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MARCELO DUZZIONI
COMPARAÇÃO DO EFEITO DA SUBSTÃNCIA P COM O DO
DIAZEPAM E DO PENTILENOTETRAZOL NO COMPORTAMENTO
DE RATOS AVALIADOS NO LABIRINTO EM T
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Curso de Pós-graduação em Farmacologia
da Universidade Federal de Santa Catarina
como requisito parcial à obtenção do título
de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof.
a
Dra. Thereza Christina
Monteiro de Lima Nogueira
FLORIANÓPOLIS – SC
2005
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DUZZIONI, Marcelo. Comparação do efeito da substância P com o do
diazepam e do pentilenotetrazol no comportamento de ratos avaliados no
labirinto em T. Florianópolis, 2005, 81p. Dissertação (Mestrado em
Farmacologia) – Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade
Federal de Santa Catarina.
Orientador: Thereza Christina Monteiro de Lima Nogueira
Defesa: 23/02/2005
O presente estudo teve por objetivo investigar a relação entre a [substância P (SP)] e o
[diazepam (DZP)] nos comportamentos de [ansiedade] e [memória] em ratos avaliados no
[labirinto em T (LT)]. O procedimento experimental no teste consistiu em medir a latência
para deixar o braço fechado (Linha de Base, Esquiva 1 e Esquiva 2) e aberto (Fuga 1) do
aparelho; e no re-teste (72 h após) foram registradas a Esquiva 3 e Fuga 2. Nossos
resultados mostraram que o DZP i.p. apresentou um efeito ansiolítico e/ou amnésico da
memória de curta duração (STM) da esquiva inibitória (E.I.), o PTZ i.p. um efeito
ansiogênico e/ou facilitador na aprendizagem da E.I. e a SP i.p. não apresentou efeito
algum neste paradigma experimental. Observamos ainda que o tratamento i.p. com PTZ e
SP foi capaz de bloquear e reverter o(s) efeito(s) promovido(s) pelo DZP. Nossos
resultados mostraram também que a administração i.c.v. de SP foi capaz de reverter, via
receptores NK
1
, o efeito ansiolítico e/ou amnésico da STM promovido pelo DZP i.p. na
E.I.. Por fim, nenhum dos diferentes tratamentos foi capaz de afetar a latência de fuga no
teste e re-teste, bem como a memória de longa duração da E.I.. Em resumo, nossos
resultados ratificam a interação existente entre os sistemas GABAérgico e taquicinérgico na
modulação da ansiedade e memória no LT, demonstrada em outros modelos experimentais,
e mostram que o LT não é um modelo sensível às ações da SP per se.
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“Há mais mistérios entre o céu e a terra que imagina a vã Filosofia”
Willian Shakespeare (1564-1616)
Mas,
“Eu sou brasileiro e não desisto nunca”
autor desconhecido
AGRADECIMENTOS
! Á Professora Dra. Thereza Christina Monteiro de Lima Nogueira pela
orientação dada, não só sobre assuntos do mundo acadêmico, mas
principalmente pelos ensinamentos da vida; pela compreensão, amizade e
convivência.
! A todos os professores da Coordenadoria Especial de Farmacologia da
UFSC, pela qualidade do programa e por terem contribuído para a minha
formação acadêmica.
! Aos funcionários da Coordenadoria Especial de Farmacologia,
particularmente à Sandra, Rita, Diana e Maria Goretti
! Ao Pedro, funcionário do Biotério Setorial da Coordenadoria Especial de
Farmacologia, pela amizade e qualidade dos serviços prestados.
! Aos colegas da turma de mestrado 2003, em especial ao Fabrício e Rafael,
pelo companheirismo nos momentos de alegria e tristeza.
! Aos ex- e atuais colegas de laboratório, Ricardo Vieira (in memoriam), Luiz
Rangel, Raquel, Selma, Tulani, Clarissa, Luciana, Karine, Elaine Gavioli, Marco
Lorenzo, Denise, Ana Calixto, Rebeca, Filipe (Marreta), Rosane, Aline Foppa,
Elayne de Morais, Fernanda e Gilliard, pelos conhecimentos trocados, pela
convivência e acima de tudo, por terem feito do laboratório uma extensão da
minha casa.
! Aos professores membros da banca examinadora do mestrado: Antônio de
Pádua Carobrez, Cláudio da Cunha e Reinaldo Naoto Takahashi, pelas críticas,
sugestões e reflexões adicionais, que contribuíram para a elaboração da versão
final desta dissertação.
! Aos professores Dr. João Batista Calixto e Dra. Maria Martha Campos, pela
doação do FK 888.
! Á minha família, em especial aos meus pais: Nilton e Sirlei, pelo amor,
carinho e por não medirem esforços para a concretização de meus sonhos; aos
meus irmãos: Rodrigo, Daniela, Eduardo, Fernando e Renata, pelo carinho, apoio
e amizade; e as minhas sobrinhas: Ana Carolina e Maria Eduarda, pela beleza,
simplicidade e pureza.
! À minha namorada, Janaína, pelo amor, carinho e dedicação e, em
especial, pela compreensão.
! Ao CNPq, pelo apoio financeiro.
! Á todas as pessoas não mencionadas que, direta ou indiretamente,
contribuíram para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................... i
ABSTRACT ................................................................................................. iii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................... v
LISTA DE TABELAS ................................................................................... v
LISTA DE ABREVIAÇÕES ......................................................................... vi
INTRODUÇÃO ............................................................................................
1
Neuropeptídeos ........................................................................................... 1
Taquicininas ................................................................................................ 4
Substância P ............................................................................................... 6
Localização da substância P no sistema nervoso central ........................... 6
Distribuição dos receptores taquicinérgicos no sistema nervoso central .... 6
Substância P e ansiedade .......................................................................... 8
Substância P e memória ............................................................................. 11
Benzodiazepínicos ...................................................................................... 16
Benzodiazepínicos, ansiedade e memória ................................................. 17
Labirinto em T elevado – modelo experimental de ansiedade e memória .. 18
OBJETIVOS ................................................................................................
22
MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................
23
Animais ....................................................................................................... 23
Drogas e soluções ...................................................................................... 23
Procedimentos gerais ................................................................................. 25
Aparelho ...................................................................................................... 25
Protocolos experimentais ............................................................................ 26
Procedimento para administração central de drogas .................................. 28
Cirurgias estereotáxicas .............................................................................. 28
Cânulas, estiletes, parafusos e agulhas injetoras........................................ 29
Administração central de drogas ................................................................. 30
Histologia .................................................................................................... 30
Análise estatística ....................................................................................... 30
RESULTADOS ...........................................................................................
32
Caracterização dos efeitos comportamentais da injeção intraperitoneal de
diazepam, pentilenotetrazol e substância P na ansiedade e nos
processos mnemônicos em ratos avaliados no labirinto em T. .................. 32
Efeito comportamental da administração intraperitoneal de
pentilenotetrazol e substância P no efeito ansiolítico e/ou amnésico da
memória de curta duração promovidos pelo diazepam em ratos avaliados
no labirinto em T. ........................................................................................ 39
Efeito comportamental da administração central de substância P no efeito
ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta duração promovidos pelo
diazepam em ratos avaliados no labirinto em T. ......................................... 43
Avaliação da participação do receptor NK
1
na influência da substância P
sobre o efeito ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta duração
promovidos pelo diazepam em ratos avaliados no labirinto em T. ............. 46
DISCUSSÃO ...............................................................................................
49
CONCLUSÕES ...........................................................................................
55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................
56
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni i
RESUMO
O presente estudo teve por objetivo investigar a relação entre a substância
P (SP) e o diazepam (DZP) nos comportamentos de ansiedade e memória em
ratos avaliados no labirinto em T (LT). Na primeira etapa, os animais foram
tratados intraperitonealmente (i.p.) com diazepam (DZP, 0,5, 1 e 2 mg/Kg;
ansiolítico padrão), pentilenotetrazol (PTZ, 5, 15 e 30 mg/Kg; ansiogênico padrão),
SP (5, 50 e 250 µg/Kg, droga teste) ou solução Salina (NaCl 0,9%, solução
controle), antes de serem testados no LT. O procedimento experimental no teste
consistiu em medir a latência para deixar o braço fechado (Linha de Base, Esquiva
1 e Esquiva 2) e aberto (Fuga 1) do aparelho; e no re-teste (72 h após) foram
registrados a Esquiva 3 e a Fuga 2. Nossos resultados mostraram que a droga
padrão DZP apresentou um efeito ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta
duração (STM) e a droga padrão PTZ um efeito ansiogênico e/ou facilitador na
aprendizagem da esquiva inibitória. Por outro lado, a SP não apresentou per se
efeito algum neste paradigma experimental. Na segunda etapa, os animais foram
pré-tratados i.p. com DZP (1 mg/Kg) e tratados, pela mesma via, com Salina, SP
(5 mg/Kg) ou PTZ (30 mg/Kg). Os resultados mostraram que o DZP continuou
apresentando um efeito ansiolítico e/ou amnésico da STM da esquiva inibitória e
que este efeito foi bloqueado e revertido tanto pelo PTZ como pela SP. Na terceira
etapa, os animais foram pré-tratados i.p. com DZP (1 mg/Kg) e tratados via
intracerebroventricular (i.c.v.) com SP (10 pmoL) ou PBS (controle). O DZP
continuou apresentando seu(s) efeito(s) e este(s) efeito(s) sendo revertido(s) pela
administração central de SP. Na quarta e última etapa, foi avaliado o envolvimento
dos receptores NK
1
na reversão do efeito ansiolítico e/ou amnésico produzido pelo
DZP com a administração central de SP. Os animais foram pré-tratados com DZP
(1 mg/Kg) i.p. e com FK 888 (100 pmoL) i.c.v. e na seqüência tratados i.c.v. com
SP (10 pmoL) ou PBS. O FK 888, antagonista do receptor NK
1
, não interferiu per
se no(s) efeito(s) do DZP, mas foi capaz de abolir a reversão do(s) efeito(s) do
DZP induzido pela injeção i.c.v. de SP. A latência de fuga no teste e re-teste, bem
como a memória de longa duração da esquiva inibitória não foi afetada pelos
diferentes tratamentos em nenhuma das etapas experimentais avaliadas no LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni ii
Em resumo, nossos resultados mostraram que o LT não é um modelo sensível
aos efeitos tipo ansiogênico e facilitador dos processos mnemônicos da SP, além
de ratificarem a interação existente entre os sistemas GABAérgico e
taquicinérgico, já mostrada em outros modelos experimentais, na modulação da
ansiedade e memória no LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni iii
ABSTRACT
The present study aimed to investigate the relationship among substance P
(SP) and diazepam (DZP) in anxiety and memory related behaviors as evaluated in
the elevated T maze (ETM) in rats. In the first approach, the animals were
intraperitoneally (i.p.) treated with diazepam (DZP, 0,5, 1 and 2 mg/Kg; the
standard drug for an anxiolytic action), pentylenotetrazol (PTZ, 5, 15 and 30
mg/Kg; the standard drug for an anxiogenic action), SP (5, 50 and 250 mg/Kg, drug
under investigation) or physiological saline solution (NaCl 0,9%, control solution),
before they being tested in ETM. The experimental procedure in this test consisted
in measuring the latency to leave the enclosed arm (Baseline, Avoidance 1 and
Avoidance 2) and the open arm (Escape 1) of the apparatus, and in the re-test (72
h later), Avoidance 3 and Escape 2 were registered. Our results showed that the
standard drug DZP presented an anxiolytic effect and/or an amnesic effect in the
short-term memory (STM) and the standard drug PTZ showed an anxiogenic effect
and/or a facilitatory effect in the learning of inhibitory avoidance. On the other
hand, SP did not present any effect per se in this experimental paradigm. In the
second approach, the animals were i.p. pretreated with DZP (1 mg/Kg) and
treated, by the same route, with physiological saline solution, SP (5 mg/Kg) or PTZ
(30 mg/Kg). The results showed that DZP continued to present an anxiolytic effect
and/or a amnesic effect in the STM of inhibitory avoidance and this effect was
blocked and reverted by pretreatment with PTZ and SP, respectively. In the third
approach, the animals were pretreated i.p. with DZP (1 mg/Kg) and
intracerebroventricularly (i.c.v.) treated with SP (10 pmoL) or phosphate-buffered
saline (PBS). DZP continued presenting its effects which were reverted by the
central administration of SP. In the last experimental approach, we have evaluated
the participation of NK1 receptors in the blockade and reversion of the DZP effects
by the central administration of SP. The animals were pretreated with DZP (1
mg/Kg) i.p. and FK 888 (100 pmoL) i.c.v. followed by i.c.v. treatment with SP (10
pmoL) or PBS. FK 888, an antagonist of the NK1 receptor, did not interfere in the
DZP effects of DZP, but it was able to abolish the reversion of these effects
induced by the central injection of SP. The latency to escape in the test and retest,
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni iv
as well as the long-term memory of the inhibitory avoidance was not affected by
different treatments in none of the experimental studies at ETM. In conclusion, our
results shows that ETM is not a sensitive experimental paradigm to evaluate SP’s
effect on anxiety and memory processes and they also strengthens previous
experimental data showing an interaction between the systems GABAergic and
tachykinergic systems, such as previously demonstrated in other experimental
models, to the modulation of anxiety and memory in ETM.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Efeito do diazepam na latência para sair (A) e entrar (B) no
braço fechado do LT. .................................................................................. 34
Figura 2 - Efeito do pentilenotetrazol na latência para sair (A) e entrar (B)
no braço fechado do LT. ............................................................................. 36
Figura 3 - Efeito da substância P na latência para sair (A) e entrar (B) no
braço fechado do LT. .................................................................................. 38
Figura 4 - Influência da administração sistêmica de substância P e
pentilenotetrazol no efeito ansiolítico e/ou amnésico do diazepam
medido pela latência para sair (A) e entrar (B) no braço fechado do LT. ... 42
Figura 5 - Influência da administração i.c.v. de substância P no efeito
amnésico e/ou ansiolítico da injeção i.p. de diazepam medido pela
latência para sair (A) e entrar (B) no braço fechado do LT. ........................ 45
Figura 6 - Efeito do antagonista NK
1
, FK 888, na influência do tratamento
central (i.c.v.) com substância P sobre o efeito amnésico e/ou ansiolítico
do diazepam medido pela latência para sair (A) e entrar (B) no braço
fechado do LT. ............................................................................................ 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Alguns neuropeptídeos de mamíferos e suas famílias. .............
3
Tabela 2 - Classificação dos distúrbios de ansiedade segundo o manual
DSM-IV. ....................................................................................................... 9
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni vi
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AAs Aminoácidos
ACTH Hormônio adrenocorticotrópico
BZD(s) Benzodiazepínico(s)
CCK Colecistocinina
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
CRH Hormônio liberador da corticotropina
DPAG Substância cinzenta periaquedutal dorsal
DZP Diazepam
EK Endocinina
GHRH Hormônio liberador do hormônio de crescimento
GLP-1 Peptídeo-1 tipo glucagon
HK-1 Hemocinina-1
i.c.v. Intracerebroventricular
i.p. Intraperitoneal
LCE Labirinto em cruz elevado
LDCVs Vesículas de alta densidade
LHRH Hormônio liberador do hormônio luteinizante
LT Labirinto em T
LTD Potenciação de curta duração
LTP Potenciação de longa duração
NBM Núcleo Basal Magnocelular
NK Neurocinina
NKA Neurocinina A
NKB Neurocinina B
NP(s) Neuropeptídeo(s)
nts Neurotensina
PBS Solução de tampão fosfatada
PPTA Pré-pró-taquicinina A
PPTB Pré-pró-taquicinina B
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni vii
PPTC Pré-pró-taquicinina C
PTZ Pentilenotetrazol
SNC Sistema nervoso central
SP Substância P
TK(s) Taquicinina(s)
TRH Hormônio liberador da tireotropina
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 1
INTRODUÇÂO
Neuropeptídeos
A definição óbvia de um neuropeptídeo (NP) seria “um peptídeo encontrado
no nervo”. Entretanto, está definição incluiria um número muito grande de
peptídeos e proteínas de pequeno tamanho com inúmeras funções. Holmgren e
Jensen (2001), na tentativa de dar um significado mais restrito a palavra, definem
os NPs como sendo peptídeos que podem ser liberados por um neurônio como
moléculas sinalizadoras, que apresentarão efeitos como neurotransmissores ou
moduladores em outras células excitáveis e algumas vezes na própria célula que o
libera.
