( PDF ) Avaliação da freqüência de metilação de promotores gênicos nas síndromes mielodisplásicas da infância

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AVALIAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE METILAÇÃO DE

PROMOTORES GÊNICOS NAS SÍNDROMES

MIELODISPLÁSICAS DA INFÂNCIA

DANIEL ONOFRE VIDAL

Dissertação apresentada à Fundação Antônio

Prudente para obtenção do título de Mestre em

Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Dr. Luiz Fernando Lopes

Co-Orientador: Dr. André Luiz Vettore

São Paulo

2005

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do Centro de Tratamento e Pesquisa

Hospital do Câncer A.C. Camargo

Vidal, Daniel Onofre.

Avaliação da freqüência de metilação de promotores gênicos nas

síndromes mielodisplásicas da infância / Daniel OnofreVidal-- São Paulo,

2005.

78p.

Dissertação(mestrado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração: Oncologia.

Orientador: Luiz Fernando Lopes

Descritores: 1. SÍNDROMES MIELODISPLÁSICAS/genética. 2. MEDULA

ÓSSEA. 3. METILAÇÃO DE DNA. 4. CRIANÇA.

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DEDICATÓRIA

Gostaria de dedicar está dissertação as pessoas que me acompanham desde os

primeiros passos, das primeiras palavras, das primeiras decepções, das alegrias e que

muitas vezes deixaram seus sonhos de lado para me ajudar a realizar os meus. Meus

pais, Dagoberto e Ângela.

Ao meu grande amigo, meu irmão Diego, companheiro pra qualquer coisa a

qualquer hora, mas principalmente por me apoiar e dividir a felicidade de minhas

conquistas e das suas também.

Especialmente a minha namorada, futura esposa, pelo apoio, compreensão e

carinho que tem me dado nesses cinco anos de convivência diária. Isso só pode ser

amor mesmo. Te amo!!!

As crianças com câncer que, em sua inocência, nunca abdicaram do direito de

viver e sorrir, fazendo nossas vidas mais felizes e nos dando força para continuar...

Dedico a meu orientador e ao meu co-orientador por acreditarem em mim,

pela paciência, pelo aprendizado, pela amizade e pela confiança.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a meu orientador Dr. Luiz Fernando Lopes por ter aberto as portas

dessa nova fase da minha vida, pela confiança em mim e em meu trabalho, por tudo

que me ensinou em relação a seu trabalho tão competente, pela paciência, pela

dedicação, pela amizade e pelo agradável convívio durante esse período.

Ao meu co-orientador Dr. André Luiz Vettore pela imensa contribuição neste

trabalho. Por contribuir em minha formação compartilhando seus conhecimentos, por

ter acreditado em mim, pela amizade e pelas grandiosas discussões sobre os mais

variados assuntos.

À Dra. Otávia Caballero, que apesar do pouco tempo de convivência

contribuiu em muito para minha formação e engrandecimento, não apenas sendo um

exemplo de uma ótima profissional, mas também por ser um exemplo de vida a ser

seguido.

Ao Dr. André Carvalho, que foi muito importante para o fechamento deste

trabalho por meio das discussões e opiniões e também pela orientação em algumas

análises.

Às grandes amigas Mariana Brait e Márcia Dellamano, minhas irmãs mais

velhas do lab, que me acolheram na minha chegada e que apesar da distância nunca

deixaram de me ajudar. Companheiras de grandes comemorações e de muitas risadas

durante o tempo em que estavam por aqui.

À Valéria Paixão, que com seu jeito meio elétrico se demonstrou uma grande

pessoa com uma personalidade marcante, por ter me ensinado muitas coisas no lab. e

pelas conversas sinceras e conselhos.

A Dra. Maria Isabel Achatz, pela amizade, por sempre me apoiar e também

pelas conversas entre um experimento e outro. Te admiro, pelo seu exemplo de

mulher, mãe e profissional, muito obrigado!!!

À Andréa Seixas pela grande amizade, pelo agradável convívio, pela

paciência e principalmente pelo tabule que eu dividia com a Márcia.

À todo pessoal do laboratório pela agradável convivência e grande amizade:

Adriana Bulgarelli, Danielle Renzoni; Fabio Piccoli; Fabrício de Carvalho, Roberta

Félix, Luciane Kagohara, , Fernanda Góes, Dinamar Gaspar.

Aos amigos desde os tempos da faculdade e que hoje fazem parte da minha

caminhada: Fabiana Bettoni, Lílian Pires e Raphael Bessa.

À Dra. Maria do Rosário Lattore, que em plena véspera de Natal teve

disponibilidade e paciência me ensinando e me ajudando com as análises estatísticas

deste trabalho.

Ao Dr. Julio César Santin, por ter ajudado com a coleta das amostras de MO

dos pacientes e a toda equipe do Instituto Dante Pazzanese pela grande ajuda e

disposição que demonstroram pra colaborar com este trabalho.

À Dra. Elizabete X. Souto e a Dra. Mary O. Santana por toda a ajuda com o

arquivo de lâminas do qual foram retiradas as amostras.

À todos os profissionais que fazem parte do GCB-SMD-PED, pois sem o

esforço de vocês não seria possível a realização deste trabalho.

À Amandina Morbeck, pela ajuda com todas as informações do banco de

pacientes cadastrados no GCB-SDM-PED.

Ao Dr. Ricardo Renzo Brentani, diretor do Instituto Ludwig e Presidente do

Hospital do Câncer A.C. Camargo pelas excelentes condições de trabalho.

Ao diretor da pós-graduação Dr. Luiz Fernando Lima Reis por apoiar e

acreditar em nossa formação e trabalho.

À Ana Maria Kuninari e Marcia Hiratani, por todo carinho, pela atenção e por

sempre estarem dispostas a escutar e ajudar no que fosse preciso.

À todas as meninas da biblioteca: Suely Francisco; Maria Adriana M.

Bassols; Francyne Pólen G. Lima; e Rosinéia Aguiar Carneiro, pelo competente

trabalho, pelo carinho e atenção, pela enorme ajuda e dedicação quando eu descia

para ficar algum tempo na biblioteca trabalhando.

Aos médicos, residentes e funcionários do Departamento de Pediatria do

Hospital do Câncer A.C. Camargo pela importante colaboração e paciência.

Aos membros da banca de qualificação desta dissertação: Dr. Alex Fiorini,

Dra. Marilda de Souza e Dra. Helena Brentani pelo tempo atribuído à leitura dos

relatórios e pelas sempre proveitosas sugestões.

À Isabel C. Carneiro (Bel) e Sirléia M. Sampaio (Léia), por todas as risadas e

também por organizar nossa bagunça com os materias que usamos no dia a dia.

Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida, a FAPESP pelo apoio financeiro

através do CEPID e ao Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer pelo apoio

financeiro e pela oportunidade de desenvolver nosso projeto.

A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho.

A Banca Julgadora da Dissertação pelo tempo atribuído à leitura desta

dissertação.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Agradeço especialmente a minha família, por todo o amor que tem me dado

durante esses anos.

Ao meu amor, Aninha, e a sua família, Senhor Valentim, Senhora Lourdes,

Senhor Manuel e Valmor, por terem me acolhido muito bem em suas vidas e pela

força e conselhos que tem me dado nesses anos de convivência.

À todas as crianças, que fazem nossas vidas mais felizes e surpreendentes.

À minhas grandes amigas, Letícia Olops e Edaíse M. Silva, por esses dois

anos de convivência diária, pela compreensão, companheirismo e por me mostrar que

o universo feminino pode ser mais complexo do que eu poderia imaginar. Nunca vou

esquecer esses dias que passei com vocês.

À outras duas grandes amigas, Mariana Maschietto e Amanda Gonçalves, por

tudo que tem feito por mim, por dividir suas alegrias e conquistas comigo e também

por esses seis anos de uma forte amizade.

À minhas “irmãzinhas”, Aline Bolpetti e Vanessa Pereira, nunca vou

esquecer o trio (FB) que formávamos na faculdade e pela amizade que se estenderá

pelo resto de nossas vidas.

À s amigas Mariana Brait e Márcia Dellamano por tudo o que fizeram por

mim, pelo meu aprendizado e principalmente pela grande amizade.

À todos que contribuíram de alguma forma para essa conquista.

RESUMO

Vidal DO. Avaliação da freqüência de metilação de promotores gênicos nas

síndromes mielodisplásicas da infância. São Paulo; 2005. [Dissertação de

Mestrado-Fundação Antônio Prudente].

As Síndromes Mielodisplásicas (SMD) compreendem um grupo heterogêneo de

desordens clonais de células-tronco hematopoéticas, sendo caracterizada por um

processo de hematopoese deficiente e pela alta probabilidade de progressão para a

Leucemia Mielóide Aguda (LMA). Apesar de rara na infância, o prognóstico para

essa doença é desfavorável e a maioria dos pacientes pediátricos evoluem a óbito em

consequência da transformação leucêmica ou devido a complicações decorrentes da

evolução da doença (infecções e hemorragias). A metilação anormal, que ocorre na

região promotora dos genes está associada ao silenciamento gênico. Esta alteração

quando ocorre em genes com característica de supressão tumoral tem sido

relacionada ao início e progressão do câncer e, por isso pode ser considerada como

um marcador em potencial para a doença. Tais marcadores podem ser importantes

para a detecção do câncer em estágios mais precoces, na determinação de

prognóstico, no seguimento da doença e na determinação de resposta a terapia. Os

objetivos deste estudo foram avaliar o padrão de metilação de 14 genes (CDKN2B,

CDKN2A, CALCA, CDH1, HIC1, GSTP1, p73, p14

ARF

, MGMT, APC, RARβ,

CDH13, DAPK e TIMP-3) com característica de supressão tumoral em 12 amostras

de aspirado de medula óssea (a fresco) e 13 amostras de esfregaço de MO de

pacientes pediátricos acometidos pela SMD e verificar a correlação desses dados

com as características clínico-laboratorias dos pacientes. Os DNAs foram extraídos a

partir das amostras e submetidos a reação de MSP. Os genes que apresentaram

maiores freqüências de metilação nas amostras foram: CALCA (76%), GSTP1 (52%)

e CDKN2B (50%). Para os outros 11 genes analisados as freqüências encontradas

foram menores que 25% ou não foi possível detectar a presença de metilação em

nenhuma das amostras analisadas. A metilação do promotor do gene GSTP1 foi

correlacionada, com significância estatística, a maiores taxas de hemoglobina e

hematrócrito nesses pacientes. Os resultados do presente estudo sugerem que o

padrão de metilação da SMD em crianças é semelhante ao de adultos e que a

metilação nesses genes pode vir a ser usada como uma ferramenta para auxiliar no

diagnóstico e tratamento da SMD. No entanto, estudos mais amplos que concentrem

uma maior casuística são necessários para a confirmação destes achados.

SUMMARY

Vidal DO. [Aberrant methylation of gene promoter in childhood

myelodysplastic syndrome]. São Paulo; 2005. [Dissertação de Mestrado-Fundação

Antônio Prudente].

The myelodysplastic syndrome (MDS) encloses a heterogeneous group of clonal

hematopoetic stem cell disorders and it is characterized by ineffective hematopoesis

and by a high incidence of progression to AML (Acute Myeloid Leukemia). Despite

the rarity in childhood, the disease prognostic is poor and the majority of the patients

die in consequence of the leukemic transformation or complications involved in the

evolution of the MDS (infections and hemorrhage). The abnormal methylation in the

promoter region of some genes is related to gene silence. The abnormal methylation

could be involved with initiation and progression of cancer when it occurs in tumor

suppressor genes. For this reason it has been evaluated as potential markers for the

detection of the cancer in early stages (before the clinical manifestation), for the

prognostic determination, for the follow-up of the disease progression and for the

determination of the response to therapy. We analyzed the aberrant methylation

profile of the promoter region of 14 genes (CDKN2B, CDKN2A, CALCA, CDH1,

HIC1, GSTP1, p73, p14

ARF

, MGMT, APC, RARβ, CDH13, DAPK e TIMP-3) with

tumor suppression features in 12 bone marrow aspirate samples and 13 bone marrow

smear samples of pediatric patients diagnosed with MDS. DNA of these samples was

extracted and submitted to MSP. The most frequently methylated genes were CALCA

(76%), GSTP1 (52%) and CDKN2B (50%). For the other genes the methylation

frequency was below 25%. We tried to correlate the methylation profile with clinic-

laboratorial parameters. GSTP1 promoter methylation was significantly correlated

with higher rates of red blood parameters. Our results suggest that the methylation

pattern in childhood MDS could be similar to the methylation pattern in adults MDS

and that the methylation of the genes presented here can be used as a tool to improve

the diagnostic and treatment of the MDS.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema modificado representando a hierarquia da hematopoiese na

medula óssea. 3

Figura 2 MSP do gene CDKN2A. 35

Figura 3 Amplificação de um fragmento de 252 pb do gene hMLH1 a partir de

amostras de DNA obtidas de esfregaços de MO corados e não-corados 36

Figura 4 Amplificação de um fragmento de 252 pb do gene hMLH1 a partir de

amostras de DNA obtidas de esfregaços de MO de diferentes períodos de

estocagem. 37

Figura 5 Amplificação de um fragmento de 252 pb do gene hMLH1 a partir de

amostras de DNA obtidas de medula óssea total de 3 pacientes com SMD. 38

Figura 6 Perfil de metilação em uma amostra de MO a fresco (SMD41) e uma

amostra de esfregaço de MO (L167) obtidas do mesmo paciente. 39

Figura 7 Perfil de metilação da região promotora dos genes CALCA, GSTP1 e

CDKN2B nas 25 amostras de MO incluídas neste estudo. 43

Figura 8.

