( PDF ) Estudo comparativo de carragenanas comerciais Kappa, Iota e Lambda no processo inflamatório em ratos: edema intraplantar e pleurisia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA

ESTUDO COMPARATIVO DE CARRAGENANAS

COMERCIAIS KAPPA, IOTA E LAMBDA NO PROCESSO

INFLAMATÓRIO EM RATOS: EDEMA INTRAPLANTAR E

PLEURISIA

NATAL

2005

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FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA

ESTUDO COMPARATIVO DE CARRAGENANAS

COMERCIAIS KAPPA, IOTA E LAMBDA NO PROCESSO

INFLAMATÓRIO EM RATOS: EDEMA INTRAPLANTAR E

PLEURISIA

Dissertação apresentada ao Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte como requisito parcial para obtenção do

título de Mestre em Bioquímica.

Orientadora: Edda Lisboa Leite

NATAL

2005

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FERNANDO ROBERTO FERREIRA SILVA

ESTUDO COMPARATIVO DE CARRAGENANAS COMERCIAIS KAPPA, IOTA E

LAMBDA NO PROCESSO INFLAMATÓRIO EM RATOS: EDEMA

INTRAPLANT AR E PLEURISIA

Dissertação apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito parcial para

obtenção do título de Mestre em

Bioquímica.

Aprovado em: 19/07/2005

BANCA EXAMINADORA

Dedico esta obra

À Professora Edda Lisboa Leite, por ter sido sempre muito mais que orientadora. Fica aqui

minha gratidão pela orientação, amizade e, com certeza, nunca esquecerei esses quase 5

anos de convivência.

Aos meus pais, Maria e Dias, pelo incentivo incondicional e compreensão para que este

trabalho pudesse se realizar.

AGRADECIMENTOS

Aos professores: Hugo, Luís, Fernanda, Maurício, Selma, Jacira, Suely e Elizeu. Vocês

foram muito importantes, cada um do seu jeito, para minha formação como aluno,

biólogo e como homem. Muito obrigado!

À Professora Dilma pelo carinho, preocupação e por sempre ter se mostrado a disposição

para ajudar. Obrigado pela força!

À Professora Eliza Xavier pelo carinho, apoio, amizade e por ter sempre me socorrido

quando precisei. Grato!

À Creuza por ter sido a primeira pessoa a me trazer para um laboratório de bioquímica,

fazendo com que despertasse o interesse pela biologia. Obrigado também pelo incentivo

e preocupação (quase de mãe) comigo.

As amigas Karla e Valquíria pela amizade, pelas conversas na bancada e pela grande ajuda

nos meus primeiros passos no laboratório.

À Celina. Quando você entrou no laboratório, imaginei que não iríamos ter um bom

relacionamento. Entretanto, você mostrou ser, acima de tudo, uma grande amiga.

Obrigado pela grande participação e colaboração para que eu pudesse chegar até aqui

hoje. Gosto muito de você! Cheiros!

À Cybelle pela grande ajuda na realização desse trabalho e pela amizade. Muito obrigado!

Aos colegas do laboratório (antigos e novos): Glória, Luciana, Lydice, Antônio Carlos, Vivi,

Gabi, Carol, Tarciana, Carol, Micheline, Yuly, Leonardo, Duda, Leandro. Obrigado pela

ajuda e pelo ótimo convívio.

Aos colegas da turma do mestrado: Ivan, Raquel, Ciro, Rose, Olívia, Patrícia, Beth.

Obrigado pela amizade, brincadeiras e pela troca de experiências. Ficarei com saudades

de vocês!

A todos colegas do departamento, muito obrigado pela colaboração.

Aos amigos da minha turma da graduação, em especial: Lula, Pedro, Dulcian, Lorena,

Recy, Kuka, Felippe, Ramona, Alexsandra, Fabíola, Bia, Márcia, Danile e Thaís.

Obrigado pela amizade e por todos os momentos de descontração. Gosto muito de vocês

todos e nunca os esquecerei.

À Aretha. Se cheguei até aqui hoje, muito devo a você. Essa conquista também é sua, muito

obrigado!

Aos amigos e colegas de Biologia, em especial Denis, Matheus e Lobinho. Muito obrigado!

À minha amiga Thasia pela amizade e torcida para realização desse trabalho.

Aos meus amigos da UERN: Tanísia, Dinaide, Ovídio, Jesus, Amanda, Denise, Lara, João,

Rodrigo, etc. Por terem agüentado minha ausência e terem me ajudado bastante para

que não fosse reprovado. Muito grato a todos vocês!

Aos meus eternos amigos da ETFRN: Véio, Chaguinha, Djanilton, Soft, Gustavinho e Hugo.

Vocês são grandes amigos e contem sempre comigo, do mesmo modo que sei que posso

sempre contar com vocês. Grande abraço e obrigado pela amizade sincera e verdadeira!

À Fernanda. Obrigado por ter agüentado minhas ausências, meu estresse e por estar sempre

disposta a me ajudar no que fosse preciso. Muitíssimo obrigado! Amo você!

RESUMO

As carragenanas comerciais Iota, Kappa e Lambda são raramente puras e,

normalmente, apresentam vários outros tipos de polímeros. A quantidade exata de

impurezas depende do método de extração e da alga utilizada. Logo, diferentes

métodos têm sido utilizados para a determinação do conteúdo das carragenanas,

tento em vista que elas são extensivamente usadas nas indústrias alimentícia, de

cosméticos e farmacêutica. A eletroforese desses compostos provou que eles são

constituídos de polissacarídeos sulfatados. Estes compostos foram caracterizados

por métodos colorimétricos e foi observado que a carragenana Lambda possui o

maior teor de sulfato (33,38%). Esses polímeros foram analisados por

espectroscopias de IV e

C RNM. Estes polissacarídeos consistem principalmente

de unidades alternadas de galactose e anidrogalactose sulfatadas. Foi possível

avaliar a ação inflamatória desses diferentes compostos através de um modelo

clássico de inflamação, que é o de inflamação aguda, na pata de ratos, induzida por

carragenanas. O edema plantar foi induzido pela injeção das carragenanas (N, L e O)

na pata direita de ratos machos da raça Wistar (175-200g). A inflamação aguda

induzida por carragenanas foi expressa pela relação tempo-edema e medida pelo

volume do edema plantar. Para isto, foi utilizado um paquímetro, que confere mais

precisão a mensuração da inflamação (inchaço na pata do rato). Os resultados

mostraram que a carragenana Kappa (1%) induz um edema de 3,7mm e o aumento

de volume do edema é tempo e dose-dependente; a Iota (0,2%) provoca um edema

de 4mm; e a Lambda (1%) um edema de 3,6mm. O outro modelo usado neste

estudo comparativo é baseado na inflamação da pleura (pleurisia). A injeção de

carragenanas na cavidade pleural dos ratos induz uma resposta inflamatória aguda

caracterizada pelo acumulo de líquido na cavidade pleural, um grande número de

neutrófilos e aumento na produção de NO. A carragenana Iota provocou a

inflamação intensa, o que pode ser comprovado pela verificação do volume do

exudato (1,52 ml), o teor de nitrato/nitrito (63,478 nmol/rato) e a contagem de

leucócitos polimorfonucleares - PMN (4902 x 10

células). A avaliação quantitativa

da inflamação em ratos é um parâmetro importante para a avaliação da eficácia de

drogas antiinflamatórias.

Palavras-chave: Carragenana. Edema plantar. Inflamação.

ABSTRACT

The Iota, Kappa and Lambda commercial carrageenans are rarely pure and normally

contain varying amounts of the other types of carrageenans. The exact amount of

impurity depends on the seaweed source and extraction procedure. Then, different

analysis methods have been applied for determination of the main constituents of

carrageenans because these three carrageenans are extensively used in food,

cosmetic and pharmaceutical industry. The electrophoresis of these compounds

proved that the carrageenans are constituted by sulfated polysaccharides. These

compounds were characterized by colorimetric methods and was observed that the

Lambda carrageenan shown the greater value (33.38%) of sulfate. These polymers

were examined by means of

C NMR spectroscopy and infrared spectra. The

polysaccharides consisted mainly of units alternating of sulfated galactoses and

anhydrogalactoses. The aim of the study was also to test the inflammatory action of

these different polysaccharides. A suitable model of inflammation is acute sterile

inflammation of the rat hind limb induced by carrageenan. Paw edema was induced

by injecting carrageenans (N, L and O) in saline into the hind paw of a male Wistar rats

(175–200 g). The pathway to acute inflammation by carrageenan (kappa, iota and

lambda) were expressed as time-edema dependence and measured by paw edema

volume. For this purpose, was used an apparatus (pakymeter), which makes it

possible to measure the inflammation (swelling of the rat foot) with sufficient

accuracy. The results showed that N-carrageenan (1%) have an edema of 3.7 mm

and the paw edema increase was time and dose dependent; the L-carrageenan

(0.2%) caused an edema of 4 mm and the O-carrageenan (1%) caused an edema of

3.6 mm. Other model was used in this study based in the inflammation of pleura for

comparatives studies. Injection of carrageenans into the pleural cavity of rat induced

an acute inflammatory response characterized by fluid accumulation in the pleural

cavity, a large number of neutrophils and raised NO production. The levels of NO

were measured by Griess reactive. The L-carrageenan caused the greater

inflammation, because it has high concentration of nitrite/nitrate (63.478 nmoles/rat),

exudato volume (1.52 ml) and PMNs (4902 x 10

cells). Quantitative evaluation of

inflammations of rats is a useful and important parameter for the evaluation of the

efficacy of anti-inflammatory drugs.

Key-words: Carrageenan. Paw edema. Inflammation.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura das unidades dissacarídicas repetitivas dos

três principais tipos de carragenanas: L, N e O. 28

FIGURA 2 Síntese do óxido nítrico a partir da L-arginina. 37

FIGURA 3 Perfil eletroforético das carragenanas comerciais L, N, O

(50 Pg de cada) em gel de agarose, tampão PDA.

OR - Origem. 52

FIGURA 4 Espectro Infravermelho (400 a 4000 cm

-1

) das carragenanas

Comerciais N, L e O. 56

FIGURA 5 Espectro de RMN

C da carragenana N. 62

FIGURA 6 Espectro de RMN

C da carragenana O. 62

FIGURA 7 Espectro de RMN

C da carragenana L. 63

FIGURA 8 Edema plantar resultante da inflamação induzida por

carragenana N. 68

FIGURA 9 Edema plantar resultante da inflamação induzida por

carragenana L. 70

FIGURA 10 Edema plantar resultante da inflamação induzida por

carragenana O. 72

FIGURA 11 Análises histológicas das carragenana N na indução do

edema eplantar em ratos Wistar após 3h da injeção intraplantar.

A - animais que receberam salina (NaCl 0,9%); B - animais que

receberam carragenana N (1%). HEX20 74

FIGURA 12 Análises histológicas das carragenanas L e O na indução do

edema plantar em ratos Wistar após 3h da injeção intraplantar.

A - animais tratados com carragenana L (1%); B - animais

tratados com carragenana O (1%). HEX20 75

FIGURA 13 Concentrações de nitrato/nitrito no exudato pleural 4 h após

indução das carragenanas nas cavidades pleurais de ratos

Wistar. O controle deste experimento foi realizado com a injeção

de salina (NaCl 0,9%). Foram utilizados 6 animais por grupo.

*** P < 0.001 vs. Salina. 79

FIGURA 14 Contagem de leucócitos do exudato pleural após 3 h de indução

das carragenanas nas cavidades pleurais de ratos Wistar.

O controle deste experimento foi realizado com a injeção de

salina (NaCl 0,9%). Foram utilzados 6 animais por grupo.