Existem várias diferenças entre os NPs e os transmissores clássicos no
sistema nervoso em relação à síntese, armazenamento e sinalização (Hökfelt et
al., 2003). Os NPs são sintetizados no retículo endoplasmático rugoso, formando
uma grande molécula precursora inativa (pré-pró-peptídeo). Uma parte desta
molécula é clivada na seqüência N-terminal, peptídeo de sinal, dando origem a um
pró-peptídeo. No aparelho de Golgi o pró-peptídeo é armazenado em vesículas de
alta densidade (LDCVs, do inglês Large Dense Core Vesicles) junto a enzimas de
processamento e transportado axonalmente para o terminal nervoso. Estas
enzimas de processamento, também chamadas de convertases, removem
fragmentos de peptídeos demarcados por pares de aminoácidos (AAs) básicos
(Lys-Lys ou Lys-Arg). Os NPs liberados pela ação das convertases podem ser
ativos ou sofrer processamento adicional pós-tradução, tal como, amidação C-
terminal, glicosilação, acetilação, fosforilação e sulfatação, antes de serem
secretados por exocitose, mediante um estimulo apropriado (Hökfelt et al., 2000;
Rang et al., 2001; Zupanc, 1996).
O padrão de expressão dos NPs nos neurônios, em circunstâncias normais,
pode se dar de três modos distintos: no primeiro, os NPs estão presentes em altos
níveis, indicando que eles estão funcionalmente disponíveis a qualquer momento;
no segundo, são expressos em níveis muito baixos, podendo ser up-regulated
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 2
após um estímulo apropriado, como um dano nervoso; no terceiro, apresentam
expressão transitória durante o desenvolvimento, sendo muitas vezes up-
regulated durante o período pré-natal (Hökfelt et al., 2000).
Os NPs estão presentes em todas as partes do sistema nervoso e quase
sempre coexistem com outros mensageiros no interior do mesmo neurônio.
Geralmente, os NPs estão armazenados em compartimentos sub-celulares
(LDCVs) diferentemente dos outros mensageiros (Merighi, 2002). Por esta razão,
essas substâncias podem ser liberadas seletivamente sob determinados estímulos
e, conseqüentemente, produzir respostas com diferentes amplitudes, durações e
sinais (Nusbaum et al., 2001).
Os NPs, à exceção do receptor ionotrópico para o tetrapeptídeo
FMRFamida, encontrado nos neurônios do caracol Helix aspersa e do molusco
Aplysia, e de um dos subtipos de receptores para a neurotensina (nts3),
promovem suas ações biológicas através da ligação a receptores acoplados à
proteína G, encontrados nos mais variados tecidos corporais (Cottrell, 1997;
Lingueglia et al., 1995; Vincent et al., 1999).
Outros dois fatos envolvendo os receptores dos NPs merecem atenção: a
internalização do complexo ligante-receptor, por ser um mecanismo importante
para a inativação do ligante, a regulação do receptor e talvez também para a
sinalização trans-membrana (Beaudet et al., 1998); e a presença de receptores
pré-sinápticos que afetam sua própria liberação ou a de outros co-transmissores
(Lever et al., 2003; Malcangio e Bowery, 1999; Maubach et al., 2001).
Diferente de outros transmissores que possuem um mecanismo de
recaptação, os NPs têm geralmente suas atividades peptídicas terminadas por
enzimas proteolíticas, também chamadas de peptidases, proteases ou
proteinases. Estas enzimas podem ser divididas em exopeptidases e
endopeptidases, sendo que as primeiras hidrolisam as ligações próximas às
extremidades N e C-terminal da cadeia polipeptídica, enquanto que as últimas
atuam sobre as demais ligações (García-López et al., 2002).
Mediante alguns critérios como distribuição anatômica, função biológica,
homologia na seqüência de AAs e a procedência de um precursor comum, os NPs
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 3
têm sido agrupados em famílias, conforme pode ser visto na tabela 1 (Merighi,
2002).
Tabela 1.
Alguns neuropeptídeos de mamíferos e suas famílias.
Hormônios hipotalâmicos
:
Ocitocina; Vasopressina; Somatostatina; Hormônio liberador da corticotropina
(CRH); Hormônio liberador do hormônio de crescimento (GHRH); Hormônio
liberador do hormônio luteinizante (LHRH); Hormônio liberador da tireotropina
(TRH)
Taquicininas:
Substância P; Neurocinina A; Neurocinina B
Peptídeos opióides:
β-endorfina; Dinorfina; Met-encefalina; Leu-encefalina
Neuropeptídeo Y e peptídeos relacionados:
Neuropeptídeo tirosina; Polipeptídeo pancreático; Polipeptídeo tirosina-tirosina
Família VIP-glucagon:
Polipeptídeo intestinal vasoativo; Peptídeo-1 tipo glucagon (GLP-1)
Peptídeos não-classificados:
Peptídeo natriurético cerebral; CART/peptídeo; Corticostatina; Endorfina-1 e 2;
Peptídeo tipo glucagon 1; Galanina; Hipocretina/orexina; Neurotensina;
Nocistatina; Nociceptina/orfanina FQ; Urocortina; Hormônio
adrenocorticotrópico (ACTH); Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
(CGRP); Colecistocinina (CCK)
Adaptado de Merighi (2002).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 4
Taquicininas
Em 1931, Ulf von Euler e John Gaddum descreveram que um extrato bruto,
obtido a partir do cérebro e intestino de eqüinos, continha um fator resistente à
atropina que causava contração de tecidos intestinais isolados e reduzia a pressão
sangüínea em coelhos. Em 1934, John Gaddum e Schild introduziram o termo
substância P (SP), referindo-se a um concentrado do princípio ativo na forma de
um pó seco estável, previamente denominado como “preparação P”. Em 1971,
Michael Chang, Susan Leeman e Hugh Niall determinaram pela primeira vez a
seqüência de AAs da SP como sendo a de um undecapeptídeo (H-Arg-Pro-Lys-
Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH
2
; Para revisão histórica ver Leeman e
Ferguson, 2000).
A SP foi o primeiro e o único peptídeo, até 1983, a ser caracterizado como
uma taquicinina (TK) nos mamíferos. Em 1983, dois grupos distintos de
pesquisadores relataram simultaneamente a existência de novas TKs (Kimura et
al., 1983; Maggio et al., 1983; Nawa et al., 1983) que, mais tarde, tornaram-se
conhecidas como neurocinina A (NKA) e neurocinina B (NKB). Passados dois
anos, dois novos peptídeos foram incluídos a essa família, o neuropeptídeo K
(Tatemoto et al., 1985) e o neuropeptídeo γ (Kage et al., 1988).
O nome TK resulta da similaridade farmacológica desses peptídeos com a
bradicinina, um mediador inflamatório endógeno, que elícita uma contração lenta
(brady) da musculatura lisa extra-vascular. As TKs, ao contrário, promovem uma
contração imediata (rápida, tachy) do mesmo tecido (Khawaja e Rogers, 1996). Os
membros dessa família compartilham uma seqüência comum de AAs na
extremidade C-terminal, Phe-X-Gly-Leu-Met-NH
2
, onde o X pode ser um AA
aromático ou alifático, fenilalanina (Phe) ou tirosina (Try) e valina (Val) ou
isoleucina (Ile), respectivamente (para revisão ver Severini et al., 2002).
Nos mamíferos, as TKs são derivadas de dois genes distintos, os genes
pré-pró-taquicinina A (PPTA) e pré-pró-taquicinina B (PPTB), que codificam a
síntese da SP, NKA, neuropeptídeo K, neuropeptídeo-γ e NKB, respectivamente.
O gene PPTA pode expressar quatro diferentes formas de RNAm (RNAm da α, β,
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 5
γ e δ-PPTA), sendo que todas elas transcrevem a seqüência de AAs para a
síntese de SP (Harmar et al., 1990; Hökfelt et al., 2001; Krause et al., 1987; Nawa
et al., 1983).
Recentemente, a família das TKs foi ampliada com a descoberta de um
terceiro gene, o pré-pró-taquicinina C (PPTC), que codifica a síntese dos
peptídeos hemocinina 1 (HK-1) e endocininas A, B, C e D (EKA-D), em roedores e
humanos (Kurtz et al., 2002; Page et al., 2003; Zhang et al., 2000).
As ações biológicas promovidas pelas TKs são mediadas pela interação
com três subtipos de receptores acoplados a proteína G: neurocinina (NK)
1
, NK
2
e
NK
3
; que exibem preferência de ligação para SP, NKA e NKB, respectivamente.
Embora, as TKs endógenas não sejam altamente seletivas para um dado receptor,
um dos critérios válidos para a classificação dos receptores taquicinérgicos é a
ordem de potência dos agonistas (Mussap et al., 1993; Nakanishi, 1991). Com as
recentes demonstrações de que a potência de ligação da HK-1 é similar a da SP
aos receptores taquicinérgicos (Kurtz et al., 2002; Duffy et al., 2003), a
nomenclatura existente para esses peptídeos e seus receptores vem sendo
questionada e ainda não alcançou um consenso geral (Patacchini et al., 2004).
A estrutura molecular de cada um dos receptores taquicinérgicos difere
ligeiramente entre as espécies, particularmente entre ratos e cobaias (Nakanishi,
1991). Gerard e colaboradores (1991) demonstraram que a seqüência protéica do
receptor NK
1
em ratos e humanos apresenta uma homologia de 92% entre as
duas espécies. Além disso, há evidências que corroboram para a existência de
diferentes subtipos ou conformações dos receptores NK
1
em roedores e humanos
(Beaujouan et al., 2000; Caberlotto et al., 2003; Fong et al., 1992).
Em ratos, os genes que codificam os receptores NK
1
, NK
2
e NK
3
estão
localizados nos cromossomos 4, 20 e 2, respectivamente (Mori et al., 1992),
enquanto nos seres humanos os genes que codificam os receptores NK
1
, NK
2
e
NK
3
estão localizados nos cromossomos 2, 10 e 4, respectivamente (Gerard et al.,
1990; Gerard et al., 1991; Kris et al., 1991; Pennefather et al., 2004).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 6
Substância P
Localização da substância P no sistema nervoso central
A investigação da distribuição anatômica de SP só foi possível a partir dos
anos 70, com o desenvolvimento de anticorpos anti-SP (Ribeiro-da-Silva e Hökfelt,
2000). No sistema nervoso central (SNC) de ratos, fibras nervosas e corpos
celulares imunorreativos à SP foram encontrados em altas densidades no
hipotálamo (núcleo pré-optico medial e núcleo hipotalâmico anterior), tálamo (parte
dorsal do núcleo medial da habênula), globo pálido, estriado, núcleo
entopeduncular, núcleo amigdalóide cortical, substância cinzenta periaquedutal,
substância negra, locus coeruleus e núcleo do trato solitário (Cuello e Kanazawa,
1978; Shults et al., 1984; Ribeiro-da-Silva e Hökfelt, 2000). Em humanos, as áreas
mais imunorreativas à SP no SNC estão na amígdala, no núcleo caudado, no
putâmen, no globo pálido, no hipotálamo, na substância negra e no locus ceruleus
(Severini et al., 2002). Além disso, Harlan et al. (1989), usando a técnica de
hibridização in situ, revelaram que o septo lateral, a região central e medial da
amígdala e a substância cinzenta periaquedutal contêm neurônios que expressam
o gene PPTA, cuja transcrição origina o RNAm responsável pela síntese da SP e
NKA.
Distribuição dos receptores taquicinérgicos no sistema nervoso central
A distribuição dos receptores NK
1
no SNC de mamíferos tem sido
investigada por técnicas de hibridização in situ, imunohistoquímica e
radioautografia, que revelaram resultados similares e forneceram evidências para
uma ampla, mas distinta distribuição desses receptores em várias áreas cerebrais
(Saria, 1999). No SNC de ratos os receptores NK
1
estão distribuídos, de forma
moderada à intensa, no estriado, núcleo entopeduncular, núcleo accumbens,
núcleo amigdalóide medial, giro denteado, habênula, núcleo lateral do hipotálamo,
substância cinzenta periaquedutal dorsal (DPAG), núcleo da rafe, locus coeruleus,
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 7
núcleo do trato solitário e tronco cerebral (Maeno et al., 1993; Mussap et al., 1993;
Nakaya et al., 1994). Esses resultados somados aos obtidos por Yip e Chahl
(1999), que revelaram o padrão de ativação de c-fos, após a administração
intracerebroventricular (i.c.v.) de um agonista seletivo do receptor NK
1
([Sar
9
,
Met(0
2
)
11
]), em várias estruturas do sistema límbico do cérebro de cobaias,
sugerem papéis importantes para os receptores NK
1
no controle das emoções,
aprendizagem e memória, atenção e regulação autonômica. Entretanto, ao se
comparar o padrão regional de distribuição do receptor NK
1
com o das fibras e
corpos celulares positivos para SP no SNC, percebe-se que em algumas dessas
áreas não há uma relação consistente entre esses parâmetros. Um exemplo disso
está na substância negra, onde há uma intensa densidade de fibras nervosas
reativas para SP e quase não há para o receptor NK
1
(Nakaya et al., 1994; Shults
et al., 1984).
A presença dos receptores NK
2
no SNC tem sido investigada utilizando
diferentes radioligantes, mas devido a pobre seletividade dos ligantes utilizados,
esses resultados não são convincentes (Maggi, 1995). Porém, a demonstração da
presença de receptores NK
2
no SNC, especialmente em alguns núcleos talâmicos,
hipocampo e camadas corticais, tem sido feita com outras técnicas e ferramentas,
incluindo o uso de radioligantes mais seletivos (Hagan et al., 1993; Saffroy et al.,
2001).
Vários estudos, através das técnicas de radioautografia (Dam et al., 1990;
Mussap e Burcher, 1990; Renzetti et al., 1991; Stoessl e Hill, 1990), hibridização in
situ (Ding et al., 1996; Shughrue et al., 1996) e imunohistoquímica (Carpentier e
Baude, 1996) têm mostrado uma ampla distribuição dos receptores NK
3
no SNC
de ratos. Particularmente, uma distribuição de forma moderada à intensa é
encontrada no bulbo olfatório, córtex cingulado, hipocampo, amígdala, núcleo do
leito da estria terminal, áreas hipotalâmicas dorsal e lateral, área tegmental
ventral, locus coeruleus, núcleo do trato solitário e núcleo motor dorsal do vago
(para revisão ver Massi et al., 2000).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 8
Substância P e ansiedade
Existem tantas definições de ansiedade quanto às causas de sua
manifestação. De modo geral, a ansiedade pode ser definida como um estado
subjetivo de apreensão ou tensão, difuso ou vago, freqüentemente acompanhado
por uma ou mais sensações físicas – por exemplo, aumento da pressão arterial,
da freqüência cardíaca, da respiração, urgência de micção ou defecação induzida
pela expectativa de perigo, dor ou necessidade de um esforço especial. A
inquietação e o desejo de movimentar-se são também comuns (Brandão, 2001).
A ansiedade difere conceitualmente do medo. O medo refere-se às
respostas comportamentais e neurovegetativas decorrentes de uma ameaça física
ou à própria sobrevivência do organismo, se manifestando em situações onde o
perigo é iminente pela presença imediata do objeto ou da situação temida. A
ansiedade é um estado de apreensão diante de circunstâncias onde o perigo não
é tão evidente, porém vago e persistente, estando ligada a uma expectativa futura
desproporcional, ou quando os sinais de advertência que provocam o medo não
são conscientemente percebidos (Gentil, 1994; Gentil Filho, 1994; Graeff et al.,
1999).
