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ANGELA FLORÃO
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS
DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE QUATRO ESPÉCIES DE BACCHARIS,
ASTERACEAE
CURITIBA
2006
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ANGELA FLORÃO
AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS
DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE QUATRO ESPÉCIES DE BACCHARIS,
ASTERACEAE
Dissertação apresentada como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas – Área de Análises Clínicas,
Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do
Paraná.
Orientadora: Prof.ª Dr.
a
Almeriane M. Weffort-Santos.
CURITIBA
2006
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ii
NOTA BIOGRÁFICA
A autora graduou-se em Farmácia – Bioquímica pela Universidade Federal do
Paraná em 2004. Durante a graduação, de agosto de 2001 a julho de 2002,
participou do Programa de Iniciação Científica, Departamento de Genética, sob
orientação da Professora Maria Luiza Petzl Erler, com o projeto de pesquisa: “Genes
do MHC e outros de função relacionada ao sistema imune: variabilidade em
populações”. Ainda na graduação, de abril de 2003 a março de 2004, foi monitora na
disciplina de Hematologia I, Departamento de Patologia Médica, sob orientação da
Professora Almeriane Maria Weffort Santos. Em setembro de 2005, após concurso
público, iniciou sua carreira como Professora Substituta do Curso de Farmácia –
Bioquímica, da Universidade Federal do Paraná, onde foi responsável pela disciplina
de Bioquímica Clínica II, até dezembro de 2005. No ano de 2004, ingressou no
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, área de Análises Clínicas,
onde desenvolveu projeto sobre atividades biológicas de óleos essenciais de
espécies de Baccharis, cujos resultados estão contidos nesta dissertação.
iii
DEDICATÓRIA
Ao meu noivo, João, meus pais e irmão.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por sempre ter abençoado e iluminado meus
caminhos.
Aos meus pais, Ilene Rossi e João Florão, e ao meu irmão Andre, pelo
incansável apoio, estímulo e amor em todos os momentos.
Ao meu noivo João, pelo amor, compreensão e incentivo incondicional.
A Profª Almeriane Maria Weffort-Santos, pela dedicação, entusiasmo, bons
conselhos, ensinamentos e, especialmente, pela amizade, sendo um exemplo de
inteligência e perseverança.
Ao Prof. Cid Aimbiré de Moraes Santos, pelo auxílio em minha formação,
sugestões e amizade.
A Profª Márcia do Rocio Duarte e Jane Manfron Budel, pela gentileza de
fornecer os óleos essenciais, que possibilitaram a realização deste trabalho.
A Profª Cyntia M. T. Fadel-Picheth, pela atenção e disponibilidade para
realização dos experimentos de atividade antibacteriana.
A Irene, pela amizade e valiosíssima ajuda.
A Celene, Geni, Graça e Regina, pela atenção e auxílio.
A todos os professores da UFPR, em especial aos professores Rogério Luiz
Kopp, José Domingos Fontana e Maria Suely Soares Leonart, por suas
colaborações que tornaram possível a realização desse trabalho.
Aos amigos Júlio, Jeanine, Christian, Ingrid, Maria Cecília, Patrícia, Sônia,
Silvia, Caroline, Mauren, Lisângela, Wesley, Juliana, Ana Paula e colegas da Pós-
Graduação, pelas contribuições e amizade.
A Fabiana e Larissa, pela inestimável ajuda em meus experimentos, por todos
os bons momentos que compartilhamos e pela amizade.
A CAPES, Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,
pela bolsa de mestrado.
E a todas as pessoas que, de maneira direta ou indireta, contribuíram para a
realização deste trabalho.
v
EPÍGRAFE
“Não importa onde você parou... em que momento da vida você cansou...
O que importa é que sempre é possível e necessário recomeçar.
Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo...
É renovar as esperanças na vida e, o mais importante...
Acreditar em você de novo. Se desejarmos fortemente o melhor e...
Principalmente, lutarmos pelo melhor...
O melhor vai se instalar em nossa vida.
Porque sou do tamanho daquilo que vejo. E não do tamanho da minha altura.”
Carlos Drummond de Andrade
vi
SUMÁRIO
NOTA BIOGRÁFICA.......................................................................................... ii
DEDICATÓRIA................................................................................................... iii
AGRADECIMENTOS.......................................................................................... iv
EPÍGRAFE.......................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS........................................................................................... viii
LISTA DE TABELAS.......................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS & FÓRMULAS QUÍMICAS.................. x
RESUMO.......................................................................................................... xiii
ABSTRACT........................................................................................................ xiv
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 1
1.1 GÊNERO Baccharis — ASTERACEAE...................................................
1
1.2 ÓLEOS ESSENCIAIS.............................................................................. 3
1.3 MECANISMOS DE DEFESA DO ORGANISMO HUMANO.................... 6
1.4 INFLAMAÇÃO E A RESPOSTA INFLAMATÓRIA................................... 7
1.5 QUIMIOTAXIA......................................................................................... 9
1.6 O SISTEMA IMUNITÁRIO....................................................................... 10
1.7 REGIÕES NUCLEOLARES CORADAS PELA PRATA – AgNOR.......... 19
2 OBJETIVOS..................................................................................................... 22
2.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 22
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................... 22
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 23
3.1 SOLUÇÕES............................................................................................. 23
3.2 ENSAIOS DE SOLUBILIZAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS................ 25
3.3 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA............................ 26
3.4 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS HUMANOS........................................... 26
3.4.1 Separação das populações de leucócitos humanos.......................
27
3.5 VIABILIDADE E CITOTOXICIDADE CELULARES................................. 27
3.6 PREPARO DE CITOCENTRIFUGADOS................................................ 28
3.7 COLORAÇÃO DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA...................................... 28
3.8 QUIMIOTAXIA DE GRANULÓCITOS .................................................... 28
vii
3.9 ENSAIOS DE IMUNOMODULAÇÃO....................................................... 29
3.9.1
A
tivação/proliferação de linfócitos avaliada por citometria de
fluxo...........................................................................................................
30
3.9.2 Ativação de linfócitos avaliada morfologicamente............................
31
3.10 IMPREGNAÇÃO PELA PRATA DE REGIÕES NUCLEOLARES
ORGANIZADAS – AgNOR............................................................................
31
3.11 ATIVIDADE SOBRE O CRESCIMENTO BACTERIANO...................... 32
3.11.1 Reativação da viabilidade e competência dos
microorganismos.......................................................................................
32
3.11.2 Teste de difusão em ágar..............................................................
32
3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................... 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 34
4.1 ENSAIOS DE SOLUBILIZAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS................ 34
4.2 EFEITO DA TEMPERATURA E DO PERÍODO DE INCUBAÇÃO
SOBRE A VOLATILIDADE DOS COMPONENTES DO ÓLEO ESSENCIAL
DE Baccharis.................................................................................................
35
4.3 CITOTOXICIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CÉLULAS
MONONUCLEARES E GRANULÓCITOS.....................................................
37
4.4 QUIMIOTAXIA DE GRANULÓCITOS INDUZIDA POR CASEÍNA.......... 40
4.5 EFEITOS DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DE Baccharis
SOBRE A IMUNOMODULAÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES ........
44
4.5.1 Efeitos do etanol e dimetilsufóxido sobre a imunomodulação de
linfócitos humanos in vitro........................................................................
44
4.5.2 Potencial imunomodulatório dos óleos essenciais..........................
58
4.6 ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Baccharis SOBRE O
CRESCIMENTO BACTERIANO....................................................................
64
5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................... 69
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 71
ANEXOS............................................................................................................. 80
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aspecto geral de B. articulata, B. dracunculifolia, B. crispa e B.
gaudichaudiana...........................................................................................
04
Figura 2. Efeito da temperatura e do período de incubação sobre os
constituintes do óleo essencial de Baccharis dracunculifolia......................
36
Figura 3. Citotoxicidade de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre
leucócitos periféricos...................................................................................
39
Figura 4. Avaliação do potencial quimiotático de óleos essenciais de
espécies de Baccharis sobre granulócitos humanos..................................
41
Figura 5. Efeito do pré-tratamento com óleos essenciais de espécies de
Baccharis sobre a quimiotaxia de granulócitos induzida por
caseína........................................................................................................
42
Figura 6. Representação gráfica em pontos para análise da atividade
imunomodulatória de linfócitos por citometria de fluxo...............................
45
Figura 7. Efeito in vitro de etanol e DMSO sobre a proliferação basal de
linfócitos humanos......................................................................................
46
Figura 8. Efeito in vitro de etanol e DMSO sobre a proliferação de linfócitos
humanos estimulados por fitohemaglutinina...............................................
47
Figura 9. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a transformação
blástica de linfócitos humanos....................................................................
48
Figura 10. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a transformação
blástica de linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina..............
48
Figura 11. Efeito do DMSO e etanol sobre a formação de AgNOR em
linfócitos humanos......................................................................................
50
Figura 12. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a formação de
AgNOR em linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina............
51
Figura 13. Aspecto morfológico de AgNOR em linfócitos humanos.................. 52
Figura 14. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a morfologia de
AgNOR de linfócitos humanos....................................................................
54
Figura 15. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre
a proliferação de linfócitos humanos...........................................................
59
Figura 16. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre
a proliferação de linfócitos humanos estimulados por
fitohemaglutinina.........................................................................................
60
Figura 17. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre
a formação de AgNOR em linfócitos humanos estimulados por
fitohemaglutinina.........................................................................................
63
Figura 18. Efeito in vitro do óleo essencial de B. dracunculifolia sobre a
proliferação de linfócitos humanos estimulados por
fitohemaglutinina.........................................................................................
63
Figura 19. Atividade antibacteriana dos óleos essenciais de espécies de
Baccharis....................................................................................................
67
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição química e concentração relativa (%) dos óleos
essenciais de Baccharis articulata (BA), B. crispa (BC), B. dracunculifolia
(BD) e B. gaudichaudiana (BG) obtidos por cromatografia gasosa
acoplada a espectroscopia de massa.........................................................
5
Tabela 2. Mitógenos: características e células alvo........................................... 17
Tabela 3. Influência da temperatura sobre os componentes do óleo essencial
de B. dracunculifolia....................................................................................
37
Tabela 4. Influência de DMSO e etanol na morfologia de linfócitos humanos
cultivados na presença ou não de fitohemaglutinina, avaliada em
citocentrifugados corados com May-Grunwald-Giemsa.............................
49
Tabela 5. Toxicidade do DMSO e etanol sobre células mononucleares
humanas avaliada por citometria de fluxo...................................................
56
Tabela 6. Efeito dos óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre a
viabilidade de células mononucleares..............................................................
59
Tabela 7. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre a
transformação blástica de linfócitos humanos estimulados ou não por
fitohemaglutinina............................................................................................
61
Tabela 8. Influência de óleos essenciais de Baccharis sobre a morfologia de
linfócitos, avaliada em citocentrifugados corados com May-Grunwald-
Giemsa........................................................................................................
62
Tabela 9. Atividade antibacteriana dos óleos essenciais de B. articulata, B.
crispa, B. dracunculifolia e B. gaudichaudiana sobre bactérias gram-
positivas......................................................................................................
66
x
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS
&
FÓRMULAS QUÍMICAS
AgNOR Regiões nucleolares impregnadas pela prata
AMPc Adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico
AP-1
Fator de ativação Proteína 1 (Activation Protein-1)
ATCC
American Type Culture Collection
Atm Atmosfera
ATP Adenosina trifosfato
ATPase Adenosina trifosfatase
Ba B. articulata
Bc B. crispa
CaCl
2
Cloreto de cálcio
Bd B. dracunculifolia
Bg B. gaudichaudiana
BSA Albumina sérica bovina
Ca
++
Íon cálcio
CAA Células apresentadoras de antígenos
C3a Fração C3 do complemento ativada
C5a Fração C5 do complemento ativada
CD
Grupos de diferenciação (Cluster of Differentiation)
CF Citometria de fluxo
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CO
2
Dióxido de carbono
Con A Concanavalina A
D Dalton
DNA
Ácido desoxiribonucléico (Desoxyribonucleic Acid)
DEXA Dexametasona
DMSO Dimetilsulfóxido
DP Desvio padrão
DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
EPM Erro padrão da média
FACS
Fluorescent activated cell sorting
F1-73 Fibroblastos de células normais da pele 1-73
f MLP
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
FSC
Forward light scatter
g
Aceleração da gravidade
G
0
Fase do ciclo celular em que as células não estão em processo
de divisão
G
1
Fase do ciclo celular em que as células estão se preparando
para entrar em atividade de intensa síntese
GALT Tecido linfóide associado ao intestino
GM-CSF Fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos
GNC Granulócitos
HCl Ácido clorídrico
HL-60 Células humanas de leucemia pró-mielocítica 60
HLA
Antígeno Leucocitário Humano (Human Leukocyte Antigen)
HepG2 Células derivadas de hepatocarcinoma 2
H
2
SO
4
Ácido sulfúrico
IL Interleucina
IL2-R Receptor para Interleucina 2
IP Índice de proliferação
K
+
Íon potássio
xi
KCl Cloreto de potássio
KH
2
PO
4
Fosfato monobásico de potássio
LPS Lipopolissacarídeo
LTB4 Leucotrieno B4
M Mol, molar
MALT Tecido linfóide associado a mucosas
MAPK
Proteína quinase ativada por mitógeno (Mitogen-Activated
Protein Kinase)
Mg
++
Íon magnésio
MgCl
2
Cloreto de magnésio
MgCl
2
.6H
2
0 Cloreto de magnésio hexaidratado
MgSO
4
.7H
2
0 Sulfato de magnésio heptaidratado
MHC
Complexo de histocompatibilidade principal (Major
Histocompatibility Complex)
min Minutos
ml Mililitros
mmol/l Milimolar por litro
MNC Células mononucleares
M-PHA Meio com fitohemaglutinina
Na
+
Íon sódio
NaCl Cloreto de sódio
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
NFATc
Fator nuclear de células T ativadas (Nuclear Factor of Activated
T-Cells)
NaHCO
3
Bicarbonato de sódio
Na
2
HPO
4
Fosfato dissódico
Na
2
HPO
4
.H
2
0 Fosfato dissódico monoidratado
NaH
2
PO
4
.2H
2
0 Fosfato monossódico diidratado
NaOH Hidróxido de sódio
NH
4
Cl Cloreto de amônio
nm Nanômetros
NOR Regiões nucleolares organizadas
PAF
Fator de ativação plaquetária (Platelet Activating Factor)
PBS
Salina tamponada com fosfatos (Phosphate Buffered Saline)
PBSs Salina tamponada com fosfatos suplementada
PGE1 Prostaglandina E1
pH Potencial hidrogeniônico
PHA
Fitohemaglutinina (Phytohemagglutinin)
PKC
Proteína C quinase (Protein Kinase C)
PMN Polimorfonucleares
p/v Peso por volume
PWM
Pokeweed mitogen
RNA
Ácido ribonucleico (Ribonucleic Acid)
rpm Rotações por minuto
RPMI
Rosewell Park Memorial Institute
SK-MEL-28 Células de melanoma humano 28
SSC
Side light scatter
T.A. Temperatura ambiente
TB Transformação blástica
TcR Receptor de células T
Th1
Linfócitos T auxiliares subtipo 1 (T helper)
Th2 Linfócitos T auxiliares subtipo 2
xii
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa (Tumor Necrosis Factor - alpha)
TSA
Trypticase Soy Agar
TSB
Trypticase Soy Broth
UFC Unidades formadoras de colônias
UV Ultravioleta
v/v Volume por volume
µl Microlitros
xiii
RESUMO
O gênero Baccharis (Asteraceae) possui mais de quinhentas espécies,
especialmente distribuídas nas áreas tropicais da América do Sul, muitas das quais
são utilizadas na medicina tradicional para o tratamento e prevenção de várias
patologias. Por sua vez, diferentes métodos in vitro têm sido empregados para a
investigação de atividades biológicas de plantas usadas na medicina popular. Este
trabalho teve como objetivo investigar o potencial biológico dos óleos essenciais
extraídos das partes aéreas de Baccharis articulata, B. crispa, B. dracunculifolia e B.
gaudichaudiana, conhecidas popularmente como carquejas, enfatizando
citotoxicidade, atividades imunomodulatórias, quimiotáticas e antibacterianas. Para
tanto, a citotoxicidade dos óleos essenciais sobre leucócitos humanos foi estimada
pela coloração com azul de tripano, enquanto os efeitos sobre a transformação
blástica e a proliferação de linfócitos humanos, induzidas ou não pelo mitógeno
fitohemaglutinina, foram avaliados por citometria de fluxo; a quimiotaxia de
granulócitos humanos, pelo método de Boyden, através de um gradiente de caseína;
o efeito sobre o desenvolvimento de colônias de
Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa foi investigado
pelo método de difusão em ágar. Os resultados apresentados demonstraram que
concentrações dos óleos essenciais superiores a 10
-2
µl/ml apresentaram-se tóxicos
para leucócitos humanos. Os ensaios de imunomodulação revelaram que o
dimetilsulfóxido, mas não o etanol, solventes utilizados para incorporação dos óleos
essenciais em meio aquoso, apresenta efeito inibitório significativo sobre a
proliferação de linfócitos humanos espontânea e induzida por fitohemaglutinina,
sendo inadequado para se estudar o perfil proliferativo de linfócitos humanos in vitro.
Por outro lado, os óleos essenciais das espécies de B. dracunculifolia e B.
gaudichaudiana diluídos em etanol inibiram significativamente a proliferação de
linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina sem interferir com a
proliferação espontânea dos mesmos. De particular interesse, B. articulata e B.
dracunculifolia, inibiram significativamente a quimiotaxia induzida por caseína, efeito
não observado para B. crispa e B. gaudichaudiana, provavelmente pela variação
entre os constituintes e nas suas quantidades individuais. Os óleos essenciais
também demonstraram moderada atividade antibacteriana contra bactérias gram-
positivas, produzindo halos de inibição de maneira dose dependente, que variaram
de acordo com a espécie ensaiada. Embora estudos mais aprofundados sejam
necessários, os resultados contidos neste trabalho servem como base preliminar de
dados que, com certeza, ajudarão a confirmar a utilidade dos óleos essenciais de
espécies de Baccharis para o combate, controle ou mesmo prevenção de doenças.
Palavras-chaves: óleos essenciais, Baccharis, imunomodulação, quimiotaxia,
atividade antibacteriana
xi
v
ABSTRACT
The Baccharis genus (Asteraceae) has over 500 species distributed mainly in tropical
areas of South America, which have been used in the folk medicine for the treatment
and prevention of several diseases. Different in vitro methods have been used for
investigating biological activities of medicinal plants. The aim of this work was to
evaluate the biological potential of the essential oils extracted from the aerial parts of
Baccharis articulata, B. crispa, B. dracunculifolia, and B. gaudichaudiana, popularly
known as carquejas, focusing their toxicity, immunomodulatory, chemotactic, and
antibacterial activities. To accomplish this, the effect of the essential oils upon human
leukocyte viability was evaluated by the trypan blue exclusion test; the blastic
transformation and proliferation of lymphocytes, stimulated or not by
phytohemagglutinin, by flow citometry; the human granulocyte chemotaxis induced
by casein by the Boyden’s method; and the Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa colony growth by the agar
diffusion method. The results herein presented showed, in one hand, that
concentrations over 10
-2
ul/ml of the essential oils tested are toxic for human cells.
