( PDF ) Associação dos polimorfismos -1131T>C e S19W do gene da apolipoproteína A-V com doença arterial coronariana e diabete melito tipo 2

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CAROLINE LUISE PROCHASKA

ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS -1131T>C E S19W DO GENE

DA APOLIPOPROTEÍNA A-V COM DOENÇA ARTERIAL

CORONARIANA E DIABETE MELITO TIPO 2

CURITIBA

2006

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CAROLINE LUISE PROCHASKA

ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS -1131T>C E S19W DO GENE

DA APOLIPOPROTEÍNA A-V COM DOENÇA ARTERIAL

CORONARIANA E DIABETE MELITO TIPO 2

Dissertação apresentada como requisito

parcial à obtenção do grau de Mestre em

Ciências Farmacêuticas, Curso de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas,

Setor de Ciências da Saúde, Universidade

Federal do Paraná.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Marileia Scartezini

Co-orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi

de Souza.

CURITIBA

2006

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À minha mãe, Eloisa, por todo

seu amor e carinho e por sempre

me incentivar a estudar.

CAROLINE LUISE PROCHASKA

Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal do Paraná, Farmacêutica Bioquímica da Diagnósticos da

América no período de março de 2004 a setembro de 2005, Farmacêutica

Bioquímica do Hospital Erasto Gaertner de Curitiba desde março de 2006. Graduada

em Farmácia e Bioquímica pela Universidade Federal do Paraná em 2003.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Marileia Scartezini, pelo carinho e preciosa amizade e

pelas oportunidades ofertadas nestes dois anos de trabalho.

Ao meu co-orientador, Emanuel Maltempi de Souza, pelo grande apoio e por

viabilizar a realização deste trabalho.

Ao professor Geraldo Picheth por conceber a idéia deste projeto, pelo apoio,

amizade, disponibilidade em sempre ajudar e por ser um entusiasta da ciência.

À minha família, pelo incentivo e compreensão nos momentos de ausência,

em especial à minha mãe Eloisa e aos meus tios Carla e Pedro, obrigada por tudo.

À Mauren Isfer Anghebem Oliveira, obrigada pela presença constante, pelo

carinho, incentivo e por ter se tornado uma amiga muito especial.

À minha orientadora de iniciação científica, Maria Suely Soares, pela amizade

e por me iniciar nos caminhos da ciência.

Aos meus colegas do Laboratório de Hematologia e Citologia da UFPR,

professora Almeriane Weffort Santos, funcionária Irene Ermelino Santos,

farmacêuticos bioquímicos Aline Borsato Hauser e Daniel Witchmichen Krukoski pelo

auxílio e amizade nos anos de iniciação científica.

À farmacêutica bioquímica, querida amiga, professora e companheira de

experimentos Ligia Maria Claro pela amizade e pelos conhecimentos

compartilhados.

Às queridas amigas e colegas de mestrado Ângela Florão, Jeanine Marie

Nardin e Lisangela Cristina Oliveira, sem vocês eu não teria chegado até aqui.

Aos colegas e pesquisadores do Departamento de Bioquímica da UFPR pela

acolhida, auxílio e acesso às instalações do departamento.

À Profª Drª Eleidi Chautard Freire Maia, do Departamento de Genética da

UFPR, pela colaboração com as análises estatísticas.

Ao Hospital Cardiológico Costantini, em especial ao Dr. Costantino Ortiz

Costantini, pelo auxílio na seleção dos pacientes e coleta das amostras.

Aos meus amigos da graduação, em especial a Fernanda Santana Ferreira

Smolareck, Fernanda Louise Voos, Nathalia Marchiori Iensen, Fernanda Gaensly e

André Schenkel Dedecek, obrigada pelo apoio.

Ao meu querido Camilo Batiston Prado, obrigada pela compreensão nos

momentos ausentes, pelo carinho, paciência, incentivo e ajuda nas figuras e

apresentações.

À coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,

seus alunos e professores.

A todas as pessoas que, mesmo não mencionadas, contribuíram de alguma

forma para a realização deste trabalho.

“Aventureiro me chamam aventureiro.

Pois venha um tempo marinheiro

Um vento de aventura.

Altas são as montanhas

E as águas do mar são vastas.”

Manuel Alegre

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................ x

LISTA DE TABELAS ........................................................................................... xii

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... xiv

RESUMO ............................................................................................................. xv

ABSTRACT ......................................................................................................... xvi

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1

2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 2

2.OBJETIVO PRINCIPAL .................................................................................... 2

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 2

3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................ 3

3.1 DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA E DIABETE MELITO........................ 3

3.2 LIPOPROTEÍNAS E APOLIPOPROTEÍNAS.................................................. 6

3.3 APOLIPOPROTEÍNA A-V............................................................................... 11

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 18

4.1 DADOS DOS PACIENTES............................................................................. 19

4.1.1 Variáveis antropométricas .......................................................................... 19

4.1.2 Variáveis bioquímicas.................................................................................. 19

4.2 REAGENTES.................................................................................................. 20

4.3 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA.................................................. 20

4.4 AMPLIFICAÇÃO DO DNA E IDENTIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR. 22

4.4.1 Polimorfismo -1131T>C ............................................................................. 22

4.4.2 Polimorfismo S19W..................................................................................... 23

4.5 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO

-1131T/C DO GENE DA APO A-V HUMANA.......................................................

4.6 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO

S19W DO GENE DA APO A-V HUMANA............................................................

4.7 IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO............................. 26

5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS.............................................................................. 29

6 RESULTADOS.................................................................................................. 30

6.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA.............................................................. 30

6.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE DA APO A-V............................... 33

6.3 ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO ENTRE HAPLÓTIPOS E GENÓTIPOS DO

GENE DA APO A-V E DAC NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DM2...............

7 DISCUSSÃO..................................................................................................... 43

7.1 DADOS ANTROPOMÉTRICOS E BIOQUÍMICOS......................................... 43

7.2 VARIABILIDADE GENÉTICA......................................................................... 46

7.3 ANÁLISES COMPARATIVAS PARA OS POLIMORFISMO -1131T>C E

S19W....................................................................................................................

7.4 ESTUDO DE HAPLÓTIPOS........................................................................... 51

7.5 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO E OUTRAS COMPARAÇÕES..................... 52

8 CONCLUSÕES.................................................................................................. 55

REFERÊNCIAS.................................................................................................... 56

ANEXOS............................................................................................................... 64

LISTA DE ABREVIATURAS

apo

Apolipoproteína

APO

Gene de apolipoproteína

Pares de base; base pair

CETP

Proteína de transferência de éster de colesterol

Controle

Grupo DM2-DAC-

DAC

Doença Arterial Coronariana

DAC +

Presença de Doença Arterial Coronariana comprovada por

coronarioangiografia

DAC –

Ausência de Doença Arterial Coronariana comprovada por

coronarioangiografia

Diabete melito

DM2 –

Ausência de Diabete melito tipo 2

DM2 +

Presença de Diabete melito tipo 2

DM2-DAC-

Grupo controle, composto de indivíduos sem diabetes tipo 2 e sem

Doença Arterial Coronariana

DM2-DAC+

Grupo composto de indivíduos sem diabetes tipo 2 e com Doença

Arterial Coronariana

DM2+DAC+

Grupo composto de indivíduos com diabetes tipo 2 e com Doença

Arterial Coronariana

Grau de liberdade

HbA

Hemoglobina Glicada A

HDL

Lipoproteína de alta densidade

HDL-C

HDL-Colesterol

IDL

Lipoproteína de densidade intermediária

IMC

Índice de massa corporal

LDL

Lipoproteína de baixa densidade

LDL-C

LDL-Colesterol

Lp(a)

Lipoproteína (a)

LPL

Lipoproteína lipase

PCR

Reação em cadeia da polimerase; Polimerase Chain Reaction

PPAR

Receptores de proliferação ativada do peroxissomo; Peroxissome

Proliferator Activated Receptors

PPRE

Elemento de resposta específica

RFLP

Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição;

Restriction Fragment Length Polymorphism

SNP

Polimorfismo de Nucleotídeo Único; Single Nucleotide Polymorphism

TBE

Tampão Tris-Borato-EDTA

Triglicérides

VLDL

Lipoproteína de muito baixa densidade

VLDL-C

VLDL-Colesterol

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO

POLIMORFISMO -1131T>C DO GENE DA APO A-V NAS

DIVERSAS POPULAÇÕES ESTUDADAS.........................................

TABELA 2

FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO

POLIMORFISMO S19W DO GENE DA APO A-V NAS DIVERSAS

POPULAÇÕES ESTUDADAS............................................................ 15

TABELA 3 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS EM ESTUDO........................... 19

TABELA 4 MARCADORES BIOQUÍMICOS......................................................... 20

TABELA 5 CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DO

POLIMORFISMO -1131T>C............................................................... 22

TABELA 6 PROGRAMA UTILIZADO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS

FRAGMENTOS DO POLIMORFISMO -1131T>C.............................. 23

TABELA 7 CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DO

POLIMORFISMO S19W.................................................................... 24

TABELA 8 PROGRAMA UTILIZADO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS

FRAGMENTOS DO POLIMORFISMO S19W................................... 24

TABELA 9 CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO

DO POLIMORFISMO -1131T>C........................................................ 25

TABELA 10 CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO

DO POLIMORFISMO S19W............................................................... 25

TABELA 11 DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIAS POR SEXO E FATORES DE

RISCO PARA DAC NOS GRUPOS ESTUDADOS............................ 30

TABELA 12 DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIAS DE IDADE............................... 31

TABELA 13 VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E BIOQUÍMICAS DOS

GRUPOS: DM2−DAC−, DM2−DAC+ E DM2+DAC+, COM MÉDIA

(M) ± DESVIO PADRÃO (DP) E AMPLITUDE DE VARIAÇÃO (AV)

DAS VARIÁVEIS ANALISADAS.........................................................

TABELA 14 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS

POLIMORFISMOS -1131T>C E S19W DO GENE DA APO A-V

NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E

DM2+DAC+ (N=65) E NA AMOSTRA (N=206)..................................

TABELA 15 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DA AMOSTRA

AMPLIADA PARA O POLIMORFISMO S19W DO GENE DA APO

A-V NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=77), DM2−DAC+ (N=140) E

DM2+DAC+ (N=78)............................................................................

TABELA 16 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS

POLIMORFISMOS -1131T>C E S19W DO GENE DA APO A-V

NOS GRUPOS DAC− (N=66) E DAC+ (N=140).................................

TABELA 17 DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIA (%) DOS GENÓTIPOS

-1131T>C/S19W DO GENE DA APO A-V NOS GRUPOS

DM2−DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E DM2+DAC+ (N=65).......

TABELA 18 FREQÜÊNCIAS ABSOLUTAS E RELATIVAS DOS DIFERENTES

HAPLÓTIPOS DO GENE DA APO A-V (-1131T>C/S19W) NOS

GRUPOS DM2−DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E DM2+DAC+

(N=65).................................................................................................

TABELA 19 DISTRIBUIÇÃO DAS FREQÜÊNCIAS (%) DOS GENÓTIPOS

TT/WW E DEMAIS GENÓTIPOS -1131T>C/S19W DO GENE DA

APO A-V NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75)

E DM2+DAC+ (N=65).........................................................................

TABELA 20 ANÁLISE DE CORRELAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS

-1131T>C E S19W E VARIÁVEIS ATROPOMÉTRICAS E

BIOQUÍMICAS COM PROBABILIDADE ≤ 0,10..................................

TABELA 21 FREQÜÊNCIA DO POLIMORFISMO SS E SW EM RELAÇÃO À

CONCENTRAÇÃO DA MEDIANA DO ÁCIDO ÚRICO NOS

GRUPOS DM2-DAC- (N=77), DM2-DAC+ (N=140) E DM2+DAC+

(N=78).................................................................................................

TABELA 22 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS DOS POLIMORFISMOS

-1131T>C E S19W EM RELAÇÃO ÀS CONCENTRAÇÕES DE

TRIGLICÉRIDES NOS GRUPOS DM2-DAC- (N=66), DM2-DAC+

(N=75) E DM2+DAC+ (N=65).............................................................

TABELA 23 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO

POLIMORFISMO -1131T>C DO GENE DA APO A-V NAS

DIVERSAS POPULAÇÕES ESTUDADAS E COMPARADAS COM

O PRESENTE ESTUDO.....................................................................

TABELA 24 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO

POLIMORFISMO S19W DO GENE DA APO A-V NAS DIVERSAS

POPULAÇÕES ESTUDADAS E COMPARADAS COM O

PRESENTE ESTUDO.........................................................................

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DOS GENES DAS

APOLIPOPROTEÍNAS HUMANAS.................................................. 9

FIGURA 2 ESTRUTURA GENÔMICA E LOCALIZAÇÃO DOS

POLIMORFISMOS DO GENE APOA5............................................. 12

FIGURA 3 MODELO DE AÇÃO DA APOLIPOPROTEÍNA A-V......................... 17

FIGURA 4 PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO DNA A PARTIR DE SANGUE

TOTAL.............................................................................................. 21

FIGURA 5 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO POLIMORFISMO

-1131T>C DA APOLIPOPROTEÍNA A-V AMPLIFICADO E SUA

LOCALIZAÇÃO................................................................................ 27

FIGURA 6 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO POLIMORFISMO S19W

DA APOLIPOPROTEÍNA A-V AMPLIFICADO E SUA

LOCALIZAÇÃO................................................................................. 28

FIGURA 7 PERFIL ELETROFORÉTICO DA PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO

POLIMORFISMO -1131T>C DO GENE DA APO A-V...................... 33

FIGURA 8 PERFIL ELETROFORÉTICO DA PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO

POLIMORFISMO S19W DO GENE DA APO A-V........................... 34

FIGURA 9 PERFIL ELETROFORÉTICO DA PCR-RFLP DO

POLIMORFISMO -1131T>C DA APOLIPOPROTEÍNA A-V............. 35

FIGURA 10 PERFIL ELETROFORÉTICO TÍPICO DA PCR-RFLP DO

POLIMORFISMO S19W DA APOLIPOPROTEÍNA A-V................... 35

RESUMO

A apolipoproteína A-V (apo A-V) está associada com a regulação das concentrações

plasmáticas de triglicérides (TG). Polimorfismos da apo A-V têm sido associados

com a hipertrigliceridemia, um fator de risco independente para a Doença Arterial

Coronariana (DAC), e também freqüente no Diabete Melito tipo 2 (DM2). Foram

analisados os polimorfismos -1131T>C e S19W em 206 indivíduos submetidos à

cineangiocoronariografia. A amostra foi classificada em três grupos designados:

controle, (DM2-DAC-, N=66); DM2-DAC+ (presença de DAC e ausência de DM2,

N=75) e DM2+DAC+ (presença de DAC e DM2, N=65). A DAC foi definida como a

presença de estenose > 50% em qualquer artéria coronária. O diagnóstico do DM2

foi realizado segundo os critérios da Associação Americana de Diabetes. A amostra

apresentou idade média de 65,5 ± 10,4 anos, com prevalência de euro-brasileiros

(92,8%). Foram analisadas as variáveis idade, sexo, tabagismo, pressão arterial,

história familiar para DAC, IMC, bem como as concentrações séricas de glicose,

HbA

, apo A-I, apo B, perfil lipídico e a relação log(TG/HDL-C). Apenas o IMC e o

log(TG/HDL-C) foram significativamente diferentes (P<0,05) entre os três grupos. Os

polimorfismos em estudo foram caracterizados através de PCR-RFLP utilizando

iniciadores que induzem a sítios de restrição para as enzimas Mse I (-1131T>C) e

Taq I (S19W). A identificação dos fragmentos de restrição foi realizada por

eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% e os fragmentos de DNA visualizados

com brometo de etídeo em luz UV. As freqüências para os genótipos -1131T>C (TT,

TC e CC) e S19W (SS e SW) foram,respectivamente, para os grupos controle 0,848;

0,136; 0,015 e 0,818; 0,182; DM2-DAC+ 0,853; 0,120; 0,027 e 0,947; 0,053 e

DM2+DAC+ 0,831; 0,138; 0,031 e 0,877; 0,123. A freqüência do genótipo SW foi

significativamente menor no grupo DM2-DAC+ quando comparado aos grupos

controle e DM2+DAC+. O polimorfismo -1131T>C não mostrou diferença entre os

grupos. Para o polimorfismo -1131T>C a freqüência genotípica observada foi similar

às populações inglesa, canadense e tunísica e para o genótipo TC + CC foi

significativamente menor que o descrito para a população oriental. Para o

polimorfismo S19W a freqüência genotípica observada foi similar às populações

inglesa, tcheca e canadense e para o genótipo SW + WW foi significativamente

maior que o descrito para as populações chinesa, norte-irlandesa e hispânica. O

grupo DM2-DAC+ apresentou freqüências significativamente menores do haplótipo

TW (-1131T>C/S19W) e do genótipo TT/SW em relação ao grupo controle. As

concentrações séricas de ácido úrico foram significativamente correlacionadas com

o polimorfismo S19W (P=0,010), sendo que a freqüência do genótipo SW foi maior

no grupo DM2+DAC+ com a concentração de urato ≥ 5,6 mg/dL, tendo as mulheres

como responsáveis pela alteração. Não houve diferença significativa entre as

concentrações de TG e os polimorfismos em estudo.

Palavras-chave: Doença Arterial Coronariana, DAC, aterosclerose, Diabete melito

tipo 2, apolipoproteína A-V, apo A-V, APO A5, polimorfismo, SNP,

RFLP, -1131T>C, SNP3, S19W.

