( PDF ) Caracterização molecular de amostras mistas de Rotavirus A e de adenovirus humano detectados a partir de amostras fecais provenientes de crianças da região Centro-Oeste do Brasil

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

ERIKA REGINA LEAL DE FREITAS

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AMOSTRAS MISTAS DE ROTAVIRUS A E

DE ADENOVIRUS HUMANO DETECTADOS A PARTIR DE AMOSTRAS FECAIS

PROVENIENTES DE CRIANÇAS DA REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL

Orientadora: Profa. Dra. Divina das Dôres de Paula Cardoso

Dissertação de Mestrado

Goiânia-Goiás

2006

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Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

ERIKA REGINA LEAL DE FREITAS

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AMOSTRAS MISTAS DE ROTAVIRUS A E

DE ADENOVIRUS HUMANO DETECTADOS A PARTIR DE AMOSTRAS FECAIS

PROVENIENTES DE CRIANÇAS DA REGIÃO CENTRO-OESTE DO BRASIL

Orientadora: Profa. Dra. Divina das Dôres de Paula Cardoso

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Tropical da

Universidade Federal de Goiás como

requisito parcial para obtenção do Grau de

Mestre, na área de concentração de

Microbiologia.

Goiânia-Goiás

2006

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À minha filha Maria Paula, pela paciência e carinho;

ao meu esposo Roserlan, pelo incentivo e

companheirismo; e em especial à minha avó Maria

pelo amor e dedicação em todos os momentos da

minha vida.

Meu eterno carinho a todos os professores que fizeram

parte da minha vida estudantil, e despertaram em mim

o gosto pela biologia e a vontade de aprender sempre

mais, em especial a Profa. Dra. Divina das Dores de

Paula Cardoso, que sempre me incentivou a crescer,

cuja sabedoria, bondade e orientação tornaram

possível a concretização de um sonho, a realização

deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me dar vida e força para continuar superando os obstáculos e continuar buscando

pelos meus objetivos.

A toda minha família, pelo carinho e compreensão em todos os momentos da minha vida.

À Profa. Dra. Wilia Marta E. D. Brito por ter acreditado em mim desde o princípio, quando

ainda na especialização me encaminhou ao Laboratório de Virologia Humana-IPTSP/UFG.

Aos meus amigos que estão e que estiveram no Laboratório de Virologia Humana, Ana Maria

T. Borges, Fabíola S. Fiaccadori, Rodrigo Alessandro T. Santos, Paula Andréia Silva e

Menira B.L.D. Souza, pela amizade, paciência, ensinamentos, convívio e colaboração neste

trabalho.

Às colegas e amigas do Laboratório de Virologia Animal, Bernadete T. Alfaia, Alessandra

C.V.C. Barbosa, Talissa M. Tavares, Letícia Aparecida Silva, Denise L. Barthasson e Marieta

P. M. Souza, pelo apoio na realização dos cultivos celulares, sobretudo, pela amizade e

estímulo tornando-se mais fácil essa conquista.

Aos professores do departamento de Microbiologia do IPTSP/UFG, especialmente a Dra.

Regina Maria B. Martins e Dra. Megmar Aparecida S. Carneiro.

Ao Laboratório de Biologia Molecular/ICB/UFG, em especial a Profa. Dra. Célia Maria A.

Soares e Juliana Parente, pela paciência, suporte técnico e científico no desenvolvimento

deste trabalho.

Aos bolsistas e estagiários do Laboratório de Virologia, Vinícius B. Silva, Dean Frank V.

Silva e Raquel C. Franco, pela amizade e auxílio neste trabalho.

Aos servidores do Instituto de patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, que de forma direta

ou indireta, ajudaram na realização deste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical pela constante colaboração.

As crianças e aos seus responsáveis que participaram neste estudo, minha eterna gratidão.

SUMÁRIO

Lista de siglas e abreviaturas iii

Lista de figuras, tabelas e quadros vi

RESUMO viii

ABSTRACT ix

I. INTRODUÇÃO 1

1.1- Considerações gerais 1

1.2- Propriedades gerais de Rotavirus A e adenovírus humano 3

1.2.1- Rotavirus A 3

1.2.1.1- Estrutura morfológica, protéica e genômica 3

1.2.1.2- Classificação dos Rotavirus 12

1.2.1.3- Infecções mistas por Rotavirus A 14

1.2.1.4- Diagnóstico laboratorial para Rotavirus A 15

1.2.1.4.1- Detecção viral 15

1.2.1.4.2- Caracterização viral 16

1.2.2- Adenovirus humano 18

1.2.2.1- Estrutura morfológica, protéica e genômica 18

1.2.2.2- Classificação dos adenovírus humanos 23

1.2.2.3- Adenovírus entéricos 24

1.2.2.4- Diagnóstico laboratorial para adenovírus humano 25

1.2.2.4.1- Detecção viral 25

1.2.2.4.2- Caracterização viral 27

II- JUSTIFICATIVA 28

III- OBJETIVOS 30

IV- MATERIAL E MÉTODOS 31

4.1- Material de estudo 31

4.2- Metodologia 31

4.2.1- Cultivo celular e propagação viral de adenovírus humano 31

4.2.2- Extração do dsRNA de Rotavirus A e dsDNA de adenovírus humano 32

4.2.3- Caracterização molecular das amostras Rotavirus A 33

4.2.3.1- Genotipagem P por hemi-nested-RT-PCR 33

4.2.3.2- Sequenciamento genômico direto a partir do produto de amplificação da

hemi-nested-RT-PCR 35

4.2.3.2.1-Purificação do produto da hemi-nested-RT-PCR e quantificação do DNA 35

4.2.3.2.2- Reação de sequenciamento 35

4.2.4- Caracterização molecular das amostras de adenovirus humano 36

4.2.4.1- Determinação da espécie de adenovírus humano através da multiplex-PCR 36

4.2.4.2- Determinação do sorotipo de adenovírus humano através da PCR-RFLP 37

4.2.4.3- Sequenciamento genômico direto a partir do produto de amplificação

da PCR de amostras de adenovírus entéricos 38

4.2.4.3.1- Reação de sequenciamento 39

V- RESULTADOS 40

5.1- Rotavirus A 40

5.1.1- Características das amostras Rotavirus A 40

5.1.2- Genotipagem P por hemi-nested-RT-PCR 40

5.1.3- Sequenciamento genômico de amostras Rotavirus A reagentes mais de um

iniciador P 42

5.2- Adenovírus humano 47

5.2.1- Características das amostras de adenovírus humanos 47

5.2.2- Identificação das espécies de adenovírus humanos por multiplex-PCR 47

5.2.3- Determinação das espécies de adenovírus humanos por

multiplex-PCR-específico 49

5.2.4- Determinação dos sorotipos de adenovírus humano por PCR-RFLP 51

5.2.5- Sequenciamento genômico de amostras de adenovírus entéricos 53

VI- DISCUSSÃO 55

VII- CONCLUSÕES 60

VIII- APÊNDICE 61

IX- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 64

iii

LISTAS DE SIGLAS E ABREVIATURAS

aa- Aminoácido

AdV- Adenovírus

AdVH- Adenovírus humano

ATP- Adenosina trifosfato

A-549- Células de carcinoma de pulmão humano

C- Citosina

CaCo-2- Células de carcinoma de cólon humano

Core- Cerne

Da- Dalton

DBP- DNA Binding Protein (Proteína de ligação ao DNA)

DLP- Double-Layered Particles (Partícula viral de dupla camada)

DMSO- Dimetil sulfóxido

DNA- Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucléico)

dNTP- Deoxinucleoside triphosphate (desoxirribonucleotídeo trifosfato)

dsDNA- double strand Deoxyribonucleic Acid (DNA fita dupla)

dsRNA- double strand Ribonucleic Acid (RNA fita dupla)

Ead- Enteric Adenovirus (Adenovírus entérico)

ECP- Efeito citopático

EGPA- Eletroforese em gel de poliacrilamida

eIF- eukaryotic Initiation Factor (Fator de iniciação eucariótica)

EIE- Ensaio imunoenzimático

EIERA- Ensaio imunoenzimático combinado para rotavírus e adenovírus

e-value- Valor de referência

FC- Fixação de complemento

Fita-d- Fita direita

Fita-e- Fita esquerda

g- Unidade média de força relativa

g- Grama

G- Guanina

GTP- Guanosina trifosfato

HDF- Células diplóide de fibroblasto de embrião humano

HEK- Células de rim de embrião humano

HEK-293- Células de rim de embrião humano transformadas com DNA de AdVH5

HeLa- Células de carcinoma de cérvice uterina

HEp-2- Células de carcinoma epidermóide de laringe humana

HI- Inibição da hemaglutinação

IF- Imunofluorescência

IFI- Imunofluorescência indireta

IME- Imunomicroscopia eletrônica

IPTSP- Instituto da Patologia Tropical e Saúde Pública

ITRs- Inverted Terminal Repeat sequences (Seqüência Terminal Repetida Invertida)

KB- Células de carcinoma bucal

kDa- KiloDalton

MA-104- Células de rim de macaco Rhesus

MAb- Monoclonal Antibodie (Anticorpo monoclonal)

ME- Microscopia eletrônica

MEM- Meio essencial mínimo

MLP- Major Late Promoter (Promotor maior tardio)

MRC-5- Células de fibroblasto de pulmão de embrião humano

mRNA- RNA mensageiro

M- Molar

mL- Mililitro

mM- Milimolar

μg- Micrograma

μl- Microlitro

μM- Micromolar

ng- Nanograma

nm- Nanômetro

NDP- Nucleotídeo difosfato

NSP- Non-structural protein (Proteína não estrutural)

NTP- Nucleotídeo trifosfato

ORF- Open Reading Frame (Quadro aberto de leitura)

PABP- Poly(A) Binding Protein (Poli(A) ligante de proteína)

pb- Pares de base

PBS- Phosphato Buffer Salt (Tampão fosfato salina)

PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia pela polimerase)

pH- Potencial de hidrogênio

q.s.p- Quantidade suficiente para

RE- Retículo endoplasmático

RFLP- Restriction Fragment Lenght Polymorphism (Polimorfismo de fragmentos

de DNA por clivagem com enzima de restrição)

RNA- Ribonucleic Acid (Ácido ribonucléico)

RT- Reverse Transcription (Transcrição Reversa)

RV- Rotavírus

SA-11- Rotavírus símio

SDS- Sulfato duodecil de sódio

SFB- Soro fetal bovino

SN- Soroneutralização

ssRNA- single strand Ribonucleic Acid (RNA fita simples)

TP- Terminal Protein (Proteína terminal)

UFG-Universidade Federal de Goiás

UV- Ultra-violeta

U- (enzima) Unidade de atividade enzimática

U- (antibiótico) Unidade

VA- Vírus associado

VP- Viral Protein (Proteína viral)

°C- Graus Celsius

%- Porcentagem

LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS

Figuras

Figura 1- Estrutura tridimensional da partícula de rotavírus. 4

Figura 2- Organização genômica dos rotavírus representada por 1 dos 11

segmentos do dsRNA. 12

Figura 3- Modelo de um virion de adenovirus humano, sorotipo 2 (AdVH2). 19

Figura 4- Organização genômica de adenovírus humano, espécie E (AdVH-E). 22

Figura 5- Eletroforese em gel de agarose de amostras submetidas a

hemi-nested-RT-PCR utilizando pool de iniciadores e iniciadores em separado

(1T1 -P[8]e 3T1-P[6]). 41

Figura 6- Árvore filogenética referente à seqüência nucleotídica do gene de VP4

de amostras mistas de Rotavírus A construída pelo Clustal X e Tree View. 45

Figura 7- Fluxograma apresentando as etapas da carcterização molecular das

amostras de Rotavirus A 46

Figura 8- Efeito citopático de amostras de adenovírus humano em células Hep-2. 48

Figura 9- Eletroforese em gel de agarose mostrando a comparação do produto

amplificado por multiplex-PCR proveniente de: a) suspensão fecal e b) lisado

celular obtido a partir de propagação viral em células HEp-2. 49

Figura 10- Perfil de cinco amostras de adenovírus em eletroforese em gel de

agarose a partir da PCR-RFLP por digestão do produto amplificado (956pb)

pelas enzimas: a) HinfI, b) HaeIII e C) StyI. 52

Figura 11- Árvore filogenética da seqüência nucleotídica do gene do

Hexon de AdVH41 construída pelo Clustal X e Tree View. 53

Figura 12- Fluxograma apresentando as etapas da carcterização molecular das

amostras de adenovírus humano. 54

Quadros

Quadro 1- Classificação dos adenovírus humanos 24

Quadro 2- Iniciadores utilizados para a reação de hemi-nested-RT-PCR para detecção

dos genótipos P de Rotavirus A (Gentsch et al. 1992). 33

vii

Quadro 3- Iniciadores utilizados para a PCR-multiplex para a detecção de

Adenovírus Humano (Pring-Åkerblom et al. 1999). 36

Quadro 4- Iniciadores utilizados para PCR-RFLP (Saitoh-Inagawa et al.1996). 37

Quadro 5- Identificação das amostras mistas para genótipo P - Rotavirus A-

por comparação a amostras depositadas no GenBank utilizando o

programa BLAST. 43

Quadro 6- Identificação das nove amostras P[8] - Rotavirus A –

por comparação a amostras depositadas no GenBank utilizando o

programa BLAST. 43

Quadro 7- Características das amostras confirmadas como infecções mistas por mais

de um genótipo P. 44

Tabelas

Tabela 1- Genótipos P de Rotavirus A detectados por hemi-nested-RT-PCR

utilizando pool de iniciadores e iniciadores P em separado

(1T1-P[8], 2T1-P[4] e 3T1-P[6])- Genotipagem anterior X Genotipagem atual. 41

Tabela 2- Amostras mistas de Rotavírus A caracterizadas por sequenciamento

genômico em relação a hemi-nested-RT-PCR. 42

Tabela 3- Espécies de adenovírus humano definidas por multiplex-PCR considerando

lisados celulares e suspensão fecal. 50

Tabela 4- Distribuição das espécies de adenovírus humano caracterizadas por

Multiplex-PCR a partir de lisado celular obtido após propagação viral em

células HEp-2, considerando a cidade de coleta das amostras fecais. 51

Tabela 5- Sorotipos de adenovírus humanos determinados por PCR-RFLP a

partir de lisados celulares após propagação viral em células HEp-2, considerando

a cidade de coleta das amostras. 51

viii

RESUMO

A gastroenterite viral é importante em termos de morbidade e mortalidade infantil,

especialmente em países em desenvolvimento. Os Rotavírus A são considerados os principais

agentes etiológicos de gastroenterite aguda, e os adenovirus entéricos (EAd) são

freqüentemente associados a surtos esporádicos de gastroenterite no mundo todo. Este

trabalho teve como objetivos a identificação de infecções mistas por Rotavirus A relativas ao

genótipo P por hemi-nested-RT-PCR com confirmação por sequenciamento genômico, bem

como a determinação das espécies de adenovírus humano (AdVH) por multiplex-PCR e

respectivos sorotipos por PCR-RFLP após propagação viral em células HEp-2 e confirmação

de EAd por sequenciamento genômico. Foi observado que de 81 amostras de Rotavírus A que

em estudos anteriores reagiram para mais de um genótipo P, 25 (30,8%) foram confirmadas

para essa condição por hemi-nested-RT-PCR usando iniciadores em separado. Destas, 14,8 %

(12/81) foram confirmadas como mistas após sequenciamento genômico. Das 12 amostras, 10

foram P[6]P[8], uma P[4]P[6] e uma P[4]P[6]P[8]. Em relação a adenovírus humano, de 74

amostras, 39 (52,7%) foram confirmadas por multiplex-PCR sendo que 30 (76,9%) foram da

espécie F, seis (15,4%) da espécie C, duas (5,1%) da espécie A e uma (2,5%) se apresentou

como mista para as espécies F e C. Ademais, foram determinados por PCR-RFLP os sorotipos

de 34 das 39 amostras de AdVH, sendo que 14 (41,7%)foram AdVH41, 15 (44,1%) AdVH40

e cinco (14,7%) AdVH5. Uma amostra de EAd sorotipo 41 foi confirmada por

sequenciamento genômico. Os dados obtidos neste estudo mostram a importância de uma

constante monitorização de infecções mistas por Rotavírus A, uma vez que essas podem

refletir na eficácia da vacina que está sendo utilizada no Brasil. Com relação aos adenovírus

humanos, os resultados encontrados também demonstram a importância desses vírus,

principalmente os entéricos, na etiologia da gastroenterite na região Centro-Oeste do País.