The immunomodulation assays indicated that dimethyl sulfoxide, but not ethanol, is
not appropriate for evaluating the proliferative potential of human leukocytes as a
solvent when hydrophobic substances such as essential oils must be incorporated
into aqueous medium, because it inhibits the lymphocyte proliferation independent of
the presence of phytohemagglutinin. On the other hand, B. dracunculifolia and B.
gaudichaudiana essential oils, diluted into ethanol, inhibited significantly the
lymphocyte proliferation when phytohemagglutinin was present in the medium. Of
particular interest, only B. articulata and B. dracunculifolia inhibited significantly the
casein-induced human granulocyte chemotaxis, probably as a consequence of their
constituents or their individual amount in the mixture. The essential oils also showed
bactericidal activity, producing growth inhibition of gram-positive bacteria, which
varied according to the assayed specie. Although further studies are needed, the
results and suggestions presented in this work may be useful as a preliminary data to
confirm the usefulness of Baccharis essential oils for combating, controlling, and
preventing diseases.
Keywords: essential oils, Baccharis, immunomodulation, chemotaxis, bactericidal
activity
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 GÊNERO Baccharis — ASTERACEAE
A família Asteraceae é o grupo sistemático mais numeroso dentro das
Angiospermas, compreendendo cerca de 1.100 gêneros e 25.000 espécies. São
plantas de aspecto extremamente variado, incluindo principalmente pequenas ervas
ou arbustos e, raramente, árvores (Heywood, 1993). Cerca de 98% dos gêneros são
constituídos por plantas de pequeno porte, sendo encontrados em todos os tipos de
habitat, mas principalmente nas regiões tropicais montanhosas na América do Sul
(Joly, 1967).
O gênero Baccharis está representado por mais de quinhentas espécies
distribuídas principalmente no Brasil, Argentina, Colômbia, Chile e México, ocupando
as regiões mais elevadas (Dupont, 1966; Malagarriga Heras, 1976). A alta
concentração no Brasil e nos Andes indica que uma dessas áreas é o provável
centro de origem desse gênero (Teodoro-Luis, 1955). Como recentemente revisado
por Verdi e colaboradores (2005) no Brasil estão descritas pelo menos 120 espécies
de Baccharis, com a maior parte delas localizada na região sudeste do país, estima-
se em cem o número de espécies na Argentina, 28, no México e cerca de quarenta,
na Colômbia, constituindo um dos mais importantes grupos de plantas neste país,
das quais 38% são endêmicas.
As espécies do gênero Baccharis constituem-se de arbustos em sua maioria e
sua altura varia, em média, de 0,5 a 4m. Apresentam elevado valor sócio-
econômico, com ampla dispersão nos estados de Santa Catarina, Paraná, São
Paulo e Rio Grande do Sul, entre outras regiões do país, onde grande número delas
é utilizado na medicina popular para controle ou tratamento de várias doenças. São
consumidas, principalmente, na forma de chás, com as mais variadas indicações,
desde males do estômago, fígado, anemias, inflamações, diabetes e doenças da
próstata, sendo também descritas para o processo de desintoxicação do organismo,
como poderá ser visto mais adiante neste capítulo.
O estudo de espécies do gênero Baccharis tem mostrado grandes avanços
devido ao seu reputado uso na medicina caseira na América Latina. Cerca de 120
espécies do gênero Baccharis foram estudadas quimicamente e, dentre estas, cerca
de trinta apresentam estudos de atividade biológica, dos quais destacam-se os
efeitos alelopáticos, antimicrobianos, citotóxicos e antiinflamatórios (Verdi et al.,
2005). Entre as espécies mais pesquisadas quanto à composição química e/ou
2
atividade biológica, encontram-se B. megapotamica, B. incarum, B. trimera, B.
trinervis, B. salicifolia, B. crispa, B. coridifolia, B. dracunculifolia, B. grisebachii e B.
tricuneata. Interessante notar que, para o extrato de B. articulata, descreveu-se
recentemente atividade antioxidante, sendo a fração n-butanólica a mais ativa (De
Oliveira et al., 2003), enquanto que, para a B. gaudichaudiana, relatou-se atividade
citotóxica de clerodanos, labdanos e flavonóides (Fullas et al., 1994).
Muitas são as implicações econômicas dessas espécies, podendo-se citar
aspectos negativos e positivos. Por exemplo, ajudam no combate à erosão e podem
ser utilizadas como plantas ornamentais, mas também podem apresentar-se como
pragas de difícil combate em pastagens, podendo envenenar o gado. Contudo, o
destaque maior da sua utilização está na medicina caseira (Carneiro e Fernandes,
1996; Jarvis et al., 1991).
Dentre as espécies de Baccharis mais comuns no Paraná, destacam-se B.
dracunculifolia, B. articulata, B. crispa e B. gaudichaudiana. Entre as espécies
denominadas coletivamente de carqueja, está a B. dracunculifolia, que é também
popularmente conhecida como alecrim-de-vassoura, alecrim-do-campo, vassoureira,
vassourinha, vassoura, erva-de-são-joão-maria, chilca, cilca e suncho thola. É
utilizada na medicina tradicional para combater distúrbios gástricos, cansaço físico,
inapetência, afecções febris e debilidade orgânica (Mors et al., 2000; Silva Júnior,
1997). A partir de suas folhas é extraído, por arraste de vapor, óleo de vassoura, de
alto valor para a indústria de fragrâncias (Molt e Trka, 1983). Além disso, B.
dracunculifolia tem sido a fonte botânica mais importante para produção de própolis
verde (Kumazawa et al., 2003; Midorikawa et al., 2001; Park et al., 2002).
B. articulata, conhecida como carqueija, carquejinha, carqueja-doce, carqueja-
do-morro, carqueja-miúda e vassoura (Alonso, 1998; Barroso, 1975-6; Corrêa, 1984;
Mors et al., 2000; Silva Júnior, 1997; Takeda e Farago, 2001), é empregada para
uso interno na medicina popular como tônica, febrífuga, diurética, hepatoprotetora,
antianêmica e colagoga e, para uso externo, como anti-séptica e secante de úlceras
(Alonso, 1998; Corrêa, 1984; Silva Júnior, 1997). Na Argentina, acredita-se que B.
articulata tenha atividade no tratamento da impotência sexual masculina e da
esterilidade feminina. No Paraguai, é usada como anti-hipertensiva (Takeda e
Farago, 2001). É uma planta amarga, digestiva e rica em saponinas (Corrêa, 1984).
Já o extrato aquoso das partes aéreas de B. crispa demonstrou efeito
antioxidante no ensaio com DPPH (Simoes-Pires et al., 2005), enquanto a B.
gaudichaudiana é usada popularmente no Paraguai como tônica, antidiabética e
para distúrbios gastrintestinais, onde é conhecida como chilca melosa (Fullas et al.,
3
1994). Flavonóides extraídos de B. gaudichaudiana também demostraram moderada
atividade antioxidante pelo ensaio com DPPH (Akaike et al., 2003).
1.2 ÓLEOS ESSENCIAIS
Óleos essenciais são líquidos oleosos aromáticos que se evaporam quando
expostos ao ar. São obtidos de várias partes vegetais, principalmente, por
hidrodestilação ou expressão. Quimicamente, constituem-se misturas de
substâncias divididas em dois grupos principais: derivados terpenóides e/ou
derivados fenilpropanóides (Robbers et al., 1997). Estão amplamente distribuídos no
reino vegetal, especialmente nas famílias Asteraceae, Laminaceae, Lauraceae,
Myrtaceae, Rutaceae e Apiaceae (Alonso, 1998; Lavabre, 1997). Sua função
envolve sinais de comunicação química no reino vegetal e atuam como armas de
defesa química contra o reino animal.
O cultivo de espécies aromáticas tem aumentado e a obtenção de óleos
essenciais constitui importante atividade econômica, sendo amplamente utilizados
como fragrância em cosméticos, aromatizantes de alimentos, bebidas e produtos de
utilidade doméstica, como, por exemplo, detergentes, sabões, repelentes de insetos
e aromatizantes de ambiente, além de seu emprego como intermediários sintéticos
de perfumes (Woolf, 1999). O uso de óleos essenciais na aromaterapia tem se
expandido por todo o mundo e inclui terapia contra várias doenças inflamatórias,
alergias, reumatismo e artrite. Estas atividades são reconhecidas através de
experimentação clínica, especialmente por aplicações na pele via massagens e
ungüentos, mas existem poucos estudos científicos sobre suas ações biológicas
(Maruyama et al., 2005).
Além disso, plantas que os possuem são utilizadas in natura para a
preparação de infusões com finalidades terapêuticas ou ainda para aromatização de
formas farmacêuticas destinadas a uso oral, além da aromaterapia (Lavabre, 1997;
Simões e Spitzer, 2000). Os óleos essenciais têm sido empregados no setor
farmacêutico devido às suas propriedades antimicrobianas (Burt, 2004). Neste
contexto, relatos sobre a ação dos óleos essenciais na degradação da parede
bacteriana, alteração na membrana plasmática e nas proteínas de membrana, no
fluxo de elétrons e na coagulação do citoplasma (Gustafson et al., 1998; Juven et al.,
1994; Ultee et al., 2002) vêm se acumulando. Essas ações parecem estar
relacionadas à hidrofobicidade desses compostos e à sua capacidade de ligação
com íons (Gustafson et al., 1998; Sikkema et al., 1994b).
4
O gênero Baccharis é uma fonte rica de óleos essenciais utilizados na
indústria de perfumaria (Silva et al., 1978; Silva Júnior, 1997). Vários constituintes
dos óleos essenciais de B. articulata, B. crispa, B. dracunculifolia e B.
gaudichaudiana (Figura 1) foram recentemente descritos (Manfron, 2005,
comunicação pessoal)
e estão relacionados na Tabela 1.
Figura 1. Aspecto geral de B. articulata (A), B. dracunculifolia (B), B. crispa (C) e B.
gaudichaudiana (D).
Entretanto, o gênero Baccharis, por sua ampla distribuição geográfica e
grande variedade de espécies, associado ao notável destaque na medicina popular
no Brasil e em outros países da América do Sul, apresenta estudos de atividade
biológica um tanto tímidos (Verdi et al., 2005). Dessa forma, estas plantas tornaram-
se alvo de nosso interesse, amparados não só no fato de serem muito usadas na
medicina caseira, mas e principalmente, porque suas indicações de uso, assim
como sua composição química, podem estar relacionadas a aspectos envolvidos
com os mecanismos das respostas inflamatória e imunológica.
A
B
Fonte: www.herbotecnia.com.ar/ aut-carqueja.html www.herbs-suppliers.com/ English/herbs.htm
C
D
www.ahau.org/oregano_ alecrim.0.html
www.uniguacu.edu.br/biblioteca/mandou_bem/ PDF
%20DO%20ARTIGO%20DE%20B.%20gaudichaudiana.p
df
5
Tabela 1. Composição química e concentração relativa (%) dos óleos
essenciais de Baccharis articulata (BA), B. crispa (BC), B. dracunculifolia (BD)
e B. gaudichaudiana (BG) obtidos por cromatografia gasosa acoplada a
espectroscopia de massa.
Pico
Tempo de
retenção
(min)
Componente BA BC BD BG
1 7.12 ? 0,31 0,31 0,31 0,31
2 8.36
α-pineno
0,55 - 1,38 -
3 9.82
β-pineno
5,63 0,22 6,64 -
4 10.41
β-mirceno
0,16 - 0,62 2,64
5 11.56 p-cimeno 0,11 - 0,07 -
6 11.70 limoneno 3,30 0,18 6,72 2,01
7 12.17 ? 0,24 0,24 0,24 0,24
8 12.47
β-ocimeno (E)
0,23 0,10 0,12 -
9 12.81
γ-terpineno
- - 0,05 -
10 13.08 acetofenona - - 0,11 -
11 13.88 terpinoleno 0,09 - 0,05 -
12 14.37 linalool 0,97 0,12 0,22 7,63
13 14.93 ? - - 0,11 -
14 15.04 ? - 0,07 - -
15 15.71 ? 0,13 - - -
16 16.03 ? - 0,08 - -
17 16.43 ? - 1,84 - -
18 17.09 terpin-4-ol 0,13 - 0,12 -
19 17.38 ? - 0,10 - -
20 17.59
α-terpineol
0,60 0,06 0,34 0,74
21 17.75 mirtenal 0,14 - - -
22 18.28 ? - 0,06 - -
23 18.55 ? - 0,12 - -
24 19.89 ? - 0,19 - -
25 21.41 ? - 20,05 - -
26 21.67 ? - 0,03 - -
27 22.97
α-cubebeno
0,36 0,11 0,25 -
28 23.63
ovl α-copaeno/longicicleno
0,28 0,13 0,10 -
29 23.81
α-copaeno
2,86 0,30 - 2,85
30 24.10
β-bourboneno
0,19 - - 1,97
31 24.11 ? - 0,10 - -
32 24.35
β-elemeno
0,36 1,47 0,25 4,18
33 24.78 metileugenol 0,10 0,06 0,07 -
34 24.90 longifoleno 0,33 0,96 0,32 -
35 25.00 ? - 0,19 - -
36 25.20
β-cariofileno
13,54 1,47 6,29 3,85
37 25.31 ? - - 0,31 -
38 25.50
β-gurjuneno
1,11 - - 0,12
39 25.66 ovl aromadrendeno 0,09 0,05 0,12 -
40 25.80 aromadrendeno 1,29 0,40 1,53 -
41 25.95 ? 0,09 0,12 0,23 -
42 26.11 cis-muurola-4(14)5-dieno 0,50 0,31 0,52 -
43 26.25
epi β-santaleno
0,88 0,53 1,40 1,81
44 26.47
γ-gurjuneno
1,38 1,73 2,38 0,81
45 26.68 ? - 0,15 - -
46 26.90
ovl γ-muuroleno
0,76 - - -
47 26.99
γ-muuroleno
3,55 1,72 1,69 1,23
48 27.00 ? - 0,76 - 0,66
49 27.13 ? - - 5,43 -
50 27.13 ovl germacreno D 13,54 - - -
51 27.27
β-selineno
0,72 - 0,57 1,97
52 27.14 germacreno D - 12,10 - -
53 27.72 ? - - 0,09 -
54 27.18 ar-curcumeno - - - 2,09
55 27.44
cis-β-guaieno
0,50 - 0,31 -
56 27.57 biciclogermacreno 7,87 1,18 8,68 5,59
57 27.70
α-muuruleno
3,26 0,90 0,60 1,13
58 27.91
γ-cadineno
1,36 3,03 1,05 3,14
59 28.39
δ-cadineno
7,18 3,49 2,95 5,63
60 28.65 cadina-1,4-dieno 0,38 0,05 0,10 -
61 28.80
α-cadineno
0,33 0,04 0,87 -
62 28.96
α-calacoreno
0,14 0,19 0,14 0,87
63 29.63 ledol 0,26 14,99 11,66 10,95
64 30.00 espatulenol 4,81 1,94 14,17 21,27
65 30.13 cariofileno oxide - - - 17,51
66 30.16 globulol 2,80 0,63 3,87 -
67 30.40 ? 1,58 4,20 1,43 2,36
68 31.28
β-eudesmol
- 0,09 0,22 -
69 31.42 ? 0,32 - - -
70 31.81
α-cadinol
- 0,53 1,26 -
(?): desconhecido; (—): ausente.
Fonte: Manfron, 2005.
6
1.3 MECANISMOS DE DEFESA DO ORGANISMO HUMANO
Todos os seres vivos estão sujeitos a ações nocivas de substâncias de
natureza diversificada que podem comprometer seu estado de saúde. Quando o
agente agressor supera as linhas de defesa ou barreiras naturais exemplificadas
pela pele, mucosa dos tratos gastrintestinal, respiratório e geniturinário, conjuntiva
ocular, invadindo o hospedeiro, nele instala-se e, quando possível, multiplica-se,
causando quadros infecciosos e/ou inflamatórios. O agente agressor pode ser de
natureza física, química ou biológica, destacando-se, nesta última categoria,
microorganismos como bactérias, fungos, protozoários, vírus e parasitas
multicelulares.
Numa infecção localizada, na maioria dos casos, a invasão é limitada por
fatores inerentes ao microorganismo e a agressão ocorre nas células não só do
tecido lesado, como também naquelas pertencentes aos tecidos adjacentes ao foco
de invasão. Quando generalizada, os microorganismos alcançam diversos tecidos,
distantes do foco primário de instalação. Há, também, microorganismos que liberam
toxinas que exercem efeitos nocivos quando carreadas pelo sangue ou linfa para
outros tecidos ou órgãos, além do infectado (Margni, 1990).
Diante de uma lesão celular, independentemente do agente agressor, uma
série de modificações no tecido conjuntivo vascularizado ocorre, com acúmulo de
líquidos e recrutamento de elementos celulares com funções específicas,
particularmente granulócitos neutrófilos ou polimorfonucleares (PMN), e macrófagos,
ambos fagócitos por excelência, que objetivam a eliminação rápida do agente
agressor e a reparação do tecido lesado, caracterizando a resposta inflamatória
aguda (Cotran et al., 1994).
Sob certas circunstâncias, quando o processo reacional agudo não é
suficiente para eliminar o agente causal e/ou reparar os danos locais causados, a
reação inflamatória pode prolongar-se por dias ou mesmo por semanas ou meses,
instalando-se então, um processo reacional crônico, com a infiltração de linfócitos,
plasmócitos, eosinófilos e mastócitos, além dos macrófagos e PMN já presentes
(Cotran et al., 1994).
7
1.4 INFLAMAÇÃO E A RESPOSTA INFLAMATÓRIA
A reação orgânica aguda que se verifica em uma inflamação é,
fundamentalmente, uma resposta de defesa e proteção do organismo lesado contra
o agente agressor e as conseqüências que ele pode vir a causar. É um fenômeno
estereotipado, cujos sinais clássicos rubor, tumor, calor e dor foram primeiramente
descritos por Celsius 178 a.C, sendo que a estes, Galeno adicionou a perda de
função (Cotran et al., 1994). Atualmente, sabe-se que estes sinais são
conseqüências da liberação de substâncias químicas encontradas no local da lesão,
particularmente as citocinas (Sedgwick e Willoughby, 1985; Silva, 1978).
As citocinas inflamatórias são substâncias químicas circulantes no plasma e
importantes mediadores das respostas vascular e celular desencadeadas pelo
estímulo inflamatório agudo. Dentre elas, destacam-se as interleucinas 1 (IL-1), IL-6
e IL-8, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o fator estimulador de colônia de
macrófagos e granulócitos (GM-CSF) (Cassatela, 1995; Springer, 1994; Springer,
1995).
No decorrer de um processo infeccioso ou inflamatório agudo, os leucócitos
circulantes no sangue periférico aproximam-se da parede vascular devido à sua
ativação por mediadores da inflamação, liberados por células presentes na área de
lesão, tais como bactérias, células lesadas ou frações do complemento, passando a
ocupar uma posição mais periférica. Em seguida, aderem-se firmemente, mas de
forma transitória, ao endotélio e atravessam a parede do vaso (Smith et al., 1979).
