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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
Estudo de polimorfismos de DNA dos genes de metaloproteinases de matriz como fatores de
risco da doença aterosclerótica coronariana
Vanessa Libreloto Dalepiane
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Diagnóstico
Genético e Molecular da Universidade
Luterana do Brasil para obtenção do Grau de
Mestre em Diagnóstico Genético e Molecular
Orientador: Dr. Daniel Simon
Canoas
2005
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Genética Molecular Humana do Programa de Pós-
Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular
da Universidade Luterana do Brasil,
subvencionado pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul
(FAPERGS) e Universidade Luterana do Brasil
(ULBRA).
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente, aos meus familiares, especialmente ao meu esposo pelo
apoio e incentivo contínuo durante esta caminhada.
Ao meu orientador que de forma responsável e compreensiva conduziu a realização
deste trabalho.
Aos professores do curso Mestrado em Diagnóstico Genético e Molecular pelos
conhecimentos adquiridos.
Aos bolsistas do Centro de Pesquisas Médicas pela colaboração prestada na realização
da pesquisa.
Enfim, a todos que, de uma forma ou de outra, contribuíram para a realização deste
trabalho.
4
ÍNDICE
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO................................................................................................................7
1.1. Aterosclerose....................................................................................................7
1.1.1. Conceito ....................................................................................................7
1.1.2. Constituintes..............................................................................................8
1.1.3. Patogênese.................................................................................................8
1.1.4. Fatores de Risco para Doença Aterosclerótica Coronariana.....................9
1.2. Metaloproteinases de Matriz (MMPs) .............................................................11
1.2.1. Conceito ....................................................................................................12
1.2.2. Estrutura e função .....................................................................................12
1.2.3. Classificação .............................................................................................13
1.2.4. Regulação da atividade das MMPs ...........................................................14
1.2.5. Ativação ....................................................................................................15
1.3. Metaloproteinases e aterosclerose....................................................................16
1.4. Evidências da ligação da atividade da MMP com ruptura da placa.................17
1.5. Polimorfismos nos genes das MMPs ...............................................................18
1.5.1. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-3 (estromelisina-1) ...........18
1.5.2. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-9 (gelatinase B) ................19
1.5.3. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-12 (metaloelastase)...........20
1.5.4. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-1 (colagenase-1) ...............20
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS................................................................................21
CAPÍTULO 2
Matrix metalloproteinase gene polymorphisms on angiographically assessed coronary
atherosclerosis.................................................................................................................... ......22
CAPÍTULO 3
DISCUSSÃO....................................................................................................................40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................44
5
RESUMO
A aterosclerose é a principal causa de mortalidade no mundo. As metaloproteinases de
matriz (MMPs) desempenham um importante papel na aterosclerose, patologia que está
intimamente relacionada com a maioria dos casos de doença arterial coronariana (DAC). No
presente estudo, nós testamos a hipótese de que polimorfismos nos genes das MMPs estão
associados com o risco de desenvolver DAC em uma amostra de brasileiros do Rio Grande do
Sul. Foram estudados polimorfismos funcionais na região promotora dos genes MMP-1,
MMP-3, MMP-9 e MMP-12 em 183 pacientes caucasóides submetidos à angiografia
coronariana. Destes pacientes, 67 (42%) não apresentaram alterações significativas nas
artérias coronarianas, constituindo o grupo controle, e 116 (58%) apresentaram DAC (grupo
de pacientes com DAC). Os polimorfismos –1607 1G/2G MMP-1, –1171 5A/6A MMP-3, –
1562 C/T MMP-9 e –82 A/G MMP-12 foram analisados através da reação em cadeia da
polimerase (PCR) seguida da metodologia de genotipagem específica para cada polimorfismo
através de clivagem com enzimas de restrição. Não foram observadas diferenças significativas
nas freqüências alélicas e genotípicas entre pacientes com DAC e indivíduos do grupo
controle. A análise haplotípica também não mostrou diferenças significativas entre pacientes e
controles. Observou-se uma diferença significativa na severidade da DAC, medida através do
número de artérias obstruídas, em pacientes homozigotos para MMP-1 1G/1G e indivíduos
homozigotos para o alelo 6A do polimorfismo do gene da MMP-3. Entretanto, após análise
multivariada tal diferença entre genótipos não foi mais estatisticamente significativa. Desta
forma, nossos resultados indicam que os polimorfismos estudados não têm impacto
significativo no risco ou severidade da DAC.
6
ABSTRACT
Atherosclerosis is one of the major causes of mortality in the world. Matrix metalloproteinases
(MMPs) play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis, the pathology
underlying the majority of coronary artery disease (CAD). In this study we tested the
hypothesis that variations in the MMP genes are associated with the risk to develop CAD in a
Brazilian Caucasian population of Rio Grande do Sul. Functional polymorphisms in the
promoter of the MMP-1, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 genes were analyzed in 183 subjects
submitted to coronary angiography. Of these, 67 (42%) had normal coronary arteries (control
group) and 116 (58%) had CAD (CAD patient group). The –1607 1G/2G MMP-1, –1171
5A/6A MMP-3, –1562 C/T MMP-9 and –82 A/G MMP-12 polymorphisms were analyzed by
PCR followed by restriction digestion. No significant differences in allele and genotype
frequencies were observed between CAD patients and controls. Haplotype analysis also did
not show differences between CAD patients and controls. There was a significant difference
in the severity of CAD, assessed by the number of diseased vessels, in MMP-1 1G/1G
homozygous subjects and in homozygous for the 6A allele of MMP-3 polymorphism.
However, multivariate analysis of the data showed that the differences between genotypes
were not statistically significant. Thus, our findings indicate that the MMP polymorphisms
have no significant impact on the risk and severity of CAD.
7
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares são o maior problema de saúde, não somente em nosso
meio, mas também em todo mundo, porque elas constituem-se na maior causa de mortalidade
e morbidade e são responsáveis por altos custos de assistência médica (Gus et al., 2002).
Conforme dados do Ministério da Saúde, cerca de 60% dos óbitos informados no país,
em 1998, foram devidos a três grupos de causas: doenças do aparelho circulatório (32,4%),
causas externas (14,9%) e neoplasias (14,0%), com pequenas variações em relação aos valores
de 1991. As doenças do aparelho circulatório ocupam o primeiro lugar das causas de óbito em
todas as regiões do país. Comparada com as outras regiões, a região Sul tem a maior
percentagem de mortalidade por doenças circulatórias, 35,4%. Taxas elevadas de mortalidade
por doenças do aparelho circulatório são decorrentes da grande incidência destas doenças na
população. Por sua vez, a incidência está associada à freqüência de fatores de risco, como
tabagismo, hipertensão, obesidade, hipercolesterolemia, diabetes, sedentarismo e estresse
(Ministério da Saúde, 2004).
As doenças arteriais cardíacas (DAC) são exaustivamente abordadas na literatura e são
responsáveis por mais mortes no mundo do que qualquer outro distúrbio. Embora qualquer
artéria possa ser afetada, a aorta, as coronárias e os vasos cerebrais são os principais alvos, e
desta forma o infarto do miocárdio e os aneurismas da aorta são as principais conseqüências
da doença (Robbins et al., 1994).
1.1. Aterosclerose
1.1.1. Conceito
A aterosclerose é uma doença vascular inflamatória causada por uma série de
processos, incluindo lesão endotelial, migração de células inflamatórias e reativação da
proliferação de células musculares lisas, processo no qual várias moléculas extracelulares
8
estão envolvidas (Ross, 1999). É uma patologia coronariana comum, causada por desordens
multifatoriais com fatores genéticos e ambientais. A herdabilidade é estimada em torno de 50
a 60%, mas as bases genéticas precisam ser melhores esclarecidas (Lusis, 2000).
A aterosclerose é um processo dinâmico, evolutivo, a partir de dano endotelial de
origem multifatorial com característica de reparação tecidual, sendo uma doença basicamente
das artérias elásticas e das artérias musculares calibrosas e médias (III Diretrizes Brasileiras
Sobre Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose, 2001). A lesão básica, o
ateroma ou placa fibrogordurosa, consiste em uma placa focal elevada no interior da íntima
que possui um núcleo lipídico (principalmente colesterol e ésteres) e uma capa fibrosa que o
recobre. Os ateromas distribuem-se esparsamente a princípio, mas tornam-se cada vez mais
numerosos à medida que a doença evolui, chegando por vezes a cobrir toda a circunferência
das artérias seriamente afetadas. Os ateromas ocluem as artérias pequenas comprometendo o
fluxo sangüíneo para os órgãos distais e causando lesão isquêmica; no entanto, são destrutivos
nas artérias calibrosas (Robbins et al., 1994).
