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RÉGIA MARIA FELTRIN DAMBROS
AMPLIFICAÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA
RECOMBINANTE DO VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY
EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS PARA UTILIZAÇÃO
EM PROGRAMA DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO
LAGES – SC
2006
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC
CENTRO DE CIÊNCIAS AGROVETERINÁRIAS - CAV
MESTRADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
RÉGIA MARIA FELTRIN DAMBROS
AMPLIFICAÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA
RECOMBINANTE DO VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY
EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS PARA UTILIZAÇÃO
EM PROGRAMA DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias, da
Universidade do Estado de Santa Catarina,
como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Orientadora: Profª. Drª. Janice Reis Ciacci
Zanella
LAGES – SC
2006
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RÉGIA MARIA FELTRIN DAMBROS
AMPLIFICAÇÃO, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA
RECOMBINANTE DO VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY
EM SISTEMA DE BACULOVÍRUS PARA UTILIZAÇÃO
EM PROGRAMA DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, da
Universidade do Estado de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Banca Examinadora:
Orientadora: _____________________________________________
Profª Drª Janice Reis Ciacci Zanella
EMBRAPA Suínos e Aves Concórdia SC
Co-orientadora: _____________________________________________
Profª Drª Eliana Knackfuss Vaz
CAV – UDESC Lages SC
Membro: _____________________________________________
Profª Drª Vânia Helena Techio
UnC Concórdia SC
Lages (SC), 04 de Julho de 2006.
A você José Aníbal, amado companheiro, e aos
meus filhos Marina e José Raul, meus eternos
amores, dedico esta obra, que tem muito de
vocês por tudo que fizeram ou simplesmente
suportaram. Obrigada por fazerem parte da
minha caminhada.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Drª Janice Reis Ciacci Zanella, que por confiar no meu
trabalho, permitiu que eu desse esse grande passo e pudesse crescer sob tantos
aspectos. Considero-a um ser humano fantástico, sempre pronta para o apoio
didático, mas sobretudo sempre aberta para as lamentações e por reconfortar com
palavras de incentivo. E a grande verdade, “que tudo vai dar certo ao seu tempo,
cada coisa na sua vez”. Obrigada pela orientação, confiança, oportunidade e
amizade.
Agradecer a minha co-orientadora, Drª Eliana Knackfuss Vaz, pelo apoio e
suporte técnico nas inúmeras vezes que solicitamos sua ajuda. Agradecer pelo
empréstimo das literaturas, pelas excelentes ‘dicas’, sempre nos alertando dos
entraves a serem vencidos, e pelo exemplo de profissional dedicado e
extremamente capacitado. Muito abrigada.
Aos professores do CAV-UDESC, em especial aos da pós-graduação, por me
fazerem descobrir que ainda sou capaz de aprender. Obrigada por tudo, em especial
pela paciência e pela amizade.
Agradeço a coordenação do curso de pós-graduação, na pessoa do professor
Dr. Alceu Mezzalira e atualmente na do professor Dr. Aury Nunes de Moraes e em
seus nomes agradecer ao colegiado e funcionários da pós-graduação e a toda
direção do CAV-UDESC de Lages.
Aos colegas e amigos encontrados durante o período em que fiquei em
Lages. Vocês moram em meu coração e sempre passeiam em meus pensamentos.
Agradeço ao colega José Cristani (professor do CAV) pela ajuda em
conseguir um lugar para ficar em Lages, onde morei por quase um ano. Muito
obrigada.
5
Aos professores Sandra Ferraz Catagna (com quem tive o prazer de morar
por alguns dias) e Ubirajara Costa (membro suplente de nossa banca), competentes
profissionais, mas sobretudo pessoas maravilhosas que nos contagiam com sua
garra e semblantes sempre felizes.
Agradecer aos membros da minha banca de avaliação da dissertação, à Drª
Janice Zanella (minha orientadora), à Drª Eliana K. Vaz (minha co-orientadora) e a
Drª Vânia H. Techio (membro externo da banca) da UnC de Concórdia. Vocês
contribuíram imensamente com suas avaliações, questionamentos, sugestões e
correções para a melhoria da produção escrita dos trabalhos realizados e para o
nosso crescimento científico-profissional. Muito obrigada.
Em Lages, tive a oportunidade de ser vizinha da família da Gorete. Família
maravilhosa que me fez inúmeros favores e sempre estava pronta a me socorrer.
Muito obrigada, Gorete. Sua família tem um lugar bem especial em meu coração.
Tive o privilégio de encontrar uma amiga-irmã em Lages. É interessante como
as pessoas se cruzam, como as afinidades se atraem ou até pelas diferenças.
Nossa diferença de idade me fez tua irmã de coração mais velha, entretanto eras tu
que por muitas e muitas vezes, me escutaste e me viste chorar de saudades de
meus filhos, do meu lar. Encontrei amparo em tua família. A adorável Carol (minha
amiguinha), em teu filho Alan, em tua mãe (dona Odete) e em ti, querida amiga. Os
fatos que se sucederam, as fatalidades que ocorreram. Sei lá! Será que tudo isso já
estava escrito? Olha! Tenho em ti um sincero carinho e uma eterna amiga. Muito
obrigada por tudo, querida amiga e irmãzinha, Carine Rüsche.
Agradeço ao professor Dr. Leonardo José Richtzenhain, VPS/FMVZ/USP
(Lab. Biologia Molecular Aplicada e Sorologia da USP), que além do profissional e
pesquisador de renome, sempre demonstra ser um ser humano com um coração
enorme e de uma dedicação para com os trabalhos e com as pessoas sem igual.
Obrigada pelo incentivo e principalmente por acreditar na nossa capacidade de
trabalho.
Sou grata ao destino, pois através dele, encontrei a Simone (Perecmanis) e
por seu intermédio conheci o professor Bergmann.
Ao ser humano maravilhoso chamado Simone Perecmanis, que assim no
mais me acolheu em sua casa, e além da hospedagem me ofereceu sua amizade,
bom humor, ‘papo’ agradável e muita ajuda técnica. Recebeu-me como a uma irmã.
Muitíssimo obrigada.
6
À pessoa fantástica, de uma sabedoria e serenidade imensa, por tudo que me
ajudou. Pela oportunidade de participar do seu curso em biologia molecular e de
trabalhar em seu laboratório. De nos acolher de forma tão despretensiosa,
estendendo uma mão tão profissional e tão amiga, nos fazendo sentir em casa. Pela
paciência para me ensinar e poder em seu laboratório ter conseguido desenvolver
uma das etapas mais importantes deste trabalho que ora finalizo. Muito obrigada,
prof. Bergmann Morais Ribeiro, e em seu nome agradeço a todos professores do
Laboratório de Microscopia Eletrônica e Virologia do Departamento de Biologia
Celular da Universidade de Brasília (DF).
Um abraço bem grande e toda minha gratidão a todos do Laboratório de
Microscopia Eletrônica e Virologia da UnB (DF) que me ajudaram em todos os
aspectos durante minhas estadas em Brasília. Um forte abraço aos colegas/amigos
do laboratório, a Susane, a Ana Maria, ao Roberto, ao Marcelo (Spicer man), a todos
os ‘meninos’, a Mariana, a Thati, a Maria, a Danielle, a Érica, a Aline e a tantos
outros não mencionados aqui, meu muito obrigada. Minha eterna gratidão.
Toda minha admiração pela obstinação e coragem ao meu braço direito no
laboratório da virologia molecular da UnB Raimundo Wagner. Sou muito grata por
tudo que me ensinou e ajudou. Pela presença constante no laboratório, de segunda
a segunda, do início da manhã até noite adentro para vencermos as etapas de
trabalho. Muito, muito obrigada.
Agradecer a Nayara (UnB) que sempre estava pronta a me socorrer, ser
humano generoso e acolhedor, de um coração imenso. Tecnicamente não preciso
nem citar todas as suas qualificações. Parabéns pela tua garra e que Deus te
mantenha assim tão especial, tão comprometida em ajudar o mundo a ser melhor.
Aos colegas (e muitos amigos) do laboratório de virologia da EMBRAPA
Suínos e Aves: a Marisete, a Tânia, ao seu Nene (que Deus permita que retorne em
breve com muita saúde), a Magda, a Neide, ao ex-bolsista Kleithon, a bolsista
Michele, ao Marcelo (o Japa), a Danielle (a Gava) e a Lauren.
Aos doutores e mestres da virologia Liana, Rejane, Paulo Esteves (PAE) e
Iara, com certeza vocês fizeram a diferença. Cada um do seu jeito, com todo o seu
conhecimento conseguiram me manter no caminho e perseverar para conseguir
cumprir etapas, que por muitas vezes foram difíceis e pareciam sem saída. Foram
nesses momentos, principalmente, que vocês estavam ali para nos levantar, nos
orientar e mostrar alternativas para continuar o jogo.
7
Agradecer a todos do laboratório de bacteriologia e micoplasma da
EMBRAPA Suínos e Aves, em especial aos pesquisadores Laurimar, Cátia, Virgínia
e Jalusa. Agradecer a Marni (que por inúmeras vezes me auxiliou e me ensinou), ao
Bordin, ao Vizotto (quantas vezes você me ajudou com os preparos dos reagentes,
pH e tudo mais?), a Susana (da mesma forma me auxiliou muitíssimo com os géis
de poliacrilamida), a Beatriz, a Daiane e a todos os bolsistas e estagiários.
Meus sinceros agradecimentos a todos do laboratório de sanidade: a Fran, ao
Altair, ao Djalmo, ao Maximino, ao Gerson, a Salete, ao Alexandre, a Sílvia, ao
Armando, ao Dhamer, ao Idelsino, a Maria, ao Jair e a tantos outros que não citei ou
que já estão em outras pradarias.
Obrigada aos pesquisadores do laboratório de sanidade da EMBRAPA
Doralice, Carlos Costa, Mônica, Fátima e Morés.
Um abraço especial para a pesquisadora Fátima, minha amiga desde 1991,
dos bons tempos das aulas de inglês, lembra? Como é revitalizante as boas
gargalhadas que damos juntas. A gente ri à toa. Rimos por qualquer motivo e isso é
muito bom. Obrigada.
Aos amigos Lauren, Marisete, Marcelo, Tânia, Michele e Neide que além de
todo suporte profissional me apoiaram em tudo. Obrigadaaaaa!!! Foi muito bom tê-
los por perto, sem a sua colaboração muito, com certeza, não teria sido alcançado. E
tudo foi bom. Os momentos de trabalho, os intervalos para o café, as quintas-feiras
com os lanches da Leoni, e muito, muito trabalho.
Um agradecimento especial à Neide, que foi meu braço direito e muitas vezes
o esquerdo. Ajudou-me sob inúmeros aspectos. Você é uma pessoa maravilhosa e
uma profissional de muita competência, apesar de sua pouca idade. Pois é
“Alemoa”, você faz idéia de quanto me ajudou? E ainda por cima fazíamos
brincadeiras, fazendo-a ficar zangada e vermelhinha? Ah! São essas coisas e
principalmente as pessoas que fazem a vida ser tão especial. Muito abrigada!
Obrigada a você, Marcelo (Japa), sobretudo pela paciência para me explicar o
que me parecia tão difícil e complicado, socorrendo-me com dicas fantásticas na
área de informática, nas dúvidas com a PCR, técnicas recombinantes e outros testes
da bio-molecular. (E lembre que está devendo ‘aquela’ costela de gado assada no
forno).
Obrigada a você, Lauren, me emprestando um ombro técnico, mas sobretudo
um ombro amigo. Você tem um dinamismo contagiante e interage muito bem com as
8
pessoas. Foi muito bom ter você por perto. Sempre incentivando e se colocando à
disposição. Foram muitos papos legais e muitas gargalhadas gostosas. Às vezes
ríamos do nada, já em outras, em virtude de meus ‘achados espetaculares’.
Obrigada pelas palavras reconfortantes e pelo incentivo constante.
Aos funcionários do laboratório CEDISA: a Eliane, a Franciele, a Nara, a
Andréia, a Marna, a Keli, a Loni, a Simaia, a Tatiane, a Áuria e a Kellen. Quero
reforçar aqui a imensa importância que vocês tiveram para que hoje eu alcance este
objetivo. Com certeza vocês me ajudaram em muito.
A você Áuria, cara amiga, só agradecer e agradecer. Saiba que você é
exemplo de sucesso. Que com tudo que a vida ofereceu, você transformou em uma
saborosa e refrescante limonada. Pessoa batalhadora e uma profissional dedicada e
comprometida com a qualidade do produto final.
Aos colegas da CIDASC, técnicos e amigos do laboratório CEDISA Ricardo
Volcato, José Luiz Marques e Helder Machado (atualmente em área administrativa),
nosso gerente regional da CIDASC de Concórdia (SC). Pessoas que comprometidas
com o nosso objetivo, não mediram esforços em permitir que pudéssemos nos
afastar de nossa bancada de trabalho para poder desenvolver este projeto
profissional e, sobretudo de vida. Muito obrigada.
A CIDASC, aqui representada pelo presidente da empresa, Sr. Vilmar Carelli
e atualmente Dr. Hamilton Ricardo Farias e pelo comitê de Pós–graduação, por ter
aprovado meu projeto de pós-graduação e ter confiado no meu potencial. Com
certeza retornarei um pouco melhor e cheia de vontade de ajudar, de colaborar com
o engrandecimento de nossa empresa. Muito obrigada.
Agradeço a EMBRAPA Suínos e Aves de Concórdia por ter me recebido tão
bem e me oportunizado desenvolver meu projeto de mestrado. Agradecer na pessoa
do chefe geral Dr. Élsio Figueiredo, e em seu nome estender os agradecimentos à
toda a direção e funcionários. Muito obrigada.
Aos meus familiares. Muito obrigada pai, seu Mário Feltrin, meu modelo, e a
você mãe, dona Georgina, que de onde a senhora estiver, tenho certeza está
orgulhosa por nossa conquista. Você foi uma heroína, pena ter ido tão cedo.
Obrigada vó Nenê (dona Maria José), a senhora sempre foi um exemplo. Admiro-a
muito e senti que a senhora e a mãe em muitos momentos estavam comigo, me
apoiando e vibrando nas etapas vencidas.
9
Aos meus irmãos, Rosmary de Fátima (a Fata), Robson José (o Bob), Rosane
Aparecida (a Ane), Ricarda Malena (a Kada), Rosilda Helena (a Zida) e o Renan
André (Renan), nosso meio-irmão e meu afilhado. É de vocês que busco referências.
Obrigada por compartilharem comigo de toda essa história.
E quase por fim, à minha família. José Aníbal, minha outra metade. Marina,
meu anjo da guarda e José Raul, criativo e cheio de pegadinhas, me faz rir com
freqüência. Obrigada! Vocês representam o tudo de bom, o sol do amanhecer, a
chuva do entardecer e a brisa de viver. Vocês simplesmente são tudo para mim.
Ao responsável por tudo isso. O dono de toda obra. Muito obrigada por
permitir que eu faça parte da sintonia universal. De ter encontrado momentos e
pessoas tão maravilhosas. Por ter me mostrado que é na humildade que
encontramos os maiores sábios, que na serenidade se obtém o oceano cheio de
respostas e que todas as qualificações estão exemplificadas na vivência do homem,
o ser racional, com o livre arbítrio.
Obrigada por todo aprendizado, carinho, amor e amizade de todos.
“Se vi mais longe do que os outros, é porque
estava apoiado nos ombros de gigantes”.
ISAAC NEWTON
“Família, a chave de todo o conhecimento!”
Frase de uma criança aos nove anos de idade.
RESUMO
A doença de Aujeszky (DA) é uma enfermidade infecto-contagiosa que causa graves
prejuízos econômicos ao produtor e à agroindústria suinícola. Com o objetivo de
desenvolver insumos e aprimorar tecnologias que sejam mais rápidas, sensíveis e
específicas de diagnóstico para uso em regiões livres ou em erradicação da DA, a
seqüência codificadora da glicoproteína E (gE) do vírus da doença de Aujeszky
(VDA) foi amplificada, clonada e expressada. Através da engenharia genética a
seqüência do gene da gE foi propagada em um organismo hospedeiro. A gE foi
amplificada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) , clonada no
vetor pGem®-T Easy e transformada em células competentes de Escherichia coli,
DH-5α™. O clone obtido foi subclonado no plasmídeo de expressão pFastBac™1, o
qual possui o sítio promotor do gene da poliedrina. O subclone obtido foi analisado
para certificação de sua orientação correta dentro do plasmídeo com as
endonucleases de restrição BamH I e EcoR I. O subclone com a orientação correta
teve seu DNA extraído e usado para a transposição dentro do “bacmid” (baculovírus
recombinante e plasmídeo “helper” em célula competente DH10Bac™). As colônias
com inserto gE foram selecionadas pelo fenótipo da colônia, a qual expressa cor
branca quando clonada. As colônias brancas recombinantes tiveram seu DNA
extraído e usado para a co-transfecção em células do inseto Trichoplusia ni (BTI-
Tn5B1-4). O baculovírus gE-recombinante ao ser inoculado em cultivo celular,
expressou a gE recombinante, comprovada pela técnica de PCR e “Western
blotting”. O baculovírus gE-recombinante contendo apenas o gene da gE do VDA
será utilizado para produção de antígeno e de anticorpos monoclonais, o que
auxiliará no desenvolvimento de um teste de diagnóstico mais sensível, específico e
mais seguro para uso em áreas livres do VDA.
PALAVRAS-CHAVE: Doença de Aujeszky. Glicoproteína E. Baculovírus.
Recombinante.
ABSTRACT
Aujeszky’s disease (AD) is an infect-contagious illness that causes serious
economical damages to the producer and the swine industry. Aiming to develop
mechanisms and to improve technologies that are faster, more sensitive and more
specific for diagnosis and for use in free areas or in AD’s eradication programs, the
sequence codifier of the glycoprotein E (gE) of Aujeszky’s disease virus (ADV) was
amplified, cloned and expressed. Through genetic engineering the sequence of the
gE gene was propagated in an host organism. The gE was amplified by the
technique of polimerase chain reaction (PCR), cloned in the vector pGem®-T Easy
and transformed in competent cells of Escherichia coli, DH-5α™. The clone obtained
was sub-cloned in the expression plasmid pFastBac™1, which contains the promoter
gene of the polyhedrin. The obtained subclone was analyzed inside for certification of
its correct plasmid orientation with the restriction endonucleases BamH I and EcoR I.
The sub-clone with the correct orientation had its DNA extracted and used for
transposition inside the bacmid (recombinant baculovirus and “helper” plasmid with
competent DH10Bac™ cell). Colonies with inserted gE were selected by the
phenotype of the colony, which expresses white color when cloned. White
recombinant colonies had their DNA extracted and used for cotransfection in insect
cells Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4). The recombinant-gE baculovirus was inoculated
in cultured cells and expressed the recombinant gE by PCR and “Western blotting”.
The recombinant-gE baculovirus containing only the gE gene of the VDA will be used
for antigen and monoclonal antibodies production, which will aid in the development
of a more sensitive, specific and safer for the use in VDA free regions.
Key-words: Aujeszky’s disease. Glycoprotein E. Baculovirus. Recombinant.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 - Mapa da organização do genoma VDA.............................................
31
Figura 02 - Nucleocapsídeo típico de herpesvírus…………………......................
32
Figura 03 - Partícula de herpesvírus....................................................................
33
Figura 04 - Representação esquemática do ciclo de replicação do VDA............
35
Figura 05 - Representação esquemática de tipos genômicos do VDA (I, II e III)
com base na migração dos três primeiros fragmentos obtidos com
BamH I..............................................................................................
40
Figura 06 - Cultura de células BTI-Tn5B1-4 infectadas como vírus AcMNPV
selvagem...........................................................................................
44
Figura 07 - Monocamada de cultura celular do inseto BTI-Tn-5B1-4..................
47
Figura 08 - Diferentes fases do ciclo de vida da Trichoplusia ni………………….
48
Figura 09 - Esquema da produção da glicoproteína gE do VDA.........................
53
Figura 10 - DNA genômico do vírus da doença de Aujeszky...............................
80
Figura 11 - DNA genômico do VDA digerido com BamH I...................................
80
Figura 12 - Gel de agarose 0,8% da PCR gE.VDA..............................................
81
Figura 13 - Teste da qualidade e concentração do DNA gE.VDA purificado e
do plasmídeo pGem®-T Easy...........................................................
83
Figura 14 - DNAs da minipreparação da clonagem pGem®-T Easy com a
seqüência codificadora gE do VDA...................................................
84
Figura 15 - Digestão de DNAs plasmideais transformantes com EcoR I ............
86
Figura 16 - Gel de agarose LMP 1% de digestões com EcoR I para recuperar
a seqüência gE.VDA do plasmídeo recombinante pGem-gE.VDA...
87
Figura 17 - Teste da qualidade e da concentração de DNA do fragmento gE.
VDA recuperado e purificado...........................................................
88
Figura 18 - Digestão do DNA gE.VDA com a enzima Bsr I em gel de agarose 2%.
88
Figura 19 - Simulação mapa de restrição da glicoproteína E com os dois
“primers” com sítios de restrição EcoR I e BamH I...........................
89
Figura 20 - Gel de agarose 0,8% de amostras de DNA da miniprepreparação
dos subclones recombinante pFastBac-gE.VDA..............................
90
Figura 21 - Gel de agarose 0,8% do DNA plasmideal recombinante pfastBac-
gE.VDA.............................................................................................
92
Figura 22 - Teste da qualidade e concentração do DNA plasmideal recombi-
nante pFastBac -gE.VDA em gel de agarose 1%.............................
93
Figura 23 - Análise em gel de agarose 0,5% da minipreparação de DNAs
“bacmid” da transposição..................................................................
96
Figura 24 - Gel de agarose das reações da PCR com amostras de DNAs de
colônias da transposição dos plasmídeos recombinantes pFastBac
-gE.VDA com o “bacmid”...................................................................
97
Figura 25 - Células Trichoplusia ni BTI-TN5B1-4 infectadas com o vírus
AcMNPV selvagem..........................................................................
98
Figura 26 - Células Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4 infectadas com o vírus
recombinante bacmid-pFastBac-gE.VDA.........................................
199
Figura 27 - Gel de agarose das reações de PCR com amostras de DNA dos
vírus recombinantes “bacmid” da co-transfecção.............................
100
Figura 28 - Gel SDS-PAGE da co-transfecção dos vírus recombinantes bac-
mid. pFastBac-gE.VDA.....................................................................
101
Figura 29 - “Western blotting” de vírus recombinantes bacmid.pFastBacgE.
VDA da co-transfecção.....................................................................
102
Figura 30 - Gel SDS-PAGE de infecção transiente do vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA............................................................................
103
Figura 31 - “Western blotting” de vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.
VDA da infecção em células de inseto.............................................
104
Figura 32 - “Western blotting” de recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA da
infecção em células de inseto..........................................................
105
Figura 33 - Análise por “Western blotting” do extrato celular da produção de
proteína recombinante gE.VDA em células do inseto BTI-Tn5B1-4
107
15
LISTA DE ABREVIATURAS
α Alfa
aa Aminoácido
AcMNPV Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (baculovírus)
APS Persulfato de amômia
β Beta
bacmid.pFastBac-gE.VDA Vírus recombinante bacmid-plasmídeo com a gE do VDA
BHV-1 Herpesvírus bovino tipo 1
BV “Budded virus” (vírus que brota extracelular)
CIAP “Calf Intestinal Alkaline Phosphatase” (fosfatase alcalina)
cm
2
Centímetro quadrado
D Dálton
DMSO Dimetil sulfóxido de sódio
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Deoxinucleotídeos trifosfatos
D.O. Densidade ótica
ECP Efeito citopático
EDTA Ácido etilediamino tetracético
EHV-1 e 4 Herpesvírus eqüino tipo 1 e 4
ELISA “Enzime Linked Immunosorbent Assay” (Ensaio imunoenzimático)
g Glicoproteína
gD Glicoproteína D
gE Glicoproteína E
gI Glicoproteína I
gM Glicoproteína M
gP I Glicoproteína gP I (antigo nome da gE)
gx Força da gravidade
º Graus
ºC Graus Celsius ou centígrados
HSPG “Heparan Sulfate Proteoglycan” (receptor celular)
HSV-1 Herpes simplex vírus tipo 1
I% Percentagem de inibição
IF Imunofluorescência
Ig Imunoglobulina
IPTG Isopropiltio-β-D-Galactoside
IRS Seqüência Repetida Interna
k Kilo (10
3
)
kbp kilo pares de base
kDa kilo Dáltons
LB Meio de crescimento bacteriano "Luria – Bertani"
LMP “Low Melting Point” (gel de agarose de baixo ponto de aquecimento)
µ Micro (10
-6
)
µg Micrograma
µL Microlitro
m Mili (10
-3
)
17
M Molar ou molaridade (mol/L)
mA miliamperes
mL Mililitro
mM Milimolar
MOI Multiplicidade de infecção
MOPS 3-[N-N orpholino] propanesulfonic acid
η Nano (10
-9
)
nm Namômetro
OB “Occlusion body” (corpo de oclusão = poliedro)
occ Corpos oclusos de poliedro do baculovírus (múltiplos e grandes poliedros)
ORF “Open Reading Frame” (fase aberta de leitura)
OV “Occluded virus” (vírus ocluso: corpos de oclusão poliédricos)
PBS Tampão salina com fosfatos
PCR “Polimerase Chain Reaction” (reação em cadeia da polimerase)
PS “Primer sense” (Iniciador “forward”)
pFastBac-gE.VDA Plasmídeo recombinante de expressão com a gE do VDA
pfu Unidade formadora de placa
pGem-gE.VDA Plasmídeo recombinante de clonagem com a gE do VDA
pH Potencial hidrogeniônico
pmol Picomoles
polh Poliedrina
PA “Primer antisense” (Iniciador reverso)
% Porcentagem
PRV Vírus da pseudo-raiva
qsp Quantidade suficiente para
18
RI Seqüência Repetida Interna (região repetida invertida interna do genoma viral)
RFLP “Restriction Fragment Lenght Polimorfism” (Análise por polimorfismo de
tamanho determinado por perfil de restrição enzimática)
rpm Rotações por minuto
RNA Ácido ribonucléico
RT Seqüência Repetida Terminal (região repetida invertida terminal do genoma viral)
SDS-PAGE Sódio Duodecil Sulfato – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
SFB Soro fetal bovino
SK-6 “Swine Kidney” (células de linhagem, fibroblastos de rim suíno)
SPF “Specific Patogen Free”
Taq “Thermus aquaticus”
TCID
50
Dose infectante para 50% dos cultivos celulares
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
TRS Seqüência Repetida Terminal
U
L
“Unique Long” (região única longa do genoma viral)
U
S
“Unique Short” (região única curta do genoma viral)
UV Ultravioleta
VDA Vírus da doença de Aujezsky
VZV Vírus da varicella-zoster
X-gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside
19
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .................................................................................................
24
1 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................
28
1.1 HERPESVÍRUS...........................................................................................
28
1.2 HERPESVÍRUS SUÍNO TIPO 1 (VDA).......................................................
29
1.2.1 Genoma....................................................................................................
30
1.2.2 Capsídeo..................................................................................................
31
1.2.3.Tegumento...............................................................................................
32
1.2.4 Envelope...................................................................................................
32
1.2.5 Glicoproteínas..........................................................................................
33
1.2.6 Ciclo de replicação do VDA......................................................................
34
1.2.7 Latência....................................................................................................
35
1.3 DETECÇÃO DO AGENTE INFECCIOSO OU DE ANTICORPOS ANTI
VDA.............................................................................................................
36
1.4 CLONAGEM E EXPRESSÃO.....................................................................
41
1.4.1 Baculovírus...............................................................................................
42
1.4.1.1 Infecção e replicação viral.....................................................................
44
1.4.1.2 Expressão gênica em baculovírus.........................................................
44
1.4.1.3 Baculovírus como vetor de expressão..................................................
45
1.4.2 Cultura de células de inseto.....................................................................
47
1.4.3 Poliedrina, promotor e lacZ ....................................................................
48
1.4.4 Plasmídeos e transposons.......................................................................
49
2 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................
53
2.1 CÉLULAS....................................................................................................
54
2.2 AMOSTRAS DE VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY..............................
54
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO VIRAL..................................................
54
2.3.1 Teste da qualidade e quantidade do DNA genômico...............................
55
20
2.4 REAÇÕES EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR).....................................
56
2.4.1 Desenho dos iniciadores da seqüência do gene gE do VDA...................
56
2.4.2 Padronização do protocolo da PCR para amplificar a seqüência
codificadora da gE do VDA......................................................................
