite.
Key-words: Biomphalaria glabrata, molluscicide plant, Schistosoma mansoni
and schistosomose.
INTRODUÇÃO
O caramujo Biomphalaria glabrata representa um dos principais
agentes para a transmissão da esquistossomose no Brasil. Esta espécie atua
como hospedeiro intermediário obrigatório do trematódeo Schistosoma
mansoni, causador da parasitose (Paraense 1956; Rey 1956). Estes
caramujos desenvolvem-se em meio aquático e com vegetação submersa,
mesmo ambiente onde ocorre parte do desenvolvimento do ciclo biológico do
parasito. A transmissão das formas larvais ao hospedeiro intermediário e ao
hospedeiro definitivo ocorre na água, que exerce papel fundamental nas
fases de vida livre do parasito – ovo, miracídios e cercárias (Amaral, Porto
1994). Dessa forma, assegura a propagação da doença principalmente em
locais onde o homem, por razões trabalhistas e/ou de lazer, promove
mudanças ambientais favoráveis à manutenção do hospedeiro intermediário
e do próprio parasito na natureza.
A esquistossomose é uma doença endêmica, que atinge milhares de
pessoas por todo o mundo, principalmente em países em desenvolvimento.
Conta com tratamento eficaz e conhecido, mesmo assim ainda é uma
importante causa de mortalidade por doenças parasitárias nestes países,
causando graves prejuízos econômicos e de saúde pública. A infecção ocorre
logo na faixa etária de maior produção e as pessoas ficam impossibilitadas
de trabalharem deixando de contribuir para o desenvolvimento de seus
países por um longo período de tempo.
O ciclo biológico deste parasito já foi extensamente estudado e seu
mapa genético recentemente concluído. Muitos estudos voltados no sentido
de interromper a transmissão da doença utilizam moluscicidas no controle
dos hospedeiros intermediários e larvicidas no combate as formas
infectantes, miracídios e cercárias, estão em andamento (Carvalho et al.
1998; Bezerra et al. 2002). Para Mendes et al (1999), embora a distribuição
geográfica da esquistossomose tenha sido alterada, devido aos programas de
controle, o número de pessoas infectadas ou que vivem em locais com risco
de infecção não tem sido reduzido. Estes dados justificam a busca por
medicamentos alternativos para o controle dos caramujos, além de
moluscicidas eficazes, econômicos e de baixo impacto ecológico. O uso de
plantas, que apresentam efeito moluscicida e cercaricida, pode representar
uma alternativa viável quando integrado às demais medidas de controle
desta parasitose.
Este estudo mostra o efeito dos extratos vegetais de Pterodon
emarginatus Vogel leguminosaea, (sucupira branca), Magonia pubescens St.
Hil, Sapindacea, (tingüi) e Croton urucurana Baill 1864, Euphorbiaceae,
(sangra d`água) sobre caramujos infectados com Schistosoma mansoni e
sobre cercárias livres na água através de bioensaio realizado em laboratório.
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado no Setor de Parasitologia do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás
(UFG).
As cascas dos caules das espécies Pterodon emarginatus, Magonia
pubescens e Croton urucurana foram coletadas na região de Alto Paraíso,
Goiás, no mês de novembro de 2001 e processadas no Laboratório de
Bioatividade de Plantas, IPTSP/UFG. Para obtenção do extrato bruto, o
material foi seco em estufa de ventilação forçada a 40°C, e, em seguida,
moído até baixa granulometria, em moinho de facas. Parte do pó foi
submetida à percolação com etanol, por 72 horas, por duas vezes
consecutivas, à temperatura ambiente, e o produto filtrado e concentrado em
evaporador rotativo, sob vácuo.
A obtenção das soluções-teste partiu inicialmente de uma solução-
mãe com 0,07mg de extrato bruto e 700ml de água de condicionamento
resultando uma concentração de 100ppm.
Os caramujos B. glabrata infectados foram mantidos no Biotério do
IPTSP/UFG em caixas com água de condicionamento, ou seja, água
desclorada, à temperatura entre 27 e 28ºC. Foram alimentados com folhas
de alface, couve e abóbora, e ração a base de proteínas, carboidratos, fibras
e CaCO3, segundo Becker, Lamprecht (1977).
