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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
JOSIRENY MARIANO MENDES
AÇÃO LEISHMANICIDA DE EXTRATOS DE PLANTAS NO
DESENVOLVIMENTO DE PROMASTIGOTAS DE
Leishmania amazonensis E ESTUDO DO PERFIL
METABÓLICO UTILIZANDO A TÉCNICA DE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE).
Orientador:
Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Dissertação de Mestrado
Goiânia - Goiás, 2006.
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i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Josireny Mariano Mendes
Ação leishmanicida de extratos de plantas no
desenvolvimento de promastigotas de Leishmania
amazonensis e estudo do perfil metabólico utilizando a
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Orientador:
Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de pós-
graduação em Medicina Tropical no Instituto de Patologia Tropical
e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, Goiânia - GO
como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em
Medicina Tropical na área de concentração de Parasitologia.
Goiânia - Goiás, 2006.
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ii
Todas as virtudes acumuladas
na composição desta tese
dedico à pesquisa científica e
à
paz, no mundo e interna,
de
todos os seres.
Em homenagem especial aos
meus pais, José Carlos e Ireny.
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me proporcionar a oportunidade de
crescimento, aprendizado e vida.
Ao professor orientador desta dissertação, Doutor José Clecildo
Barreto Bezerra, pela ajuda no crescimento profissional e pessoal, por me
fazer acreditar que posso mais do que imaginava ser.
Ao Professor Doutor co-orientador, Milton Adriano Pelli de
Oliveira, pela paciência de sempre ensinar e colaborar nos mínimos
detalhes.
À Professora Doutora, Heloísa Helena Garcia da Silva, pela coleta
e obtenção dos extratos da planta do Cerrado, utilizada neste trabalho.
A Professora Doutora Ana Maria de Castro pelo apoio, incentivo,
carinho e atenção constantes nesta trajetória.
A coordenação de pós-graduação do IPTSP/UFG, ao apoio
financeiro da CAPES, aos colegas do mestrado, funcionários, profissionais
do IPTSP/UFG e todos que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização deste trabalho.
Aos amigos de laboratório Aline Araújo, Cirlane Ferreira, Marines
Rieth, Marcos Gontijo, Tatiane Luiza, Mariana Félix e Juliana Avelar pelo
companheirismo e apoio e a Janayna Roriz pela força mesmo à distância.
Em especial à amiga Marina Clare Vinaud pelo incentivo diário e
apoio emocional fundamentais nos momentos de dificuldades profissionais
e pessoais e à Carolina Araújo pela colaboração e contribuição prática.
A amiga-irmã Renata Mundim pelo carinho e incentivo e aos
meus novos amigos da Pilates Corporale pelo apoio e torcida incondicional.
Ao meu amigo e namorado Lucas Mendonça de Castro, pelo
amor, apoio, paciência e companheirismo nos bons e, principalmente, nos
momentos de maior dedicação.
Por fim, aos meus pais, José Carlos Mendes e Ireny Mariano
Mendes, em conjunto com meus irmãos, Thiago Aires Mendes e Danilo
Aires Mendes, a família que nutre meus sonhos e sempre será meu ponto
de partida e de chegada. Muito Obrigada!
iv
“O segredo da vitória em todos os setores da vida permanece na
arte do aprender e fazer mais um pouco.”
André Luiz
v
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................ ... -vi-
ABSTRACT.............................................................................. ... -vii-
LISTA DE FIGURAS ................................................................ ... -viii-
LISTA DE TABELAS ................................................................ ... -xi-
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................... ... -xii
INTRODUÇÃO......................................................................... ... -1-
1. A doença e o agente ..................................................... ... -2-
2. Ciclo biológico.............................................................. ... -6-
3. Tratamento e recursos naturais ................................... ... -7-
4. Metabolismo ............................................................... ... -12-
JUSTIFICATIVA....................................................................... ... -17-
OBJETIVOS ............................................................................ ... -20-
ARTIGO 1 – Avaliação do perfil metabólico de promastigotas de
Leishmania amazonensis através da análise de ácidos orgânicos
realizada por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) ... ...
-22-
ARTIGO 2 – Análise por cromatografia líquida de alta eficiência
do efeito leishmanicida dos extratos naturais de Ma
g
onia
pubescens e Glycyrrhisa glabra
no desenvolvimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis.................................. -43-
CONCLUSÕES FINAIS ........................................................... ... -68-
CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................... ... -71-
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................... ... -74-
ANEXOS ................................................................................. ... -89-
vi
RESUMO
Dois milhões de novos casos de Leishmaniose ocorrem
anualmente nas áreas tropicais e subtropicais do globo, com uma
estimativa de doze milhões de pessoas atualmente infectadas no mundo
e trezentos e cinqüenta milhões sob risco de infecção. O gênero
Leishmania, responsável pela doença, compreende muitas espécies
diversas e complexas que apresentam resistência aos fármacos
utilizados no seu tratamento, além das características indesejáveis. A
eficácia do controle e tratamento de uma doença parasitária depende do
conhecimento detalhado do ciclo de vida, metabolismo e biologia em
geral do parasito. A Organização Mundial de Saúde, associada a outros
órgãos de pesquisas têm estimulado a investigação de novos extratos de
plantas nativas como alternativa para o tratamento e combate das
doenças parasitárias. Neste trabalho padronizou-se técnicas de estudos
bioquímicos através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
avaliando excreção e consumo dos ácidos orgânicos em promastigotas
de Leishmania amazonensis e realizou-se bioensaios com Magonia
pubescens (tingui) e Glycyrrhisa glabra (alcaçuz) nas concentrações de
25, 50 e 100 mg.L-1. Foram detectados os seguintes ácidos: lactato,
oxalato, citrato, -cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e
propionato, demonstrado atividades na via glicolítica, ciclo de Krebs e
cadeia respiratória. Ambos os extratos testados apresentaram ação
leishmanicida com melhor efeito para Glycyrrisa glabra 100 mg.L-1 e
Magonia pubescens 25 mg.L-1. A Glycyrrisa glabra teve melhor ação na
fase estacionária de crescimento ao contrario da Magonia pubescens
que melhor agiu na fase logarítmica. Constituintes químicos das
plantas podem atuar diretamente ou indiretamente no metabolismo do
parasito, afetando vias metabólicas essenciais.
Palavras Chave: Leishmania, metabolismo, ácidos orgânicos, plantas
leishmanicidas.
vii
ABSTRACT
Two million new cases of Leishmaniose occur annually in the
tropical and subtropical areas of the globe, with a estimate of twelve
million people currently infected in world and three hundred and fifty
million under infection risk. The Leishmania sort, responsible for the
disease, understands many diverse and complex species that present
resistance to the drugs used in its treatment, beyond the characteristics
undesirable. The effectiveness of the control and treatment of a
parasitic disease depends on the detailed knowledge of the cycle of life,
metabolism and biology in general of the parasite. The World Health
Organization, associated with other agencies of research has stimulated
the extract inquiry new of native plants as alternative for the treatment
and combat of the parasitic disease. In this work one standardized
techniques of studies biochemists through liquid chromatography high
performace (HPLC) evaluating organic acid excretion and consumption
of in promastigotes of Leishmania amazonensis and became fullfilled
biotests with Magonia pubescens (tingui) and Glycyrrhisa glabra
(alcaçuz) in the concentrations of 25, 50 and 100 mg.L-1. The acid had
been detected following: lactate, oxalate, citrate, -Ketoglutarate,
succinate, fumarate, malate and propionate, demonstrated activities in
the glycolytic pathway, cycle of Krebs and respiratory chain. Both the
tested extracts had presented leishmanicid action with better effect for
Glycyrrisa glabra 100 mg.L-1 and Magonia pubescens 25 mg.L-1. The
Glycyrrisa glabra had better action in the stationary phase of growth to
opposes it of Magonia pubescens that better acted in the logaritmic
phase. Chemical components of plants can act directly or indirectly in
the metabolism of the parasite, affecting essential metabolic pathways.
Key words: Leishmania, metabolism, acid organic, antileishmanial
plants.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição mundial da Leishmaniose...............................................
-3-
Figura 2 Distribuição dos casos de leishmaniose no Brasil...............................
-5-
Figura 3 Ciclo biológico da Leishmania.............................................................
-6-
Figura 4 Vias de degradação de carboidratos
(
metabolismo aeróbio
)
na
Leishmania........................................................................................
-14-
Figura 5 Curva de crescimento em triplicata, realizada com promastigotas de
Leishmania amazonensis, em meio de cultura Grace modificado,
durante 8 dias consecutivos...............................................................
-33-
Figura 6 Média da taxa de concentração de lactato
no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis
no início, no segundo, quarto e sexto dias..........................................
-34-
Figura 7 Média da taxa de concentração de oxalato
no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis
no início, no segundo, quarto e sexto dias..........................................
-34-
Figura 8 Média da taxa de concentração de citrato
no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis
no início, no segundo, quarto e sexto dias..........................................
-35-
Figura 9 Média da taxa de concentração de -cetoglutarato
no meio de cultura
e nas curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania
amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto dias......................
-35-
Figura 10 Média da taxa de concentração de succinato no meio de cultura e
nas curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania
amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto dias......................
-36-
Figura 11 Média da taxa de concentração de fumarato
no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis
no início, no segundo, quarto e sexto dias..........................................
-36-
Figura 12 Média da taxa de concentração de malato
no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis
no início, no segundo, quarto e sexto dias..........................................
-37-
Figura 13 Média da taxa de concentração de propionato no meio de cultura e
nas curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania
amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto dias......................
-37-
ix
Figura 14 Metabolismo da via glicolítica e dos aminoácidos................................
-42-
Figura 15 Ação da Magonia pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100
mg.L-1, na curva de crescimento das formas promastigotas de
Leishmania amazonenses...................................................................
-53-
Figura 16 Ação da Glycyrrhisa glabra, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-
1, na curva de crescimento das formas promastigotas de Leishmania
amazonenses.....................................................................................
-53-
Figura 17 Inibição média, em porcentagem, do crescimento de promastigotas de
Leishmania amazonensis sob ação da Glycyrrhisa glabra e da
Magonia pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.........
-54-
Figura 18 Inibição média, em porcentagem, do crescimento de promastigotas de
Leishmania amazonensis sob ação da Glycyrrhisa glabra e da
Magonia pubescens
nos sete dias consecutivos de cultura e de
exposição aos extratos........................................................................
-54-
Figura 19 Taxa de concentração de lactato
na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-57-
Figura 20 Taxa de concentração de oxalato
na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-58-
Figura 21 Taxa de concentração de citrato
na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-59-
Figura 22 Taxa de concentração de -cetoglutarato
na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-60-
Figura 23 Taxa de concentração de succinato na curva de crescimento
de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-61-
x
Figura 24 Taxa de concentração de fumarato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-62-
Figura 25 Taxa de Concentração de malato
na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-63-
Figura 26 Taxa de concentração de propionato
na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia
pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.......................
-64-
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela I Concentração em mmol x 10
-6
dos ácidos orgânicos no meio de
cultura e na cultura de promastigotas de Leishmania
amazonensis.............................................................................
-33-
Tabela II Detecção de ácidos orgânicos na cultura de promastigotas de
Leishmania amazonensis testadas com extrato de Gl
y
c
y
rrhisa
glabra (alcaçuz) nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1......
-56-
Tabela III Detecção de ácidos orgânicos na cultura de promastigotas de
Leishmania amazonensis testadas com extrato de Ma
g
onia
pubescens (tingui) nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1...
-56-
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA - Analysis of variation
ATP – Adenosina tri-fosfato
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
CO
2
– Dióxido de carbono
CRF – Conselho Regional de Farmácia
HPLC – Liquid Chromatography High Performace
IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
LC – Leishmaniose Cutânea
LV – Leishmaniose Visceral
NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo
OMS – Organização Mundial de Saúde
PPGMT – Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
SQR – Substância Química de Referência
UFG – Universidade Federal de Goiás
WHO - World Health Organization
Introdução 2
__________________________________________________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
1) A doença e o agente
As doenças infecciosas têm seu destaque na história da
humanidade por constituírem grandes problemas de saúde pública. No
Brasil, o quadro epidemiológico atual caracteriza-se pela coexistência de
doenças degenerativas e endêmicas, e o retorno de velhas doenças
infecciosas. Malária, leishmaniose, hanseníase, tuberculose, entre
outras, representaram, e ainda representam, grandes problemas de
saúde, particularmente na região amazônica. A melhoria da qualidade
de vida nos países do hemisfério norte, bem como os efeitos da
revolução Industrial e, particularmente, os fenômenos de urbanização e
aceleração tecnológica, restringiram essas doenças às “áreas pobres” do
mundo, dentre essas, as zonas tropicais (Sá et al. 1992).
Por muitos anos, as Leishmanioses têm sido um problema de
saúde pública subestimado, no entanto nos últimos dez anos, regiões
endêmicas têm apresentado um aumento significativo nos números de
casos da doença. Apesar da declaração ser compulsória, somente trinta
e dois dos oitenta e oito paises afetados pelas leishmanioses possuem
registro substancial de novos casos. Na realidade, dois milhões de novos
casos ocorrem anualmente nas áreas tropicais e subtropicais do globo,
com uma estimativa de doze milhões de pessoas atualmente infectadas
no mundo e trezentos e cinqüenta milhões sob risco de infecção (Figura
1). Destes novos casos um milhão e meio são de leishmaniose cutânea e
quinhentos mil de visceral. Apesar dos surpreendentes números,
somente seiscentas mil infecções são oficialmente registradas a cada
ano (ANVISA 2003, WHO 2006).
Como muitas doenças relacionadas com as desigualdades sociais,
nesta também ocorre uma alta morbidade e uma baixa mortalidade,
isso porque a leishmaniose se apresenta invisível, visto que a maioria
dos infectados vive em áreas afastadas dos centros urbanos, em parte
devido ao estigma social, pois as deformidades e as cicatrizes
desFigurantes causadas por esta doença mantém os pacientes
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 3
__________________________________________________________________________________________________________
escondidos. As inaptidões relacionadas com a doença impõem um
grande fardo social, especialmente para mulheres, e prejudicam as
produtividades econômicas, impedindo assim, o desenvolvimento
socioeconômico das regiões endêmicas (WHO 2006).
Figura 1: Distribuição mundial da Leishmaniose (Handman 2000)
Em várias áreas do mundo, há um nítido aumento no número de
casos e neste contexto também se encontra o Brasil, visto que de 1998
até 2002 ocorreu um aumento de aproximadamente 18.200 casos de
leishmaniose cutânea e 4.160 de leishmaniose visceral (Desjeux 2004).
No Brasil, a leishmaniose visceral atinge 19 estados, especialmente da
região Nordeste, onde estão concentrados mais de 90% dos casos
humanos da doença. Há focos importantes também nas regiões Norte,
Sudeste e Centro-Oeste, nas duas últimas décadas tem havido um
crescente aumento da incidência, com uma média anual nos últimos
cinco anos de 3.500 casos (Figura 2). O aumento da incidência da
leishmaniose está associado com o desenvolvimento urbano,
devastações florestais, mudanças ambientais e migrações de pessoas
para áreas onde a doença é endêmica e ainda mudanças na
suscetibilidade do hospedeiro humano à infecção como no caso de
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 4
__________________________________________________________________________________________________________
imunossupressão e desnutrição (Carvalho et al. 2000, Patz et al. 2000,
Ashford 2000, Silva e Camargo-Neves 2006).
As leishmanioses, em especial a Leishmaniose visceral (LV), tem
sido associadas a infecções por HIV. O impacto destas co-infecções pode
ser enorme em países como a Índia, Sudão e, possivelmente, no Brasil e
região mediterrânea, podendo mudar a epidemiologia da LV. Alguns
desses fatores podem ser diminuídos com a aplicação de estratégias de
controle, associadas às entidades eco-epidemiológicas e ajustados às
mudanças ambientais com auxílio dos novos avanços metodológicos de
informação geográfica e da pesquisa científica (Desjeux 2001, Guerin et
al. 2002).
As manifestações clínicas da doença são variáveis e dependem da
associação entre as características de virulência da espécie de
Leishmania infectante e da resposta imunológica do hospedeiro
(Pearson e Souza 1996). De acordo com as manifestações clínicas, as
leishmanioses podem ser classificadas, particularmente, num complexo
de três grupos: leishmaniose visceral, cutânea e mucocutânea e difusa.
