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Pontifícia Universidade Catolólica do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-graduação em Medicina
Área de concentração em Cirurgia
A EXPRESSÃO DO FATOR TECIDUAL NO ADENOCARCINOMA
COLO-RETAL: RELAÇÃO COM ANGIOGÊNESE E
ASPECTOS CLÍNICO-PATOLÓGICOS
Autor: Lúcio Sarubbi Fillmann
Orientador: Prof. Dr. Vinícius Duval da Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Gustavo Franco Carvalhal
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Medicina da PUCRS, área de
concentração em cirurgia, como requisito para
obtenção do título de Doutor.
Porto Alegre, maio de 2006
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Aos meus pais, Érico e Consuelo, por
terem proporcionado, ao longo de
minha vida, as condições para
realização de meus sonhos.
A minha esposa e filhas, Cláudia, Laura
e Gabriela, pelo apoio e carinho nesta
minha jornada científica.
A meu irmão e colega de trabalho,
Henrique, pelo exemplo de médico e
pesquisador.
4
Agradecimentos
• Ao Dr. Vinicius Duval da Silva, que tive o prazer de conhecer por ocasião do início
deste projeto e que se revelou um pesquisador exemplar, um incentivador nos
momentos de dificuldade e um grande amigo.
• Ao Dr. Gustavo Franco Carvalhal, meu amigo de longa data, pelas inestimáveis
sugestões, críticas e incentivo ao longo da execução deste projeto.
• Ao Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital São Lucas da PUCRS, pela ajuda
na obtenção do material de pesquisa.
• À Dra Ana Maria Geiger pelo auxílio em decifrar os enigmas da imunoistoquímica.
• Aos colegas de pesquisa em angiogênese, Dr. Marcelo Toneto, Dr. Eurico Dornelles
Neto, e Dra. Elinês Maciel pelo auxílio e companheirismo diante das dificuldades
encontradas na realização deste projeto.
• À Faculdade de Medicina da PUCRS pelo apoio ao meu desenvolvimento profissional
através do incentivo à realização deste projeto.
• Aos meus colegas de serviço, Dr Érico Fillmann e Dr Henrique Fillmann, pelo
incentivo e companheirismo durante meus longos períodos de ausência de minhas
atividades rotineiras.
5
Índice
Resumo........................................................................................................................................
7
Abstract.......................................................................................................................................
8
Introdução
Epidemiologia do câncer colo-retal.............................................................................................
9
Avaliação clínica e anátomo-patológica dos tumores colo-retais: dados relevantes para o
prognóstico...................................................................................................................................
11
Angiogênese tumoral: fisiopatologia e importância clínico-patológica......................................
17
Fator tecidual: funções fisiológicas e importância no desenvolvimento de neoplasias
malignas.......................................................................................................................................
26
Objetivos.....................................................................................................................................
38
Pacientes e métodos
Seleção dos pacientes e dos materiais utilizados........................................................................
39
Análise da expressão do fator tecidual.........................................................................................
40
Quantificação da densidade microvascular..................................................................................
42
Técnica de imunoistoquímica................................................................................................... 44
Análise estatística.........................................................................................................................
44
Aspectos bioéticos da pesquisa....................................................................................................
45
Resultados
Características da amostra estudada.............................................................................................
46
Expressão do fator tecidual..........................................................................................................
48
Relação entre a expressão do fator tecidual e a densidade microvascular...................................
49
Relação entre a intensidade da expressão do fator tecidual e fatores clínicos e anátomo-
6
patológicos na amostra.................................................................................................................
50
Discussão.....................................................................................................................................
54
Perspectivas de novos estudos envolvendo o fator tecidual e o câncer colo-retal................
60
Conclusão....................................................................................................................................
63
Lista de abreviaturas.................................................................................................................
64
Bibliografia.................................................................................................................................
65
7
Resumo:
A importância da interação entre o mecanismo de coagulação e o câncer é reconhecida
desde as descrições pioneiras de Trousseau. Mais recentemente, estudos demonstraram a
importância do fator tecidual, uma proteína de membrana celular ligada ao
desencadeamento da cascata da coagulação, na progressão de neoplasias malignas através
da estimulação do processo de angiogênese. Realizamos marcação imunoistoquímica para o
fator tecidual em 43 adenocarcinomas colo-retais de pacientes submetidos a tratamento
cirúrgico no Serviço de Coloproctologia do HSL-PUCRS e comparamos a intensidade da
sua expressão com a densidade microvascular, critérios de estadiamento, idade, sexo e
sobrevida geral. Oitenta e três por cento dos tumores
apresentaram alta expressão do fator
tecidual, havendo uma relação estatisticamente significativa entre esta e a maior densidade
microvascular (p=0,02). Observamos também que os pacientes com alta expressão do fator
tecidual apresentavam uma média de idade significativamente maior do que a dos pacientes
com baixa expressão desta proteína (p<0,01). Em conclusão, a elevada intensidade de
marcação imunoistoquímica para o fator tecidual se relacionou com uma média de
densidade microvascular mais elevada e com pacientes mais idosos quando comparados aos
casos com baixa expressão desta proteína.
8
Abstract:
Several reports recognize the interaction between malignant cell growth and coagulation
pathway. Recently, some studies suggested that tissue factor, a primary initiator of
coagulation, is expressed in a variety of solid tumors in association with increased
angiogenesis. We analyzed tissue factor expression in 43 colorectal carcinomas of patients
treated by surgery at our institution, comparing the results with microvascular density,
pathologic staging, gender, age, and overall survival. Tissue factor was intensely expressed
in 88,3% of the tumors and its expression was positively associated with increased
microvascular density (p=0.02). Patients with intense expression of tissue factor were
significantly older than the ones with lower expression of this protein (p<0.01). In
conclusion, the high intensity of tissue factor expression in colorectal carcinoma correlates
with tumoral angiogenesis and appears to be present in older patients.
9
Introdução
Epidemiologia do câncer colo-retal.
O adenocarcinoma colo-retal é uma das neoplasias malignas mais incidentes no ser
humano (1,2,3). No mundo inteiro, são esperados mais de 570.000 novos casos a cada ano
(2). Mais prevalente em países do hemisfério norte, esta doença representa uma importante
questão de saúde pública em nações desenvolvidas (1).
No Brasil, com o aumento da expectativa de vida associado à progressiva
industrialização, observamos que os tumores malignos, de uma maneira geral, crescem em
importância, ocupando, progressivamente, posições mais altas no perfil epidemiológico de
incidência e de mortalidade geral da população (1). Este é o caso do câncer de intestino
grosso e reto. Entre os brasileiros, os carcinomas colo-retais estão entre as cinco neoplasias
malignas mais freqüentes (2). Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) (4), os
números projetados para o ano de 2006 apontam uma taxa de incidência de 12 novos
casos/100.000 indivíduos/ano entre homens e de 15 novos casos/100.000 indivíduos/ano
entre mulheres. No Rio Grande do Sul, as taxas de incidência projetadas pelo INCA
indicam uma incidência significativamente mais elevada, com 27 novos casos/100.000
indivíduos/ano entre homens e 28 novos casos/100.000 indivíduos/ano entre mulheres. Em
Porto Alegre estas cifras são ainda mais significativas com 46 novos casos entre homens e
48 novos casos entre mulheres para cada 100.000 indivíduos no ano de 2006. Neves e
colaboradores (2), em uma análise dos dados epidemiológicos para o câncer de reto e
intestino grosso no período de 1980 a 1997, relataram que as taxas de mortalidade
apresentaram importantes diferenças regionais e entre capitais, observando-se índices mais
10
elevados nas regiões Sul e Sudeste, ainda que a tendência aponte para um aumento destes
números em todas as regiões do país. Para os autores, as regiões Sul e Sudeste, em
comparação com as demais, apresentam hábitos de vida que poderiam se associar mais
facilmente a um risco elevado de desenvolvimento do câncer colo-retal, como o baixo
consumo de fibras e o alto teor de lipídios na dieta, ingestão elevada de álcool e maior
prevalência de tabagismo(2).
11
Avaliação clínica e anátomo-patológica dos tumores colo-retais: dados relevantes para
o prognóstico.
Inúmeras são as variáveis consideradas na avaliação prognóstica dos
adenocarcinomas colo-retais. Tais dados, coletados a partir de informações clínicas ou
obtidos após estudo detalhado de espécimes cirúrgicos, são utilizados na definição da
indicação de tratamentos complementares e servem como base para uma estimativa das
possibilidades de cura da doença.
Diversas séries demonstraram vários fatores que estão associados a um melhor ou
pior prognóstico do câncer colo-retal. Philips e colaboradores (5), revisando dados de 2518
pacientes reunidos no Projeto Britânico do Câncer de Intestino Grosso relacionaram quatro
variáveis que apresentaram valor preditivo significativo na sobrevida em cinco anos destes
pacientes:
1) Profundidade da invasão das lesões na parede intestinal: pacientes com lesões
limitadas à submucosa demonstraram melhores taxas de sobrevida do que aqueles que
apresentavam tumores invadindo a muscular própria do intestino, e estes últimos
tinham também sobrevida superior aos casos com invasão transmural da parede
intestinal.
2) Ocorrência de invasão linfática da cadeia regional do intestino grosso.
3) Grau de diferenciação celular do tumor.
4) Identificação da invasão de vasos sangüíneos por células neoplásicas.
Os critérios de invasão da parede intestinal e a ocorrência de metástases em
linfonodos regionais compõem os aspectos mais relevantes do estadiamento anátomo-
patológico do câncer colo-retal (6). São reconhecidos como de importância prognóstica
12
desde os trabalhos de estadiamento descritos na classificação de Dukes, várias vezes
atualizada, bem como na classificação da American Joint Committee on Cancer (AJCC)
mais recente, a qual utiliza o sistema “tumor, node, metastases” (TNM) (6,7). Os
carcinomas de cólon e reto são subdivididos, neste último sistema, no que se refere à
invasão da parede do intestino, em: lesões limitadas à mucosa (Tis); aqueles com invasão
da submucosa (T1); os que atingem a muscular própria (T2); os casos que ultrapassam a
muscular própria do intestino e chegam à serosa ou a regiões não peritonizadas peri-
intestinais (T3) como no caso do reto; e, por fim, os que invadem estruturas adjacentes
(T4). Quanto à presença de metástases linfáticas, os tumores colo-retais se subdividem em:
metástases ausentes (N0); de 1 a 3 linfonodos pericólicos ou peri-retais envolvidos (N1);
quatro ou mais linfonodos peri-intestinais envolvidos (N2). Da mesma maneira que Philips
e colaboradores, diversos autores descreveram a relação entre o estágio da doença e a
sobrevida dos pacientes afetados pelo adenocarcinoma do cólon e reto. Lindmark (8), em
212 casos de tumores colo-retais, observou que o estágio clínico-patológico da doença foi a
variável mais fortemente relacionada à sobrevida, dentre outras avaliadas. Wiggers (9),
revisando dados patológicos de 350 pacientes com câncer de cólon e reto, encontrou uma
forte associação entre o estágio anátomo-patológico da doença e a sobrevida em 5 anos.
Jessup (10), em uma revisão sobre os fatores prognósticos nos tumores colo-retais, concluiu
que os determinantes clínico-patológicos mais significativos no resultado do tratamento
destas neoplasias são aqueles vistos no estadiamento patológico, ou seja, o grau de
penetração na parede intestinal e a ocorrência de metástases linfáticas. Steinberg (11), em
uma relação de 572 tumores colo-retais, considerou que o estágio da doença apresenta
grande relação tanto com a sobrevida em 5 anos quanto com a sobrevida livre de neoplasia.