Após a diapedese, continuam a migrar em direção ao foco inflamatório pelo
processo de quimiotaxia (Dekker e Segal, 2000).
Dessa forma, pelo menos três etapas estão distintamente envolvidas no
desenvolvimento de um processo inflamatório agudo: (1) adesão dos leucócitos ao
endotélio, (2) sua passagem através do mesmo e (3) sua migração em direção ao
estímulo quimiotático (Dekker e Segal, 2000; Mackai e Rosen, 2000).
Uma função crítica da inflamação é a migração de células especializadas
provenientes do sangue periférico para o tecido conjuntivo no qual se situa o foco
inflamatório. Estudos recentes têm demonstrado que os mecanismos moleculares
que recrutam os diferentes tipos de leucócitos para as áreas inflamadas são
similares (Mackai e Rosen, 2000). Esses experimentos também mostram que a
adesão, a transmigração e a locomoção de leucócitos envolvem a ativação, por
ligantes específicos, de diferentes famílias de receptores presentes na superfície
dessas células e na matriz extracelular (Bokoch, 1995; Dekker e Segal, 2000).
8
Das células com grande capacidade de responder a estímulos inflamatórios
destacam-se os granulócitos (GNC) circulantes no sangue periférico. Dentre esses,
há os neutrófilos, que constituem a população celular primária na defesa aguda
contra vários tipos de microorganismos presentes no meio ambiente, acumulando-se
rapidamente no sítio invasivo ou de lesão. Sua participação no processo inflamatório
é multifuncional e envolve (1) o reconhecimento seletivo do agente agressor, (2)
resposta apropriada por meio de locomoção, (3) fagocitose do microorganismo e (4)
sua subseqüente destruição. Para tanto, possuem a habilidade de secretar
substâncias não só capazes de retardar a disseminação da infecção, mas, quando
necessário, também recrutar outros tipos de leucócitos para o foco
infeccioso/inflamatório (Cassatela, 1995).
O neutrófilo é uma célula que participa da defesa inata e, nos tecidos, está
presente em todas as portas de entrada do organismo humano que fazem contato
com o meio externo. Com um tempo de vida média na circulação de
aproximadamente sete horas (Quesenberry e Colvin, 2001), passam a maior parte
desse tempo circulando no sangue periférico, num processo passivo.
Para o mesmo número de neutrófilos que está circulando no leito central do
vaso, tem-se igual quantidade na porção mais periférica, próxima ao endotélio,
representando o compartimento marginal, ou pool marginal. Ainda, para que o
organismo possa atender a uma demanda tecidual extra de PMN como, por
exemplo, no combate a patógenos invasores ou em uma inflamação aguda, a
medula óssea dispõe do pool de reserva, composto por neutrófilos segmentados e
seus precursores imediatos, os neutrófilos bastonetes e os metamielócitos. Assim,
quando necessário, um maior número de neutrófilos pode ser lançado na corrente
circulatória, colaborando com a leucocitose, geralmente acompanhada do aumento
do número de neutrófilos (neutrofilia) e de bastonetes (Lee et al., 1999a).
Em contraste com a reação aguda, a inflamação crônica caracteriza-se por
uma maior infiltração de células mononucleares (MNC), incluindo macrófagos,
linfócitos e plasmócitos, como reflexo de lesão tecidual persistente (Cotran et al.,
1994). Dentre essas células, os macrófagos ocupam posição de destaque
comparável ao papel principal desempenhado pelos PMN na reação aguda.
Os macrófagos são células que se originam dos monócitos circulantes que,
por sua vez e à semelhança dos GNC, são descendentes de progenitores
hematopoiéticos presentes na medula óssea (Lee et al., 1999a). Após diapedese, os
monócitos se distribuem nos mais diferentes tecidos do organismo dos mamíferos
(Reeves e Todd, 2000). Em contraste com um tempo de vida de cerca de 24 horas
9
para os monócitos circulantes, os macrófagos sobrevivem por vários meses, durante
os quais, ao responderem a vários estímulos, especialmente de citocinas, tornam-se
ativados e capazes de exercer inúmeras funções, como proliferação, síntese,
armazenamento e secreção de moléculas biologicamente ativas (enzimas
proteolíticas, componentes do sistema complemento, fibronectina, α
2
-
macroglobulina, fatores de coagulação, prostaglandinas, fatores de crescimento,
citocinas etc), atuam como células apresentadoras de antígenos para linfócitos,
produzem reagentes metabólitos do oxigênio e outras moléculas importantes para a
eliminação de microorganismos (Cotran et al., 1994; Reeves e Todd, 2000).
1.5 QUIMIOTAXIA
O afluxo de leucócitos ao local de injúria, cuja locomoção é direcional e
determinada por substâncias químicas, é denominado quimiotaxia. Necessário se
faz distinguir um fenômeno em que apenas a velocidade ou a freqüência da
locomoção celular é afetada por substâncias químicas, porém o movimento não é
direcional e denomina-se quimiocinese ou, atualmente, ortoquinese (Wilkinson,
1998).
Quimiotaxia, ou o movimento celular direcional a favor ou contra um gradiente
químico, é comum a várias células eucarióticas e implica numa série sucessiva de
eventos que se iniciam com a polarização celular, seguida de extensão da bainha
frontal (pseudopodium ou lamelipodium), fixação ao substrato e retração do corpo
celular. Todos estes eventos dependem da dinâmica do citoesqueleto de actina que
se reorganiza em resposta ao sinal recebido (Wilkinson, 1996).
Os atraentes químicos são, em geral, moléculas pequenas e solúveis que
reconhecem e se ligam a receptores transmembrana específicos, via proteína G,
localizados na superfície dos leucócitos. O sinal quimiotático liberado dessa
interação é o AMPc (adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico), mensageiro intermediário
que ativa vias de sinalização que estimulam a polimerização de actina, produzindo
filamentos ramificados (F-actina) na linha de frente, próxima ao sinal. Esta
polimerização localizada empurra a membrana celular para frente, acompanhada de
contração do pólo posterior, a qual é medeiada pela proteína motora miosina II
(Chung et al., 2001). Na sua forma globular monomérica, a actina é solúvel, mas
quando polimerizada produz filamentos insolúveis de considerável força mecânica.
As miosinas interagem com filamentos de actina e convertem a energia química do
ATP (adenosina trifosfato) em trabalho mecânico, resultando no movimento celular.
10
Portanto, como resultado da ativação de receptores quimioatraentes, os
neutrófilos são estimulados a mover-se, aderir-se, rearranjar seu citoesqueleto e, por
fim, fagocitar microorganismos. Além disso, freqüentemente ocorre degranulação e
ativação da NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato) oxidase, gerando
metabólitos tóxicos do oxigênio (Bokoch, 1995).
As substâncias capazes de induzir quimiotaxia, denominadas
quimioatraentes, não constituem uma classe específica de compostos e podem ter
natureza exógena ou endógena. Dentre as substâncias exógenas que provocam
alterações no comportamento locomotor dos leucócitos encontram-se alguns
produtos de bactérias, como os peptídios N-formilados (f-MLP) (Johansson et al.,
2002; Qu et al., 1995; Rabgaoui et al., 1994); certas citotaxinas como a caseína
(Lewis e Van Epps, 1983; Rabgaoui et al., 1994; Siddiqui et al., 1999; Wang et al.,
2001; Wilkinson, 1974; Wilkinson e Haston, 1988), os derivados de bactérias como
os lipopolissacarídeos (LPS) (Qu et al., 1995), proteínas desnaturadas (Wilkinson e
Haston, 1988). Dentre as substâncias endógenas, as mais conhecidas são as
citocinas, já citadas anteriormente e que, de modo geral, são capazes de estimular
todos os tipos de leucócitos do sangue. Dessas, destacam-se a IL-8, o interferon
gama, o TNF-α, além de componentes do sistema complemento, como as frações
C3a e C5a, os produtos relacionados a lipoxigenação do ácido araquidônico
(leucotrienos), particularmente o LTB4, e o fator de ativação plaquetária (PAF)
(Bokoch, 1995; Cotran et al., 1994; Johansson et al., 2002; Lewis e Van Epps, 1983;
Siddiqui et al., 1999; Wilkinson e Haston, 1988).
1.6 O SISTEMA IMUNITÁRIO
Após a instalação de um agente patogênico, o organismo reage para a
eliminação do mesmo numa ação integrada entre fagócitos, protagonistas da reação
inflamatória, e as células do sistema imunitário.
O local da infecção e o tipo de patógeno são fatores determinantes do tipo de
resposta imunológica que será desencadeada. A resposta imunológica adaptativa
desenvolve-se após o contato entre as células do sistema e o patógeno como, por
exemplo, vírus, bactérias ou protozoários, o que lhe confere caráter de
especificidade (Roitt et al., 2003). Estas células são capazes de identificar e reagir
somente com as moléculas que são estranhas ao organismo.
Outro fator que colabora para a ativação do sistema imunitário adaptativo é o
fato da agressão pelo agente ser reincidente, pois uma característica específica
11
deste sistema é a produção de uma memória imunológica a partir da primeira
infecção (Parham, 2001).
Células do sistema imunitário adaptativo
Devido a suas importantes características de memória, especificidade e
reconhecimento do não próprio, o sistema imunitário adaptativo é muito eficaz na
defesa do organismo. Os tipos celulares que medeiam esta reação são os linfócitos,
em particular os B e T, e as células apresentadoras de antígenos (CAA),
representadas por uma coleção de macrófagos e células dendríticas (Roitt et al.,
2003).
Linfócitos
Principais células responsáveis pela resposta imunológica adaptativa, no ser
humano, as células da linhagem linfóide originam-se a partir das mesmas células-
tronco hematopoiéticas que dão origem aos granulócitos, eritrócitos e plaquetas
presentes, subseqüentemente durante a ontogenia, no saco vitelínico, fígado e
medula óssea (Lee et al., 1999a). Nos indivíduos adultos, são continuamente
produzidos às custas da proliferação controlada das células linfóides primitivas
presentes na medula óssea, as quais dão origem à populações distintas de
linfócitos.
Antes de se tornarem células maduras e capazes de exercer funções
específicas, os linfócitos passam por processos sucessivos para aquisição de
imunocompetência no timo ou na própria medula óssea, denominados órgãos
linfóides primários. Os que requerem um período de diferenciação no timo são
denominados linfócitos T. Outros que continuam a se diferenciar no próprio sítio
produtor emergem como linfócitos B.
Mais de 70% dos linfócitos circulantes são representados pela linhagem T, os
quais participam ativamente na defesa do organismo contra infecções causadas por
agentes intracelulares. Enquanto estão no timo, os linfócitos T em desenvolvimento
(ou timócitos) apresentam o marcador CD3 e diferenciam-se em duas linhagens,
expressando receptores de membrana distintos relacionadas com as suas funções
efetoras, destacando-se as glicoproteínas CD4 e CD8 (Parham, 2001).
A fase de desenvolvimento dos timócitos envolve um exame crítico de
receptores produzidos. A seleção positiva envolve células T que podem reconhecer
peptídeos apresentados por moléculas do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) próprias, enquanto que a negativa elimina as células
12
potencialmente auto-reativas, que poderiam ser ativadas por peptídeos normalmente
apresentados por moléculas MHC na superfície das células saudáveis. É durante a
seleção positiva que as células T CD3, primeiramente duplo-positivas para CD4 e
CD8, irão se tornar células T CD3 de positividade única para CD4 ou CD8, sendo
que as CD4 interagem somente com moléculas MHC de classe II, enquanto as CD8
interagem somente com moléculas MHC de classe I (Parham, 2001).
Como é no tecido linfóide periférico que ocorrem as maiores chances dos
linfócitos T encontrarem antígenos, após a fase de amadurecimento no timo, essas
células, agora imunocompetentes, ficam circulando entre a corrente sangüínea e o
tecido linfóide periférico até encontrarem o seu antígeno específico, quando, então,
são induzidas a proliferar e se diferenciar em células T efetoras (Janeway, 2002).
Fazem parte do tecido linfóide periférico, também chamado secundário, os
linfonodos, a polpa branca do baço, o tecido linfóide associado ao intestino (GALT) e
o tecido linfóide associado a mucosas (MALT), representado pelas tonsilas, placas
de Peyer, apêndice, tecidos brônquico e mamário.
O encontro com um antígeno específico provoca a fase final do
desenvolvimento e diferenciação dos linfócitos T, onde as células CD8 tornam-se
células T citotóxicas para as células que expressam esses antígenos protéicos,
enquanto as células CD4, sob influência de citocinas, tornam-se células T auxiliares
subtipos 1 ou 2 (Th1 e Th2, respectivamente), sendo que o tipo celular que
predominará dependerá do patógeno e do tipo de resposta imunológica requerida
(Parham, 2001).
Em contraste com o processo de amadurecimento dos linfócitos T, os
precursores dos linfócitos B são induzidos a diferenciar dentro da própria medula
óssea, influenciados por várias citocinas produzidas pelas células estromais. No
sangue periférico, representam de 5 a 15% da população de linfócitos circulantes.
Enquanto sua ativação por antígenos protéicos requer a presença de linfócitos T, a
qual é facilitada pela expressão de moléculas classe II do sistema HLA (Human
Leukocyte Antigen), antígenos de natureza lipídica, glicolipídica ou constituídos de
proteínas polimerizadas ou carboidratos estimulam diretamente as células B.
Macrófagos
Macrófagos fazem parte do sistema fagocitário mononuclear que se constitui
de células de origem medular, incluindo os monócitos que trafegam no sangue
periférico e os macrófagos tissulares. Dependendo do tecido ou órgão onde se
encontram, recebem diferentes nomes, como as células de Kuppfer do fígado, os
histiócitos dos linfonodos, os macrófagos alveolares e os esplênicos, quando nos
13
pulmões e no baço, respectivamente. Da circulação, os monócitos migram para os
tecidos, onde se transformam em macrófagos, células com elevada capacidade
fagocitária, responsáveis pela remoção de restos celulares e materiais estranhos
particulados (Reeves e Todd, 2000).
Os macrófagos podem ser ativados, processo este que culmina com aumento
do seu tamanho, elevação dos níveis de enzimas lisossomais, metabolismo ativo e
grande habilidade de fagocitar e matar microorganismos. Sua ativação pode ser
efetivada por meio de toxinas bacterianas, moléculas de adesão, citocinas
secretadas por linfócitos T ativados e outros mediadores químicos presentes nas
reações inflamatórias (Lee et al., 2003; Scott et al., 2003).
Após ativação dos macrófagos, elementos celulares centrais da inflamação
crônica como já citado, estes passam a sintetizar e secretar várias moléculas
biologicamente ativas, coletivamente chamadas citocinas, que são importantes
mediadores das respostas inflamatórias e imunológicas (Homolka et al., 2003).
Particularmente importantes são as citocinas produzidas que têm a habilidade de
ativar linfócitos, os quais passam também a secretar mediadores, fechando e
amplificando um círculo de respostas biológicas responsáveis não só pela
eliminação de agentes invasores, mas também envolvidas nos processos para
garantir o restabelecimento do organismo e desenvolver resistência.
Como células apresentadoras de antígenos, os macrófagos têm a capacidade
de reconhecer e, subseqüentemente, internalizar antígenos, processá-los e,
posteriormente, expor fragmentos destes para os linfócitos T por meio de moléculas
de superfície específicas do MHC (Roitt et al., 2003).
Dessa forma, os macrófagos desempenham funções centrais na resposta
imunológica, assim como o fazem na resposta inflamatória. Primeiro eles são
necessários para processar e apresentar antígenos aos linfócitos T
imunocompetentes, pois, ao contrário das células B, as células T não são ativadas
por antígenos solúveis. Segundo, eles produzem numerosas citocinas, dentre elas a
IL-1 e o TNF-α, capazes de amplificar as respostas inflamatória e imunitária.
Também, são elementos capazes de lisar células tumorais pela produção de
metabólitos tóxicos e enzimas proteolíticas, sendo importantes na vigilância
imunológica (Cotran et al., 1994).
14
Funções dos elementos celulares envolvidos na resposta imunológica
O modo pelo qual um antígeno é reconhecido pelos linfócitos T e B é
específico e isso reflete as diferentes funções dessas células após sua ativação pelo
antígeno.
Um linfócito B ativado pode transformar-se num plasmócito produtor de
imunoglobulinas com a mesma especificidade para o receptor do linfócito que lhe
deu origem. A função desses anticorpos é ligar-se diretamente ao antígeno que lhe
deu origem, com a finalidade de neutralizar sua atividade ou de desencadear
mecanismos de defesa que culminem na sua eliminação. Na prática, isso significa
que células B podem interagir com o antígeno na sua forma nativa, sem
modificações (Brostoff e Male, 1994; Reeves e Todd, 2000).
Já os linfócitos T regulam a atividade das outras células do sistema imunitário
ou eliminam as células infectadas. Portanto, interações com outros tipos celulares
são necessárias para que as células T possam desempenhar sua função. Esta é
uma das razões que explicam porque, em contraste com os linfócitos B, os T podem
reconhecer e ser ativados por antígenos ligados a glicoproteínas específicas do HLA
presentes na superfície das CAA, codificadas pelos genes do MHC, processo que é
denominado duplo reconhecimento, pois receptores de células T não se ligam ao
antígeno ou às moléculas do HLA independentemente, mas à combinação de
ambos.
Uma das funções básicas das CAA é ativar linfócitos T e eliminar, por
endocitose, células alvo que foram mortas por estes, ou eliminar antígenos que
foram neutralizados por anticorpos. Muitos antígenos em seu estado natural não
conseguem se associar eficientemente às moléculas do HLA e o fazem somente
após terem sido processados pelas CAA. Este processamento envolve sua parcial
degradação enzimática, liberando unidades peptídicas de tamanho e seqüência
apropriada para se ligarem às moléculas do HLA e, então, servirem como epítopos
para ligação de linfócitos T. Relevante é o fato de que esses determinantes
antigênicos podem ser originados de qualquer parte do antígeno original e um
corolário disto é que linfócitos T e B podem interagir com epítopos totalmente
diferentes e, ainda assim, demonstrar especificidade para o mesmo antígeno
(Brostoff e Male, 1994; Reeves e Todd, 2000).
É importante ressaltar que todos os tipos celulares acima citados também
têm, como função, a liberação de citocinas, que estimulam e amplificam a resposta
ou a suprimem quando o agente for totalmente erradicado.
15
Dessa forma, a ativação e o desempenho de funções pelos linfócitos T e B
requerem interação recíproca, assim como com outros tipos celulares. Como já visto,
as oportunidades para que esses contatos ocorram são maximizadas pela
recirculação dos linfócitos através de todo o organismo e pela sua manutenção nos
órgãos linfóides secundários, levando ao desenvolvimento do vasto repertório
imunológico observado em indivíduos normais (Reeves e Todd, 2000).
Interação de linfócitos e antígenos
Os eventos celulares que decorrem da ativação de um linfócito são
denominados coletivamente de transformação blástica e as células resultantes deste
processo são referidas como células efetoras da resposta imunológica.