1.1.2. Constituintes
A placa aterosclerótica contém tipicamente um núcleo rico em lipídeos cercado por
uma cápsula fibrosa constituída predominantemente de células musculares lisas e proteínas da
matriz extracelular. As principais proteínas de matriz na placa são colágeno tipo I e III,
proteoglicanos e elastina, sendo o colágeno 60% do total de proteínas (Katsuda e Kaji, 2003).
O conteúdo celular da lesão aterosclerótica contém macrófagos, que, entre outros fatores,
expressam um número de enzimas proteolíticas que têm influência na aterogênese e na
estabilidade da placa aterosclerótica (Braunwald et al., 2003).
1.1.3. Patogênese
A aterosclerose pode se desenvolver depois de rompimento endotelial, ativação e
agregação plaquetária, proliferação das células musculares lisas e remodelamento da matriz
extracelular (Katsuda e Kaji, 2003).
As primeiras alterações ultra-estruturais no processo de aterogênese são o acúmulo de
pequenas partículas de lipoproteínas na camada basal da artéria. O segundo evento na
9
formação do ateroma é o recrutamento e acúmulo de leucócitos, que tem um importante papel
na produção de substâncias que participam da aterogênese (Braunwald et al., 2003). Outro
processo na patogênese é a migração de células musculares lisas e sua proliferação na parede
do vaso sangüíneo. As células musculares lisas são cercadas por uma membrana, composta
primariamente por colágeno tipo IV, laminina e fibronectina. Além da replicação destas
células desempenhar um papel na aterosclerose, a sua morte também pode estar envolvida em
complicações da placa aterosclerótica (Blankenberg et al., 2003; Leskinen et al., 2003).
1.1.4. Fatores de Risco para Doença Aterosclerótica Coronariana
Vários fatores de risco para DAC foram identificados epidemiologicamente com base
na relação com a incidência de DAC (Robbins et al., 1994). Entre os fatores de risco mais
referidos estão sexo, idade, hipertensão, diabetes mellitus e dislipidemia. Fatores de risco
relacionados com o estilo de vida como obesidade, sedentarismo, dieta aterogênica e
tabagismo também estão envolvidos com a DAC (Izar et al., 2003). Além dos fatores de risco
clássicos, outros têm sido propostos a fim de explicar a incidência das doenças
cardiovasculares (III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da
Aterosclerose, 2001).
- Sexo/Idade: A idade avançada e o sexo masculino aumentam o risco de aterosclerose e
infarto do miocárdio e este risco aumenta a cada década de vida, sendo incomum em mulheres
pré-menopáusicas (Robbins et al., 1994). O efeito da idade nos exames laboratoriais de perfil
lipídico tem sido reconhecido a tal ponto que intervalos de referência distintos distinguem as
populações pediátrica, adolescente, adulta e geriátrica. Entre 15 e 55 anos há um progressivo
aumento dos níveis de colesterol total, com níveis bastante baixos em mulheres pré-
menopausa, talvez pelo efeito protetor dos estrógenos, quando comparadas com homens de
mesma idade. Isto talvez possa explicar a diferença de incidência em relação ao sexo e idade
(III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose,
2001).
- Dislipidemia: A dislipidemia é uma condição onde existem alterações (elevações ou
reduções) em pelo menos um dos lipídeos plasmáticos, e é um dos principais fatores de risco e
10
um dos principais alvos da terapêutica. Alterações nos níveis de colesterol, determinadas por
fatores genéticos, podem levar à aterosclerose prematura (Watkins, 2003).
- Hipertensão: Embora o mecanismo não seja bem claro, a hipertensão arterial acelera
inequivocadamente a aterogênese. Quanto maior a pressão arterial, maior o risco. Depois dos
45 anos de idade, a hipertensão é um fator de risco maior do que a hipercolesterolemia
(Watkins, 2003).
- Diabetes: Quando comparados aos não-diabéticos, os indivíduos com diabetes mellitus
apresentam um aumento na incidência de DAC. Isto está associado ao fato da hiperglicemia
causar um acúmulo de subprodutos envolvidos no dano vascular; além disto, os pacientes
diabéticos desenvolvem um comprometimento da função da musculatura lisa do endotélio,
como também a resistência insulínica produz um estado pró-trombótico. Outros fatores que
acompanham o diabetes como a hipertrigliceridemia, os baixos níveis de HDL-C, e os altos
níveis de LDL-C também contribuem para a aterogênese (Zellweger e Pfisterer, 2001).
- Tabagismo: O tabagismo está bem comprovado como fator de risco das doenças causadas
pela aterosclerose, sendo a causa de maior incidência de infarto do miocárdio em mulheres. O
tabagismo influencia a formação do ateroma através dos seguintes mecanismos: intensificação
de oxidação de LDL-C, redução de níveis de HDL-C, dificultando a vasodilatação da artéria
coronária, entre outras alterações de fatores hemostáticos e inflamatórios (Braunwald et al.,
2003).
- Fatores relacionados ao estilo de vida: Incluem: (1) insuficiência de atividade física
regular: os mecanismos pelos quais a atividade física regular diminui o risco cardiovascular
permanecem incertos, mas provavelmente envolvem efeitos favoráveis na pressão arterial, no
controle de peso, no perfil lipídico e na melhora da tolerância à glicose. Também melhora a
função endotelial, aumenta a fibrinólise e reduz a atividade plaquetária e a propensão para
trombose; (2) estilo de vida estressante: a estimulação adrenérgica do estresse mental pode
aumentar nitidamente as necessidades miocárdicas de oxigênio, agravando a isquemia
miocárdica, pode também causar vasoconstrição nas artérias coronárias ateroscleróticas.
Ainda permanece pouco esclarecido o efeito do estresse mental por si mesmo no
desenvolvimento de aterosclerose; (3) obesidade: estudos indicam que a razão cintura/quadril
é um indicativo independente de risco vascular; (4) uso de anticoncepcionais orais: associa-se
a um aumento da incidência de trombose intravascular, incluindo AVC (Acidente Vascular
11
Cerebral) e infarto do miocárdio. Sendo que estes efeitos são proeminentes entre as fumantes
(Robbins et al., 1994, Braunwald et al., 2003).
Em alguns indivíduos, entretanto, a DAC não está associada apenas com os fatores de
risco convencionais, sugerindo que outros fatores podem contribuir para esta patologia
(Shimokata et al., 2004). Fatores genéticos e inflamatórios, ambos, têm papel importante na
patogênese da aterosclerose e doença arterial coronariana. Estudos epidemiológicos têm
investigado a associação entre DAC e polimorfismos gênicos em moléculas inflamatórias,
como fator de necrose tumoral (TNF), interleucinas (IL-1 e IL-6), receptor de
lipopolissacarídeo (CD14) e moléculas de adesão de plaquetas (PECAM-1) (Auer et al., 2003;
Humphries e Morgan, 2004).
Estudos em gêmeos, irmãos e familiares têm mostrado importantes evidências de
herdabilidade, mas os genes envolvidos não foram claramente identificados. Alguns
pesquisadores têm reportado que indivíduos com maior espessura da parede das artérias
coronarianas apresentam variantes de genes relacionados com o metabolismo lipídico (lipase
hepática, ApoE, CETP, e PON1) e a deposição de matriz (MMP-3) (Humphries e Morgan,
2004; Manolio et al., 2004).
1.2. Metaloproteinases de Matriz
O remodelamento vascular é uma característica chave da aterogênese e os genes
envolvidos neste processo são candidatos para a determinação do risco de desenvolver a
doença aterosclerótica coronariana. A família das metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus
inibidores contribuem para o crescimento da placa aterosclerótica. Além disso, a degradação
da matriz extracelular está envolvida na estabilidade da placa, e a degradação excessiva pode
predispor à ruptura da placa e assim aumentar o risco de infarto do miocárdio (Humphries,
2003).