56
2.4.2.1 Purificação das reações da PCR que amplificaram a seqüência
codificadora gE do VDA........................................................................
57
2.5 PREPARO DE CÉLULAS COMPETENTES...............................................
57
2.5.1 Preparo de células competentes E. coli DH5α™ com cloreto de cálcio
(CaCl
2
)......................................................................................................
58
2.5.2 Preparo de células competentes E. coli DH5α™ com cloreto de rubídio
(RbCl
2
)......................................................................................................
59
2.6 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DH5α™ – CLONA
GEM E SUBCLONAGEM............................................................................
60
2.6.1 Ligação inserto gE.VDA com o plasmídeo pGem®-T Easy e clonagem
por transformação das células competentes............................................
60
2.6.1.1 Isolamento do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA por mini
preparação............................................................................................
62
2.6.1.2 Análise do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA com enzi-
mas de restrição....................................................................................
63
2.6.1.2.1 Liberação do fragmento gE.VDA do DNA plasmideal recombinante
pGem-gE.VDA....................................................................................
63
2.6.1.2.2 Digestão do fragmento gE.VDA com a endonuclease de restrição
Bsr I e análise eletroforética do fragmento gE digerido......................
64
2.6.2 Subclonagem do fragmento gE.VDA e do plasmídeo de expressão
pFastBac™1….........................................................................................
64
2.6.2.1 Digestão do plasmídeo de expressão pFastBac™1.............................
65
2.6.2.2 Ligação do fragmento gE.VDA com o plasmídeo de expressão pFast-
Bac™1 linearizado e subclonagem por transformação das células
competentes..........................................................................................
65
2.6.2.2.1 Isolamento do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA
por minipreparação............................................................................
66
a) Análise do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA com enzimas
de restrição....................................................................................................
66
2.7 TRANSPOSIÇÃO DO DNA PLASMIDEAL RECOMBINANTE pFAST-
BAC-
gE.VDA COM O BACULOVÍRUS RECOMBINANTE “BACMID”
ATRAVÉS DA TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E.
coli DH10BAC™........................................................................................
67
2.7.1 Transposição do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA por
transformação das células competentes DH10Bac..................................
67
21
2.7.1.1 Seleção dos recombinantes bacmid.pFastBac-
gE.VDA pelo fenótipo
das colônias bacterianas…………………………………………………..
68
2.7.1.2 Isolamento do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA de
colônias bacterianas DH10Bac™ transformadas – Isolamento de
plasmídeos grandes..............................................................................
69
2.7.1.3 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA isolado
de colônias bacterianas DH10Bac™ transformadas.............................
70
2.7.1.3.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA por
eletroforese em gel de agarose.........................................................
70
2.7.1.3.2 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA
pela
técnica da PCR..................................................................................
70
2.8 CO-TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS DE INSETO COM O DNA VIRAL
RECOMBI-NANTE BACMID.pFASTBAC-gE.VDA.....................................
70
2.8.1 Preparo das células do inseto Trichoplusia ni
em placas de
cultivo......................................................................................................
70
2.8.2 Preparo do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA..............
71
2.8.3 Co-
transfecção em células de inseto do DNA recombinante bacmid.
pFast Bac-gE.VDA com lipofectina.........................................................
71
2.8.3.1 Isolamento do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA
das co-transfecções.............................................................................
72
2.8.3.1.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA das
co-transfecções pela técnica de PCR...............................................
73
2.8.4 Infecção de cul
turas celulares de inseto com vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA para avaliação dos níveis de expressão e
tempo de infecção...................................................................................
73
2.8.5 Preparo das amostras de células co-
transfectadas e infectadas com
vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA........................................
74
2.9 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA GLICOPROTEÍNA E POR ELETRO-
FORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-
PAGE) EM
CONDIÇÕES DESNATURANTES.............................................................
74
2.9.1 Preparo dos géis de poliacrilamida..........................................................
75
2.9.2 Análise dos géis de poliacrilamida...........................................................
75
2.9.3 Revelação dos géis..................................................................................
75
2.10 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA GLICOPROTEÍNA E POR “WESTERN
BLOTTING”...............................................................................................
76
2.10.1 Transferência do gel poliacrilamida para membrana de nitrocelulose...
76
2.10.2 “Western blotting”..…………………………………………………………..
76
2.11 PRODUÇÃO DE ESTOQUES VIRAIS......................................................
77
2.11.1 Produção de proteína heteróloga secretada em células do inseto T. ni
77
2.11.2 Produção de estoque do vírus recombinante.........................................
78
22
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................
79
3.1 PRODUÇÃO DE DNA GENÔMICO VDA....................................................
79
3.2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR).......................................
81
3.2.1 Purificação e análise da seqüência gE.VDA amplificada pela PCR.........
82
3.3 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DH5α™ -
CLONAGEM E SUBCLONAGEM DA GLICOPROTEÍNA E DO VDA......
83
3.3.1 Ligação inserto gE.VDA com o plasmídeo pGem®-T Easy e clonagem
por transformação das células competentes............................................
83
3.3.1.1 Análise do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA isolado por
minipreparação......................................................................................
84
3.3.1.2 Análise do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA com
enzima de restrição..............................................................................
85
3.3.1.2.1 Análise do DNA gE.VDA liberado com EcoR I, recuperado em LMP
e purificado........................................................................................
87
3.3.1.2.2 Digestão do fragmento gE.VDA com a enzima de restrição Bsr I......
88
3.3.2. Ligação e subclonagem do gene gE.VDA e do plasmídeo de
expressão pFastBac™1........................................................................
90
3.3.2.1 Análise do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA com
enzimas de restrição............................................................................
91
3.4 TRANSPOSIÇÃO DO DNA PLASMIDEAL RECOMBINANTE pFAST-
BAC-
gE.VDA COM O BACULOVÍRUS RECOMBINANTE “BACMID”
ATRAVÉS DA TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E.
coli DH10BAC™........................................................................................
94
3.4.1 Resultado da seleção dos “bacmid” recombinantes pelo fenótipo das
colônias bacterianas................................................................................
94
3.4.1.1 Isolamento e análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA de colônias bacterianas DH10Bac™ transformadas por
minipreparação de plasmídeos grandes...............................................
95
3.4.1.1.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA por
eletroforese........................................................................................
95
3.4.1.1.2 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA pela
técnica de PCR...................................................................................
96
3.5 CO-TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS DE INSETO COM O DNA
RECOMBINANTE BACMID.pFASTBAC-gE.VDA E EXPRESSÃO DO
GENE HETERÓLOGO..............................................................................
97
3.5.1 Análises dos vírus recombinantes “bacmid” expressos em células de
inseto.......................................................................................................
99
23
3.5.1.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA das
co-transfecções pela técnica de PCR...................................................
100
3.5.1.2 Análises eletroforéticas SDS-PAGE e “Western blotting”
da expressão
da gE.VDA.............................................................................................
101
3.6 Produção de proteína heteróloga secretada em células de inseto.............
107
3.7 Produção de estoques virais.......................................................................
107
CONCLUSÕES.................................................................................................
110
REFERÊNCIAS.................................................................................................
111
ANEXOS...........................................................................................................
123
24
INTRODUÇÃO
A região Sul do Brasil, em particular o Estado de Santa Catarina (SC), é
caracterizada por pequenas propriedades agrícolas. O Estado de SC é
constituído por 293 municípios e representa 1,13% da superfície do território
brasileiro com uma área de 95.318,3 km
2
(ICEPA, 2006). De acordo com o IBGE,
em 2000 o estado possuía uma população de 5.333.284 habitantes, dos quais
aproximadamente 21% (~1.119.989 habitantes) viviam no campo (IBGE, 2006).
Conforme levantamento agropecuário de Santa Catarina (LAC, 2003)
realizado entre o período de 01/09/2002 e 31/08/2003, o Estado de SC possui um
total de 230.157 estabelecimentos agrícolas, dos quais 54.730 são
estabelecimentos suinícolas com um total de 5.579.975 suínos. A suinocultura
catarinense possui o melhor nível de produtividade do país, tanto no campo como
na indústria e está concentrada, principalmente, no Meio Oeste e Oeste
catarinense (SANDRIN, 2000).
Ainda segundo o instituto CEPA (2006), no ano de 2005, o Estado de SC
foi responsável por 24,3% da produção de carne suína no Brasil e, quanto à
formação do valor bruto da produção agropecuária estadual, a suinocultura é a
segunda principal atividade econômica, com 19% do total. Emprega diretamente
em torno de 65 mil e, indiretamente, mais de 140 mil pessoas. A região Oeste do
estado concentra 70% do rebanho e 90% da produção suinícola (ICEPA, 2006).
O crescimento mundial e a modernização da indústria suinícola nas últimas
duas décadas evidenciam a necessidade de uma maior e mais detalhada atenção
no que diz respeito à saúde dos plantéis (SESTI, 2003).
Coincidentemente com o incremento do uso da prática de confinamento na
produção de suínos, a doença de Aujeszky (DA) tem sido uma das mais
significativas enfermidades infecciosas, que freqüentemente afetam a produção
mundial de suínos (OSÓRIO, 2001).
25
A DA é uma doença infecto-contagiosa causada por um herpesvírus que
causa graves prejuízos econômicos ao produtor e à agroindústria (ROMERO et
al., 1989; TOOD e McFERRAN, 1985). A significância econômica da DA baseia-
se, sobretudo, nas perdas por transtornos reprodutivos; mortalidade, geralmente
de 100%, de leitões recém-nascidos; transtornos respiratórios em animais da
terminação, levando, geralmente à infecções secundárias; estabelecimento de
latência em suínos (KLUGE et al., 1999; METTENLEITER, 2000), o que dificulta
seu controle. As granjas registradas com diagnóstico da infecção perdem a
certificação para a venda de reprodutores e de material genético (sêmen e
embriões) e a DA impõe restrições às exportações (ZANELLA, 2002). A DA está
classificada junto ao Código Zoosanitário da Oficina Internacional de Epizootias
(O.I.E., 2006), e a sua notificação é compulsória.
No Brasil, o primeiro relato da DA data de 1912 (CARINI e MACIEL, 1912)
em gado bovino e, em Santa Catarina desde 1983 em suínos (ROMERO et al.,
1984). Segundo Sandrin (2000), após os primeiros focos da DA em SC, adotou-
se como forma de controle da doença somente o uso de vacinação dos plantéis
suínos diagnosticados com a doença, sem adotar outras medidas sanitárias para
evitar a difusão do vírus. A ausência de programas formais de erradicação
aumenta a incidência da doença, gastos com vacinações por tempo indefinido e
mortes de outras espécies domésticas que vêm a se infectar. O impacto
econômico anual da DA sobre a atividade suinícola estadual foi estimado, no ano
de 2001, em R$ 931.224,00 (ZANELLA, 2002).
Até o ano de 2000, existiam oficialmente em SC, cerca de 110
propriedades suinícolas diagnosticadas infectadas e/ou que usavam vacina para
controlar a DA (ZANELLA, 2002). Desde abril de 2001, sob a coordenação da
Embrapa Suínos e Aves em parceria com a Secretaria Estadual da Agricultura e
do Desenvolvimento Rural de SC, CIDASC (Companhia Integrada de
Desenvolvimento Agrícola de SC), Sindicarnes-SC (Sindicato das Indústrias de
Carnes e Derivados), ACCS (Associação Catarinense de Criadores de Suínos) e
Secretaria Estadual de Defesa Agropecuária do MAPA, teve início um programa
com o objetivo de erradicar a DA do rebanho suinícola catarinense (MORÉS et
al., 2005). A estratégia global do programa de erradicação foi atuar inicialmente
nas propriedades anteriormente identificadas. Posteriormente, rebanhos cujas
informações epidemiológicas indicavam a possibilidade de estarem infectados,
26
rebanhos onde a rastreabilidade indicou aquisição de animais de granjas
infectadas e rebanhos localizados num raio de 2500 metros de um rebanho com
surto da doença, também foram amostrados sorologicamente. Além da sorologia,
medidas de biosseguridade e controle da doença foram adotadas, conforme
preconizado no programa de erradicação. Como resultado preliminar dos
trabalhos desenvolvidos pelo programa de erradicação da DA, o último caso de
infecção pelo VDA, em SC, ocorreu em julho de 2004 (MORÉS, 2005).
A vacina para DA aprovada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA) desde 1995 para uso no Brasil, é uma vacina inativada
com uma deleção de todo o gene que codifica a glicoproteína E (gE) do vírus da
DA (VDA). Isto permite identificar e diferenciar animais infectados com vírus de
campo daqueles vacinados com esta vacina, através de um teste ELISA
diferencial para a glicoproteína gE.
Os testes sorológicos de ELISA são necessários para monitorar, controlar
ou detectar infecções suínas (TOMA, MOUTOU e FORTIER, 1979). Para tanto, é
necessário dispor de testes para a detecção de anticorpos contra o VDA que
sejam específicos, realizados em série e de rápida execução na obtenção do
resultado (TOMA, MOUTOU e FORTIER, 1979) visando auxiliar os programas de
controle e erradicação da DA em suínos.
Uma ferramenta que vem sendo atualmente empregada para se obter
bons testes de diagnóstico é a biologia molecular. Uma vantagem destas técnicas
é poder trabalhar com apenas partes não essenciais de microorganismos
patógenos. Uma característica importante da manipulação genética é poder
propagar moléculas de ácido nucléico de um determinado organismo em um
outro hospedeiro diferente através da habilidade de atravessar as barreiras
naturais da espécie (WOLD e PRINROSE, 1991).
Os baculovírus são, atualmente, as viroses de inseto mais estudadas
devido à sua utilização como agente de controle biológico e como vetor para
expressão de genes heterólogos (RIBEIRO, 2004). Através das técnicas de
clonagem, é possível inserir partes de interesse de um DNA em um organismo
hospedeiro e ligá-lo a um vetor de expressão. Um desses exemplos é o
baculovírus recombinante, que ao ser inoculado em cultivo celular, expressará o
produto de interesse inserido no vírus (LUCKOW et al., 1993).
27
Objetiva-se amplificar, clonar e expressar a proteína recombinante do vírus
da DA, utilizando o sistema de baculovírus recombinante para que possa ser
utilizado em programas de controle e erradicação da DA em suínos. Ao utilizar
somente uma porção do VDA, uma glicoproteína não essencial para a replicação
viral em cultura celular (KLUGE et al., 1999; SPEAR, 1993; ZUCKERMANN,
1988), obtêm-se um antígeno direcionado à anticorpos anti-VDA com grande
especificidade e sensibilidade.
Através desta ferramenta, áreas livres de determinados agentes patógenos
poderão usar produtos/insumos oriundos da engenharia genética, que contenham
apenas partes do agente infeccioso de interesse, sem por em risco a região ou
país quanto a biosseguridade, uma vez que não se manipulará o agente
infeccioso.
28
1 REVISÃO DE LITERATURA
1.1 HERPESVÍRUS
Os herpesvírus são membros da família Herpesviridae e estão
amplamente disseminados na natureza (FENNER et al., 1993). Possuem um
genoma de fita dupla de DNA, tamanho do vírion e a estrutura (capsídeo,
tegumento e envelope) semelhantes entre si e sofrem uma fase latente em seu
ciclo de vida (ROIZMAN e SEARS, 1991).
A família Herpesviridae tem uma extraordinária diversidade biológica e
com base em suas propriedades biológicas, na organização e conteúdo
genômico a maioria dos herpesvírus pode ser subdividido em três principais
subfamílias Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae
(MINSON et al., 2000; ROIZMAN, 1991) em conformidade com o Comitê
Internacional de Taxonomia Viral (ICTV, 2006). Essas subfamílias diferem no tipo
celular onde a latência é estabelecida e na duração do seu ciclo produtivo de
replicação.
Os membros da subfamília Alphaherpesvirinae têm um maior número de
hospedeiros, tendem a se reproduzir rapidamente com efeitos citopáticos e
produzir partículas virais em poucas horas. Além disso, podem estabelecer
latência nos gânglios nervosos próximos à região infectada (ROIZMAN, 1991) e
em neurônios (KLUGE et al., 1999; METTENLEITER, 2000). Os membros da
subfamília Betaherpesvirinae estão restritos a um espectro menor de hospedeiros
em relação aos da subfamília Alfaherpesvirinae e possuem um ciclo longo de
replicação (ROIZMAN, 1991). Os membros da subfamília Gamaherpesvirinae
estão limitados à família ou ordem a que seus hospedeiros naturais pertencem e
a latência viral é freqüentemente demonstrada em tecido linfóide (ROIZMAN,
1991).
Apesar da homologia significativa do VDA com os alfaherpesvírus humano
e do grande número de hospedeiros, o VDA não é transmitido ao homem. Os
29
raros relatos de VDA humano não foram substanciais e refletem, provavelmente,
uma baixa reação cruzada de anticorpos anti-gB do HSV-1 com anticorpos anti-
gB do VDA (ROBBINS, et al., 1987).
1.2 HERPESVÍRUS SUÍNO TIPO 1 (VDA)
O vírus da doença de Aujeszky (VDA), também denominado de vírus da
pseudo-raiva (PRV), ou herpesvírus suíno tipo 1 (POMERANZ, REYNOLDS e
HENGARTNER, 2005) é o agente patogênico da DA e pertence à família
Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicelovirus. Os
Alfaherpesvírus são vírus DNA de cadeia dupla, com envelope, e que possuem
várias propriedades biológicas em comum. Infectam várias espécies animais,
replicam rápido e liticamente em células de cultivos celulares, possuem
neurotropismo e estabelecem infecções latentes em gânglios do sistema nervoso
periférico e em outros tecidos nervosos (KLUGE et al., 1999; METTENLEITER,
2000; ROIZMAN, 1991). O sítio predominante da infecção latente é o gânglio
trigeminal (POMERANZ, REYNOLDS e HENGARTNER, 2005).
A DA é uma doença de grande impacto econômico sobre a produção de
suínos por causar inúmeros sinais clínicos, incluindo transtornos reprodutivos,
respiratórios e do sistema nervoso central (KLUGE et al., 1999; METTENLEITER,
2000), causando alta mortalidade de leitões, com estabelecimento de infecção
latente em suínos e recorrência viral (KLUGE et al., 1999), levando à restrição na
movimentação de animais destinados à reprodução (ROMERO et al., 1989).
Enquanto esforços para erradicar o VDA nos Estados Unidos e na Europa
mostram grande progresso, este patógeno ainda é um problema endêmico em
muitos países (POMERANZ, REYNOLDS e HENGARTNER, 2005).
O genoma dos alfaherpesvírus codifica vários produtos, entre os quais
algumas glicoproteínas do envelope que não são essenciais para replicação do
vírus em cultivo celular (METTENLEITER, 2002; SPEAR e LONGNECKER,
2003). Uma vez que o VDA pode causar infecção latente em suínos, o
desenvolvimento de sorologias marcadas, que possam ser usadas para
diferenciar animais vacinados dos infectados com o vírus selvagem, deve ser
considerada importante no estabelecimento do modelo de vacina para a DA
30
(ELIOT et al., 1989, KIT e KIT, 1991; VAN OIRSCHOT et al., 1990). Portanto, a
base das vacinas diferenciais consiste na inativação ou deleção de um gene que
codifica uma glicoproteína não essencial, e o uso desse vírus mutante como
vacina (KIT e KIT, 1991). A engenharia genética permitiu que um ou mais genes
de glicoproteínas não essenciais fossem construídos e aplicados na produção de
vacinas (PENSAERT et al., 1992).
1.2.1 Genoma
O genoma de VDA é constituído por uma molécula de DNA dupla-fita, com
143.461 nucleotídeos (143,461Kpb), 72 ORF (“Open Reading Frame”) homólogas
com alfaherpesvírus relacionados (KLUPP et al., 2004).
As 72 ORFs codificam 70 diferentes proteínas, pois os genes que
codificam as proteínas IE180 e US1 são encontrados duas vezes: uma vez na
seqüência repetida interna (RI) e outra na seqüência repetida terminal (RT). Todo
o genoma do VDA foi seqüenciado usando fragmentos de seqüências
provenientes de seis diferentes cepas. As cepas foram sempre seqüenciadas e
identificadas, tendo como base principal, a sua homologia com os genes
encontrados em outros alfaherpesvírus (KLUPP et al., 2004). Aproximadamente
metade dos genes alfaherpesvírus são considerados como não essenciais, isto é,
são dispensáveis para a replicação viral, pelo menos em cultura de células
(METTENLEITER, 2000; SPEAR e LONGNECKER, 2003).
O DNA viral possui uma alta taxa de nucleotídeos guanina (G) e de
citosina (C) em torno de 73%. O genoma do VDA é semelhante em arranjo
genômico ao EHV-1, BHV-1 e VZV, formado por um único segmento longo (U
L
) e
uma região única curta (U
S
). A região U
S
é flanqueada por duas seqüências
complementares repetidas invertidas, resultando na formação de dois possíveis
isômeros do genoma VDA com orientação oposta à região U
S
(FENNER et al.,
1993; KLUPP et al., 2004; METTENLEITER, 2000), conforme demonstrado na
figura 1, que mostra também a localização da gE na região U
S
, no fragmento 7
(BRACK et al., 2000 ). A seqüência e a disposição dos genes no genoma do
VDA são conhecidas e já está estabelecido um mapa da provável organização da
transcrição, apoiado por dados experimentais (KLUPP et al., 2004).
31
Figura 1 – Mapa da organização do genoma VDA. A) Diagrama esquemático do genoma VDA: a
seqüência única longa (U
L
) e a seqüência única curta (U
S
), as seqüências repetidas
invertidas interna (RI) e terminal (RT). B) Mapa dos fragmentos liberados com enzima
de restrição BamH I. C) Ampliação do fragmento 7 BamH I localizado na seqüência
U
S
, com sítios de clivagem importantes: ß) BamH I; St) StuI; Sp) SphI).
Fonte: Brack et al., 2000 (Adaptado).
1.2.2 Capsídeo
O VDA possui um capsídeo bem definido icosaédrico de aproximadamente
100 nm de diâmetro, composto de 162 capsômeros. O capsídeo contém e
protege o genoma viral e quando fora da célula está sempre envolvido pelo
tegumento e pelo envelope viral. O genoma do vírus no capsômero é de
aproximadamente 75 nm de diâmetro e o capsídeo é circundado por um envelope
“solto” com um diâmetro de aproximadamente 150-200 nm (LARSKI, 1980). A
figura 2 apresenta um modelo digitalizado de um nucleocapsídeo típico dos
herpesvírus.
32
Figura 2 – Nucleocapsídeo típico de herpesvírus. Detalhe digitalizado de um penta-peplômero
axial, cercado por hexa-peplômeros.
Fonte: Zhou et al., 1999.
1.2.3 Tegumento
A camada de tegumento do VDA (Figura 3) é uma estrutura eletrondensa
amorfa que preenche o espaço entre o capsídeo e a membrana do envelope de
partículas maduras de herpesvírus (ROIZMAN, 1991). As proteínas do tegumento
têm papel importante durante a entrada e a morfogênese do vírion
(METTENLEITER, 2002).
1.2.4 Envelope
Os vírus envelopados possuem uma capa protéica envolvida por uma
camada dupla lipídica (Figura 3). O envelope contém proteínas que permitem que
o vírus se ligue nas células e que auxiliam a sua entrada nas mesmas. A
membrana lipídica é adquirida quando o vírus é liberado da célula por um
processo de brotamento da membrana plasmática, levando um pouco desta
membrana junto (ALBERTS et al., 1999). No curso da passagem através da
membrana nuclear da célula hospedeira, o vírus recebe seu envelope primário. O
envelope determina a virulência do vírus e o protege contra a ação de anticorpos
específicos devido à relação antigênica em questão (LARSKI, 1980).
33
Figura 3 – Partícula de herpesvírus. N) nucleocapsídeo; T) tegumento; E) envelope; G)
glicoproteínas.
Fonte: Stannard, 2003.
1.2.5 Glicoproteínas
As glicoproteínas dos herpesvírus são encontradas em grande quantidade
em todas as membranas das células infectadas, assim como no envelope viral.
As glicoproteínas formam protusões ou espículas no envelope viral, que nos
herpesvírus são mais curtas e em maior número do que aquelas que aparecem
nas superfícies de outros vírus envelopados (ROIZMAN, 1991). Essas proteínas
de membrana desempenham funções vitais no processo de infecção viral,
mediando os processos de reconhecimento e adsorção das células do
hospedeiro, penetração do vírion, fusão e disseminação do vírus célula-a-célula
em cultivos celulares (POMERANZ, REYNOLDS e HENGARTNER, 2005). As
proteínas também modulam a resposta imune e promovem a formação de
sincício. Devido à sua localização na superfície do envelope viral e nas
membranas das células infectadas, as glicoproteínas são o principal alvo do
sistema imune do hospedeiro em resposta à infecção (TODD, HULL e McNAIR,
1987).
O genoma do VDA codifica 16 proteínas de membrana e onze dessas
proteínas, durante sua passagem pelo trans Golgi, são modificadas por
glicosilação N- ou O-ligado por adição de cadeias laterais de açucares e, então,
denominadas de glicoproteínas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL, gM e gN
(METTENLEITER, 2000), com peso molecular entre 50 kDa a 130 kDa (HAMPL,
1984). Quatro proteínas adicionais trans-membrana que não são glicosiladas
(UL20, UL43, US9 e provavelmente UL24) são encontradas no envelope viral
G
E
T
N
34
(FUCHS et al., 2002; KLUPP, GRANZOW e METTENLEITER, 2000) e a UL34,
uma proteína de membrana encontrada no envelope primário do vírion. Durante a
entrada, as glicoproteínas gC, gB, gD, gH e gL são responsáveis pela fixação à
superfície da célula hospedeira e a subseqüente fusão do envelope viral com a
membrana plasmática (FAVOREEL et al., 1997; HAMPL, et al., 1984). As
glicoproteínas gH, gL, gM, gN, gE e gI, interagem genicamente formando os
complexos não-cavalentes: gH/gL, gMgN e gE/gI (METTENLEITER, 2002).
Zuckermann et al. (1988) e Whealy et al. (1993) relataram que a
glicoproteína E (gE) do VDA forma uma ligação complexa não-covalente com a
glicoproteína I (gI), e que este complexo é uma entidade funcional e importante
para a correta apresentação dos descontínuos epítopos imunodominantes na gE.
O complexo antigênico gE/gI é mais bem reconhecido pelo anticorpo monoclonal
que o antígeno gE sozinho (JACOBS et al., 1995 apud GUT et al., 1999).
A nomenclatura padrão das glicoproteínas de envelope do VDA e do HSV
foi adaptada no ano de 1993, durante o “18
th
International Hespesvirus
Workshop”. Trabalhos publicados antes do ano de 1995, nominavam as
glicoproteínas gB, gC, gD, gE, gG e gI do VDA como gII, gIII, gp50, gI, gX e
gp63, respectivamente.
1.2.6 Ciclo de replicação do VDA
O ciclo de replicação viral do VDA inicia com a ligação entre a gC do
envelope viral e receptores heparina sulfato proteoglicanos (HSPG) na superfície
celular. Os próximos passos de entrada requerem as glicoproteínas de envelope
gD, gB, gH, e gL. Depois da fusão do envelope do vírion com a membrana
celular, as proteínas do capsídeo e do tegumento são liberadas dentro da célula.
As proteínas virais do tegumento começam a tomar a síntese protéica da
maquinaria celular hospedeira imediatamente após entrarem na célula
(METTENLEITER, 2000; POMERANZ, REYNOLDS e HENGARTNER, 2005). O
capsídeo e as proteínas internas, firmemente ligadas ao tegumento, são
transportados ao longo de microtúbulos para o núcleo da célula (SODEIK,
EBERSOLD e HELENIUS, 1997). A figura 4 apresenta a esquematização do
ciclo de replicação do VDA.
35
Figura 4 – Representação esquemática do ciclo de replicação do VDA.
Fonte: Pomeranz, Reynolds e Hengartner, 2005.
1.2.7 Latência
Membros da subfamília Alphaherpesvirinae podem estabelecer infecções
latentes em gânglios nervosos, onde o DNA viral pode persistir em forma
epissomal (não integrado ao DNA do genoma da célula) nos núcleos das células
Binding
gC
36
infectadas. Portanto, animais com infecção latente servem de reservatório natural
para o vírus durante toda a vida do animal e são um fator constante de risco de
ocorrer uma reativação e liberação viral e a conseqüente disseminação do vírus
para uma população susceptível. A latência é definida como um status no qual o
DNA viral persiste, mas a infecção viral não é produzida (METTENLEITER,
2000).