** P < 0.01 vs. Salina, *** P < 0.001 vs. Salina. 82

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Código alfabético para as carragenanas e sua respectiva

nomenclatura IUPAC. 25

TABELA 2 Composição química das carragenanas comerciais L, N e O. 54

TABELA 3 Bandas típicas, seus respectivos grupos funcionais e as

ocorrências nas carragenanas comerciais utilizadas neste estudo. 58

TABELA 4 Deslocamentos químicos das unidades mais comuns das

carragenanas L, N e O. 60

TABELA 5 Avaliação da atividade anticoagulante das carragenanas

comerciais L, N e O sobre a via intrínseca da cascata de

coagulação (aPTT) comparando-as com a atividade

da heparina padrão. 65

TABELA 6 Avaliação da atividade anticoagulante das carragenanas

comerciais L, N e O sobre a via extrínseca da cascata de

coagulação (PT) comparando-as com a atividade da heparina

padrão. 65

TABELA 7 Volume do exudato retirado da cavidade pleural após

indução de pleurisia pelas carragenanas comerciais L, N e O. 77

LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS

E Beta

N Capa

L Iota

O Lambda

P Miu

Q Niu

T Téta

Pg Micro grama

5-HT Serotonina

AA Ácido araquidônico

AT Antitrombina

°C Graus centígrados

C Isotópo 13 do carbono

Carbono 1

Carbono 2

Carbono 3

Carbono 4

Carbono 5

Carbono 6

C2 Componente do sistema complemento

C3a Fragmento a do componente 3 do sistema complemento

C4 Componente do sistema complemento

C5a Fragmento a do componente 5 do sistema complemento

CETAVLON Brometo de cetil trimetilamônio

cm Centímetro

O Água deuterada

eNOS Oxido nítrico sintase endotelial

g Grama

H Isotópo do Hidrogênio

HCl Ácido Clorídrico

HE Hematoxilina-eosina

IL-1 Interleucina 1

IL-6 Interleucina 6

IL-8 Interleucina 8

iNOS Oxido nítrico sintase induzível

IV Infravermelho

KBr Brometo de potássio

KCl Cloreto de Potássio

L-NAME N

-nitro-L-arginina-metiléster

L-NMMA N

-monometil-L-arginina

L-NNA N

-nitro-L-arginina

LTB

Leucotrieno

LTC

Leucotrieno

LTD

Leucotrieno

LTE

Leucotrieno

M Metil éter

mg Miligrama

min Minuto

mM Milimolar

mm Milímetro

N Normal

Óxido nitroso

NaCl Cloreto de sódio

NADPH Nicotinamida-adenina dinucleotídeo fosfatado reduzida

NF-NE Fator nuclear capa beta

NGF Fator de Crescimento Nervoso

nmol nano mol

nNOS Oxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido Nítrico

Íon nitrato

NOS Oxido nítrico sintase

NSAID Drogas aintiinflamatórias não esteroidais

Oxigênio

ONOO

Peroxinitrito

OR Origem

P Acetal piruvato

450

-like Família citocromo (hemeproteínas)

PDA 1,3 diaminopropano acetato

PGD

Prostaglandina D

PGE

Prostaglandina E

PGF

Prostaglandina F

PMN Polimorfonuclear

ppm Partes por milhão

RNM Ressonância Nuclear Magnética

S Éster de sulfato

TNF Fator de Necrose Tumoral

TNF-D Fator de Necrose Tumoral D

TNF-E Fator de Necrose Tumoral E

TXA Tromboxano

UI/mg Unidades Internacionais por miligrama

W/W Weight/Weight (peso/peso)

X Xilose

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 19

1.1. ALGAS MARINHAS 19

1.1.1. Considerações gerais 19

1.2. ALGAS VERMELHAS 20

1.3. ÁGAR 21

1.4. CARRAGENANAS 22

1.4.1. Considerações gerais 22

1.4.2. Nomenclatura 24

1.4.3. Estrutura 26

1.5. INFLAMAÇÃO 29

1.5.1. Mediadores inflamatórios 30

1.5.2. Inflamação x coagulação 34

1.6. ÓXIDO NÍTRICO 36

1.6.1. Síntese e metabolismo 36

1.6.2. Isoenzimas 37

1.6.3. Implicações do NO na inflamação 40

2. OBJETIVOS 41

3. MATERIAIS E METÓDOS 42

3.1. MATERIAL BIOLÓGICO 42

3.1.1. Animais 42

3.2. CARRAGENANAS 43

3.3. OUTROS MATERIAIS 43

3.4. MÉTODOS 43

3.4.1. Caracterização química das carragenanas 43

3.4.1.1. Eletroforese em gel de agarose 43

3.4.1.2. Análises químicas 45

3.4.1.2.1. Polissacarídeos totais 45

3.4.1.2.2. Proteína 45

3.4.1.2.3. Sulfato 45

3.4.2. Espectroscopia de Infravermelho (IV) 46

3.4.3. Ressonância nuclear magnética (RNM)

C 46

3.4.4. Avaliação In Vitro da atividade anticoagulante 46

3.4.4.1. aPTT - Tempo de tromboplastina parcialmente ativada 46

3.4.4.2. PT - Tempo de pró-trombina 47

3.4.5. Edema plantar 47

3.4.5.1. Análises histológicas 48

3.4.6. Pleurisia 49

3.4.6.1. Avaliação dos teores de nitrato/nitrito 50

3.5. ANÁLISES ESTATÍSTICAS 50

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 51

4.1. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA 51

4.1.1. Eletroforese em gel de agarose 51

4.1.2. Dosagens químicas 53

4.2. ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IV) 55

4.3. RESSONÃNCIA NUCLEAR MAGNÉTICA (RNM)

C 59

4.4. AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 64

4.5. EDEMA PLANTAR 67

4.5.1. Análises histológicas 73

4.6. PLEURISIA 76

4.6.1. Teores de nitrito/nitrato 77

5. CONCLUSÕES 83

REFERÊNCIAS 84

1. INTRODUÇÃO

1.1. Algas marinhas

1.1.1. Considerações gerais

As algas marinhas fazem parte do grupo dos seres mais simples, uma vez

que não apresentam órgãos e sistemas e são completamente dependentes da água,

pois não possuem vasos. Entretanto, essa aparente simplicidade não é refletida no

que diz respeito à composição de seus constituintes, os quais sempre foram objetos

de estudo (McCANDLES, CRAIGIE, 1979).

Há cerca de cinco décadas passadas o mundo ocidental desconhecia

praticamente tudo acerca das algas. Entretanto, atualmente, muito já se conhece

sobre seus constituintes, como, por exemplo, que são ricos em proteínas,

mucilagens, carboidratos, vitaminas, fósforo, iodo, potássio, cloro, entre outros.

Alguns desses elementos presentes nas algas não são encontrados com freqüência

em outros organismos, por isso, até em quantidades diminutas estes têm grande

importância (NOSEDA, 1994).

As indústrias de alimentos e cosmética foram às pioneiras no uso das algas

marinhas como fonte de matéria-prima para seus produtos. Contudo, o grande

centro das atenções, atualmente, é o uso das algas como fonte de compostos para a

indústria farmacêutica, destacando-se nesse aspecto os seus polissacarídeos

constituintes (McCANDLES, CRAIGIE, 1979). Nesse contexto, é imprescindível

salientar a importância da extração de compostos de fontes vegetais, reduzindo aí o

risco de contaminação viral, fato ocorrido com grande freqüência nas matérias-

primas animais.

As três principais divisões de macroalgas marinhas são as Phaeophyta (as

algas marrons), Chlorophyta (algas verdes) e Rhodophyta (algas vermelhas), que

juntos compreendem 7000 espécies (RORRER, CHENEY, 2004).

1.2. Algas vermelhas

As algas vermelhas (Rhodophyta) são um dos três principais grupos de

organismos fotossintéticos primários. Elas são o principal constituinte das

comunidades de macroalgas desde os pólos até os trópicos, e são importantes

produtores primários nos ecossistemas marinhos costeiros. Apesar de uma

diversidade enorme de formas de vida e estratégias reprodutivas, as algas

vermelhas não apresentam diferenciação tissular verdadeira, o que leva à alguns

autores especularem que elas representam os eucariotos mais primitivos (REITH,

1995; STILLER, HALL, 1997)

Elas se caracterizam por possuir como pigmentos a clorofila a, a clorofila d,

carotenóides e ficobilinas (ficocianina, aloficocianina e ficoeritrina), que mascaram a

tonalidade verde das clorofilas, deixando a alga com seu tom avermelhado

característico. A presença da ficoeritrina permite-lhes absorver a luz azul podendo

assim, sobreviver a profundidades muito superiores às das outras algas. Já foram

encontradas algas desta divisão a mais de 260 metros de profundidade, desde que a

água seja límpida o suficiente para permitir a passagem de luz (CRAIGIE, 1990).

O material de reserva das algas vermelhas é o amido florídeo. A sua parede

celular consiste em uma trama de polissacarídeos como celulose, xilano ou manano,

coberta de mucilagens polímeras de galactose, como ágar e carragenana,

constituindo assim a matriz da parede celular dessas algas (CRAIGIE, 1990;

PAINTER, 1983). Além disso, essas duas substâncias são responsáveis pela

importância econômica das Rhodophytas: o ágar é amplamente utilizado na indústria

farmacêutica e na cultura de bactérias; e as carragenanas são bastante utilizadas

como agente emulsificante ou estabilizante principalmente em alimentos (RAVEN,

EVERT, EICHHORN, 1996).

1.3. Ágar

O ágar é sintetizado pelas espécies de algas do gênero Gelidum, Gracilaria,

Acanthopeltis, Ahnfeltia, Ceramium, Campylaephora, Phllophora e Pterocladia spp.

O extrato de algas produtoras de ágar vem sendo comercializado há 700 anos no

Japão e posteriormente comercializado também pela Espanha, Coréia, Rússia, EUA,

dentre outros países. O ágar é extraído por meio de água quente e consiste de um

polímero de galactose (LEE, 1992).

Este polímero pode ser separado em duas frações: agarose e a agaropectina.

Este último pode conter substituintes como metil, sulfato e ácido pirúvico. Essa

substituição fornece ao polímero suavidade, flexibilidade e também propriedades

elásticas. A maior parte dos resíduos da galactose da agaropectina tem um

substituinte de éster sulfato, mas a agarose caracteriza-se pelo baixo teor de sulfato.

A incorporação do sulfato às substâncias orgânicas ocorre por uma reação direta,

intermediada por nucleotídeos sulfatados. A gelificação do ágar na solução aquosa

é reversível e quando o gel é aquecido há uma quebra nas ligações por pontes de

hidrogênio. O resfriamento proporciona ligações por pontes de hidrogênio formando

uma dupla hélice. Quanto mais sólido maior a formação de pontes de hidrogênio

(LEE, 1992).

O ágar hidratado adquire consistência lisa decorrente de seu intumescimento

e pelo fato de não ser irritante favorece o peristaltismo normal e é usado como

laxativo. É usado também como agente emulsificante, gelificante para supositórios,

lubrificante cirúrgico, como excipiente e desintegrante de comprimidos e auxilia no

processamento de alimentos e em outras técnicas industriais. Além dessas

utilidades, é importante para o cultivo de bactérias, já que fazem parte do meio de

cultura utilizado nas placas de Petri (RENNENBERG, 1984).

A agarose também tem aplicação especial no diagnóstico clínico: é usada

como matriz na imunodifusão, na separação de globulinas e de outras proteínas por

eletroforese e em cromatografias de gel filtração (KANNO et al., 1990).

1.4. Carragenanas

1.4.1. Considerações Gerais

As carragenanas são conhecidas desde o século XIX quando eram extraídas

da alga vermelha Chondrus crispus e utilizadas pela população da cidade irlandesa

de “Carrageen”, como agente emulsificante e gelificante em alimentos caseiros

(NOSEDA, 1994). Atualmente estes compostos são objeto de estudos e muitos

trabalhos têm sido desenvolvidos com relação a sua estrutura, propriedades físico-

químicas como viscosidade, variações inter e intra-específicas, biossíntese e

aplicações industriais dentre outras (DE RUITER, RUDOLPH, 1997).