ABSTRACT

Viral gastroenteritis is an important cause of morbidity and mortality among children, mainly

in developing countries. Rotavirus A is considered the major etiologic agent of acute

gastroenteritis and enteric adenovirus (Ead) are frequently associated with sporadic

gastroenteritis outbreak worldwide. This study aimed the identification of Rotavirus A mixed

infection regarding P genotype by hemi-nested-RT-PCR with confirmation by genomic

sequencing, and characterization of the human adenovirus specie by multiplex-PCR, and their

serotypes by PCR-RFLP after viral propagation in HEp-2 cells, with subsequent confirmation

of enteric serotype by genomic sequencing. Previously, 81 Rotavirus A samples, were

considered to be mixed infection for P genotypes. In this study, 25 of those samples were

confirmed as mixed infection after genotyping by hemi-nested-RT-PCR using specific primers

separately and 14.8% (12/81) of the samples were confirmed by genomic sequencing as

mixed P genotype. Ten of these 12 samples were P[6]P[8], one P[4][6] and one P[4]P[6]P[8].

Concerning the human adenovirus, from 74 samples, 39 (52.7%) were confirmed by

multiplex-PCR and from those, 30 (76.9%) were species F, six (15.4%) specie C, two (5.1%)

specie A and one (2.5%) was mixed specie F and C. Additionally, it was determined by PCR-

RFLP the serotype from 34 of those 39 AdVH samples: 14 (41.7%) were AdVH41, 15

(44.1%) were AdVH40 and 5 (14.7%) were AdVH5. One EAd sample serotype 41 was

confirmed by genomic sequencing. Data from this study show the importance of

monitorization of mixed infections by Rotavirus A since, it can influence the efficacy of the

vaccine that is being used in our country. Similarly data obtained in this study for human

adenovirus also shows the importance of these viruses, mainly as etiological agent of

gastroenteritis in our region.

I-INTRODUÇÃO

1.1-Considerações gerais

A gastroenterite é causa importante de morbidade e mortalidade infantil,

especialmente em países em desenvolvimento (Bern et al. 1992, Parashar et al. 2003) e

estima-se, em termos mundiais, a ocorrência de 1,5 bilhões de casos de diarréia aguda por ano

em crianças menores de cinco anos de idade, com cerca de três milhões de óbitos (Bern et al.

1992, Murray & Lopez, 1997, Kapikian et al. 2001).

Embora desde a década de 1940 os vírus tenham sido considerados como possíveis

agentes etiológicos da gastroenterite (Parashar et al. 1998), apenas em 1972 essa associação

foi confirmada, a partir da visualização por imunomicroscopia eletrônica (IME) do vírus

Norwalk em amostras fecais de jovens e adultos com diarréia aguda (Kapikian et al. 1972).

Bishop et al. (1973) observaram por microscopia eletrônica (ME) a presença de partículas

hoje denominadas rotavírus em cortes histológicos da mucosa duodenal de crianças com

gastroenterite. Em 1975, os astrovírus (Madeley & Cosgrove, 1975) e adenovírus entéricos

foram identificados em fezes de crianças com quadro de diarréia aguda (Flewett et al. 1975).

Atualmente, mais de 20 vírus têm sido reconhecidos como agente causal de

gastroenterite e, destes, são reconhecidas como clinicamente importantes vírus pertencentes a

quatro famílias/gêneros: Reoviridae/Rotavirus, Caliciviridae/Norovirus e Sapovirus,

Adenoviridae/Mastadenovirus e Astroviridae/Mamastrovirus (Wilhelmi et al. 2003).

Rotavírus A é o agente etiológico mais importante da gastroenterite viral aguda em

crianças (Kapikian, 1997) e considera-se que estes vírus sejam responsabilizados, anualmente,

por aproximadamente 111 milhões de episódios de gastroenterite, 2 milhões de

hospitalizações e 440 mil óbitos em crianças com menos de cinco anos de idade (Parashar et

al. 2003).

Embora os adenovírus humanos sejam mais associados a infecções respiratórias,

alguns sorotipos são relacionados à diarréia e considerados globalmente significantes quando

associado a surtos esporádicos de gastroenterite aguda em diversos países do mundo (Chiba et

al. 1983, Van et al. 1992). Estudos conduzidos em diversos países indicam que os adenovírus

entéricos (EAd40 e EAd41) apresentam incidência de infecção variável, sendo esta em países

desenvolvidos de 1% a 18% (Wood et al. 1988, Bates et al. 1993, Bon et al. 1999), enquanto

que, em países em desenvolvimento, esta tem sido estimada em 1% a 31% (Cruz et al. 1990,

Stewien et al. 1993, Soares et al. 2002). Embora os sorotipos de adenovírus mais

freqüentemente associados a gastroenterite sejam os sorotipos 40 e 41 (espécie F), outros

sorotipos como 12, 18 e 31 (espécie A) (Brown et al. 1996), e os sorotipos 1, 2 e 5 (espécie C)

também têm sido associados à doença (Gomes et al. 1989, Horwitz, 2001, Li et al. 2005).

A gastroenterite por Rotavírus A pode ser prevenida pela vacinação, mas em função da

extensiva variabilidade antigênica destes vírus com ocorrência de genotipos particulares em

determinadas regiões geográficas (Gouvea et al. 1994, Leite et al. 1996), bem como

emergência de genotipos em determinado período de tempo e local (Unicomb et al. 1999,

Araújo et al. 2001), torna-se necessário uma vigilância mundial das amostras circulantes

inclusive a partir da introdução de vacina específica em diferentes regiões do mundo

(Linhares et al. in press).

Por outro lado, a gastroenterite por adenovírus ainda não é prevenível por vacinação,

desde que, até o momento, só existem vacinas contra os sorotipos 4 e 7, os quais são

relacionados a doença respiratória, sendo usadas em militares (Gurwith et al. 1989).

Finalmente, em razão do impacto dos Rotavírus A e adenovírus humano no processo

da diarréia infantil e também considerando a extensiva variabilidade antigênica destes

últimos, admite-se que o controle e a erradicação desses agentes constituem, hoje, metas para

a saúde pública em plano mundial.

1.2-Propriedades gerais de Rotavirus A e adenovírus humano

1.2.1-Rotavírus A

1.2.1.1- Estrutura morfológica, protéica e genômica

Os Rotavírus A são vírus desnudos, com simetria icosaédrica e o virion possui

aproximadamente 100 nm de diâmetro. Apresenta três camadas concêntricas de proteínas

(capsídeo) que circundam o genoma viral. A camada mais interna ou core (Figura 1C), que

envolve o genoma é formada por 60 dímeros de proteína VP2, que interage com VP1 e VP3

organizados na forma de 12 complexos enzimáticos aderidos à superfície interna de VP2,

sendo que as proteínas VP1 e VP3 ligam-se diretamente ao RNA. A camada intermediária é

formada por 260 trímeros de VP6 formando partículas virais de dupla camada (DLPs). A

camada externa é composta de duas proteínas, VP4 e VP7 (Figura 1B). A superfície externa

plana do vírus é formada de 780 cópias da proteína VP7, organizadas como trímeros,

enquanto 120 cópias de VP4 estão dispostas como espículas, organizadas como dímeros,

projetando-se aproximadamente em 12 nm da superfície externa (Estes & Cohen, 1989, Estes,

2001, Pesavento et al. 2003).

Esses vírus possuem ainda uma característica estrutural singular na forma de 132

grandes canais que se estendem desde a camada externa até o core viral, permitindo a entrada

de metabólitos para transcrição do RNA e saída de RNA mensageiro (mRNA) para o processo

subseqüente da replicação viral, poden ser distinguidos três tipos de canais (I, II e III) (Figura

1B) baseado em sua posição e tamanho (Prasad et al. 1988).

As partículas maduras de Rotavirus A possuem seis proteínas estruturais (Figura 1).

Estas são designadas pela sigla VP seguida de um número arábico (VP1, 2, 3, 4, 6, 7).

Ademais, durante o ciclo de infecção viral, a proteína VP4 é clivada gerando duas proteínas as

quais são designadas pela adição de “asterisco” após o número, VP5* e VP8* (Estes &

Cohen, 1989).

Segmentos

RNA

Proteínas

mRNA transcrito

A B

Figura 1 – Estrutura tridimensional da partícula de rotavírus. A – Eletroforese em gel de poliacrilamida

mostrando os 11 segmentos do dsRNA formando o genoma dos rotavírus (neste exemplo SA-11) e as proteínas

codificadas por cada um desses segmentos. B – Estrutura tridimensional da partícula completa dos rotavírus

determinada por eletrocriomicroscopia associada ao processamento da imagem por computador. C – Estrutura

tridimensional da camada intermediária e interna da partícula dos rotavírus determinada também por

eletrocriomicroscopia associada ao processamento da imagem por computador (modificado de Estes, 2001).

VP1 - A proteína VP1 é codificada pelo segmento 1 e representa 2% da massa

presente no virion. Possui massa molecular de aproximadamente 125 kDa, sendo constituída

por 1088 aminoácidos (aa). Como referido, a VP1, juntamente com VP2 e VP3, formam o

core viral (Cohen et al. 1989, Estes & Cohen, 1989). Estudos indicam que a VP1 é uma RNA

polimerase e funciona tanto como uma transcriptase como uma replicase. A análise da

seqüência de VP1 mostra que esta contém seqüências típicas de RNA polimerase - RNA-

dependente (Cohen et al. 1989, Mattion et al. 1994) e que, quando da expressão em

baculovírus, esta intermedia a replicação viral atuando como replicase (Patton et al. 1993,

Zeng et al. 1996). Por outro lado, tem sido mostrado que para essa atividade a VP1 requer a

presença de VP2 (Patton et al. 1993).

VP2 – A proteína VP2 é codificada pelo segmento 2. Possui aproximadamente 102

kDa, sendo constituída por 880 aa. (Liu et al. 1988). É a proteína estrutural mais abundante do

core viral, sendo altamente imunogênica e os anticorpos para esta proteína são considerados

indicadores de infecção primária (Bican et al. 1982, Svensson et al. 1987, Conner et al. 1988,

Liu et al. 1988,). Estudos têm mostrado que VP2 possui afinidade não específica para RNA

fita simples (ssRNA) e RNA fita dupla (dsRNA), embora esta afinidade para ssRNA seja maior

que para dsRNA (Boyle & Holmes, 1986). Considera-se que a afinidade de VP2 por ssRNA

possa estar associada com o empacotamento do mRNA viral dentro do core durante o processo

de replicação. Devido ao seu tamanho e resistência, o dsRNA deve ser curvado para se

encaixar dentro do core e esta curvatura tem sido atribuída como função dessa proteína

(Kapahnke et al. 1986).

VP3 – A VP3 é codificada pelo segmento 3. Possui 98 kDa, sendo constituída por 835

aa (Liu et al. 1988). Estudos têm mostrado que VP3 pode ligar-se a região N-teminal de VP2,

uma região na qual VP1 também se liga, sendo esta região requerida para a replicação (Labbe

et al. 1994, Zeng et al. 1998). VP3 liga-se covalentemente a guanosina trifosfato (GTP), o que

sugere ser esta uma guanililtransferase (Pizarro et al., 1991, Liu et al. 1992). Essa proteína

também é considerada como uma metiltransferase, por possuir atividade de acoplar resíduos

cap aos mRNAs transcritos (Chen et al. 1999, Patton & Chen, 1999).

VP4 – A proteína VP4, que constitui a camada externa do vírus é codificada pelo

segmento 4, possui aproximadamente 88 kDa, sendo constituída por 776 aa (Liu et al. 1988,

Estes & Cohen, 1989, Shaw et al. 1993). Estudos mostram, que esta proteína atua na adsorção

e penetração viral, tem ação de hemaglutina, e está associada à restrição do crescimento viral

em cultura celular (Greenberg et al. 1983b). Induz a formação de anticorpos neutralizantes

(Hoshino et al. 1985, Offit & Blavat, 1986), tanto in vitro (Greenberg et al. 1983a, Coulson et

al. 1985, Taniguchi et al. 1985, Hoshino et al. 1985, Burns et al. 1988), quanto in vivo,

observada a partir de imunização passiva de camudongos (Offit et al. 1986). VP4 é

susceptível a proteólise, processo que facilita a entrada do vírus na célula (Kaljot et al. 1988).

Pela clivagem desta proteína, são geradas duas proteínas, VP8* (28 kDa, 247 aa) e VP5* (60

kDa, 529 aa). Estudos mostram que a entrada do vírus na célula é um processo que envolve

receptores contendo ácido siálico, no passo inicial da adsorção, e integrinas tais como αvβ3,

α4β1, α2β1, durante os passos subsequentes pós-adsorção (Coulson et al. 1997, Guerrero et

al. 2000, Zarate et al. 2000). Neste processo, o domínio VP8* está envolvido na interação

com ácido siálico, enquanto VP5* está implicada na interação com as integrinas. Não

obstante, a utilização de ácido siálico não é fato comum, uma vez que grande número de

amostras de rotavírus provenientes de animais incluindo de humanos não o utilizam como

receptor inicial (Ciarlet et al. 2001). Nessas amostras, a maioria dos anticorpos monoclonais

neutralizantes que reconhecem VP4 selecionam mutações em VP5*, sugerindo que a entrada

na célula é mediada por VP5* (Kobayashi et al. 1990, Padilla-Noriega et al. 1995, Kirkwood

et al. 1996).

VP6 – É a proteína que forma a camada intermediária do vírus. Possui 41 kDa, sendo

constituída por 397 aa e é codificada pelo segmento 6 do genoma viral. Constitui cerca de 50-

60% da massa viral sendo, portanto, o maior constituinte protéico estrutural das partículas

virais completas (Estes & Cohen, 1989, Prasad & Chiu, 1994). A VP6 tem papel essencial na

estrutura do virion, uma vez que faz interações, tanto com ambas as proteínas da camada

externa (VP4 e VP7), quanto com a proteína do core (VP2). Forma trímeros espontaneamente

e é extremamente estável (Estes et al. 1987). É proteína hidrofóbica, altamente imunogênica

(Gorziglia et al. 1985, Estes et al. 1987, Sabara et al. 1987) e considera-se que possa ter papel

na imunidade protetora (Burns et al. 1996). Na VP6, a presença de epítopos antigênicos

comuns caracterizam os antígenos de grupo (espécie) e a presença ou a ausência de outros

determinantes antigênicos nessa proteína determina também a especificidade para subgrupos

(RVA-RVG) (Kalica et al. 1981, Greenberg et al. 1983c).

VP7 – Esta proteína possui 326 aa e 37 kDa, podendo ser codificada pelos segmentos

7, 8 ou 9 do genoma, dependendo da amostra viral (Estes & Cohen, 1989, Prasad et al. 1990).

A VP7 é uma glicoproteína e forma a camada externa do vírus. É a segunda proteína mais

abundante do virion. A VP7 é considerada como antígeno capaz de elicitar a formação de

anticorpos neutralizantes e responsável pela determinação de sorotipos G (Kalica et al. 1981,

Greenberg et al. 1983b, Hoshino & Kapikian, 1996). Estudos mostram que a parte glicídica

desta proteína é constituída apenas de manose (Arias et al. 1982, Ericson et al. 1982,

Kabcenell & Atkison, 1985), sendo os resíduos de manose encontrados tanto na VP7

intracelular quanto extracelular (Kabcenell & Atkison, 1985, Kabcenell et al. 1988). No

processo intracelular, ela é co-traducionalmente glicosilada e inserida dentro da membrana do

retículo endoplasmático (RE), sendo essa inserção dirigida através de uma sequência sinal

clivável encontrada na região amino-terminal da proteína (Both et al. 1983, Ericson et al.