13
Além do estadiamento anátomo-patológico, diversas características dos tumores
foram testadas com relação à sobrevida dos pacientes.
A relação entre a idade dos pacientes e as perspectivas de sucesso do tratamento do
câncer colo-retal tem se mostrado, na literatura, um ponto controverso. Wiggers e
colaboradores (9), revisando 350 pacientes portadores deste tipo de neoplasia, não
encontraram relação entre idade e sobrevida em cinco anos. Arbmam (12), investigando
596 pacientes operados por carcinoma do cólon e reto, também não encontrou relação entre
a idade no momento da cirurgia e a sobrevida dos indivíduos analisados. Violi e
colaboradores (13), em uma revisão de 1.256 casos de neoplasia de intestino grosso e reto,
não observaram relação entre a idade e a sobrevida a longo prazo dos indivíduos
submetidos a tratamento cirúrgico. Notaram que o número de óbitos foi maior no grupo de
maior idade, mas que tal fato ocorreu devido à maior freqüência de patologias
concomitantes nas faixas etárias mais elevadas. Por outro lado, Whittle (14) em um estudo
dos registros de 5586 pacientes tratados por câncer de cólon, observou que a sobrevida em
um ano dos indivíduos acima de 85 anos era de 65% em comparação com 85% para aqueles
com idade entre 66 e 69 anos. Na sobrevida em dois anos, os números diminuíam para 50%
e 75% respectivamente. A tendência para diminuição da sobrevida com o aumento da idade
foi significativa tanto para um ano quanto para dois. Da mesma maneira, Lindmark (8)
encontrou, em 212 casos de câncer colo-retal, uma associação entre a idade mais elevada e
um pior prognóstico oncológico. A questão não está definida, mas a tendência atual é a de
se supor que o prognóstico do câncer colo-retal não é pior para aqueles indivíduos mais
idosos (10). Por outro lado, os pacientes abaixo de 40 anos parecem apresentar um maior
risco de recorrência da doença, o que pode se dever tanto a um comportamento biológico
14
mais agressivo dos tumores, quanto a um atraso no início do tratamento na suposição de
que os sintomas referidos estejam relacionados a uma doença benigna (10).
No que diz respeito à localização da lesão primária, as evidências científicas
acumuladas até o momento mostram um resultado também conflitante entre as experiências
dos vários autores. Existem diversos relatos de que o carcinoma do reto apresenta um pior
prognóstico oncológico quando comparado aos tumores de cólon (6,10,15). A razão para tal
diferença pode se dever tanto a uma maior dificuldade na obtenção de margens mais amplas
e confiáveis em função das restritas condições de se intervir cirurgicamente na pelve (10),
quanto por um comportamento biológico distinto entre tumores do reto e lesões do cólon
(15). Philips e colaboradores, entretanto, não encontraram relação entre a localização
primária do tumor e a recorrência mais freqüente da doença em sua numerosa série de
pacientes (16). Wiggers (9) e Lindmark (8) também chegaram a essa mesma conclusão, não
encontrando diferença significativa nas taxas de recorrência entre tumores de reto e do
intestino grosso.
Analisando somente lesões colônicas, Eisenberg (15) demonstrou uma recorrência
mais freqüente da doença entre tumores do cólon esquerdo do que do cólon direito.
Steinberg (17), no entanto, analisando 572 pacientes com câncer de intestino grosso,
concluiu que a localização do tumor era de pouca importância prognóstica, não afetando a
sobrevida geral ou a sobrevida livre de doença. Wiggers (9) e Lindmark (8) chegaram a esta
mesma conclusão, não observando diferenças significativas quanto à sobrevida entre lesões
situadas no cólon esquerdo, direito ou transverso.
Com relação ao grau de diferenciação histológica, a literatura demonstra resultados
muito mais uniformes com relação a sua importância prognóstica do que o observado para
idade dos pacientes e localização primária do tumor no intestino. O grau de diferenciação
15
histológica foi relacionado à tendência de invasão linfática, à profundidade da invasão
tumoral na parede intestinal, à fixação a estruturas adjacentes e ao número de linfonodos
envolvidos (18). Saclarides (19), analisando os dados referentes a 62 pacientes com câncer
de reto, demonstrou que o grau de diferenciação celular guardava importante relação com a
possibilidade de metástases em linfonodos regionais. Wiggers (9) demonstrou um número
significativamente maior de óbitos relacionados à neoplasia naqueles tumores pouco
diferenciados em comparação com os de maior grau de diferenciação celular. Lindmark (8)
também demonstrou um pior prognóstico relacionado à pouca diferenciação dos tumores
colo-retais. Philips (5) e colaboradores colocaram o grau de diferenciação histológica como
uma das variáveis com maior influência na sobrevida em cinco anos dos pacientes tratados
por carcinoma do cólon e reto.
Outra variável já pesquisada foi a dimensão das lesões colo-retais. O tamanho dos
tumores foi muitas vezes relacionado a um melhor ou pior prognóstico tanto para a
ressecção quanto para a sobrevida geral dos pacientes (9,18). Steinberg e colaboradores
(11) não encontraram relação entre o tamanho dos tumores colo-retais e a sobrevida dos
pacientes quando o tamanho tumoral foi analisado como variável única. Entretanto, quando
ajustada para outros fatores relacionados à doença, a dimensão dos tumores de cólon e reto
se mostrou bastante significativa quanto ao prognóstico das lesões tratadas. Cohen (18)
observou que, nos tumores bem diferenciados e moderadamente diferenciados, 42% das
lesões com 4 cm ou mais invadiam toda a parede intestinal, em comparação a 12% daquelas
com menos de 4 cm. Além disso, 77% dos carcinomas definidos como pouco diferenciados
ou colóides e que tinham mais de 4 cm de tamanho invadiam toda a espessura da parede
colo-retal. Wiggers (9), por outro lado, observou que lesões de tamanho relativamente
grande (3,5 até 6 cm) apresentavam melhor sobrevida do que grupos de tumores maiores
16
(mais de 6cm ) bem como de lesões menores (menos que 3,5 cm). Wolmark (20), revisando
dados colhidos de 906 pacientes tratados por câncer colo-retal, não encontrou relação entre
o maior diâmetro dos tumores primários e a ocorrência de metástases linfáticas regionais. A
tendência atual na literatura especializada é de considerar o tamanho dos carcinomas colo-
retais como de pouco valor prognóstico (8), principalmente quando esta variável é
analisada isoladamente (11).
Por fim, a ocorrência de invasão vascular, principalmente invasão venosa, foi
amplamente demonstrada em tumores malignos de cólon e reto (9,19,21,22). Talbot e
colaboradores (21) observaram que a ocorrência de metástases hepáticas aumentou
significativamente naqueles pacientes com invasão de vasos sangüíneos adjacentes ao
tumor primário. O prognóstico foi ainda pior naqueles indivíduos em que a invasão ocorreu
em veias localizadas fora do limite da parede intestinal. Minsky e colaboradores (22)
também relataram um prognóstico adverso naqueles casos em que foi demonstrado
comprometimento dos vasos sangüíneos, principalmente quando a lesão envolvia vasos
extramurais. Shirouzu (23) observou um aumento significativo na recorrência local e no
surgimento de metástases hepáticas em pacientes que apresentavam invasão vascular peri-
tumoral, demonstrando também uma diminuição importante da sobrevida nestes casos.
Wiggers (9) relatou a ocorrência de comprometimento vascular em 93 de 329 tumores de
cólon e reto. Destes 93 casos, 48,4% apresentaram óbito relacionado à progressão da
doença, em comparação com 23,7% daqueles em que não havia invasão vascular.
17
Angiogênese tumoral: fisiopatologia e importância clínico-patológica.
A relação dos tumores malignos com o seu suprimento sangüíneo regional vem se
revestindo de importância cada vez mais significativa na literatura. Não só a invasão
vascular, mas a habilidade que as lesões adquirem de controlar o seu próprio aporte de
sangue constitui hoje motivo de atenção e pesquisa, e é o tema deste estudo.
Chamamos angiogênese ao processo de criação de novos vasos sangüíneos. Tal
mecanismo é observado fisiologicamente em inúmeras funções e fases de desenvolvimento
do organismo. Novos vasos são fundamentais no desenvolvimento dos tecidos normais, no
processo de reprodução e crescimento embrionário e na cicatrização de feridas (24). A
neovascularização, entretanto, também é um processo associado ao surgimento e ao
desenvolvimento de diversas doenças no ser humano. Dentre estas, o câncer tem sua
progressão e letalidade associadas à aquisição da habilidade de controlar seu próprio
suprimento sangüíneo, viabilizando assim o crescimento ilimitado e descontrolado que
caracteriza a doença (24,25).
Folkman (25) foi um dos pioneiros no estudo do controle, por parte das neoplasias
malignas, da proliferação de vasos sangüíneos adjacentes à lesão. A constatação de que a
freqüência de surgimento de tumores in situ observados em estudos de autópsia é
significativamente maior do que a de tumores malignos francamente invasores,
especialmente nas lesões de mama, tireóide e próstata, indica que a ocorrência de
disseminação sistêmica é um evento relativamente infreqüente (25). A incapacidade de
progredir como lesão neoplásica, segundo Folkmann, reside no fato de que tumores in situ
não adquiriram um fenótipo angiogênico que possibilitasse seu crescimento (25).
A teoria de desenvolvimento tumoral de Folkman baseia-se em vários aspectos.
Inicialmente, a maioria das lesões apresenta uma fase de aparente inatividade proliferativa
18
associada a um estágio praticamente avascular (25,26). A nutrição destas células depende
principalmente da difusão de nutrientes pelos tecidos adjacentes, o que limita seu tamanho
a aproximadamente 1 ou 2 mm (25,26). Em uma segunda fase, estes pequenos tumores
adquirem uma capacidade de recrutar células endoteliais de vasos sangüíneos normais do
tecido hospedeiro, formando novos capilares que circundam e posteriormente permeiam a
lesão, possibilitando o seu crescimento ilimitado (25,26). Esta habilidade de gerar
suprimento sangüíneo foi creditada à produção, por parte das neoplasias, de um agente
bioquímico inicialmente chamado de fator de angiogênese tumoral (26). Logo tornou-se
extremamente atraente a possibilidade de se criar uma substância com função bloqueadora
do fator angiogênico como forma de tratamento de tumores malignos, reconhecendo-se que
tal medida provavelmente reduziria a lesão a um tamanho em que o suprimento sangüíneo
não mais seria fundamental para a sobrevivência das células (1 ou 2 mm) (26). O câncer
não seria, portanto, erradicado, mas teria uma regressão sustentada enquanto o bloqueio
angiogênico fosse mantido (26). Estas hipóteses são a base teórica para o uso terapêutico de
drogas bloqueadoras da formação de vasos sangüíneos tumorais.
O primeiro alvo para um ataque bloqueador da angiogênese tumoral foi identificado
em 1984 por Shing e colaboradores (27) em amostras de um condrossarcoma, tendo sido
chamado fator básico de crescimento do fibroblasto. Apesar de seu uso em modelos
experimentais haver resultado no crescimento de capilares sangüíneos, esta substância não
parecia ser um agente de importância significativa. Foi com as descrições que se seguiram
de um novo agente associado à permeabilidade vascular e à angiogênese, inicialmente
chamado de fator de permeabilidade vascular e, posteriormente, de fator de crescimento do
endotélio vascular (vascular endothelial growth factor,VEGF), que se obteve uma
substância com representatividade clínica significativa e alvo de medidas terapêuticas (28).