Atualmente, o termo “carragenana” descreve uma classe de galactanas

sulfatadas que ocorrem como constituinte da parede celular de diversas espécies

de algas marinhas vermelhas (TOJO, PRADO, 2003). Juntamente com os alginatos

e o ágar, as carragenanas formam um grupo de substâncias biopoliméricas

complexas chamado ficocolóides, que são colóides, principalmente, de natureza

hidrofílica (FERNÁNDEZ et al., 2003). Essa característica tem conferido as

carragenanas enorme importância na indústria alimentícia, estando presente na

composição de cremes, gelatinas, queijos, achocolatados, dentre outros produtos.

Somando-se a isso, elas são também utilizadas em produtos não alimentícios como

em formulações farmacêuticas e cosméticos (THERKELSEN, 1993; IMESON, 2000;

VAN DE VELDE, DE RUITER, 2002). Em geral, são utilizadas como agentes

gelificantes, estabilizantes e viscosos.

Além disso, as carragenanas vêm sendo utilizadas como ferramentas para

investigar o processo inflamatório em ratos e camundongos (LEVY, 1969). Quando

injetada subcutâneamente na superfície plantar em uma pata de rato, ela causa uma

inflamação característica, que pode ser usada para quantificar o poder da ação de

drogas antiinflamatórias (SAMMONS et al., 2000).

A inflamação induzida pela carragenana é um processo muito complexo,

envolvendo um grande número de mediadores e caminhos para produzir a

hiperalgesia inflamatória (SAMMONS et al., 2000). Dentre esses mediadores

podemos destacar produtos do metabolismo do ácido araquidônico (BLACKHAM et

al., 1979), conteúdos de mastócitos (histamina, 5-HT) (BURITOVA et al., 1997; DI-

ROSA, SORRENTINO, 1968; KOCHER et al., 1987), neurocininas (substância P)

(CODERRE, MELZACK, 1991), citocinas (IL-1E) (IANARO et al., 1999), óxido nítrico

(SALVEMINI et al., 1996), fator de crescimento nervoso (NGF) (McMAHON, 1996) e

muitos outros. Entretanto, o papel exato de cada um desses componentes na

inflamação induzida por carragenana não está ainda bem definido.

1.4.2. Nomenclatura

Os estudos com as carragenanas iniciaram-se com o fracionamento destes

polímeros em duas frações: uma insolúvel em KCl 0,125 M e outra solúvel nesta

mesma solução, a primeira denominou-se Kappa carragenana e a segunda Lambda

carragenana (SMITH, COOK, 1953). Surgia, assim, a primeira diferenciação de

carragenanas quanto à nomenclatura.

Hoje em dia, habitualmente, todas as carragenanas são identificadas por um

prefixo grego, indicando o principal componente da amostra. Essa nomenclatura é

usada universalmente na indústria, na ciência e na legislação correspondente.

Entretanto, esse critério não é usado para descrever polímeros mais complexos de

forma não ambígua. Para descrever estruturas mais complexas, uma nomenclatura

alternativa para carragenanas e agar foi criada. (KNUTSEN et al., 1994) Este código

alfabético (Tabela 01) é encontrado na IUPAC e segue uma descrição sistemática de

moléculas de polímeros complexos, tendo como estrutura ideal a seqüência

alternada de (o3)-E-D-Galactopiranose e (o4)-D -D-Galactopiranose ou (o4) 3,6-

anidro-D-D-Galactopiranose.

TABELA 01: Código alfabético para as carragenanas e sua respectiva nomenclatura

IUPAC.

Letra código Encontrado nas

carragenanas

Nomenclatura IUPAC*

E (o3)-E-D-Galactopiranose

D Não encontrada**

(o4)-D -D-Galactopiranose

E,N (o4) 3,6-anidro-D-D-Galactopiranose

N, L, O, P, Q, T

Éster sulfato (O-SO

)

G2S

O, T (o3)-E-D-Galactopiranose 2-sulfato

G4S

N, L, P, Q (o3)-E-D-Galactopiranose 4-sulfato

DA2S

L, T (o4) 3,6-anidro-D-D-Galactopiranose 2-sulfato

D2S,6S

O, Q (o4)-D -D-Galactopiranose 2,6-disulfato

D6S

P (o4)-D -D-Galactopiranose 6-sulfato

* Nomenclatura: International Union of Pure And Applied Chemistry (McNAUGHT, 1996)

** Não encontrada em carragenanas de ocorrência normal, mas em amostras dessulfatadas

Essa nomenclatura baseada em códigos alfabéticos (letras) ganha espaço

nas publicações científicas que tratam de carragenanas e ágars. Muitos autores

descrevem estruturas complexas usando essa nomenclatura. Em adição as

notações (S) para éster de sulfato, existem (M) para metil éter, (P) para acetal

piruvato e unidades glicosidícas como a xilose (X) são introduzidas para descrever

carragenanas com diferentes substituintes (MILLER, BLUNT, 1998).

1.4.3. Estrutura

Até meados deste século as carragenanas eram consideradas como

homopolissacarídeos constituídos de D-galacotose, embora este polissacarídeo

representasse apenas 35 a 40 % do polissacarídeo ou 60% da matéria orgânica do

mesmo (NOSEDA, 1994). Os estudos relatam que a hidrólise ácida destes

compostos levava ao surgimento de um composto denominado de 5-hidrometilmetil-

2-furfural. A sua presença sugeria aos pesquisadores uma reação positiva das

carragenanas com reativos específicos para cetoses induzindo alguns

pesquisadores a supor a presença de frutose nestes polímeros. Posteriormente,

sugeriu tratar-se de 3,6-anidro-D-D-anidrogalactose, conhecido como um carboidrato

lábil ácido (HAWORTH et al., 1940).

Carragenanas são uma família de galactanas sulfatadas, lineares e solúveis

em água. São formadas de (o3)-ȕ-D-galactopiranose (Unidades G) e (o4)-Į-D-

galactopiranose (Unidades D) ou (o4)-3,6 anidro-Į-D-galactopiranose (Unidades

DA), formando a unidade repetitiva dissacarídica das carragenanas. Além de

galactose e sulfato, outros resíduos de carboidratos (como por exemplo xilose,

glicose e ácidos urônicos) e substituintes (como por exemplo metil e piruvato) podem

estar presentes em preparações de carragenanas (VAN DE VELDE et al., 2002).

Carragenanas naturais são uma mistura de polissacarídeos, fazendo com que

o termo unidade dissacarídica repetitiva passe a ser utópico (VAN DE VELDE et al.,

2004). Os três principais tipos de carragenanas são Iota, Kappa e Lambda (Figura

1). As duas primeiras contêm unidades de 3,6 anidrogalactose e são polímeros

formadores de gel e a última contém apenas unidades de galactose e atua como um

agente espessante (DE RUITER, RUDOLPH, 1997). Essa diferença reológica

resulta do fato de que as unidades DA da L e N possuem a conformação

enquanto que a unidades D da O não possui essa conformação. A conformação

das unidades 3,6-anidrogalactopiranosil nas carragenanas L e N forma uma estrutura

secundária helicoidal, que é essencial para as propriedades formadoras de gel.

Logo, a presença de unidades dissacarídicas sem o anel 3,6-anidro previne a

formação dessa estrutura helicoidal e, conseqüentemente, a gelificação das

carragenanas (VAN DE VELDE et al., 2002).

Todos os tipos de carragenanas ocorrem em estados de alto grau de

polimerização bem como alto grau de polidispersão (GLICKSMAN, 1983; PICULELL,

1995). As formas comerciais dessas carragenanas são quase sempre impuras e

normalmente contém vários outros tipos de polímeros, levando em conta a forma de

extração e a alga utilizada (HARRIS, 1990).

FIGURA 1: Estrutura das unidades dissacarídicas repetitivas dos três principais tipos

de carragenanas: L, N e O (DYRBY et al.,2004).

1.5. Inflamação

Inflamação pode ser definida como sendo um conjunto complexo de reações

que ocorrem no tecido conjuntivo vascularizado, levando ao acúmulo de líquido e

células no interstício ou líquido intersticial (PEREIRA, BOGLIOLO, 1998). A

inflamação pode ser assim considerada uma reação de defesa local (MAJNO,

PALADE,1961).

A resposta inflamatória tem por objetivo sanar o dano que a causou e induzir

a reparação, no caso de destruição de células e tecidos por reposição de células e

tecidos mortos por células sadias, oriundas do epitélio adjacente (reepitelização), por

células do parênquima (regeneração) ou células do estroma (cicatrização).

A inflamação pode ser aguda ou crônica. A aguda é a de curta duração,

ocorrendo nas primeiras horas, dias e caracteriza-se pela não especificidade e

grande quantidade de exudação do fluido e de proteínas do plasma para o interstício

com o objetivo de eliminar os tecidos mortos, proteger contra infecção local e

permitir o acesso do sistema imune à área danificada. (MAJNO, 1961; BUTCHIER,

1991; STEVENS, LOWE 1998). Persistindo o agente lesivo, inicia-se a fase crônica,

que é de longa duração e está, na maioria das vezes, associada com a presença de

células (linfócitos, macrofágos, dentre outras), angiogenêse, fibrose e necrose de

tecidos (DRAY, 1995; POBER, COTRAN, 1990).

Independente do que venha a causar a inflamação, ocorre a indução da

liberação de mediadores pelos mastócitos, plaquetas e leucócitos nas reações

imunes ou seguindo-se ao dano tecidual, estes atuam conjuntamente com outras

moléculas liberadas pelos sistemas de enzimas plasmáticas controlando a

permeabilidade vascular e o suprimento sanguíneo.

1.5.1. Mediadores Inflamatórios

O conceito de mediadores da inflamação está em substâncias endógenas ou

exógenas que uma vez ativadas participam, desencadeando, mantendo e/ou

amplificando os diversos processos envolvidos na resposta inflamatória. Para que

uma determinada substância seja considerada um mediador da reação inflamatória é

necessário que ela se enquadre em alguns critérios como: serem isoladas do foco

inflamatório; se injetados, provocarem reação inflamatória; se bloqueados,

impedirem o fenômeno inflamatório (VASCONCELOS, 2000).

Esses mediadores podem ser exógenos advindos de bactérias, vírus,

protozoários e endógenos, aqueles produzidos pelo próprio organismo como as

cininas, fatores de coagulação, sistema complemento, dentre outros (FANG et al.,

1997).

Dentre os mediadores endógenos destacam-se a histamina, o principal

mediador pré-formado da inflamação, que é liberada pelos mastócitos, basófilos e

plaquetas sempre que haja qualquer estímulo físico ou químico indutor de

inflamação, provocando vasodilatação arteriolar, aumento da permeabilidade

vascular, além de atuar como potente fator quimiotático para eosinófilos (MAJNO,

PALADE, 1961).

Além dela, existe um grupo de mais de 30 proteínas, chamado sistema

complemento, que interagem entre si e com outras moléculas do sistema imune

propiciando muitas das funções efetoras do sistema imune (KIM et al., 2004). Esse

sistema pode atuar através de três vias: a clássica, que é ativada por complexo

antígeno-anticorpo e é mais rápida; a alternativa, que é ativada por fatores não

imunológicos e é mais lenta; e a via das lectinas, que consiste de uma nova forma

de ativação para os componentes C2 e C4 da via clássica (LAPPEGARD et al.,

2004). Os principais componentes efetores desse conjunto de proteínas são C3a e

C5a: o primeiro é produzido tanto na via clássica quanto na alternativa e atua

aumentando a permeabilidade vascular na microcirculação o que implica na

formação do edema; o segundo componente também aumenta a permeabilidade

vascular, mas também é altamente quimiotático para neutrófilos, basófilos e

monócitos. Além disso, esse sistema atua na opsonização e lise de

microorganismos, desgranulação de mastócitos, dentre outras funções (KIM et al.,

2004).