Morfologicamente, são caracterizados como linfoblastos e possuem elevada
capacidade proliferativa. Como resultado, observa-se um aumento do número de
células, da produção e secreção de citocinas, assim como de expressão de
receptores específicos.
As células efetoras originadas da ativação de linfócitos T CD4 proliferam,
dando origem a células auxiliares, responsáveis pela propagação da resposta
imunológica por meio da produção e secreção de interleucinas. Os linfócitos T CD8,
após contato com o antígeno, ativam-se e proliferam, originando também células
capazes de produzir grandes quantidades de citocinas, que são secretadas para a
eliminação do agente agressor.
No caso de linfócitos B, após transformação, muitos proliferam, dando origem
aos plasmócitos, células especializadas na síntese de imunoglobulinas que são,
então, secretadas como anticorpos livres, como já citado anteriormente.
Outros linfoblastos formam uma população de memória específica para o
antígeno que induziu a resposta primária, readquirindo o aspecto morfológico do
linfócito inicial. São essas células que, quando re-expostas ao mesmo antígeno ou a
outro cuja estrutura antigênica seja muito semelhante, produzem uma rápida e
vigorosa resposta imunológica, chamada secundária (Reeves e Todd, 2000).
Ativação e proliferação de linfócitos
Ativação de linfócitos decorre da interação entre um antígeno e o receptor
presente na superfície celular com o qual ele pode interagir. Em células CD4, por
exemplo, este evento culmina com a proliferação, diferenciação e produção de
citocinas que medeiam as funções específicas de células T efetoras, como já citado.
16
Eventos subseqüentes, que ocorrem em segundos ou minutos após a interação
ligante-receptor, incluem mudanças no fluxo de cátions monovalentes (Na
+
e K
+
) e a
ativação de metiltransferases. Ao mesmo tempo, síntese e utilização de fosfolipídeos
aumentam, envolvendo fosfatidil inositol, um constituinte dos fosfolipídeos de
membrana. Influxo de Ca
++
é central na ativação de linfócitos e ocorre em menos de
cinco minutos após interação do mitógeno fitohemaglutinina, por exemplo, com
receptores presentes na superfície de linfócitos humanos. Após algumas horas
dessa interação ligante-receptor, a síntese de proteínas aumenta, alcançando um
pico entre 48 e 72 horas. Neste período, ocorre aumento da síntese de RNA, assim
como há síntese de várias proteínas (Cooper, 1972). O conteúdo de RNA em
linfócitos dobra em 48 horas e reflete-se em alterações morfológicas distintas da
célula. Finalmente, aumento da síntese de DNA, a marca registrada da proliferação
celular, inicia-se após cerca de 36 horas, atingindo níveis máximos entre 48 e 72
horas (Greaves e Janossy, 1972).
Para que a proliferação celular ocorra, fatores de transcrição, que são
ativados simultaneamente à interação ligante-receptor, representam intermediários
essenciais, os quais traduzem e direcionam sinais extracelulares em respostas
transcricionais específicas. A regulação combinada da transcrição envolve
complexos multiprotéicos que se ligam de forma cooperativa a regiões específicas
do DNA alvo. Esta interação permite a convergência de diferentes sinais para uma
região definida do DNA, a qual, por sua vez, exerce controle regulatório rigoroso
sobre a expressão dos genes alvos em resposta aos sinais recebidos.
Neste contexto, complexos formados por fatores de transcrição da família
NFATc, por exemplo, junto com proteínas AP-1 e ras, integram vias de sinalização
dependentes de Ca
++
, as quais regulam a expressão de genes que codificam
proteínas imunomodulatórias como IL-2, IL-4, IL-3/GM-CSF, TNF-α, CD40 e Faz
(Feske et al., 2000; Rao et al., 1997; Trama et al., 2000).
A replicação de linfócitos T é muito particular e é determinada pela interação
de IL-2 com seus receptores (IL-2-R) em níveis significativos para desencadear esta
ação. Entretanto, células T não expressam IL-2-R a menos que sejam estimulados
por antígenos, anticorpos monoclonais específicos para células T, lectinas
mitogênicas ou forbol éster, por exemplo. Além disso, uma vez exposta a esses
agentes, cada célula T expressa IL-2-R de forma individual, entrando em fases
proliferativas do ciclo celular de forma assincrônica. Se níveis de IL-2 não se
mantiverem contínuos, a expressão de IL-2-R se mantém, mas a síntese de DNA
17
não ocorre, uma vez que é a interação com IL-2-R o fenômeno crucial para que
ocorra a replicação do DNA (Cantrell e Smith, 1984).
Um outro ponto de relevância é que a expressão de IL-2-R é dependente da
presença de antígeno e a retirada do estímulo do meio leva à queda progressiva de
seus níveis. Em paralelo, há o declínio, também progressivo, da proliferação celular
e todas as células, eventualmente, passam a se apresentar na fase G
o
do ciclo
celular, mesmo na presença de concentrações saturantes de IL-2 (Smith e Cantrell,
1985).
Resposta de linfócitos a mitógenos
Certas substâncias possuem a habilidade de ativar e, subseqüentemente,
induzir a proliferação de linfócitos T, B ou de ambos in vitro, sendo genericamente
denominados mitógenos (Gery et al., 1972; Gery e Waksman, 1972; Janossy e
Greaves, 1972; Oppenheim e Rosenstreich, 1976). A Tabela 2 mostra uma seleção
dessas substâncias e sua especificidade com referência à população estimulada.
Tabela 2. Mitógenos: características e células alvo.
Mitógeno Fonte
Tamanho
molecular (D)
Células Alvo Espécie(s)
Concanavalina A
(Con A)
Canavalia
einsformis
55.000 Linfócitos T
humana,
camundongo
Fitohemaglutinina
(PHA)
Phaseolus
vulgaris
140.000 Linfócitos T
humana,
camundongo
Lipopolissacarídeo
(LPS)
Bactérias gram
negativas
1-24x10
6
Linfócitos B Roedores
Pokeweed
mitogen (PWM)
Phytolacca
americana
32.000
Linfócitos T e
B
Humana e
camundongo
Dextran sulfato - 500.000 Linfócitos B -
Adaptado de Myers, 1995.
Enquanto a resposta dos linfócitos a antígenos in vivo é específica, gerando
amplificação clonal, sua resposta a mitógenos in vitro é inespecífica e influencia,
simultaneamente, um grande número de células, levando-as a sofrer transformação
blástica e, posteriormente, proliferar.
18
Diferente do que acontece in vivo, esse estímulo à proliferação não depende
de células apresentadoras de antígenos, embora os mesmos mecanismos
bioquímicos estejam aparentemente envolvidos (Burgermeister et al., 2003). Esta
propriedade favorece estudos experimentais e Fitohemaglutinina (PHA) e
Concanavalina A (ConA), lectinas extraídas e purificadas de plantas que estimulam
sub-populações de células T, têm sido usadas como mitógenos para estudos de
proliferação dessas populações in vitro e a resposta resultante pode ser utilizada
para qualificar e quantificar a imunocompetência dessas células (Myers, 1995).Como
já visto, o primeiro passo para a ativação de um linfócito reside na interação de
receptores de superfície com um agente estimulante. A interação de um mitógeno
com o receptor das células T (TcR), por exemplo, também inicia, na célula, eventos
que envolvem o recrutamento de íons cálcio e a ativação simultânea das enzimas
tirosina quinases citossólicas fosfolipases Cγ e A
2
, proteína C quinase (PKC),
proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e calcineurina. Estas, por via de
cascatas metabólicas específicas, produzem sinais direcionados ao núcleo,
promovendo a transcrição de fatores pró-mitóticos. Estes, por sua vez, conduzem os
eventos da proliferação e de síntese de IL-2, a qual é o principal mediador químico
da amplificação da resposta imunológica (Cooper, 1972; Feske et al., 2000; Rao e
Chakrabarti, 2005; Smith e Cantrell, 1985; Trama et al., 2000).
São várias as metodologias in vitro utilizadas para quantificar a ativação e
proliferação celulares. Entre estas estão os ensaios que incluem a incorporação de
nucleotídeos radioativos (Brunner et al., 1968; Gillis et al., 1978), a redução de sais
tetrazólio (Mosmann, 1983), a incorporação de agentes fluorescentes (Lyons, 2000),
a incorporação de análogos de pirimidina (Kubbies et al., 1985) e a análise por
citometria de fluxo, tecnologia que inclui métodos para a avaliação de efeitos sobre a
população analisada, como, por exemplo, ativação e proliferação celulares, para a
identificação de eventuais modificações que ocorrem dentro e fora das células e na
análise das substâncias produzidas e secretadas pelas células em estudo (Shapiro,
1985).
Esta versatilidade deriva da múltipla e independente quantidade de análises
das características físicas e químicas das células, as quais são individualmente
conduzidas por um canal de corrente fluída, que intersepta um ou mais feixes de luz
provenientes de um raio laser. Ao passarem pelos raios, as células causam
dispersão da luz em várias direções, a qual depende do tamanho e da estrutura
interna de cada célula (Macey, 1994). Também, moléculas fluorescentes, quando
19
ligadas às células, podem ser excitadas e, subseqüentemente, emitir luz de acordo
com a natureza da molécula fluorescente (Assenmacher et al., 1995).
A luz dispersa e/ou a fluorescência emitida são, então, coletadas por
diferentes sensores, os quais, por sua vez, convertem-nas em sinais elétricos que
são amplificados e transferidos a processadores matemáticos. O feixe de luz que
passa pela partícula com um mínimo de desvio está relacionado com o tamanho
celular (forward light scatter - FSC), enquanto aquele que capta o desvio ortogonal
aos eixos do fluído celular e do raio laser (side light scatter - SSC), relaciona-se com
a complexidade interna da célula, em particular sua granularidade (Macey, 1994;
Robinson, 1993; Shapiro, 1985).
1.7 REGIÕES NUCLEOLARES CORADAS PELA PRATA – AgNOR
Regiões nucleolares organizadas (NOR) são alças de DNA localizadas nos
braços curtos dos cromossomos acrocêntricos humanos 13, 14, 15, 21 e 22, as
quais codificam RNA ribossomal (Crocker, 1990, 92; Derenzini e Ploton, 1991;
Mamaev e Mamaeva, 1990). Durante a intérfase, um NOR origina um nucléolo
(Junera et al., 1995), cujo tamanho e forma variam entre diferentes tipos celulares e
mesmo entre células iguais, em função do estado de proliferação celular
(Goodpasture e Bloom, 1975).
A técnica de impregnação pela prata (Goodpasture e Bloom, 1975; Howell e
Black, 1980; Ploton et al., 1986) para demonstração de NOR (AgNOR) é empírica e,
aparentemente, forma complexos entre proteínas nucleolares diferentes das
histonas, mas envolvidas na regulação da transcrição ou processamento do
transcrito primário, localizadas dentro dos nucléolos, e a prata (Crocker, 1990, 92;
Derenzini e Ploton, 1991; Mamaev e Mamaeva, 1990). As duas proteínas envolvidas
na biogênese ribossomal, nucleolina e B23 (Tuteja e Tuteja, 1998), parecem ser o
principal substrato para a reação de coloração em células interfásicas (Roussel e
Hernandez-Verdun, 1994).
A impregnação pela prata foi originalmente utilizada para demonstrar NOR de
cromossomos, para avaliar sua função e para a identificação de cromossomos em
preparações citogenéticas (Goodpasture e Bloom, 1975). A técnica foi simplificada e
aplicada a secções histológicas por Ploton e colaboradores (1986) e,
subsequentemente, popularizada especialmente por Crocker (1990). Os AgNOR
podem ser visualizados ao microscópio óptico como pontos castanhos ou negros,
20
bem definidos, que, nas células interfásicas, estão localizados exclusivamente nos
nucléolos (Derenzini et al., 1990; Derenzini e Ploton, 1991).
O número de NOR expressos pelos tecidos parece estar relacionado à taxa
de proliferação e diferenciação celulares, assim como à transformações neoplásicas
(Crocker, 1990, 92; Derenzini e Ploton, 1991; Dervan et al., 1989; Hall et al., 1988;
Hall e Levison, 1990; Leek et al., 1991; Mamaev e Mamaeva, 1990; Raymond e
Leong, 1989; Trere et al., 1991; Trere et al., 1989), ou seja, parece estar relacionado
à atividade mitótica (Ivanyi et al., 1992). Neste contexto, Crocker e outros
pesquisadores têm demonstrado sua utilidade no diagnóstico de patologias pela
demonstração do potencial neoplásico e para avaliação do prognóstico e
agressividade de neoplasmas malignos (Cardillo, 1992; Crocker, 1990, 92; Derenzini
e Ploton, 1991; Derenzini et al., 1988; Mamaev e Mamaeva, 1990; Raymond e
Leong, 1989; Trere et al., 1991). Por exemplo, foi demonstrado que células
cancerosas de próstata são caracterizadas por número elevado de AgNOR,
comparados às células benignas ou hiperplásicas correspondentes (Ploton et al.,
1986).
Estabeleceu-se, também in vitro, a correlação inversa entre o tamanho dos
AgNOR e o tempo de duplicação celular (Derenzini et al., 1990; Ofner et al., 1992;
Trere et al., 1989). Estas observações foram confirmadas em modelos animais, onde
a diminuição de AgNOR contrasta com o aumento do tempo de duplicação de
massa tumoral em ratos atímicos (Trere et al., 1997). Mais recentemente, modulação
experimental da duração do ciclo celular pela temperatura demonstrou que o
tamanho dos AgNOR diminui quando o ciclo celular é estendido (Canet et al., 2001),
sugerindo que seu tamanho pode ser um marcador da velocidade do ciclo celular.
Três métodos têm sido usados para a avaliação quantitativa de AgNOR:
método manual de contagem, método morfométrico e análise por citometria de fluxo.
O método manual de contagem consiste na enumeração dos precipitados argênticos
diretamente observados ao microscópio de luz em aumento de 1000x (Trere, 2000);
neste contexto, Crocker e colaboradores recomendam considerar como um único
AgNOR todos os precipitados que não podem ser resolvidos como NOR individuais
(Crocker et al., 1989). Já o método morfométrico consiste de medida automática ou
semi-automática da área ocupada pelas estruturas impregnadas pela prata através
de análise de imagem computadorizada (Trere et al., 1995). Mais recentemente,
Jacquet e colaboradores usaram a citometria de fluxo para caracterizar a presença e
o tamanho de AgNOR (Jacquet et al., 2001), uma vez que essa metodologia tem a
capacidade de definir com maior precisão do que as outras, populações de acordo
21
com o seu tamanho (FSC), além da sua complexidade interna (SSC), como
anteriormente descrito.
De especial interesse, os produtos extraídos de plantas medicinais continuam
a representar uma diversidade química única, a qual continuará a ser uma fonte
importante de compostos-modelo para programas de investigação clínica, iniciados
a partir da observação das espécies de plantas regionais popularmente utilizadas.
Devido à importância do gênero Baccharis destacada nesta introdução e aos poucos
relatos sobre atividades biológicas de seus óleos essenciais, as espécies B.
articulata, B. crispa, B. dracunculifolia e B. gaudichaudiana tornaram-se alvo de
nosso interesse no sentido de explorar o potencial medicinal desses óleos em
ensaios in vitro.
22
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar atividades biológicas in vitro de óleos essenciais de Baccharis
articulata, B. crispa, B. dracunculifolia e B. gaudichaudiana, Asteraceae, espécies de
carquejas de uso medicinal.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
! Avaliar a toxicidade dos óleos essenciais sobre leucócitos humanos
! Verificar os efeitos dos óleos essenciais de espécies Baccharis sobre a
quimiotaxia espontânea de granulócitos e naquela induzida por caseína
! Avaliar o potencial imunomodulatório dos óleos essenciais de espécies Baccharis
sobre a transformação blástica e proliferação de linfócitos humanos, basal e
estimulada por fitohemaglutinina
! Investigar atividades antibacterianas dos óleos essenciais de espécies de
Baccharis contra Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa e Escherichia coli, usando o método de difusão em ágar.
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os sais e reagentes utilizados neste trabalho são de procedência Merck,
Sigma ou Reagen, salvo indicação contrária. Para o preparo das soluções, utilizou-
se água obtida pelo sistema Puritech / Permution.
As soluções foram preparadas e em seguida esterilizadas (1) por calor úmido
(autoclavação a 121ºC, trinta min, 1atm) ou (2) por filtração (0,22µm – Acrodisc) e,
posteriormente, armazenadas em temperaturas apropriadas para sua conservação
(temperatura ambiente – T.A., 4 - 8ºC ou a –20ºC), ao abrigo de luz, conforme
indicado.
3.1 SOLUÇÕES
Solução salina fisiológica
Cloreto de sódio 150mmol/l em água.
Solução salina tamponada com fosfatos (PBS)
(Dacie e Lewis, 1995)
A solução tampão foi preparada dissolvendo-se NaH
2
PO
4
.2H
2
0 (150mmol/l),
Na
2
HPO
4
(150mmol/l) e NaCl (154mmol/l) em água. Após ajuste do pH para 7,2 –
7,4 com solução de NaOH 1N, procedeu-se à esterilização por autoclavação e
armazenamento a 4 – 8ºC.
Solução de azul de tripano a 0,4% (p/v)
Azul de tripano em solução salina tamponada com fosfatos.
PBS suplementado (PBSs)
PBS foi suplementado, em condições assépticas, na hora do uso, com soro
albumina bovina (BSA) 0,25% (p/v), glucose 0,1% (p/v), CaCl
2
(0,9mmol/l) e MgCl
2
(0,5mmol/l).
Solução hemolisante de Gey
Solução A: NH
4
Cl (654,20mmol/l), KCl (24,83mmol/l), Na
2
HPO
4
.H
2
0
(6,53mmol/l), KH
2
PO
4
(0,88mmol/l), glucose (27,77mmol/l), vermelho de fenol
(0,05g/l).
Solução B: MgCl
2
.6H
2
0 (2,06mmol/l), MgSO
4
.7H
2
0 (0,56mmol/l), CaCl
2
(3,42mmol/l).
24
Solução C: NaHCO
3
(26,78mmol/l).
O pH de cada solução foi ajustado para 7,2 – 7,4 com solução de NaOH 1N e
os reagentes foram conservados a 4ºC. No momento do uso, a solução hemolisante
foi preparada na proporção de 4:1:1:14 para as soluções A, B, C e água,
respectivamente.
Solução de caseína a 5 % (p/v) (Siddiqui et al., 1999)
Caseína em pó foi dissolvida em PBS (50mg/ml) e aquecida a 56
o
C por dez
min. A solução foi resfriada rapidamente a 4
o
C, centrifugada a 1300g por cinco min
para remoção de partículas insolúveis, fracionada em alíquotas e armazenada à
temperatura de –20ºC, sendo descongelada apenas na hora do uso.
Meio RPMI 1640
RPMI 1640 (Gibco) em pó foi dissolvido em água conforme instruções do
fabricante e suplementado com 3g/l de bicarbonato de sódio. O meio foi, então,
esterilizado por filtração, usando-se o sistema a vácuo Sterifil, Millipore, com filtro de
0,22 µm de diâmetro.
Meio RPMI suplementado com 10% (v/v) de soro humano
No momento do uso, soro humano obtido de uma mistura de soros
provenientes de sangue de, pelo menos, vinte doadores, foi acrescentado ao meio
RPMI 1640, na proporção de 1:10, em condições de esterilidade.