19
O VEGF é possivelmente o mais potente agente angiogênico conhecido (29). Sua
presença aumenta a permeabilidade vascular e constitui importante estímulo para a mitose
de células endoteliais (26,29,30). Em situações de hipóxia, é possível observar um aumento
significativo dos níveis de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm) para VEGF, bem como
da proteína resultante (26,29,30). Outros agentes biológicos parecem interferir na produção
de VEGF: as interleucinas 1, 6 e 8; o fator de crescimento derivado de plaquetas; o fator de
crescimento de hepatócito; o fator beta de crescimento de fibroblastos; e os fatores de
crescimento transformadores (TGFs – “transforming growth factors”) (30).
Uma vez havendo sido identificadas algumas das fontes do estímulo angiogênico, a
próxima descoberta significativa foi a correlação entre o grau de neovascularização tumoral
e o prognóstico adverso observado em vários tipos de lesões malignas (26). Neste campo de
estudo, os achados pioneiros de Weidner (31) são o ponto de partida para a correlação entre
a densidade de microvasos tumorais e o comportamento clínico destas lesões. A
vascularização tumoral, segundo este autor, é quantificada através da aplicação de método
imunoistoquímico para antígenos presentes em células endoteliais como o CD31, CD34 e o
fator VIII (fator de von Willebrand). Os vasos corados pelo método são então contados em
microscopia de grande aumento nas áreas de maior concentração vascular, os chamados
“hot-spots”. Usando esta metodologia, Weidner e colaboradores (31) analisaram dados de
49 pacientes com carcinoma de mama invasor. Os resultados demonstraram que a
contagem de microvasos foi significativamente maior no grupo de pacientes que
desenvolveram doença metastática, seja sistêmica ou axilar, sugerindo que a densidade
microvascular poderia ser um fator preditivo independente para desenvolvimento de
metástases a partir de neoplasias malignas de mama.
20
Desde então, esta metodologia foi utilizada para avaliar a neovascularização de
diversos tipos de lesões neoplásicas, bem como a sua relação com o prognóstico dos
pacientes tratados.
É possível encontrar estudos relacionando a densidade microvascular (DMV) com
inúmeros tumores de diversos sistemas. Uma revisão neste sentido nos mostra que o
significado clínico deste parâmetro de quantificação da angiogênese tumoral apresenta
ampla variação quanto a sua importância prognóstica.
Em tumores de cabeça e pescoço, por exemplo, os estudos recentes apresentam
resultados conflitantes. Cantu de Leon e colaboradores (32), avaliando 118 pacientes
portadores de carcinomas do tipo epidermóide da região cervical, encontraram correlação
entre DMV elevada e recorrência tumoral nos casos identificados como estágio II e em
pacientes com idade inferior a 40 anos. Em lesões de estágio clínico mais avançado,
entretanto, os autores não encontraram relação entre a DMV e o prognóstico. Garcia de la
Torre e colaboradores (33), avaliando lesões proliferativas de paratireóide, observaram que
a DMV estava aumentada em adenomas, mas que este dado não se relacionava com o
comportamento clínico das lesões, utilizando-se como critérios o tamanho dos tumores e
níveis séricos de hormônio paratireóideo e cálcio. Brieger e colaboradores (34), estudando
neurinomas de nervo acústico, observaram que, nos 34 casos avaliados, a contagem
microvascular não se correlacionava com o tamanho dos tumores, a duração dos sintomas
ou a idade dos pacientes.
Em neoplasias ginecológicas, Nayha e colaboradores (35) avaliaram a intensidade
da neovascularização em endométrios normais, hiperplásicos e no adenocarcinoma. Os
autores observaram que alterações na DMV se correlacionavam com estágios
progressivamente mais graves da doença endometrial, com DMV inferior em endométrios
21
proliferativos e hiperplasias simples, e mais elevada em hiperplasias com atipias
significativas e adenocarcinomas. Em neoplasias de ovário, por outro lado, Sonmezer e
colaboradores (36) não encontraram correlação entre a DMV, a sobrevida ou parâmetros
anátomo-patológicos. Os níveis de VEGF também não se mostraram de importância
significativa, ocorrendo correlação estatística somente com o volume de ascite. Não se
observou também relação entre a intensidade de marcação imuno-histoquímica para VEGF
e a DMV nestes tumores.
No trato gastrointestinal, temos diversos estudos demonstrando a importância
prognóstica da DMV em tumores de esôfago, estômago, fígado, pâncreas e cólon. Tais
estudos trazem dados comparativos de especial interesse para nossa linha de pesquisa.
Em carcinomas de esôfago, Du e colaboradores (37) observaram que 81,36% das
lesões expressavam VEGF, resultando em índices aumentados de densidade microvascular.
Tais dados demonstraram relação significativa com o grau de diferenciação tumoral e
metástases linfáticas, não tendo sido observada importância significativa na profundidade
de penetração na parede intestinal. Nakagawa e colaboradores (38), analisando dados de
103 esofagectomias por carcinoma epidermóide do esôfago, observaram que a DMV
guardava relação com a profundidade de penetração do tumor na parede do órgão,
ocorrência de metástases intramurais, índices elevados de recorrência pós-operatória e pior
sobrevida geral.
Em adenocarcinomas gástricos, Chung e colaboradores (24) avaliaram a relação
entre a intensidade da expressão do VEGF, a DMV, a sobrevida geral e os índices de
recorrência metastática em indivíduos submetidos a tratamento cirúrgico com intenção
curativa. Os autores relataram que a DMV foi significativamente mais alta em leões VEGF
positivas, sendo que tais pacientes tiveram um índice de 66,7% de recorrência hepática,
22
comparados a 16,7% naqueles com VEGF negativo. Du e colaboradores (37) observaram
que 67,5% dos adenocarcinomas de estômago expressavam VEGF, sendo a contagem
microvascular nestas lesões maior do que a encontrada em patologias benignas. Na
avaliação destes autores, a DMV foi significativamente maior em tumores avançados
quando comparados a lesões precoces. Ichinoe e colaboradores (39), comparando
adenocarcinomas gástricos precoces de padrão de crescimento superficial ou infiltrativo,
encontraram uma forte relação entre a DMV, a expressão de VEGF, de óxido nítrico
sintetase e ciclo-oxigenase-2 neste último tipo de tumor, enquanto que as lesões de
crescimento superficial apresentavam fraco padrão de neovascularização. Por fim, Tsujitani
e colaboradores (40) relataram que a DMV, o tamanho dos tumores e a presença de
metástases linfáticas foram fatores preditivos independentes do prognóstico de
adenocarcinomas de estômago, sendo que a densidade de microvasos foi maior naqueles
casos em que o VEGF estava significativamente expresso.
Nas neoplasias pancreáticas, Tan e colaboradores (41) demonstraram que tumores
neuroendócrinos não apresentavam comportamento desfavorável mesmo com contagem
elevada de microvasos. Por outro lado, diversos estudos observaram um melhor
prognóstico para adenocarcinomas do pâncreas que se mostravam hipovascularizados (41).
Em hepatocarcinomas, Yao e colaboradores (42) observaram dados prognósticos
significativos com relação à DMV. Em 90,9% dos casos metastáticos, os tumores
expressavam VEGF, contra 63,9% das lesões localizadas. A contagem de microvasos
acompanhou a taxa de expressão do VEGF, sendo ambas maiores nas lesões não
encapsuladas, pouco diferenciadas e metastáticas. Tanto a DMV quanto os índices de
expressão do VEGF se correlacionaram com a intensidade de invasão vascular e com a
disseminação sistêmica em tumores primários de fígado.
23
No câncer colo-retal, objeto de nosso estudo, a análise do significado clínico da
contagem microvascular apresenta resultados conflitantes. Em 1994, Saclarides e
colaboradores (43) relataram uma casuística de 48 indivíduos portadores de
adenocarcinoma do reto em que a DMV aumentada foi relacionada a estágios anátomo-
patológicos mais avançados, maior tamanho dos tumores e maior recorrência metastática.
Em 1995, o mesmo autor em conjunto com Frank e colaboradores (44), descreveu
resultados significativos em relação à menor sobrevida em cinco anos em 105 pacientes
tratados por carcinomas de cólon no estágio B2 de Astler-Coller que apresentavam escores
elevados de DMV. Chung e colaboradores (24) observaram uma associação direta entre a
expressão de VEGF e os níveis elevados de contagem de microvasos em carcinomas colo-
retais. A estes achados foram somadas evidências apontando para uma correlação entre a
DMV e a ocorrência de metástases por via hematogênica. Tanigawa e colaboradores (45),
em 133 casos de câncer colo-retal, observaram que a contagem microvascular foi
significativamente maior no grupo de pacientes que foram a óbito em decorrência de
recidiva da neoplasia quando comparados com os indivíduos livres de doença. A DMV
elevada apresentou correlação estatisticamente significativa com a ocorrência de metástases
por via hematogênica, tumores pouco diferenciados e maior profundidade de penetração na
parede intestinal pela lesão. Kaio e colaboradores (46) relacionaram a elevada intensidade
da expressão de agentes angiogênicos na extremidade mais profunda de invasão de
adenocarcinomas colo-retais com índices elevados de DMV. Tal associação mostrou
resultados significativos quanto ao risco de metástases hematogênicas e menor sobrevida
global dos pacientes. Por fim, Tarta (47) observou que a proliferação vascular acompanha o
desenvolvimento dos tumores colo-retais, com números progressivamente maiores de
microvasos em adenomas de baixo grau, alto grau e adenocarcinomas precoces.
24
Nem todos os pesquisadores que analisaram a importância da contagem
microvascular no adenocarcinoma colo-retal chegaram a estas mesmas conclusões. Banner
e colaboradores (48), estudando 22 pacientes com carcinomas do cólon e reto com invasão
transmural da parede intestinal e sem metástases linfáticas, relataram que aqueles
indivíduos com sobrevida mais longa apresentavam índices de DMV maiores quando
comparados aos casos de recorrência precoce da neoplasia. Lindmark (49) já havia
observado resultados semelhantes dois anos antes. Sua série de 227 pacientes com
adenocarcinoma colo-retal demonstrou uma maior sobrevida nos casos com DMV elevada,
sendo que não se observou relação entre a contagem dos vasos sangüíneos tumorais e o
grau de diferenciação celular dos tumores ou o estágio clínico da doença. Cianchi e
colaboradores (50) relataram também uma associação entre DMV elevada e melhor
comportamento clínico de tumores do reto sem metástases para a cadeia linfática regional.
Os autores observaram ainda que contagens elevadas de vasos sangüíneos tumorais eram
acompanhadas de um aumento na infiltração linfocitária das lesões, o que poderia indicar
uma melhor resposta imune celular, a qual se correlacionaria com um melhor prognóstico.
Estes mesmos linfócitos seriam os responsáveis pelo estímulo angiogênico aumentado
através da liberação de agentes pró-angiogênicos. Abdalla e colaboradores (51) também
descreveram uma série de pacientes tratados por adenocarcinoma do cólon e reto em que a
DMV mais elevada foi associada com melhor prognóstico e sobrevida. Estes autores
também descrevem a importância da reação inflamatória tumoral como agente estimulante
da produção de vasos sangüíneos, devendo-se levar em consideração outros fatores como
expressão de oncogenes, composição da matriz extracelular, móleculas de adesão
intercelular, fatores de crescimento tumoral e grau de apoptose, que poderiam interferir na
interpretação dos resultados. Boxer e colaboradores (52), da mesma maneira, observaram
25
um pior prognóstico nos pacientes com índices de DMV baixos em casos de carcinoma
colo-retal sem invasão linfática. Estes mesmos autores descreveram que a expressão do
VEGF na extremidade invasora da lesão maligna guardava importante relação com a
recorrência tumoral sistêmica, mesmo com contagens microvasculares reduzidas nesta
mesma região. A deficiciência de vascularização dos tumores nas margens invasoras que
conduziria à hipóxia, um importante estímulo à produção do VEGF, poderia explicar estes
achados. Tal fato teria importância clínica significativa uma vez que justificaria o uso de
agentes anti-angiogênicos bloqueadores de VEGF mesmo em casos com contagens
vasculares tumorais reduzidas.