Embora a ansiedade seja considerada um fenômeno emocional comum na
população humana, ela pode expressar um estado de ansiedade patológica que
causa sofrimento aos pacientes (Clement e Chapouthier, 1998). Entretanto, o
limite entre ansiedade normal e patológica é difícil de estabelecer. Um certo grau
de ansiedade é necessário para um bom desempenho em tarefas cognitivas,
enquanto que uma ansiedade exagerada pode ser inadequada, a ponto de
perturbar acentuadamente o desempenho (Brandão, 2001; Graeff et al., 1999).
A ansiedade pode ser dividida em duas categorias: o “traço de ansiedade” e
o “estado de ansiedade”. O “traço de ansiedade” é uma característica durável e
persistente da personalidade do indivíduo e que reflete a forma como ele interage
com seu ambiente físico e social. Por outro lado, o “estado de ansiedade” é o que
é visto em um dado indivíduo por um determinado período. Portanto, muda com o
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 9
tempo, com os níveis de estresse e a forma que o estresse é percebido (Sandford
et al., 2000; para revisão ver Endler e Kocovski, 2001).
A 4ª edição do Manual Estatístico e Diagnóstico de Distúrbios Mentais
(DSM-IV, do inglês Diagnostic Statistical Manual), da Associação Psiquiátrica
Norte-americana, lista seis tipos de ansiedade patológica (Tabela 2), tomando
como referência à fenomenologia (intensidade, duração, qualidade e a história dos
sintomas da ansiedade) e as diferenças biológicas (genética, respostas
fisiológicas e farmacológicas; American Psychiatric Association, 1994).
Tabela 2. Classificação dos distúrbios de ansiedade segundo o manual DSM-IV.
DISTÚRBIOS DE ANSIEDADE
Distúrbio de ansiedade generalizada
Distúrbio do pânico (com ou sem agorafobia)
Distúrbio de estresse pós-traumático
Fobias sociais
Fobias específicas
Distúrbio obsessivo compulsivo
Adaptado de Gross e Hen (2004).
A ansiedade patológica pode provocar confusão e distorções da percepção
temporal, espacial, em relação a pessoas e ao significado dos acontecimentos.
Essas distorções podem interferir no aprendizado pela diminuição da
concentração, redução da memória e prejuízo da capacidade de associação
(Brandão, 2001).
Os efeitos da SP sobre os comportamentos relacionados com medo e
ansiedade em roedores são diferentes na dependência da região cerebral e da
dose administrada. Dessa forma, a administração sistêmica de SP, em baixas
doses, ou no núcleo basal magnocelular (NBM) resulta em um efeito ansiolítico
(Hasenöhrl et al., 1998); enquanto a injeção sistêmica de SP, em altas doses, na
DPAG, no núcleo septal lateral ou i.c.v. promove um efeito ansiogênico (Aguiar e
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 10
Brandão, 1996; De Araujo et al., 1999; Gavioli et al., 2002; Gavioli et al., 1999;
Hasenöhrl et al., 1998; Teixeira et al., 1996).
Esses dados obtidos com a SP podem ser extrapolados para os seus
fragmentos (amino (N)- e carboxi (C)-terminal) e para outras espécies de animais.
Estudos têm demonstrado que a injeção do fragmento C-terminal no ventrículo
lateral e na DPAG apresenta um efeito ansiogênico (De Araujo et al., 2001; De
Araujo et al., 1999; Duarte et al., 2004), enquanto a administração sistêmica do
fragmento N-terminal, em primatas não-humanos (Callithrix penicillata; Barros et
al., 2002) ou na DPAG (De Araujo et al., 2001), e dos fragmentos C- e N-terminal,
no NBM de roedores (Nikolaus et al., 2000), apresenta efeito ansiolítico.
Mais evidências de que o sistema SP-NK
1
está envolvido na regulação das
respostas de medo e ansiedade vêm dos estudos com antagonistas e animais
knockout do receptor NK
1
(NK
1
-/-) ou do gene que codifica SP (PPTA -/-;
Santarelli e Saxe, 2003). Diferentes antagonistas dos receptores NK
1
inibem as
vocalizações em cobaias separadas de suas mães (Boyce et al., 2001; Kramer et
al., 1998; Rupniak et al., 2000) e em gerbilos e outros roedores apresentam um
aumento no contato social no teste de interação social (Cheeta et al., 2001; File,
1997; Gentsch et al., 2002; Vassout et al., 2000) e efeitos tipo ansiolítico no
labirinto em cruz elevado (LCE, Teixeira et al., 1996; Varty et al., 2002). Os
resultados obtidos com a utilização de animais knockout demonstraram que as
supressões do gene PPTA e do receptor NK
1
resultaram em comportamentos
antidepressivo em camundongos avaliados nos testes da natação forçada
(“forced-swimming test”) e da suspensão pela cauda (“tail-suspension test”), e
ansiolítico nos testes de interação social, vocalizações induzidas por separação
maternal e LCE (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Rupniak et al., 2000; Santarelli et al.,
2001). Juntos, a interrupção farmacológica e genética da neurotransmissão
SP/NK
1
fornecem evidências substanciais de que esta via está envolvida na
mediação de comportamentos em modelos animais de ansiedade e depressão.
Além dos receptores NK
1
, a modulação da atividade dos outros receptores
taquicinérgicos tem sido explorada por seu possível papel funcional nos distúrbios
de ansiedade. Os receptores NK
2
e NK
3
, principalmente, estão distribuídos em
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 11
áreas tradicionalmente envolvidas no controle do medo e/ou ansiedade, tais como
hipotálamo, amígdala, hipocampo e substância cinzenta periaquedutal (Ding et al.,
1996; Maggi, 1995; Mussap et al., 1993; Otsuka e Yoshioka, 1993). A partir dessa
hipótese, alguns trabalhos demonstraram que a administração i.c.v. dos agonistas
natural (NKA) e seletivo ([β-Ala
8
]neurocinina A-(4-10)) do receptor NK
2
apresentaram um efeito ansiogênico, enquanto que a administração do agonista
sintético seletivo do receptor NK
3
(senktide), pela mesma via, indicou um efeito
ansiolítico em roedores avaliados no LCE (Ribeiro et al., 1999; Teixeira et al.,
1996). De acordo com esses resultados estão os obtidos com os antagonistas do
receptor NK
2
(GR 159897, GR 100679 e SR 48968), que apresentaram um efeito
ansiolítico, em roedores e primatas, nos testes de interação social, LCE e caixa
claro-escuro (De Lima et al., 1995; Griebel et al., 2001; Stratton et al., 1993;
Teixeira et al., 1996; Walsh et al., 1995) e aqueles com o antagonista peptídico do
receptor NK
3
, [Trp
7
, βAla
8
]NKA
(4-10)
, que mostrou um perfil de ação ansiogênica,
em camundongos avaliados no LCE (Ribeiro et al., 1999).
Substância P e memória
A memória é a capacidade que têm o homem e os animais de
armazenarem informações que possam ser recuperadas e utilizadas
posteriormente. Ela pode ser classificada quanto ao tempo de retenção e quanto à
sua natureza. Quanto ao tempo de retenção, a memória pode ser dividida em (1)
memória imediata ou memória ultra-rápida, cuja retenção não dura mais que
alguns segundos; (2) memória de curta duração (STM, do inglês short-term
memory), que dura segundos, minutos ou horas e serve para proporcionar a
continuidade do nosso sentido de “presente”. Um tipo especial de memória de
curta duração é a chamada memória operacional (WM, do inglês working
memory), que se refere à habilidade de reter informações por um tempo suficiente
para uma ação seqüencial; e (3) memória de longa duração (LTM, do inglês long-
term memory), que retém a informação por dias, semanas ou até mesmo a vida
inteira (Lent, 2004; Purves et al., 1997).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 12
Uma questão que tem gerado muita controvérsia é se as memórias de curta
e de longa duração estão seqüencialmente ligadas ou agem independentemente e
em paralelo (McGaugh, 2000). Estudos realizados utilizando uma tarefa de
esquiva inibitória (step-down) têm mostrado que a memória de longa duração
inicia imediatamente após a aquisição e coexiste, mas não é dependente, dos
processos da memória de curta duração, que opera através de seus próprios
sistemas bioquímicos (Bevilaqua et al., 2003; Bianchini et al., 1999; Izquierdo e
Medina, 1997; Izquierdo et al., 1999; Izquierdo et al., 1998; Quevedo et al., 2004).
Em termos comportamentais, também existem diferenças entre as características
das memórias de curta e de longa duração. Ao contrário da primeira, a memória
de longa duração sofre extinção e é susceptível aos efeitos amnésicos da
exposição a um novo ambiente (Izquierdo et al., 1999). A formação da memória de
longa duração ocorre através de mudanças nas sinapses, sendo que duas formas
de plasticidade sináptica, a potenciação de longa duração (LTP, do inglês long-
term potentiation) e a potenciação de curta duração (LTD, do inglês long-term
depression), são os processos candidatos a mediar as bases bioquímicas da
aprendizagem e memória (Malenka e Bear, 2004).
Quanto à sua natureza, a memória pode ser classificada em explícita ou
implícita. A memória explícita ou declarativa é a espécie de memória que é
mencionada quando o termo “memória” é usado na linguagem do dia a dia; e se
refere à capacidade de recordação consciente de fatos e eventos. A informação
armazenada é flexível e pode orientar o desempenho em uma ampla variedade de
teste e/ou condições experimentais. Esse tipo de memória depende da integridade
do lobo temporal medial e de estruturas diencefálicas, tais como o hipocampo,
subiculum e córtex entorrinal. A memória implícita ou não declarativa, ao contrário
da memória explícita, é caracterizada pela evocação não consciente de tarefas,
como as habilidades motoras e depende da integridade do córtex motor e pré-
motor, do estriado e também do cerebelo (Kolb e Whishaw, 2002; Lent, 2004;
Squire, 2004).
A memória implícita pode ser dividida em quatro tipos: 1) memória de
representação perceptual ou memória adquirida e evocada por meio de “dicas”
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 13
(priming), que corresponde à representação difusa de uma imagem, preliminar à
compreensão do que ela significa; 2) memória de procedimentos, que corresponde
às habilidades e hábitos; 3) memória associativa, que associa dois ou mais
estímulos (condicionamento clássico) ou um estímulo a uma certa resposta
(condicionamento operante); e 4) memória não associativa, que atenua uma
resposta (habituação) ou a aumenta (sensibilização) através da repetição da
apresentação de um estímulo (Lent, 2004).
A memória é muitas vezes considerada como um processo que tem vários
estágios, incluindo aquisição, consolidação e evocação (Abel e Lattal, 2001). A
aquisição consiste na entrada de uma informação qualquer nos sistemas neurais
ligados à memória. Como as informações são geralmente múltiplas e complexas,
os sistemas de memória fazem uma seleção, permitindo somente a aquisição de
alguns aspectos mais relevantes para a cognição, mais marcantes para a emoção,
mais focalizados pela nossa atenção, mais fortes sensorialmente ou,
simplesmente, priorizados por critérios desconhecidos. Após a aquisição dos
aspectos selecionados de uma informação, estes são retidos temporariamente e
em seguida, alguns desses aspectos ou mesmo todos eles, podem desaparecer
da memória (esquecimento) ou permanecer por um tempo prolongado, às vezes
permanentemente. Neste último caso diz-se que houve consolidação (Lent, 2004).
Há alguns casos em que o esquecimento é patológico. A perda da memória e/ou
da capacidade de adquirir novas informações é chamada de amnésia e pode ser
dividida em amnésia retrógrada e amnésia anterógrada (Kapczinski et al., 2000).
Na amnésia anterógrada ocorre perda seletiva da memória para eventos ocorridos
após a recuperação da consciência, enquanto que na amnésia retrógrada ocorre
perda seletiva para eventos ocorridos antes do distúrbio que gerou a perda da
consciência (Brandão, 2001).
Não há dúvida que a memória para eventos com componente emocional
tende a ser mais bem lembrada que a para eventos neutros (McGaugh, 2004).
Isso é claramente adaptativo, pois estímulos emocionais, sejam prazerosos ou
aversivos, são geralmente mais importantes para a sobrevivência das espécies
(Quevedo et al., 2003). Há várias evidências de que a amígdala, particularmente o
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 14
núcleo basolateral, está envolvida na modulação da consolidação da memória,
através de projeções para muitas outras regiões cerebrais, incluindo o hipocampo,
o prosencéfalo basal, o núcleo accumbens, o estriado e várias regiões corticais
(MacGaugh, 2002a). Relatos obtidos a partir de diferentes tipos de experimentos
indicam que os hormônios do estresse adrenal, adrenalina e glicocorticóides,
liberados durante ou após experiências com caráter emocional, exercem um papel
crítico na consolidação de memórias duradouras através da ativação da amígdala
basolateral (McGaugh, 2002b; para revisão ver McGaugh, 2004).
O último dos processos mnemônicos é a evocação
ou lembrança, através
da qual temos acesso à informação armazenada para utilizá-la mentalmente na
cognição e na emoção, por exemplo, ou para exteriorizá-la através do
comportamento (Lent, 2004).
Vários estudos têm mostrado que a SP está envolvida em processos
mnemônicos, bem como em processos reforçadores. Nesses estudos, diferentes
tarefas de aprendizagem (esquiva inibitória e tarefas apetitivas, modelos de
aprendizagem e habituação em labirintos), vias de administração (sistêmica e em
certas áreas cerebrais) e variação no tempo de injeção em relação à tarefa (pré-,
pós-treino e pré-teste) têm sido utilizadas (Huston e Hasenöhrl, 1995). A
administração sistêmica de SP em roedores facilita a aprendizagem de tarefas de
discriminação (Schlesinger et al., 1986), de esquiva ativa e passiva (Schlesinger et
al., 1983a) e reverte a amnésia retrógrada e anterógrada induzida por choque
eletroconvulsivo e diazepam, respectivamente (Costa e Tomaz, 1998; Schlesinger
et al., 1983b). Além disso, outros trabalhos têm demonstrado que a administração
pós-treino de SP tem efeitos facilitadores da memória em tarefas de esquiva
passiva, após injeção sistêmica (Tomaz e Huston, 1986; Hasenöhrl et al., 2000) ou
central no núcleo septal medial (Stäubli e Huston, 1980), no núcleo basal
magnocelular (Gerhardt et al., 1992) e na amígdala basolateral (Lénárd e Kertes,
2002).
Entretanto, estudos mais antigos mostraram que a administração central
pós-treino de SP na substância negra (Huston e Stäubli, 1978) e na amígdala
(Huston e Stäubli, 1979) prejudica o desempenho dos animais em tarefas de
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 15
aprendizagem, sendo que este último dado contraria os resultados mais recentes
de Lénárd e Kertes (2002).
Huston e colaboradores (1977) propõem a teoria do processamento da
memória para agentes reforçadores. Especificamente, os agentes reforçadores
podem fortalecer eventos centrais geralmente referidos como “traços de memória”,
impedindo a sua extinção e, conseqüentemente, fortalecendo a aprendizagem
(consolidação; para revisão ver Huston e Oitzl, 1989). Vários estudos têm
estabelecido uma relação entre os agentes reforçadores, como as drogas de
abuso, estimulantes e comida, com os níveis de dopamina no sistema
mesolímbico (Koob, 1992; Koob e Bloom, 1988; Wise e Rompre, 1989). Além
disso, o bloqueio ou destruição da atividade dopaminérgica no núcleo accumbens
impede o efeito reforçador desses estímulos (Leone e Di Chiara, 1987). A
administração periférica e central de SP também apresenta efeitos reforçadores
(Holzhäuer-Oitzl et al., 1988;Holzhäuer-Oitzl et al., 1987; Huston e Oitzl, 1989).
Soma-se a isso o fato de que a administração sistêmica de SP aumenta a
liberação de dopamina no núcleo accumbens (Boix et al., 1992). Assim, é possível
que a SP melhore o desempenho em tarefas de aprendizagem por sua ação
reforçadora nos processos mnemônicos (para revisão ver Huston e Oitzl, 1989).