1983, Kabcenell & Atkison, 1985). Acredita-se que a presença de íons cálcio (Ca

) seja

necessária para a manutenção da estabilidade de VP7 e por sua associação com o RE durante

a maturação do virion (Abmadian & Shabrabadi, 1999). Experimentos em culturas celulares

indicam que essa glicoproteína desempenha um papel na adsorção viral conferindo

estabilidade às espículas de VP4 e facilitando a apresentação dos epítopos funcionais dessa

proteína (Prasad & Estes, 1997). Sua interação com VP4 parece também exercer influência na

especificidade de ligação de VP4 ao receptor celular da célula alvo (Sabara et al. 1985, Ludert

et al. 1996).

Além das proteínas estruturais, o genoma viral codifica também seis proteínas não

estruturais que são designadas pela sigla NSP, seguida de um número de 1 a 6, que varia de

acordo com a sua ordem de migração em gel de poliacrilamida (Prasad & Estes, 1997).

Destas, cinco estão envolvidas na replicação viral (NSP1, NSP2, NSP3, NSP5 e NSP6) e uma

na morfogênese e virulência viral (NSP4). Todas as proteínas não estruturais, exceto NSP4,

interagem com o ácido nucléico (Estes, 2001).

NSP1 - É uma proteína com 58 kDa, formada por 495 aa que são codificados pelo

segmento 5 do genoma viral. Ela é expressa em baixos níveis na célula infectada. Ensaio de

imunofluorescência indireta (IFI) indica que a NSP1 não é acumulada no viroplasma, mas de

forma pontuada no citoplasma possivelmente em associação com o citoesqueleto (Hua &

Patton, 1994). Estudo utilizando cultura celular mostra que a NSP1 parece não ser essencial

para a replicação viral, muito embora se admita que esta possa ser implicada como um fator

de virulência em camundongos (Broome et al. 1993), o mesmo não tendo sido observado para

suínos e coelhos (Bridger et al. 1998, Ciarlet et al. 2000a). Essa proteína é a menos

conservada das proteínas virais, mostrando maiores variações que VP4 ou VP7. A NSP1

contém um domínio conservado de zinco, mas em função deste ser perdido em algumas

amostras virais, considera-se não ser este essencial para a replicação viral (Okada et al. 1999).

NSP2 - Essa proteína é codificada pelos segmentos 7, 8 ou 9, dependendo da amostra

viral. Possui 35 kDa e 317 aa. Esta tem a habilidade de se ligar não especificamente a ssRNA,

uma característica que permite a formação de complexos de proteína e RNA (Kattoura et al.

1992, Taraporewala et al. 1999). É expressa em níveis altos nas células infectadas, sendo

acumulada no viroplasma (Petrie et al. 1984). A análise das características de crescimento de

um rotavírus tsE mutante sensível a temperatura com alterações no segmento oito, indicam

que NSP2 é essencial para a formação de viroplasma e para a replicação genômica (Ramig &

Petrie, 1984, Gombold et al. 1985). Estudos bioquímicos usando NSP2 recombinante têm

mostrado que ela forma octâmeros, tem atividade de desestabilizar a hélice do ácido nucléico,

sendo esta desestabilização independente de íons magnésio (Mg

) e adenosina trifosfato

(ATP). Ainda, NSP2 possui atividade de nucleotídeo trifosfatase (NTPase), que na presença

de Mg

catalisa a hidrólise de todos os quatros NTPs para nucleotídeos difosfato (NDPs).

Ademais tem sido observado que a hidrólise de NTPs resulta na fosforilação de NSP2 tanto in

vitro quanto in vivo. Sugere-se, ainda, que a atividade NTPase de NSP2 forneça à proteína a

energia necessária para funcionar como um motor molecular dirigindo o empacotamento do

mRNA viral (Taraporewala et al. 1999, Taraporewala & Patton, 2001).

NSP3 – É codificada pelos segmentos 7, 8 ou 9 do genoma viral. Possui 63 kDa e 315

aa, é uma proteína ácida e pouco abundante na célula infectada (Estes, 2001). Na célula

hospedeira, a mensagem de capeamento é reconhecida pelo fator de iniciação eucariótica

(eIF4E) e a mensagem de poliadenilação por uma poli(A) ligante de proteína (PABP), os

quais vão interagir com o fator eIF4G, uma proteína adaptadora que é responsável pela

entrega da mensagem cap e poliadenilação para o ribossoma. Os rotavírus, como referido, não

possuem cauda poli (A), mas possuem uma seqüência consenso na sua extremidade terminal

3’ que especificamente liga-se a NSP3 de maneira que, enquanto o domínio N-terminal de

NSP3 liga-se a esta seqüência consenso, metade do domínio C-terminal interage com eIF4G

com uma afinidade maior que com PABP possibilitando uma tradução viral seletiva durante a

infecção. Desta forma, NSP3 é uma proteína codificada pelo vírus para subverter a

maquinaria de tradução da célula hospedeira e seletivamente aumentar a tradução do mRNA

viral (Poncet et al. 1993, Piron et al. 1998, Vende et al. 2000, Deo et al. 2002, Groft & Burley,

2002, Jayaram et al. 2004).

NSP4 – O gene 10 apresenta extensiva variabilidade genética o que leva o seu

produto, a proteína NSP4, ser classificada em cinco genogrupos: A (KUN), B (Wa), C (AU-

1), D (EW) e E (avian-like) (Ciarlet et al. 2000b, Ito et al. 2001, Mori et al. 2002). A proteína

é glicosilada e ligada ao RE. Possui 28 kDa e 175 aa (Mattion et al. 1994, Tian et al. 1996). A

NSP4 é uma proteína que não se liga ao RNA e estudos mostram que ela possui papel na

morfogênese viral e também na virulência por funcionar como uma enterotoxina. Na

morfogênese viral ela funciona como um receptor intracelular por mediar a conversão de

partículas de dupla camada no citoplasma para partículas de tripla camada no RE. Estudos

realizados com rotavírus de símio (SA-11) mostram que a expressão de NSP4 recombinante

em baculovírus induz diarréia idade-dependente em camundongos quando administrada por

via intraperitonial ou intraluminal (Bern & Glass, 1994, Ball et al. 1996). Em adição, a

administração de peptídeo sintético para SA-11 que contém resíduos dos aminoácidos 114 ao

135 de NSP4 também induz diarréia em camudongos lactentes, porém não em camudongos

adultos. Ademais, resíduo de tirosina 131 da proteína tem sido considerado como o aa

associado com a atividade toxigênica de NSP4. É sugerido que NSP4 interage com um

receptor celular do epitélio intestinal e estimula um sinal de tradução cálcio-dependente que

aumenta a permeabilidade da membrana plasmática a íons cloro e potencializa a secreção

clorídrica, o que culmina na indução de diarréia (Ball et al. 1996, Dong et al. 1997, Morris et

al. 1999).

NSP5 – É a maior das duas proteínas codificadas pelo segmento 11. Possui 198 aa,

sendo acumulada no viroplasma. É uma proteína ácida, rica em serina e resíduos de treonina,

que formam dímeros (Poncet et al. 1997). Quando co-expressa em células infectadas, tem sido

visto que esta é hiperfosforilada por NSP2 (Afrikanova et al. 1998), muito embora o

mecanismo dessa hiperfosforilação seja pouco conhecido (Welch et al. 1989, Poncet et al.

1997, Afrikanova et al. 1998, Gonzáles et al. 1998). A fosforilação da proteína nos resíduos

serina resultam em formas isofórmicas alcançando tamanhos de 26 a 32-34 kDa (Welch et al.

1989, Afrikanova et al. 1998, Blackhall et al. 1997, Poncet et al. 1997). Ao contrário de

NSP2, que tem pouca afinidade por dsRNA, NSP5 liga-se eficientemente tanto ao ssRNA

quanto ao dsRNA (Vende et al. 2002).

NSP6 – é a menor proteína (11kDa) codificada pelo ORF alternativo do segmento 11.

Possui 92 aa, é acumulada no viroplasma, sendo conhecida por interagir com NSP5 (Mattion

et al. 1991, Torres-Vega et al. 2000). A região C-terminal de NSP5 que interage com NSP6 é

também a região de NSP5 requerida para a dimerização e assim se admite que NSP6 possa

influenciar na formação de dímeros de NSP5 (Torres-Vega et al. 2000). O baixo nível de

expressão de NSP6 em células infectadas por rotavírus é sugestiva de função reguladora da

proteína. Algumas amostras de Rotavirus A, como Mc323 e Alabama, bem como os Rotavirus

C não codificam NSP6 (Torres-Vega et al. 2000). Isto sugere que NSP6 pode não ser

requerida para a replicação dos rotavírus, ou mesmo que nenhuma proteína viral ou celular

substitua funcionalmente, nessas amostras, a NSP6 (Taraporewala & Patton, 2004).

O genoma viral possui 11 segmentos de RNA fita dupla (dsRNA), sendo que os

segmentos genômicos variam de 667 (segmento 11) a 3.302 pares de bases (segmento 1), com

o genoma total contendo aproximadamente 18.522 pares de bases e massa molecular variando

de 2 x 10

a 2,2 x 10

Da (Rixon et al. 1984, van Regenmortel et al. 2000).

Cada segmento de RNA começa com guanidina-5’, seguido por um conjunto de

seqüências conservadas que são parte da seqüência não codificadora da extremidade 5’, a qual

se segue um quadro aberto de leitura (ORF, open reading frame), o qual codifica no mínimo

uma proteína. Segue-se um conjunto de seqüências não codificadoras, que contém um

subconjunto de seqüências conservadas terminais 3’ que termina com citidina-3’ seguida do

códon de parada (Estes & Cohen, 1989, Estes, 2001) (Figura 2).

Os mRNAs dos Rotavirus A terminam com uma seqüência consenso 5’-UGUGACC-

3’, a qual contém sinal para expressão gênica e replicação genômica. O tamanho das regiões

não codificadoras nas extremidades 5’ e 3’ varia para os diferentes genes, os quais não

possuem sinal de poliadenilação na extremidade 3’. Por outro lado, a fita positiva do RNA

viral contém uma estrutura cap 5’ terminal (5’-m

GpppG(m)GC...-3’). Admite-se que as

regiões não codificantes, apesar de constituírem uma mínima parte do genoma, possuem

seqüências determinantes para as seguintes funções: empacotamento de mRNAs,

reconhecimento pela RNA polimerase viral para início da síntese das fitas de sentido positivo

e negativo e realização de uma tradução eficiente (Imai et al. 1983, Nibert et al. 1996, Estes,

2001).

Figura 2 – Organização genômica dos rotavírus representada por um dos 11 segmentos do dsRNA (modificado

de Estes, 2001).

O padrão eletroforético dos 11 segmentos genômicos (dsRNA) dos rotavírus permite o

seu fácil reconhecimento, pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), em

padrões de migração distintos, característicos de cada espécie de rotavírus (Maunula & van

Bonsdorff, 1995). Nos Rotavírus A, o padrão de migração encontrado é o de agrupamento dos

segmentos genômicos em quatro classes distintas contendo 4, 2, 3 e 2 segmentos de dsRNA

(Figura 1A) (Besselaar et al. 1986).

1.2.1.2- Classificação dos Rotavírus

Os Rotavirus infectam somente vertebrados (mamíferos e aves), incluindo humanos.

Constituem um gênero da família Reoviridae, que possui atualmente nove gêneros

(Orthoreovirus, Orbivirus, Coltivirus, Fijivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus, Cypovirus,

Aquareovirus e Rotavirus). Outros dois gêneros têm sido propostos (Seadornavirus e

Entomovirus) (Mertens et al. 2000, ICTV –2004).

O gênero Rotavírus compreende 7 espécies (grupos) designadas de RVA a RVG,

sendo esta especificidade determinada pela proteína VP6 (Hoshino & Kapikian, 2000,

Mertens et al. 2000, van Regenmortel et al. 2000). As espécies A, B e C são encontradas em

animais e humanos e as demais somente em animais (Estes, 2001).

Adicionalmente, os Rotavirus A são sorologicamente classificados em subgrupos

também em função da variabilidade da proteína VP6, os quais são denominados I, II, I e II,

não I não II (Greenberg et al. 1983a, van Regenmortel et al. 2000). Estes vírus são ainda

classificados em sorotipos/genotipos considerando as duas proteínas do capsídeo externo

(VP7 e VP4) e os genes que as codificam. A classificação em sorotipos é definida por ensaios

sorológicos, como neutralização por redução de placa em cultura celular e neutralização por

redução foco-fluorescente usando anticorpos monoclonais (MAbs) purificados provenientes

de animais hiperimunizados. Esses ensaios baseiam-se na reatividade de anticorpos com as

duas proteínas, as quais induzem anticorpos com atividade neutralizante (Kalica et al. 1983,

Hoshino et al. 1985, Offit & Blavat, 1986, Hoshino et al. 1988). Os genotipos são

determinados por métodos moleculares, como sequenciamento genômico, hibridização de

ácido nucléico ou ainda pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando iniciadores

específicos para os genes das proteínas VP4 e VP7 (Flores et al. 1989, Gouvea et al.1990,

Estes, 2001).

A proteína VP7 define os chamados genotipos/sorotipos G (assim denominados por

ser esta uma glicoproteína) e a VP4 define os genotipos/sorotipos P (assim denominada por

ser sensível a protease). Todos os genotipos G correspondem aos sorotipos G, não ocorrendo

o mesmo com os genotipos P (Desselberger, 2000). Assim, baseado em diferenças genéticas e

antigênicas tem sido definidos 15 sorotipos/genotipos G e 25 genotipos P e devido a

insuficiência de anticorpos monoclonais específicos para a diversidade dos sorotipos P,

somente 14 sorotipos P, com três subtipos, têm sido definidos (Rao et al . 2000, Estes, 2001,

Hoshino et al. 2002, Liprandi et al. 2003, Martella et al. 2003, McNeal et al. 2005, Rahman et

al. 2005). Os sorotipos/genotipos G são sempre designados pela letra G seguida de algarismo

arábico, o mesmo ocorrendo para sorotipo P, enquanto que para genotipo P a denominação é

feita pela letra P seguida do algarismo arábico colocado entre colchetes (Hoshino & Kapikian,

1996).

Dos 15 genotipos G, dez (G1-G6, G8-G10 e G12) e dos 25 genotipos P, onze (P[1],

P[3]-P[6], P[8]-P[11], P[14] e P[19]) infectam humanos (Nakagomi et al. 1994, Hoshino &

Kapikian, 2000, Jagannath et al. 2000, Okada et al. 2000). Ainda, em humanos, tem sido

observada ocorrência maior de cinco genotipos G (G1-G4 e G9) e de três genotipos P (P[4],

P[6] e P[8]) sendo que as combinações G e P mais comumente observadas são P[8],G1;

P[4],G2; P[8],G3; P[8],G4; P[6],G9 e P[8]G9 (Gentsch et al. 1996, Leite et al. 1996,

Ramachandran et al. 1996, Santos & Hoshino, 2005).

1.2.1.3-Infecções mistas por Rotavirus A

A natureza segmentada do genoma dos rotavírus favorece um mecanismo singular, o

reassortment genético, o qual permite a geração de diversidade genética quando em processo

de infecções mistas, ou seja, com amostras virais diferentes. Esta situação tem sido observada

tanto in vivo quanto in vitro. Como as segregações dos genes VP4 e VP7 ocorrem

independentemente, várias possibilidades de combinações G e P têm sido observadas em

infecções naturais (Ramig, 1997, Palombo, 2002). Por outro lado, infecções mistas inclusive

combinações não comuns, como P[4]P[6],G2G8 e P[4]P[6],G2G9, têm sido observadas. Este

fato tem sido atribuido ao reassortment natural de amostras de ocorrência comum, como

P[6]G8 com P[4]G2 e P[6]G9 com P[4]G2 (Fischer et al. 2003).