A estabilidade da placa aterosclerótica depende da integridade da capa fibrosa. A
dissolução da matriz extracelular pelas MMPs, que são produzidas pelos macrófagos e células
12
musculares lisas, é um importante mecanismo que contribui para a ruptura da placa
aterosclerótica (Leskinen et al., 2003).
1.2.1. Conceito
As metaloproteinases de matriz são uma família de endopeptidades Zn
2+
dependentes
capazes de clivar componentes da matriz extracelular (Lijnen e Collen, 1999). Esta habilidade
de modificar a integridade do tecido é essencial para certos aspectos da fisiologia normal,
incluindo o desenvolvimento embrionário, a migração celular e a cicatrização (Nagase e
Woessner, 1999). As MMPs modificam a ativação de certas cascatas de sinalização celular, e
também contribuem para regulação da função plaquetária. A alteração ou ativação da
expressão das MMPs é uma característica de inúmeras condições patológicas, como
metástases tumorais, remodelagem vascular e cardíaca e certas condições reumáticas (Nagase
e Woessner, 1999). Recentemente, vários estudos têm evidenciado o papel das MMPs na
ruptura da placa aterosclerótica e conseqüente síndrome coronariana aguda (Jones et al.,
2003).
As MMP-1, MMP-3, MMP-9 estão presentes e enzimaticamente ativas na placa
aterosclerótica e foram associadas com a progressão e desenvolvimento da lesão
aterosclerótica (Galis et al., 1994).
1.2.2. Estrutura e função
As MMPs foram descobertas em 1962, em um esforço para estabelecer como ocorria a
metamorfose de girino para rã. Desde então mais de 66 MMPs, incluindo 20 MMPs humanas,
foram seqüenciadas. As MMPs são encontradas em muitos organismos, incluindo as mais
simples bactérias, sugerindo que estas enzimas vêm evoluindo há mais de 3,5 bilhões de anos
(Jones et al., 2003).
Muitas MMPs são sintetizadas e secretadas como pró-enzimas inativas. A maioria das
MMPs inclui um domínio pró-peptídeo específico e altamente conservado contendo uma
seqüência de cisteína que é capaz de ligar zinco ao domínio catalisador, assim tornando a
enzima inativa. O rompimento proteolítico do sítio Zn
2+
- cisteína remove o domínio pró-
13
peptídeo e ativa a enzima. Íons cálcio também são requeridos para a ativação da expressão da
atividade enzimática (Nagase e Woessner, 1999).
1.2.3. Classificação
As MMPs são divididas em colagenases, gelatinases, estromelisinas, matrilisinas,
metaloelastases e metaloproteinases de matriz tipo-membrana:
- Colagenases: Incluem as MMP-1, MMP-8 e MMP-13. Este grupo tem a habilidade de clivar
os colágenos tipo I, II e III. O sítio de clivagem nesta fibra colágena foi mostrado como sendo
Gly-Ile/Leu. Colágenos do tipo IV e V são completamente resistentes à atividade destas
colagenases (Tsukioka et al., 2002).
- Gelatinases: São compostas de MMP-2 e MMP-9. Estas enzimas são conhecidas por clivar
colágeno dos tipos IV,V, VII, X e elastina, bem como o produto de colágeno tipo I, II e III
depois da proteólise por colagenase (Ye, 2000; Pollanen et al., 2001; Tsukioka et al., 2002).
Pesquisas demonstraram que MMP-2 é também capaz de clivar o colágeno tipo I no mesmo
sítio que as colagenases intersticiais, contudo a MMP-9 não tem esta habilidade (Hahn-
Dantona et al., 2000).
- Estromelisinas: São compostas de MMP-3, MMP-10 e MMP-11. As MMP-3 e MMP-10
têm um espectro de atividade idêntico, mas a MMP-3 é mais potente. Seus substratos incluem
proteoglicanos, laminina, fibronectina, elastina, bem como regiões não helicoidais de
colágeno (Tsukioka et al., 2002; Humphries, 2003).
- Matrilisina: É composta pela MMP-7, a qual foi a primeira caracterizada em um carcinoma
retal. A MMP-7 tem maior atividade que outras MMPs contra proteoglicanos que são
particularmente abundantes na placa aterosclerótica e também degrada outros substratos
comuns às estromelisinas (Halpert et al., 1996). A MMP-7 é também menos suscetível aos
inibidores teciduais de MMPs (TIMPs) (Jones et al., 2003).
- Metaloelastase: representada pela MMP-12, tem atividade contra a elastina, mas também é
capaz de degradar outros componentes da matriz extracelular, incluindo proteoglicanos,
fibronectina, laminina, vitronectina, colágeno tipo IV e sulfato de heparan (Shapiro, 1999).
14
- Metaloproteinases de matriz tipo membrana (MT-MMP): São quatro grupos (MT-MMPs
1, 2, 3, e 4) que têm ação de degradação de gelatina, fibronectina, laminina, vitronectina, e
proteoglicano, e também são iniciadores de ativação de MMP-2. A MT1-MMP também tem
demonstrado atividade de clivagem dos colágeno tipos I e III (Jones et al., 2003).
1.2.4. Regulação da atividade das MMPs
A atividade das MMPs é regulada em três níveis: transcrição, ativação pós-
transcricional de zimogênios, e interação com seus inibidores. A chave da regulação das
MMPs é a transcrição, com exceção da MMP-2. A expressão do gene MMP é regulada pela
interação de fatores de transcrição, co-ativadores, e proteínas co-repressoras agindo em cis na
região promotora dos genes MMPs (Nagase e Woessner, 1999).
A ativação transcricional pode ser realizada por uma variedade de citocinas
inflamatórias, hormônios e fatores de crescimento, como interleucina-1β (IL-1β), interleucina-
6 (IL-6), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), fator de crescimento epidermal, fator de
crescimento de plaquetas (PDGF) e fator de crescimento de fibroblasto (Galis et al., 1995).
Outros fatores envolvidos incluem a proteína de choque térmico HSP60 de Chlamydia
pneumoniae, a qual induz o TNF-α e MMP-9; e CD40, que induz MMP-1, MMP-3, e MMP-8
(Herman et al., 2001). Insulina, por influência da proteína ativadora-1 (AP-1), tem um efeito
estimulatório na expressão da MMP-12 (Jormsjo et al., 2000). A hiperglicemia pode aumentar
a atividade da MMP-9 nas células endoteliais vasculares; entretanto, este efeito poderia ser
secundário ao aumento da insulina (Uemura et al., 2001). Foi demonstrado que a trombina
pode regular a produção de RNAm da MMP-2 e MMP-3 (Duhamel-Clerin et al., 1997).
Hipóxia prolongada, mais de 24 horas, resultou em um aumento da expressão do RNAm de
MMP-2 e oxidação de LDL –C aumentando a expressão de MMP-1, MMP-9 e MMP-14
(Ben-Yosef et al., 2002).
Vários fatores também são conhecidos por inibir a expressão dos genes de MMPs.
Alguns destes inibidores incluem indometacina, corticóide e interleucina-4 (IL-4) (Siwik et
al., 2000).
A transcrição dos genes das MMPs pode também ser modificada por variações na
seqüência da região promotora (Ye, 2000).
15
1.2.5. Ativação
Muitas MMPs são secretadas como precursores latentes (zimogênios) que são
proteoliticamente ativados no espaço extracelular, com exceção da MMP-11 e MT1-MMP,
que são ativadas intracelularmente (Kuzuya e Iguchi, 2003).
O mecanismo de ativação da pro-MMP-2 envolve formação de complexos na
superfície da célula com MT1-MMP e TIMP-2. Este processo pode ser mediado pela ligação
do domínio hemopexina da pro-MMP-2 o qual facilita o processo. Várias integrinas têm sido
mostradas por estar envolvidas neste processo, incluindo α2β1 e αVβ3 (Ellerbroek et al.,
2001).
Certas proteases, especialmente plasmina, têm uma contribuição muito importante na
ativação extracelular via cisteína. Dois fatores de coagulação, trombina e fator Xa, foram
relacionados à ativação da pro-MMP-2. Foi demonstrado que a MMP-3 pode ativar MMP-1,
MMP-7, MMP-8, MMP-9, e MMP-13. Uma vez ativado, MMP-7 pode também ativar pró-
MMP-1, MMP-9 e MMP-13, assim produzindo uma cascata na ativação das MMPs.