Perfil de metilação na região promotora dos genes CALCA, GSTP1 e

DAPK. 44

Figura 9. Curvas de sobrevida global em relação ao perfil de metilação da região

promotora dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Seqüência dos iniciadores utilizados na MSP. 29

Tabela 2 Temperaturas utilizadas nas reações de MSP. 30

Tabela 3 Número e porcentagem de pacientes acometidos por SMD segundo

características demográficas e clínicas. 32

Tabela 4 Descrição da média e desvio padrão das características clínico-

laboratoriais dos pacientes acometidos por SMD. 33

Tabela 5 Freqüência de metilação na região promotora dos 14 genes estudados

nas amostras de MO de pacientes acometidos pela SMD e nas amostras

de MO sem neoplasia. 42

Tabela 6 Correlação do padrão de metilação dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B

com as características demográficas e clínicas dos pacientes acometidos

pela SMD. 46

Tabela 7 Correlação do padrão de metilação dos genes CALCA e GSTP1

combinados, com as características demográficas e clínicas dos pacientes

acometidos pela SMD. 47

Tabela 8 Descrição da idade e das características laboratoriais segundo o padrão de

metilação dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B. 49

Tabela 9 Descrição das características laboratoriais segundo o padrão de metilação

combinado dos genes CALCA e GSTP1. 50

LISTA DE ABREVIATURAS

AA anemia aplástica

APC adenomatosis polyposis coli

CALCA calcitonin-related polypeptide (alpha)

CCG Children's Cancer Group

CDH1 cadherin 1(E-cadherin)

CDH13 cadherin 13(H-cadherin)

CDKI cyclin-dependent kinase inhibitor

CDKN2A cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16)

CDKN2B cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (p15)

CT células tronco

DAPK death-associated protein kinase

DHL desidrogenase lática

DNA ácido desoxirribonucleico

DNMT DNA methyltransferase

dNTPs deoxinucleotídeos fosfato

E.U.A. Estados Unidos da América

E2F E2F transcription factor

EDTA ethylenediaminetetracetic acid

EWOG-MDS European Working Group in Myelodysplastic Syndrome

FAB French-American-British Group (classificação para SMD)

FAP Fundação Antônio Prudente

GCB-SMD-PED Grupo Cooperativo Brasileiro de Síndrome Mielodisplásica em Pediatria

GSTM1 glutathione S-transferase M1

GSTP1 glutathione S-transferase pi

GSTT1 glutathione S-transferase theta 1

HDAC histone deacetylases

HIC1 hypermethylated in cancer 1

HL60 linhagem celular de leucemia promielocítica aguda

hMLH1 humam Mut-L Homologue 1

IDPC/SP Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia – São Paulo

IPSS International Prognostic Scoring System

LLA leucemia linfocítica aguda

LMA leucemia mielóide aguda

LMC leucemia mielóide crônica

LMMJ leucemia mielomonocítica juvenil

µg micrograma

µL microlitro

µM micromolar

M molar

mm milímetro

mM milimolar

milímetros cúbicos

MBP methyl CpG binding protein

MeCP methyl-core binding protein

MgCl

cloreto de Magnésio

MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

MO medula óssea

MSP methylation specific PCR

NaOH hidróxido de sódio

NF1 neurofibromin 1

NFKB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells

ng nanograma

NQO1 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1

N-ras neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog

p14

ARF

cyclin-dependent kinase inhibitor 2B, isoform 3

pb pares de bases

PCR reação em cadeia da polimerase cuja sigla do inglês é Polimerase Chain

Reaction

RA anemia refratária

RAEB anemia refratária com excesso de blastos

RAEB-t anemia refratária com excesso de blastos em transformação

RARβ retinoic acid receptor ( beta)

RARS anemia refratária com sideroblasto anelado

RC citopenias refratárias

SMD síndrome mielodisplásica

SP sangue periférico

TIMP3 tissue inhibitor of metalloproteinase 3

t-MDS/AML leucemia mielóde aguda transformada a partir de estado mielodisplásico

TMO transplate de medula óssea

TP53 tumor protein p53

U unidades

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Hematopoese 1

1.2 Leucemias na Infância 3

1.3 A Síndrome Mielodisplásica 4

1.4 A Síndrome Mielodisplásica na Infância 7

1.5 Aspectos Moleculares 10

1.6 Alterações Citogenéticas e SMD 13

1.7 Metilação e SMD 13

2 OBJETIVOS 20

2.1 Objetivo Geral 20

2.2 Objetivos Específicos 20

3 MATERIAL E MÉTODOS 22

3.1 Casuística 22

3.2 Extração, Quantificação e Avaliação do DNA 23

3.3 Tratamento com Bissulfito de Sódio 24

3.4 Reação de MSP (Methylation Specific PCR) 25

3.5 Variáveis do Estudo 26

3.6 Análise Estatística 27

3.7 Aspectos Éticos 27

4 RESULTADOS 31

4.1 Casuística 31

4.2 Tratamento com Bissulfito de Sódio e MSP de Pequenas Quantidades

de DNA 34

4.3 Padronização da Extração de DNA de Esfregaço de Medula Óssea 35

4.4 Extração, Quantificação e Avaliação do DNA Extraído das Amostras

de Medula Óssea 37

4.5 Perfil de Metilação para as Amostras de Medula Óssea dos Indivíduos

sem SMD e dos Pacientes com SMD 39

4.6 Correlação entre os Dados Demográficos, Clínicos e Laboratoriais e o

Padrão de Metilação dos Genes 45

4.6.1 Correlação do Padrão de Metilação dos Genes CALCA, GSTP1 e

CDKN2B 45

4.6.1.1 Com os parâmetros demográficos e clínicos 45

4.6.1.2 Com os parâmetros laboratoriais (hemograma) 48

4.6.1.3 Com a sobrevida global 51

5 DISCUSSÃO 52

6 CONCLUSÕES 67

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68

ANEXO

Anexo I Termo de consentimento pós-informado.

Anexo II Apresentação dos dados individuais para cada um dos pacientes

incluídos no estudo.

1 INTRODUÇÃO

1.1 HEMATOPOESE

A medula óssea (MO), um dos maiores órgãos do corpo humano, é o sítio de

formação das células sanguíneas pós-nascimento. No adulto normal, a MO é

responsável pela produção e exportação, para o sangue periférico (SP), de cerca de

2,5 bilhões de hemácias, 2,5 bilhões de plaquetas e 1 bilhão de granulócitos por quilo

de massa corpórea por dia. Essa atividade pode ser aumentada em até 10 vezes

quando necessário, como em casos de resposta inflamatória (ROTHSTEIN 1993).

A hematopoese começa na vida intra-uterina e apresenta diferentes sítios de

acordo com o desenvolvimento. Até os 2 meses de vida intra-uterina os sítios

hematopoéticos se concentram no saco vitelínico, entre 2 e 9 meses, principalmente

no fígado (e baço, em menor proporção) e a partir do nascimento na MO. A MO

origina-se dos corpos vertebrais e os primeiros espaços medulares são supridos por

vasos sanguíneos e células reticulares adventícias do tecido conectivo. Estas

estruturas irão formar o estroma medular e seu microambiente condicionador que,

numa etapa futura, permitirão o assentamento e colonização das células-tronco, bem

como a proliferação e maturação das futuras células sanguíneas.

A MO pode ser subdividida em dois grupos distintos, o estroma e o

parênquima medular. O estroma medular é formado por uma complexa malha de

vasos sanguíneos, organizada em unidades repetidas. Pequenos vasos retornam a

cavidade medular combinando-se para formar sinusóides venosos, os quais são

rodeados de tecido hematopoético. A parede desses sinusóides é formada por uma

camada unicelular que aparenta ser uma membrana basal. Essa membrana é contínua

e as células da MO passam para a corrente sanguínea penetrando entre essas células

endoteliais, sendo esse processo mediado por fatores que modulam e possibilitam

essa passagem. O estroma é também formado por células reticulares adventícias do

tecido conectivo, o qual ancoram o tecido hematopoético ativo na MO. O parênquima

medular é formado pelas células hematopoéticas originais derivadas das células-

tronco, e que se constituem nas linhagens eritróide, granulocítica

(neutro/eosino/basofílica), monocítica e megacariocítica (ROTHSTEIN 1993,

ALBERTS et al. 1994).

Sob o ponto de vista funcional, as células hematopoéticas podem ser

agrupadas em três classes, que abrangem um espectro de células em diferentes

momentos de diferenciação (Figura 1). A classe das células-tronco (CT) apresenta

grande capacidade de se auto-renovar, bem como de originar as múltiplas linhagens

hematopoéticas. No estágio subseqüente de diferenciação, encontra-se a classe das

células progenitoras que se originam a partir das células-tronco e são

morfologicamente indistinguíveis entre si, sendo que a diferença entre elas só pode

ser evidenciada pela sua capacidade de formar linhagens celulares diferentes. A

próxima classe é a dos precursores (blastos), na qual as células progenitoras adquirem

características antigênicas permitindo sua diferenciação em sub-linhagens, ou seja,

perdem características de multilinhagem ganhando especificidade. Estas células são

largamente estocadas na MO, o que permite um rápido recrutamento e migração

destas para o sangue periférico e tecidos quando necessário (ROTHSTEIN 1993;

ALBERTS et al. 1994).

células precursoras

linfócito T

linfócito B

(linfoblastos)

neutrófilo

(mieloblastos)

monócito

Célula

progenitora

eosinófilo

Célula tronco

plaquetas

basófilo

eritrócitos

Figura 1 – Esquema modificado representando a hierarquia da hematopoese n

medula óssea (ROTHSTEIN 1993).

1.2 LEUCEMIAS NA INFÂNCIA

Apesar de rara, a leucemia é a doença maligna mais comum na infância

correspondendo aproximadamente a 30% dos casos de câncer pediátrico. Oitenta e

cinco por cento (85%) das crianças apresentam leucemia linfocítica aguda (LLA),

10% apresentam leucemia mielóide aguda (LMA) e 5% leucemia mielóide crônica

(LMC). As leucemias linfocíticas crônicas não se manifestam na infância (GOLUB e

ARCECI 2002).

As LLAs têm pico de incidência entre os 2 e 5 anos de idade. Nos Estados

Unidos (E.U.A), são diagnosticadas aproximadamente 2.500

a 3.500 crianças com

LLA por ano, apresentando uma incidência de 30 ou 40 casos novos por milhão por

ano em crianças abaixo dos 14 anos de idade (ROTHSTEIN 1993).

A LMA representa um grupo heterogêneo de desordens hematológicas que se

originam dentro da medula óssea nos precursores das linhagens celulares mielóide,

monocitóide, eritróide e megacariocítica. Pode ser considerada como evento primário

(LMA de novo), como evento secundário (LMA pós-quimioterapia) ou como

resultado de uma transformação a partir de um prévio estado mielodisplásico (t-

MDS/AML) (GOLUB e ARCECI 2002).

1.3 A SÍNDROME MIELODISPLÁSICA

A Síndrome Mielodisplásica (SMD) abrange um grupo heterogêneo de

desordens clonais de células hematopoéticas que acomete principalmente indivíduos

adultos de meia idade ou idade avançada (50 a 70 anos). A SMD é caracterizada por

baixa celularidade (citopenia) do sangue periférico, hipercelularidade da medula

óssea, alterações morfológicas em uma ou mais linhagens celulares e pela

possibilidade de transformação leucêmica. A SMD portanto já foi chamada de pré-

leucemia, uma vez que existe a possibilidade de transformação para LMA em uma

proporção significante de pacientes (HASLE et al. 1999; MIYAZATO et al. 2001;

TORRE et al. 2002) podendo também ocorrer mais raramente a transformação para

LLA (SATO et al. 2004). Este fenômeno sugere que, de fato, a célula que dá origem a

SMD pode originar-se de uma célula progenitora hematopoética multipotente

(segundo estágio de diferenciação), ou até mesmo da célula-tronco onipotente e

indiferenciada (primeiro estágio) (STEENSMA e TEFFERI 2003). O tempo

necessário para a transformação para LMA (t-MDS/AML) pode variar de uma forma

consideravelmente lenta (anos) até aquelas com rápida transformação (2 ou 3 meses).

Sendo que, nos adultos essa transformação, quando ocorre, parece ser mais lenta do

que nas crianças (LUNA-FINEMAN et al. 1999; LOPES e LORAND-METZE 1999;

LOPES et al. 2002; WOODS et al. 2002).

A SMD pode ocorrer como uma desordem hematopoética primária, ou seja

SMD de novo, ou pode ser um evento secundário, após o tratamento quimioterápico

de outros tipos de tumores primários com agentes alquilantes (e.g. ciclofosfamida),

agonistas e antagonistas de topoisomerase II (e.g. etoposide) ou ainda após o

tratamento com radioterapia, por meio de radiação ionizante. A SMD secundária foi

primeiramente descrita em pacientes tratados para a doença de Hodgkin, mielomas

múltiplos, câncer de ovário e recentemente após altas doses de quimioradioterapia

(HASLE et al. 1999; MIYAZATO et al. 2001; LOPES et al. 2002; WOODS et al.

2002).

Em 1982, o grupo French-American-British (FAB) propôs uma classificação

baseada na morfologia das células e na porcentagem de blastos encontrados no

sangue periférico e na medula óssea. Segundo esta classificação, as SMD podem ser

divididas em cinco grupos: a) anemia refratária (RA), caracterizada pela presença de

até 1% de blastos no SP e menos de 5% de blastos em MO com hiperplasia eritróide e

discreta eritropoese; b) RA com sideroblasto anelado (RARS), que é semalhante a

RA, entretanto apresenta dismorfismo na morfologia das células vermelhas no SP e a

presença de sideroblastos e mais de 15% de precursores eritróides em MO; c) RA

com excesso de blastos (RAEB), apresentando menos que 5% de blastos e citopenia

de 2 ou 3 linhagens hematopoéticas em SP e com 5 a 20% de blastos e 2 ou 3

linhagens apresentando dismorfismo em MO; d) RA com excesso de blastos em

transformação (RAEB-t), apresentando 5 a 29% de blastos e bastonetes de Auer no

SP e 20 a 30% de blastos e bastonetes de Auer na MO, além das demais alterações

descritas para a RAEB; e e) a Leucemia Mielomonocítica Juvenil (LMMJ),

caracterizada pela presença de até 5% de blastos, mais de 1x10

monócitos/L de SP e

a presença de 1 a 20% de blastos com monocitose em MO (BENNETT et al. 1982).

A incidência da SMD, atualmente, é bastante discutida devido a dificuldade

de se obter estimativas precisas, uma vez que a classificação desta doença somente foi

estabelecida em 1982. Ainda assim, alguns casos de SMD permanecem

inclassificáveis, apresentando dificuldade para o diagnóstico. Em meados de 1970,

nos E.U.A, a incidência da SMD foi estimada em 1.500 novos casos por ano.

Entretanto, estimativas mais recentes sugerem um número no mínimo 10 vezes maior.

Se comparado à incidência da SMD em relatos de estudos ingleses, que

demonstraram taxas de 9,3 a 12,6 casos por 100.000 habitantes por ano, somente nos

E.U.A deveriam ser diagnosticados mais de 30.000 novos casos de SMD anualmente.

Dessa forma, acredita-se que se levando em conta apenas as estimativas mais

conservadoras (2 a 4 casos por 100.000 habitantes por ano), a ocorrência da SMD de

adultos seja pelo menos tão comum como a LMA (STEENSMA e TEFFERI 2003).

A partir do estabelecimento da classificação FAB em 1982, muitos estudos

foram propostos com intuito de avaliar uma série de fatores para a criação de um

sistema de escore para a predição de prognóstico dos pacientes acometidos por SMD,

ou seja, fatores esses significantes para prever a história natural da doença

(progressão para LMA), bem como a sobrevida desses pacientes (STEENSMA e

TEFFERI 2003). O estudo mais utilizado atualmente com este intuito é o

International Prognostic Scoring System (IPSS) desenvolvido por GREENBERG et

al. em 1997. Neste trabalho, com a realização de uma análise multivariada de 816

pacientes adultos acometidos por SMD de novo, sem prévio tratamento, os autores

utilizaram fatores (porcentagem de blastos na MO, cariótipo e citopenias em SP) que

permitem agrupar os pacientes em grupos de risco bem definidos (baixo risco, risco

intermediário 1, risco intermediário 2 e alto risco) que apresentam média de sobrevida

(em anos) de 5,7, 3,5, 1,2, 0,4, respectivamente (GREENBERG et al. 1997).

1.4 A SÍNDROME MIELODISPLÁSICA NA INFÂNCIA

A SMD é relativamente incomum em crianças, representando em torno de 3%

a 7% das malignidades hematológicas pediátricas e ao contrário dos adultos, na

infância ocorre a predominância dos subtipos morfológicos mais agressivos da

doença, no caso RAEB, RAEB-t e LMMJ. O prognóstico para essa doença na

infância é desfavorável, sendo que a maioria dos pacientes evolui a óbito,

apresentando sobrevida, para aquelas crianças que não disponibilizam de doador de

medula óssea compatível para transplante, de apenas 20-25% em 5 anos nos

subgrupos RAEB e RAEB-t, de acordo com dados do Grupo Cooperativo Brasileiro

de Síndrome Mielodisplásica em Pediatria (GCB-SMD-PED) (LOPES e LATORRE

2003). Esta baixa taxa de sobrevida se deve, principalmente, em decorrência da

transformação leucêmica ou por posteriores complicações, como infecções e

hemorragias. Em crianças a transformação leucêmica é mais rápida e pode ser vista

em 15 a 70% dos pacientes, dependendo do tipo de SMD e da faixa etária do

paciente, sendo que nesta faixa os pacientes também apresentão maior risco de

transformação leucêmica (JAKAB et al. 1999; LOPES et al. 2002; WOODS et al.

2002).

Algumas anormalidades congênitas estão associadas ao desenvolvimento da

SMD na infância como a síndrome de Down, a anemia de Fanconi (associação com

genes de reparo a danos no DNA), a neurofibromatose tipo 1 (associada a fatores de

crescimento e apoptose), entre outras (GOLUB e ARCECI 2002).