Segundo Mettenleiter (2000) e Pomeranz, Reynolds e Hengartner (2005),
durante a infecção aguda, partículas virais do VDA replicam primeiro nos tecidos
epiteliais da mucosa orofaringeana e então entram diretamente nos terminais
nervosos do nervo sensorial da região infectada. Após a primeira replicação no
epitélio, a progênie viral é produzida abundantemente levando a um incremento
da infecção primária dos neurônios. Os principais sítios de latência do VDA são o
gânglio trigeminal, o bulbo olfatório e a tonsila. Nesses órgãos, o DNA viral pode
ser detectado mesmo na ausência de uma infecção viral produtiva e transcritos
associados à latência (LAT -“latency asociated transcripts”) podem ser
demonstrados por PCR (METTENLEITER, 2000). Portanto, durante a latência, a
expressão do gene viral fica restrita à transcrição de uma parte distinta do
genoma viral, denominada LAT.
O vírus pode ser reativado e liberado de animais com infecção latente após
serem submetidos a fatores estressantes. Esses fatores incluem transporte,
condições precárias de criação, outras enfermidades concomitantes, partos,
trocas na dieta, condições extremas e variáveis de temperatura e umidade,
tratamento com agentes imunossupressivos (corticosteróides), sendo um dos
fatores responsáveis pela perpetuação e transmissão do vírus no rebanho
(KLUGE et al., 1999; ROIZMAN, 1991). Ao final do processo de reativação, o
vírion é transportado através dos axônios ao local onde ocorreu a infecção
original.
1.3 DETECÇÃO DO AGENTE INFECCIOSO OU DE ANTICORPOS ANTI VDA
A identificação de antígenos virais para a DA pode ser realizada de
secreções ou tecidos de animais infectados por imunofluorescência direta, imuno-
histoquímica, isolamento do vírus em cultivos celulares ou através de métodos
37
moleculares de diagnóstico. O isolamento viral é a técnica padrão para a
detecção do VDA (ROMERO et al., 1986). Para sua execução, suspensões de
tecidos ou secreções são colocadas sobre cultivos de células, as quais podem
ser cultivos primários ou linhagens celulares contínuas. Após um período variável
de incubação, a presença do vírus é detectada pelo efeito citopático (ECP)
causado nas células do cultivo (ROMERO et al., 1986).
A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) promove a
amplificação de uma região selecionada da molécula de interesse do DNA.
Qualquer região da molécula pode ser selecionada, contanto que as seqüências
das bordas da região sejam conhecidas (ALBERTS, et al., 1999; PASSAGLIA e
ZAHA, 1996). Apresenta como vantagem a possibilidade de alcançar altos
índices de sensibilidade e especificidade, além da rapidez de execução
(ALBERTS, et al., 1999; PASSAGLIA e ZAHA, 1996; WOLD e PRINROSE,
1991). Nesse caso, podem ser utilizados tanto tecidos como secreções para a
extração do DNA viral.
Uma técnica usada para visualizar e quantificar proteínas e DNAs é a
eletroforese em gel. Moléculas de DNA têm carga negativa, e sob uma corrente
elétrica, as moléculas de DNA migram através do gel a uma razão que dependerá
do tamanho do DNA. Uma molécula pequena de DNA poderá atravessar/passar
através do gel facilmente e, portanto migrar mais facilmente que as moléculas
maiores (WOLD e PRINROSE, 1991). Ainda, segundo Wold e Prinrose (1991), o
gel de eletroforese não é somente usado como um método analítico, mas
também para purificar fragmentos específicos de DNA. O gel é composto por
acrilamida ou agarose. O uso da agarose é conveniente para separar fragmentos
de DNA que podem variar de tamanho desde poucas centenas a 20 kb, enquanto
que para fragmentos pequenos de DNA, é preferível utilizar a acrilamida.
A análise genômica com enzimas de restrição é um tipo de análise voltada
para a caracterização genômica de amostras virais já isoladas. Após a
multiplicação viral em cultivo celular, o DNA da amostra viral é extraído e
posteriormente clivado com enzimas de restrição. A análise dos fragmentos do
DNA digerido é feita por eletroforese em gel de agarose e revelado com brometo
de etídeo (GIELKENS e BERNS, 1982).
Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição reconhecem uma
seqüência de bases específicas na dupla-hélice do DNA e cortam as duas fitas
38
da hélice em lugares determinados (BEN-PORAT et al., 1984; PASSAGLIA e
ZAHA, 1996). São enzimas indispensáveis na análise da estrutura dos
cromossomos, no sequenciamento de moléculas longas de DNA, no isolamento
de genes e na criação de moléculas novas de DNA que podem ser clonadas
(PASSAGLIA e ZAHA, 1996). O número e tamanho do fragmento gerado de
populações diferentes de moléculas fornecem informações sobre a constituição
genética das mesmas. Assim, se a clivagem do DNA de duas cepas diferentes de
vírus por uma determinada enzima gerar fragmentos que diferem no seu número
e tamanhos, confirma-se a existência de heterogeneidade genética entre essas
cepas. Estas diferenças são úteis em estudos epidemiológicos (BEN-PORAT et
al., 1984).
Análises do genoma de vários isolados de VDA recuperados de diferentes
casos epidemiológicos demonstraram que seus padrões de fragmentos de
restrição são diferentes. Essas diferenças no padrão de migração podem ser
devidas a uma perda dos sítios de clivagem (gerando fusão de fragmentos),
deleção ou inserção de seqüências de nucleotídeos (gerando assim fragmentos
maiores ou menores) ou translocação de seqüências de uma região do genoma
para outra (mudando, assim, também o tamanho do fragmento) (BEN-PORAT et
al., 1984). Ficinska et al. (2003), caracterizaram cepas do VDA com virulência
reduzida, com mutações na região única curta (U
S
), focando principalmente os
genes gE e gI e, detectaram que o peso molecular da gE e/ou gI, podem variar
entre as cepas do VDA.
A localização genômica dos principais fragmentos de DNA gerados pelas
enzimas de restrição BamH I e Kpn I foram descritas por Ben-Porat, Rixon e
Blakenship (1979) e Rixon e Ben-Porat (1979), os quais publicaram o mapa físico
dos sítios de clivagem usando uma cepa do VDA.
Herrmann, Heppner e Ludwig (1984), analisaram 150 isolados, obtidos de
diferentes partes do mundo. As cepas dos vírus VDA usadas neste estudo
podem ser claramente agrupadas em 4 tipos principais de genoma (grupos I a
IV), usando como enzima discriminatória a BamH I. O padrão DNA de quatro
cepas vacinais foi ligeiramente diferente das cepas selvagens e baseado no
mapa genômico do VDA, as cepas Bartha e Dessau, indicam ter uma deleção na
região U
S
do genoma.
39
Os resultados obtidos por Herrmann, Heppner e Ludwig (1984) mostraram
que os quatro tipos de genomas são correlatos com certas áreas geográficas. Os
vírus do grupo I são similares ou idênticos com o padrão de DNA BamH I
publicado por Rixon e Ben-Porat (1979). As cepas do grupo II não possuem o
fragmento número 2 do grupo I, mas possuem dois novos fragmentos acima e
abaixo do fragmento 4. Esses dois grupos representam vírus encontrados na
Europa Central (Alemanha e Bélgica). A freqüência do genoma tipo II junto com
seus variantes foi de aproximadamente 75% em todos os isolados. O Grupo III
(genoma tipo III) e IV (genoma tipo IV) são estritamente limitados aos isolados
originários do Norte Europeu (Dinamarca e Suécia) e Tailândia, respectivamente.
O grupo III difere ligeiramente do grupo I, quando analisado com Bam HI, mas foi
bem distinto no padrão de digestão com BstE II. O Grupo genômico IV, porém,
diferiu amplamente na distribuição dos sítios de clivagem com ambas as enzimas
(HERMANN et al., 1984).
Muitos outros estudos com endonucleases têm sido conduzidos ou para
análise do DNA após várias passagens em cultura celular ou animais
(MENGELING et al., 1983; WATHEN e PIRTLE, 1984) ou para comparar DNAs
virais de diferentes regiões ou países (CHRISTENSEN, SOERENSEN e LEI,
1987; PIATTI et al., 2001; SCHAEFER et al., 2005; TODD e McFERRAN, 1985).
No Brasil, um trabalho que analisou o perfil de restrição com BamH I de 30
amostras isoladas do VDA, dentre os anos de 1982 a 1996, de diferentes regiões
do país, encontrou 28 amostras com perfil genômico do grupo II e somente duas
amostras do grupo I (PIATTI et al., 2001). Recentemente, Schaefer e
colaboradores (2005) analisaram através da digestão com BamH I, 38 amostras
de DNA genômico de isolados VDA dos últimos 20 anos (1983 a 2003)
provenientes da região Sul do Brasil. Trinta e seis amostras de DNA
apresentaram perfil grupo II e somente duas do grupo I.
O padrão de migração dos primeiros três fragmentos pode ser usado para
tipificar o genoma das cepas de VDA (Figura 5). O tipo genômico II tem um sítio
de clivagem extra no fragmento 2, o qual leva ao aparecimento de dois novos
fragmentos 2a e 2b, situados abaixo do fragmento 3 (não mostrado). O genoma
tipo III não tem um sítio de restrição entre os fragmentos 2 e 9, com o
aparecimento de um fragmento (2 + 9) exatamente abaixo do fragmento 1.
40
Figura 5 – Representação esquemática de tipos genômicos do VDA (I, II e III) com base na
migração dos três primeiros fragmentos obtidos com BamH I.
Fonte: Piatti et al., 2001.
Inúmeros testes sorológicos laboratoriais podem ser conduzidos para
detectar anticorpos anti-VDA. Este tipo de diagnóstico pode ser realizado através
de técnicas como a imunoperoxidase, imunofluorescência, soroneutralização
(SN) e ensaios imunoenzimáticos. A SN é considerada a técnica padrão para
detecção de anticorpos neutralizantes contra VDA (ROMERO et al., 1986).
Entretanto, é uma técnica trabalhosa dependente da existência de um estoque de
vírus e de cultivos celulares adequados. O resultado da prova é usualmente
obtido em três a cinco dias e a SN não permite uma diferenciação precisa entre
animais infectados com vírus de campo de animais vacinados contra o VDA.
Os testes imunoenzimáticos do tipo ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay) são muito utilizados atualmente, devido à sua alta sensibilidade,
especificidade, capacidade de processamento de grande número de amostras,
relativa facilidade e rapidez de execução e, geralmente, os resultados de provas
tipo ELISA, podem ser quantificados através do uso do espectrofotômetro (VAN
OIRSCHOT, 1989).
Entretanto, o uso maciço de vacinas para a DA em rebanhos suinícolas
tem demandado a necessidade de ELISAs diferenciais. Atualmente, tem-se um
número muito grande de referências documentadas sobre a técnica de ELISA
“screening” e diferencial para glicoproteínas E. O desenvolvimento de testes
ELISA diferenciais com bons níveis de sensibilidade e especificidade tem sido
relatados (DEA et al., 2000; ELIOT et al., 1989; GUT et al., 1999; KINKER et al.,
1997; STEGEMAN et al., 1997).
41
Segundo Gut et al. (1999), o sucesso de um programa de controle e
erradicação utilizando vacinas gene-deletadas para a glicoproteína gE do VDA
com testes sorológicos diferenciais depende da habilidade do teste diferencial em
detectar, com precisão, suínos infectados, uma vez que, a diferenciação entre
suínos infectados e vacinados para a DA é muito importante para o controle da
doença em países que praticam a vacinação (VAN OIRSCHOT e OEI, 1989).
Com o surgimento da cepa VDA Bartha, com uma deleção natural do gene
gE, Van Oirschot e Oei (1989) desenvolveram um teste sorológico que permitia
distinguir animais vacinados (sem anticorpos anti-gE mas com anticorpos contra
outras glicoproteínas do VDA) dos animais com anticorpos anti-gE (infectados
com vírus selvagem). A partir de então, o conceito de “vacinas marcadas” surgiu
e o sucesso de seu uso nos programas de erradicação contribuiu para reforçar
este conceito (METTENLEITER, 2000).
Com o advento da engenharia genética, testes de diagnóstico podem ser
melhorados sob o aspecto de sensibilidade e especificidade e quanto a não
difusão de organismos patogênicos, pois a engenharia genética permite
manipular apenas partes antigênicas específicas, garantindo maior sensibilidade
antígeno-anticorpo e inocuidade quanto a infectividade viral (WOLD e
PRINROSE, 1991). Atualmente, vários trabalhos com organismos recombinantes
expressando proteínas virais têm sido publicados (ESHAGHI et al., 2004; GUT et
al., 1999; JARVIS, HOWE e AUMILLER, 2001; KIMMAN et al., 1996;
MORENKOV et al., 1997).
1.4 CLONAGEM E EXPRESSÃO
Segundo Passaglia e Zaha (1996), a técnica principal na tecnologia do
DNA recombinante é o isolamento e a propagação de moléculas idênticas de
DNA em um organismo hospedeiro. Esta técnica, clonagem molecular, se baseia
em dois estágios. Primeiro uma molécula de DNA recombinante é gerada pela
ligação de um inserto de DNA, oriundo da clivagem (digestão) do DNA de
interesse e de uma outra molécula de DNA, denominada de vetor de clonagem,
geralmente um plasmídeo. O segundo passo, se dá quando a molécula
recombinante (inserto e vetor ligados) é introduzida para dentro de uma célula
42
hospedeira, onde poderá se replicar. O processo de introdução de DNA em
células é chamado de transformação.
Plasmídeos são moléculas de DNA circular, de fita dupla,
extracromossômicos, que existem naturalmente em bactérias e em alguns
organismos eucariotos unicelulares, como as leveduras. Possuem capacidade de
replicação autônoma e freqüentemente, transportam genes que conferem
resistência a antibióticos (PASSAGLIA e ZAHA, 1996), o que permite distinguir
células hospedeiras que receberam o inserto com o vetor plasmideal daquelas
que não receberam.
Quando se tem a confirmação da presença do inserto de interesse na
célula hospedeira, o produto pode ser co-cultivado com um vírus (selvagem ou
recombinante) em cultura celular, através do processo denominado de co-
transfecção. A co-transfecção ocorre quando dois ou mais produtos são
inoculados conjuntamente para gerar um só produto final (PASSAGLIA e ZAHA,
1996; O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992).
Segundo O’Reilly, Miller e Luckow (1992), após a co-transfecção, o
produto é purificado em placa de cultivo celular, e a glicoproteína expressa
(baculovírus em células do inseto) poderá ser identificada sob vários métodos,
incluindo triagem visual, por hibridização do DNA, amplificação por PCR,
imunodetecção e teste da atividade enzimática (enzimas de restrição) do produto
gênico expresso. Após confirmar a identidade e pureza do produto obtido, este
poderá ser utilizado como insumo para produzir outros produtos (O’REILLY,
MILLER e LUCKOW, 1992), tais como anticorpos monoclonais e antígenos de
interesse.
1.4.1 Baculovírus
Os gêneros Nucleopolyedrovirus (NPV) e o Granulovirus pertencem à
família Baculoviridae (VAN REGENMORTEL et al., 2000) que são diferenciados,
quanto à sua estrutura e tamanho de seus corpos de oclusão. Os baculovírus
causam viroses patogênicas para invertebrados, principalmente insetos. Há
relatos de infecções por baculovírus em mais de 600 espécies de insetos,
43
entretanto nenhum relato em plantas, mamíferos ou outros vertebrados
(WEIGHTMAN e BANKS, 1999).
Os Nucleopolyedrovirus (NPV) induzem a formação de poliedrose nuclear
(poliedros) enquanto que os Granulovírus (GVs) têm pequenos corpos de oclusão
chamados de grânulos, que geralmente contém um único vírion (FUNK,
BRAUNAGEL e ROHRMANN, 1997). O baculovírus produtor de poliedros pode
ser utilizado para co-transfecção de transformantes com inserto de interesse nas
células de inseto (RIBEIRO, SOUZA e KITAJIMA, 1998).
O tamanho do genoma para diferentes membros da família Baculoviridae
pode variar de 80 a 180 kbp, composto por um DNA circular de fita dupla (VAN
REGENMORTEL et al., 2000). Segundo Ribeiro, Souza e Kitajima (1998), a
família Baculoviridae é muito importante em entomologia aplicada, pelo uso como
bioinseticidas virais, vetores de expressão de proteínas heterólogas e de terapia
gênica. O capsídeo em forma de bastonete pode acomodar, teoricamente, até
100.000 pares de base (pb) de DNAs adicionais de inserções montadas de
material genético de outros organismos (POSSEE e ROHRMANN, 1997).
A proteína principal que compõe o poliedro é denominada poliedrina
(CASTRO et al., 1999; MARUNIAK, 1986), que corresponde à cerca de 95% do
conteúdo protéico nos “occlusion body” (OB) ou corpos de oclusão do
baculovírus. Os vírus deste gênero podem conter apenas um nucleocapsídeo por
vírion (Vírus de Poliedrose Nuclear Simples – SNPV) ou vários nucleocapsídeos
por vírion (Vírus de Poliedrose Nuclear Múltipla – MNPV). A espécie tipo do
gênero Nucleopolyhedrovirus é a Autographa californica multiple
nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e seu genoma possui 133.894 pb (RIBEIRO,
SOUZA e KITAJIMA, 1998; VAN REGENMORTEL et al., 2000) (Figura 6).
44
Figura 6 – Cultura de células BTI-Tn-5B1-4 infectadas como vírus AcMNPV. A seta identifica
núcleos celulares repletos de poliedros.
1.4.1.1 Infecção e replicação viral
Durante a replicação viral dos baculovírus, os vírions podem assumir duas
formas bioquímica e morfologicamente distintas. Em uma delas o vírion brota da
membrana citoplasmática da célula hospedeira para o meio extracelular de forma
polarizada, sendo envelopado individualmente e é denominado “budded virus”
(BV) ou de “extracelular vírus” (ECV). A outra forma é denominada “polyhedra-
derived virus” (PDV) ou de “occluded virus” (OV) em que o vírion adquire a
membrana sintetizada no núcleo da célula infectada, podendo ser encontrado
mais de um nucleocapsídeo por vírion, oclusos em cristais protéicos
denominados corpos de oclusão (GRANADOS e WILLIAMS, 1986).
1.4.1.2 Expressão gênica em baculovírus
A síntese das duas formas virais (BV -“budded virus” e OV - “occluded
virus”) durante a infecção celular é temporalmente regulada. Essa e tantas outras
transições durante o curso da infecção são provavelmente reguladas pela
expressão de genes virais, onde os genes expressos em uma classe temporal
45
regulam a expressão gênica seguinte. Uma vez iniciado o processo de infecção,
a expressão gênica ocorre ordenadamente em cascata (O’REILLY, MILLER e
LUCKOW, 1992). Analogicamente à síntese de proteínas virais, os RNAs
mensageiros virais também são sintetizados de uma maneira temporal em células
infectadas (FRIESEN, 1997).
A expressão de genes virais pode ser dividida em duas fases gerais: a
primeira (“early”), que ocorre até 7 horas pós-infecção (hpi), antes da replicação
do DNA viral, e a segunda (“late”), que ocorre a partir do começo ou após a
replicação. Durante a fase inicial da infecção, dois grupos de genes podem ser
diferenciados: os “immediate early” e os “delayed early”. Os genes “late” também
podem ser subdivididos em genes “late” e “very late”, que são expressos a partir
ou após o começo da replicação do DNA viral (18 hpi em diante) quando ocorre a
síntese de proteínas envolvidas na oclusão das partículas virais, como a
poliedrina e a p10, expressas em grande quantidade (O’REILLY, MILLER e
LUCKOW, 1992; RIBEIRO, SOUZA e KITAJIMA, 1998). A partir de 60 horas a
lise celular já pode ser observada.
1.4.1.3 Baculovírus como vetor de expressão
Os baculovírus têm sido largamente usados como vetores de expressão
gênica desde 1980. Os primeiros relatos do uso de baculovírus como vetores de
expressão foram publicados por Smith, Summers e Fraser (1983) e Pennock,
Shoemaker e Miller (1984), que usaram o AcMNPV (O’REILLY, MILLER e
LUCKOW, 1992).
Ribeiro e Crook (1998), relatam algumas vantagens para a utilização do
sistema de expressão de proteínas heterólogas, como por exemplo: a alta
especificidade dos baculovírus, o que torna o sistema seguro de ser utilizado;
existência de promotores fortemente ativos durante a fase tardia da infecção (não
interferindo no ciclo viral); altos níveis de expressão das proteínas heterólogas;
facilidade de purificação das proteínas heterólogas; capacidade para inserção de
grandes quantidades de DNA e a co-expressão de dois ou mais genes.
A expressão do gene exógeno é geralmente dirigida através do promotor
da poliedrina do vírus Autografha californica nuclear polyhedrosis (AcNPV), o qual
46
é altamente transcrito durante o estágio tardio da infecção. O genoma circular de
fita dupla do AcNPV tem mais de 130 kpb com múltiplos sítios de reconhecimento
para muitas endonucleases de restrição. A proteína recombinante é
freqüentemente expressa em altos níveis em larvas ou cultura de células de
inseto infectadas (LUCKOW e SUMMERS, 1988; MILLER, 1997; O’REILLY,
MILLER e LUCKOW, 1992) e a proteína de interesse é detectada por meio de
várias técnicas, como a eletroforese em gel de poliacrilamida, Western blotting,
ensaios enzimáticos (RIBEIRO, SOUZA e KITAJIMA, 1998) e PCR.
A tecnologia para a construção de baculovírus vetores é feita com base em
plasmídeos de transferência (JARVIS, 1997), inserindo uma seqüência que
codifica uma proteína de interesse dentro de vetor de transferência. Após a
inserção do gene de interesse no vetor plasmideal, esse é introduzido em células
de inseto juntamente com o DNA viral, e espera-se que através da recombinação
homóloga entre seqüências virais no vetor e o DNA viral, ocorra a troca entre o
gene viral não-essencial e o gene de interesse presente no vetor. A freqüência de
recombinantes é de aproximadamente 0,1% e a progênie é usualmente
selecionada por testes de placa, o qual pode levar de 4 a 6 semanas. O clone
recombinante é identificado por microscopia através do fenótipo distinto (corpos
de oclusão / occ) nas células infectadas (LUCKOW et al., 1993). Segundo Kost,
Condreay e Jarvis (2005) e Zhao, Chapman e Jones (2003), a seleção por testes
de placa de vírus recombinantes além de morosa é difícil de identificar quando se
usa o fenótipo sem corpos oclusos (sem poliedros = occ
-
).
Outra vantagem do sistema de expressão, baseado em baculovírus, é que
esses não são infecciosos a vertebrados (FEDERICI, 1997), assim, são
considerados suficientemente seguros para manipulação e produção industrial de
proteínas de importância biotecnológica. As aplicações dessas proteínas podem
ser citadas para uso na produção de vacinas, montagem de testes de
diagnóstico, análise tri-dimensional de estruturas protéicas, produção de bio-
inseticidas (JARVIS, 1997; RIBEIRO, SOUZA e KITAJIMA, 1998), pesquisas
biomédicas entre outros.
Com o desenvolvimento de um método bacteriano de transposição in vivo,
descrito pela primeira vez por Luckow et al. (1993) e mais tarde comercializado
como sistema “Bac-to-Bac® Baculovírus Expression Systems” (Invitrogen™), foi
eliminada a necessidade de fazer o isolamento de vírus recombinantes por testes
47
de placa. Este método envolve transposição sítio-específica de um gene exógeno
de um plasmídeo doador para um DNA baculovírus recombinante, ou “bacmid” de
tal forma que o gene exógeno é controlado pelo promotor da poliedrina
(LUCKOW et al., 1993).
1.4.2 Cultura de células de inseto
Uma linhagem celular de insetos foi desenvolvida por Granados et al.
(1994), denominada BTI-Tn-5B1-4 (Figura 7). As células BTI-Tn5B1-4 têm
morfologia esférica e são preparadas de ovos do lepdóptero Trichoplusia ni
pertencente à família de insetos Noctuidae da ordem Lepidoptera, conhecida
popularmente como lagarta mede-palmo (Figura 8 A a D). As células de ovos da
Trichoplusia ni têm como principal propriedade a alta densidade de expressão de
proteínas de baculovírus.
Figura 7 – Monocamada de cultura celular do inseto BTI-Tn-5B1-4 (Tn-5B1-4).
48
A. B.
C. D.
Figura 8 - Diferentes fases do ciclo de vida da Trichoplusia ni. a) ovo; b) larva; c) e d) adulto.
Fonte: Fotos A e C: Mau e Kessing, 1992; Foto B: Amaral, 2005; Foto D: Capinera e Castner,
2005.
1.4.3 Poliedrina, promotor e lacZ
Ao final do ciclo de replicação do baculovírus (JARVIS, 1997) o núcleo
ocupa o maior volume da célula infectada do hospedeiro e está preenchido com
poliedros. O principal componente dos poliedros é uma proteína denominada
poliedrina (O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992), que compreende pelo menos
25% da proteína total em células infectadas com baculovírus durante a fase “very
late” da infecção (SMITH, SUMMERS e FRASER, 1983). O desenvolvimento dos
baculovírus como vetores de expressão se fundamentou na propriedade de
produzir grandes quantidades de poliedrina durante a infecção (JARVIS, 1997)
sob o comando do promotor da poliedrina (polh), um promotor muito forte e de
tamanho pequeno (50 pb) que pode ser removido para outros locais do genoma
(O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992).
A presença do gene polh, um gene não essencial para a replicação viral in
vitro, resulta em um fenótipo occ
+
, que é caracterizado pela presença de múltiplos
e grandes poliedros (corpos oclusos de poliedro) no núcleo de células infectadas.
49
Se um gene não é essencial para a replicação em cultivo celular, este pode ser
funcionalmente inativado através da inserção de seqüências heterólogas dentro
da região codificadora, usando métodos de recombinação homóloga (JARVIS,
1997). Geralmente são usadas as seqüências heterólogas de um vetor de
transporte carreando o gene lacZ, que se insere em uma outra localização no
genoma viral durante a construção do vetor recombinante. O gene lacZ é então
retido no recombinante, e placas occ
–
serão distinguíveis visualmente na
monocamada por sua cor azul (O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992) quando
incubadas na presença de um cromatógeno como indicador (POSSEE e
ROHRMANN, 1997).
1.4.4 Plasmídeos e transposons
Em decorrência de sua simplicidade e curto tempo de gerar uma nova
progênie, as bactérias e, em especial a E. coli, são os organismos mais
estudados em nível celular. Genes bacterianos podem ser transferidos de uma
bactéria para outra. As células bacterianas têm três mecanismos com os quais
podem adquirir genes de outras células da população bacterianas: conjugação,
transformação e, com a ajuda de vírus, a transdução. A habilidade para tal é
conferida pelos genes contidos nos plasmídeos bacterianos (ALBERTS et al.,
1999), os quais são moléculas pequenas, circulares e de dupla fita de DNA que
estão separados do cromossomo bacteriano.
A transformação é a capacidade das bactérias de assimilarem pequenos
fragmentos de DNA resultantes da morte e degradação de outras bactérias
presentes nos arredores. O DNA entra na célula viável e se incorpora no DNA
genômico por recombinação homóloga (ALBERTS et al., 1999).
Plasmídeos podem ser usados como transportadores (vetores) de um
fragmento de DNA exógeno a ser clonado (DNA recombinante) para dentro de
um outro organismo (transformação em células E. coli competentes). Cada vez
que a célula se multiplica, o número de cópias da molécula de DNA recombinante
também de duplica (ALBERTS et al., 1999; LEWIN, 2000).
Um fragmento de DNA de interesse a ser clonado, pode ser isolado e
amplificado pela PCR. Para facilitar a inserção deste DNA amplificado dentro de
50
um vetor, foram desenvolvidos métodos de clonagem usando como estratégia um
plasmídeo linear que possui, acrescido em seus dois sítios terminais de uma
timidina (T) (KNOCHE e KEPHART, 1999; KOBS, 1995; MARCUS, HARTNETT e
STORTS, 1996). Existe comercialmente o vetor pGEM®-T (Promega), um
sistema conveniente para clonagem de produtos da PCR.