Frente a estes achados conflitantes na literatura, o estudo de outros fatores
associados à angiogênese tumoral além da simples contagem dos vasos parece fundamental
para que possamos compreender melhor a biologia das lesões e para expandirmos o nosso
arsenal terapêutico oncológico.
26
Fator tecidual: funções fisiológicas e importância no desenvolvimento de neoplasias
malignas.
Estudos pioneiros, datando do final do século XIX, demostraram que o mecanismo
de coagulação sangüínea resulta da interação entre protrombina, cálcio, fibrinogêneo e um
quarto fator conhecido como tromboplastina ou, mais freqüentemente, fator tecidual (FT)
(53).
O FT desempenha uma função fundamental na cascata de coagulação sangüínea ao
combinar-se com o fator VII, complexo este que tem ação proteolítica, resultando então na
ativação dos fatores IX e X, desencadeando a seqüência de reações que terminam por
converter fibrinogêneo em fibrina, levando à formação final de um coágulo (53,54,55).
Em sua forma madura, o FT, uma proteína trans-membrana, apresenta 219
aminoácidos em sua porção extracelular, 23 aminoácidos na cadeia trans-membrana e 21 na
sua porção citoplasmática (53). Ele é classificado como um membro da família dos
receptores de fatores de crescimento hematopoiético que também incluem os receptores do
interferon alfa e da interleucina 10 (53).
Usualmente, o FT está presente nos fibroblastos da adventícia de vasos sangüíneos,
cápsulas de órgãos, células epiteliais de pele e mucosas, células do estroma endometrial e
astrócitos no sistema nervoso central (53). Não foi detectada a presença de fator tecidual
em células intravasculares, como o endotélio normal, sugerindo que ele constitui um
envelope hemostático no caso de ruptura da integridade vascular ou tecidual (53).
Acredita-se também que o FT apresente efeitos morfogênicos, por exemplo, sobre
células de músculo liso (53). Na placa aterosclerótica, estudos demonstraram que ele é
expresso em macrófagos e na muscular do vaso (53). Toshi e colaboradores (56)
demonstraram que o FT está presente nas placas ateroscleróticas ricas em lipídios e
27
sugeriram que ele representa um forte estímulo trombogênico sobre estas lesões
ateromatosas, principalmente após a ruptura espontânea da placa. Por outro lado, após lesão
mecânica arterial, como visto na angioplastia ou dilatação com balão, ocorre a migração de
células de músculo liso que participam da reparação do trauma. Este efeito benéfico,
mediado em parte pelo fator tecidual, representa uma contrapartida vantajosa ao risco de
trombose associado à exposição do FT a proteínas plasmáticas relacionadas à coagulação.
De fato, estudos demonstraram que a neutralização do complexo FT/Fator VII ativado
(FT/FVIIa) resulta em diminuição da espessura da íntima arterial (57).
Também foi identificada a expressão do fator tecidual em diversas células de
tecidos embrionários como epitélios, cardiomiócitos, células do endoderma visceral,
músculo liso vascular e tecido neural, especialmente durante períodos de desenvolvimento
embrionário nos quais os fatores de coagulação não estão presentes ou são incapazes de
cruzar a barreira placentária (53). Mais recentemente, estudos com inativação de genes
revelaram que a deficiência do FT é letal para embriões em função de um desenvolvimento
vascular comprometido (53, 58).
Além do período embrionário, outras circunstâncias podem induzir a expressão do
FT. Citocinas inflamatórias (como o fator de necrose tumoral), mitógenos (como o VEGF,
insulina e o fator de crescimento de fibroblastos), hormônios, endotoxinas, infecções virais,
hipóxia e trauma mecânico foram também associados a um aumento de atividade desta
proteína (53).
Além destas funções reconhecidas, o FT pode apresentar outras funções não
relacionadas à coagulação sangüínea. Sua expressão se encontra aumentada em vários tipos
celulares tumorais que apresentam atividade pró-coagulante (53,59). Recentemente, o FT
também foi relacionado ao desenvolvimento de metástases através de mecanismos de
28
sinalização intracelular, bem como através da atividade proteolítica do complexo FT/Fator
VII ativado (53,59). Esta associação entre a expressão do FT e o desenvolvimento de
neoplasias malignas é o foco central de nossa pesquisa.
A relação entre os mecanismos de coagulação e o desenvolvimento do câncer é
reconhecida desde longa data. Em 1865, Armand Trousseau (59) observou que pacientes
que se apresentavam com trombo-embolismo sintomático freqüentemente eram também
portadores de uma neoplasia maligna oculta. Ele também notou que indivíduos
reconhecidamente portadores de um tumor maligno apresentavam uma tendência
aumentada para fenômenos de natureza trombo-embólica. Levantamentos estatísticos mais
recentes mostraram que esta observação é bastante precisa. Em pacientes com neoplasia de
mama, a incidência de trombose e embolia é de 0,1% no estágio clínico I, incidência esta
que chega a 18% nos estágios III e IV (60). No plano inverso, indivíduos com trombo-
embolismo sem uma condição clínica aparente e detectável apresentam um risco
significativamente aumentado, podendo chegar até a nove vezes o observado na população
em geral, de terem diagnosticada uma neoplasia maligna nos seis meses a um ano
subseqüentes (61). Esta chance é ainda maior se um segundo episódio de trombose ocorrer
(61).
Um dos agentes associados aos estados de hipercoagulabilidade relacionados aos
tumores malignos é o fator tecidual (FT) (59,62). Sua expressão encontra-se aumentada em
neoplasias como as de pequenas células de pulmão (63), os gliomas (64), e os carcinomas
de mama (65), pâncreas (66), cólon (67) e próstata (68), sendo também relacionada com
estágios avançados destas doenças.
29
Vários autores indicaram que o FT desempenha um papel crucial na fisiopatologia
do câncer devido à capacidade de estimular a expressão genética do VEGF e, através dele,
criar uma proliferação vascular tumoral exagerada, fundamental para o desenvolvimento do
tumor e sua habilidade de produzir metástases (59,67,69,70). A alteração na homeostase
angiogênica requer um desequilíbrio no balanço de fatores pró-angiogênese e anti-
angiogênese que normalmente manteriam a proliferação de células endoteliais sob controle
(59). O FT parece interferir neste equilíbrio através de um estímulo à expressão do VEGF
(59,71) e também na supressão da trombospondina, um peptídeo anti-angiogênico (59).
Além disto, tanto o FT quanto o VEGF têm expressão aumentada na hipóxia, fenômeno
freqüentemente observado no câncer (72). Aparentemente, duas vias fisiopatológicas
existem para explicar o estímulo angiogênico do FT (59). Uma delas é dependente do
mecanismo de coagulação (59,73) e a outra não (59).
No primeiro caso, a rota angiogênica dependente de coagulação resulta da ativação
da trombina via ligação do FT ao fator de coagulação VII. A presença de trombina resulta
em lise dos fibrinopetídeos A e B a partir da molécula do fibrinogênio, que determina a
conversão deste em fibrina. Níveis plasmáticos elevados de fibrinopeptídeo A foram
relacionados com crescimento tumoral (59). Além disto, a presença de trombina ativa as
plaquetas, que se unirão à fibrina formando o coágulo. As plaquetas ativadas liberam
fatores pró-angiogênicos, dentre eles o VEGF, que contribuem para a migração e a
proliferação de células endoteliais. O VEGF, por sua vez, induz um aumento de
permeabilidade vascular que determina um escape de proteínas plasmáticas, especialmente
fibrina, as quais irão formar uma matriz ao redor das células tumorais (59,73,74). Esta
matriz serve como base para migração de células endoteliais e para a angiogênese justa-
tumoral. Por fim, a degradação da matriz de fibrina libera novos agentes estimulantes da
30
proliferação vascular, o que contribui para a manutenção e para o incremento do estímulo
angiogênico (59,73,74).
Existem também evidências de que um mecanismo não diretamente relacionado à
cascata da coagulação, mas ainda assim envolvendo a expressão do FT por células tumorais
representa uma fonte de estímulo angiogênico para as neoplasias (59). A fosforilação da
porção citoplasmática do FT induz a formação de uma seqüência de sinais intracelulares
que resultam na transcrição de vários genes (59,70,74,75). O fator de crescimento vascular
endotelial tem sua transcrição aumentada pela ativação do FT, levando a um potente
estímulo angiogênico (59,70,74,75). Por outro lado, a trombospondina é inibida pelo FT,
reduzindo a sua capacidade anti-angiogênica (59). Além disto, como vimos anteriormente,
o aumento da atividade do VEGF por ação do FT resulta em uma permeabilidade vascular
exagerada a proteínas plasmáticas, com deposição de fibrina na forma de uma matriz junto
às células tumorais (59). Tal matriz representa também um estímulo a proliferação de vasos
sangüíneos uma vez que sua análise demonstrou altas concentrações de agentes pró-
angiogênicos como o fator de crescimento de fibroblastos, o próprio VEGF e o fator de
crescimento associado à insulina tipo 1 (IGF-1) (59). Da mesma forma, o extravasamento
de proteínas plasmáticas aumenta o índice de ligação entre o fator VII e o FT. O fator VII
ativado produz um aumento de cálcio intracelular que, por sua vez, estimula a fosforilação
da porção intracitoplasmática do FT, completando um ciclo de retroalimentação positiva
através de um novo incremento na transcrição do VEGF (59).
Ainda não se conhece a real parcela de responsabilidade de cada um destes
mecanismos na fisiopatologia do fator tecidual com relação ao desenvolvimento do câncer.
Hembrough e colaboradores (76), em uma tentativa de avaliar o papel da coagulação no
crescimento de tumores, testaram, in vivo, inibidores específicos para o complexo FT-FVIIa
31
e para o fator X ativado (FXa). Estes autores demonstraram que dois inibidores do
complexo FT/FVIIa conseguiram diminuir a progressão de lesões primárias e metástaticas
em cobaias. Por outro lado, o uso de inibidores específicos do FXa não demonstrou
atividade anti-tumoral. Uma vez que o FXa constitui o elemento final da rota pró-
coagulante do FT-FVIIa, estes dados sugerem que a ação proteolítica deste último promove
a proliferação tumoral e a angiogênese por um outro mecanismo além daquele observado
através da cascata de coagulação sangüínea.
Rickles e colaboradores (77) observaram uma forte correlação entre a expressão de
FT e a síntese de VEGF em linhagens tumorais humanas. A inoculação destas células
neoplásicas em camundongos imunossuprimidos levou ao desenvolvimento de tumores
com alta taxa de densidade microvascular. Ao se transfectar em uma linhagem tumoral
com baixa expressão de FT/VEGF uma seqüência codificante completa do FT, estas células
se tornaram produtoras destes dois elementos. Por outro lado, quando se inoculava uma
seqüência de FT com alterações na porção intracitoplasmática que impediam a fosforilação,
o que se observava era uma intensa produção do fator tecidual, mas não do VEGF. Estes
resultados sugeriam que a porção citoplasmática do FT é necessária para o estímulo à
produção do VEGF.