A forma cutânea caracteriza–se por úlceras crônicas na pele,
desenvolvidas no local da picada do inseto vetor e que podem levar
meses para cicatrizar. Já a forma mucocutânea causa, no início,
úlceras na pele similares aquelas da leishmaniose cutânea que,
entretanto, cicatrizam para depois reaparecerem, principalmente, nas
mucosas do nariz e da boca, geralmente esta forma é acompanhada por
infecções secundárias e destruição de grandes extensões de tecido. A
leishmaniose visceral, conhecida como calazar, é uma doença sistêmica
muito grave, com migração dos parasitos para o fígado, baço e medula
óssea, podendo levar o hospedeiro à morte (Handman 2000, Carvalho
2000).
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 5
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Figura 2: Distribuição dos casos de leishmaniose no Brasil (FUNASA 2001)
Essas doenças infecciosas que acometem humanos e outros
vertebrados são causadas por várias espécies de protozoários do gênero
Leishmania (ordem Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae) e
transmitidas por insetos fêmeas da subfamília Phlebotominae
(Phlebotomus sp e Lutzomyia sp). O gênero Leishmania compreende
muitas espécies epidemiologicamente diversas e complexas, que podem
ser agrupadas, segundo Lainson e Shaw (1987), em dois sub-gêneros,
Leishmania e Viannia, tendo por base o desenvolvimento natural do
parasito no seu vetor (Grimaldi e Tesh 1993, Genaro 2000). Até o
momento, foram identificadas, no Brasil, seis espécies de Leishmania
pertencentes aos subgêneros Leishmania e Viannia. A principal é
Leishmania (Viannia) braziliensis, encontrada em todas as zonas
endêmicas do país e associada à presença de animais domésticos. As
outras são a Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia)
naiffi, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) lainsoni e
Leishmania (Leishmania) amazonensis (estas espécies predominam na
região norte do Brasil) (Gontijo e Carvalho 2003). Os reservatórios
primários do parasito são os animais silvestres. Porém, os animais que
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 6
__________________________________________________________________________________________________________
convivem diretamente com o homem, como o cão e o cavalo, servem,
secundariamente, como reservatórios (Oliveira-Neto et al. 2000).
2) Ciclo biológico
As leishmanioses compreendem um grupo de doenças que
apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas
distintas, sendo uma protozoose causada por parasitos intracelulares
do sistema fagocítico mononuclear. Essa doença é uma zoonose
primariamente de animais silvestres, sobretudo roedores, sendo
transmitida por flebotomíneos. Seres humanos possuem uma
suscetibilidade variada à doença, embora não faça parte da cadeia de
transmissão habitual (Veronesi 1991, Carvalho 2000).
A Leishmania é um parasito que, para sua multiplicação no
hospedeiro, se apresenta obrigatoriamente na forma intracelular.
Durante o ciclo evolutivo (Figura 3), estes protozoários apresentam duas
formas básicas, amastigotas e promastigotas. As promastigotas vivem
no lúmem do tubo digestivo do inseto vetor e são formas alongadas,
flageladas e móveis, enquanto as amastigotas são formas arredondadas
sem flagelo aparente e que infectam células do sistema mononuclear
fagocítico do hospedeiro vertebrado (Chang, 1990).
Figura 3: Ciclo biológico da Leishmania. Abreviações: VL –
Leishmaniose visceral, CL – Leishmania cutânea. (Fonte: WHO 2006)
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 7
__________________________________________________________________________________________________________
Uma vez inoculada na pele do hospedeiro, pela picada do
mosquito, a forma promastigota metacíclica (infectiva) liga-se por
receptores específicos aos macrófagos e é fagocitada, elas são imunes
aos ácidos e enzimas dos lisossomos com que os macrófagos tentam
digerí-las e transformam-se nas formas amastigotas após algumas
horas. Então começam a multiplicar-se por divisão binária, saindo para
o sangue ou linfa por exocitose e no momento em que a célula
hospedeira está densamente parasitada, há o rompimento de sua
membrana e as amastigotas disseminam pelos tecidos, infectando
novos macrófagos, exarcebando assim, o quadro de infecção (Russeal
1995).
A infecção do vetor ocorre quando as fêmeas, ao sugarem o
sangue de mamíferos infectados, ingerem macrófagos parasitados por
formas amastigotas da Leishmania. No trato digestivo anterior ocorre o
rompimento dos macrófagos liberando as amastigotas que se
reproduzem por divisão binária e se diferenciam rapidamente em
formas flageladas denominadas de promastigotas, estas também se
reproduzem por processos sucessivos de divisão binária. As amastigotas
ingeridas pelos insetos transmissores demoram oito dias ou mais para
se diferenciar em promastigotas. As formas promastigotas
transformam-se em paramastigotas as quais colonizam o esôfago e a
faringe do vetor, onde permanecem aderidas ao epitélio pelo flagelo,
quando se diferenciam em formas infectantes - promastigotas
metacíclicas fechando, dessa forma, o ciclo biológico de transmissão
deste protozoário (Alexander et al. 1999, Burchmore e Barrett 2001).
3) Tratamento e recursos naturais
O diagnóstico precoce da leishmaniose é essencial para que a
resposta terapêutica seja mais efetiva e sejam evitadas as seqüelas
deformantes e/ou funcionais (Oliveira-Neto et al. 2000). Entre os
fármacos disponíveis para o tratamento, encontram-se o alopurinol, que
tem sido explorado clinicamente no tratamento da leismaniose cutânea
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 8
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(Martinez et al. 1992). Os antimoniais pentavalentes, como o
antimoniato de meglumina (Glucantine) e o estibogluconato de sódio
(Pentostan) formam a “primeira-linha” de fármacos no tratamento das
leishmanioses cutâneas (McGreevy et al. 1986, Berman 2003). Uma
“segunda-linha” de fármacos é empregada no tratamento de leismaniose
visceral (Anfotericina B). A duração da terapia e a resposta clínica
variam de região a região e da interação patógeno-hospedeiro.
Os antimoniais pentavalentes são indicados para o tratamento de
todos os tipos de manifestação clínica de leishmaniose, embora as
formas mucosas e mucocutâneas exijam maiores cuidados por
apresentarem respostas mais lentas e maior possibilidade residual. As
drogas de segunda escolha são a Anfotericina B e a Pentamidina.
Recentemente tem-se reportado resistência aos fármacos de primeira
escolha requerendo o uso de compostos mais tóxicos como os de
segunda escolha (Rocha et al. 2005).
Na prática, a aplicação de altas doses por prolongados períodos é
comum. A anfotericina B apresenta efeitos colaterais indesejados e até
graves como artralgias, inapetência, reuralgia, náuseas entre outros,
portanto a necessidade de sua administração em hospitais é uma
dificuldade adicional no tratamento, em se considerando as condições
de saúde pública prevalentes nas regiões endêmicas (Berman 1997,
2003). Além disso, os fármacos utilizados apresentam alto custo,
requerem um regime de tratamento longo e estão se tornando cada vez
menos efetivos (Rocha et al. 2005).
Esta terapia tem se mostrado pouco eficiente em diversos casos.
Em pacientes resistentes ao Glucantine e ao Fungizon não se
identificam alternativas eficazes. Tende-se a repetir o tratamento, com
doses nos limites da tolerância ou a utilizar o isotionato de pentamidina
como uma última alternativa. Aliado a baixa eficácia de tratamento, se
observam também diversas reações de toxicidade severa que vão desde
náusea, vômitos e mialgia até, nos casos mais graves o choque,
alterações eletrocardiográficas, hipersensibilidade, anemia e trombose
venosa (Berman 1997).
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
Introdução 9
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Além disso, os fármacos possuem uma eficácia variável, pois a
administração é feita por via parenteral por períodos prolongados,
levando o paciente, muitas vezes, a não completar o esquema
terapêutico (Craft 2006). Tais características indesejáveis, associadas ao
aparecimento de formas resistentes de Leishmania (Geary et al. 1989) e
a ausência de medidas profiláticas eficientes e de uma vacina efetiva,
têm exacerbado a necessidade do desenvolvimento de fármacos
antileishmanióticos mais eficazes e menos tóxicos ao paciente. A
toxicidade é particularmente severa no tratamento de crianças e idosos
ou indivíduos portadores de infecções oportunistas secundárias. Novas
estratégias de controle e ou combate à doença devem ser investigadas
Diante disto, sabe-se que os produtos naturais sempre foram
procurados pelas indústrias agroquímica e farmacêutica como fonte de
novas substâncias ativas com objetivo de extração e síntese de novos
compostos químicos ativos, apesar de todo avanço no planejamento
racional de fármacos, síntese química e química combinatória (Verdine
1996, Harvey 2000). O uso empírico de plantas medicinais pela
população tem demonstrado que caule, raízes, folhas, sementes e frutos
de plantas apresentam eficiência na cura de diversos males, suscitando
assim grande interesse no estudo científico destas plantas. Nos últimos
anos, as plantas tornaram-se uma importante fonte de produtos
naturais biologicamente ativos, 25% dos medicamentos do mercado
farmacêutico possuem extratos em sua composição, alguns dos quais
têm sido usados como matéria-prima de fármacos semi-sintéticos
(Bergmann et al. 1997).
A observação das propriedades terapêuticas de produtos naturais
tem levado à pesquisa dos compostos ativos de várias espécies vegetais.
metabólitos secundários tais como alcalóides, terpenóides, flavonóides,
considerados no passado como inativos, são hoje ferramentas
importantes no tratamento e investigação clínica. Compostos que
estimulam o sistema imune são úteis quando usados como adjuvantes
no tratamento de certas doenças causadas por fungos, bactérias e
protozoários, como na leishmaniose. Neste caso, estudos químicos e
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Introdução 10
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imunofarmacológicos têm sido realizados com o intuito de encontrar
novos compostos menos tóxicos, economicamente mais viáveis de efeito
específico e que reverta a resistência do parasito aos fármacos
(Bergmann et al. 1997).
Um número grande de extratos de plantas, algumas de uso
tradicional, foi mostrado possuir atividade contra espécies de
Leishmania e em alguns casos as substâncias ativas foram
identificadas. Resultados obtidos com extrato de plantas, in vivo e in
vitro, demonstram que a atividade pode ser encontrada numa extensa
diversidade de famílias, das quais se destacam Crassulaceae (gênero
Kalanchoe), Annonaceae (muitos gêneros), Piperaceae (especialmete o
gênero Piper), Rutaceae (com destaque para o gênero Galipea) e
Apocynaceae (gênero Peschiera entre outros). Classes químicas que se
distinguem incluem alcalóides e chalconas que foram demonstrados
agir diretamente sobre o parasito, enquanto outras classes que
abrangem uma variedade de substâncias fenólicas, terpênicas e
polissacarídeos parecem agir sobre o macrófago estimulando-o a
produzir óxido nítrico, mediadores de reação imunológica letais ao
parasito sem prejudicar o próprio macrófago (Gilbert e Favoreto 2005).
Dentre as numerosas plantas com potencial na modulação da
resposta imune na leishmaniose, a Kalanchoe pinata tem demonstrado
efeito sobre a redução das lesões em camundongos de linhagem
susceptível pelo aumento da produção de óxido nítrico por macrófagos
(Bergmann et al. 1997). Outra espécie Solanum lyratum Thunb
(Solanaceae), utilizada na medicina Coreana, também aumenta a
produção de óxido nítrico produzido por macrófagos da cavidade
peritoneal de camundongos, o que sugere possível atividade terapêutica
no tratamento da leishmaniose (Kim et al. 1999).
O efeito leishmanicida dos compostos isolados das espécies
vegetais tem sido avaliado in vitro sobre formas promastigostas e/ou
amastigota de Leishmania; dentre eles terpenóides de Artemisia annua
(Yang et al. 1992), de Peperomia galioides (Mahiou et al. 1995) e de
Guarea rhophalocarpa (Camacho et al. 2000); aminoglicosteróides e
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Introdução 11
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aminosteróides de Holarrhena curtisii (Kam et al. 1997), naftoquinonas
de Pera benensis (Fournet et al. 1992, Kayser et al. 2000), iridóides
glicosídicos de Picrorhiza kurroa (Mittal et al. 1998); flavonóides de
Centrolobium sclerophyllum (Araújo et al. 1998) e neolignanas de Virola
surinamensis (Barata et al. 2000).
Além destes compostos, os alcalóides também têm sido muito
estudados quanto ao seu potencial leishmanicida. Muitos destes
alcalóides são isolados de espécies vegetais nativas bolivianas,
utilizadas pelos indígenas quimane dentre elas: Cardiopetalum
calophyllum, Abuta rufescens e Abuta pahni (revisto por Fournet et al.
1992).
Dentre os alcalóides, a isotetrandrina isolada de Limaciopsis
loangensis da família Menispermaceae tem efeito leishmanicida similar
ou maior que o glucantime em modelos experimentais in vivo sobre a
infecção causada por Leishmania amazonensis e Leishmania
venezuelensis (Fournet et al. 1992). Foram também isolados dois
alcalóides quinolínicos da Galipea longiflora da família Rutaceae, que
apresentam efeito leishmanicida in vivo da infecção causada por estas
duas espécies de Leishmania (Fournet et al. 1993).
Além de apresentarem efeito sobre a infecção do Novo Mundo em
camundongos, estudos toxicológicos de alguns dos alcalóides sugerem
ausência de efeitos tóxicos em doses bioativas, em curto prazo de tempo
(Fournet et al. 1993). O estudo de compostos ativos de plantas pode se
tornar um método alternativo na busca pelo controle e tratamento da
doença. Grande parte das drogas antiparasitárias foram desenvolvidas
sem um estudo detalhado. O mecanismo de ação e interação em
humanos é geralmente descoberto após a liberação do uso destes
medicamentos (Davis et al 2004). Por isso, é importante e necessário
definir diferenças metabólicas entre parasito e seu hospedeiro.
4) Metabolismo
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Introdução 12
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Vários membros da família Trypanosomatidae geram energia por
uma mesma via metabólica, entretanto diferenças fundamentais
também existem e não são sempre conhecidas. A Leishmania e o
Trypanosoma são membros da família dos tripanosomatídeos,
apresentam ciclos de vida complexos, envolvendo, ambos, hospedeiros
vertebrados e o inseto vetor. Durante seu ciclo de vida os parasitos
adaptam seu metabolismo com a disponibilidade de alimentos, ou
melhor, com os substratos disponíveis. A glicose é a maior fonte de
energia pra maioria dos estágios nos hospedeiros vertebrados, no
entanto, os estágios no inseto preferem aminoácidos, como a prolina, e
não a glicose como fonte de energia, porém a via glicolítica é sempre
ativa. A prolina e o glutamato são os dois substratos mais importantes
utilizados e são oxidados em α-cetoglutarato e degradados até succinato
via ciclo de Krebs e podem ser importantes somente nos estágios onde
este ciclo é ativo (Tielens e Van Hellemond 1998).
Os tripanossomatideos degradam carboidratos pela via glicolítica
e em todos os membros desta família a primeira reação ocorre dentro do
glicossomo, organela única da ordem Kinetoplastida (Opperdoes 1995,
Clayton e Michels 1996). Enzimas glicolíticas como a hexoquinase,
fosfofrutoquinase, frutose-1,6-bifosfatase, glicerol-3-fosfato-
desidrogenase, glicerol-3-fosfato desidrogenase, gliceroquinase,
fosfoglicerato, estão presentes nessa organela (Galbraith, 1991, Urbina
1994).
O piruvato é o produto final da glicólise e é freqüentemente
degradado por uma mitocôndria única, no entanto, a participação
mitocondrial na degradação dos carboidratos varia muito, embora todos
tripanossomatideos possuam somente uma mitocôndria durante todo
ciclo de vida (Figura 4). As promastigotas de Leishmania possuem um
metabolismo energético no qual pequena parte do carboidrato é oxidado
completamente em CO
2
, via ciclo de Krebs, mas grande parte é oxidado
em produtos como acetato, piruvato e succinato que são também
produtos finais da glicose (Cazzulo 1992). Uma pequena parte do
piruvato é transaminado em alanina que é excretada (Blum 1993).
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Introdução 13
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Nas promastigotas, parte dos produtos finais oxidados são
resultados do metabolismo aeróbio envolvendo uma cadeia
transportadora de elétrons com um aceptor final de oxigênio como no
Trypanosoma em condições aeróbias. O succinato produzido durante
incubações de promastigotas em condições aeróbias é principalmente
produzido via oxidativa envolvendo parte do ciclo de Krebs (de
oxalacetato via citrato até succinato) e oxidação de NADH via cadeia
respiratória (Van Hellemond et al. 1997).