ABSTRACT

Apolipoprotein A-V (apo A-V) is associated with plasmatic triglyceride (TG) level

regulation. Apo A-V polymorphisms have been associated with hypertriglyceridaemia,

an independent risk factor for Coronary Artery Disease (CAD), and also frequently in

type 2 Diabetes Mellitus (DM2). The polymorphisms -1131T>C and S19W were

analyzed in 206 individuals submitted to coronary angiography. The sample was

classified into three groups called control (DM2-CAD-, N=66); DM2-CAD+ (presence

of CAD and absence of DM2, N=75) and DM2+CAD+ (presence of CAD and DM2,

N=65). CAD was defined as the presence of stenosis > 50% in any coronary artery.

DM2 diagnosis was realized in agreement with American Diabetes Association

criteria. The sample mean age was 65,5 ± 10,4 years, predominating Euro-Brazilians

(92,8%). There were analyzed the variables age, sex, smoking, blood pressure,

familial history for CAD, BMI, as well as serum levels of glucose, HbA

, apo A-I, apo

B, lipid profile and the log(TG/HDL-C) ratio. Only the BMI an the log(TG/HDL-C) ratio

were significantly different (P<0,05) between the three groups. The polymorphisms in

study were characterized after PCR-RFLP using primers that induce restriction sites

to Mse I (-1131T>C) and Taq I (S19W) enzymes. Restriction fragments identification

was realized by 10% acrylamide electrophoresis and the DNA fragments visualized

with ethidium bromide in UV light. The frequencies to the genotypes -1131T>C (TT,

TC and CC) and S19W (SS and SW) were, respectively, to control group 0,848;

0,136; 0,015 and 0,818; 0,182; DM2-CAD+ 0,853; 0,120; 0,027 and 0,947; 0,053 and

DM2+CAD+ 0,831; 0,138; 0,031 and 0,877; 0,123. The SW genotype frequency was

significantly lower in DM2-CAD+ group when compared with control and DM2+CAD+

groups. The -1131T>C polymorphism didn’t show difference between the groups.

The observed genotype frequency to the polymorphism -1131T>C was similar to the

English, Canadian and Tunisian populations and to the genotype TC + CC it was

significantly lower than the described to the oriental population. The observed

genotype frequency to the polymorphism S19W was similar to the English, Czech

and Canadian populations and to the genotype SW + WW it was significantly higher

than the described to the Chinese, Northern Irish and Hispanic populations. Group

DM2-CAD+ had significantly lower frequencies to haplotype TW (-1131T>C/S19W)

and to genotype TT/SW compared to control group. The uric acid serum levels were

significantly correlated with the polymorphism S19W (P=0,010), while the genotype

SW frequency was higher in DM2+CAD+ group with the urate level ≥ 5,6 mg/dL,

being women as responsible for the alteration. There weren’t significantly differences

between TG levels and the polymorphisms in study.

Key-words: Coronary Artery Disease, CAD, atherosclerosis, type 2 Diabetes mellitus,

apolipoprotein A-V apo A-V, APO A5, polymorphism, SNP, RFLP,

-1131T>C, SNP3, S19W.

1 INTRODUÇÃO

A Doença Arterial Coronariana (DAC) é umas das causas de morte mais

comuns no mundo. As concentrações séricas de colesterol total e de colesterol de

baixa densidade (LDL-colesterol) estão significativamente associadas ao risco para

DAC, entretanto, evidências apontam as concentrações de triglicérides como um

fator de risco independente para o seu desenvolvimento (GINSBERG e TUCK,

2001). Devido à complexidade da hipertrigliceridemia, há várias origens possíveis

para a desordem, incluindo causas secundárias como alcoolismo, diabete melito e

obesidade. No entanto, fatores genéticos predisponentes têm papel importante no

metabolismo e regulação dos triglicérides e, assim, genes candidatos têm sido

investigados.

Um gene fortemente candidato para a hipertrigliceridemia severa é o

recentemente descoberto gene da apolipoproteína A-V humana (APO A5), baseado

na sua modulação das concentrações séricas de triglicérides. Em camundongos, a

superexpressão do gene apoa5 promoveu diminuição das concentrações de

triglicérides, enquanto que camundongos nocauteados tiveram aumento de quatro

vezes nas concentrações de triglicérides (PENNACCHIO et al., 2001). Em humanos,

estudos independentes demonstraram que haplótipos variantes em diferentes

polimorfismos do APO A5 são determinantes das concentrações séricas de

triglicérides em várias populações (PENNACCHIO et al., 2002; TALMUD et al., 2002;

OLIVIER et al., 2004).

O diabete melito tipo 2 (DM2) está associado como um fator de alto risco para

a Doença Arterial Coronariana. O fato de que muitos indivíduos com DAC possuem

diabete melito do tipo 2 torna importante a identificação de genes independentes que

conferem susceptibilidade para DAC nestes pacientes.

Estudos epidemiológicos recentes demonstraram que a hipertrigliceridemia é

um dos principais fatores de risco independentes para DAC (FRUCHART e DURIEZ,

2002) O entendimento dos fatores que controlam as concentrações plasmáticas de

triglicérides e quais genes refletem primariamente nas concentrações de

lipoproteínas circulantes ricas em triglicérides é de principal importância e pode

fornecer novas frentes de intervenção terapêutica na dislipidemia aterogênica

(TALMUD et al., 2002; PRIEUR et al.,2003).

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

• Associar os polimorfismos -1131T>C e S19W do gene da apolipoproteína A-V

em uma população brasileira submetida à angiografia na presença de doença

arterial coronariana e diabete melito tipo 2.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o efeito das variáveis antropométricas e bioquímicas em indivíduos

com doença arterial coronariana na presença ou ausência de diabete melito

tipo 2 comparando com um grupo controle;

• Determinar as freqüências alélicas, haplotípicas e genotípicas dos

polimorfismos -1131T>C e S19W do gene da apolipoproteína A-V, através do

procedimento de PCR-RFLP, correlacionando-as com a doença arterial

coronariana, na presença ou ausência de diabete melito tipo 2;

• Associar as freqüências genotípicas com as concentrações de triglicérides;

• Verificar associação das freqüências haplotípicas com doença arterial

coronariana e diabete melito tipo 2;

• Avaliar a capacidade discriminatória dos genótipos em estudo em relação à

doença arterial coronariana e ao diabete melito tipo 2.

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA E DIABETE MELITO

As doenças cardiovasculares são a primeira causa de morte por doença no

Brasil (Ministério da Saúde – Brasil, 2005) e em vários países do mundo (WHO –

Organização Mundial da Saúde, 2004). Também são a principal causa de morbidade

e mortalidade em indivíduos com diabete melito tipo 2 (DM2) (TEMELKOVA-

KURKTSCHIEV e HANEFELD, 2004).

Dentre as doenças cardiovasculares, a Doença Arterial Coronariana (DAC)

destaca-se como a maior causadora de incapacidade e morte. É uma doença da

idade adulta e de etiologia multifatorial (VOGEL e MOTULSKY, 1997). No Anexo I

encontram-se os valores de referência para o perfil lipídico para adultos com idade

superior a 20 anos.

A associação positiva entre triglicérides (TG) plasmáticos aumentados e DAC

foi confirmada por meta-análise realizada por HOKANSON E AUSTIN (1996),

indicando as concentrações de triglicérides plasmáticos como fator de risco

independente para DAC e não meramente conseqüência do efeito das baixas

concentrações de HDL-C.

O maior risco para DAC pelos níveis aumentados de TG plasmáticos resulta

da superprodução de lipoproteínas ricas em TG e de lipoproteínas parcialmente

hidrolisadas, que não podem ser removidas eficientemente da circulação e, assim,

acumulam-se no plasma. Triglicérides dessas partículas são inapropriadamente

transferidas para as lipoproteínas de baixa densidade (LDL), que se tornam

depletadas de colesterol e ricas em triglicérides. Subseqüente hidrólise desses TG

pela lipase hepática converte essas partículas de LDL em partículas menores e

densas (LDL pequena e densa). Partículas de LDL pequenas e densas são

propensas à oxidação porque não são mais clareadas pelo receptor de LDL (LDL-R),

permanecendo na circulação. Estas partículas são então clareadas pelo receptor

scavenger nos macrófagos, formando-se a célula espumosa e, conseqüentemente, a

aterogênese (CHAPMAN et al., 1998).

A ocorrência de DAC varia amplamente no mundo e, geralmente, a maior

freqüência é encontrada em países ocidentais ou com estilo de vida ocidental.

Estudos epidemiológicos prospectivos têm demonstrado que a incidência de DAC

em indivíduos com diabete melito (DM) é cerca de duas a três vezes maior do que a

observada na população em geral (ROSEGREN et al., 1989; STAMLER et al., 1993).

A prevalência de DM entre portadores de DAC aumentou significantemente nos

últimos 10 anos (TAKAISHI et al., 2004). O aumento do risco de eventos

cardiovasculares em indivíduos com DM2 pode ser relacionado, ao menos em parte,

com anormalidades no metabolismo de lípides e lipoproteínas (BERNARD et al.,

2004).

A complexidade da DAC surge da diversidade de fenótipos clínicos e das

múltiplas vias biológicas que contribuem para a formação da placa aterosclerótica,

incluindo o metabolismo lipídico, inflamação, função endotelial, estresse oxidativo e

trombose. Em adição aos fatores ambientais, variações interindividuais na

susceptibilidade à DAC podem ocorrer da variabilidade nos genes que codificam

proteínas que participam nessas e em outras vias biológicas (CHANNON e

WATKINS, 2004). Os principais fatores de risco para DAC estão listados no Anexo II.

A aterosclerose coronariana resulta de respostas inflamatórias e

fibroproliferativas exacerbadas a vários tipos de injúria ao endotélio e músculo liso

da artéria, respostas nas quais participam um grande número de fatores de

crescimento, citocinas e moléculas vasoreguladoras (SHIMOKATA et al., 2004).

Pacientes com DM têm risco aumentado de desenvolver complicações específicas,

dentre elas, a aterosclerose (American Diabetes Association, 2005), base fisiológica

da Doença Arterial Coronariana.

O DM é uma síndrome de etiologia múltipla decorrente da falta de insulina

e/ou da incapacidade da insulina de exercer adequadamente seus efeitos.

Caracteriza-se por hiperglicemia crônica com distúrbios do metabolismo dos

carboidratos, lípides e proteínas (American Diabetes Association, 2005). O

diagnóstico de DM é realizado conforme o Anexo III.

O DM2 está presente em mais de 90-95% dos indivíduos com diabetes e

anteriormente era descrito como diabetes não-insulino dependente ou diabetes da

maturidade. A maioria dos pacientes com este tipo de diabetes apresenta

obesidade, a qual é relacionada à resistência à insulina. O risco de desenvolver DM2

aumenta com a idade, obesidade e falta de atividade física. O DM2 está associado

com predisposição genética complexa (American Diabetes Association, 2005). A

susceptibilidade para DAC em indivíduos com DM não pode ser inteiramente

explicada por fatores de risco convencionais; existem fatores genéticos influenciando

no desenvolvimento de complicações vasculares nestes indivíduos (LEVY, 2003).

O DM2 tem alta prevalência na população brasileira (7,6%) e é um importante

fator de risco independente de DAC (Ministério da Saúde, 2005). Na mulher, é um

fator de risco mais expressivo do que no homem, elevando a mortalidade por DAC

em 3 a 7 vezes. No indivíduo com DM, é particularmente importante o controle

associado dos outros fatores de risco – como sedentarismo, obesidade, tabagismo;

para diminuição mais eficaz do risco de DAC (III Diretrizes Brasileiras em

Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose, 2001).

O indivíduo portador de DM2 apresenta em geral um conjunto de

anormalidades lipídicas caracterizado por concentrações aumentadas de TG,

redução do HDL-C e alteração de LDL-C (KRAUSS, 2004), situação que tem sido

referida como a Tríade Lipídica da Síndrome Metabólica.

A dislipidemia é um dos principais fatores de risco para doença cardiovascular

em pacientes diabéticos. As alterações lipídicas mais freqüentes na população

diabética são hipertrigliceridemia, HDL-C baixo e alterações qualitativas nas

lipoproteínas, tais como a formação de partículas de LDL pequenas e densas. A LDL

pequena e densa é mais freqüente na circulação quanto mais elevadas forem as

concentrações de triglicérides, sendo mais aterogênica do que as demais partículas

lipídicas que são maiores e menos densas (American Diabetes Association, 2005).

A doença arterial coronariana continua a ser uma das principais causas de

morbidade e mortalidade em todo o mundo. Vários estudos epidemiológicos

estabeleceram que, em adição aos níveis plasmáticos elevados do LDL-C e

reduzidos do HDL-C, as concentrações plasmáticas de TG contribuem como fator de

risco independente para a DAC. Adicionalmente, a hipertrigliceridemia está

freqüentemente associada a síndromes metabólicas que caracterizam o DM e a

obesidade. Assim, a identificação de fatores e/ou genes que afetam o metabolismo

dos TG é de significância clínica para a correção da hipertrigliceridemia e DAC

associada (VU-DAC et al., 2003).

Vários estudos prospectivos demonstraram associação com hiperaciduremia

e incidência de DAC, doença cardiovascular e morte. Também se sugeriu que as

concentrações de ácido úrico estão mais fortemente associadas com eventos

adversos em mulheres do que em homens (BRAND et al., 1985; FREEDMAN et al.,

1995; LEHTO et al., 1998). O ácido úrico também está associado com DM e

intolerância à glicose, fatores de risco que conferem maior risco relativo para doença

cardiovascular em mulheres (WILSON et al., 1991; BARRET-CONNOR et al., 1991;

SOWERS, 1998), assim como a síndrome metabólica, resistência à insulina,

obesidade, hipertensão e dislipidemia (REAVEN, 1994; YOO et al., 2005).

3.2 LIPOPROTEÍNAS E APOLIPOPROTEÍNAS

Os lipídios são substâncias orgânicas pouco solúveis em água e solúveis em

solventes orgânicos. Os principais lipídios no plasma humano são o colesterol livre

ou esterificado, os ácidos graxos, os TG (também chamados de triacilgliceróis) e os

fosfolípides (BURTIS et al., 1999).

Os ácidos graxos podem ser saturados, mono ou poliinsaturados. Nos

animais, os resíduos de ácidos graxos predominantes são os que têm cadeia com 16

e com 18 átomos de carbono - o palmítico e o esteárico, que são saturados, e o

oléico e o linoléico, que são insaturados. Os TG são a forma de armazenamento

energético mais importante no organismo, constituindo depósitos no tecido adiposo

e muscular. Os fosfolípides têm, entre outras, a função primordial de formar a

bicamada lipídica, que é a estrutura básica das membranas celulares. O colesterol é

o precursor dos hormônios esteróides, dos ácidos biliares, da vitamina D, além de ter

importantes funções nas membranas celulares, influenciando sua fluidez e no estado

de ativação de enzimas ligadas a membranas (BURTIS et al., 1999).

As lipoproteínas são responsáveis pelo transporte dos lipídios no plasma e

são compostas por lipídios e proteínas, as chamadas apolipoproteínas (“apo”). As

apolipoproteínas têm diversas funções no metabolismo das lipoproteínas como

montagem da partícula (apo B-100 e B-48), meio ligante a receptores de membrana

que as captam para o interior da célula (apo B-100 e E) ou co-fatores enzimáticos

(apo C-II, apo C-III e apo AI-) (BURTIS et al., 1999).

Existem quatro grandes classes de lipoproteínas. As maiores e menos

densas, ricas em TG, os quilomícrons, de origem intestinal, e as lipoproteínas de

densidade muito baixa (VLDL), de origem hepática. As lipoproteínas de baixa

densidade (LDL) e as lipoproteínas de alta densidade (HDL) são ricas em colesterol.

Existe ainda uma quinta classe, as lipoproteínas de densidade intermediária (IDL}.

Uma outra lipoproteína de interesse clínico é a lipoproteína (a) [Lp(a)] (BURTIS et

al., 1999).

Os quilomícrons são sintetizados nas células da mucosa intestinal a partir das

gorduras da dieta, posterior à absorção na forma de micelas, onde os TG são

resintetizados, e, junto com o colesterol da dieta e fosfolípides são acrescidos de

apo B-48, proteína que é sintetizada nestas células. Uma vez no sangue, os

quilomícrons adquirem apo E e apo C-II e têm seu tamanho progressivamente

reduzido pela ação da lipoproteína lípase (LPL), que é ligada ao endotélio capilar e

catalisa a remoção de ácidos graxos livres destas partículas. A LPL é ativada pela

apo C-II no quilomícron, hidrolisando a maioria das partículas de triglicérides em

ácidos graxos livres, que se ligam à albumina e são finalmente depositados no tecido

adiposo. As partículas de quilomícrons remanescentes, depletadas de TG, são

captadas pelo hepatócito através de um processo mediado por receptor, sendo a

apo E do quilomícron o ligante para o receptor hepático de LDL. No hepatócito, o

quilomícron remanescente libera seu conteúdo, isto é, TG, ésteres de colesterol,

fosfolipídeos e apolipoproteínas. O hepatócito remonta esses produtos derivados do

quilomícron remanescente, juntamente com TG endógeno e ésteres de colesterol,

em partículas de VLDL, e as secreta para a circulação. Como os quilomícrons, as

partículas de VLDL também são ricas em TG e contêm apo C-II e apo E. Entretanto,

possuem menor quantidade de TG, são menores e apresentam a apo B-100 ao

invés da apo B-48. A apo B-100 é um ligante fisiológico para o receptor de LDL. A

LPL, novamente ativada pela apo C-II da partícula de VLDL, reduz o TG da VLDL,

deixando a partícula progressivamente menor, mais densa e rica em colesterol até a

formação de IDL. A hidrólise de TG da partícula de IDL em ácidos graxos livres é

mediada por outra lípase, a lipase hepática, e a LDL é a partícula final desta via.

Cerca de um terço da VLDL é removida pelo receptor hepático da LDL, enquanto

que dois terços passam pela via já descrita, terminando como LDL. A transição de

VLDL para IDL é acompanhada pela transferência de apo C-II, para a HDL, e

também pela sua remoção, da HDL, durante a transição da apo E da IDL para a

LDL. Assim, a LDL, cuja meia-vida na circulação é de vários dias, contém apenas

apo B-100 e somente uma cópia por partícula (BURTIS et al., 1999).