A cascata ou sistema de coagulação possui a função primordial de controlar a

perda de sangue nos animais superiores com vistas à manutenção da homeostase

(DAVIE et al., 1991). Esse controle se dá devido a esse sistema induzir a formação

de fibrina quando acionado, esta, por sua vez, é um elemento essencial para a

formação do trombo sangüíneo. Este é desencadeado pela injúria tecidual ou por

fatores liberados pelos tecidos, e tem como função, delimitar a área inflamada

impedindo desta forma a dispersão de qualquer agente infeccioso dentro do

organismo hospedeiro (LEVI et al., 2002; LEVI, 2004).

É importante observar que as três vias importantes controladoras da cascata

de coagulação são: antitrombina (AT), proteína C ativada / proteína S e inibidor da

via do fator tecidual (WU, THIAGARAJAN, 1996). A antitrombina inibe a trombina

(efeito antiinflamatório indireto) e liga-se a glicosaminoglicanos específicos, na

ausência de heparina, na superfície das células endoteliais, induzindo a síntese de

prostaciclinas, que inibem a agregação plaquetária, expressão de moléculas de

adesão, a ligação de neutrófilos às células endoteliais e ainda atenuam a liberação

de IL-6, IL-8 e TNF a partir das células endoteliais (SOUTER et al., 2001). AT é

capaz de inibir a produção de fator nuclear kapa B (NF-kB), fundamental na geração

da resposta inflamatória. Este último é translocado para o núcleo onde modula a

expressão de uma variedade de genes incluindo citocinas, fatores de crescimento,

proteínas de fase aguda, moléculas de adesão celular entre outros (CHEN et al.,

2001).

Além do Sistema de Coagulação existe o Sistema Fibrinolítico que age no

processo de coagulação desfazendo os trombos e mantendo um fluxo sangüíneo

contínuo. Com relação à resposta inflamatória, este sistema ativa o Sistema

Complemento e atua também no aumento da permeabilidade vascular

(CARMELIET, COLLEN, 1997).

O Sistema Cinina (Peptídeos básicos) é um sistema de enzimas que

influenciam a pressão sangüínea, a permeabilidade vascular, a contração dos

músculos lisos, a ativação das plaquetas e estimulam os receptores para dor

(MARGOLIUS, 1995). Estes compostos são formados enzimaticamente pela ação de

glicoproteínas chamadas calicreínas. Estas estão presentes no plasma e em

diversos tecidos e possuem propriedades catalíticas sobre os cininogêneos

precursores das cininas. Nos mamíferos são encontradas a bradicinina,

lisilbradicinina e metil-lisilbradicinina (GUYTON, HALL, 2002).

O Ácido Araquidônico (AA) é encontrado em fosfolipídeos de membranas

celulares em mastócitos, basófilos, macrófagos e células endoteliais. Seus

metabólitos são bastante conhecidos como mediadores do processo inflamatório e

subdividem-se em duas classes: Leucotrienos (LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4) e as

Prostaglandinas (PGE

, PGD

, PGF

, PGI

e Tromboxano TxA

). Esta última é

formada através da via da Ciclooxigenase e age na vasodilatação, inibição da

agregação de plaquetas, potencialização da dor, vasocronstrição e modula a

função de macrófagos (FUNK, 2001). O TxA

é o principal produto plaquetário e atua

como um potente agregador plaquetário e vasoconstritor. A PGI

causa

vasodilatação e potencializa a formação do edema enquanto que a PGE

está

envolvida na patogenia da febre, da dor e da inflamação (FUNK, 2001; KUMAR,

SHIVKAR, 2004). Por outro lado, a PGD

é o principal produto da Via Ciclooxigenase

nos mastócitos, promovendo a dilatação e permeabilidade vascular local agindo

também como um potente quimiotático de neutrófilos (SIMMONS et al., 2004)

Já os Leucotrienos são formados a partir da via da lipooxigenase e promovem

quimiotaxia, aumento da permeabilidade vascular, agregação e pavimentação de

leucócitos nas células endoteliais e vasoconstrição (FUNK, 2001).

As citocinas são um tipo especial de mediadores que podem ser produzidos

pelas células do tecido afetado, e atraem linfócitos e fagócitos (LUSTER, 1998).

Assim como, estão envolvidos na regulação de células inflamatórias e no

crescimento e diferenciação de leucócitos imaturos (LIN, 1996). Dentre os prinicipais

representantes podemos citar as interleucinas e o Fator de Necrose Tumoral (TNF).

Este é expresso sob duas formas: TNFD (produzido por macrófagos) e TNFE ou

linfotoxina (linfócitos T). Os TNFD e E, no endotélio, induzem uma série de

mudanças (segundo o nível de estímulo para a transcrição de genes) chamado de

ativação do endotélio, ocorre aumento da produção de moléculas de adesão e

mediadores químicos (citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, NO).

Promovendo assim a marginação e migração dos leucócitos para o local da

inflamação (STITES et al., 1997).

Dentre as interleucinas, destacam-se a IL-8, que é um poderoso

quimioativador e ativador de neutrófilos, e a IL-1, que é um poderoso vasodilatador.

As ações combinadas desses compostos na fase aguda da inflamação são

responsavéis por alterações sistêmicas como febre, sudorese, anorexia

(XANTHOULEA et al., 2004; SAMA et al., 2004 ).

1.5.2. Inflamação X coagulação

Inflamação e coagulação possuem grande importância no estudo de doenças

vasculares. Ultimamente, as evidências de ligação entre esses dois sistemas estão

cada vez maiores, ao passo que não apenas a inflamação dispara a coagulação,

mas o inverso também é observado. Como exemplo dessa íntima relação podemos

destacar a ativação da coagulação e deposição de fibrina como uma conseqüência

da inflamação, este mecanismo é bem conhecido e pode ser visto como uma parte

essencial da defesa do hospedeiro contra agentes infecciosos e células estranhas,

em um esforço para conter o invasor e limitar a resposta imune a uma área restrita

(LEVI et al., 2004; LEVI, 2004).

As proteases envolvidas na coagulação induzem os mediadores pró-

inflamatórios que tem atividade pró-coagulante amplificando, assim, a cascata de

coagulação, como podemos observar na expressão de material pró-coagulante

pelas células inflamatórias pode iniciar a ativação da coagulação, e a trombina

gerada irá tanto atuar na ativação de plaquetas como na formação do trombo.

Dessa forma, é importante salientar que a ativação da inflamação leva a um

aumento da coagulação e que esta última tem uma ação indutora sobre as células

inflamatórias, fato comprovado, por exemplo, com a ativação de receptores celulares

específicos em células endoteliais pela trombina, o que pode afetar, por exemplo, a

produção de citocinas ou a apoptose de células inflamatórias (LEVI, VAN DER

POLL, BULLER, 2004).

Assim, para a compreensão da atividade inflamatória de determinados

compostos é fundamental a mensuração da participação desses compostos na

cascata de coagulação.

ROSENBERG e DAMUS, (1973) demonstraram que a heparina exercia o seu

efeito anticoagulante potencializando a ação inibitória da antitrombina (AT) sob a

trombina e outras proteases da coagulação. TOLLEFSON, BLANK, (1981) e

posteriormente CHURCH et al., (1988) estudaram a ação anticoagulante de

glicosaminoglicanos, dermatam sulfato, e de compostos polianiônicos, inclusive,

polinucleotídeos fosfatados. Os autores observaram que esta ação ocorria também

via interação com o co-fator II da heparina.

O primeiro relato de extratos de algas marinhas com propriedades

anticoagulante foi feito por CHARGAFF et al., (1936) em estudos realizados com a

alga vermelha Iridae laminarioides. Esta galactana possuía 30 UI/mg de atividade

anticoagulante comparado a heparina (155 UI/mg). Desde que estes estudos foram

realizados, têm sido feitos muitos outros relacionando essa atividade com a

propriedade anti-hemostática dos extratos e de frações purificadas das algas

vermelhas, marrons e verdes (LEVI et al., 2004).

Com relação ao estudo da atividade anticoagulante em algas vermelhas, já

foram pesquisadas mais de 40 espécies (SHANMUGAN, MODY, 2000). Dentro

desse contexto, muitos desses estudos são sobre a atividade anticoagulante de

carragenanas (HAWKINS, LEONARD, 1962; HAWKINS, LEONARD, 1963;

ANDERSON, DUNCAN, 1965; ANDERSON, 1967; KINDNESS et al., 1979).

1.6. Óxido Nítrico

Esta pequena molécula tem efeitos fascinantes desde a manutenção inicial da

vida, através do controle da circulação placentária, como também efeitos letais

consideráveis, por exemplo, no choque séptico. Além disso, sua atividade na imuno-

regulação está presente na inflamação e nos mecanismos de auto-imunidade

(FILHO, ZILBERSTEIN, 2000).

1.6.1. Síntese e metabolismo

O óxido nítrico é uma molécula gasosa simples, habitualmente encontrada no

ar atmosférico em pequenas quantidades, altamente tóxica devido à presença de

radical livre (elétron extra) que a torna um agente químico altamente reativo. Quando

diluído, o NO tem uma meia vida de menos de 10 segundos devido à sua rápida

oxidação a nitrito e nitrato. O NO liga-se à hemoglobina e outras proteínas que

contém o núcleo heme levando ao término de sua atividade biológica (SNYDER,

BREDT, 1992).

A Figura 2 mostra a reação química para formação do NO, onde a L-arginina

é transformada em um intermediário (N-hidroxi-L-arginina), sendo necessário

NADPH e O

para a produção de L-citrulina e NO. A L-arginina é um aminoácido

semi-essencial produzido no organismo, porém em quantidades reduzidas. Além do

ciclo da uréia, ela é utilizada na síntese de creatina e fornece ornitina para a síntese

de poliaminas.

FIGURA 2: Síntese do óxido nítrico a partir da L-arginina.

A síntese enzimática da L-citrulina pode ser inibida por análogos da L-arginina

como N

-monometil-L-arginina (L-NMMA), N

-nitro-L-arginina (L-NNA) e N

-nitro-L-

arginina-metiléster (L-NAME) (SNYDER, BREDT, 1992; REES et al., 1990). Estes

inibidores têm grande importância na pesquisa dos efeitos do NO nos tecidos, uma

vez que a substituição da L-arginina irá inibir a produção de NO e,

conseqüentemente, seus efeitos.

A demonstração da produção de NO é muito difícil e sempre feita por via

indireta. Ela pode ser realizada considerando-se a concentração de nitrito e nitrato

como indicadores da produção de óxido nítrico ou a utilização dos análogos da L-

arginina, sendo a ausência do efeito encontrado imputado a não produção de NO.

1.6.2. Isoenzimas

Hemeproteínas da família citocromo P450-like são capazes de sintetizar o

NO. As NO sintases (NOS) são dependentes de O

, NADPH, flavinas e biopterinas

para exercer sua atividade. Existem três isoformas de NOS, chamadas de acordo

com o tipo celular ou com as condições onde foram identificadas inicialmente -

endotelial NOS (eNOS), neuronal NOS (nNOS) e induzível NOS (iNOS). Cada

isoforma é produto de um gene isolado: o gene para eNOS está localizado no

cromossomo humano 7, o gene para nNOS no cromossomo 12 e o gene para iNOS

no cromossomo 17 (VALLANCE, 2003; WANG, MARDSEN, 1995).

a) Neuronal NOS

A nNOS ou isoforma I está presente em neurônios centrais e periféricos e

atua, principalmente, como um neurotransmissor não-clássico (não é empacotada

em vesículas e liberadas em quanta) ou neuromodulador (GARTHWAITE,

BOULTON, 1995). Além dessas funções, esta molécula está envolvida na mediação

da hiperalgesia em diversos modelos de inflamação, assim como, a inibição da

produção de NO gera efeitos analgésicos (LOU, CZIDOVA, 2000).