Os efeitos nos processos mnemônicos e reforçadores obtidos com a SP
íntegra podem também ser extrapolados para seus fragmentos C- e N-terminal. A
administração sistêmica (Hasenöhrl et al., 1990a; Hasenöhrl et al., 1990b) e
central no núcleo basal magnocelular (Gerhardt et al., 1992; Hasenöhrl et al.,
1990b) das seqüências N- e C-terminal promovem um aumento na aprendizagem
da esquiva inibitória e na preferência condicionada de lugar, respectivamente, de
forma similar à molécula de SP inteira (para revisão ver Huston et al., 1993). Uma
outra relação estrutura-atividade bastante similar tem sido obtida para o efeito
mnemônico da SP após a injeção no núcleo accumbens, onde o fragmento N-
terminal (SP
1-7
), mas não o C-terminal (SP
7-11
), demonstrou facilitar a
aprendizagem em uma tarefa de esquiva passiva (Gaffori et al., 1984).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 16
Benzodiazepínicos
Desde sua introdução na prática clínica há 40 anos, o uso dos
benzodiazepínicos (BZDs) tem tornado-se amplo por causa de sua eficácia,
segurança e tolerabilidade. Até 1977 o seu mecanismo de ação era desconhecido,
quando foi descoberto que os BZDs interagem com receptores específicos no
SNC. Em 1987 este receptor, o benzodiazepínico-GABA
A
, pertencente à
superfamília de canais iônicos ativados por ligantes foi clonado. Atualmente,
sofisticadas técnicas de biologia molecular e de neuroimagem estão fornecendo
informações precisas de como e onde os BZDs atuam (Nutt e Malizia, 2001).
Os BZDs agem por aumentar a efetividade do ácido γ-aminobutírico (GABA,
do inglês gamma-aminobutyric acid), o neurotransmissor inibitório predominante
no SNC. A ligação do GABA ao complexo receptor benzodiazepínico-GABA
A
induz
mudanças conformacionais que aumentam a permeabilidade do poro central aos
íons cloreto. O influxo resultante de cloreto hiperpolariza o neurônio, reduzindo
sua excitabilidade e produzindo um efeito inibitório geral na atividade neuronal
(Nutt e Malizia, 2001; Owens e Kriegstein, 2002).
Os receptores GABA
A
também contêm outros sítios de ligação para
diferentes espécies de moduladores, tais como os barbitúricos, neuroesteróides,
picrotoxina e anestésicos, o que o torna alvo de medicações psiquiátricas para o
tratamento, dentre outros, da ansiedade, insônia e epilepsia (Korpi et al., 2002;
Sandford et al., 2000).
Os receptores GABA
A
são compostos por cinco subunidades protéicas, cuja
composição e arranjo podem variar. Nos mamíferos são conhecidas dezenove
subunidades (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, φ, π, ρ1-3), que podem formar os mais
variados subtipos de receptores, amplamente distribuídos no SNC, com algumas
subunidades sendo mais restrita a determinadas localizações, como por exemplo,
a subunidade α-5 nas células piramidais hipocampais (Burt, 2003). Usando
técnicas de biologia molecular (camundongos knockout e knockin) têm-se
demonstrado que a subunidade α1 exerce um papel importante no efeito sedativo;
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 17
a subunidade α2 no efeito ansiolítico; e a subunidade α5 nas ações dos BZDs nos
processos mnemônicos (Burt, 2003; Whiting, 2003).
Benzodiazepínicos, ansiedade e memória
As evidências de que os distúrbios de ansiedade podem ser causados por
anormalidades no receptor BZD vêm de estudos utilizando agonistas e
antagonistas deste receptor (Nutt e Malizia, 2001). Em animais experimentais,
efeito ansiolítico tem sido relatado no LCE, após a administração aguda de BZDs
e ansiogênico, após a administração de antagonistas e agonistas inversos do
receptor GABA
A
(Rodgers e Cole, 1994). Além disso, os BZDs reduzem as
medidas ansiogênicas avaliadas no campo aberto, como tempo gasto na periferia,
“grooming” e defecação, e na caixa claro-escuro, onde aumentam a latência para
entrar no compartimento escuro (Clement e Chapouthier, 1998).
Clinicamente, os BZDs têm sido usados extensivamente para o tratamento
do distúrbio de ansiedade generalizada (DAG), pois possuem um rápido início de
ação, com máximo efeito alcançado dentro de duas semanas. A droga favorita,
por anos nesta classe de medicamentos, tem sido o diazepam (DZP, agonista do
receptor GABA
A
). Entretanto, para o tratamento do distúrbio de pânico (DP) o BDZ
mais eficaz é o alprazolam, BDZ de alta potência (Argyropoulos et al., 2000).
Além da ação ansiolítica, os BZDs possuem outras propriedades
farmacológicas importantes, que encontram aplicações clínicas. Assim, são
hipnóticos em doses mais elevadas que as ansiolíticas, produzem relaxamento
parcial da musculatura estriada ou voluntária e melhoram certas manifestações da
epilepsia. Em contrapartida, causam ataxia e instabilidade da marcha (Graeff et
al., 1999).
Várias evidências têm apontado o envolvimento do complexo receptor
GABA
A
nos processos mnemônicos. Compostos que aumentam a ação do GABA,
tais como os BZDs, prejudicam o processamento da memória. Por outro lado,
compostos que reduzem a ação do GABA, tais como β-carbolina (β-CCM),
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 18
pentilenotetrazol ou picrotoxina, têm uma ação oposta, isto é, melhoram o
processamento da memória (Chapouthier e Venault, 2004).
Estudos experimentais, usando tarefas de esquiva inibitória, mostraram que
a administração pós-treino do agonista GABA
A
, muscimol, na região CA1 do
hipocampo causa amnésia para a STM e de LTM; no córtex entorrinal e parietal
reduz a latência de retenção da STM; e no córtex pré-frontal anterolateral bloqueia
a LTM (Izquierdo et al., 1999; Izquierdo et al., 1998; Zarrindast et al., 2002). Na
amígdala, a injeção pós-treino de muscimol e baclofen, antagonista do receptor
GABA
B
, também reduz a latência de retenção, enquanto a administração
intrahipocampal e intraamígdala do antagonista GABA
A
, bicuculina, promove um
efeito contrário e diminui o efeito do muscimol (Izquierdo e Medina, 1991;
Zarrindast et al., 2002). Estudos experimentais e clínicos mostraram ainda um
efeito amnésico para os BZDs. Em animais experimentais, vários BZDs
demonstraram causar amnésia, em diferentes variantes de uma tarefa de esquiva
passiva (Costa e Tomaz, 1998, Izquierdo et al., 1999; Zarrindast et al., 2002). Em
seres humanos, os efeitos foram primeiramente observados quando os BZDs
foram utilizados na anestesia pré-cirúrgica (Chapouthier e Venault, 2004; Rudolph
e Antkowlak, 2004).
Labirinto em T elevado - modelo experimental de ansiedade e memória
O modelo experimental de determinada condição normal ou patológica
representa uma tentativa de: 1) estabelecer um sistema de teste, possibilitando a
simulação de certos aspectos da condição clínica e normal; 2) permitir analisar o
mecanismo de ação de agentes conhecidos; 3) detectar o potencial terapêutico de
novas drogas (Porsolt et al., 1993). No entanto, para que um modelo seja
considerado útil para avaliar uma determinada condição normal ou patológica, ele
precisa ser previamente validado. Três critérios de validade costumam ser
utilizados (Clement e Chapouthier, 1998; Graeff e Guimarães, 2001): 1) validade
de predição ou predictabilidade, é definida como a capacidade do teste de prever
efeitos de drogas na clínica. Assim, um modelo com alto valor neste critério deve
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 19
ser sensível a agentes farmacológicos que atenuam ou agravam determinada
condição patológica, na direção esperada, bem como insensível a drogas que
afetam outros distúrbios. Mais ainda, deve apresentar correlação positiva,
altamente significativa, entre a magnitude do efeito clínico e a alteração da medida
do comportamento animal no teste, tomada como índice da psicopatologia; 2)
validade de expressão ou analógica se refere à semelhança entre o
comportamento do animal no teste com as manifestações clínicas do transtorno
psiquiátrico; 3) validade teórica ou homologia considera a correspondência entre
processos fisiológicos, bioquímicos, psicológicos e/ou substratos neuroanatômicos
mobilizados na patogenia do transtorno e no comportamento animal medido no
teste.
Neste contexto, o labirinto em T (LT) foi desenvolvido baseado na hipótese
de Deakin e Graeff (1991) sobre os efeitos opostos da serotonina nos distúrbios
de ansiedade generalizada e pânico. Segundo esses autores existem dois
sistemas serotoninérgicos separados, ambos partindo do núcleo dorsal da rafe,
que regulam comportamentos defensivos. Em um sistema, a ativação da via
serotoninérgica, que inerva a substância cinzenta periaquedutal dorsal, inibe
reações de fuga ou luta, que estão associadas a respostas de pânico; enquanto
que no outro a ativação da via serotoninérgica que inerva a amígdala e o córtex
frontal, facilita comportamentos defensivos aprendidos, como a esquiva inibitória,
e pode ser relacionada, em termos clínicos, ao distúrbio de ansiedade
generalizada (Graeff et al., 1998; Graeff et al., 1997; Teixeira et al., 2000; Viana et
al., 1994; Zangrossi et al., 2001).
O LT ou elevated T-maze (ETM) é derivado do elevated plus-maze (EPM)
ou labirinto em cruz elevado (LCE), um modelo de ansiedade amplamente
utilizado e validado para ratos e camundongos (Handley e Mithani, 1984; Pellow et
al., 1985; Lister, 1987). O aparelho possui três braços de dimensões iguais,
elevados a 50 cm do chão, sendo que um dos braços é fechado por paredes
laterais e é perpendicular aos outros dois braços abertos, formando assim um
labirinto em forma de “T” (Graeff et al., 1993).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 20
Na sessão experimental são avaliadas duas espécies de comportamentos
motivados aversivamente: a esquiva inibitória e a fuga dos braços abertos. O
primeiro corresponde ao tempo que os animais levam para deixar o braço
fechado, sendo que a exposição repetida dos animais dentro deste braço para
explorar o aparelho permite que eles aprendam a esquivar-se dos braços abertos,
num comportamento conhecido como resposta condicionada de medo (esquiva
inibitória). O último corresponde ao tempo que os animais levam para deixar um
dos braços abertos em direção ao braço fechado, num comportamento conhecido
como resposta de fuga. Além disso, a memória desses procedimentos pode ser
avaliada pela re-exposição dos animais ao aparelho, após um determinado tempo,
pelos mesmos parâmetros (Conde et al., 1999; Viana et al., 1994; Zangrossi e
Graeff, 1997).
A tendência natural dos roedores de esquivarem-se de lugares abertos
(Pellow et al., 1985; Treit et al., 1993) faz com que as medidas de latência de
saída do braço fechado do labirinto sejam crescentes e duradouras, pois podem
ser recuperadas até três meses após a primeira exposição (Sanson e Carobrez,
1999). Além disso, pelo fato do condicionamento ser uma forma de aprendizado, o
medo gerado no labirinto pode ser avaliado como medida de ansiedade, bem
como de memória. De fato, várias evidências experimentais indicam que as
estruturas cerebrais envolvidas na ansiedade e na modulação da memória,
particularmente da memória emocional, sobrepõem-se extensivamente (Graeff et
al., 1993; Tomaz et al., 1992 apud Graeff et al., 1993).
A SP e o DZP parecem modificar tanto as respostas comportamentais
relacionadas à ansiedade, como aquelas relacionadas à aprendizagem e
memória. Além disso, em animais, foi estabelecida uma relação entre as TKs e o
DZP na avaliação desses comportamentos, em diferentes modelos experimentais.
Na ansiedade, esta relação foi obtida através do bloqueio da ação ansiolítica do
DZP com a administração i.c.v. de NKA e Trp-7 (antagonista peptídico seletivo do
receptor NK
3
; Drapeau et al., 1990), mas não com SP, em camundongos
avaliados no LCE, sendo que o mecanismo de ação desses compostos
taquicinérgicos não parece envolver uma ação direta no sítio de ligação dos BZDs
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 21
no complexo receptor GABA
A
, porque o pré-tratamento com flumazenil,
antagonista BZD, não foi capaz de bloquear o efeito ansiolítico promovido pela
administração central do antagonista NK
2
SR48968 (Emonds-Alt et al., 1992;
Ribeiro e De Lima, 2002). Na memória, esta relação foi obtida através do bloqueio
do efeito amnésico promovido pelo DZP, i.p. pré-treino, com a administração de
SP e de seu fragmento N-terminal (SP1-7), i.p. pós-treino, mas não com a sua
seqüência C-terminal ([pGlu
6
]-SP6-11), em ratos avaliados no step-down (Costa e
Tomaz, 1998).
O presente trabalho procura verificar a relação existente entre as TKs, em
especial a SP, e o DZP nos parâmetros de medo e ansiedade, bem como nos
processos mnemônicos, utilizando um único modelo experimental – o labirinto em
T.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 22
Objetivos
Geral
O objetivo do presente estudo foi investigar a relação entre a substância P
(SP) e o diazepam (DZP) nos comportamentos de ansiedade e memória avaliados
no teste do labirinto em T elevado (LT), em ratos.
Específicos
Para que o objetivo geral fosse atingido, tornou-se necessário estabelecer
alguns objetivos intermediários como:
→ Caracterizar os efeitos comportamentais da injeção intraperitoneal (i.p.) de
DZP, pentilenotetrazol (PTZ) e SP na ansiedade e nos processos mnemônicos
em ratos avaliados no LT.
→ Verificar se a administração i.p. de SP e PTZ interfere nos efeitos
comportamentais produzidos pela injeção i.p. de DZP no LT.
→ Verificar se a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de SP interfere nos
efeitos comportamentais produzidos pela injeção i.p. de DZP no LT.
→ Verificar se o efeito da substância P i.c.v. no LT em reverter o efeito tipo
ansiolítico e/ou amnésico do DZP i.p. é mediado por receptores taquicinérgicos
do tipo NK
1
, receptores preferenciais da SP.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 23
Material e Métodos
Animais
Os experimentos foram realizados com ratos Wistar machos adultos (280 a
350 g) provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa
Catarina e mantidos, após o desmame, no Biotério Setorial da Coordenadoria
Especial de Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Santa Catarina. Os animais, alojados em caixas plásticas (60 x 60 x 35 cm) em
grupos de 4-6, foram mantidos em uma sala com temperatura (23 ± 2 °C) e ciclo
de luz claro-escuro de 12 horas controlado automaticamente (luzes ligadas às
07:00 h). Todos os experimentos foram realizados durante o ciclo claro entre
14:00 e 18:00h. Os grupos controles e experimentais foram escolhidos de maneira
aleatória, com cada animal sendo utilizado somente uma vez. Água e comida
estavam disponíveis à vontade. Todos os experimentos foram realizados de
acordo com as recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociências e
Comportamento (SBNeC) e o protocolo experimental foi aprovado pela Comissão
de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (CEUA
23080.001156/2001-50/UFSC e 23080.027554/2004-49/UFSC). O número mínimo
de animais foi utilizado para obtenção de dados confiáveis.
Drogas e soluções
Foram utilizadas as seguintes drogas e soluções:
• Solução de cloreto de sódio a 0,9% (salina, Laborasa Indústria Farmacêutica
Ltda, Brasil), solução controle, injetada intraperitonealmente (i.p.) 20 ou 30 min
antes dos animais serem submetidos ao LT.
• PBS (“phosphate buffer solution” – solução de tampão fosfatada; Sigma
Chemical Co, St. Louis, MO, EUA), composto por: NaCl 137 mM, KCl 1,17 mM
e tampão fosfato 10 mM, pH 7,4, utilizado como solução controle, quando
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 24
injetado intracerebroventricular (i.c.v.) 5 min antes dos animais serem
submetidos ao LT, ou como veículo, para dissolver a solução estoque de
substância P na concentração de 1 mM.