Tais achados se somam aos de Abe e colaboradores (78) que descreveram, através
de metodologia semelhante, o comportamento de várias linhagens de melanoma em relação
à expressão do FT e a angiogênese. Tumores com altas taxas de FT/VEGF quando
inoculados em camundongos imunossuprimidos produziam lesões sólidas altamente
vascularizadas. Por outro lado, melanomas com baixa expressão destes dois elementos
produziam tumores relativamente avasculares. A inoculação de uma seqüência de DNA
para o FT que produzisse uma proteína cuja porção citoplasmática fosse inutilizada levava
32
à expressão do FT, mas a uma baixa taxa de VEGF. Se a cadeia de DNA inoculada, por
outro lado, levasse somente à inativação da porção extracelular do FT, ou seja, a porção
ligante do Fator VII ativado, os níveis de VEGF eram semelhantes àqueles vistos em
tumores produtores de FT. Zhang e colaboradores (70) descreveram mais recentemente
resultados semelhantes aos descritos anteriormente, só que utilizando linhagens celulares de
tumores gástricos. Da mesma maneira, células inoculadas com mutações da porção
extracelular da molécula de FT produziam altos níveis de VEGF. Se a mutação, entretanto,
afetasse a região intracelular, mesmo que a expressão do FT estivesse plenamente
demonstrada, a produção do VEGF ficava significativamente comprometida.
Se, por um lado, a porção citoplasmática do fator tecidual foi associada à produção
do VEGF em linhagens tumorais, a porção ligante extracelular teve sua participação
associada à disseminação de tumores malignos. Mueller e Ruf (79) desenvolveram um
modelo experimental de metástases hematogênicas dependentes de FT que demonstrou a
importância do complexo FT/FVIIa na evolução de lesões neoplásicas. Ao que parece,
existe a necessidade da ação proteolítica deste complexo para o favorecimento da
disseminação das células tumorais através da corrente sangüínea.
Amirkhosravi e colaboradores (72) avaliaram a importância da hipóxia, um achado
freqüente em neoplasias malignas, no aumento da expressão do FT em tecidos tumorais. Ao
cultivarem células de vários tipos de neoplasias em meios com baixa tensão de oxigênio,
relataram um aumento da atividade pró-coagulante bem como da expressão do FT. Ao
injetarem estas culturas em cobaias, notaram que aquelas expostas à baixa tensão de
oxigênio (O
2
) produziram mais trombocitopenia e metástases pulmonares do que células
cultivadas com níveis normais de O
2
. Em conclusão, os autores relataram que a hipóxia
aumenta a expressão do FT em neoplasias malignas, fato que estimula a adesão plaquetária,
33
facilitando o desenvolvimento de metástases hematogênicas através de um mecanismo mais
associado à atividade coagulante do FT, portanto de sua porção relacionada ao fator VII
ativado, do que a sua porção intra-citoplasmática.
Em conjunto com estes achados, diversos estudos foram desenvolvidos para avaliar
a freqüência da expressão do FT e correlacioná-la com fatores prognósticos classicamente
reconhecidos nos mais variados tipos de neoplasias malignas.
Seto e colaboradores (80) avaliaram a expressão do fator tecidual em 67 pacientes
com adenocarcinoma colo-retal, correlacionando-a com a ocorrência de metástases
hepáticas. Os autores observaram que neoplasias com altas taxas de atividade do fator
tecidual apresentaram um risco significativamente maior de desenvolvimento de lesões no
fígado, bem como um pior prognóstico após três anos de acompanhamento.
Da mesma maneira, Nakasaki e colaboradores (81) avaliaram a expressão de FT em
100 tumores malignos colo-retais. O fator tecidual estava presente em 57% da amostra e a
intensidade de sua expressão se correlacionou com a classificação de Dukes destes tumores.
Além disto, observou-se uma relação significativa entre a expressão do FT e a do VEGF.
Tais dados sugerem que a expressão do FT se relaciona com o grau de progressão da
doença avaliado pelos critérios de Dukes, sendo o VEGF um elemento significativo na
determinação do prognóstico destes pacientes.
Contrino e colaboradores (82) avaliaram a expressão do FT em carcinomas de
mama e encontraram também uma relação prognóstica. Ao analisarem a atividade do FT
na superfície vascular endotelial de pacientes portadores de neoplasias malignas, relataram
que em sete casos havia atividade desta proteína a nível do endotélio assim como em
células tumorais. Em comparação, em dez casos de doença fibrocística, nenhum apresentou
análise imuno-histoquímica positiva para o FT. Os autores concluíram que células tumorais
34
podem ativar células endoteliais adjacentes à lesão e estimular a proliferação de vasos
sangüíneos justa-tumorais através de um importante estímulo angiogênico mediado pelo
fator tecidual.
Vrana e colaboradores (83) avaliaram a expressão do fator tecidual em células do
estroma peritumoral de neoplasias de mama e encontraram uma relação significativa entre a
presença do FT e a progressão para o carcinoma invasor. Células positivas para o FT eram
particularmente abundantes nas proximidades de lesões infiltrativas, sendo constituídas
principalmente por macrófagos e miofibroblastos. Para os autores, estes dados indicaram
que o recrutamento ou ativação de células positivas para FT é um evento precoce na
progressão para um carcinoma localmente invasor.
Mais recentemente, Kato e colaboradores (84) observaram um efeito sinérgico entre
a progesterona e a expressão do FT em um modelo experimental baseado em células de
carcinoma mamário. A incubação de células da linhagem ZR 75 em meio rico em
progesterona foi acompanhada de um aumento da atividade do RNAm e da expressão do
próprio FT. Tal efeito foi acompanhado de um incremento da atividade pró-coagulante
desta linhagem celular, bem como do seu potencial invasor. Para os autores, o efeito da
progesterona estimulando a expressão do FT representa uma vantagem em termos de
viabilidade das células tumorais e um risco nos casos de reposição hormonal em pacientes
portadoras de câncer de mama.
Hamada e colaboradores (85) avaliaram a expressão do FT em 44 espécimes
cirúrgicos de gliomas. Seus dados concluíram que o nível de expressão se relacionava grau
histológico de malignidade, uma vez que 10% dos gliomas definidos como de baixo grau
apresentavam positividade para o FT, enquanto que 86% dos astrocitomas anaplásicos e
95% dos glioblastomas expressavam de forma moderada ou intensa esta mesma proteína.
35
Kakkar e colaboradores (86) avaliaram 55 casos de carcinomas ductais pancreáticos
quanto à expressão do FT. Observaram que tumores pouco diferenciados apresentavam
maior atividade do fator tecidual que inclusive não estava presente em tecidos pancreáticos
não neoplásicos.
Nitori e colaboradores (87) avaliaram a freqüência da expressão do fator tecidual,
correlacionando-a a fatores prognósticos também em neoplasias ductais pancreáticas. A
expressão aumentada, considerada no estudo como a presença de mais de 25% das células
positivas para o FT, foi relacionada a uma maior extensão do tumor primário, à ocorrência
de metástases linfonodais e a tumores pouco diferenciados. De fato, a expressão do FT se
mostrou como uma variável prognóstica de valor independente para recorrência e óbito por
este tipo de neoplasia. Os autores relataram ainda que a inativação do FT por bloqueio do
RNAm reduziu o potencial invasor in vitro de células tumorais pancreáticas, o que o
associa com a agressividade deste tipo de tumor.
Para Khorana e Fine (88), a expressão freqüente do FT pelas células malignas
pancreáticas representa a principal razão para ocorrência de fenômenos típicos de
coagulopatia, como tromboembolismo, trombose de veia porta, coagulação intravascular
disseminada e trombose venosa profunda, que aparecem como complicadores em até 57%
dos indivíduos afetados por este tipo de neoplasia.
Poon e colaboradores (89), estudando casos de carcinoma hepatocelular, avaliaram a
relação entre a expressão do FT, a DMV e fatores prognósticos. A atividade do FT foi
associada a uma maior densidade de vasos sangüíneos bem como a uma elevada presença
de VEGF. Além disso, tumores positivos para FT demonstraram maior ocorrência de
invasão venosa, estágios clínicos mais avançados e lesões não encapsuladas. De fato, o FT
se mostrou como fator prognóstico negativo independente nestas lesões.
36
Kaido e colaboradores (90), da mesma forma, encontraram importância prognóstica
em relação ao FT em casos de carcinoma hepatocelular. Indivíduos com tumores que
expressavam o FT apresentaram uma maior freqüência de trombose neoplásica da veia
porta, metástases intra-hepáticas, hipoalbuminemia, e invasão capsular. A sobrevida livre
de doença foi significativamente maior nos pacientes com lesões negativas para atividade
do FT, o que, nesta amostra, demonstrou que o mesmo é um fator prognóstico negativo
independente.
Em casos de adenocarcinoma de próstata, Abdulkhadir (68) e Carvalhal (91)
demonstraram que a atividade do fator tecidual na membrana celular teve associação direta
com níveis mais elevados de PSA. Quando quantificada a densidade microvascular nestas
lesões, os índices mais elevados foram observados nos casos positivos para FT, levando os
autores a concluírem que a sua expressão poderá servir como um marcador da
agressividade dos tumores prostáticos, assim como um indicador de angiogênese
aumentada. Akashi e colaboradores (92) também encontraram correlação prognóstica na
expressão do fator tecidual em neoplasias de próstata. Em casos de doença metastática,
75,3% dos tumores expressavam o FT, sendo que estes indivíduos apresentaram pior
desempenho clínico no tratamento com supressão hormonal.
Wang e colaboradores (93) descreveram a importância dos fatores relacionados à
coagulação, dentre eles o FT, na progressão e evolução clínica das neoplasias ovarianas de
origem epitelial. Análises de DNA demostraram aumento da atividade de genes
relacionados a proteínas de coagulação e à inflamação no peritônio pélvico e em regiões
próximas a implantes. Tal expressão teve correlação com atividade proliferativa celular,
potencial de invasão, angiogênese, produção de ascite e metástases.
37
Por fim, Koomagi e colaboradores (94) estudaram a expressão do fator tecidual em
191 neoplasias malignas pulmonares do tipo não pequenas células. Nestes casos, a
atividade do FT se correlacionou com a intensidade da expressão do VEGF e com a
densidade microvascular das lesões. A positividade das células tumorais para o FT foi
também associada a um pior prognóstico, com redução significativa da sobrevida após o
tratamento.
Frente a estes achados o estudo das interações entre o fator tecidual e o câncer,
especialmente no que se refere ao seus mecanismos de ação, pode abrir um campo
alternativo de tratamento das neoplasias malignas, envolvendo não só o controle da
expressão de substâncias pró-angiogências, mas também dos sistemas regulatórios da
coagulação sangüínea.
38
Objetivos
• Descrever a expressão do fator tecidual em adenocarcinomas colo-retais de pacientes
submetidos a tratamento cirúrgico no Serviço de Colo-Proctologia do Hospital São
Lucas da PUCRS (HSL-PUCRS).
• Relacionar a intensidade da expressão do fator tecidual com a densidade microvascular
dos tumores colo-retais.
• Relacionar a intensidade da expressão do fator tecidual com:
Idade e sexo dos indivíduos analisados.
Profundidade de penetração na parede intestinal pela neoplasia colo-retal.
Ocorrência de metástases linfáticas.
Localização das lesões no intestino.
Sobrevida dos pacientes tratados.
Sítios de recorrência metastática.
Diferenciação histológica das neoplasias.
39
Pacientes e métodos:
1) Seleção da amostra e material utilizado:
Desenvolvemos um estudo no qual foram analisados dados anátomo-patológicos e de
acompanhamento clínico de 43 pacientes atendidos no Serviço de Colo-proctologia do
Hospital São Lucas da PUCRS no período de 1993 a 1998 com diagnóstico de
adenocarcinoma do cólon e reto.
