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Caracterização imunobiológica
de isolados de leishmanias de
pacientes com Leishmaniose
Tegumentar Americana
CARINA SCOLARI GOSCH
GOIÂNIA-GO, 2005
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E
SAÚDE PÚBLICA
Orientador:
Fátima Ribeiro-Dias
Dissertação de Mestrado
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1. INTRODUÇÃO
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma zoonose causada por
protozoários do gênero Leishmania, que acomete a pele e/ou mucosas de diferentes
espécies de animais silvestres, sobretudo roedores, animais domésticos e
eventualmente o homem. Embora o homem não faça parte da cadeia de
transmissão habitual, ele apresenta uma suscetibilidade variada à infecção. Os
parasitos são transmitidos aos hospedeiros mamíferos por flebotomíneos de
florestas tropicais, dos gêneros Lutzomyia e Psychodopygus e, uma vez nos
hospedeiros, infectam e se multiplicam em células do sistema fagocítico
mononuclear (Desjeux, 1996; Ashford, 2000).
As leishmanioses encontram-se, segundo a Organização Mundial da Saúde
(OMS), entre as seis doenças infecto-parasitárias de maior importância no Brasil e
na América Latina. No que se refere à distribuição geográfica mundial, a
leishmaniose é prevalente nos 4 continentes (WHO, 2002). No Brasil, tem ampla
distribuição geográfica, apresentando franco crescimento, tanto em número de
casos quanto de municípios atingidos. Nos últimos 20 anos, a LTA apresentou
dispersão progressiva e surtos epidêmicos, principalmente nas regiões Centro-
Oeste, Norte e Nordeste, sendo registrados 21.800 casos de LTA em 1998 e um
aumento para 60.000 casos em 2003. Na região Centro-Oeste, em 64,3% dos
municípios houve registro de casos de LTA em 1998. A elevada incidência no
número de casos, entre os anos de 1997 a 1999, classificou a região como sendo a
segunda maior em coeficiente de detecção da doença. No estado do Mato-Grosso,
onde 100% dos municípios possuem registros de casos autóctones, foram
notificados 4.895 novos casos em 1999. No estado de Goiás, foi verificada uma
expansão significante em 4 anos, passando de 71 municípios atingidos em 1994
para 113 em 1998, o que correspondeu a um acréscimo de 62%, e foram notificados
532 casos em 1999 (FUNASA, 2000). Segundo dados da Secretaria Estadual de
Saúde do Estado (SINAN), o número de casos autóctones de LTA notificados nos
últimos anos em Goiás tem aumentado, sendo observado que a maior incidência da
doença ocorre principalmente em áreas rurais. A doença acomete principalmente
pessoas em plena atividade produtiva, do gênero masculino e maiores de 20 anos
(SINAN, 2001). Há uma tendência para a urbanização da LTA, tendo em vista o
aumento no número de registros da ocorrência de vetores peridomiciliares
1
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(FUNASA, 2000). A presença dos vetores, responsáveis pela transmissão das
espécies de leishmania em áreas urbanas, reflete a capacidade dos vetores e dos
parasitos em adaptar-se às mudanças em seu habitat natural. Tais fatores
contribuem para acentuar o problema de saúde pública que constitui a leishmaniose
(FUNASA, 2000; Oliveira et al., 2004).
Várias espécies de Leishmania são reconhecidas como agentes etiológicos da
LTA, elas são morfologicamente similares, porém produzem um amplo espectro de
manifestações clínicas da doença. No Brasil, as principais espécies responsáveis
pela LTA pertencem a dois subgêneros: (1) Viannia, representado pelas espécies L.
(V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis, associadas com lesões cutâneas localizadas
ou disseminadas e lesões mucocutâneas e (2) Leishmania, representado pela
espécie L. (L.) amazonensis, associada com o desenvolvimento de lesões cutâneas
localizadas ou com a forma difusa (FUNASA, 2000; Gontijo & Carvalho, 2003).
L. (V.) braziliensis é a espécie que possui maior distribuição geográfica no
Brasil, incluindo a região Centro-Oeste (Barbosa et al., 1976; Grimaldi et al., 1987;
Nunes et al., 1995; Dorta et al., 2003). Freqüentemente está associada ao
desenvolvimento das lesões mais graves da doença, com lesões cutâneas múltiplas
ou extensas, e cerca de 2% dos casos estão relacionadas à invasão de mucosa. A
forma mucocutânea apresenta lesões destrutivas do tecido e da mucosa naso-
faríngea, podem ser desfigurantes e também incapacitantes, gerando grande
repercussão no campo psicossocial do indivíduo. L. (L.) amazonensis está presente
numa extensa área geográfica, que compreende as regiões Norte, Nordeste,
Centro-Oeste e Sudeste. A doença causada por L. (L.) amazonensis é relativamente
rara, sendo amplamente variado o espectro clínico da doença, podendo ocorrer
lesão ulcerada, geralmente única, a forma visceral da leishmaniose ou a forma
cutânea difusa. Esta última é caracterizada pela presença de lesões nodulares com
infiltração cutânea pronunciada, dispersas por todo o corpo. As lesões geralmente
não cicatrizam espontaneamente e são classicamente resistentes ao tratamento
(Barral et al., 1991; FUNASA, 2000; WHO, 2002; Contijo & Carvalho, 2003). O
tratamento quimioterápico para LTA é realizado com o antimonial pentavalente,
Glucantime, como droga de primeira escolha. Apesar dos vários efeitos colaterais
causados pelo uso dessa droga, a porcentagem de cura clínica após o tratamento
correto é elevada (FUNASA, 2000).
2
O amplo espectro clínico após infecção por L. (L.) amazonensis ou L. (V.)
braziliensis é definido pela relação parasito-hospedeiro. Do ponto de vista do
hospedeiro, características genéticas associadas a fatores imunológicos podem
predispor ao desenvolvimento de formas brandas ou severas da doença. A infecção
por L. major em camundongos de linhagens genéticas diferentes, constitui o modelo
que melhor representa a relevância da genética do hospedeiro para a definição das
conseqüências da doença. L. major é uma das principais espécies causadoras de
leishmaniose cutânea no sudeste da Ásia e norte da África (WHO, 2002). A infecção
de camundongos da linhagem C57Bl/6 por esta espécie, revelou que estes
desenvolvem lesões locais que curam após algumas semanas. A resistência à
infecção foi associada ao desenvolvimento de células T CD4
+
auxiliares do tipo 1
(Th1), produtoras de interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF, do
inglês tumor necrosis factor). Ambas citocinas são importantes para a ativação de
macrófagos, capacitando-os a produzirem maiores quantidades de derivados
intermediários de oxigênio e nitrogênio. Essas moléculas, altamente tóxicas, são
responsáveis pela morte intracelular das leishmanias. Em contraste, a
suscetibilidade à infecção foi observada em camundongos da linhagem BALB/c.
Estes camundongos desenvolvem lesões persistentes, progressivas e pode ocorrer
a disseminação dos parasitos para os órgãos viscerais. A resposta imune ineficiente
para o controle da doença foi associada ao desenvolvimento de células T CD4
+
auxiliares do tipo 2 (Th2), produtores de interleucina 4, 10 e 13 (IL4, IL10 e IL13) e
fator transformador do crescimento β (TGF-β, do inglês Transforming growth factor
β), que inibem a produção de IFN-γ e a ativação dos macrófagos (revisto em
Mosmann et al., 1986; Sacks & Noben-Trauth, 2002).
Em humanos, o paradigma Th1/Th2, associado à cura ou não resolução da
infecção na LTA, não é tão claro como nos camundongos. Durante a fase ativa da
forma cutânea localizada há predominância de células T CD4
+
com produção mista
de citocinas do tipo Th1 e Th2 (IFN-γ e IL-4). Nos indivíduos que curam
espontaneamente ou naqueles que apresentam cura clínica após o tratamento
quimioterápico, foi observada uma proporção similar de células T CD4
+
e T CD8
+
,
com produção de IFN-γ e baixos níveis de IL-4 (Coutinho et al., 1998). No entanto,
indivíduos com a forma mucosa podem apresentar níveis de IFN-γ similares àqueles
de indivíduos que apresentam cura espontânea de lesões cutâneas (Carvalho et al.,
1995). A produção de TNF-α e IFN-γ controla a multiplicação dos parasitos na fase
3
inicial da infecção, no entanto, a produção de TNF-α exacerbada pode estar
associada a uma maior gravidade da doença. Níveis mais elevados de TNF-α foram
detectados nos pacientes com a forma mucosa da doença quando comparados com
indivíduos que apresentam a forma cutânea e uma dissociação entre níveis de IFNγ
e TNF-α foi observada em pacientes com a forma cutânea que curaram após
tratamento (Da-Cruz et al., 1996; D’Oliveira Jr. et al., 2002). A heterogeneidade
genética dos seres humanos dificulta a compreensão da relação parasito-
hospedeiro, responsável pelas conseqüências da infecção e das respostas imunes.
Em paralelo às características genéticas do hospedeiro, foi verificado que
componentes genéticos dos parasitos também influenciam na resposta imune do
hospedeiro e conseqüentemente nas manifestações clínicas da infecção. O uso de
modelos experimentais, com camundongos isogênicos, permite a avaliação da
virulência intrínseca de leishmanias. Scott et al. (1983) demonstraram que
camundongos C57Bl/6 infectados por diferentes espécies de leishmania
apresentavam cursos distintos de infecção. Diferenças na virulência dos parasitos
também foram identificadas em isolados de leishmania de uma mesma espécie. O
estudo da infecção de camundongos BALB/c por isolados de L. major do norte da
África revelou heterogeneidade no comportamento in vitro e in vivo destes parasitos.
O isolado que apresentou maior taxa de crescimento em culturas axênicas, também
foi o que promoveu a maior lesão na pata de camundongos infectados. E entre os
isolados, este foi o que apresentou menor capacidade de indução de IFN-γ e níveis
mais elevados de IL-4, detectados nas culturas dos linfonodos drenantes da lesão
(Kébaïer et al., 2001). Almeida et al. (1996) avaliaram isolados de L. (L.)
amazonensis obtidos de indivíduos com distintas formas clínicas de leishmaniose
(Cutânea localizada, Mucocutânea e Visceral) e verificaram que a patogenicidade
induzida por essas leishmanias em camundongos suscetíveis era heterogênea.
Características clínicas e imunológicas diferentes também foram observadas em
camundongos BALB/c infectados com isolados L. (V.) braziliensis de duas regiões
endêmicas do Brasil, um do estado do Ceará e outro da Bahia. O isolado do estado
do Ceará induziu aumento no tamanho da pata dos camundongos e a lesão foi
associada à fibrose cutânea e aumento ganglionar, características não observadas
na lesão induzida pelo isolado da Bahia (Indiani de Oliveira et. al., 2004).