As formas amastigotas são intracelulares e possuem uma
mitocôndria reduzida denominada pró-mitocôndria. Isto sugere um
metabolismo aeróbio ou anaeróbio facultativo, semelhante nas
promastigotas, porém ambos os estágios são dependentes da atividade
do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória semelhante aos mamíferos,
embora os ácidos graxos provavelmente sejam os mais importantes
substratos para os estágios no inseto, como na L. mexicana (Hart e
Coombs 1982).
Outra via de degradação de glicose, a pentose fosfato, é também
ativa nos tripanossomatideos. Esta via não é muito utilizada no
catabolismo de substratos (glicose), pois são necessários ribose 5-
fosfato (biossíntese de nucleotídeos) e NADPH, e não estão disponíveis
para o parasito. Assim a atividade da pentose fosfato na Leishmania é
extremamente dependente de condições de cultura (Barrett 1997).
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Introdução 14
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Figura 4: Vias de degradação de carboidratos (metabolismo aeróbio) na
Leishmania. Os produtos finais estão em negrito e as linhas pontilhadas
indicam vias menos utilizadas. O complexo enzimático envolvido no transporte
de elétrons são indicados por quadrados verdes e azuis e o complexo
ubiquinona/ubiquinol por elipses amarelas. Legenda: AcCoA – acetil-CoA, Citr
– citrato, DHAP – diidroxiacetona fosfato, FBP - frutose 2,6 bifosfato, F6P -
frutose 6-fosfato, GAP - gliceraldeído 3-fosfato, G3P - glicerol 3-fosfato, G6P -
glicose 6-fosfato, F6P - frutose 6 fosfato, MAL – malato, Oxac – oxalacetato,
PEP – fosfoenolpiruvato, Pyr – piruvato, Succ – succinato, SuccCoA - succinil-
CoA, 1,3BPGA - 1,3 bifosfoglicerato, 2-PGA – 2 fosfoglicerato, 3-PGA - 3-
fosfoglicerato. (Adaptado de Tiellens e Van Hellemond 1998)
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Introdução 15
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Durante o ciclo de vida, os tripanossomatideos encontram
grandes variações de viabilidade de oxigênio, visto que as formas
sanguíneas possuem muito oxigênio viável, enquanto certos estágios,
como no inseto, podem se confrontar com condições de hipóxia.
Surpreendentemente existem diferenças na capacidade anaeróbia dos
tripanossomatideos, formas sanguínea de Trypanosoma brucei são
organismos anaeróbios facultativos e possuem funções adequadas na
ausência de oxigênio, enquanto que as promastigotas de Leishmania
possuem baixa capacidade funcional anaeróbia e utilizam o
metabolismo de reserva durante a anóxia (Van Hellemond et al. 1997,
Van Hellemond e Tielens 1997).
As promastigotas não são resistentes a anóxia, elas começam se
mover lentamente ou ficam inertes e não proliferam quando a tensão de
oxigênio é baixa (Van Hellemond e Tielens 1997, Hart e Coombs 1981).
Elas possuem uma pobre capacidade anaeróbia e dependem
principalmente da respiração para gerar energia. Entretanto, embora as
promastigotas aparentemente não possuam um metabolismo anaeróbio
facultativo como o T. brucei, elas são tolerantes a hipóxia por um
extenso período e a inibição de sua cadeia respiratória resulta numa
reversão das condições no qual o metabolismo é reduzido a níveis
mínimos, podendo induzir a uma estivação das promastigotas. Esta
habilidade garante a sobrevivência em condições adversas e muitas
vezes previne o desenvolvimento durante o estágio no mosquito (Van
Hellemond e Tielens 1997).
Quanto à cadeia respiratória existe uma diferença essencial entre
os vários estágios de desenvolvimento, pois todas as espécies e estágios
possuem muitos tipos de cadeia transportadora com oxidases terminais
que usam o oxigênio como aceptor final de elétrons. As promastigotas
possuem uma clássica cadeia respiratória, mas carece de uma oxidase
alternativa que esta presente em outros tripanossomatideos (Martin e
Mukkada 1979). Isto tem sido apresentado porque as promastigotas são
extremamente dependentes desta clássica cadeia respiratória para sua
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Introdução 16
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geração de energia. Isto esta de acordo com a observação que as
promastigotas possuem um metabolismo energético no qual a maioria
dos carboidratos é degradada e parcialmente oxidada até os produtos
finais como acetato, succinato e piruvato, um processo que
concomitantemente produz NADH que é re-oxidado pela cadeia
respiratória (Van Hellemond et al. 1997).
Em muitos tripanossomatideos o succinato é um produto final do
metabolismo energético. Tem sido sugerido que este succinato é
produzido pela fumarato redutase uma enzima homologa a succinato
desidrogenase do ciclo de Krebs, que catalisa a reação reversa –
oxidação do succinato. A fumarato redutase é bem conhecida em
bactérias e em helmintos, onde sua função esta na absorção de elétrons
no metabolismo anaeróbio destes organismos. Entretanto é pouco
provável que a fumarato redução ocorra significativamente nos
tripanossomatideos (Ackrell et al. 1992, Tielens 1994).
Nas promastigotas o succinato é produzido principalmente por
normal funcionamento do ciclo de Krebs. Somente os estágios que
possuem ciclo de Krebs ativo produzem succinato, o que indica que
estes dois processos são observados no parasito e que a redução de
fumarato tem ocorrido ao mesmo tempo em que a oxidação do
succinato, bioenergeticamente é um evento improvável em uma
mitocôndria única (Tielens e Van Hellemond 1998).
Sendo assim, a compreensão metabólica e o conhecimento
aprimorado dos mecanismos metabólicos específicos do parasito e de
seu hospedeiro amplia a possibilidade de um combate mais acentuado e
eficaz ás muitas doenças que atingem o homem. Estabelecer diferenças
metabólicas nesta relação possibilita a determinação de medidas
terapêuticas de controle e combate dos parasitos através de alvos
específicos nos quais o uso de compostos naturais ou sintéticos não
propicie danos ao hospedeiro, porém seja letal ao parasito.
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Justificativa 18
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JUSTIFICATIVA
A eficácia do controle e tratamento de uma doença parasitária
depende do conhecimento detalhado do ciclo de vida, metabolismo e
biologia em geral do parasito. No passado, homens eram tratados com
produtos extraídos de plantas por administração exclusivamente oral,
pois se acreditava que o sítio das infecções fosse o trato intestinal. Os
avanços dos conhecimentos anatômicos, bioquímicos e estudos
fisiológicos, e o entendimento de quase todos os ciclos de vida dos
parasitos no homem, permitem que atualmente se realize um processo
de planejamento de tratamento de maneira mais racional, com ênfase
no mecanismo de ação (Frayha et al. 1997), visando atingir diretamente
os alvos específicos e essenciais dos parasitos. Explorando as diferenças
entre o metabolismo do hospedeiro e do parasito, pode-se determinar
importantes mecanismos de ação de fármacos.
A Organização Mundial de Saúde (OMS), associada a outros
órgãos de pesquisas têm estimulado a investigação de novos extratos de
plantas nativas como alternativa para o tratamento e combate das
doenças parasitárias (Bodeker e Willcox 2000). Torna-se importante
destacar que o Brasil é privilegiado por possuir uma riqueza imensa de
espécies vegetais e que esse potencial vem sendo reduzido devido ao
avanço da agricultura e devido as queimadas, onde várias espécies de
plantas, com potenciais antiparasitários, além de outras importantes
propriedades, estão sendo extintas.
Dentro deste contexto está a região Centro-Oeste, formada pela
flora do Cerrado, que representa o segundo maior bioma vegetal
brasileiro. Esse importante recurso natural carece de estudos mais
profundos e aplicados, visando o encontro de formas alternativas para
garantir a saúde da população de forma menos onerosa, eficiente e
segura, além de chamar atenção para a necessidade de preservação do
ecossistema. Assim, várias espécies da flora do cerrado são
consideradas plantas taníferas, por apresentarem altos teores de
taninos que contribui na defesa das plantas contra ataque de
Justificativa 19
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herbívoros, além de limitar o crescimento de microorganismos
patogênicos (Alcanfor et al. 1999, Silva et al. 1999).
Um fator relevante é a análise de como atuam estas substâncias
em hospedeiros ou parasitos, e se destes produtos poderiam ser
extraídos componentes específicos ao metabolismo, que pudessem inibir
determinada reação metabólica vital (Bezerra e Becker 1994, 1997,
1999, Herzog-Soares et al. 1999). Portanto, além dos bioensaios pode-se
estabelecer análise com ácidos orgânicos, indicadores do perfil
metabólico, frente às situações fisiológicas expostas. Os ácidos
orgânicos são essências como indicadores de distúrbios biológicos e
importantes componentes no metabolismo intermediário e energético de
todos os seres vivos (Scriver et al. 1989). A detecção e quantificação de
tais ácidos orgânicos são importantes em muitas áreas de biotecnologia.
Estes estudos estão sendo viabilizados utilizando-se o método de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), através de uma coluna
específica para análise de ácidos orgânicos. Trata-se de um método
aplicado em exames de distúrbios fisiológicos, principalmente no campo
da medicina para análise de pequenos volumes de urina ou soro de
recém-nascidos (Kohlschutter et al. 1982, Daish e Leonard 1985,
Scriver et al. 1989), com comprovada adaptação para o estudo da
relação entre hospedeiros e parasitos (Bezerra 1994).
Objetivos
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OBJETIVOS
• Avaliar a excreção e o consumo dos ácidos orgânicos em L.
amazonensis como subsídios ao conhecimento das vias glicolíticas,
cadeia respiratória e atividades do ciclo de Krebs.
• Validar técnicas de estudos bioquímicos utilizando a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para o monitoramento do
perfil metabólico de parasitos.
• Avaliar a bioatividade de extratos brutos de Magonia
pubescens (tingui) e de Glycyrrhisa glabra (alcaçuz) em culturas de
formas promastigotas de L. amazonensis.
• Estudar a ação de produtos naturais na bioquímica de
promastigotas de L. amazonensis, avaliando o efeito metabólico dessa
interação nos ácidos orgânicos, indicadores metabólicos.
23
Artigo 1
AVALIAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE
PROMASTIGOTAS DE Leishmania amazonensis ATRAVÉS
DA ANÁLISE DE ÁCIDOS ORGÂNICOS REALIZADA POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE).
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Metabolismo de Leishmania – CLAE
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RESUMO
O conhecimento aprofundado e detalhado do metabolismo gera
novas oportunidades terapêuticas tendo como alvo vias essenciais do
parasito que não afete o hospedeiro. As vias bioquímicas ausentes em
humanos podem ser aquelas que controlam a virulência do parasito, e
as suas atenuações podem reduzir a gravidade da doença O
metabolismo energético dos parasitos do gênero Leishmania é baseado,
praticamente, em carboidratos e aminoácidos. As promastigotas usam
preferencialmente aminoácidos para obtenção de energia, que são
oxidados em α-cetoglutarato e degradados até succinato via ciclo de
Krebs e podem ser importantes somente nos estágios onde este ciclo é
ativo. As promastigotas de Leishmania possuem um metabolismo
energético no qual pequena parte do carboidrato é oxidado
completamente em CO
2
, via ciclo de Krebs, mas grande parte é oxidado
em produtos como acetato, piruvato e succinato que são também
produtos finais da glicose. É interessante ressaltar que a eficácia do
controle e tratamento de uma doença parasitária depende do
conhecimento detalhado do ciclo de vida, metabolismo e biologia em
geral do parasito. O método de cromatografia liquida de alta eficiência
(CLAE) foi viabilizado neste trabalho como alternativa para estudo e
monitoramento do perfil metabólico das promastigotas de L.
amazonensis. Foi detectado na cultura de promastigotas lactato,
oxalato, citrato, -cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e
propionato, sendo que destes ácidos somente o succinato não foi
constatado como constituinte do meio de cultura demonstrando ser
excretado pelos parasitos a partir do quarto dia. As promastigotas de L.
amazonensis apresentaram glicólise, ciclo de Krebs, metabolismo de
ácidos graxos e cadeia respiratória ativos, pois os ácidos orgânicos
encontrados são produtos de tais vias enzimáticas.
Palavras chave: metabolismo, ácidos orgânicos, promastigotas, CLAE.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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ABSTRACT
The knowledge deepened and detailed of the metabolism
generates new therapeutical chances having as white essential
pathways of the parasite that does not affect the host. The pathways
absent biochemists in human beings can be those that control the
virulence of the parasite, and its attenuations can reduce the gravity of
the disease, the energy metabolism of the parasites of the Leishmania
sort are based, practically, in carbohydrates and amino acids.
Promastigotes referential uses amino acids for energy attainment, that
are oxidated in -ketoglutarate and degraded until succinate it saw
cycle of Krebs and only can be important in the periods of training
where this cycle is active. Promastigotes of Leishmania possess an
energy metabolism in the which small part of the carbohydrate is
oxidated completely in CO
2
, saw cycle of Krebs, but great part is
oxidated in products as acetate, piruvate and succinate that are also
end products of the glucose. It is interesting to stand out that the
effectiveness of the control and treatment of a parasitic disease depends
on the detailed knowledge of the cycle of life, metabolism and biology in
general of the parasite. The liquid chromatography hight performace
method (HPLC) was made possible in this work as alternative for study
and monitorament of the metabolic profile of L. amazonensis
promastigotes. It was detected in the culture of promastigotes lactate,
oxalate, citrate, -ketoglutarate, succinate, fumarate, malate and
propionate, being that of the this acid only succinate it was not only
evidenced as constituent of the way of culture demonstrating to be
excreted by the parasites from the fourth day. Promastigotes of L.
amazonensis had presented glycolyse, cycle of Krebs, active metabolism
of fatty acid and respiratory chain, therefore the organic acid founded
are products of such enzymatic pathways.
Key words: metabolism, organic acid, promastigotes, HPLC.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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INTRODUÇÃO
Recentemente tem ocorrido um aumento significativo nos casos
de leishmanioses em áreas peri-urbanas de grandes cidades,
particularmente no país. As leishmanioses constituem um complexo de
enfermidades que atingem o homem, causadas por diferentes espécies
morfologicamente semelhantes pertencentes ao gênero Leishmania,
ordem Kinetoplastida, sendo diferenciadas apenas por métodos
bioquímicos, imunológicos ou mesmo patológicos, são zoonoses
classificadas em oito diferentes grupos segundo a sintomatologia e
espécie de parasito envolvido, afetando o sistema fagocítico
mononuclear (Lainson and Shaw 1987).
Características indesejáveis, quanto à terapêutica, associadas ao
aparecimento de formas resistentes de Leishmania (Geary et al. 1989),
têm destacado a necessidade do desenvolvimento de fármacos
antileishmanióticos mais eficazes e menos tóxicos ao paciente. A
abordagem moderna de desenvolvimento racional de drogas se baseia
na identificação de vias metabólicas indispensáveis à sobrevivência do
parasito. Após seleção dos alvos biológicos, o objetivo passa a ser a
caracterização detalhada dos componentes da via enzimática envolvida.
Enzimas chave podem ser exploradas para o desenvolvimento de
inibidores da reação enzimática, sem afetar o hospedeiro (Kayser et al.
2000, Khabnadideh et al. 2000).
O bloqueio de vias essenciais ao parasito gera novas
oportunidades terapêuticas. No caso de uma enzima não essencial ao
parasito e que não está presente no hospedeiro, pode ser desenvolvida
um fármaco com um composto ativo sobre o parasito e não sobre o
hospedeiro. As vias bioquímicas ausentes em humanos podem ser
aquelas que controlam a virulência do parasito e suas atenuações
podem reduzir a gravidade da doença (Davis et al 2004).
O metabolismo energético dos parasitos do gênero Leishmania é
baseado, praticamente, em carboidratos e aminoácidos (Cazzulo et al
1985). A glicose é a principal fonte de energia, sendo o catabolismo de
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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aminoácidos o mais utilizado pelas formas intracelulares amastigotas.
Os estágios no inseto (promastigotas) preferem aminoácidos, como a
prolina como fonte de energia, porém a via glicolítica é sempre ativa. A
prolina e o glutamato são os dois substratos mais importantes
utilizados e são oxidados em α-cetoglutarato e degradados até succinato
via ciclo de Krebs e podem ser importantes somente nos estágios onde
este ciclo é ativo (Tielens e Van Hellemond 1998).