O transporte direto dos lípides para as células periféricas é a via

predominante para a entrega de ácidos graxos livres, o combustível metabólico

primário do organismo. É a única via para a entrega do colesterol, que é essencial

para a síntese e a manutenção das membranas celulares. O balanço metabólico do

colesterol é mediado pelo seu transporte reverso pelas partículas de HDL. A

lipoproteína HDL é sintetizada nas células da mucosa intestinal e nos hepatócitos e

secretada como partícula de HDL nascente, contendo apenas uma pequena

quantidade de fosfolipídeos e apo A-I, denominada HDL-pré-β. Esta absorve

avidamente o colesterol livre das células periféricas por via de difusão aquosa da

membrana celular para a partícula. Esse efluxo de colesterol é facilitado pela ligação

da partícula HDL nascente aos receptores de superfície celular, receptor scavenger

B1 (SR-B1). Sendo o colesterol livre anfipático, ele é absorvido na superfície da HDL

a partir de uma membrana celular doadora. A lecitina-colesterol aciltransferase

(LCAT), ativada pela apo A-I catalisa a esterificação do colesterol, causando a

entrada da molécula lipofílica de éster de colesterol no centro da partícula de HDL,

liberando, assim, espaço na sua superfície para posterior absorção de colesterol. A

ação coordenada de apo A-I, HDL e LCAT promove o acúmulo de ésteres de

colesterol na partícula de HDL e contribui na manutenção unidirecional do transporte

reverso do colesterol. Com a continuidade deste processo, a HDL gradualmente

torna-se madura e adquire a sua forma esférica (α-HDL). Ao longo da absorção de

colesterol, a HDL acumula apo C-II e apo E provenientes das partículas de VLDL e

IDL. Uma das funções da HDL é servir de reservatório de apolipoproteínas,

especialmente apo C-II, que é essencial para a ativação da LPL (BURTIS et al.,

1999).

A remoção de lípides da partícula madura de HDL ocorre por duas vias, direta

e indireta. A via direta envolve dois caminhos, um é a remoção seletiva, mediada por

SR-B1 (TRIGATTI et al., 2000) e o outro uma remoção através de “holopartícula”,

mediada por receptores de apo E (FIDGE, 1999). A via indireta envolve a

transferência de ésteres de colesterol da HDL para lipoproteínas contendo apo B

(VLDL, IDL e LDL) mediada pela proteína de transferência de éster de colesterol

(CETP) (TALL et al., 2000). No fígado, os hepatócitos expressam receptores LDL na

sua superfície celular que reconhecem a apo B e a apo E como ligantes fisiológicos.

Assim, o receptor hepático de LDL media a retirada de remanescentes de

quilomícrons, VLDL, IDL e LDL (BURTIS et al., 1999).

As apolipoproteínas estão envolvidas no metabolismo das lipoproteínas

auxiliando na solubilidade dos lipídios no plasma, ativando as enzimas e permitindo

a captação pelos tecidos. Defeitos na estrutura de uma apolipoproteína ou na sua

síntese podem afetar o metabolismo dos lipídios resultando em progressão para a

DAC (GROENENDIJIK et al., 2001).

Embora existam vários fatores que contribuam para as concentrações

plasmáticas de lipídios, as apolipoproteínas representam o principal componente na

dinâmica do metabolismo lipídico. Até o presente momento foram identificadas as

apolipoproteínas, classificadas de A a M (SEDA e SEDOVÁ, 2003). A Figura 1

mostra as duas principais regiões (clusters) de genes das apolipoproteínas nos

cromossomos humanos 11 e 19.

FIGURA 1 – LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DOS GENES DAS

APOLIPOPROTEÍNAS HUMANAS

FONTE: SEDA e SEDOVÁ, 2003

O cluster dos genes das apolipoproteínas APOA1/C3/A4 na região 23 do

braço longo do cromossomo 11 (11q23) é uma região conhecida por influenciar os

parâmetros lipídicos em humanos e mutações neste intervalo têm sido associadas

como contribuintes na hipertrigliceridemia severa, evidenciada há mais de 15 anos

(GROENENDIJIK et al., 2001).

A apo A-I é uma proteína sintetizada principalmente no fígado e em menor

extensão no intestino delgado (SORCI-THOMAS et al., 1989). É a principal proteína

encontrada nas lipoproteínas de alta densidade (HDL) e é cofator obrigatório da

enzima lecitina-colesterol acil transferase (LCAT) e, assim, participa na regulação do

transporte reverso do colesterol dos tecidos periféricos para o fígado. Camundongos

desprovidos da expressão de apoAI apresentaram níveis de HDL-C

significativamente reduzidos (PLUMP et al., 1997).

A apoliproteína C-II (apo C-II) é co-fator para a lipoproteína lipase (LPL),

responsável pelo catabolismo das lipoproteínas ricas em triglicérides.

A apolipoproteína E, no seu papel de ligante, promove a captação de

quilomícrons e lipoproteínas de densidade intermediária. Camundongos desprovidos

da expressão do gene APOE desenvolveram hipercolesterolemia severa e

aterosclerose espontânea (PLUMP et al., 1992).

A apoliproteína C-III (apo C-III) é sintetizada principalmente no fígado e em

menor proporção no intestino (BRUNS et al., 1984). A apo C-III é um componente

intercambiável das lipoproteínas ricas em TG (TGRL) e das lipoproteínas de alta

densidade (HDL). Seu papel in vivo é pouco entendido. Estudos in vitro

demonstraram que a apo C-III é um inibidor não competitivo da atividade da

lipoproteína lipase, reduzindo a capacidade de hidrolisar as TGRL. Além disso, a apo

C-III está envolvida no processo de ligação de lipoproteínas a receptores específicos

no fígado (CLAVEY et al., 1995). Camundongos sem expressão da apo C3

apresentaram menor concentração de triglicérides plasmáticos quando comparados

aos controles (MAEDA et al., 1994), enquanto que a superexpressão do gene

APOC3 humano resulta em hipertrigliceridemia. Isso se deve a um número

aumentado na circulação de partículas de VLDL, que contêm maior quantidade de

triglicérides e apo C-III e menor quantidade de apo E, reduzindo, assim, a retirada de

lipoproteína mediada pela apo E (AALTO SETALA, 1992)

A apolipoproteína A-IV foi primeiramente descrita em 1977 por SWANEY et al.

como um componente dos quilomícrons e das lipoproteínas de alta densidade (HDL)

no rato. A proteína análoga apo A-IV humana é incorporada em novas TGRL

secretadas no intestino e na HDL (BEISIEGEL e UTERMANN, 1979). A função

metabólica da apo A-IV ainda não foi totalmente estabelecida. Sugeriu-se que a apo

A-IV tem papel na absorção de lípides. A síntese e secreção intestinal de apo A-IV é

aumentada durante a absorção de gorduras (BISGAIER et al., 1985).

3.3 APOLIPOPROTEÍNA A-V

Uma importante descoberta na biologia dos TG foi feita em 2001 quando um

novo membro da família da apolipoproteínas, a apolipoproteína A-V (apo A-V), foi

identificada por técnicas pós-genômicas. Ela foi identificada independentemente por

dois grupos distintos. O primeiro grupo utilizou comparação de seqüências ortólogas

do homem e do camundongo (PENNACCHIO et al., 2001) e o segundo grupo

identificou a apolipoproteína A5 do camundongo após observar a marcada super

regulação do gene APOA5 durante regeneração hepática (VAN DER VLIET et al.,

2001).

O gene da apolipoproteína A-V (Figura 2) foi identificado como o quarto

membro do conjunto de genes (cluster) das apolipoproteínas APOA1/C3/A4 no

cromossomo 11, estando localizado aproximadamente 27 kb distal do APOA4 e 37

kb do APOC3, sendo responsável pela síntese da apolipoproteína A-V

(PENNACCHIO et al, 2001; OLIVIER et al., 2004).

FIGURA 2 - ESTRUTURA GENÔMICA E LOCALIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS

DO GENE APOA5

O gene é transcrito da esquerda para a direita como indicado pela grande seta horizontal. Os exons

são mostrados por caixas, sendo que as regiões codificadoras de proteínas estão pintadas de preto.

As posições e identidades dos SNPs identificados no gene APOA5 são mostrados abaixo do

esquema. FONTE: Adaptado de PENNACCHIO et al., 2002.

A apo A-V humana é uma proteína de 39-kDa com 343 resíduos de

aminoácidos e 27% de identidade à apo A-IV humana (WEINBERG et al., 2003). A

apo A-V está presente no soro humano e circula em concentrações muito menores

que outras lipoproteínas como a apo A-I. A concentração molar da apo A-V é de ~4

nmol/L, enquanto que apo A-I é encontrada no soro humano a ~40 µmol/L e a apo B

a 2 µmol/L. Isso explica porque a apo A-V não foi descoberta no soro, como as

demais apolipoproteínas codificadas no lócus do cromossomo humano 11q23, e sim

a nível molecular em estudos animais através de open reading frames (O’BRIEN et

al., 2005; PENNACCHIO et al., 2001; VAN DER VLIET et al., 2001).

A apo A-V é detectada nas partículas de lipoproteína de muito baixa

densidade (VLDL), de alta densidade (HDL) e quilomícrons, mas não é encontrada

nas lipoproteína de baixa densidade (LDL) (BECKSTEAD et al., 2003; WEINBERG

et al., 2003; O’BRIEN et al., 2005).

O gene da apolipoproteína A-V é preferencialmente expresso no fígado. A

exata função do gene APOA5 ainda não está clara. Estudos demonstrando a

superregulação do APOA5 durante a regeneração hepática após hepatectomia

parcial de ratos sugeriu um papel no controle da secreção de triglicérides (VAN DER

VLIET et al., 2001). Estudos recentes sugeriram que o gene APOA5 pode modular a

síntese hepática intracelular e/ou a secreção de lipoproteínas de muito baixa

densidade (VLDL) (BECKSTEAD et al., 2003; WEINBERG et al., 2003).

Os cinco haplótipos mais comuns do gene APOA5 são definidos por sete

polimorfismos de um único nucleotídeo [1891T>C (SNP1), 1764C>T, V153M,

751G>T (SNP2), S19W, -3A>G e -1131T>C (SNP3)] (OLIVIER et al., 2004). O

haplótipo APOA5*1 é o tipo selvagem, definido pelos alelos comuns nos sete sítios.

O haplótipo APOA5*2 é distinguido do haplótipo comum por quatro substituições de

nucleotídeos (c.1259T>C ou 1891T>C, IVS3 + 476G>A ou 751G>T, -1131T>C e

c.-3A>G designados SNP1, SNP2, SNP3 e Kozak, respectivamente, onde c.

representa a região codificadora da proteína e o sinal negativo representa a região

do promotor). O haplótipo APOA5*3 é distinguido do haplótipo comum pela

substituição de G por C no nucleotídeo c.56 (códon 19 na seqüência de

aminoácidos), ocorrendo a substituição de uma serina por um triptofano, também

conhecido como S19W (PENNACCHIO et al., 2001; PENNACCHIO et al., 2002).

Verificou-se que as concentrações plasmáticas de TG estão fortemente

relacionadas com variações no gene da apolipoproteína A-V. Os camundongos em

que o gene da apolipoproteína A-V humana foi superexpresso tinham os níveis

plasmáticos de triglicérides cerca de um terço inferior em relação aos seus controles,

enquanto que camundongos sem a expressão do gene (nocauteados por indução),

apresentaram concentrações plasmáticas de triglicérides quatro vezes maiores do

que os controles selvagens (PENNACCHIO et al., 2001).

As variantes -1131C e 19W têm sido associadas com concentrações

aumentadas de TG em caucasianos saudáveis (PENNACCHIO et al., 2001;

PENNACCHIO et al., 2002; TALMUD et al., 2002; PENNACCHIO et al., 2003) e em

afro-americanos e hispânicos (PENNACCHIO et al., 2002) e com aumentado risco

relativo no desenvolvimento de dislipidemias (RIBALTA et al., 2002; HORINEK et al.,

2003).

A Tabela 1 resume as freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo

-1131T>C em diferentes estudos.

TABELA 1 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO POLIMORFISMO

-1131T>C DO GENE DA APO A-V NAS DIVERSAS POPULAÇÕES

ESTUDADAS

Genótipos Alelos

População

TT(N) TC(N) CC(N) T(N) C(N)

Descrição Referência

Afro-

americana

0,777

(537)

0,213

(147)

0,010

(7)

0,884

(1382)

0,116

(161)

Mulheres

Afro-

americana

0,772

(376)

0,218

(106)

0,010

(5)

0,881

(858)

0,119

(116)

Homens

Hispânica

0,668

(125)

0,310

(58)

0,021

(4)

0,824

(308)

0,176

(66)

Mulheres

Hispânica

0,741

(103)

0,245

(34)

0,014

(2)

0,863

(240)

0,137

(38)

Homens

Caucasiana

0,866

(311)

0,134

(48)

0,933

(670)

0,067

(48)

Mulheres

Caucasiana

0,872

(286)

0,128

(42)

0,936

(614)

0,064

(42)

Homens

PENNACCHIO et al.,

2002

Inglesa

0,883

(2257)

0,111

(285)

0,006

(14)

0,940

(4799)

0,060

(313)

Homens TALMUD et al., 2002

Japonesa

0,418

(425)

0,477

(485)

0,105

(107)

0,656

(1335)

0,344

(699)

Homens e

Mulheres

NABIKA et al., 2002

0,408

(225)

0,476

(263)

0,116

(64)

0,646

(713)

0,354

(391)

Toda a

amostra

0,241

(7)

0,483

(14)

0,276

(8)

0,483

(28)

0,517

(30)

TG alto

Japonesa

0,417

(218)

0,476

(249)

0,107

(56)

0,655

(685)

0,345

(361)

TG normal

ENDO et al., 2002

0,330

(27)

0,540

(44)

0,130

(11)

0,598

(98)

0,402

(66)

TG alto

Chinesa

0,520

(44)

0,430

(37)

0,050

(4)

0,735

(125)

0,265

(45)

TG normal

BAUM et al., 2003

0,805

(174)

0,172

(53)

0,023

(7)

0,857

(401)

0,143

(67)

DAC+

Húngara

0,894

(277)

0,100

(31)

0,006

(2)

0,944

(585)

0,056

(35)

Controles

SZALAI et al., 2004

Chinesa

0,404

(135)

0,494

(165)

0,102

(34)

0,651

(435)

0,349

(233)

Voluntários LI et al, 2004

Canadense

0,848

(375)

0,138

(61)

0,014

(6)

0,917

(811)

0,083

(73)

Caucasianos LEE et al., 2004

Inglesa

0,818

(242)

0,182

(54)

Homens TALMUD et al., 2004

0,747

(74)

0,211

(21)

0,040

(4)

0,854

(169)

0,146

(29)

DM2-DAC-

0,719

(41)

0,263

(15)

0,018

(1)

0,851

(97)

0,149

(17)

DM2-DAC+

0,718

(56)

0,269

(21)

0,013

(1)

0,853

(133)

0,147

(23)

DM2+DAC-

Tunísica

0,703

(52)

0,230

(17)

0,067

(5)

0,818

(121)

0,182

(27)

DM2+DAC+

CHAABA et al., 2005

0,490

(246)

0,422

(212)

0,088

(44)

0,701

(704)

0,299

(300)

Controles

Chinesa

0,375

(181)

0,468

(226)

0,157

(76)

0,609

(588)

0,391

(378)

DAC+

LIU et al., 2005

N = número de indivíduos.

A Tabela 2 resume as freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo

S19W em diferentes estudos.

TABELA 2 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO POLIMORFISMO

S19W DO GENE DA APO A-V NAS DIVERSAS POPULAÇÕES

ESTUDADAS

Genótipos Alelos

População

SS(N)

SW(N) WW(N)

T(N) C(N)

Descrição Referência

Afro-

americana

0,861

(707)

0,132

(108)

0,007

(6)

0,927

(1522)

0,073

(120)

Mulheres

Afro-

americana

0,865

(494)

0,131

(75)

0,004

(2)

0,931

(1063)

0,069

(79)

Homens

Hispânica

0,743

(185)

0,229

(57)

0,028

(7)

0,878

(427)

0,142

(71)

Mulheres

Hispânica

0,696

(119)

0,292

(50)

0,012

(2)

0,842

(288)

0,158

(54)

Homens

Caucasiana

0,874

(386)

0,122

(54)

0,004

(2)

0,934

(826)

0,066

(58)

Mulheres

Caucasiana

0,892

(362)

0,108

(44)

0,946

(768)

0,054

(44)

Homens

PENNACCHIO et al.,

2002

Inglesa

0,890

(2223)

0,105

(263)

0,004

(11)

0,943

(4709)

0,057

(285)

Homens TALMUD et al., 2002

0,699

(58)

0,265

(22)

0,036

(3)

0,831

(138)

0,169

(28)

TG alto

República

Tcheca

0,859

(2198)

0,138

(352)

0,003

(9)

0,928

(4748)

0,072

(370)

Controles

VRABLÍK et al., 2003

Canadense

0,875

(364)

0,115

(48)

0,010

(4)

0,933

(776)

0,067

(56)

Caucasianos LEE et al., 2004

Inglesa

0,859

(268)

0,141

(44)

- - Homens TALMUD et al., 2004

1,000

(502)

0 0

1,000

(1004)

0 Controles

Chinesa

0,909

(439)

0,089

(43)

0,002

(1)

0,953

(921)

0,047

(45)

DAC+

LIU et al., 2005

0,920

(480)

0,080

(41)

0,961

(1001)

0,039

(41)

Controles

Norte

Irlandesa

0,710

(98)

0,250

(35)

0,040

(5)

0,837

(231)

0,163

(45)

TG alto

WRIGHT et al., 2005

N = número de indivíduos.