Similarmente, a MMP-2 ativa a pró-MMP-9 e foi demonstrado que MMP-12 ativa a pró-
MMP-2 e MMP-3 (Jones et al., 2003).
As atividades das MMPs são também reguladas por inibidores tissulares específicos,
que são conhecidos como inibidores tissulares de metaloproteinases de matriz (TIMPs). Os
TIMPs são secretados por uma variedade de linhagens celulares incluindo células musculares
lisas e macrófagos, e sua atividade é aumentada por fatores de crescimento (PDGF e TGF-β) e
diminuída por diferentes interleucinas, entre outros fatores (Lijnen e Collen, 1999).
1.3. Metaloproteinases de matriz e aterosclerose
Alguns estudos indicam evidências da influência das MMPs no processo aterogênico.
As atividades das MMPs podem contribuir para a patogênese da aterosclerose facilitando a
migração de células musculares lisas no espaço interno da lâmina elástica onde elas proliferam
e formam a placa aterosclerótica (Jones et al., 2003). Por outro lado, a atividade das MMPs
16
pode diminuir o volume da placa por degradação da matriz extracelular no seu interior
(Ardans et al., 2001).
Estudos usando manipulações genéticas em modelos animais têm sido realizados para
determinar qual a relevância das MMPs na progressão da aterosclerose (Silence et al., 2002).
Em um estudo com camundongos deficientes de TIMP-1 (nos quais a atividade das MMPs
estava aumentada), observou-se redução significativa do tamanho da placa aterosclerótica
(Silence et al., 2002). Em contraste, em outro estudo do mesmo grupo, camundongos
alimentados com uma dieta rica em colesterol durante 30 dias e deficientes de apolipoproteína
E (ApoE) ou com deficiência combinada de ApoE e MMP-3 mostraram aumento do tamanho
da placa na aorta (Silence et al., 2001). Estudos em artérias de camundongos “knockout” de
MMP-9 (deficientes em MMP-9) demonstraram a diminuição da hiperplasia da íntima e da
perda do lúmen, mas um acúmulo de colágeno intersticial (Galis e Khatri, 2002). Estes autores
especulam que a inibição da MMP-9 pode aumentar o mecanismo de estabilidade das artérias
por um aumento de seu conteúdo de colágeno e diminuição de perda do lúmen.
Sukhova et al. (1999) analisaram artérias com placas ateroscleróticas e artérias
normais em humanos e observaram que as placas ateromatosas têm níveis mais elevados de
MMP-13 e MMP-1.
Loftus et al. (2000), em um estudo em humanos, demonstraram que os níveis de
MMP-9 são maiores naqueles pacientes que possuem placas ateroscleróticas instáveis. Dados
obtidos de análises de segmentos arteriais ateroscleróticos de pacientes após 24 horas do óbito
revelaram que a MMP-2 e a MMP-9 estão aumentadas nos segmentos que sofreram
remodelamento arterial expansivo, ou seja, que apresentavam-se maiores que segmentos
adjacentes (Pasterkamp et al., 2000). Em contraste, um estudo com pacientes que
apresentavam lesão coronariana não observou alterações significativas na presença de MMP-2
e MMP-9 em coronárias com remodelamento expansivo (Schoenhagen et al., 2002). Contudo
estes autores observaram um aumento da MMP-3 em coronárias com remodelamento positivo,
demonstrando que as MMPs podem também facilitar o remodelamento da parede da artéria
através da digestão da lâmina elástica externa.
Análises realizadas em porcos, que sofreram injúria nas artérias coronarianas,
demonstraram que a MMP-9 participa também da formação do trombo pela ativação da
cascata da coagulação (Morishige et al., 2003).
17
Nem todos os dados clínicos são consistentes a respeito das MMPs e a extensão da
aterosclerose. Noji et al. (2001) investigaram os níveis circulantes de MMPs em pacientes
japoneses com aterosclerose coronariana prematura. Níveis plasmáticos de MMP-9 foram
significativamente maiores nos pacientes com DAC do que nos indivíduos do grupo controle
(indivíduos sem DAC). Porém, pacientes com DAC apresentaram níveis menores de MMP-2
e MMP-3.
1.4. Evidências da ligação da atividade da MMP com ruptura da placa
Há evidências sugerindo que a Síndrome Coronariana Aguda pode ser influenciada
pela ação das MMPs degradando a capa fibrosa. A força elástica da cápsula fibrosa que
protege a placa contra o rompimento é devido ao colágeno tipo I e III; entretanto, ela também
contém elastina e proteoglicanos. O acúmulo de macrófagos na lesão aterosclerótica está
correlacionado com aumento da liberação local de MMPs e uma cápsula fibrosa fina (Burleigh
et al., 1992).
Os dados existentes fornecem evidências da ação das MMPs na ruptura da placa.
Brown et al. (1995), analisando pacientes com angina instável (ruptura recente da placa
aterosclerótica) demonstraram um aumento de 70% da MMP-9 intracelular, indicando síntese
ativa, comparada com pacientes com angina estável (sem isquemia aguda).
A atividade das enzimas MMP-1 e MMP-13 mostraram-se aumentadas em um estudo
de endartectomia carótida de pacientes com placas ateroscleróticas (Sukhova et al., 1999). As
metaloproteinases MMP-7 e MMP-12 têm um importante papel na ruptura de placas
aterosclerótica (Herman et al., 2001). Foi reportada a expressão de MMP-8 em células do
endotélio vascular, células musculares lisas, e macrófagos. Além do mais, a atividade está
mais aumentada nas regiões da placa ateromatosa que são mais vulneráveis a ruptura (Herman
et al., 2001). No grupo das colagenases intersticiais, a MMP-8 tem maior atividade contra o
colágeno tipo I (maior responsável pela força elástica da fibra da placa) e tem sido encontrada
aumentada em regiões da placa ateromatosa (Herman et al., 2001). A MMP-3 é expressa por
células da placa, mas não por células normais da artéria (Galis et al., 1995). A MMP-11 tem
sido demonstrada em placas ateroscleróticas, com papel na destruição da matriz extracelular,
18
ação na cascata da coagulação e atividade fibrinolítica. A MMP-14 juntamente com a MMP-2
foi localizada na placa em regiões ricas em lipídios (Schonbeck et al., 1999).
1.5. Polimorfismos nos genes das MMPs
A ocorrência de polimorfismos de DNA tem sido estimada, em média, de um em 1000
pares de bases ao longo do genoma humano. Aproximadamente 90% dos polimorfismos de
DNA são polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs), resultado de uma simples
substituição de base. Além dos SNPs, há polimorfismos do tipo minissatélites e microsatélites
que resultam de variação no número de repetições in tandem de seqüências de DNA. A
maioria dos microssatélites ocorrem como seqüências de dinucleotídeos, tal como repetições
(CA)n. Geralmente, os SNPs são bi-alélicos e os microssatélites são multi-alélicos (Ye,
2000).
Embora a maioria dos polimorfismos de DNA seja provavelmente neutra, uma
proporção deles pode mostrar efeitos alelo específico na regulação da expressão do gene ou na
função da proteína codificada, podendo resultar em diferenças nas características fenotípicas
entre os indivíduos, tais como suscetibilidade para doenças. Conforme Ye (2000) e Lamblin et
al. (2002) variações naturais nos genes de MMPs humanas foram identificadas e pode estar
associadas com suscetibilidade e/ou progressão da aterosclerose, como também de outras
patologias.
1.5.1. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-3 (estromelisina-1)
A MMP-3 pode degradar uma variedade de proteínas da matriz extracelular e ativar
outros membros da família das MMPs, fazendo uma ligação entre a degradação e o
remodelamento da matriz extracelular (Schoenhagen et al., 2002). A MMP-3, assim como,
outras MMPs, são expressas na lesão da aterosclerose, sugerindo que tenha um papel no
remodelamento da matriz extracelular associado com a aterogênese. Além disso, análises por
hibridização in situ e imunocitoquímica demonstraram que a expressão de MMP-3 é
particularmente abundante nas áreas onde ocorre ruptura da placa aterosclerótica, apoiando a
hipótese de que a atividade desta MMP pode arruinar a estrutura e assim desestabilizar o
ateroma, tornando-o propenso à ruptura (Lamblin et al., 2002). A ruptura da placa
19
aterosclerótica é a causa mais comum de evento coronariano isquêmico como o infarto do
miocárdio. Além disso, há evidências sugerindo que a MMP-3 e algumas outras MMPs
contribuem para o desenvolvimento de aneurisma (Lamblin et al., 2002).