Foram incluídos no estudo aqueles indivíduos submetidos exclusivamente a ressecções
intestinais com ou sem anastomose associada, seguindo padrões oncológicos terapêuticos e
não palitivos. Os pacientes seguiram acompanhamento clínico, laboratorial e endoscópico
no Serviço de Colo-proctologia do Hospital São Lucas da PUCRS, sendo os casos de
recidivas tumorais documentados por exame físico, provas laboratoriais (provas de função
hepática, marcadores tumorais ou testes específicos do órgão afetado), testes de imagem
(ecografia, tomografia computadorizada ou ressonância nuclear magnética) e seguimento
clínico do desfecho final (óbito ou resolução). Foram incluídos todos os pacientes opreados
noperíodo e que atenderam os pré-requisitos acima descritos.
Para análise das variáveis principais do estudo (expressão do fator tecidual e densidade
microvascular) utilizaram-se espécimes dos tumores colo-retais armazenados no
Laboratório de Anatomia Patológica do HSL-PUCRS sob a forma de blocos de parafina. O
material coletado foi avaliado pelo pesquisador e por um patologista do próprio laboratório
quanto à representatividade da neoplasia através de corte e coloração com hematoxilina-
eosina.
Os dados referentes aos achados anátomo-patológicos foram aqueles originalmente
obtidos na análise dos espécimes ressecados e utilizados para a definição do estadiamento
clínico-patológico realizado imediatamente após as intervenções cirúrgicas. Tais
40
informações encontravam-se armazenadas no próprio laboratório de Anatomia Patológica
do HSL-PUCRS, sendo complementados com informações clínicas contidas nos
prontuários médicos guardados no Serviço de Arquivo Médico e Estatística do HSL-
PUCRS.
Foram coletados dados referentes a:
• Idade e sexo dos pacientes;
• Localização dos tumores no reto ou cólon;
• Grau de diferenciação histológica das neoplasias subdivididas em três categorias:
adenocarcinomas bem diferenciados, moderadamente diferenciados e pouco
diferenciados (95);
• Profundidade de penetração na parede intestinal, sendo os tumores agrupados em 4
categorias de acordo com o estadiamento anátomo-patológico das lesões colo-retais:
carcinomas invasores de submucosa; da muscular própria do intestino; da serosa ou
gordura peri-intestinal; e de estruturas adjacentes;
• Metástases para cadeias linfáticas regionais do intestino;
• Sobrevida após o tratamento do adenocarcinoma colo-retal quantificada em meses após
a cirurgia.
2) Análise da expressão do fator tecidual:
Secções de tecido neoplásico foram preparadas através de método imunoistoquímico
com anticorpos monoclonais anti-fator tecidual (Mouse anti-human tissue factor, type 1 US
Biological – type Mab, IgG1 clone 2K1). A reatividade para o FT foi avaliada utilizando-se
microscópio óptico Zeiss Axioskop 40 (Oberkohen, Alemanha) com magnificação de 100X
41
e classificada de acordo com o percentual de glândulas malignas positivas para o antígeno
pesquisado. A expressão do FT foi subdividida em 4 grupos (78,91):
1. Zero a 25% das glândulas de carcinoma coradas;
2. Vinte e seis a 50% das glândulas de carcinoma coradas;
3. Cinqüenta e um a 75% das glândulas de carcinoma coradas;
4. Setenta e seis a 100% das glândulas de carcinoma coradas.
Esta variável foi avaliada independentemente por dois 2 observadores treinados, não
havendo discordância entre os dados computados para este quesito. As figuras 1 e 2
exemplificam a classificação acima proposta com lesões na categoria 1 e 4.
Figura 1: Exemplo da expressão do fator tecidual em 100% das glândulas de um
adenocarcinoma colo-retal
. As setas apontam glândulas neoplásicas expressando
intensamente o fator tecidual.
42
Figura 2: Exemplo de expressão ausente do fator tecidual em glândulas de adenocarcinoma
(indicadas por setas) em um caso de nossa amostra.
3) Quantificação da densidade microvascular
A contagem de microvasos foi relizada utilizando-se marcação imunoistoquímica
com anticorpo anti-CD34 endotelial (CD34 classe II Clone QBEnd 10, Dakocytomation,
EUA) em secções de tecido neoplásico obtidas consecutivamente a partir dos mesmos
blocos de parafina empregados para avaliação da expressão do fator tecidual. Para a
realização da contagem do número de vasos sangüíneos por área de tumor utilizou-se
método de captura digital de imagens das lesões analisadas. Foi utilizado o sistema de
análise de imagens do Laboratório de Patologia do Hospital São Lucas da PUCRS,
composto por um microscópio ótico Zeiss Axioskop 40 (Oberkohen, Alemanha) com lentes
plan-neofluares conectado através de uma videocâmera Roper Scientific (Media
Cybernetics, Silver Spring, EUA) a um microcomputador Pentium IV 2.2 GHz com 512
43
MB de memória RAM, disco rígido de 160 GB e placa de captura Image Pro Capture kit
(Media Cybernetics, Silver Spring, EUA). Para a análise digital de imagens foi utilizado o
programa Image Pro Plus versão 4.5. Este programa permite a captura de uma imagem
digital com a possibilidade da inserção de grade de correção, marcação e contagem das
áreas de interesse. As imagens foram armazenadas no formato TIFF (True Image Format
File) para análise posterior. Histologicamente, os microvasos foram identificados pela
coloração acastanhada, em contraste com fundo de cor azul claro (hematoxilina). A
identificação da microvascularização foi realizada através da seleção das áreas mais
vascularizadas, preferencialmente na região periférica do tumor, examinadas com
magnificação de 100X. Estas áreas hipervascularizadas, ou “hot spots”, são representativas
dos locais de maior densidade microvascular. Após a sua identificação, foi realizada a
captura da imagem em 20 campos diferentes para a contagem dos vasos com uma
magnificação de 400X, com resolução de 1392X1040 pixels por 0,76mm
2
. Qualquer célula
endotelial separada de microvasos adjacentes foi contada como um microvaso. Não foi
necessária a visualização da luz vascular ou a presença de hemácias, pois o diâmetro médio
dos capilares é de 10 a 12 micrômetros, semelhante ao maior diâmetro de uma hemácia.
Tanto células isoladas quanto vasos maiores, porém sem parede muscular ou adventícia
foram incluídos na contagem. A inserção de uma grade de correção resultou em um campo
com amplitude de 1312X960 pixels, correspondendo à área de 0,66 mm
2
. Somente foram
contados os vasos dentro da área da grade, ou que tocassem a linha de demarcação
pontilhada. A contagem foi realizada numa escala ordinal e após foi realizada a média
aritmética dos 20 campos selecionados em cada “hot spot” (96).
44
4) Técnica de imunoistoquímica:
A partir dos tecidos fixados e incluídos em parafina referentes aos tumores incluídos
no estudo, cortes com espessura de 3 µm foram submetidos à recuperação antigênica em
banho-maria por 30 minutos à 99ºC utilizando tampão Tris/EDTA, ph 9 (20 mM Tris/0,65
mM EDTA). O bloqueio da peroxidase endógena foi feito utilizando solução de peridrol
3%(H
2
O
2
em álcool metílico) por 30 minutos. Os cortes foram imersos em soro fisiológico
normal a 5% com tampão PBS (Phosphate binding saline) por 30 minutos para diminuir o
background. As secções foram incubadas com anticorpo monoclonal de rato anti-Fator
Tecidual tipo 1 (Mouse anti-human tissue factor, type 1 US Biological – type Mab, IgG1
clone 2K1) com diluição de 1:30 e anticorpo anti-humano monoclonal de rato para CD34
(CD34 classe II Clone QBEnd 10 Dakocytomation) com diluição de 1:400. O sistema de
detecção utilizado foi com o Kit Dako LSAB + peroxidase (Streptoavidina). Os cortes
foram revelados usando o cromógeno 3,3`- diaminoazobenzidina em solução tampão PBS e
0,002% de peróxido de hidrogênio e contra-corados com hematoxilina. Os cortes em
lâminas foram então desidratados, clarificados e finalmente montados com bálsamo e
lamínula.
5)Análise estatística:
Os dados categóricos foram descritos por freqüência e percentual e os quantitativos
por média e desvio padrão. A comparação da idade e da densidade vascular por campo no
“hotspot” foi realizada entre os grupos de alta e baixa expressão do fator tecidual pelo teste
t de Student. As demais variáveis foram comparadas entre esses mesmos grupos com o
teste de qui-quadrado. As análises foram realizadas com o auxílio do programa SPSS
45
versão 12.0, sendo a figura 4 elaborado pelo programa SigmaPLot versão 8.0. Para a
comparação da sobrevida nos dois grupos, foram elaboradas curvas do tipo Kaplan-Meier.
6)Aspectos bioéticos da pesquisa:
O presente estudo foi apresentado aos Comitês de Ética e de Pesquisa do Hospital
São Lucas da PUCRS previamente ao início da coleta dos dados, tendo obtido autorização
de ambos para sua realização (Ofícios 174/04-PG e 606/04-CEP).
46
Resultados
1) Características da amostra estudada:
Foram analisados os dados clínicos e anátomo-patológicas dos 43 pacientes incluídos
no estudo. Nesta população, a média de idade foi de 58,1 +
12,64 anos, sendo 16 (37,2%)
indivíduos do sexo feminino e 27 (62,8%) do sexo masculino. Os tumores se localizavam
mais freqüentemente no reto (60,4%), sendo que a maioria já apresentava extensão até a
serosa ou ao tecido gorduroso peri-intestinal (72,1%). A cadeia linfática regional
apresentava comprometimento por adenocarcinoma em 20 pacientes analisados (46,5%).
Na classificação quanto ao grau de diferenciação histológica das neoplasias, os
adenocarcinomas moderadamente diferenciados foram aqueles mais freqüentemente
observados, representando 72,1% da amostra.
Durante o acompanhamento, 22 pacientes (51,1%) apresentaram recidiva da doença,
sendo o óbito constatado, em média, com 27,6 +12,84 meses de pós-operatório. O sítio
mais freqüentemente observado como primeiro local de recidiva neoplásica foi o fígado,
com 50% dos casos de nossa amostra. Nos indivíduos sem evidências de recidiva tumoral,
o tempo médio de acompanhamento foi de 103,8 +
34,53 meses.
Os dados detalhados referentes aos pacientes e suas lesões podem ser observados na
tabela 1.
47
Tabela 1: Características clínicas e anátomo-patológicas da amostra.
Variáveis Subclassificação Total
1)Média de idade 58,1 +12,64 anos
2)Localização
Reto
26 (60,4%)
Sigmóide 5 (11,6%)
Descendente 4 (9,3%)
Transverso 1 (2,3%)
Ascendente 7 (16,4%)
3)Linfáticos
Com metástases
20 (46,5%)
Sem metástases 23 (53,5%)
4) Profundidade da lesão
no intestino
Submucosa
2 (4,6%)
Muscular própria 7 (16,4%)
Serosa 31 (72,1%)
Estruturas vizinhas 3 (6,9%)
5)Evolução
Sem recorrência
21 (48,9%)
Com recorrência Total 22 (51,1%)
Fígado 11 (50%)
Carcinomatose 2 (9,2%)
Pulmão 1 (4,5%)
Cérebro 1 (4,5%)
Pâncreas 1 (4,5%)
Pelve 6 (27,3)
6)Diferenciação
histológica
Bem
2 (4,6%)
Moderadamente 31 (72,1%)
Pouco 10 (23,3%)
48
2) Expressão do fator tecidual:
A intensidade da expressão do fator tecidual em tumores de nossa amostra foi
significativa. Trinta e oito pacientes (88,4%) apresentavam lesões que expressavam
intensamente o fator tecidual (76-100% das células tumorais positivas para FT, grupo 4).