Meio com fitohemaglutinina (M-PHA)
Meio para cariótipo comercial (Cultilab, Campinas/SP), contendo PHA em
RPMI 1640, HEPES e soro fetal bovino; conservado a temperatura de -20ºC e ao
abrigo de luz, conforme instruções do fabricante.
Solução de H
2
SO
4
1% (v/v)
Ácido sulfúrico P.A., na proporção de 1:100 em água.
Fixador de Carnoy
Etanol absoluto, clorofórmio e ácido acético foram misturados na proporção
de 6:3:1, respectivamente e, mantidos em temperatura ambiente.
25
Solução de Gelatina
Gelatina 2% (Sigma) (p/v) foi dissolvida em solução de ácido fórmico 1% (v/v)
e, após vinte minutos a temperatura ambiente, a solução foi filtrada em papel de filtro
Inlab tipo 30, no mesmo dia do uso.
Solução de Nitrato de prata
Nitrato de prata 50% (p/v) foi dissolvido em água destilada, imediatamente
antes do uso.
Solução de Trabalho
Solução foi preparada no momento do uso através da mistura de uma parte
da solução de gelatina 2% com duas partes da solução de nitrato de prata 50%.
Solução de Hipossulfito de Sódio
Hipossulfito de sódio 5% (p/v) foi dissolvido em água destilada e a solução foi
mantida a temperatura ambiente.
Solução de Verde de Malaquita
Verde de Malaquita 3% (p/v) foi dissolvido em água destilada e a solução foi
mantida a temperatura ambiente.
3.2 ENSAIOS DE SOLUBILIZAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
Óleos essenciais foram extraídos das partes aéreas floridas de B.
dracunculifolia D.C., coletada na região de Vila Velha, Ponta Grossa em fevereiro de
2002; B. articulata (Lam.) Pers., em Campo Magro, em setembro de 2001; B. crispa
Sprengel., em Campo Largo, em fevereiro de 2002; e B. gaudichaudiana D.C., na
localidade de Inácio Martins, em outubro de 2001, todos no estado do Paraná. Os
exemplares foram submetidos à confecção de exsicatas, identificadas por
especialistas e os representantes equivalentes estão registrados no Herbário do
Instituto de Ciências Naturais da UFRGS sob os seguintes números: B.
dracunculifolia – ICN n.° 122946, B. articulata – ICN n.° 122945, B. crispa – ICN n.°
122944 e B. gaudichaudiana – ICN n.° 122943. O material coletado foi devidamente
processado para a realização do estudo morfo-anatômico e dos métodos de análise
de fármacos vegetais. Cem gramas das partes aéreas secas em estufa a 40°C e
fragmentadas foram submetidas à destilação por arraste a vapor pelo aparelho de
26
Clevenger para essências menos densas que a água por aproximadamente 5 horas.
Os óleos essenciais obtidos foram, então, tratados com sulfato de sódio anidro para
retirada de humidade residual e armazenados em frascos âmbar a 4°C.
Testes para avaliar a solubilidade dos óleos essenciais das espécies de
Baccharis incluídas neste trabalho foram realizados com PBS acidificado com HCl
(pH=6,8), acetona, etanol e dimetilsulfóxido (DMSO).
Diluições seriadas foram realizadas nos solventes, em PBS, PBSs e RPMI
1640 suplementado. Na escolha dos solventes, levou-se em consideração que
ensaios posteriores seriam realizados em meio aquoso e com a utilização de células
sanguíneas humanas. As diluições dos óleos essenciais para a realização das
análises subsequentes sempre foram preparadas imediatamente antes do uso.
3.3 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Para avaliação do efeito da temperatura sobre a volatilidade dos compostos
químicos presentes no óleo essencial de B. dracunculifolia, utilizou-se cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE). Para tanto, o óleo essencial foi diluído em etanol
(5µl/ml) e incubado a 37°C durante cinco dias em placa estéril de 96 cavidades. As
análises foram realizadas antes (1º dia) e após três e cinco dias de incubação a
37°C, utilizando-se o equipamento Varian, bomba Prostar 210 (série 02038),
detector UV-VIS Prostar 320 (série 01453), módulo organizador, válvula rheodyne,
Programa Workstation Star 6.0. A coluna utilizada foi Microsorb-MV 100 C-18 de 250
mm, tamanho de partícula de 5µm e diâmetro interno de 4,6mm. O loop utilizado foi
de 20 µl. Foram utilizados reagentes grau HPLC, sendo a fase móvel constituída de
água:acetonitrila (11:9) (Sharma e Sharma, 2001), a qual foi sonicada durante trinta
minutos antes do procedimento experimental. As amostras foram analisadas em
209, 217 e 237nm, com fluxo de 1ml/min, durante 120 minutos, após varredura entre
200 e 400 nm. As análises sem incubação (controle) e após cinco dias de incubação
a 37°C foram realizadas no mesmo dia, portanto, nas mesmas condições
experimentais.
3.4 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS HUMANOS
O protocolo para obtenção de leucócitos humanos foi submetido à apreciação
do Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Setor de Ciências da Saúde
da UFPR sob registro CEP/SD: 039.SI.003/04-01 e aprovado em abril de 2004.
27
Amostras de sangue periférico de indivíduos voluntários sadios (10ml), após
consentimento informado, colhidas em seringas estéreis e anticoaguladas com
heparina, foram utilizadas para obtenção das diferentes populações de leucócitos
humanos.
3.4.1 Separação das populações de leucócitos humanos
Células mononucleares (MNC: linfócitos e monócitos) foram separadas dos
granulócitos (GNC: polimorfonucleares, eosinófilos e basófilos) por meio de
centrifugação, usando-se Ficoll-Paque
TM
PLUS 1,077g/cm
3
(Amersham,
Biosciences). Após centrifugação a 200g por dez minutos a T.A., o plasma rico em
plaquetas foi retirado e o volume original reconstituído com PBS. Nova centrifugação
a 800g por 25 minutos permitiu a separação do creme leucocitário, que foi
submetido ao gradiente de densidade. Com centrifugação de 200g por trinta minutos
a T.A., os MNC recuperados da interface do gradiente foram lavados duas vezes
com PBS (800g/cinco minutos), ressuspensos em RPMI suplementado e a
concentração ajustada para 10
6
células/ml, após contagem em hemocitômetro de
Neubauer. Os granulócitos recuperados do sedimento após lise dos eritrócitos com
solução hemolisante de Gey, foram lavados duas vezes com PBS (800g/cinco
minutos), ressuspensos em PBSs, enumerados com o auxílio de um hemocitômetro
e sua concentração igualmente ajustada para 10
6
células/ml.
3.5 VIABILIDADE E CITOTOXICIDADE CELULARES
A viabilidade dos leucócitos foi avaliada após o processo de isolamento e
durante todas as etapas dos procedimentos metodológicos. Para tanto, usou-se o
teste com azul de tripano (Merchant et al., 1964). Populações de leucócitos isoladas
como descrito anteriormente foram diluídas apropriadamente em solução a 0,4%
(p/v) de azul de tripano em PBS e sua viabilidade observada ao microscópio de luz
(Olympus CH30). As células discriminadas como viáveis apresentavam-se íntegras,
brilhantes, incolores e redondas, enquanto que as não viáveis mostraram-se coradas
em azul, muitas com perda da definição de contorno.
A toxicidade dos óleos essenciais de Baccharis sobre leucócitos humanos foi
avaliada usando-se concentrações crescentes das amostras (10 a 10
-4
µl/ml)
diluídas em solventes apropriados. Para MNC (10
6
células/ml), as amostras foram
incorporadas em etanol e incubadas por cinco dias, a 37°C, em atmosfera de 5-10%
CO
2
. Para GNC (10
6
células/ml), as amostras foram incorporadas em DMSO e
28
incubadas a 37°C por somente cinco horas. Após o período de incubação, o efeito
tóxico foi avaliado com solução de azul de tripano (1:2), como descrito para a
viabilidade.
Quanto aos ensaios que envolviam citometria de fluxo, após o período de
incubação, a viabilidade dos MNC foi observada de acordo com a variação dos seus
parâmetros físicos detectados no citômetro, considerando que células mortas e
restos celulares possuem pequeno tamanho (baixo FSC; ≤ 180) e complexidade
interna média (SSC) quando comparados a células vivas e íntegras (FSC > 200). A
comparação foi realizada entre células MNC do controle em RPMI suplementado e a
mesma população incubada na presença de diferentes concentrações dos óleos
essenciais, localizadas na região R3 dos gráficos de citometria (ver seção de
Resultados).
3.6 PREPARO DE CITOCENTRIFUGADOS
Para observação da composição das frações celulares ensaiadas,
citocentrifugados contendo 8x10
4
células foram preparados através de centrifugação
da suspensão de leucócitos a 1500 rpm por cinco minutos em T.A., sob baixa
aceleração, em citocentrífuga Cytopro (Wescor). Em seguida, as lâminas secas ao
ar foram coradas com May-Grünwald-Giemsa (Dacie e Lewis, 1995) e as células
diferenciadas e enumeradas com auxílio de um microscópio óptico. Fotografias
foram obtidas usando-se o software IMAGE PRO PLUS acoplado ao microscópio.
3.7 COLORAÇÃO DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA
Lâminas contendo citocentrifugados secos ao ar foram recobertas
completamente com corante de May-Grünwald por três minutos; posteriormente, o
corante foi diluído com gotas de água destilada tamponada (pH 6,8) por um minuto.
Em seguida, as lâminas foram recobertas com corante de Giemsa diluído em água
tamponada (1:20) por quinze minutos e, finalmente, lavadas em água corrente e
secas ao ar.
3.8 QUIMIOTAXIA DE GRANULÓCITOS
A quimiotaxia dos granulócitos foi observada em câmaras de Boyden (Lee et
al., 1999a; Wilkinson, 1988), sendo este ensaio realizado em duas etapas.
29
Na primeira série de experimentos, granulócitos humanos (2x10
5
) separados
por gradiente de densidade foram adicionados ao compartimento superior de
câmaras de Boyden e expostos a concentrações crescentes dos óleos essenciais
(10
-2
a 10
-4
µl/ml) incorporados em DMSO (Synth) e adicionados a PBS
suplementado, localizados no compartimento inferior. Filtros de policarbonato
isentos de polivinilpirrolidona (Nuclepore, Neuroprobe), com poros de 5µm de
diâmetro, foram usados para separar os compartimentos. As câmaras foram, então,
incubadas a 37
º
C por noventa minutos e o número de leucócitos que migraram
ativamente para o compartimento inferior foram enumerados com o auxílio de um
hemocitômetro.
Na segunda série de experimentos, os granulócitos foram pré-tratados com
concentrações crescentes de óleo essencial (10
-2
a 10
-4
ul/ml) por trinta minutos, a
37ºC. Em seguida, foram lavados (800g/cinco minutos), ressuspensos em PBSs,
adicionados ao compartimento superior de câmaras de Boyden e estimulados a
migrar contra um gradiente de 0,5% de caseína, presente no compartimento inferior
do sistema. As câmaras foram, então, incubadas a 37
º
C por noventa minutos e o
número de leucócitos que migraram para o compartimento inferior contados.
Dexametasona (10
-3
M) foi utilizada como controle de inibição do procedimento
experimental.
O monitoramento do movimento espontâneo dos leucócitos (controle) e a
influência do solvente sobre a migração de GNC foram realizados com adição de
PBSs e DMSO, respectivamente, no compartimento inferior da câmara.
Os resultados estão expressos como porcentagem média de células
recuperadas do compartimento inferior das câmaras em relação aos resultados
obtidos para o PBSs (Controle) ou aquele induzido por caseína, na ausência de óleo
essencial.
3.9 ENSAIOS DE IMUNOMODULAÇÃO
Para avaliar o efeito dos óleos essenciais das espécies de Baccharis sobre
linfócitos, MNC (10
6
células/ml) foram incubados em RPMI 1640 (Gibco) contendo
10% (v/v) de soro humano e na presença de concentrações crescentes (10
-2
a 10
-4
µl/ml) dos óleos essenciais, em placas estéreis de 96 cavidades (TPP), a 37°C por
cinco dias, em atmosfera de 5-10% de CO
2
(Bier, 1977). Em alguns experimentos,
avaliou-se o efeito dos óleos essenciais sobre MNC na presença de mitógeno,
adicionando-se 10% (v/v) do meio de cultura comercial denominado Meio para
30
Cariótipo enriquecido com fitohemaglutinina (Cultilab-Campinas/SP) à mistura (M-
PHA). Cada ensaio foi realizado em triplicata e, como resultado de cada
experimento, utilizou-se a média da triplicata.
Em alguns experimentos, concentrações específicas dos compostos testados
foram adicionadas somente após 72 horas de incubação das suspensões de MNC
com M-PHA e reincubadas por mais dois dias. Em outros, 10% de M-PHA foi
adicionado às culturas de MNC previamente incubados com concentrações
específicas dos compostos e reincubadas por mais quatro dias (ou 96 horas).
3.9.1 Ativação/proliferação de linfócitos avaliada por citometria de fluxo
Após incubação, as células MNC foram transferidas para tubos de ensaio
apropriados e analisadas com um citômetro de fluxo modelo FACSCalibur, equipado
com laser de Argônio (488nm) e detectores de dispersão para tamanho e
complexidade interna, Becton & Dickinson. Para cada análise, eventos foram
adquiridos por 45 segundos na velocidade média em escala linear e gráficos,
baseados no tamanho (FSC - forward light scatter) e na complexidade interna (SSC -
side light scatter) das células, foram construídos. Delineou-se janelas
discriminatórias para as populações de linfócitos (R1), blastos (R2) e células
mortas/debris celulares (R3). Os dados foram analisados usando-se o software
WinMDI 2.8.
O efeito proliferativo foi avaliado através do índice de proliferação (IP) (Gaines
et al., 1996), onde a média aritmética das triplicatas (X) dos valores obtidos por
ensaio foram aplicadas como a seguir:
A porcentagem de transformação blástica foi avaliada usando-se a média
aritmética das triplicatas (X) dos valores obtidos, como a seguir:
X (células detectadas em R2)
teste
X (células detectadas em R2)
control
e
IP =
TB (%) = 100 (células presentes em R2 – células presentes em R1)
células presentes em R2
31
3.9.2 Ativação de linfócitos avaliada morfologicamente
A morfologia das células de citocentrifugados corados dos diferentes grupos
foi observada sob imersão em microscópio de luz. Linfócitos foram reconhecidos por
seu aspecto morfológico característico, apresentando-se como células
arredondadas, pequenas, mantendo elevada relação núcleo-citoplasmática,
citoplasma geralmente escasso, de coloração azul, ausência de granulação
específica, núcleo arredondado e denso, com cromatina densa com agregados
irregulares e eventual presença de estruturas semelhantes a nucléolos, porém mal
definidos. Linfócitos transformados pela ação da fitohemaglutinina foram
considerados como blastos ou linfoblastos e identificados como células maiores do
que linfócitos não-ativados, citoplasma azul intenso, geralmente vacuolizado, com
Complexo de Golgi desenvolvido, definido como a área não corada ao redor do
núcleo; cromatina delicada, presença de dois ou mais nucléolos visíveis,
proeminentes e delineados, com volume aumentado (Lee et al., 1999a).
3.10 IMPREGNAÇÃO PELA PRATA DE REGIÕES NUCLEOLARES
ORGANIZADAS – AgNOR
Para a realização do ensaio de AgNOR, todo o material foi previamente
desmineralizado, sendo a vidraria utilizada imersa em ácido nítrico 30% durante 24
horas e, posteriormente, lavada exaustivamente com água. Citocentrifugados
preparados a partir da suspensão celular de MNC foram fixados em solução de
Carnoy por trinta minutos. Em seguida, as lâminas foram recobertas com a Solução
de Trabalho e mantidas a 37°C por 25 minutos. Após lavagem em água, foram
imersas em solução de hipossulfito de sódio por 2,5 minutos; após nova lavagem, as
mesmas foram mergulhadas em etanol absoluto por três minutos. Finalmente, o
material foi contracorado com Solução de Verde de Malaquita por dez minutos. Após
desprezar o corante e lavar as lâminas com água, as mesmas foram mantidas no
escuro até sua leitura. A contagem de AgNOR foi realizada sob microscopia de
imersão de acordo com os critérios sugeridos por Shome e Khurana (1999), ou seja:
AgNOR Tipo I: precipitados pequenos, arredondados e bem delimitados;
AgNOR Tipo II: precipitados maiores, disformes;
Complexa: presença das estruturas do Tipo I e Tipo II na mesma célula.
32
3.11 ATIVIDADE SOBRE O CRESCIMENTO BACTERIANO
A atividade dos óleos essenciais de Baccharis foi investigada frente às cepas
de Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 25922).
3.11.1 Reativação da viabilidade e competência dos microorganismos
Cepas de bactérias mantidas a -20°C em glicerol:TSB (1:2) foram inoculadas
em ágar Cled (Becton Dickinson) e incubadas a 36°C por 24 horas. Colônias
isoladas foram, então, individualmente inoculadas em TSA inclinado (Becton
Dickinson), incubadas a 36°C por 24 horas e mantidas em geladeira por até quatro
semanas. A partir do TSA, foram feitos subcultivos em ágar Mueller Hinton (Oxoid) e,
após 24 horas de incubação a 36°C, três a cinco colônias isoladas de cada bactéria
foram transferidas para frasco contendo salina estéril e a concentração bacteriana
ajustada de acordo com o tubo 0,5 da escala de McFarland, correspondente a
1,5×10
8
UFC/ml.
3.11.2 Teste de difusão em ágar
O teste de difusão em ágar foi realizado segundo metodologia descrita por
Hindler (1998), com algumas modificações. A suspensão bacteriana, na
concentração equivalente ao tubo 0,5 de McFarland, foi inoculada com auxílio de
zaragatoa, homogeneamente, em placas de Petri contendo ágar Mueller Hinton. Os
óleos essenciais diluídos em etanol (Carlo Erba Reagents), nas concentrações de
1,25µl, 2,5µl, 5µl e 10µl, foram colocados em discos de papel de filtro e distribuídos
na superfície do meio. As placas foram refrigeradas a 4°C por trinta minutos, para
facilitar a difusão dos óleos essenciais, e posteriormente incubadas a 36°C por 24
horas. Após o período de incubação, os halos de inibição que se desenvolveram
foram medidos em milímetros, sendo incluído o diâmetro do disco (6mm). Os
ensaios foram realizados em duplicata e os controles incluíram discos de
antibióticos, para cada cepa de bactéria, recomendados pelo NCCLS (2005), além
de um disco embebido em 10µl de etanol, o qual foi utilizado como solvente para os
óleos essenciais nestes ensaios.
33
3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados estão apresentados como a média ± 1 erro padrão da média
(EPM) quando n ≥ 3, e como a média ± 1 desvio padrão (DP), quando n = 2. Para
análise estatística dos resultados, usou-se a Análise de Variância (ANOVA - one
way); o teste post hoc empregado foi o teste de Tukey quando apropriado. Os
cálculos foram realizados utilizando-se o software InStatSoft e valores de p≤0,05
foram considerados estatisticamente significativos.