O plasmídeo pGEM®-T foi preparado através da digestão do vetor
pGEM®-5Zf(+) com EcoR V e adição de uma timidina (T) no 3’ terminal em
ambas extremidades do vetor. Essas terminações 3’-T melhoram em muito a
eficiência de ligação de um produto de PCR no plasmídeo, evitando a
recircularização do plasmídeo e provendo uma ligação compatível de produtos de
PCR gerado pela polimerase termoestável (Taq DNA polimerase) (MARCUS,
HARTNETT e STORTS, 1996). Esta polimerase freqüentemente adiciona uma
única deoxiadenosina (A), nas terminações 3’ dos fragmentos amplificados
(CLARK, 1988). O plasmídeo pGem®-T Easy possui um promotor da RNA
polimerase em cada uma de suas extremidades (o T7 e o SP6) e dentro da
região de clonagem múltipla do plasmídeo estão inseridos sítios múltiplos para
enzimas de restrição, entre elas a EcoR I, a qual está inserida nas duas
extremidades do plasmídeo. Esses sítios de restrição liberam o inserto por
digestão com uma única enzima de restrição. O plasmídeo pGem®-T Easy é
flanqueado por sítios de reconhecimento duplo para as enzimas de restrição
EcoR I, BstZ I e Not I (MARCUS, HARTNETT e STORTS, 1996).
Após a clonagem dentro do vetor de transferência e de sua transformação
em células de E. coli, o DNA recombinante é isolado por enzimas de restrição e
subclonado em um vetor de expressão. Atualmente, existe disponível no mercado
kits de clonagem que disponibilizam um plasmídeo doador e células competentes
com o “bacmid” e um plasmídeo “helper” inseridos em seu genoma (KOST,
CONDREAY e JARVIS, 2005). Em 1993, Luckow e colaboradores (1993)
desenvolveram um baculovírus recombinante com sítio-específico do transposon
mediando a inserção de genes diferentes ao genoma do baculovírus através da
propagação em E. coli. Esses conhecimentos levaram a produção do kit
denominado “Bac-to-Bac® Baculovirus Expression Systems” (Invitrogen™)
(KOST, CONDREAY e JARVIS, 2005).
O plasmídeo de expressão pFastBac™1, possue entre os braços direito e
esquerdo do Tn7, no sentido horário, estão dispostos o gene de resistência a
51
gentamicina, um promotor forte, o sítio promotor do gene da poliedrina, seguido
pelo sítio de múltipla clonagem do plasmídeo, com 16 sítios de restrição
(localizado a 4032 pb até 4137 pb no plasmídeo de 4775 pb). O primeiro sítio de
restrição é para BamH I (4032 pb) e o quarto sítio é para EcoR I (4055 pb). O
mini-Tn7 possui ainda, um sinal de poliadenilação (SV40), um sinal de terminação
da transcrição) (LUCKOW, 1993). O “bacmid” foi produzido (montado) com um
“replicon” mini-F de baixo número de cópias (as células E. coli DH5OαF’IQ foram
usadas como a fonte de DNA plasmideal F’); um marcador selecionável de
resistência a kanamicina (Tn903) e um segmento de DNA, inserido no N-terminal
do “bacmid”, que codifica o peptídeo lacZα (O’REILLY, MILLER e LUCKOW,
1992; POSSEE e ROHRMANN, 1997).
O “bacmid” foi inserido em células hospedeiras de E. coli DH10B™ para se
propagar junto com essas bactérias. Todos esses elementos foram
transformados dentro de células E. coli DH10B™ (Invitrogen™) e esta linhagem
celular de E. coli com o “bacmid” foi denominada, então, de DH10Bac™ (KOST;
CONDREAY; JARVIS, 2005).
Além do sítio da lacZα inserido no N-terminal do “bacmid”, há também uma
pequena região de ligação para o transposon bacteriano Tn7, denominada de
mini-attTn7 (um sítio marcado para o Tn7 com 112 pb). Todos os componentes
estão inseridos no lócus da poliedrina do AcMNPV. As DH10Bac possuem
também, fora de seu genoma, um plasmídeo “helper”, o qual confere resistência à
tetraciclina e codifica a enzima transposase. Esta enzima atua em trans no
transposson Tn7 durante a transposição, deslocando o mini-Tn7 do plasmídeo
pFastBac™1 para o sítio de atachamento mini-attTn7 no “bacmid” (localizado no
N-terminal).
Genomas bacterianos contêm trechos de DNA denominados elementos de
transposição (transposons), os quais podem mover-se de um lugar para outro no
genoma de seus hospedeiros através da enzima transposase. Alguns
transposons possuem promotores de transcrição e quando se posicionam
próximo de um gene podem interferir na expressão em diferentes níveis ou
diferentes controles celulares. Esse movimento cria mudanças nos genomas
hospedeiros e fornece outra fonte de variação genética (ALBERTS et al., 1999;
LEWIN, 2000).
52
Quando o mini-Tn7 (transposon) inserido no plasmídeo pFastBac™1 salta,
durante a transposição com as células DH10Bac, para a região mini-attTn7 do
“bacmid” (LUCKOW, 1993), desloca o sítio do lacZ no N-terminal e, portanto
interrompe o gene da β-galactosidase (O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992;
POSSEE e ROHRMANN, 1997), conferindo uma coloração branca às colônias
com o plasmídeo recombinante quando cultivadas em meio com indutor da cor X-
gal/IPTG (LUCKOW, 1993).
As células bacterianas E. coli DH10B™ têm em seu genótipo uma deleção
para a β-galactosidase. A porção amino-terminal da β-galactosidase codificada
pela região lacZα do “bacmid” é capaz de uma complementação intra-alélica com
a forma defectiva da β-galactosidase (PENNOCK, SHOEMAKER eMILLER,
1984). Em função disso, o “bacmid” é propagado em E. coli como um plasmídeo
grande que confere resistência a kanamicina e pode complementar uma deleção
presente da lacZ no cromossomo para formar colônias azuis na presença do
substrato cromogênico X-gal (USB) e do indutor da cor IPTG (Sigma®).
O DNA recombinante de alto peso molecular é preparado de colônias E.
coli selecionadas contendo o “bacmid” recombinante, e este DNA é usado para
transfectar células de inseto (Manual de Instrução “Bac-to-Bac® Baculovírus
Expression System”, 2002; Invitrogen™).
53
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Os materiais e métodos utilizados foram conduzidos em etapas seqüenciais
conforme demonstrado no esquema da figura 9 de forma sintetizada.
Figura 9 - Esquema da produção da glicoproteína gE do VDA.
DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DA PROTEÍNA (SDS-PAGE) CONFIRMAÇÃO
DA EXPRESSÃO DA REGIÃO-ALVO (PCR/“WESTERN BLOTTING)
CÉLULAS E CEPAS VIRAIS VDA
PRODUÇÃO DE DNA VIRAL
SUB-CLONAGEM DA REGIÃO-ALVO (pFastBac™1)
DETERMINAÇÃO DA REGIÃO-
ALVO
(Gene gE do VDA / Desenho dos “primers”)
AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO-ALVO (PCR)
CO
-
TRANSFECÇÃO DA REGIÃO
-
ALVO
(Bacmid.pFastBac-gE.VDA/Células de Inseto)
CLONAGEM DA REGIÃO-ALVO (pGem®-T Easy)
TRANSPOSIÇÃO DA REGIÃO
-
ALVO
(pFastBac-gE.VDA/“Bacmid” – DH10Bac™)
EXPRESSÃO DA REGIÃO
-
ALVO
(Vírus recombinante Bacmid.pFastBac-gE.VDA)
54
2.1 CÉLULAS
Para propagar e titular o vírus da doença de Aujeszky (VDA) foram utilizadas
células de linhagem Swine Kidney (SK-6 ou fibroblastos de rim de suíno)
pertencentes ao banco de células do setor de virologia da Embrpa Suínos e Aves,
cultivadas com meio de cultura Ham F 10 (Cultilab) e meio 199 (Cultilab)
suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (SFB; Cultilab), garamicina (sulfato de
gentamicina; Schering-Plough) concentração final 50 µg/mL e anfotericina B
(Fungizon; Bristol-Myers Squibb) concentração final 3,5 µg/mL. As células foram
multiplicadas a cada 72 horas segundo métodos usuais do laboratório de sanidade
da Embrapa Suínos e Aves, em Concórdia, SC.
2.2 AMOSTRAS DE VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY
Foram utilizadas amostras de herpesvírus suíno pertencente ao banco de
microrganismos virais do setor de virologia do Centro de Diagnóstico em Saúde
Animal (CEDISA) e da Embrapa Suínos e Aves, em Concórdia (SC), amostras estas
representativas do vírus da doença de Aujeszky (VDA), isolados de campo em Santa
Catarina, identificados sob os números de protocolo 0261/83 e 006/90 (Embrapa
Suínos e Aves) e 1951/02 (CEDISA). Os estoques de vírus foram titulados seguindo
métodos usados na rotina nesses laboratórios (ROWE e ROMERO, 1986), sendo os
títulos calculados pelo método de Spearman e Karber (LORENZ e BÖGEL, 1973).
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO VIRAL
Cultivo celular infectado com VDA foi submetido à extração de DNA pelo
método da proteinase K (SAMBROOK, FRITSCH e MANIATIS, 1989). As amostras
virais utilizadas neste estudo foram mantidas com poucas passagens in vitro (entre 5
e 10 passagens), com título não inferior a 10
6
TCID
50.
O vírus foi multiplicado em
células SK-6, cultivadas em garrafas de 150 cm
2
(30-40 x10
6
células). Quando os
cultivos celulares apresentavam cerca de 90% de efeito citopático (ECP), o conteúdo
55
das garrafas foi colhido e clarificado por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos a 4
ºC para separação das células. O sobrenadante foi, então, recuperado e congelado
a –70 ºC ou imediatamente ultracentrifugado através de um colchão de sacarose.
Para o preparo do DNA de cada uma das cepas virais, foram utilizados dois tubos de
ultracentrífuga. Cada tubo recebeu um volume de 27 mL do sobrenadante viral e 3
mL da solução de sacarose 25%. Os tubos foram ultracentrifugado a 110.000 x g
por 3 horas a 4 ºC, para concentração dos vírus presentes no sobrenadante. Em
seguida, o sobrenadante foi descartado e o material de cada tubo, sedimento viral,
foi, então, ressuspendido em 100 µL de tampão TNE (pH 7,4) (ANEXO A).
Posteriormente foi feito um ‘pool’ dos dois tubos de cada cepa viral e transferido para
um microtubo novo de 1,5 mL, totalizando 200 µL de TNE e sedimento viral. O
material foi incubado com 1 µL de proteinase K (20 mg/mL; BioLabs) e 20 µL de
dodecil sulfato de sódio (SDS ) 10% por 1 hora a 37 ºC, sob agitação leve constante.
Após a incubação, o material foi submetido à extração com 200 µL de fenol
(“UltraPure™ Phenol”; Invitrogen™) (pH 8.0), com a adição de NaCl até a
concentração final de 0,3 M (~7 µL, 5 M). O material foi homogeneizado sob
agitação leve em temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugado a 12.000 x g
por 5 minutos. O sobrenadante foi precipitado com a adição de 550 µL de etanol
absoluto gelado (–20 ºC) e incubado durante uma hora a –20 ºC. A amostra de DNA
foi recuperada por centrifugação a 12.000 x g a 4 ºC por 45 minutos. O etanol foi
descartado, o “pellet” lavado com etanol 70% gelado e centrifugado a 12.000 x g por
5 minutos. O etanol 70% foi desprezado, e o “pellet” de DNA viral foi desidratado em
temperatura ambiente e ressuspendido em 50 µLde TE-RNase (pH 8,0) estéril
(ANEXO A). O DNA foi mantido a 4 ºC ou armazenado em ultracongelador –70 ºC.
2.3.1 Teste da qualidade e quantidade do DNA genômico
Para testar a qualidade das amostras de DNA genômico produzido, 5 µL de
cada DNA VDA produzido foi digerido com enzima de restrição BamH I, para uma
reação final de 15 µL. Uma alíquota de 8 µL da digestão foi analisada por
eletroforese em gel de agarose 0,8% a 90 volts por 1 hora em cuba horizontal com
tampão TAE (ANEXO A). O gel foi corado com brometo de etídeo (5 µg/mL; Sigma)
(ANEXO A) e visualizado sob luz ultravioleta (UV). A medição do padrão de
56
migração das bandas foi conferida com o uso de 3,5 µL do marcador de 1 Kb DNA
Ladder (Invitrogen™) diluído 1:5 (ANEXO A). Uma alíquota de 1,5 µL do DNA VDA
não digerido também foi incluída na eletroforese como marcador e para avaliar a
concentração da amostra de DNA.
2.4 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
2.4.1 Desenho dos iniciadores da seqüência do gene gE do VDA
Com o objetivo de amplificar toda região codificadora da glicoproteína E (gE)
das amostras de VDA, foram desenhados dois pares de iniciadores (“primers”). Uma
seqüência da gE do vírus da doença de Aujeszky registrada no GenBank com
número de acesso AY249861 (HYUN et al., 2003) (ANEXO B) foi utilizada para
obter as seqüências de “primers”, que foram desenhados com o auxílio do professor
Dr. Bergmann Morais Ribeiro, do Laboratório de Microscopia Eletrônica e Virologia,
departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, DF (UnB). Foram
desenhados duas seqüências de iniciadores, o “primer sense” (PS) com sítio de
restrição EcoR I (5’...G
AATTC...3’) (5'- cacaccggggttgaattccatgc-3') e um “primer
antisense” (PA) com sítio de restrição BamH I (5’...G
GATCC...3’) (5'-
gaccggatcccccggtatttaagc-3') correspondente à região do genoma do PRV 123483 a
125253, totalizando 1771 nucleotídeos, referente a todo o gene da gE adicionada de
mais alguns oligonucleotídeos que antecedem e finalizam o gene da gE com a
inserção dos sítios de restrição (ANEXO C). As seqüências dos “primers” foram
preparadas pela XX IDT® Integrated DNA Technologies, Inc (Dialab Diagnostics,
SA).
2.4.2 Padronização do protocolo da PCR para amplificar a seqüência codificadora da
gE do VDA
A PCR foi realizada em aparelhos termocicladores e com o volume final de
50 µL por tubo, que continha 10% de tampão da enzima Taq DNA polimerase
(50 mM KCL; 20 mM Tris-HCl, pH 8,4), 4,0 mM de MgCl
2
, 0,2 mM de cada dNTPs
57
(deoxinucleotídeo), 5% de glicerol (v/v), 50 ρmoles de cada “primer”, 2,5 unidades
de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen™), 100 ηg do DNA viral e água
estéril qsp 50 µL. As reações foram inicialmente submetidas a um passo de
desnaturação (95 ºC, 4 minutos) e anelamento (56 ºC, 1:30 minutos) e, só então, foi
acrescido a cada reação a Taq DNA polimerase e seguida de uma extensão (72 ºC,
2 minutos). Após, procedeu-se cinco ciclos de desnaturação (95 ºC, 1 minuto);
anelamento (58 ºC, 1:30 minutos) e extensão (70 ºC, 2 minutos) e 30 ciclos de
desnaturação (95 ºC, 1 minuto); anelamento (60 ºC, 1:30 minutos) e extensão
(72 ºC, 2 minutos). Após os 30 ciclos, as reações foram submetidas um ciclo final de
extensão a 72 ºC por 10 minutos.
Ao final das reações no termociclador, uma alíquota de 8 µL foi separada de
cada reação de 50 µL, e foi imediatamente testadas por eletroforese em gel de
agarose 0,8%, conforme descrito anteriormente (item 2.3.1). As reações da PCR
com a seqüência codificadora da gE amplificada foram reunidas em um “pool” e
imediatamente purificadas para serem posteriormente clonadas com o vetor de
clonagem.
2.4.2.1 Purificação das reações da PCR que amplificaram a seqüência codificadora
gE do VDA
As reações da PCR com a seqüência gE do VDA amplificada foram reunidas
em um “pool” e purificadas utilizando o kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System” (Promega), conforme as orientações do fabricante. Um e meio microlitros
de cada DNA purificado foi imediatamente analisado por eletroforese em gel de
agarose 0,8% conforme descrito anteriormente (item 2.3.1), para verificar sua
qualidade e concentração, para em seguida serem usados na ligação com o vetor de
clonagem. Meio microlitro do DNA pGem-T Easy (Promega) (ANEXO D) também
foi analisado.
2.5 PREPARO DE CÉLULAS COMPETENTES
Determinadas cepas de Escherichia coli são utilizadas como hospedeiras de
moléculas de DNA recombinantes. Este DNA é introduzido na bactéria através da
58
transformação e cada vez que a bactéria se duplica, o número de cópias da
molécula de DNA recombiante também se duplica (ALBERTS, 1999).
Células de E. coli DH5α™ (Invitrogen™) e DH10Bac™ (Invitrogen™) foram
empregadas nos procedimentos de clonagem e transposição, respectivamente,
como hospedeiras para os plasmídeos pGem®-T Easy (Promega) e pFastFac™1
(Invitrogen™) e para o vetor de transposrte “bacmid” (Invitrogen ™), o baculovírus
AcMNPV recombinante utilizados no trabalho.
As células E. coli DH5α™ foram utilizadas com os plasmídeos de clonagem e
sub-clonagem pGem®-T Easy e pFastFac™1, respectivamente. Já as células E.
coli DH10Bac™ que fazem parte do kit “Bac-to-Bac® Baculovirus Expression
Systems” (Invitrogen™), o qual possui ainda o plasmídeo pFastBac™1, o plasmídeo
pFastBac™-Gus (controle do kit) e o reagente CellFECTIN® (lipossomo) foram
utilizadas para a transposição. As células E. coli DH10Bac são o resultado da
construção de um baculovírus como vetor de transporte, o “bacmid”, conforme
descrito (item 1.4.4). Para tornar as duas cepas de E coli, citadas acima,
competentes e, portanto prontas para usá-las na transformação dos produtos das
ligações e na transposição, foram seguidos os seguintes procedimentos:
2.5.1 Preparo de células competentes E. coli DH5α™ com cloreto de cálcio (CaCl
2
) -
Adaptado de Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989)
As células E. coli DH5α™ armazenadas em glicerol a –70 ºC foram semeadas
por esgotamento em meio agar Luria Bertani (LB) (ANEXO A) sem antibióticos e
incubadas a 37 °C por aproximadamente 18 horas (durante a noite). Foram
transferidas 4 a 5 colônias isoladas de E. coli de 1-2 mm para um tubo contendo 1
mL de meio LB líquido sem antibióticos, que foi homogeneizado com o “vortex” em
moderada velocidade para dispersar bem as bactérias. O conteúdo do tubo foi
transferido para um frasco Erlenmeyer de 1 L contendo 50 mL de meio LB sem
antibiótico e incubado a 37 °C por 3 horas sob agitação constante de 200 x rpm até
que atingisse uma densidade óptica (DO), medida em espectrofotômetro sob o
comprimento de onda de 600 nanômetros (DO
600
), de 0,4 – 0,6. Foi acrescentado 50
mL de meio LB pré-aquecido a 37 ºC sem antibióticos e novamente a cultura foi
59
incubada a 37 °C sob agitação constante de 200 x rpm até que o crescimento
bacteriano atingisse uma DO
600
de 0,6 (cerca de 30 minutos de incubação).
Os cultivos de 100 mL do crescimento bacteriano foram divididos em dois
tubos de centrifuga e mantidos em banho de gelo por 10 minutos para baixar a
temperatura da cultura para 0 ºC. Após isso, as células foram recuperadas por
centrifugação a 2500 x g por 10 minutos a 4 °C. Cuidadosamente, o sobrenadante
de cada tubo foi descartado e o “pellet” celular de cada tubo foi ressuspendido em
50 mL de cloreto de cálcio (CaCl
2
) 100 mM gelado (ANEXO A). Posteriormente, as
células foram novamente centrifugadas (2500 x g por 10 minutos a 4 °C). O
sobrenadante foi descartado, o “pellet” celular de cada tubo foi ressuspendido em 25
mL de CaCl
2
100 mM gelado e as células ressuspendidas foram reunidas em um
único tubo o qual foi novamente centrifugado, conforme já descrito acima.
Descartou-se, então, o sobrenadante e o “pellet” foi suavemente ressuspendido em
5 mL de Ca Cl
2
100 mM gelado e incubado em banho de gelo durante 15 minutos.
Adicionou-se, lentamente gota-a-gota, 2,5 mL de glicerol 70% estéril gelado, sob
agitação constante do frasco em banho de gelo. As células foram envasadas em
criotubos (200 µl/criotubo) e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido. Após o
rápido congelamento, as ampolas com as células foram estocadas no
ultracongelador –70 ºC.
2.5.2 Preparo de células competentes E. coli DH10Bac com cloreto de rubídio
(RbCl
2
) - Adaptado de Glover (1984)
As células E. coli DH10Bac™ armazenadas em glicerol a –70 ºC foram
semeadas por esgotamento em meio agar LB sem antibióticos e incubadas a 37 °C
por aproximadamente 18 horas. Uma colônia isolada da placa agar LB foi inoculada
em 7 mL de meio SOB (ANEXO A) sem antibióticos, e incubada a 37 °C por 18
horas (durante a noite). Os 7 mL cultivados foram utilizados como inóculo em 250
mL de meio SOB sem antibióticos acondicionados em um frasco Erlenmeyer de 1L.
A cultura foi incubada a 37 °C
sob agitação constante de 200 x rpm até que atingisse
uma densidade celular de 4 a 7 x 10
7
células por mL (de 4 a 5 horas de incubação).
A densidade celular foi medida em espectrofotômetro sob o comprimento de onda de
600 nanômetros (DO
600
) de 0,4 a 0,7.
60
Os 250 mL do crescimento bacteriano foram divididos em tubos de centrifuga
de 50 mL e mantidos em banho de gelo por 10 minutos para baixar a temperatura da
cultura para 0 ºC. Em seguida, as células foram recuperadas por centrifugação a
1000 x g por 15 minutos a 4 °C. Cuidadosamente, o sobrenadante foi descartado e o
“pellet” celular de cada tubo foi ressuspendido com 4 mL da solução RF1 (pH 5,8)
(ANEXO A) gelada, totalizando 25 mL da solução. O volume celular ressuspendido
foi reunido em um único tubo, o qual foi mantido em gelo por 15 minutos. Após essa
incubação em gelo, as células foram novamente centrifugadas a 1000 x g a 4 °C por
15 minutos. O sobrenadante do tubo foi descartado e o “pellet” celular foi
cuidadosamente ressuspendido em 10 mL da solução RF2 (pH 6,8) (ANEXO A)
gelada e incubada em gelo por 15 minutos. As células foram envasadas em
criotubos (200 µl/criotubo) e rapidamente congeladas em nitrogênio líquido. Após o
rápido congelamento, as ampolas com as células foram estocadas no
ultracongelador –70 ºC.
2.6 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DH5α™ – CLONAGEM E
SUBCLONAGEM
Células da cepa E. coli DH5α™ competentes foram utilizadas para
transformação do plasmídeo de clonagem pGem®-T do kit “pGem®-T Easy Vector
Systems” (Promega) e do plasmídeo de expressão pFastBac™1 do kit “Bac-to-Bac®
Baculovirus Expression Systems” (Invitrogen™). Os dois plasmídeos possuem um
gene de resistência para a ampicilina, a qual é usada para selecionar as colônias
transformantes recombinantes. As transformações com DH5α™ foram conduzidas
com ampicilina [50 mg/ml] (USB) no meio LB líquido e agar LB para uma
concentração final de 100 µg/ml.
2.6.1 Ligação inserto gE.VDA com o plasmídeo pGem®-T Easy e clonagem por
transformação das células competentes
O plasmídeo pGem®-T Easy foi utilizado por facilitar a clonagem de produtos
da PCR, conforme descrito anteriormente (item 1.4.4).
61
O “pool” dos produtos das reações da PCR (seqüências gE amplificadas) foi
purificado com o kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega) e
ligado ao plasmídeo de clonagem pGem®-T Easy (Promega) através da enzima
T4DNA ligase (Promega). Todas as reações foram feitas durante 20 horas a 4 ºC,
seguindo as condições indicadas pelo fabricante da enzima ligase. Foram feitas ao
todo quatro ligações: duas ligações de inserto com o plasmídeo com taxa molar de
5:1 e 2:1; uma ligação com o DNA (fragmento do pGem®-luc) controle do kit
“pGem®-T Easy Vector Systems” (controle da ligação) e uma ligação usando
somente o plasmídeo pGem®-T Easy.
O co-cultivo foi conduzido com um volume de 2,5 µL da ligação inserto-
plasmídeo que foi adicionado a um tubo novo estéril de polipropileno (17 x 100 mm),
devidamente identificado e mantido no gelo. Ampolas com 200 µL de células
competentes E. coli DH5α™ foram retiradas do ultracongelador –70 ºC e
imediatamente acondicionadas em banho de gelo. Cem microlitros dessas células
foram passados para cada um dos tubos com a ligação. Como controle das
transformações foram também transformadas células competentes DH-5α™ e o
plasmídeo pGem-T Easy (controle negativo). As transformações foram mantidas
em banho de gelo durante 20 minutos.
Um choque térmico durante 45 segundos em banho-maria a 42 ºC foi
realizado, ao que se seguiu nova incubação em banho de gelo durante dois minutos.
Posteriormente, foram adicionados 900 µL de meio SOC (ANEXO A) às células
transformadas contendo a ligação inserto-plasmídeo e os tubos foram incubados a
37 ºC
sob agitação constante de 200 x rpm durante 60 a 90 minutos. Após a
incubação, 100 µL das células (transformações inserto-plasmídeo) foram
diretamente plaqueadas em agar LB com ampicilina e os demais 900 µL das células
foram peletizadas sob centrifugação a 1000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o “pellet” ressuspendido em 200 µL de meio SOC e 100 µL foi
plaqueado (semeado), em duplicata, em placas agar LB contendo ampicilina
(concentração final 100 µg/mL). As placas foram incubadas a 37 ºC por 16 a 24
horas. As transformações sem ligações, somente com células competentes, foram
plaqueadas em agar LB com e sem ampicilina. A transformação somente com o
plasmídeo pGem-T Easy foi plaqueada em agar LB com ampicilina 100 µg/mL
(ANEXO A).
62
2.6.1.1 Isolamento do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA por
minipreparação - Adaptado de Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989)
Colônias crescidas isoladamente foram selecionadas e inoculadas em 3 mL
de meio LB com ampicilina (concentração final 100 µg/mL) acondicionados em tubos
estéreis de polipropileno de 15 mL. A incubação foi conduzida a 37 ºC sob agitação
(200 x rpm) durante 18 horas. Dos tubos com crescimento bacteriano foram
separados 1,5 mL deste crescimento e acondicionados em tubos de centrífuga de 2
mL, os quais foram centrifugados a 5000 x g por 1 minuto a 4 ºC. O sobrenadante foi
descartado e o “pellet” celular foi ressuspendido com 100 µL da Solução I (ANEXO
A) gelado e homogeneizado com “vortex”. Foi acrescentado 200 µL da Solução II
(ANEXO A) e para permitir a homogeneização do conteúdo do tubo, este foi
cuidadosamente invertido por 5 a 6 vezes . Em seguida, foram adicionados 150 µL
da Solução III (ANEXO A) gelada e os tubos foram invertidos 3 a 5 vezes com
cuidado para não romper o lisado. Os tubos foram incubados no gelo por 3 a 5
minutos e centrifugados a 12.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi
recuperado e o DNA plasmideal foi extraído com 220 µL de fenol re-equilibrado com
TE (pH 8,0) e 220 µL de clorofórmio. Os tubos foram homogeneizados com “vortex”
por 20 segundos e novamente centrifugados 12.000 x g por 5 minutos a 4 ºC. A fase
superior foi recuperada e precipitada com 900 µLl de etanol absoluto na temperatura
ambiente. Os tubos foram homogeneizados com “vortex”, incubados por 2 minutos e
centrifugados a 12.000 x g por 5 minutos a 4 ºC. Os “pellets” foram lavados com
1000 µL de etanol 70% gelado. Os tubos foram homogeneizados com “vortex” e
centrifugados 12.000 x g por 5 minutos a 4 ºC. O etanol foi descartado e o “pellet”
desidratado à temperatura ambiente e ressuspendido em 50 µL de TE (pH 8,0) com
RNase (USB) (20 µg/mL) (ANEXO A). As amostras de DNA em suspensão foram
incubadas a 37 ºC por 10 minutos e agitadas no “vortex”, para produzir uma
suspensão homogênea de DNA, incubadas em temperatura ambiente e finalmente
armazenadas a –20 ºC. Uma alíquota de 4 µL foi separada para ser testada por
eletroforese em gel de agarose 0,8%, conforme descrito no item 2.3.1.