As infecções mistas por Rotavirus A têm sido observadas em diferentes regiões

geográficas e, principalmente, em países em desenvolvimento, como no Brasil e Índia onde

são vistas com índices que variam de 10% a 23% (Ramachandran et al. 1996, Leite et al.

1996, Mascarenhas et al. 1998, Das et al. 2002). Considera-se que essas infecções mistas

possam ser relacionadas a condições higiênico-sanitárias, reflexo também da situação

socioeconômica da população. Por outro lado, em paises desenvolvidos, as infecções mistas

também têm sido observadas, embora inicialmente admitidas como sendo raras (Bishop et al.

1991, Iturriza-Gomara et al. 2000), sendo que em estudo realizado na Dinamarca mostrou

índice de infecção mista por Rotavirus A similar a de países em desenvolvimento (21%)

(Fischer et al. 2005). No estudo considerou-se que o achado possa ser em função do uso de

metodologias mais sensíveis utilizando iniciadores específicos “locus-único” em reação de

PCR ou pelo uso de sequenciamento genômico em adição à metodologia largamente utilizada,

multiplex-RT-PCR.

1.2.1.4-Diagnóstico laboratorial para Rotavirus A

As manifestações clínicas resultantes da infecção por rotavírus não são suficientes

para permitir o diagnóstico etiológico, uma vez que outros vírus levam ao mesmo quadro de

doença, o que torna imprescindível o exame laboratorial para a definição do agente causador

da infecção (Estes, 2001). Para Rotavirus A diferentes procedimentos laboratoriais têm sido

desenvolvidos visando não somente a detecção viral como também a definição da amostra

viral (sorotipo/genotipo G e P) circulante (Fischer & Gentsch, 2004).

1.2.1.4.1-Detecção viral

Para detecção viral, fezes são o espécime clínico universalmente utilizado (Yolken &

Wilde, 1994). Essas devem ser colhidas preferencialmente com até quatro dias após o início

da doença, muito embora a excreção viral possa se estender por mais de três semanas pós-

infecção (Riepenhoff -Talty et al. 1981).

A detecção viral pode ser feita pela visualização da partícula viral através da ME ou

IME, ou pela detecção de antígeno viral utilizando uma variedade de metodologias, dentre

estas, o ensaio imunoenzimático (EIE), o teste de aglutinação passiva e imunofluorescência

(IF) (Birch et al. 1979, Sanekata et al. 1981). Adicionalmente a presença viral, pode ser

observada pela detecção do ácido nucléico, seja utilizando metodologia de amplificação

genômica, reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR) (Gouvea et al.

1991, Gentsch et al. 1992), ou sem amplificação, o que pode ser feito por eletroforese em gel

de poliacrilamida (EGPA) (Pereira et al. 1983) ou por hibridização molecular (Flores et al.

1989, Fernandez et al. 1992). A RT-PCR é considerada como sendo 100.000 vezes mais

sensível que a EGPA e 5.000 vezes mais sensível que a hibridização (Wilde et al. 1991,

Yolken & Wilde, 1994).

O isolamento viral também é passível de ser realizado, muito embora exista a

dificuldade de se propagar vírus selvagem. Dentre as linhagens celulares utilizadas para a

propagação, tem-se a MA-104 (células de rim de macaco Rhesus) e a CaCo-2 (células de

carcinoma de cólon humano) (Hasegawa et al. 1982, Svensson et al. 1991, Ciarlet & Estes,

2001).

1.2.1.4.2-Caracterização viral

A meta primária de vários estudos que objetivam a vigilância laboratorial das amostras

circulantes de Rotavírus A tem sido a de determinar os sorotipos/genotipos virais de G e P

considerando a importância da diversidade antigênica destes vírus em termos da imunidade,

principalmente vacinal. Nesse sentido, o sorotipo viral pode ser determinado por ensaio de

neutralização em cultura celular ou por EIE bem como por IME de fase-sólida utilizando

anticorpos monoclonais sorotipo-específicos (MAbs) de VP7 e de VP4 (Greenberg et al.

1983c, Yolken & Wilde, 1994, Coulson, 1996, Hoshino & Kapikian, 1996). A sorotipagem G

através de EIE é método comum de caracterização, o qual utiliza MAbs específicos

produzidos para os diferentes sorotipos de VP7 (Greenberg et al. 1983c, Coulson, 1996). Pelo

procedimento, aproximadamente 70% a 85% das amostras são tipadas, mas o método depende

da presença de partícula de tripla camada, o que nem sempre é possível em função de

degradação da partícula (Fischer & Gentsch, 2004). A sorotipagem P, por outro lado, é pouco

realizada, em função da pequena disponibilidade de MAbs específicos para VP4,

possivelmente em função de que, esta proteína pode ser perdida durante o manuseio ou a

estocagem do vírus (Estes & Cohen, 1989, Coulson, 1996, Hoshino & Kapikian, 1996).

A partir da década de 1990, foram desenvolvidos métodos moleculares visando

determinar os genotipos de VP7 e VP4. Dentre estes, o método multiplex-hemi-nested-RT-

PCR, o qual apresenta boa correlação de tipos de VP7 em relação a sorotipagem utilizando

MAbs. Neste ensaio, são comumente usados para a genotipagem G, dois conjuntos de

iniciadores consensuais: Beg9/End9, combinado com iniciadores específicos (G1-G4, G8 e

G9) (Gouvea et al. 1990) ou 9Con1/9Con2 combinado com iniciadores específicos (G1-G4 e

G9) (Das et al. 1994). Em adição, um procedimento modificado tem sido utilizado pelo uso

dos iniciadores consensuais Beg9/End9 para RT-PCR e 9Con1 adicionado dos iniciadores

específicos G1-G9 desenvolvidos por Das et al. (1994) em multiplex-nested-RT-PCR (Fischer

et al. 2003).

A genotipagem P é bastante realizada e esta tem sido feita como para a genotipagem

G, através de multiplex-hemi-nested-RT-PCR (Gentsch et al. 1992, Gunasena et al. 1993), ou

através de PCR com sondas obtidas a partir de sorotipos de VP4 determinados por

neutralização (Larralde & Flores, 1990). Para determinação dos genotipos P, têm sido usados

dois conjuntos de iniciadores consensuais: Con3/Con2 e HumCom5/HumCom3 combinados

com iniciadores específicos para os genotipos P[8], P[4], P[9], P[10] e P[6] (Gentsch et al.

1992, Gunasena et al. 1993).

Para a confirmação dos genotipos determinados por RT-PCR, ou mesmo para a

definição daqueles que não puderam ser tipados por outras metodologias, tem sido utilizado o

sequenciamento genômico, o qual pode ser feito diretamente utilizando o produto da RT-PCR

(sequenciamento direto) ou após a clonagem desse produto. O sequenciamento permite

também discriminar a origem da amostra, humana ou animal (Gouvea et al. 1993), além de

permitir a identificação de novos genotipos (Leite et al. 1996, Ramachandran et al. 1996).

Outras metodologias também têm sido utilizadas para a determinação de genotipos, ou

para confirmação dos resultados da genotipagem, dentre elas a hibridização molecular

utilizando sondas específicas de genotipos G e P marcados com digoxigenina (Leite et al.

1996, Ramachandran et al. 1996). Outro procedimento é o da análise do polimorfismo de

fragmentos de DNA a partir da clivagem com enzimas de restrição (RFLP-Restriction

Fragment Length Polymorphism) pós-RT-PCR (Iizuka et al. 1993). Atualmente, um novo

método tem sido desenvolvido visando tanto a detecção quanto a genotipagem de rotavírus, a

hibridização em microarray. Esse método combina a grande sensibilidade da PCR com a

seletividade da hibridização DNA-DNA (Chizhikov et al. 2002).

1.2.2- Adenovírus humano

1.2.2.1- Estrutura morfológica, protéica e genômica

Os adenovírus são partículas de simetria icosaédrica, não envelopadas e possuem de

70-100 nm de diâmetro (Horne et al. 1959). O capsídeo é constituído de 252 capsômeros,

sendo 240 do tipo hexon que formam as 20 faces triangulares do icosaedro e 12 do tipo penton

que formam os vértices do icosaedro (Stewart et al. 1993). Da base de cada penton projeta-se

uma estrutura protéica denominada fibra, a qual possui comprimento variável conforme o

sorotipo. Na extremidade de cada fibra, existe uma protuberância que possui propriedade

imunogênica tendo ainda como função a adsorção do vírus à célula hospedeira (Norrby,

1969).

O virion possui pelo menos 11 proteínas (Figura 3), sendo que todas as proteínas

podem ser observadas por análise eletroforética em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de

sódio (SDS), com exceção da proteína terminal (TP) contida no core (Robinson et al. 1973,

Wadell, 1979). As 10 proteínas são convencionalmente numeradas iniciando pelo

polipeptídeo II, uma vez que polipeptídio I é considerado como uma mistura de moléculas

agrupadas (Maizel et al. 1968).

Figura 3 – Modelo de um virion de adenovirus humano, sorotipo 2 (AdVH2). A - Reconstrução de uma imagem

tridimensional. B - Esquema representativo da partícula de adenovírus composta pelos seus respectivos

polipeptídeos e DNA (modificado de -

http:/www.zool.unizh.ch/Research/CellBiology/MediaLinks/ImageGallery.html – em 17 de janeiro de 2006).

O capsídeo viral é composto de sete polipeptídios (II, III, IIIa, IV, VI, VIII e IX). O

polipeptídeo II (967aa) é o mais abundante, sendo o hexon formado por três moléculas deste

polipeptídio (Horwitz et al. 1970). Adicionalmente, os polipeptídios VI (217 aa), VIII (134

aa) e IX (139 aa) associam-se ao hexon, estabilizando as faces dos capsômeros, sendo que os

polipeptídios VI e VIII são admitidos fazerem uma ponte entre o capsídeo e o core viral

(Everitt et al. 1973).

Cinco cópias do polipeptídio III (571 aa) formam a base do penton (van Oostrum &

Burnett, 1985), enquanto que o polipeptídio IIIa (566 aa) associa-se ao hexon, liga as faces

adjacentes do capsídeo e serve como ponte entre o hexon e o polipeptídio VII do core (Everitt

et al. 1975). O polipeptídio IV (582 aa) forma a fibra trimérica, a qual se projeta da base do

penton de cada vértice do icosaedro (van Oostrum & Burnett, 1985).

O core do virion, que circunda o genoma viral, é formado por quatro proteínas [V,

VII, X (mμ) e TP], sendo que as proteínas V, VII e X (mμ) são básicas, ricas em arginina, e a

proteína terminal (TP) é covalentemente associada à extremidade 5’ do DNA viral, ainda,

observa-se uma protease cisteína p23 associada não covalentemente ao DNA (Robinson et al.

1973, Mangel et al. 1993, Stewart et al 1993). O polipeptídio VII (174 aa) é a maior proteína

do core e assemelha-se a um centro de histona que envolve e empacota o DNA viral (Mirza &

Weber, 1982, Chatterjee et al. 1986). O polipeptídio V (368 aa) liga-se a base do penton

fazendo uma ponte entre o core e o capsídeo (Everitt et al. 1975). A proteína terminal (TP)

(671 aa) serve como um primer para a replicação do DNA e media a ligação do genoma viral

à matriz nuclear (Challberg et al. 1980, Tamonoi & Stillmam, 1982). A protease cisteína p23

degrada a proteína VI colaborando para a dissociação do capsídeo durante o processo de

infecção (Greber et al. 1996). A função da proteína X (mμ) (19 aa) não é bem conhecida,

estudo realizado por Anderson et al. (1989) mostraram que esta proteína precipita DNA in

vitro, sugerindo que ela ajuda a condensar o DNA no core viral por meio de interações com

resíduos da arginina nove desta proteína com fosfato da cadeia-DNA.

O genoma viral consiste de uma molécula linear de fita dupla de DNA com massa

molecular de 20-24 x 10

Da, com aproximadamente 36.000 pares de bases (pb) e composição

de 47-60% de bases G + C (Green & Pina, 1963, Hierholzer, 1992). Nas extremidades do

DNA, há seqüências terminais (3’e 5’) repetidas e invertidas (ITRs) que variam de tamanho

(103-165 nucleotídeos) de acordo com o sorotipo de adenovírus (Shinagawa et al. 1987). O

genoma contém ainda uma seqüência cis-acting para encapsidação, onde no final da fita que

transcreve para a esquerda entre os nucleotídeos 200 e 400 existe uma seqüência de A

repetidos (consenso: 5’-TTTGN

CGNG-3’). Considera-se que essa seqüência seja requerida

para o empacotamento do genoma dentro do capsídeo (Hearing et al. 1987, Grable & Hearing,

1992, Ostapchuk & Hearing, 2003). O genoma viral também possui de um a dois genes

(dependendo do sorotipo) denominados vírus-associado (VA) transcritos pela RNA-

polimerase III. Os VA RNAs estimulam a síntese protéica viral e ainda antagonizam a ação

antiviral de interferon produzido pelo sistema imune celular (O’Malley et al. 1986, Kitajewski

et al. 1986, Ma & Mathews, 1996).

O genoma possui diferentes unidades (regiões) de transcrição (Figura 4), as quais são

transcritas temporalmente. Essas são referidas como regiões iniciais (E1, E2, E3 e E4),

regiões iniciais tardias ou intermédiarias (IX e IVa2) e região tardia (MLP-promotor maior

tardio). As regiões E1 e E2 são subdivididas em E1A, E1B e E2A e E2B, e a região tardia é

processada para gerar cinco famílias de mRNAs tardios (L1 a L5), diferenciados por splicing

alternativo e, em alguns casos, pelo o uso de diferentes sítios poli(A), todos transcritos pela

RNA polimerase II (Berget et al. 1977, Chow et al. 1979, Shenk, 2001).

A transcrição gênica ocorre em ambas as direções, sendo que a fita que transcreve da

esquerda para a direita (fita-d), transcreve as regiões E1A, E1B, IX, MLP, VA-RNA e E3. A

fita que transcreve em direção oposta (fita-e), transcreve as regiões E2A, E2B, E4 e IVa2. A

transcrição dos genes dos adenovírus é um evento de duas fases, ocorrendo antes e depois da

replicação do DNA viral (Shenk, 2001).

Figura 4 – Organização genômica de adenovírus humano, espécie E (AdVH-E) (modificado de Davison et al.

2003).

O gene E1A transcreve cinco mRNAs, dois são transcritos durante a fase precoce da

infecção (13S e 12S) e três acumulam-se tardiamente durante o ciclo infeccioso (11S, 10S e

9S), sendo que os mais estudados são: o mRNA 13S que codifica uma proteína de 55 kDa

(289aa) e o 12S que codifica uma proteína de 47 kDa (243aa), estas duas proteínas ativam a

transcrição de outros genes e induzem a célula hospedeira a entrar na fase S do ciclo celular,

por outro lado, não foram descritas funções distintas para os produtos dos outros três mRNAs

(11S, 10S e 9S) (Stephens & Harlow, 1987). O gene E1B codifica duas proteínas que

bloqueiam a apoptose (19K e 55K), além de codificar o polipeptídeo estrutural IX, o qual é

essencial para a encapsidação do DNA viral. E2 codifica proteínas que sinalizam para a

replicação do DNA, dessa forma a região E2A codifica uma proteína, DBP, que se liga a fita

simples do DNA e a E2B codifica uma DNA polimerase e uma proteína precursora terminal

(pTP), além de codificar o polipeptídeo IVa2 que possui função ativadadora do MLP. Os

produtos de E3 modulam a resposta do hospedeiro para a infecção viral: 12,5K, gp19K, 14,7K

e outros produtos dependendo do sorotipo. E4 possui cinco ORFs (1, 2, 3, 4 e 6/7), podendo

esse número variar de acordo com a espécie, cujos produtos possuem funções de regulação

transcricional, transporte de mRNA, modulação da replicação do DNA e apoptose celular

(Lutz & Kedinger, 1996, Ruuskanen et al. 1997, Rosa-Calatrava et al. 2001, Shenk, 2001,

Reddy et al. 2005).