Apesar de ainda ser usada em crianças, a classificação FAB está gerando

amplo debate na comunidade científica, pois teve como base a SMD de adultos tendo-

se mostrado inconsistente e imprecisa para abordagem na infância (HASLE e

KERNDRUP 2001; MANDEL et al. 2002). Desde 1982, outros autores (BADER-

MEUNIER et al. 1996; HARRIS et al. 1999) vêm propondo classificações para a

SMD pediátrica, sendo a mais recente a de HASLE et al. (2003) que classifica a SMD

na infância em três grupos principais: a) doença mielodisplásica/ mieloproliferativa, a

qual inclui LMMJ, b) doença (SMD/LMA) relacionada à Síndrome de Down e c)

SMD de novo, a qual teve os subgrupos RAEB (2 a 19% de blastos em SP ou 5 a 19%

de blastos em MO) e RAEB-t (20 a 29% de blastos em SP ou MO) mantidos, como

na classificação FAB. Essa nova classificação enfatiza os subtipos pediátricos de

SMD, unindo os subgrupos RA e RARS dentro de uma nova classe denominada

citopenias refratárias (RC).

Segundo dados do grupo brasileiro (PAULA 2004), 56,9% dos pacientes

diagnosticados com SMD são do subtipo RAEB e quando agrupados, os casos de

RAEB-t, esse número sobe para 61,2%, de acordo com a classificação FAB. Em

relação a outros grupos internacionais, a maioria dos casos se concentra nas LMMJ

assim como na China com 45,8% dos casos (CHAN 2003), no Canadá com 37,2%

(LUNA-FINEMAN et al. 1999) e no Reino Unido com 49,6% (PASSMORE et al.

2003). A LMMJ é apontada como um subtipo de SMD e considerada uma síndrome

mieloproliferativa que se comporta diferentemente dos outros subtipos de SMD. No

trabalho de WOODS et al. (2002) os autores relatam 2,7% de RA, 44,5% de RAEB e

35,1% de RAEB-t, dados esses semelhantes aos achados do grupo brasileiro.

A carência de dados em relação a SMD pediátrica reflete a falta de

conhecimento de algumas formas existentes de SMD (HASLE et al. 1999; MANDEL

et al. 2002). Assim, até o presente momento apenas três estudos populacionais

enfocando a SMD pediátrica foram realizados. Segundo estes estudos, na Dinamarca,

a SMD infantil representa 9% de todas neoplasias hematológicas da infância, tendo

uma incidência anual de 1,8 casos/milhão/crianças < 14 anos (HASLE et al. 1995), no

Canadá, representa 6% (HASLE et al. 1999) e na Inglaterra, 4,3% com uma

incidência anual de 0,8 casos/milhão/crianças < 14 anos (PASSMORE et al. 2003).

Os autores procuram abranger todos tipos já conhecidos de SMD na faixa pediátrica,

sendo que essa discrepância de resultados pode ser explicada pelo fato de que a

incidência possa estar sub ou superestimada devido aos diferentes critérios

diagnósticos adotados por cada grupo, como a contagem de blastos, inclusão ou não

de síndromes associadas entre outros. Esforços recentes têm sido empregados na

tentativa de se chegar a uma estimativa de incidência mais precisa (HASLE et al.

1999; MANDEL et al. 2002).

Atualmente, não há na literatura um sistema de predição de prognóstico

desenvolvido a partir de pacientes pediátricos com SMD. Dessa forma, os sitemas de

escore prognóstico embasados em características de pacientes adultos, quando

aplicados a infância não atingem resultados satisfatórios. Estudos desenvolvidos pelo

Grupo de Trabalho Europeu em SMD da Infância (EWOG-MDS) (HASLE et al.

2000), no Japão (SASAKI et al. 2001) e na Inglaterra (PASSMORE et al. 2003)

avaliaram o uso do IPSS em SMD pediátrica e todos chegaram a conclusão que o

sistema é limitado para o emprego em pediatria. Na infância, o único fator que parece

ser relevante para o prognóstico dos pacientes é a anormalidade citogenética,

especialmente a monossomia do cromossomo 7 (PASSMORE et al. 2003).

A imprecisão no diagnóstico e na classificação da SMD pediátrica parece

influenciar nas estratégias de tratamento. Muitos casos não apresentam progressão

apesar de não receber qualquer forma de tratamento, enquanto que, outros mostram

curso severo da doença embora seja empregada uma quimioterapia intensiva. Dessa

forma, ainda hoje, não existe um consenso a respeito de alguma terapia efetiva para

esses pacientes. No momento, apenas o transplante de medula óssea (TMO) alogênico

oferece a cura potencial para a doença. (JAKAB et al. 1999).

1.5 ASPECTOS MOLECULARES

A progressão histopatológica do tecido normal para o câncer é um processo de

múltiplos passos, no qual várias lesões genéticas críticas se acumulam culminando na

transformação cancerígena. O desenvolvimento e progressão da SMD a partir de

estágios precoces até estágios mais avançados da doença e sua eventual

transformação para leucemia parecem estar de acordo com este conceito

(STEENSMA e TEFFERI 2003). Por isso, a SMD representa um excelente modelo de

desenvolvimento leucêmico com aumento progressivo de blastos envolvendo a

medula óssea. Embora, anormalidades cromossômicas possam ser demonstradas em

50-60% dos casos de novo, alterações moleculares responsáveis pelo início e

evolução dessa desordem ainda são desconhecidas (QUESNEL et al. 1998; TIEN et

al. 2001).

Alterações que ocorrem exclusivamente ou mais comumente em células

cancerígenas podem ser usadas para identificar estas células, sendo importantes na

detecção do câncer em estágios mais precoces (antes da manifestação clínica), na

determinação de prognóstico, no monitoramento da progressão da doença e na

determinação da resposta a terapia (SIDRANSKY 2002).

A identificação dessas alterações no seguimento de doenças hematopoéticas

pode ser importante para a avaliação da evolução dos pacientes (LEITH e

WILLMAN 1996), como mutações nos genes associados à perda do controle de

crescimento celular nas LLA que conferem pior prognóstico a esses pacientes.

Estudos utilizando tais alterações no monitoramento da resposta a terapia estão

resultando em importantes achados sobre a biologia das leucemias (APPELBAUM

1999), como em relação à sensibilidade ou resistência das células leucêmicas a

determinadas classes de drogas.

Mutações que ocorrem no gene supressor de tumor, TP53 e em oncogenes da

família RAS também têm sido descritas nas SMD, entretanto suas incidências ainda

permanecem incertas. Mutações no gene TP53 estão associadas em 5 a 10% dos casos

em adultos, principalmente nos que apresentam doença mais avançada e cariótipo

complexo (HIRAI 2003). Alterações no TP53 cooperam com a ativação de oncogenes

como o RAS, contribuindo para tumorigênese. A família gênica RAS é composta por

uma série de elementos regulatórios críticos na transdução de sinal, proliferação

celular e manutenção do fenótipo maligno. Sabe-se que os genes dessa família são

ativados por mutações pontuais e dentre elas as mutações no N-ras são as mais

freqüentes, estando presentes em 10 a 15% dos casos de SMD de adultos, sendo

associadas a uma menor sobrevida e a maior probabilidade de transformação

leucêmica (HIRAI 2003; MUFTI et al. 2003). A associação de mutações responsáveis

pela ativação de oncogenes da família RAS ou inativação do NF1 coexistindo com

alterações do cromossomo 7 é observada em muitas crianças com SMD sugerindo

que essas alterações podem cooperar para o processo de leucemogênese (LUNA-

FINEMAN et al. 1999).

Polimorfismos em certos genes também estão associados com o aumento da

suscetibilidade ao câncer. O benzeno, um potente agressor da medula óssea, é

parcialmente inativado pela enzima quinona redutase codificada pelo gene NQO1. A

substituição de um aminoácido em determinada seqüência desse gene gera uma

mutação “missense” que em homozigose inativa completamente a ação enzimática da

quinona redutase, tornando o paciente mais suscetível a desenvolver a SMD (NAOE

et al. 2000). Alterações nos genes GSTT1 e GSTM1, detoxificadores de carcinógenos

como os agentes alquilantes, também são encontradas em pacientes com SMD e

LMA, entretanto parecem ser eventos independentes na evolução da doença, não

sendo relacionados a alterações cromossômicas ou a mutações em genes como o

TP53 e RAS. Esses fatos também sugerem a relação entre o polimorfismo de alguns

genes e o aumento da suscetibilidade a SMD (SASAI et al. 1999).

1.6 ALTERAÇÕES CITOGENÉTICAS E SMD

Muitas alterações citogenéticas já foram descritas para SMD e entre as mais

comuns estão as deleções totais ou parciais dos cromossomos 5, 7, 11, 12, 20 e a

trissomia do cromossomo 8 (HOFMANN et al. 2004), sendo que algumas dessas

também estão presentes na t-MDS/AML (AKTAS et al. 2000; GOLUB e ARCECI

2002; TORRE et al. 2002; WOODS et al. 2002).

Na criança, as alterações cromossômicas mais freqüentes envolvem o

cromossomo 7, tais como monossomia 7 (-7) ou deleção 7q (-7q) que estão presentes

em 55 a 70% dos casos, seguida por trissomia do cromossomo 8. A monossomia 7

está associada a um pior prognóstico da doença nessas crianças, pois se acredita que

nessa região estejam localizados um ou mais genes supressores de tumor ou ainda

genes envolvidos no controle da hematopoese (HASLE et al. 1999; PASSMORE et

al. 2003). A trissomia 8 em crianças está presente em torno de 5% dos casos, sendo a

segunda alteração cromossômica mais encontrada (PASSMORE et al. 2003).

A deleção 5q, também conhecida como a síndrome 5q-, é a alteração

cromossômica mais comum na SMD de adultos e está presente em aproximadamente

20% dos pacientes acometidos por esta doença sendo associada a um bom

prognóstico (HOFMAN et al. 2004).

1.7 METILAÇÃO E SMD

A pesquisa nos últimos 10 anos indica que alterações epigenéticas

desempenham um papel importante no processo de tumorigênese (MOMPARLER

2003). Fatores epigenéticos são aqueles que alteram o fenótipo sem alterar o

genótipo, ou seja, não causam alterações na seqüência de DNA (FEINBERG 2001).

A metilação, principal processo epigenético envolvido na regulação da

expressão gênica, é um processo biológico que consiste na adição de um radical metil

(CH

) nas bases nitrogenadas citosinas (C) que estão localizadas na posição 5’ de

guaninas (G). Este fenômeno pode ser freqüentemente observado nas ilhas de CpG,

que são seqüências de DNA que apresentam uma alta concentração do dinucleotídeo

CG e estão presentes, principalmente, nas regiões promotoras dos genes

(MOMPARLER 2003). A presença destes radicais metil na região promotora dos

genes está associada a supressão da expressão gênica. (MOMPARLER 2003; LAIR

2003).

As DNA metiltransferases (DNMT) são um grupo de enzimas (DNMT1,

DNMT1b, DNMT1o, DNMT1p, DNMT2, DNMT3a, DNMT3L e DNMT3b com

suas isoformas) responsáveis por transferir o radical metil para a citosina (DAS e

SINGAL 2004). O primeiro gene de DNMT identificado em organismos eucariotos

foi clonado em camundogos há quase uma década, o Dnmt1. Este gene é conservado

entre os organismos eucariotos e ortólogos deste gene foram identificados em várias

espécies, incluíndo a humana (DNMT1). A DNMT1 é responsável pela manutenção

dos padrões de metilação e apresenta uma alta afinidade com substratos

hemimetilados. Essa enzima também é capaz de promover a metilação de novo em

células adultas e esse mecanismo pode ser estimulado por estruturas de DNA

aberrante e resíduo de citosinas metiladas em simples ou dupla fita de DNA. As

DNMT3a e DNMT3b também são responsáveis por estabelecer os padrões de

metilação de novo, que então serão mantidos pela DNMT1 (SINGAL e GINDER

1999; JONES e BAYLIN 2002; DAS e SINGAL 2004).

Um dos mecanismos utilizados pelas células humanas normais para regular a

expressão de determinados genes é a metilação, sendo que o padrão de metilação do

DNA é conservado após a duplicação e divisão celular pela atividade da DNMT1.

Nessas células a metilação também está envolvida em processos como a inativação do

cromossomo X na mulher e no imprinting genômico (JONES e LAIRD 1999;

MOMPARLER 2003).

Apesar do conhecimento de que a metilação do DNA pode atuar com um

regulador negativo da transcrição gênica, os mecanismos envolvidos nesta regulação

ainda não estão completamente definidos. Três possíveis mecanismos podem explicar

a repressão transcricional devido a metilação do DNA. O primeiro refere-se a

interferência direta dos grupos metil que impedem a ligação de fatores de transcrição

ao DNA. Alguns fatores de transcrição, como E2F e NF-κB, reconhecem seqüências

contendo dinucleotídeos CpG, entretanto essa ligação é impedida quando esses

resíduos apresentam-se metilados (JONES e LAIRD 1999). O segundo seria a ligação

de repressores transcricionais específicos, conhecidos como as proteínas ligantes da

citosina metilada, as quais reconhecem e se ligam a seqüências de DNA metilado por

meio de domínios de ligação ao CpG metilado, o que por sua vez também impediria a

ligação de fatores de transcrição ao DNA. A MeCP1 e MeCP2 foram as primeiras

proteínas descritas que fazem parte desta classe de repressores e também já foram

descritas como envolvidas no mecanismo de repressão trancricional de Neurospora.

Atualmente, outras proteínas foram descritas, incluindo a MBD1, MBD2, MBD3,

MBD4 e Kaiso (DAS e SINGAL 2004). O terceiro mecanismo pelo qual a metilação

pode mediar a repressão transcricional é pela alteração da estrutura da cromatina. As

proteínas MeCP2, MBD2 e MBD3 formam complexos que contém deacetilases de

histonas (HDAC), enzimas que removem o grupo acetil das histonas permitindo

assim, uma compactação da cromatina, o que dificulta ainda mais a ligação dos

fatores de transcrição ao DNA (SINGAL e GINDER 1999; DAS e SINGAL 2004).

Acredita-se que os três mecanismos atuem em sinergismo.

A hipótese postulada por Knudson de que seria necessário a ocorrência de

dois eventos para a completa inativação de genes supressores de tumor é crucial para

o entendimento do processo de tumorigênese. Acreditava-se que esses eventos só

poderiam ocorrer como consequências de danos ao genoma, os quais são descritos

como perdas do material cromossômico ou mutações da informação genética, o que

provoca grandes perdas na atividade gênica e, portanto predispõe ao desenvolvimento

do câncer. Atualmente, o fato da metilação de promotores gênicos estar associada ao

silenciamento da transcrição e a observação desta alteração em células tumorais, pode

sugerir que esta seria uma via em potencial a ser acrescentada na teoria de Knudson

para inativação de genes supressores de tumores (DAS e SINGAL 2004).

Recentemente, tem sido observado com freqüência a ocorrência de metilação

exacerbada (hipermetilação) nas regiões promotoras de genes normamelmente não

metilados, nas células normais, em um grande número de tumores. Estes genes estão,

geralmente, envolvidos no controle do ciclo e morte celular, como CDKN2B,

CDKN2A¸ p14

ARF

, p73 e DAPK (ESTELLER et al. 1999), com o sistema de reparo de

DNA, como MGMT, na supressão do processo de metástase, como TIMP-3

(ZÖCHBAUER-MÜLLER et al. 2001), com a supressão tumoral, como APC e HIC1,

e genes envolvidos em adesão celular, como CDH1 e CDH13 (MARUYAMA et al.

2001). A hipermetilação parece ocorrer em estágios precoces do desenvolvimento

tumoral e aumenta, progressivamente, com o desenvolvimento do fenótipo maligno.

A detecção de metilação anormal ou hipermetilação tem sido utilizada como um

marcador em potencial para o câncer (HERMAN et al. 1998; ESTELLER et al. 1999;

JONES e LAIRD 1999; SANCHEZ-CESPEDES et al. 2000; MOMPARLER 2003).

Alterações epigenéticas, como a metilação, são freqüentemente encontradas em

pacientes adultos com LMA e LLA,

e também já foram relatadas na SMD

(PREISLER et al. 2001; CHEN e WU 2002).