63
2.6.1.2 Análise do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA com enzimas de
restrição
As amostras de DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA analisadas por
eletroforese que apresentaram bandas no peso molecular compatível com o
esperado (~4800pb) foram digeridas com a enzima EcoR I (Promega) para
certificação da trasformação, produzindo duas bandas, uma com aproximadamente
1771 pb (inserto gE.VDA) e outra com 3015 pb (plasmídeo pGem®-T Easy). Dois
microlitros de DNA foi digerido com EcoR I para uma digestão final de 15 µl durante
três horas a 37 ºC. A digestão foi analisada por eletroforese em gel de agarose
0,8%, conforme citado anteriormente (item 2.3.1), com a aplicação de 6 µl de cada
digestão com a enzima EcoR I. Para controle da digestão foram também digeridos
DNAs transformantes vazios (plasmídeo pGem-desarmado) (controle negativo), do
plasmídeo pGem®-T Easy vazio (somente 0,5 µl) e do plasmídeo pBlueScript® II
(Stratagene).
O cultivo bacteriano contendo o clone recombinante pGem-gE.VDA foi
propagado num volume maior de meio LB com ampicilina e depois foi armazenado
com glicerol a –70 ºC.
2.6.1.2.1 Liberação do fragmento gE.VDA do DNA plasmideal recombinante pGem-
gE.VDA
Vinte microlitros do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA foi digerido
com EcoR I para uma digestão final de 50 µL durante três horas a 37 ºC. A digestão
foi analisada por eletroforese em gel de agarose 0,8%, conforme citado
anteriormente (item 2.3.1), com a aplicação de 2 µL de cada digestão com a enzima
EcoR I. Após confirmada a total digestão do clone a reação restante foi precipitada
e recuperada em gel de agarose LMP (Low Melting Point; Invitrogen™) 1% em TAE
com voltagem de 10 volts durante 24 horas a temperatura de 4 a 8 ºC. O fragmento
de altura aproximada de 1,8 kb liberado foi extraído do gel, purificado com o kit
“Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega) e antes de ser
subclonado, o DNA recuperado foi analisado quanto à sua qualidade e concentração
em gel de agarose 0,8%, conforme descrito anteriormente (item 2.3.1).
64
2.6.1.2.2 Digestão do fragmento gE.VDA com a endonuclease de restrição Bsr I e
análise eletroforética do fragmento gE digerido
Para a certificação de que o produto amplificado pela PCR com os dois sítios
de restrição (EcoR I e BamH I) e que depois de clonado ao pGem-T Easy foi digerido
com EcoRI, produzindo um fragmento de 1772 pb, era a seqüêcia codificadora da
gE do VDA, a seqüência gE.VDA teve seu mapa de restrição analisado no programa
NEBcutter V2.0 (VINCZE, POSFAI E ROBERTS, 2003; New England BioLabs Inc)
A análise no programa NEBcutter V2.0 mostrou sítios de restrição para várias
enzimas, entre os quais para a enzima Bsr I, a qual possui um sítio (5’...ACTGG...3’)
na seqüência da gE do VDA. Então, para conferir se o fragmento liberado do
plasmídeo recombinante pGem-gE.VDA era a gE.VDA, este fragmento foi submetido
a uma digestão com Bsr I, a qual cliva a seqüência gE.VDA em um único sítio,
produzindo dois fragmentos de aproximadamente 820 e 950 pb cada, segundo os
dados obtidos no programa NEBcutter V2.0.
Uma alíquota de 5 µL da seqüência da gE.VDA liberada após a clivagem com
a enzima de restrição EcoR I e recuperada do gel LMP foi digerida com a enzima de
restrição Bsr I (seqüência 5’...ACTG
GN...3’; BioLabs) para uma digestão final de 15
µL durante três horas a 65 ºC. Após a digestão uma alíquota de 2 µL da digestão foi
testada por eletroforese, conforme descrito anteriormente (item 2.3.1). Amostra do
DNA gE.VDA liberado não digerido foi usado como controle na eletroforese.
2.6.2 Subclonagem do fragmento gE.VDA e do plasmídeo de expressão
pFastBac™1
Para subclonagem do fragmento da gE do VDA foi utilizado o plasmídeo de
expressão pFastBac™1 do kit “Bac-to-Bac® Baculovírus Expression Systems”
(Invitrogen™). Este plasmídeo recombinante foi utilizado por conter em sua
seqüência um mini-Tn7 (transposon) que pode saltar para dentro do genoma do
baculovírus recombinante, conforme descrito anteriormente (item 1.4.4).
65
2.6.2.1 Digestão do plasmídeo de expressão pFastBac™1
O plasmídeo de expressão pFastBac™1 foi linearizado por digestão com a
enzima EcoR I para posterior clonagem com o fragmento gE.VDA.
Setecentos e cinqüenta microgramas (1,5 µL) do DNA plasmideal
pFastBac™1 foi digerido com EcoR I para uma digestão final de 30 µL durante três
horas a 37 ºC. Uma alíquota de 3 µL foi separada para posterior análise. Depois da
digestão, o plasmídeo foi desfosforilado com 5 unidades de fosfatase alcalina (Calf
Intestinal Alkaline Phosphatase – CIAP [20 U/µL]; Invitrogen™) durante 30 minutos a
37 ºC ao que se seguiu a inativação da enzima CIAP por extração orgânica com
igual volume de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). O DNA foi então
precipitado com 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol
absoluto e depois ressuspendido em 22 µL de TE (pH 8,0). Uma alíquota de 2 µL, do
DNA plasmideal tratado, foi separada e analisada quanto à sua qualidade e
concentração em gel de agarose 0,8%, conforme descrito anteriormente (item 2.3.1).
2.6.2.2 Ligação do fragmento gE.VDA com o plasmídeo de expressão pFastBac™1
linearizado e subclonagem por transformação das células competentes
O fragmento gE.VDA com 1772 pb, resultado da digestão do clone pGem-
gE.VDA com EcoR I foi ligado ao plasmídeo de expressão pFastBac™1 (kit “Bac-To-
Bac® Baculovírus Expression Systems”, Invitrogen™) com 4775pb (ANEXO F),
digerido com EcoR I. A digestão cliva (abre) o pFastBac™1 no sítio EcoR I, a 4055
pb no sítio de multiclonagem do plasmídeo, região onde o fragmento gE.VDA foi
inserido. Se a inserção do fragmento se der na orientação horário (correta) o
fragmento gE.VDA se insere entre a região aberta no plasmídeo (sítio EcoR I a 4055
pb), no sentido horário da fragmento gE.VDA (sentido: EcoR I - Fragmento gE.VDA -
Sítio BamH I - Sítio EcoR I).
A ligação do fragmento gE.VDA com o plasmídeo de expressão pFastBac™1,
linearizado no sítio de clonagem da enzima EcoR I (localizado a 4055 pb no
plasmídeo), foi feita com a enzima T4DNA ligase (Invitrogen™) durante 20 horas a
14 ºC. Todas as reações foram feitas seguindo condições indicadas pelo fabricante
da enzima ligase. Foram feitas três ligações de 20 µL cada do inserto com o
66
plasmídeo com taxa molar de 16:1, 12:1 e 8:1 e uma ligação usando somente o
plasmídeo pFastBac™1, como controle negativo da ligação.
O co-cultivo foi conduzido conforme descrito (item 2.6.1) com um volume de 3
µL da ligação inserto-plasmídeo. As transformações foram mantidas em banho
de gelo durante 20 minutos. Como controle das transformações foram também
transformadas células competentes DH-5α e o plasmídeo circular pFastBac™1
(controle negativo). As transformações foram mantidas em banho de gelo durante 60
minutos.
Os demais procedimentos de transformação foram realizados como descrito
anteriormente (item 2.6.1).
2.6.2.2.1 Isolamento do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA por
minipreparação - Adaptado de Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989)
Colônias crescidas isoladamente foram selecionadas e inoculadas em 3 mL
de meio LB com ampicilina (USB) (concentração final 100 µg/mL) acondicionados
em tubos estéreis de polipropileno de 15 mL. A incubação foi conduzida a 37 ºC sob
agitação a 200 x rpm durante 18 horas. O preparo do DNA plasmideal foi conduzido
seguindo procedimentos de minipreparação adaptado de Sambrook, Fritsch e
Maniatis (1989), conforme descrito anteriormente (item 2.6.1.1).
a) Análise do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA com enzimas de
restrição
As amostras de DNA analisados por eletroforese que apresentaram bandas
com padrão de migração compatível com o esperado (~6550pb) foram digeridas
com EcoR I para certificar se liberavam duas bandas, uma de aproximadamente
1772 pb (inserto gE.VDA) e outra de 4775 pb (plasmídeo pFastBac™1) e se o
inserto gE.VDA estava na orientação correta dentro do plasmídeo (sentido horário).
Digestões com a endonuclease BamH I também foram realizadas como controle do
padrão de migração das bandas resultantes das digestões.
Quatro microlitros de DNA foi digerido com a enzima BamH I (BioLabs) e com
a enzima EcoR I para uma digestão final de 30 µL a 37 ºC durante uma e três horas,
67
respectivamente). A digestão foi analisada por eletroforese em gel de agarose 0,8%,
conforme descrito anteriormente (item 2.3.1), com a aplicação de 6 µl de cada
digestão. Para controle da digestão foram também digeridos DNAs recombinantes
vazios (plasmídeo pFastBac™1 desarmado) e DNA do plasmídeo pFastBac™1
circular.
O crescimento bacteriano com o subclone recombinante pFastBac-gE.VDA foi
cultivado em um volume maior de meio LB com ampicilina e depois foi armazenado
com glicerol 60% (ANEXO A) no ultracongelador –70 ºC.
2.7 TRANSPOSIÇÃO DO DNA PLASMIDEAL RECOMBINANTE pFASTBAC-
gE.VDA COM O BACULOVÍRUS RECOMBINANTE “BACMID” ATRAVÉS DA
TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E. coli DH10BAC™
Para transposição foram utilizadas as células E. coli DH10Bac do kit “Bac-to-
Bac® Baculovirus Expression Systems” (Invitrogen™). O genótipo dessa linhagem
celular se caracteriza por conter inserido em seu genoma o baculovírus
recombinante “bacmid”, conforme descrito (item 1.4.4). A síntese deste protocolo,
consiste em clonar o gene de interesse dentro do plasmídeo de expresão
pFastBac™ (Invitrogen™) e depois transformá-lo dentro de células competentes E.
coli DH10Bac™ (Invitrogen™), as quais contêm o “bacmid” com um sítio marcado
para a mini-attTn7 e o plasmídeo “helper”. O elemento mini-Tn7 do plasmídeo de
xepressão (doador) pode, por transposição, se ligar ao sítio mini-attTn7 no “bacmid”,
na presença da enzima transposase, fornecida pelo plasmídeo “helper”. Colônias
bacterianas contendo o “bacmid” recombinante são identificadas pela ruptura do
gene da lacZ, quando crescidas em meio com indutores da cor.
2.7.1 Transposição do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA por
transformação das células competentes DH10Bac
Após a análise eletroforética em gel de agarose para observar a qualidade e a
concentração do DNA recombinante, este foi diluído (1:30) em tampão TE (pH 8,0) e
3 µl foram usados para transformar células competentes DH10Bac™. Como controle
da transposição, foi usado o plasmídeo controle pFastBac™-Gus diluído (1:8) em
tampão TE (pH 8,0).
68
O co-cultivo foi conduzido conforme descrito (item 2.6.1) com um volume de 3
µL do DNA recombinante pFastBac-gE.VDA diluído 1:30.. Como controle das
transformações foram transformadas células competentes DH-10Bac™ e 2 µLdo
plasmídeo pFastBac™-Gus diluído 1:8.
As transformações foram mantidas em banho de gelo durante 30 minutos. Os
demais procedimentos de transformação foram realizados como descrito
anteriormente (item 2.6.1) e então foram incubadas a 37 ºC
sob agitação constante
de 200 x rpm, durante 4 horas. Após o período de incubação, cada transposição foi
diluída com meio SOC 10
-1
e 10
-2
. Cem microlitros de cada diluição foi plaqueado em
agar Lúria (ANEXO A) com antibióticos e X-gal/IPTG, e em duplicata . As placas
agar Lúria (ANEXO A) foram preparadas com antibióticos (50 µg/mL de kanamicina,
7 µg/mL de gentamicina, 10 µg/mL de tetraciclina) e com X-gal (20 µg/mL; USB)
(ANEXO A) e IPTG (40 µg/mL) (ANEXO A). Os antibióticos e o indutor da cor X-
gal/IPTG foram usados para seleção prévia das células transformadas com
recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA. As células DH10Bac™ transformadas
(controle celular) foram plaqueadas em agar Lúria com e sem antibióticos. As placas
foram incubadas a 37 ºC por 24 a 48 horas.
2.7.1.1 Seleção dos recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA pelo fenótipo das
colônias bacterianas
Colônias brancas contendo o recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA
(subclone pFastBac-gE.VDA dentro do “bacmid”), resultantes da tranfromação de
células DH10Bac, foram selecionadas para o isolamento do DNA recombinante.
Para confirmar o fenótipo das colônias, elas foram re-semeadas em placa agar Lúria
com antibióticos e X-gal/IPTG. As colônias que cresceram isoladas e que
confirmaram o fenótipo branco foram colhidas assepticamente e inoculadas em 3 mL
de meio LB contendo antibióticos (kanamicina, gentamicina e tetraciclina) e
incubadas a 37 ºC por 18 horas.
Uma colônia azul da transposição somente com DH10Bac “bacmid” (controle
celular e dos antibióticos), uma colônia recombinante bacmid.pFastBac desarmado
(vazio, sem inserto do recombiante pFastBac-gE.VDA) e uma colônia recombinante
69
bacmid.pFastBac-Gus (DNA controle da transposição e da co-transfecção) também
foram colhidas para serem usadas como controle.
2.7.1.2 Isolamento do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA de colônias
bacterianas DH10Bac™ transformadas – Isolamento de plasmídeos grandes
O isolamento dos DNAs recombinantes foram realizados seguindo o protocolo
estabelecido no manual de instrução do kit “Bac-toBac® Baculovirus Expression
Systems” (página 8, item 3.5). Um e meio mililitros de cultivo dos recombinantes
bacmid.pFastBac-gE.VDA foram transferidos para um tubo de microcentrífuga. O
cultivo do recombinante bacmid.pFastBac desarmado (vazio / sem inserto do
recombinante pFastBac-gE.VDA), do recombinante bacmid.pFastBac-Gus e das
células DH10Bac “bacmid” (controle celular e dos antibióticos) também foram
processados. O “pellet” celular foi recuperado por centrifugação a 8000 x g por 1
minuto a 4 ºC e foi adicionado 300 µL de Solução I-G (ANEXO A) ao “pellet” celular.
O conteúdo foi cuidadosamente homogeneizado e incubado a temperatura ambiente
por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados, lentamente, 300 µL de acetato de
potássio 3 M (pH 5,5) a 4 ºC. Durante a adição do acetato gelado um espesso
precipitado branco de proteína e DNA genômico de E. coli foi se formando. Os tubos
com as amostras foram incubados no gelo por 5 a 10 minutos e então centrifugados
por 10 minutos a 14.000 x g. O sobrenadante recuperado, sem nenhum traço de
material precipitado branco, foi cuidadosamente transferido para tubos limpos
contendo 800 µL de isopropanol absoluto. O material foi cuidadosamente misturado
por inversão dos tubos (5 a 6 inversões) e depois incubado no gelo por 5 a 10
minutos. Após esta incubação, os tubos foram centrifugados por 15 minutos a
14.000 x g em temperatura ambiente.
O sobrenadante dos tubos foi descartado e ao “pellet” foram adicionados 500
µL de etanol 70%. Os tubos foram invertidos várias vezes e foram novamente
centrifugados por 5 minutos a 14.000 x g em temperatura ambiente. Com muito
cuidado, o etanol 70% foi removido e o “pellet” foi desidratado em temperatura
ambiente durante 10 minutos e ressuspendido com 40 µL de TE (pH 8,0).
Antes de ser armazenado a –20 ºC, uma alíquota do DNA plasmideal
recombinante foi separada para ser testada em gel de agarose e PCR.
70
2.7.1.3 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA isolado de
colônias bacterianas DH10Bac™ transformadas
2.7.1.3.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA por
eletroforese em gel de agarose
Cinco microlitros do DNA recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA foi testado
em gel de agarose 0,5% a 23 volts durante 12 horas, conforme procedimento
descrito no item 2.3.1. A amostra do DNA recombinante bacmid.pFastBac
desarmado (vazio / sem inserto do recombinante pFastBac-gE.VDA), do
recombinante bacmid.pFastBac-Gus (DNA controle da transposição) e das células
DH10Bac “bacmid” (controle celular e dos antibióticos) também foram testados como
controle.
O gel de agarose foi realizado para analisar a presença do DNA na amostra
testada e sua concentração, para posterior uso na co-transfecção em células do
inseto Trichoplusia ni.
2.7.1.3.2 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA pela técnica
da PCR
As amostras dos DNAs recombinantes bacmid-gE.VDA foram testadas pela
PCR usando os mesmos “primers” (PS.gE sítio EcoR I e PA.gE sítio BamH I) e as
mesmas condições utilizadas para amplificar a glicoproteína gE do VDA (item 2.4.2).
Também foram testados os DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-Gus e
bacmid.pFastBac desarmado (vazio / sem inserto do recombinante pFastBac-
gE.VDA) como controle negativo.
2.8 CO-TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS DE INSETO COM O DNA VIRAL
RECOMBINANTE BACMID.pFASTBAC-gE.VDA
2.8.1 Preparo das células do inseto Trichoplusia ni em placas de cultivo
Células Trichoplusia ni BTI-Tn5B1-4 em cultura (GRANADOS et al., 1994)
pertencentes ao banco de células do Laboratório de Microscopia Eletrônica e
71
Virologia, departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, DF (UnB)
foram usadas neste experimento. As células foram mantidas em meio TC-100
(Gibco-BRL), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB; Cultilab) e
incubadas a 27 ºC.
Uma garrafa de 25 cm
2
contendo as células do inseto BTI-Tn5B1-4 com
quatro dias de cultivo foram ressuspendidas em aproximadamente 6,5 mL de meio.
Placas de 35 mm de diâmetro receberam 1,5 mL de meio TC-100, suplementado
com 10% SFB e 0,5 mL (6x10
5
células) da suspensão celular foi adicionada a cada
placa previamente guarnecida com meio. As células foram cuidadosamente
homogeneizadas e mantidas a 27 ºC por 3 a 4 horas, para a formação da
monocamada de células.
2.8.2 Preparo do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA
Cinco microlitros de cada um dos DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-
gE.VDA foram diluídos em 250 µL de meio TC-100 sem soro, acondicionado em
poços identificados de uma microplaca de 24 poços. Também foram preparados os
DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição) e o
bacmid.pFastBac desarmado (da colônia azul vazia da transposição / sem inserto
do recombinante pFastBac-gE.VDA).
Cinqüenta microlitros do lipossomo lipofectina (CellFECTIN®; Invitrogen™),
foram diluídos em 3,5 mL de meio TC-100 sem soro. O lipossomo foi utilizado por
interagirem com o DNA facilitando a introdução de ácidos nucléicos dentro das
células do inseto. Em seguida, 250 µL dessa mistura foi cuidadosamente misturada
à solução contendo o DNA recombinante no poço da microplaca e incubados por 30
minutos à temperatura ambiente.
2.8.3 Co-transfecção em células de inseto do DNA viral recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA com lipofectina
Foi retirado o meio de cultura das células e foi adicionado 500 µL da mistura
do DNA recombinante com lipofectina e as microplacas foram incubadas em
temperatura ambiente por 3 horas. Após esse período, a mistura foi retirada,
72
substituída por 2 mL de meio TC-100 contendo 10% SFB e incubadas a 27 ºC,
durante cinco dias. Células com o “bacmid” recombinante apresentaram ECP (efeito
citopático), porém com fenótipo sem a formação de poliedros (occ-) no núcleo da
célula hospedeira, uma vez que o gene da poliedrina está deletado no “bacmid” do
kit “Bac-to-Bac® Baculovírus Expression Systems”. Ao final do período de
incubação o sobrenadante e as células co-transfectadas foram ressuspendidos,
colhidos em dois microtubos de 1,5 mL e centrifugados a 2500 x g por 10 minutos
em temperatura ambiente. O sobrenadante contendo os vírus “budded virus” (BV)
recombinantes (bacmid.pFastBac-gE.VDA, bacmid.pFastBac-Gus e bacmid.pFast
Bac desarmado) foram recuperados por centrifugação e armazenados ao abrigo da
luz a 4 ºC. O “pellet” celular foi lavado duas vezes com 1 mL de PBS (pH 7,2)
(ANEXO A) sob centrifugação a 2500 x g por 5 minutos e armazenados no
ultracongelador –70 ºC.
2.8.3.1 Isolamento do DNA viral recombinante “bacmid” das co-transfecções
Um mililitro do sobrenadante viral recombinante “bacmid” recuperado por
centrifugação foi centrifugado a 14.000 x g por 15 minutos em temperatura
ambiente. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” viral foi ressuspendido com 100
µL de tampão “Virus Disruption” (ANEXO A). Foram adicionados 2,5 µL de
proteinase K (20 mg/mL), resultando em uma concentração final de 500 µg/mL. A
mistura foi incubada a 37 ºC durante a noite (~18 horas). Ao término da digestão, o
DNA foi purificado por extração seqüencial. Na primeira extração, foi adicionado aos
100 µL da digestão, 50 µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e na
segunda extração foi adicionado 50 µL de clorofórmio. Após a homogeneização do
conteúdo dos tubos a fase superior foi recuperada por centrifugação a 14.000 x g
por 5 minutos. O DNA foi precipitado com a adição de 9 µL (1/10 do volume inicial)
de acetato de sódio 3 M (pH 5,2). O conteúdo foi homogeneizado por inversão do
tubo (5 a 6 vezes) e foram adicionados 180 µL de etanol absoluto à temperatura
ambiente (duas vezes o volume inicial). O precipitado foi mantido a –20 ºC por 18
horas e em seguida foi centrifugado a 14.000 x g por 10 minutos. O “pellet” foi
lavado com 400 µL de etanol 70% e novamente centrifugado por 2 minutos. O etanol
73
foi descartado e o “pellet” foi desidratado à temperatura ambiente durante 10
minutos e ressuspendido em 20 µL de água Mill-Q estéril.
2.8.3.1.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA das co-
transfecções pela técnica de PCR
O DNA extraído do sobrenadante da co-transfecção foi analisado em reações
de PCR com os oligonucleotídeos desenhados para amplificar toda a seqüência
codificadora da gE do VDA. As reações de PCR foram feitas sob as mesmas
condições utilizadas para amplificar a glicoproteína gE do VDA (item 2.4.2). Também
foram testados os DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-Gus e bacmid.pFastBac
desarmado que foram co-transfectados como controle negativo.
2.8.4 Infecção de culturas celulares de inseto com vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA para avaliação dos níveis de expressão e tempo
de infecção
Células do inseto BTI-Tn5B1-4 (6x10
5
) foram semeadas em 2 mL de meio
TC-100 suplementado com 10% SFB em microplacas de 35 mm de diâmetro. As
células foram incubadas a 27 °C para a formação da monocamada celular por 24
horas. Em seguida, as células foram inoculadas com 10 unidades formadoras de
placa (pfu)/célula de vírus recombinante das co-transfecções. O inóculo foi
adicionado às células e mantido por 2 horas, sendo homogeneizado a cada 15 a 20
minutos. Após o período de incubação o inóculo foi retirado, hora zero pós inoculo, e
as células receberam, 2 mL de meio com 10% SFB e foram incubadas a 27 °C. A
partir da hora zero, foram realizadas as coletas das células às 12, 24, 48, 72 e 96
horas pós-infecção (hpi). Após cada coleta, as células foram recuperadas por
centrifugação a 500 x g por 10 minutos, lavadas com PBS, conforme descrito
anteriormente (item 2.8.3) e congeladas no ultracongelador –70ºC. Ao final de todas
as coletas, os “pellets” celulares foram preparados para serem aplicados em gel de
SDS-PAGE para determinar o momento em que a glicoproteína de interesse é
expressa e quando as células infectadas expressando a glicoproteína devem ser
colhidas.
74
Também foram infectadas células de inseto com vírus tipo AcMNPV
selvagem, recombinante bacmid.pFastBac-Gus e bacmid.pFastBac desarmado
como controle. Células BTI-Tn5B1-4 não infectadas também foram incubadas.
2.8.5 Preparo das amostras de células co-transfectadas e infectadas com vírus
recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA
O “pellet” celular de co-transfecções e de infecções com vírus recombinantes
bacmid.pFastBac-gE.VDA lavados em PBS, conforme descrito (item 2.8.3), e
armazenados em ultracongelador –70 ºC, foram ressuspendidos em um volume de
PBS (pH 7,2) conforme a concentração celular do “pellet”. Uma alíquota do
ressuspendido celular foi misturada com igual volume de tampão de amostra de
proteína (Tampão Redutor) (ANEXO A) e o material foi aquecido a 95 °C por 5
minutos para desnaturação das proteínas. Imediatamente as amostras foram
mantidas em banho de gelo até o momento de sua aplicação no gel de SDS-PAGE.
O material celular das infecções em células de inseto com vírus recombinante
foram colhidos com diferentes horas pós-infecção.
Como controle, também foram preparados “pellets” celulares infectados com
vírus tipo selvagem AcMNPV, recombinante bacmid.pFastBac-Gus e
bacmid.pFastBac desarmado (vazio). Células BTI-Tn5B1-4 não infectadas também
foram preparadas (mock).
2.9 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA GLICOPROTEÍNA E POR ELETROFORESE
EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) EM CONDIÇÕES
DESNATURANTES
O padrão protéico resultante da expressão do vírus recombinante
bacmid.pFasBac-gE.VDA foi avaliado segundo Laemmli (1970) para análise de
proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de
sódio (SDS-PAGE). Amostras de células previamente preparadas com tampão
redutor foram devidamente identificadas e posteriormente aplicadas no gel de SDS-
PAGE.
75
2.9.1 Preparo dos géis de poliacrilamida
A concentração de poliacrilamida utilizada foi de 4% para o gel de
empilhamento (concentrador) e de 12% para o gel de separador, em tampão de
corrida (ANEXO A). Os géis foram preparados conforme Laemmli (1970).
2.9.2 Análise dos géis de poliacrilamida
As amostras celulares foram analisadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS-PAGE usando dois sistemas: o “Mini-Protean II Eletrophoresis
Cell” (Bio-Rad®) e o “Hoefer® MiniVE Vertical Eletrophoresis System” (Hoefer).
Para o primeiro a eletroforese foi realizada a 120 volts (amperagem livre) por 20
minutos (até passar pelo gel concentrador) e em seguida a 130 volts (amperagem
livre) por mais 90 minutos. Para o segundo sistema a eletroforese foi realizada a 30
miliamperes (mA) e voltagem livre por 45 minutos (até passar pelo gel concentrador)
e em seguida a 50 mA por mais 3 a 4 horas, com voltagem livre. D
Dez microlitros de cada amostra preparada com tampão redutor foram
aplicadas no gel. Foi incluído no teste como padrão de monitoramento da
eletroforese um marcador de alto peso molecular. Como marcadores foram
utilizados o “BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder” (6 a 180 kDa) (Invitrogen™)
ou o “High Molecular Weight Standard Mixture” (29 a 205 kDa ) (SDS-6H; Sigma®).
2.9.3 Revelação dos géis
O gel foi corado e fixado em solução “Coomassie blue” (ANEXO A) por 18
horas, sob leve agitação e descorado em solução descorante (ANEXO A) por
aproximadamente 2 horas, sob leve agitação.
76
2.10 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA GLICOPROTEÍNA E POR “WESTERN
BLOTTING”
As células BTI-Tn5B1-4 infectadas com vírus recombinante foram
centrifugadas a 500 x g por 10 minutos e lavadas duas vezes com PBS (pH 7,2),
conforme descrito anteriormente (item 2.3.8). Uma alíquota da amostra
ressuspendida em PBS foi aquecida a 95 °C por 5 minutos com tampão
desnaturante de amostra e em seguida as amostras foram analisadas por
eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a 12%, conforme Laemmli (1970).
Após a eletroforese, o gel foi utilizado para transferência das proteínas para uma
membrana de nitrocelulose, para realizar a imunodetecção (“Western blotting”).
2.10.1 Transferência do gel de poliacrilamida para membrana de nitrocelulose
Após a eletroforese, uma tira do gel, que correspondente ao marcador de alto
peso molecular, foi recortada e revelada conforme descrito (item 2.9.3). O marcador
foi incluído no gel como padrão de monitoramento da eletroforese. O restante do gel
de proteínas foi transferido para uma membrana de nitrocelulose (Osmonics),
usando-se o equipamento de transferência “MiniVE® Blotter System” (Hoefer®). A
transferência do gel foi realizada a 100 volts e miliamperagem livre por 60 minutos.