Um polimorfismo na região promotora do gene da MMP-3 foi descrito pela primeira
vez por Ye et al. (1996). O polimorfismo é devido a uma variação no comprimento da
seqüência de adeninas localizadas na posição – 1612, relativa ao sítio de início da transcrição,
resultando em um alelo que tem cinco adeninas (5A) e outro alelo que tem seis adeninas (6A).
Análises in vitro demonstraram que alelo 5A tem maior atividade promotora quando
comparado com o alelo 6A em fibroblastos e células musculares lisas vasculares (Ye et al.,
1996). Estudos revelam uma ligação diferencial de fatores de transcrição na região promotora
do gene MMP-3 dependendo do alelo presente na posição –1612 (Ye et al., 1996).
O polimorfismo 5A/6A no promotor do gene da MMP-3 foi analisado com relação a
sua influência em doenças coronarianas. Em um estudo em japoneses mostrou-se que
portadores do alelo 5A têm maior probabilidade de ruptura da placa aterosclerótica e isto foi
atribuído ao aumento da expressão da MMP-3 (Terashima et al., 1999). Por outro lado, a
presença do alelo 6A está associada com o crescimento acelerado do ateroma devido a
expressão diminuída da MMP-3 (Ye et al., 1996). Já em outro estudo realizado por Ye et al.
(2003) não foi encontrada uma associação entre este polimorfismo e o risco de doença
coronariana.
1.5.2. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-9 (gelatinase B)
Vários polimorfismos no gene da MMP-9 têm sido reportados, sendo um destes na
região promotora do gene na posição -1562 (Lamblin et al., 2002). Este polimorfismo é
devido a substituição de uma citosina por uma timina. Estudos in vitro mostram que esta
substituição resulta na perda de ligação de uma proteína nuclear para esta região no promotor
do gene da MMP-9, e um aumento na atividade transcricional em macrófagos (Ye, 2000).
A MMP-9 possui atividade proteolítica contra o colágeno tipo IV, que representa o
maior percentual de colágeno componentes da membrana do endotélio do vaso, e isto facilita a
migração vascular de células musculares lisas. Zhang et al. (1999) mostraram associação entre
o polimorfismo C-1562T e a severidade da aterosclerose coronariana, devido a maior
20
habilidade de migração das células musculares lisas durante a aterogênese em indivíduos
portadores do alelo T.
Morgan et al. (2003), em um estudo com indivíduos que realizaram angiografia,
verificaram que o alelo T do polimorfismo C-1562T foi encontrado com maior freqüência em
indivíduos com estenose coronariana do que em indivíduos normais.
1.5.3. Polimorfismo no promotor do gene da MMP-12 (metaloelastase)
O elemento AP-1 localizado a aproximadamente 70 pb upstream do início do sítio de
transcrição nos genes das MMPs tem um papel fundamental na regulação da transcrição.
Recentemente, um polimorfismo foi identificado imediatamente adjacente ao sítio AP-1 no
gene da MMP-12. O polimorfismo localizado na posição –82 é devido a uma substituição de
adenina por guanina, com o alelo A sendo mais prevalente. Estudos in vitro mostraram que
esta mudança tem efeitos na afinidade de ligação do fator de transcrição AP-1 e,
conseqüentemente, na atividade de transcrição do gene da MMP-12. O alelo A com uma
maior afinidade de ligação à AP-1, tem maior atividade transcricional em macrófagos
(Lamblin et al., 2002). Em um estudo angiográfico em europeus, o polimorfismo foi associado
com a DAC (Lamblin et al., 2002). Em outro estudo, também em europeus, com indivíduos
diabéticos o alelo A estava associado com um menor diâmetro do lúmen (Jormsjo et al.,
2000).
1.5.4. Polimorfismo no gene promotor da MMP-1 (colagenase-1)
Um polimorfismo resultante de uma inserção/deleção de uma guanina na posição –
1607 foi identificado no promotor do gene da MMP-1. Dois alelos foram detectados, um alelo
tem uma única guanina (1G) e outro tem duas guaninas (2G) no sítio polimórfico. Este
polimorfismo está relacionado com tumores e metástases (Ye, 2000).
Estudos in vitro mostraram que o alelo 2G tem maior atividade promotora
transcricional que o alelo 1G, e este aumento da atividade da MMP-1 no ateroma pode ser um
fator que contribui para a instabilidade da placa aterosclerótica. Também é especulado que o
aumento da expressão desta enzima nos estágios iniciais da aterogênese pode ser uma resposta
benéfica para o acúmulo de colágeno e ajude a deter a progressão da lesão (Ye et al., 2003).
21
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Devido às altas taxas de morbidade e mortalidade decorrentes da doença
aterosclerótica coronariana, as estratégias de prevenção primária e secundária incluem o
reconhecimento e os controle dos fatores de risco associados. Estudos epidemiológicos têm
revelado diversos fatores de risco genéticos e ambientais importantes associados à
aterosclerose. O crescimento da placa aterosclerótica ocorre através de mudanças estruturais
que levam à acumulação de células, matriz extracelular e lipídeos dentro da camada íntima da
artéria afetada. A importância dos eventos relacionados à degradação e reorganização da
matriz extracelular explica o interesse recente na participação de enzimas especializadas,
como as metaloproteinases de matriz, no remodelamento vascular. Um conceito emergente
postula que variações genéticas relacionadas aos genes das metaloproteinases de matriz
podem contribuir para a heterogeneidade da apresentação e história natural da aterosclerose.
Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a associação entre
polimorfismos de DNA nos genes das metaloproteinases de matriz MMP-1, MMP-3, MMP-9
e MMP-12 e o risco do desenvolvimento da doença aterosclerótica coronariana, através do
estudo de pacientes submetidos a cineangiocoronariografia.
A seguir, os dados do presente estudo são apresentados na forma de um artigo a ser
submetido à publicação na revista Clinica Chimica Acta.
22
CAPÍTULO II
Matrix metalloproteinase gene polymorphisms in patients with coronary artery disease
Este artigo refere-se ao estudo de polimorfismos de DNA da região promotora de
genes de metaloproteinases de matriz (MMPs) como fatores de risco para doença
aterosclerótica coronariana e será submetido à revista Clinica Chimica Acta.
23
Matrix metalloproteinase gene polymorphisms in patients with coronary artery disease
Running title: MMP polymorphisms and CAD
Vanessa L.N. Dalepiane
1, 2
, Daiane N. Silvello
3
, Crislaine A. Paludo
4
, Israel Roisenberg
4
,
Daniel Simon
1,3
1
Programa de Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular, Universidade Luterana
do Brasil (ULBRA), Canoas, Brazil;
2
Curso de Farmácia, Fundação Universidade de Cruz
Alta (UNICRUZ), Cruz Alta, Brazil;
3
Curso de Biologia, ULBRA, Canoas, Brazil;
4
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto
Alegre, Brazil.
Acknowledgements
Thanks to Dr. W.C. Manfroi for his help in recruitment of subjects for the study. Financial
support was provided by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul
(FAPERGS, grant 02/0198.2), and Universidade Luterana do Brasil.
Keywords: Matrix metalloproteinase, coronary artery disease, single nucleotide
polymorphism, atherosclerosis.
Corresponding author:
Daniel Simon
PPG Diagnóstico Genético e Molecular
Universidade Luterana do Brasil
Av. Farroupilha, 8001 – Prédio 22 – 5° andar
92425-900 Canoas, RS, Brazil
Fax: + 55 51 34771313
Tel: + 55 51 34779219
e-mail: [email protected]
24
ABSTRACT
Background: Matrix metalloproteinases (MMPs) play an important role in the pathogenesis of
atherosclerosis, the pathology underlying the majority of coronary artery disease (CAD). In
this study we tested the hypothesis that variation in the MMP genes influences the risk to
develop atherosclerosis.