4
Os dados acima demonstram que o polimorfismo dos parasitos influencia nas
manifestações clínicas da infecção em um determinado hospedeiro. Ao analisar a
variabilidade genética entre isolados de L. (V.) braziliensis, através das técnicas de
DNA Fingerprinting e RAPD (do inglês, Random Amplified Polymorphic DNA),
Gomes et al. (1995) identificaram um alto grau de polimorfismo genético entre os
isolados de duas populações de leishmania. Os autores atribuíram essas variações
genéticas, em parte, às diferenças eco–epidemiológicas das duas regiões
geográficas das quais os isolados foram obtidos, Pará e Minas Gerais. No entanto,
as diferenças genéticas não devem ser dependentes da distância entre as regiões
ocupadas pelos parasitos, pois os estudos de Ishikawa et al. (2002) mostraram que
isolados de duas localidades próximas do estado do Pará, apresentaram menor
similaridade genética entre si do que quando comparados a isolados dos estados do
Paraná. As diferenças genéticas foram associadas a pressões seletivas, exercidas
por diferentes componentes do ciclo de transmissão de cada área eco-
epidemiológica ocupada por esses parasitos, sugerindo que a ocorrência de
determinadas variantes genéticas esteja intimamente associada à relação dos
parasitos com seus reservatórios silvestres e insetos vetores. De fato, Cupolillo et al.
(2003) mostraram que apesar da alta heterogeneidade genotípica de isolados de L.
(V.) braziliensis do Brasil, a maioria dos genótipos é específica a algumas áreas
geográficas. Os autores descrevem que o grau de diversidade genética dos
parasitos apresenta forte correlação com a distribuição das espécies de vetores e
reservatórios silvestres. Dessa forma, clones de L. (V.) braziliensis com patrimônio
genético semelhante ou não podem ser encontrados em regiões próximas ou
distantes, dependendo apenas da existência de agentes de transmissão comuns
nas diferentes localidades.
A relevância deste elevado polimorfismo genético dos isolados de L. (V.)
braziliensis nas manifestações clínicas da LTA ainda necessita ser esclarecido. Os
dados recentemente publicados por Schriefer et al. (2004) demonstram uma
associação entre genótipos de L. (V.) braziliensis e determinadas manifestações
clínicas da doença, sugerindo a genotipagem das leishmanias para prognóstico da
LTA.
Um dos problemas para se avaliar a infecção por L. (V.) braziliensis é a
dificuldade do isolamento desta espécie a partir de lesões de pacientes e sua
manutenção em culturas axênicas. Isto faz com que não haja muitos estudos sobre
5
o comportamento biológico dos isolados desta espécie, cuja relevância se justifica
pela alta prevalência e pelo elevado número de casos de LTA causados por esta
leishmania no Brasil. A infecção de camundongos isogênicos com L. (V.) braziliensis
foi pouco investigada até o momento, sendo este modelo experimental importante
para avaliar se existem diferenças entre os parasitos, pois exclui as variações
individuais da resposta imunológica dos hospedeiros. No entanto, apesar das
dificuldades em avaliar as respostas de hospedeiros heterogeneicos, a avaliação da
interação entre o parasito e as células humanas é necessária para a compreensão
da relação parasito-hospedeiro e das manifestações clínicas da doença. Neste
aspecto, a interação entre as leishmanias e os macrófagos humanos é fundamental,
tendo em vista que os macrófagos sustentam o crescimento das leishmanias no
organismo, sendo ao mesmo tempo importantes células da imunidade inata e
participando efetivamente da regulação da imunidade adquirida.
A avaliação da infecção de macrófagos humanos in vitro por diferentes
espécies de leishmanias mostra que estas células são permissivas à infecção por
estes parasitos, porém, uma vez ativadas com produtos bacterianos, tais como o
lipopolissacarídeo (LPS) e citocinas, especialmente o IFN-γ, são capazes de eliminar
os parasitos intracelulares (Vouldoukis et al., 1995; Bosque et al., 1998; Panaro et
al., 1999). O IFN-γ é a principal citocina para o controle da infecção tanto in vitro
quanto in vivo, podendo ser a sua produção associada à resolução da infecção
(Coutinho et al., 1998). Os estudos de interação entre macrófagos humanos e
leishmanias são escassos e menos ainda há publicado, considerando a infecção por
L. (V.) braziliensis (Rey et al., 1990.).
Lainson & Shaw (1987) indicaram a análise de fatores intrínsecos dos
parasitos, como as características morfológicas e bioquímicas e dos fatores
extrínsecos, como a análise do comportamento dos parasitos nos hospedeiros e em
culturas in vitro, a resposta imune do homem, as características clínicas e a
distribuição geográfica, para a caracterização dos parasitos. Assim, no presente
trabalho foram caracterizados alguns isolados de leishmanias de pacientes com LTA
nas formas cutânea localizada ou disseminada, dos estados de Mato Grosso e
Goiás, sendo avaliadas características intrínsecas e extrínsecas dos parasitos, com
enfoque no estudo de isolados de L. (V.) braziliensis.
2. OBJETIVOS
6
2.1. Objetivos gerais:
Caracterizar isolados de leishmanias obtidos de pacientes com LTA
procedentes dos estados de Goiás e Mato-Grosso quanto ao subgênero e
espécie e quanto ao comportamento biológico dos parasitos.
Avaliar a interação entre três isolados de L. (V.) braziliensis, nativos da região
Centro-Oeste e de L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903 (leishmania
M2903) com diferentes macrófagos humanos.
2.1.1 Objetivos específicos:
a) Identificar o subgênero e a espécie de leishmanias oriundas de lesões
cutâneas de pacientes de diferentes localidades dos estados de Goiás e
Mato-Grosso, através de técnicas de PCR.
b) Avaliar o comportamento biológico dos isolados em culturas in vitro, por
análise do crescimento em culturas axênicas e suscetibilidade às variações
de temperatura (crescimento e metabolismo energético mitocondrial).
c) Avaliar a capacidade de um mesmo isolado de L. (V.) braziliensis e da
leishmania M2903 infectar macrófagos derivados de diferentes indivíduos,
através de co-culturas de macrófagos humanos e promastigotas em fase
estacionária do crescimento.
d) Comparar a capacidade de infecção de três isolados de L. (V.) braziliensis e
da leishmania M2903 em co-culturas com macrófagos oriundos de um
mesmo indivíduo.
e) Avaliar a suscetibilidade ou resistência de três isolados de L. (V.) braziliensis
e da leishmania M2903 aos mecanismos leishmanicidas dos macrófagos
humanos ativados com IFNγ e LPS.
f) Avaliar a indução de lesão nas patas de camundongos isogênicos da
linhagem C57Bl/6 pelos isolados de L. (V.) braziliensis e pela leishmania
M2903, através da mensuração da espessura das patas infectadas durante 9
semanas.
7
8
3. METODOLOGIA
3.1. Pacientes
Foram estudados sete isolados de leishmania obtidos de pacientes atendidos
no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad (HDT) de Goiânia, Goiás,
diagnosticados com LTA através de dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais.
Os pacientes eram provenientes da região Centro-Oeste, cinco deles do estado de
Goiás, apresentavam lesões cutâneas localizadas, e dois do estado do Mato
Grosso, um deles apresentava uma lesão cutânea localizada e o outro a forma
cutânea disseminada. Todos eram trabalhadores rurais, em idade produtiva, sendo
três mulheres e quatro homens. O estudo do material colhido dos pacientes foi
aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Doenças Tropicais e o consentimento
informado foi obtido de todos os indivíduos envolvidos no estudo.
3.2. Camundongos
Foram usados camundongos isogênicos das linhagens C57Bl/6 e C57Bl/6
geneticamente deficientes de Interfon - gama (IFN-γ KO, gentilmente doados pela
Profa. Dra. Leda Quércia Vieira, Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG),
fêmeas de idade entre 45 e 60 dias, fornecidos e mantidos no Biotério do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
(IPTSP/UFG/GO).
3.3. Parasitos
Foram usadas leishmanias de referência da Organização Mundial da Saúde
(OMS), L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903), referida no trabalho como
leishmania M2903 (gentilmente doada pelo Prof. Dr. Luis Carlos Crocco Afonso,
Departamento de Imunologia, UFOP) e L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8),
referida como leishmania PH8 (gentilmente doada pela Profa. Dra. Leda Quércia
Vieira, Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG). Essas leishmanias têm
9
sido extensivamente estudadas, servindo de controle para as nossas condições
experimentais. Também foram usados sete isolados de leishmanias obtidos de
pacientes atendidos no HDT.
10
3.3.1. Isolamento dos parasitos
Um fragmento de biópsia, obtido da lesão do paciente com leishmaniose foi
macerado em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,3 (PBS, do inglês
phosphate buffer saline) e inoculado na pata de camundongo C57Bl/6 IFN-γ
KO. Após o aparecimento da lesão, o camundongo foi sacrificado em câmara
contendo CO
2
. A lesão da pata e o linfonodo drenante foram retirados e
macerados em PBS, sendo em seguida, uma porção da suspensão celular
cultivada em placa de cultura de 24 poços (Costar, Cambridge, MA, EUA), em
meio Grace completo (Grace’s Insect Medium, Sigma Chemical Co., St Louis,
MD, EUA) suplementado com 20% Soro Fetal Bovino (SFB, Cripion,
Andradina, SP, Brasil) inativado, 2 mM de L-glutamina (Sigma), 100 U/mL de
penicilina (Sigma) e 100 μg/mL de estreptomicina (Sigma), à temperatura de
26ºC. A outra porção foi inoculada novamente em camundongos C57Bl/6
IFN-γ KO, para manutenção do parasito in vivo.
3.3.2. Cultivo dos parasitos in vitro
Os parasitos foram mantidos in vitro em placas de 24 poços (Costar),
cultivados em meio Grace completo, à temperatura de 26ºC. As leishmanias
foram repicadas de três em três dias, sempre iniciando a cultura com 5 x 10
5
parasitos/mL. A quantificação dos parasitos foi realizada após diluição de
uma pequena alíquota da cultura em PBS–formaldeído 2% e contagem em
hemocitômetro. De acordo com as curvas de crescimento, foram
considerados parasitos em fase logarítmica, os colhidos com dois dias de
cultura e, em fase estacionária, aqueles colhidos com cinco dias de cultura.
Para não haver perda de virulência, as leishmanias foram continuamente
inoculadas em camundongos e re-isoladas da pata. Os parasitos também
foram criopreservados em nitrogênio líquido (SFB contento 10% de
dimetilsulfóxido (DMSO), Sigma).
11
3.4. Caracterização do subgênero e da espécie das
leishmanias
3.4.1. Reação em cadeia da polimerase (Polimerase
Chain Reaction, PCR) para identificação do subgênero Viannia e da
espécie L. (L.) amazonensis
3.4.1.1. Extração do DNA genômico: Parasitos obtidos de cultura in vitro, em fase
estacionária (1 x 10
8
parasitos), foram lavados três vezes com 10 mL de PBS
através da centrifugação a 1.800 g por 15 min à temperatura de 10ºC. Após a
lavagem, os parasitos foram ressuspendidos em 150 µL de TELT (Tris 50 mM, pH
8,0; EDTA 62,5 mM, pH 9,0; LiCl 2,5 M; Triton X-100 4%) e homogenizados por 5
min, para romper as membranas celulares. Em seguida, foram acrescentados 150
µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, Gibco BRL, Grand Island, NY,
EUA) para separar o DNA das proteínas através da centrifugação a 15.000 g por 5
min, à temperatura ambiente (T.a. ~ 25ºC). A fração aquosa, contendo o DNA, foi
coletada e a esta fração foi acrescentado etanol absoluto (Merck, Rio de Janeiro,
RJ, Brasil) na proporção de 1:2 (v/v), seguida de incubação por 20 h a -20ºC. Após
incubação, as amostras foram centrifugadas (15.000 g por 5 min, à T.a.) e o
precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70% (15.000 g por 5 min, à T.a.). Ao
sedimento foram acrescentados 30 µL de TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0)
contendo 50 µg/mL de RNAse (USB
TM
, Cleveland, OH, EUA) e as amostras
incubadas por 1 h a 37ºC. As amostras de DNA foram conservadas a -20ºC.