A proximidade do gene APOA5 aos genes APOA4/C3/A1 na mesma região

gênica no cromossomo 11q23 levantou a questão se os efeitos de elevação nas

concentrações de TG dos SNPs APOA5 simplesmente refletiriam desequilíbrio de

ligação com variantes funcionais no outro gene responsável pelo aumento dos TG,

APOC3, ou se seriam efeitos funcionais independentes (TALMUD et al., 2002).

Análise de haplótipos da região gênica APOA5/A4/C3 identificou que, enquanto o

polimorfismo S19W mostrou associação com as concentrações plasmáticas de TG,

independente do APOC3, o polimorfismo -1131T>C está em forte desequilíbrio de

ligação com o polimorfismo APOC3 -482C>T. Logo, associações do haplótipo

APOA5*2 podem ser devidas aos efeitos do -482C>T, que interrompe a resposta

normal da insulina à apo C-III (TALMUD et al., 2002; OLIVIER et al., 2004; TALMUD

et al., 2005).

A apoliporoteína A-V representa a primeira apolipoproteína descrita cuja

superexpressão diminui os níveis de triglicérides. Sabendo-se que os fibratos são

comumente utilizados na terapêutica para diminuição dos níveis de triglicérides em

humanos, investigou-se a sua habilidade em modular a expresão do gene APOA5 e

conseqüentemente influenciar os níveis de triglicérides plasmáticos (VU-DAC et al.,

2003).

Fibratos são drogas hipolipemiantes com efeitos pleiotrópicos no metabolismo

lipídico, incluindo a redução dos TG plasmáticos. A ação dos fibratos na diminuição

dos TG é explicada pela diminuição da secreção hepática de lipoproteínas de baixa

densidade (VLDL) e no aumento da remoção dos TG plasmáticos. Estudos

estabeleceram que esse efeito é mediado através da indução da expressão da

lipoproteína lipase (SCHOONJANS et al., 1996) e pela repressão da expressão do

gene APOC3 pelos fibratos (STAELS et al., 1995). Demonstrou-se que uma via

principal pela qual os fibratos regulam a expressão de genes relacionados ao

metabolismo de lipídeos ocorre através da ativação de receptores de proliferação

ativada do peroxissomo α (PPARα) (ISSEMANN e GREEN, 1990).

Receptores de proliferação ativada do peroxissomo (PPARs) são membros da

superfamília de receptores nucleares hormonais de fatores transcripcionais ativados

por ligantes que estão relacionados a receptores hormonais retinóides, esteróides e

tireóides. Os PPARs desempenham um papel importante em muitas funções

celulares, incluindo metabolismo lipídico, proliferação celular, diferenciação,

adipogênese e sinalização inflamatória. Descobriu-se que os PPARs interagem com

um número variado de lipídeos endógenos e drogas para o tratamento de doenças

metabólicas (PPAR Signaling Pathway).

Estudos com hepatócitos primários humanos demonstraram que o APOA5 é

um gene alvo altamente responsivo ao PPAR α e suportam a sua função como

principal mediador para redução dos TG plasmáticos pelos fibratos em humanos

(PRIEUR et al., 2003; VU-DAC et al., 2003).

Desde a sua descoberta, dois mecanismos foram propostos para a ação da

apo A-V humana. A apo A-V poderia inibir a produção hepática de VLDL

(WEINBERG, et al., 2003; BECKSTEAD et al., 2003; OLOFSSON, 2005), ou seria

um ativador intravascular da hidrólise dos TG pela LPL (FRUCHART-NAJIB et al.,

2004; MERKEL et al., 2005; SCHAAP et al., 2004). O atual modelo de ação da apo

A-V está representado na Figura 3.

FIGURA 3 – MODELO DE AÇÃO DA APOLIPOPROTEÍNA A-V

FONTE: MERKEL e HEEREN, 2005

Através da ligação aos quilomícrons ou à VLDL por um sítio e aos

proteoglicanos endoteliais e à LPL pelo outro, a apo A-V estabiliza o sistema

lipolítico endotelial e assim aumenta a hidrólise de TG mediada pela LPL. A apo A-V

pode também estabilizar a LPL dimérica ou, menos provavelmente, modular a forma

das lipoproteínas ricas em TG, tornando-as um melhor substrato para a LPL. A apo

A-V pode ser reutilizada e transferida para outras partículas de lipoproteínas após a

hidrólise, então baixas concentrações plasmáticas de apo A-V são suficientes para

mediar esse efeito (MERKEL e HEEREN, 2005).

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras de sangue de 206 pacientes, classificados nos grupos descritos

abaixo, foram utilizadas para a realização desta pesquisa. O Projeto de Pesquisa

“Variabilidade no Gene da Apolipoproteína A-V e Correlação com os Níveis Séricos

de Triglicérides em Indivíduos com ou sem Diabete Melito e Doença Arterial

Coronariana” foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos

(HC-UFPR) em 29 de março de 2005 pelo Protocolo CEP/HC 1004.043/2005-3.

A seleção dos pacientes e coleta de sangue foi realizada nos serviços de

hemodinâmica do Hospital Cardiológico Costantini (N=179) e Hospital de Clínicas da

UFPR (N=27). Para os pacientes submetidos a cateterismo ou angioplastia a coleta

de sangue total foi realizada no início do procedimento, aproveitando o mesmo vaso

utilizado para a angiografia, sendo coletado em tubos de vácuo (Vacutainer®, BD)

utilizando EDTAK

(5 mL) para as extrações de DNA e gel separador (10 mL) para

as análises bioquímicas.

A amostra foi divida em três grupos de acordo com a presença ou não de

Diabete Melito tipo 2 (DM2), e também de acordo com a presença ou não de Doença

Arterial Coronariana (DAC). Foi considerado DM2+ o paciente com a história clínica

da doença e valor de glicose em jejum ≥ 126 mg/dL e considerado DAC+ o paciente

com estenose > 50% em pelo menos uma das artérias (Diretrizes de Doença

Coronariana Crônica Angina Estável), através de cineangiocoronariografia. Os

grupos foram caracterizados de acordo com os seguintes perfis:

- Grupo 1: pacientes não portadores de doença arterial coronariana comprovada

através de angiografia coronária (“cateterismo branco”) e não portadores de diabete

melito (DM2-DAC-), considerado grupo controle;

- Grupo 2: pacientes não portadores de diabete melito e portadores de doença

arterial coronariana comprovada através de angiografia coronária (DM2-DAC+);

- Grupo 3: pacientes portadores de diabete melito e portadores de doença arterial

coronariana comprovada através de angiografia coronária (DM2+DAC+).

A Tabela 3 sumariza a classificação dos grupos estudados.

TABELA 3 - CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS EM ESTUDO

Grupo

Número de Indivíduos

Características

DM2-DAC- N = 66 (30 homens; 36 mulheres)

Sem diabete melito tipo 2 e sem

Doença Arterial Coronariana

DM2-DAC+ N = 75 (53 homens; 22 mulheres)

Sem diabete melito tipo 2 e com

Doença Arterial Coronariana

DM2+DAC+ N = 65 (38 homens; 27 mulheres)

Com diabete melito tipo 2 e com

Doença Arterial Coronariana

O grupo DM2-DAC- foi composto de 62 euro-brasileiros e 4 afro-brasileiros. O

grupo DM2-DAC+ foi composto de 71 euro-brasileiros, 2 afro-brasileiros e 2

orientais. O grupo DM2+DAC+ foi composto de 58 euro-brasileiros, 5 afro-brasileiros

e 2 orientais. Foram excluídos deste estudo pacientes com patologias não

relacionadas ao diabete melito ou à doença cardiovascular, como hepatopatias e

doenças pulmonares.

4.1 DADOS DOS PACIENTES

4.1.1 Variáveis antropométricas

As variáveis antropométricas dos pacientes foram obtidas de acordo com

ficha de coleta de dados padronizada, cujo modelo encontra-se no Anexo IV.

4.1.2 Variáveis bioquímicas

As variáveis bioquímicas foram quantificadas no soro, obtido por coleta a

vácuo em tubo de 10 mL com gel separador (Vacutainer®, BD). Os princípios

metodológicos e reagentes empregados estão sumarizados na Tabela 4. Os

ensaios, calibração e controle de qualidade foram realizados conforme protocolo

fornecido pelo fabricante do reagente. Os reagentes utilizados são específicos de

cada sistema automatizado. Todas as análises foram realizadas no Laboratório

Frischmann Aisengart de Curitiba-PR.

TABELA 4 - MARCADORES BIOQUÍMICOS

DOSAGEM METODOLOGIA AUTOMAÇÃO/MARCA

Apolipoproteína A Imunoturbidimétrico Hitachi 912 / Roche

Apolipoproteína B Imunoturbidimétrico Hitachi 912 / Roche

Colesterol total Enzimático, colorimétrico Vitros 750 / Johnson & Johnson

Glicose Enzimático, glicose oxidase Vitros 750 / Johnson & Johnson

Ácido úrico Enzimático, colorimétrico Vitros 750 / Johnson & Johnson

HDL-Colesterol Homogêneo, enzimático Hitachi 912 / Roche

Hemoglobina glicada HPLC com troca iônica Variant / BioRad

LDL-Colesterol Homogêneo, enzimático Hitachi 912/ Roche

Triglicérides Enzimático, colorimétrico Vitros 750 / Johnson & Johnson

Os valores de referência para os parâmetros bioquímicos encontram-se no

Anexo V.

4.2 REAGENTES

A enzima Taq DNA polimerase foi adquirida da MGM Assessoria Biológica

S.A., bem como o tampão para Taq DNA polimerase e solução de cloreto de

magnésio 50 mM. Os desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTP) foram adquiridos da

Amersham Biosciences. Os marcadores de massa molecular de 100 pares de base

(100 bp) e de 123 pares de base (123 bp) foram adquiridos da Amersham

Biosciences e Invitrogen, respectivamente. Os oligonucleotídeos iniciadores foram

sintetizados pela Alpha DNA. A agarose e a acrilamida foram adquiridas da

Invitrogen. A água reagente tipo I, apresentando condutividade de 18,2 mΩ-cm, foi

obtida em sistema Milli-Q (Millipore) e esterilizada por autoclavação. Os demais

reagentes foram provenientes de diversas fontes, sendo todos reagentes de grau

analítico.

4.3 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

O DNA genômico foi purificado de sangue total, coletado com sistema a

vácuo na presença de EDTA (Vacutainer®, BD), utilizando o procedimento descrito

por LAHIRI e NURNBERGER (1991), adaptado para tubos do tipo Eppendorf de 1,5

mL, como descrito abaixo. A Figura 4 esquematiza as etapas da extração do DNA.

FIGURA 4 - PROCESSO DE EXTRAÇÃO DO DNA A PARTIR DE SANGUE TOTAL

O sangue total (1 mL) foi centrifugado a 10.000 rpm por 5 minutos a

temperatura ambiente. O plasma foi removido com auxílio de pipeta automática.

Para ocorrer a hemólise, ao sedimento foi adicionado 900 µL de TKM1 contendo o

detergente Nonidet P-40 (Sigma) a 2,5%, homogeneizando por inversão. A mistura

foi centrifugada a 10.000 rpm por 3 minutos, desprezando o sobrenadante. Ao

sedimento foi adicionado 1 mL de TKM1 (sem Triton) e homogeneizado em agitar

por alguns segundos, sendo esse processo repetido até que o sedimento se

tornasse esbranquiçado. O sobrenadante foi novamente descartado. As proteínas

foram precipitadas em meio contendo alta concentração de cloreto de sódio

(concentração final de 3 mol/L) e na presença de 10% de SDS (dodecil sulfato de

sódio). O DNA presente no sobrenadante foi, então, precipitado em 2 volumes de

etanol absoluto e as impurezas removidas com duas lavagens com etanol a 70%. O

DNA seco a temperatura ambiente foi solubilizado em água do tipo Milli-Q estéril e

ajustado para uma concentração de aproximadamente 100 ng/µL e as amostras

foram mantidas em freezer a -20ºC. O tempo aproximado para extração de uma

amostra foi de 60 minutos.

A quantificação do DNA foi realizada por espectrofotometria em 260 nm e a

pureza pela relação da Absorbância 260/Absorbância 280 (A

260/280

). O procedimento

possibilitou a obtenção de amostras com DNA nas concentrações de 50 a 500 ng/µL

e relação A

260/280

entre 1,5 e 1,9.

4.4 AMPLIFICAÇÃO DO DNA E IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA

A reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizada para amplificar o DNA dos

pacientes em estudo foi realizada em termociclador Mastercycler Gradient

(Eppendorf) utilizando os protocolos descritos abaixo para cada polimorfismo em

estudo. A seqüência do gene da apo A-V com a identificação dos produtos da PCR

para os polimorfismos -1131T>C e S19W são mostrados no Anexo VI.

Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados na metodologia da PCR foram

estão descritos abaixo.

4.4.1 Polimorfismo -1131T>C

F 5’ GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT 3’;

R 5’ CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT 3’.

Essa amplificação foi desenhada para forçar uma substituição C>A (T no

iniciador reverso), que introduz um sítio de restrição para Mse I (T↓TAA) no alelo

comum. Esses iniciadores fornecem um produto de PCR de 154 bp, e após a

restrição enzimática, fragmentos de 133 bp e 21 bp para o alelo T e um único

produto não cortado para o alelo C.

TABELA 5 – CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DO

POLIMORFISMO -1131T>C

REAGENTES E DNA CONCENTRAÇÃO FINAL VOLUME

DNA molde

∼ 10 ng/µL

1,0 µL

Tampão Taq (10X) 1 X 1,0 µL

MgCl

(50 mM) 1,5 mmol/L 0,3 µL

dNTP (5mM) 0,2 mmol/L 0,4 µL

Oligonucleotídeos Iniciadores (10 pmol/µL cada) 10 pmol (cada) 1,0 µL

Taq DNA polimerase (5U/ µL) 2 U 0,4 µL

Água Reagente tipo 1 estéril ---- 5,9 µL

Volume final 10 µL

Tampão Taq 10X concentrado: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4); 500 mM KCl

TABELA 6 – PROGRAMA UTILIZADO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS

DO POLIMORFISMO -1131T>C

N° CICLOS ETAPAS TEMPERATURA (°C) TEMPO

1X Desnaturação 96 5 min

Desnaturação 96 30 s

31 X Anelamento 58 30 s

Extensão 72 45 s

1 X Extensão Final 72 10 min

A quantidade e qualidade do produto de PCR obtido foram determinadas

através da eletroforese submarina em gel de agarose a 1,5% (cuba Horizon 58®,

Life Technologies) a 60 V e 30 mA durante 1 hora em tampão TBE 1X (Tris-

hidroximetilaminometano 89 mmol/L; ácido bórico 89 mmol/L e EDTA 1 mmol/L, pH

8,2). O DNA foi corado com solução de brometo de etídeo 0,5 µg/mL e visualizado

em transiluminador sob luz ultravioleta (302 nm). As imagens dos géis foram obtidas

com câmara CCD em sistema Biochemi (UVP).

4.4.2 Polimorfismo S19W

F 5’ GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG 3’;

R 5’ GCCTTTCCGTGCCTGGGTGGT 3’.

Os iniciadores foram desenhados para forçar uma substituição G>A (T no

iniciador reverso), introduzindo um sítio de restrição para a enzima Taq I (T↓CGA)

no alelo raro. Esses iniciadores fornecem um produto de PCR de 157 bp, e após a

restrição enzimática, fragmentos de 134 bp e 23 bp para o alelo T e um único

produto não cortado para o alelo C.

TABELA 7 – CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DO

POLIMORFISMO S19W

REAGENTES E DNA CONCENTRAÇÃO FINAL VOLUME

DNA molde

∼ 10 ng/µL

1,0 µL

Tampão Taq (10X) 1 X 1,0 µL

MgCl

(50 mM) 1,5 mmol/L 0,3 µL

dNTP (5mM) 0,2 mmol/L 0,4 µL

Oligonucleotídeos Iniciadores (10 pmol/µL, cada) 10 pmol (cada) 1,0 µL

Taq DNA polimerase (5U/ µL) 2 U 0,4 µL

Água Reagente tipo 1 estéril ---- 5,9 µL

Volume final 10 µL

Tampão Taq 10X concentrado: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4); 500 mM KCl

TABELA 8 – PROGRAMA UTILIZADO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS

DO POLIMORFISMO S19W

N° CICLOS ETAPAS TEMPERATURA (°C) TEMPO

1X Desnaturação 94 3 min

Desnaturação 94 15 s

30 X Anelamento 70 20 s

Extensão 72 30 s

1 X Extensão Final 72 1 min

A quantidade e qualidade do produto de PCR obtido foram determinadas

através da eletroforese submarina em gel de agarose a 1,5% (cuba Horizon 58, Life

Technologies) a 60 V e 30 mA durante 1 hora em tampão TBE 1X (Tris-

hidroximetilaminometano 89 mmol/L; ácido bórico 89 mmol/L e EDTA 1 mmol/L, pH

8,2). O DNA foi corado com solução de brometo de etídeo 0,5 µg/mL e visualizado

em transiluminador sob luz ultravioleta (302 nm). As imagens dos géis foram obtidas

com câmara CCD em sistema Biochemi (UVP).

4.5 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO

-1131T/C DO GENE DA APO A-V HUMANA

Para determinação do polimorfismo -1131T>C, os produtos de amplificação

foram submetidos a digestão pela enzima Mse I (New England Biolabs) conforme

descrito na Tabela 9.