Ela está localizada em muitas regiões do cérebro, principalmente no cerebelo,

hipotálamo e lobo olfatório.

b) Endotelial NOS

Foi demonstrado que o relaxamento da artéria de coelho mediante a presença

de acetilcolina dependia da integridade do endotélio (FURCHGOTT, ZAWADSKI,

1980). Se o endotélio for removido, o relaxamento ocorre através de outros

mediadores (noradrenalina), mas não pela acetilcolina. Esse fato é mediado pela

liberação de óxido nítrico do endotélio e tem sido demonstrada em artérias,

arteríolas, veia e vênulas em uma série de espécies, incluindo humanos, in vivo ou in

vitro (VALLANCE et al., 1989).

A inibição farmacológica da eNOS com análogos da L-arginina não impede

apenas a resposta a acetilcolina ou outro mediador endotélio-dependente, mas

também causa um aumento substancial na resistência vascular sistêmica

(VALLANCE et al., 1989). Dessa forma, a administração sistêmica de inibidores da

eNOS aumenta a pressão arterial causando hipertensão devido ao aumento da

resistência vascular (BARBA et. al., 2000).

O óxido nítrico previne a adesão de plaquetas e leucócitos no endotélio,

assim como inibe a formação de agregados plaquetários e estimula a desagregação

desses agregados (RADOMSKI et al., 1996).

c) Induzível NOS:

Inicialmente, foi descoberta a forma induzível (isoforma II) em macrófagos de

murinos (GREEN et al., 1990). Ela é transcricionalmente regulada, ou seja, após a

estimulação por lipopolissacarídeos bacterianos (endotoxina) ou várias citocinas pró-

inflamatórias (interleucina-1, interferon-J ou TNF-D) a transcrição gênica é

estimulada, o RNAm para iNOS aparece e a enzima é sintetizada (PALMER et. al.,

1993).

A indução desta enzima parece ser um importante mecanismo de defesa do

hospedeiro contra alguns patógenos. E o mecanismo chave desse processo parece

ser a reação entre o NO e o O

, que é altamente favorável e rápida levando a

produção de peroxinitrito (ONOO

). Entretanto, este peroxinitrito pode se isomerizar

à forma de nitrato (NO

), que é um potente oxidante, podendo causar graves danos

celulares assim como estimular a produção de outros radicais como os radicais

hidroxi (BECKMAN, KOPPENOL, 1996).

1.6.3. Implicações do NO na inflamação

O papel do NO na inflamação é um dos aspectos mais estudados na fisiologia

nos últimos anos. Muitos estudos mostram um importante papel do NO como agente

antiinflamatório, entretanto muitos outros demonstram a participação dessa molécula

como indutora de disfunções teciduais e da ativação de células inflamatórias. Esse

aparente paradoxo pode ser entendido estudando-se a química fisiológica do NO e

seu metabolismo determinando, assim, uma distinção entre os efeitos deletérios e

benéficos desse composto (GRISHAM et al., 1999).

A química fisiológica do NO é um processo complexo englobando enumeras

reações potenciais. A química é o fator determinante para a elucidação dos efeitos

desta molécula nos sistemas biológicos. Esses efeitos podem ser classificados em

direitos, onde o NO interagem diretamente com a molécula biológica, e indiretos,

onde intermediários derivados do NO interagem com o sistema biológico (WINK,

MITCHELL, 1998).

A interação direta do NO com proteínas metálicas ou com radicais orgânicos

livres representam as duas principais formas de efeitos biológicos deste composto

nos sistemas biológicos (WINK et al., 1997; PADMAJA, HUIE, 1993). Em contraste,

os efeitos indiretos são mediados por espécies oxidas de nitrogênio altamente

reativas, formadas pela reação do NO com O

e O

. Essas espécies estão

associadas com a fisiopatologia de diversos modelos de inflamação (GRISHAM et

al., 1998; NATHAN, 1997; WINK, MITCHELL, 1998) e as mais significantes são

óxido nitroso (N

) e peroxinitrito (ONOO

), que induzem dois tipos de estresse

químico: oxidação e nitrosação (WINK, MITCHELL, 1998).

Objetivos

2. OBJETIVOS

Este trabalho tem por objetivo geral a comparação da atuação das três

principais carrragenanas comerciais (Kappa, Lambda e Iota) como indutores do

processo inflamatório: edema intraplantar e pleurisia.

Pode-se também mencionar alguns objetivos específicos, tais como:

x Caracterizar quimicamente as três carragenanas;

x Analisar os compostos por métodos espectroscópicos: infravermelho e

ressonância nuclear magnética;

x Avaliar a influência das carragenanas na duas vias da cascata de

coagulação;

x Verificar a ação das carragenanas no edema intraplantar em ratos;

x Mensurar o poder desses compostos como agentes indutores do processo

inflamatório, usando como modelo o da pleurisia.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Material Biológico

3.1.1. Animais

Ratos da linhagem Wistar com seis a oito semanas de idade, pesando entre

175-200g, obtidos no biotério do Departamento de Bioquímica/UFRN, foram

utilizados em todos os experimentos deste estudo e mantidos em gaiolas individuais,

com livre acesso à comida e água e em condições controladas de iluminação (ciclo

12 h claro/ escuro) e temperatura (24 r 2ºC).

3.2. Carragenanas

As carragenanas foram adquiridas da Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo,

EUA), conforme especificações abaixo:

x Carragenana Iota (Tipo V, C-3799) - extraída da alga Eucheuma spinosa;

x Carragenana Kappa (Tipo III, C-1263) - extraída da alga Eucheuma cottonii;

x Carragenana Lambda (Tipo VI, C-3889) - extraída das algas Gigartina acicularis

e Gigartina pistillata.

3.3. Outros materiais

x Ácido Sulfúrico foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha);

x Azul de Toluidina e Coomasie briliant blue R 250 foram adquiridos da Sigma

Chemical Co. (St. Louis, Mo, EUA);

x Agarose (Stanford Low Mr) adquirido da Bio Rad Laboratories (Richmond, CA.

EUA);

x Cloreto de sódio, ácido acético, ácido clorídrico da Reagen Quimibrás Indústrias

Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);

x 1,3–diamino propano adquiridos da Aldrich Chemical Co. Inc. (WI, EUA);

x Brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) da Britsh Drug House Chemical Ltd.

(Poole, Inglaterra);

x Todos os demais reagentes foram da melhor qualidade possível.

3.4. Métodos

3.4.1. Caracterização química das carragenanas

3.4.1.1. Eletroforese em gel de agarose

A agarose (0,6%) foi diluída em tampão 1,3 diaminopropano acetato (PDA)

0,05 M, pH 9,0 foi colocado sobre lâminas de vidro medindo (7,5x 5,0x 0,2cm) e

(7,5x 10x 0,2cm) até o resfriamento e formação do gel. Alíquotas de 5 Pl (50 Pg das

amostras) foram aplicadas em canaletas no gel e submetidas à eletroforese (5 V/cm

durante 1 hora), em uma cuba resfriada a 4ºC. A origem das aplicações corresponde

ao pólo negativo. (DIETRICH, DIETRICH, 1977).

Após o tempo previsto de migração eletroforética para o sistema de tampão

PDA, os compostos foram precipitados no gel de agarose pela submersão da lâmina

por um tempo mínimo de duas horas, a temperatura ambiente, em CETAVLON 0,1%

(brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamônio). Após a precipitação dos polissacarídeos,

o gel foi seco sob uma corrente contínua de ar quente e corado com azul de

toluidina 0,1 %, numa solução de ácido acético 1% e etanol 50%, onde o excesso de

corante foi removido em solução descorante, uma solução preparada a partir de

ácido acético 1% em etanol 50 %. A etapa de descoloração do gel de agarose foi

então repetida até que o fundo da lâmina descora-se completamente. Em seguida, o

gel foi então posto para secar a temperatura ambiente.

As bandas de migração eletroforética das carragenanas foram reveladas pela

metacromasia específica de cada composto. Aqueles compostos ricos em sulfato

demonstraram uma coloração azul/arroxeada característica, enquanto aqueles cujas

cargas negativas são fornecidas pelas carboxilas necessitam de uma imersão em

solução de acetato de sódio 0,2M pH 5,8 (NEWTON et al, 1974) apresentando

então, uma coloração roxa avermelhada como descrita por McCULLY, (1965).

3.4.1.2. Análises químicas

3.4.1.2.1. Determinação dos polissacarídeos totais

A quantificação dos açúcares totais foi realizada pelo método do fenol/ácido

sulfúrico de acordo com DUBOIS et al., (1956), empregando-se como padrão L-

galactose como monossacarídeo padrão. As leituras foram realizadas a 490 nm.

3.4.1.2.2. Determinação de proteínas

O conteúdo de proteína foi determinado com o reagente de Croomassie blue

R segundo o método de SPECTOR, (1978) e a leitura realizada a 595 nm,

empregando-se como padrão albumina de soro bovina.

3.4.1.2.3. Determinação de sulfato

O teor de sulfato total foi determinado, após hidrólise ácida (HCl 6N, 6 horas,

100ºC), por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (DODGSON, PRICE, 1962).

O sulfato de sódio (1 mg/ml) foi utilizado como padrão sendo submetido às mesmas

condições das amostras em estudo.

3.4.2. Espectroscopia de Infravermelho (IV)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotômetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104, de 4000 a 400 cm

-1

. Os polissacarídeos (5 mg) foram

analisados após secagem sob a forma de pastilha de KBr.

As análises foram realizadas no Departamento de Química da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte.

3.4.3. Ressonância Nuclear Magnética (RNM)

Os espectros da ressonância magnética nuclear foram obtidos a 80ºC

utilizando 10 mg das amostras. Elas foram dissolvidas em 0,5 mL de água deuterada

O) a 99,75% e todos os espectros foram obtidos a 60º C com supressão da água

por pressaturação. Todos os deslocamentos químicos foram relativos ao ácido

trimetilpropriônico.

As análises foram realizadas no Istituto Scientifico di Chimica e Biochimica G.

Ronzoni localizado na Itália.

3.4.4. Avaliação in vitro da atividade anticoagulante

3.4.4.1. aPTT – Tempo de tromboplastina parcialmente ativada

Foram colocadas em um tubo de ensaio e misturadas cuidadosamente, 9

partes de sangue humano colhido recentemente com 1 parte de citrato de sódio.

Esta mistura contendo o anticoagulante foi centrifugado a aproximadamente

1000g a fim de provocar a separação das partes líquida e sólida. O plasma obtido foi

então acondicionado em um tubo limpo e seco. Foram utilizados no ensaio 0.1 ml de

plasma e 0.1 ml de cefalina líquida (ativada com complexo Caolin). Os reagentes

foram homogeneizados e incubados por 3 min à 37ºC. Foi adicionado 0.1 ml de

Cloreto de cálcio aquecido à 37ºC. A leitura foi realizada em coagulômetro a fim de

se observar a formação ou não da rede de fibrina.

3.4.4.2. PT – Tempo de protrombina

O plasma foi obtido da mesma forma que mencionado no item 3.5.4.1.

Adicionou-se ao plasma 0.1 ml do reagente REPLASTIN (tromboplastina extraída do

cérebro de coelho). Incubou-se 0,1 ml de cloreto de cálcio 25mM à 37ºC e o tempo

de PT foi avaliado em um coagulômetro.

3.4.5. Edema plantar

Neste estudo foram formados 12 grupos (n=5):

x Carragenana Kappa 0,1%, 0,2%, 0,5% e 1%;

x Carragenana Lambda 0,1%, 0,2%, 0,5% e 1%;

x Carragenana Iota 0,1%, 0,2%, 0,5% e 1%.

Inicialmente, os animais foram anestesiados com éter. Em seguida, o edema

plantar foi induzido pela injeção subcutânea, na pata direita do rato, de 0,1 ml das

soluções dos grupos acima listados. O edema planar foi medido imediatamente

após a injeção e em intervalos de 1, 2, 3, 4, 8, 12 e 24h com um paquímetro, sempre

com o animal anestesiado. O grupo controle foi realizado injetando-se, na pata

esquerda do rato, 0,1 ml de solução salina (NaCl 0,9%) em todos os animais (de

todos os grupos). O edema será medido da mesma forma que nos grupos teste.