As promastigotas de Leishmania spp. possuem um metabolismo
energético no qual pequena parte do carboidrato é oxidado
completamente em CO
2
, via ciclo de Krebs, mas grande parte é oxidado
em produtos como acetato, piruvato e succinato que são também
produtos finais da glicose (Cazzulo 1992). Parte dos produtos finais
oxidados são resultados do metabolismo aeróbio envolvendo uma cadeia
transportadora de elétrons com um aceptor final de oxigênio. O
succinato produzido durante incubações de promastigotas em
condições aeróbias é principalmente produzido via oxidativa envolvendo
parte do ciclo de Krebs (de oxalacetato via citrato até succinato) e
oxidação de NADH via cadeia respiratória (Van Hellemond et al. 1997).
É interessante ressaltar que a eficácia do controle e tratamento de
uma doença parasitária depende do conhecimento detalhado do ciclo de
vida, metabolismo e biologia em geral do parasito (Frayha et al. 1997).
Baseado na necessidade de se conhecer melhor a atividade metabólica
do parasito, testes de análises dos ácidos orgânicos excretados e
presentes em culturas de formas promastigotas de Leishmania
amazonensis foram viabilizados por meio do método de cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE), como alternativa do estudo e
monitoramento do perfil metabólico, visando encontrar futuros alvos
terapêuticos.
Este trabalho tem por objetivo validar técnicas de estudos
bioquímicos através do CLAE avaliando excreção ou consumo dos
ácidos orgânicos em promastigotas de L. amazonensis, estudando vias
enzimáticas, cadeia respiratória ou atividades do ciclo de Krebs.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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MATERIAL E MÉTODOS
Os parasitos utilizados no presente trabalho foram formas
promastigotas de L. amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8), cuja cultura
original foi, gentilmente, cedida pelo Laboratório de citocinas e
imunobiologia das leishmanioses do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública -UFG, de responsabilidade do Professor Doutor Milton
Adriano Pelli de Oliveira. Os parasitos de fase logarítmica
(promastigotas pró-cíclicas) e de fase estacionária (promastigotas
metacíclicas) foram isolados e criopreservados em nitrogênio liquido ou
em freezer –70
o
C até o uso.
As amostras de formas promastigotas foram mantidas em estufa à
26ºC através de cultivo in vitro em placas ou frascos de plástico de 75
cm
2
(BECTON-DICKINSON) e repicadas a cada dois dias a partir de 1 x
10
5
promastigotas/ml em um meio líquido de cultura Grace,
suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de L-
glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina
(Sartori et al. 1997).
A criopreservação foi realizada, preferencialmente, com parasitos
na fase logarítmica (log) de crescimento, visto que os parasitos nesta
fase estão no início do desenvolvimento e apresentam maior
multiplicação. As promastigotas foram centrifugadas a 1169g a 10
o
C
por 15 minutos e foram ressuspendidas e conservadas com 50% de
meio de cultura completo, juntamente com meio de congelamento
(DMSO 10%), acrescido de 70% de soro bovino fetal, e levadas para
congelamento a -70ºC. O descongelamento foi realizado uma vez a cada
um mês para cultivo em meio de cultura Grace completo.
A curva de crescimento das promastigotas foi estabelecida pela
metodologia descrita por Brener (1961) adaptada para microscópio
binocular. O número de parasitos foi quantificado em intervalos de 24
horas por sete dias consecutivos, quando se inicia a morte das formas
promastigotas. A quantificação foi realizada em Câmara de Newbauer e
as promastigotas foram diluídas com formoldeido para contagem.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
29
A avaliação do crescimento dos parasitos na fase log, na qual
ocorre a presença de formas promastigotas pró-cíclicas, foi definida
entre o primeiro e o terceiro dia. A fase estacionária, considerada mais
infectante devido a maior concentração de formas promastigotas
metacíclicas, ocorre a partir do quarto dia, com declínio iniciando no
quinto dia, quando os parasitos começam a morrer. A avaliação do
desenvolvimento e multiplicação das promastigotas foi realizada através
de uma curva de crescimento resultante dessa quantificação durante
sete dias de crescimento.
As amostras foram extraídas do meio de cultura contendo as
formas promastigotas no início, no segundo, quarto e sexto dias da
cultura, totalizando quatro amostras por cultura avaliada. Foram
retiradas amostras de 250 μL de cada cultura realizada e estas foram
extraídas com auxílio de uma bomba de vácuo através de uma coluna
Varian de extração denominada Bond Elut (SAX-anion exchange-
quaternary amine, Analytichem International, Harbor city, USA),
adequada para separação em fase sólida, como descrito por Bezerra et
al. (1997, 1999). O meio de cultura sem cultivo de formas promastigotas
também foi submetido à extração como forma de controle na análise
dos ácidos orgânicos e produtos finais do metabolismo dos parasitos.
As colunas de extração foram ativadas na caixa de vácuo com 1
mL de ácido clorídrico a 0,5 mol/L, 1 mL de metanol e 2 mL de água
ultrafiltrada (tipo I). Neste momento com a coluna já ativada e ainda sob
vácuo, adicionou-se 250 μL da amostra biológica (meio de cultura com
ou sem as promastigotas) seguido de 2 mL de água ultrafiltrada (tipo I).
Logo após, as colunas foram retiradas do vácuo e com a finalidade de
eluir os ácidos orgânicos retidos na coluna, foi adicionado 250 μL de
ácido sulfúrico a 0,5 mol/L e em seguida as mesmas foram
centrifugadas a 520g durante 5 minutos à 2
o
C. A amostra resultante da
centrifugação (amostra biológica) foi congelada e, conseqüentemente,
submetida a uma cromatografia líquida de alta eficiência para análise
dos ácidos orgânicos.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
30
O aparelho de cromatografia liquida de alta eficiência utilizado,
CLAE - Varian ProStar, possui uma bomba, um injetor, uma coluna de
separação (BIORAD –Aminex Íon Exclusion HPX-87H 300x7,8mm), um
detector ultravioleta e um sistema de dados (computador e impressora).
Esta coluna é preparada com material específico para separação de
ácidos orgânicos e é protegida por uma pré-coluna (Aminex HPX-85, Fa.
BIORAD).
As condições para análise foram: fluxo de 0,8 mL/minuto da fase
móvel (0,5 mM H
2
SO
4
) à uma temperatura de 30
o
C, detecção na fase
móvel ultravioleta com comprimento de onda de 210 nm e volume
injetado da amostra de 20 μL. A separação dos ácidos orgânicos ocorre
à medida que a amostra e a fase móvel são bombeadas através da
coluna. Estes componentes que eluem da coluna são demonstrados por
picos no programa de análise.
A validação do aparelho foi realizada através de uma mistura de
ácidos orgânicos (substância química de referência - sqr) injetados em
concentrações variadas e, posteriormente, analisados pelo programa e
avaliados de acordo com o tempo de retenção e de fatores de calibração
para conseqüente desenvolvimento de um programa de análise e banco
de dados. O tempo de retenção dos ácidos orgânicos e a área do pico
destas substâncias foram representados por gráficos, integrados por
software próprio, fornecendo e calculando, deste modo, as devidas
concentrações. Estes foram os parâmetros utilizados nos estudos
avaliatórios dos ácidos e, por conseguinte, do perfil metabólico dos
organismos estudados.
As sqr foram compostas pelos seguintes ácidos: piruvato, lactato,
oxalato, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, acetato e
propionato. Utilizaram-se concentrações isoladas de cada ácido e
também associados entre si, identificando, dessa forma, os tempos de
retenção específicos, bem como, a concentração referente dos ácidos,
finalizando, assim, a validação do aparelho.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
31
A curva de crescimento da Leishmania juntamente com as
análises dos ácidos orgânicos no CLAE foram realizadas em triplicata. O
teste ANOVA realizado pelo programa Sigma Pro Stat, foi o utilizado na
análise estatística comparando-se as concentrações dos ácidos
orgânicos no controle (meio de cultura sem as formas promastigotas) e
na cultura de Leishmania no início do repique, no segundo, quarto e
sexto dias. As concentrações foram expressas em média ou mediana de
acordo com a normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Considerou-se
estatisticamente significativo o valor de p menor que 0,05.
RESULTADOS
Para realização e observação da curva de crescimento, as culturas
das formas promastigotas foram realizadas em triplicata. A fase
logarítmica (até o quarto dia) e estacionária (entre o quarto e sétimo
dias) puderam ser observadas. O declínio, ou morte dos parasitos
ocorreu a partir do sétimo dia (Figura 5). Não houveram diferenças
significativas no crescimento dos parasitos comparando-se as três
curvas realizadas, confirmando a confiabilidade do estudo e
possibilitando um delineamento do perfil comportamental do parasito
estudado.
Nas amostras obtidas das culturas, após análise pelo CLAE,
foram detectados oito dos dez ácidos previamente calibrados no
aparelho, característicos do metabolismo e excreção dos parasitos,
sendo estes, lactato, oxalato, citrato, -cetoglutarato, succinato,
fumarato, malato e propionato (Tabela I). No entanto, destes ácidos
encontrados, somente o succinato não estava presente no controle
realizado com o meio de cultura Grace sem cultivo do parasito.
Houve diferença estatisticamente significativa entre as
concentrações do citrato comparando-se o controle, o início (tempo
zero), o segundo, quarto e sexto dias de cultura, demonstrando um
significativo aumento da excreção do mesmo no decorrer da cultura
(Figura 8). Em relação ao oxalato, o fumarato e o lactato, não foram
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
32
detectadas diferenças significativas quantos as variações das
concentrações (Figuras 6, 7 e 11).
Comprovou-se, ainda, a excreção do succinato pelos parasitos no
quarto e sexto dias (fase estacionária), visto que tal ácido estava
ausente no controle, no início e no segundo dias de cultura, porém não
houve diferença significativa comparando-se as concentrações obtidas
entre o quarto e sexto dias (Figura 10).
Quanto ao propionato, observou-se diferença significativa entre a
concentração no sexto dia em relação ao controle, o início e o segundo
dia, mas comparando-se com o quarto dia tal diferença não foi
significativa (Figura 13). Tal fato sugere uma excreção significativa do
ácido em questão somente no sexto dia de cultura.
Já o -cetoglutarato (Figura 9), ao contrário dos outros ácidos que
apresentaram aumento de suas taxas de concentração, ou melhor,
excreção no decorrer do crescimento das promastigotas, observou-se
consumo a partir do segundo dia, visto que houve estatisticamente
diferença entre a taxa de concentração encontrada no início da curva e
os dias seguintes. A concentração do -cetoglutarato no controle e no
início do crescimento dos parasitos mostrou-se sem diferença
significativa, marcando alteração deste ácido a partir do segundo dia.
Por fim, o resultado da análise do malato demonstrou diferença
significativa comparando-se com o controle, na verdade ocorreu
aumento da sua concentração, se tornando mais significativa no sexto
dia (Figura 12).
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
33
Tabela I: Concentração em mmol x 10
-6
dos ácidos orgânicos detectados
pelo CLAE no meio de cultura (controle) e na cultura de promastigotas
de Leishmania amazonensis.
Cultura de promastigotas de L. amazonensis Ácidos
Orgânicos
Meio de
cultura
Início (0) 2 dias 4 dias 6 dias
Oxalato 3,03 3,42
3,39
3,45 4,20
Citrato 21,81 31,77
41,26
53,43 80,14
Propionato 205,63 225,76
272,78
345,37 422,66
Succinato nd nd
nd
9,52 19,24
-cetoglutarato 11,39 14,55
9,28
9,34 9,08
Acetato nd nd
nd
nd nd
Malato 55,23 76,56
74,08
88,03 115,76
Fumarato 4,73 5,66
5,48
6,29 6,88
Piruvato nd nd
nd
nd nd
Lactato 0,78 1,08
0,96
1,13 1,16
Legenda: nd - ácido não detectado.
Curva de Crescimento
1
10
100
1000
012345678
Tempo (dias)
No. Promastigotas x 10
5
/ml
Curva 1 Curva 2 Curva 3
Figura 5: Curva de crescimento em triplicata, realizada com promastigotas de
Leishmania amazonensis, em meio de cultura Grace modificado, durante 8
dias consecutivos.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
34
0,78
1,08
0,96
1,13
1,16
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
CONCENTRAÇÃ
O
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
LACTATO
Figura 6: Média da taxa de concentração de lactato no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis no início,
no segundo, quarto e sexto dias
.
3,03
3,42
3,39
3,45
4,20
0
1
1
2
2
3
3
4
4
5
CONCENTRAÇÃO
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
OXALATO
Figura 7: Média da taxa de concentração de oxalato no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas de Leishmania amazonensis no início,
no segundo, quarto e sexto dias
.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
35
21,81
31,77
41,26
53,43
80,14
0
20
40
60
80
100
CONCENTRAÇÃ
O
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
CITRATO
*
*
*
*
*
Figura 8: Média da taxa de concentração de citrato no meio de cultura e nas curvas de
crescimento de promastigotas Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e
sexto dias. (*)Diferença estatisticamente significativa.
11,39
14,55
9,28
9,34
9 8,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
CONCENTRAÇÃ
O
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
α-CETOGLUTARATO
*
*
*
*
Figura 9: Média da taxa de concentração de α-cetoglutarato no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias. (*) Diferença estatisticamente significativa.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
36
9,52
19,24
0
5
10
15
20
CONCENTRAÇÃO
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
SUCCINATO
*
*
Figura 10: Média da taxa de concentração de succinato no meio de cultura e nas curvas
de crescimento de promastigotas Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto
e sexto dias. (*) Diferença estatisticamente significativa.
4,73
5,66
5,48
6,29
6,88
0
1
2
3
4
5
6
7
CONCENTRAÇÃ
O
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
FUMARATO
Figura 11: Média da taxa de concentração de fumarato no meio de cultura e nas curvas
de crescimento de promastigotas Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto
e sexto dias.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
37
55,23
76,56
74,08
88,03
115,76
0
20
40
60
80
100
120
CONCENTRAÇÃO
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
MALATO
*
Figura 12: Média da taxa de concentração de malato no meio de cultura e nas curvas de
crescimento de promastigotas Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e
sexto dias. (*) Diferença estatisticamente significativa.
205,63
225,76
272,78
345,37
422,66
0
100
200
300
400
500
CONCENTRAÇÃ
O
(mmol x 10
-6
)
Meio
graces
0246
Cultura de
Leishmania
(dias)
PROPIONATO
*
Figura 13: Média da taxa de concentração de propionato no meio de cultura e nas
curvas de crescimento de promastigotas Leishmania amazonensis no início, no segundo,
quarto e sexto dias. (*) Diferença estatisticamente significativa.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
38
DISCUSSÃO
No presente trabalho as promastigotas L. amazonensis
apresentaram fase logarítmica de crescimento até o quarto dia e partir
deste até o sexto dia, fase estacionária (Figura 5). Os parasitos
iniciaram a morte a partir do sétimo dia. Existem três estágios de
Leishmania sp envolvidos no seu ciclo de vida: amastigotas,
promastigotas pró-cíclicas e promastigotas metacíclicas. As fases de
crescimento logarítmica ou exponencial e estacionária são,
freqüentemente, utilizadas como sinônimo para promastigotas pró-
cíclica e metacíclica, respectivamente, apesar de que outros estágios
existem (Gossage et al. 2003). As fases do crescimento do parasito estão
intimamente relacionadas com sua capacidade de divisão (Killick-
Kendrick 1990).
A fase log corresponde à intensa reprodução do parasito, porém
com baixa motilidade, são em geral mais arredondadas, ao contrário
das promastigotas metacíclicas (fase estacionária), consideradas as
formas infectivas para o hospedeiro mamífero, que apresentam baixa
divisão, porém maior motilidade, se apresentado mais afiladas na sua
estrutura (Killick-Kendrick 1974 a).
O gênero Leishmania e os membros da família Trypanosomatidae,
realizam metabolismo anaeróbio da glicose, tendo como principais
produtos finais succinato, acetato, lactato e traços de piruvato
(Chatterjee e Datta 1974, Cannata e Cazzulo 1984). Esta preferência
metabólica depende de vários fatores tais como a concentração dos
substratos e sua natureza química, pH e aeração do meio de cultura e
alterações nas enzimas de células inoculadas (Cazzulo et al 1985). A
Figura 14 esquematiza o metabolismo da via glicolítica e dos
aminoácidos, para melhor visualizar a origem dos produtos finais.