Os mRNAs tardios (L1 a L5), gerados pelo processamento do MLP, são responsáveis

pela produção e montagem dos componentes do capsídeo. L1 produz duas proteínas (52/55k e

IIIa); L2 quatro proteínas (pIII,VII, V e X); L3 três proteínas (VI, hexon e protease); L4

quatro proteínas (100K, 22K, 33K e pVIII); e L5 produz a proteína formadora da fibra (IV)

(Ruuskanen et al. 1997, Shenk, 2001, Reddy et al. 2005).

1.2.2.2- Classificação dos adenovírus humanos

Os adenovírus (AdV) constituem a família Adenoviridae, que é subdividida em quatro

gêneros, Mastadenovirus – infectam humanos e outros mamíferos; Aviadenovirus – infectam

aves; Atadenovirus – infectam mamíferos (marsupiais e cervos), répteis (cobras) e aves

(patos); e Siadenovirus – infectam anfíbios (rãs) e aves (perus). Um quinto gênero que inclui

vírus que infectam peixes tem sido proposto (Harrach & Benko, 1998, Benko et al. 2002,

Davison & Harrach, 2002, ICTV- 2004). O gênero Mastadenovirus é formado por mais de 90

sorotipos, dentre os quais 51 infectam humanos (AdVH). Estes se subdividem em seis

subgêneros ou espécies, A a F (de Jong et al. 1999, Horwitz, 2001). Cada sorotipo dentro do

gênero Mastadenovirus é determinado por neutralização utilizando anticorpos dirigidos contra

as duas maiores proteínas do capsídeo, o hexon e a fibra. Por outro lado, a classificação das

espécies foi inicialmente baseada na habilidade de aglutinação de eritrócitos, humano e

animal (Rosen, 1960, de Jong et al. 1999). Outros parâmetros foram posteriormente

considerados, os quais incluem o percentual de bases nitrogenadas da espécie (G e C), o

potencial oncogênico em roedores, o grau de homologia do DNA viral, o tamanho da fibra, o

peso molecular de determinados polipeptídios estruturais, além do padrão de fragmentação do

DNA viral por enzimas de restrição (Quadro1) (Wadell et al. 1980, Adrian et al. 1986, Albert,

1986).

Quadro 1- Classificação dos adenovírus humanos

Espécie Sorotipos

Potencial oncogênico

Subgrupo % GC

por HA* Tumor em Transformação no DNA

animais em culturas

de células

A 12, 18, 31 IV Elevado + 47-49

B 3, 7, 11, 14, 16, 21, I Moderado + 50-52

34, 35, 50

C 1, 2, 5, 6 III Baixo ou + 57-59

nenhum

D 8-10, 13, 15, 17, 19, II Baixo ou + 57-60

20, 22-30, 32, 33, nenhum

36-39, 42-49, 51

E 4 III Baixo ou + 57

nenhum

F 40, 41 III Desconhecido Desconhecido 57-59

*Subgrupos por hemaglutinação (HA): I - aglutinação completa com eritrócitos de macaco; II - aglutinação

completa com eritrócitos de rato; III - aglutinação parcial com eritrócitos de rato; IV - ausência de aglutinação

(Adaptado de Ruuskanen et al. 1997).

1.2.2.5-Adenovírus entéricos

Os adenovírus entéricos foram assim denominados por Jacobsson et al. (1979) em

função de sua associação à diarréia, feita por Flewett et al. (1975), que observaram um grande

número de partículas de adenovírus pela ME após a ocorrência de um surto de doença

diarréica em crianças. No entanto, já em 1973, na Holanda, um adenovírus não tipável foi

isolado em células de carcinoma de cérvice uterino (HeLa) a partir das fezes de uma criança

com gastroenterite. Este vírus não era compatível com antisoro para nenhum dos 39 tipos

conhecidos até aquele momento e permaneceu não caracterizado por vários anos até sua

definição como de adenovírus humano sorotipo 41 (AdVH41), cepa Tak. Várias outras

amostras de adenovírus não tipáveis isoladas em células HeLa e células de rim de macaco

Cynomolgus, a partir de fezes de crianças com diarréia e/ ou vômito, foram posteriormente

definidos como AdVH40, cepa Dugan (de Jong et al. 1983). A característica inicial desses

vírus era a difícil propagação nessas células e a não propagação em células de rim de embrião

humano (HEK) ou em células diplóides de fibroblasto de embrião humano (HDF),

diferentemente das outras espécies de adenovírus (AdVHA-AdVHE). Por isso, foram

denominados não cultiváveis (Gary et al. 1979) ou fastidiosos (Kidd & Madeley, 1981).

Assim, considerando estudos sorológicos que utilizavam antisoro preparado a partir de

vírus purificados das fezes e o de mapeamento do DNA por enzima de restrição, além da

análise protéica, estes adenovírus passaram a ser considerados como sendo dois novos

sorotipos, constituindo uma espécie diferente das previamente existentes. Foram então

denominados sorotipos 40 e 41 da espécie F e com denominação de adenovírus entéricos

(EAd) (van der Avoort et al. 1989, Tiemessen & Kidd, 1995).

Estudos têm demonstrado a distribuição global desses agentes em crianças com

gastroenterite aguda com índices de 1% a 31% (Cruz et al. 1990, Stewien et al. 1993, Moore

et al. 1998, Soares et al. 2002, Li et al. 2005), sendo que mais de 50% das crianças menores

de quatro anos de idade apresentam anticorpos para os EAd (Kidd et al. 1983, Shinozaki et al.

1987, Jarecki-Khan & Unicomb, 1992).

1.2.2.6-Diagnóstico laboratorial para adenovírus humano

A sintomatologia resultante da infecção por adenovírus é variada, sendo esta

semelhante à provocada por outros patógenos. Portanto, o diagnóstico clínico é insuficiente

para definir adenovírus como causador da infecção, sendo necessário o diagnóstico

laboratorial (Ruuskanen et al. 1997) que pode ser realizado por diferentes procedimentos.

1.2.2.6.1-Detecção viral

Para detecção viral um dos procedimentos utilizados tem sido o isolamento em

culturas celulares, sendo que estes vírus, em sua grande maioria possuem capacidade de se

replicarem nestes sistemas vivos. Eles podem ser isolados a partir de excreção de nasofaringe,

garganta, nariz e conjuntiva, fluído cerebroespinhal, sangue, urina, fezes, bem como de

material de biópsia (Ruuskanen et al. 1997). Todos os sorotipos de adenovírus, exceto EAd40

e EAd41, propagam-se bem e produzem efeito citopático (ECP) em uma variedade de células.

As células mais permissivas são as células HEK (Krisher et al. 1987), seguindo-se, as células

de carcinoma de pulmão humano (A-549), células HeLa, células de carcinoma epidermóide

de laringe humana (HEp-2), células de carcinoma da cavidade bucal (KB) e fibroblastos de

pulmão de embrião humano (MRC-5). Para a propagação dos sorotipos entéricos, EAd40 e

EAd41, tem sido utilizadas principalmente células conjuntivais Chang, HEp-2, células

terciárias de rim de macaco Cynomolgus e células de rim de embrião humano transformadas

com DNA de AdVH5 (HEK-293) (Graham et al. 1977, Kidd & Madeley, 1981, de Jong et al.

1983). O efeito citopático produzido por adenovírus é considerado característico e geralmente

começa na periferia da monocamada celular onde se observam células arredondadas,

agregação de células intumescidas (cachos de uva ou rede de pescador) e inclusões

intranucleares (Leite, 1994, Ruuskanen et al 1997). O cultivo celular, além de promover o

isolamento viral, apresenta a vantagem de aumentar a quantidade de partículas virais para

posterior caracterização. A identificação dos isolados pode ser feita através de

imunofluorescência (IF), fixação do complemento (FC), inibição da hemaglutinação (HI) e

soroneutralização (SN) (Hierholzer, 1995).

A ME tem sido usada para detectar adenovírus tanto de material de cultivo quanto de

espécime clínico, onde se observa a morfologia característica destes agentes, sendo que a

descoberta dos adenovírus “não cultiváveis” foi realizada por este método (Flewett et al.

1975). Adicionalmente, os adenovírus podem ser detectados diretamente no espécime clínico

utilizando também a IF, o ensaio imunoenzimático (EIE) e a aglutinação em látex (Herrmann

et al. 1987).

1.2.2.6.2-Caracterização viral

A identificação dos sorotipos de adenovírus pode ser feita utilizando qualquer das

metodologias de detecção, como IF, EIE ou SN, ou por IME utilizando anticorpos

monoclonais epítopos tipo-específicos do hexon ou da fibra (Noel et al. 1994).

Por outro lado, métodos moleculares têm sido desenvolvidos, os quais permitem a

definição da espécie, bem como do sorotipo de adenovírus. Dentre os procedimentos, tem-se a

reação em cadeia pela polimerase (PCR) (Pring-Akerblom & Adrian, 1994, Pring-Akerblom

et al. 1999). Para a definição da espécie utilizando a PCR, têm sido usados iniciadores

desenhados a partir da região do hexon ou das regiões VAI e VAII (Wu et al. 1992,

Hierholzer et al. 1993). Para definição de sorotipos, são utilizados iniciadores tipo-específico,

sendo que para EAd40 e o EAd41 são bastante utilizados os desenhados para região E1B

(Allard et al. 1992).

A caracterização dos sorotipos de adenovírus tem também sido feita pela análise de

polimorfismo dos fragmentos de DNA em gel de agarose (RFLP-Restriction Fragment

Length Polymorphism), onde o sítio de clivagem do DNA por enzima de restrição é

dependente da seqüência do DNA. A presença de mutações num sítio de clivagem potencial

resulta em padrões diferentes de fragmentação do genoma quando esses fragmentos são

separados em gel de agarose. A desvantagem desse método é o de requerer uma grande

quantidade de DNA purificado direto do espécime clínico. Nesse sentido há necessidade da

amplificação prévia do DNA viral pela PCR o que resulta na metodologia denominada PCR-

RFLP (Saitoh-Inagawa et al. 1996, Arens, 1999, Li et al. 2005). Outra metodologia bastante

utilizada para caracterização de adenovírus é a hibridização do DNA viral com sondas

específicas desenhadas tanto para a espécie quanto para os sorotipos específicos (Wadell et al.

1980, Suzuki et al. 1981).

II – JUSTIFICATIVA

A gastroenterite é causa importante de doença infantil em todo o mundo, sendo a

segunda após as doenças respiratórias (Murray & Lopez, 1997, Guerrant, 1998). É

especialmente crítica em países em desenvolvimento, onde representa um fator importante de

mortalidade infantil (Ho et al. 1988, Bern & Glass, 1994, Kapikian, 1996, Lima et al. 2000).

Como exposto anteriormente, os Rotavírus A e os adenovírus humanos são causa

importante de gastroenterite aguda, podendo levar a óbito tanto crianças menores que cinco

anos de idade infectadas por rotavírus (Carlson et al. 1978, Lynch et al. 2003, Parashar et al.

2003) quanto indivíduos imunocomprometidos infectados por adenovírus (Cunninghan et al.

1988, Krajden et al. 1990, Hierholzer, 1992). Ademais, os adenovírus entéricos têm sido alvo

de estudos por serem um importante patógeno humano, estando entre os quatro vírus mais

importantes relacionados a gastroenterite infantil (Wilhelmi et al. 2003).

Admite-se que a estratégia principal para o controle dos Rotavírus A seja através da

vacinação, mas para que ocorra uma prevenção efetiva é preciso que haja o conhecimento dos

genotipos G e P circulantes antes, durante o período de vacinação e após vacinação. Por outro

lado, o monitoramento da circulação desses genotipos G e P permitem também a identificação

de genotipos não comuns ou não usuais, bem como infecções mistas, o que por certo tem

reflexo importante em relação à vacina em uso, em determinado período e localidade.

O Laboratório de Virologia do IPTSP/UFG vem desde a década de 80 realizando

investigações que visam identificar vírus causadores de gastroenterite em populações adulta e

infantil (Cardoso et al. 1989, Camarota et al. 1992, Cardoso et al. 2003, Souza et al. 2003). Os

resultados destes estudos mostram que amostras de Rotavírus A reagem frente a mais de um

iniciador específico (Cardoso, 1997, Souza, 2001, Costa, 2003, Andreasi, 2004), o que

poderia ser em uma primeira análise considerada uma infecção mista. Para a definição dessa

condição, outros procedimentos metodológicos devem ser empregados o que é a proposição

de parte deste estudo.

Ademais, os estudos conduzidos neste laboratório mostraram percentuais importantes

de detecção de adenovirus em espécimes fecais, tanto em população adulta quanto infantil

(Cardoso et al. 1989, Camarota et al. 1992, Azevedo, 1997, Borges, 2000). Por outro lado,

poucas são as informações referentes à espécie de adenovírus humano (Borges, 2000), sendo

ainda inexistente o conhecimento do sorotipo infectante. Em assim sendo, a segunda proposta

deste estudo objetiva a caracterização de amostras de adenovírus humanos.

Assim, a justificativa do estudo é a de conhecer as espécies e sorotipos de adenovírus

bem como a ocorrência de infecção mista por Rotavirus A na Região Centro-Oeste do Brasil.

Os dados obtidos no presente estudo deverão auxiliar em medidas preventivas e

terapêuticas contra os rotavírus e adenovírus circulantes em nossa região e no País,

contribuindo assim para a saúde pública.

III – OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivos:

1. Confirmar infecções mistas por Rotavirus A, relativas a genotipo P, por hemi-nested-RT-

PCR e sequenciamento genômico.

2. Determinar as espécies de adenovírus humano diretamente do espécime fecal, bem como

após propagação em cultura celular, através de multiplex-PCR.

3. Determinar os sorotipos de adenovírus humano em amostras submetidas à propagação em

cultura celular através de PCR-RFLP.

IV- MATERIAL E MÉTODOS

4.1 – Material de estudo

O material de estudo foi constituído de 81 amostras fecais positivas para Rotavírus A

previamente detectadas pelo ensaio imunoenzimático combinado para rotavírus e adenovírus

(EIERA) (Pereira et al. 1985) e EGPA (Pereira et al. 1983), que após reação de multiplex-

hemi-nested-RT-PCR (Gentsch et al. 1992) reagiram a mais de um iniciador específico P

(Cardoso, 1997, Souza, 2001, Costa, 2003, Andreasi, 2004). Ainda, 74 amostras positivas

para adenovírus humano previamente detectadas pelo EIERA (Cardoso et al. 1989, Camarota

et al. 1992, Azevedo, 1997, Borges, 2000). As amostras foram detectadas a partir de

espécimes fecais de crianças com diarréia, com exceção de duas amostras positivas para

adenovírus, sendo todas elas colhidas de crianças com até 5 anos de idade. As crianças eram

residentes das cidades de Brasília – DF, Campo Grande – MS e Goiânia – GO. A colheita das

amostras de rotavírus foi realizada no período de abril de 1998 a agosto de 2003 e as amostras

de adenovírus de abril de 1989 a dezembro de 2003, mediante autorização prévia dos pais ou

responsáveis.

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade

Federal de Goiás sob o número 004/2000.

4.2 – Metodologia

4.2.1 – Cultivo celular e propagação viral de adenovírus humano

Amostras protótipos de adenovírus humano (AdVH4, AdVH5, AdVH7, AdVH10,

AdVH31 e AdVH41), bem como as amostras do estudo, detectadas pelo EIERA, foram

propagadas em células HEp-2. As células foram mantidas a 37°C em meio mínimo essencial

(MEM-Gibco BRL

) com 10% de soro fetal bovino (SFB-Gibco BRL

). As células HEp-2 e

os adenovírus protótipos AdVH4, AdVH5, AdVH7 e AdVH10 foram gentilmente cedidos

pelo Dr. José Paulo G. Leite (Laboratório de Virologia Comparada/Instituto Osvaldo Cruz), e

os protótipos AdVH31 e AdVH41 foram gentilmente cedidos pela Dr.