• Substância P (SP = H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-
NH2), Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA), neurocinina endógena com
ação preferencial nos receptores NK
1
(Chang et al., 1971). A SP foi preparada
como solução estoque (1mM) em PBS e posteriormente dissolvida em salina
ou PBS, para administração i.p. ou i.c.v., respectivamente, nas doses
desejadas.
• Diazepam (DZP) (Sanofi Winthrop Farmacêutica Ltda, Brasil), agonista do
receptor GABA
A
(Rang et al., 2001). O DZP foi diluído em salina nas doses
desejadas e injetado i.p. 30 min antes dos animais serem submetidos ao LT.
• Pentilenetetrazol (PTZ = 6, 7, 8, 9, - tetrahidro – 5H – tetrazol – [1, 5 – a]
azepina), Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA), antagonista do receptor
GABA
A
e droga ansiogênica prototípica (Jung et al., 2002). O PTZ foi diluído
em salina nas doses desejadas e injetado i.p. 15 min antes dos animais serem
submetidos ao LT.
• FK 888 {(4R)-4-hidróxi-1-[1-metil-1 H-indol-3 I] carbonil-propil–L-N-benzil-
N-metil-3-2-2-(naftil)-L-alaninamida}, (Fujisawa Pharmaceutical Co., Osaka,
Japão), antagonista seletivo dos receptores NK
1
(Fuji et al., 1992). O FK 888
foi diluído em etanol na concentração de 1 mM e estocado a -20°C em tubos
de Eppendorf siliconizados. Essa droga foi posteriormente diluída em PBS +
etanol 10% na concentração desejada. A solução controle do antagonista
neurocinérgico (veículo) foi preparada com PBS + etanol 10%, para evitar
qualquer interferência do solvente do FK 888 na avaliação experimental.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 25
As doses e os tempos de tratamento para as diferentes drogas utilizadas
neste estudo foram selecionados através da literatura e/ou estudos preliminares
(De Souza et al., 1998; Gavioli et al., 1999; Hasenöhrl et al., 2000; Viana et al.,
1994; Teixeira et al., 1996).
As drogas anestésicas tiopental sódico (Thionembutal ®, ABBOTT
Laboratories; Illinois, EUA) e hidrato de cloral (Merck; Darmstadt, Alemanha) foram
diluídas em solução fisiológica de NaCl 0,9%. O hidrato de cloral foi armazenado
na geladeira (4 ºC) e ao abrigo da luz, enquanto que o tiopental sódico foi mantido
à temperatura ambiente.
Procedimentos Gerais
Aparelho
Na tentativa de analisar diferentes tipos de ansiedade e ao mesmo tempo
avaliar memória, um novo modelo experimental foi desenvolvido por Viana e
colaboradores (1994), chamado de Labirinto em T (LT). O aparelho recebe esse
nome porque é derivado do labirinto em cruz elevado (Handley e Mithani, 1984)
pela obstrução da entrada de um dos braços fechados. Esse modelo foi validado
para ratos por Graeff e colaboradores (1998) e, posteriormente para
camundongos, com algumas alterações procedurais e estruturais, por Carvalho-
Netto e Nunes-de-Souza (2004).
O LT de ratos foi construído em acrílico transparente e possui três braços
de dimensões iguais (50 x 10 cm), elevados a 50 cm do chão. O braço fechado do
LT é formado por paredes com 40 cm de altura, enquanto que os braços abertos
são circundados por uma borda de 1cm de altura, para evitar a queda dos animais
do aparelho. Os braços abertos e o fechado são conectados por uma plataforma
central (10 x10 cm) e todo o chão do aparelho é confeccionado em acrílico preto.
O aparelho está localizado em uma sala com luz vermelha (15 W) e a intensidade
luminosa sobre todos os braços do LT é de 3 lux.
Nas sessões de teste, cada animal foi colocado no final do braço fechado
do LT, com a cabeça voltada para a plataforma central, e o tempo necessário para
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 26
sair com as quatro patas deste braço pela primeira vez foi registrado e adotado
como Linha de Base (LB). Em seguida, duas novas medidas (Esquiva 1 e Esquiva
2), com intervalos de 30 s, foram tomadas. Após novamente 30 s, cada animal foi
colocado no final do braço aberto direito e o tempo necessário para entrar com as
quatro patas no braço fechado foi registrado (Fuga 1). Nas sessões de re-teste,
realizadas 72 h após o teste, a latência para sair (Esquiva 3) e entrar no braço
fechado (Fuga 2) foram registradas novamente, com intervalo de 30 s, para cada
animal (Viana et al., 1994).
Durante os intervalos no teste e no re-teste, cada animal permanecia numa
caixa plástica (60 x 60 x 35 cm), dentro da própria sala de experimento. Ao final
das avaliações de cada animal, o aparelho era limpo com uma solução de etanol
10%.
Protocolos experimentais
Protocolo experimental 1
Injeção i.p. de
Salina
(NaCl 0,9 %)
Injeção i.p. de
DZP
0,5, 1,0 e 2,0
mg/Kg
Injeção i.p. de
PTZ
5,0, 15,0 e
30,0 mg/Kg
Injeção i.p. de
SP
5,0, 50,0 e
250,0 µg/Kg
Teste no LT
Re - teste no LT
72 h
20 min
30 min
15 min
20 min
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 27
Protocolo experimental 2
Protocolo experimental 3
Injeção i.p.
de Salina
(NaCl 0,9%)
Injeção i.p.
de SP 5,0
µg/Kg
Injeção i.p.
de DZP
1,0 mg/Kg
Injeção i.p.
de Salina
(NaCl 0,9%)
Injeção i.p.
de SP
5,0 µg/Kg
Injeção i.p.
de PTZ
30,0 mg/Kg
Teste no LT
Re - teste no LT
20 min
20 min
10 min
10
min
72 h
20 min
20 min
15 min
15 min
Injeção i.p. de
Salina
(NaCl 0,9%)
Injeção i.c.v. de
PBS
(2 µL)
Injeção i.c.v. de
SP 10 pmoL
(2 µL)
Injeção i.c.v. de
PBS
(2 µL)
Injeção i.c.v.
de SP 10 pmoL
(2 µL)
Teste no LT
Re - teste no LT
25 min
5min
72 h
25 min
Injeção i.p. de
DZP
1,0 mg/Kg
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 28
Protocolo experimental 4
Procedimentos para administração central de drogas
Cirurgias estereotáxicas
Cada animal foi anestesiado com tiopental sódico (20 mg/Kg, i.p.) e hidrato
de cloral (300 mg/Kg, i.p.) e, depois de verificada a perda total dos reflexos,
imobilizado em um aparelho estereotáxico (Stoelting, mod. 300, USA) com a ajuda
de duas barras auriculares colocadas nos meatos auditivos e uma presilha nasal,
fixada nos incisivos e no osso nasal. Em seguida, procedeu-se a tricotomia, a
assepsia com álcool iodado e a injeção com lidocaína (com 2 % de vasoconstritor,
por via subcutânea, para anestesia local e redução do extravasamento sangüíneo
no momento da incisão) na parte posterior da cabeça de cada animal. Ao final, a
calota craniana foi exposta, após a raspagem do periósteo, e perfurada com uma
Injeção i.p. de DZP
1,0 mg/Kg
Injeção i.c.v. de
FK 888 100 pmoL
(1 µL)
Injeção i.c.v. de
FK 888 100 pmoL
(1 µL)
Re
-
teste no LT
24 min
24 min
5min
72 h
Injeção i.c.v. de
Veículo 1µL
(
PBS + Etanol - 10%
)
Injeção i.c.v. de
Veículo 1 µL
(PBS + Etanol - 10%)
Injeção i.c.v. de
SP 10 pmoL
(1 µL)
1min
Injeção i.p. de Salina
(NaCl 0,9%)
Teste no LT
1min
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 29
broca odontológica para a fixação de dois parafusos de aço inoxidável e inserção
de uma cânula-guia (0,22 mm de diâmetro interno e 0,28 mm externo) no
ventrículo lateral esquerdo (0,8 e 1,5 mm posterior e lateral ao bregma,
respectivamente; 2,5 mm abaixo da superfície do crânio), conforme as
coordenadas de Paxinos e Watson (1986).
A área aberta, feita para fixação dos parafusos e introdução da cânula-guia,
foi preenchida com acrílico auto-polimerizável (JET Artigos Odontológicos Clássico
Ltda., São Paulo, Brasil). Por fim, um estilete foi introduzido na cânula-guia para
evitar a oclusão da mesma, que só foi retirado segundos antes da infusão das
drogas.
Cada animal, após o término da cirurgia, foi aquecido por uma lâmpada de
40 W, a fim de amenizar a hipotermia induzida pela anestesia geral. Após a
recuperação total, cada animal, foi reconduzido a sua caixa moradia, aonde
permanecia, recebendo água e ração à vontade, por 5 a 7 dias antes do teste
experimental, sendo que durante esse período de recuperação foi manipulado
somente durante a troca da caixa.
Cânulas, estiletes, parafusos e agulhas injetoras
As cânulas-guia utilizadas para as injeções intracerebroventriculares foram
confeccionadas manualmente no Laboratório de Neurofarmacologia a partir de
agulhas descartáveis 25 x 7 mm (calibre 22 interno/28 externo) e com o auxílio de
um paquímetro (General Hardware MFG. Inc., New York, EUA) e um disco de
carburundum conectado a uma broca odontológica. As cânulas foram cortadas no
comprimento de 17,0 mm.
Os estiletes foram confeccionados com fios de aço inoxidável (n° 26),
introduzidos no interior das cânulas-guia e presos ao cimento dentário.
Os parafusos utilizados foram de aço inoxidável com 4,6 mm de
comprimento total, 1,8 mm de diâmetro de cabeça e 1,4 mm de diâmetro de rosca
(Insight Equipamentos Ltda EPP, Ribeirão Preto, SP, Brazil).
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 30
As agulhas injetoras foram confeccionadas a partir de agulhas gengivais
odontológicas, cortadas no comprimento de 18,0 mm, ou seja, 1,0 mm maiores
que as cânulas-guia.
Administração central de drogas
Cada animal, após a retirada do estilete adaptado à cânula-guia, foi
infundido manualmente com a(s) droga(s) em estudo, através de uma agulha
injetora, conectada por um tubo de polietileno (PE-10 STWL; Plastics One Inc.,
Virginia, USA) a uma microseringa Hamilton 701 N (10 µL). Cada solução foi
injetada num volume de 1 ou 2 µL, por um período de 30 s, sendo que a agulha
injetora permaneceu por mais um período de 30 s dentro da cânula-guia para que
todo seu conteúdo se difundisse para os tecidos adjacentes.
Histologia
Para a confirmação da localização das cânulas, após o término dos
experimentos, os animais foram anestesiados com hidrato de cloral 40% e
perfundidos intracardiacamente com solução salina (NaCl 0,9%), seguida de
solução de formaldeído 4%. Em seguida, os animais foram decapitados e
receberam uma micro-injeção de solução de Azul de Evans 0,5% (2 µL)
intraventricularmente. Os cérebros foram retirados e checados quanto à
localização das cânulas. Animais que não apresentavam localização correta das
cânulas foram descartados da análise estatística dos dados.
Análise estatística
Para as análises estatísticas foi utilizado o programa Statistic versão 6.0.
Testes não-paramétricos foram usados para analisar todos os resultados
experimentais, pois em nenhum dos grupos tratados a distribuição dos dados,
obtidos para o teste e o re-teste obedeceu à normalidade. Os resultados foram
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 31
expressos como mediana ± intervalo interquartil. As comparações dentro dos
grupos ao longo das variáveis foram feitas com os testes de Friedman (múltiplas
variáveis) e Wilcoxon (duas variáveis), enquanto que os testes de Kruskal-Wallis
(múltiplos grupos) e Mann-Whitney (dois grupos) foram utilizados para detectar
diferenças significativas entre os grupos de tratamento dentro da mesma variável.
As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando o nível de
probabilidade (p) foi menor que 0,05.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 32
RESULTADOS
Experimento 1 - Caracterização dos efeitos comportamentais da injeção
intraperitoneal de diazepam, pentilenotetrazol e substância P na ansiedade e
nos processos mnemônicos em ratos avaliados no labirinto em T.
Os dados das latências para sair e entrar nos braços fechados do LT dos
animais tratados com Salina (NaCl 0,9%) são os mesmos para os experimentos
1(Figuras 1, 2 e 3) e 2 (Figura 4), pois os valores obtidos das latências para os
animais do grupo controle, ao longo desses experimentos, foram agrupados.
Na figura 1A, o teste de Friedman detectou mudanças significativas na
latência da esquiva inibitória ao longo das variáveis (Linha de Base, Esquiva 1,
Esquiva 2 e Esquiva 3) para os animais tratados com Salina (χ
2
17
(3) = 34,77; p <
0,001). O teste de Wilcoxon mostrou que as Esquivas 1 (T
17
= 15,50; p < 0,05) e 2
(T
17
= 0,00; p < 0,001) foram estatisticamente superiores à Linha de Base,
indicando que os animais adquiriram o comportamento de esquiva inibitória. Além
disso, a Esquiva 3 foi semelhante à Esquiva 2 (T
17
= 12,00, p = 0,11) e
estatisticamente maior que a Linha de Base (T
17
= 2,00, p < 0,001), demonstrando
que os animais lembraram desse procedimento.
Na figura 1A, o teste de Friedman também detectou mudanças significativas
na latência da esquiva inibitória ao longo das variáveis para os animais tratados
com DZP 0,5 mg/Kg (χ
2
12
(3) = 17,69; p < 0,001), 1,0 mg/Kg (χ
2
9
(3) = 12,91; p <
0,05) e 2,0 mg/Kg (χ
2
8
(3) = 12,15; p < 0,05). O teste de Wilcoxon mostrou que a
Esquiva 1 dos animais tratados com DZP 0,5 mg/Kg (T
12
= 0,00; p < 0,05) e a
Esquiva 2 dos tratados com DZP 0,5 mg/Kg (T
12
= 1,00; p < 0,05) e 1,0 mg/Kg (T
9
= 0,00; p < 0,05) foram estatisticamente maiores que a Linha de Base, indicando
que o tratamento com DZP, nessas doses, não interferiu na aquisição da esquiva
inibitória. A Esquiva 2 dos animais tratados com DZP 2,0 mg/Kg não foi
estatisticamente significante, quando comparada à Linha de Base (T
8
= 4,50, p =
0,058), apesar da tendência a ser maior. Nenhuma das doses de DZP interferiu na
retenção dessa tarefa – memória de longa duração, pois a Esquiva 3 dos animais
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 33
tratados com DZP, nas diferentes doses, foi estatisticamente maior que a Linha de
Base (DZP 0,5 mg/Kg, T
12
= 1,00; p < 0,05; 1,0 mg/Kg, T
9
= 3,50; p < 0,05 e 2,0
mg/Kg, T
8
= 0,00; p < 0,05) e semelhante à Esquiva 2 (DZP 0,5 mg/Kg, T
12
=
16,00; p = 0,78; 1,0 mg/Kg, T
9
= 21,00; p = 0,86 e 2,0 mg/Kg, T
8
= 13,50; p = 0,52).
Além disso, o teste de Kruskal-Wallis não detectou nenhuma diferença significativa
entre os grupos de tratamento na Esquiva 3 (H
46
(3) = 6,77; p = 0,08). O valor da
Esquiva 3 para os animais tratados com a maior dose de DZP confirma a
tendência, anteriormente observada, da Esquiva 2 ser maior que a Linha de Base.