Methods: Functional polymorphisms in the promoter of the MMP-1, MMP-3, MMP-9 and
MMP-12 genes were analyzed in 183 Brazilian Caucasian subjects submitted to coronary
angiography. Of these, 67 (42%) had normal coronary arteries (control group) and 116 (58%)
had CAD (CAD patient group). The –1607 1G/2G MMP-1, –1171 5A/6A MMP-3, –1562 C/T
MMP-9 and –82 A/G MMP-12 polymorphisms were analyzed by PCR followed by restriction
digestion.
Results: No significant differences were observed in allele and genotype frequencies between
CAD patients and controls. Haplotype analysis did not present differences between CAD
patients and controls either. There was significant difference in the severity of CAD, assessed
by the number of diseased vessels, in MMP-1 1G/1G homozygous subjects and in
homozygous for the 6A allele of MMP-3 polymorphism. However, multivariate analysis
showed that diabetes mellitus was the only variable independently associated to severity of
CAD.
Conclusion: Our findings indicated that the MMP polymorphisms have no significant impact
on the risk and severity of CAD.
25
1. Introduction
Atherosclerosis, the underlying pathology of coronary artery disease (CAD), is a
common, multifactorial disorder with both genetic and environmental components. Its
heritability is estimated to be 50-60%, but its genetic basis remains incompletely understood
[1]. Matrix metalloproteinases (MMPs) form a family of zinc-dependent enzymes with
proteolytic activity against connective tissue proteins such as collagen, proteoglycans, and
elastin [2]. Several lines of evidence have implicated MMPs in both atherogenesis and the
precipitation of acute coronary syndromes by regulating connective tissue remodeling, thus
determining the volume expansion of the atherosclerotic plaque, its stability, and the potential
for smooth muscle cell proliferation [3]. Previous studies have found that MMP-1 (interstitial
collagenase), MMP-2 (72-kD gelatinase or gelatinase A), MMP-3 (stromelysin-1), MMP-9
(92-kD gelatinase or gelatinase B) and MMP-12 (macrophage metalloelastase) are expressed
in atheroma at elevated levels compared with normal vessel wall [3,4]. These MMPs have the
capacity to degrade virtually all components of the extracellular matrix in the arterial wall
(collagens, elastin, proteoglycans, laminin, fibronectin, etc.). In view of the important role of
MMPs in the atherogenesis it has been hypothesized that genetic variation affecting the
expression of MMPs influences the susceptibility and progression of atherosclerosis [5].
Expression of MMPs is regulated primarily at the level of transcription, where the promoter of
the genes responds to different regulators [6]. Some functional polymorphisms were described
in the regulatory region of MMP genes [7]. Therefore, the aim of this study was to test if
polymorphisms in the promoter of MMP-1, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 genes are
associated with the risk to develop CAD in a Brazilian population of European descent.
26
2. Materials and methods
2.1. Study population
A total of 183 consecutive and unrelated Brazilian Caucasian individuals admitted for
routine angiography, for investigation of chest pain and/or suspected CAD were recruited for
the study at the Hemodynamics Service of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Rio
Grande do Sul, Brazil) as previously described [8]. Briefly, individuals with angiography-
proven ≥50% stenosis in a major coronary artery or one of their branches constituted the CAD
group (116 individuals) and those without angiographically significant lesion constituted the
control group (67 individuals). Excluding the ten subjects with >10 and <50% stenosis gave
identical results. All individuals completed a standard questionnaire concerning their personal
history and were recorded demographic and clinical data (Table 1). The studied population is
descended from Europeans, mainly from Portugal, Spain, Italy, and Germany [9]. The study
was approved by the Institutional Ethics Committee of the Universidade Luterana do Brasil.
All subjects gave written informed consent for a blood sample drawn for DNA extraction to
be used in studies approved by Hospital Ethics Committee.
Individuals reporting regular smoking during the last five years were considered to be
smokers. Hypertension was defined as present if mean blood pressure was higher than 140/90
mmHg, or if the patient was already under treatment with antihypertensive drugs at inclusion.
Diabetes mellitus was diagnosed as present if the fasting blood glucose level was ≥126 mg/dl
or if the individuals were on treatment with insulin or other antidiabetic agents at the time of
27
inclusion. Dyslipidemia was defined by levels of triglycerides ≥150 mg/dl, HDL cholesterol
<40 mg/dl and LDL cholesterol >100 mg/dl, or if the individual was receiving lipid-lowering
treatment at inclusion. Overweight or obesity was defined as BMI ≥25 kg/m
2
.
2.2. DNA analysis
High-molecular weight DNA was extracted from whole blood using a nonenzymatic
technique for DNA analysis [10] and amplified using polymerase chain reaction (PCR).
The –1607 1G/2G MMP-1 polymorphism was analyzed as described by Dunleavey et
al. [11]. The polymorphism is characterized by the presence of 1 guanine base (1G) or 2
guanine bases (2G). Carriers of the 2G allele seem to have higher MMP-1 activity than
carriers of the 1G allele [12] as well a reduced risk of coronary artery disease [13].
The –1171 5A/6A MMP-3 polymorphism was analyzed as described by Dunleavey et
al. [14]. The polymorphism is characterized by the presence of 5 adenine bases (5A) or 6
adenine bases (6A). Carriers of the 6A allele have lower MMP-3 expression than carriers of
the 5A allele [15] and a higher coronary atheroma growth [16-18].
The –1562 C/T MMP-9 polymorphism was analyzed as described by Morgan et al.
[19]. The polymorphism is caused by a single base change C→T. Carriers of the T allele have
higher MMP-9 transcriptional activity than carriers of the C allele [20] and a higher severity
of coronary atherosclerosis [19-21].
The –82 A/G MMP-12 polymorphism was analyzed as described by Zhang et al. [22].
The polymorphism is caused by a single base change A→G. Carriers of the A allele have
28
higher MMP-12 transcriptional activity than carriers of the G allele and a higher coronary
stenosis [23].
2.3. Statistical analysis
Allele frequencies were determined by direct count of the alleles. Departures from
Hardy-Weinberg equilibrium and differences between groups were evaluated by the chi-
square test. The quantitative variables were compared between groups using Student t test or
Mann-Whitney non-parametric test when indicated. Haplotype frequencies were determined
using the SNPAnalyzer computer software which employs an expectation-maximisation
algorithm [24]. The severity of coronary angiographic findings was assessed by multiple
logistic regression analysis in which the dependent variable was the number of diseased
vessels (single-vessel lesion and two or three-vessel lesion). The independent variable tested
were age, gender, body mass index, hypertension, hypercholesterolemia, diabetes mellitus,
smoking status, family history of CAD, and MMP genotypes. The p<0.05 was considered to
be significant.
3. Results
Clinical and demographic characteristics of the population study are summarized in
Table 1. No significant differences were observed between patients and controls for some
CAD risk factors (smoking, diabetes mellitus, hypertension and overweight/obesity), although
patients were significantly older and there were more males and dyslipidemics in the patient
group than in the control group.
29
Table 2 presents the allele and genotype frequencies of polymorphisms in CAD
patients and controls. The observed genotype frequencies were in Hardy-Weinberg
equilibrium in the total sample and in all subgroups. No significant differences were observed
in genotype frequencies between 116 CAD patients and 67 control subjects for any of the
polymorphisms analyzed.
Since the MMP-1, MMP-3 and MMP-12 genes are in the same chromosome cluster
location (11q22.3), haplotype analysis was undertaken. Haplotype frequencies estimated are
described in the Table 3. No significant differences were observed between CAD patients and
controls in regard to haplotype frequencies. The haplotype 1G 6A A (MMP-1, MMP-3 and
MMP-12), that carry the risk alleles, showed similar frequencies between patients and
controls.