Alguns grupos já avaliaram a freqüência e a importância da hipermetilação da

região promotora de alguns genes em pacientes com SMD. Todos estes estudos

enfocaram a SMD em idade adulta e concentraram seus esforços em dois genes

inibidores de ciclinas dependentes de quinases (CDKI), CDKN2B e CDKN2A, que

estão envolvidos no controle do ciclo celular, e no gene CALCA (calcitonina) que está

envolvido com a regulação dos níveis de cálcio no sangue. UCHIDA et al. (1997)

demonstraram a hipermetilação de CDKN2B em 78% dos pacientes adultos que

apresentavam RAEB e RAEB-t, e também em pacientes que evoluíram para LMA.

QUESNEL et al. (1998) observaram a hipermetilação desse gene em 73% dos

pacientes adultos de alto risco, segundo o IPSS, e em 100% dos pacientes com

transformação leucêmica. TIEN et al. (2001) também obtiveram resultados

semelhantes e ainda associaram o aumento na freqüência de hipermetilação desse

gene de acordo com a progressão da doença quando realizado o acompanhamento e

monitoramento da mesma. Todos esses trabalhos associaram a hipermetilação de

CDKN2B com maior risco de progressão para LMA e também com um pior

prognóstico para os pacientes adultos. Ao contrário de CDKN2B, o gene CDKN2A foi

demonstrado como não metilado (0%) em pacientes adultos com SMD (UCHIDA et

al. 1997).

IHALAINEN et al. (1993) encontraram hipermetilação de CALCA em 92 %

dos pacientes adultos estudados. Dos pacientes que se apresentavam metilados para

este gene faziam parte todos os pacientes de baixo risco, segundo o IPSS, que tinham

RA, sugerindo o envolvimento precoce da hipermetilação desse gene na cascata de

desenvolvimento da SMD até t-MDS/AML. DHODAPKAR et al. (1995) mostraram a

hipermetilação do gene CALCA em 65% de pacientes adultos com SMD, não

relacionando com os subtipos da doença, entretanto demonstrando pior prognóstico

para esses pacientes por predizer uma possível transformação leucêmica.

Outros genes têm sido avaliados quanto ao seu padrão de metilação em

desordens hematopoéticas, principalmente nas leucemias agudas. O gene CDH1,

envolvido na adesão celular, foi descrito como hipermetilado em 32 a 78% de

pacientes com LMA e em 53% de pacientes com LLA. O gene HIC1, candidato a

gene supressor tumoral, está hipermetilado em 10% dos pacientes com LMA e em 50

a 100% para LLA (LEONE et al. 2002). O gene GSTP1 não apresenta alta freqüência

de hipermetilação na LMA (MELKI et al. 1999)

e o gene p73 também demonstrou

baixa freqüência de metilação (18%) em LLA (GARCIA-MANERO et al. 2003).

Além desses, os perfis de metilação de outros genes como o p14

ARF

, MGMT,

APC, RARβ, CDH13, DAPK e o TIMP-3 têm sido investigados em uma série de

outros tipos de tumores, em adultos, como os de cavidade oral, pulmão, mama, cólon,

prostáta e bexiga (TSUCHIYA et al. 2000; MARUYAMA et al. 2001;

ZÖCHBAUER-MÜLLER et al. 2001).

Devido à carência de dados em estudos moleculares que abordam a SMD na

infância, aos recentes estudos que descrevem a ocorrência de metilação em alguns

genes nas leucemias agudas da infância e na SMD de adultos e aos achados em

relação ao tratamento de pacientes adultos com SMD utilizando-se drogas

desmetilantes, o presente estudo buscou avaliar a freqüência de metilação de 14 genes

nas SMD da infância e verificar seu impacto na evolução dos pacientes acometidos

por esta desordem hematopoética.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho visa estabelecer a freqüência de metilação da região

promotora de genes alvos nas síndromes mielodisplásicas da infância, dos subtipos

RAEB e RAEB-t.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar a freqüência de metilação da região promotora dos genes

CDKN2B, CDKN2A, CALCA, CDH1, HIC1, GSTP1, p73, p14

ARF

, MGMT,

APC, RARβ, CDH13, DAPK e TIMP-3 em amostras de medula óssea de

pacientes em idade pediátrica com SMD e em amostras de medula óssea sem

neoplasia.

2. Determinar a freqüência de metilação da região promotora dos genes mais

freqüentemente metilados, definidos na etapa anterior, em amostras de

lâminas de esfregaço de medula óssea de pacientes em idade pediátrica com

SMD.

3. Correlacionar os dados clínico-laboratoriais dos pacientes acometidos pela

SMD pediátrica com a freqüência de metilação das regiões promotoras dos

genes estudados.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 CASUÍSTICA

Foram incluídas neste estudo 30 amostras de medula óssea total de pacientes

com idade pediátrica (0 a 16 anos) acometidos por Síndrome Mielodisplásica,

subgrupos RAEB ou RAEB-t, diagnosticados no período de agosto de 1989 a outubro

de 2003, sendo 12 amostras de MO total a fresco e 18 amostras de esfregaço de MO.

Todas as amostras foram provenientes do Grupo Cooperativo Brasileiro em Síndrome

Mielodisplásica Pediátrica (GCB-SMD-PED), incluindo os casos do Departamento de

Pediatria – Hospital A.C. Camargo – S.P.

Como controle de MO sem neoplasia foram utilizadas 2 amostras de medula

óssea total a fresco colhidas de pacientes pediátricos cardiopatas encaminhados para

cirurgia cardíaca no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC/SP). Também

foram incluídas 10 amostras de esfregaço de MO, colhidas pelo Departamento de

Pediatria – Hospital A.C. Camargo – S.P, no momento do estadiamento, de pacientes

pediátricos acometidos por retinoblastoma intraocular sem infiltração da MO (essas

MO foram consideradas sem neoplasia), no período de dezembro de 2001 a janeiro de

2004.

As amostras de MO total a fresco foram coletadas em EDTA, separadas em

alíquotas de 600µl e estocadas a -70

As amostras foram colhidas e utilizadas após assinatura do termo de

consentimento pós-informado pelos pais ou responsáveis pelos pacientes (anexo I).

3.2 EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DO DNA

Para a extração do DNA das amostras de medula óssea total foi utilizado o kit

Perfect gDNA Blood Mini (Eppendorf), conforme protocolo fornecido pelo

fabricante. Essa extração consistiu na digestão do tecido com a enzima Proteinase K,

seguido da ligação e lavagem do DNA em uma coluna de filtragem e sua posterior

eluição.

Para extração do DNA das amostras de esfregaço de MO foi utilizado o kit

Nucleon HT for Hard Tissue (Amersham). O tecido foi previamente retirado de uma

lâmina de esfregaço (raspado) com auxílio de lâmina de bisturi e posteriormente

submetido a extração de DNA, conforme protocolo fornecido pelo fabricante.

Resumidamente, essa extração consistiu na digestão do tecido com Proteinase K,

desproteinização com uma solução de perclorato de sódio, extração do DNA com

clorofórmio, seguida de precipitação do DNA com etanol absoluto e subseqüente

lavagem com etanol a 70%.

Os DNAs extraídos a partir de MO total a fresco foram quantificados por

espectrofotômetro (GENEQUANT pro - Amersham) e diluídos para obter-se uma

concentração final de 50ng/µl. Para se avaliar a qualidade do DNA foi realizada uma

reação de PCR utilizando iniciadores desenhados nos íntrons 12 e 13 do gene hMLH1

(human mult-L homologue 1 – NM_000249) ( Direto - 5’ TTG TGT CTC TAG TTC

TGG 3’ e Reverso - 5’ CAT TGT TGT AGT AGC TCT GC 3’). Com o uso desses

iniciadores intrônicos, a amplificação de um fragmento de 252 pares de base indica a

presença do DNA genômico na amostra. Essa reação foi realizada sob as seguintes

condições: 1,5 mM de MgCl

, 0,2mM de dNTPs, 0,3µM de cada iniciador, 1X

Tampão de PCR, 1,5U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen) e 2µl de DNA (50ng/µl)

em um volume final de reação de 25µl. O programa de PCR utilizado foi: 94

C por 5

minutos; 35 ciclos de 94

C por 30 segundos, 60°C por 45 segundos e 72

C por 45

segundos; 72

C por 7 minutos. Para a visualização dos produtos amplificados as

amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida a 8% e coradas com nitrato de

prata (SANGUINETTI et al. 1994).

Devido à pequena quantidade do material proveniente de esfregaço de lâmina

de MO, a reação de PCR para confirmação da presença de DNA foi realizada

conforme descrito acima, entretanto, em cada reação foram adicionados 2µl de DNA

sem qualquer tipo de quantificação prévia.

3.3 TRATAMENTO COM BISSULFITO DE SÓDIO

Os DNAs das amostras foram submetidos ao tratamento de bissulfito de sódio

conforme descrito por GOLDENBERG et al. (2004), com algumas adaptações. Este

tratamento converte as citosinas não-metiladas em uracilas, enquanto as citosinas

metiladas permanecem inalteradas.

Resumidamente, a 500ng do DNA genômico foi adicionado água para um

volume final de 17µl. A esse DNA foram adicionados 3µl de uma solução contendo

3M de Hidróxido de Sódio (NaOH) e esta mistura foi mantida por 20 minutos a 50°C.

Em seguida adicionou-se 500µl da solução de Bissulfito de Sódio (2,5M de Bissulfito

de Sódio, 125mM de Hidroquinona e 350mM de NaOH) e incubou-se por 3 horas a

70°C. O DNA tratado foi purificado com o kit Wizard DNA Clean-up System

(Promega), conforme protocolo fornecido pelo fabricante, eluído em 45µl de água e

dessulfonado com 5µl de uma solução contendo 3M de NaOH por 10 minutos a

temperatura ambiente. O DNA foi então precipitado pela adição de 45µl de 7,5M de

Acetato de Amônio, 350µl de etanol absoluto e 1µl de glicogênio (20mg/ml) e

incubado a -20°C por 16 horas. Após 15 minutos de centrifugação a 13.000 rpm a

4°C, o DNA foi lavado com 500 µl de etanol 70%, solubilizado em 50µl de água e

estocado a -70°C até o uso.

3.4 REAÇÃO DE MSP (METHYLATION SPECIFIC PCR)

Foram realizadas reações de PCR específicas para detecção de metilação

(MSP - methylation specific PCR) conforme descrito por HERMAN et al. (1996),

para cada um dos 14 genes incluídos nesta análise.

Nestes experimentos, na amplificação por PCR utilizam-se dois pares de

iniciadores, um dos pares reconhece especificamente as seqüências com as citosinas

mantidas em suas posições originais (metiladas), enquanto o outro é específico para

as timinas nos lugares das citosinas (seqüências não-metiladas).

Para as reações de MSP foram utilizados iniciadores complementares a região

promotora dos genes CDKN2A, TIMP-3, MGMT, DAPK, CDH1, p14

ARF

e GSTP1,

conforme descrito por ZÖCHBAUER-MÜLLER et al. (2001), para o gene RARβ,

conforme descrito por UEKI et al. (2000), para o gene APC, conforme descrito por

ESTELLER et al. (2000), para o gene CDH13, conforme descrito por TOYOOKA et

al. (2002), para o gene CDKN2B, conforme descrito por CHAN et al. (2002), para o

gene p73, conforme descrito por SIU et al. (2002) e para o gene HIC1 conforme

descrito por DONG et al. (2001). Os iniciadores para o gene CALCA foram

desenhados utilizando o programa MethPrimer (Tabela 1) (LI e DAHIYA 2002).

As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o kit Platinum Taq DNA

Polymerase (Invitrogen). As condições de reação utilizadas foram: 0,2mM de dNTPs;

0,5µM de cada iniciador; 0,5U de Platinum Taq DNA Polymerase; 1,5mM MgCl

1X Tampão de Reação, em um volume final de 25µl. O programa de PCR utilizado

foi: desnaturação inicial de 95

C por 2 minutos, seguido por 10 ciclos de 95

C por 30

segundos, a primeira temperatura de annealing por 1 minuto e 72

C por 1 minuto,

depois, mais 10 ciclos de 95

C por 30 segundos, a segunda temperatura de annealing

por 1 minuto e 72

C por 1 minuto, por último, foram mais 15 ciclos de 95

C por 30

segundos, a terceira temperatura de annealing por 1 minuto e 72

C por 1 minuto. Para

finalizar, incubou-se a 72

C por 7 minutos. Em cada reação foram adicionados 2µl do

DNA proveniente das MO a fresco tratado com bissulfito de sódio (conforme descrito

acima), diluído cinco vezes em água. Para as amostras de esfregaço de MO foram

adicionadas 2µl de DNA sem diluição prévia.

As temperaturas de annealing e o tamanho esperado dos fragmentos

amplificados com cada par de iniciadores estão descritos na Tabela 2.

Para a visualização dos fragmentos amplificados, os produtos de PCR foram

separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e corados com nitrato de

prata.

3.5 VARIÁVEIS DO ESTUDO

As variáveis demográficas incluídas neste estudo foram sexo, idade, raça e

antecedentes de SMD na família. As variáveis clínicas-laboratorias foram palidez,

hepatomegalia, esplenomegalia, adenomegalia, classificação da doença,

transformação leucêmica, óbito, seguimento do paciente, contagem de glóbulos

vermelhos, contagem de glóbulos brancos, taxa de hemoglobina, taxa de hematócrito,

contagem de plaquetas, de bastonetes, de células segmentadas, de monócitos e

porcentagem de blastos na MO. Os valores para cada variável foram obtidos a partir

dos exames referentes ao momento do diagnóstico, assim como as amostras, e estão

dispostos no Anexo II.

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Primeiramente, as variáveis foram analisadas descritivamente por meio de

proporções ou da média e desvio padrão a depender de serem do tipo qualitativa ou

quantitativa, respectivamente. A seguir, para as associações entre as variáveis

qualitativas demográficas e clínicas e a freqüência de metilação dos genes foi

utilizado o teste de Fisher. Para as variáveis quantitativas, a comparação entre o

padrão de metilação foi avaliada através do teste não-paramétrico de Mann-Whitney.

Também foram estimadas as curvas de possibilidade de sobrevida acumulada

utilizando o estimador produto-limite de Kaplan-Meier sendo a comparação das

mesmas feito pelo teste log-rank.

As diferenças foram consideradas significativas quando o p foi menor que

0,05 e todas as análises foram feitas utilizando o programa SPSS versão 10.0.

3.7 ASPECTOS ÉTICOS

O presente projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do

Hospital do Câncer A.C. Camargo - Fundação Antônio Prudente (FAP) – S.P. em

adendo do dia 30/09/2003, protocolo número 503/03, e pelo Comitê de Ética em

Pesquisa do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (IDPC/SP), em reunião do dia

06/05/2003, protocolo número 3166/2003.

Tabela 1 - Seqüência dos iniciadores utilizados na MSP.

D: Iniciador direto; R: Iniciador reverso.