Para o cálculo da determinação do edema, considerou-se o valor do edema como

sendo a diferença entre o valor obtido nos grupos (pata direita) e o valor obtido no

controle (pata esquerda).

3.4.5.1. Análises histológicas

A região plantar das patas dos ratos foram seccionadas com vistas à

realização de lâminas histológicas. Logo em seguida, foram realizadas as fixações

dos tecidos seccionados com formol a 10% com a finalidade de evitar a destruição

das células por suas próprias enzimas (autólise) ou por bactérias. A desidratação e

outras etapas do tratamento teve como objetivo a extração da água dos tecidos pela

submersão dos mesmos em banhos com concentrações crescentes de etanol a 70%

até etanol absoluto. Este solvente foi então substituído por xilol, substância miscível

com o meio de inclusão. Desta forma, os tecidos tornam-se translúcidos, razão

porque essa etapa foi denominada diafanização ou clareamento. Por último, foi

realizada a inclusão dos fragmentos mergulhados em parafina. Os cortes teciduais

foram colocados em moldes retangulares, formando um bloco que foram

subseqüentemente seccionados por navalhas de aço do micrótomo de 2 a 3 µm e

colocados numa lâmina com adesivo especial denominado de organosilano

Posteriormente, foram realizadas as colorações hematoxilina e eosina (JUQUEIRA,

CARNEIRO, 2004).

3.4.6. Pleurisia

Neste experimento, foram formados 4 grupos (n=5):

x Controle – solução salina (NaCl 0,9%);

x Carragenana Kappa 1%;

x Carragenana Lambda 1%;

x Carragenana Iota 1%.

A indução de pleurisia por carragenanas foi realizada segundo CUZZOCREA

et al., 1998. Os ratos foram anestesiados com éter e submetidos a um incisão na

pele à nível do sexto espaço intercostal. Os músculos subjacentes foram dissecados

e 0,2 ml de solução salina (grupo controle) ou 0,2 ml de carragenana 1% (grupos

das carragenanas) foi injetada na cavidade pleural. Após 4h da injeção de salina ou

carragenanas, os animas foram sacrificados pela inalação de clorofórmio ou éter. A

cavidade torácica foi cuidadosamente aberta e a cavidade pleural foi lavada com 2

ml de solução salina contendo heparina (5 U/ml) e indometacina (10 Pg/ml). O

exudato juntamente com a solução usada para lavar a cavidade pleural foram

removidas por aspiração (seringa) e o volume total medido. O exudato que foi

contaminado com sangue, foi descartado. O volume do exudato foi calculado pela

subtração do volume de solução salina (2 ml) do volume total recolhido. Os

leucócitos presentes no exudato foram corados pela solução de Türck e então

contados na câmara de Neabauer.

3.4.6.1. Avaliação dos teores de Nitrato / Nitrito

A produção de nitrito e nitrato, um indicador da síntese de NO, foi medida no

exudato como previamente descrito (CUZZOCREA et al., 1998). Inicialmente, o

nitrato no exudato foi reduzido a nitrito pela incubação com a enzima nitrato redutase

(670 um/ml), na presença de NADPH (160 PM) à temperatura ambiente por 3h. Após

esse tempo, a concentração de nitrito foi medida pela reação de Griess, pela adição

de 100 Pl desse reagente para 100 Pl da amostra. A densidade ótica à 540 nm foi

medida usando-se um leitor de ELISA. As concentrações de nitrito foram calculadas

comparando-se a densidade ótica das amostras com soluções padrão de nitrito de

sódio preparado em solução salina.

3.5. Análises Estatísticas

Para a análise estatística do grupo controle e dos modelos experimentais de

inflamação foram utilizados os seguintes testes:

x Estatística de Bartlett para verificar a homogeneidade das variâncias, onde

um valor baixo de P indica que as populações são diferentes;

x Análise de variância (ANOVA one-way) - compara três ou mais grupos

definindo se a diferença entre os grupos é significativa (P<0,05);

x Teste de Tukey-Kramer, para determinar que grupos diferem entre os valores

obtidos para o grupo controle e os experimentais (comparações múltiplas);

x Teste de Kolmogorov e Smirnov - verifica se os dados formam uma

distribuição Gauseana.

Resultados e Discussão

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1.Caracterização química das carragenanas

4.1.1. Eletroforese em gel de agarose

As análises das carragenanas e outros hidrocolóides por muitos

pesquisadores foram realizadas por eletroforese e cromatografia em camada

delgada, usando uma variedade de materiais de suporte incluindo acetato celulose,

agarose, papel e gel de sílica. (SCHERZ, 1986; PECHANEK et. al., 1982). Nos

últimos dez anos o emprego de eletroforese capilar tem sido um método bastante

utilizado para a análise de carboidratos (NOVOTNY, 1977; NOVOTNY, SUDOR,

1993).

Neste trabalho utilizamos a eletroforese em gel de agarose como já descrito

no item 3.5.1.1. Como as carragenanas são dotadas de grupos sulfatos e estes têm

a capacidade de interagir com a diamina presente no tampão diaminopropano

acetato formando um complexo decorrente das interações entre as cargas negativas

dos grupos sulfatos e as positivas da diamina; esta forma de caracterização é

bastante satisfatória no estudo envolvendo carboidratos. Polissacarídeos acídicos,

como as carragenanas, podem ser identificados por apresentarem uma cor

metacromática característica, típica da interação com os grupos sulfatos, quando

reage com azul de toluidina. Analisando-se a Figura 3, observa-se que nas três

carragenanas há uma grande coloração nas origens e não se formaram bandas

típicas, fatos estes atribuídos a alta viscosidade dos compostos que impossibilita ou

dificulta a mobilidade no gel de agarose e a existência de mais de uma população de

Resultados e Discussão

polissacarídeos em cada carragenana. Além disso, verifica-se a maior coloração da

carragenana O, o que implica em uma maior quantidade de sulfato em relação as

outras duas carragenanas. Dado esse, que corrobora com a estrutura ideal para as

três carragenanas.

ȜȚ

FIGURA 3: Perfil eletroforético das carragenanas comerciais L, N, O (50 Pg de cada)

em gel de agarose, tampão PDA. OR - Origem.

Resultados e Discussão

4.1.2. Dosagens químicas

Existem diversos métodos para se quantificar os polissacarídeos em animais

e vegetais (ROBERTS, QUEMENER, 1999). Os métodos mais utilizados são os

métodos colorimétricos, que se baseiam na coloração destes polímeros frente a uma

série de reagentes como o azul de metileno (SOEDJAK, 1994), a orto-toluidina

(GRAHAM, 1972), entre outros. Todos eles avaliam-se a complexação de reagentes

(contendo orcinol, alfa naftol, resorcinol, dentre outros) com poliânions formando

complexos coloridos que podem ser quantificados por meio de leituras

espectrofotométricas.

Como os polissacarídeos analisados neste trabalho contêm baixo grau de

impureza nós resolvemos quantificá-los utilizando o método de DUBOIS et al.,

(1956) que quantifica açúcares totais. Pode-se observar na Tabela 2 que a

carragenana L apresentou maiores teores de polissacarídeos totais (64.98%),

seguido da carragenana O (61.2%) e da carragenana N (60,26%).

Outra determinação importante nestes compostos está relacionada com os

teores de sulfato, uma vez que estes grupos químicos são responsáveis por

inúmeras interações das carragenanas com proteínas e com outros carboidratos. Os

teores de sulfato nas três carragenanas apresentaram valores diferenciados (Tabela

2), sendo a carragenana O a mais sulfatada (33,38%), seguida da carragenana L

(27,2%), enquanto a carragenana N foi a que apresentou menor percentual de

sulfato (17,89%). Este resultado está de acordo com os citados na literatura, que

afirmam que os teores de sulfato estão compreendidos entre 15 e 40% (ROBERTS,

QUEMENER, 1999).

Resultados e Discussão

A Tabela 2 mostra ainda que a N-, L- e O-carragenanas apresentaram baixos

teores de proteínas (0,2, 0,1 e 0,1%), o que corrobora com o fato dos compostos

serem puros e, conseqüentemente, livres de contaminação com este nutriente.

TABELA 2: Composição química das carragenanas comerciais L, N e O.

Carrageenanas Proteína

Polissacarídeos Totais

(%)

Sulfato

0,2 60,26 17,89

0,1 64,98 27,2

0,1 61,2 33,38

a - SPECTOR, 1978

b - Pelo método DUBOIS et al., (1956).

c - Quantificado pelo método turbidimétrico de DOGSON, PRICE, (1962)

Resultados e Discussão

4.2.Espectroscopia de Infravermelho (IV)

A espectroscopia de infravermelho (IR) tem sido largamente usada na

caracterização das carragenanas

(STANCIOFF, STANLEY, 1969;

McCANDLES et al., 1973; McCANDLES et al., 1982; DAWES et al., 1977; WHYTE

et al., 1985; ROCHAS et al., 1986). É um método rápido, não destrutivo e requer

apenas pequena quantidade de amostra (5mg). As absorbâncias das bandas de

infravermelho revelam informações à cerca da presença ou não de alguns grupos

químicos. Isto é de fundamental importância não só na caracterização de alguns

grupos funcionais, como nas modificações químicas induzidas nos mesmos.

Os espectros de infravermelho das carragenanas comerciais

utilizadas neste trabalho, são mostrados na Figuras 4. Nos três espectros observam-

se bandas de absorção típica por volta de 1250 cm

-1

, que correspondem aos grupos

éster-sulfato e bandas de 1100-1000 cm

-1

características para os polissacarídeos

(TURQUOIS et al., 1996). Além disso, pode-se observar que as bandas mostraram-

se com traços nítidos (bem definidos), o que indica a presença reduzida de

impurezas nas carragenanas comerciais, fato que acontece com certa freqüência

com esse tipo de amostra.

Algumas bandas são utilizadas para diferenciação entre as carragenanas,

como, por exemplo: absorções na região 805-800 cm

-1

caracterizam um grupo

sulfato no C

da 3,6-anidrogalactose, que é típico da carragenana L; absorções na

região 820-810 cm

-1

caracterizam um grupo sulfato no C

da galctose, que típico da

carragenana O (TURQUOIS et al., 1996).

Resultados e Discussão

FIGURA 4: Espectro Infravermelho (400 a 4000 cm

-1

) das carragenanas

comerciais N, L e O.

Resultados e Discussão

A Tabela 3 traz os principais grupamentos químicos encontrados nos

polissacarídeos e em carragenanas, juntamente com suas respectivas bandas

típicas de absorção. Além disso, ela mostra, de forma simplificada, as bandas

encontradas nas três carragenanas comerciais utilizadas nesse estudo.

Observe nesta tabela que todos os grupamentos químicos observados nas

carragenanas em questão estão de acordo ou corroboram com as estruturas

apresentadas na Figura 1, indicando, mais uma vez, a ausência de outros

compostos ou de uma mistura de carragenanas.

Resultados e Discussão

TABELA 3: Bandas típicas, seus respectivos grupos funcionais e as ocorrências nas

carragenanas comerciais utilizadas neste estudo.