34
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A variabilidade de climas e regiões geográficas no Brasil favorece o
desenvolvimento de uma flora variadíssima, sendo que um grande número dessas
plantas são usadas na medicina popular com finalidade terapêutica específica e,
dentre elas, somente cerca de 5% têm estudos farmacológicos descritos (Buss e
Waigh, 1995).
No Brasil, como em todo o mundo, tem sido crescente o uso de plantas
medicinais como terapia alternativa e/ou como suporte às terapias convencionais,
principalmente pela maior circulação de informações na mídia, além de oferecerem
menor custo e poucos, quando existentes, efeitos colaterais. Sabe-se que cerca de
80% da população mundial que vive em países em desenvolvimento faz uso de
produtos naturais para o tratamento de problemas primários de saúde (Mans et al.,
2000). Mesmo em países industrializados, uma grande porcentagem dos produtos
farmacêuticos comercializados provém de produtos naturais (Eldin e Dunford, 2001).
Assim, os produtos extraídos de plantas medicinais continuam a representar uma
diversidade química única, a qual continuará a ser uma fonte importante de
compostos-modelo para programas de investigação clínica, iniciados a partir da
observação das espécies de plantas regionais popularmente utilizadas.
Pelo potencial biológico dos óleos essenciais de B. articulata, B. crispa, B.
dracunculifolia e B. gaudichaudiana, como descrito na introdução deste trabalho,
investigaram-se suas propriedades antiinflamatórias, imunomoduladoras e
antimicrobianas.
4.1 ENSAIOS DE SOLUBILIZAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
Como as metodologias experimentais escolhidas para avaliar as atividades
biológicas dos óleos essenciais envolviam sistemas aquosos incompatíveis com a
sua natureza, diluições em solventes orgânicos foram realizadas com a finalidade de
maximizar a incorporação desses em meio aquoso. Para tanto, avaliaram-se os
seguintes solventes: PBS, PBSs, PBS acidificado com HCl (pH=6,8), RPMI 1640
suplementado, acetona, etanol e DMSO, em diluições seriadas (1:2 a 1:20.000).
Enquanto não houve solubilização em PBS, PBSs, PBS acidificado com HCl
ou RPMI 1640 suplementado, onde a solução tornou-se visivelmente prejudicada,
com separação das fases óleo/água, os óleos essenciais foram pouco solúveis em
acetona, deixando a solução final com aspecto opalescente. Entretanto, houve sua
35
total solubilização em etanol e DMSO. Dessa forma, as diluições seriadas que se
fizeram necessárias foram sempre realizadas em DMSO ou em etanol.
4.2 EFEITO DA TEMPERATURA E DO PERÍODO DE INCUBAÇÃO SOBRE A
VOLATILIDADE DOS COMPONENTES DO ÓLEO ESSENCIAL DE Baccharis
Óleos essenciais contêm uma variedade de compostos químicos,
principalmente monoterpenos e sesquiterpenos não oxigenados e oxigenados, que
diferem em volatilidade segundo sua estrutura e função química. Como nos ensaios
biológicos propostos utilizar-se-ia leucócitos de sangue periférico que seriam
mantidos na presença dos óleos essenciais por até cinco dias, a temperatura de
aproximadamente 37°C, avaliou-se o perfil cromatográfico dos componentes do óleo
essencial de B. dracunculifolia, espécie mais conhecida entre as estudadas neste
trabalho, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
A varredura espectral entre 200 e 400nm demonstrou a presença de
compostos com absorção em 209, 217 e 237nm com o mesmo tempo de retenção.
Entretanto, a melhor resolução foi obtida em 217nm. Dessa forma, este foi o
comprimento de onda utilizado para se obter o perfil cromatográfico do óleo
essencial de B. dracunculifolia após três e cinco dias de incubação a 37°C, e
compará-lo com aquele obtido antes do ensaio.
Como ilustrado nos cromatogramas da Figura 2, a maioria dos picos
presentes na amostra inicial (Figura 2-A) foi observada após três (Figura 2-B) e cinco
dias (Figura 2-C), sendo que os principais estão listados na Tabela 3, de acordo com
o tempo de retenção. Entretanto, a área total dos picos aumentou cerca de 2,1
vezes entre o primeiro e o quinto dias experimentais, indicando concentração desses
constituintes ou por volatilização do solvente ou por volatilização de outros
componentes que, indiretamente, contribuíram para a concentração daqueles
detectados nesse comprimento de onda. De fato, análise individual desses picos
demonstra que, dos dezoito listados, doze tiveram aumento da área relativa (picos 1-
3, 5, 7-9, 13-17), enquanto somente seis diminuíram este parâmetro (picos 4, 6, 10-
12, 18), elevando a área total desses cromatogramas de 83,9 para 91,5%.
Embora não se possa excluir o fato de que foram visualizados somente
componentes detectados na região do ultravioleta, esses resultados sugerem, que
nem a temperatura nem o período de incubação parecem interferir com a
composição deste óleo essencial, ou seja, não implicam diferenças na constituição
do óleo para análise e/ou ensaios.
36
Figura 2. Efeito da temperatura e do período de incubação sobre os constituintes do óleo
essencial de Baccharis dracunculifolia. Óleo essencial de B. dracunculifolia, na concentração de
5µl/ml em etanol, foi incubado por um período de 5 dias, a 37°C. Os cromatogramas representam o
perfil obtido por CLAE, antes da incubação (A) e após 3 (B) e 5 (C) dias, em 217nm, com fase móvel
água:acetonitrila (11:9), coluna C18 e fluxo de 1ml/min, durante 120 min. Os picos numerados em
vermelho correspondem aos descritos na Tabela 3.
A
B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
17
14
13
15
16
18
minutos
C
1
2
3
5
4
6
7
8
9
10
11
12
17
14
13
15
16
18
37
Tabela 3. Influência da temperatura sobre os componentes do óleo essencial
de B. dracunculifolia.
Tempo de retenção (minutos) Área (%)
Picos
1º dia 5º dia 1º dia 5º dia
1 6,751 6,715 0,4541 0,6052
2 7,768 7,757 0,2246 0,4960
3 8,940 9,021 0,0493 0,0731
4 9,614 9,526 0,2438 0,1146
5 11,832 11,784 0,8504 0,8946
6 13,534 13,469 0,0803 0,0778
7 27,944 27,870 8,3086 9,4952
8 33,406 33,397 6,4807 8,1083
9 36,989 37,084 2,1445 3,0401
10 44,255 44,426 12,9511 12,5956
11 50,903 50,961 7,0913 4,4910
12 54,976 55,075 7,4519 5,7170
13 58,587 58,376 30,3327 30,7068
14 66,560 66,977 0,1192 0,1258
15 77,079 78,010 0,3622 5,8209
16 83,572 83,855 1,3415 2,7277
17 95,733 96,224 2,6028 3,9214
18 115,316 115,426 2,8293 2,4979
Área Parcial (%) 83,9183 91,5090
4.3 CITOTOXICIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CÉLULAS
MONONUCLEARES E GRANULÓCITOS
A realização de ensaios biológicos de imunomodulação e quimiotaxia com
leucócitos humanos exige, além de um solvente que permita a incorporação dos
óleos essenciais em meio aquoso, testes preliminares para avaliação da
citotoxicidade destes compostos. Neste contexto, o ensaio que utiliza o corante azul
de tripano é muito útil, pois permite observar este efeito sobre as células em estudo,
as quais possuindo membrana citoplasmática íntegra, com preservação da sua
permeabilidade seletiva, excluem o corante (Merchant et al., 1964). Assim, células
viáveis, após alguns minutos de contato com o corante, apresentam-se incolores,
esféricas e refringentes.
Para a realização dos ensaios de citotoxicidade, quimiotaxia e
imunomodulação, os leucócitos obtidos de sangue periférico de voluntários sadios
foram divididos em duas populações, mononucleares (MNC) e granulócitos (GNC),
38
ambas obtidas após centrifugação com um gradiente de densidade. Como esperado,
citocentrifugados corados dessas duas populações demonstraram que linfócitos e
monócitos predominaram entre os MNC (>90%), enquanto neutrófilos e eosinófilos
constituíram mais de 95% da fração dos GNC (n=11). Além disso, somente amostras
contendo ≥90% de células viáveis, após o processo de isolamento, foram utilizadas
nos experimentos.
Dessa forma, leucócitos GNC e MNC foram expostos a concentrações
crescentes de óleos essenciais (10 a 10
-4
µl/ml) das espécies de Baccharis incluídas
neste estudo e seus efeitos citotóxicos investigados sob microscopia de luz, após
duas e cinco horas de incubação a 37°C para os GNC, tempo em que o ensaio de
quimiotaxia é realizado e, para a população de MNC, após quatro e cinco dias de
cultivo a 37°C sob atmosfera de 5-10% de CO
2
, tempo necessário para se avaliar a
atividade imunomodulatória.
Como ilustrado na Figura 3A, todos os óleos essenciais demonstraram
comportamento semelhante e, na concentração de 10µl/ml apresentaram
citotoxicidade elevada para GNC, sendo a viabilidade de apenas 18,0±1,2% para B.
articulata, 32,0±2,5% para B. dracunculifolia, 23,7±4,9% para B. crispa e, 41,3±8,4%,
para B. gaudichaudiana, após cinco horas de incubação (n=3). À 10
-2
µl/ml, o óleo
essencial de B. articulata foi o que demonstrou maior toxicidade para GNC, com
somente 77,6±3,4% de sua população mantendo-se viável. Já para
B. dracunculifolia
(90,0±4,2%), B. crispa (92,7±1,8%) e B. gaudichaudiana (97,3±0,9%), a viabilidade
manteve-se superior a 90%. Concentrações de 10
-3
e 10
-4
µl/ml de óleo essencial
demonstraram não influenciar a viabilidade dos GNC, os quais mantiveram-se com
viabilidade semelhante à observada para o controle (93,8±2,2%), neste caso, na
presença de 2% de DMSO, concentração final de solvente presente em todos os
ensaios.
Quanto ao potencial tóxico apresentado pelos óleos essenciais em relação
aos MNC, este foi mais evidente após cinco dias de incubação, onde uma
viabilidade celular média de somente 5,3±3,2% foi registrada na presença de 10µl/ml
de óleo essencial de B. articulata, enquanto a viabilidade, nesta concentração, foi de
1,5±1,5% para o de
B. dracunculifolia, 0,7±0,7% para B. gaudichaudiana, e ausência
de células viáveis na presença de óleo essencial de B. crispa (Figura 3B).
Em contraste, na presença de 10
-2
µl/ml dos óleos essenciais de B. articulata,
B. dracunculifolia, B. crispa e B. gaudichaudiana, a viabilidade média observada foi
39
de 79,0±5,1%; 83,5±5,8%; 90,0±2,3% e 88,3±3,2%, respectivamente, enquanto o
controle apresentou-se com 86,0±4,2% de células íntegras.
A
B
Figura 3. Citotoxicidade de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre leucócitos
periféricos. Leucócitos obtidos de sangue periférico de voluntários sadios, após isolamento em
gradiente de densidade, foram tratados com óleos essenciais de B. articulata (Ba), B. dracunculifolia
(Bd), B. crispa (Bc) e B. gaudichaudiana (Bg) como indicado. Granulócitos (A) foram incubados por
duas e cinco horas, enquanto que mononucleares (B) foram incubados por 4-cinco dias em atmosfera
de 5-10% de CO
2
, ambos a 37°C. Os pontos representam a média ± EPM, em porcentagem, de
células viáveis verificada pelo teste com azul de tripano, de pelo menos três experimentos
independentes. Viabilidade de 93,8±2,2% para o controle de granulócitos, e de 86,0±4,2% para o
controle de células mononucleares.
Os resultados experimentais obtidos demonstraram que concentrações
superiores a 10
-2
µl/ml dos óleos essenciais de Baccharis são, de fato, tóxicas tanto
para GNC como para MNC humanos.
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
0
25
50
75
100
2 h (Ba)
5 h (Ba)
2 h (Bd)
5 h (Bd)
Concentração (µ
µµ
µl/ml)
Viabilidade %
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
0
25
50
75
100
2 h (Bc)
5 h (Bc)
2 h (Bg)
5 h (Bg)
Concentração (µ
µµ
µl/ml)
Viabilidade %
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
0
25
50
75
100
4° dia (Ba)
5° dia (Ba)
4° dia (Bd)
5° dia (Bd)
Concentração (µ
µµ
µl/ml)
Viabilidade %
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
0
25
50
75
100
4° dia (Bc)
5° dia (Bc)
4° dia (Bg)
5° dia (Bg)
Concentração (µ
µµ
µl/ml)
Viabilidade %
40
A literatura relata estudos de citotoxicidade com óleos essenciais,
principalmente sobre linhagens de células de carcinoma. Por exemplo, óleo
essencial de Backhousia citriodora e citral, seu principal constituinte, mostraram-se
tóxicos para células HepG2, derivada de hepatocarcinoma, e para F1-73,
fibroblastos provenientes de células normais da pele (Hayes e Markovic, 2002). Em
contraste, o óleo essencial de Heteropyxis dehniae, cujos principais constituintes são
linalool, 4-terpineol, α-terpineol e cariofileno, não apresentou citotoxicidade para
células SK-MEL-28 de melanoma humano ou células 5637 de carcinoma humano
(Sibanda et al., 2004).
Embora os dados apresentados favoreçam o uso dos óleos essenciais para
estudos biológicos com células humanas, é preciso ressaltar que resultados de
experimentação in vitro não devem ser comparados com a dinâmica de um
organismo vivo, pois neles têm-se um acúmulo de metabólitos no meio de cultura, os
quais, devido à ausência das vias de biotransformação e excreção como
normalmente ocorre in vivo, não podem ser eliminados do sistema, causando efeito
nocivo que pode superestimar a toxicidade de substâncias (Hayes e Markovic,
2002).
4.4 QUIMIOTAXIA DE GRANULÓCITOS INDUZIDA POR CASEÍNA
Como revisto na introdução, a resposta inflamatória envolve várias etapas,
com o objetivo maior de recrutar populações celulares distintas, capazes de eliminar
o agente causal, com concomitante reparo do tecido lesado. Quando este processo
torna-se exacerbado, ultrapassando os seus efeitos salutares, há a necessidade de
se usar agentes que interfiram em uma ou mais dessas etapas.
Os neutrófilos formam a primeira linha de defesa do hospedeiro, sendo as
primeiras células a chegar nas áreas de lesão. Aí, desempenham inúmeras funções
com a finalidade de eliminar o agente agressor. A locomoção por si só envolve uma
série de fases, incluindo alterações das propriedades de adesividade, de forma e de
orientação da célula em estudo.
Neste trabalho em particular, investigou-se o potencial dos óleos essenciais
de Baccharis em interferir no recrutamento de fagócitos, etapa fundamental da
resposta inflamatória.
Como ilustrado na Figura 4, os óleos essenciais, independente da
concentração, parecem não ser dotados da habilidade de atrair granulócitos
humanos, tendo comportamento semelhante à população exposta ao PBSs, em
41
contraste com a caseína (n=19), onde significativamente um número 2,4±0,15
[F(14,59)=19,30; p<0,001] vezes maior de células migraram para o compartimento
inferior das câmaras em comparação a PBSs.
0
100
200
300
PBS
s
Caseína
D20
Ba
Bc
Bd
Bg
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
(µl/ml)
*
Migração celular (%)
Figura 4. Avaliação do potencial quimiotático de óleos essenciais de espécies de
Baccharis sobre granulócitos humanos. Granulócitos (GNC) obtidos de sangue
periférico de doadores sadios foram expostos a gradiente de concentração de caseína
(0,5%, p/v), DMSO 20µl/ml (D20), ou às concentrações indicados de óleo essencial
extraído de B. articulata (Ba), B. crispa (Bc), B. dracunculifolia (Bd) e B. gaudichaudiana
(Bg), adicionadas ao compartimento inferior de câmaras de Boyden, por noventa minutos,
a 37°C. As colunas representam a porcentagem média ± EPM de GNC recuperados em
relação à população não-estimulada (PBSs), normalizada em 100% (n = 3 a 19), *p ≤ 0,05
em relação aos dados do PBS
s
– ANOVA, seguida do teste de Tukey.
Entretanto, pré-tratamento de GNC humanos com concentrações crescentes
dos óleos essenciais de B. dracunculifolia e de B. articulata resultou em inibição
significativa da quimiotaxia induzida por caseína, na concentração de 10
-2
µl/ml, para
ambas espécies (Figura 5), onde apenas 41,7±10,2% [n=5; F(14,47)=6,56; p<0,01]
das células tratadas migraram para o compartimento inferior da câmara, enquanto
53,9±12,5% [n=5; F(14,47)=6,56; p<0,05] foram recuperados para B. articulata,
sendo estatisticamente significativos quando comparados às populações tratadas
com DMSO (95,2±3,0%; n=5), solvente usado neste modelo experimental para
incorporação dos óleos essenciais ao meio experimental. Este efeito inibitório foi,
embora não significativo, inclusive, superior àquele demonstrado para a DEXA,
droga usada freqüentemente como padrão de inibição em estudos semelhantes
42
(Lomas et al., 1991; Zentay et al., 1999), onde 59,0±7,2% [n=8; F(14,47)=6,56;
p<0,01] das células foram recuperadas.
Em contraste, os óleos essenciais de B. crispa e B. gaudichaudiana não
demonstraram interferir na quimiotaxia de granulócitos induzida por caseína. Para o
óleo essencial de B. crispa, 102±4,51%, 94,96±10,44% e 88,26±9,66% das células
migraram para o compartimento inferior das câmaras de Boyden, enquanto que,
para B. gaudichaudiana, observou-se os valores de 89,19±7,39%, 97,84±7,92% e
101,29±15,89%, respectivamente, para as concentrações de 10
-4
a 10
-2
µl/ml.
0
50
100
150
Caseína
Dexa
D20
Ba
Bc
Bd
Bg
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
(µl/ml)
#
*
*
Migração celular (%)
Figura 5. Efeito do pré-tratamento com óleos essenciais de espécies de Baccharis
sobre a quimiotaxia de granulócitos induzida por caseína. Granulócitos obtidos de
doadores sadios foram tratados, a 37°C, por trinta minutos, com as concentrações
indicadas de óleo essencial de B. articulata (Ba), B. crispa (Bc), B. dracunculifolia (Bd) e B.
gaudichaudiana (Bg) e induzidos a migrar, em câmara de Boyden, por noventa minutos,
contra um gradiente de 0,5% (p/v) de caseína.
Dexametasona (DEXA) foi utilizada como
controle de inibição. Cada coluna representa a porcentagem média ± EPM de células
migradas em relação ao controle (sem tratamento), normalizada em 100% (n=3-8); *p ≤
0,05 em comparação às células migradas após tratamento com DMSO 20 µl/ml (D20). # p
≤ 0,05 em relação ao controle não-tratado – ANOVA, seguida do teste de Tukey.