Em três tumores (7%), a atividade do FT foi quantificada em 0 a 25% das glândulas, o que
corresponde ao grupo 1, e dois casos (4,6%) foram incluídos no grupo 2 (26-50% das
glândulas positivas para FT). Não foram identificados pacientes no grupo 3 (51-75% das
células coradas para FT).
Em função do pequeno número de pacientes alocados nos demais grupos e da
polarização observada na intensidade da expressão do FT, para melhor análise estatística,
os casos incluídos nos grupos 1 e 2 foram estudados em conjunto, formando um novo
grupo (0-50% das glândulas positivas para FT). As figura 3 ilustra um caso com elevada
expressão do fator tecidual tanto no citoplasma quanto na membrana celular encontrado em
nossa amostra.
Figura 3: Fotomicrografia de grande aumento demonstrando a expressão do fator tecidual
em glândulas neoplásicas de adenocarcinoma colo-retal.
49
3) Relação entre a expressão do fator tecidual e a densidade microvascular:
Observamos que, entre as lesões que apresentavam alta expressão do fator tecidual
(grupo 4), a média da contagem de microvasos por campo de grande aumento foi de 28,4 +
10,1. Já naqueles casos com expressão de ausente à moderada (grupos 1 e 2) e que foram
reunidos em um novo grupo de expressão fraca do fator tecidual, a média da contagem foi
de 17,1 +7,9 vasos por campo. A análise comparativa entre a média destes dois grupos se
mostrou estatisticamente significativa, com valor p=0,022, como vemos na figura 4.
Figura 4 – Gráfico de dotplot representando a densidade vascular, expressa pela contagem
de vasos por campo no hotspot, em relação à intensidade de marcação imunoistoquímica
para o fator tecidual
50
4) Relação entre a intensidade da expressão do fator tecidual e fatores clínicos e
anátomo-patológicos na amostra:
Na análise final dos dados referentes à população estudada observamos os resultados
que seguem:
• A média de idade dos indivíduos no grupo com alta expressão do fator tecidual foi de
60,2 +11,5 anos, em comparação com uma média de 42,6 +10,2 anos observada nos
casos de expressão mais reduzida, sendo a diferença estatisticamente significativa
(p<0,01).
• Quanto à distribuição por sexo, não houve diferença estatisticamente significativa na
distribuição de mulheres e homens entre os grupos de expressão alta ou reduzida do
fator tecidual.
• Quanto à classificação dos tumores pelo grau de diferenciação histológica, no grupo de
expressão elevada do fator tecidual observamos duas lesões bem diferenciadas (5,3%),
28 carcinomas moderadamente diferenciados (73,7%) e oito pouco diferenciados
(21%). Nos tumores com baixa expressão do FT não observamos lesões bem
diferenciadas, sendo três casos classificados como moderadamente diferenciados (60%)
e dois tumores considerados como pouco diferenciados (40%). Não foi observada
diferença estatisticamente significativa na comparação entre os dois grupos (p=0,67).
• Na análise comparativa entre os dois grupos de expressão do fator tecidual em relação à
profundidade de penetração na parede intestinal, entre os casos com expressão reduzida
foram encontrados quatro lesões invasoras da serosa ou gordura peri-intestinal (80%
das lesões no grupo) e uma lesão restrita a muscular própria do intestino (20%). No
grupo com elevada expressão do FT, duas lesões eram limitadas à submucosa (5,2%),
51
seis atingiam a muscular própria do intestino (15,8%), 27 progrediam até a serosa ou
gordura peri-intestinal (71,1%) e três comprometiam estruturas adjacentes (7,9%). A
distribuição pouco pareada comprometeu a análise estatística. Optou-se então por
agrupar as lesões em uma nova subdivisão: tumores de invasão limitada à parede, com
extensão submucosa ou até a muscular própria do intestino; e lesões francamente
invasoras, comprometendo a serosa ou gordura peri-intestinal, ou mesmo invadindo
estruturas adjacentes. Novamente, a diferença observada se mostrou sem diferença
estatística significativa. Na tabela 2, no item penetração, observa-se a freqüência das
lesões francamente invasoras estratificadas pela expressão do fator tecidual.
• Com relação à invasão da cadeia linfática regional do intestino, três pacientes no grupo
com expressão reduzida do fator tecidual apresentavam metástases linfonodais (60%
dos casos no grupo) em comparação com 17 (44,7%) no grupo de expressão elevada. A
diferença não foi considerada estatisticamente significativa.
• Quanto à evolução clínica dos pacientes tratados e acompanhados, observou-se que, dos
22 indivíduos que apresentaram recaída da doença, três (60% dos pacientes no grupo)
encontravam-se entre os casos de expressão baixa do fator tecidual e 19 (50% do grupo)
entre os de alta expressão. Na amostra estudada, todas as recidivas dos tumores colo-
retais evoluíram para óbito em função da doença. No grupo de baixa expressão do FT, o
tempo médio de sobrevida foi de 77 meses (IC: 24 – 130 meses). No grupo com
expressão elevada, a média da sobrevida foi de 89 meses (IC: 69-109 meses). A
diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,69). O gráfico 5 apresenta a curva
de sobrevida observada entre os casos de alta e baixa expressão do FT. Em ambos os
grupos, o fígado foi o sítio mais freqüente de metástases, sendo impossível uma análise
52
comparativa detalhada do padrão de recorrência em função da distribuição variável na
freqüência do local da recidiva neoplásica.
Figura 5: Curva comparativa da sobrevida dos pacientes tratados em relação à intensidade
da expressão do fator tecidual.
• Na distribuição dos casos com alta ou baixa expressão do fator tecidual em relação à
localização do tumor primário, o reto foi o local mais prevalente em ambas as situações,
53
com 60% dos casos nos dois grupos. Novamente, a ampla variação da localização dos
tumores combinado com o pequeno número de indivíduos no grupo com baixa
expressão impediu uma análise estatística detalhada.
A tabela 2 apresenta um resumo dos achados clínicos e anátomo-patológicos em um
quadro comparativo quanto à expressão do fator tecidual.
Tabela 2 – Características dos pacientes com tumor colo-retal segundo os níveis de
expressão do fator tecidual
Expressão do fator tecidual
Baixa
Alta
Característica n = 5
N = 38 P
Sexo masculino, nº (%) 3 (60,0)
24 (63,2) 1,00
Idade, anos 42,6±10,2
60,2±11,5 <0,01
Tipo histológico, nº (%)
0,67
Bem diferenciado 0 (0,0)
2 (5,3)
Moderadamente diferenciado 3 (60,0)
28 (73,7)
Pouco diferenciado 2 (40,0)
8 (21,0)
Penetração extensa na parede, nº (%)* 4 (80,0)
30 (78,9) 1,00
Metástases em linfonodos, nº (%) 3 (60,0)
17 (44,7) 0,65
Metástase sistêmica, nº (%) 3 (60,0)
19 (50,0) 1,00
Densidade microvascular, vasos/campo 17,1±7,9
28,4±10,1 0,02
Os dados são apresentados como nº (percentual) ou média±desvio padrão.
54
Discussão
A relevância da freqüência da expressão do fator tecidual em tumores malignos no
ser humano foi demonstrada diversas vezes na literatura internacional
(80,81,82,83,85,87,89,91,94). Como apresentado, a relação entre elementos ligados ao
mecanismo de coagulação já havia sido observada e descrita no final do século 19 (59).
Neste mesmo período foi também descrita a presença freqüente de coágulos sangüíneos e
depósito de material semelhante à fibrina em neoplasias malignas, aumentando o interesse
no estudo da interação entre a progressão do câncer e a cascata da coagulação (97). Mais
recentemente, o aperfeiçoamento do método científico possibilitou a identificação de
elementos da coagulação relacionados ao câncer, contribuindo para ampliar a compreensão
sobre a história natural deste grupo de doenças. Os possíveis mecanismos desta interação
envolvem (97): ativação direta da cascata da coagulação por células neoplásicas circulantes
na corrente sangüínea, fato relacionado aos estados de hipercoagulabilidade observados em
pacientes com câncer; ativação de fatores de coagulação em sítios extravasculares nos
tumores malignos; indução da produção de fatores relacionados à coagulação sangüínea por
células inflamatórias recrutadas pelo hospedeiro para a resposta imunológica ao tumor.
O fator tecidual produzido pelas neoplasias malignas parece participar da
progressão do câncer por mecanismos não só relacionados à cascata da coagulação, mas
também através de um sistema de sinalização intracelular não dependente diretamente de
elementos da coagulação sangüínea (59,70,74,75,97). Um dos principais pontos envolvidos
no estudo do papel desempenhado pelo fator tecidual no desenvolvimento do câncer é sua
habilidade de estimular a produção de vasos sangüíneos, fenômeno este já várias vezes
relacionado a um pior prognóstico oncológico em diversos tipos de lesões malignas
(25,26,31).
55
Os nossos achados quanto à freqüência da expressão do fator tecidual no câncer
colo-retal sugerem a importância do mesmo no estudo destes tumores. Em nossa amostra,
88,3% dos casos analisados apresentavam níveis consideráveis de fator tecidual na estrutura
das glândulas neoplásicas. Tais números são indicativos de que o fator tecidual está
presente e, como vimos, interage com outros elementos significativos para a progressão do
câncer colo-retal em uma parcela expressiva dos indivíduos portadores da doença. Tal
representatividade tem amplo respaldo na literatura internacional.
Gordon e Mielicki (98), em sua revisão sobre anormalidades hemostáticas
relacionadas ao câncer, descreveram o fator tecidual como uma das substâncias mais
relevantes na avaliação da atividade pró-coagulante de células isoladas de tumores
malignos humanos. De fato, Callander e colaboradores (99) descreveram que pelo menos
60% dos tumores de origem epitelial produziam fator tecidual, o qual podia ser detectado
por método imunoistoquímico. Mais significativo ainda para o objetivo do presente estudo
foi o fato de que, nas amostras estudadas por estes autores, as lesões do trato gastro-
intestinal apresentaram altos índices de positividade para o FT, sendo a análise
imunoistoquímica positiva em 100% das lesões de estômago e pâncreas. Carvalhal (91), em
sua série de adenocarcinomas de próstata observou expressão elevada
do FT em 73% dos
casos analisados, correlacionando este índice a fatores prognósticos significativos para este
tipo de tumor. Em outros estudos, neoplasias de diversas linhagens também demonstraram
altas taxas de positividade para o FT. Hamada e colaboradores (85) demonstraram que 86%
dos astrocitomas anaplásicos de sua amostra eram moderada ou altamente positivos para a
expressão do FT, sendo que, entre os glioblastomas, tal índice atingia 95%.