Gene

Seqüências dos iniciadores

para a situação metilada (5’- 3’)

Seqüências dos iniciadores

para a situação não-metilada (5’- 3’)

Referências

CDKN2A

D - TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC

R - GACCCCGAACCGCGACCGCGACCGTAA

D - TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT

R – CAACCCCAAACCACAACCATAA

Zöchbauer-Müller

et al

(2001)

TIMP-3

D -

CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC

R -

CCGAAAACCCCGCCTCG

D -

TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT

R - CCCCCAAAAACCCCACCTCA

Zöchbauer-Müller

et al

(2001)

MGMT

D -

TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC

R -

GCACTCTTCCGAAAACGAAACG

D -

TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT

R -

AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA

Zöchbauer-Müller

et al

(2001)

DAPK

D - GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC

R - CCCTCCCAAACGCGA

D - GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT

R – CAAATCCCTCCCAAACACCAA

Zöchbauer-Müller

et al. (2001)

CDH1

D - TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT

R - TAACTAAAAATTCACCTACCGAC

D - TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT

R – CACAACCAATCAACAACACA

Zöchbauer-Müller et

al. (2001)

P14

ARF

D - GTGTTAAAGGGCGGCGTAGC

R - AAAACCCTCACTCGCGACGA

D - TTTTTGGTGTTAAAGGGTGGTGTAGT

R – CACAAAAACCCTCACTCACAACAA

Zöchbauer-Müller

et al. (2001)

GSTP1

D - TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC

R - GCCCCAATACTAAATCACGACG

D - GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT

R – CCACCCCAATACTAAATCACAACA

Zöchbauer-Müller

et al

(2001)

RARβ

D - GGATTGGGATGTCGAGAAC

- TACAAAAAACCTTCCGAATACG

D - AGGATTGGGATGTTGAGAATG

R – TTACAAAAAACCTTCCAAATACA

Ueki et. al. (2000)

APC

D - TATTGTGGAGTGGGGGTC

R - TGCACGAACTCCCGACGA

D - GTGTTTTATTGTGGAGTGTGGGTT

R – CCAATCAACAAACTCCCAACAA

Esteller et al

(2000)

CDH13

D - TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC

R - GATGTTTTCATTCATACACGCG

D - TTGTGGGGTTGTTTTTTGT

R – AACTTTTCATTCATACACACA

Toyooka et. al. (2002)

CDKN2B

D - GCGTTCGTATTTTGCGGTT

R - CGTACAATAACCGAACGACCGA

D - TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT

R – CCATACATAACCAAACAACCAA

Chan et. al. (2002)

P73

D - GGACGTAGCGAAATCGGGGTTC

R - ACCCCGAACATCGACGTCCG

D - AGGGGATGTAGTGAAATTGGGGTTT

R – ATCACAACCCCAAACATCAACATCCA

Siu et. al. (2002)

HIC

D - TCGGTTTTCGCGTTTTGTTCGT

R - AACCGAAAACTATCAACCCTCG

D - TTGGGTTTGGTTTTTGTGTTTTG

R – CACCCTAACACCACCCTAAC

Dong et. al. (2001)

CALCA

D - GTTTTGGAAGTATGAGGGTGACG

R - TTCCCGCCGCTATAAATCG

D - TTTTAGGTTTTGGAAGTATGAGGGTGATG

R – TTCCCACCACTATAAATCA

* Os iniciadores para CALCA foram construídos utilizando-se o programa MethPrimer

Tabela 2 - Temperaturas utilizadas nas reações de MSP.

U = produto obtido da amplificação com os iniciadores desenhados para as seqüências não-metidadas.

Gene Temperaturas da PCR (

C)* Tamanho esperado dos fragmentos (pb)

CDKN2A 66 – 64 – 62

U – 151

M – 150

TIMP-3 62 – 60 – 58

U – 122

M – 116

MGMT 64 – 62 – 60

U – 93

M – 81

DAPK 62 – 60 – 58

U – 106

M – 98

CDH1 58 – 56 – 54

U – 97

M – 115

P14 64 – 62 – 60

U – 132

M – 122

GSTP1 62 - 58 – 56

U – 97

M – 91

RARβ 58 – 56 – 54

U – 100

M – 100

APC 62 – 60 – 58

U – 108

M - 98

CDH13 62 – 60 – 58

U – 243

M – 243

CDNK2B 64 – 62 – 60

U – 154

M – 148

P73 68 – 66 – 64

U – 69

M – 60

HIC1 60 – 58 – 56

U – 118

M – 95

CALCA

56 (U)

68 (M)

U – 105

M – 100

M = produto obtido da amplificação com os iniciadores desenhados para as seqüências metidadas.

Temperaturas de annealing usadas nas reações de PCR.

Para CALCA as reacões foram feitas utilizando temperaturas únicas e diferentes para o annealing dos

iniciadores.

4 RESULTADOS

4.1 CASUÍSTICA

As características demográficas, clínicas e laboratoriais dos pacientes

pediátricos acometidos pela SMD, subtipo RAEB ou RAEB-t, foram obtidas a partir

de um levantamento feito no arquivo de documentos (ficha clínica, exames) do GCB-

SMD-PED e todos valores obtidos referem-se ao momento do diagnóstico, assim

como as amostras.

A idade dos pacientes variou de 8 meses a 15 anos de idade (média= 5,4

anos). Em nossa casuística há o predomínio da raça branca (62,5%). Os achados mais

freqüentes ao exame físico nos pacientes deste estudo foram palidez (65,2%) e

hepatomegalia (54,2%). Em nossa população não foi possível observar diferença

entre a proporção de pacientes do sexo masculino e feminino (razão 0,92:1). Em

relação à evolução dos pacientes de nosso estudo podemos observar que 54,2% foram

a óbito e 33,3% apresentaram transformação para leucemia. Ainda, em nossa

população, há o predomínio (88%) dos pacientes classificados com SMD subtipo

RAEB, segundo a classificação FAB(Tabela 3). O tempo de sobrevida dos pacientes

foi em média de 19 meses (desvio padrão= 15,8 meses) A caracterização da

população segundo as características clínica-laboratoriais está descrita na Tabela 4.

Tabela 3 - Número e porcentagem de pacientes acometidos por SMD segundo

características demográficas e clínicas.

Variável categoria N

Sexo

Masculino 12 48

Feminino 13 52

Raça

branco 15 65,2

pardo/mulato 3 13

ignorado 5 21,8

Palidez

ausente 8 34,8

presente 15 65,2

Hepatomegalia

ausente 11 45,8

presente 13 54,2

Esplenomegalia

ausente 16 66,7

presente 8 33,3

Adenomegalia

ausente 17 73,9

presente 6 26,1

Classificação FAB

RAEB 22 88

RAEB-t 3 12

Transformação

leucêmica

não 12 66,7

sim 6 33,3

Óbito

não 11 45,8

sim 13 54,2

O fígado e baço foram considerados aumentados quando se

apresentaram > 2cm do rebordo costal ao exame físico

gânglios palpáveis e aumentados

Quando os dados não foram obtidos os pacientes não foram

considerados na análise

porcentagem em relação aos pacientes que apresentavam os dados

para a variável.

Tabela 4. Descrição da média e desvio padrão das características clínico-laboratoriais

dos pacientes acometidos por SMD.

Características N

Média desvio padrão

Labaratoriais

Glóbulos vermelhos

14 3063571,0 1210617,18

(/mm

)

Hemoglobina

20 7,97 2,98

(g/dl)

Hematócrito

18 24,48 11,19

(%)

Plaquetas

19 95789,47 66824,46

(/mm

)

Glóbulos brancos

19 10915,79 20119,59

(/mm

)

Bastonetes (%) 19 2,55 3,38

Segmentados (%) 20 29,15 17,93

Monócitos (%) 20 8,61 8,11

Blastos (%) 24 11,06 6,18

idade (anos) 23 5,2 4,46

Quando os dados não foram obtidos os pacientes não foram

considerados na análise.

4.2 TRATAMENTO COM BISSULFITO DE SÓDIO E MSP DE

PEQUENAS QUANTIDADES DE DNA

Devido a pequena quantidade de DNA obtido a partir da extração dos

esfregaços de MO foi necessário otimizar a reação de MSP a partir de pequenas

quantidades de DNA tratado com bissulfito de sódio. Sendo assim, 100 a 400ng de

DNA de sangue periférico e de linhagem celular de leucemia promielocítica aguda

(HL60) foram tratados com bissulfito de sódio e ressuspendidos em 50µl de água.

Um microlitro de cada DNA tratado foi submetido a reação de MSP para o gene

CDKN2A. A linhagem celular HL60 foi utilizada porque outros autores já haviam

demonstrado que o gene CDKN2A se encontrava metilado nesta linhagem. Como

pode ser observado na Figura 2, até mesmo com a utlilização de 100ng de DNA

tratado foi possível detectar o produto na reação de MSP e que a quantidade de DNA

tratado não influencia no resultado da MSP.

Este fato nos permitiu acreditar que seria possível a utilização de DNA

extraído a partir de lâminas de esfregaço de medula óssea total. Desta forma,

pudemos incluir no nosso estudo mais 18 casos de SMD, aumentando o número de

amostras analisadas.

400ng

100ng

200ng

400ng

100ng

Ma U M U M U M U M U M U M U M

200 bp

100 b

Figura 2 - MSP do gene CDKN2A. As reações foram realizadas com diferentes quantidades de DNA

tratado com bissulfito de sódio (100, 200 e 400ng). Ma: marcador de peso molecular (Laedder 100bp -

Invitrogen); U: situação não-metilada; M: situação metilada. 1, 2 e 3: diferentes quantidades de DNA

de sangue periférico tratadas com bissulfito de sódio. 4, 5 e 6: diferentes quantidades de DNA de

HL60 tratadas com bissulfito de sódio. NO: controle negativo da reação de MSP (ausência de DNA).

Gel de poliacrilamida 8% corado com prata.

4.3 PADRONIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE DNA DE ESFREGAÇO

DE MEDULA ÓSSEA

Para verificar a viabilidade da obtenção de DNA a partir de amostras de

esfregaço de MO foram realizados experimentos utilizando-se algumas lâminas de

esfregaço de MO, provenientes do laboratório clínico, obtidas de pacientes sem SMD

no momento de coleta para estadiamento.

O material destas lâminas foi raspado com auxílio de bisturi e foi submetido a

extração de DNA com o kit Nucleon HT for Hard Tissue (Amersham), de acordo com

o protocolo do fabricante. Após ressuspensão, em 20µl de água, esse DNA foi

quantificado gerando resultados que variavam entre quantidades de 300 a 500ng de

DNA, confirmando a expectativa de se obter pouco DNA a partir deste material. A

presença de DNA foi verificada através da amplificação de um fragmento de 252 pb

do gene hMLH1. Assim, 100ng de DNA de cada amostra foram submetidos à reação

de PCR com iniciadores localizados nos introns 12 e 13 do gene hMLH1 (Figura 3).

Foram utilizados esfregaços de MO sem coloração e esfregaços de MO corados com

corante Giemsa para estudos de citologia. Estes experimentos demonstraram que seria

possível extrair das lâminas de esfregaços de MO quantidades de DNA suficientes

para desenvolver as análises de metilação e que o fato das lâminas estarem coradas

não interfere no processo de extração do DNA.

2 C+

300 pb

hMLH1

200 pb

Figura 3. Amplificação de um fragmento de 252 pb do gene hMLH1 a partir de amostras de

DNA obtidas de esfregaços de MO corados e não-corados. Ma: marcador de peso molecular

(Laedder 100bp - Invitrogen); 1: esfregaço de MO sem coloração. 2: esfregaço de MO corado. C+:

controle positivo da reação de PCR (DNA genômico). NO: controle negativo da reação de PCR

(ausência de DNA). Gel de poliacrilamida 8% corado com prata.

O próximo passo foi avaliar se o tempo de estocagem desses esfregaços de

MO influenciaria na qualidade do DNA. Para isto foi extraído o DNA de esfregaços

de MO feitos nos anos de 1980 e de 2003. Assim, após quantificação 100ng de DNA

de cada amostra foi submetido à reação de PCR para a amplificação do fragmento do

gene hMLH1 (Figura 4). A partir deste experimento observou-se que o tempo de

estocagem parece não interferir na qualidade do DNA obtido. Assim, pudemos

concluir que seria possível extrair DNA de lâminas de esfregaço de MO que

estivessem estocadas há muito tempo.

C+

300 pb

hMLH1

200 pb

Figura 4 - Amplificação de um fragmento de 252 pb do gene hMLH1 a partir de amostras de

DNA obtidas de esfregaços de MO de diferentes períodos de estocagem. Ma: marcador de peso

molecular (Laedder 100bp - Invitrogen); 1: esfregaço de MO feito no ano de 1980. 2: esfregaço de MO

feito no ano de 2003. C+: controle positivo da reação de PCR (DNA genômico). NO: controle

negativo da reação de PCR (ausência de DNA). Gel de poliacrilamida 8% corado com prata.

4.4 EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DO DNA

EXTRAÍDO DAS AMOSTRAS DE MEDULA ÓSSEA

O DNA foi extraído a partir de 200µl de cada uma das 12 amostras de MO a

fresco de 12 pacientes com SMD e de 18 amostras de esfregaço de MO de pacientes

com SMD (cada amostra era proveniente de duas lâminas de esfregaço de MO de

cada um dos 18 pacientes com SMD).

As amostras de MO a fresco foram quantificadas e resultaram em quantidades

de DNA que variaram entre 3µg a 28µg. Como era esperado um baixo rendimento na

extração de DNA das amostras de esfregaço de MO, esses não foram quantificados a

fim de evitar a perda de DNA. A presença de DNA foi verificada para as 12 amostras

de MO a fresco, através da amplificação do fragmento do gene hMLH1 a partir de

100ng de DNA de cada amostra. A Figura 5 exemplifica o resultado da reação de

PCR obtido com o DNA proveniente de 3 das 12 amostras de MO a fresco (SMD 19,

21 e 23).

SMD

C-

C+

400pb

300pb

hMLH1

200pb

Figura 5. Amplificação de um fragmento de 252 pb do gene hMLH1 a partir de amostras de

DNA obtidas de medula óssea total de 3 pacientes com SMD. Ma: marcador de peso molecular

(Laedder 100bp - Invitrogen); C+: controle positivo (DNA genômico), C-: controle negativo (ausência

de DNA). Gel de poliacrilamida 8% corado com prata.

O mesmo experimento foi realizado utilizando-se 2µl do DNA (sem prévia

quantificação) das 18 amostras de DNA provenientes dos esfregaços de MO. Embora,

em nenhuma destas amostras tenha sido possível a visualização do fragmento de

252pb do gene hMLH1 que evidenciaria o êxito da extração de DNA todas as

amostras foram submetidas ao tratamento com Bissulfito de Sódio e posterior reação

de MSP. Foram extraídos também os DNAs de 10 amostras de esfregaços de MO de

pacientes com retinoblastoma intraocular sem invasão de células tumorais na MO

(controle sem neoplasia) e de 2 amostras de MO a fresco colhidas do esterno de

crianças submetidas à cirurgia cardíaca (controle sem neoplasia). Sem prévia

quantificação, 2µl de cada DNA extraído destas amostras-controle de MO foram

submetidos a amplificação do fragmento de 252pb do gene hMLH1 e em todas foi

possível a visualização do fragmento esperado. A partir deste resultado essas

amostras foram quantificadas e 1µg de DNA de cada amostra foi submetido ao

tratamento com Bissulfito de Sódio e realização das reações de MSP.

4.5 PERFIL DE METILAÇÃO PARA AS AMOSTRAS DE MEDULA

ÓSSEA DOS INDIVÍDUOS SEM SMD E DOS PACIENTES COM SMD

A fim de confirmar se o padrão de metilação encontrado nas amostras de

esfregaço de MO não sofre alterações devido ao processo de fixação e estocagem do

material, os DNAs de uma amostra de MO a fresco e de uma amostra de esfregaço de

MO (corado) obtidos do mesmo paciente tiveram seu padrão de metilação avaliado

para os genes CALCA e GSTP1. Como pode ser observado na figura 6, o padrão de

metilação para os 2 genes avaliados é idêntico em ambas as amostras. Ou seja, o

processo de preparação, estocagem e coloração por que passam as amostras de

esfregaço de MO parece não introduzir alterações no padrão de metilação.

L167

SMD41

L167

SMD41

Ma U M U M

100 pb

Figura 6. Perfil de metilação em uma amostra de MO a fresco (SMD41) e uma amostra de

esfregaço de MO (L167) obtidas do mesmo paciente. A. gene CALCA B. gene GSTP1 Ma:

marcador de peso molecular (Laedder 100bp - Invitrogen); U: situação não-metilada; M: situação

metilada. Gel de poliacrilamida 8% corado com prata.

O próximo passo do estudo foi avaliar o perfil de metilação dos genes

selecionados nas 12 amostras de MO a fresco de pacientes acometidos pela SMD.