Muitas plantas têm sido utilizadas na medicina tradicional pela sua eficiência
em atenuar ou mesmo eliminar os efeitos indesejáveis da resposta inflamatória
aguda, como tumor, calor e dor. Estudos de efeito antiinflamatório com óleos
essenciais normalmente usam modelos in vivo. Por exemplo, óleos essenciais de
três espécies de Eucalyptus demonstraram efeito antiinflamatório, inibindo a
migração de neutrófilos para a cavidade peritonial de ratos induzida por carragenina
43
(Silva et al., 2003). Recentemente, óleos essenciais de gerânio, limão e hortelã-
pimenta suprimiram o recrutamento de leucócitos induzido pela injeção
intraperitonial de caseína em ratos (Abe et al., 2004). Atividade antiinflamatória
similar do óleo essencial de Bupleurum fruticescens, em modelo de indução de
edema em pata de ratos por carragenina ou PGE1, foi atribuída ao α-pineno e ao β-
cariofileno, componentes majoritários dessa fração (Martin et al., 1993), enquanto a
ação do óleo de Bupleurum fruticosum foi atribuída aos componentes α e β-pineno
(Lorente et al., 1989).
Aplicação cutânea em ratos de óleo essencial de gerânio, lavanda, eucalipto
e melaleuca suprimiram a inflamação local, inibindo a acumulação de neutrófilos, da
mesma forma como observado para geraniol e terpinen-4-ol, principais constituintes
do óleo essencial de gerânio e melaleuca, respectivamente (Maruyama et al., 2005).
Os resultados aqui apresentados mostraram que, das espécies estudadas,
somente os óleos essenciais de B. articulata e B. dracunculifolia possuem a
habilidade de interferir significativamente na quimiotaxia induzida por caseína. Dos
componentes listados na Tabela 1, somente α-pineno, p-cimeno, terpinoleno,
terpinen-4-ol e cis-β-guaieno foram detectados por CG nos óleos essenciais dessas
duas espécies. Além disso, somente nessas espécies é que se observou
concentração representativa de β-pineno e β-cariofileno. Assim, é possível que
essas substâncias, isoladas ou em combinação, sejam as responsáveis pelos efeitos
observados, embora a contribuição de outras substâncias nessa atividade não possa
ser descartada.
A habilidade dos óleos essenciais de interferir na migração de granulócitos
estimulada por caseína foi investigada em um sistema in vitro, específico para
avaliar esta função. É possível que os resultados daí derivados possam apontar os
compostos dos óleos essenciais como fontes importantes de substâncias
antiinflamatórias a serem incorporadas em formas farmacêuticas adequadas para o
tratamento de estados inflamatórios. Acrescente-se, ainda, o fato de que a caseína
mobiliza GNC humanos interagindo com eles via receptores opióides, que se
expressam abundantemente na membrana dessas células (Makman et al., 1995;
Pasotti et al., 1992). Interessante seria investigar este efeito com outros agentes
mobilizadores de granulócitos, que atuam em outros receptores, e observar se o
mecanismo de inibição da quimiotaxia aqui observado se repete. Portanto, apesar
dos óleos essenciais terem apresentado resultados sugestivos de sua participação
na quimiotaxia, estudos mais aprofundados devem ser realizados por meio de
44
ensaios experimentais específicos que investiguem os mecanismos desses efeitos
em nível molecular.
4.5 EFEITOS DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DE Baccharis SOBRE A
IMUNOMODULAÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES
A estratégia utilizada para avaliar a proliferação de MNC por citometria de
fluxo (CF), ilustrada com detalhes na Figura 6, baseou-se em conceitos clássicos
que distinguem cada população particular de células presente na medula óssea ou
no sangue periférico de acordo com seu tamanho (FSC – forward side scatter) e
complexidade interna (SSC – side light scatter) (Civin e Loken, 1987) e no trabalho
de Kristensen e colaboradores (1982), com algumas modificações.
A janela R1 foi, então, delineada de forma subjetiva para especificar a
população de linfócitos (Figura 6A), caracterizados por baixos FSC e SSC,
correspondente a células de pequeno tamanho e complexidade citoplasmática
simples (Civin e Loken, 1987), conforme morfologia ilustrada na Figura 6C; a janela
R2 foi traçada, também de forma subjetiva, para caracterizar células ativadas (Figura
6B), ou seja, aquelas que sofreram alteração morfológica, ou transformação blástica,
conforme morfologia ilustrada na Figura 6D, e se deslocaram para uma região de
maior complexidade e tamanho (linfoblastos), porém incluindo a janela R1. A janela
R3 delimita uma região ampla, na qual dispõem-se granulócitos, por apresentarem
elevada complexidade interna e variável tamanho, células não viáveis, além de
debris celulares.
4.5.1 Efeitos do etanol e dimetilsulfóxido sobre a imunomodulação de linfócitos
humanos in vitro
Dimetilsulfóxido e etanol são solventes amplamente utilizados para diluir ou
incorporar componentes ou misturas de natureza não aquosa em meios de cultura
para ensaios biológicos. Como anteriormente citado, foram os solventes que
viabilizaram a incorporação dos óleos essenciais incluídos neste trabalho nos meios
que seriam utilizados para o estudo de suas atividades biológicas. Dessa forma,
para eliminar a hipótese de qualquer interferência desses solventes sobre os
estudos que seriam realizados, seus efeitos sobre MNC humanos foram avaliados
com relação à viabilidade e à multiplicação celular por citometria de fluxo, em
45
R2
R3
R1 R1
R3
R2
Figura 6. Representação gráfica em pontos para análise da atividade imunomodulatória de
linfócitos por citometria de fluxo. Os gráficos representam populações de mononucleares, onde as
características de tamanho (FSC) e complexidade interna (SSC) foram utilizadas para distinguir cada
população e definir as regiões para avaliação da proliferação de linfócitos do grupo controle (A) e do
grupo tratado, neste caso com fitohemaglutinina (B). R1 denota a região delimitada para linfócitos não
ativados, R2 delineia a região para linfócitos ativados, que se transformam em linfoblastos, e R3
delimita a área para granulócitos e debris celulares. Cada ponto representa uma célula detectada pelo
sistema. Citocentrifugados preparados dessas populações e corados com May-Grunwlad-Giemsa
demonstraram populações predominantes de linfócitos (C) e blastos (D). (magnificação: 1000x)
A B
FSC
S
S
C
C D
46
relação à morfologia em citocentrifugados corados e em relação à quantificação de
AgNOR. Para tanto, células mononucleares de sangue periférico humano foram
expostos às concentrações de 10 (D10 ou E10) e 20µl/ml (D20 ou E20) de DMSO ou
etanol, respectivamente, por serem os volumes finais desses solventes presentes no
meio de cultivo experimental. Seus efeitos foram, também, avaliados sobre a
proliferação de linfócitos estimulados por fitohemaglutinina (PHA).
A fitohemaglutinina, como esperado (Figura 8), foi capaz de promover
significativamente a proliferação de linfócitos, com um índice de proliferação (IP)
5,49±0,7 vezes maior em relação ao IP obtido para o controle não estimulado [n=8;
F(13,41)=7,79; p<0,001].
Para o DMSO, observou-se inibição dose-dependente sobre a proliferação
basal de linfócitos (Figura 7), com um IP médio de 0,69±0,1 e de 0,54±0,02 [n=3;
F(4,10)=13,81; p<0,01], para 10 (D10) e 20µl/ml (D20) de DMSO, respectivamente,
perfil que se reproduziu, porém com maior intensidade, na avaliação da proliferação
de linfócitos estimulados por PHA (Figura 8), onde 2,05±0,8 [n=3; F(13,41)=7,79;
p<0,05] e 0,84±0,1 [n=3; F(13,41)=7,79; p<0,001] de IP foram obtidos para as
concentrações de 10 (D10+PHA) e 20µl/ml (D20+PHA), respectivamente. Para o
etanol, os IP médios observados foram de 5,41±1,1 (E10+PHA) e 4,37±0,9
(E20+PHA), 1,1±0,06 (E10) e 1,09±0,08 (E20), respectivamente, para 10 e 20µl/ml,
na presença ou não de PHA (n=3-4).
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle
D10
D20
E10
E20
*
Índice de Proliferação
Figura 7. Efeito in vitro de etanol e DMSO sobre a proliferação basal
de linfócitos humanos
. Mononucleares obtidos de sangue periférico de
voluntários sadios foram tratados com 10 ou 20
µ
l/ml de DMSO (D) ou
etanol (E) e incubados a 37°C, por cinco dias, em atmosfera de CO
2
. Cada
coluna representa a média ± EPM do índice de proliferação obtido da
relação entre o número de eventos detectados por citometria de fluxo na
região R2 dos experimentos contendo DMSO ou etanol e o número obtido
no Controle (MNC não-tratados) de células incubadas em RPMI
suplementado de, pelo menos, três experimentos independentes,
realizados em triplicata.*
p≤
0,05 em relação ao controle (ANOVA+Tukey).
47
0
1
2
3
4
5
6
7
Controle
PHA
D10+PHA
D10
t0
+PHA
t24
D10
t72
+PHA
t0
D20+PHA
D20
t0
+PHA
t24
D20
t72
+PHA
t0
E10+PHA
E10
t0
+PHA
t24
E10
t72
+PHA
t0
E20+PHA
t
E20
t0
+PHA
t24
*
*
*
*
*
#
E20
t72
+PHA
t0
Índice de Proliferação
Figura 8. Efeito in vitro de etanol e DMSO sobre a proliferação de linfócitos humanos
estimulados por fitohemaglutinina
. Mononucleares (MNC) obtidos de sangue periférico,
foram tratados com meio contendo fitohemaglutinina (PHA) e com 10 ou 20
µ
l/ml de DMSO
(D) ou etanol (E), e incubados a 37°C, por cinco dias, em atmosfera de CO
2
. Em alguns
experimentos incubou-se suspensão de MNC com as concentrações indicadas dos
solventes por 24 horas (t
24
) e, após adicionou-se meio contendo PHA; em outros,
incubaram-se as células com PHA por 72 horas e, em seguida, adicionou-se o solvente na
concentração indicada (t
72
). Cada coluna representa a média ± EPM do índice de
proliferação obtido da relação entre o número de eventos detectados por citometria de
fluxo na região R2 dos experimentos contendo DMSO ou etanol e o número obtido no
Controle de, pelo menos, três experimentos independentes, realizados em triplicata. *
p ≤
0,05 em relação a PHA. #
p ≤
0,05 em relação ao controle (ANOVA + Tukey).
Simultaneamente, avaliou-se a transformação blástica por citometria de fluxo,
através da porcentagem de células deslocadas da região R1 para a R2. Para as
concentrações de 10 e 20
µ
l/ml, os valores obtidos foram, respectivamente,
14,3
±
2,03% e 14,3
±
2,02% para o DMSO, e 11,1
±
2,78% e 14,1
±
3,04% para o etanol,
enquanto para o controle, os resultados foram 18,8
±
4,46% (Figura 9). Ou seja, nas
culturas realizadas para avaliação da proliferação linfocitária basal, a maioria das
células, como esperado, manteve-se na região R1, independente da presença de
solventes.
Já nas culturas onde o mitógeno foi acrescentado (Figura 10), observou-se
que 83,4
±
2,0% das células deslocaram-se para a região R2 [
F
(13,46)=44,90;
p<
0,001 em relação ao controle sem PHA]. O acréscimo de DMSO diminui a
presença de células nessa região, com 75,4
±
0,9% delas, para a concentração de
10
µ
l/ml, e 50,0
±
2,5% [
F
(13,46)=44,90;
p<
0,001] para 20
µ
l/ml. Para o etanol, nas
concentrações de 10 e 20
µ
l/ml, 86,9
±
3,4% e 83,5
±
4,2%, respectivamente, das
células sofreram transformação blástica, migrando para R2.
48
0
10
20
30
Controle
D10
D20
E10
E20
Transformação Blástica %
Figura 9. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a
transformação blástica de linfócitos humanos
. Mononucleares
obtidos de sangue periférico de voluntários sadios foram tratados
com 10 e 20
µ
l/ml dos solventes e incubados a 37°C, por cinco dias,
em atmosfera de CO
2
. Cada coluna representa a porcentagem
média
±
EPM dos valores resultantes da relação entre R1 e R2,
descrita na sessão de Material e Métodos, obtidos por citometria de
fluxo (n=3-6).
0
25
50
75
100
PHA
D10+PHA
D10
tO
+PHA
t24
D10
t72
+PHA
t0
D20+PHA
D20
t0
+PHA
t24
D20
t72
+PHA
t0
E10+PHA
E10
t0
+PHA
t24
E10
t72
+PHA
t0
E20+PHA
E20
t0
+PHA
t24
E20
t72
+PHA
t0
*
*
Transformação Blástica %
Figura 10. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a transformação blástica de
linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina
. Mononucleares (MNC) obtidos
de sangue periférico foram tratados com fitohemaglutinina (PHA) e com 10 e 20
µ
l/ml dos
solventes, incubados a 37°C, por cinco dias, em atmosfera de CO
2
. Em alguns
experimentos, incubou-se suspensão de MNC com as concentrações indicadas dos
solventes por 24 horas (t
24
) e, após adicionou-se meio contendo PHA; em outros, incubou-
se as células com PHA por 72 horas e, em seguida, adicionou-se o solvente (t
72
). Cada
coluna representa a porcentagem média
±
EPM dos valores resultantes da relação entre
R1 e R2, descrita na sessão de Material e Métodos, obtidos por citometria de fluxo (n=3-6).
*
p ≤
0,05 em relação a PHA.
49
Esses resultados foram confirmados pela análise morfológica das populações
celulares em citocentrifugados corados com May-Grünwald-Giemsa e resumidos na
Tabela 4, onde se observa predominância absoluta de linfócitos nas culturas sem
mitógeno, principalmente naquelas onde somente DMSO foi adicionado.
Sendo a contagem de AgNOR paralela à atividade mitótica e estando
correlacionada com a taxa de renovação celular (Ivanyi
et al.
, 1992), explorou-se
este comportamento dos linfócitos na presença ou não de PHA, DMSO e etanol.
Uma nítida e significativa [n=2;
F
(5,6)=122,00;
p<
0,001] diferença no número
médio de AgNOR por célula foi encontrada em linfócitos estimulados por mitógeno
em relação aos não estimulados. Como ilustra a Figura 11, a grande maioria das
células cultivadas na ausência de mitógeno apresentou somente um AgNOR
(1,05
±
0,02), fato que se reproduziu para linfócitos cultivados somente na presença
de DMSO ou de etanol, independente da concentração. Entretanto, quando
cultivados na presença de PHA, observou se uma média de 2,9
±
0,2 AgNOR por
célula (Figura 12).
Tabela 4. Influência de DMSO e etanol na morfologia de linfócitos humanos
cultivados na presença ou não de fitohemaglutinina, avaliada em
citocentrifugados corados com May-Grunwald-Giemsa.
Linfócitos (%)
Linfoblastos
(%)
Linfócitos (%)
Linfoblastos
(%)
MNC
89 11 - -
PHA
16 84 - -
10µ
µµ
µl/ml
20µ
µµ
µl/ml
DMSO
99 01 98 02
Etanol
92 08 89 11
DMSO + PHA
42 58 82 18
DMSO
t0
+ PHA
t24
36 64 88 12
DMSO
t72
+ PHA
t0
25 75 25 75
Etanol + PHA
10 90 15 85
Etanol
t0
+ PHA
t24
15 85 11 89
Etanol
t72
+ PHA
t0
20 80 11 89
Células mononucleares (MNC) obtidas de sangue periférico foram tratadas com as concentrações
indicadas dos solventes, incubadas a 37°C, por cinco dias, em atmosfera de CO
2
. Em alguns
experimentos, os MNC foram simultaneamente expostos a fitohemaglutinina (PHA); em outros,
incubou-se MNC com as concentrações indicadas dos solventes por 24 horas e, em seguida,
adicionou-se PHA; ainda, em outros, incubou-se as células com PHA por 72 horas e, em seguida,
adicionou-se o solvente. A morfologia foi avaliada em citocentrifugados corados com May-Grunwald-
Giemsa, sob imersão em microscópio comum. Cada valor representa a porcentagem média de
células obtidas de dois experimentos, onde um mínimo de 100 células por experimento foi
observado.
50
Nossos resultados estão de acordo com vários estudos que relacionam a
contagem e a morfologia de AgNOR, especialmente entre células normais e
cancerosas. Neste contexto, Lee e colegas (1999b) relataram que linfócitos de
sangue periférico apresentam cerca de um AgNOR por célula, sendo
aproximadamente todos do mesmo tamanho e com morfologia arredondada. De
fato, este tipo de morfologia foi observada para nossas culturas sem adição de
mitógeno, ou seja, aquelas em que os linfócitos, por não sofrerem estimulação,
apresentaram-se em absoluta maioria (98,0
±
2,8%) com morfologia tipo I (Figura
14A). Já, maior porcentagem de células com morfologia complexa [20,5
±
6,4%,
F
(5,6)=208,15;
p<
0,05] e do tipo II (9,0
±
0,0%), em detrimento da morfologia do tipo I
[70,5
±
6,4%;
F
(5,6)=208,15;
p<
0,001], foi observada somente quando linfócitos foram
cultivados na presença de PHA (Figura 14, B e C).
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle
D10
D20
E10
E20
N°médio de AgNOR/célula
Figura 11. Efeito do DMSO e etanol sobre a formação de
AgNOR em linfócitos humanos.
Células mononucleares
humanas foram incubadas por cinco dias a 37°C, na presença de
10 ou 20
µ
l/ml de DMSO (D) ou etanol (E). Citocentrifugados foram
corados para revelação de AgNOR, como descrito na sessão de
Material e Métodos. As colunas representam o n° médio de
AgNOR
±
DP por célula (n=2, experimentos independentes).
51
0
1
2
3
4
PHA
D10+PHA
D10
tO
+PHA
t24
D10
t72
+PHA
t0
D20+PHA
D20
t0
+PHA
t24
D20
t72
+PHA
t0
*
*
*
E10+PHA
E10
tO
+PHA
t24
E10
t72
+PHA
t0
E20+PHA
E20
t0
+PHA
t24
E20
t72
+PHA
t0
N°médio de AgNOR/célula
#
Figura 12. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a formação de AgNOR em
linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina.
Mononucleares humanos
foram incubados por cinco dias na presença de fitohemaglutinina (PHA), DMSO (D) ou
etanol (E), 10 ou 20
µ
l/ml. Citocentrifugados foram corados para revelação de AgNOR,
como descrito na sessão de Material e Métodos. As colunas representam o n° médio de
AgNOR
±
DP/célula (n=2, experimentos independentes). *
p ≤
0,05 em relação a PHA. #
p ≤
0,05 em relação a DMSO 10 µl/ml acrescido de PHA (ANOVA + Tukey).
Com a finalidade de se esclarecer às diferenças de comportamento induzidas
pelo DMSO, duas séries de experimentos foram realizadas onde, além da incubação
simultânea na presença do mitógeno, concentrações específicas dos solventes
foram adicionadas após 72 horas de incubação dos MNC com PHA. Em outros, PHA
foi adicionada às culturas de MNC previamente incubadas por 24 horas com os
solventes.