Estabelecimento do Ciclo Evolutivo de Schistosoma mansoni
Os camundongos BALB/C, utilizados para a manutenção do ciclo
biológico de S. mansoni, cepa BH, foram mantidos no Biotério do
IPTSP/UFG. A infecção deu-se pela exposição individual de caramujos
infectados à luz artificial, provocando a liberação das cercárias em água de
condicionamento. Em seguida, a água contendo cercárias era colocada num
recipiente formando um pool que foi inoculado na região subdérmica. Após
60 dias, estes camundongos foram necropsiados, e o fígado e baço, contendo
ovos do parasito, foram triturados e colocados em água. Os ovos em contato
com a água liberaram os miracídios que, por sua vez, penetraram nos
caramujos e, cerca de quatro semanas após, liberaram cercárias,
completando o ciclo em laboratório.
Os testes para atividade moluscicida foram realizados de acordo com
as normas da Organização Mundial de Saúde (OMS) (WHO 1995). Consiste,
basicamente, na imersão do caramujo na solução aquosa do extrato sob
investigação na concentração de 100ppm. Foram considerados mortos os
exemplares que não apresentavam batimentos cardíacos, ao serem
observados em microscópio estereoscópio, nem demonstravam qualquer
reação ao serem estimulados.
Bioensaio com caramujos infectados
Após a determinação dos bioensaios com caramujos não-
infectados, as plantas P. emarginatus, M. pubescens e C. urucurana que
apresentaram alguma bioatividade, foram selecionadas para o bioensaio com
caramujos infectados com S. mansoni. Após cinco dias da infecção com
miracídios, os caramujos foram submetidos à exposição a extratos das
plantas selecionadas: P. emarginatus (100ppm), M. pubescens (100, 50, 25 e
12,5ppm) e C. urucurana (100, 50, 25 e 12,5ppm), que foram as
concentrações testadas com caramujos não-infectados.
Os caramujos foram mantidos por 24 horas na solução, recebendo
alimentação. Após esse tempo, foram retirados e lavados lentamente com
água corrente de condicionamento, colocados em recipiente contendo cinco
litros de água limpa, sendo observados por mais 72 horas para registro da
mortalidade. Para avaliar a taxa de mortalidade dos caramujos infectados
com S. mansoni, em diferentes extratos de plantas com concentrações
decrescentes, utilizou-se o Teste Exato de Fisher.
Após 72 horas de observação, os caramujos infectados foram
mantidos no laboratório por oito semanas para o controle de massas ovígeras,
que foi analisada pela Análise de Variância Inteiramente Casualizada.
Foram realizadas observações para comparar o número de massas
ovígeras entre caramujos infectados e não-infectados durante oito semanas. A
comparação da oviposição por caramujo infectado por S. mansoni e não-
infectado foi realizada pelo teste t de Student para amostras independentes
heterocedásticas. Avaliou-se também a associação entre o tempo de vida do
caramujo e a quantidade de oviposição quando infectados e não-infectados.
Após 40 dias da exposição, os caramujos infectados que
sobreviveram aos extratos foram colocados separadamente, um a um, para
eliminar cercárias sob influência da luz e aumento da temperatura induzido
por uma lâmpada durante 60 minutos.
Os experimentos foram acompanhados por grupos controle,
contendo o mesmo número de caramujos infectados em condições padrão de
laboratório.
A influência do moluscicida foi avaliada pela taxa de mortalidade
das cercárias e inibição do desenvolvimento do ciclo de S. mansoni através da
eliminação ou não de cercárias. Para comparar a quantidade de cercárias
eliminadas por caramujo na presença dos extratos das plantas P.
emarginatus e C. urucurana, após 60 minutos de exposição à luz, na quinta
semana de infecção com S. mansoni, utilizou-se o Teste t de Student para
amostras independentes homocedásticas.
Bioensaio com cercárias de Schistosoma mansoni
As cercárias de S. mansoni foram coletadas a partir de B. glabrata
infectadas experimentalmente após 40 dias. O teste foi realizado em
triplicata nas concentrações de100ppm para P. emarginatus; 100, 50, 25 e
12,5ppm para M. pubescens e 100, 50, 25 e 12,5ppm para C. urucurana As
cercárias foram submetidas às soluções por duas horas, tendo sido
realizadas as leituras com 15, 30, 60 e 120 minutos de exposição.
O experimento foi acompanhado por um grupo controle, contendo
cercárias para observação do tempo de vida das mesmas.
RESULTADOS
O extrato de P. emarginatus, na concentração de 100ppm, não
apresentou bioatividade sobre caramujos adultos infectados com S. mansoni,
em 24 horas de exposição nem sobre cercárias livres na água (tabelas V e
VIII).