3.4.1.2. Amplificação: O ensaio de amplificação pela PCR, foi
realizado conforme Volpini et al. (2004). Foram usados iniciadores que amplificam
regiões conservadas dos minicírculos do kDNA de Leishmania, produzindo
fragmentos de 120 pb para subgênero Viannia e 116 pb para o subgênero
Leishmania. Na reação foram usados 1 µM de cada iniciador (150: 5’ GGG(G/T)
AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA 3’ e 152: 5’ (C/G)(C/G) (C/G)(A/T)CT AT(A/T)
TTACACCAACCCC 3’), 200 µM de dNTPs, (utilizando dUTP), 0,4 U de Taq DNA
polimerase (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), tampão composto com Tris-HCL 10
mM, pH 8,6; KCl 50 mM; MgCl
2
1,5 mM e 1 µL da amostra de DNA. A amplificação
foi realizada em termociclador Mastercycler personal (Eppendof Research,
12
Hamburg, Germany), nas seguintes condições: desnaturação inicial da amostra a
95ºC por 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min, anelamento
a 55ºC por 30 seg e extensão a 72ºC por 10 seg, sendo a extensão final a 72ºC por
5 min. O produto de amplificação da PCR foi aplicado em gel de poliacrilamida 8%
(Gibco, EUA) após mistura com o tampão de amostra (Xylenocianol 0,25%, azul de
bromofenol 0,25% e sacarose 40%). A migração eletroforética foi realizada por 70
min a 80V utilizando o sistema Mini-Protean3cell (BioRad, Hercules, CA, EUA).
Após, a reação foi revelada pela coloração de nitrato de prata. Para isto,
primeiramente o gel foi fixado por 10 min (solução fixadora: ácido acético 0,5% em
etanol 10%) e depois, corado com solução de nitrato de prata 0,2% por 15 min sob
agitação, sendo em seguida, lavado com água. A solução reveladora foi adicionada
(formaldeído a 0,3% em hidróxido de sódio 0,75 M) para visualização das bandas.
3.4.1.3. PCR-RFLP (RFLP, Restriction Fragment Length
Polymorphism) para identificação do subgênero: As amostras positivas na PCR
foram digeridas pela adição de 1U das enzimas de restrição Hae III ou AVA I
(Invitrogen), por 3h a 37ºC. Apenas as espécies do subgênero Viannia apresentam
sítios de restrição para a enzima Hae III, que cliva o DNA em fragmentos com 80 e
40 pares de bases (pb). A enzima AVA I, específica para a espécie L. (L.)
amazonensis, cliva o DNA em fragmentos com 38 e 78 pb. O produto da restrição foi
separado em gel de poliacrilamida 15% no sistema Mini-Protean3cell (BioRad),
corado pela prata, como descrito acima.
3.4.2. PCR para identificação da espécie das leishmanias
do subgênero Viannia.
A identificação da espécie das leishmanias do subgênero Viannia foi
realizada pelo ensaio da PCR, através da amplificação da enzima glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49), conforme Castilho et al. (2003). No ensaio, o
DNA foi extraído como descrito acima, em seguida, a amplificação foi realizada
usando 50 µM dos iniciadores que amplificam a G6PD específicos para L. (V.)
braziliensis (ISVB, 5’ TACTCGCCAT GTCGGAGG 3’ e ISVC, 5’ ATCACAATGATG
GTCAACGCA 3’), 50 µM de dNTPs, 0,4 U de Taq DNA polimerase, tampão
composto com Tris-HCL 10 mM, pH 8,6; KCl 50 mM; MgCl
2
1,5 mM e 2 µL da
13
amostra de DNA. A amplificação foi realizada em termociclador Mastercycler
personal (Eppendof Research), nas seguintes condições: desnaturação inicial da
amostra a 94ºC por 4 min, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 min,
anelamento a 44ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 30 seg, sendo a extensão final
a 72ºC por 4 min. O produto de amplificação da PCR foi aplicado em gel de agarose
1% (Gibco, EUA) em tampão TAE (Tris acetato 40 mM e EDTA 2 mM). A migração
eletroforética foi realizada por 45 min a 80V, utilizando o sistema para eletroforese
de gel horizontal Sunrise (Gibco BRL, Life Technologies, Argentina). As bandas de
234 pb foram visualizadas pela incorporação de brometo de etídio (Bio-Rad).
3.5. Curva de crescimento dos parasitos
Os parasitos foram cultivados em meio Grace completo, à temperatura de
26ºC, em placas de cultura de 24 poços (Costar), iniciando a cultura com 5 x 10
5
parasitos/mL. A quantificação dos parasitos, como descrito acima, foi realizada
diariamente durante seis dias de cultura. A quantidade de parasitos foi expressa em
número de parasitos/mL.
3.6. Teste de suscetibilidade dos parasitos à
temperatura
A suscetibilidade a diferentes temperaturas foi avaliada in vitro através da
quantificação do número e da avaliação da atividade metabólica dos parasitos.
Parasitos em fase logarítimica do crescimento foram cultivados em placas de 96
poços de fundo chato (Costar), na concentração de 2 x 10
6
parasitos/0,1mL de meio
Grace completo ou meio RPMI 1640 completo (Sigma). Este último, suplementado
com 10% de SFB (Gibco, Argentina), 2 mM de L-glutamina (Sigma), 11 mM de
Bicarbonato de Sódio (Merck), 100 U/mL de penicilina (Sigma) e 100 μg/mL de
estreptomicina (Sigma), pH 7,3. As placas foram incubadas por 48 h em estufas
com diferentes temperaturas (26ºC; 35ºC ou 37ºC), em atmosfera úmida contendo
5% CO
2.
Após a incubação, foi realizada a contagem em hemocitômetro dos
parasitos cultivados em meio Grace completo e avaliada a atividade metabólica dos
parasitos cultivados em meio RPMI completo, através do ensaio colorimétrico do
MTT, (3-(4,5-dimethylthiazol- 2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma),
14
conforme descrito por Sabath et al. (2003). Brevemente, aos 100 µL das
suspensões de parasitos foram adicionados 20 µL do MTT (5 mg/mL em PBS) e as
placas foram então incubadas por 3 h em atmosfera úmida contendo 5% de CO
2
.
Após este período, foram adicionados 100 µL da solução SDS 10% - DMF 50%
(SDS, Dodecil sulfato de sódio, USB
TM
Cleveland, OH, EUA; DMF,
Dimetilformamida, Vetec, São Paulo, SP, Brasil), preparada conforme Hansen et al.
(1989). O SDS foi dissolvido a 10% a 37ºC em solução de DMF 50% em água, pH
4,7, ajustado com ácido acético a 80%. Esta solução dissolve os cristais de
formazan oriundos da redução do MTT, durante 20 h a 35ºC. A densidade óptica
(D.O.) foi determinada em filtro de 550 nm em um leitor de microplacas Thermo
Labsystems, descontando-se a D.O. dos poços controles que continham apenas
meio completo, tratados como os poços com parasitos.
3.7. Avaliação da interação das leishmanias com
macrófagos humanos
3.7.1. Separação de monócitos do sangue periférico e
infecção pelas leishmanias
Para a obtenção dos monócitos, foram utilizados 20 mL de sangue periférico
de 25 doadores saudáveis do Banco de Sangue do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Goiás (HC-UFG). As amostras de sangue venoso foram
colhidas em tubos vacutainer (BD Vacutainer
TM
, Juiz de Fora, MG, Brasil), contendo
solução de EDTA como anticoagulante. O sangue foi centrifugado a 240 g por 15
min (T.a.). O plasma, rico em plaquetas, foi descartado e o sangue diluído (v/v) em
solução de EDTA, 0,01 M em PBS, pH 7,3 (PBS-EDTA) e aplicado sobre gradiente
de densidade de sílica coloidal revestida por polivinilpirrolidona (Percoll, Sigma) com
densidade igual a 1,077, na proporção de 20 mL de sangue diluído para 10 mL de
Percoll. Após centrifugação a 1.400 g por 15 min (T.a.), o anel contendo as células
mononucleares (CMN) foi colhido da interface e lavado em solução de PBS-EDTA
(600 g, 10 min, T.a.). As CMN foram ressuspendidas em PBS-EDTA e a suspensão
foi aplicada sobre um segundo gradiente de Percoll, de densidade igual a 1,064
(Almeida et al., 2000), na proporção de 6 mL da suspensão de células para 3 mL
Percoll. Após centrifugação (1.400 g, por 15 min, T.a.), a interface rica em
15
monócitos foi colhida e lavada por duas vezes, sendo a primeira a 600 g e a
segunda a 200 g (10 min cada, T.a.). Após a última lavagem, as células foram
ressuspendidas em meio RPMI completo e quantificadas em hemocitômetro, após a
diluição de uma pequena alíquota da suspensão celular em solução de azul de
tripano 0,1% em PBS. A viabilidade celular foi determinada através da exclusão do
corante vital azul de tripano e foi sempre superior a 98%. Em seguida, os monócitos
foram cultivados em meio RPMI completo em placas de 24 poços (Costar), sobre
lamínulas de vidro de 13 mm de diâmetro (VWR Scientific, Inc. West Chester, PA,
EUA) na concentração de 2 x 10
5
células/0,5mL (para determinação do índice de
infecção e curva de crescimento dos parasitos), durante 48 h a 37ºC em atmosfera
úmida contendo 5% de CO
2
. Após esse período, os poços foram suavemente
lavados (meio RPMI completo pré-aquecido a 37ºC) para a retirada de células não
aderentes, sendo em seguida reposto o meio de cultura. Para pré-estimulação das
células, 10 U/mL de rIFN-γ humano (Sigma) foram adicionadas a alguns poços,
sendo as placas novamente incubadas por mais 24 h. Leishmanias, em fase
estacionária, foram lavadas três vezes com PBS (1.800 g, 15 min, 15ºC, para
retirada do meio Grace) e ressuspendidas em meio RPMI completo. Depois da
quantificação em hemocitômetro, a concentração foi ajustada para 2 x 10
5
parasitos/0,01mL. As leishmanias foram adicionadas aos macrófagos (proporção de
~ 1:1, célula:parasito), sendo as placas incubadas a 35ºC, em atmosfera úmida
contendo 5% de CO
2
, por diferentes períodos de incubação.
3.7.2. Avaliação do índice de infecção dos macrófagos e
do crescimento intracelular das leishmanias
Algumas lamínulas foram colhidas nos intervalos de 6 ou 24 h após
incubação dos macrófagos com as leishmanias, sendo fixadas e coradas como
descrito abaixo, para a avaliação do índice de infecção. Após 24 h, os poços foram
lavados com meio RPMI completo (pré-aquecido a 37ºC) para a retirada de
leishmanias extracelulares. Em seguida, o meio foi reposto e as placas re-incubadas
por mais 24 ou 48 h, para a avaliação do crescimento intracelular das leishmanias
após a infecção. As lamínulas foram fixadas com metanol absoluto e coradas
utilizando o Kit comercial Instant Prov, (Newprov, Pinhais, PR, Brasil). Em seguida,
foram fixadas sobre lâminas para microscopia, usando Entellan Novo (Merck KgaA,
Damstadt, Germany). Sob microscopia óptica (aumento de 1.000 vezes), foram
16
determinadas a freqüência de células infectadas e o número de parasitos em cada
100 células (300 a 500 células analisadas), bem como o número de parasitos nas
células infectadas (50 a 100 células infectadas analisadas).