To assess the influence of the MMP genotypes on the severity of coronary
atherosclerosis, we divided the CAD patients group in subjects with single-vessel lesion and
in those having two or three major epicardial coronary arteries with obstructions. The 116
CAD patients consisted of 40 subjects with one, 40 with two, and 36 with three significantly
diseased coronary arteries (>50% reduction in the luminal diameter). The number of patients
with two or more diseased vessels was significant higher in carriers of MMP-1 1G/1G
genotype than in carriers of 1G/2G and 2G/2G genotypes (p<0.05). It was also observed a
significant difference in the severity of CAD in carriers of MMP-3 6A/6A when compared
with subjects with 5A/6A and 5A/5A genotypes (p<0.05). No significant association was
observed between the MMP-9 and MMP-12 genotypes and CAD severity. To assess the
independent influence of MMP-1 and MMP-3 genotypes on the severity of CAD, an logistic
regression analysis was performed. After confounding variables were controlled for, diabetes
mellitus was the only variable independently associated to severity of CAD (p<0,05).
30
4. Discussion
In the present study we investigated the association between CAD and MMP
polymorphisms in the promoter region of four MMP genes. In our sample of Caucasian
Brazilian patients submitted to coronary angiography, no significant differences were
observed in genotype frequencies between CAD patients and control subjects for the
polymorphisms analyzed in all MMP genes studied.
A major contribution of a single gene would be very unlikely for a multifactorial
disease as CAD, where a large number of disease mechanisms results in one clinical endpoint.
Several gene polymorphisms of the matrix extracellular system are currently identified as risk
factors for atherosclerosis and/or acute coronary syndromes. We assessed the potential
association between CAD and functional polymorphisms of the MMP genes, on the basis of
their relevance in the pathophysiology of atherosclerosis. MMPs can be categorized into the
several groups, including collagenases (MMP-1), gelatinases (MMP-9), stromelysins (MMP-
3), and metalloelastases (MMP-12). MMP-1, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 genes all have
polymorphisms in their promoter regions associated with different transcriptional activity in
vitro. Further, three genes are located on the same chromosome allowing haplotype analysis
associating risk alleles. We did not accept the hypothesis that if different genes have a small
contribution, a combination of high-risk alleles would be less frequent in the control subjects.
Our results did not show significant association between haplotypes carrying risk-alleles and
CAD.
Several studies show that MMPs are associated with CAD, but studies with MMP
polymorphisms are relatively few and have controversial results. MMP-3 polymorphism is the
31
MMP genetic variant more studied in relation to atherosclerosis. The MMP-3 gene promoter
5A/6A polymorphism has been analysed in a number of genetic epidemiological studies and
there is consistent evidence for association of this polymorphism with CAD [16-18,25-27]. In
the present study, no association was observed between MMP-3 polymorphism and CAD, but
it was observed a significant difference in the severity of CAD in carriers of MMP-3 6A/6A
compared with subjects with 5A/6A and 5A/5A genotype. However, this did not remain after
the multivariate analysis.
Our results were not consistent with findings from three previous studies of CAD and
MMP-9 polymorphism, that found association between –1562T allele and coronary
atherosclerosis [19-21]. Although, some studies did not find association between MMP-9
polymorphism and the risk of CAD [28], and the risk of CAD and MI or the extent of CAD
[29]. However, Haberbosch & Gardemann [29] showed that patients with TT genotype had
higher extent of CAD than the other genotypes in subgroups of individuals with high
apolipoprotein B levels, high lipoprotein A and/or fibrinogen levels. This suggests that the
influence of MMP-9 genotypes on CAD can be modulate by complex interactions. On the
basis of the conflicting results of these studies, it is possible to assume that the MMP-9
promoter polymorphism can have some effect on CAD, but this influence may be slight and
perhaps restricted to some specific environment-genotype effect. On this way, some studies
show a smoking-genotype interaction in the risk of CAD in regard to MMP-3 polymorphism
[30-31], and MMP-12 polymorphism was associated with CAD in diabetic patients [23].
Only two studies were done with atherosclerosis and MMP-1 polymorphism, and
showed controversial results. Ghilardi et al. [32] found that the homozygosity for the 2G allele
in association with MMP-3 6A homozygosity predicts an increased risk of internal carotid
artery stenosis. On the other hand, Ye et al. [13] reported reduced risk of CAD in 2G
32
homozygous. In our study, we find that the number of patients with two or more diseased
vessels was significant higher in carriers of MMP-1 1G/1G genotype compared with 1G/2G
and 2G/2G genotypes.
In respect to MMP-12 polymorphism only one study related to CAD was carried out.
Jormsjo et al. [23] found that MMP-12 polymorphism influences coronary artery luminal
dimensions in diabetic patients with manifest coronary artery disease.
In the interpretation of our findings, some limitations must be considered. First, it
should be noted that the statistical power to detect differences in the present study may be
limited due to the small sample size of the control group. Second, this is a cross-sectional
study, and this kind of design might not be the best method in order to study CAD risk factors
and severity.
In conclusion, evidence for MMP gene variations as independent risk factors of CAD
could not be found in the present study. Our findings indicate that MMP gene polymorphisms
probably have no significant impact on the risk and extent of coronary heart disease in the
Brazilian Caucasian sample studied.
33
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37
Table 1. Clinical and demographic characteristics of CAD patients and controls
CAD patients
(n=116)
Controls
(n=67)
p value
Age (years)
62.5 ± 10.7 56.4 ± 11.7
0.001
Male gender 75.0 44.8 <0.001
Smoker (current or former) 31.9 28.3 0.63
Overweight/obesity 69.0 59.7 0.25
Hypertension 78.4 73.1 0.38
Diabetes mellitus 16.4 13.4 0.59
Dyslipidemia 44.0 26.9 0.02
Data are reported as percentages, except for age (years).
*p<0.05 compared to controls (unpaired Student t test for age, and χ
2
test for other data).
38
Table 2. Allele and genotype frequencies of MMP gene polymorphisms in CAD patients and
control subjects
Patients
(n=116)
Controls
(n=67)
p value
MMP-1 Allele 1G 115 (49.6) 62 (46.3) 0.54
–1607 1G/2G 2G 117 (50.4)
72 (53.7)
1G/1G 29 (25.0) 15 (22.3)
Genotype 1G/2G 57 (49.1) 32 (47.8) 0.82
2G/2G 30 (25.9) 20 (29.9)
MMP-3 Allele 5A 102 (44.0) 62 (46.0) 0.67
–1171 5A/6A 6A 130 (56.0)
72 (54.0)
5A/5A 23 (20.0) 12 (18.0) 0.52
Genotype 5A/6A 56 (48.0) 38 (57.0)
6A/6A 37 (32.0) 17 (25.0)
MMP-9 Allele C 206 (88.8) 113 (84.3) 0.21
–1562 C/T T 26 (11.2)
21 (15.7)
CC 92 (79.3) 46 (68.6)
Genotype CT 22 (19.0) 21 (31.4) 0.10
TT 2 (1.7) -
MMP-12 Allele A 197 (84.9) 118 (88.0) 0.40
-82 A/G G 35 (15.1)
16 (12.0)
AA 85 (73.3) 52 (77.6)
Genotype AG 27 (23.3) 14 (20.9) 0.67
GG 4 (3.4) 1 (1.5)
39
Table 3. Haplotype frequencies of MMP-1, MMP-3 and MMP-12 polymorphisms in CAD
patients and controls
Haplotype Patients Controls
MMP-1 MMP-3 MMP-12
1G 5A A 72 (31.0) 36 (26.9)
2G 6A A 56 (24.1) 34 (25.4)
1G 6A A 42 (18.1) 24 (17.9)
2G 6A G 30 (12.9) 12 (8.9)
2G 5A A 28 (12.1) 24 (17.9)
1G 6A G 2 (0.9) 2 (1.5)
2G 5A G 2 (0.9) 2(1.5)
40
CAPÍTULO III
DISCUSSÃO
Vários estudos têm demonstrado a influência de fatores genéticos no desenvolvimento
e progressão da DAC, além dos fatores de riscos convencionais. O conhecimento destes
fatores são importantes para o combate das doenças ateroscleróticas, através da prevenção,
como também o desenvolvimento de novas terapias. A dificuldade em estabelecer fatores de
riscos independentes para DAC é grande, em virtude de ser uma patologia multifatorial. Os
estudos realizados nesta área, têm uma contribuição importante, em virtude da DAC ser uma
doença altamente freqüente e responsável por altas taxas de morbidade e mortalidade.