TABELA 9 – CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO DO

POLIMORFISMO -1131T>C

REAGENTES REAÇÃO CONCENTRAÇÃO FINAL

Enzima MseI (10 U/µL) 0,25 µL 0,125 U

NE Buffer 2 (10X) 2,0 µL 1X

Albumina Bovina (100 µg/mL) 0,2 µL 0,001 µg

Produto de PCR apo A-V 2,0 µL 20 a 50 ng

Água Reagente tipo 1 estéril 15,55 µL ----

Volume final 20 µL ----

Homogeneizar e deixar em Banho-maria a 37°C por 16 horas

NE Buffer 2 [10X]: 50 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl; 10 mM MgCl

; 1mM DTT ; pH 7,9 25°C

4.6 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO

S19W DO GENE DA APO A-V HUMANA

Para determinação do polimorfismo S19W, os produtos de amplificação foram

submetidos a digestão pela enzima Taq I (Q-BIOgene) conforme descrito na Tabela

10.

TABELA 10 – CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO DO

POLIMORFISMO S19W

REAGENTES REAÇÃO CONCENTRAÇÃO FINAL

Enzima Taq I (10 U/µL) 0,17 µL 0,34 U

Buffer Taq I (10X) 0,5 µL 1 X

Albumina Bovina (1 µg/µL)

0,5 µL 0,1 µg

Produto de PCR apo A-V 1,5 µL 15 a 30 ng

Água Reagente tipo 1 estéril 2,33 µL ----

Volume final 5 µL ----

Homogeneizar e deixar em Banho-Maria a 65°C por 3 horas

Buffer Taq I (10X): 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl (pH 8,4, 25ºC); 10mM MgCl

; 1 mM dithiothreitol

4.7 IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO

Ao produto de restrição (5 ou 10 µL) foi adicionado 3 µL de solução de glicerol

30% contendo os corantes azul de bromofenol (0,05%) e xileno cianol (0,05%). A

mistura foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida (29:1) a 10% (cuba

Rubi, Amersham Biosciences) com 150 V e 51 mA. Para o preparo da poliacrilamida

dissolveu-se a acrilamida (29 g) e a bisacrilamida (1 g) em copo de Becker e com

auxílio de agitador magnético. Adicionou-se à mistura aproximadamente 2,5% de

resina Dowex MB3 (Sigma) e deixou-se no agitador magnético por no mínimo 2

horas em baixa velocidade para deionizar a acrilamida. Filtrou-se a mistura em papel

de filtro e completou-se o volume (100 mL) com água reagente. Para o preparo de 1

gel de poliacrilamida 10% (45 mL) adicionou-se 15 mL da acrilamida 29:1, 4,5 mL de

TBE 10X, 25,5 mL de água mili-Q, 300 µL de persulfato de amônio 10% e 50 µL de

TEMED. A eletroforese foi interrompida quando o corante azul de bromofenol atingia

aproximadamente 2/3 do gel. Os fragmentos de DNA foram corados com brometo de

etídeo 0,5 µg/mL e visualizados em transiluminador UV (302 nm). Os

eletroforetogramas foram registrados com o sistema de captação de imagens digital

com câmera CCD, Biochemi (UVP).

Os sítios de clivagem das enzimas Mse I e Taq I para os polimorfismo

-1131T>C e S19W, respectivamente, bem como os possíveis genótipos e os

tamanhos dos fragmentos produzidos estão mostrados nas Figuras 5 e 6.

FIGURA 5 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO POLIMORFISMO -1131T>C

DA APOLIPOPROTEÍNA A-V AMPLIFICADO E SUA LOCALIZAÇÃO

FONTE: Adaptado de OLIVIER et al., 2004.

FIGURA 6 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO POLIMORFISMO S19W DA

APOLIPOPROTEÍNA A-V AMPLIFICADO E SUA LOCALIZAÇÃO

FONTE: Adaptado de OLIVIER et al., 2004.

5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Statistica

para Windows versão 5.0.

Os níveis médios dos marcadores bioquímicos foram comparados entre os

diferentes grupos estudados utilizando a análise da variância (ANOVA) ou teste “t”

para amostras não pareadas. As determinações de TG que não apresentaram

distribuição normal, foram logaritmicamente transformadas para normalização. As

freqüências alélicas foram obtidas pela contagem dos genes.

Para a análise das variáveis categóricas foram utilizados o teste exato de

Fisher (bidirecional) ou o teste do Chi-quadrado, conforme as características da

análise.

As tabelas de contingência foram analisadas utilizando o programa estatístico

RxC (MILLER, 2005).

As freqüências haplotípicas foram obtidas empregando-se o método da

verossimilhança máxima, programa ARLEQUIM – versão 3 (EXCOFFIER e

SCHNEIDER, 2005).

Valores de P<0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

6 RESULTADOS

6.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

A amostra estudada foi composta por 206 indivíduos, sendo 191 euro-

brasileiros (92,8%), 11 afro-brasileiros (5,3%) e 4 orientais (1,9%). As distribuições

dos indivíduos por sexo e fatores de risco para DAC estão descritos na Tabela 11.

TABELA 11 – DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIAS POR SEXO E FATORES DE

RISCO PARA DAC NOS GRUPOS ESTUDADOS

SEXO FATORES DE RISCO PARA DAC

Tabagismo

Hipertensão

Arterial

Histórico Familiar

de DAC

Masculino Feminino

Sim Não Sim Não Sim Não

N = 206

N % N % N % N % N % N % N % N %

DM2-DAC-

30 45,5 36 54,5 26 39,4 40 60,6 24 36,4 42 63,6 27 40,9 39 59,1

DM2-DAC+

53 70,7 22 29,3 48 64 27 36 34 45,3 41 54,7 31 41,3 44 58,7

DM2+DAC+

38 58,5 27 41,5 32 49,2 33 50,8 35 53,9 30 46,1 29 44,6 36 55,4

*χ

(P)

*χ

=9,21: P=0,010 *χ

=8,69; P=0,012

*χ

=2,33; P=0,314 *χ

=0,22; P=0,890

DM2-DAC- X

DM2-DAC+

=9,22; P=0,024 χ

=8,52; P=0,003

=1,17; P=0,280 χ

=0,00; P=0,959

DM2-DAC- X

DM2+DAC+

=2,22; P=0,136 χ

=1,28; P=0,257

=4,04; P=0,044

=0,18; P=0,668

DM2-DAC+ X

DM2+DAC+

=2,28; P=0,131 χ

=3,10; P=0,078 χ

=1,01; P=0,315 χ

=0,15; P=0,695

N = Número de indivíduos

Teste de Chi-quadrado com Grau de Liberdade = 1.

*Teste de Chi-quadrado com Grau de Liberdade = 2.

A Tabela 12 ilustra a distribuição de freqüências da idade entre os grupos

estudados.

TABELA 12 – DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIAS DA IDADE

Freqüências (N)

Faixa etária (anos) Todos DM2-DAC- DM2-DAC+ DM2+DAC+

N % N % N % N %

< 36 – 40 2 0,97 1 1,51 1 1,33 0 0

41 – 45 9 4,37 4 6,06 4 5,33 1 1,54

46 – 50 11 5,34 6 9,09 3 4,00 2 3,08

51 – 55 24 11,65 9 13,64 10 13,33 5 7,69

56 – 60 36 17,48 15 22,72 11 14,66 10 15,38

61 – 65 36 17,48 9 13,66 12 16,00 15 23,08

66 – 70 28 13,59 11 16,66 6 8,00 11 16,92

71 – 75 34 16,50 9 13,64 13 17,33 12 18,46

76 – 80 16 7,77 1 1,51 8 10,67 7 10,77

> 81 10 4,85 1 1,51 7 9,33 2 3,08

Total 206 100 66 100 75 100 65 100

Média 65,5 59,0 63,6 64,8

Desvio Padrão 10,4 9,9 11,5 8,6

Mediana 62,0 58,0 62,0 64,0

Amplitude de Variação

36 - 84 36 - 83 36 - 84 43 - 83

N = Número de indivíduos

Foi realizado o teste “t” para comparação entre as médias de idade. Os

resultados foram: grupo controle vs grupo DM2-DAC+ (“t” = -2,51; P = 0,013); grupo

controle vs grupo DM2+DAC+ (“t” = -3,53; P < 0,001) e grupo DM2-DAC+ vs

DM2+DAC+ (“t” = -0,654; P = 0,514).

As Médias (M) ± Desvio Padrão (DP), a Amplitude de Variação (AV) e valores

de P dos dados antropométricos e bioquímicos dos 3 grupos estudados estão

demonstrados na Tabela 13.

TABELA 13 – VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E BIOQUÍMICAS DOS GRUPOS: DM2−DAC−, DM2−DAC+ E DM2+DAC+,

COM MÉDIA (M) ± DESVIO PADRÃO (DP) E AMPLITUDE DE VARIAÇÃO (AV) DAS VARIÁVEIS

ANALISADAS

Variáveis

Grupo DM2−DAC− (N=66) Grupo DM2−DAC+ (N=75)

Grupo DM2+DAC+ (N=65)

M ± DP AV M ± DP AV

M ± DP AV

***

IMC (kg/m

)

23,9 ± 3,3 16,5 – 33,8 26,1 ± 3,9 17,9 – 41,8

0,006

27,7 ± 4,9 18,9 – 45,8

<0,001 0,046

Pressão arterial sistólica (mmHg)

140,7 ± 20,6 95 – 220 144,3 ± 20,3 110 – 200 0,558 145,2 ± 20,9 100 – 200 0,432 0,966

Pressão arterial diastólica (mmHg)

79,9 ± 9,4 60 – 100 77,9 ± 8,9 60 – 100 0,361 79,9 ± 8,6 59 - 100 0,998 0,398

Hemoglobina glicada (%)

5,3 ± 0,6 2,6 – 6,4 5,4 ± 0,5 3,0 – 6,5 0,868 7,7 ± 1,6 5,1 – 12,4

<0,001 <0,001

Glicose (mg/dL)

91,0 ± 11,1 71 – 116 92,9 ± 11,9 67 – 123 0,956 157,4 ± 67,8 80 – 340

<0,001 <0,001

Colesterol Total (mg/dL)

175,1 ± 35,0 114 – 290 167,9 ± 38,3 74 – 295 0,503 170,8 ± 40,2 94 – 303 0,797 0,893

HDL-C (mg/dL)

47,8 ± 12,5 24 – 78 43,1 ± 10,3 24 – 69

0,028

40,6 ± 9,8 21 – 66

<0,001

0,365

LDL-C (mg/dL)

119,3 ± 29,7 52 – 192 111,0 ± 35,8 29 – 257 0,264 111,7 ± 28,3 46 – 174 0,350 0,991

Triglicérides (mg/dL)

105,8 ± 58,1 31 – 418 130,6 ± 61,8 31 – 362 0,130 164,4 ± 102,7 57 – 588

<0,001 0,023

log Triglicérides

1,97 ± 0,22 1,49 – 2,62 2,07 ± 0,20 1,49 – 2,56

0,015

2,15 ± 0,22 1,75 – 2,77

<0,001

0,054

Apolipoproteína A-I (mg/dL)

120,3 ± 26,9 74 – 178 111,1 ± 24,5 58 – 184 0,083 114,4 ± 25,2 61 – 176 0,386 0,722

Apolipoproteína B (mg/dL)

89,3 ± 23,9 40 – 163 89,0 ± 27,8 19 – 184 0,997 93,1 ± 24,7 45 - 149 0,681 0,620

Ácido úrico (mg/dL)

5,5 ± 1,6 2,4 – 9,7 5,9 ± 1,6 3,3 - 11 0,299 6,0 ± 1,9 2,7 12,6 0,224 0,972

log (TG/HDL-C)

0,32 ± 0,29 0,38 – 1,10 0,45 ± 0,24 0,06 – 1,05

0,012

0,56 ± 0,26 0,06 – 1,22

<0,001 0,037

N= número de indivíduos

= diferença estatística entre Grupo Controle (DM2−DAC−) e Grupo DM2−DAC+

= diferença estatística entre Grupo Controle (DM2−DAC−) e Grupo DM2 +DAC+

***

= diferença estatística entre Grupo DM2−DAC+ e Grupo DM2 +DAC+

Comparações realizadas pelo teste “t” (ANOVA)

6.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE DA APO A-V

As Figuras 7 a 10 mostram resultados típicos para os produtos de PCR e para

os perfis de restrições estudados.

FIGURA 7 – PERFIL ELETROFORÉTICO DA PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO

POLIMORFISMO -1131T>C DO GENE DA APO A-V

Eletroforese em agarose 1,5%, em tampão TBE 1X (60 V, 30

mA). Os produtos de PCR (2 µL, ~40 ng) foram corados com

brometo de etídeo 0,5 µg/mL e visualizados em transiluminador

UV (302 nm). As imagens foram registradas com câmera digital

CCD Biochemi (UVP).

A linha 1 mostra o marcador de massa molecular (123 bp); as

linhas 2 a 5 mostram produto de PCR da amplificação do gene

da apo A-V contendo o polimorfismo -1131T>C. O tamanho

esperado para o produto de PCR está identificado à direita do

gel.

1 2

123 bp

154

123 bp123 bp

246 bp246 bp

369 bpbp

FIGURA 8 – PERFIL ELETROFORÉTICO DA PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO

POLIMORFISMO S19W DO GENE DA APO A-V

Eletroforese em agarose 1,5%, em tampão TBE 1X (60 V,

30 mA). Os produtos de PCR (2 µL, ~30 ng) foram corados

com brometo de etídeo 0,5 µg/mL e visualizados em

transiluminador UV (302 nm). As imagens foram registradas

com câmera digital CCD Biochemi (UVP).

A linha 5 mostra o marcador de massa molecular (100 bp);

as linhas 1 a 3 mostram produto de PCR da amplificação do

gene da apo A-V contendo o polimorfismo S19W; a linha 4

mostra o controle da reação (sem DNA). O tamanho

esperado para o produto de PCR está identificado à

esquerda do gel.

100 bp

200 bp

300 bp

1234 5

157 bp

100 bp100 bp

200 bp200 bp

300 bp300 bp

1234 5

157 bp

FIGURA 9 – PERFIL ELETROFORÉTICO DA PCR-RFLP DO POLIMORFISMO -

1131T>C DA APOLIPOPROTEÍNA A-V

Eletroforese em gel de poliacrilamida (29:1) a 10%, em tampão

TBE 1X (150 V, 51 mA). Os fragmentos de DNA (10 µL; ~20 ng)

do polimorfismo -1131T>C do gene da apo A-V foram corados

com brometo de etídeo 0,5µg/mL e visualizados em

transiluminador UV (302 nm). As imagens foram registradas

com câmera digital CCD Biochemi (UVP).

As linhas 1, 2 e 4 mostram o perfil de restrição para os

genótipos TC, CC e TT, respectivamente. A linha 3 mostra o

marcador de massa molecular (123 bp). Os tamanhos

esperados para os fragmentos de restrição estão identificados à

esquerda do gel.

1234

123 bp

246 bp

369 bp

133 bp

154 bp

1234

123 bp123 bp

246 bp246 bp

369 bp369 bp

133 bp133 bp

154 bp154 bp

FIGURA 10 – PERFIL ELETROFORÉTICO TÍPICO DA PCR-RFLP DO

POLIMORFISMO S19W DA APOLIPOPROTEÍNA A-V

12 3 4

100 bp

200 bp

300 bp

157 bp

134 bp

12 3 4

100 bp100 bp

200 bp200 bp

300 bp300 bp

157 bp157 bp

134 bp134 bp

Eletroforese em gel de poliacrilamida (29:1) a 10%, em tampão

TBE 1X (150 V, 51 mA). Os fragmentos de DNA (5 µL; ~15 ng)

do polimorfismo S19W do gene da apo A-V foram corados com

brometo de etídeo 0,5µg/mL e visualizados em transiluminador

UV (302 nm). As imagens foram registradas com câmera digital

CCD Biochemi (UVP).

A linha 1 mostra o marcador de massa molecular (100 bp); a

linha 2 mostra o produto de PCR sem corte; as linhas 3 e 4

mostram o perfil de restrição para os genótipos SW e SS,

respectivamente. Os tamanhos esperados para os fragmentos

de restrição e o produto de PCR sem corte estão identificados à

direita do gel.

A variabilidade dos polimorfismos -1131T>C e S19W do gene da

apolipoproteína A-V das 206 amostras estudadas está apresentada nas Tabelas 14

a 19, que mostram as freqüências dos genótipos e dos alelos, nos grupos controle,

DM2-DAC+ e DM2+DAC+.

TABELA 14 - FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS POLIMORFISMOS

-1131T>C E S19W DO GENE DA APO A-V NOS GRUPOS DM2−

DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E DM2+DAC+ (N=65) E NA

AMOSTRA (N=206)

Genótipos Alelos H-W

Apo A-V Grupos TT (N) TC (N) CC (N) ** P T (N) C (N) ** P

(1)

; *P

DM2−DAC−

0,849

(56)

0,136

(9)

0,015 (1) -

0,917

(121)

0,083

(11)

=0,761;

P=0,617

DM2−DAC+

0,853

(64)

0,120

(9)

0,027 (2) 1,000

0,913

(137)

0,087

(13)

0,709

=4,39;

P=0,963

DM2+DAC+

0,831

(54)

0,138

(9)

0,031 (2) 0,817

0,900

(117)

0,100

(13)

0,544

=3,46;

P=0,937

-1131T>C

Todos

0,845

(174)

0,131

(27)

0,024 (5) ***0,976

0,910

(375)

0,090

(37)

*** 0,909 -

Apo A-V

Grupos

SS (N) SW (N) WW (N) ** P S W ** P

(1)

; *P

DM2−DAC−

0,818

(54)

0,182

(12)

- (0) -

0,909

(120)

0,091

(12)

=0,659;

P=0,583

DM2−DAC+

0,947

(71)

0,053

(4)

- (0)

0,030

0,973

(146)

0,027

(4)

0,036

=0,056;

P=0,187

DM2+DAC+

0,877

(57)

0,123

(8)

- (0) 0,225

0,938

(122)

0,062

(8)

0,236

=0,279;

P=0,403

S19W

Todos

0,883

(182)

0,117

(24)

- (0)

***0,043

0,942

(388)

0,058

(24)

0,055 -

N = número de indivíduos

H-W: Equilíbrio de Hardy-Weinberg

* Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ

); Grau de Liberdade (GL) = 1

** Valor de probabilidade “P” para o Teste Exato de Fisher (bidirecional), comparação com controle

(DM2−DAC−)

***Valor de probabilidade “P” calculado pelo Teste RxC para os três grupos

As distribuições das freqüências observadas desses genótipos nos grupos

controle (DM2-DAC-), DM2-DAC+ e DM2+DAC+ não mostraram diferenças

estatisticamente significativas quando comparadas com aquelas esperadas pela Lei

de Hardy-Weinberg, o que sugere que a distribuição genotípica em todos os grupos

está de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (P>0,05).