3.7.3. Ensaio da atividade leishmanicida dos macrófagos
Macrófagos cultivados sobre lamínulas na ausência ou presença da
estimulação prévia com rIFN-γ (10U/mL) foram co-cultivados com as leishmanias,
como descrito acima, e simultaneamente ativados com 50 ng/mL de
lipopolissacarídeo (LPS, de Escherichia coli, sorotipo 0111:B4, Sigma). Em seguida,
a cultura foi incubada por 48 h a 35ºC, em atmosfera úmida contendo 5% de CO
2
.
Após esse período, as lamínulas foram colhidas, fixadas, coradas e as células
analisadas como descrito acima.
3.8. Infecção de camundongos C57Bl/6 e avaliação do
desenvolvimento da lesão
Leishmanias, em fase estacionária de crescimento in vitro, foram lavadas três
vezes com PBS através da centrifugação a 1.800 g por 15 min à 10ºC. Após, os
parasitos foram ressuspendidos em PBS e quantificados em hemocitômetro. Os
camundongos foram inoculados com 1 x 10
7
promastigotas na pata esquerda
traseira, num volume de 0,05 mL, via subcutânea, e na pata direita, com igual
volume de PBS. O desenvolvimento da lesão foi avaliado semanalmente por
mensuração da espessura das patas com o uso de paquímetro (Starfer, 150 x 0,02
mm). A medida da pata inoculada com leishmania foi subtraída da medida da pata
inoculada com PBS, sendo o resultado expresso como lesão em milímetros (mm).
3.9. Análises estatísticas
Os dados foram apresentados como média + EPM. Os resultados foram
avaliados pelo test t pareado de Wilcoxon ou por ANOVA Kruskal-Wallis seguida de
teste de Dunn ou por One-Way ANOVA/Bonferroni ou por Two-Way ANOVA. O
nível de significância foi estabelecido em p<0,05. As análises foram feitas utilisando
o GraphPad Prism 4.0 Software.
17
4. RESULTADOS
4.1. Perfil dos pacientes com LTA
Para avaliar o comportamento imunobiológico de leishmanias isoladas de
pacientes da região Centro-Oeste, foram selecionados aleatoriamente sete isolados
de leishmanias de pacientes diagnosticados com LTA, através de dados clínicos,
epidemiológicos (Quadro 1) e exames laboratoriais (Quadro 2). Como pode ser visto
no Quadro 2, nem sempre o exame direto ou o histopatológico confirmam a
presença de amastigotas, sendo o isolamento da leishmania das lesões dos
pacientes útil para a confirmação de LTA. Os pacientes selecionados incluíram três
do gênero feminino e quatro do gênero masculino, todos em idade produtiva
variando de 19 a 60 anos (média de 41 anos). O exame clínico identificou lesões
cutâneas localizadas do tipo ulcerada em seis pacientes e em um deles foi
diagnosticada a forma cutânea disseminada. O tempo de doença dos pacientes
variou de 45 dias a 2 anos, sendo que todos foram tratados com Glucantime e
apresentaram cura clínica após o tratamento. Os dados epidemiológicos revelaram
que a transmissão da leishmania ocorreu em área rural, onde residiam ou possuíam
atividade profissional ligada à agricultura ou à pecuária. Cinco dos pacientes eram
provenientes do estado de Goiás (GO) e dois do estado de Mato – Grosso (MT). A
localização dos municípios de procedência de cada paciente é mostrada na Figura
1.
4.2. Caracterização do subgênero e espécie dos
parasitos
Para isolar as leishmanias dos pacientes, foi feita uma biópsia da lesão e o
fragmento obtido foi macerado em PBS e inoculado na pata de camundongos
C57Bl/6 IFN-γ KO. Após o surgimento da lesão, as leishmanias foram isoladas da
pata e cultivadas em meio Grace a 26ºC. O isolamento dos parasitos confirmou
definitivamente o diagnóstico de LTA. Os parasitos foram então nomeados por:
IMG3, NAP3, JM3, SFF3, EGS3, VBL1 e JRS1.
18
Para a identificação do subgênero das leishmanias isoladas dos pacientes foi
realizada a técnica de PCR-RFLP. No ensaio da PCR, foram usados iniciadores que
amplificam regiões conservadas dos minicírculos do kDNA de leishmania,
produzindo fragmentos de 120 pb para o subgênero Viannia e 116 pb para o
subgênero Leishmania. A amplificação do DNA genômico dos isolados foi
visualizada em gel de poliacrilamida 8% após a coloração pela prata (Fig. 2A). Por
ser muito pequeno o número de pares de bases que separam os dois subgêneros,
foi realizada após a amplificação, a digestão do produto da PCR. As enzimas
utilizadas para a digestão foram, AVA I, que possui sítios de restrição específicos
para a espécie L. (L.) amazonensis, clivando o DNA em dois fragmentos, um de 38
pb e outro de 78 pb (Fig. 2B) e Hae III, que possui sítios específicos para o
subgênero Viannia e cliva o DNA em fragmentos de 40 pb e 80 pb (Fig. 2C). Na
restrição, foram visualizados os fragmentos de DNA tratados com as enzimas AVA I
ou Hae III, identificando que três dos isolados pertenciam a espécie L. (L.)
amazonensis e quatro ao subgênero Viannia. Como o enfoque deste trabalho foi o
estudo imunobiológico de isolados de L. (V.) braziliensis, foi realizado o ensaio da
PCR para caracterização da espécie de Leishmania do subgênero Viannia. Na PCR
foram utilizados iniciadores específicos para a amplificação de genes que codificam
uma isoforma da enzima G6PD exclusiva para a espécie de L. (V.) braziliensis. O
produto da PCR foi visualizado em gel de agarose 1%, após incorporação de
brometo de etídio (Fig. 3). Os resultados mostram que os quatro isolados do
subgênero Viannia pertencem a espécie L. (V.) braziliensis.
19
20
Quadro1. Perfil clínico e epidemiológico dos pacientes
a
.
a
Dados clínicos e epidemiológicos de sete pacientes com leishmaniose tegumentar
americana, atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad, Goiânia – Goiás.
Quadro 2. Dados laboratoriais dos pacientes
a
Pacient
e
Exame
Direto
Imunofluorescênci
a indireta (IFI)
Intradermorreação
de Montenegro
Analíse
histopatológica
IMG
Positivo Não reagente 10mm Presença de amastigota
NAP
Negativ
o
Não reagente
< 5mm
Inflamação crônica
JM
Positivo Não reagente 7mm Presença de amastigota
SFF
Negativ
o
Não reagente 5mm Inflamação crônica
JRS
Positivo Não reagente
< 5 mm
Presença de amastigota
EGS
Negativ
o
160 15 mm Inflamação crônica
VBL
Positivo 160 22 mm Inflamação crônica
a
Dados laboratoriais da 1ª consulta de sete pacientes com leishmaniose tegumentar
americana, atendidos no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad, Goiânia – Goiás
Paciente Gênero Idade Profissão Tempo
de lesão
Forma
clínica
Tipo
de lesão
N° de
lesão
Estado
IMG
F 43 Do Lar 45
dias
Cutânea
localizada
Ulcerada 2 GO
NAP
F 60 Do Lar 2
anos
Cutânea
localizada
Ulcerada 1 GO
JM
M 46 Agricultor 2
meses
Cutânea
disseminada
Ulcerada Várias MT
SFF
F 34 Do Lar 6
meses
Cutânea
localizada
Ulcerada 2 GO
JRS
M 29 Lavrador 4
meses
Cutânea
localizada
Ulcerada 3 GO
EGS
M 57 Lavrador 2
meses
Cutânea
localizada
Ulcerada 2 GO
VBL
M 19 Pedreiro 4
meses
Cutânea
localizada
Ulcerada 1 MT
21
Figura 2. Identificação do subgênero dos isolados de leishmania por PCR-
RFLP. O DNA dos parasitos foi extraído, amplificado e tratado com as enzimas de
restrição AVA I (Leishmania) ou Hae III (Viannia). O produto da PCR e os
fragmentos de restrição foram separados em gel de poliacrilamida seguido da
coloração pela prata. Em A: produto da PCR, B: produtos da PCR após digestão por
AVA I, C: produto da PCR após digestão por HAE III. Em A1, B1 e C1, padrão de
peso molecular de 25 pb; em A2, B2 e C2, L. (V.) braziliensis
MHOM/BR/1975/M2903, referência da OMS; em A3, B3 e C3, L. (L.) amazonensis
IFA/BR/1967/PH8, referência da OMS; em A4-A10, B4-B10 e C4-C10, isolados de
leishmanias (4-SFF3; 5-IMG3; 6-NAP3; 7-JM3; 8-EGS3; 9-JRS1; 10-VBL1); em A11,
controle negativo da PCR.
22
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
B
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
120 pb
116 pb
78 pb
38 pb
80 pb
40 pb
Figura 3. Identificação de L. (V.) braziliensis por PCR. O DNA extraído dos
parasitos do subgênero Viannia foi amplificado utilizando iniciadores específicos
para a enzima G6PD de L. (V.) braziliensis. O produto da PCR foi visualizado em gel
de Agarose 1%, após a incorporação do brometo de etídio. Em 1: padrão de peso
molecular φX-174; 2: L. (L.) amazonensis IFA/BR/1967/PH8, isolado de referência
da OMS; 3: L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, isolado de referência da
OMS; 4: isolado IMG3; 5: isolado NAP3; 6: isolado JM3 e em 7: SFF3; 8:controle
negativo.
23
234 pb
1 2 3 4 5 6 7 8
4.3. Diversidade morfológica das culturas de
leishmania e curso temporal do crescimento in
vitro dos isolados de L. (V.) braziliensis
O aspecto morfológico das culturas das leishmanias foi avaliado durante a
fase logarítmica de crescimento in vitro. Foi observado que as formas promastigotas
dos isolados de L. (V.) braziliensis, NAP3 (Fig. 4D), IMG3 (Fig. 4E), SFF3 (Fig. 4F) e
JM3 apresentam-se como pequenas estruturas ovaladas que se organizam em
grumos durante o processo de divisão binária. A morfologia dos isolados foi
comparada com a da L. (V.) braziliensis M2903. Foi observado que os isolados
IMG3 (Fig. 4E) e SFF3 (Fig. 4F) apresentam aspectos morfológicos de crescimento
distintos da leishmania M2903 (Fig. 4C). Para comparação, as Figuras 4A e 4B,
mostram parasitos L. (L.) amazonensis, que são maiores e crescem dispersos no
meio de cultura.