Para 6 dos 14 genes analisados (CDKN2A, HIC1, p73, DAPK, APC e TIMP-3) não foi

possível detectar a presença de metilação na região promotora. Os quatro genes que

apresentaram a sua região promotora mais freqüentemente metilada nestas amostras

foram: CALCA (83,3%), CDH1 (75%), GSTP1 (58,3%) e CDKN2B (50%). Nos

outros quatro genes restantes (p14

ARF

, RARβ, MGMT e CDH13), as freqüências de

metilação encontradas foram menores que 30% (Tabela 4).

Em seguida, foi avaliado o padrão de metilação da região promotora dos 14

genes selecionados nas 12 amostras de MO sem neoplasia (controle). Para 9 genes

(HIC1, p14

ARF

, p73, DAPK, APC, TIMP-3, MGMT, CDH13 e CDKN2B) não foi

detectada a presença de metilação da região promotora. Para o gene RARβ foi

possível detectar a metilação da região promotora em 25% das amostras, enquanto

que, o gene CALCA apresentou-se metilado em 16,6% das amostras e os genes

CDKN2A e GSTP1 estavam metilados em 8,3% das amostras. O gene CDH1

demonstrou ser freqüentemente metilado (66,6%) nessas amostras (Tabela 4).

Embora o gene CDH1 tenha apresentado uma alta freqüência de metilação nas

amostras de MO (75%), este gene também se apresentou bastante metilado nas

amostras de controle sem neoplasia (66%) e por isso esse gene foi excluído das

demais análises.

A próxima etapa da analise foi a avaliação da freqüência de metilação dos três

genes que apresentaram maior freqüência de metilação (CALCA, GSTP1 e CDKN2B)

nas 18 amostras de esfregaço de MO. Em 5 destas amostras não foi possível observar

a amplificação de nenhum fragmento na reação de MSP, seja o fragmento

representando a situação não-metilada, seja o fragmento da situação metilada. Isto

pode ter ocorrido devido a ausência de DNA destas amostras. Portanto, o estudo

prosseguiu com 13 amostras de esfregaço de MO. Os genes CALCA e GSTP1

apresentaram uma freqüência de metilação na sua região promotora de 69,2% e

46,2%, respectivamente (Tabela 4). Mesmo após exaustivas tentativas, o gene

CDKN2B não pode ter a freqüência de metilação de sua região promotora

determinada nestas 13 amostras de esfregaço de MO, pois a reação de MSP para este

gene nessas amostras apresentou sempre uma grande inespecificidade, dificultando

assim a sua análise.

Quando a análise da freqüência de metilação dos genes CALCA e GSTP1 foi

realizada combinando-se os resultados obtidos com as 25 amostras de MO (a fresco e

lâminas) de pacientes acometidos pela SMD as freqüências de metilação observadas

foram de 76% e 52%, respectivamente (Tabela 4).

Considerando os 25 casos estudados, podemos observar o perfil de metilação

dos três genes mais freqüentemente metilados, individualmente, na figura 7. Se

analisarmos apenas os genes CALCA e GSTP1 podemos observar que 88% dos

pacientes apresentam metilação para pelo menos um dos genes e ainda que 40%

apresentam metilação para ambos. Para ilustrar os resultados, a figura 8 mostra o

padrão de metilação detectado nas regiões promotoras dos genes CALCA, GSTP1 e

DAPK em amostras de MO.

Tabela 5. Freqüência de metilação na região promotora dos 14 genes estudados nas

amostras de MO de pacientes acometidos pela SMD e nas amostras de MO sem

neoplasia.

Freqüência de Metilação % (n)

Gene MO a fresco (12) Esfregaço de MO (13)

MO a fresco +

Esfregaço de MO (25)

MO s/neoplasia (12)

CALCA

83,3 (10) 69,2 (9) 76 (19) 16,6 (2)

CDH1

75 (9) - - 66,6 (8)

GSTP1

58,3 (7) 46,2 (6) 52 (13) 8,3 (1)

CDKN2B

50 (6) - - 0

CDH13

25 (3) - - 0

MGMT

16,6 (2) - - 0

p14ARF

16,6 (2) - - 0

RARβ

8,3 (1) - - 25 (3)

CDKN2A

0 - - 8,3 (1)

HIC1

0 - - 0

p73

0 - - 0

DAPK

0 - - 0

APC

0 - - 0

TIMP-3

0 - - 0

No. Caso Amostras

CALCA GSTP P15

38 SMD 4

43 SMD 36

41 SMD 234

112 SMD 7

115 SMD 10

132 SMD 14

142 SMD 16

135 SMD 17

185 SMD 19

195 SMD 21

166 SMD 23

139 SMD 1271

L31

12 L35 -

16 L39 -

18 L54 -

48 L175 -

52 L196 -

145 L746 -

169 L771 -

170 L833 -

172 L854 -

181 L931 -

193 L1023 -

198 L1041 -

Figura 7 - Perfil de metilação da região promotora dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B nas 25

amostras de MO incluídas neste estudo. Caixas pretas, amostras que são metiladas. Caixas brancas,

amostras que são não-metiladas.

SMD – amostras de MO a fresco. L – amostras de esfregaço de MO.

Figura 8. Perfil de metilação na região promotora dos genes CALCA, GSTP1 e DAPK. Após a reação

de MSP, os produtos obtidos foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e

visualizados através da coloração com prata. A. Status de metilação para o gene CALCA nas amostras

4, 10 e 14. B. Status de metilação para o gene GSTP1 nas amostras L746 e L833. C. Status de

metilação para o gene DAPK nas amostras 21 e 23. Ma: marcador de peso molecular (Laedder 100bp -

Invitrogen); U: situação não-metilada; M: situação metilada; LU: DNA de linfócitos normais utilizado

como controle para a situação não-metilada; LM: DNA de linfócito metilado in vitro utilizado como

controle da situação metilada; HCT116: linhagem celular de adenocarcinoma coloretal (controle da

situação metilada para CALCA); NO: controle negativo da reação de MSP (ausência de DNA).

U M U M Ma U M U M U M

L833

L746

HCT116

Ma U M U M U M U M U M U M

100 bp

100 pb

Ma U M U M U M U M U M

100 pb

4.6 CORRELAÇÃO ENTRE OS DADOS DEMOGRÁFICOS,

CLÍNICOS E LABORATORIAIS E O PADRÃO DE METILAÇÃO DOS

GENES

Após a verificação de que apenas 3 dos 14 genes (CALCA, GSTP1 e

CDKN2B) apresentavam uma elevada freqüência de metilação em suas regiões

promotoras, nas amostras de MO dos pacientes com SMD e baixa freqüência de

metilação nos controles de MO sem neoplasia, partimos para verificar se existia

alguma correlação entre presença da metilação da região promotora destes três genes

e características demográficas e clínicas destes pacientes. Também foi observado

perfil de metilação desses pacientes segundo suas características laboratoriais

(hemograma).

4.6.1 CORRELAÇÃO DO PADRÃO DE METILAÇÃO DOS GENES

CALCA, GSTP1 e CDKN2B

4.6.1.1 Com os Parâmetros Demográficos e Clínicos

Em uma primeira análise foi feita a associação entre o padrão de metilação

dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B, separadamente, em relação as características

demográficas e clínicas, não demonstrando correlações estatisticamente significativas

para as variáveis estudadas (Tabela 6).

Na análise da associação entre o padrão de metilação dos genes CALCA e

GSTP1 combinados, e as características demográficas e clínicas também não foi

possível observar correlações estatisticamente significativas (Tabela 7).

Tabela 6 - Correlação do padrão de metilação dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B

com as características demográficas e clínicas dos pacientes acometidos pela SMD.

U: não metilado; M: metilado

CALCA

GSTP1 CDKN2B

U M U M U M

Variável

categoria

(%)

(%) n

(%)

(%) n

(%)

Sexo

Masculino 1 (16,7) 11 (57,9) 5 (41,7) 7 (53,8) 3 (50) 3 (50)

Feminino 5 (83,7) 8 (42,1)

0,160

7 (58,3) 6 (46,2) 3 (50) 3 (50)

1,000

Total 6 (100) 19 (100) 12 (100) 13 (100)

0,695

6 (100) 6 (100)

Raça

branco 3 (100) 12 (80) 8 (88,9) 7 (77,8) 5 (100) 3 (75)

pardo/mulato - 3 (20)

1,000

1 (11,1) 2 (22,2)

1,000

- 1 (25)

0,444

Total 3 (100) 15 (100) 9 (100) 9 (100) 5 (100) 4 (100)

Palidez

ausente 1 (20) 7 (38,9) 5 (41,7) 3 (27,3) 1 (20) 2 (33,3)

presente 4 (80) 11 (61,1)

0,621

7 (58,3) 8 (72,7)

0,667

5 (80) 4 (66,7)

0,545

Total 5 (100) 18 (100) 12 (100) 6 (100) 6 (100)

Antecedente

de SMD

não 2 (100) 14 (87,5) 10 (100) 6 (75) 1 (16,7) 3 (50)

sim - 2 (12,5)

1,000

- 2 (25)

0,183

5 (83,3) 3 (50)

1,000

Total 2 (100) 16 (100) 10 (100) 8 (100) 6 (100) 6 (100)

Hepatomegalia

ausente 2 (40) 9 (47,4) 5 (41,7) 6 (50) 5 (100) 4 (80)

presente 3 (60) 10 (52,6)

1,000

7 (58,3) 6 (50)

1,000

- 1 (20)

1,000

Total 5 (100) 19 (100) 12 (100) 12 (100) 5 (100) 5 (100)

Esplenomegalia

ausente 3 (60) 13 (68,4) 8 (66,7) 8 (66,7) 2 (33,3) 3 (50)

presente 2 (40) 6 (31,6)

1,000

4 (33,3) 4 (33,3)

1,000

4 (66,7) 3 (50)

1,000

Total 5 (100) 19 (100) 12 (100) 12 (100) 6 (100) 6 (100)

Adenomegalia

ausente 3 (60) 14 (77,8) 8 (66,7) 9 (81,8) 4 (66,7) 4 (66,7)

presente 2 (40) 4 (22,2)

0,576

4 (33,3) 2 (18,2)

0,640

2 (33,3) 2 (33,3)

0,545

Total 5 (100) 18 (100) 12 (100) 11 (100) 6 (100) 6 (100)

Transformação

leucêmica

não 1 (50) 11 (73,3) 5 (55,6) 7 (87,5) 3 (50) 5 (83,3)

sim 1 (50) 4 (26,7)

0,515

4 (44,4) 1 (12,5)

0,294

3 (50) 1 (16,7)

1,000

Total 2 (100) 15 (100) 11 (100) 8 (100) 6 (100) 6 (100)

História familiar de SMD

O fígado e baço foram considerados aumentados quando se apresentaram > 2cm do rebordo costal ao

exame físico

gânglios palpáveis e aumentados

P: teste de Fisher

número e porcentagem de pacientes estudados para cada variável.

Tabela 7 - Correlação do padrão de metilação dos genes CALCA e GSTP1

combinados, com as características demográficas e clínicas dos pacientes acometidos

pela SMD.

História familiar de SMD

metilação de CALCA e GSTP1

nenhum pelo menos 1 ambos

Variável categoria

(%)

(%) n

(%)

Sexo

Masculino - 6 (50) 6 (50)

Feminino 3 (100) 6 (50) 4 (40)

0,186

Total 3 (100) 12 (100) 10 (100)

Raça

branco 2 (100) 7 (87,5) 6 (75)

pardo/mulato - 1 (12,5) 2 (25)

0,638

Total 2 (100) 8 (100) 8 (100)

Palidez

ausente 1 (33,3) 4 (36,4) 3 (33,3)

presente 2 (66,7) 7 (63,6) 6 (66,7)

0,988

Total 3 (100) 11 (100) 9 (100)

Antecedente

de SMD

não 2 (100) 8 (100) 6 (75)

sim - - 2 (25)

0,245

Total 2 (100) 8 (100) 8 (100)

Hepatomegalia

ausente 1 (33,3) 5 (45,5) 5 (50)

presente 2 (66,7) 6 (54,5) 5 (50)

0,878

Total 3 (100) 11 (100) 10 (100)

Esplenomegalia

ausente 2 (66,7) 7 (63,6) 7 (70)

presente 1 (33,3) 4 (36,4) 3 (30)

0,953

Total 3 (100) 11 (100) 10 (100)

Adenomegalia

ausente 1 (33,3) 9 (81,8) 7 (77,8)

presente 2 (66,7) 2 (18,2) 2 (22,2)

0,244

Total 3 (100) 11 (100) 9 (100)

Transformação

leucêmica

não 1 (50) 4 (57,1) 7 (87,5)

sim 1 (50) 3 (42,9) 1 (12,5)

0,346

Total 2 (100) 7 (100) 8 (100)

O fígado e baço foram considerados aumentados quando se apresentaram > 2cm do rebordo costal ao

exame físico

gânglios palpáveis e aumentados

P: teste do Qui-quadrado

número e porcentagem de pacientes estudados para cada variável

4.6.1.2 Com os Parâmetros Laboratoriais (Hemograma)

Em um segundo momento foi feita à análise entre o padrão de metilação dos

genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B, separadamente, segundo as características

laboratoriais dos pacientes. Em relação ao padrão de metilação do gene CALCA não

foi possível observar correlações estatisticamente significativas para as variáveis

estudadas. O mesmo foi observado para o gene CDKN2B (Tabela 8). Entretanto,

quando avaliamos as características laboratoriais em relação ao padrão de metilação

do gene GSTP1 foi possível observar que este apresentou correlação estatisticamente

significativa com as taxas de hemoglobina e de hematócrito (p=0,044 e p=0,029,

respectivamente). Também foi possível observar que a metilação deste gene

apresentou uma tendência a se correlacionar com a taxa de glóbulos vermelhos

(p=0,054) e contagem de glóbulos brancos (p=0,088) (Tabela 8).

A associação do padrão de metilação dos genes CALCA e GSTP1,

combinados, demonstrou que em relação as características laboratoriais dos pacientes,

a correlação com as taxas de hemoglobina e hematrócrito se mantêm estatisticamente

significativas (p=0,012 e p=0,005, respectivamente). Nesta análise também foi

possível observar que a correlação com a taxa de glóbulos vermelhos torna-se

estatisticamente significativa (p=0,016), entretanto para os pacientes que apresentam

um ou ambos genes metilados em relação aos que não possuem nenhum dos genes

metilados foi mantida a tendência de correlação com a contagem de glóbulos brancos

(p=0,083) (Tabela 9). Para as variáveis restantes não foi possível observar correlações

estatisticamente significativas.

Tabela 8 - Descrição da idade e das características laboratoriais segundo o padrão de

metilação dos genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B.