O teste de Kruskal-Wallis detectou uma diferença significante entre os
grupos de tratamento na Esquiva 1 (H
46
(3) = 10,62; p < 0,05) e Esquiva 2 (H
46
(3)
= 15,40; p < 0,05), indicando que o desempenho dos animais foi afetado pelo
tratamento com DZP nessas variáveis. O teste de Mann-Whitney mostrou que o
tratamento com DZP, na dose de 1,0 mg/Kg na Esquiva 1 (U = 38,50; p < 0,05) e
nas doses de 1,0 e 2,0 mg/Kg na Esquiva 2 (U = 11,00; p < 0,001 e U = 19,00; p <
0,05, respectivamente), reduziu significantemente o tempo para os animais saírem
do braço fechado do aparelho, quando comparado ao grupo Salina, indicando um
efeito ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta duração em ratos no LT.
Em relação à latência para entrar no braço fechado, figura 1B, não houve
diferença significante entre os diferentes grupos de tratamento nas Fugas 1 (H
46
(3) = 1,60; p = 0,66) e 2 (H
46
(3) = 0,16; p = 0,98), bem como entre os animais do
mesmo grupo entre as sessões com droga e sem droga, indicando que as doses
utilizadas de DZP não interferiram no comportamento de fuga dos braços abertos
do LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 34
A)
B)
Figura 1 - Efeito do diazepam (DZP) na latência para sair (A) e entrar (B) no braço
fechado do LT. A Linha de Base, Esquiva 1, Esquiva 2 e Fuga 1 foram medidos 20 e 30
min após a administração i.p. de Salina e DZP, respectivamente. A Esquiva 3 e a Fuga 2
foram medidas 72 h após (sem droga). As barras representam a mediana ± intervalo
interquartil. *p < 0,05 e ** p < 0,001 em relação a Linha de Base (teste t de Wilcoxon); φ p
< 0,05 e φφ p < 0,001 em relação ao grupo Salina (teste U de Mann-Whitney).
0
100
200
300
Salina (n=17)
DZP 0,5 mg/kg (n=12)
DZP 1,0 mg/Kg (n=9)
DZP 2,0 mg/Kg (n=8)
Linha de Base
Esquiva 1 Esquiva 2 Esquiva 3
Diazepam
Sem droga
*
*
*
**
*
Latência para sair do braço fechado
(s)
*
*
*
**
ϕ
ϕϕ
ϕ
0
100
200
300
Fuga 1
Fuga 2
Diazepam Sem droga
Latência para entar no braço fechado
(s)
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 35
Na figura 2A, o teste de Friedman mostrou mudanças significantes na
latência da esquiva inibitória ao longo das variáveis para os animais tratados com
PTZ 5 mg/Kg (χ
2
11
(3) = 22,27; p < 0,001), 15 mg/Kg (χ
2
13
(3) = 23,05; p < 0,001) e
30 mg/Kg (χ
2
8
(3) = 13,1; p < 0,05). O teste de Wilcoxon mostrou que a Esquiva 1
dos animais tratados com PTZ 5 mg/Kg (T
11
= 2,50; p < 0,05), 15 mg/Kg (T
13
=
7,00; p < 0,05) e 30 mg/Kg (T
8
= 0,00; p < 0,05), bem como a Esquiva 2 para os
tratados com PTZ 5 mg/Kg (T
11
= 0,00; p < 0,05), 15 mg/Kg (T
13
= 0,00; p < 0,05) e
30 mg/Kg (T
8
= 1,00; p < 0,05) foram estatisticamente superiores em relação à
Linha de Base, indicando que esses tratamentos não interferiram na aquisição da
esquiva inibitória. Nenhuma das doses de PTZ interferiu na retenção dessa tarefa
– memória de longa duração, pois a Esquiva 3 dos animais tratados com PTZ, nas
diferentes doses, foi estatisticamente maior que a Linha de Base (PTZ 5 mg/Kg,
T
11
= 0,00; p < 0,05; PTZ 15 mg/Kg, T
13
= 7,00; p < 0,05 e PTZ 30 mg/Kg, T
8
=
2,00; p < 0,05) e semelhante à Esquiva 2, somente para a dose intermediária e
maior de PTZ (T
13
= 9,00; p = 0,11 e T
8
= 0,00; p = 0,11, respectivamente). Além
disso, o teste de Kruskal-Wallis não detectou nenhuma diferença significativa entre
os grupos de tratamento na Esquiva 3 (H
49
(3) = 1,63; p = 0,65). Apesar da
Esquiva 3 dos animais tratados com PTZ 5 mg/Kg (T
11
= 0,00; p < 0,05) ter sido
estatisticamente menor que a Esquiva 2, essa dose de PTZ não prejudicou a
retenção da memória.
O teste de Kruskal-Wallis detectou diferença significante entre os grupos de
tratamento na Linha de Base (H
49
(3) = 14,84; p < 0,05) e Esquiva 1 (H
49
(3) =
13,80; p < 0,05), indicando que o desempenho dos animais foi afetado pelo
tratamento com PTZ nessas variáveis. O teste de Mann-Whitney mostrou que a
Linha de Base (U = 8,0; p < 0,001) e a Esquiva 1 (U = 14,5; p < 0,05) para os
animais tratados com PTZ 30 mg/Kg foram estatisticamente maiores que a do
grupo Salina, indicando um efeito ansiogênico e/ou facilitador da aquisição da
esquiva inibitória em ratos no LT.
Em relação à latência para entrar no braço fechado (Figura 2B), não houve
diferença significante entre os diferentes grupos de tratamento nas Fugas 1 (H
49
(3) = 1,77; p = 0,62) e 2 (H
49
(3) = 0,56; p = 0,91), bem como entre os animais do
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 36
mesmo grupo entre as sessões com droga e sem droga, indicando que as doses
utilizadas de PTZ não interferiram no comportamento de fuga dos braços abertos
do LT.
A)
B)
Figura 2 - Efeito do pentilenotetrazol (PTZ) na latência para sair (A) e entrar (B) no braço
fechado do LT. A Linha de Base, Esquivas 1 e 2 e Fuga 1 foram medidos 15 e 20 min
após a administração i.p. de PTZ e Salina, respectivamente. A Esquiva 3 e a Fuga 2
foram medidas 72 h após (sem droga). As barras representam a mediana ± intervalo
interquartil. * p < 0,05 e ** p < 0,001 em relação à Linha de Base; Ψ p < 0,05 em relação à
Esquiva 2 (teste t de Wilcoxon). φ p < 0,05 e φφ p < 0,001 em relação ao grupo Salina
(teste U de Mann-Whitney).
0
100
200
300
Salina (n=17)
PTZ 5mg/Kg (n=11)
PTZ 15 mg/Kg (n=13)
PTZ 30 mg/Kg (n=8)
Linha de Base Esquiva 1 Esquiva 2 Esquiva 3
Sem droga
Pentilenotetrazol
Latência para sair do braço fechado
(s)
*
*
*
* ***** ** * * *
ϕϕ
ϕ
ψ
0
100
200
300
Fuga 1 Fuga 2
Sem drogaPentilenotetrazol
Latência para entar no braço fechado
(s)
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 37
Na figura 3A, o teste de Friedman mostrou mudanças significantes na
latência da esquiva inibitória ao longo das variáveis para os animais tratados com
SP 5 µg/Kg (χ
2
12
(3) = 22,27; p < 0,001), 50 µg/Kg (χ
2
14
(3) = 24,30; p < 0,001) e
250 µg/Kg (χ
2
9
(3) = 15,80; p < 0,05). O teste de Wilcoxon mostrou que a Esquiva 1
dos animais tratados com SP 5 e 50 µg/Kg (T
12
= 6,00; p < 0,05 e T
14
= 8,00; p <
0,05, respectivamente), bem como a Esquiva 2 para os tratados com SP 5 µg/Kg
(T
12
= 0,00; p < 0,05), 50 µg/Kg (T
14
= 0,00; p < 0,001) e 250 µg/Kg (T
9
= 3,00; p <
0,05) foram estatisticamente maiores que a Linha de Base, indicando que o
tratamento com SP, nessas doses, não interferiu na aquisição da esquiva
inibitória. Nenhuma das doses de SP interferiu na retenção dessa tarefa –
memória de longa duração, pois a Esquiva 3 dos animais tratados com SP, nas
diferentes doses, foi estatisticamente maior que a Linha de Base (SP 5 µg/Kg, T
12
= 2,00; p < 0,05; SP 50 µg/Kg, T
14
= 15,50; p < 0,05 e SP 250 µg/Kg, T
9
= 4,00; p <
0,05) e semelhante à Esquiva 2, somente para a dose maior (T
9
= 7,00; p = 0,24)
de SP. Além disso, o teste de Kruskal-Wallis não detectou nenhuma diferença
significativa entre os tratamentos na Esquiva 3 (H
52
(3) = 4,94; p = 0,18). Apesar
da Esquiva 3 dos animais tratados com SP 5 e 50 µg/Kg (T
12
= 1,00; p < 0,05 e T
14
= 7,00; p < 0,05, respectivamente) ter sido estatisticamente menor que a Esquiva
2, essas doses de SP não prejudicaram a retenção da memória.
O teste de Kruskal-Wallis detectou diferença significante entre os grupos de
tratamento somente na Linha de Base (H
52
(3) = 9,16; p < 0,05), indicando que o
desempenho dos animais foi afetado pelo tratamento com SP nessa variável. O
teste de Mann-Whitney mostrou que a Linha de Base dos animais tratados com
SP 50 µg/Kg (U = 42,50; p < 0,05) e 250 µg/Kg (U = 38,50; p < 0,05) foi
estatisticamente superior em relação aos tratados com Salina, indicando um
possível efeito ansiogênico e/ou facilitador da aquisição da esquiva inibitória para
essas doses de SP no LT. Entretanto, esse efeito não é confirmado porque as
Esquivas 1 e 2 , desses tratamentos são semelhantes a do grupo controle.
Em relação à latência para entrar no braço fechado (figura 3B) não houve
diferença significante entre os diferentes grupos de tratamento nas Fugas 1 (H
52
(3) = 4,08; p = 0,25) e 2 (H
52
(3) = 0,60; p = 0,90), bem como entre os animais do
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 38
mesmo grupo entre as sessões com droga e sem droga, indicando que as doses
utilizadas de SP não interferiram no comportamento de fuga dos braços abertos
do LT.
A)
B)
Figura 3 - Efeito da substância P (SP) na latência para sair (A) e entrar (B) no braço
fechado do LT. A Linha de Base, Esquivas 1 e 2 e Fuga 1 foram medidos 20 min após a
administração i.p. de SP ou Salina. A Esquiva 3 e Fuga 2 foram medidas 72 h após (sem
droga). As barras representam a mediana ± intervalo interquartil. * p < 0,05 e ** p < 0,001
em relação à Linha de Base; Ψ p < 0,05 em relação à Esquiva 2 (teste t de Wilcoxon). φ p
< 0,05 em relação ao grupo Salina (teste U de Mann-Whitney).
0
100
200
300
Salina (n=17)
SP 5 µg/Kg (n=12)
SP 50 µg/Kg (n=14)
SP 250 µg/Kg (n=9)
Sem droga
Substância P
Linha de Base Esquiva 1 Esquiva 2 Esquiva 3
** **
**
*
*
*
**
*
*
*
Latência para sair do braço fechado
(s)
ψ
ψ
ϕ
ϕ
0
100
200
300
Fuga 1 Fuga 2
Sem drogaSubstância P
Latência para entar no braço fechado
(s)
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 39
Experimento 2 - Efeito comportamental da administração intraperitoneal de
pentilenotetrazol e substância P no efeito ansiolítico e/ou amnésico da
memória de curta duração promovidos pelo diazepam em ratos avaliados no
labirinto em T.
Na figura 4A, o teste de Friedman detectou mudanças significantes na
latência da esquiva inibitória ao longo das variáveis para os animais tratados com
Salina (χ
2
17
(3) = 34,77; p < 0,001), DZP + Salina (χ
2
11
(3) = 8,56; p < 0,05), SP 5
µg/Kg (χ
2
12
(3) = 22,27; p < 0,001), DZP + SP (χ
2
9
(3) = 21,16; p < 0,001) e DZP +
PTZ (χ
2
10
(3) = 14,72; p < 0,05). O teste de Kruskal-Wallis também detectou
mudanças significantes entre os grupos de tratamento na Linha de Base (H
59
(4) =
24,31; p < 0,001), Esquiva 1 (H
59
(4) = 21,18; p < 0,001), Esquiva 2 (H
59
(4) =
30,98; p < 0,001) e Esquiva 3 (H
59
(4) = 13,72; p < 0,001), demonstrando que os
diferentes tratamentos interferiram no desempenho dos animais na resposta de
esquiva inibitória no LT.
Na figura 4A, o teste de Wilcoxon mostrou que a Esquiva 2 dos animais
tratados com DZP + Salina foi estatisticamente maior que a Linha de Base (T
11
=
8,00; p < 0,05), indicando que esse tratamento não interferiu na aquisição da
esquiva inibitória. As Esquivas 1 (U = 43,50; p < 0,05) e 2 (U = 15,50; p < 0,001)
do mesmo grupo (conforme o teste de Mann-Whitney) foram significantemente
menores que a do grupo Salina, demonstrando um efeito ansiolítico e/ou amnésico
da memória de curta duração. O teste de Mann-Whitney também mostrou que a
Esquiva 3 do grupo DZP + Salina foi estatisticamente menor que a do grupo
Salina (U = 48,00; p < 0,05), sendo que esse resultado pode ser proveniente de
um efeito amnésico da memória de longa duração do tratamento DZP + Salina, ou
não, já que a Esquiva 3 desse grupo foi significantemente maior que a Linha de
Base e similar à Esquiva 2 (T
11
= 10,00; p < 0,05; T
11
= 27,00; p = 0,59,
respectivamente).
As Esquivas 1 e 2 (T
12
= 6,00; p < 0,05 e T
12
= 0,00; p < 0,05,
respectivamente) dos animais tratados com SP 5 µg/Kg foram estatisticamente
maiores que a Linha de Base (conforme o teste de Wilcoxon, figura 4A), indicando
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 40
que essa dose de SP não interferiu na aquisição da esquiva inibitória. Embora, a
Esquiva 3 desses animais tenha sido estatisticamente menor que a Esquiva 2 (T
12
= 1,00; p < 0,05), essa dose de SP não interferiu na retenção da memória, pois a
Esquiva 3 (T
12
= 2,00; p < 0,05) foi estatisticamente maior que Linha de Base e
similar à Esquiva 3 do grupo tratado com Salina (U=48,00; p = 0,12; teste de
Mann-Whitney). Esses resultados já haviam sido descritos no experimento 1
(figura 3A), porque os dados coletados ao longo desses experimentos (1 e 2)
foram agrupados. O teste de Mann-Whitney mostrou que a latência do grupo SP 5
µg/Kg é estatisticamente maior que a do grupo DZP + Salina nas Esquivas 1 (U =
18,50; p < 0,05), 2 (U = 1,00; p < 0,001) e 3 (U = 27,00; p < 0,05), indicando que
essa dose de SP não apresenta um efeito ansiolítico e/ou amnésico em ratos no
LT.
O teste de Wilcoxon (figura 4A) mostrou que as Esquivas 1, 2 e 3 do grupo
DZP + SP foram estatisticamente maiores que a Linha de Base (T
9
= 2,00; p <
0,05, T
9
= 0,00; p < 0,05 e T
9
= 0,00; p < 0,05, respectivamente) e que as Esquivas
2 e 3 são iguais, indicando que esse tratamento não interferiu na aquisição e
retenção da esquiva inibitória. O teste de Mann-Whitney mostrou que o grupo DZP
+ SP aumentou, de forma significante, a latência para sair do braço fechado na
Linha de Base (U = 16,00; p < 0,05) e Esquiva 1 (U = 30,50; p < 0,05) em relação
aos animais tratados com Salina, indicando um efeito ansiogênico e/ou facilitador
na aquisição dessa tarefa. O mesmo teste mostrou que a latência para sair do
braço fechado do grupo DZP + SP na Linha de Base (U = 20,50; p < 0,05),
Esquiva 1 (U = 7,50; p < 0,05), Esquiva 2 (U = 0,00; p < 0,001) e Esquiva 3 (U =
12,00; p < 0,05) foi maior que a do grupo DZP + Salina, indicando que a SP
reverteu (Esquiva 1) e bloqueou (Esquiva 2 e 3) o efeito ansiolítico e/ou amnésico
do DZP. O teste de Mann-Whitney também mostrou que não houve nenhuma
diferença significante ao longo das variáveis entre os tratamentos com SP 5 µg/Kg
e DZP + SP, demonstrando que esses dois grupos são semelhantes.