-1

Grupos funcionais Carragenanas Referências

3400-3000 O-H

N, L, O

2920 C-H

N, L, O

1380-1355 Sulfatos

N, L, O

1250-1230 O=S=O

N, L, O

B, D

1190 S=O

N, L, O

1125 Ligações glicosídicas

N, L, O

1080-1040 C-O + C-OH

N, L, O

C, E, F

1026 S=O in C2

1012 S=O in C6

1002 Ligações glicosídicas

N, L, O

970-965 Ligações glicosídicas

N, L, O

930 C-O-C (3,6-anidrogalactose)

N, L

A, D, E,G

900-890

Grupo C6 na E-D-galactose O

E, H

850-840 Grupo C4-O-S na galactose

N, L

D, E, G

830-825 C2-O-S na galactose

820-810 C6-O-S

D, E

805-800 C2-O-S na 3,6-anidrogalactose

A, D, E, G

705 Sulfatos em C4, galactose

N, L

615-608 O=S=O

N, L, O

580 O=S=O

, L, O

A – ROCHAS et al., 1986

B – BELTON et al., 1988

C – WILSON et al., 1987

D - JACOBSSON, HAGMAN, 1993

E - SEKKAL, LEGRAND, 1993

F – BELTON et al., 1989

G - SEKKAL et al., 1993

H - MATSUHIRO, RIVAS, 1993

Resultados e Discussão

4.3.Ressonância Nuclear Magnética (RNM)

A espectroscopia RNM tem fornecido grandes avanços para a elucidação de

estruturas e configurações de todos os tipos de macromoléculas biológicas

(ROBERTS, QUEMENER, 1999). A espectroscopia de RNM

C fornece

informações sobre todos os átomos de carbono da molécula e conseqüentemente a

estrutura dos polímeros analisados, não só de carboidratos como de outras

macromoléculas biológicas. (ZINOUM et al., 1993; McCANDLES, GRETZ, 1984).

Nos dias atuais, a espectroscopia RNM (tanto

H como

C) é uma das

principais ferramentas para determinação da estrutura química de amostras de

carragenanas (ROBERTS, QUEMENER, 1999; USOV, 1998).

Os espectros das carragenanas consistem, cada um, de 12 sinais,

correspondendo aos 12 átomos de carbono das duas unidades dissacarídicas

repetitivas (Tabela 4). Os dados desta tabela são organizados a partir de

comparações dos espectros das carragenanas com os espectros do metil-ȕ-D-

galactopiranose (GORIN, MAZUREK, 1975) e do metil-3,6-anidro-Į-galactopiranose

(BALZA et al., 1977), que são monômeros modelos para as unidades de

carragenanas.

Resultados e Discussão

TABELA 4: Deslocamentos químicos das unidades mais comuns das carragenanas

L, N e O.

Carragenanas Unidades C

Referência

G4S 104.7 71.72 80.98 76.25 77.00 63.49 A

DA 97.34 72.11 81.41 80.54 79.07 71.72 A

G4S 104.43 71.53 79.06 74.34 77.04 63.52 B

DA2S 94.29 77.15 80.04 80.55 79.29 72.02 B

G2S 105.61 79.61 77.99 66.35 76.51 63.45 A

D2S,6S 93.85 97.04 71.76 82.61 70.89 70.25 B

A - USOV et al., 2002

B - VAN DE VELDE, PEREIRA, ROLLEMA, 2004

No presente estudo, justifica-se o emprego da RMN no sentido de se

comprovar os tipos de polissacarídeos utilizados, pelos motivos já explicitados

anteriormente.

Apesar da viscosidade acentuada de alguns destes polímeros, os espectros

obtidos foram de boa qualidade, bem definidos e sem formação de perfis largos,

sugerindo que as amostras foram criteriosamente dissolvidas, como podemos

observar nas figuras 5, 6 e 7.

As espectroscopias de RMN das carragenanas utilizadas neste estudo

mostraram que todas elas apresentam uma região de carbonos anoméricos bastante

simples. A ressonância observada em 104,2 ppm corresponde ao C-1 da E-

galactose, o sinal químico observado a 96,8 ppm é atribuído ao C-1 da D-galactose

ligada a E-galactose 2S. Estes resultados são coincidentes com os obtidos para

Resultados e Discussão

carragenana N por NOSEDA (1994) e USOV et al., (2002) e podem ser observados

na Figura 5.

O espectro da carragenana O apresenta um sinal a 103,9 ppm atribuído ao C-

1 da E-galactose 2-sulfato ligada a 3,6 anidrogalactose redutora. Ainda, na região do

carbono anomérico foi observado um sinal de baixa intensidade a 101,9 ppm,

atribuído ao C-1 E-galactose 2-sulfato ligada a D-3,6 anidrogalactose 2-sulfato. Tais

dados corroboram também, com os obtidos por NOSEDA (1994) em estudos com

carragenanas. Neste mesmo espectro podemos observar um outro sinal a 93,8 ppm

sugerindo a presença de uma D-galactose redutora (Figura 6).

O espectro de

C da carragenana L (Figura 7) apresenta um sinal a 103,9

ppm e outro a 93,8 ppm. Estes sinais são decorrentes da presença no polímero de

E-galactose unida a 3,6–anidrogalactose.

Vale salientar que alguns sinais atribuídos a carragenana O por diversos

autores (FALSHAW, FURNEAUX, 1994; STORTZ et al., 1994) são diferentes dos

encontrados neste trabalho. Estas divergências são comuns segundo NOSEDA,

(1994) e decorrentes das diversas temperaturas utilizadas na RMN e as diferentes

massas moleculares dos polímeros.

Com a finalidade de simplificar o estudo das três carragenanas analisamos

apenas a região anomérica, uma vez que é ela que determina que tipos de unidades

constituem a molécula, logo, os demais carbonos são apenas utilizados como

ferramenta auxiliar (TURQUOIS et al., 1996).

Resultados e Discussão

FIGURA 5: Espectro de RMN de

C da carragenana Kappa.

FIGURA 6: Espectro de RMN de

C da carragenana Lambda.

Resultados e Discussão

FIGURA 7: Espectros de RMN de

C das carragenanas Iota.

Resultados e Discussão

4.4. Avaliação in vitro do efeito anticoagulante

A atividade anticoagulante das carragenanas comerciais N, L e O foram

avaliadas segundo os métodos aPTT e PT, como já descritos nos itens 3.5.4.1 e

3.5.4.2., utilizando-se para isto plasma humano de doadores saudáveis.

Os resultados obtidos no ensaio aPTT demonstraram que as carragenanas

em questão apresentaram baixa atividade anticoagulante na via intrínseca da

cascata de coagulação quando comparadas a heparina padrão, como pode-se

observar na Tabela 5.

As carragenanas N e L apresentaram atividade anticoagulante significativa

(132,3 e 240s, respectivamente) em uma concentração muito elevada (100 Pg/ml),

revelando um atividade muitas vezes inferior à heparina padrão e, pelo menos, cinco

vezes menor do que a carragenana O, que obteve o mesmo resultado da

carragenana L com uma concentração de 20 Pg/ml. Esses resultados estão de

acordo com os obtidos por HAWKINS, LEONARD, (1962) e HAWKINS, LEONARD,

(1963), onde a carragenana O foi a de maior atividade, entretanto esta atividade foi

quinze vezes menor do que a heparina padrão e, por outro lado, quatro vezes maior

do que a carragenana N.

Os resultados obtidos no ensaio PT só vieram confirmar os obtidos no aPTT,

ou seja, demonstraram que estes polissacarídeos possuem baixa ação

anticoagulante também na via extrínseca da cascata de coagulação quando

comparadas com a heparina.

As carragenanas N e L na concentração de 100 µg/ml apresentaram

coagulação nos tempos 31,07 e 30,5s, respectivamente (Tabela 6), valores esses

Resultados e Discussão

que estão muito aquém da heparina padrão (120s com apenas 5 µg/ml). No entanto,

a carragenana

foi, mais uma vez, a que apresentou maior efeito anticoagulante

(atingiu 120s com 20 µg/ml). Esses resultados também estão de acordo com a

literatura (HAWKINS, LEONARD, 1962; HAWKINS, LEONARD, 1963).

TABELA 5: Avaliação da atividade anticoagulante das carragenanas comerciais N, O

e L sobre a via intrínseca da cascata de coagulação (aPTT) comparando-as com a

atividade da heparina padrão.

Concentração (Pg)

0 5 10 15 20 40 60 100

Heparina padrão 34,3 240 240 240 240 240 240 240

Carragenana N

34,3 n.d.

n.d.

55,7 88,3 108,7 132,3

Carragenana O

34,3 47,87 70,7 116,8 240 240 240 240

Carragenana L

34,3 n.d.

n.d.

36,1 54,1 87,9 240

Todos os valores em segundos (s).

- não determinado.

TABELA 6: Avaliação da atividade anticoagulante das carragenanas comerciais N, O

e L sobre a via extrínseca da cascata de coagulação (PT) comparando-as com a

atividade da heparina padrão.

Concentração (Pg)

0 5 10 15 20 40 60 100

Heparina padrão 0 120 120 120 120 120 120 120

Carragenana N

0 n.d.

n.d.

16,93 23 25,33 31,07

Carragenana O

0 9,53 14,13 83,57 120 120 120 120

Carragenana L

0 n.d.

n.d.

25,4 25,53 27,87 30,5

Todos os valores em segundos (s).

- não determinado.

Resultados e Discussão

O fato dos resultados terem indicado a carragenana O como a de maior

atividade dentre as carragenanas se deve, provavelmente, ao maior conteúdo de

sulfato deste composto (SHANMUGAN, MODY, 2000), o que foi comprovado pela

eletroforese (Figura 3) e pela dosagem de sulfato (Tabela 2). Resultados

semelhantes foram encontrados com carragenana O extraída de Phyllophora

brodiaei e Grateloupia turuturu (EFIMOV et al., 1983), que demonstraram alta

atividade anticoagulante.

Entretanto, o conteúdo de sulfato, algumas vezes, pode não estar diretamente

relacionado com a atividade anticoagulante dessas moléculas (ANDERSON,

DUNCAN, 1965). Outros fatores devem ser levados também em consideração:

tamanho do polímero, e a presença de uma região pentassacarídica altamente

aniônica como é observado na heparina (LEVI, 2004).

O mecanismo de ação da atividade anticoagulante de carragenanas vêm

sendo bastante estudado (DI ROSA, 1972). Devido a sua alta viscosidade, as

carragenanas têm propensão à formação de agregados insolúveis com as proteínas

do plasma como o fibrinogênio. Logo, formas degradadas de carragenanas

produzem complexos solúveis com fibrinogênio em pH fisiológico (BJORK et al.,

1989). O mecanismo da atividade anticoagulante da carragenana é exibido via

inibição da trombina (KINDNESS et al., 1979), fato comprovado pela atividade da

carragenana O tanto na via intrínseca quanto na extrínseca (Tabelas 4 e 5). Estudos

com substratos cromogênicos revelaram que essa atividade antitrombina pode ser

mediada via AT-III (Antitrombina III), o mecanismo principal de atuação da heparina

(KINDNESS et al., 1979). Dessa forma, pode-se afirmar que a inibição da trombina

pelas carragenanas pode ocorrer diretamente (mecanismo desconhecido) ou

indiretamente via cofator II da heparina (HC-II).

Resultados e Discussão

4.5. Edema plantar

A indução da inflamação local pelas carragenanas é uma forma muito comum

de se avaliar a eficácia e os mecanismos de ação de alguns fármacos como: drogas

aintiinflamatórias não esteroidais (NSAID), tendo em vista que com o progresso da

inflamação, uma série de eventos passa a ocorrer como: a liberação acentuada de

bradicinina e histamina; o acumulo de liquido e células no local da inflamação

(FUJISAWA et al., 2005). Vale ressaltar que na fase inicial da inflamação (edema 0-1

h) não ocorre inibição do processo pelos NSAID, fato que remete a importância da

mensuração do que ocorre com o processo inflamatório por um pouco mais de

tempo (até 24h).

A injeção intraplantar da carragenana comercial N em ratos Wistar ocasionou

a formação de um edema máximo de 3,7 mm nos animais que receberam a

concentração de 1%, no tempo de 8h, em relação aos animais controle que

receberam solução salina. As concentrações 0,1, 0,2 e 0,5% apresentaram volumes

máximos do edema da ordem de 2,2; 2,75 e 2,85 mm após 2, 3 e 3h da aplicação da

carragenana, respectivamente (Figura 8).

A análise estatística desses grupos mostra que a diferença entre eles é

extremamente significativa (P<0,0001) quando comparado ao grupo controle. O

teste Tukey-Kramer avaliou a significância dos grupos dois a dois e o resultado foi

que apenas houve uma diferença significativa entre o grupo 1% e os demais grupos

(P<0,001 com relação ao grupo 0,1%; P<0,01 com relação ao grupo 0,2%; e P<0,05

com relação ao grupo 0,5%).