Promastigotas de leishmania recém isoladas da pata de camundongos
C57Bl/6, em fase logarítmica de crescimento in vitro, foram quantificadas e o
número de parasitos foi acertado para 5 x 10
5
parasitos/mL, para iniciar as curvas de
crescimento em meio Grace completo, a 26ºC. O crescimento in vitro foi avaliado
por contagem diária do número de parasitos por mL em hemocitômetro, durante seis
dias de cultivo. As curvas de crescimento dos isolados de L. (V.) braziliensis e da
leishmania M2903 estão representadas na Figura 5. O pico do crescimento das
leishmanias foi obtido no quarto ou quinto dia de cultivo. O isolado JM3 apresentou
maior número de parasitos no quarto dia cultura (50 ± 2,0 x 10
6
, n= 4), enquanto os
demais isolados, apresentaram número máximo de parasitos no quinto dia (M2903,
49,8 ± 4,6 x 10
6
, n= 4; NAP3, 48,2 ± 9,4 x 10
6
, n= 4; SFF3, 36,2 ± 6,2 x 10
6
, n = 4;
IMG3, 29,5 ± 0,5 x 10
6
, n= 4). O único isolado que apresentou diferença significante
no crescimento in vitro foi IMG3, este apresentou menor número de parasitos no
início da fase estacionária (4º dia, p< 0,05) e uma queda mais acentuada no número
de parasitos no sexto dia de cultura (p<0,05). Os parasitos foram considerados em
fase logarítmica de crescimento do primeiro ao terceiro dia de cultura, sendo usados
para experimento os colhidos no segundo dia de cultivo e, em fase estacionária do
quarto ao sexto dia de cultura, sendo usados para experimento os colhidos no
quinto dia de cultivo.
24
Figura 4. Diversidade morfológica das culturas dos isolados de leishmania. Os
parasitos foram cultivados em meio Grace a 26ºC e os aspectos morfológicos foram
analisados sob microscopia óptica durante a fase logarítmica de crescimento in vitro.
Em A: L. (L.) amazonensis, PH8, referência da OMS; B: isolado EGS3; C: L. (V.)
braziliensis M2903, referência da OMS; D: isolado NAP3; E: isolado IMG3 e em F:
isolado SFF3. Aumento óptico de 500 x em (A) e (B) e de 300 x em (C), (D), (E) e
(F).
25
A B
C D
E
F
0 1 2 3 4 5 6 7
J M3
M2 9 0 3
IMG 3
NA P 3
*
*
0,1
1
10
10 0
S F F 3
D ias d e cultura
Número de parasitos x 10
6
/mL
Figura 5. Curva de crescimento in vitro de isolados de L. (V.) braziliensis.
Parasitos em fase logarítmica foram cultivados na concentração inicial de 5 x 10
5
parasitos/mL em meio Grace completo, à temperatura de 26ºC. A quantificação dos
parasitos foi realizada em intervalos de 24 h durante seis dias de cultura, usando
hemocitômetro. Cada ponto representa a média ± EPM de 4 experimentos, cada um
realizado em duplicata. *p<0,05 (IMG3 vs JM3 e M2903, quarto dia das culturas, e
IMG3 vs NAP3, sexto dia das culturas), Two-way e One-way ANOVA/Bonferroni.
26
4.4. Aumento da temperatura altera o crescimento e a
atividade metabólica dos isolados de L (V.)
braziliensis
Para avaliar o comportamento dos parasitos em temperaturas acima daquela
do cultivo (26
o
C), o que é necessário para os ensaios de interação das leishmanias
com os macrófagos, foram avaliados o crescimento e a atividade metabólica dos
parasitos. Os parasitos em fase logarítmica foram cultivados na concentração de 2 x
10
6
/0,1mL em meio Grace, durante 48 h, em três diferentes temperaturas (26ºC,
35ºC e 37ºC), em atmosfera úmida contendo 5% CO
2
. Após este período de
incubação, o número de leishmanias foi quantificado em hemocitômetro. O
crescimento dos parasitos foi máximo na temperatura de 26ºC, havendo aumento
de 2 a aproximadamente 4 vezes no número dos parasitos em 48 h de cultivo (Fig.
6). O aumento da temperatura para 35ºC não causou uma redução significante no
crescimento dos isolados, exceto para a leishmania M2903 que teve redução de
40% no crescimento (p<0,01). O aumento da temperatura para 37ºC reduziu
significantemente o crescimento de três isolados, NAP3 (61%, p<0,05), IMG3 (62%,
p<0,05) e M2903 (55%, p<0,001). O isolado JM3 não apresentou alterações
significantes no crescimento com o aumento da temperatura.
A avaliação da atividade metabólica dos isolados foi realizada de maneira
similar à avaliação do crescimento, porém os parasitos foram cultivados em meio
RPMI completo durante as 48 h de incubação nas três diferentes temperaturas.
Neste ensaio foi utilizado o meio RPMI completo, por ser este o meio usado nos
ensaios de interação das leishmanias com os macrófagos. A atividade metabólica
da leishmania M2903 e do isolado NAP3 aumentou significantemente com a
elevação da temperatura de 26ºC para 35ºC ou 37ºC (p<0,001 e p<0,01,
respectivamente, n= 6, Fig. 7). Os isolados JM3 e IMG3, ao contrário, apresentaram
redução significante na atividade metabólica com o aumento da temperatura. O
isolado JM3 não apresentou alterações significantes à 35
o
C, porém, mostrou uma
redução de 34,6% na atividade metabólica a 37ºC (p<0,001, 35
o
C vs 37
o
C n= 10,
Fig. 7), enquanto o isolado IMG3 teve seu metabolismo reduzido em 77% a 35ºC
(p<0,05) e em 85,6% a 37ºC (p<0,01, n= 6, Fig. 7), este isolado apresentou
alterações morfológicas com o aumento da temperatura, sendo visualizadas formas
mais arredondadas a 35ºC e 37
o
C (dados não mostrados). Considerando a
27
temperatura para estudos de interações com os macrófagos, 35
o
C, foi concluído que
nesta temperatura, apenas a leishmania M2903 apresentou diminuição no
crescimento. E, ainda, nesta temperatura, a atividade metabólica dos isolados é
aumentada, exceto a do isolado IMG3.
28
M 2 9 0 3 N A P 3 J M 3 I M G 3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
26ºC
35ºC
37ºC
***
*
**
*
Número de parasitos x 10
6
/0,1mL
Figura 6. Aumento da temperatura diminui o crescimento in vitro da maioria
dos isolados de L. (V.) braziliensis. Formas promastigotas, na fase logarítmica do
crescimento, foram cultivadas na concentração de 2 x 10
6
parasitos/0,1mL de meio
Grace completo durante 48 h em diferentes temperaturas (26ºC, 35ºC ou 37ºC) em
atmosfera úmida contendo 5% CO
2
. Após a incubação, o número de parasitos foi
quantificado em hemocitômetro. Os dados representam a média ± EPM de 6 a 10
experimentos independentes, cada um em duplicata. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001
(26ºC vs 35ºC ou 26ºC vs 37ºC). One-way ANOVA/Bonferroni.
29
M 2 9 0 3 N A P 3 J M 3 IM G 3
26ºC
35ºC
37ºC
***
***
***
**
**
**
*
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
D.O.
550nm
Figura 7. Aumento da temperatura altera a atividade metabólica dos isolados
de L. (V.) braziliensis. Formas promastigotas, na fase logarítmica do crescimento,
foram cultivadas na concentração de 2x10
6
parasitos/0,1mL de meio RPMI completo
em diferentes temperaturas (26ºC, 35ºC ou 37ºC), em atmosfera úmida contendo
5% CO
2
. Após 48 h de incubação, foram adicionados às culturas 20µL de MTT (5
mg/mL em PBS) e as placas foram incubadas por mais 3 h, sendo a reação
finalizada com 100 µL de solução SDS 10% - DMF 50%. Após 20 h, a 35ºC, a
densidade óptica (D.O.) foi determinada em leitora de microplacas com filtro de 550
nm. Os resultados são representados como média ± EPM de 6 a 10 experimentos
independentes, cada um em duplicata. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001 (26ºC vs 35ºC
ou 26ºC vs 37ºC ou 35ºC vs 37ºC). One-way ANOVA/Bonferroni.
30
4.5. Macrófagos humanos são infectados pelos
diferentes isolados de Leishmania (V.)
braziliensis
Para avaliar a interação entre três isolados de L. (V.) braziliensis e da
leishmania M2903 com os macrófagos humanos, foi primeiramente verificada a
capacidade das leishmanias infectarem e sobreviverem dentro dessas células à
temperatura de 35
o
C. Para tanto, os macrófagos foram co-cultivados com as
promastigotas em fase estacionária do crescimento durante 6 ou 24 h. Após este
período, as culturas foram lavadas para retirada das leishmanias extracelulares. Em
seguida, o meio de cultura foi reposto e as células re-incubadas por mais 24 ou 48
h. A freqüência de células infectadas após 6 h variou de 10 a 13%, não aumentando
significantemente após 24 h (10,2 a 23,5%, medianas para os 4 isolados avaliados,
n= 5 doadores, Fig. 8A). O isolado JM3 apresentou aumento considerável na
freqüência de células infectadas após 48 e 72 h de cultivo.
O número máximo de parasitos por cada 100 macrófagos analisados variou
de 21,7 a 34,1 para os 4 isolados avaliados após 24 h de infecção e, exceto para o
isolado JM3, estes valores não foram alterados significantemente ao longo do
período de incubação (Fig. 8B, medianas, n= 5). O número máximo de parasitos por
macrófagos infectados variou de 1,4 a 2,3 após 48 h de incubação, não
apresentando diferenças entre os resultados obtidos para os 4 isolados (Fig. 8C,
medianas, n= 5). Os resultados demonstram que os diferentes isolados são capazes
de infectar macrófagos humanos e que sobrevivem dentro destes por até 72 h a
35
o
C. O isolado NAP3 foi o único que apresentou uma diminuição no crescimento
dentro dos macrófagos entre 24 e 48 h, porém não houve significância estatística.
Para avaliar a variabilidade da capacidade dos isolados em infectar os
macrófagos, bem como a suscetibilidade destas células à infecção por diferentes
leishmanias, foram avaliados macrófagos de 14 ou 15 indivíduos, após co-cultivo
com os isolados durante 48 h a 35
o
C. Pode ser observado que a freqüência de
células infectadas (Fig. 9A) e o número de parasitos em cada 100 macrófagos (Fig.
9B) foram similares para todos os isolados. O número de parasitos por macrófago
infectado (Fig. 9C) foi levemente maior para o isolado IMG3 do que o isolado NAP3
(3,2 vs 1,9, n= 14-15, p<0,05). As Figuras 9D, E e F mostram que um mesmo
isolado pode apresentar baixa capacidade de infecção para macrófagos de um
31
indivíduo e alta para outros (exemplo: o isolado JM3 infecta pouco as células do
indivíduo 3 e infecta muito as do indivíduo 13), bem como uma mesma cultura de
macrófagos pode mostrar diferentes graus de suscetibilidade aos isolados (exemplo:
células dos indivíduos 7 e 10 são pouco infectadas pela leishmania M2903 e muito
infectadas pelo isolado IMG3. Em contrapartida, os macrófagos dos indivíduos 14 e
15 são pouco infectados pelo isolado IMG3 e muito infectados pelo isolado NAP3).