Dos ácidos orgânicos detectados no presente estudo, somente o
succinato não foi detectado no meio, demonstrando ser resultado da
excreção dos parasitos a partir do quarto dia. Os ácidos tiveram
variações de concentração, porém fica claro que o metabolismo da L.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
39
amazonensis depende das condições de cultivo e dos substratos do meio
de cultura . A composição do meio de crescimento dos parasitos pode
influenciar diretamente na análise das vias bioquímicas em estudo
(Barret 1997). Um exemplo disto é a transformação de L. mexicana de
amastigota para promastigota influenciada por fatores exógenos como a
presença de ácidos graxos não-esterificados ou a tensão de oxigênio no
meio (Galbraith, 1991).
Estudos do metabolismo de tripanossomatideos têm apresentado
que a L. mexicana prefere aminoácidos para geração de energia,
utilizando glicose somente no final da fase log e no início da fase
estacionária, produzindo succinato, em menor quantidade acetato,
pequenas quantidades de piruvato e nenhum L-lactato ou malato
(Cazzulo et al 1985). No entanto, observou-se que a L. amazonensis não
apresentou detecção de piruvato e acetato, mas houve detecção de
malato. O lactato não apresentou diferença significativa de sua
concentração em relação ao que já continha no meio.
As promastigotas de L. panamensis tendo glicose como única
fonte de energia produz glicerol, succinato, acetato, piruvato, alanina e
D-lactato, juntamente com CO
2,
mas não L-lactato. Células incubadas
com glicerol como única fonte de carbono produzem acetato, succinato,
D-lactato e CO
2
. Ambos alanina e glutamato são oxidados via ciclo de
Krebs com proporção comparável ou maior que a oxidação da glicose.
Em condições anaeróbias com a glicose como substrato, mais D-lactato,
glicerol, piruvato succinato e alanina e menos acetato foram produzidos
como principais produtos finais, enquanto o consumo de glicose na
ausência de CO
2
diminuiu. O CO
2
foi restaurado em níveis aeróbios
indicando que a fixação de CO
2
em anaeróbios é essencial para manter
o alto fluxo glicolítico (Keegan et al. 1987, Darling et al. 1987, 1989).
A prolina e o glutamato são os dois substratos mais importantes
utilizados no metabolismo energético de promastigotas e são oxidados
em α-cetoglutarato e degradados até succinato via ciclo de Krebs e
podem ser importantes somente nos estágios onde este ciclo é ativo
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
40
(Tielens e Van Hellemond 1998), entretanto na cultura realizada nesta
pesquisa houve consumo significativo de -cetoglutarato desde o início
da cultura, com excreção de succinato no quarto e sexto dias.
Em muitos tripanossomatideos o succinato é um produto final do
metabolismo energético. Tem sido sugerido que succinato é produzido
pela fumarato redutase, uma enzima homóloga a succinato
desidrogenase do ciclo de Krebs, que catalisa a reação reversa – a
oxidação do succinato. A fumarato redutase é bem conhecida em
bactérias e em helmintos, onde sua função esta na absorção de elétrons
no metabolismo anaeróbio destes organismos (Ackrell et al. 1992,
Tielens 1994).
Nas promastigotas de Leishmania sp o succinato é produzido
principalmente por normal funcionamento do ciclo de Krebs. Somente
os estágios que possuem ciclo de Krebs ativo produzem succinato, o que
indica que estes dois processos são relatados e que também implica que
a redução de fumarato tem ocorrido ao mesmo tempo em que a
oxidação do succinato (Tielens e Van Hellemond 1998).
O citrato é um ácido orgânico gerado a partir da reação de
condensação do oxaloacetato com a Acetil CoA, catalisada pela enzima
citrato sintase. Este ácido orgânico é importante, quanto à sua
disponibilidade e volume de produção, durante o ciclo de Krebs. Possui
propriedades como capacidade de acidificar o meio, funcionado como
tampão e ainda como quelante de íons metálicos, gerando uma ação
anti-oxidante e preservante (Karaffa et al 1997). As promastigotas
apresentaram excreção significativa no decorrer da curva de
crescimento, sugerindo a necessidade de manutenção de condições
ideais de sobrevivência.
Resultante do metabolismo de ácidos graxos, o propionato é ainda
um dos principais produtos do metabolismo do lactato (Marounek et al
1999). É relatado como produto final do metabolismo de bactérias e
outros invertebrados. Muitas vezes sua produção ocorre em função de
um acúmulo da produção de succinato, observado no presente
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
41
trabalho. Como ácido graxo, sua via metabólica produz ATP, além de ser
um ácido volátil de fácil excreção celular (Van Hellemond e Tielens
1998). A combinação da produção de succinato a partir do quarto dia e
de propionato significativamente no sexto dia, revela uma seqüência
metabólica que permite à L. amazonensis sobreviver no meio de cultura
por mais tempo, atribuindo-se a estas vias metabólicas a estratégia
para sua manutenção.
Resta a observação de que para a manutenção do sistema
fumarato redutase faz-se necessário que parte do malato seja
transformado em piruvato. O piruvato não foi detectado no presente
trabalho, mas sabe-se que é substrato para a formação de acetato ou
alanina, com produção de ATP. Os resultados obtidos se confirmam
com o registro na literatura do aumento da taxa de concentração do
aminoácido alanina no meio (Darling et al. 1987, 1989, Keegan et al.
1987). Os produtos finais registrados, como succinato e propionato
indicam uma passagem para o metabolismo parcialmente anaeróbio,
podendo significar uma preparação fisiológica para o próximo passo
biológico que seria a transformação na forma intracelular amastigota ou
a morte celular.
Metabolismo de Leishmania – CLAE
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42
Alanina
Figura 14: Metabolismo da via glicolítica e dos aminoácidos (Bezerra et al
1997). Legenda: seta em azul – gliconeogênese, seta em vermelho –
catabolismo do malato.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
44
Artigo 2
EFEITO LEISHMANICIDA DE EXTRATOS NATURAIS DE
Magonia pubescens E Glycyrrhisa glabra NO
DESENVOLVIMENTO DE PROMASTIGOTAS DE
Leishmania amazonensis E ANÁLISE POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE).
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
45
RESUMO
O alto índice de mortalidade e morbidade da leishmaniose associado
com a dificuldade do tratamento e a resistência do parasito estimulam a
investigação e pesquisa de novos extratos de plantas nativas, como
alternativa para o tratamento e combate de doenças parasitárias. Existem
princípios ativos que podem atacar diretamente o parasito como as
chalconas, alcalóides e taninos, encontrados em diversas plantas, que
muitas vezes são utilizadas na medicina popular. Porém, um fator relevante
é a análise de como atuam estas substâncias em hospedeiros ou parasitos,
e se destes produtos poderiam ser extraídos componentes específicos ao
metabolismo, que pudessem inibir determinada reação metabólica vital ao
parasito sem afetar o hospedeiro. Neste trabalho realizou-se bioensaios com
Magonia pubescens (tingui) e Glycyrrhisa glabra (alcaçuz) nas concentrações
de 25, 50 e 100 mg.L-1 em culturas de promastigotas de Leishmania
amazonensis com conseqüente detecção de ácidos orgânicos com o
cromatógrafo líquido de alta eficiência. Os ácidos orgânicos são importantes
indicadores de distúrbios biológicos e importantes componentes no
metabolismo intermediário e energético de todos os seres vivos. Ambos os
extratos testados apresentaram inibição do crescimento dos parasitos,
porém a G. glabra foi mais efetiva na fase estacionária de crescimento e a M.
pubescens na fase logarítmica. A M. pubescens foi mais eficaz na
concentração de 25 mg.L-1 e a G. glabra na de 100 mg.L-1, apesar de que
todas as concentrações foram efetivas. As alterações encontradas nas taxas
de concentração dos ácidos orgânicos comprovaram a dependência da
atividade do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória e que as condições de
substrato e oxigênio são essenciais para a sobrevivência do parasito, no
entanto o que garante sua sobrevivência em condições adversas é sua
capacidade e habilidade de alterar o metabolismo reduzindo a níveis
mínimos ou mesmo revertendo vias metabólicas.
Palavras chave: plantas leishmanicidas, metabolismo, ácidos orgânicos.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
46
ABSTRACT
The high index of mortality and morbidy of leishmaniasi associated
with the difficulty of the treatment and the resistance of the parasite
stimulate the inquiry and search of new extracts of native plants, as
alternative for the treatment and combat of parasitic diseasis. There are
active principles that can attack the parasite directly as chalcones, alkaloids
and tanins, found in diverse plants, that many times are used in the
popular medicine. However, an revelant factor is the analysis of as these
substances in hosts or parasites act, and if of these products could be
extracted specific component to the metabolism, that could inhibit
determinated vital metabolic reaction to the parasite without affecting the
host. In this work realized biotests with Magonia pubescens (tingui) and
Glycyrrhisa glabra (alcaçuz), in the concentrations of 25, 50 and 100 mg.L-
1, in the cultures of Leishmania amazonensis promastigotes with
consequent detention of organic acid with liquid chromatography high
performace. The organic acids are important pointers of biological disturds
and important components in the intermediate and energetic metabolism of
all human beings. Both tested extracts had presented inhibition of the
parasites growth, however the G. glabra was more effective in the stationary
phase of growth and M. pubescens in the logaritmic phase. M. pubescens
was more efficient in the concentration of 25 mg.L-1 and the G. glabra in
the 100 mg.L-1 concentration, although all the concentrations has been
effective. The alterations founded in the concentration taxes of the organic
acids had proven the dependence of the activity of the cycle of Krebs and the
respiratory chain and that the substrat conditions and oxygen are essential
for the survival of the parasite, however what guarantees its survival in
adverse conditions is its capacity and ability to modify the metabolism,
reducing the minimum levels or same reverting the metabolic pathways.
Keywords: Antileishmanial plants, metabolism, organic acids.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
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INTRODUÇÃO
A Leishmania é um protozoário parasito endêmico em várias partes do
mundo e é responsável por um sério problema de saúde pública em
inúmeros países. Várias espécies estão envolvidas com a manifestação da
doença (Enserink 2000). Estima-se que dois milhões de novos casos de
leishmaniose ocorram anualmente nas regiões tropicais e subtropicais do
globo, estando mais de 12 milhões de indivíduos contaminados e 350
milhões sob risco de infecção (ANVISA 2003, 2006). No Brasil estudos
apresentam a ocorrência de cerca de vinte mil novos casos por ano (Ashford
2000).
Esses alarmantes números retratam um alto índice de mortalidade e
morbidade da doença, estimulam a investigação e pesquisa de novos
extratos de plantas nativas, como alternativa para o tratamento e controle
das doenças parasitárias (Bodeker e Willcox, 2000). O tratamento da
leishmaniose é muito difícil devido à localização das formas infectivas, bem
como o aparecimento de formas resistentes de Leishmania, além disso, o
tratamento terapêutico utilizado envolve características indesejáveis como a
utilização de medicamentos injetáveis (Geary et al. 1989) e isso têm
exacerbado a necessidade do desenvolvimento de drogas antileishmanióticas
mais eficazes e menos tóxicas ao paciente. A toxicidade é particularmente
severa no tratamento de crianças e idosos ou indivíduos portadores de
infecções oportunistas secundárias.
No passado, homens eram tratados com produtos extraídos de
plantas por administração exclusivamente oral, pois se acreditava que o
sítio das infecções fosse o trato intestinal. Os avanços dos conhecimentos
anatômicos, bioquímicos e estudos fisiológicos, e o entendimento de quase
todos os ciclos de vida dos parasitos no homem, exigem que atualmente se
realize um processo de planejamento de tratamento de maneira mais
racional, com ênfase no mecanismo de ação (Frayha et al. 1997), visando
atingir diretamente os alvos específicos e essenciais dos parasitos.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
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A flora do Cerrado representa o segundo maior bioma vegetal
brasileiro. Esse importante recurso natural carece de estudos mais
profundos e aplicados, visando o encontro de métodos alternativos de
garantir a saúde da população de forma simples, eficiente e segura, além de
chamar atenção para a necessidade de preservação deste rico ecossistema.
Das 107 espécies vegetais do Brasil ameaçadas de extinção, 54 são plantas
medicinais (Correio Brasiliensis 2002) e algumas estão sendo testadas como
forma alternativa no controle de parasitoses e vetores (Carvalho 1991,
Haslan 1996).
Várias espécies da flora brasileira são consideradas plantas taníferas,
por apresentarem altos teores de taninos que contribui na defesa das
plantas contra ataque de herbívoros, além de limitar o crescimento de
microorganismos patogênicos (Alcanfor et al. 1999, Silva et al. 1999). A
Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae), conhecida popularmente como
tingui, é uma planta característica do cerrado brasileiro e apresenta alto
teores de tanino na sua composição (Silva et al. 2004).
O tanino, muitas vezes, é o composto ativo de plantas empregado na
medicina tradicional para o tratamento de diversas moléstias orgânicas, por
apresentar atividades biológicas como a ação bactericida (Scalbert 1991),
fungicida, moluscicida e inibição enzimática (Simões et al. 2001), pois
apresenta grande capacidade de interação com proteínas se tornando tóxico
para muitos microorganismos. Acredita-se que os taninos interferem nos
macrófagos estimulando a liberação de interferons que eliminam
amastigotas de Leishmania, mas não possuem efeito direto nas
promastigotas (Kolodziel et al. 2001).
Entretanto, existem compostos ativos que podem atuar diretamente
no parasito como as chalconas e alcaloides. Existem vários tipos de
chalconas e análogos que podem ser encontradas em plantas, mas também
são passíveis de síntese e representam uma classe promissora para o
desenvolvimento de novos medicamentos. Um exemplo típico é a
licochalcona 2 encontrada nas raízes e rizomas do alcaçuz chinês ou Gan
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Cao, ativa para parasitos de manifestação cutânea e visceral, destruindo a
mitocôndria de promastigotas e amastigotas, sem prejuízo às demais
organelas e sem afetar a mitocôndria do macrófago (Christensen et al. 1994,
Gilbert e Favoreto 2005).
O alcaçuz, G. glabra, a mais de 3 mil anos é utilizado na medicina
natural, originário da Europa, é uma planta arbustiva, variando de 1 a 2
metros de altura e está aclimatada no Brasil. A erva tem propriedades
antiespasmódicas, diuréticas, antiinflamatórias, anti-sépticas e
expectorantes. A medicina popular a utiliza no tratamento de úlceras
pépticas, bronquites, tosses catarrais, rouquidão e acidez estomacal.
Também pode ser empregado contra furunculoses. Externamente, por meio
de bochechos, é utilizado contra inflamações bucais. Compressas de infusão
da raiz auxiliam no tratamento da conjuntivite aguda. No cerrado brasileiro
há uma espécie de alcaçuz, Periandra mediterrânea, já aclimatada, segundo
site do herbário brasileiro, 2006.
Um fator relevante é a análise de como atuam estas substâncias em
hospedeiros ou parasitos, e se destes produtos poderiam ser extraídos
componentes específicos ao metabolismo, que pudessem inibir determinada
reação metabólica vital (Bezerra e Becker 1994, Bezerra et al. 1997, 1999,
Herzog-Soares et al. 1999). Portanto, além dos bioensaios pretende-se, com
o presente trabalho estabelecer análise com ácidos orgânicos visando o
conhecimento metabólico do parasito. A detecção e quantificação de tais
ácidos orgânicos são importantes em muitas áreas de biotecnologia. Os
ácidos orgânicos são essências como indicadores de distúrbios biológicos e
importantes componentes no metabolismo intermediário e energético de
todos os seres vivos (Scriver et al. 1989).
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no Setor de parasitologia do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP
– UFG). Os bioensaios foram realizados com dois extratos de plantas:
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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extrato bruto etanólico em pó de cascas do caule de M. pubescens,
conhecido popularmente por tingui, gentilmente cedido pelo laboratório de
bioatividade de plantas do IPTSP/UFG sob responsabilidade da Professora
Doutora Heloísa Helena Garcia da Silva e extrato bruto em pó da raiz de G.
glabra conhecido por alcaçuz ou raiz doce, procedente de uma farmácia de
produtos naturais, em Goiânia – GO, sob responsabilidade da farmacêutica
Léia Cury (CRF – GO 1325).