O extrato da espécie M. pubescens nas concentrações de 100, 50,
25 e 12,5ppm, apresentou 100% de taxa de mortalidade em doze horas de
exposição enquanto o grupo exposto ao extrato de C. urucurana apresentou
100% em 100 e 50ppm, com 24 horas, 40% em 25ppm, com 36 horas, e em
12,5ppm não apresentou bioatividade.
Houve diferença significativa na taxa de mortalidade [valor-p
(0,03<0,05); entre os extratos de M. pubescens e C. urucurana para as
concentrações de 25 e 12,5 ppm (Tabela V)]. Em concentrações maiores,
ambas apresentam a mesma mortalidade.
Não houve diferença significativa (F
calc=
0,10 < F
0,05unilateral;3;28
= 2,95)
na oviposição por caramujo infectado, comparando-se a exposição à planta
C.urucurana e à P. emarginatus entre si, nem entre os extratos de plantas e
seus controles. A presença dos extratos das plantas estudadas não alterou a
oviposição por caramujo infectado (tabela VI e figura 6).
Porém, houve diferença significativa (
calc
t
=3,1 >
=
9;05,0 unilateral
t
1,8)
da quantidade de oviposição entre os caramujos infectados (
=x
6,4
ovos/caramujo e s=3,9 ovos/caramujo) e não-infectados (
=x
2,2
ovos/caramujo e s=1,1 ovo/caramujo). Houve forte correlação positiva entre
o tempo de vida do caramujo infectado e a quantidade de oviposição ( =
0,74), porém, para o caramujo não-infectado, a correlação foi menos intensa
e negativa ( =-0,30) (figura 7).
oit
r
;
onit
r
;
Os caramujos expostos ao extrato de C. urucurana eliminaram
cercárias após 40 dias da infecção com miracídios de S. mansoni (tabela VII).
A diferença entre o grupo exposto ao extrato e seu grupo controle não foi
significativa (
calc
t
=0,04 < = 1,7). Entre (Controle-Pterodon) e o
grupo exposto, a diferença também não foi significativa (
28;05,0 unilateral
t
calc
t
=0,39 <
= 1,7).
28;05,0 unilateral
t
Com o grupo cercária (tabela VIII) o extrato a 100ppm de P.
emarginatus não apresentou bioatividade. Com M pubescens a 100 e 50ppm,
a bioatividade ocorreu a partir de quinze minutos, e em 25 e 12,5ppm em 60
minutos. Já com C. urucurana em 100 e 50ppm, a bioatividade ocorreu em
60 minutos de exposição, em 25ppm após duas horas e em 12,5ppm após
três horas.
Tabela V. Taxa de mortalidade (%) de Biomphalaria glabrata
infectados com Schistosoma mansoni, sob concentrações decrescentes de
extratos de plantas (n=15), no período de 72 h de observação.
Extratos Concentração (ppm) Taxa de mortalidade
Pterodon emarginatus
100 0
Magonia pubescens
100 100
50 100
25 100*
12,5 100*
Croton urucurana
100 100
50 100
25 40*
12,5 0*
Controle 0 0
* Diferença significativa para valor-p (0,03<0,05), pelo Teste Exato de Fisher.
Tabela VI. Oviposição de Biomphalaria glabrata infectado com Schistosoma
mansoni num período de oito semanas de exposição aos extratos de Pterodon
emarginatus (100ppm) e Croton urucurana (12,5ppm) (n=15).
Semana de Oviposição/caramujo
Extratos
1
a
2
a
3
a
4
a
5
a
6
a
7
a
8
a
Total
Pterodon emarginatus
3,5 4,3 4,5 4,9 3,7 5,7 6,9 4,4 37,9
Controle-Pterodon
2,8 3,8 4,7 3,1 2,6 2,9 3,8 3,1 26,7
Croton urucurana
3,1 5,1 3,4 6 5,2 4,4 5,7 3,0 35,9
Controle-Croton
4,1 7,1 1,5 3,2 2,5 2,4 1,7 2,4 24,9
Total
13,5 20,2 14,1 17,2 14,0 15,4 18,1 12,9 125,4
Figura 6. Oviposição de Biomphalaria glabrata infectado com Schistosoma
mansoni no período de oito semanas após exposição aos extratos de Pterodon
emarginatus (100ppm) e Croton urucurana (12,5ppm) (n=15).
Figura 7. Oviposição de Biomphalaria glabrata infectados com Schistosoma
mansoni e não-infectados, num período de 8 semanas.