Assim, a variabilidade na taxa de infecção das células de diferentes indivíduos
avaliados reflete as diferenças na capacidade de infecção dos parasitos, bem como
a variabilidade da suscetibilidade dos macrófagos hospedeiros. Os dados obtidos
sugerem que o isolado IMG3 apresenta maior capacidade de infectar macrófagos
humanos. A Figura 10 apresenta a morfologia de macrófagos infectados pelos
isolados JM3 (Fig. 10A) e IMG3 (Fig. 10B).
4.6. Tratamento com rIFN-γ e LPS diminui a infecção
dos macrófagos humanos.
Para avaliar a suscetibilidade dos isolados de L. (V.) braziliensis e da
leishmania M2903 aos mecanismos leishmanicidas dos macrófagos humanos, as
células foram pré-ativadas com rIFN-γ por 24 h e, em seguida, co-cultivados com as
leishmanias na presença de LPS. A freqüência de células infectadas foi
significantemente menor nas culturas tratadas com IFN-γ e LPS e infectadas com o
isolado IMG3 (20,0 vs 10,4%, Fig.11B, n= 9, p<0,05). Para os demais isolados,
apesar de algumas culturas de macrófagos apresentarem franca diminuição da
freqüência de células infectadas, na maioria delas tal fato não foi observado
(Fig.11A, C e D). Por outro lado, o tratamento com IFN-γ e LPS diminuiu
significantemente o número de parasitos em cada 100 macrófagos, sendo obtida
maior significância estatística com o isolado NAP3 (Fig.11E, F, G e H). O número de
parasitos por células infectadas diminuiu significantemente apenas para o isolado
JM3 (isolado NAP3: 1,9 [1,6-6,3] vs 1,6 [1,0-3,5]; isolado IMG3: 3,2 [2,3-4,4] vs 2,7
[1,8-3,9]; isolado M2903: 2,0 [1,7-3,8] vs 1,6 [1,3-3,3]; isolado JM3: 1,9 [1,3-3,5] vs
1,7 [1,2-2,6], n= 8-9, p<0,05, mediana [mínimo-máximo]
32
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
6
2 4 4 8
7 2
A
% d e m a c ró fa g o s in fe c ta d o s
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
6 2 4 4 8 7 2
B
Parasitos/100 macrófagos
0
1
2
3
4
M 2 9 0 3 N A P 3 IM G 3 J M 3
6 2 4 4 8
7 2
C
h o ra s d e in c u b a ç ã o
Parasitos/macrófagos
infectados
Figura 8. Isolados de L. (V.) braziliensis infectam e sobrevivem nos
macrófagos humanos. Monócitos humanos foram cultivados sobre lamínulas (2 x
10
5
/ 0,5 mL) por 48 h a 37ºC e em seguida, incubados na presença de diferentes
isolados de L. (V.) braziliensis (2 x 10
5
promastigotas em fase estacionária/0,5 mL)
durante 6 ou 24 h, a 35ºC, em atmosfera úmida contendo 5% de CO
2.
Após 24 h de
incubação, as culturas foram lavadas com meio pré-aquecido (37ºC). O meio de
cultura foi reposto e as células re-incubadas por mais 24 ou 48 h (35ºC). Após os
períodos de incubação, as lamínulas foram coradas e as células avaliadas sob
microscopia óptica. Em A: porcentagem de macrófagos infectados (300-500 células
avaliadas). Em B: número de parasitos em 100 macrófagos avaliados (300-500
células avaliadas). Em C: número de parasitos por macrófago infectado (50-100
células avaliadas). São apresentadas as curvas temporais, sendo cada ponto a
mediana do grupo avaliado (n= 5).
33
0
10
20
30
40
50
60
A
% de macrófagos infectados
0
20
40
60
80
100
120
140
160
B
Parasitos/100 macrófagos
NAP3 IMG3 JM3 M2903
0
1
2
3
4
5
6
7
8
C
*
Parasitos/macrófagos
infectados
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15
0
20
40
60
80
100
120
140
160
E
Parasitos/100 macrófagos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
D
% de macrófagos infectados
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
1
2
3
4
5
6
7
8
NAP3 IMG3
JM3
M2903
F
Doador
Parasitos/macrófagos
infectados
Figura 9. Infecção de macrófagos humanos pelos isolados de L. (V.)
braziliensis: variabilidade da capacidade infectante dos parasitos e da
suscetibilidade das células dos hospedeiros. Monócitos humanos foram
cultivados por 48 h sobre lamínulas (2 x 10
5
/ 0,5 mL de meio, 37ºC, 5% CO
2
), sendo
em seguida, co-cultivados com promastigotas em fase estacionária do crescimento
(2 x 10
5
/0,5 mL) por 48 h (35ºC, 5 % CO
2
). Após incubação, as lamínulas foram
coradas e avaliadas sob microscopia óptica. Em A e D: percentagem de macrófagos
infectados (300-500 células avaliadas); em B e E: número de parasitos/100
macrófagos (300-500 células avaliadas); em C e F: número de parasitos/macrófagos
infectados (50-100 células avaliadas). Em A, B e C são mostrados os valores
individuais e as medianas (n= 14-15). Em D, E e F são apresentados
individualmente cada cultura de macrófagos infectados pelos 4 isolados de L. (V.)
braziliensis. * p<0,05 (IMG3 x NAP3). Anova Kruskall Wallis/Dunn.
34
Fig. 10. Infecção de macrófagos humanos por isolados de L. (V.) braziliensis.
Monócitos humanos foram cultivados em meio RPMI na concentração de 2 x 10
5
células, sobre lamínulas de vidro, durante 72 h a 37ºC em atmosfera úmida
contendo 5% de CO
2 .
Em seguida, as células foram co-cultivadas com promastigotas
em fase estacionária de crescimento in vitro, durante 48 h a 35ºC (5% CO
2
). Após
esse período de incubação as lamínulas foram fixadas e coradas. Em A:
Macrófagos humanos infectados com o isolado JM3; B: macrófagos humanos
infectados com o isolado IMG3. Aumento óptico de 1.000 x em (A) e (B).
35
A
B
NAP3
0
10
20
30
40
50
60
A
% de macrófagos infectados
NAP3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
80
100
120
140
160
E
**
Parasitos/100 macrófagos
IMG3
0
10
20
30
40
50
60
B
*
% de macrófagos infectados
IMG3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
80
100
120
140
160
F
#
Parasitos/100 macrófagos
JM3
0
10
20
30
40
50
60
C
% de macrófagos infectados
JM3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
80
100
120
140
160
G
#
Parasitos/100 macrófagos
M2903
0
10
20
30
40
50
60
Meio
IFNγ+LPS
D
% de macrófagos infectados
M2903
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Meio
IFNγ+LPS
H
#
Parasitos/100 m acrófagos
Figura 11. Tratamento com rIFN-γ e LPS diminui a infecção dos macrófagos
humanos pelos isolados de L. (V.) braziliensis. Monócitos humanos foram
cultivados por 48 h (2 x 10
5
/ 0,5 mL de meio, 37ºC, 5% CO
2
) sobre lamínulas. Em
seguida, foram tratados com rIFN-γ (10U/mL) por 24 h e co-cultivados com
promastigotas em fase estacionária do crescimento (2 x 10
5
/0,5 mL) e LPS (50
ng/mL), por 48 h (35ºC, 5% CO
2
). Após incubação, as lamínulas foram coradas e
avaliadas sob microscopia óptica. Em A: NAP3; B: IMG3; C: JM3 e D: M2903 são
mostradas as percentagens de macrófagos infectados (300-500 células avaliadas);
em E: NAP3; F: IMG3; G: JM3 e H: M2903 são mostrados os números de parasitos
em 100 macrófagos (300-500 células avaliadas). São apresentados os valores
individuais e as medianas (n= 8-9), sendo representadas as diferentes culturas de
macrófagos pela mesma cor em todos os quadros. * p<0,05; ** p<0,01; # p< 0,02.
Test t pareado de Wilcoxon.
36
4.7. Diferenças no desenvolvimento da lesão induzida
pelos isolados de L. (V.) braziliensis em
camundongos C57Bl/6
Para avaliar o desenvolvimento da lesão nos camundongos C57Bl/6, estes
foram inoculados com 1 x 10
7
parasitos, em fase estacionária, na pata esquerda
traseira e na pata direita foi injetado PBS. O desenvolvimento da lesão foi
acompanhado semanalmente durante nove semanas, através da mensuração da
espessura da pata infectada subtraída da espessura da pata controle (Fig. 12). O
isolado JM3 apresentou um pequeno aumento no tamanho da pata na terceira
semana após a infecção, que atingiu um pico de 0,18 ± 0,04 mm de lesão, o qual foi
significantemente inferior aos valores obtidos para os demais isolados neste período
(p<0,01, n= 4, Fig. 13). Na quarta semana houve redução no tamanho da lesão
desse isolado, permanecendo assim até a nona semana após a infecção. O curso
de infecção dos camundongos infectados com os isolados IMG3 e a leishmania
M2903 foram similares. Ambos isolados induziram aumento súbito no tamanho da
lesão na segunda semana após a infecção (IMG3 0,9 ± 0,2 mm e M2903 0,78 ±
0,11 mm), sendo significantemente superior aos valores obtidos para os demais
isolados neste período (p<0,05, n= 2-6, Fig. 13). Os camundongos infectados pela
leishmania M2903 após a segunda semana do inóculo apresentaram redução
gradativa no tamanho da lesão até a oitava semana, quando não foram mais
detectadas diferenças entre as patas infectadas e as controles. Os camundongos
infectados com o isolado IMG3 apresentaram pico de lesão de 1,2 ± 0,2 mm (n= 2)
na quarta semana, e em seguida também apresentaram redução gradual na lesão
(Fig. 13). O isolado NAP3 induziu aumento gradativo no tamanho da lesão até a
quarta semana após o inóculo, que apresentou pico de 1,53 ± 0,08 mm, e não
houve regressão significante no tamanho da lesão até a nona semana após
infecção. O tamanho da lesão deste isolado na nona semana de infecção foi
significantemente maior do que o dos demais isolados (0,5 ± 0,2 n= 3, p<0,001),
sendo que nesta semana os animais foram sacrificados (Fig. 13).
37
Figura 12. Infecção de camundongos C57Bl/6 por L. (V.) braziliensis M2903.
Camundongos C57Bl/6 foram inoculados com 1x10
7
promastigotas em fase
estacionária de crescimento. O desenvolvimento da lesão foi acompanhado através
da mensuração da espessura da pata infectada (esquerda) subtraído da espessura
da pata controle (direita). Na foto acima, representação da lesão (~1mm)
desenvolvida após duas semanas do inóculo com a leishmania M2903.
38
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
J M3
M2 9 0 3
N A P 3
IMG 3
***
**
*
***
0 ,0
0 ,1
0 ,2
0 ,3
0 ,4
0 ,5
1 ,0
1 ,5
2 ,0
S e m a n a s a p ó s a in fe c ç ã o
Lesão (mm)
Figura 13. Curso temporal da infecção de camundongos C57Bl/6 com isolados
de L. (V.) braziliensis. Camundongos C57Bl/6 foram infectados com 1 x 10
7
parasitos em fase estacionária (0,05 mL), na pata esquerda traseira e na pata direita
foram injetados 0,05 mL de PBS. O curso da infecção foi avaliado semanalmente
por mensuração da espessura das lesões nas patas com o uso de paquímetro. A
medida de cada pata inoculada com leishmania foi subtraída da medida da pata
inoculada com PBS e o resultado foi expresso em milímetro (mm). Cada ponto
representa a média ± EPM (n=2-6 camundongos). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001,
Two-way e One-way ANOVA/Bonferroni.