As freqüências genotípicas observadas para homens e mulheres para os

polimorfismos -1131T>C e S19W estão descritas nas Tabelas 23 e 24,

respectivamente.

Em relação ao sexo, houve diferença significativa (P = 0,012) apenas para o

polimorfismo -1131T>C, onde o sexo masculino representa 65,3% dos indivíduos

para o genótipo TT e 5,33 para o genótipo TC + CC.

A Tabela 15 mostra a distribuição nos grupos em estudo e respectivas

freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo S19W para a amostra ampliada

(N=295).

TABELA 15 - FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DA AMOSTRA

AMPLIADA PARA O POLIMORFISMO S19W DO GENE DA APO A-V

NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=77), DM2−DAC+ (N=140) E

DM2+DAC+ (N=78)

Genótipos Alelos H-W

Apo A-V

Grupos SS (N) SW (N) WW (N) * P S W * P

*χ

DM2−DAC−

0,831

(64)

0,169

(13)

- (0) -

0,916

(141)

0,084

(13)

=0,65;

P=0,581

DM2−DAC+

0,921

(129)

0,089

(11)

- (0)

0,042

0,961

(269)

0,039

(11)

0,049

=0,23;

P=0,371

0,971 0,972

S19W

DM2+DAC+

0,833

(65)

0,167

(13)

- (0)

**0,046

0,917

(143)

0,083

(13)

**0,114

=0,64;

P=0,578

* Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ

); Grau de Liberdade (GL) = 1,

comparação com controle (DM2−DAC−)

**Comparação entre os grupos DM2-DAC+ e DM2+DAC+, Teste do Chi-quadrado (χ

); Grau de

Liberdade (GL) = 1

Os grupos DM2-DAC+ e DM2+DAC+ foram reunidos formando um grupo

designado DAC+, cujos dados estão mostrados na Tabela 16. Para a análise

estatística os genótipos TC e CC foram agrupados.

TABELA 16 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS

POLIMORFISMOS -1131T>C E S19W DO GENE DA APO A-V

NOS GRUPOS DAC− (N=66) E DAC+ (N=140)

Genótipos Alelos

Apo A-V Grupos TT (N) TC (N) CC (N) T (N) C (N)

DAC−

0,848 (56) 0,136 (9) 0,015 (1) 0,917 (121) 0,083 (11)

DAC+

0,842 (118) 0,129 (18) 0,029 (4) 0,907 (254) 0,093 (26)

-1131T>C

= 0,01 ; P = 0,917 χ

= 0,10; P = 0,752

Apo A-V Grupos SS (N) SW (N) WW (N) S W

DAC−

0,818 (54) 0,182 (12) - (0) 0,909 (120) 0,091 (12)

DAC+

0,914 (128) 0,086 (12) - (0) 0,957 (268) 0,043 (12)

S19W

= 4,02 ; P = 0,044 χ

= 3,78 ; P = 0,052

N = número de indivíduos. Para análise estatística os genótipos TC e CC foram agrupados.

Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ

); Grau de Liberdade (GL) = 1.

6.3 ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO ENTRE HAPLÓTIPOS E GENÓTIPOS DO GENE

DA APO A-V E DAC NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DM2

As freqüências dos genótipos do polimorfismo -1131T>C/S19W do gene da

apo A-V encontradas nos grupos controle (DM2−DAC−), DM2−DAC+ e DM2+DAC+

estão apresentadas na Tabela 17.

TABELA 17 – DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIA (%) DOS GENÓTIPOS

-1131T>C/S19W DO GENE DA APO A-V NOS GRUPOS DM2−

DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E DM2+DAC+ (N=65)

GENÓTIPOS

DM2−DAC−

N=66

DM2−DAC+

N=75

DM2+DAC+

N=65

-1131T>C S19W N % N % N %

TT SS

45 68,2 60 80 47 72,3

TT SW

11 16,7 4 5,3 7 10,8

TT WW

0 - 0 - 0 -

TC SS

8 12,1 9 12 8 12,3

TC SW

1 1,5 0 - 1 1,5

TC WW

0 - 0 - 0 -

CC SS

1 1,5 2 2,7 2 3,1

CC SW

0 - 0 - 0 -

CC WW

0 - 0 - 0 -

N = número de indivíduos

RxC: P=0,508; SE=0,025

As freqüências haplotípicas dos polimorfismos -1131T>C/S19W do gene da

apo A-V, mostradas na Tabela 18, foram obtidas com base nos genótipos

apresentados na Tabela 17.

TABELA 18 – FREQÜÊNCIAS ABSOLUTAS E RELATIVAS DOS DIFERENTES

HAPLÓTIPOS DO GENE DA APO A-V (-1131T>C/S19W) NOS

GRUPOS DM2−DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E DM2+DAC+

(N=65).

DM2-DAC- DM2-DAC+ DM2+DAC+

DM2-DAC-

DM2-DAC+

DM2-DAC-

DM2+DAC+

DM2-DAC+

DM2+DAC+

Apo A-V

-1131T>C/S19W

N % N % N %

109 82,57 133 88,6 109 83,85 2,14 0,143 0,08 0,783 1,38 0,240

12 9,1 4 2,7 8 6,15 5,41

0,020

0,80 0,371 2,06 0,151

11 8,33 13 8,7 13 10 0,01 0,920 0,15 0,701 0,22 0,640

0 0 0 0 0 0 - - - - - -

Total

132 100 150 100 130 100

**χ

= 5,58; P = 0,232

N = número de alelos

*Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ

); grupos dois a dois; Grau de Liberdade

(GL) = 1

**Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ

); todos os grupos; Grau de Liberdade

(GL) = 4

A Tabela 19 mostra as freqüências do genótipo TT/SW e demais genótipos -

1131T/C/S19W entre os grupos em estudo.

TABELA 19 – DISTRIBUIÇÃO DAS FREQÜÊNCIAS (%) DOS GENÓTIPOS

TT/SW E DEMAIS GENÓTIPOS -1131T>C/S19W DO GENE DA APO

A-V NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=66), DM2−DAC+ (N=75) E

DM2+DAC+ (N=65)

DM2-DAC- DM2-DAC+ DM2+DAC+

DM2-DAC-

DM2-DAC+

DM2-DAC-

DM2+DAC+

DM2-DAC+

DM2+DAC+

Apo A-V

-1131T>C/

S19W

N % N % N % P* P* P*

TT/SW

12 18,2 4 5,3 8 12,3

Demais

Genótipos

54 81,8 71 94,7 57 87,7

0,031

0,467 0,225

TOTAL

66 100 75 100 65 100

**χ

= 5,67; P = 0,058

N = número de alelos

** Valor de probabilidade “P” Teste exato de Fisher (bidirecional)

**Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ

) entre todos os grupos; Grau de

Liberdade (GL) = 2

Realizou-se análise de correlação linear entre os polimorfismos estudados e

as variáveis antropométricas e bioquímicas descritas anteriormente. Os resultados

de correlação apresentando probabilidade ≤ 0,10 estão mostrados na Tabela 20.

TABELA 20 – ANÁLISE DE CORRELAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS

-1131T>C E S19W E VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E

BIOQUÍMICAS COM PROBABILIDADE ≤ 0,10

Genótipos (N) Variáveis *Correlação P

-1131T>C (206) Pressão arterial sistólica -0,1302 0,062

S19W (295) Ácido úrico 0,1421

0,015

*Teste de Correlação de Pearson

A distribuição da freqüência do polimorfismo S19W em relação à

concentração da mediana do Ácido úrico e grupos em estudo está descrita na

Tabela 21.

TABELA 21 – FREQÜÊNCIA DO POLIMORFISMO SS E SW EM RELAÇÃO À

CONCENTRAÇÃO DA MEDIANA DO ÁCIDO ÚRICO NOS GRUPOS

DM2-DAC- (N=77), DM2-DAC+ (N=140) E DM2+DAC+ (N=78)

Genótipos/ Grupos DM2-DAC- (N) DM2-DAC+ (N) DM2+DAC+ (N)

Ácido úrico (mg/dL)

≤ 5,6

> 5,6

≤ 5,6

> 5,6

≤ 5,6

> 5,6

SS (%)

42 (54,5) 22 (28,6) 60 (42,9) 69 (49,3) 37 (47,4) 28 (36,0)

8 (10,4) 5 (6,5) 3 (2,1) 8 (5,7) 3 (3,9) 10 (12,8)

Fisher (P)

0,760 0,345

0,034

Homens

SS (%)

17 (50,0) 11 (32,4) 38 (37,3) 55 (53,9) 19 (40,4) 20 (42,6)

1 (2,9) 5 (14,7) 1 (1,0) 8 (7,8) 3 (6,4) 5 (10,6)

Fisher (P)

0,078 0,147 0,706

Mulheres

SS (%)

25 (58,1) 11 (25,6) 22 (56,4) 14 (35,9) 18 (58,1) 8 (25,8)

7 (16,3) 0 2 (5,1) 1 (2,6) 0 5 (16,1)

Fisher (P)

0,163 1,000

0,008

N = Número de indivíduos

Valor de probabilidade “P” Teste exato de Fisher (bidirecional)

As comparações através do teste “t“ entre as concentrações de Ácido úrico

relacionadas ao polimorfismo S19W mostraram significância apenas no grupo

DM2+DAC+, com concentrações médias de ácido úrico de 5,8 e 7,1 mg/dL para os

genótipos SS e SW, respectivamente (teste “t”=-2,23; P=0,029).

TABELA 22 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS DOS POLIMORFISMOS -1131T>C E

S19W EM RELAÇÃO ÀS CONCENTRAÇÕES DE TRIGLICÉRIDES

NOS GRUPOS DM2-DAC- (N=66), DM2-DAC+ (N=75) E DM2+DAC+

(N=65)

Genótipos DM2-DAC- (N) DM2-DAC+ (N) DM2+DAC+ (N)

Triglicérides (mg/dL)

<150

≥150

<150

≥150

<150

≥150

-1131T>C (%) TT

47 (71,2) 9 (13,6) 46 (61,4) 18 (24,0) 32 (49,2) 22 (33,8)

TC + CC

10 15,2) 0 7 (9,3) 4 (5,3) 5 (7,7) 6 (9,2)

Fisher (bidirecional)

P=0,334 P=0,721 P=0,509

S19W (%) SS

46 (69,7) 8 (12,1) 49 (65,4) 22 (2,3) 33 (50,8) 24 (36,9)

11 (16,7) 1 (1,5) 4 (5,3) 0 4 (6,2) 4 (6,1)

Fisher (bidirecional)

P=1,000 P=0,314 P=0,717

N = Número de indivíduos

Valor de probabilidade “P” Teste exato de Fisher (bidirecional)

7 DISCUSSÃO

A Doença Arterial Coronariana e o diabete melito tipo 2 são patologias que

afetam elevada parcela da população mundial. Genes ou polimorfismos genéticos

como os SNPs (polimorfismos de um único nucleotídeo) têm sido pesquisados na

procura de associações com estas doenças ou suas complicações

O gene da apo A-V, recentemente identificado, tem papel chave na

determinação das concentrações plasmáticas de triglicérides. Devido à

hipertrigliceridemia ser um fator de risco independente para DAC, a determinação de

fatores que afetem sua incidência em diversas populações é de considerável

importância e tem sido alvo de intensa pesquisa.

Neste estudo, os polimorfismos de único nucleotídeo no gene da apo A-V,

-1131T>C da região promotora e o S19W do exon 2, são pesquisados em uma

população essencialmente euro-brasileira (93%), caracterizada quanto à presença

de DAC por cineangiocoronariografia e separada em grupos com a presença ou não

de diabete melito tipo 2. Este estudo também inclui um grupo controle (DM2-DAC-),

caracterizado por indivíduos que não apresentaram alterações significativas no

procedimento angiográfico (estenose < 50%) e sem alterações dos níveis

glicêmicos. Estes pacientes estavam vinculados à clinica cardiológica devido a

alterações no perfil lipídico, hipertensão arterial, histórico familiar para DAC ou

outros fatores associados a risco cardiovascular.

7.1 DADOS ANTROPOMÉTRICOS E BIOQUÍMICOS

A distribuição racial da amostra, preponderando euro-brasileiros (92,8%),

reflete a população atendida pelo Hospital Cardiológico Costantini, fornecedor de

cerca de 87% da amostra presente neste estudo.

A distribuição de freqüências por sexo e fatores de risco da amostra (Tabela

11) mostra uma prevalência (P = 0,024) de mulheres no grupo controle (DM2-DAC-)

em relação ao grupo DM2-DAC+; este, no entanto não difere do grupo DM2+DAC+.

O uso do tabaco é significativamente menor (P = 0,003) no grupo controle quando

comparado ao grupo DM2-DAC+ e não difere do grupo DM2+DAC+. Esta

característica reflete a associação do tabagismo com a DAC, sendo que pacientes

com DM2, devido ao tratamento contínuo são desestimulados ao fumo por este ser

um fator de risco adicional ao diabético. A presença de hipertensão arterial supera

os 36% em todos os grupos e ressalta a importância deste fator de risco na

população em estudo. Os grupos controle e DM2+DAC+ apresentaram diferenças

significativas (P = 0,044) neste quesito, ressaltando a maior taxa de pressão arterial

entre diabéticos, uma conhecida característica secundária desta patologia. PIEGAS

et al. (2003) ao estudarem fatores de risco para o infarto do miocárdio, uma das

principais complicações da DAC, em uma população brasileira, reportaram o

tabagismo (mais que cinco cigarros por dia) como um dos principais fatores de risco

independente, seguido em ordem de importância da glicose ≥ 126 mg/dL, portanto

em concordância com os dados obtidos para os indivíduos com DAC presentes na

amostra em estudo. O histórico familiar para DAC não diferiu significativamente entre

os grupos em estudo (P > 0,600), e está associado a mais de 40% de todos os

participantes deste estudo. A elevada prevalência deste fator de risco não

modificável é comum em estudos com desenho amostral semelhante ao aqui

apresentado (PHILLIPS et al., 2004).

A distribuição de idade entre os grupos (Tabela 12) mostra que o grupo

controle tem idade média (59 anos) significativamente menor que os grupos DM2-

DAC+ (63,6 anos, P = 0,013) e DM2+DAC+ (64,8 anos; P < 0,001). Este achado é

compatível à estabelecida associação de aumento de risco para DAC e diabetes

concomitante ao aumento da idade (SHARMA, 2003). Outra possibilidade aventada

para o grupo controle apresentar idade menor em relação aos demais pode estar

relacionada à procura de assistência médica precoce, associada a maior informação

do paciente sobre condutas preventivas.

Os dados das variáveis antropométricas e bioquímicas (Tabela 13) mostram

que as médias das pressões arteriais sistólica e diastólica não apresentaram

diferença significativa entre os três grupos, assim como as concentrações séricas

médias de colesterol total, LDL-C, apo A-I, apo B e ácido úrico. Embora os

elementos descritos sejam marcadores de risco para DAC, a não diferenciação entre

o grupo controle e os demais pode refletir a intensa terapia medicamentosa anti-

hipertensiva e hipolipemiante a que estes pacientes estejam submetidos, achado

usual nos pacientes que atendem à rotina das clínicas de cardiologia.

Houve diferença significativa (P<0,05) quando comparadas as médias das

variáveis IMC, HbA

, glicose, HDL-C, TG, logaritmo de TG, e o logaritmo da relação

TG/HDL-C entre os grupos controle, DM2-DAC+ e DM2+DAC+.

As médias de IMC foram significativamente diferentes (P < 0,05) entre os três

grupos. Os valores de IMC aumentaram progressivamente na ordem: controle, DM2-

DAC+ e no grupo com diabetes tipo 2, com valores médios de 23,9; 26,1 e 27,7

kg/m

, respectivamente. Este achado reflete a associação do aumento ponderal com

o risco para DAC, fato bem estabelecido na literatura (SHARMA, 2003), e reforça a

conhecida relação entre o diabete melito tipo 2 com a obesidade (LAZAR, 2005;

YOLOGLU et al., 2005).

As concentrações médias de glicose e de HbA

, respectivamente 157,4

mg/dL e 7,7%, dos indivíduos do grupo DM2+DAC+ foram significativamente

maiores (P < 0,001) em comparação aos demais grupos. As concentrações

reportadas no grupo com diabetes para HbA

, um marcador do controle glicêmico,

refletem uma população com controle da glicemia aquém dos parâmetros

recomendados (HbA

≤ 7,0%), como preconizado em Consensos Nacionais e

Internacionais (Consenso Brasileiro sobre Diabetes, 2002; American Diabetes

Association, 2005). Analisados em conjunto, os níveis de glicemia e HbA

observados neste estudo, refletem também a adequada classificação da amostra,

aonde apenas um grupo apresenta diabetes.