U: não-metilado; M: metilado

Características

Labaratoriais

CALCA N

Média (dp

) P

***

GSTP1 N

Média (dp) P

CDKN2B N

Média (dp) P

Glóbulos vermelhos

(/mm

) U 3

3653333,00

(544105,88)

U 7

2424285,71

(1122970,12)

U 4

2935000,00

(1643664,60)

M 12

2934167,00

(1251947,27)

0,233

M 8

3650000,00

(919720,45)

0,054

M 5

3290000,00

(1408918,02)

0,730

total 15 total 15 total 9

Hemoglobina

(g/dl) U 5 8,64 (2,06) U 11 6,69 (2,67) U 6 8,78 (3,86)

M 18 7,73 (3,03)

0,446

M 12 9,06 (2,58)

0,044

M 6 7,96 (3,33)

0,937

total 23 total 23 total 12

Hematócrito

(%) U 5 26,80 (5,66) U 10 18,70 (9,40) U 6 25,16 (13,98)

M 16 23,63 (11,59)

0,445

M 11 29,56 (8,76)

0,029

M 6 25,55 (12,98)

0,937

total 21 total 21 total 12

Plaquetas

(/mm

) U 3

88333,33

(53910,42)

U 10

87500,00

(73251,85)

U 5

96000,00

(61688,73)

M 18

95777,78

(68761,78)

1,000

M 11

101272,73

(60867,22)

0,512

M 5

99600,00

(71814,34)

0,841

total 21 total 21 total 10

Glóbulos brancos

(/mm

) U 5

22600,00

(37821,89)

U 11

15872,73

(25716,34)

U 6

4533,33

(2491,32)

M 17

6288,24

(6460,64)

0,401

M 11

4118,18

(2111,79)

0,088

M 5

4840,00

(3296,66)

0,931

total 22 total 22 total 11

Bastonetes (%)

U 4 5,50 (9,11) U 10 3,50 (4,47) U 6 2,00 (2,28)

M 18 2,53 (3,48)

1,000

M 12 2,71 (5,22)

0,346

M 5 1,72 (1,22)

0,931

total 22 total 22 total 11

Segmentados (%)

U 5 29,00 (13,71) U 11 32,54 (20,34) U 6 33,50 (20,91)

M 18 29,72 (18,66)

0,857

M 12 26,83 (14,62)

0,347

M 6 21,66 (12,27)

0,394

total 23 total 23 total 12

Monócitos (%)

U 5 5,00 (3,80) U 11 8,09 (9,74) U 6 12,66 (13,51)

M 18 8,62 (8,56)

0,446

M 12 7,60 (6,07)

0,695

M 6 8,88 (4,11)

0,937

total 23 total 23 total 20

Blastos (%)

U 5 10,30 (8,91) U 12 11,70 (6,60) U 6 9,88 (3,21)

M 19 11,26 (5,57)

0,265

M 12 10,41 (5,96)

0,551

M 6 6,95 (3,12)

0,132

total 24 total 24 total 12

idade (anos)

U 4 2,77 (2,63) U 11 4,77 (4,08) U 6 4,50 (2,57)

M 19 5,70 (4,65)

0,324

M 12 5,58 (4,94)

0,880

M 6 5,68 (6,57)

0,699

total 23 total 23 total 12

Parâmetros retirados do exame de hemograma

dp – desvio padrão

P: teste de Mann-Whitney

Tabela 9 - Descrição das características laboratoriais segundo o padrão de metilação

combinado dos genes CALCA e GSTP1.

Parâmetros retirados do exame de hemograma

Características

Labaratoriais

padrão de metilação

de CALCA/GSTP1

Média (dp

) P

***

Glóbulos vermelhos

(/mm

) nenhum 2 3840000,00 (636396,10)

pelo menos 1 6 2095000,00 (804307,15)

ambos 7 3702857,14 (980199,20)

0,016

total 15

Hemoglobina

(g/dl) nenhum 2 10,10 (1,55)

pelo menos 1 12 6,36 (2,23)

ambos 9 9,50 (2,69)

0,012

total 23

Hematócrito

(%)

nenhum 2 31,30 (3,25)

pelo menos 1 11 17,80 (7,66)

0,005

ambos 8 31,72 (9,11)

total 21

Glóbulos Brancos

(/mm

)

nenhum 2 50250,00 (56214,99)

pelo menos 1

7216,67 (7477,22)

ambos

4100,00 (2109,16)

0,083

total 22

dp – desvio padrão

***

P: teste de Kruskal-Wallis

4.6.1.3 Com a Sobrevida Global

Em uma terceira análise foi aplicado o método de Kaplan-Meier relacionando

o perfil de metilação da região promotora de cada um dos três genes em relação à

sobrevida global, entretanto não foi possível determinar uma correlação

estatisticamente significativa (Figura 9).

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

CALCA

metilado

não metilado

p= 0,655

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

GSTP

metilado

não metilado

p= 0,708

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

CDKN2B

metilado

não metilado

p= 0,523

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

CALCA

metilado

não metilado

p= 0,655

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

CALCA

metilado

não metilado

p= 0,655

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

GSTP

metilado

não metilado

p= 0,708

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

GSTP

metilado

não metilado

p= 0,708

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

CDKN2B

metilado

não metilado

p= 0,523

tempo de sobrevida (meses)

60483624120

SobrevidaGlobal (%)

1.0

0.0

CDKN2B

metilado

não metilado

p= 0,523

Figura 9 – Curvas de sobrevida global em relação

ao perfil de metilação da região promotora dos

genes CALCA, GSTP1 e CDKN2B.

5 DISCUSSÃO

Neste estudo foi analisado o padrão de metilação da região promotora de 14

genes (CDKN2B, CDKN2A, CALCA, CDH1, HIC1, GSTP1, p73, p14

ARF

, MGMT,

APC, RARβ, CDH13, DAPK e TIMP-3) em 12 amostras de MO a fresco de pacientes

acometidos por SMD, subtipos RAEB e RAEB-t, cadastrados no arquivo do GCB-

SMD-PED. Os genes mais freqüentemente metilados nestas amostras (CALCA,

GSTP1 e CDKN2B) tiveram seu padrão de metilação também avaliado em um outro

grupo de 13 amostras de esfregaço de MO de pacientes acometidos pela SMD. A

partir dos resultados tentamos correlacionar o padrão de metilação dos genes mais

freqüentemente metilados com as características demográficas, clínicas e laboratoriais

desses pacientes.

Após uma busca por informações na literatura, ao que parece, nosso estudo foi

o primeiro a avaliar o padrão de metilação da região promotora de um grupo de genes

em amostras de MO de pacientes pediátricos acometidos pela SMD. Três dos genes

incluídos em nossa análise (CALCA, CDKN2A e CDKN2B), também já haviam sido

estudados, por outros grupos, em amostras de MO de pacientes acometidos pela

SMD, entretanto, estes grupos avaliaram as freqüências de metilação da região

promotora destes genes em amostras de pacientes adultos. Para os outros 11 genes

não encontramos relatos na literatura de estudos que avaliam os perfis de metilação

de suas regiões promotoras em amostras de MO de pacientes acometidos pela SMD,

independente da faixa etária.

A SMD em crianças é uma doença rara e apresenta baixa incidência que varia

de 0,8 a 1,8 casos/milhão/crianças < 14 anos, segundo os estudos populacionais

desenvolvidos até o momento (HASLE et al. 1995; PASSMORE et al. 2003). Devido

à raridade da SMD em crianças, é importante ressaltar que a casuística de nosso

estudo (25 amostras de SMD, subtipo RAEB ou RAEB-t) é bastante razoável quando

comparada à casuística de trabalhos descritos na literatura para os estudos que

envolvem metilação em SMD de adultos, os quais variam de 15 a 50 pacientes

distribuídos entre todos subtipos da SMD (IHALAINEM et al. 1993; DHODAPKAR

et al. 1995; UCHIDA et al. 1997; QUESNEL et al. 1998, VOSO et al. 2004).

Inicialmente, para a realização de nosso estudo, foram obtidas 12 amostras de

DNA de MO a fresco de pacientes pediátricos com SMD colhidas no período de

fevereiro de 2000 a outubro de 2003. Devido à raridade da SMD na infância e com

intuito de aumentar a nossa casuística, optamos por incluir em nosso estudo 13

amostras de esfregaço de MO, provenientes do arquivo de lâminas do GCB-SMD-

PED colhidas no período de agosto de 1989 a abril 2003.

A decisão de utilizar amostras de esfregaço de MO neste estudo assumiu o

pressuposto de que seria possível a utilização de pequenas quantidades de DNA para

o tratamento de Bissulfito de Sódio e subseqüente reação de MSP. Os primeiros

autores que descreveram essa técnica recomendaram a utilização de pelo menos 1µg

de DNA para o tratamento com Bissulfito de Sódio (HERMAN et al. 1996). Nós

realizamos experimentos preliminares que demonstraram que seria possível obter

resultados satisfatórios com pequenas quantidades de DNA (100ng) e que a

concentração de DNA utilizada no tratamento com Bissulfito de Sódio e posterior

reação de MSP não interfere nos resultados observados. Desta forma, pudemos

utilizar amostras de esfregaço de MO, aumentando o número de amostras analisadas.

Outro ponto importante avaliado foi confirmar se o padrão de metilação das

amostras de esfregaço de MO poderia ser comparado ao das amostras de MO a

fresco, ou seja, se o fato desse material ter sido manipulado para a fixação em uma

lâmina e em alguns casos corado, não resultaria em alterações no seu padrão de

metilação. Para esclarecer este fato o padrão de metilação da região promotora dos

genes CALCA e GSTP1 foi analisado em uma amostra de MO a fresco e em uma

amostra de esfregaço de MO do mesmo paciente. O padrão de metilação observado

foi idêntico em ambos os genes, indicando que a manipulação da MO durante o

processo de esfregaço parece não interferir no padrão de metilação do DNA. Esses

resultados também permitiram a utilização de amostras de esfregaço de MO de

crianças acometidas por retinoblastoma intraocular, sem invasão de células tumorais

na MO, ou seja, MO considerada sem neoplasia como grupo controle de nosso

experimento. Também foram utilizadas como controle sem neoplasia, amostras de

MO colhidas do externo de crianças submetidas a cirurgia cardíaca no Instituto Dante

Pazzanese de Cardiologia (IDPC/SP). Entretanto, esta abordagem logo se mostrou

pouco viável, pois, as crianças cardiopatas, geralmente, são submetidas a este tipo de

cirurgia antes do primeiro ano de vida e, o fato destas crianças serem muito pequenas,

impedia que quantidades suficientes de MO fossem obtidas.

Neste estudo, optamos por utilizar as amostras de pacientes classificados nos

subtipos RAEB e RAEB-t da SMD, de acordo com a classificação FAB. Não foram

incluídas as amostras de LMMJ, pois, apesar de ser considerado um subtipo de SMD,

trata-se de uma doença mieloproliferativa. As amostras de RA não foram incluídas,

pois, no momento da estruturação deste estudo, apenas 3 amostras deste subtipo

provenientes de esfregaço de MO estavam disponíveis.

Em relação à população do nosso estudo podemos observar que a amostra

estudada tem características semelhantes a do grupo brasileiro, em que predominam

os subtipos RAEB e RAEB-t. A média de idade (5,4 anos) dos pacientes do nosso

estudo apresentou-se semelhante a média de idade (5,2 anos) encontrada para os

pacientes com SMD (93 casos) cadastrados no grupo brasileiro (PAULA 2004),

enquanto que para outros estudos essa média de idade variou entre 3,1 anos (Reino

Unido, PASSMORE et al. 2003) e 6,9 anos (Polônia, WÖJCILK e USSOWICZ

2003). Os achados mais freqüentes ao exame físico nos pacientes deste estudo foram

palidez (65,2%) e hepatomegalia (54,2%), sendo semelhante aos dados encontrados

pelo grupo brasileiro, com 61,3% e 54,8%, respectivamente. Não houve em nossa

população uma diferença entre a proporção de pacientes do sexo masculino e

feminino (0,92:1), enquanto que os dados do grupo brasileiro revelam uma ligeira

predominância do sexo masculino (razão 2,4:1). Nos estudos de outros grupos

internacionais também ocorre uma pequena predominância do sexo masculino sendo

a maior razão de 4:1 na Grécia (POLYCHRONOPOULOU 2003) e a menor de 1,3:1

no Reino Unido (PASSMORE et al. 2003). Dos pacientes estudados, 54,2% foram a

óbito e 33,3% apresentaram transformação para leucemia, o que também é visto para

os pacientes do grupo brasileiro com 54,8% e 36,5%, respectivamente. Nos estudos

desenvolvidos pelos grupos internacionais a freqüência de transformação leucêmica

se apresenta bastante variável, sendo o grupo grego o qual apresentou maior

porcentagem de transformação com 51% dos pacientes e o grupo turco (The Turkish

National Pediatric MDS Study Group 2003) o que apresentou menor porcentagem

com 25% dos pacientes.

Os genes que apresentaram sua região promotora mais freqüentemente

metilada nas 12 amostras de MO a fresco foram: CALCA (83,3%), CDH1 (75%),

GSTP1 (58,3%) e CDKN2B (50%). Em um segundo momento do estudo foram

iniciadas as análises para as amostra de MO sem neoplasia, quando então foi possível

observar que o gene CDH1 apresentava-se freqüentemente (66,6%) metilado nestas

amostras. Esta porcentagem elevada nas amostras de MO sem neoplasia nos levou a

buscar informações na literatura. GUTIERREZ et al. (2003) avaliaram a freqüência

de metilação dos genes CDH1, DAPK, MGMT, p73, CDKN2A, CDKN2B e p14

ARF

129 amostras (MO ou SP) de pacientes pediátricos acometidos por LLA. Com o

intuito de analisar se haveria alguma interferência da metilação de algum gene em

linfócitos normais, os autores também verificaram o padrão de metilação desses genes

em 17 amostras normais de sangue (12 adultos e 5 crianças). Após a reação de MSP

apenas para o gene CDH1 foi possível observar a presença do fragmento metilado em

algumas dessas amostras normais. Recentemente, LOMBAERTS et al. (2004)

relataram a presença de metilação no gene CDH1 em amostras de tumores de mama

que expressavam a proteína e-caderina. Os autores observaram que para esses casos o

tecido tumoral apresentava um infiltrado leucocitário. A análise da metilação do

promotor do gene CDH1, através de MSP, em leucócitos normais purificados, revelou

a presença de metilação na região promotora deste gene nestas células. Podemos

observar em nossos dados uma alta freqüência de metilação do gene CDH1 tanto nas

amostras de SMD (71,4%,) quanto nas MO sem neoplasia (controle) (66,6%),

entretanto esse achado pode ser devido à presença desses leucócitos na MO e não das

células displásicas e/ou blásticas. Por isso decidimos não avaliar o perfil de metilação

do gene CDH1 em nossas amostras de MO total.

Assim, prosseguimos com a análise nas 13 amostras de esfregaço de MO dos

três genes mais freqüentemente metilados (CALCA, GSTP1 e CDKN2B) nas 12

amostras de MO a fresco. A freqüência de metilação para a região promotora do gene

CALCA foi de 69,2% e para GSTP1 de 46,2%. Não foi possível avaliar a freqüência

de metilação para o gene CDKN2B nessas amostras, pois, mesmo depois de várias

alterações efetuadas nas condições da reação, vários fragmentos inespecíficos eram

sempre formados durante a MSP, o que impossibilitou a análise deste gene.

Nosso estudo parece ser o primeiro a avaliar a freqüência de metilação da

região promotora do gene CALCA em crianças acometidas por SMD. Nossos dados

demonstraram que foi possível detectar a presença de metilação do gene CALCA em

76% das amostras, resultados semelhantes aos descritos na literatura para SMD de

adultos.

Aparentemente, até o momento, apenas dois grupos avaliaram o padrão de

metilação da região promotora do gene CALCA em amostras de MO e SP de

pacientes acometidos pela SMD. IHALAINEN et al. (1993) avaliaram a freqüência

de metilação do gene CALCA em 26 amostras de pacientes adultos acometidos pela

SMD (3 RA, 4 RARS, 15 RAEB, 3 RAEB-t e 1 t-MDS/AML). Os autores

observaram a metilação do gene CALCA em 92% das amostras, ou seja, este gene

estava metilado na maioria das amostras, independente do subtipo da doença. Os

autores observaram também que a metilação deste gene não está relacionada a

porcentagem de blastos encontrados na MO e ainda que os dois pacientes que

apresentaram um padrão normal de metilação para este gene tiveram doença estável

durante 3 e 6 anos. A partir deste estudo não foi possível estabelecer o papel da

metilação do gene CALCA no processo da SMD, entretanto como este gene foi

encontrado metilado em amostras de MO de pacientes com RA, os autores sugerem

que esta alteração deva ocorrer em um estágio relativamente precoce da doença não

estando envolvida com o processo de transformação leucêmica.

Um segundo grupo avaliou o padrão de metilação do gene da CALCA em 19

amostras de MO de pacientes adultos acometidos pela SMD (8 RA, 2 RARS, 8

RAEB, 1 RAEB-t) (DHODAPKAR et al. 1995). Os autores observaram a metilação

deste gene em 68% das amostras. Esses autores, também não encontraram uma

correlação entre a metilação do gene e os subtipos da doença, bem como com a

porcentagem de blastos das amostras de MO. Entretanto, das 8 amostras de RA, 6

apresentaram metilação do gene CALCA. A partir destes dados estes autores também

sugerem que a metilação do gene CALCA deva estar envolvida com estágios mais

precoces da doença. Neste trabalho, os autores demonstram uma diferença

estatisticamente significativa em relação à sobrevida global e a metilação do gene

CALCA, sendo que os pacientes que apresentaram a metilação para este gene tem

sobrevida de 30% aos 17 meses (log rank p=0,04), enquanto que dos não-metilados

todos os pacientes estavam vivos neste período.