Após a transferência, a membrana foi bloqueada com proteína (soro albumina
bovina) e armazenada em congelador –20 ºC ou foi imediatamente lavada para
posterior imunodetecção.
Também foi utilizada membrana de nitrocelulose (Schleicher), usando-se o
equipamento de transferência da Bio-Rad®, o “Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer
Cell”, de acordo com o protocolo do fabricante.
2.10.2 “Western blotting”
Após a transferência, a membrana foi bloqueada com 3% de soro albumina
bovina (BSA) em PBS (pH 7,2) por 60 minutos e armazenada em congelador a –
20 ºC ou imediatamente lavada. A membrana foi lavada três vezes, durante 15
minutos, com PBS-T20 0,05% (ANEXO A). A membrana foi cortada em tiras
77
(canaletas) ou partes maiores, dependendo do material celular recombinante
transferido para a membrana ou do soro suíno sangüíneo e da diluição deste.
Depois de lavada, a membrana foi incubada durante 90 minutos em temperatura
ambiente ou à noite (~18 horas) a 4 ºC com o primeiro anticorpo sob agitação leve
(~70 rpm). As membranas ou tiras foram incubadas com o primeiro anticorpo diluído
em PBS-BSA 1%. Foram utilizados soro suíno anti-gE do VDA (IDEXX), soro suíno
SPF (Embrapa Suínos e Aves) e soro suíno positivo policlonal para anticorpos contra
o vírus da doença de Aujeszky (infecção de campo; CEDISA). Em seguida a
membrana foi lavada com PBS-T20 0,05% conforme descrito no início deste item e
em seguida incubada durante 1 a 2 horas com o segundo anticorpo, conjugado
peroxidase (HRP) IgG anti-suíno 0,5 mg (KPL) diluído 1:3500 a 1:7000 em PBS-
BSA 1%, sob agitação leve (~70 rpm). Após esta incubação a membrana foi lavada
conforme descrito no início deste item com PBS-T20 0,05% e incubada com solução
reveladora tampão DAB (cromatógeno 3 - 3’ diaminobenzidine; Sigma®) (ANEXO
A) sob agitação leve durante 10 a 20 minutos (até o aparecimento das bandas). A
reação foi então bloqueada com PBS-T20 0,05%.
2.11 PRODUÇÃO DE ESTOQUES VIRAIS
As cepas virais recombinantes foram amplificadas em cultivo de células do
inseto Trichoplusia ni BTI-Tn5B1-4, mantidas em meio TC-100 (GIBCO-BRL),
suplementadas com 10% de SFB e incubadas a 27 °C (GRANADOS et al., 1994).
2.11.1 Produção de proteína heteróloga secretada em células do inseto T. ni
A propagação de vírus recombinante em células BTI-Tn5B1-4 foi realizada
usando uma MOI de 10 vírus por célula. O inóculo foi mantido por 2 horas, sendo
homogeneizado sobre as células a cada 15 a 20 minutos. Após o período de
incubação, o inóculo foi retirado e as células receberam 2 mL de meio novo com
10% SFB e foram então incubadas a 27 °C durante 96 horas. Ao final do período de
incubação as células foram recuperadas por centrifugação a 500 x g por 10 minutos,
lavadas com PBS conforme descrito no item 2.3.8 e congeladas no ultracongelador –
78
70ºC. As células inoculadas foram preparadas, conforme descrito anteriormente
(item 2.8.5), e foram aplicadas em um gel de SDS-PAGE (alguns géis foram
transferidos para membrana de nitrocelulose para a realização do “Western blotting”)
para constatar a expressão e quantidade da glicoproteína E do VDA produzida.
2.11.2 Produção de estoque do vírus recombinante
O baculovírus selvagem Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
(AcMNPV), os vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA, o vírus recombinante
bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição e da co-transfecção) e o vírus
recombinante bacmid.pFastBac desarmado (controle negativo), produzidos neste
experimento, foram propagados em células do inseto BTI-Tn5B1-4 (2x106/ garrafa
25 cm
2
), infectadas com 1 pfu por célula com cada um dos vírus acima citados. Os
cultivos foram mantidos a 27 ºC durante 5 a 7 dias. Após isso, o sobrenadante foi
colhido, centrifugado a 500 x g por 15 minutos, recuperado em frascos limpos e
armazenado a 4 ºC ao abrigo da luz. Células BTI-Tn5B1-4 não infectadas (mock)
foram mantidas como controle da infecção.
79
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O VDA causa infecções em suínos, os quais são considerados como
hospedeiros naturais do VDA por sua habilidade de desenvolverem infecções
subclínicas ou latentes (KLUGE, et al., 1999). A doença de Aujeszky causa grandes
prejuízos econômicos ao produtor e à agroindústria suinícola (ROMERO et al., 1989;
TOOD; McFERRAN, 1985). Uma das medidas para o controle da doença é o uso de
vacina nos plantéis suínos diagnosticados com a doença.
Porém, segundo Gut et al. (1999), o sucesso de um programa de controle e
de erradicação da doença, dependerá também, do uso de vacinas diferenciais com
deleção de um gene que codifica uma glicoproteína não essencial (KIT e KIT, 1991)
associado a testes sorológicos que permitam detectar, com precisão, suínos
infectados. A diferenciação entre suínos infectados e vacinados para a DA é muito
importante para o controle da doença em países que praticam a vacinação (VAN
OIRSCHOT e OEI, 1989).
Neste trabalho, foi clonado um fragmento de DNA de 1772 kb, amplificado
pela PCR, contendo toda a seqüência codificadora do gene da glicoproteína E (gE)
do vírus da doença de Aujeszky (VDA), no genoma do baculovírus recombinante
“bacmid” do AcMNPV, e sua expressão em células de insetos, com o objetivo de
desenvolver insumos e aprimorar tecnologias que sejam mais rápidas, sensíveis e
específicas de diagnóstico para uso em regiões livres ou em erradicação da DA.
A produção do DNA genômico do VDA, sua qualidade e concentração é o
primeiro resultado a ser mostrado.
3.1 PRODUÇÃO DE DNA GENÔMICO VDA
A qualidade e a concentração dos DNAs do VDA produzidos foram analisados
em gel de agarose 0,8%. Na figura 10 observa-se três amostras do DNA genômico
do VDA não digerido e na figura 11 o DNA genômico dos três DNAs digeridos com a
enzima BamH I.
80
Figura 10 – DNA genômico do vírus da doença de Aujeszky. Poço 1) Marcador 1kb DNA Ladder
(Invitrogen™); Poços 2, 3 e 4) Amostras de DNA genômico do VDA.
Figura 11 – DNA genômico do VDA digerido com BamH I. Poços 1 e 5) Marcador 1 kb DNA Ladder;
Poços 2 a 4) Três amostras de DNAs VDA digeridos com BamH I.
As três cepas virais do VDA digeridas com BamH I apresentaram padrão
genômico tipo II (CHRISTENSEN; SOERENSEN; LEI, 1987; HERRMANN;
HEPPNER; LUDWIG, 1984) segundo padrão de migração, no gel de agarose, dos
três primeiros fragmentos digeridos, confirmando com os resultados obtidos por
Piatti et al. (2001) e Schaeffer et al. (2005). A digestão com BamH I pode liberar,
dependendo da cepa viral, até 17 fragmentos (KLUPP et al., 2004). O gene gE.VDA
está localizado na região U
S
do genoma viral, no fragmento 7 (BRACK et al., 2000;
KLUPP et al., 2004; METTENLEITER, 2000) e, a digestão dos DNAs genômicos do
VDA com BamH I, revelou a presença do fragmento 7 BamH I nas cepas virais
utilizadas.
3054 pb
1 2 3 4
1 2 3 4 5
Fragmento 7
BamH I
7126 pb
2036 pb
2036 pb
6108 pb
81
3.2 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Uma alíquota de 8 µL de cada reação de PCR gE.VDA foi testada por
eletroforese em gel de agarose. O padrão de migração das bandas foi conferido com
o uso do marcador 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen™) diluído 1:5 (Figura 12).
Figura 12 - Gel de agarose 0,8% da PCR gE.VDA. Figura A: Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder;
Poços 2 a 5) Quatro reações PCR com DNA VDA com amplificação da seqüência
gE.VDA. Poço 6) Reação PCR com água Milli-Q estéril (controle da PCR). No detalhe,
reações PCR com amplificação da gE.VDA.
A PCR com os “primers” sense (PS) e antisense (PA) gE com sítios de
restrição EcoR I e BamH I, respectivamente amplificou um fragmento de 1771 pb,
correspondente ao tamanho da seqüência codificadora gE do VDA (1734 pb) mais
os 37 oligonucleotídeos dos “primers”. A Taq DNA polimerase adicionada a PCR
após os primeiros 4 a 5 minutos da desnaturação da reação, permite maior
fidelidade, resultando em mais especificidade e habilidade em gerar fragmentos
maiores (CLARK, 1988).
O objetivo da amplificação do gene completo da gE do VDA foi obter sua
expressão em cultivo celular para uso em produção de anticorpos monoclonais e de
kits de diagnóstico que identifiquem e diferenciam animais infectados dos vacinados
contra o VDA. Após a amplificação pela PCR, o produto foi clonado e depois o gene
foi inserido no “bacmid” e expresso em cultivo celular. Morenkov et al. (1997), para
caracterizarem diferentes epítopos antigênicos da gE do VDA, também usaram a
técnica da PCR para amplificar parte da seqüência 5’-terminal de 1 a 125
2036 pb
1636 pb
Amplificação gE.VDA
1771 pb
1 2 3 4 5 6
82
aminoácidos codificada pelo gene da gE do VDA. O produto foi usado para
clonagem e posterior produção de anticorpos monoclonais, os quais foram testados
em diferentes técnicas de ELISA, usando como antígeno o VDA selvagem. Em um
outro experimento, com o vírus Nipah, Eshaghi e colaboradores (2004), também
clonaram e expressaram um gene viral, usando a PCR para amplificar o produto de
interesse, no caso o gene G do vírus Nipah. A finalidade da expressão deste gene,
também foi a sua aplicação para o diagnóstico da enfermidade.
Ainda com o objetivo de produzir testes sorológicos de diagnóstico e de
melhorarem sua sensibilidade e especificidade para a DA, inclusive diferenciando
animais vacinados dos infectados com VDA, Gut et al. (1999) e Kimman et al.
(1996), desenvolveram testes imunoenzimáticos do tipo ELISA. Entretanto, para a
clonagem usaram como produto o fragmento 7 BamH I, resultado da digestão do
DNA genômico do VDA.
A técnica da PCR além da amplificação da seqüência codificadora da gE do
VDA, adicionou uma adenosina (A), pela ação do DNA polimerase, nas duas
extremidades do produto da PCR, conforme descrito (CLARK, 1988), o que facilitou
a ligação com o plasmídeo pGem-T Easy, por este conter uma timidina (T) nas duas
extremidades de clonagem (3’-T) do plasmídeo (KNOCHE e KEPHART, 1999;
KOBS, 1995).
3.2.1 Purificação e análise da seqüência gE.VDA amplificada pela PCR
A figura 13 mostra um gel de agarose 0,8% usado na análise da qualidade e
concentração das amostras de DNA gE do VDA purificadas com kit ”Wizard® SV Gel
and PCR Clean-Up System” e do plasmídeo pGem®-T Easy, que foram usados na
clonagem.
83
Figura 13 – Teste da qualidade e concentração do DNA gE.VDA purificado e do plasmídeo pGem®-T
Easy. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2) Marcador Lambda DNA EcoR I +
Hind III (Promega); Poços 3 a 6) DNA gE purificado: “pool” de reações da PCR que
obtiveram amplificação do gene gE.VDA; Poço 7) DNA do plasmídeo pGem®-T Easy.
A qualidade do DNA é importante para obtenção da clonagem e a
concentração é avaliada para o cálculo da razão molar (quantia de plasmídeo:
quantia de DNA amplificado) que define o volume da cada produto usado para a
clonagem (MARCUS, HARTNETT e STORTS, 1996; SAMBROOK, FRITSCH e
MANIATIS, 1999).
3.3 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DH5α™ - CLONAGEM E
SUBCLONAGEM DA GLICOPROTEÍNA E DO VDA
3.3.1 Ligação inserto gE.VDA com o plasmídeo pGem®-T Easy e clonagem por
transformação das células competentes
O produto de 1771 pb da seqüência completa gE do VDA amplificado pela
PCR foi clonado no pGem®-T Easy através da enzima T4DNA ligase. O produto da
ligação foi transformado em células E. coli DH5α™, originando o plasmídeo pGem-
gE.VDA, com aproximadamente 4,786 kb (Figura 14).
pGem-T Easy
3015 pb
1 2 3 4 5 6 7
2036 pb
1904 pb
1636 pb
21.226 pb
gE.V
DA
purificada
1771 pb
84
3.3.1.1 Análise do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA isolado por
minipreparação
As amostras de DNAs plasmideais recombinantes preparadas por
minipreparação, resultantes da clonagem da gE.VDA com o pGem®-T Easy, foram
analisadas por eletroforese em gel de agarose (Figura 14).
DNA recombinante desarmado
Figura 14 – DNAs da minipreparação da clonagem pGem-T Easy com a seqüência codificadora gE do
VDA. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2) DNA plasmideal pGem®-T Easy;
Poços 3 a 4 e 6 a 12) DNAs plasmideais recombinantes pGem desarmados (vazios);
Poço 5) DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA (no detalhe) com 4786 pb.
A amostra de DNA plasmideal recombinante com a seqüência gE.VDA
inserida no plasmídeo apresenta um padrão de migração mais lento (~4786 pb) que
os demais DNAs plasmideais recombinantes testados (recombinante plasmideal
pGem desarmado / vazio).
O gene completo da gE do VDA com 1734 pb (HYUN et al., 2003) foi
amplificado pela PCR com os sítios EcoR I e BamH I provenientes dos “primers”,
adicionando à seqüência da gE mais 37 pb durante a amplificação. Este fragmento
da seqüência gE.VDA de 1771 pb foi clonado (ligado pela ação da enzina T4DNA
ligase) à região de clonagem múltipla do plasmídeo pGem®-T Easy, que é
flanqueado pelos promotores da RNA polimerase T7 e SP6 (KNOCHE e KEPHART,
1999; KOBS, 1995). Com a ligação do fragmento gE.VDA (1771 pb) ao plasmídeo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1636 pb
4072 pb
85
pGem® -T Easy (3015 pb), obteve-se um plasmídeo recombinante de 4786 pb
através da transformação. A construção do plasmídeo recombinante é facilitada
pelas características genômicas do plasmídeo pGem®-T Easy, o qual possui em
cada extremidade 3’-terminal uma timidina (T), que portanto, evitam a
recircularização do plasmídeo (MARCUS, HARTNETT e STORTS, 1996) e
favorecem uma ligação compatível de produtos da PCR gerados pela polimerase
termoestável (Taq DNA) (KNOCHE e KEPHART, 1999; KOBS, 1995) que adiciona
uma adenosina (A) em cada uma das extremidades da seqüência amplificada
(CLARK, 1988).
3.3.1.2 Análise do DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA com enzima de
restrição
Os DNAs recombinantes foram digeridos com EcoR I que clivou o DNA
plasmideal recombinante pGem-gE.VDA (4786 pb) em seus sítios para a EcoR I
(dois sítios no plasmídeo e um sítio na seqüência gE.VDA amplificada), produzindo
três fragmentos. Um fragmento com 21 pb, entre o sítio EcoR I localizado a 52 pb na
região múltipla de clonagem T7 no plasmídeo até o sítio EcoR I localizado a 13 pb
na seqüência gE.VDA (sítio EcoR I do “primer”). O segundo fragmento de 1772 pb,
entre o sítio EcoR I localizado a 13 pb na seqüência gE.VDA (sítio EcoR I do
“primer”) até o sítio EcoR I localizado a 70 pb na região múltipla de clonagem SP6 no
plasmídeo, que representa uma clivagem a 14 pb no plasmídeo e 1758 pb da
seqüência gE.VDA. Nesta clivagem o fragmento gE, perde 13 pb (região entre o
início da amplificação até o sítio EcoR I adicionado pelo “primer” com sítio EcoR I, e
incorpora 14 pb do plasmídeo (clivado a 14 pb no sítio EcoR I na região múltipla de
clonagem SP6 no plasmídeo). E um terceiro fragmento de 2993 pb, entre o sítio
EcoR I localizado a 70 pb na região múltipla de clonagem SP6 no plasmídeo até o
sítio EcoR I localizado a 52 pb na região múltipla de clonagem T7 no plasmídeo.
Este último fragmento representa quase toda a seqüência do plasmídeo. Na
clivagem o plasmídeo perde 22 pb, 8 pb na região múltipla de clonagem T7 e 14 pb
na região múltipla de clonagem SP6.
A mobilidade eletroforética de um fragmento de DNA é inversamente
proporcional ao número de pares de bases. Géis de poliacrilamida separam
fragmentos contendo até 1000 pb, enquanto que géis mais porosos, preparados com
86
agarose, conseguem resolver misturas de fragmentos maiores (ZAHA et al, 1996).
Portanto, o fragmento de 21 pb formado não pode ser visualizado em gel de agarose
devido ao seu pequeno tamanho.
As enzimas de restrição somente cortam o DNA em sítios específicos,
determinados por uma curta seqüência de nucleotídeos. Com isso, produzem um
conjunto de fragmentos específicos do DNA de um genoma. Os fragmentos
resultantes da clivagem são separados uns dos outros por eletroforese em gel, em
função de seu comprimento (ALBERTS, 1999).
Na figura 15, é demonstrado o padrão de migração em gel de agarose dos
fragmentos produzidos pela digestão com EcoR I: o DNA recombinante pGem-
gE.VDA (1772 pb), o plasmídeo pGem®-T Easy (2993 pb) e o fragmento de 21 pb
(não pode ser visualizado em gel de agarose). Também foram digeridos e incluídos
no gel de agarose, o DNA plasmideal pBlueScript® II (Stratagene) com 3000 pb, o
DNA plasmideal pGem®-T Easy e um DNA plasmideal recombinante pGem
desarmado (vazio) controle negativo.
Figura 15 – Digestão de DNAs plasmideais recombinantes com EcoR I. Poço 1) Marcador 1 kb DNA
Ladder; Poço 2) DNA plasmideal pGem®-T Easy (3015 pb); Poço 3) DNA plasmideal
pBlueScript II (3000 pb); Poço 4) DNA plasmideal recombinante pGem desarmado / vazio
(controle negativo); Poço 5) DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA.
Os resultados de clonagem com o pGem®-T Easy e o fragmento gE.VDA
obtidos neste trabalho, assim como as digestões do plasmídeo recombinante pGem-
gE.VDA corroboram com resultados obtidos em outros trabalhos (ESHAGHI et al.,
2004; GUT et al., 1999; KIMMAN et al., 1996; MORENKOV et al., 1997 ), com
plasmídeos de clonagem e/ou de expressão.
1636 pb
Plasmídeo
pGem-T Easy
2993 pb
Fragmento
pGem-gE.VDA
1772 pb
1 2
3 4 5
87
O fragmento da seqüência gE.VDA liberado após a digestão do plasmídeo
recombinante pGem-gE.VDA com EcoR I, assume uma nova seqüência de
nucleotídeos em suas duas extremidades devido clivagem no sítio EcoR I. Perde 13
pb no início na seqüência gE.VDA e são adicionados 14 pb provenientes do
plasmídeo pGem-T Easy, localizado na região múltipla de clonagem SP6 do
plasmídeo. Esse novo fragmento gE.VDA de 1772 pb possui agora um sítio BamH I,
localizado a 1739 pb na seqüência gE.VDA e dois sítios EcoR I. Um sítio EcoR I no
início da fragmento (1 pb) e o outro a 14 pb do final do fragmento (a 1758 pb na
seqüência gE.VDA). Estas localizações dos sítios na seqüência gE.VDA são
importantes por serem regiões no fragmento usadas para análise de restrição
enzimática do plasmídeo recombinante para certificação da presença e da
orientação do inserto no plasmídeo (sentido horário da seqüência gE.VDA: sítio
EcoR I – seqüência gE.VDA – sito BamH I – sítio EcoR I).
3.3.1.2.1 Análise do DNA gE.VDA liberado com EcoR I, recuperado em LMP e
purificado
Na figura 16 podemos observar, em um gel de agarose LMP 1%, a digestão
de uma quantia maior de DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA.
Figura 16 – Gel de agarose LMP 1% de digestões com EcoR I para recuperar a seqüência gE.VDA do
plasmídeo recombinante pGem-gE.VDA. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poços 2 a
4) Digestão DNA plasmideal recombinante pGem-gE.VDA.
O fragmento gE.VDA produzido pela digestão foi extraído do gel, purificado e
então, utilizado para a subclonagem com o plasmídeo de expressão pFastBac™1
com 4775 pb. Um e meio microlitros dos DNAs gE.VDA recuperados e purificados
foram analisados quanto à sua qualidade e concentração em gel de agarose 0,8%.
1 2 3 4
pGem-T Easy
2993 pb
Fragmento
gE.VDA
1772 pb
2036 pb
3054 pb
88
Um e meio microlitros do plasmídeo de expressão pFastBac™1 digerido com
EcoR I também foi analisado (Figura 17).
Figura 17 – Teste da qualidade e da concentração de DNA do fragmento gE.VDA recuperado e
purificado. Poço 1) Marcador de 1 Kb DNA Ladder; Poços 2 a 4) DNA plasmideal
recombinante pGem-gE.VDA (no detalhe); Poço 5) DNA plasmideal pFastBac™1
digerido com EcoR I.
3.3.1.2.2 Digestão do fragmento gE.VDA com a enzima de restrição Bsr I
A digestão do DNA gE.VDA com Bsr I liberou dois fragmentos de
aproximadamente 950 pb e 820 pb (Figura 18).
Figura 18 – Digestão do DNA gE.VDA com a enzima Bsr I em gel de agarose 2%. Poço 1) Marcador 1
Kb DNA Ladder; Poço 2) DNA gE.VDA não digerido; Poço 3) DNA gE.VDA digerido com
Bsr I.
O objetivo da análise foi conferir o sítio de restrição Bsr I da seqüência da gE
do VDA amplificada com os dois sítios de restrição (1772 pb). A digestão resultou
1 2 3 4
5
2036 pb
1636 pb
PFastBac
4775 pb
Fragmento
gE.VDA
1772 pb
1 2 3
820 pb
950 pb
2036 pb
89
em dois fragmentos com tamanhos compatíveis aos simulados pelo programa
NEBcutter V2.0 (VINCZE, POSFAI e ROBERTS, 2003) (Figura 19), o qual apresenta
os sítios de todas as enzimas de restrição para a seqüência gE do VDA. O sítio para
a enzima Bsr I está localizado a aproximadamente 820 pb no fragmento gE.VDA
amplificado com os dois “primers”.
O fragmento completo da gE com 1734 pares de bases submetido ao
programa NEBcutter V2.0 (VINCZE, POSFAI e ROBERTS, 2003; BioLabs) (ANEXO
E), apresentou todos os sítios de enzimas de restrição, 577 aminoácidos (aa),
GC=74% e AT=26%. O sítio para a Bsr I está localizado a aproximadamente 800 pb
na seqüência gE.VDA.
Figura 19 – Simulação do mapa de restrição da glicoproteína E com os dois “primers” com sítios de
restrição EcoR I e BamH I. No detalhe sítio da Bsr I na seqüência gE.VDA com os dois
sítios de restrição (EcoR I e BamH I).
Através da análise do mapa de restrição, é possível analisar genomas, seus
genes e fragmentos menores. As enzimas de restrição reconhecem uma seqüência
de bases específicas na dupla-hélice do DNA e cortam as duas fitas da hélice em
sítios específicos (BEN-PORAT et al., 1984; PASSAGLIA e ZAHA, 1996) e portanto,
análises da estrutura dos cromossomos, do sequenciamento de moléculas longas de
DNA, do isolamento de genes e da criação de moléculas novas de DNA que podem
ser clonadas (PASSAGLIA e ZAHA, 1996) podem ser realizadas. O número e
tamanho do fragmento, resultante da digestão de populações diferentes de
moléculas, fornecem informações sobre a constituição genética das mesmas (BEN-
PORAT et al., 1984).
90
3.3.2. Ligação e subclonagem do gene gE.VDA e do plasmídeo de expressão
pFastBac™1
Para a subclonagem do gene gE.VDA, o plasmídeo de clonagem
pFastBac™1 foi digerido com enzima de restrição EcoR I e analisado em gel de
agarose (Figura 17) quanto à sua qualidade e concentração. O fragmento
correspondente ao gene gE.VDA foi ligado ao plasmídeo pFastBac™1 e usado na
transformação de células DH5α™, formando um novo plasmídeo de
aproximadamente 6547 pb, denominado pFastBac-gE.VDA.
A figura 20 representa um gel de agarose com amostras de DNA preparadas
por minipreparação resultantes da clonagem da gE.VDA com o pFastBac™1. A
amostra de DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA apresenta um padrão
de migração no gel mais lento, diferente da migração dos fragmentos dos demais
DNAs recombinantes testados (DNA plasmideal recombinante desarmado).
Figura 20 – Gel de agarose 0,8% de amostras de DNA da miniprepreparação dos subclones
recombinantes pFastBac-gE.VDA. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2) DNA
plasmideal pFastBac™1 circular; Poço 3) DNA plasmideal pFastBac™1 digerido com
EcoR I; Poços 4 a 6 e 8) DNAs plasmideais recombinantes pFastBac desarmados
(vazios); Poço 7) DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA.
Para a subclonagem do gene gE.VDA, foi utilizado o plasmídeo de expressão
pFastBac™1, o qual possui em seu “cassette” de expressão um gene Gm
r
(resistência a gentamicina), um promotor específico do baculovírus (poliedrina), um
sítio múltiplo de clonagem e um sinal de parada SV40 (Simian Virus 40) poli A
inserido entre o braço direito (R) e esquerdo (L) do Tn7 (transposon) (LUCKOW et
1 2 3 4 5 6 7 8
Subclone
pFastBac-gE.VDA
6547 pb
1018 pb
3054 pb
5090 pb
91
al., 1993). Este plasmídeo possui também, em uma região fora dos braços do
transposon, o gene marcado para a ampicilina. O ANEXO F apresenta o desenho
esquemático do plasmídeo pFastBac™1.
Plasmídeos que transportam genes que conferem resistência a antibióticos
(PASSAGLIA e ZAHA, 1996), são úteis por permitirem distinguir células hospedeiras
que receberam o inserto com o plasmídeo recombinante daquelas que não
receberam. A seleção das colônias recombinantes, também é conduzida pelo
fenótipo da cor das colônias crescidas em meio com X-gal e IPTG, pois quando o
mini transposon salta para o sítio de ligação (mini-attTn7) na região N-terminal no
“bacmid”, ele desloca o gene lacZ (LUCKOW et al., 1993; O’REILLY, MILLER e
LUCKOW, 1992). Outra vantagem desse tipo de plasmídeo é a presença do sítio
promotor do gene da poliedrina, entre os braços do transposon. Durante a
transposição o elemento mini-Tn7 do plasmídeo transpassa para a região marcada
do “bacmid” em E. coli DH10Bac através da ação da enzima transposase fornecida
pelo plasmídeo “helper”. Dessa forma, o gene exógeno gE.VDA, sob o controle do
promotor da poliedrina no “bacmid recombinante é expresso quando introduzido (co-
trasnfectado) em células de inseto (LUCKOW et al., 1993). Este sistema elimina a
necessidade de fazer o isolamento de vírus recombinantes por testes de placa
(KOST; CONDREAY; JARVIS, 2005; ZHAO; CHAPMAN; JONES, 2003) e ainda
possibilita altos níveis de expressão das proteínas heterólogas (RIBEIRO; CROOK,
1998).
3.3.2.1 Análise do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA com enzimas de
restrição
Amostras de DNA plasmideais recombinantes (~6550pb) foram digeridas com
a enzima de restrição BamH I para certificação da transformação, produzindo duas
bandas, uma de aproximadamente 1772 pb (inserto gE.VDA) e outra de 4775 pb
(plasmídeo pFastBac™1) e se o inserto gE.VDA estava na orientação correta
(sentido horário) dentro do plasmídeo (Figura 21). Digestões com a endonuclease
EcoR I também foram realizadas como controle.