Tabela VII. Quantidade de cercárias liberadas por Biomphalaria glabrata na
presença de extratos de plantas, após 60 minutos de exposição à luz
artificial.
Caramujos
Extratos
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15
Total
Pterodon
emarginatus
8 12 5 7 6 4 9 11 0 0 0 0 0 0 0 62
Controle-
Pterodon
2 7 0 10 10 12 11 0 0 0 0 0 0 0 0 52
Cróton
urucurana
8 5 7 5 11 10 3 1 12 0 0 0 0 0 0 62
Controle-
Croton
2 8 11 9 3 10 3 12 5 0 0 0 0 0 0 63
Tabela VIII. Taxa de mortalidade (%) das cercárias expostas a concentrações
decrescentes de extratos de plantas (n=15), no período de 24 h de
observação.
Tempo (min)
Extratos Concentração (ppm)
15 30 60 120 >300
Pterodon emarginatus
100 0 0 0 0 0
Magonia pubescens
100 100 - - - -
50 100 - - - -
25 0 100 - - -
12,5 0 0 0 100 -
Croton urucurana
100 100 - - - -
50 100 - - - -
25 0 0 0 100 -
12,5 0 0 0 0 100
Controle 0 0 0 0 0 0
DISCUSSÃO
A importância do caramujo B. glabrata como hospedeiro intermediário de S. mansoni é bastante conhecida. Ele
desempenha papel crucial na transmissão da esquistossomose, pois é um elemento obrigatório no
desenvolvimento do ciclo biológico deste parasito. Apesar desta enfermidade, passível de prevenção e cura, o
custo de seu controle ainda é alto. Assim, controlar as populações de caramujos é extremamente importante
para o controle eficaz desta parasitose no sentido de interromper o ciclo evolutivo do parasito e prevenir a
infecção humana (Souza et al. 1997). O controle, que pode ser feito por meio de moluscicidas sintéticos, tem
apresentado danos ao ecossistema por estes não apresentarem especificidade de alvo. Associado ao controle do
hospedeiro intermediário, o tratamento das pessoas infectadas até o presente momento reduz a morbidade, mas
não evita a transmissão da doença, pois não imuniza o paciente, além de provocarem na maioria das vezes,
efeitos colaterais desagradáveis.
A necessidade de moluscicidas eficientes e ecologicamente aceitáveis tem impulsionado as pesquisas de
produtos naturais na busca de substâncias ativas para o desenvolvimento de moluscicidas alternativos (Kloos,
McCullough 1993), visando o controle do caramujo transmissor bem como o combate das formas infectantes –
miracídios e cercárias. Portanto, o uso de plantas com propriedades moluscicidas e cercaricidas é considerado
promissor no controle da esquistossomose uma vez que, pelos resultados encontrados na literatura, as plantas
moluscicidas apresentam também função larvicida em meio aquático. (Carvalho et al. 1998; Silva et al. 2004;
Vinaud 2005).
Neste trabalho, o extrato de M. pubescens testado sobre B. glabrata
adulto não-infectado apresentou efeito moluscicida em concentrações de
100, 50, 25 e 12,5ppm. Estes resultados mostraram-se próximos daqueles
recomendados pela OMS (WHO 1997) para servirem como moluscicidas de
origem vegetal. Caramujos infectados com miracídios de S. mansoni,
submetidos ao bioensaio com extrato bruto desta espécie, apresentaram
100% de bioatividade nas concentrações utilizadas. O experimento mostrou
que o moluscicida foi eficaz igualmente para exemplares infectados e não-
infectados. Assim outras espécies que apresentam efeito moluscicida para
caramujos não-infectados poderão ser utilizadas também para o controle de
caramujos infectados.
A atividade moluscicida dos extratos brutos de C. urucurana sobre caramujos infectados foi mais acentuado do
que sobre caramujos não-infectados. Em bioensaio realizado com caramujos não-infectados, os resultados
prévios, foram, para taxa de mortalidade, de 26,6% em 100ppm e em concentrações menores 50, 25 e 12,5ppm
não foi apresentada bioatividade. Nos testes com caramujos infectados apresentou 100% de mortalidade nas
concentrações de 100 e 50ppm, em 24 horas de exposição ao extrato. Após 36 horas do início da exposição em
25ppm, apresentou 40% de taxa de mortalidade. Estes dados mostram que houve maior sensibilidade à
atuação dos extratos em caramujos infectados comparado aos não-infectados.