No caso específico do adenocarcinoma colo-retal os resultados obtidos são
semelhantes aos encontrados em outros estudos desse mesmo tipo de neoplasia. Callander e
56
colaboradores (99) descreveram que 75% das lesões colo-retais avaliadas para expressão do
FT eram positivas à análise imunoistoquímica. Seto e colaboradores (80), em 67 casos de
tumores de cólon e reto, observaram expressão do FT em 31 lesões (46%). Este número é
significativamente menor do que o encontrado em nossa amostra. Devemos observar que
Seto descreveu uma relação estatisticamente significativa entre a expressão do fator
tecidual e o estágio clínico visto pela classificação TNM, com tumores mais avançados
apresentando uma proporção maior de atividade do FT. Analisando detidamente o tamanho
de sua amostra, vemos que os tumores avaliados tinham uma distribuição de acordo com o
TNM bastante uniforme, com 14 casos (21%) no estágio I, em comparação com 2
indivíduos (4,6%) neste mesmo estágio em nossa casuística. Nakasaki e colaboradores (81)
chegaram à conclusão semelhante, relacionando a expressão do fator tecidual com o estágio
clínico da doença, sendo que 84,6% das lesões no estágio III apresentavam significativa
atividade do FT em comparação com 41,2% no estágio I. Uma vez que 83,7% da amostra
aqui estudada era composta de lesões localmente avançadas, o índice de expressão do fator
tecidual encontrado acompanha o que é observado na literatura, não sendo possível
demonstrar, como Seto e Nakasaki fizeram, uma relação estatisticamente significativa entre
a atividade do FT e o estágio TNM, por provável limitação do número de pacientes em
estágios mais precoces da doença.
De importância significativa há também a identificação de um dos prováveis
mecanismos da interação entre a atividade do fator tecidual e o comportamento de
neoplasias malignas. No nosso estudo, a expressão do FT foi associada a angiogênese
tumoral, efeito este demonstrado através de uma densidade microvascular maior em lesões
com alta atividade do FT em comparação com aqueles tumores com baixa expressão desta
proteína. Este dado também apresenta amplo respaldo na literatura.
57
Carvalhal (91) observou contagens microvasculares significativamente maiores em
lesões definidas como de elevada positividade para o fator tecidual. Para o autor, a relação
entre a expressão do fator tecidual e a angiogênese tumoral ficou particularmente
fortalecida através da contagem de microvasos nas proximidades das regiões onde a
atividade do FT era especialmente pronunciada. Com base nisso, fica caracterizada a
hipótese de uma relação causal entre a presença do FT nas células tumorais e o resultante
incremento na produção de vasos sangüíneos pelas lesões.
Outros autores observaram relação semelhante entre a presença do fator tecidual e a
contagem de vasos sangüíneos. Poon e colaboradores (89) descreveram contagens
microvasculares elevadas em carcinomas hepatocelulares que apresentavam atividade do
FT, fato este acompanhado de um pior prognóstico oncológico. Koomagi e colaboradores
(94) chegaram a esta mesma conclusão estudando neoplasias pulmonares do tipo não
pequenas células. De comum entre estes dois estudos, devemos observar que ambos
realizaram concomitantemente pesquisa para presença de VEGF nas lesões, concluindo que
o incremento na produção de vasos sangüíneos nos tumores foi resultado da ação desta
proteína, sendo provável que sua produção foi estimulada pela presença do fator tecidual.
Em adenocarcinomas colo-retais, Seto e colaboradores (80) reconheceram a
importância prognóstica da expressão aumentada do FT, mas não encontraram uma relação
estatisticamente significativa entre sua atividade e a presença de VEGF. Os autores
reconhecem a possibilidade de que outros agentes relacionados à presença do fator tecidual
podem ser os responsáveis pela disseminação metastática dos carcinomas de cólon e reto,
mecanismos estes eventualmente ainda associados a um incremento na produção de vasos
sangüíneos tumorais.
58
Estes dados são importantes na análise do presente estudo. Observou-se aqui uma
relação estatisticamente significativa entre a intensidade da expressão do fator tecidual e a
densidade microvascular. Tal relação aponta para um mecanismo de estímulo angiogênico
associado à presença do fator tecidual em neoplasias colo-retais. Estudos prévios haviam
indicado a existência de um mecanismo de sinalização intracelular mediado pelo complexo
FT/FVIIa que determinaria um aumento na produção de VEGF pelas células tumorais
(59,70,74,77). Seto e colaboradores (80), ao não demonstrarem uma relação entre a
expressão do fator tecidual e a presença aumentada de VEGF, levantaram a possibilidade
de que outros mecanismos estejam presentes, tanto para incrementar a progressão dos
tumores quanto para estimular a produção de vasos sangüíneos. Estes mesmos autores
colocaram como um limitador dos resultados apresentados pelo seu estudo o fato de não
terem pesquisado a densidade microvascular. Ao demonstrar que a atividade aumentada do
FT esta associada a uma maior produção de vasos sangüíneos, nosso estudo sugere a
expansão do leque de possibilidades de pesquisa no sentido de identificar outros possíveis
mecanismos angiogênicos ligados à expressão do FT e à cascata da coagulação.
Apesar de termos encontrado uma relação entre angiogênese e a presença do fator
tecidual, não observamos um impacto significativo no prognóstico dos casos estudados
frente à expressão desta proteína. Nossa revisão bibliográfica mostrou resultados muitas
vezes conflitantes em relação à importância prognóstica da contagem de microvasos
(44,45,46,47,48,49,50,51,52). A angiogênese tumoral e a resultante disseminação
mestastática, entretanto, são eventos multifatoriais dependentes de um balanço estrito entre
agentes pró e anti-angiogênicos (24). Outros mecanismos e interações precisam ser
esclarecidos, eventualmente com séries maiores de pacientes, para que se possa ampliar a
59
compreensão sobre a regulação de mecanismos de coagulação por neoplasias malignas e
seu efeito sobre a produção de vasos sangüíneos e sobre a evolução da doença.
Por fim, entre as diversas variáveis clinicas e anátomo-patológicas comparadas com
a expressão do fator tecidual, além da densidade microvascular, a única que demonstrou
resultados estatisticamente significativos foi a média de idade dos indivíduos estudados. O
grupo com expressão reduzida do fator tecidual era significativamente mais jovem do que o
grupo com alta expressão. Seto e colaboradores (80) também observaram, na sua série, que
pacientes com lesões com baixa expressão do FT tinham uma média de idade menor do que
os que expressavam intensamente a proteína, não sendo a diferença, entretanto,
estatisticamente significativa. Não encontramos na literatura evidências semelhantes às que
observamos em nossa série. Estes dados, entretanto, merecem referência para observação
futura em comparação com outros estudos.
60
Perspectivas de novos estudos envolvendo o fator tecidual e o câncer colo-retal:
Frente a freqüência e a intensidade da expressão do FT no adenocarcinoma colo-
retal, abrem-se inúmeras perspectivas de estudo tanto na avaliação da fisiopatologia da
progressão dos tumores em combinação com a cascata da coagulação, como na
possibilidade de novas abordagens terapêuticas.
Seto (80) sugeriu a possibilidade de que outros mecanismos moleculares além do
VEGF estejam associados a um estímulo angiogênico incrementado pelo fator tecidual. O
mesmo autor observou um pior prognóstico nas lesões com alta expressão desta proteína.
Como o VEGF parece ter sua produção estimulada pela atividade da porção
intracitoplasmática do FT, resta avaliar o significado que a porção extracelular ligante ao
Fator VII tem sobre a progressão da doença. Siegbahn (100) sugeriu que a ativação de
elementos da cascata da coagulação mediada pelo complexo FT/FVIIa conduziria ao
encapsulamento de células neoplásicas por fibrina e plaquetas o que poderia estar
relacionado a disseminação sistêmica e formação de mestástases. A identificação da
produção aumentada ou do consumo exagerado de elementos da coagulação sangüínea
poderiam contribuir para a elucidação da participação deste mecanismo na evolução do
câncer colo-retal.
O estudo da relação entre a cascata da coagulação e progressão do câncer pode ter
também aplicações terapêuticas. Ao serem identificadas lesões com maior atividade do FT,
medidas mais enérgicas na prevenção de fenômenos tromboembólicos podem reduzir a
mortalidade dos pacientes tratados (67). No caso do câncer colo-retal, tal medida pode ser
ainda mais importante. Lwaleed e colaboradores (101) observaram, em modelos
experimentais, que eventos de natureza infecciosa no pós-operatório podem resultar em
aumento da produção de FT o que poderia levar a um maior risco de trombose e embolia.
61
Uma vez que o elemento central do tratamento do câncer de cólon e reto é a cirurgia e
frente ao fato de que as ressecções do intestino grosso e reto resultam em um potencial
infeccioso considerável, a presença aumentada do FT nos tumores pode resultar em um
risco elevado de complicações tromboembólicas no período peri-operatório. Resta também
averiguar se tal reação apresenta efeito prognóstico a médio ou longo prazo no controle da
neoplasia.
Um outro campo de aplicação do conhecimento da participação do fator tecidual na
progressão dos tumores é o do diagnóstico e acompanhamento de indivíduos portadores de
neoplasias malignas. Lwalled e colaboradores (102) realizaram dosagens urinárias de FT
em pacientes portadores de doenças inflamatórias e de neoplasias benignas e malignas de
mama e de cólon. Observaram que o diagnóstico de tumores malignos era acompanhado de
aumento significativo dos níveis urinários de FT, sendo que havia também uma relação
entre estes índices e o grau de diferenciação histológica das lesões, sendo que pacientes que
evoluíram para óbito em função da doença apresentam os maiores valores dentre os casos
incluídos na amostra. Cabe agora investigar se a dosagem do FT na urina serve como um
parâmetro prognóstico e é útil no acompanhamento para detecção de recorrências
metacrônicas de tumores colo-retais submetidos a tratamento.
Por fim, surgem também opções terapêuticas através do bloqueio da cascata da
coagulação com resultante efeito antiangiogênico. Mousa e colaboradores (103), através de
estudos “in vitro” e em cobaias, demonstraram a ação antiangiogênica da tinzaparina, um
derivado de baixo peso molecular da heparina. O mecanismo de ação parece envolver a
ativação intracelular do chamado inibidor da rota do fator tecidual (“tissue factor pathway
inhibitor”, TFPI). Os autores demonstraram um bloqueio angiogênico com o uso da
tinzaparina em células de adenocarcinoma de cólon implantadas na membrana
62
corioalantóide de embriões de galinha, mecanismo este que pode ter aplicação clínica em
humanos.
63
Conclusões
A análise dos dados coletados em nosso estudo nos permitiu chegar às seguintes
conclusões:
• O FT apresenta expressão freqüente e intensa na membrana celular e no citoplasma de
células de adenocarcinoma do cólon e reto.
• Existe uma relação positiva entre o grau da expressão do fator tecidual e a angiogênese
tumoral, com densidade microvascular significativamente mais alta em lesões nas quais
a atividade do FT é elevada.
• Indivíduos portadores de tumores colo-retais com alta expressão do FT são, em média,
mais idosos do que aqueles com pouca ou nenhuma atividade desta proteína.
• Não foi observada relação entre a intensidade da expressão do FT e:
- a profundidade de penetração na parede intestinal pela neoplasia;
- a ocorrência de metástases linfáticas regionais;
- a sobrevida dos pacientes;
- o grau de diferenciação histológica dos tumores;
- os sítios de recorrência da doença;
- o sexo dos pacientes tratados;
- a localização das lesões no intestino.
64
Lista de abreviaturas
INCA: Instituto Nacional do Câncer.
AJCC: American Joint Committee on Cancer.
TNM: “tumor, node, metastases”; Tumor, nódulos linfáticos e metástases.
VEGF: vascular endothelial growth factor; fator de crescimento do endotélio vascular.
RNAm: ácido ribonucleico mensageiro
TGFs: “transforming growth factors”; fatores de crescimento transformadores.
DMV: densidade microvascular
FT: fator tecidual
FT/FVIIa: complexo FT/Fator VII ativado.
FXa: Fator 10 ativado.
DNA: Ácido desóxi-ribonucleico.
HSL-PUCRS: Hospital São Lucas da PUCRS.
TIFF: True Image Format File.
PBS: Phosphate binding saline.
65
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