Também na figura 4A, o teste de Wilcoxon mostrou que as Esquivas 1 e 2
dos animais tratados com DZP + PTZ foram estatisticamente maiores que a Linha
de Base (T
10
= 4,00; p < 0,05 e T
10
= 0,00; p < 0,05, respectivamente), indicando
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 41
que esse tratamento não interferiu na aquisição da esquiva inibitória. Apesar da
latência na Esquiva 3 ter sido estatisticamente menor que a Esquiva 2 (T
10
= 0,00;
p < 0,05) e semelhante à Linha de Base (T
10
= 18,50; p = 0,36), não houve
prejuízo na retenção dessa tarefa, pois a Esquiva 3 do grupo DZP + PTZ foi similar
(teste de Mann-Whitney) àquela apresentada pelo grupo Salina (U = 60,00; p =
0,21). O teste de Mann-Whitney também mostrou que o grupo DZP + PTZ
aumentou de forma significativa à latência para sair do braço fechado na Linha de
Base (U = 9,00; p < 0,001) e Esquiva 1 (U = 32,50; p < 0,05), em relação aos
animais tratados com Salina, indicando um efeito ansiogênico e/ou facilitador na
aquisição dessa tarefa. O mesmo teste também mostrou que as latências na Linha
de Base (U = 10,00; p < 0,05), Esquiva 1 (U = 9,50; p < 0,05) e Esquiva 2 (U =
6,50; p < 0,001) do grupo DZP + PTZ foram estatisticamente maiores que a do
grupo DZP + Salina, indicando que esse tratamento reverte (Esquiva 1) e bloqueia
(Esquiva 2) o efeito ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta duração do
DZP. Além disso, a latência do grupo DZP + PTZ, somente na Linha de Base (U =
26,00; p < 0,05), foi estatisticamente maior que a do grupo SP 5 µg/Kg,
confirmando, mais uma vez, que a SP 5 µg/Kg não é ansiogênica no LT (Figura
3A). Na Esquiva 3 não houve diferença significante do tratamento DZP + PTZ em
relação aos animais tratados com DZP + Salina (U = 43,00; p = 0,40), mas houve
em relação aos tratados com DZP + SP (U = 17,50; p < 0,05), sendo
estatisticamente menor. Tomados juntos, esses resultados mostram que o
tratamento com PTZ interfere no nível de ansiedade dos animais de forma similar
à SP, aumentando-o (ver Esquiva 1), mas esses tratamentos diferem quanto a sua
influência nos processos mnemônicos (ver Esquiva 3), onde apresentam efeitos
contrários, com o PTZ tendendo a promover amnésia e a SP tendendo a produzir
uma facilitação na retenção da tarefa.
Em relação à latência para entrar no braço fechado, figura 4B, não houve
diferença significante entre os diferentes grupos de tratamento nas Fugas 1 (H
59
(4) = 4,60; p = 0,33) e 2 (H
59
(4) = 2,16; p = 0,70), bem como entre os animais do
mesmo grupo, entre as sessões com droga e sem droga, indicando que esses
tratamentos não interferiram no comportamento de fuga dos braços abertos do LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 42
A)
B)
Figura 4 – Influência da administração sistêmica de substância P (SP) e pentilenotetrazol
(PTZ) no efeito ansiolítico e/ou amnésico do diazepam (DZP) medido pela latência para
sair (A) e entrar (B) no braço fechado do LT. Todas as drogas foram injetadas i.p. e as
barras representam a mediana ± intervalo interquartil. * p < 0,05 e ** p < 0,001 em relação
à Linha de Base; Ψ p < 0,05 em relação à Esquiva 2 (teste t de Wilcoxon). ϕ p < 0,05 e ϕϕ
p < 0,001 em relação ao grupo Salina; ω p < 0,05 e ωω p < 0,001 em relação ao grupo
DZP + Salina;
φ
p < 0,05 em relação a SP 5 µg/Kg; α p < 0,05 em relação ao grupo DZP +
SP (teste U de Mann-Whitney).
0
100
200
300
Fuga 1 Fuga 2
Sem droga
Com droga
Latência para entar no braço fechado
(s)
0
100
200
300
Salina (n=17)
DZP + Salina (n=11)
SP (n=12)
DZP + SP (n=9)
DZP + PTZ (n=10 )
Linha de base
Esquiva 1 Esquiva 2 Esquiva 3
Com droga Sem droga
*
***
*
***
*
**** **
ϕϕ
ϕϕ
ϕ
ϕϕ
ϕϕ
ϕ
ω
ω
ω
ωω
Latência para sair do braço fechado (s)
ωωω
ω
ωω ω
ψ
ψ
α
Φ
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 43
Experimento 3 – Efeito comportamental da administração central de
substância P no efeito ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta
duração promovidos pelo diazepam em ratos avaliados no labirinto em T.
Na figura 5A, o teste de Friedman detectou mudanças significantes na
latência da esquiva inibitória ao longo das variáveis para os animais tratados com
Salina + PBS (χ
2
8
(3) = 13,80; p < 0,05), Salina + SP (χ
2
9
(3) = 21,73; p < 0,001) e
DZP + SP (χ
2
6
(3) = 16,50; p < 0,001), mas não para os animais tratados com DZP
+ PBS (χ
2
6
(3) = 7,30; p < 0,06). O teste de Kruskal-Wallis também detectou
diferença significativa entre os grupos de tratamento na Esquiva 1 (H
29
(3) = 14,96;
p < 0,05), Esquiva 2 (H
29
(3) = 18,95; p < 0,001) e Esquiva 3 (H
29
(3) = 12,89; p <
0,05), demonstrando que os diferentes tratamentos interferiram no desempenho
dos animais na resposta de esquiva inibitória no LT.
O teste de Wilcoxon (figura 5A) mostrou que as Esquivas 1 (T
8
= 3,00; p <
0,05) e 2 (T
8
= 0,00; p < 0,05) dos animais tratados com Salina + PBS, a Esquiva 2
dos tratados com Salina + SP (T
9
= 0,00; p < 0,05) e as Esquivas 1 e 2 (T
6
= 0,00;
p < 0,05) dos tratados com DZP + SP foram estatisticamente maiores que a Linha
de Base, indicando que os animais adquiriram o comportamento de esquiva
inibitória. O mesmo teste detectou que a Esquiva 3 do grupo Salina + PBS (T
8
=
18,00, p = 1,00) foi semelhante à Esquiva 2 e estatisticamente maior que a Linha
de Base (T
8
= 4,00, p < 0,05), demonstrando que os animais lembraram desse
procedimento. Também na figura 5A (teste de Wilcoxon) a Esquiva 3 do grupo
Salina + SP (T
9
= 5,00, p = 1,00) foi semelhante à Esquiva 2, enquanto que a do
grupo DZP + SP foi igual. Além disso, a Esquiva 3 do grupo Salina + SP (T
9
=
0,00, p < 0,05) e DZP + SP (T
6
= 0,00, p < 0,05) foi estatisticamente maior que a
Linha de Base e similar a Esquiva 3 do grupo Salina + PBS (Salina + SP, U =
17,5; p = 0,075; DZP + SP, U = 9,00; p = 0,06, conforme o teste de Mann-
Whitney), indicando que os animais lembraram dessa tarefa avaliada no LT.
O teste de Mann-Whitney (Figura 5A) mostrou que a latência do grupo DZP
+ PBS nas Esquivas 1 (U = 5,00; p < 0,05) e 2 (U = 7,50; p < 0,05) foi
estatisticamente menor que a do grupo Salina + PBS, indicando um efeito
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 44
amnésico da memória de curta duração, já que os animais não adquiriram o
comportamento de esquiva inibitória (conforme o teste de Friedman), e/ou um
efeito ansiolítico. O mesmo teste na Esquiva 3 demonstrou que a latência do
grupo DZP + PBS é estatisticamente menor que a do grupo Salina + SP (U = 6,50;
p < 0,05).
Na figura 5A, o teste de Mann-Whitney mostrou que a latência do grupo
DZP + SP nas Esquivas 1 (U = 1,50; p < 0,05) e 2 (U = 3,00; p < 0,05) foi
estatisticamente maior que a do grupo Salina + PBS, indicando um efeito
ansiogênico e/ou facilitador na aquisição da esquiva inibitória. O mesmo teste
também detectou diferença significativa do grupo DZP + SP em relação ao grupo
DZP + PBS nas Esquivas 1 (U = 0,00; p < 0,05), 2 (U = 0,00; p < 0,05) e 3 (U =
3,00; p < 0,05), indicando que a SP reverteu o efeito amnésico da memória de
curta duração e/ou ansiolítico do DZP.
Ainda na figura 5A, o teste de Mann-Whitney não detectou nenhuma
diferença significativa entre os animais tratados com Salina + SP nas Esquivas 1
(U = 34,50; p = 0,89) e 2 (U = 16; p = 0,055), em relação aos animais tratados com
Salina + PBS, indicando, novamente, que o tratamento direto com SP não
interfere no desempenho dos animais nesse tipo de comportamento avaliado no
LT. Além disso, o grupo Salina + SP apresentou dois comportamentos distintos
nas Esquivas 1 e 2; este grupo foi estatisticamente menor que o grupo tratado
com DZP + SP na Esquiva 1 (U = 7,00; p < 0,05) e maior que o grupo tratado com
DZP + PBS na Esquiva 2 (U = 0,00; p < 0,05), conforme o teste de Mann-Whitney,
ratificando os dados obtidos anteriormente que a SP diretamente não apresenta
perfil ansiogênico ou ansiolítico, bem como um efeito facilitador ou amnésico
dessa tarefa no LT.
Em relação à latência para entrar no braço fechado (Figura 5B), não houve
diferença significante entre os diferentes grupos de tratamento nas Fugas 1 (H
29
(3) = 4,53; p = 0,21) e 2 (H
29
(3) = 6,57; p = 0,09), bem como entre os animais do
mesmo grupo entre as sessões com droga e sem droga, indicando que esses
tratamentos não interferiram no comportamento de fuga dos braços abertos do LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 45
A)
B)
Figura 5 – Influência da administração i.c.v. de substância P (SP) no efeito amnésico e/ou
ansiolítico da injeção i.p. de diazepam (DZP) medido pela latência para sair (A) e entrar
(B) no braço fechado do LT. As barras representam a mediana ± intervalo interquartil. * p
< 0,05 em relação à Linha de Base (teste t de Wilcoxon). ϕ p < 0,05 em relação ao grupo
Salina; ω p < 0,05 em relação ao grupo DZP + PBS;
φ
p < 0,05 em relação ao grupo Salina
+ SP (teste U de Mann-Whitney).
0
100
200
300
Salina + PBS (n=7)
Salina + SP (n=9)
DZP + PBS (n=6)
DZP + SP (n=6)
Com droga
Latência para sair do braço fechado
(s)
Sem droga
Linha de base Esquiva 1 Esquiva 2 Esquiva 3
*
*
*
** ***
ϕ
ϕ
ϕ
ϕφ
ϖ
ϖ
φ
ϖ
φ
0
100
200
300
Latência para entar no braço fechado
(s)
Fuga 1 Fuga 2
Com droga Sem droga
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 46
Experimento 4 – Avaliação da participação do receptor NK
1
na influência da
substância P sobre o efeito ansiolítico e/ou amnésico da memória de curta
duração promovidos pelo diazepam em ratos avaliados no labirinto em T.
Na figura 6A, o teste de Friedman detectou mudanças significantes
somente na latência da esquiva inibitória, ao longo das variáveis, para os animais
tratados com Salina + FK 888 + Veículo (χ
2
6
(3) = 16,29; p < 0,001). O teste de
Wilcoxon mostrou que a Esquiva 2, desse tratamento, foi estatisticamente maior
que a Linha de Base (T
6
= 0,00; p < 0,05), indicando que o FK 888 não interferiu
na aquisição da esquiva inibitória e memória avaliada no LT, pois a Esquiva 3 foi
igual à Esquiva 2 e estatisticamente maior que a Linha de Base (T
6
= 0,00; p <
0,05).
Na figura 6A, o teste de Kruskal-Wallis detectou diferença significante entre
os grupos de animais tratados com Salina + FK 888 + Veículo, DZP + FK 888 +
Veículo e DZP + FK 888 + SP nas Esquivas 2 (H
18
(2) = 12,80; p < 0,05) e 3 (H
18
(2) = 8,07; p < 0,05), indicando que os diferentes tratamentos interferiram no
desempenho dos animais nessas variáveis.
O teste de Mann-Whitney mostrou que a Esquiva 2 (figura 6A) dos animais
tratados com DZP + FK 888 + Veículo (U = 0,00; p < 0,05) e DZP + FK 888 + SP
(U = 0,00; p < 0,05) foi estatisticamente menor que a dos animais tratados com
Salina + FK 888 + Veículo. Esses resultados indicam: no primeiro caso, que o FK
888 não interferiu no efeito amnésico do DZP, já que os animais não adquiriram o
comportamento de esquiva inibitória (χ
2
6
(3) = 5,84; p = 0,12, conforme o teste de
Friedman), e/ou ansiolítico; no segundo, que a reversão, promovida pela injeção
i.c.v. de SP do efeito amnésico e/ou ansiolítico do DZP, ocorre via receptores NK
1
,
pois a administração do antagonista NK
1
(FK 888) aboliu esse efeito.
Também na figura 6A, o teste de Mann-Whitney mostrou que a Esquiva 3
dos animais tratados com DZP + FK 888 + Veículo (U = 3,00; p < 0,05) e DZP +
FK 888 + SP (U = 4,00; p < 0,05) foi estatisticamente menor que a dos animais
tratados com Salina + FK 888 + Veículo como resultado de um déficit na
aprendizagem dessa tarefa, mais que um efeito do tipo amnésico da memória de
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 47
longa duração, já que o teste de Friedman não detectou mudanças significantes
na latência da esquiva inibitória, ao longo das variáveis, para os animais tratados
com DZP + FK 888 + Veículo (χ
2
6
(3) = 5,84; p = 0,12) e DZP + FK 888 + SP (χ
2
6
(3) = 5,40; p = 0,14).
Em relação à latência para entrar no braço fechado (figura 6B), não houve
diferença significante entre os diferentes grupos de tratamento nas Fugas 1 (H
18
(2) = 3,22; p = 0,20) e 2 (H
18
(2) = 0,64; p = 0,73), bem como entre os animais do
mesmo grupo entre as sessões com droga e sem droga, indicando que esses
tratamentos não interferiram no comportamento de fuga dos braços abertos do LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 48
A)
0
100
200
300
Salina+FK888+Veículo
DZP+FK888+Veículo
DZP+FK888+SP
Linha de Base Esquiva 1 Esquiva 2 Esquiva 3
Com Droga Sem Droga
*
*
ϕ
ϕ
ϕ
ϕ
Latência para sair do braço fechado
(s)
B)
Figura 6 – Efeito do antagonista NK
1
, FK 888, na influência do tratamento central (i.c.v.)
com substância P (SP) sobre o efeito amnésico e/ou ansiolítico do diazepam (DZP)
medido pela latência para sair (A) e entrar (B) no braço fechado do LT. As barras
representam a mediana ± intervalo interquartil. * p < 0,05 em relação à Linha de Base
(teste t de Wilcoxon). ϕ p < 0,05 em relação ao grupo Salina + FK 888 + Veículo (teste U
de Mann-Whitney).
0
100
200
300
Latência para entar no braço fechado
(s)
Fuga 1 Fuga 2
Com Droga Sem Droga
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 49
DISCUSSÃO
Várias evidências indicam uma intima relação entre ansiedade e memória.