Foi significativa a diferença encontrada na taxa de mortalidade
entre os extratos de M. pubescens e C. urucurana para as concentrações de
25 e 12,5 ppm. Pode-se afirmar, com 95% de confiança, que os extratos de
M. pubescens provocam maior mortalidade em caramujos infectados com
Schistosoma mansoni que os extratos de C. urucurana, considerando-se as
concentrações de 25 e de 12,5 ppm. Em concentrações maiores, ambas
apresentam a mesma mortalidade. Entretanto, o extrato de P. emarginatus,
mesmo a 100ppm, não causou mortalidade nos caramujos infectados.
Os moluscicidas utilizados apresentaram algum efeito de toxicidade na fisiologia dos caramujos infectados em
curto espaço de tempo. Estudos mostram que B. glabrata apresenta grande capacidade de adaptar-se às
condições ecofisiológicas adversas, entre elas a da infecção (Becker 1980; Shaw, Erasmus 1987; Bezerra et al.
1999; Alcanfor 2001). Pela condição fisiológica de infecção, o caramujo já apresenta certas deficiências
nutricionais que são desviadas para a manutenção do ciclo biológico do parasito, que retira do hospedeiro os
substratos essenciais à sua multiplicação (Becker 1980). Trabalhos realizados por Bacila (1970), Richards
(1967) e Bezerraet al (1999) têm mostrado que, em condições contrárias, o caramujo readapta seu metabolismo
no sentido de garantir sua sobrevivência no ambiente. Neste bioensaio não foi observada tal situação e sim a
morte dos caramujos expostos.
Os estudos realizados por Tenge et al (1979), Liebsch, Becker (1990) e Zelck (1999), demonstraram que
caramujos infectados sofrem alterações fisiológicas e metabólicas, que poderiam ser comparadas com o
metabolismo adaptativo do caramujo em jejum onde, em ambas as situações, precisam garantir a sobrevivência
da espécie. Apesar destas condições de adaptação, onde o caramujo B. glabrata pode sobreviver por algum
tempo, os experimentos realizados neste trabalho mostraram que, quando expostos aos extratos, tais ajustes
não ocorreram no sentido de garantir a sobrevivência temporária dos mesmos.
O efeito letal instantâneo de extratos sobre caramujos infectados representa um dado importante no controle da
transmissão da esquistossomose devido às características comportamentais do hospedeiro intermediário.
Estudos mostram que caramujos podem desenvolver resistência a moluscicidas sobrevivendo à exposição e,
após o efeito químico do produto, retornar às condições de sobrevivência e, até mesmo, os parasitos retornarem
à continuidade do ciclo (Barbosa, Barbosa 1958). Através de estudos bioquímicos de extratos derivados de
plantas sobre caramujos infectados, será possível determinar a ação destes no metabolismo do caramujo, bem
como monitorar as concentrações bioativas e o tempo necessário para que o produto permaneça na água para
causar tal efeito.
Os caramujos que foram submetidos à infecção por miracídios de
S. mansoni liberaram cercárias ao mesmo tempo, que seu grupo controle
demonstrando que o extrato não apresentou efeito no ciclo evolutivo do
parasito, que ocorre no interior do caramujo. Não houve diferença
significativa na quantidade de cercárias liberadas por caramujos infectados,
quando o meio não contém extrato de planta (Controle-Croton) e quando o
meio continha extrato de C. urucurana. Também não houve diferença
significativa de liberação de cercárias quando os caramujos infectados
estavam em meio sem extrato de planta (Controle-Pterodon) e quando o meio
continha extrato de P. emarginatus. A presença dos extratos dessas plantas
não alterou a quantidade de cercárias liberadas por caramujo infectado.
Pela produção e liberação de cercárias ficou evidenciado que estes extratos não atuaram no desenvolvimento
dos esporocistos. Em bioensaio realizado por Zidam et al (1998), utilizando extratos de Azolla pinnata sobre
miracídios e cercárias, mostrou-se o efeito larvicida de 100 e 19,45%, respectivamente, numa concentração de
6600ppm. Neste mesmo estudo, os autores demonstraram que a presença do extrato na água não impediu que
ocorresse a infecção do hospedeiro intermediário pelos miracídios.
Os caramujos que sobreviveram aos extratos de C. urucurana e P.
emarginatus realizaram postura de massas ovígeras demonstrando não
haver diferença significativa na oviposição por caramujo infectado,
comparando-se a exposição às plantas C. urucurana e a P. emarginatus entre
si, nem entre os extratos de plantas e seus controles. A presença dos
extratos das plantas estudadas não demonstrou alteração na oviposição por
caramujo infectado.