Resultados e Discussão

0.5

1.5

2.5

3.5

0123481224

Tempo (h)

Edema plantar (mm)

K 0,1 %

K 0,2 %

K 0,5 %

K 1 %

FIGURA 8: Edema plantar resultante da inflamação induzida por carragenana N.

Resultados e Discussão

Devido as diferentes características químicas destes polissacarídeos, as

carragenanas O e L tiveram também seus efeitos avaliados neste mesmo processo.

Os resultados mostraram que estas carragenanas apresentam, também, um forte

efeito indutor do processo inflamatório, conforme mostram as Figuras 9 e 10.

Observa-se na Figura 9 que a injeção intraplantar da carragenana comercial L

em ratos Wistar ocasionou a formação de um edema máximo de 4 mm nos animais

que receberam a concentração 0,2%, no tempo de 2h, em relação aos animais

controle que receberam solução salina, ao contrário das outras duas carragenanas

onde sempre o valor máximo foi observado na concentração máxima.

A análise estatística desses grupos mostra que a diferença entre eles é

extremamente significativa (P<0,0001) quando comparado ao grupo controle. O

teste Tukey-Kramer avaliou a significância dos grupos dois a dois e o resultado foi

que não há diferença significativa (P<0,05) entre nenhum dos grupos quando

comparados entre si, demonstrando que o efeito (produção do edema) provocado

pela carragenana L não depende da concentração.

Resultados e Discussão

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

0123481224

Tempo (h)

Edema plantar (mm)

I 0,1 %

I 0,2 %

I 0,5 %

I 1 %

FIGURA 9: Edema plantar resultante da inflamação induzida por carragenana L.

Resultados e Discussão

Como observado no edema induzido pela carragenana N, o edema induzido

pela O também teve seu valor mais elevado (3,6 mm) no grupo 1% nos tempos 1 e

3h (Figura 10).

A análise estatística desses grupos mostra que a diferença entre eles é

extremamente significativa (P<0,0001) quando comparado ao grupo controle. O

teste Tukey-Kramer avaliou a significância dos grupos dois a dois e o resultado foi

que não há diferença significativa entre o grupo 1% e o 0,1% (P<0,01) e entre o 1%

e 0,2% (P<0,05).

A análise realizada comparando-se as carragenanas em cada concentração

duas a duas, através do teste Tukey-Kramer, mostrou que na concentração 0,1%,

não há diferença significativa (P>0,05) entre as carragenanas N e O, mas existe

diferença (P<0,01) entre a L e as demais. Resultado semelhante observou-se para a

concentração 0,2%, onde só houve diferença entre a carragenana L comparada com

a N (P<0,05) e a O (P<0,05). Já nas concentrações 0,5 e 1% não foram observadas

diferenças significativas entre as carragenanas.

Resultados e Discussão

0.5

1.5

2.5

3.5

0123481224

Tempo (h)

Edema plantar (mm)

L 0,1 %

L 0,2 %

L 0,5 %

L 1 %

FIGURA 10: Edema plantar resultante da inflamação induzida por carragenana O.

Resultados e Discussão

4.5.1. Análise histológica

A análise das lâminas dos animais tratados apenas com solução salina

(animais controle) e coradas com HE mostraram pele e tecido sem anormalidades e

ausência de reação inflamatória (Figura 11-A).

As análises histológicas dos animais tratados com as carragenanas

demonstraram uma grande infiltração de células. Todas as carragenanas

provocaram injúria tecidual com grande infiltração de neutrófilos quando comparado

com os animais que receberam apenas solução salina (Figuras 11-B, 12-A e 12-B).

O recrutamento de neutrófilos para o tecido inflamado é decorrente da

liberação de citocinas e isto pode levar a destruição tecidual pela produção de

espécies reativas de oxigênio, enzimas e citocinas (CUZZOCREA et al., 1999).

As evidências obtidas, somadas neste trabalho sugerem que todos os tipos

de carragenanas possuem um grande potencial inflamatório, entretanto, como já

discutido no item anterior, as carragenanas N e O (1%) demonstraram uma

quantidade maior de infiltrado celular, uma vez que foram elas que ocasionaram o

edema maior nesse tempo (3h).

Resultados e Discussão

FIGURA 11: Análises histológicas das carragenana N na indução do edema eplantar

em ratos Wistar após 3h da injeção intraplantar. A - animais que receberam salina

(NaCl 0,9%); B - animais que receberam carragenana N (1%). HE X20.

Resultados e Discussão

FIGURA 12: Análises histológicas das carragenanas L e O na indução do edema

plantar em ratos Wistar após 3h da injeção intraplantar. A - animais tratados com

carragenana L (1%); B - animais tratados com carragenana O (1%). HEX20.

Resultados e Discussão

4.6. Pleurisia

A injeção intrapleural de carragenana é uma das formas de indução do

processo inflamatório e com o progresso deste processo ocorre a liberação de

células, as quais se tornam numerosas com o decorrer da inflamação (FUJISAWA et

al., 2005).

A injeção de 0.2 ml das três carragenanas na cavidade pleural dos ratos

Wistar provocou uma resposta inflamatória aguda, que é caracterizada pela

acumulação de exudato inflamatório nos respectivos ratos. A Tabela 7 mostra que o

volume do exudato para os ratos tratados com a carragenana L foi 1,52 r 0,051, para

os tratados com a O foi de 1,35 r 0,022 e 1,28 r 0,057 para os tratados com a

carragenana N. Esses resultados corroboram com os encontrados na literatura que

indicam volumes entre 1,4 e 1,6 ml, contudo, como já mencionado, não havendo

qualquer menção à cerca do tipo de carragenana utilizada nesses trabalhos.

A análise estatística desses dados mostra que eles são extremamente

significantes (P<0,0001) segundo a ANOVA. O teste Tukey-Kramer mostrou que a

diferença observada entre os grupos estudados e o grupo controle foi altamente

significativa (P<0,001), entretanto entre os grupos O e N não se observou

significância (P>0,05). Além disso, os dados distribuíram-se de forma Gausiana

(teste de Kolmogorov e Smirnov).

Resultados e Discussão

TABELA 7: Volume do exudato retirado da cavidade pleural após indução de

pleurisia pelas carragenanas comerciais L, N e O.

Volume do exudato (ml)

Solução salina

0,15 r 0,05

Carragenana L 1,52 r 0,051***

Carragenana N 1,28 r 0,057***

Carragenana O 1,35 r 0,022***

***P<0,001 comparado com o controle.

4.6.1. Teores de nitrito/nitrato

A injeção de carragenanas no espaço pleural induziu a inflamação nesta

região levando a infiltração de leucócitos na cavidade pleural. Esta cavidade foi

lavada e o líquido pleural foi utilizado para contagem de células e determinação de

NO (nitrato e nitrito). O exudato plasmático resultante foi heparinizado com o objetivo

de se quantificar os teores de leucócitos presentes no líquido pleural e quantificação

dos níveis de NO

/NO

. A inflamação pleural decorrente da ação destes

polissacarídeos mobilizou rapidamente sistemas alvos, afetando os linfonodos e

aumentando o número de leucócitos circulantes, bem como os presentes na

cavidade pleural.

Resultados e Discussão

A Figura 13 mostra os teores de nitrito/nitrato produzidos após administração

das carragenanas. Conforme esta Figura, as carragenanas provocaram resultados

significantes (P<0.001) quando comparados ao controle (solução salina), segundo

os testes ANOVA e Tukey-Kramer. A carragenana L gerou 63,478 r 2,580 nmol de

nitrato/nitrito, valor que está de acordo com o obtido na mensuração do volume do

exudato, uma vez que foi essa carragenana que provocou o maior aumento no

volume do exudato. Além disso, a quantidade de nitrato/nitrito foi duas vezes maior

em relação aos valores obtidos para as outras duas carragenanas: N (25,042 r 0,719

nmol) e O (33,172 r 0,887 nmol). Segundo o teste Tukey-Kramer, a variação entre

os grupos é altamente significativa (P<0.001).

Resultados e Discussão

Salina Kappa Lambda Iota

Nitrato/Nitrito (nmol)

***

FIGURA 13: Concentrações de nitrato/nitrito no exudato pleural 4 h após indução

das carragenanas nas cavidades pleurais de ratos Wistar. O controle deste

experimento foi realizado com a injeção de salina (NaCl 0,9%). Foram utilizados 6

animais por grupo. *** P < 0.001 vs. Salina.

Resultados e Discussão

Segundo MARZOCO et al., (2004), os neutrófilos tem também a propriedade

de infiltrarem no tecido pulmonar, estando esta infiltração, associada com a

peroxidação lipídica. A Figura 14 mostra que todas as carragenanas desenvolveram

pleurisia aguda, produzindo um exudato turvo contendo uma larga quantidade de

leucócitos polimorfonucleares (PMN) e a relação obtida na determinação de

nitrato/nitrito foi mantida: a L gerou a maior quantidade de células (4902 r 289,43 x

células), seguida pela O (4540 r 1133,2 x 10

células) e N (3666 r 436,38 x 10

células). Segundo as análises estatísticas (ANOVA e Tukey-Kramer), as

carragenanas produziram uma resposta significativa quando comparadas ao grupo

controle (P<0,01 para a N vs. Salina e P<0,001 para a L e O vs. Salina). Entretanto,

entre os grupos das carragenanas observa-se significância apenas entre as

carragenanas N e a L (P<0,05).

A análise dos dados da contagem de células e da mensuração do teor de

nitrato/nitrito mostrou que ambos se distribuem de forma Gausiana, segundo o teste

de Kolmogorov e Smirnov. Já o teste de Bartlett indicou valores de P=0,0482 e

P=0,0028, respectivamente, sugerindo que em ambos os casos houveram

diferenças significantes entre os grupos, ou seja, que os experimentos foram

eficazes ao que se propunham.

Estes resultados relacionados aos teores de nitrato/nitrito e a contagem de

células sugerem haver uma relação complexa entre a resposta inflamatória

ocasionada pelas carragenanas e as estruturas desses compostos, tendo em vista,

por exemplo, que a carragenana mais sulfatada (carragenana O) não apresentou

resposta satisfatória, indicando que o teor de sulfato não é um fator determinante.

Por outro lado, as carragenanas L e N possuem em sua unidade dissacarídica os

Resultados e Discussão

mesmos constituintes, entretanto provocaram respostas extremamente diferentes,

fato que pode ser atribuído ao teor de sulfato maior da carragenana L, que foi a que

apresentou a resposta mais satisfatória. Diante do exposto, fica claro a complexa

interação existente entre a estrutura e resposta resultante, sendo o teor de sulfato

apenas mais um dos fatores determinantes, juntamente com a conformação

espacial, interação com outras moléculas, dentre outros.

Resultados e Discussão

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Salina Kappa Lambda Iota

Número de células (x10

)

***

FIGURA 14: Contagem de leucócitos do exudato pleural após 3 h de indução

das carragenanas nas cavidades pleurais de ratos Wistar. O controle deste

experimento foi realizado com a injeção de salina (NaCl 0,9%). Foram utilzados

6 animais por grupo. ** P < 0.01 vs. Salina, *** P < 0.001 vs. Salina.

Conclusões

CONCLUSÕES

As análises estruturais confirmaram que as três carragenanas comerciais

utilizadas nesse estudo são satisfatoriamente puras e possuem estruturas

correlatas com as indicadas como ideais na literatura.

Já os testes biológicos demonstraram que as três carragenanas possuem

atividade inflamatória sendo, portanto, uma excelente ferramenta na avaliação da

eficácia de drogas antiinflamatórias. Contudo, essa atividade verificada ocorreu

de forma diferenciada entre as três carragenanas, sendo a carragenana L a que

apresentou melhores resultados tanto na indução do edema intraplantar quanto

na pleurisia, sendo assim a mais indicada nesse tipo de estudo.

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