Charlote M. Hársi

(Departamento de Microbiologia – ICB/USP). A propagação viral foi feita com a

monocamada celular com 80% de confluência. Para o cultivo das amostras do estudo,

inicialmente 400 μL de cada suspensão fecal era tratada com gentamicina (1000 μg/mL),

penicilina G (1000 UI/mL) e anfotericina B (50 μg/mL) em incubação por 1 hora em

temperatura ambiente, seguido de centrifugação a 13.000 x g por 5 minutos. Após, o

sobrenadante era inoculado na monocamada celular, previamente lavada com PBS pH 7,4,

com incubação a 37°C por 1 hora e homogeneização a cada 15 minutos. Adicionavam-se

então 5,5 mL de MEM contendo 2% de soro fetal bovino, e mantinha-se a incubação a 37°C

com observação diária da monocamada feita por microscópio invertido (ZEISS-Telaval 31).

Após o aparecimento do ECP (de 2 a 10 dias, dependendo da amostra) ou não (sem ECP em

até 10 dias), a monocamada era congelada e descongelada (3 vezes), para o rompimento das

células infectadas e liberação das partículas virais. O material era então aliquotado e estocado

a -20ºC para análise posterior. As amostras protótipos foram propagadas como as do estudo,

exceto pelo não tratamento com antibióticos e antifúngico.

4.2.2 - Extração do dsRNA de Rotavírus A e dsDNA de adenovírus humano

O dsRNA e o dsDNA viral foram extraídos a partir de suspensões fecais a 20% sendo

que, para adenovírus, o dsDNA foi também extraído a partir dos lisados celulares resultantes

da propagação viral em cultura celular, tanto para as amostras de estudo quanto para amostras

protótipos. O método de extração foi o de sílica, utilizando o isotiocianato de guanidina, como

descrito por Boom et al. (1990), modificado por Cardoso et al. (2002). Para o procedimento,

em tubos tipo eppendorf de 1,5 mL eram adicionados 400 µL da amostra, 1000 µL de tampão

L6 (GuSCN/Tris-HCl/EDTA) e 15 µL de sílica (Sigma-Aldrich

). A suspensão era

homogeneizada em vórtex (Phoenix-AP56) e incubada sob agitação (Kline Evlab-EV:07E)

por 30 minutos em temperatura ambiente. Após, procedia-se à centrifugação (14.000 x g por 1

minuto - Microcentrífuga SpinII) e o sedimento resultante era lavado (duas vezes) com 1000

µL de tampão L2 (GuSCN/Tris-HCl). Seguiam-se lavagens sucessivas desse sedimento com

1000 µL de etanol (Quimex) a 70% (duas vezes) e com acetona P.A. (J.T.Baker). Após cada

etapa, era feito o procedimento de centrifugação a 14.000 x g por 1 minuto. A seguir, o

sedimento era incubado a 56°C por 15 minutos e ressuspenso em 40 µL de água Milli-Q

estéril quando então era novamente incubado a 62°C por 15 minutos, seguido de

centrifugação (14.000 x g por 3 minutos). O sobrenadante era então coletado e guardado a -

20°C até o momento do uso.

4.2.3 – Caracterização molecular das amostras Rotavirus A

4.2.3.1 – Genotipagem P por hemi-nested RT-PCR

Os iniciadores consensuais e específicos utilizados (Quadro 2), bem como o

procedimento para a genotipagem P foram seguidos como descrito por Gentsch et al. (1992).

Quadro 2. Iniciadores utilizados para a reação de hemi-nested-RT-PCR para detecção

dos genotipos P de Rotavirus A (Gentsch et al. 1992)

Iniciadores Seqüência 5’– 3’ Posição Tamanho

nucleotídeos fragmentos

(pb)

Con 2

ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC

868-887 -

Con 3

TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A

11-32 876

2T-1 P[4]

CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC

474-494 483

3T-1 P[6]

TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA

259-278 267

1T-1 P[8]

TCT ACT TGG ATA ACG TGC

339-356 345

5T-1 P[10]

ATC ATA GTT AGT AGT CGG

575-594 583

A transcrição reversa e a primeira reação de amplificação foram feitas em etapa única.

Inicialmente, 5 µL do dsRNA extraído eram adicionados em 3 µL de dimetil sulfóxido

(DMSO) e incubados a 97°C por 5 minutos seguido de banho de gelo por 5 minutos. A seguir,

era adicionada a mistura para a transcrição reversa e amplificação do DNA para um volume

final de 100 µL: Tampão de reação 1X (PCR Buffer-Tris HCl 20 mM pH 8,0 e KCl 50 mM-

Invitrogen

™

/Life Technologies), MgCl

2 mM, pool de dNTPs (dATP 0,8 mM, dCTP 0,8 mM,

dTTP 0,8 mM, dGTP 0,8 mM), 2,5 U Taq-DNA polimerase (Invitrogen

™

/Life Technologies),

200 U Transcriptase Reversa SuperScript

™

II (Invitrogen

™

/Life Technologies), e 0,2 µM de

cada iniciador consensual (Con2 e Con3). A reação era processada utilizando a seguinte

ciclagem: um ciclo a 42°C por 60 minutos, um ciclo a 99°C por 5 minutos, 30 ciclos a 94°C

por 1 minuto, 50°C por 2 minutos e 72°C por 1 minuto, 1 ciclo a 72°C por 7 minutos e, por

último, 4°C para conservação (Eppendorf Mastercycler personal). A seguir, procedia-se à

reação seqüencial de hemi-nested-PCR. Para o procedimento, era utilizado 1 µL do produto

obtido na primeira amplificação, o qual era adicionada a mistura de reação também para um

volume final de 100 µL. Esta continha os mesmos reagentes, nas mesmas concentrações como

para a primeira reação, a exceção do não uso da transcriptase reversa e pelo uso de apenas o

Con3 como iniciador consensual e os iniciadores específicos de P (P[4], P[6], P[8], P[10]). A

ciclagem utilizada foi a que se segue: 15 ciclos a 94°C por 1 minuto, 42 °C por 2 minutos e

72°C por 1 minuto, um ciclo a 72°C por 7 minuto e, por último, 4°C para conservação. Em

todas as reações, foi utilizado como controle positivo a amostra Wa (genotipo P[8] humano) e

como controle negativo água Milli-Q estéril.

A visualização do produto amplificado foi feita em transluminador UV (Hoefer-

MacroVue UV-20) a partir de gel de agarose a 1,5% contendo 1 µg/mL de brometo de etídeo

usando como tampão de corrida Tri/Borato/EDTA (TBE) 1X. Em cada corrida eletroforética,

foi utilizado o 123 pb DNA ladder (Invitrogen

™

/Life Technologies), como padrão de peso

molecular.

4.2.3.2- Sequenciamento genômico direto a partir do produto de amplificação da hemi-nested-

RT-PCR

Foram analisadas por sequenciamento genômico apenas as amostras que reagiram

novamente a mais de um iniciador específico P. Para a reação, a qual foi feita utilizando o

produto resultante da hemi-nested-RT-PCR, foi utilizado o iniciador consensual Con3.

4.2.3.2.1-Purificação do produto da hemi-nested-RT-PCR e quantificação do DNA

A purificação do produto de hemi-nested-RT-PCR foi feita utilizando o kit Qiaquick

PCR Purification (Qiagen), seguindo instruções do fabricante. A quantificação do DNA foi

feita por estimativa a partir de gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo (0,5

μg/mL) por comparação visual o DNA com concentração previamente conhecida. Para o

procedimento de sequenciamento, foram considerados satisfatórios produtos com, no mínimo,

50 a 100 ng de DNA.

4.2.3.2.2-Reação de sequenciamento

A reação foi feita, em sentido único utilizando seqüenciador automático (MegaBACE

1000 – Amersham Biosciences). O sistema de reação de sequenciamento utilizado foi o

“DYEnamic ET, Dye Terminator Cycle Sequencing” (Amersham Bioscences). A reação foi

preparada utilizando 4 μL de DNA e água Milli Q, para volume final de 10 μL. A

amplificação foi feita em 35 ciclos, nas seguintes condições: dois segundos/95°C, 10

segundos/95°C, 15 segundos/50°C e 60 segundos/60°C. Após, as amostras foram precipitadas

com 7,5 M de acetato de amônia e etanol a 100%, lavadas com etanol a 70%, e ressuspensas

em 10 μL de tampão contendo formamida.

As seqüências de nucleotídeos obtidas foram analisadas pelo programa BLAST

(www.ncbi.nlm.nih.gov), conforme Altschul et al. (1990). Estas foram comparadas a

seqüências depositadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html), e o

alinhamento das mesmas foi realizado pelo Clustal X (www.igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo)

(Higgins & Sharp, 1998). A árvore filogenética foi construída pelo programa TreeView.

4.2.4 – Caracterização molecular das amostras de adenovírus humano

4.2.4.1 – Determinação da espécie de adenovírus humano através de multiplex-PCR

A determinação da espécie de adenovírus humano nas amostras positivas foi a partir

das suspensões fecais e dos lisados celulares através de multiplex-PCR. Foram utilizados os

iniciadores HsgA1-F1 e HsgA2-F2, desenhados para região conservada do hexon. Os

iniciadores, bem como a metodologia seguida, foram utilizados conforme preconizado por

Pring-Åkerblom et al. (1999) (Quadro 3).

Quadro 3. Iniciadores utilizados para a multiplex-PCR para a detecção de

Adenovírus Humano (Pring-Åkerblom et al. 1999).

Para a PCR foram utilizados: 0,5 μM de cada iniciador, MgCl

1,5 mM, 0,2 mM de

cada dNTP, 1U de Taq-DNA-polimerase, tampão da enzima 1X (PCR Buffer-Tris HCl 20mM

pH 8,0 e KCl 50mM-Invitrogen

™

/Life Technologies) para um volume final de 50 μL. Em

Espécie Iniciador

Tamanho

Seqüência 5’– 3’ fragmento

A HsgA1

AAGGTGTCAATYATGTTTG

A HsgA2 299 pb

ACGGTTACTTKTTT'

B HsgB1

TCTATTCCCTACCTGGAT

B HsgB2 465 pb

ACTCTTAACGGCAGTAG

C HsgC1

ACCTTTGACTCTTCTGT

C HsgC2 269 pb

TCCTTGTATTTAGTATC

D HsgD1

CCATCATGTTCGACTCCT

D HsgD2 331 pb

AGGTAGCCGGTGAAGCC

E HsgE1

GACTCTTCCGTCAGCTGG

E HsgE2 399 pb

GCTGGTAACGGCGCTCT

F HsgF1

ATTTCTATTCCTTCGCG

F HsgF2 586 pb

TCAGGCTTGGTACGGCC

cada reação foi utilizado água Milli-Q estéril como controle negativo e amostras protótipos de

adenovírus como controle positivo. A amostra foi amplificada utilizando o termociclador

Mastercycler Personal-Eppendorf e a ciclagem que se segue: um ciclo a 95ºC por 900

segundos, 38 ciclos a 91ºC por 40 segundos, 40ºC por 30 segundos e 72ºC por 40 segundos e

um ciclo final a 72ºC por 400 segundos. A visualização do produto amplificado foi feita como

para Rotavirus A, exceto pela utilização do 50 pb DNA ladder (Invitrogen

™

/Life

Technologies) como padrão de peso molecular.

4.2.4.2-Determinação do sorotipo de adenovírus humano através da PCR-RFLP

A determinação do sorotipo de adenovírus humano foi feita a partir do lisado celular.

Para a PCR, foram utilizados os iniciadores AdTU7 e AdTU4’ para a primeira amplificação e

AdnU-S’ e AdnU-A para a segunda amplificação, desenhados para região conservada do

hexon. Os iniciadores utilizados foram preconizados por Saitoh-Inagawa et al. (1996) (Quadro

4), e a metodologia seguida, foi de acordo com Li et al. (2005).

Quadro 4. Iniciadores utilizados para PCR-RFLP (Saitoh-Inagawa et al. 1996).

Iniciadores Seqüência 5’– 3’ Posição Tamanho

nucleotídeos fragmentos

(pb)

AdTU7

GCC ACC TTC TTC CCC ATG GC

20,734-20,753 1,004

AdTU4’

GTA GCG TTG CCG GCC GAG AA

21,718-21,737

AdnU-S’

TTC CCC ATG GCN CAC AAC AC

20,743-20,762 956

AdnU-A

GCC TCG ATG ACG CCG CGG TG

21,679-21698

Para a realização da primeira reação de amplificação (PCR), 3 µL do dsDNA extraído

foram adicionados de 3,5 µL de DMSO e aquecidos a 98°C por 10 minutos, com posterior

incubação em banho de gelo por 5 minutos. A seguir, adicionou-se a mistura de reação para

um volume final de 25 µL: tampão de reação 1X (PCR Buffer-Tris HCl 20 mM pH 8,0 e KCl

50 mM-Invitrogen

™

1,5 mM, pool de dNTPs (0,2 mM de cada /Life Technologies), MgCl

dNTP) , 1U Taq-DNA polimerase (Invitrogen

™

/Life Technologies) e 0,5 µM de cada iniciador

(AdTU7 e AdTU4’). Para todas as reações, foi utilizada água Milli-Q estéril como controle

negativo e amostras protótipos de adenovírus como controle positivo. A ciclagem das

amostras (termociclador Mastercycler Personal-Eppendorf) foi a que se segue: um ciclo a

94ºC por 3 minutos, 35 ciclos a 94ºC por 1 minuto, 45ºC por 2 minutos e 72ºC por 3 minutos

e um ciclo a 72ºC por 7 minutos. A segunda amplificação foi realizada nas mesmas condições

da primeira amplificação com exceção dos iniciadores utilizados (AdnU-S’ e AdnU-A).

Os produtos de todas as amostras que foram positivas na segunda reação de

amplificação (956 pb) foram digeridos com três enzimas de restrição: StyI, HaeIII e HinfI

(Promega) individualmente, seguindo instruções do fabricante, por três horas a 37°C. Após,

procedia-se a visualização do produto digerido como feito para Rotavirus A, exceto pela

concentração da agarose (3%). A determinação do sorotipo foi feita por comparação aos

padrões de fragmentos obtidos por Saitoh-Inagawa et al. (1996), bem como aos padrões de

fragmentos obtidos das amostras protótipos de adenovírus humano, digeridos com as mesmas

enzimas.

4.2.4.3- Sequenciamento genômico direto a partir do produto de amplificação da PCR de

amostras de adenovírus entéricos

A reação de sequenciamento foi feita diretamente, utilizando o produto resultante de

amplificação específica da região do hexon com os iniciadores AdnU-S’ e AdnU-A. A

purificação e quantificação do DNA viral foram feitos como para Rotavirus A.

4.2.4.3.1-Reação de sequenciamento

A reação foi feita, nos dois sentidos, a partir do produto da PCR, nas mesmas

condições e sistema de reação utilizado para Rotavirus A. Igualmente, a análise da seqüência

de nucleotídeos obtida, o alinhamento e a construção da árvore filogenética foram feitos como

para Rotavirus A.

V –RESULTADOS

5.1-Rotavírus A

5.1.1-Características das amostras Rotavírus A

Das 81 amostras positivas para Rotavírus A, todas eram provenientes de crianças com

diarréia, sendo que 61 amostras eram de crianças residentes de Goiânia-GO, 12 de Brasília-

DF e oito de Campo Grande-MS. Ainda, das 81 amostras, 80 eram provenientes de crianças

com até três anos de idade e uma amostra proveniente de uma criança com cinco anos de

idade. Também, das 81 crianças, 49 eram do sexo masculino e 32 feminino.

5.1.2-Genotipagem P por hemi-nested -RT-PCR

Das 81 amostras reagentes a mais de um iniciador P em estudos prévios utilizando

pool de iniciadores em reação de multiplex-nested-RT-PCR, 25 (30,9%) continuaram

apresentando reatividade mista quando novamente submetidas à genotipagem usando

iniciadores P específicos em separado para cada amostra, em reação de hemi-nested-RT-PCR.