As promastigotas de L. amazonensis cepa PH8 foram gentilmente
cedidas pelo Laboratório de citocinas e imunobiologia de leishmanioses do
IPTSP-UFG, de responsabilidade do Professor Doutor Milton Adriano Pelli de
Oliveira. Os parasitos foram mantidos através de cultivo in vitro mantidos
em estufa à 26ºC e repicados a cada dois dias a partir de 5 x 10
5
promastigotas/ml em meio de cultura Grace, suplementado com 20% de
soro bovino fetal inativado, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e
100 μg/mL de estreptomicina (Sartori, 1997). O repique ocorreu entre o
segundo e o terceiro dia (fase log), que permite manter sempre a forma
promastigota pró-cíclica em cultivo, no entanto, após 15 repiques, estes
parasitos eram renovados, estabelecendo, assim, uma nova cultura de
Leishmania.
Os extratos foram diluídos em solução salina estéril e adicionados ao
meio de cultura Grace completo nas concentrações de 100, 50 e 25 mg.L-1,
em seguida, foram repicadas para este meio uma quantidade inicial de 5 x
10
5
promastigotas/mL e as promastigotas foram quantificadas em Câmara
de Newbauer, utilizando a metodologia descrita por Brener (1961), adaptada
para microscópio binocular, em intervalos de 24 horas por sete dias
consecutivos. A avaliação da atividade leishmanicida foi realizada por meio
da determinação de uma curva de crescimento comparada ao grupo controle
que recebeu somente salina. Para cada análise foram realizadas três
repetições.
As amostras que foram submetidas ao CLAE, foram extraídas a partir
do meio de cultura de promastigotas contendo os extratos testados nas
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
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diferentes concentrações analisadas e do meio de cultura controle contendo
salina, no início, no segundo, no quarto e sexto dias da cultura, totalizando
um número de quatro amostras por cultura avaliada. Foram retiradas
amostras de 250 μL para posterior extração.
A extração foi realizada com auxílio de uma bomba de vácuo e através
de uma coluna Varian de extração denominada Bond Elut (SAX-anion
exchange-quaternary amine, Analytichem International, Harbor city, USA),
adequada para separação em fase sólida, como descrito por Bezerra et al.
(1997, 1999). As colunas foram ativadas na caixa de vácuo com 1 mL de
ácido clorídrico a 0,5 mol/L, 1 mL de metanol e 2 mL de água ultrafiltrada
(tipo I). Neste momento com a coluna já ativada e ainda sob vácuo,
adicionou-se 250 μL das amostras contendo promastigotas com ou sem
extrato das plantas, seguido de 2 mL de água ultrafiltrada (tipo I). Logo
após, as colunas foram retiradas do vácuo e com a finalidade de eluir os
ácidos orgânicos retidos na coluna, foi adicionado 250 μL de ácido sulfúrico
a 0,5 mol/L e em seguida as mesmas foram centrifugadas a 520g durante 5
minutos à 2
o
C. A amostra resultante da centrifugação (amostra biológica) foi
congelada e, conseqüentemente, submetida a uma cromatografia líquida de
alta eficiência para análise dos ácidos orgânicos.
O aparelho utilizado para análise dos ácidos foi o cromatógrafo líquido
de alta eficiência (CLAE) da Varian ProStar, que possui uma bomba, um
injetor, uma coluna de separação (BIORAD –Aminex Íon Exclusion HPX-87H
300x7,8mm), um detector ultravioleta e um sistema de dados (computador e
impressora). Esta coluna é preparada com material específico para
separação de ácidos orgânicos e é protegida por uma pré-coluna (Aminex
HPX-85, Fa. BIORAD).
As condições para análise foram: fluxo de 0,8 mL/minuto do eluente
ou fase móvel (0,5 mM H
2
SO
4
) à uma temperatura de 30
o
C, detecção por
ultravioleta com comprimento de onda de 210 nm e volume da amostra
injetável de 20 μL. A separação dos ácidos orgânicos ocorre à medida que a
amostra e a fase móvel são bombeadas através da coluna.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
52
Estes componentes que eluem da coluna foram demonstrados por
picos no programa de análise de acordo com o tempo de retenção e área de
pico de cada ácido, anteriormente validado, representados por gráficos e
integrados por software próprio, fornecendo e calculando, desse modo, as
devidas concentrações.
A análise estatística foi realizada com o teste ANOVA pelo programa
Sigma Pro Stat, comparando-se as concentrações dos ácidos orgânicos no
controle, na cultura com extrato da G. glabra e da M. pubescens, ambos nas
concentrações de 100, 50 e 25 mg.L-1, no início, no segundo, quarto e sexto
dia de cultura. O mesmo teste também foi utilizado na avaliação do efeito
leishmanicida dos extratos de plantas testados. As concentrações foram
expressas em média ou mediana de acordo com a normalidade de
Kolmogorov-Smirnov. Considerou-se estatisticamente significativo o valor de
p menor que 0,05.
RESULTADOS
A curva de crescimento das promastigotas de L. amazonensis sob ação
do extrato bruto diluído de M. pubescens (tingui) e de G. glabra (alcaçuz)
está representada na Figura 15 e 16, respectivamente. Pode-se observar que
ambos os extratos testados apresentaram inibição do crescimento do
parasito, entretanto a G.glabra apresentou uma inibição geral maior do que
a M. pubescens. A concentração mais efetiva foi de 100 mg.L-1 para a G.
glabra e de 25 mg.L-1 para a M. pubescens, correspondendo,
respectivamente, a 35 e 27% de inibição de crescimento em média (Figura
17). A análise estatística considerou significativa somente a inibição
apresentada pela G. glabra 25 e 100 mg.L-1, no quinto dia, e 100 mg.L-1 no
sexto dia e pela M. pubescens 100 mg.L-1 no quinto dia.
O sexto dia de crescimento, correspondente a fase estacionária,
apresentou a maior média de inibição quanto ao ensaio com a G. glabra,
porém, ao contrário, para a M. pubescens este foi o dia de menor inibição. A
M. pubescens foi mais efetiva durante a fase estacionária do crescimento
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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53
das promastigotas, em contra partida, a M. pubescens teve maior ação na
fase log (Figura 18).
1
10
100
1000
01234567
TEMPO (DIAS)
No. Promastigotas x 10
5
/ml
Controle
M. pubescens 25mg/L
M. pubescens 50mg/L M. pubescens 100mg/L
Figura 15: Ação da Magonia pubescens, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-
1, na curva de crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis.
1
10
100
1000
01234567
TEM PO (DIAS)
No. Promastigotas x 10
5
/ml
Controle
G. glabra 25mg/L G. glabra 50mg/L G. glabra 100mg/L
Figura 16: Ação da Glycyrrhisa glabra, nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1,
na curva de crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonenses.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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54
30%
27%
25%
23%
35%
20%
25 mg/L 50 mg/L 100 mg/L
Concentração do extrato
G.
g
labra M.
p
ubescens
Figura 17: Inibição média, em porcentagem, do crescimento de promastigotas de
Leishmania amazonensis sob ação da Glycyrrhisa glabra e da Magonia pubescens,
nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.
21%
38%
26%
25%
17%
28%
15%
17%
43%
16%
46%
10%
44%
29%
1234567
Dia da cultura
G. glabra M. pubescens
Figura 18: Inibição média, em porcentagem, do crescimento de promastigotas de
Leishmania amazonensis sob ação da Glycyrrhisa glabra e da Magonia pubescens
nos sete dias consecutivos de cultura e de exposição aos extratos.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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55
Quanto à análise dos ácidos orgânicos pelo CLAE, foram detectados
lactato, oxalato, citrato, -cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e
propionato. Dentre estes ácidos encontrados o succinato não foi detectado
no meio de cultura demonstrando ser fruto da excreção das promastigotas.
Segundo a análise estatística não houve diferença entre as
concentrações encontradas de oxalato, citrato, fumarato, malato e lactato,
referente a todas culturas testadas (controle, M. pubescens 25, 50 e 100
mg.L-1 e G. glabra 25, 50 e 100 mg.L-1) e os dias do crescimento avaliados
(Figuras 19, 20, 21, 24 e 25). Observou-se uma diminuição da concentração
do citrato no segundo dia, apesar de não haver diferenças significativas
quanto às variações das concentrações deste ácido (Figura 21).
O succinato foi detectado a partir do quarto dia da cultura controle,
da cultura com G. glabra 25, 50 e 100 mg.L-1 e da M. pubescens 100 mg.L-
1. Entretanto no ensaio com M. pubescens 25 e 50 mg.L-1, já no início da
curva (tempo zero) houve detecção do succinato. Todos as culturas tiveram
aumento na concentração do succinato no decorrer dos dias de cultura,
com exceção da M. pubescens 50 mg.L-1 que apresentou queda no quarto
dia, porém não houve diferença quanto à taxa de concentração do ácido
entre as culturas testadas e os dias do crescimento avaliados (Figura 23).
Em relação ao -cetoglutarato houve diferença significativa quanto à
concentração encontrada na cultura com G. glabra 25 mg.L-1 comparada
com o controle, no segundo dia de cultura, demonstrando um aumento
significativo deste ácido. Com a G. glabra nas concentrações de 100 e 25
mg.L-1, comparada ao controle, também houve aumento significativo de
concentração, relativo ao quarto dia de crescimento das promastigotas.
Outra diferença significativa foi encontrada quanto à detecção do -
cetoglutarato, no sexto dia da cultura para M. pubescens e G. glabra, ambos
nas concentrações de 25 e 50 mg.L-1, que apresentaram concentrações
maiores do ácido em comparação com a encontrada no controle (Figura 22).
A presença ou ausência dos ácidos nos testes realizados está representada
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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56
nas Tabelas II e III e as taxas de concentrações dos ácidos detectados nas
Figuras 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26.
Tabela II: Detecção de ácidos orgânicos na cultura de promastigotas de
Leishmania amazonensis testadas com extrato de Glycyrrhisa glabra
(alcaçuz) nas concentrações de 25, 50 e 100 mg.L-1.
Início da cultura Segundo dia Quarto dia Sexto dia Ácidos orgânicos
Ct A25 A50 A100 Ct A25
A50
A100
Ct
A25
A50
A100 Ct A25
A50
A100
Oxalato + + + + + + + + + + + + + + + +
Citrato + + + + + + + + + + + + + + + +
Propionato + + + + + + + + + + + + + + + +
Succinato - - - - - - - - + + + + + + + +
-cetoglutarato - + + + + + + + + + + + + + + +
Malato + + + + + + + + + + + + + + + +
Fumarato + + + + + + + + + + + + + + + +
Lactato + + + + + + + + + + + + + + + +
Legenda: Ct controle com salina, A25 alcaçuz 25 mg.L-1, A50 alcaçuz 50 mg.L-1,
A100 alcaçuz 100 mg.L-1. (+) presente, (-) ausente – não detectado.
Tabela III: Detecção de ácidos orgânicos na cultura de promastigotas de
Leishmania amazonensis testadas com extrato da Magonia pubescens
(tingui) nas concentrações de 25, 50 e 100mg.L-1.
Início da cultura Segundo dia Quarto dia Sexto dia Ácidos orgânicos
Ct T25 T50 T100 Ct
T25
T50
T100
Ct
T25
T50
T100 Ct T25
T50
T100
Oxalato + - - + + + + + + + + + + + + +
Citrato + + + + + + + + + + + + + + + +
Propionato + + + + + + + + + + + + + + + +
Succinato - + + - - + + - + + + + + + + +
-cetoglutarato - + + + + + + + + + + + + + + +
Malato + + + + + + + + + + + + + + + +
Fumarato + + + + + + + + + + + + + + + +
Lactato + + + + + + + + + + + + + + + +
Legenda: Ct controle com salina, T25 tingui 25 mg.L-1, T50 tingui 50 mg.L-
1, T100 tingui 100 mg.L-1. (+) presente, (-) ausente – não detectado.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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57
LACTATO
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
TEMPO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x 10
-6
)
Controle
1,58 1,15 1,96 1,96
G. glabra 25mg/L
1,39 1,90 1,85 2,06
G. glabra 50mg/L
1,41 1,67 1,78 2,32
G. glabra 100mg/L
1,55 1,70 2,26 1,97
M. pubescens 25mg/L
1,84 1,54 1,73 2,80
M. pubescens 50mg/L
1,57 1,44 1,88 1,86
M. pubescens 100mg/L
1,59 1,67 1,38 2,00
0246
Figura 19: Taxa de concentração de lactato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100 mg.L-1.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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58
OXALATO
0
1
2
3
4
5
6
7
8
TEMPO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x 10
-6
)
Control e
1,98 0,12 2,19 1,42
G. glabra 25mg/L
5,08 6,49 6,73 4,22
G. glabra 50mg/L
4,72 4,20 4,40 4,91
G. glabra 100mg/L
4,45 2,86 3,62 2,91
M . pubescens 25mg/L
0 4,36 0,16 6,99
M . pubescens 50mg/L
0 2,56 7,57 4,78
M . pubescens 100mg/L
4,92 6,71 2,62 0,74
0246
Figura 20: Taxa de concentração de oxalato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100mg.L-1. Legenda: 0 – ácido não detectado.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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CITRATO
0
20
40
60
80
100
120
140
TEM PO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x10
-6
)
Controle
118,20 30,54 35,74 26,84
G. glabra 25mg/L
95,89 20,77 25,88 30,38
G. glabra 50mg/L
33,80 17,46 23,94 37,99
G. glabra 100mg/L
44,43 16,55 27,47 28,37
M. pubescens 25mg/L
95,62 26,84 22,87 30,35
M. pubescens 50mg/L
71,58 17,37 21,42 27,10
M. pubescens 100mg/L
57,99 22,12 74,54 28,54
0246
Figura 21: Taxa de concentração de citrato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100mg.L-1.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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60
-CETOGLUTARATO
0
2
4
6
8
10
12
TEM PO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x 10
-6
)
Control e
0 4,37 1,57 1,68
G. glabra 25mg/L
5,35 10,40 6,80 4,35
G. glabra 50mg/L
7,65 9,14 5,93 5,49
G. glabra 100mg/L
9,48 8,49 6,94 3,50
M . pubescens 25mg/L
1,53 5,66 6,07 5,83
M . pubescens 50mg/L
8,03 9,40 5,09 4,24
M . pubescens 100mg/L
7,12 9,70 4,56 3,97
0246
Figura 22: Taxa de concentração de -cetoglutarato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100 mg.L-1. Legenda: 0 – ácido não detectado.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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61
SUCCINATO
0
5
10
15
20
25
30
35
TEMPO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x10
-6
)
Control e
0 0 9,12 19,66
G. glabra 25mg/L
0 0 18,27 26,36
G. glabra 50mg/L
0 0 9,52 19,33
G. glabra 100mg/L
0 0 14,61 17,69
M . pubescens 25mg/L
4,76 7,14 26,11 20,95
M . pubescens 50mg/L
6,01 20,43 12,52 33,14
M . pubescens 100mg/L
009,7025,80
0246
Figura 23: Taxa de concentração de succinato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100 mg.L-1. Legenda: 0 – ácido não detectado.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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FUMARATO
0
1
2
3
4
5
6
7
8
TEMPO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x 10
-6
)
Control e
6,95 4,92 5,41 5,52
G. glabra 25mg/L
6,78 6,59 5,84 5,34
G. glabra 50mg/L
5,48 5,94 5,12 5,10
G. glabra 100mg/L
6,31 5,99 5,99 4,69
M . pubescens 25mg/L
6,31 5,37 5,98 4,57
M . pubescens 50mg/L
7,31 6,15 4,12 5,74
M . pubescens 100mg/L
5,95 5,69 4,26 4,44
02 46
Figura 24: Taxa de concentração de fumarato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100 mg.L-1.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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MALATO
0
20
40
60
80
100
120
TEM PO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x 10
-6
)
Control e
57,35 50,32 84,83 88,71
G. glabra 25mg/L
81,96 106,61 101,94 95,85
G. glabra 50mg/L
70,85 91,08 84,77 104,43
G. glabra 100mg/L
87,10 77,30 101,29 81,41
M . pubescens 25mg/L
86,91 91,45 83,86 109,27
M . pubescens 50mg/L
89,89 95,58 80,66 87,98
M . pubescens 100mg/L
73,65 88,50 64,06 73,27
0246
Figura 25: Taxa de concentração de malato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100 mg.L-1.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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PROPIONATO
0
50
100
150
200
250
300
TEMPO (DIAS)
CONCENTRAÇÃO (mmol x 10
-6
)
Control e
122,17 143,36 239,87 268,17
G. glabra 25mg/L
105,96 170,62 203,53 224,94
G. glabra 50mg/L
84,70 144,34 185,70 218,72
G. glabra 100mg/L
99,30 165,28 213,74 228,21
M . pubescens 25mg/L
108,50 165,56 153,49 246,23
M . pubescens 50mg/L
144,26 176,98 195,42 235,00
M . pubescens 100mg/L
115,13 182,66 179,42 196,51
0246
Figura 26: Taxa de concentração de propionato na curva de crescimento de
promastigotas de Leishmania amazonensis no início, no segundo, quarto e sexto
dias, testadas com Glycyrrhisa glabra e Magonia pubescens, nas concentrações de
25, 50 e 100mg.L-1.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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65
DISCUSSÃO
Chalconas, alcalóides e taninos se destacam por demonstrar ação
sobre o parasito ou sobre seu metabolismo energético ou, ainda, na
liberação de interferons atingindo o macrófago, no entanto há um número
grande de extratos de plantas, alguns de uso tradicional, que demonstram
possuir atividade leishmanicida, porém nem todas substâncias ativas foram
identificadas (Gilbert e Favoreto 2005). A necessidade de encontrar drogas
antileishmanióticas com menor toxidade e que consiga contornar a
resistência do parasito têm estimulado as pesquisas com produtos naturais
no sentido de desenvolver novos fármacos a partir de substâncias extraídas
de caules, raízes, folhas e frutos de plantas já utilizadas na medicina
popular (Bergmann et al. 1997, Geary et al. 1989, Harvey 2000).