39
5. DISCUSSÃO
No presente trabalho, foram avaliados sete isolados de leishmanias de
pacientes com LTA procedentes de diferentes municípios de Goiás e Mato-Grosso.
Seis dos pacientes apresentavam de uma a três lesões cutâneas localizadas, do
tipo ulcerada e um, a forma disseminada com múltiplas lesões. As lesões
geralmente eram identificadas nos membros superiores e/ou no segmento cefálico.
Quatro dos pacientes apresentavam linfadenopatia satélite e reatividade na
intradermorreação de Montenegro. As características clínicas destes pacientes são
representativas daquelas dos pacientes assistidos nos últimos 25 anos no
ambulatório do Hospital de Doenças Tropicais pela Dra. Ledice Inácia de Araújo
Pereira, componente do nosso grupo de pesquisa em Leishmaniose (Comunicação
pessoal). O mesmo perfil clínico foi observado em estudos anteriores realizados na
região (Rassi et al., 1972; Barbosa et al., 1976; Pereira et al., 1979, Nunes et al.,
1995). Nem sempre as características clínicas e epidemiológicas, associadas aos
dados laboratoriais são suficientes para o diagnóstico de LTA. Nos pacientes NAP e
SFF, os exames laboratoriais, como a análise histopatológica das biópsias, exame
direto e imunofluorescência indireta, não foram conclusivos. Assim, o isolamento do
parasito das lesões foi determinante para a confirmação da doença. Após o
isolamento dos parasitos foram utilizadas neste trabalho técnicas de PCR, para
identificar as leishmanias quanto ao subgênero e espécie (Castilho et al., 2003;
Volpini et al., 2004). Três isolados foram identificados como L. (L.) amazonensis e
quatro isolados pertencentes ao subgênero Viannia, foram todos da espécie L. (V.)
braziliensis. A espécie L. (V.) braziliensis tem sido descrita como a mais prevalente
na região Centro-Oeste, sendo a espécie L. (L.) amazonensis também isolada na
região (Barbosa et al., 1972; Grimaldi et al., 1987; Nunes et al., 1995). Estudo
realizado por Dorta et al. (2003) identificou através da técnica de PCR que 93,3%
dos pacientes com LTA, provenientes de um assentamento rural próximo à região
metropolitana de Goiânia - Goiás apresentavam infecção por leishmanias do
subgênero Viannia. A identificação das espécies de leishmania através de técnicas
moleculares permite o diagnóstico da LTA com alta especificidade e sensibilidade
(Fernandes et al., 1996; Castilho et al., 2003; Victoir et al., 2003; Volpini et al.,
2004). Essas técnicas permitem a caracterização precisa da espécie nas áreas em
que co-existem várias leishmanias, o que possibilita a caracterização epidemiológica
40
dos parasitos e pode permitir a avaliação de associações entre as características
clínicas e as espécies prevalentes, bem como entre as espécies e as respostas aos
tratamentos.
Como a imunologia da L. (V.) braziliensis é bem menos estudada que a da L.
(L.) amazonensis, o presente trabalho focalizou o estudo nessa espécie. As
características biológicas avaliadas dos isolados de L. (V.) braziliensis nativos da
região Centro-Oeste foram avaliadas simultaneamente com as da leishmania de
referência da OMS, a M2903, isolada de lesão cutânea de um paciente residente na
Serra dos Carajás estado do Pará (Walton et al., 1977). Foi demonstrado que esta
leishmania cresce relativamente bem em culturas axênicas e infecta hamster,
camundongos isogênicos e macrófagos humanos (Rey et al., 1990; Souza-Neto et
al., 2004). No presente trabalho, na análise da morfologia e do crescimento em
culturas in vitro, foi identificado que os isolados apresentam tamanho pequeno com
formação de pequenos grumos durante a fase logarítmica de crescimento. As
curvas de crescimento foram similares entre os isolados, sendo a taxa de
crescimento moderada. Tais características biológicas são compatíveis às de
leishmanias pertencentes ao subgênero Viannia (Walton et al., 1977).
Os isolados IMG3 e SFF3, apresentaram pequenas diferenças no aspecto
morfológico da cultura in vitro, com formação de grandes grumos e um rendimento
levemente menor do número de parasitos, quando comparados aos demais
isolados. Para cultura destes isolados foram testados diferentes meios de cultivo,
Grace ou RPMI 1640, preparados com diferentes concentrações de soro, lotes de
soro e pH, além da ausência ou presença de 5% CO
2
e, em todas as condições de
cultivo, os parasitos preservaram as mesmas características morfológicas. Também
foi necessário manter a cultura destes isolados em alta densidade para garantir a
sobrevivência dos parasitos (dados não mostrados). Tal fato pode ser resultado de
diferenças na capacidade de adaptação dos parasitos às condições experimentais
de cultivo in vitro. As curvas de crescimento obtidas com a leishmania M2903 foram
similares àquelas descritas por Rey et al. (1990). No presente trabalho, foi
observada uma grande homogeneidade entre as curvas temporais de crescimento
dos isolados de L. (V.) braziliensis, não sendo possível associar perfis de
crescimento das leishmanias com os aspectos clínicos dos pacientes. O isolado JM3
oriundo de paciente com LTA cutânea disseminada apresentou crescimento in vitro
similar aos demais isolados e ao da leishmania M2903. O número de isolados
41
avaliados foi pequeno, talvez com um número maior de isolados analisados,
oriundos de pacientes com diferentes formas clínicas de LTA seja possível verificar
associação entre perfis de crescimento in vitro e clínica. Tal associação foi
demonstrada por Kebaïer et al. (2001) na infecção de camundongos BALB/c por
diferentes isolados de L. major.
A suscetibilidade dos isolados de L. (V.) braziliensis e da leishmania M2903
ao aumento da temperatura foi avaliada no presente trabalho. A sobrevivência dos
parasitos em temperaturas superiores à de cultivo in vitro é fundamental para que
estes sejam capazes de infectar macrófagos. A análise do crescimento in vitro, feita
pela contagem dos parasitos em diferentes temperaturas, identificou que o aumento
da temperatura de 26ºC, usada no cultivo das leishmanias, para a temperatura de
35ºC, que mimetiza a da infecção in vivo na leishmaniose cutânea, não alterou o
crescimento dos isolados. Houve redução significante apenas no crescimento da
leishmania M2903. Na temperatura de 37ºC, somente o isolado JM3 não apresentou
redução no crescimento. Este isolado provém de paciente com a forma cutânea
disseminada da doença, sendo provável que haja uma correlação entre resistência à
temperatura e capacidade de disseminar ou invadir mucosas. Redução no
crescimento intracelular das espécies L. tropica e L. (L.) amazonensis em
macrófagos peritoneais de camundongos C57Bl/6 devido ao aumento da
temperatura de 35ºC para 37ºC foram observados por Scott et al. (1983), sugerindo
que isolados de LTA da forma cutânea são mais sensíveis ao aumento da
temperatura.
A atividade metabólica mitocondrial dos isolados também foi avaliada em
diferentes temperaturas, tendo sido demonstrado neste trabalho que os isolados
apresentam elevada atividade metabólica à 35ºC, à exceção do isolado IMG3. O
aumento da temperatura para 37ºC reduziu a atividade metabólica dos isolados
IMG3 e JM3. Assim, o metabolismo energético mitocondrial parece ser
diferentemente alterado pela elevação da temperatura nos diferentes isolados. O
aumento da atividade das mitocôndrias foi relacionado à transformação das
amastigotas em promastigotas, (revisto em Figueiredo et al, 1976). Dessa forma, a
redução na atividade mitocondrial com a elevação da temperatura nos isolados
IMG3 e JM3 pode estar relacionado à transformação das promastigotas para a
forma amastigota. Sereno et al. (1997) utilizando o ensaio do MTT também
mostraram que há menor atividade metabólica nas formas amastigotas, estudando
42
L. (L.) amazonensis. Nas culturas do isolado IMG3 foram visualizadas formas mais
arredondadas nas temperaturas de 35ºC e 37ºC (dados não mostrados). Os ensaios
de avaliação da taxa de crescimento e da atividade metabólica dos isolados, frente
ao aumento da temperatura, foram realizados com os meios Grace ou RPMI e com
promastigotas em fase logarítmica ou em fase estacionária, foi observado o mesmo
fenômeno em todas as condições analisadas (dados não mostrados).
No presente trabalho, a avaliação da capacidade de infecção de macrófagos
humanos pelos diferentes isolados de L. (V.) braziliensis mostrou que esta é
heterogênea, dependendo tanto do parasito quanto do hospedeiro. A alta
variabilidade na freqüência de células infectadas e no número de parasitos por
células dificultou as análises, não sendo demonstradas significâncias estatísticas em
relação à freqüência de células infectadas ou número de parasitos em 100
macrófagos avaliados. Com relação ao número médio de parasito por célula
infectada, o isolado IMG3 mostrou um número significantemente superior ao do
isolado NAP3, sendo similar aos demais isolados. Analisando o perfil individual dos
isolados e das diferentes culturas de macrófagos, foi demonstrado que um mesmo
isolado pode infectar um menor ou maior número de macrófagos de diferentes
indivíduos, revelando a diversidade do hospedeiro. Por outro lado, uma mesma
cultura de macrófagos pode ser infectada em diferentes graus pelos 4 isolados
avaliados, revelando a diversidade do parasito. Assim, a combinação parasito-
hospedeiro é determinante na infecção pela leishmania.
Considerando a baixa relação parasito:macrófago utilizada no presente
estudo (~1:1), houve uma freqüência relativamente elevada de macrófagos
infectados após 6 h de incubação. Uma hora de incubação rendeu freqüências
muito baixas (dados não mostrados) e ao co-cultivar os macrófagos por 48 h com as
promastigotas foi possível aumentar a infecção e avaliar o fenômeno com maior
amplitude. Curtos períodos de incubação de macrófagos humanos com diferentes
espécies de leishmanias têm sido bastante utilizados, porém com maiores relações
parasito:macrófagos, em geral 10:1 ou 20:1 (Pearson et al., 1983; Robledo et al.,
1994; Vouldoukis et al., 1995; Bosque et al., 2000). Para análises por períodos mais
longos de co-cultivo de leishmanias com macrófagos, as relações
parasitos:macrófagos são baixas, na ordem de 1:1 ou menos (Passwell et al., 1984;
Panaro et al., 2001). Poucos trabalhos relatam a infecção de macrófagos humanos
com L. (V.) braziliensis e estes usaram altas relações parasitos:macrófagos por
43
curtos períodos de incubação, apenas para avaliar o grau de infecção, sendo que os
macrófagos eram das linhagens celulares U937 e THP-1 (Ogunkolade et al., 1990;
Rey et al., 1990).