Conforme descrito no item 2.6.2.2, quando o recombinante plasmideal
pFastBac-gE.VDA está subclonado ao fragmento gE.VDA no sentido correto
(horário), a digestão com BamH I, cliva o plasmídeo recombinante em seus sítios
92
para BamH I e libera dois fragmentos. Um fragmento de 1752 pb, entre o sítio BamH
I localizado a 4032 pb no pFastBac-gE.VDA (13 pb antes do sítio EcoR I clivado no
plasmídeo) até o sítio BamH I localizado a 1739 pb na seqüência gE.VDA (sítio
BamH I do “primer”). Nesta clivagem o fragmento gE, incorpora 13 pb do plasmídeo,
região entre 4032 pb (sítio BamH I) até 4055 pb (sítio EcoR I) na região múltipla de
clonagem no plasmídeo e perde 33 pb (região entre o sítio BamH I até o sítio EcoR I
adicionado s pelos “primers” no fragmento gE.VDA). E, um segundo fragmento de
4795 pb, entre o sítio BamH I localizado 1739 pb na seqüência gE.VDA (sítio BamH I
do “primer”) até o sítio BamH I localizado a 4032 pb no pFastBac-gE.VDA (13 pb
antes do sítio EcoR I). Este último fragmento representa quase toda a seqüência do
plasmídeo.
Figura 21 – Gel de agarose 0,8% do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA. Cada DNA foi
testado na forma circular, digerido com BamH I e com digerido com EcoR I,
respectivamente. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2 a 4) DNA plasmideal
pFastBac™1 (circular, xBamH I e xEcoR I, respectivamente); Poços 5 a 7 e 11 16) DNAs
plasmideais recombinantes pFastBac desarmados/vazios (circular, xBamH I e xEcoR I,
respectivamente); Poços 8 a 10) DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA
(circular, xBamH I e xEcoR I, respectivamente). No detalhe, plasmídeo recombinante
pFastBac-gE.VDA na orientação correta.
Caso durante a ligação o fragmento gE.VDA se incorpore ao plasmídeo na
posição invertida, o sítio BamH I do fragmento gE.VDA (próximo ao final da
3054 pb
1636 pb
5090 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Plasmídeo
recombinante
desarmado
Plasmídeo
recombiante
pFastBac-gE.VDA
Plasmídeo
pFasttBac™1
93
seqüência gE) estará inserido próximo ao sítio BamH I do plasmídeo. Portanto,
quando o plasmídeo recombinante pFastBac-gE.VDA com o inserto invertido
(sentido anti-horário) for digerido com BamH I resulta em dois fragmentos. Um
fragmento de 6501 pb e outro, um pequeno fragmento de 46 pb, o qual em virtude
do pequeno comprimento da seqüência, provavelmente não poderá ser visualizado
em gel de agarose. Por outro lado, todos os DNAs plasmideais recombinantes
pFastBac desarmados (vazios) quando digeridos com BamH I produziram somente
um fragmento de 4775 pb, ocorrendo o mesmo quando digeridos com EcoR I, pois o
plasmídeo pFastBac™1 contém em sua seqüência genômica somente um sítio para
cada uma dessas enzimas de restrição (LUCKOW et al., 1993).
Dois microlitros do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA e 2 µL
do DNA pFastBac™1, foram analisados quanto sua qualidade e concentração em
gel de agarose (Figura 22).
Figura 22 – Teste da qualidade e concentração do DNA plasmideal recombinante pFastBac-gE.VDA
em gel de agarose 1%. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2) Marcador Lambda
DNA EcoR I + Rind III; Poços 3 e 4) DNA plasmideal recombinante PfastBac-gE.VDA;
Poços 5 e 6) DNA plasmideal pFastBac™1.
Após a análise em gel de agarose, o plasmídeo recombinante pFastBac-
gE.VDA na orientação correta, foi utilizado para a subseqüente transposição com o
“bacmid” através da transformação de células competentes DH10Bac™.
3054 pb
1584 pb
1 2 3 4 5 6
pFastBac-
gE.VDA
6553 pb
pFastBac™1
4775 pb
94
3.4 TRANSPOSIÇÃO DO DNA PLASMIDEAL RECOMBINANTE pFASTBAC-
gE.VDA COM O BACULOVÍRUS RECOMBINANTE “BACMID” ATRAVÉS DA
TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES E. coli DH10BAC™
O gene completo da gE do VDA foi inserido sob o comando do promotor da
poliedrina, no plasmídeo de expressão pFastBac™1 e subclonado através da
transformação de células DH5α. Depois, por transformação de células E. coli
DH10Bac™, ocorreu a recombinação homóloga entre as regiões do plasmídeo
recombinante pFastBac-gE.VDA (transposon “mini-Tn7” com o fragmento gE.VDA
inserido após o promotor polh) e do genoma viral recombinante “bacmid” (sem o
gene da poliedrina), na região de ligação “mini-attTn7”, através da transposição, a
qual ocorre por ação da enzima transposase fornecida pelo plasmídeo “helper”
(LUCKOW et al., 1993).
3.4.1 Resultado da seleção dos “bacmid” recombinantes pelo fenótipo das colônias
bacterianas
Células E. coli DH10Bac™ transformadas que receberam por transposição o
DNA recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA, adquirem resistência marcada para
antibióticos e perdem o marcador lacZ e, portanto podem ser facilmente
selecionadas e identificadas com antibióticos e indutores da cor (LUCKOW et al.,
1993; PENNOCK, SHOEMAKER e MILLER, 1984; ZHAO et al., 2003).
A transposição foi confirmada pelo fenótipo das colônias bacterianas
crescidas em agar LB com X-gal e IPTG com antibióticos. Colônias contendo o
recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA têm fenótipo branco devido a ruptura do
gene da lacZα na posição N-terminal no sítio de ligação “mini-attTn7” no “bacmid”. A
ruptura ocorreu durante a transposição, quando o plasmídeo recombinante se
inseriu no “bacmid”, deslocando o gene da lacZα (LUCKOW et al., 1993; PENNOCK,
SHOEMAKER e MILLER, 1984; O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992). Então, as
colônias crescidas com o fenótipo azul, são aquelas onde o transposon Tn7 do
plasmídeo recombinante pFastBac-gE.VDA não saltou para a região N-terminal do
“bacmid”, portanto não ocorreu a ruptura do lacZ. As colônias azuis não contêm o
fragmento recombinante gE.VDA. Gut et al. (1997) e Luckow et al. (1993), também
usaram a transposição sítio-específica para inserir genes exógenos dentro de um
baculovírus, como um vetor de transporte e propagado em células de E. coli,
95
possibilitando um grande número de vantagens para a geração de baculovírus
recombinantes em células de inseto através da recombinação homóloga.
3.4.1.1 Isolamento e análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA
de colônias bacterianas DH10Bac™ transformadas por minipreparação de
plasmídeos grandes
O DNA das colônias brancas recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA (com
inserto), de uma colônia azul recombinante bacmid-pFastBac desarmado (vazia,
sem inserto do recombinante pFastBac-gE.VDA), de uma colônia do controle da
transposição, o “bacmid” recombinante pFastBac™-Gus e de uma colônia das
células DH10Bac “bacmid” (controle celular e dos antibióticos) foram extraídos por
minipreparação de DNAs grandes.
Os DNAs das colônias “bacmid” recombinantes foram isolados e usados para
co-transfectar células do inseto Trichoplusia ni. Um único DNA viral isolado do clone
bacteriano positivo (com o fragmento gE.VDA transposto) e o uso deste DNA
recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA para co-transfectar células de inseto,
produzirão o vírus recombinante de interesse (LUCKOW et al., 1993) e a expressão
da proteína recombinante.
3.4.1.1.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA por
eletroforese em gel de agarose
A análise para avaliar a presença e a concentração do DNA recombinante foi
realizada por eletroforese em gel de agarose. Esta análise é realizada para
determinar a quantia de DNA recombinante que será usado na co-transfecção em
células de inseto. O produto isolado pela minipreparação é um DNA grande, com
mais de 135 kb e o inserto gE.VDA, de somente 1772 pb, está inserido no DNA
“bacmid” do recombinante. Portanto, não é possível observar o fragmento gE.VDA
isoladamente (o fragmento gE.VDA migra inserido ao DNA “bacmid”) entre as
bandas liberadas durante uma corrida lenta com baixa voltagem (Figura 23 A), onde
é possível observar o padrão de migração dos fragmentos que compõem a amostra
do DNA “bacmid” recombinante que migram conforme seu comprimento. O gel
96
demonstrado na figura 23 ‘B’, é resultado de uma corrida rápida com voltagem alta,
que analisa somente a concentração e a presença de DNA na amostra testada.
Figura 23 – Análise em gel de agarose 0,5% da minipreparação de DNAs “bacmid” da transposição.
Gel A - corrida 23 v por 12 horas: Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2) Amostra de DNA
recombinante bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição); Poço 3) Amostra de DNA
recombinante bacmi-pFastBac desarmado (vazio/colônia azul); Poços 4 a 9) Amostras de
DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA.
Gel B - corrida 90 v por 90 minutos: Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poços 2 a 11) Amostras de
DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA; Poço 12) Amostra de DNA recombinante
bacmi-pFastBac desarmado (vazio/colônia azul); Poço 13) Amostra de DNA recombinante
bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição); Poço 14) Amostra de DNA DH10Bac
“bacmid” (controle celular) transformadas sem o plasmídeo recombinate pFastBac-gE.VDA.
A confirmação da presença do DNA “bacmid” recombinante, através do gel de
agarose, foi indicada pela visualização de uma banda que migrou mais lentamente
que a banda produzida pelo DNA do plasmídeo “helper” e do fragmento de 12.216
pb do marcador 1 Kb DNA Ladder (Manual de Instrução “Bac-to-Bac® Baculovírus
Expression System”, 2002; Invitrogen™).
3.4.1.1.2 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA pela técnica
de PCR
O DNA recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA foi testado pela técnica de
PCR usando os mesmos “primers” (PS sítio EcoR I e PA sítio BamH I) e as mesmas
condições utilizados para amplificar a seqüência codificadora da gE do VDA.
Também foram testados DNAs das colônias recombinantes bacmid.pFastBac-Gus,
1 2 3 4 5 6 7 8 9
12.216 pb
A
DNA
“bacmid”
DNA
“helper”
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12 13 14
B
> 135 kb
1636 pb
97
recombinante bacmid-pFastBac desarmado (vazio, sem inserto do recombinante
pFastBac-gE.VDA) e um DNA das células DH10Bac “bacmid” (controle celular)
usados como controle negativo para a PCR (Figura 24).
Figura 24 – Gel de agarose das reações da PCR com amostras de DNAs de colônias da transposição
dos plasmídeos recombinantes pFastBac-gE.VDA com o “bacmid”. Poço 1) Marcador 1
Kb DNA Ladder; Poço 2) Reação PCR com água Milli Q estéril no lugar do DNA (controle
da PCR); Poço 3) Reação PCR com DNA DH10Bac “bacmid” (controle celular); Poço 4)
Reação PCR com DNA recombinante bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição);
Poço 5) Reações PCR com DNA recombinante bacmid-pFastBac desarmado (vazio / sem
inserto do recombinante pFastBac-gE.VDA); Poços 6 e 7, 9 a 11 e 12) Reações PCR com
DNA recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA sem amplificação; Poços 8, 10 e 13)
Reações PCR com DNA recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA com amplificação da
seqüência codificadora gE.VDA, no detalhe.
A amplificação da seqüência gE.VDA pela PCR, em reações onde foi usado como
DNA o vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA da transposição, demonstrou
que o gene gE.VDA está presente neste DNA.
3.5 CO-TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS DE INSETO COM O DNA RECOMBINANTE
BACMID.pFASTBAC-gE.VDA E EXPRESSÃO DO GENE HETERÓLOGO
O DNA do vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA foi tratado com
lipofectin (lipossomo) e co-transfectado em células BTI-Tn5B1-4. Amostras de DNAs
dos vírus recombinantes bacmid-pFastBac desarmado (vazio, sem inserto do
recombinante pFastBac-gE.VDA), DNA do controle da transposição, o recombinante
bacmid.pFastBac-Gus também foram preparados e co-transfectados em células
BTI-Tn5B1-4.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2036 pb
Amplificação
gE.VDA
1772 pb
1636 pb
98
Nas figuras 25 e 26 observa-se células do inseto Trichoplusia ni infectadas
com o vírus AcMNPV selvagem e com o vírus recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA, demonstrando a presença e a ausência de poliedros no núcleo celular,
respectivamente.
Figura 25 – Células Trichoplusia ni BTI-TN5B1-4 infectadas com o vírus AcMNPV selvagem.
Observa-se núcleo celular repleto de poliedros (setas).
O gene gE.VDA clonado (inserido) entre os braços do transposon Tn7 no
pFastBac, fica sob o comando do promotor da poliedrina e desta forma, nas células
de inseto, o vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA expressa a glicoproteína
gE e não expressa a poliedrina, pois o “bacmid” recombinante usado neste trabalho,
não possui o gene da poliedrina, conforme estabelecido por Luckow et al. (1993).
Lipídeos sintéticos foram especificamente projetados para formar lipossomos
(vesículas lipídicas esféricas fechadas) (STRYER, 1988), positivamente carregados
que espontaneamente interagem com DNA ou RNA (O’REILLY, MILLER e
LUCKOW, 1992). E, portanto, o uso de lipossomos catiônicos pode facilitar a
introdução de ácidos nucléicos dentro de células eucarióticas (ALBERTS et al.,
1999).
Quando este reagente é misturado com uma solução de DNA, todo o DNA é
ligado ao lipossomo. Somado a isso (O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992), quando
o complexo lipossomo-DNA é adicionado às células, o lipossomo liga-se à superfície
negativamente carregada da célula e então, se fusionam com a membrana celular,
99
introduzindo eficientemente o DNA dentro da célula hospedeira (O’REILLY, MILLER
e LUCKOW, 1992).
Figura 26 – Células Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4 infectadas com o vírus recombinante bacmid-
pFastBac.gE.VDA. Observa-se ECP no núcleo celular sem a formação de poliedros
(setas).
Cinco dias pós-infecção, as células e o sobrenadante foram colhidos e
recuperados por centrifugação. O sobrenadante com o vírus recombinante foi
recuperado e armazenado a 4 ºC. O título viral esperado da co-transfecção inicial foi
de 2 a 4 x 107 pfu/ml. Os “pellets” celulares foram preparados e aplicados em gel de
poliacrilamida e de parte do sobrenadante viral de cada “bacmid” recombinante foi
extraído o DNA.
O DNA do “bacmid” recombinante usado para co-transfectar células de inseto
produziu vírus recombinante que induzem à formação de efeito citopático sem
poliedros. Esta característica fenotípica é explicada pela ausência, no “bacmid”
recombinante utilizado no trabalho, do gene que codifica a poliedrina, conforme já
estabelecido por Luckow et al. (1993).
3.5.1 Análises dos vírus recombinantes “bacmid” expressos em células de inseto
A proteína recombinante é freqüentemente expressa em altos níveis em
larvas ou cultura de células de inseto infectadas (LUCKOW e SUMMERS, 1988;
MILLER, 1997; O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992) e a proteína de interesse é
100
detectada por meio de várias técnicas, como a eletroforese em gel de poliacrilamida,
Western blotting, ensaios enzimáticos (RIBEIRO, SOUZA e KITAJIMA, 1998) e PCR.
Uma das vantagens do sistema de expressão baseada em baculovírus, é que
esses vírus não infecção em vertebrados (FEDERICI, 1997), assim, são
considerados suficientemente seguros para manipulação e produção industrial de
proteínas de importância biotecnológica.
3.5.1.1 Análise do DNA viral recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA das co-
transfecções pela técnica de PCR
Após a co-transfecção, o produto do cultivo celular, e a glicoproteína expressa
(baculovírus em células do inseto) poderá ser identificada sob vários métodos,
incluindo amplificação por PCR (O’REILLY, MILLER e LUCKOW, 1992).
As amostras de DNAs dos vírus recombinantes “bacmid” obtidas da co-
transfecção foram analisadas pela PCR com os mesmos “primers” e condições da
amplificação da seqüência codificadora gE.VDA. Também foram testadas amostras
dos DNAs recombinantes bacmid.pFastBac-Gus e bacmid-pFastBac desarmado
(vazio, sem inserto do recombinante pFastBac-gE.VDA). O resultado da PCR foi
analisado em gel de agarose 0,8% (Figura 27).
Figura 27 - Gel de agarose das reações de PCR com amostras de DNA dos vírus recombinantes
“bacmid” da co-transfecção. Poço 1) Marcador 1 Kb DNA Ladder; Poço 2) Reação PCR
com água Milli-Q estéril no lugar do DNA (controle da PCR); Poços 3 e 7) Reações PCR
com DNA do vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA com amplificação da
seqüência codificadora gE.VDA (no detalhe); Poços 4 a 6) Reações PCR com DNA do
vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA sem amplificação; Poço 8) Reação PCR
com DNA recombinante bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição e da co-
transfecção); Poço 9) Reação PCR com DNA recombinante bacmid-pFastBac
desarmado (vazio / sem inserto do recombinante pFastBac-gE.VDA).
Amplificação
gE.VDA
1772 p
b
1636 pb
2036 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
101
Observa-se, nos poços 3 e 7 do gel de agarose da figura 27, a presença de
uma banda que migrou entre os fragmentos 1636 e 2036 pb do marcador 1 Kb DNA
Ladder, com um tamanho compatível com a seqüência gE.VDA. A amplificação da
seqüência gE.VDA, usando como DNA o sobrenadante viral da co-transfecção com
o vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA, demonstra que a proteína gE.VDA
foi expressa.
3.5.1.2 Análises eletroforéticas SDS-PAGE e “Western blotting” da expressão da
gE.VDA
Células da co-transfecção, colhidas aos 5 dias pós infecção (dpi), dos vírus
recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA foram analisadas em gel SDS-PAGE
corado com “Coomassie blue” (Figura 28) e por “Western blotting” (Figura 29).
Também foram incluídas células do inseto BTI-Tn5B1-4 não infectadas (mock), do
recombinante bacmid.pFastBac desarmado (colônia azul / subclone vazio) e o
recombinante bacmid.pFastBac-Gus (controle da transposição e da co-transfecção).
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
181,8
115,5
82,2
64,2
48,8
37,1
Figura 28 – Gel SDS-PAGE da co-transfecção dos vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA.
Poço 1) Marcador de alto peso molecular (Invitrogen); Poços 2 a 7) Vírus recombinantes
bacmid.pFastBac-gE.VDA em células de inseto e colhidas com 5 dias pi (no detalhe);
Poço 8) Vírus recombinante bacmid.pFastBac desarmado (colônia azul/subclone vazio);
Poço 9) Células BTI-Tn-5B1-4 (mock); Poço 10) Vírus recombinante bacmid.pFastBac-
Gus (controle da transposição e da co-transfecção).
Observa-se, na figura 28 (no detalhe), nos poços 2 a 7 com os vírus
recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA, a presença de banda (algumas bem
Vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA
102
tênues) expressa com um padrão de migração entre os fragmentos de 82,2 kDa e
115,5 kDa do DNA marcador, o que não é observado nos poços 8 a 10 sem os vírus
recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA.
Nos “Western blotting” foram utilizados como imunomarcadores o anticorpo
anti-gE do VDA (Figura 29), anticorpo policlonal anti-VDA e soro SPF negativo para
anticorpos anti-VDA (Figuras 30 e 31).
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
181,8
115,5
82,2
64,2
48,8
37,1
25,9
19,4
14,8
6,0
Figura 29 – “Western blotting” de vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA da co-transfecção.
Soro anti-gE do VDA (IDEXX) diluído 1:100 e conjugado peroxidase (KPL) diluído
1:7000. Poço 1) Marcador de alto peso molecular (Invitrogen); Poço 2) Células BTI-
Tn5B1-4 (mock); Poço 3) Vírus recombinante bacmid.pFastBac desarmado (colônia azul
/subclone vazio); Poço 4) Vírus recombinante bacmid.pFastBac-Gus (controle da
transposição e da co-transfecção); Poços 5 a 11) Vírus recombinantes bacmid.
pFastBac-gE.VDA (no detalhe).
No detalhe da figura 29, observa-se nos poços 5 a 11 com os vírus
recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA, banda detectada (algumas bem tênues)
pelo anticorpo anti-gE do VDA, com um padrão de migração entre os fragmentos de
82,2 kDa e 115,5 kDa do DNA marcador, o que não é observado nos poços 2 a 4
sem os vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA.
Vírus recombinante
bacmid.pFastBac
-
gE.VDA
103
Na figura 30, referente a um SDS-PAGE da infecção transiente com vírus
recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA para avaliação dos níveis de expressão e
tempo de infecção, podemos observar uma banda com um padrão de migração de
aproximadamente 62 kDa, peso molecular compatível ao sintetizado por uma
proteína celular e uma banda de aproximadamente 95 kDa que pode ser a banda
esperada para a expressão da glicoproteína E do VDA. O melhor momento da
expressão da gE.VDA, parece ser às 72 hpi.
0 12 24 48 72 96 hpi
kDa 1 2 3 4 5 6 7
205,0
116,0
97,4
66,0
45,0
29,0
Figura 30 – Gel SDS-PAGE de infecção transiente do vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA.
Poço 1) Marcador de alto peso molecular (Sigma®); Poços 2 a 7) Vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA inoculado em células de inseto e colhidas a zero, 12, 24, 48,
72 e 96 hpi, respectivamente. Observa-se banda com alta expressão com padrão de
migração de 62 kDA, referente a uma proteína expressa pela célula. Bandas expressas
com padrão de migração entre os fragmentos de 66 kDa e 97,4 kDa do marcador, são
compatíveis ao tamanho esperado da expressão da proteína gE.VDA.
No próximo “Western blotting” (Figura 31), no poço referente ao extrato de
células SK-6 infectadas com o vírus selvagem do VDA, também pode ser observado
uma banda com padrão de migração de aproximadamente 100 kDa, semelhante ao
da gE.VDA recombinante. Extratos celulares com o vírus recombinantes
bacmid.pFastBac-gE.VDA e extrato celular não infectado (controle) também foram
analisados. Foram utilizados como primeiro anticorpo, os soros suínos SPF negativo
e policlonal anti-VDA, diluídos 1:200.
Expressão
proteína celular
~62 kDa
Expressão
proteína
gE.VDA
104
SORO SANGÜÍNEO SUÍNO DILUIÇÃO 1:200
SPF POLICLONAL VDA
Figura 31 – “Western blotting” de vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA da infecção em
células de inseto. Soro policlonal anti-VDA (CEDISA) e SPF (Embrapa Suínos e Aves)
diluídos 1:200. Conjugado peroxidase diluído 1:4000. Poços 1 e 4) Células BTI-Tn5B1-4
não infectadas (mock); Poços 2, 5 e 7 a 9) Vírus recombinante bacmid.pFastBac-
gE.VDA com 96 hpi; Poço 3 e 6) Vírus VDA selvagem com 96 hpi em células SK-6;
Poço 10) Marcador de alto peso molecular (Sigma®). No detalhe, presença de bandas
com padrão de migração da gE.VDA recombinante expressa e imunodetectada.
Observa-se, na figura 31 (no detalhe), nos poços 5 a 9 (com soro suíno
positivo policlonal anti-VDA), banda com padrão de migração entre os fragmentos
97,4 kDa e 116 kDa do marcador, o que não é observado no poço 4 (com células
não infectadas). Nos poços 1 a 3 (canaletas) onde foi usado soro suíno SPF
negativo para anticorpos anti-VDA, não se observa o mesmo padrão de migração.
Um outro “Western blotting” (Figura 32) com anticorpo policlonal anti-VDA e
soro suíno SPF negativo para anticorpos anti-VDA diluídos 1:250, também detectou
uma banda com um padrão de migração correspondente ao citado acima. Neste
“Western blotting” foram incluídos extratos celulares dos vírus recombinantes
bacmid.pFastBac-gE.VDA com o inserto e desarmado, do vírus recombinante
bacmid.pFastBac-Gus, do vírus AcMNPV selvagem (com o gene da poliedrina), de
células SK-6 infectadas com o vírus VDA selvagem e do extrato celular BTI-Tn5B1-4
não infectado (controle celular).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
205,0
116,0
97,4
66,0
45,0
29,0
k
Da
105
SORO SANGÜÍNEO SUÍNO DILUIÇÃO 1:250
SPF POLICLONAL VDA
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa
Figura 32 – “Western blotting” de vírus recombinantes bacmid.pFastBac-gE.VDA da infecção em
células de inseto. Soro policlonal anti-VDA (CEDISA) e SPF (Embrapa Suínos e Aves)
diluídos 1:250. Conjugado peroxidase diluído 1:4000. Poços 1 e 9) Vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA com 72 hpi; Poços 2) Vírus recombinante bacmid.pFastBac
desarmado (colônia azul / subclone vazio); Poços 3) Células BTI-Tn5B1-4 não
infectadas (mock); Poços 4) Vírus recombinante bacmid.pFastBac-Gus (controle da
transposição e da co-transfecção); Poços 5) Vírus AcMNPV selvagem; Poços 6) Vírus
VDA selvagem com 48 hpi em células SK-6; Poços 7 e 8) Vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA com 120 e 96 hpi, respectivamente (no detalhe); Poço 10)
Marcador de alto peso molecular (Sigma®).
Neste “Western blotting” (Figura 32), também se observa a presença de
bandas com padrão de migração entre os fragmentos de 97,4 kDa a 116 kDa do
marcador, nos poços com vírus recombinante bacmid.pFast-gE.VDA e incubados
com soro suíno positivo policlonal anti-VDA. Nos poços sem o vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA e incubados com soro suíno positivo policlonal anti-VDA
ou nos poços onde as amostras foram incubadas com soro suíno negativo para VDA
(SPF), não se observa o mesmo padrão de migração das bandas, encontrado nos
poços com o vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA. Esses resultados são
similares aos encontrados no “Western blotting” da figura 31.
Análises em SDS-PAGE e “Western blotting” da gE ou de um segmento desta
e do VDA genômico têm sido documentadas (CHANG; PAN; LEE, 1996; FICINSKA
et al., 2003; MORENKOV et al., 1997; TODD; McNAIR, 1987).
205
116
97,4
66,0
45,0
29,0
106
Conforme descrito na literatura (HAMPL, 1984) as glicoproteínas do envelope
viral apresentam um peso molecular que variam entre 50 kDa a 130 kDa e que a gE
do VDA pode ser uma proteína maior ou menor, dependendo da cepa viral, o que foi
confirmado em um trabalho descrito por Ficinska et al. (2003).
No detalhe (Figura 32), presença de bandas com padrão de migração da
gE.VDA recombinante expressa e imunodetectada. Também foi observado que o
extrato celular com o vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA colhido às 96 hpi
(poço 8, no detalhe), apresentou uma melhor expressão, devido a presença de uma
banda mais nítida na membrana. Além disso, nos poços com o extrato celular do
vírus VDA selvagem, mostraram um padrão de migração das bandas diferente ao do
vírus recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA. Uma das razões, talvez, seria que no
vírus selvagem a gE foi expressa complexada com a gI (METTENLEITER, 2002;
ZUCKERMANN et al., 1988; WHEALY et al., 1993), portanto o tamanho do
fragmento formado é diferente e, também, o vírus VDA selvagem foi cultivado em
células de mamíferos (SK-6), e portanto a glicosilação das proteínas de membrana
(METTENLEITER, 2000) do VDA seriam processadas diferentemente no Golgi de
células de inseto.
Foi observado nos géis SDS-PAGE e nos “Western blotting” várias outras
bandas de diferentes padrões de migração, além da gE.VDA, nos géis e nas
membranas incubadas com soro anti-gE, policlonal anti-VDA ou mesmo SPF. Para
melhorar a especificidade dos “Western blotting” há necessidade de padronizar o
teste para a proteína gE.VDA expressa. Os vírus recombinantes serão testados sob
diferentes concentrações de soro, conjugado, tempo de incubação, bem como
outros tipos e concentrações de bloqueadores de membrana.
Futuramente, serão realizados “Western blotting” utilizando-se anticorpo
produzido de inoculações em camundongos com a glicoproteína gE.VDA recuperada
em gel de poliacrilamida (experimento em andamento). Espera-se que a
imunomarcação com este anticorpo revele uma banda de aproximadamente 100
kDa, correspondente ao extrato de células BTI-Tn5B1-4 infectadas com o vírus
recombinante bacmid.pFastBac-gE.VDA, mostrando a especificidade do anticorpo à
glicoproteína expressada pelo vírus “bacmid” recombinante em células de inseto.