Estudos foram realizados com a M. pubescens, evidenciando os
mecanismos de ação e as alterações morfológicas que provocaram as mortes
nas larvas de Aedes aegypti, mosquito vetor da dengue e da febre amarela.
Além disso, estudos toxicológicos realizados em coelhos, ratos e cobaios
mostraram-se atóxicos de acordo com as normas para produtos vegetais
(Silva et al., 2004). Autores, após avaliarem os efeitos tóxicos de taninos
sobre a fauna associada aos culicíneos, sugeriram que os taninos vegetais
podem ser úteis como complemento em programas de controle de espécies
de mosquitos associados à atividade humana (Pautou 2000).
Os taninos representam um grupo presente em inúmeras espécies de
plantas (Porter 1994). Estudos, in vitro, com a susceptibilidade das
promastigotas de Leishmania spp ao tanino, apresentaram toxidade seletiva
para as formas extracelulares (Radtke et al. 2003). Apesar disso, no
presente trabalho o tingui, que apresenta tanino na sua constituição,
apresentou ação inibitória de crescimento para as promastigotas,
demonstrando agir também nesta forma do parasito.
O efeito de alguns extratos de plantas é baseado no estabelecimento
de resposta modulatória imune ou dos constituintes fenólicos da planta
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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66
(Kayser et al. 2001, Radtke et al. 2003). As frações do tanino podem,
também, estar relacionadas com a inibição de produção do óxido nítrico
(Kim et al. 1999).
Estudos têm apresentado que a chalcona exibe uma potente atividade
antileishmanicida in vitro e in vivo, pois este componente destrói a
ultraestrutura da mitocôndria e inibe a respiração e a atividade da
desidrogenase mitocondrial da Leishmania sp. A licochalcona A é um
exemplo típico, ela inibe a atividade da fumarato redutase. Entretanto, os
alvos específicos na mitocôndria do parasito não são bem conhecidos,
apesar de haver indicações de que o alvo específico da chalcona seja a
fumarato redutase do parasito. Esta enzima catalisa a redução do fumarato
a succinato e é a chave do metabolismo anaeróbio para muitos organismos
que utilizam o fumarato como aceptor de elétrons. Em células de mamíferos
o succinato é convertido em fumarato pela ação da succinato desidrogenase
e depois é convertido em malato pela fumarase, porém na Leishmania sp.
todo o malato retorna para a mitocôndria onde é convertido em fumarato
pela ação da fumarase e em seguida convertido à succinato pela fumarato
redutase (Blum 1994, Chen et al. 2001).
Aqui, observou-se que a G. glabra apresentou melhor inibição do
crescimento na fase estacionária, na qual a via do succinato é essencial, isto
indica uma atividade específica para organismos que utilizam o sistema
fumarato redutase. As duas plantas testadas possuem componentes ativos
contra Leishmania, a G. glabra apresenta chalcona na sua constituição e a
M. pubescens frações de tanino. Ambas apresentaram bioatividade contra os
parasitos, porém a M. pubescens teve menor efeito nas promastigotas como
sugere a literatura (Kolodziej et al. 2001). A G. glabra apresentou melhor
inibição do crescimento, entretanto a análise bioquímica dos ácidos
orgânicos, apesar de não haver variação significativa nas concentrações de
succinato e fumarato, houve um aumento de succinato no teste com
alcaçuz 25 e 100 mg.L-1 e diminuição de fumarato, mas não se pode
comprovar que tal fato ocorreu pela ação na fumarato redutase.
Efeito Leishmanicida de extratos - CLAE.
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67
O piruvato é o produto final da glicólise, no entanto nas promastigotas
parte do carboidrato é oxidado, completamente, em CO
2
via ciclo de Krebs,
mas grande parte é oxidado em produtos como acetato, piruvato e
succinato. Parte do piruvato é transaminado em alanina que é excretada
(Cazzulo 1992, Blum 1993). A excreção da alanina explica a não detecção do
piruvato nas culturas de promastigotas. Notou-se, ainda, excreção de
succinato e este foi influenciado pela presença das plantas na cultura. O
succinato é produzido principalmente por via oxidativa envolvendo parte do
ciclo de Krebs e oxidação de NADH via cadeia respiratória, somente os
estágios que possuem ciclo de Krebs ativo produzem succinato (Van
Hellemond et al 1997, Tielens e Van Hellemond 1998).
As alterações encontradas nas taxas de concentração dos ácidos
orgânicos comprovam que as promastigotas são dependentes da atividade
do ciclo de Krebs e da cadeia respiratória. As condições de substrato e
oxigênio são essenciais para a sobrevivência do parasito, no entanto o que
garante sua sobrevivência em condições adversas é sua capacidade e
habilidade de alterar o metabolismo reduzindo a níveis mínimos ou mesmo
revertendo vias metabólicas.
Conclusões
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69
CONCLUSÕES FINAIS
• Viabilizou-se técnicas de estudos bioquímicos utilizando a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A detecção de ácidos
orgânicos, pelo CLAE, se mostrou efetiva no monitoramento do
metabolismo de L. amazonensis, ampliando a possibilidade de estudos
na interação parasito-hospedeiro.
• Os ácidos, lactato, oxalato, citrato, -cetoglutarato,
succinato, fumarato, malato e propionato foram detectados na cultura
de Leishmania estudada. A promastigota apresentou glicólise, ciclo de
Krebs, metabolismo de ácidos graxos e cadeia respiratória ativos, visto
que os ácidos orgânicos encontrados são constituintes de tais vias
metabólicas. Houve aumento da excreção de citrato, malato e
propionato no decorrer da curva de crescimento das promastigotas,
sendo que o malato e o propionato apresentaram maior excreção no
sexto dia. Não houve diferença significativa quanto às variações
encontradas para o oxalato, fumarato e lactato, entretanto o -
cetoglutarato foi o único ácido que foi consumido. Este consumo foi
significativo a partir do segundo dia de crescimento. O succinato não foi
detectado na constituição do meio de cultura utilizado no cultivo das
promastigotas, no entanto observou-se que o mesmo foi excretado pelos
parasitos no quarto e sexto dias de crescimento (fase estacionária)
indicando metabolismo anaeróbio em hipóxia.
• Os extratos de M. pubescens (tingui) e de G. glabra (alcaçuz)
foram ativos em culturas de formas promastigotas de L. amazonensis
em todas as concentrações estudadas. Ambos apresentaram capacidade
leishmanicida. As concentrações mais ativas foram as de 100 mg.L-1
para G. glabra e de 25mg.L-1 para M. pubescens. A G. glabra teve maior
efeito durante a fase estacionária, ao contrário da M. glabra que foi mais
efetivo na fase logarítmica. Estatisticamente foram efetivos G. glabra 25
e 100 mg.L-1 no quinto e sexto dias.
Conclusões
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70
• As análises dos ácidos orgânicos nas culturas testadas com
G. glabra e M. pubescens, ambos nas concentrações de 25, 50 e
100mg.L-1 e do controle realizado com salina, observou-se excreção do
succinato, visto que este não foi constituinte do meio de cultura. Ambos
os ácidos foram excretados no quarto e sexto dias exceto para os testes
com G. glabra e M. pubescens, 100 mg.L-1, cujo acetato foi detectado
desde o início da cultura, porém foi consumido em todos os testes no
decorrer dos dias de cultura e para a M. pubescens, 25 e 50 mg.L-1, que
apresentou succinato, também desde o início do crescimento. Não
houve diferença significativa para o oxalato, fumarato, malato, lactato e
citrato em todos os testes, no entanto o citrato apresentou diminuição
da concentração, sendo que na cultura padrão este aumenta no
decorrer do crescimento. O -cetoglutarato foi o que apresentou
alterações mais significativas. Sua excreção aumentou no segundo dia
no teste com G. glabra 25 mg.L-1, no quarto dia com G. glabra 100 e 25
mg.L-1 e no sexto dia com M. pubescens e G. glabra, ambos nas
concentrações de 25 e 50 mg.L-1.
• Os bioensaios mostraram, por meio das alterações
metabólicas observadas nas taxas de concentração dos ácidos
orgânicos, uma influência na fisiologia e proliferação das formas
promastigotas. O aumento do succinato sob influência dos extratos das
plantas testadas indicou a ativação de vias metabólicas anaeróbias. As
alterações da taxa de concentração do citrato e do -cetoglutarato
indicaram ação por parte das soluções naturais testadas no ciclo de
Krebs.
Considerações Finais
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os parasitos do gênero Leishmania são capazes de adaptar seu
metabolismo conforme a disponibilidade de substratos energéticos, pois
apresentam um ciclo de vida complexo envolvendo dois hospedeiros
diferentes. Para estes organismos a glicose é a principal fonte
energética, porém promastigotas preferem os aminoácidos (Tielens e
Van Hellemond 1998). O conhecimento do metabolismo de parasitos
possibilita que sejam encontrados novos sítios de ação, uma vez que
estes organismos podem possuir vias bioquímicas diferenciadas de seus
hospedeiros ou apresentar inversões no seu metabolismo como forma
de resistência (Turrens 2004).
O metabolismo e as vias utilizadas podem ser conhecidos por meio
da caracterização dos ácidos orgânicos, que são importantes
indicadores bioquímicos (Bezerra et al. 1997). A descrição destes
processos bioquímicos, que muitas vezes podem ser diferentes daqueles
encontrados no hospedeiro, é umas das maiores esperanças para a
intervenção terapêutica nas leishmanioses humanas. A grande
incidência da doença e o tratamento com compostos altamente tóxicos
associados à resistência do parasito despertam o interesse e a busca
por novos meios de controle que superem tais dificuldades.
Este trabalho foi realizado na forma de dois artigos, tendo como
princípio fundamental subsidiar o controle e o conhecimento integrado
da Leishmaniose, bem como valorizar e proteger a riqueza da
biodiversidade brasileira. Plantas do Cerrado, como a M. pubescens,
vêm sendo amplamente investigadas quanto a sua atividade
antimicrobiana e antiparasitária e plantas como G. glabra já possuem
um consumo freqüente na medicina popular para várias enfermidades.
O primeiro artigo procurou caracterizar os ácidos orgânicos
durante o crescimento das promastigotas, com o objetivo de identificar
suas vias metabólicas e o comportamento bioquímico da L.
Considerações Finais
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73
amazonensis. A metodologia aplicada foi satisfatória para o
monitoramento das atividades do ciclo de Krebs, da cadeia respiratória,
da via glicolítica e do metabolismo de ácidos graxos.
O segundo artigo mostra a ação da M. pubescens e da G. glabra
no crescimento dos parasitos. Além disso, demonstra a atividade de tais
extratos na produção dos ácidos orgânicos do metabolismo das
promastigotas, possibilitando a identificação de alvos específicos de
ataque.
Os produtos naturais são excelente fonte de biodiversidade, pois
apresentam novas moléculas com alto potencial na aplicação
terapêutica. No entanto é necessário conhecer e isolar os componentes
dos extratos para que se possa testá-los separadamente com o objetivo
de se determinar àquele que apresenta melhor atividade e inibe de
forma mais efetiva alguma via metabólica essencial.
Os testes realizados neste trabalho ofereceram uma perspectiva
de ação, no entanto faz-se necessário estabelecer o mecanismo de ação
e correlacionar a estrutura química com a etapa de inibição ou geração
de ácidos orgânicos. A correlação entre alvo específico e componente
ativo é de extrema prioridade e para isso um conhecimento detalhado
do metabolismo do parasito é o primeiro passo.
Observou-se no trabalho que os resultados são inerentes às
condições de cultura. Fica aqui destacado a perspectiva de novos testes
com outro meio de cultura e outras condições de análise ou mesmo uso
de compostos químicos já conhecidos na sua atividade leishmanicida
como meio de aprimorar o conhecimento do metabolismo do parasito e
até mesmo descobrir novas vias essenciais de ataque.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ackrell BAC et al., 1992 in Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes
(Muller, F., ed.) , CRC Press. 3: 229–297.
Alcanfor JDX, Silva RC, Bezerra JCB, Ferri PH, Santos SC, 1999. Ação
metabólica de Stryphnodendron adstringens, Barbatimão do cerrado,
sob Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário de Schistosoma
mansoni. XVI Congresso Brasileiro de Parasitologia. 2 a 5 de novembro ,
Poços de Caldas, MG.
Alexander J, Satoskar AR, Russell DG, 1999. Leishmania species:
models of intracellular parasitism. J. Cell Sci. 112: 2993–3002.
ANVISA – Vigilancia Sanitaria – www.anvisa.gov.br (acesso em agosto,
2003)
Araújo CAC, Alegrio LV e Leon LL 1998. Antileishmanial activity of
compounds extracted and characterized from Centrolobium
sclerophyllum. Phytochemistry. 49: 751-754.
Ashford RW, 2000. The leishmanioses as emerging and reemerging
zoonoses. Int. J. Parasitol. 30: 1269–1281.
Barata LES, Santos LS, Ferri PH, Phillipson JD, Paine A e Croft SL
2000. Anti-leishmanicidal activity of neolignans from Virola species and
synthetic analogues. Phytochemistry. 55: 589-595.
Barrett MP, 1997. The pentose phosphate pathway and parasitic
protozoa. Parasitol. Today. 13: 11–16.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
76
Berman J, 2003. Current treatment approaches to Leishmaniasis. Curr
Opin Infect Dis (Supl). 16(5):397-401.
Bermam JD 1997. Human Leismaniases: clinical, diagnostic, and
chemotherapeutic developments in the last 10 years. Clin. Infect. Dis.
24: 684-703.
Bergmann BR, Costa SS e Moraes VLG, 1997. Brazilian medicinal
plants: A rich source of immunomodulatory substances. Brazilian
Journal Association for the Advancement of Science. 49: 395-402.
Bezerra JCB e Becker W, 1994. Efeitos da infecção com Shistosoma
mansoni no metabolismo de Biomphalaria glabrata. Revista de Patologia
Tropical (Supl). 23(2): 202.
Bezerra JCB, Becker W e Kemper A, 1995. Metabolism of Biomphalaria
glabrata, intermediate host of Schistosoma mansoni, under hypoxic
conditions. XXIV Reunião annual da Sociedade Brasileira de Bioquímica
e biologia Molecular, 6 a 9 de maio, Caxambu, MG. p.116.
Bezerra JCB, 1996. The inversion of the cycle course of tricarboxilic
acid as facultative metabolism of invertebrate. XXV
a
Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 4 a 7 de maio,
Caxambú, MG. p.81.
Bezerra JCB, Becker W e Zelck UE, 1997. A comparative study of the
organic acid content of the hemolymph of Schistosoma mansoni-
resistant and susceptible strains of Biomphalaria glabrata. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz (Supl). 92(3): 421-425.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
77
Bezerra JCB, Kemper A e Becker W, 1999. Profile of organic acids
concentrations in digestiv gland and hemolymph of Biomphalaria
glabrata under estivation. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz (Supl).
94(6): 779-784.
Blum JJ, 1993. Intermediary metabolism of Leishmania. Parasitol.
Today. 9: 118–122.
Blum JJ, 1994. Energy metabolism in Leishmania. Bioenerg Biomembr
(Supl). 26(2):147-55.
Bodeker G, Willcox M, 2000. The first international meeting of the
Research Initiative on Traditional Antimalarial Methods (RITAM). J
Altern Complement Med (Supl). 6(2):195-207.