Os valores das concentrações médias de HDL-C foram significativamente

menores (P < 0,05) nos grupos DM2-DAC+ e DM2+DAC+ em comparação ao grupo

controle, sendo que os dois últimos não diferiram entre si. Este resultado reflete a

associação inversa do HDL-C com a DAC (YOLOGLU et al., 2005). Deve-se

ressaltar que não foi observada uma redução da apo A-I na mesma magnitude e

significância que o HDL-C. Sendo a apo A-I, a principal apolipoproteína da fração

HDL, sua concentração sérica está altamente correlacionada com o HDL-C

(FRANCIS e FROHLICH, 2001). A discriminação dos grupos com DAC em

comparação ao grupo controle pelo HDL-C, sem a esperada correspondência da

apo A-I, pode sugerir que para a população em estudo o HDL-C seja um parâmetro

mais sensível e, portanto, recomendado.

As concentrações médias de triglicérides no grupo controle foram

significativamente menores em relação ao grupo contendo diabéticos (105,8 vs

164,4 mg/dL: P < 0,001). O grupo DM2+DAC+ também apresentou concentrações

superiores de triglicérides em relação ao grupo DM2-DAC+ (164,4 vs 130,6 mg/dL;

P = 0,023). Este achado reflete a já descrita elevação nas concentrações de

triglicérides associadas à DAC e em particular ao diabetes tipo 2 (TAN et al., 2001).

A relação log(TG/HDL-C) apresentada por DOBIASOVÁ e FROHLICH (2001)

como um índice aterogênico e correlacionado com o tamanho da partícula de LDL,

foi capaz de discriminar significativamente (P < 0,05) todos os grupos em estudo.

Valores crescentes desta relação do grupo controle, DM2-DAC+ e DM2+DAC+,

foram, respectivamente, 0,32; 0,45; 0,56. Os valores observados para relação

log(TG/HDL-C) foram superiores a 0,1, limite proposto por FROHLICH e

DOBIÁSOVÁ (2003) relacionado com partículas de LDL pequenas e densas (≤ 25,5

nm), de maior aterogenicidade. A sensibilidade na discriminação entre os grupos em

estudo sugere que a relação log(TG/HDL-C) pode ser um parâmetro útil na avaliação

de indivíduos com as características presentes neste estudo.

7.2 VARIABILIDADE GENÉTICA

Os polimorfismos em estudo foram caracterizados pela técnica de PCR-RFLP

utilizando oligonucleotídeos iniciadores que induzem sítios de restrição para as

enzimas Taq I e Mse I. As figuras 7 e 8, respectivamente, mostram os perfis

eletroforéticos para os produtos de PCR dos polimorfismos -1131T>C e S19W do

gene da apo A-V, evidenciando a quantidade e qualidade (ausência de bandas

inespecíficas) adequadas, obtidas com os protocolos apresentados em Materiais e

Métodos.

A separação dos fragmentos de DNA da restrição, por eletroforese em gel de

poliacrilamida a 10% e visualização com brometo de etídeo, permitiram a

identificação inequívoca dos genótipos, como mostrado nas Figuras 9 e 10,

respectivamente para os polimorfismos -1131T>C e S19W. Não foram detectados

problemas com a PCR-RFLP relacionados a restrições parciais com o procedimento

empregado.

As freqüências genotípicas e alélicas (Tabela 14) para o polimorfismo

-1131T>C do gene da apo A-V não mostraram diferenças estatisticamente

significativas entre os 3 grupos estudados, quando comparado dois a dois. No

entanto, para o polimorfismo S19W, houve diferença significativa apenas nas

freqüências genotípicas (P = 0,030) e alélicas (P = 0,036) entre os grupos controle e

DM2-DAC+. Quando comparadas as freqüências genotípicas entre os três grupos,

somente o polimorfismo S19W apresentou diferença significativa (P = 0,043).

Quanto ao sexo, as freqüências genotípicas diferiram significativamente (P = 0,012)

apenas no grupo DM2-DAC+ relacionado ao polimorfismo -1131T>C, apresentando

uma redução na freqüência do genótipo -1131TT nas mulheres em relação aos

homens (20% vs 65,3%). Para verificar a influência da etnia nas freqüências

genotípicas e alélicas, análises incluindo apenas euro-brasileiros (N = 191) foram

realizadas e não mostraram diferenças significativas quando comparado a amostra

total com os grupos estudados.

Como a freqüência para o alelo raro do polimorfismo S19W apresentou-se

baixa, não sendo detectado nenhum homozigoto W19W, novos indivíduos foram

analisados para este polimorfismo, aumentando a amostra inicial em cerca de 40%.

A distribuição genotípica e alélica para o polimorfismo S19W com a amostra

ampliada (Tabela 15) apresentou resultados semelhantes aos anteriormente

descritos, sendo que nesta amostra foi possível evidenciar uma diferença

significativa entre os grupos DM2-DAC+ e DM2+DAC+ (P = 0,046). Mesmo com a

ampliação da amostra nenhum homozigoto para o genótipo W19W foi encontrado,

confirmando as freqüências observadas por PENNACCHIO et al. (2002) e outros

autores (Tabela 2).

Os grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+ foram reunidos formando um grupo

designado DAC+ e comparados com o grupo controle, aqui designado DAC-, para

verificar se o aumento da amostra de indivíduos com DAC, sem a discriminação do

diabetes poderia afetar as distribuições genotípicas e alélicas (Tabela 16). Nesta

nova distribuição da amostra, o polimorfismo -1131T>C não apresentou diferenças

entre os grupos e a mutação S19W manteve a diferença significativa (P = 0,044), de

forma semelhante à observada anteriormente nas Tabelas 14 e 15. Este achado

reforça a observação que as freqüências genotípicas e alélicas referentes ao

polimorfismo S19W realmente são significativamente associadas a DAC com

redução na freqüência do genótipo SW, em especial quando o diabetes tipo 2 não

está presente.

Para facilitar as análises comparativas com outros estudos, as Tabelas 1 e 2

apresentadas na Revisão Bibliográfica, foram modificadas, incluindo as freqüências

genotípicas observadas no presente estudo, bem como a significância das

comparações (Tabelas 23 e 24). É relevante ressaltar que em algumas publicações

utilizadas na comparação, a caracterização da amostra não está bem estabelecida

quanto à composição étnica e patologias associadas.

7.3 ANÁLISES COMPARATIVAS PARA OS POLIMORFISMOS -1131T>C E S19W

A Tabela 23 mostra a comparação realizada entre o presente estudo e os

outros trabalhos para o polimorfismo –1131T>C, sendo que a comparação foi

realizada empregando o grupo estudado neste trabalho de melhor semelhança ao

reportado na literatura.

Os genótipos que contêm o alelo raro (TC + CC) são mais freqüentes na

população oriental do que nas demais populações (ENDO et al., 2002; NABIKA et

al., 2002; BAUM et al., 2003; LI et al., 2004), sendo significativamente maiores do

que o observado no presente estudo.

As freqüências dos genótipos que apresentaram o alelo raro do polimorfismo

–1131T>C entre homens e mulheres do presente estudo foram, significativamente

menores (P < 0,05), do que as encontradas por PENNACCHIO et al. (2002) para

homens e mulheres afro-americanos e hispânicos. Não houve diferença entre os

achados de PENNACCHIO et al. (2002) e este trabalho para a população

caucasiana.

Não houve diferença nas freqüências genotípicas entre as populações:

homens ingleses (TALMUD et al. 2002; TALMUD et al., 2004), caucasiana

canadense (LEE et al., 2004), tunísica (CHAABA et al., 2005) e a população deste

estudo.

Para a população húngara pesquisada por SZALAI et al. (2004), a freqüência

dos genótipos TC + CC foi maior no grupo portador de DAC quando comparada ao

nosso grupo DM2-DAC+. No entanto, quando comparados o grupo controle deste

estudo com sua contraparte húngara, as freqüências destes genótipos foram

significativamente menores nos últimos.

TABELA 23 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO POLIMORFISMO -

1131T>C DO GENE DA APO A-V NAS DIVERSAS POPULAÇÕES

ESTUDADAS E COMPARADAS COM O PRESENTE ESTUDO

Genótipos Comparação

População

TT(N) TC(N) CC(N)

Estatística Referências

Homens

0,869

(106)

0,098

(12)

0,033

(4)

------

Mulheres

0,802

(69)

0,186

(16)

0,012

(1)

------

Toda a

população

0,841

(175)

0,135

(28)

0,024

(5)

-----

Controle

0,848

(56)

0,136

(9)

0,015

(1)

-----

DM2-DAC+

0,853

(64)

0,120

(9)

0,027

(2)

-----

DM2+DAC+

0,831

(54)

0,138

(9)

0,031

(2)

-----

PRESENTE

ESTUDO

Mulheres

afro-

americanas

0,777

(537)

0,213

(147)

0,010

(7)

Mulheres

χ²=3,81; P=0,049

Homens

afro-

americanos

0,772

(376)

0,218

(106)

0,010

(5)

Homens

χ²=19,49;

P<0,001

Mulheres

hispânicas

0,668

(125)

0,310

(58)

0,021

(4)

Mulheres

χ²=5,13; P=0,023

Homens

hispânicos

0,741

(103)

0,245

(34)

0,014

(2)

Homens

χ²=6,66; P=0,009

Mulheres

caucasianas

0,866

(311)

0,134

(48)

Mulheres χ²=2,28; P=0,131

Homens

caucasianos

0,872

(286)

0,128

(42)

Homens χ²=0,01; P=0,930

PENNACCHIO et al.,

2002

Homens

ingleses

0,883

(2257)

0,111

(285)

0,006

(14)

Homens χ²=0,23; P=0,635

TALMUD et al.,

2002

Japonesa

0,418

(425)

0,477

(485)

0,105

(107)

Toda a

população

χ²=123,91;

P<0,001

NABIKA et al.,

2002

Japonesa

0,408

(225)

0,476

(263)

0,116

(64)

Toda a

população

χ²=114,00;

P<0,001

ENDO et al., 2002

0,805

(174)

0,172

(53)

0,023

(7)

DM2-DAC+

χ²=3,87; P=0,049

Húngara

0,894

(277)

0,100

(31)

0,006

(2)

Controle

χ²=5,08; P=0,024

SZALAI et al., 2004

Chinesa

0,404

(135)

0,494

(165)

0,102

(34)

Toda a

população

χ²=100,03;

P<0,001

LI et al, 2004

Caucasianos

Canadenses

0,848

(375)

0,138

(61)

0,014

(6)

Toda a

população

χ²=0,05; P=0,815

LEE et al., 2004

Homens

ingleses

0,818

(242)

0,182

(54)

Homens χ²=1,63; P=0,202

TALMUD et al.,

2004

0,747

(74)

0,211

(21)

0,040

(4)

Controle χ²=0,79; P=0,374

0,719

(41)

0,263

(15)

0,018

(1)

DM2-DAC+ χ²=3,58; P=0,058

Tunísica

0,703

(52)

0,230

(17)

0,067

(5)

DM2+DAC+ χ²=3,13; P=0,076

CHAABA et al.,

2005

0,490

(246)

0,422

(212)

0,088

(44)

Controle

χ²=28,79;

P<0,001

Chinesa

0,375

(181)

0,468

(226)

0,157

(76)

DM2-DAC-

χ²=60,38;

P<0,001

LIU et al., 2005

N = número de indivíduos. Para análise estatística os genótipos TC e CC foram agrupados.

A Tabela 24 mostra a comparação realizada entre o presente estudo e outros

trabalhos para o polimorfismo S19W, sendo que a amostra utilizada para

comparação foi a que mais se aproximou da utilizada por cada autor.

TABELA 24 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO POLIMORFISMO

S19W DO GENE DA APO A-V NAS DIVERSAS POPULAÇÕES

ESTUDADAS E COMPARADAS COM O PRESENTE ESTUDO

Genótipos Comparação

População

SS(N)

SW(N) WW(N)

Estatística Referências

Homens

0,878

(166 )

0,122

(23)

0 -----

Mulheres

0,874

(104)

0,126

(15)

0 -----

Toda a

população

0,877

(270)

0,123

(38)

0 -----

Controle

0,831

(64)

0,169

(13)

0 -----

DM2-DAC+

0,921

(129)

0,079

(11)

0 -----

DM2+DAC+

0,833

(65)

0,167

(13)

0 -----

PRESENTE

ESTUDO

Mulheres

afro-

americanas

0,861

(707)

0,132

(108)

0,007

(6)

Mulheres χ²=0,14; P=0,704

Homens

afro-

americanos

0,865

(494)

0,131

(75)

0,004

(2)

Homens χ²=0,22; P=0,642

Mulheres

hispânicas

0,743

(185)

0,229

(57)

0,028

(7)

Mulheres

χ²=8,19; P=0,042

Homens

hispânicos

0,696

(119)

0,292

(50)

0,012

(2)

Homens

χ²=18,11; P<0,001

Mulheres

caucasianas

0,874

(386)

0,122

(54)

0,004

(2)

Mulheres χ²=0,00; P=0,980

Homens

caucasianos

0,892

(362)

0,108

(44)

Homens χ²=0,23; P=0,632

PENNACCHIO et

al., 2002

Homens

ingleses

0,890

(2223)

0,105

(263)

0,004

(11)

Homens χ²=0,26; P=0,613

TALMUD et al.,

2002

República

Tcheca

0,859

(2198)

0,138

(352)

0,003

(9)

Controle χ²=0,72; P=0,396

VRABLÍK et al,

2003

Caucasianos

Canadenses

0,875

(364)

0,115

(48)

0,010

(4)

Toda a

população

χ²=0,00; P=0,947

LEE et al., 2004

Inglesa

0,859

(268)

0,141

(44)

Homens χ²=0,38; P=0,538

TALMUD et al.,

2004

1,000

(502)

0 0

Controle

χ²=86,70; P<0,001

Chinesa

0,909

(439)

0,089

(43)

0,002

(1)

DM2-DAC+ χ²=0,21; P=0,645

LIU et al., 2005

Norte

Irlandesa

0,920

(480)

0,080

(41)

Controle

χ²=4,48; P=0,034

WRIGHT et al.,

2005

N = número de indivíduos. Para análise estatística os genótipos SS e SW foram agrupados.

As freqüências dos genótipos SW + WW foram significativamente maiores nos

homens e mulheres hispânicos pesquisados por PENNACCHIO et al. (2002) em

relação aos homens e mulheres deste presente estudo. Com relação às demais

populações estudadas por PENNACCHIO et al. (2002), afro-americanos e

caucasianos, não houve diferença significativa quando comparadas à amostra deste

trabalho.

Não houve diferença significativa nas freqüências genotípicas do polimorfismo

S19W entre a população de homens ingleses (TALMUD et al., 2002; TALMUD et al.,

2004), tchecos (VRABLÍK et al., 2003) e caucasianos canadenses (LEE et al., 2004),

quando comparadas à amostra deste estudo.

As freqüências dos genótipos contendo o alelo raro W do polimorfismo S19W,

de modo díspar ao observado para o polimorfismo –1131T>C, foram menores na

população chinesa (LIU et al., 2005) em relação à população deste estudo, para o

grupo controle, ressaltando que os autores citados detectaram somente homozigotos

SS neste grupo.

Na população controle norte irlandesa estudada por WRIGHT et al. (2005) as

freqüências dos genótipos contendo o alelo raro, do polimorfismo S19W, foram

significativamente maiores do que no presente estudo, observando-se que nesta

população os referidos autores não encontraram nenhum homozigoto WW a

semelhança deste trabalho.

7.4 ESTUDO DE HAPLÓTIPOS

A distribuição de freqüências dos genótipos -1131T>C/S19W para o estudo

de haplótipos está mostrada na Tabela 17, sendo que os valores observados para

os genótipos não são diferentes entre os grupos estudados (P = 0,508)

Comparando-se as freqüências dos haplótipos (Tabela 18) dos polimorfismos

-1131T>C/S19W do gene da apo A-V, verificou-se que não houve diferença

estatisticamente significativa entre os 3 grupos estudados (χ

= 5,58; P = 0,232). Ao

se analisar os grupos controle, DM2−DAC+ e DM2+DAC+, dois a dois, as

freqüências destes haplótipos também não foram diferentes, exceto para o haplótipo

TW (χ

= 5,41; P= 0,020) entre os grupos controle e DM2-DAC+. Os estudos que

descreveram freqüências haplotípicas foram realizados a partir de quatro ou mais

polimorfismos, impossibilitando comparações com o nosso trabalho. A partir deste

dado, investigou-se a freqüência do genótipo TT/SW e demais genótipos

-1131T>C/S19W entre os grupos em estudo, mostrado na Tabela 19.

Comparando-se as freqüências do genótipo TT/SW com os demais genótipos

-1131T>C/S19W do gene da apo A-V, nos 3 grupos estudados, a distribuição

genotípica não foi estatisticamente significativa (χ

(2)

= 5,67; P=0,058). Analisando-

se os grupos estudados, dois a dois, pelo Teste de Fisher (bidirecional), a

distribuição do genótipo TT/SW, comparado com os demais genótipos

1131T>C/S19W do gene da apo A-V, mostrou-se estatisticamente diferente entre os

grupos controle e o DM2-DAC+ (P = 0,031), conforme a Tabela 19. Portanto a

freqüência do genótipo TT/SW foi significativamente menor no grupo com DAC e

sem diabetes quando comparado a grupo controle.

7.5 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO E OUTRAS COMPARAÇÕES

Através da análise de correlação linear de Pearson (Tabela 20) foram

comparadas as variáveis antropométricas e bioquímicas com os polimorfismos em

estudo. Apenas o ácido úrico mostrou correlação positiva e significativa (0,1421;

P = 0,015) para o polimorfismo S19W quando se analisou a população ampliada

(N=295). Com base neste achado, a distribuição das freqüências genotípicas para

os polimorfismos em estudo foram realizadas.