A figura 5 exemplifica os padrões de reação para ambas as situações.

A tabela 1 mostra o padrão de reatividade de amostras Rotavirus A quanto submetidas

a hemi-nested-RT-PCR

utilizando iniciadores específicos em separado. Observou-se que de 52

amostras, que em estudos anteriores eram P[6]P[8], 22 mantiveram o mesmo padrão de

reação, 25 foram reativas apenas para P[8] e cinco foram não genotipadas. Também, de 15

amostras que eram P[4]P[8], apenas uma continuou reagindo a ambos os iniciadores, 10

reagiram apenas para P[8] e quatro foram não genotipadas. De oito amostras que eram

anteriormente reagentes a P[8]P[10], sete apresentaram reatividade apenas para P[8] e uma

não foi genotipada. Ainda, de cinco amostras que eram P[4]P[6]P[8] apenas uma apresentou

reatividade para os três iniciadores, outra foi reativa apenas para P[4]P[6] e três reagiram

apenas para P[8]. Uma amostra que anteriormente era P[4]P[6] foi positiva apenas para P[6].

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose de amostras submetidas a hemi-nested-RT-PCR utilizando pool de

iniciadores e iniciadores em separado (1T1 -P[8]e 3T1-P[6]). Linha 1- peso molecular 123 pb. Linhas 2 e 3 -

amostras 17158 e 19318, respectivamente, com iniciadores P[6][8] onde se observa positividade tanto para P[6]

–267 pb quanto para P[8] – 345 pb. Linhas 4 e 5 - amostra 17158 onde se observa positividade para P[6] (linha

4) e P[8] (linha 5). Linhas 6 e 7 - amostra 19318 onde também se observa positividade para P[6] (linha 6) e P[8]

(linha 7). Linha 8 - controle negativo.

Tabela 1 – Genotipos P de Rotavirus A detectados por hemi-nested-RT-PCR utilizando pool

de iniciadores e iniciadores P individuais (1T1-P[8], 2T1-P[4] e 3T1-P[6])- genotipagem

anterior X genotipagem atual.

Genotipagem Atual

Genotiapgem

P[4]P[8] P[6] NG Total

P[6]P[8] P[4]P[6] P[4]P[6]P[8] P[8]

22 - - - - 25 5 52

P[6]P[8]

- - 1 - - 10 4 15

P[4]P[8]

P[8]P[10] - - - - - 7 1 8

- - - - 1 - - 1

P[4]P[6]

- 1 - 1 - 3 - 5

P[4]P[6]P[8]

Total 22 1 1 1 1 45 10 81

NG. Amostras não genotipadas para nenhum iniciador P testado.

5.1.3- Sequenciamento genômico de amostras Rotavirus A reagentes a mais de um iniciador P

Para a análise dos resultados do sequenciamento, o alinhamento das amostras

Rotavirus A com amostras depositadas no GenBank e posterior construção da árvore

filogenética, foi feito utilizando seqüências de 143 nucleotídeos para P[4], 153 para P[6] e

143 para P[8] considerando as amostras protótipos RV-5, 1076 e Wa. O mesmo tamanho de

seqüências foi tomado como base para alinhamento a outras amostras depositadas e

construção da árvore (Figura 6).

Das 25 amostras Rotavirus A reagentes a mais de um iniciador P, 21 apresentaram

concentração de DNA suficiente para o sequenciamento genômico. Quando analisadas pelo

BLAST e comparadas a sequências depositadas no GenBank, 12 amostras demonstraram ser

mistas por mais de um genotipo P, sendo 10 delas P[6][8], uma P[4][6] e outra P[4][6][8],

com valores de identidade variando de 91% a 100% e e-value de e

-9

a e

-179

(Quadro 5 e

Tabela 2). Ainda, duas amostras P[6][8] (19316 e 19608), embora mostrassem homologia a

ambos os genotipos, foram desconsideradas para o alinhamento pelo Clustal X em função do

tamanho da seqüência e e-value de 2e

-9 -15

e 2e , respectivamente, para P[6]. Assim não foram

incluídas na árvore filogenética. Também, do total de amostras submetidas ao

sequenciamento, nove apresentaram-se apenas como P[8] (Quadro 6) (Tabela 2).

Tabela 2. Amostras mistas de Rotavírus A caracterizadas por sequenciamento genômico em

relação a hemi-nested-RT-PCR.

Sequenciamento Genômico

hemi-nested

Total

P[6]P[8] P[4]P[6] P[4]P[6]P[8] P[8]

RT-PCR

10 - - 8 18

P[6]P[8]

- - - 1 1

P[4]P[8]

- 1 - - 1

P[4]P[6]

- - 1 - 1

P[4]P[6]P[8]

Total 10 1 1 9 21

Quadro 5. Identificação das amostras mistas para genotipo P - Rotavirus A – por comparação

à amostras depositadas no GenBank utilizando o programa BLAST.

e-value Amostras No. Acesso amostra

referência

Identidade genotipo

Estudo

-92

17134*** AJ302153 216/222 (97%) 3e

P[8]

17158* DQ235982 275/276 (99%) 4e

-148

P[8]

17294* DQ235982 273/277 (98%) 2e

-137

P[8]

19196* AF061358 195/210 (92%) 6e

-60

P[8]

19316* AF061358 197/201 (98%) 6e

-94

P[8]

19318* M96825 276/286 (96%) 1e

-129

P[8]

19608* M96825 272/278 (97%) 1e

-135

P[8]

19855* M96825 291/298 (97%) 1e

-147

P[8]

19808* DQ236000 224/233 (96%) 4e

-89

P[8]

20036* AY629561 144/157 (91%) 3e

-31

P[8]

27505* AY856445 267/287 (93%) 3e

-90

P[8]

-80

17134*** AJ311737 171/174 (98)% 2e

P[6]

-90

17158* AJ311737 212/221 (95)% 2e

P[6]

-56

17294* AJ311737 177/186 (95)% 2e

P[6]

-93

18657** AJ311737 176/176 (100)% 2e

P[6]

-107

19196* AJ311737 199/199 (100)% 4e

P[6]

19316* AJ311737 73/81 (90)% 2e

-09

P[6]

-67

19318* AJ311737 174/180 (96)% 3e

P[6]

19608* AJ311737 85/94 (90)% 2e

-15

P[6]

-84

19808* AJ311737 161/161 (100)% 1e

P[6]

-53

19855* AJ311737 204/219 (93)% 2e

P[6]

-99

20036* AJ311737 199/201 (99)% 8e

P[6]

27505* AF161830 187/205 (91)% 6e

-63

P[6]

17134*** DQ172840 388/407 (95%) 5e

-179

P[4]

18657** DQ172840 180/193 (93%) 8e

-58

P[4]

* Amostras mistas para os genotipos P[6][8]. ** Amostra mista para os genotipos P[4][6]. ***Amostra mista

para os genotipos P[4][6][8]

Quadro 6. Identificação das nove amostras P[8] - Rotavirus A – por comparação a amostras

depositadas no GenBank utilizando o programa BLAST.

e-value Amostras No. Acesso amostra

referência

Identidade genotipo

Estudo

-137

17097 AJ605320 274/278 (98%) 2e

P[8]

-138

17453 AJ302153 272/278 (97%) 1e

P[8]

25391 DQ235982 272/277 (98%) 5e

-135

P[8]

17265 AF061356 259/261 (99%) 3e

-139

P[8]

19418 AF061358 187/194 (96%) 4e

-73

P[8]

-117

19575 M96825 249/256 (97%) 4e

P[8]

-122

19705 M96825 243/248 (97%) 6e

P[8]

21517 DQ236000 229/231 (99%) 3e

-121

P[8]

-79

19974 AJ605319 174/179 (97%) 1e

P[8]

Do total de 81 amostras submetidas a genotipagem P por hemi-nested-RT-PCR e

sequenciamento genômico, 12 confirmaram essa condição, sendo 10 amostras provenientes de

crianças do gênero masculino e duas do feminino, todas as crianças eram residentes da cidade

de Goiânia com idade variando entre quatro meses a dois anos. Essas 12 amostras foram

coletadas entre maio de 1998 a junho de 2001 (Quadro 7).

Quadro 7- Características das amostras confirmadas como infecções mistas por mais de um

genotipo P.

Amostra Genotipos Idade Gênero Data de Coleta Cidade

17134 P[4]P[6]P[8] 10-12 meses M 05/1998 Goiânia

18657 P[4]P[6] 4-6 meses M 04/1999 Goiânia

17158 P[6]P[8] 1 ano F 06/1998 Goiânia

17294 P[6]P[8] 10-12 meses M 09/1998 Goiânia

19196 P[6]P[8] 7-9 meses M 06/1999 Goiânia

19316 P[6]P[8] 7-9 meses M 06/1999 Goiânia

19318 P[6]P[8] 2 anos F 06/1999 Goiânia

19608 P[6]P[8] 1 ano M 07/1999 Goiânia

19808 P[6]P[8] 7-9 meses M 07/1999 Goiânia

19855 P[6]P[8] 2 anos M 07/1999 Goiânia

20036 P[6]P[8] 1 ano M 08/1999 Goiânia

27505 P[6]P[8] 2 anos M 06/2001 Goiânia

17134. P4

18657. P4

L26.P4

I200-1997.P4

RV5.P4

27505. P6

19318. P6

19855. P6

19196. P6

17294. P6

18657. P6

Se585.P6

19808. P6

20036. P6

17158. P6

17134. P6

1076.P6

M37.P6

ST3.P6

100

19196. P8

19318. P8

19855. P8

Wa.P8

L8.P8

Br1054.P8

BrH8.P8

F45.P8

19808. P8

20036. P8

27505. P8

17158. P8

17134. P8

OP601.P8

17294. P8

Figura 6. Árvore filogenética referente à seqüência nucleotídica do gene de VP4 de amostras mistas de Rotavírus

A construída pelo Clustal X e Tree View. Número de acesso no GenBank: para P[8] [OP601 (AJ302153), F45

(U30716), BrH8 (U41006), L8 (AF061358), Wa (L34161), Br1054 (U41004)]; P[6] [ST3 (L33895), M37

(L20877), 1076 (M88480), Se585 (AJ311737)]; P[4] [RV5 (U59103), L26 (M58292) e I200-1997 (DQ172840)].

Figura 7. Fluxograma apresentando as etapas da caracterização molecular das amostras de Rotavírus A

5.2-Adenovírus humano

5.2.1- Características das amostras de adenovírus humano

Das 74 amostras positivas para adenovírus humano, somente duas amostras eram

provenientes de crianças que não apresentavam diarréia. Do total das 74 amostras, 53 foram

obtidas de crianças residentes em Goiânia-GO, seis em Brasília-DF e 15 em Campo Grande-

MS. Ainda, 72 amostras eram provenientes de crianças com até três anos de idade e duas de

crianças com cinco anos de idade. Trinta e nove crianças eram do sexo masculino e 35 do

feminino.

5.2.2- Identificação das espécies de adenovirus humano por multiplex-PCR

Todas as 74 amostras de adenovírus humano identificadas no estudo e seis amostras

protótipos foram submetidas a propagação viral em células HEp-2, em uma única passagem

(Figura 8). Após propagação, lisados celulares dessas amostras foram analisados por

multiplex-PCR, sendo observada confirmação de positividade para todas as amostras

protótipos e ainda para 39 (52,7%) das 74 amostras estudo. Considerando as suspensões

fecais, foram também analisadas pelo mesmo procedimento 58 amostras destas 74, as quais

tinham volume suficiente para a análise e destas, 37 (63,8%) confirmaram positividade para

adenovírus. Comparando o resultado das 37 amostras derivadas da suspensão fecal com as 39

derivadas do lisado celular, foi observado que houve concordância de resultados para quase

todas as amostras (Figura 9).

A-HEp-2 B-AdVH4

C-AdVH5 D-AdVH7

E-AdVH10 F-AdVH31

G-AdVH41 H-Amostra 769577 (AdVH40)

Figura 8. Efeito citopático de amostras de adenovírus humano em células HEp-2. A-monocamada confluente de

células HEp-2. B-ECP amostra protótipo AdVH4.C-ECP amostra protótipo AdVH5. D-ECP amostra protótipo

AdVH7. E-ECP amostra protótipo AdVH10. F-ECP amostra protótipo AdVH31. G-ECP amostra protótipo

AdVH41.H-ECP amostra estudo 769577 sorotipo Ad40.

1 2 3 4 5 6 7 8

600 pb

300 pb

250 pb

1 2 3 4 5 6 7 8

600 pb

300 pb

250 pb

Figura 9. Eletroforese em gel de agarose mostrando a comparação do produto amplificado por multiplex-PCR

proveniente de: a) suspensão fecal e b) lisado celular obtido a partir de propagação viral em células HEp-2. 1:

peso molecular (50 pb), 2: amostra 28146 da espécie A (299 pb), 3: amostra 688694 da espécie C (269 pb), 4, 5,e

6: amostras 21699, 21885 e 7471, respectivamente, todas espécie F (586 pb), 7: protótipo Ad41 espécie F (586

pb) e 8: controle negativo.

5.2.3- Determinação das espécies de adenovírus humano por multiplex-PCR-específico

As 39 amostras confirmadas a partir dos lisados celulares, bem como as 37 amostras

obtidas a partir da suspensão fecal, foram submetidas a PCR utilizando pares de iniciadores

específicos em separado, para a definição da espécie. Foi observado que 30 (76,9%) das 39

amostras de lisados celulares foram caracterizadas como sendo da espécie F, seis (15,4%)

como espécie C, duas (5,1%) como espécie A e uma (2,6%) mostrou padrão de reação para

duas espécies, F e C. Ainda, considerando amostras de suspensão fecal, foi observado que 30

(81,0%) das 37 das amostras foram caracterizadas como espécie F, seis (16,2%) como espécie

C e uma (2,7%) como espécie A. Duas amostras caracterizadas a partir do lisado celular, uma

mista para as espécies F/C e a outra da espécie A, não puderam ser caracterizada a partir da

suspensão fecal por não haver volume suficiente para a análise. A análise comparativa

considerando as diferentes fontes das amostras, lisado celular e suspensão fecal, mostrou

haver concordância de resultados para quase todas as amostras em relação à espécie

determinada, sendo que somente três amostras da espécie F foram negativas quando

analisadas a partir do lisado celular (Tabela 3).

Tabela 3. Espécies de adenovírus humano definidas por multiplex-PCR considerando lisados

celulares e suspensão fecal.

Espécies

Espécime

F C A F/C NC Total

Lisado 30 6 2 1 35 74

Celular

Suspensão

fecal**

30* 6 1 - 21 58

F/C-Amostra positiva para as espécies F e C. NC-Amostras não caracterizadas para nenhuma espécie.

*Dentre essas 30 amostras da espécie F, três foram negativas a partir do lisado celular. ** Em 16 amostras o

volume foi insuficiente para a analise e destas, uma era espécie A, uma mista para as espécies F/C, três eram

espécie F e 11 foram negativas a partir do lisado celular.

A análise da distribuição das espécies de adenovírus humano, considerando a cidade

de coleta, mostrou que das 28 amostras positivas provenientes de crianças de Goiânia, 23

foram caracterizadas como espécie F, duas como espécie C, outras duas como A e a outra se

apresentou como espécies F/C. Em Brasília, apenas uma única amostra foi caracterizada em

espécie e esta era F, enquanto que em Campo Grande de dez amostras, seis eram da espécie F

e as outras quatro, espécie C (Tabela 4).

Tabela 4. Distribuição das espécies de adenovírus humano caracterizadas por multiplex-PCR a

partir de lisado celular obtido após propagação viral em células HEp-2, considerando a cidade

de coleta das amostras fecais.