Foi observado no presente trabalho que os macrófagos são infectados pelos
diferentes isolados de L. (V.) braziliensis e que estas são quantificáveis até 72 h de
cultura a 35
o
C, estando a maioria íntegra dentro dos macrófagos, indicando que
essas células sustentam a viabilidade das leishmanias até este período. O aumento
da freqüência de células infectadas e número de parasitos por macrófagos nas co-
culturas com o isolado JM3, sugere que as leishmanias extracelulares podem não
ter sido totalmente retiradas nas lavagens após 24 h de infecção e continuaram
infectando os macrófagos, ou que este isolado após 48 h apresenta maior
capacidade de replicação intracelular quando comparados aos demais. Portanto,
experimentos futuros devem avaliar a capacidade de replicação destes isolados por
períodos mais longos do que os utilizados no presente trabalho.
O co-cultivo das leishmanias com os macrófagos até 48 h a 35
o
C, quando o
número de parasitos por macrófagos em todos os isolados foi similar, permitiu
avaliar o efeito do tratamento com IFN-γ e LPS na infecção. O tratamento com IFN-γ
24 h antes da infecção e tratamento com LPS simultâneo à infecção reduziu a
freqüência de células infectadas, especialmente naquelas culturas de macrófagos
que continham um menor número de parasitos por 100 células, indicando que a
diminuição da freqüência de células infectadas está associada à morte dos parasitos
e não a uma resistência dos macrófagos à infecção. O tratamento com IFN-γ e LPS
reduziu de maneira estatisticamente significativa o número de parasitos por
macrófagos em todos os isolados avaliados, porém pode ser observado que há
diferenças individuais. Uma mesma cultura de macrófagos consegue matar os
parasitos de um isolado e não de outro, o que mostra que o macrófago foi ativado,
mas o parasito é resistente aos mecanismos de morte. No entanto, este mesmo
parasito pode ser morto por outra cultura de macrófagos. Tais resultados sugerem
que a interação parasito-macrófago determina as conseqüências da infecção. Os
parasitos que conseguem interferir com os mecanismos microbicidas dos
macrófagos ativados conseguem sobreviver nos macrófagos, enquanto aqueles que
não interferem nestes mecanismos serão eliminados.
O IFN-γ é a principal citocina produzida pelo sistema imune para controlar a
infecção por leishmanias, sendo responsável pela ativação dos mecanismos
44
microbicidas dos macrófagos, representados especialmente pelas espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio (Passwell et al., 1986; Passwell et al., 1986; Murray et al.,
1987; Green et al., 1990; Mauel et al., 1991). Na clínica da LTA é evidente a
associação entre produção de IFN-γ e bom prognóstico da doença (Coutinho et al.,
1996; Ajdary et al., 2000; Pompeu et al., 2001; D´Oliveira Jr et al., 2002). A ativação
de macrófagos por IFN-γ causa um aumento na expressão de receptores similares à
proteína Toll (TLR, do inglês, toll-like receptor), o TLR4, o que justifica o aumento da
ativação do macrófago pelo LPS, aumentando o poder microbicida dessas células
(Bosisio et al., 2002). No presente trabalho, a ativação das culturas de macrófagos
somente com IFN-γ também foi eficaz na redução da freqüência de células
infectadas e do número de parasitos por células (dados não mostrados). Uma
análise da capacidade dos diferentes isolados de induzir fatores microbicidas, bem
como de inibidores de macrófagos é necessária para uma melhor compreensão da
relação parasito-macrófago humano. Diferentes isolados de L. (V.) braziliensis
podem induzir diferentes níveis de TGF-β, o qual é inibidor do macrófago e favorece
o crescimento de leishmanias (Barral et al., 1993).
Para avaliar o comportamento dos isolados in vivo, no presente trabalho
foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C57Bl/6. O curso da infecção
e a resposta imune dessa linhagem de camundongo infectado pela leishmania
M2903 foram anteriormente demonstrados por Souza-Neto et al. (2004) e os
resultados obtidos sobre o curso da infecção foram similares ao do presente
trabalho. Somente o isolado IMG3 induziu curso de infecção similar ao da
leishmania M2903, enquanto os demais isolados induziram diferentes cursos de
infecção nos camundongos. Considerando a homogeneidade genética dos
hospedeiros, o polimorfismo clínico obtido indica uma variabilidade nos fatores de
virulência dos parasitos. O isolado JM3, proveniente da forma disseminada da
doença, induziu uma pequena lesão nos camundongos quando comparado às
outras leishmanias, todas isoladas de formas cutâneas localizadas. Apesar desse
isolado ser o mais patogênico ao homem, ele parece ser pouco patogênico para
esta linhagem de camundongo isogênico. Tal resultado sugere que haja diferenças
nos parasitos relacionadas à capacidade destes para se adaptarem a diferentes
hospedeiros. Resultados similares foram descritos por Almeida et al. (1996) com
isolados de L. (L.) amazonensis. Naquele trabalho, isolados de L. (L.) amazonensis
de pacientes com a forma clínica visceral da doença foram menos patogênicos para
45
os camundongos BALB/c do que os isolados de pacientes com as formas cutânea
ou mucosa. Estudando isolados de L. (V.) braziliensis, Kahl et al. (1990) também
mostraram que isolados de pacientes com LTA com a forma cutânea localizada
levam ao desenvolvimento mais rápido e intenso de lesões em hamster do que os
isolados da forma cutâneo-mucosa.
O isolado NAP3 foi o único que não apresentou resolução da infecção até a
última semana avaliada. O curso temporal da infecção deste isolado deve ser
acompanhado por um período mais longo antes que seja concluído que não há
resolução da infecção induzida por ele. Ausência de resolução de infecção por
isolados de L. (V.) braziliensis de pacientes com LTA cutânea localizada foi descrita
por Kahl et al. (1990), usando hamster como modelo de infecção experimental. A
falta de cura clínica também foi descrita para um isolado de L. (V.) braziliensis em
camundongos BALB/c (Childs et al., 1984).
A baixa infectividade de isolados de L. (V.) braziliensis, bem como das
leishmanias da OMS M2903 e LTB11, para camundongos isogênicos, tem sido
descrita (Childs et al., 1984; Dekrey et al., 1998; Indiani de Oliveira et al., 2004;
Maioli et al., 2004). Na maioria dos modelos, a lesão não ultrapassa 1 mm de
espessura. Os resultados do presente trabalho são compatíveis com estes
anteriormente descritos. A diversidade na capacidade patogênica dos isolados para
o camundongo C57Bl/6 não foi associada à variabilidade na bioquímica dos
parasitos, quanto às alterações de atividade metabólica mitocondrial in vitro.
Parasito com alta atividade metabólica (M2903) à 35ºC induziu lesão significante no
camundongo, que regrediu após algumas semanas, sendo que este mesmo perfil de
infecção foi obtido com o isolado IMG3 que possui baixa atividade metabólica a
35ºC.
Apesar das dificuldades em interpretar os resultados ao se avaliar a interação
entre diferentes isolados de leishmania e culturas de macrófagos heterogeneicos, a
importância deste estudo, paralelamente à infecção de camundongos isogênicos, é
representada, no presente trabalho, pelos resultados obtidos com o isolado JM3.
Este isolado, oriundo de um paciente com LTA cutânea disseminada, parece ser
pouco patogênico para o camundongo utilizado (C57Bl/6), podendo sugerir uma
baixa capacidade de infecção. No entanto, este isolado infectou bem várias culturas
de macrófagos humanos. A patogenicidade de um isolado não deve ser associada
unicamente à capacidade de infecção e replicação do parasito, pois mesmo poucos
46
parasitos podem ser patogênicos (Khal et al., 1991; Sinagra et al., 1997; Chang et
al., 2003; Indiani de Oliveira et al., 2004). O isolado JM3 também mostrou baixo
índice de infecção em algumas culturas de macrófagos, ainda assim, ele pode ser
altamente patogênico.
No presente trabalho, foram caracterizados molecularmente sete isolados de
leishmanias da região Centro-Oeste quanto ao subgênero e espécie e
biologicamente 3 isolados de L. (V.) braziliensis. Foram identificados dois isolados
de estados diferentes, Goiás (IMG3) e Mato Grosso (JM3) com características
clínicas diferentes (IMG3, cutânea localizada e JM3, cutânea disseminada), com
características de crescimento em culturas axênicas similares, porém com
significantes diferenças no curso temporal e intensidade de desenvolvimento da
lesão em camundongos isogênicos. Estes dois isolados podem ser úteis como
modelos para a avaliação da relação parasito-hospedeiro nesta linhagem de
camundongos isogênicos. O estudo destes isolados pode assim contribuir para um
melhor entendimento da patogenia e das respostas imunes à L. (V.) braziliensis,
atualmente pouco compreendida por falta de modelos murinos para estudo. O
polimorfismo clínico apresentado por estes isolados na infecção de camundongos
pode estar associado a um polimorfismo genético, para tanto, a caracterização
genética dos parasitos pela técnica RAPD-PCR está sendo realizada.
47
6. CONCLUSÕES
• Dos sete isolados de leishmania oriundos de pacientes com LTA
procedentes de Goiás e Mato-Grosso, três eram da espécie L. (L.)
amazonensis e quatro da espécie L. (V.) braziliensis.
• As características morfológicas das culturas dos isolados de L. (V.)
braziliensis foram compatíveis com as descritas para leishmanias do
subgênero Viannia, tendo sido encontradas pequenas diferenças nos
isolados IMG3 e SFF3, em relação ao isolado de referência M2903.
• O curso temporal de crescimento in vitro, avaliado pela contagem diária
dos parasitos, foi similar para todos os isolados, não sendo possível
associar perfil de crescimento in vitro com os aspectos clínicos dos
pacientes.
• A temperatura de 35ºC não altera significantemente o crescimento dos
isolados e o ensaio de atividade metabólica identificou elevada atividade
dos parasitos à 35ºC, com exceção do isolado IMG3. Redução na
atividade metabólica também foi observada na temperatura de 37ºC nos
isolados IMG3 e JM3.
• Todos os isolados foram capazes de infectar macrófagos humanos, no
entanto, o índice de infecção foi heterogêneo. Não houve diferenças
significantes na freqüência de células infectadas e no número de
parasitos por células. O número de parasitos do isolado IMG3 por célula
é significantemente maior do que o do isolado NAP3. A diversidade do
hospedeiro foi verificada pela variação da infecção de um mesmo
isolado em diferentes culturas de macrófagos e a diversidade do
parasito foi verificada pelo diferente grau de infecção dos isolados em
uma mesma cultura de macrófagos.
• O tratamento com IFN-γ e LPS reduziu a freqüência de células
infectadas, principalmente nas culturas de macrófagos que continham
pequeno número de parasitos, indicando que a diminuição da freqüência
de células infectadas está associada à morte dos parasitos. Embora
tenha sido demonstrada uma redução da infecção para todos os
isolados com o tratamento com IFN-γ e LPS, diferenças individuais
48
apontam que os efeitos do tratamento são dependentes da interação
parasito-hospedeiro.
• Houve diferenças significantes no desenvolvimento das lesões nas patas
dos camundongos isogênicos C57Bl/6 induzidas pela infecção com os
diferentes isolados, indicando que existe variabilidade na virulência dos
parasitos.
• Como os isolados IMG3 e JM3 apresentaram diferentes perfis clínicos
no camundongo C57Bl/6, a infecção destes camundongos por estes
dois isolados pode constituir um modelo de estudo da infecção por L.
(V.) braziliensis, colaborando para uma melhor compreensão da
resposta imune a esta espécie de leishmania e das conseqüências
destas respostas na doença.
49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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