Os dois extratos utilizados apresentaram efeito cercaricida nas concentrações de 100, 50, 25 e 12,5ppm. Os
experimentos realizados com M. pubescens demonstraram alta toxicidade sobre larvas cercárias livres na água.
Em trabalho realizado por Silva et al (2004), em testes com este mesmo extrato sobre larvas do mosquito Aedes
aegypti, foi demonstrado efeito larvicida nas concentrações entre 3,1 e 36,6ppm. Estes dados apresentam que o
efeito larvicicida ocorre com concentrações menores que o efeito moluscicida. Em bioensaios realizados por Rug,
Ruppel (2000), utilizando extratos da planta Jathropa curcas em 25ppm, foi demonstrado, também, que
cercárias apresentam acentuada sensibilidade à presença de cercaricidas no meio aquático.
Este trabalho, assim como outros vários, mostrou que os extratos de origem vegetal têm mostrado eficácia como
moluscicida e como larvicida sobre as formas aquáticas de transmissão da esquistossomose. Tais resultados
podem gerar indicadores de possível controle local integrado da parasitose, uma vez que as formas larvais deste
parasito habitam o mesmo ambiente aquático do caramujo B. glabrata.
CONCLUSÕES FINAIS
1. Os sistemas de ensaio foram sensíveis e reprodutíveis, baseados nas
reações comportamentais e na taxa de mortalidade de B. glabrata e
suas massas ovígeras e cercárias de S. mansoni expostas.
2. O extrato bruto da casca do caule da planta P. emarginatus não
apresentou eficácia moluscicida para caramujos adultos na
concentração de 100ppm, sendo verificado ação moluscicida sobre
caramujos recém-eclodidos.
3. O extrato bruto da casca do caule da planta M. pubescens apresentou
100% de bioatividade sobre caramujos adultos, jovens, recém-
eclodidos e cercárias de S. mansoni em 100, 50, 25 e 12,5ppm.
4. O extrato bruto da casca do caule da planta C. urucurana sobre B.
glabrata adultos não-infectados a concentração de 100ppm
apresentou efeito moluscicida de 26,6%. E com caramujos adultos
infectados foram ativas em 100%, as concentrações de 100 e 50ppm,
em 40% a concentração de 25ppm e em 12,5ppm não apresentou
biatividade. Os efeitos moluscicida sobre caramujos recém-eclodidos e
o efeito cercaricida foi verificado nas quatro concentrações testadas.
5. A eclosão de massas ovígeras foi observada em até dez dias não
demonstrando influência dos extratos estudados.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho foi realizado na forma de dois artigos, tendo como
eixo fundamental o controle alternativo e integrado da esquistossomose, bem
como a proteção e a conservação da flora brasileira. Plantas de regiões do
Brasil, consideradas endêmicas para esta parasitose, como P. emarginatus,
M. pubescens e C. urucurana foram estudadas quanto às suas propriedades
moluscicidas e larvicidas.
O primeiro artigo apresenta a ação moluscicida das plantas
selecionadas no bioensaio sobre B. glabrata, não-infectada com larvas de S.
mansoni, em suas diversas fases evolutivas.
O segundo artigo mostra, de maneira ainda não encontrada na
literatura, a ação dos extratos das plantas sobre B. glabrata infectada, com
miracídios de S. mansoni. Apresenta, também, os efeitos dos mesmos
extratos sobre cercárias, na tentativa de busca de resultados para
interromper o ciclo do parasito de forma integrada.
Os produtos sintéticos utilizados nos programas de controle da
esquistossomose apresentam resultados tóxicos aos caramujos. Porém têm
baixa seletividade atuando sobre espécies vegetais e animais, podendo
prejudicar o equilíbrio ecológico local, além de ser tóxico ao homem no ato
da aplicação.
A procura, cada vez maior, por substâncias que sejam menos
tóxicas e facilmente biodegradáveis tem aumentado o desenvolvimento de
pesquisas sobre o uso de moluscicidas de origem vegetal. Várias plantas são
citadas, na literatura, como promissoras no controle das esquistossomoses.
Além disso, regiões do Brasil, com vegetação de conhecimento
popular sobre suas funções terapêuticas, sofrem processo de desmatamento
para dar lugar à monocutltura de produtos comercializáveis. Portanto, o
incentivo a pesquisas sobre produtos moluscicidas e cercaricidas estaria não
só incentivando o controle do caramujo transmissor e da cercária de S.
mansoni, mas também promovendo a preservação da flora brasileira.
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