As freqüências para os polimorfismos -1131T>C e S19W foram analisadas

utilizando como discriminador o valor da mediana (5,6 mg/dL) da concentração do

ácido úrico, na população em estudo, por permitir separar a amostra de forma

homogênea em termos de número de indivíduos e conseqüentemente maior

confiabilidade nos resultados (Tabela 21). Foi observada diferença significativa (P =

0,034) apenas no grupo com diabéticos tipo 2, evidenciando neste um aumento do

genótipo SW com o aumento do ácido úrico. A subclassificação deste estudo,

discriminando nos grupos homens e mulheres, mostrou que as mulheres no grupo

com diabetes tipo 2 apresentaram diferença marcante (P = 0,008), estando o

genótipo SW em maior freqüência, associado à maior concentração de ácido úrico.

HAYDEN e TYAGI (2004), revisaram estudos referentes ao papel do ácido

úrico em relação à doença cardiovascular, doença renal e hipertensão, mostrando

que concentrações de ácido úrico acima de 4 mg/dL devem ser consideradas um

sinal de alerta em pacientes com risco cardiovascular. A hiperuricemia não aparenta

apresentar um papel causal no desenvolvimento da DAC, sendo provavelmente seu

efeito associado com outros fatores de risco (CULLET0N et al., 1999). YOO et al.

(2005) relataram que as concentrações de ácido úrico foram correlacionadas

independentemente com a hipertensão arterial, resistência à insulina e fatores de

risco para síndrome metabólica. Com base nos dados obtidos neste trabalho, é

possível sugerir uma associação entre a maior prevalência do genótipo SW em

pacientes diabéticos tipo 2 com a concentração sérica elevada de ácido úrico.

Também, a correlação do genótipo SW com o ácido úrico elevado, pode estar

refletindo a já descrita associação entre este genótipo e as concentrações séricas de

TG, os quais guardam uma correlação direta com o ácido úrico (YOO et al., 2005).

Novos estudos devem ser conduzidos para esclarecer estes achados.

A importância do gene da apo A-V para a determinação das concentrações

séricas de TG foi primeiramente determinada por PENNACCHIO et al. (2001) em

camundongos transgênicos e nocauteados. Desde então diversos trabalhos têm

associado polimorfismos do gene da apo A-V e concentrações séricas de TG em

diversas populações, sendo os polimorfismos -1131T>C e S19W os mais estudados.

Embora a associação dos polimorfismos -1131T>C e S19W e o aumento na

concentração sérica de TG já tenha sido estabelecida, neste trabalho não houve

diferença significativa entre este analito, os polimorfismos e os grupos estudados

(Tabela 22). Isso pode refletir a característica da amostra, onde majoritariamente os

indivíduos estão submetidos à intensa terapia com drogas hipolipemiantes. Portanto,

as concentrações de TG na amostra em estudo não são comparáveis à maioria dos

trabalhos publicados, onde os pacientes estudados não estão sob influência

medicamentosa. Como exemplos, podem ser citados os trabalhos que obtiveram

correlação entre os polimorfismos em estudo e aumento de TG e excluíram da

amostra, pacientes em uso de drogas hipolipemiantes: LIU et al. (2005) em

chineses; ENDO et al. (2002) em crianças japonesas, VARABLÍK et al. (2003) em

tchecos, SZALAI et al. (2004) em húngaros.

Em síntese, este trabalho mostra que as freqüências genotípicas e alélicas

dos polimorfismos observados neste estudo podem apresentar-se significativamente

diferentes de outras populações, em especial quando se compara com orientais. Os

dados apresentados são inéditos para uma população brasileira com caracterização

angiográfica.

8 CONCLUSÕES

• Entre as variáveis antropométricas e bioquímicas analisadas o IMC e o

log(TG/HDL-C) foram as únicas a apresentar diferenças significativas entre os

três grupos, indicando que estas medidas foram marcadores sensíveis e

discriminantes para a população em estudo.

• As freqüências alélicas (P = 0,036) e genotípicas (P = 0,030) para o

polimorfismo S19W foram significativamente menores para o genótipo SW no

grupo DM2-DAC+ em comparação ao grupo controle. Ampliando a amostra

(N=295), a freqüência do genótipo SW também se mostrou significativamente

menor no grupo DM2-DAC+ comparado ao grupo DM2+DAC+.

• A freqüência do haplótipo TW dos polimorfismos -1131T>C/S19W do gene da

apo A-V foi significativamente maior (P = 0,020) no grupo controle em relação

ao grupo DM2-DAC+

• O genótipo TT/SW dos polimorfismos -1131T>C/S19W do gene da apo A-V

comparado aos demais genótipos, foi significativamente maior (P = 0,031) no

grupo controle em relação ao grupo DM2-DAC+.

• As concentrações séricas de ácido úrico foram correlacionadas

significativamente (0,1421; P = 0,010) com os genótipos do polimorfismo

S19W quando a análise foi realizada com a amostra ampliada (N = 295).

• A freqüência do genótipo SW foi significativamente maior (P = 0,034) apenas

no grupo DM2+DAC+ quando a concentração média de ácido úrico foi ≥ 5,6

mg/dL e comparada com concentrações < 5,6 mg/dL, sendo as mulheres as

responsáveis pela diferença significativa observada.

• Não houve diferença significativa entre as concentrações de triglicérides e os

polimorfismos em estudo.

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ANEXOS

ANEXO I - VALORES DE REFERÊNCIA PARA O PERFIL LIPÍDICO PARA

ADULTOS ACIMA DE 20 ANOS

Lípides Valores de referência

(mg/dL)

Categoria

< 200 Ótimo

200 – 239 Limítrofe

Colesterol Total

≥ 240

Alto

< 100 Ótimo

100 –129 Desejável

130 – 159 Limítrofe

160 – 189 Alto

LDL-C

≥ 190

Muito alto

< 40 Baixo

HDL-C

> 60 Alto

< 150 Ótimo

150 – 200 Limítrofe

200 – 499 Alto

Triglicérides

≥ 500

Muito alto

FONTE: III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias. Arq Bras Cardiol, v. 77 (Supl. III), p. 43, 2001.

ANEXO II - FATORES DE RISCO PARA DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA

 Idade: ♂ ≥ 45 anos, ♀ ≥ 55 anos

 Sexo: masculino

 Histórico familiar

 Tabagismo

 Hipertensão arterial (≥ 140/90 mmHg)

 LDL-C ≥ 160 mg/dL

 HDL-C < 35 mg/dL

 Diabete melito

 Hipertrigliceridemia

FONTE: III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias. Arq Bras Cardiol, v. 77 (Supl. III), p. 43, 2001.

ANEXO III - VALORES DE GLICOSE PLASMÁTICA (mg/dL) PARA DIAGNÓSTICO

DO DIABETE MELITO E SEUS ESTÁGIOS PRÉ-CLÍNICOS

Categoria Jejum* 2 horas após 75

g de glicose

Casual **

Glicemia normal

< 100 < 140

Tolerância à

glicose diminuída

≥ 100 a <

126

≥ 140 a < 200

Diabete melito

≥ 126 ≥ 200 ≥ 200 com sintomas

clássicos***

*O jejum é definido como falta de ingestão calórica por no mínimo 8 horas.

**Glicemia plasmática casual é definida como aquela realizada a qualquer hora do dia, sem se

observar o intervalo desde a última refeição.

***Os sintomas clássicos de diabete melito incluem poliúria, polidipsia e perda inexplicada de

peso.

Nota: O diagnóstico de diabete melito deve sempre ser confirmado pela repetição do teste em

outro dia, a menos que haja hiperglicemia inequívoca com descompensação metabólica aguda

ou sintomas óbvios de diabete melito.

FONTE: American Diabetes Association. Diagnosis and classification of Diabetes mellitus. Diabetes

Care, 28:S37-S42, 2005.

ANEXO IV – FICHA DE COLETA DE DADOS DO PACIENTE

Caracterização do Paciente Nº registro

interno

Data

Nome:

____/___/__

Dados clínicos

N Dados Observações

1 Sexo ( 1 ) = Masculino ( 2 ) = Feminino

2 Idade [ ] anos

3 Peso [ ] kg

4 Altura [ ] cm

5 IMC Não preencher

6 Pressão Arterial

(PA)

[________/_______] mmHg

7 Tabagismo ( 1 ) = Nunca fumou

( 2 ) = Ex-fumante

( 3 ) = Fumante

Diabete melito

( 1 ) = Sim ( 2 ) = Não

Tipo do diabetes: ( 1 ) = Tipo 1; ( 2 ) = Tipo 2;

( 3 ) = outro

Tempo do diagnóstico do Diabete melito: [ ] anos

09 História familiar de

Doença Arterial

Coronária (DAC)

Pelo menos um parente de primeiro grau foi

diagnosticado com DAC até os 55 anos (homens) ou

até 65 anos (mulheres)

( 1 )= Sim; ( 2 ) = Não

10 História clínica

Insuficiência Renal: ( 1 ) = Sim ( 2 ) = Não

Tempo da doença: [ ] anos

Infarto: ( 1 ) = Sim ( 2 ) = Não

Tempo de ocorrência do evento: [ ]/(meses) ou

(anos)

Anotar outros dados relevantes:

11 Dados do

cateterismo

Não é necessário preencher

ANEXO V – VALORES DE REFERÊNCIA PARA ANÁLISES LABORATORIAIS

ANALITOS MNEMÔNICO

VALORES DE

REFERÊNCIA

REFERÊNCIAS

Hemoglobina

Glicada A

(%)

HbA

4,5 – 6,5% Bio Rad – Variant (HPLC)

Glicose (mg/dL)

GLU 60 - 99 American Diabetes

Association, 2005.

Colesterol total

(mg/dL)

COL Desejável < 200

Limítrofe 200 - 239

Elevado > 240

HDL-colesterol

(mg/dL)

HDL-c > 40

> 45 (diabéticos)

> 60 alto (desejável)

LDL-colesterol

(mg/dL)

LDL-C < 100 Ótimo

100 – 129 Desejável

130 – 159 Limítrofe

160 – 189 Alto

≥ 190 Muito alto

Triglicérides

(mg/dL)

TG < 150 Ótimo

150 – 200 Limítrofe

200 – 499 Alto

≥ 500 Muito alto

III Diretrizes Brasileiras em

Dislipidemias, 2001.

Apolipoproteína

AI (mg/dL)

apoAI ♂ 104 - 202

♀ 108 - 225

Apolipoproteína B

(mg/dL)

apoB ♂ 66 – 133

♀ 60 - 117

Roche Diagnóstica –

Hitachi 917

Ácido úrico

(mg/dL)

♂ 3,5 – 7,5

♀ 2,5 – 6,5

ANEXO VI - SEQÜÊNCIA DE BASES DO GENE DA APOLIPOPROTEÍNA A-V.

Retirado do GenBank nº AY422949

Sentido 5’Æ 3’

FONTE: OLIVIER et al., 2004.

ctactcagtttgattcagctatgaccctttcagacatggtccaaatgagagtcacgccag

gcaaacttctatcataaacatctatttcatttgagccagaagtctaggcttcaacttggg

aacccagagggaggggctggagatggggagagcacacagtatgctccccagagggtttaa

ggagctcccacagttgggagggttcagtcccttatttaggtgtagagctatgtcaggaaa

catgggctctgccctctcctatcacagcccacacctttcgtacccaccagcatcagagcc

agcagggatattcacacaccatcacatgttctccccatgatattctctttctcccttcta

ttcccctgatagctgccatggcagccctggggagacaagtgctcctctctgtggaccagc

tgtagcagtggccaccaggcagccagaagtgactagagccaaactccaggatgtagtggc

acaggcttccagcatcacggcaaacaggcttgcagataatcacccacatgcatggtgcct

ctccctccctactccctcacccttgaatggagtaactcatgagcattcccaaatgagcac

tgggaggctgggtttgcaaagcctggtgaatgtaatgcatccagattggggagtcgcagg

aggctggatatgcaggagacagcagcccctttggtggcctccctgtcctgcacaggacct

tccaccctccacccaacaggccactttcaaggactgaaccatgctagaggctcagagcca

aggctccccagacaaggagctgggaatgggcctgggcaggtagatcctcaggggtccccc

agatggctgtggccctggtcatgaaggctgtgagtgatgtcttcccacaggtcatccaga

cgggcctgcagcttgctcagaaccttgccactgtctgtttgttgaaactctggggcgaag

gcactgtggcctggtggaggtggcgccagctgctgctggacctcctcagtctcctggtcg

atggcgcgagtgaaggcagctatctgcaggtaggtgtcctggcggaaagcctgaagtcgc

tggcgcacctcctcggagagcatctgggggtccgggccggccccttcctcagtcccagtg

cctgcaaaggctctgctgagctcttcgcgcagctggtccaggttctgctggatgcgtgcg

tgcagggccttggccttgagcgtgagcttccgggagagcacctgcacgcagcgactgagg

cgcgcggggctggcgggggcgtgcggagccacactgcggtgcagctcctgcacgtggcgc

ccgatgccgctcaccaggctctcggcgtatgggtggaagagctctttgaagcggccggtg

tggtgcaccacgcggctctgcagtccctgcagcaaagcccaagcctcgtccacgcccccc

agcaactgggccttggtgtcttcccccaccacgcgcaactgctcctgcagctcctgcacg

cgcagggccacctgctccatcagatccatcgtgtagggcttcagttgctgccgcaagccc

tccaaattccagcccaccagctcgtgcgcctctgccatgtagggctggaggcgagccttc

acctcctccaactcctcctgcagctgccgccgcatgcccaccgggtcctgtgggagccga

ggagcctcgctcccactcagaggcctcagcttttccaggaacttgttcatattgttgagg

tcttgctcaaggctgtctttcagggtcctggagaaggggacagatatccaggccgtcaga

ctgctagcccccatcatctcctttgtccccaagtcatcgcgcactgatcctctgggggaa

ccaaggacgcagggcgttggccccagggtcgagggctcttgtcctagccctggccagtaa

caactcacgcacgaagcacaaacacattgcccatacaaatccagacctacaacactctcc

aaagaaacatagatgcgccacatcatcctttgattctggggactgcagcgggcgtcctcc

cgattgatcccaggtcccgcgcctcagtgagcaagggggcaacagctacggagttgtcaa

ggcgggggctgcaggcagagggcgctaaagagcccaggatggccgggatctgcagacaga

gctagcaccgctcctttcctctgtcccagcagcggccacagaggttgaggcagcagaggc

aggtcatcatggcatggcccagctgtctcctcccttcgcctacaccccttcccctgggca

ctcacgcgggctcgcgagccatcttctgctgatggatctgctccaccctgcctttgtccc

cgctggtctggctgaagtagtcccagaa

Polimorfismo S19W: oligonucleotídeos iniciadores identificados na região sublinhada.

F 5’ GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG 3’;

R 5’ GCCTTTCCGTGCCTGGGTGGT

3’ [a timina (T) no iniciador induz a criação de sítio de restrição

(identificado por seta) para enzima Taq I].

gcctttccgtgcctgggtggc

cgaaaacgctg

tggagagggactaggtaatcagggcctgggctctcctcccccagggtggacagggccctc

tggccagcctccacccacacccccacgttgaagtcagggtcggagacccacctgaaagaa

gagcc

agagcccaggtgagcacggcagccatgcttgccattatctgctctgagaagacag

gtggagggaggcctggttaggggaagaaggagacgaagggacatggcgcaggggacttgc

ccagggggcctctgcaggggcaactgcccgaaatcctgttaccccttccttgggctgggg

agcacagagctgttggggctcaagaggactgacctaggtgagtcaaggaggctagggtgt

cttcctcagacatgggaagagggcgtgctcttgctacctcagtcacatagcagggagcgt

ggtgctctaaccccttcgcaaaggtcccagaccccaggaacagttctctaggccacttct

accacctctcccctgcccacctgtctccctccctcccatttcatggtggaaaaactgagc

cataatgagggcgaagaggcaactctgccaaaatgttccaagaggacgtcttaggggcca

ccccaggctctcccctgaggccacctgcaatgccctcccttaggactgtgacccccatcc

ctctgccccagctgctcacctgctcacgtctgggcacagagagcagacattctgctttat

actccagggccctgagcctctggcaccaattgctctgagtaaataccacgtggaagttca

aaagaagttgacctcagctgcctcccagcactcacctcctgccctttccctggcacccag

agggttaatgagtgccctggtatcaggggctgccccagtagagaagtgcttcccaggagc

tttacgggggatggggctgaactcctcacccagtttctcccaaaccccatgacctttaac

cttcccactgacctgctggctggcccaccaacagagaagaacctgtttgtctgccaaggg

cccctctcttacacaactacccagagtcactgtgtcccagccggcaagatggacagtgtt

cacctaccagccagaacccgagcagcccctgaaagcttcactacaggttccgcaggcatc

ctcagccagcattcatagggttaaagaccaaccacatccctctttatgaaacaatcctgg

aacaagcaagggaagccaggcagggtgaagatgagatggcaagaggcatctgggccaggg

actctgag

Polimorfismo -1131T>C . oligonucleotídeos iniciadores marcados com duplo sublinhado

F 5’ GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT 3’;

R 5’ CCCCAGGAACTGGAGCGAAAT

T 3’ [a timina (T) introduzida no iniciador induz a criação de sítio de

restrição (identificado por seta) para a enzima Mse I].

ccccaggaactggagcgaaagt

aagatttgccccatgaggaaaagctgaact

ccactcgcagggcctctgaggagagcaagcccaaatgctcagatcttctctgatgacaca

cccactccgtctacagtactcatacacacgttcacaagctcc

cgattcttggtcctaaat

gcatcttgaatcaatcccctctcctccatttccactaccatcattgcaccagttgtctgt

caccttgattgcattcatagcctccaacaggtctttctaccacactcctgcccatttaat

tcatcctccactgtggctcatcctgactcatttccagtctcatctgctgccacataaaac

cacagcattccctgagcctttatacaggcttccctctgcttgaaatagcctatcccctgg

tgaatatatattcattttttagagttagtttgtattagttagaattagacttggctgcaa

gggacatatatatgt

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