Em nosso trabalho foi possível avaliar a freqüência de metilação do gene

CDKN2B nas 12 amostras de MO a fresco. Nossos dados são semelhantes aos

achados da literatura para a SMD de adultos, sendo que foi possível observar a

presença de metilação em 50% das amostras de MO para SMD pediátrica.

UCHIDA et al. (1997) avaliaram a freqüência de metilação do gene CDKN2B

em 30 pacientes adultos com SMD. Desses, 12 apresentavam RA ou RARS, 18

RAEB ou RAEB-t, sendo que 10 tinham t-MDS/AML. Esse gene demonstrou uma

freqüência de metilação de 50% nas amostras de SMD de adultos. Uma análise mais

detalhada revelou que apenas 8% dos pacientes com RA ou RARS apresentavam a

metilação deste gene, enquanto que, este gene estava metilado em 78% dos pacientes

com RAEB ou RAEB-t. Os autores analisaram ainda o padrão de metilação de 4

pacientes em dois momentos, ao diagnóstico e na transformação leucêmica. E

puderam observar que no momento da transformação leucêmica havia um aumento na

freqüência de metilação deste gene, associando assim a metilação do gene CDKN2B

ao processo de transformação leucêmica. Os autores também avaliaram a freqüência

de metilação do gene CDKN2A e observaram que nenhuma das amostras apresentava

metilação para esse gene. Nossos resultados também demonstram que não foi

possível observar a metilação deste gene nas amostras estudadas, ou seja,

aparentemente, o gene CDKN2A encontra-se não-metilado tanto nos casos de SMD

de adultos como nas SMDs da infância.

QUESNEL et al. (1998), por meio da técnica de MSP, também avaliaram a

freqüência de metilação do gene CDKN2B em 44 pacientes adultos com SMD (10

RA, 2 RARS, 18 RAEB, 5 RAEB-t e 9 t-MDS/AML) e observaram uma freqüência

de metilação de 38% nas amostras. Esses autores relataram que só foi possível

detectar a metilação nas amostras que apresentavam uma porcentagem de blastos

acima dos 10% e sugeriram que esta alteração parece estar envolvida com estágios

mais avançados da doença. Os autores também avaliaram a freqüência de metilação

de amostras seqüenciais de DNA de 4 pacientes a partir do diagnóstico até a

transformação leucêmica e observaram que a metilação do gene CDKN2B foi

adquirida de acordo com a evolução da doença. Segundo os autores, a metilação do

gene CDKN2B está correlacionada com uma menor taxa de sobrevida global (p=

0,049).

Não está bem estabelecido na literatura que a SMD se inicia na fase de RA e

com um aumento progressivo de blastos evolua para os estágios de RAEB e RAEB-t.

Desta maneira, acreditamos que, mesmo encontrando a metilação do gene CALCA em

amostras de RA não é possivel correlacionar este achado ao início do

desenvolvimento da SMD como fizeram os grupos que avaliaram a metilação deste

gene em pacientes adultos. Em nosso estudo não foi possível avaliar o papel da

metilação dos genes CALCA e CDKN2B na transformação leucêmica, pois não

dispúnhamos de amostras de casos de t-MDS/AML.

A glutationa S-transferase (GST) é uma importante família de enzimas

envolvida no metabolismo de inúmeros agentes químicos tóxicos, como os

organofosfatados, os agentes alquilantes e os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos.

A baixa atividade desta enzima pode predispor alguns indivíduos a falência da

medula óssea, resultando em um provável aumento da suscetibilidade a toxinas

endógenas ou provenientes do meio externo (SUTTON et al. 2004). Também se

acredita que essas enzimas tenham um papel importante na proteção do DNA contra

danos oxidativos (JERÓNIMO et al. 2002).

O gene GSTP1 codifica uma das enzimas que faz parte da família GST e ao

que parece, até o momento, nenhum trabalho na literatura pesquisada avaliou o perfil

de metilação deste gene em amostras de MO de pacientes acometidos pela SMD, seja

em adultos ou em crianças. O nosso estudo demonstrou a presença de metilação na

região promotora do gene GSTP1 em 52% das 25 amostras de MO de crianças com

SMD. O padrão de metilação deste gene tem sido muito estudado em outras

neoplasias, como na LMA, tanto de adultos como de crianças. Os trabalhos que

avaliam a metilação deste gene, em LMA, demonstraram que o GSTP1 não apresenta

alta freqüência de metilação (MELKI et al. 1999; ESTELLER et al. 2001; HARADA

et al. 2002). Os estudos de ESTELLER et al. (1998) demonstraram que a metilação

deste gene pode ser observada em tumores de mama, fígado e próstata.

Recentemente, SUTTON et al. (2004) desenvolveram um estudo com a finalidade de

determinar a freqüência de deleções homozigotas dos genes GSTT1 e GSTM1 que

codificam enzimas da família GST em amostras de MO de pacientes acometidos por

anemia aplástica (AA) ou SMD. Os autores relataram que o genótipo nulo para ambos

genes era significativamente mais encontrado nos pacientes caucasianos acometidos

pela SMD. A partir destes resultados eles concluíram que o genótipo nulo para

GSTT1 e/ou GSTM1 estava associado a um maior risco de desenvolver SMD. Estudos

anteriores que avaliaram a freqüência do genótipo nulo para os genes GSTT1 ou

GSTM1 também associaram estas alterações a pacientes que apresentavam desordens

na MO, como o aumento da freqüência do genótipo nulo do gene GSTT1 em

pacientes brancos norte-americanos e japoneses acometidos pela SMD (CHEN et al.

1996; SASAI et al. 1999). O aumento da freqüência do genótipo nulo do gene

GSTM1 também foi descrito em pacientes gregos acometidos pela SMD (TSABOURI

et al. 2000). Como a metilação da região promotora dos genes está associada ao

silenciamento gênico na maioria das vezes, a metilação do gene GSTP1 pode resultar

em uma diminuição na expressão deste gene. Sendo assim, os nossos resultados

parecem sugerir que o mecanismo de metilação também deve estar associado à

inativação do gene GSTP1 contribuindo para o aprarecimento do genótipo nulo e,

conseqüentemente, predispor o indivíduo ao desenvolvimento da SMD.

Ainda, em relação a esses três genes encontrados como mais freqüentemente

metilados (CALCA, CDKN2B e GSTP1) em nosso trabalho, devemos considerar as

diferentes abordagens metodológicas empregadas para a análise de metilação.

IHALAINEN et al. (1993) e DHODAPKAR et al. (1995) utilizaram uma técnica

baseada na digestão com enzimas de restrição e posterior hibridização com uma

sonda (Southern blot) para a observação dos fragmentos metilados ou não metilados.

Dessa maneira dependendo da sonda a ser utilizada a região genômica analisada do

gene da CALCA pode ser diferente, o que pode ter levado ao achado de freqüências de

metilação diferente para este gene nestes dois trabalhos. A comparação com os

resultados do nosso trabalho deve ser feita com cuidado, uma vez que utilizamos a

técnica de MSP e a região genômica analisada também pode ter sido diferente das

descritas por esses autores. UCHIDA et al. (1997) avaliaram a freqüência de

metilação do gene CDKN2B, encontrando uma frequência de metilação de 50%,

entretanto os autores utilizaram a técnica de digestão com enzimas de restrição

seguida por Southern blot. QUESNEL et al. (1998), por meio da técnica de MSP,

analisaram a metilção do gene CDKN2B em SMD de adultos e utilizando os mesmos

iniciadores do nosso estudo encontraram uma freqüência de metilação de 38%,

resultado que se aproxima do nosso (50%). Neste caso devemos considerar que os

autore não estratificaram os subgrupos da doença em suas análises o que pode ter

levado a uma frequência de metilação menor, uma vez que a metilação do gene

CDKN2B parece estar ligada a estágios mais tardios da SMD. Recentemente,

HASEGAWA et al. (2005) analisaram a freqüência de metilação dos genes CDKN2A

e CDKN2B em SMD da infância, por meio de MSP e utilizando os mesmos

iniciadores do nosso estudo. Os autores descreveram o gene CDKN2A como não

metilado em suas amostras e o gene CDKN2B apresentando-se metilado em 78% de

suas amostras, resultados semelhante aos nossos com 0% e 50%, respectivamente.

Dessa forma, devido as diferentes metodologias utilizadas para a análise de metilação

os resultados devem ser observados com atenção, ainda mais se comparados ao de

outros trabalhos descritos na literatura. Entretanto nossos resultados também

demonstram-se semelhantes a outros que utilizaram a técnica de MSP para a análise

de metilação, tanto em crianças como em adultos, sugerindo desta forma que o padrão

de metilação na SMD da infância parece ser semelhante ao padrão de metilação da

SMD de adultos e ainda que o gene GSTP1 parece ser metilado na SMD de adultos.

Embora a nossa casuística apresente um numero satisfatório de pacientes para

uma doença rara, ao que parece ela ainda não é grande o suficiente para nos permitir

conclusões. Neste estudo, três genes (CALCA, GSTP1 e CDKN2B) demonstraram-se

mais freqüentemente metilados nas amostras de MO dos nossos pacientes. O padrão

de metilação desses genes foi correlacionado com as características demográficas,

clínicas e laboratoriais (hemograma) dos pacientes e alguns resultados sugerem

tendências para algumas variáveis estudadas.

Poucos escores para avaliação de prognóstico são descritos na literatura para

as SMDs. O primeiro deles descrito em 1988 por WORSLEY et al. (Bournemouth)

utilizou parâmetros como a taxa de hemoglobina, número de neutrófilos, número de

plaquetas e porcentagem de blastos para estratificar os pacientes em grupos de risco.

A medida que outros trabalhos com essa mesma finalidade foram sendo

desenvolvidos houve a inclusão ou exclusão de alguns desses parâmetros para essa

estratificação. AUL et al. (1992) utilizaram a porcentagem de blastos, número de

plaquetas, taxas de hemoglobina (limite de corte - 9 g/dl) e nível de DHL

(desidrogenase lática) em seu escore. Com o passar dos anos e o conhecimento das

alterações citogenéticas presentes nas SMD, o cariótipo passou a ser incluído em

estudos de escore de prognóstico, mostrando ser importante tanto para predizer a

evolução da doença como a sobrevida global dos pacientes (MOREL et al. 1993;

GREENBERG et al. 1997). Nossos dados demonstraram que a metilação do gene

GSTP1 estava relacionado com maiores taxas das variáveis estudadas na série

vermelha do sangue periférico. Dados do GCB-SMD-PED (PAULA 2004) mostraram

que é característica dos pacientes acometidos pela SMD apresentar baixas taxas de

hemoglobina e de hematrócrito. Outros grupos internacionais também demonstram

essas baixas taxas de hemoglobina e hematócrito em suas populações (LUNA-

FINEMAN et al. 1999; KARDOS et al. 2003; POLYCHRONOPOULOU 2003). A

metilação do gene GSTP1 individualmente ou associada a metilação do gene da

CALCA, mesmo considerando essas baixas taxas de hemoglobina e hematócrito,

demonstra que ainda assim foi possível estratificar os pacientes nestes grupos.

Neste momento do estudo é difícil avaliar o impacto da metilação destes genes

em relação às correlações observadas. Entretanto, com o aumento da casuística ou

mesmo com os avanços no conhecimento da biologia das SMD, alterações como a

metilação poderão vir a ser utilizadas em escores prognósticos ou até mesmo permitir

que se estabeleçam fatores prognósticos independentes.

Nossos resultados demonstraram que levando em conta os genes CALCA e

GSTP1 nas 25 amostras de MO analisadas, foi possível observar que pelo menos um

desses genes estava metilado em 88% das amostras e que ambos estavam metilados

em 40% das amostras. Apenas 12% das amostras não apresentaram metilação para

nenhum desses genes. Nas amostras de MO sem neoplasia podemos observar que em

apenas 16,6% das amostras pelo menos um desses genes estava metilado e que ambos

estavam metilados em apenas 8,3%, enquanto que a metilação não foi detectada para

nenhum dos genes em 83,3% dessas amostras. Isso sugere que a análise do padrão de

metilação desses genes possa vir a ser utilizada como uma ferramenta de rotina para

complementar o diagnóstico da SMD, além da citologia, histologia e citogenética.

Atualmente, não existe um tratamento padrão para a SMD da infância e

apenas o transplante de medula óssea (TMO) alogênico pode oferecer a cura potencial

para a doença (JAKAB et al. 1999). Estudos preliminares têm avaliado a utilização de

drogas que provocam a desmetilação do DNA, como a azacitidina (5-azacytidina) e a

decitabina (5-Aza-2’-deoxicitidina), no tratamento da SMD de adultos. Em um estudo

envolvendo 29 pacientes adultos com SMD (RAEB e RAEB-t), a administração de

decitabina promoveu a remissão completa em 29% dos pacientes e parcial em 18%,

com média de duração da resposta de 8 meses (SILVERMAN 2001). Em outro

estudo, fase I/II, 43 pacientes adultos receberam infusões continuas de azacitidina

durante 7 dias, sendo que 49% responderam ao tratamento, dentre os quais 37% com

resposta das três linhagens hematopoiéticas, tanto completa como parcial e com

duração da resposta em média de 15 meses (LEONE et al. 2002). DASKALAKIS et

al. (2002) demonstraram, em 23 pacientes adultos com SMD, uma freqüência de

hipermetilação de 65% para o gene CDKN2B, dos quais 12 foram submetidos a

tratamento com decitabina, sendo que 9 apresentaram resposta hematológica ao

tratamento e ainda 3 desses entraram em remissão completa. Nossos resultados

demonstraram que o padrão de metilação encontrado nos pacientes com SMD

pediátrica parece ser semelhante ao padrão de metilação dos pacientes adultos com

SMD, apesar dos poucos trabalhos encontrados na literatura que avaliaram o padrão

de metilação de genes na SMD. Isto sugere que talvez a utilização de drogas que

provocam a desmetilação do DNA possa vir a auxiliar no tratamento das SMD da

infância, após a confirmação de seus benefícios no tratamento da SMD em adultos. A

utilização de drogas desmetilantes aplicadas em estudos de fase III para a SMD de

adultos já está em prática em diversos protocolos investigacionais.

Embora os resultados obtidos neste estudo indiquem a correlação entre a

metilação da região promotora de genes com parâmetros laboratoriais dos pacientes,

um estudo mais amplo, com um número maior de amostra e com a inclusão de

amostras de outros subtipos de SMD (RA e LMMJ) é necessário para demonstrar, de

forma irrefutável, esses achados. Isso também seria importante para o entendimento

do real papel da metilação de alguns genes na evolução da SMD.

6 CONCLUSÕES

• Foi possível utilizar pequenas quantidades de DNA (100 a 400ng) para fazer o

tratamento de Bissulfito de Sódio e reação de MSP.

• Foi possível extrair quantidades suficientes de DNA a partir de lâminas de

esfregaço de MO, tratá-los com Bissulfito de Sódio e realizar as reações de

MSP.

• Os resultados obtidos com as amostras de esfregaço de MO são semelhantes

aos obtidos com as amostras de MO a fresco, sugerindo que o padrão de

metilação seja mantido independentemente do manejo da amostra para a

confecção de esfregaço em lâmina.

• Os resultados sugerem que o padrão de metilação na SMD da infância parece

ser semelhante a SMD de adultos, com maior freqüência de metilação dos

genes CALCA (76%), o GSTP1 (52%) e o CDKN2B (50%). Nos outros onze

genes estudados, as freqüências de metilação foram menores que 25%.

• A metilação da região promotora do gene GSTP1 se correlacionou, com

significância estatística, com o aumento nas taxas de parâmetros da série

vermelha do sangue periférico nos pacientes acometidos por SMD.

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