Inúmeros genes estão sendo estudados a fim de verificar a existência de associação
com aumento de risco com a DAC. Vários destes genes exibem polimorfismos que podem
influenciar a aterosclerose (Auer et al., 2003; Humphries e Morgan, 2004).
Em nosso estudo, abordamos a relação entre a doença aterosclerótica coronariana e os
polimorfismos nos genes das enzimas metaloproteinases de matriz pelo fato de exercerem um
papel fundamental no remodelamento vascular.
As MMPs são proteinases inter-relacionadas que juntas podem degradar várias
macromoléculas da matriz extracelular, tendo um papel importante no remodelamento do
tecido conectivo durante o reparo tecidual, migração celular, angiogênese, morfogênese
tecidual e crescimento (Galis e Khatri, 2002). Estes processos fisiológicos requerem um
controle entre as MMPs e seus inibidores teciduais específicos. O rompimento deste equilíbrio
poderá desenvolver um estado patológico, como a aterosclerose. Além da aterosclerose, as
MMPs estão envolvidas na síndrome coronariana aguda, justamente por regular o
remodelamento tecidual, assim determinando o volume de expansão da placa aterosclerótica,
estabilidade e migração das células musculares lisas (Nagase e Woessner, 1999).
A regulação da expressão das MMPs é complexa e acontece em nível transcricional e
pós-transcricional. Este equilíbrio na regulação das MMPs pode ser rompido pela ocorrência
de variações na seqüência da região promotora dos genes das metaloproteinases. Estes
polimorfismos têm mostrado efeitos específicos na atividade transcricional destes genes,
influenciando no remodelamento vascular que é um fenômeno essencial no desenvolvimento
de placas ateroscleróticas (Zhang et al., 1999, Jones et al., 2003).
41
Em nosso estudo, procuramos abordar as metaloproteinases, abrangendo uma
representante de cada grupo, justamente pelo fato delas exercerem sua atividade em diferentes
substratos e portanto, poder influenciar de formas diferentes no processo de formação ou
ruptura da placa aterosclerótica. Conforme Jones et al. (2003), as MMPs exercem atividade
sobre vários componentes da matriz extracelular, a partir disto, elas são classificadas em seis
grupos: colagenases, que estão representadas em nosso estudo pela MMP-1(colagenase
intersticial) que exerce atividade de clivagem sobre colágeno I, II e III, embora a MMP-1
clive preferencialmente o colágeno tipo III; gelatinases, representadas pela MMP-9 (gelatinase
B) clivando colágeno IV, V, VII e X e elastina; estromelisina, MMP-3 (estromelisina-1),
tendo como substrato colágeno IV, V, IX e X proteinoglicanos, laminina, fibronectina,
elastina e regiões não helicoidais do colágeno, além do mais a MMP-3 ativa outras MMPs,
como, a MMP-1 e MMP-9; metaloelastases, onde estudamos a MMP-12 (elastase macrófago)
secretada pela ativação de macrófagos, ela possui atividade contra a elastina, fibronectina,
laminina, vitronectina, colágeno tipo IV, e sulfato de heparan; as matrilisinas e
metaloproteinases tipo-membrana são outro dois grupos de MMPs, dos quais não foi estudada
nenhum representante.
Como já visto, em alguns estudos as MMPs podem influenciar no processo de
formação da lesão aterosclerótica (Galis e Khatri, 2002, Izar et al., 2003; Humphries e
Morgan, 2004) . Uma das formas, é através da migração de células musculares lisas para a
lâmina elástica promovendo a formação da placa, esta é a maneira pela qual acredita-se que o
polimorfismo C/T na MMP-9 atue, pois ele aumenta a transcrição desta enzima, que por sua
vez, estimula a migração de células musculares lisas (Zhang et al. 1999). Outra forma, é
através de polimorfismos que diminuem a degradação da matriz extracelular na camada
íntima, permitindo o depósito de matriz e aumento da placa aterosclerótica, mecanismo pelo
qual o polimorfismo 6A da MMP-3 provavelmente atue, pois ele diminui a transcrição (Ye et
al., 1996). Este fato nos chama a atenção, pois demonstra que tanto a ativação ou inibição da
transcrição, dependendo em qual enzima isto ocorre, podem evoluir ambas para o
desenvolvimento e progressão da placa aterosclerótica, através de diferentes mecanismos.
No presente estudo não foi encontrada relação entre o polimorfismo 5A/6A e a
aterosclerose, embora a MMP-3 seja uma das metaloproteinases mais estudadas com diversos
estudos obtendo resultados significativos de MMP-3 como fator de risco (Humphries 2003).
42
Com relação a MMP-9, alguns estudos demonstraram relação com aterosclerose (Zhang et
al.,1999; Morgan et al., 2003), mas o nosso estudo não foi o único que demonstrou resultado
contrário. Wagner et al. (2004) em um estudo também com pequeno número de amostra
obteve mesmo resultado. Este talvez seja o motivo pelo qual, a MMP-9 não é ainda
considerada como fator de risco independente e por este motivo acha-se necessária a
continuidade dos estudos para se obter uma definição.
Com relação as MMP-1 e MMP-12 deve-se realizar estudos mais aprofundados para
estabelecer melhor quais são os alelos de risco e sua relação com o desenvolvimento de DAC,
pois os estudos realizados até o momento, como no caso da MMP-12 restringe-se a pacientes
diabéticos o que limita a sua generalização. Com relação a MMP-1, além do alelo de risco não
estar bem definido, temos poucos estudos relacionados especificamente com aterosclerose,
pois eles relacionam também com a evolução para infarto do miocárdio.
Pelo fato das MMPs exercerem atividades sobre diferentes substratos achou-se
interessante fazer este estudo com uma representante de cada grupo. Também é importante
ressaltar que a ação das metaloproteinases não é independente uma da outra, como é o caso,
da MMP-3 que ativa a pró-enzima MMP-1 e MMP-9, enquanto que a MMP-12 tem
demonstrado ativar a MMP-3 (Jones et al., 2003). Isto pode estar relacionado com o fato de
que um polimorfismo em uma das MMPs pode aumentar ou diminuir atividade não apenas da
enzima que apresenta o polimorfismo, mas também de outras enzimas, ou até mesmo, ter a
capacidade de neutralizar o efeito do polimorfismo de outras MMPs. Por este motivo
realizamos a análise combinada entre os diferentes polimorfismos para os genes localizados
no mesmo cromossomo (análise haplotípica). A importância da realização desta análise
combinada entre os polimorfismos nos genes das MMPs, também se deve ao fato da DAC ser
uma doença multifatorial. Contudo nossos resultados não demonstraram nenhum haplótipo de
risco.
Pelo fato desta complexidade de mecanismos e interações que ocorrem entre estas
enzimas, bem como a interação com outros polimorfismos e fatores convencionais, tornam-se
difíceis os estudos relacionando-as a patologias.
O presente estudo apresenta algumas limitações. A principal relaciona-se ao número de
pacientes, que em comparação com outros estudos da área, pode ser considerado pequeno. Isto
pode ser uma das explicações para os resultados de ausência de associação observados entre
43
polimorfismos e DAC. Contudo, alguns estudos da literatura foram realizados com números
amostrais semelhantes (p. ex., Berdeli et al., 2005). Outra limitação refere-se ao fato deste
estudo ser um estudo do tipo observacional, seccional cruzado. Este tipo de estudo pode não
ser o melhor visando estudar a severidade da DAC e estudos prospectivos são necessários para
confirmar os resultados obtidos. Entretanto, nosso estudo apresenta uma visão de uma amostra
de pacientes brasileiros com DAC, pesquisados seqüencialmente, em um determinado
momento da história natural da doença.
As perspectivas de continuidade deste estudo referem-se principalmente à análise de
um número maior de indivíduos e à análise combinada de outros polimorfismos nas mesmas
MMPs, como por exemplo no estudo de Morgan et al. (2003) em relação à MMP-9.
Finalmente, deve-se destacar que apesar do fato de que os polimorfismos estudados
não terem demonstrado relação com a progressão da doença aterosclerótica, isto não significa
que os mesmos não possam exercer outros efeitos, como interferir no desfecho (ruptura da
placa) e conseqüente infarto do miocárdio, e estar relacionado com as diferentes formas de
apresentação da DAC.
44
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