3.6 Produção de proteína heteróloga secretada em células do inseto T. ni
107
Células do inseto BTI-Tn5B1-4 foram inoculadas usando uma MOI de 10
vírus/célula. O extrato celular e o sobrenadante foram colhidos com 72 e 96 hpi. O
sobrenadante foi armazenado a 4 ºC. Para confirmar a secreção da gE.VDA, o
“pellet” celular foi analisado por “Western blotting” (Figura 33). O extrato celular
colhido com 96 hpi mostrou uma maior expressão da glicoproteína gE.VDA.
72 96 hpi
kDa 1 2 3
Figura 33 – Análise por “Western blotting” do extrato celular da produção de proteína recombinante
gE.VDA em células de inseto BTI-Tn5B1-4. Poço 1) Marcador de alto peso molecular
(Sigma®); Poços 2 e 3) Extrato celular da produção de vírus recombinante
bacmid.pFastBac-gE.VDA (no detalhe), colhidos com 72 e 96 hpi, respectivamente.
3.7 Produção de estoques virais
O estoque viral obtido da co-transfecção dos vírus “bacmid” recombinantes
em células de inseto, com um título estimado de 2 x 10
7
pfu/ml, foram inoculados
usando uma MOI de 1 vírus/célula em BTI-Tn5B1-4. O material inoculado foi colhido
após a morte celular (5 a 7 dpi), que é considerado o melhor momento para
recuperar os vírus recombinantes (“budded virus”). Os vírus colhidos pós-infecção
usualmente resultam em uma amplificação de 2 log, ficando portanto com um título
aproximado de 2 x 10
9
pfu/ml. O sobrenadante recuperado sob centrifugação, foi
armazenado a 4 ºC ao abrigo da luz. Também foram amplificados e estocados os
vírus controle (o vírus recombinante bacmid.pFastBac desarmado e o vírus
recombinante bacmid.pFastBac-Gus).
250
116
97,4
66,0
45,0
29
,0
Expressão
gE.VDA
108
Em seqüência aos trabalhos aqui desenvolvidos, a glicoproteína E (gE) do
vírus da doença de Aujeszky expressa em células de inseto poderá ser utilizada em
pesquisas para produção de anticorpos monoclonais e antígenos recombinantes e
para a provável produção de conjugação do anticorpo monoclonal gE com
peroxidase, para ser usado como anti-igG (anticorpo secundário) em testes
sorológicos. Esses produtos finais após serem devidamente testados e titulados
serão usados como insumo para o desenvolvimento de testes de diagnóstico, como
por exemplo, a produção de um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA (enzyme-
linked immunossorbent assay), o qual utilizará como antígeno, na fase sólida do kit,
somente a glicoproteína E do VDA expressa pelo sistema baculovírus recombinante
em células de inseto e ainda, os monoclonais gE.VDA específicos produzidos e
utilizados no ensaio imunoenzimático, os quais melhoram a sensibilidade ao teste
(GUT et al., 1999).
Objetivando melhorar os testes de diagnóstico, sob o aspecto de sensibilidade
e especificidade e manipular apenas partes antigênicas específicas (WOLD e
PRINROSE, 1991), várias pesquisas com organismos recombinantes expressando
proteínas virais têm sido desenvolvidas (ESHAGHI et al., 2004; GUT et al., 1999;
JARVIS, HOWE e AUMILLER, 2001; KIMMAN et al., 1996; MORENKOV et al.,
1997). O preparo de ensaios imunoenzimáticos que utilizem somente partes
específicas e não infecciosas de patógenos (DEA et al., 2000; WOLD e PRINROSE,
1991), além de melhorar a sensibilidade e especificidade do teste sorológico (DEA et
al., 2000; GUT et al., 1999; KIMMAN et al., 1996), poderão ser usados em áreas
livres ou em erradicação da doença de Aujeszky, pois conterá como antígeno,
apenas duas glicoproteínas, a gE e a gI, não essenciais para a replicação do VDA
(KLUGE et al., 1992; SPEAR, 1993; ZUCKERMANN, 1988).
O que foi desenvolvido neste trabalho poderá servir também, como base para
novas investigações, tais como o desenvolvimento de um ELISA para identificar
anticorpos anti-gE do vírus da doença de Aujeszky utilizando a conjugação
antigênica gE/gI. O ELISA a ser desenvolvido utilizará a gE conjugada com a
glicoproteína I (gI) do VDA, uma vez que o complexo antigênico gE/gI permite uma
correta apresentação dos descontínuos epítopos imunodominantes na gE
(ZUCKERMANN et al., 1988; WHEALY et al., 1993 ) e portanto, a associação
desses dois antígenos (gE/gI) melhora o reconhecimento de anticorpos anti-gE com
mais especificidade (JACOBS et al., 1995). Pesquisas conduzidas por outros autores
109
(GUT et al., 1997) avaliaram e compararam testes sorológicos do tipo ELISA, e
comprovaram que o uso do antígeno gE/gI resulta em uma melhor detecção de
animais soro-positivos do que quando usado somente o antígeno gE.
O ELISA utilizando somente a gE como antígeno na fase sólida que será
desenvolvido servirá como modelo e como controle dos monoclonais anti-gE e do
ELISA com as gE/gI conjugadas.
A engenharia genética com uso criterioso dentro do ambiente laboratorial,
permite construir recombinantes que expressem somente proteínas virais de
interesse, as quais substituem partículas virais inteiras (KOST, CONDREAY e
JARVIS, 2005), quando do preparo de imunoensaios ou produtos afins. Esta
tecnologia possibilita o preparo de kits de diagnóstico para agentes patogênicos sem
que haja risco de disseminar o microorganismo no ambiente laboratorial ou no meio
ambiente, o que assegura o uso desses ensaios de diagnóstico em áreas livres ou
em erradicação para tal enfermidade.
110
CONCLUSÕES
Conclui-se que os resultados obtidos alcançaram os objetivos principais.
A glicoproteína E recombinante do VDA desenvolvida neste trabalho foi
amplificada a partir do DNA genômico de uma cepa do VDA pela PCR, clonada e
expressa através da co-transfecção com o “bacmid” recombinante em células do
inseto Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) e a presença da proteína foi determinada
por SDS-PAGE e confirmada pela técnica da PCR e “Western blotting”.
O trabalho desenvolvido servirá como base para pesquisas futuras, uma vez que
estabeleceu dados técnicos importantes sobre: a amplificação pela PCR, a
otimização de protocolos para o preparo de células competentes, os
procedimentos de manutenção de células do inseto T. ni e a produção de
proteínas recombinantes viabilizada pelo uso de vetores de expressão
apropriados.
A gE do VDA recombinante expressa em células T. ni BTI-Tn5B1-4, será utilizada
como antígeno para produção de anticorpos monoclonais e no desenvolvimento
de um teste tipo ELISA capaz de diferenciar as respostas sorológicas de
animais infectados com vírus VDA selvagem, o qual servirá também como
modelo e referência para o desenvolvimento de um teste imunoenzimático
utilizando os antígenos gE/gI conjugados.
Poder-se-á produzir a gE do VDA conjugada com a glicoproteína I (gI) do VDA
que serão amplificadas, clonadas e expressas em células do inseto T. ni, uma
vez que o antígeno gE/gI melhora a detecção de animais soro-positivos. Os dois
genes (gE e gI) serão utilizados para o desenvolvimento de um teste tipo ELISA
(produção de antígeno, anticorpos monoclonais e, provavelmente, conjugado
peroxidase anti-gE/gI), para o uso em áreas livres ou em erradicação da doença
de Aujeszky.
111
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123
ANEXOS
ANEXO A – MEIOS E SOLUÇÕES
DNA
TNE ( PH 7,4)
10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
150 mM NaCl
1mM EDTA (pH 8,0)
Água Milli-Q estéril qsp 1000 mL
TE (pH 8,0)
10 mM Tris (pH 8,0)
1 mM EDTA (pH 8,0)
Água Milli-Q estéril qsp 100 mL
TE-RNASE (pH 8,0) = RNase 1µg/µL
TE (pH 8,0)
49,5 µL
RNase 10 mg/mL
0,5 µL
CLONAGENS
LB CALDO
Triptona
10 g
Extrato de levedura
5 g
NaCl
5 g
Água Milli-Q qsp
1000 mL
Esterilizar por autoclavação
124
LB AGAR
Triptona
10 g
Extrato de levedura
5 g
NaCl
5 g
Água Milli-Q qsp
1000 mL
Agar bacteriológico
15 g
Diluir o agar por aquecimento
Esterilizar por autoclavação
LÚRIA AGAR
Triptona
10 g
Extrato de levedura
5 g
NaCl 10 g
Água Milli-Q qsp
850 mL
Diluir por agitação
Ajustar até pH 7,0 com NaOH 5 M
Água Milli-Q qsp
1000 mL
Agar bacteriológico
15 g
Diluir o agar por aquecimento
Esterilizar por autoclavação
SOB MEIO
Triptona
20 g
Extrato de levedura
5,0 g
NaCl 0,5 g
Água Milli-Q
850 mL
Diluir por agitação
Cloreto de potássio 250 mM
10 mL
Ajustar até pH 7,0 com NaOH 5 M
Água Milli-Q qsp 1000 mL
Esterilizar por autoclavação
Ajustar até pH 7,0 com NaOH 5 M
125
SOC MEIO
Triptona
2,0 g
Extrato de levedura
0,5 g
NaCl
0,05 g
Água Milli-Q
95 mL
Agitar até dissolução
KCl 250 mM
1,0 mL
Ajustar até pH 7,0 com NaOH 5 M
Água Milli-Q qsp 98 mL
Esterilizar por autoclavação
Magnésio estoque estéril (adicionar no momento do
uso)
1 mL
Glicose 2 M (adicionar no momento do uso)
1 mL
ESTOQUE DE MAGNÉSIO
MgCl
2
. 6 H
2
O
20,33 g
MgSO
4
.7 H
2
O
24,65 g
Água Milli-Q qsp
100 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm
ACETATO DE POTÁSSIO 3 M
Acetato de potássio
29,4 g
Água Milli-Q
50 mL
Ajustar até pH 5,5 com ácido acético glacial
Água Milli-Q qsp
100 ml
ACETATO DE POTÁSSIO 1M
Acetato de potássio
9,8 g
Água Milli-Q
50 mL
Ajustar até pH 7,5 com ácido acético 2 M
Água Milli-Q qsp
100 mL
ACETATO DE SÓDIO 3 M
Acetato de sódio x 3H
2
O
408,3 g
126
Água Milli-Q
800 mL
Ajustar até pH 5,5 com ácido acético ou até pH 7,0
com ácido acético 2 M
Água Milli-Q qsp 1000 mL
Esterilizar por autoclavação
CLORETO DE CÁLCIO (CaCl
2
) 1 M
CaCl
2
anidro
11,1 g
Água Milli-Q qsp
100 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm
Preparar alíquotas de 6 mL
Estocar a –70 ºC
CLORETO DE CÁLCIO (CaCl
2
)100 mM
Cloreto de cálcio 1 M
6 mL
Água Milli-Q estéril qsp
60 mL
MOPS 0,5 M Solução Estoque
MOPS (C
7
H
15
NO
4
S)
2,1 g
Água Milli-Q qsp
20 mL
Ajustar até pH 6,8
RF1 Solução (pH 5,8)
g/100mL
RbCl (100 mM)
1,2 g
MnCl
2
.4 H
2
O (50 mM)
1,0 g
Acetato de potássio 1 M (30mM)
3,0 mL
CaCl
2
. 2 H
2
O (10 mM)
1,5 g
Glicerol (15% p/v) 15,0 mL
Água Milli-Q 85 mL
Agitar até dissolução
Ajustar até pH 5,8 com ácido cítrico 0,2 M
Água Milli-Q qsp 100 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm pré-lavado
Estocar a 4 ºC
127
RF2 Solução (pH 6,8)
g/100mL
MOPS 0,5 M (10mM)
2 mL
Rb Cl (10 Mm)
0,12 g
Ca Cl
2
. 2 H
2
O (75 mM)
1,1 g
Glicerol (15% p/v)
15 mL
Água Milli-Q
85,0 mL
Agitar até dissolução
Ajustar até pH 6,8 com NaOH
Água Milli-Q qsp
100 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm pré-lavado
Estocar a 4 ºC
MINIPREPARAÇÃO
SOLUÇÃO I
Glucose (50 mM)
5,0 mL
Tris-Cl (pH 8,0) 1 M (25mM)
2,5 ML
EDTA (pH 8,0) 0,5 M (10 mM)
2,0 ML
Água Milli-Q qsp
100 mL
Esterilizar por autoclavação
Estocar a 4 ºC
SOLUÇÃO II
NaOH 10 N estéril (0,2 N)
SDS 10% estéril (1%)
Água Milli-Q qsp
Preparo no momento do uso.
SOLUÇÃO III
Acetato de potássio 5 M estéril
60 mL
Ácido acético glacial
11,5 mL
Água Milli-Q estéril
28,5 mL
A solução resultant
e tem 3 M de potássio e de 5 M
de acetato.
Estocar a 4 ºC
128
MINIPREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS GRANDES
SOLUÇÃO I-G
60 mL
Ácido acético glacial
11,5 mL
Tris-HCl (pH 8,0) 15 mM
EDTA (pH 8,0) 10 mM
RNase A [100 mg/mL] 100 µg/mL
Água Milli-Q estéril qsp
Esterilizar com filtro 0,22 µm
Estocar a 4 ºC
SOLUÇÃO II-G
NaOH 0,2 N
SDS 1%
Água Milli-Q estéril qsp
Esterilizar com filtro 0,22 µm
Preparar no momento do uso
X-gal Solução 2% (20 mg/mL)
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
2,0 g
DMSO (dimetil sulfoxide) qsp
100 mL
Estocar a –20 ºC
Manter ao abrigado da luz
IPTG 20% (0,8 M)
Isopropiltio-β-D-galactoside (IPTG)
2,0 g
Água Mill-Q qsp
10 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm
Estocara a 4 ºC
GEL DE POLIACRILAMIDA E IMUNODETECÇÃO
TAMPÃO DE AMOSTRAS (SDS TAMPÃO REDUTOR)
Tris-HCl (pH 6,8) 0,5 M
1 mL
129
Glicerol
0,8 mL
SDS 10%
1,6 mL
2-β-mercaptoetanol
0,4 mL
Azul de bromofenol 0,05%
0,2 mL
Água Milii-Q estéril
4,0 mL
Estocar em temperatura ambiente
TAMPÃO DE CORRIDA 5X (pH 8,3) PARA SDS-PAGE
Tris-base (15 g/L) 9,0 g
Glicina (72 g/L) 43,2 g
SDS (5 g/L)
3,0 g
Água destilada qsp
600 mL
Estocar a 4 ºC
Uso: diluir 60 mL 5X em 240 mL de água
GEL DE CORRIDA 12% ( SEPARADOR)
Tris-HCl (pH 8,8) 1,5 M
2,5 mL
SDS 10%
100 µL
Água destilada
3,5 mL
Acrilamida/Bis 30%
4,0 mL
Persulfato de amômia (APS) 10% fresco
100 µL
TEMED
10 µL
GEL DE CORRIDA CONCENTRADOR (EMPILHAMENTO) 5%
Tris-HCl (pH 6,8) 0,5 M
1,25 mL
SDS 10%
50 µL
Água destilada
3,05 mL
Acrilamida/Bis 30%
650 µL
Persulfato de amômia (APS) 10% fresco
50 µL
TEMED
10 µL
NaH
2
PO
4
H
2
O
2,3 g
Água destilada qsp
1000 mL
130
SOLUÇÃO CORANTE
Ácido acético glacial
100 mL
Metanol
400 mL
Coomassie blue R-250
1 g
Água destilada
500 mL
Estocar em temperatura ambiente
SOLUÇÃO DESCORANTE
Ácido acético glacial
10 mL
Metanol
40 mL
Água destilada
50 mL
Estocar em temperatura ambiente
TAMPÃO DE TRANSFERÊNCIA 1X
Tampão Bjerrum e Schafer-Nielsen (pH 9,2)
Tris-base (48 mM)
5,82 g
Glicina (39 mM)
2,9 g
SDS 10% (0,0375 %)
3,75 mL
Água destilada
700 mL
Dissolver e adicionar metanol
Metanol
200 mL
Água destilada qsp
1000 mL
Estocar a 4 ºC
Usar frio (4ºC)
TRIS-HCl 1M (pH 8,8)
Tris base
60,57 g
Água destilada estéril
450 mL
Ajustar até pH 8,8 com HCl
Água destilada qsp
500 mL
131
TRIS-HCl 1M (pH 6,8)
Tris base 12,11 g
Água destilada estéril 85 mL
Ajustar até pH 6,8 com HCl
Água destilada qsp 100 mL
PBS 50 X (pH 7,2)
KCl
10 g
Na2HPO4
72,45 g
KH2PO4
12 g
Água destilada
900 mL
Ajustar até pH 7,2 com HCl
Água destilada qsp
1000 mL
Acondicionar em pequenas alíquotas
Esterilizar por autoclavação
Estacar em temperatura ambiente
PBS 1 X (pH 7,2)
PBS 50 X
20 mL
NaCl
8 g
Água destilada qsp
1000 mL
PBS T20 0,05%
PBS 1 X
995 mL
Tween 20
5 mL
EDTA 0,5 M (pH 8,0)
EDTA x 2 H
2
O
74,44 g
Água Milli-Q 300 mL
Ajustar até pH 8,0 com NaOH 10 N, sob agitação
Água Milli-Q qsp 400 mL
Esterilizar por autoclavação
Estocar em temperatura ambiente
132
GLICOSE 2 M
Glicose (D-glicose anidra) 7,2 g
Água Milli-Q 18 mL
Dissolver bem e adicionar água Milli-Q qsp 20 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm
Estocar em temperatura ambiente
SACAROSE 25%
Sucrose (sacarose) 25 g
TEN (pH 7,4) qsp
100 mL
Esterilizar com filtro 0,22 µm
Estocar a 4 ºC
GLICEROL 70%
Glicerina [C3H5 (OH)3] 14 mL
Água Milli-Q
6 mL
Esterilizar por autoclavação
Estocar em temperatura ambiente
GLICEROL 60%
Glicerina [C3H5 (OH)3]
12 mL
Água Milli-Q
8 mL
Esterilizar por autoclavação
Estocar em temperatura ambiente
ELETROFORESE
TAE 50X
Tris base
242 g
Ácido acético glacial
57,1 mL
EDTA (pH 8,0) 0,5 m
100 mL
Água destilada qsp 1000 mL
A solução de trabalho 1x tem 40 mM Tris-acetato /
1 mM EDTA.
EDTA 0,5 M (pH 8,0)
100 mL
133
TAE 1X
TAE 50X
200 mL
Água destilada qsp
1000 mL
TAMPÃO CORRIDA AMOSTRAS 6X
Azul de bromofenol
25 mg
Xileno cianol
25 mg
Ficoll 400
1,5 g
Água Milli-Q qsp
10 mL
BROMETO DE ETÍDEO 10 mg/mL
Brometo de etídeo
1 g
Água destilada qsp
100 mL
Manter sob agitação por várias horas até a
completa dissolução
Armazenar em frasco escuro a 4 ºC
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
1 kb DNA Ladder 1:5
1 Kb DNA Ladder 1 mg (1,0 µg/µL) 10 µL
Tampão corrida amostras 6X
20 µL
Água Milli-Q estéril
20 µL
Estocar a –20 ºC
134
ANEXO B - Seqüência codificadora completa da glicoproteína gE do vírus da
doença de Aujeszky – CDS (AY249861), (HYUN et al., 2003).
001 atgcggccct ttctgctgcg cgccgcgcag ctcctggcgc tgctggccct ggcgctctcc
061 accgaggccc cgagtctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt
121 ccctcggccg aggtctggga cctctccacc gaggccggcg acgatgacct caacggcgac
181 ctcgacggcg acgaccgccg cgcgggcttc ggctcggccc tcgcctccct gagggaggcg
241 cccccggccc atctggtgaa cgtgtccgag ggcgccaact tcaccctcga cgcgcgcggc
301 gacggcgccg tgctggccgg gatctggacg ttcctgcccg tccgcggctg cgacgccgtg
361 tcggtgacca cggtgtgctt cgagaccgcg tgccacccgg acctggtgct gggccgcgcc
421 tgcgtccccg aggccccgga gatgggcatc ggcgactacc tgccgcccga ggtgccgcgg
481 ctccggcgcg agccgcccat cgtcaccccg gagcggtggt cgccgcacct gagcgtcctg
541 cgggccacgc ccaacgacac gggcctctac acgctgcacg acgcctcggg gccgcgggcc
601 gtgttctttg tggcggtggg cgaccggccg cccgcgccgg cggacccggt gggccccgcg
661 cgccacgagc cccgcttcca cgcgctcggc ttccactcgc agctcttctc gcccggggac
721 acgttcgacc tgatgccgcg cgtggtctcg gacatgggcg actcgcgcga gaactttacc
781 gccacgctgg actggtacta cgcgcgcgcg cccccgcggt gcctgctgta ctacgtgtac
841 gagccctgca tctaccaccc gcgcgcgccc gagtgcctgc gcccggtgga cccggcgtgc
901 agcttcacct cgccggcgcg cgcgcggctg gtggcgcgcc gcgcgtacgc ctcgtgcagc
961 ccgctgctcg gggaccggtg gctgaccgcc tgccccttcg acgccttcgg cgaggaggtg
1021 cacacgaacg ccaccgcgga cgagtcgggg ctgtacgtgc tcgtgatgac ccacaacggc
1081 cacgtcgcca cctgggacta cacgctcgtc gccaccgcgg ccgagtacgt cacggtcatc
1141 aaggagctga cggccccggc ccgggccccg ggcaccccgt ggggccccgg cggcggcgac
1201 gacgcgatct acgtggacgg cgtcacgacg ccggcgccgc ccgcgcgccc gtggaacccg
1261 tacggccgga cgacgcccgg gcggctgttt gtgctggcgc tgggctcctt cgtgatgacg
1321 tgcgtcgtcg ggggggccgt ctggctctgc gtgctgtgct cccggcgccg ggcggcctcg
1381 cggccgttcc gggtgccgac gcgggcgcgg acgcacatgc tctctccggt gtacaccagc
1441 ctgcccacgc acgaggacta ctacgacggc gacgacgacg acgaggaggc gggcgtcatc
1501 cgccggcggc ccgcctcacc cggcggggac agcggctacg aggggccgta cgcgagcctg
1561 gaccccgagg acgagttcag cagcgacgag gacgacgggc tgtacgtgcg ccccgaggag
1621 gcgccccgct ccggcttcga cgtctggttc cgcgatccgg agaaaccgga agtgacgaat
1681 ggacccaact atggcatgac cgccaaccgc ctgttgatgt cccgccccgc ttaa (1734 pb)
135
ANEXO C - Localização da seqüência dos primers com os sítios de restrição
desenhados da seüência codificadora do gene da glicoproteína gE do
vírus da doença de Aujeszky (CDS: AY249861), (HYUN et al., 2003,
adaptado com inserção dos “primers” para amplificar a gE).
Primer sense: 5'-cacaccggggttgaattccatgc-3'
Sítio EcoR I: gaattc;
Oligos substituídos ou adicionados: att Início sequencia gE
tttaaacctgggcacccccgcgagtctcgcacacaccggggttgagaccatgcggccctttctgctgcgcgccgcgc
agctcctggcgctgctggccctggcgctctccaccgaggccccgagtctctccgccgagacgaccccgggccccgtc
accgaggtcccgagtccctcggccgaggtctgggacctctccaccgaggccggcgacgatgacctcaacggcgac
ctcgacggcgacgaccgccgcgcgggcttcggctcggccctcgcctccctgagggaggcgcccccggcccatctg
gtgaacgtgtccgagggcgccaacttcaccctcgacgcgcgcggcgacggcgccgtgctggccgggatctggacgt
tcctgcccgtccgcggctgcgacgccgtgtcggtgaccacggtgtgcttcgagaccgcgtgccacccggacctggtgc
tgggccgcgcctgcgtccccgaggccccggagatgggcatcggcgactacctgccgcccgaggtgccgcggctcc
ggcgcgagccgcccatcgtcaccccggagcggtggtcgccgcacctgagcgtcctgcgggccacgcccaacgac
acgggcctctacacgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgtgttctttgtggcggtgggcgaccggccgcccg
cgccggcggacccggtgggccccgcgcgccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactcgcagctcttctcg
cccggggacacgttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaactttaccgccacgct
ggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacgagccctgcatctaccacccgcgcg
cgcccgagtgCctgcgcccggtggacccggcgtgcagcttcacctcgccggcgcgcgcgcggctggtggcgcgcc
gcgcgtacgcctcgtgcagcccgctgctcggggaccggtggctgaccgcctgccccttcgacgccttcggcgaggag
gtgcacacgaacgccaccgcggacgagtcggggctgtacgtgctcgtgatgacccacaacggccacgtcgccacc
tgggactacacgctcgtcgccaccgcggccgagtacgtcacggtcatcaaggagctgacggccccggcccgggcc
ccgggcaccccgtggggccccggcggcggcgacgacgcgatctacgtggacggcgtcacgacgccggcgccgc
ccgcgcgcccgtggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctgggctccttcgtgatg
acgtgcgtcgtcgggggggccgtctggctctgcgtgctgtgctcccggcgccgggcggcctcgcggccgttccgggtg
ccgacgcgggcgcggacgcacatgctctctccggtgtacaccagcctgcccacgcacgaggactactacgacggc
gacgacgacgacgaggaggcgggcgtcatccgccggcggcccgcctcacccggcggggacagcggctacgag
gggccgtacgcgagcctggaccccgaggacgagttcagcagcgacgaggacgacgggctgtacgtgcgccccg
aggaggcgccccgctccggcttcgacgtctggttccgcgatccggagaaaccggaagtgacgaatggacccaact
atggcatgaccgccaaccgcctgttgatgtcccgccccgcttaaataccgggagaaccggtccgcccgcattccgac
ctgcccggcgc; Oligos substituídos: g t
taa (final da gE);
Seqüência final da gE : gcttaaataccgggggatccggtc (Desenho primer
antisense com sítio BamH I: (5'-gaccggatcccccggtatttaagc-3').
136
ANEXO D – Desenho esquemático do plasmídeo de clonagem pGem®-T Easy.
Legenda: Entre T7 e SP6= região múltipla de clonagem com vários sítios de
restrição. T7 e SP6 = sítio inicial de transcrição da RNA polimerase (1pb); ori e f1 ori
= região origem pUC; lacZ = códon inicial do gene lacZ; Amp r = resistência a
ampicilina; Sca I, Xmn I e Nae I = sitios de enzimas de restrição no plasmídeo.
Fonte: Manual Técnico “pGem®-T and pGem® –T Easy Vector Systems”, 2003
(Promega); Marcus; Hartnett; Storts, 1996.
Sca I
1890
X
mn
I
2009
lac Z
Amp
r
ori
f1
ori
T
T 7
Apa I
Aat II
Sph I
BstZ I
Nco I
BstZ I
Not I
SacII
EcoRI
1
14
20
26
31
37
43
43
49
52
Spe I
EcoR I
Not I
BstZ I
Pst I
Sal I
Nde I
Sac I
BstX I
Nsi I
SP6
64
70
77
77
88
90
97
109
118
127
141
pGem-T Easy
3015 pb
NAE I
2707
T
137
ANEXO E – Mapa de restrição da glicoproteína gE.VDA com 1734 pb.
Simulação junto ao programa NEBcutter V2.0 (BioLabs)
(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php).
No destaque região da Bsr I na seqüência do gene gE.VDA.
138
ANEXO F - Mapa do vetor doador pFastBac™1. A região de clonagem múltipla inicia
em 4032 pb com o sítio para BamH I e termina com o sítio Hind III a
4137 pb. O sítio para EcoR I está localizado a aproximadamente 4053
pb no plasmídeo.
Legenda: f1 int. region = região intergênica (inicío do plasmídeo); Apr = resistência
a ampicilina (~900 pb); ori = região de origem (~1850 pb); Tn7R = transposon7,
braço esquerdo (~2700 pb); Gmr = resistência a gentamicina (~3260 pb); promotor
Polh = região do promotor do gene da poliedrina (~3900 pb); Região de clonagem
múltipla = local de inserção dos inseros de interesse com vários sítios de restrição
(~4032 pb até 4137 pb); Poly A = sinal de poliadenilação (~4290 pb) e, Tn7L =
transposon7, braço direito (final do plasmídeo).
Fonte: Manual de Instrução “Bac-to-Bac® Baculovírus Expression System”, 2002;
(Invitrogen™).
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