Brener Z, 1961. Contribuição ao estudo da terapêutica experimental da
doença de Chagas. Tese de Docência livre. Faculdade de Odontologia e
Farmácia de Minas Gerais. Belo Horizonte. p. 99.
Burchmore RJS e Barrett MP, 2001. Life in vacuoles – nutrient
acquisition by Leishmania amastigotes. International Journal for
Parasitology. 31: 1311–1320.
Camacho MR, Phillipson JD, Croft LS, Kirby GC, Warhurst DC e Solis
PN, 2000. Terpenoids from Guarea rhophalocarpa. Phytochemistry. 56:
203-210.
Cannata JJB, Cazzulo JJ, 1984. The aerobic fermentation of glucose by
Trypanosoma cruzi. Comp. Biochem. Physiol. 79B: 297-308.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
78
Carvalho PB, Arribas MAG, Ferreira EI, 2000. Leishmaniasis. What do
we know about its chemotherapy? Rev. Bras. Ci. Farm (Supl). 36(1): 69–
96.
Carvalho LH, 1991. Antimalarial activity of crude extracts from brazilian
plants studied in vivo in Plasmodium berghei infected mice in vitro gainst
Plasmodium faciparum in culture. Brazilian. J. Med. Biol. Res. (24):
1113-1123.
Clayton CE and Michels P, 1996. Metabolic compartmentation in
African trypanosomes. Parasitol. Today. 12: 465–471.
Cazzulo JJ, 1992. Aerobic fermentation on glucose by trypanosomatids.
FASEB J. 6: 3153–3161.
Cazzulo JJ, Franke de Cazzulo, BM, Engel JC and Cannata JJB, 1985.
End products and enzyme levels of aerobic glucose fermentation in
trypanosomatids. Mol. Biochem. Parasitol. 16: 329-343.
Chatterjee T, Datta AG, 1974. Studies on malate or oxaloacetate
formation from bicarbonate and pyruvate or phosphoenolpyruvate in
cell-free extracts Leishmania donovani. Comp. Biochem. Physiol. 47B:
725-738.
Christensen SB, Ming C, Andersen L, Hjorne U, Olsen CE, Cornett C,
Theander TG, Kharazmi A, 1994. An antileihmanial chalcone from
Chinese Licore roots. Planta Medica. 60(2):.121-123.
Chen M, Bennedsen M, Zhai L, Kharazmi A, 2001. Purification and
enzymatic activity of an NADH-fumarate reductase and other
mitochondrial activities of Leishmania parasites. APMIS. 109(12):801-8.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
79
Croft SL, Coombs GH, 2003. Leishmaniasis: current chemotherapy and
recent advances in the search for novel drugs. Trends Parasitol.
19(11):502-508.
Craft SL, 2006. Drug resistence in Leishmaniasis. Clin Microbiol Rev.
19(1): 11-26.
Correio Brasiliensis, 2002.
Darling TN, Dvis DG, London RE and Blum JJ, 1987. Products of
Leishmania brasiliensis glucose metabolism: release of D-lactate and,
under condictions, glycerol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 7129-7133.
Darling TN, Dvis DG, London RE and Blum JJ, 1989. Carbon dioxide
abolishes the reverse pasteur effect in Leishmania major promastigotes.
Mol. Biochem. Parasitol. 33: 191-202.
Daish P and Leonard JV, 1985. Rapid prolifiling of plasma organic acids
by high performance liquid chromatography. Clinica Chimica Acta, 146:
8-91.
Davis AJ, Murray HW and Handman E, 2004. Drugs against
leishmaniasis: a synergy of technology and partnerships. TRENDS in
Parasitology. 20(2): 73-76.
Desjeux P, 2001. The increase in risk factors for leishmaniasis
worldwide. Transactions of the royal society of tropical medicine and
hygiene. 95: 239-243.
Desjeux P, 2004. Leishmaniasis: current situation and new
perspectives. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 27 (2004) 305–318
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
80
Enserink M, 2000. Infections diseases. Has Leishmaniasis become
endemic in the US? Science. 290: 1881-1883.
Fournet A, Barrios AA, Munõz V, Hocquemiller R e Cavé A, 1992.
Effects of natural naphtoquinones in BALB/c mice infected with
Leishmania amazonensis and L. venezuelensis. Annals of Tropical
Medicine Parasitology. 43: 219-222.
Fournet A, Munõz ABC, Cavé A and Hocquemiller R, 1993. Effect of
some bisbenzylisoquinoline alkaloids on American Leishmania sp. in
BALB/c mice. Phytoterapy Research. 7: 281-284.
Fournet A, Munõz ABC, Arias AR, Muñoz V, Hocquemiller R, Cavé A
and Bruneton J, 1993. 2- Substitute quinoline alkaloids as pontecial
antileishmanial drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37:
859-863.
Frayha GJ, Smyth JD, Gobert JG and Savel J, 1997. The Mechanisms
of action of antiprotozoal and anthelminct drugs in man. Gen.
Pharmacol. 28(2): 273-299.
Galbraith RA, 1991. Intermediary metabolism in Leishmania mexican.
The Journal of Nutritional Biochemistry. 4(2): 180-184
Geary TG, Edgar A, Jensen JB, 1989. In Campbell, W. C. and Rew, R. S.
(eds.), Chemoterapy of Parasitic Diseases, Plenum Press, New York.
209-238.
Genaro O, 2000. Leishmaniose Visceral Americana. In: Neves, D. P.
(10. ed). Parasitologia Humana. São Paulo, Editora Atheneu. 10: 56-
72.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
81
Gilbert B e Favoreto R, 2005. Produtos naturais ativos em
Leishmaniose. Revista Fitos. 1(1): 43-51.
Gontijo B, Carvalho MLR, 2003. Leishmaniose Tegumentar Americana.
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 36(1):71-80.
Gossage SM, Rogers ME, Bates PA, 2003. Two separate grwth phases
during the developmentt of Leishmania in sand Flies: implications for
undertansding the life cycle. International Journaul for parasitology. 3:
1027-1034.
Grimaldi jr. G e Tesh RB, 1993. Leishmaniases of de new world current
concepts anda implications for future research. Clinical Microbiology
Review. 6: 230-250.
Guerin PJ, Olliaro P, Sundar S, Boelaert M, Croft SL, Desjeux P, 2002.
Visceral leishmaniasis: current status of control, diagnosis, and
treatment, and a proposed research and development agenda. Lancet
Infect Dis. 2: 494-501.
Handman E, 2000. Cell Biology of Leishmania. Advances in Parasitology
44: 1-39.
Hart DT and Coombs GH, 1981. The effects of carbon dioxide and
oxygen upon the growth and in vitro transformation of Leishmania
mexicana mexicana. Mol. Biochem. Parasitol. 4: 117–127.
Hart DT and Coombs GH, 1982. Leishmania mexicana: energy
metabolism of amastigotes and promastigotes. Exp. Parasitol. 54: 397–
409.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
82
Harvey A, 2000. Estrategies for discovering drugs from previously
unexplored natural products. Drug. Discov. Today. 5(7): 249-3000.
Haslam E, 1996. Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs and
medicines: possible modes of actions. Natural Products Reports, United
States. 59 (2): 205-220.
Herbario brasileiro 2006.
http://www.herbario.com.br/dataherb11/1712alcacuz.htm.
Herzog-Soares JDA, Alves RA, Bezerra JCB, 1999. Análise da
proliferação da Entamoeba moshkovskii exposta à diferentes
concentrações do extrato da casca de Stryphnodendron adstringens. XVI
Congresso de Brasileiro de Parasitologia. 2 a 5 de novembro, Poços de
Caldas, MG.
Kam TS, Sim KM, Koyana T, Toyoshima M, Hayash M and Komiyama K,
1997. Citotoxic and Leishmanicidal aminoglycosteroids and
aminosteroids from Holarrhena curtisii. Journal of Natural Products.
61: 1332-1336.
Karaffa L, Sándor E, Kozma J and Szentirmai A, 1997. Methionine
enhances sugar consumption, fragmentation, vacuolation and
cephalosporin-C production in Acremonium chrysogenu. Process
Biochemistry. 32(6): 495-499
Kayser O, Kiderlen AF, Laatsch H and Croft SL, 2000. In vitro
leishmanicidal activity of monomeric and dimeric naphthoquinones.
Acta Tropica. 77: 307-314.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
83
Kayser O, Klodziej H, Kiderlen AF, 2001. Immunomodulatory principles
of Pelargonium sidoides. Phytotherapy Research. 15: 122-126.
Keegan FP, Sansone L and Blum JJ, 1989. Oxidation of glucose, ribose,
alanine and glutamate by Leishmania brasiliensis panamensis.
Protozool. 34: 174-179.
Khabnadideh S, Tan CL, Croft SL, Kendrick H, Yardley V, Gilbert IH,
2000. Squalamine analogues as potencial anti-trypanosomal and anti-
leishmanial compounds. Biorg. Med. Chem. Lett. 10: 1237-1239.
Killick-Kendrick R, Molyneux DH, Ashford RW, 1974a. Ultrastructural
observations on the attachment of Leishmania in the sandflay. Trans. R.
Soc. Trop. Med. Hyg. 68: 269-276.
Killick-Kendrick R, 1990. The life cycle of Leishmania in the sandflay
whith special reference to the form infective to the vertebrate host. Ann.
Parasitol. Comp. Hum. 65 (Suool.): 37-42.
Kim HM, Kim MJ, Li E, Lyu YS, Hwang CY, AN, NH, 1999. The nitric
oxide-production properties of Solanum lyratum . Journal of
Ethnopharmacology. 67: 163-169.
Kolodziej JH, Kayser O, Kiderlen AF, Ito H, Hatano T, Yoshida T, Foo LY,
2001. Antileishmanial activity of hydrolyzable taninins and their
modulatory effects on nitric oxide and tumour necrosis factor alpha
release in macrophages in vitro. Planta Medica. 67(9): 825-832.
Kohlschutter A, Behbehani A, Langenbeck U, Albani M, Heidemann P,
Hoffmann G, Kleneke J, Lehnert W and Wendel U, 1982. A familial
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
84
progressive neurodegenerative discaes with 2- oxoglutaric aciduria. Eur.
J. Pediat. 138: 32-37.
Lainson R and Shaw JJ, 1987. Evolution, classification geographical
distribution. In: Petters, W & Killick-kendrick, R (eds). The
Leishmaniase in Biology and Medicine. Biology and Epidemiology.
Londom. Academic Press. 1(1): 1-120.
Marounek M, Suchorska O and Savka O, 1999. Effect of substrate and
feed antibiotics on in vitro production of volatile fatty acids and
methane in caecal contents of chickens. Animal Feed Science and
Technology. 80(3-4): 223-230.
Martin E and Mukkada AJ, 1979. Identification of the terminal
respiratory chain in kinetoplast mitochondrial complexes of Leishmania
tropica promastigotes. J. Biol. Chem. 254: , CRC Press. 12192–12198.
Mahaio UV, Roblot F, Hocquemiller R, Cavé A, 1995. Piperogalin, a new
prenylated diphenol from Peperomia galioides. Journal of Natural
Products. 58: 324-328.
Mcgreevy PB, Marsden PD, 1986. In Campbell, W. C. and Rew, R. S.
(eds.), Chemoterapy of Parasitic Diseases, Plenum Press, New York,
p. 115-127.
Mittal N, Gupta N, Saksena S, Goyal N, Roy U, Rastogi A K, 1998.
Protective effect of picrolive from Pichrorhiza kurroa against Leishmania
donovani infections in Mesocricetus auratus. Life Sciences. 63: 1823-
1834.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
85
Ministério da Saúde / FUNASA (Fundação Nacional de Saúde), 2000.
Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasília:
Centro Nacional de Epidemiologia, FUNASA, MS.
Oliveira-Neto MP, Mattos MS, Perez MA, Da-cruz AM, Fernandes O,
Moreira J, Gonçalves-Costa SC, Brahin LR, Menezes CR, Pirmez C,
2000. American tegumentary leishmaniasis (ATL) in Rio de Janeiro
State, Brazil: main clinical and epidemiologic characteristics. Int J
Dermat. 39:506-514.
Opperdoes FR, 1995 in Biochemistry and Molecular Biology of
Parasites (Marr, J.J. and Müller, M., eds), pp 19–32, Academic Press.
Pautou MP, Rey D, David JP, Meyran JC, 2000. Toxicity of vegetable
tannins on crustacea associated with Alpine mosquito breeding sites.
Ecotoxicology and Environmental Safety. 47:323-332.
Patz JA, Graczyk TK, Geller N, Vittor AY, 2000. Effects of environmental
change on emerging parasitic diseases. Int. J. Parasitol. 30: 1395–1405.
Pearson RD and Souza AQ, 1996. Clinical espectrum of leishmanioses.
Clinical Infections diseases. 22: 1-11.
Porter LJ, 1994. Flavans and proanthocyanidins. In: Harbone, j.b. (ed),
The flavonoides. Advances in Research Since 1986. Chapman and
Hall, London. p. 21-64
Radtke OA, Foo LY, Lu Y, Kiderlen AF, Kolodziej H, 2003. Evaluation of
sage phenolics for their antileishmanial activity and modulatory effects
on interleukin-6, interfern and tumour necrosis factor--release in RAW
264.7 cells. Zeitschrift fur Naturforschung. 58c: 395-400.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
86
Rocha LG, Almeida JR, Macedo RO, Barbosa-Filho JM, 2005. A review
of natural products with antiLeishmanial activity. Phytomedicine. 12(6-
7):514-35.
Sá EV, Sá MA, Souza AVS, Diniz AM, 1992. Saúde e Doenças Tropicais:
Comunidades Rurais, Conflitos Agrários e Pobreza. Belém: NUMA,
UFPA.
Sartori A, Oliveira MA, Scott P, Trinchieri G, 1997. Metacyclogenesis
modulates the ability of Leishmania promastigotes to induce IL-12
production in human mononuclear cells. J Immunol. 159(6):2849-57.
Scalbert A, 1991. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry
30: 875-3883.
Scriver RC, Beaudet al, Sly WS, Valle D, 1989. The metabolic basis of
inherited disease, McGraw-Hill, N.Y.
Silva LA, Silva IA, Ferri PH, Santos SC, Bezerra JCB, 1999. Bioatividade
de extrato de Caryocar brasiliensis (pequizeiro) sobre Biomphalaria
glabrata, e cercarias de Shistosoma mansoni. XVI Congresso Brasileiro
de Parasitologia. 2 a 5 de novembro, Poços de Caldas, MG.
Silva HHG, Silva IG, Santos RMG, Filho ER, Elias CN, 2004. Atividade
larvicida de taninos isolados de Magonia pubescens St.
Hil.(Sapindaceae) sobre Aedes aegypti (Diptera, Culicidae). Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 37(5): 396-399.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
87
Silva LJ e Camargo-Neves VLF. As Leishmanioses, uma visão para o
clínico - www.praticahospitalar.com.br/ pratica%2036, acesso em
2006.
Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick
PR, 2001. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Editora da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
Tielens AGM, 1994. Energy generation in parasitic helminths. Parasitol.
Today. 10: 346–352.
Turrens JF, 2004. Oxidative stress and antioxidant defenses: a target
for the treatment of diseases caused by parasitic protozoa. Molecular
Aspects of Medicine. 25(1-2): 211-220.
Urbina JA, 1994. Intermediary Metabolism of Trypanosoma cruzi.
Parasitology Today. 10(3).
Van Hellemond JJ and Tielens AGM, 1997. Inhibition of the respiratory
chain results in a reversible metabolic arrest in Leishmania
promastigotes. Mol. Biochem. Parasitol. 85: 135–138.
Van Hellemond JJ, Van der Meer P and Tielens AGM, 1997. Leishmania
infantum promastigotes have a poor capacity for anaerobic functioning
and depend mainly on respiration for their energy generation.
Parasitology. 114: 351–360.
Verdini GL, 1996. The combinatory chemistry of nature. Nature. 384:
11-13.
Veronesi C. Doenças infecciosas e parasitárias. 8a. Ed. P 250-262.
Referências Bibliográficas
_________________________________________________________________________________________________________
Josireny Mariano Mendes /IPTSP /2006
88
Yang DM and Liew FY, 1992. Effects of qinghaosu (artemisin) and its
derivates on experimental cutaneous leishmaniasis. Parasitology. 106:
7-11.
WHO – World Health Organization Statiscal Information System Website
– http://www.who.ch (acesso em fevereiro, 2006)
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