Assim, a esquiva passiva ou inibitória, um modelo amplamente usado para o
estudo da memória, é também um modelo de ansiedade. Além disso, as
estruturas cerebrais envolvidas na modulação da ansiedade e da memória,
particularmente da memória emocional, sobrepõem-se extensivamente. O uso do
labirinto em T tenta direcionar estas questões, pois teoricamente permite a
avaliação simultânea de dois tipos de medo, o adquirido (Linha de Base, Esquiva
1 e Esquiva 2) e o inato (Fuga 1) e da memória, isto é, do aprendizado de uma
“tarefa” (Esquiva 3 e Fuga 2) no mesmo animal (Tomaz et al., 1992 apud Graeff et
al., 1993).
Em nossos experimentos, o ansiolítico clássico DZP prejudicou a aquisição
da esquiva inibitória, enquanto que a droga ansiogênica prototípica PTZ, em doses
subconvulsivas, facilitou este comportamento. O prejuízo na aquisição da esquiva
inibitória, promovido pelo DZP, pode ser visto como um efeito ansiolítico e/ou
amnésico da STM. Por outro lado à facilitação da esquiva inibitória, promovida
pelo PTZ, pode ser vista como um efeito ansiogênico e/ou facilitador na
aprendizagem. Por outro lado, as duas drogas falharam em alterar a latência de
fuga, tomada como um índice de pânico.
Nossos resultados obtidos com o DZP vão de encontro aos obtidos em
estudos prévios no LT, que demonstraram que o DZP prejudicou seletivamente a
aquisição da esquiva inibitória sem influenciar a resposta de fuga em ratos (Graeff
et al., 1998; Graeff et al., 1993; Viana et al., 1994) e em camundongos (Carvalho-
Netto e Nunes-de-Souza, 2004). Entretanto, o efeito amnésico da STM pode ser
questionado, uma vez que Conde e colaboradores (1999) demonstraram, através
da exposição repetida nos braços fechados (mais algumas sessões além das três
tradicionais), que os animais tratados com DZP adquirem o comportamento de
esquiva inibitória, ou seja, permanecem 300 s no braço fechado. Similarmente,
nossos resultados obtidos com o PTZ corroboram com os obtidos em outros
modelos experimentais de ansiedade e memória (Jung et al., 2002; Chapouthier e
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 50
Venault, 2004), já que somos os pioneiros em utilizar o PTZ no LT. O PTZ,
antagonista do receptor GABA
A
, é bastante usado como droga ansiogênica padrão
em modelos animais de ansiedade. Em animais experimentais, seus efeitos
ansiogênicos têm sido mostrados em uma variedade de modelos experimentais,
incluindo o LCE (De Souza et al., 1998) e o teste de Vogel (Giusti et al., 1991). Em
seres humanos, o PTZ foi inicialmente descrito como uma droga convulsivante e
mais tarde como uma droga ansiogênica, em doses subconvulsivas, além de
panicolítica em doses convulsivas (Jung et al., 2002; Schenberg et al., 2001). O
PTZ também precipita “ataques de pânico” em animais na dose de 50 mg/Kg (i.p.),
que é substancialmente maior que a dose usada em modelos de ansiedade
(Schenberg et al., 2001). Nos processos mnemônicos, de modo geral, os achados
das várias situações de aprendizagem demonstram que o PTZ, em doses não
convulsivas, melhora os processos mnemônicos (Chapouthier e Venault, 2004).
Venault e colaboradores (1986 e 1992) demonstraram que a administração pré-
treino de PTZ, mas não pós-treino ou pré-teste de uma dose subconvulsivante e
não ansiogênica, em camundongos, aumentou a retenção da habituação a um
novo ambiente. Sendo assim, os resultados obtidos com as doses subconvulsivas
de PTZ no LT estão de acordo com os dados da literatura, pois o PTZ promoveu
um aumento significativo na latência da esquiva inibitória, que pode ser visto como
um efeito ansiogênico e/ou facilitador da aprendizagem dessa tarefa, e não
interferiu na latência de fuga, associada a uma resposta de pânico.
A administração periférica de SP, diferente das drogas padrão DZP e PTZ,
não interferiu na aquisição da esquiva inibitória no LT, apesar de diversos estudos
sugerirem fortemente que a ansiedade experimental e os processos de
aprendizagem e memória podem ser modulados pela SP e seus fragmentos N- e
C-terminal em outros modelos experimentais (para revisão ver Hasenöhrl et al.,
2000; Duarte et al., 2004; Gavioli et al., 2002; Gavioli et al., 1999; Huston e
Hasenöhrl, 1995; Teixeira et al., 1996). A exemplo dessas drogas padrão, a SP
não interferiu na latência de fuga avaliada no teste e re-teste no LT. Dessa forma,
a falta de efeito ou a não confirmação dos resultados obtidos para a dose
intermediária e maior de SP na Linha de Base, que indicavam um possível efeito
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 51
ansiogênico e/ou facilitador da aquisição da esquiva inibitória, aliada aos dados da
literatura seria surpreendente se não fossem as observações recentes de
Echeverry e colaboradores (2001) que também não obtiveram resultados
significativos para a injeção i.p. de SP no LT. Sendo assim, poderíamos supor que
o efeito da SP nos parâmetros de medo e memória pode ser dependente do
modelo experimental utilizado, uma vez que já foram observados efeitos
ansiolíticos e ansiogênicos da SP no LCE e no teste de interação social
(Hasenöhrl et al., 1998; Duarte et al., 2004; Gavioli et al., 1999; Teixeira et al.,
1996) e facilitadores e reforçadores da memória em uma tarefa de esquiva
inibitória (up-hill; Hasenöhrl et al., 1990a; Tomaz e Huston, 1986) e de preferência
condicionada de lugar (open-field; Hasenöhrl et al., 1990b; Oitzl et al., 1990).
Além disso, a não observação ou confirmação de um possível efeito
ansiogênico e/ou facilitador da aquisição da esquiva inibitória para a administração
i.p. de SP no LT pode ser devida ao alto nível basal de reatividade emocional dos
animais, pois o “traço de ansiedade” é uma característica durável e persistente da
personalidade do indivíduo/animal e reflete a forma como ele interage com seu
ambiente físico e social (Sandford et al., 2000). No LCE, modelo amplamente
utilizado para investigar comportamentos relacionados com ansiedade (Dawson e
Tricklebank, 1995; Hogg, 1996; Rodgers et al., 1997), vários experimentos têm
mostrado que ratos, embora idênticos na linhagem, sexo e idade, podem diferir
sistematicamente em sua resposta comportamental (Henniger et al., 2000; Ho et
al., 2002). Como o traço de ansiedade independe do teste utilizado (Henniger et
al., 2000), Conde e colaboradores (2000) demonstraram que há uma diferença
emocional interindividual no LT para os animais da linhagem Wistar de sua colônia
no desempenho da esquiva inibitória, que permite dividi-los em animais com
comportamentos de alta e baixa reatividade, utilizando um procedimento de
critério para o treino (isto é, recolocar o animal no braço fechado até que
permaneça 300 s; Conde et al., 1999), com os animais de alta reatividade
adquirindo o comportamento de esquiva inibitória com três ou menos sessões,
enquanto os de baixa reatividade adquirem o comportamento com quatro ou mais
sessões. Portanto, poderíamos supor que o possível efeito ansiogênico e/ou
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 52
facilitador da aquisição da esquiva inibitória, promovido pela injeção i.p. de SP,
pode estar sendo mascarado por um efeito teto dos animais do grupo controle na
Esquiva 2, devido à presença de animais com alta reatividade neste grupo.
O sítio de ação pelo qual a SP modula os processos de ansiedade e
memória, quando administrada perifericamente, não está determinado com
precisão, mas sabe-se que a SP pode atravessar a barreira hematoencefálica
(BBB, do inglês blood-brain barrier) e agir em estruturas centrais. Estudos in vivo e
in vitro têm mostrado que a SP pode penetrar a BBB (Banks e Kastin, 1985; Freed
et al., 2002) e, portanto, modular os comportamentos relacionados à ansiedade e
os processos mnemônicos por agir em estruturas centrais quando administrada
perifericamente. Entretanto, é também possível que efeitos periféricos diretos da
SP, tais como efeitos cardiovasculares, possam ser responsáveis por esses
resultados. Estudos anatômicos, imunohistoquímicos e com radioautografia
mostram uma alta concentração de SP e dos receptores de TKs nos terminais
vagais e no núcleo do trato solitário (NTS, Cuello e Kanazawa, 1978; Funakoshi et
al., 1989; Helke e Seagard, 2004; Mazzone e Geragty, 2000). Além disso,
Nogueira e colaboradores (1994) demonstraram que o efeito facilitatório
observado na tarefa de esquiva inibitória (step-down) pela administração periférica
pós-treino de SP é bloqueado por vagotomia sub-diafragmática, indicando que a
integridade funcional do nervo vago é importante para o efeito mnemônico
exercido pela SP.
Tradicionalmente, a LTM no LT tem sido avaliada durante a Esquiva 3,
comparando os diferentes grupos de tratamento com o grupo controle; onde uma
redução ou um aumento na latência para deixar o braço fechado pode ser
interpretado como um efeito amnésico ou facilitador na retenção desta tarefa,
respectivamente (Echeverry et al., 2001; Graeff et al., 1993; Viana et al., 1994).
Esse mesmo tipo de avaliação também é feito em outros modelos experimentais
que avaliam, especificamente, os processos mnemônicos como, por exemplo, o
step-down (Izquierdo et al., 1999). Entretanto, nesses modelos os animais são
expostos ao aparelho durante o treino geralmente uma única vez e as drogas
testadas não interferem no desempenho dos animais na aprendizagem.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 53
Diferentemente, os animais no LT são expostos no treino (teste) três vezes
consecutivas, em intervalos de 30 s e, dependendo da droga, o desempenho
poderá ser afetado, ou seja, aumentado ou reduzido, indicando, além dos efeitos
na ansiedade, um efeito facilitador ou amnésico dessa tarefa. Conseqüentemente,
a avaliação da retenção da memória (Esquiva 3) ficará prejudicada, pois não se
sabe até que ponto o nível de ansiedade estará interferindo na aprendizagem
deste comportamento ou vice-versa. Na tentativa de minimizar essa relação
resolvemos estabelecer mais outro critério para ajudar na discriminação desses
efeitos (ansiolítico/amnésico ou ansiogênico/facilitador), isto é, comparar a
Esquiva 3 com a Linha de Base e com a Esquiva 2 do mesmo grupo. Dessa
forma, para que uma droga cause, por exemplo, um efeito amnésico da LTM,
primeiro, ela não poderá interferir no aprendizado da esquiva inibitória e, segundo,
no re-teste, deverá reduzir a latência da esquiva inibitória a ponto de ser menor
que a sua própria Linha de Base e Esquiva 2, além da tradicional redução em
relação ao grupo controle na Esquiva 3. Como em nenhum dos experimentos
esses critérios foram encontrados, não foi possível detectar com segurança
nenhum efeito amnésico ou facilitador da LTM no presente estudo.
Além desses resultados, nossos dados mostraram ainda que o efeito
amnésico da STM e/ou ansiolítico produzido pelo DZP na latência da esquiva
inibitória foi revertido e bloqueado pela injeção sistêmica de PTZ e SP e
bloqueado com a administração central de SP, confirmando a relação previamente
estabelecida em modelos experimentais distintos entre as TKs, em particular a SP,
e o DZP na ansiedade e memória (Costa e Tomaz, 1998; Ribeiro e De Lima,
2002). Além disso, nossos resultados mostraram também que o bloqueio, com a
administração central de SP, do efeito amnésico da STM e/ou ansiolítico
produzido pelo DZP na latência da esquiva inibitória ocorre via receptores NK
1
,
pois o tratamento central com o antagonista preferencial deste receptor – FK 888,
que per se não apresentou efeito – foi capaz de abolir este efeito.
Evidências das ações antagônicas do DZP e PTZ vêm de estudos com
macacos Rhesus (Macaca mulatta), onde as mudanças comportamentais e
bioquímicas provocadas pela administração de PTZ (30 mg/Kg, i.m.),
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 54
caracterizadas por hipervigilância, agressividade, taquipnéia, piloereção,
freqüentes mudanças na postura e aumento significante no nível de cortisol
plasmático, podem ser bloqueadas pelo tratamento intravenoso com DZP (1,0
mg/Kg; Palit et al., 1998).
O mecanismo pelo qual a SP bloqueia e reverte o efeito comportamental
produzido pelo DZP é ainda desconhecido. Como a SP e os receptores GABA
A
estão amplamente distribuídos no sistema nervoso central é possível que estejam
atuando e/ou modulando outros sistemas de neurotransmissores. Além da
investigação do possível mecanismo responsável pela relação entre os sistemas
GABAérgico e taquicinérgico, torna-se importante saber se essa relação é
específica para a ansiedade e memória ou se pode ser estendida para o efeito
anticonvulsivante, hipotérmico e na coordenação motora (ataxia) promovida pelo
DZP.
Em resumo, nossos resultados mostraram que a administração periférica e
central de SP não interferiu diretamente na esquiva inibitória de ratos avaliados no
LT, ao contrário do DZP, que apresentou um efeito ansiolítico e/ou amnésico da
STM, e do PTZ, que apresentou um efeito ansiogênico e/ou facilitador na
aprendizagem dessa tarefa. Entretanto, a SP foi capaz de bloquear e reverter,
quando administrada perifericamente, e reverter, quando administrada
centralmente, o(s) efeito(s) promovido(s) pelo DZP; com este último efeito
ocorrendo via receptores NK
1
. Dessa forma, conseguimos verificar a relação
existente entre os sistemas GABAérgico e taquicinérgico na ansiedade e memória
em outros modelos experimentais, utilizando um único modelo – o LT. Além disso,
observamos que nenhum dos tratamentos foi capaz de alterar as respostas de
fuga e a LTM da tarefa de esquiva inibitória no LT.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 55
CONCLUSÕES
Os resultados do presente trabalho ratificam o efeito ansiolítico ou o
possível efeito amnésico da STM da droga padrão DZP e o efeito ansiogênico ou
o possível efeito facilitador da STM da droga padrão PTZ no LT, aonde
modificaram seletivamente a medida da esquiva inibitória (Linha de Base e
Esquivas 1 e 2), associadas ao distúrbio de ansiedade generalizada; sem interferir
na latência de fuga, que é relacionada com o distúrbio de pânico.
Os nossos dados mostraram também que a SP não interfere na medida da
esquiva inibitória no LT, quando administrada i.p. (5, 50 e 250 µg/Kg) e i.c.v. (10
pmol), em doses que demonstraram influenciar os comportamentos de ansiedade
e memória em outros modelos experimentais. Entretanto, a administração i.p. de
SP (5 µg/Kg) foi capaz de bloquear e reverter, enquanto que a administração i.c.v.
de SP (10 pmoL) foi capaz de reverter o efeito ansiolítico ou o possível efeito
amnésico da STM promovido pelo tratamento agudo com DZP (1 mg/Kg, i.p.) na
latência da esquiva inibitória. Estes resultados ratificam a interação existente entre
os sistemas GABAérgico e taquicinérgico na modulação da ansiedade e memória,
já mostrada em outros modelos experimentais. O PTZ (30 mg/Kg, i.p.) também foi
capaz de bloquear e reverter esse efeito promovido pelo DZP, confirmando as
ações antagônicas dessas drogas.
O tratamento i.c.v. com o antagonista seletivo do receptor NK
1
, FK 888 na
dose de 100 pmoL, foi capaz de bloquear a reversão, promovida pela
administração i.c.v. de SP 10 pmoL, do efeito ansiolítico ou do possível efeito
amnésico da STM induzido pelo DZP (1 mg/Kg, i.p.). Em contraste, a avaliação da
LTM no LT não sofreu influência de nenhum dos tratamentos.
Dissertação de Mestrado – FMC – UFSC Marcelo Duzzioni 56
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