Espécies

No. (%)

Cidade F C A F/C* Total No.(%)

Goiânia-Go 23 (82,1) 2 (7,1) 2 (7,1) 1 (3,5) 28 (100,0)

Brasília-DF 1 (100,0) - - - 1 (100,0)

Campo Grande-MS 6 (60,0) 4 (40,0) - - 10 (100,0)

Total 30 (76,9) 6 (25,4) 2 (5,1) 1 (2,5) 39 (100,0)

* Amostra positiva para duas espécies de adenovírus humano (F e C)

5.2.4- Determinação dos sorotipos de adenovírus humano por PCR-RFLP

A definição dos sorotipos foi obtida para 34 amostras caracterizadas a partir dos

lisados celulares através da PCR-RFLP utilizando as enzimas de restrição HinfI, HaeIII e StyI

(Figura 10). Todas as amostras confirmaram a identidade da espécie e, destas, 14 foram

AdVH41 (espécie F), 15 AdVH40 (espécie F), e cinco AdVH5 (espécie C) (Tabela 5).

Tabela 5. Sorotipos de adenovírus humano determinados por PCR-RFLP a partir de lisados

celulares após propagação viral em células HEp-2, considerando a cidade de coleta das

amostras.

Sorotipos

Cidade AdVH41 AdVH40 AdVH5 NS Total

Goiânia-Go 13 9 1 5 28

Brasília-DF - 1 - - 1

Campo

Grande-MS

1 5 4 - 10

Total 14 15 5 5 39

NS =Amostras que não puderam ser determinados os sorotipos.

a)HinfI

1 2 3 4 5 6 7 8

492 pb

369 pb

246 pb

123 pb

b)HaeIII

1 2 3 4 5 6 7 8

369 pb

246 pb

123 pb

c)StyI

1 2 3 4 5 6 7 8

861 pb

492 pb

369 pb

Figura 10. Perfil de cinco amostras de adenovírus em eletroforese em gel de agarose a partir da PCR-RFLP por

digestão do produto amplificado (956 pb) pelas enzimas: a) HinfI, b) HaeIII e C) StyI. Linha 1 -peso molecular

de 123 pb; 2 e 3 - amostras AdVH41; 4, 5 e 6 amostras AdVH40; 7 - amostra protótipo controle AdVH41 e 8 -

controle negativo.

5.2.5- Sequenciamento genômico de amostras de adenovírus entéricos

Foram submetidas ao sequenciamento genômico, três amostras de adenovírus sorotipo

41 visando confirmação de resultado. Todas essas amostras, quando analisadas pelo BLAST,

mostraram homologia à amostras AdVH41 depositadas no GenBank, mas apenas uma pode

ser caracterizada, uma vez que as demais não apresentaram um tamanho de seqüência

suficiente para análise comparativa. Essa amostra foi comparada a outras depositadas no

GenBank, utilizando um tamanho de seqüência de 674 nucleotídeos, apresentado 100% de

identidade com a cepa Ad41-Tak (Figura 11).

d40.Duga

Ad5

7471

Ad41.TAK

100

Figura 11. Árvore filogenética da seqüência nucleotídica do gene do Hexon de AdVH41. A árvore filogenética

foi construída pelo Clustal X e Tree View. Número de acesso no GenBank: Ad40-Dugan (X51782), Ad41-Tak

(X51783), Ad5 (X02997).

Figura 12. Fluxograma apresentando as etapas da caracterização molecular das amostras de adenovírus humano.

VI –DISCUSSÃO

O monitoramento dos genotipos de Rotavírus A no Brasil tem permitido a

identificação de quatro características epidemiológicas deste agente: 1- grande diversidade de

genotipos G e P circulando simultaneamente em determinado período e localidade; 2-

freqüente ocorrência de genotipos não usuais G e/ou P; 3- ocorrência de combinações G-P

não usuais; 4- importante proporção de ocorrência de infecções mistas por rotavírus, G e/ou P.

Estas condições podem de alguma forma influenciar na eficácia de uma vacina específica

(Santos et al. 2003). Neste contexto, um dos objetivos deste estudo foi mostrar a ocorrência de

infecções mistas por Rotavírus A em relação ao genotipo P em crianças da região Centro-

Oeste do Brasil.

As 81 amostras de Rotavirus A objeto deste estudo foram previamente caracterizadas

como mistas em estudos anteriores (Cardoso, 1997, Souza, 2001, Costa, 2003, Andreasi,

2004) quando analisadas por multiplex-nested-RT-PCR. No entanto, quando se utilizaram

iniciadores P específicos em separado em reação de hemi-nested-RT-PCR, foi observado que

apenas 25 (30,9%) destas amostras continuaram reagindo para mais de um iniciador. A

explanação admitida para essa redução no numero de amostras mistas é a de que a utilização

de um pool de iniciadores possibilita a ocorrência de dimerização entre diferentes iniciadores

em uma mesma mistura de reação, e/ou competição entre estes, além de interferência nas

especificidades para a temperatura de anelamento (Fischer et al. 2003). Dessa forma, a

utilização de iniciadores específicos em separado permite melhor definição das infecções

mistas. Por outro lado, a observação de que dez amostras se apresentaram como não

genotipadas para genotipo P nesta segunda análise, pode ser compreendida em função da

possibilidade de degradação viral nas suspensões fecais, uma vez que estas permaneceram

estocadas a -20°C por um período prolongado (por mais de cinco anos) com congelamentos e

descongelamentos.

Adicionalmente, de 21 amostras consideradas como infecções mistas apenas 12

(57,1%) confirmaram essa condição quando submetidas ao sequenciamento genômico, e nove

amostras (42,8%) confirmaram apenas para P[8]. Consideramos que essa ocorrência possa ser

explicada em função da baixa concentração de DNA no fragmento amplificado para P[6] e

P[4] o que limitaria o sequenciamento. De qualquer forma, o percentual de infecção mista

observado neste estudo de 14,8% (12/81) é semelhante ao encontrado por outros autores, onde

o índice de infecção mista para mais de um genotipo P varia de 10% a 23% (Ramachandran et

al. 1996, Leite et al. 1996, Mascarenhas et al. 1998, Das et al. 2002, Fischer et al. 2005).

No conjunto, as infecções mistas ocorreram preferencialmente para amostras P[6]P[8],

seguidas de P[4]P[6] e P[4]P[6]P[8]. Este resultado é semelhante ao de outros estudos em

diferentes regiões do mundo (Cunliffe et al. 2001, Nielsen et al. 2005, Fischer et al. 2005),

incluindo o Brasil (Leite et al. 1996, Mascarenhas et al.1998, Volotão et al. 2006). Esta

condição pode também influenciar no processo de vacinação para Rotavirus A uma vez que

poderiam facilitar o reassortment genético entre as amostras com subseqüente aparecimento

de novas combinações G-P, resultando no aumento da diversidade de genotipos que poderiam

vir a infectar a população humana (Gentsch et al. 1996, Santos et al. 2003, Banyai et al.

2004).

Os adenovírus foram o outro objeto deste estudo, sendo a definição da espécie e

sorotipo importante quando associados a um quadro de gastroenterite (Cruz et al. 1990).

Dessa forma, foi realizada a caracterização quanto a espécie e sorotipo de amostras de

adenovírus previamente detectados pelo EIERA (Cardoso et al. 1989, Camarota et al. 1992,

Azevedo, 1997, Borges, 2000).

Para isso, inicialmente foi realizada a propagação das amostras de adenovírus em

cultivo celular considerando que este procedimento aumenta a concentração de vírus

facilitando a caracterização viral por PCR-RFLP (Allard et al. 2001). Alguns autores relatam

dificuldade para o cultivo de adenovírus entérico em células HEp-2 (Hammond et al. 1985,

Perron-Henry et al. 1988, Ahluwalia et al. 1994), o que diverge do presente estudo, uma vez

que foi obtido 52,7% de confirmação de cultivo através da multiplex-PCR utilizando essa

linhagem celular, considerando a positividade prévia das amostras pelo EIERA.

Adicionalmente, houve concordância de resultados para quase todas as amostras em relação a

identificação da espécie, seja utilizando suspensão fecal ou lisado celular o que reforça a

fidelidade do cultivo das amostras.

Deve-se ressaltar que 76,9% dos isolados foram de amostras espécie F, que são

consideradas particularmente fastidiosas quando cultivadas nessa linhagem celular

(Hammond et al. 1985, Perron-Henry et al. 1988, Ahluwalia et al. 1994). Resultado

semelhante foi obtido por Vizzi et al. (1996) que ainda observaram não haver diferença no

padrão de isolamento para EAd quando comparado células HEp-2 a outra linhagem celular

(HEK-293), bem como por Soares et al. (2002). Consideramos que o não cultivo das demais

amostras de adenovírus possa ter se dado por degradação com perda da infectividade do vírus

durante a estocagem da suspensão fecal a -20°C por período prolongado, o que tem sido

admitido por outros (Gomes et al. 1989).

Como referido, a espécie F foi predominante entre os isolados de adenovírus seguida

da espécie C, a segunda espécie mais detectada, sendo encontrada em Goiânia e Campo

Grande, e após, a espécie A que foi encontrada somente em Goiânia. Nesta cidade, foi

também detectada infecção mista por duas espécies, F e C. A predominância da espécie F

também tem sido apontada por outros autores (Brown, 1990, Li et al. 2005), fato esperado

considerando a natureza do espécime em análise, onde apenas duas amostras fecais eram

provenientes de crianças sem diarréia. Destas duas amostras fecais não diarréicas, uma foi

caracterizada como espécie A e outra como C, corroborando a assertiva de que ambas podem

ou não ser associadas a gastroenterite (Gomes et al. 1989, Krajden et al. 1990, Horwitz, 2001,

Li et al. 2005). Em relação à amostra F/C detectada no estudo, resultado semelhante foi

encontrado por Pring-Akerblom et al. (1999). Os autores sugerem que essa situação possa ser

decorrente de uma infecção aguda simultânea por ambas as espécies, e argumentam que nessa

condição existe a possibilidade de um pior prognóstico da infecção. Uma outra possibilidade

seria a excreção prolongada da espécie C com infecção aguda pela espécie F (Pring-Akerblom

et al. 1999).

A definição da espécie F de adenovírus foi confirmada quando da definição dos

sorotipos. Neste sentido, foi observado que dentro da espécie, os sorotipos 40 e 41 foram

detectados em mesma proporção, o que está de acordo com a literatura (de Jong et al. 1983,

Jarecki-Khan et al. 1993). Confirmação semelhante foi observada para a espécie C, tendo sido

observado que cinco de seis amostras eram sorotipo 5. Por outro lado, cinco amostras não

puderam ser sorotipadas, duas em função da baixa concentração de DNA para a digestão com

as enzimas de restrição (uma da espécie C e uma da espécie F) e três devido a não

amplificação na reação de PCR-RFLP (2 amostras espécie A e 1 mista pelas espécies F e C).

Considerando que nenhuma das amostras da espécie A pôde ter definição de sorotipo em

função da não amplificação, consideramos a hipótese de que isso possa ter-se dado em função

dos iniciadores utilizados na reação terem sido desenhados com base na comparação de

seqüências do gene hexon derivados de vírus espécie C (AdVH2 e AdVH5) e F (AdVH40 e

AdVH41) (Saitoh-Inagawa et al. 1996). Confirmação também dos resultados relativos à

espécie/sorotipo de adenovírus foi visto quando do sequenciamento genômico de uma amostra

de AdVH41, que mostrou total identidade à cepa Ad41-Tak (de Jong et al. 1983).

Este é o primeiro estudo realizado na região Centro-Oeste do Brasil, no que se refere a

infecções mistas confirmadas por Rotavirus A, e de caracterização de amostras de adenovírus

humano em espécies e sorotipos. Assim sendo, consideramos que os resultados aqui

apresentados não só reforçam a literatura como também fornecem subsídios para uma melhor

compreensão destes agentes em relação à população infantil e futuros processos de vacinação.

Nesse sentido sugerimos que estudos futuros que venham a ser desenvolvidos sejam

direcionados ao nível de proteção oferecida por vacinas contra Rotavírus A em países com

prevalência elevada de genotipos não comuns e infecções mistas, como ocorre no Brasil.

VII –CONCLUSÕES

1- Infecções mistas de genótipos P de Rotavírus A foram confirmadas em crianças da

região Centro-Oeste do Brasil com predominância de amostras P[6]P[8].

2- A espécie de adenovírus pode ser identificada tanto em amostras submetidas ao

isolamento em cultura celular quanto diretamente a partir da suspensão fecal,

sendo a espécie F a mais freqüentemente encontrada, seguida das espécies C e A.

3- Foram identificados os sorotipos 5 (espécie C) e os sorotipos entéricos 40 e 41

(espécie F), estes dois últimos com igual frequência, sendo ainda confirmado por

sequenciamento genômico, o sorotipo de uma amostra AdVH41.

VIII–APÊNDICE

Meio, Soluções e Reagentes

7.1-Meio, antibióticos e antifúngico para a cultivo e manutenção de células HEp-2

7.1.1-Meio de Cultura MEM com L-Glutamina e sais de Earle, sem bicabornato de sódio

(Gibco BRL

MEM............................................................................................................................9,5 g

Água tridestilada estéril q.s.p.......................................................................................1000 mL

7.1.2-Antibióticos

Penicilina G..................................................................................................................10.000 U

Solução salina 0,85% estéril.........................................................................................20mL

Estreptomicina..............................................................................................................10.000 μg

Solução salina 0,85% estéril.........................................................................................20 mL

7.1.3-Antifúngico

Anfotericina B..............................................................................................................50 mg

Água estéril...................................................................................................................5 mL

7.2-Solução utilizada para o preparo das suspensões fecais

7.2.1-Tampão salina fosfato (PBS) pH 7,4

NaCl..............................................................................................................................8 g

Na 12H O.....................................................................................................................2,89 g

2 2

KH PO .........................................................................................................................0,2 g

2 4

KCl................................................................................................................................0,2 g

Água destilada estéril q.s.p...........................................................................................1000 mL

7.3-Soluções utilizadas para a extração do dsRNA de Rotavirus A e dsDNA de adenovirus

humano

7.3.1-Tampão Tris/HCl 1M – pH 6,4

Tris base.........................................................................................................................0,2 g

Água destilada estéril q.s.p............................................................................................1000 mL

7.3.2-Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,2 M – pH 8,0

EDTA............................................................................................................................74,4 g

Água destilada estéril q.s.p............................................................................................1000 mL

7.3.3-Sílica

Dióxido de sílica............................................................................................................60,0 g

Água destilada estéril q.s.p............................................................................................500 mL

7.3.4-Tampão L6

Isotiocianato de guanidina (GUSCN)............................................................................120 g

Triton X-100...................................................................................................................2,6 mL

EDTA 0,2 M pH 8,0.......................................................................................................22 mL

Tris/HCl 0,1 M pH 6,4...................................................................................................100 mL

7.3.5-Tampão L2

Isotiocianato de guanidina (GUSCN)............................................................................120 g

Tris/HCl 0,1 M pH 6,4...................................................................................................100 mL

7.4-Soluções utilizadas para a corrida em gel de agarose

7.4.1-EDTA 0,5 M pH 8,0

EDTA………………………………………………………………………………….186,1 g

NaOH.............................................................................................................................20 g

Água destilida estéril q.s.p.............................................................................................1000 mL

7.4.2-Solução de brometo de etídeo 0,5 mg/mL

Brometo de etídeo 10 mg/mL.........................................................................................50 μL

Água destilada estéril q.s.p............................................................................................950 μL

7.4.3-Tampão Tris/Borato/EDTA (TBE) 10X – pH 8,4

Tris base.........................................................................................................................108 g

Ácido bórico...................................................................................................................55 g

EDTA 0,5 M pH 8,0.......................................................................................................40 mL

Água bidestilada estéril q.s.p.........................................................................................1000 mL

7.4.4-Tampão corante para amostras

Azul de bromofenol........................................................................................................25 mg

Xileno cianol...................................................................................................................25 mL

Ácido bórico....................................................................................................................55 g

Glicerol............................................................................................................................3 mL

Água bidestilada estéril q.s.p...........................................................................................7 mL

7.4.5-Padrão de tamanho molecular

123 pb DNA ladder ou 50 pb DNA ladder.....................................................................2 μL

Tampão TBE 1X.............................................................................................................8 μL

Tampão corante para amostras........................................................................................1 μL

IX- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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