O IP obtido para MNC (Figura 8) incubados previamente com o DMSO e 24
horas depois acrescidos de PHA foi de 1,74
±
0,68 [
F
(13,41)=7,79;
p<
0,05] e
0,60
±
0,10 [
F
(13,41)=7,79;
p<
0,001], para 10 (D10
t0
+PHA
t24
) e 20
µ
l/ml
(D20
t0
+PHA
t24
), sendo ambos estatisticamente significativos em relação ao grupo
tratado apenas com PHA, mas sem diferença em relação ao IP obtido na incubação
concomitante do DMSO e PHA (D10 ou D20+PHA), cujos valores de IP foram de
2,05
±
0,8 e 0,84
±
0,1 para 10 e 20µl/ml, respectivamente. A transformação blástica
também foi inibida: somente 48,1
±
6,1% [
F
(13,46)=44,90;
p<
0,001] de células
ocuparam a região R2 quando 20
µ
l/ml de DMSO foi incubado por 24 horas antes do
acréscimo de PHA (Figura 10 – D20
t0
+PHA
t24
), com valor similar ao encontrado
quando houve incubação simultânea (Figura 10 – D20+PHA). Estes resultados estão
em concordância com os valores de IP obtidos, indicando, a princípio, uma provável
atuação do DMSO nos mecanismos de ativação celular ou transformação blástica,
de forma dose-dependente.
52
Figura 13. Aspecto morfológico de AgNOR em linfócitos humanos.
Citocentrifugados de
mononucleares humanos obtidos de sangue periférico cultivados por cinco dias em RPMI 1640
suplementado com soro humano (10%), a 37°C e tensão de CO
2
, na presença (
C
e
D
) ou não (
A
e
B
) de fitohemaglutinina, foram fixados em solução de Carnoy e submetidos à impregnação argêntica
para definição das regiões nucleolares impregnadas pela prata (setas) e contracoradas com solução
de Verde de Malaquita. AgNOR Tipo I: precipitados pequenos, arredondados e bem delimitados;
AgNOR Tipo II: precipitados maiores, disformes; AgNOR Complexos: Tipo I e Tipo II na mesma
célula. (magnificação: A/C 400x, B/D 1000x)
.
A
D C
B
Tipo I
Tipo I
Tipo I
Tipo I
Tipo II
Tipo II
Tipo II
53
Para a população previamente incubada por 72 horas com o mitógeno e
posteriormente acrescida de DMSO (Figura 8), o IP foi significativo para a
concentração de 20
µ
l/ml (D20
t72
+PHA
t0
) em relação ao grupo tratado com PHA,
sendo de 2,18
±
0,04 [n=3;
F
(13,41)=7,79;
p<
0,05], enquanto para a concentração de
10
µ
l/ml (D10
t72
+PHA
t0
) o IP foi de 3,06
±
0,4 (n=3).
Na avaliação morfológica, praticamente todas as células mantiveram-se como
linfócitos (Tabela 4), reforçando o efeito inibitório observado para o IP. Na presença
de PHA, foi notável a diferença entre as doses de 10 e 20
µ
l/ml, com cerca de 82%
das células com morfologia de linfócitos na maior concentração, valor que ainda se
acentuou quando os MNC foram incubados previamente com DMSO, onde 88% das
células demonstraram características morfológicas de linfócitos, sendo praticamente
o mesmo percentual encontrado na incubação dos MNC em RPMI suplementado
(controle), com 89% de linfócitos.
Com relação ao número médio de AgNOR/célula, na população tratada
simultaneamente com DMSO e PHA observou-se diminuição significativa, com
2,0
±
0,09 [10
µ
l/ml;
F
(12,13)=21,24;
p<
0,05] e 1,1
±
0,05 [20
µ
l/ml;
F
(12,13)=21,24;
p<
0,001]. Este valor manteve-se em 1,3
±
0,1 [
F
(12,13)=21,24;
p<
0,001] quando
20
µ
l/ml de DMSO foram adicionados 24 horas antes da PHA, enquanto que, para
10
µ
l/ml de DMSO, o valor encontrado foi de 2,6
±
0,3. No tratamento com DMSO
adicionado 72 horas após a incubação com PHA, 2,5
±
0,3 e 2,6
±
0,09 foram os
números médios de AgNOR/célula obtidos para 10 e 20
µ
l/ml, respectivamente
(Figura 12).
Em paralelo, a morfologia do tipo I foi a mais freqüente quando MNC foram
submetidos a 20
µ
l/ml de DMSO, com uma média de 95,5
±
0,7% [
F
(20,21)=172,08;
p<
0,001] no tratamento simultâneo de DMSO e PHA, e de 93,0
±
1,4%
[
F
(20,21)=172,08;
p<
0,001] quando DMSO foi adicionado 24 horas antes da PHA
(Figura 14-C). Conseqüentemente, a morfologia complexa apareceu em somente
1,0
±
0,0% [
F
(20,21)=172,08;
p<
0,01] das células quando da adição concomitante de
mitógeno e solvente, e em 3,0
±
2,8% [
F
(20,21)=172,08;
p<
0,05] das células na
adição prévia de DMSO no meio de cultura, deixando 3,5
±
0,7% e 4,0
±
1,4%,
respectivamente, para a morfologia do tipo II.
Para o etanol, quando se incubou os MNC por 24 horas e, após, adicionou-se
PHA seguindo-se incubação por mais quatro dias, os valores de IP foram de
4,41
±
0,9 (n=3, E10
t0
+PHA
t24
) e 4,37
±
0,8 (n=3, E20
t0
+PHA
t24
), respectivamente, para
as concentrações de 10 e 20
µ
l/ml.
54
A
0
50
100
150
Controle
D10
D20
E10
E20
Tipo I Tipo II Com plexa
% Células
B
0
25
50
75
100
PHA
E10+PHA
E10
tO
+PHA
t24
E10
t72
+PHA
t0
E20+PHA
E20
t0
+PHA
t24
E20
t72
+PHA
t0
Tipo I Tipo II Complexa
% Células
C
0
25
50
75
100
PHA
D10+PHA
D10
tO
+PHA
t24
D10
t72
+PHA
t0
D20+PHA
D20
t0
+PHA
t24
D20
t72
+PHA
t0
Tipo I Tipo II Complexa
*
*
*
*
Morfologia de AgNOR
% Células
Figura 14. Efeito in vitro de etanol (E) e DMSO (D) sobre a
morfologia de AgNOR de linfócitos humanos.
Células
mononucleares humanas foram tratadas com etanol ou
DMSO, 10 ou 20
µ
l/ml (
A
) e incubadas a 37°C, por cinco dias,
em atmosfera de CO
2
. Mononucleares foram tratados com
etanol (
B
) e DMSO (
C
), respectivamente, além da adição de
PHA como descrito na sessão de Material e Métodos. Após
este período citocentrifugados foram preparados e corados
para revelação de AgNOR. As colunas representam a
porcentagem média de células
±
DP contendo AgNOR do tipo
I, II ou complexa (n=2, experimentos independentes). *
p ≤
0,05
em relação a PHA (ANOVA + Tukey).
55
Na incubação concomitante de etanol com PHA, deve-se ressaltar que,
quanto à morfologia, 86,6±2,7% e 82,6±2,4% de blastos, respectivamente, para 10 e
20µl/ml, foram observados. De igual modo, o etanol não interferiu com o número
médio de AgNOR por célula, assim como não alterou a morfologia destes. O número
médio de AgNOR/célula foi de 2,8
±
0,1 e 2,8
±
0,2, respectivamente, para os
tratamentos com 10 e 20
µ
l/ml de etanol em presença de PHA. Ao adicionar PHA 24
horas após a incubação de MNC com etanol, 2,7
±
0,1 e 3,2
±
0,1 foram as médias de
AgNOR por célula para 10 e 20
µ
l/ml, com morfologia complexa em 22,0
±
1,4%
(10
µ
l/ml) e 19,5
±
4,9% (20
µ
l/ml) das células. Nesta última situação, os achados para
AgNOR não foram diferentes dos controles (2,9±0,2 AgNOR por célula, com
20,5±6,4% das células apresentando morfologia complexa).
Para a população previamente incubada por 72 horas com o mitógeno e
posteriormente acrescida de etanol, o IP foi de 4,21
±
1,1 e 5,74
±
0,4 para as
concentrações de 10 (E10
t72
+PHA
t0
) e 20
µ
l/ml (E20
t72
+PHA
t0
), respectivamente, com
números médios de AgNOR de 2,7
±
0,2 (10
µ
l/ml) e 2,5
±
0,3 (20
µ
l/ml).
Os resultados dessas duas séries de experimentos sugerem que o DMSO,
mas não o etanol, interfere, de forma dose-dependente, na imunomodulação de
linfócitos humanos, quando submetidos às condições experimentais propostas.
Análise mais minuciosa dos dados indica que esta interferência é mais acentuada na
etapa de ativação celular, ou seja, nos mecanismos que antecedem sua
proliferação. Esta afirmação encontra suporte no fato de que os MNC pré-tratados
com DMSO mantiveram morfologia predominante de linfócitos após exposição ao
mitógeno e com baixos números de AgNOR, cuja morfologia simples (Tipo I) implica
características de células com reduzida atividade mitótica, como já sugerido por
outros (Ivanyi
et al.
, 1992).
Estes resultados contrastam com aqueles observados para o etanol, os quais
foram bastante próximos aos obtidos nas culturas controle contendo mitógeno e que
demonstraram presença intensa de blastos, com alta prevalência de células com
morfologia de AgNOR complexos.
Deve-se ressaltar que a possibilidade de um efeito tóxico do DMSO sobre as
células MNC foi avaliada por citometria de fluxo durante todos os procedimentos
experimentais e está demonstrada na Tabela 5. Interessante notar que, somente nas
culturas em que ele foi adicionado 72 horas após a ação do mitógeno, elevada
porcentagem de células foram registradas na região R3, indicando toxicidade.
Entretanto, essas mesmas culturas registraram a presença majoritária de células
56
blásticas, independente da concentração de DMSO, com quantidade de AgNOR
próximo aos valores obtidos para os controles. Sendo assim, é possível inferir uma
toxicidade elevada do DMSO frente às células blásticas, que sofreram ativação e
transformação celular.
Tabela 5. Toxicidade do DMSO e etanol sobre células mononucleares
humanas avaliada por citometria de fluxo.
Viabilidade (%)
Solvente
10µ
µµ
µl/ml 20µ
µµ
µl/ml
DMSO
86,5
±
6,8 96,99
±
3,01
DMSO + PHA
96,4
±
3,6
>
99
DMSO
t0
+ PHA
t24
91,8
±
8,2
>
99
DMSO
t72
+ PHA
t0
49,7
±
12,0 32,6
±
2,0
Etanol
>
99
>
99
Etanol + PHA
>
99 92,2
±
7,8
Etanol
t0
+ PHA
t24
90,3
±
9,7
>
99
Etanol
t72
+ PHA
t0
87,5
±
5,9 91,5
±
4,2
Células mononucleares (MNC) obtidas de sangue periférico foram tratadas com as
concentrações indicadas dos solventes, incubados a 37°C, por cinco dias, em atmosfera de
CO
2
. Em alguns experimentos, os MNC foram simultaneamente expostos a PHA; em outros,
incubou-se suspensão de MNC com as concentrações indicadas dos solventes por 24 horas e,
após, adicionou-se meio contendo PHA. Em outros, incubou-se as células com PHA por 72
horas e, em seguida, adicionou-se o solvente. Cada valor representa a porcentagem média de
viabilidade
±
EPM obtida entre o número de eventos detectados por citometria de fluxo dos
experimentos contendo etanol ou DMSO e o número obtido no controle de células não tratadas
ou expostas a PHA (n=3).
A interferência do DMSO no metabolismo celular não é desconhecida. Por
exemplo, há relatos de que o DMSO é capaz de induzir diferenciação celular em
várias linhagens mielóides, enquanto que, para células de linhagem linfóide, a
concentração de 1,5% de DMSO é capaz de bloquear, de forma reversível, o ciclo
celular em G
1
(Sawai
et al.
, 1990).
Neste contexto, vários estudos relacionam a interferência do DMSO com o
influxo de Ca
++
. Zhang e Eyzaguirre (1999) relataram que o aumento na
concentração de cálcio intracelular induzido por hipóxia em células “glomous” de
ratos é bloqueado pela presença de DMSO, enquanto estudos com células humanas
HL-60, de leucemia pró-mielocítica, indicam que o aumento na concentração de
Ca
++
intracelular induzido por neurotensina desapareceu após tratamento com
57
DMSO (Choi
et al.
, 1999). Michel (1998) mostrou redução significante nas elevações
de Ca
++
causada por adrenalina e pelo neuropeptídeo Y em células humanas de
eritroleucemia. Reynaud e colaboradores (1999) relataram similar interferência do
DMSO sobre o efeito da hepoxilina A
3
em neutrófilos humanos.
Além disso, McConnel e colegas (1999), usando membranas isoladas de
eritrócitos humanos, mostraram que o DMSO inibe a estimulação da calmodulina
ATPase Ca
++
-Mg
++
dependente e Na
+
-K
+
dependente, sem nenhum efeito significativo
sobre a calmodulina ATPase independente de Ca
++
-Mg
++
ou sobre a atividade da
ATPase dependente de Mg
++
. A coerência entre esses resultados obtidos com
diferentes sistemas biológicos e moduladores de Ca
++
intracelular sugerem uma
ação inespecífica do DMSO, como sugerido por outros (Santos
et al.
, 2003).
Como o influxo de Ca
++
é central na ativação de linfócitos e ocorre em menos
de cinco minutos após a interação do mitógeno PHA com receptores na superfície
de linfócitos humanos (Cooper, 1972), um bloqueio nesta etapa pelo DMSO ratifica
os efeitos encontrados em nossos estudos relacionados à inibição da proliferação de
linfócitos, provavelmente por atuação deste nas etapas que envolvem a ativação
celular. Em adição, como o conteúdo de RNA em linfócitos estimulados dobra em 48
horas (Greaves e Janossy, 1972), justifica-se as alterações na morfologia e no
número médio de AgNOR por célula, quando DMSO e PHA encontram-se
simultaneamente no meio de cultura ou quando da adição primária do DMSO, fato
não observado quando o solvente foi acrescentado somente 72 horas após a
incubação com o mitógeno. Neste último caso, as células já teriam sofrido
estimulação pela PHA e aumentado seu conteúdo em RNA quando da adição do
solvente, não alterando dessa forma o perfil morfológico dos AgNOR.
O conjunto de resultados obtidos indica que o DMSO é uma substância
inadequada para ser utilizada como solvente quando se deseja a incorporação de
compostos insolúveis em meios aquosos com a finalidade de se estudar o perfil
proliferativo de linfócitos humanos
in vitro
.
Nossos resultados são de particular relevância, considerando que o DMSO,
um composto anfipático, com um domínio altamente polar e dois grupos apolares e
que, torna-se solúvel em meios aquoso e orgânico (Santos
et al.
, 1997), é
freqüentemente usado como solvente em estudos biológicos e como veículo de
drogas terapêuticas (Santos
et al.
, 2003). Portanto, a ausência de compreensão dos
efeitos do DMSO pode ocasionar artefatos experimentais e levar à interpretação
equivocada dos resultados.
58
4.5.2 Potencial imunomodulatório dos óleos essenciais
Tendo se estabelecido que o etanol não interfere nas atividades
imunomodulatórias de linfócitos humanos nas condições experimentais propostas,
ele foi o solvente utilizado para se estudar o efeito imunomodulatório dos óleos
essenciais de
Baccharis
. Assim, concentrações crescentes dos mesmos diluídas em
etanol foram adicionadas à suspensões de MNC humanos e sua ação avaliada na
ausência e presença de mitógeno.
Simultaneamente e primariamente ao efeito imunomodulatório, avaliou-se a
citotoxicidade dos óleos essenciais de
Baccharis
por citometria de fluxo, através do
número de células localizadas na região R3, comparando-se aos respectivos
controles (com e sem PHA), todos normalizados em 100%. Na maioria das análises,
a viabilidade dos MNC mostrou-se superior a 90% e, de forma geral, sempre
superior a 83%, como demonstrado na Tabela 6, indicando que, nas concentrações
ensaiadas, os óleos essenciais não se mostraram tóxicos aos MNC humanos,
ratificando os resultados prévios com azul de tripano.
Em paralelo, também não se observou efeito desses compostos sobre a
proliferação de linfócitos, como ilustra a Figura 15. No entanto, quando PHA foi
adicionada simultaneamente ao meio de cultura, observou-se diminuição dessa
proliferação (Figura 16). Neste contexto, óleo essencial de
B. dracunculifolia
e
B.
gaudichaudiana
, na concentração de 10
-2
µl/ml, apresentaram efeito inibitório
significativo sobre a proliferação de linfócitos quando comparados a MNC tratados
com PHA e 20µl/ml de etanol (IP=3,46±0,4). A espécie
gaudichaudiana
apresentou a
inibição mais significativa à 10
-2
µ
l/ml, com IP de 2,06±0,1 [n=4;
F
(13,36)=2,98;
p
<0,01], enquanto para 10
-3
e 10
-4
µ
l/ml os valores de IP foram, respectivamente, de
2,40
±
0,1 (n=4) e 2,88
±
0,1 (n=4). Para
B. dracunculifolia
o IP foi de 2,11
±
0,4 [n=4;
F
(13,36)=2,98;
p
<0,05], na dose de 10
-2
µ
l/ml, e de 2,58±0,25 e 2,67±0,4 para 10
-3
e
10
-4
µ
l/ml. Para
B. articulata
, atividade inibitória, porém não significativa, foi
observada, com valores de IP de 2,61
±
0,2, 2,57
±
0,2 e 2,39
±
0,2 (n=3),
respectivamente, para as concentrações de 10
-4
a 10
-2
µ
l/ml. Finalmente, a espécie
crispa
, apresentou IP de 2,46
±
0,01 (n=3), 2,55
±
0,2 (n=4) e 2,21
±
0,2 (n=3), para 10
-4
a 10
-2
µ
l/ml. Enquanto o IP obtido para a PHA foi de 3,14±0,16 (n=6).
59
Tabela 6. Efeito dos óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre a
viabilidade de células mononucleares.
Viabilidade (%)
Óleo essencial
10
-4
µ
µµ
µl/ml 10
-3
µ
µµ
µl/ml 10
-2
µ
µµ
µl/ml
B. articulata
96,09
±
3,08 95,83
±
1,58 91,48
±
8,52
+ PHA
91,36
±
8,63 96,10
±
3,89 99,21
±
0,79
B. crispa
95,99
±
4,01 91,48
±
8,52 96,91
±
1,80
+ PHA
83,78
±
16,21 92,62
±
7,34 96,29
±
3,71
B. dracunculifolia
96,92
±
2,91 85,86
±
8,87 94,43
±
5,18
+ PHA
> 99
97,40
±
2,60
> 99
B. gaudichaudiana
84,91
±
15,09 91,67
±
8,32 95,80
±
4,20
+ PHA
> 99
87,97
±
12,03 91,15
±
8,85
Mononucleares (MNC) obtidos de sangue periférico de voluntários sadios foram tratados com
concentrações indicadas de óleos essenciais de
Baccharis
, incubados a 37°C, por cinco dias,
em atmosfera de CO
2
. Em alguns experimentos, os MNC foram simultaneamente expostos a
fitohemaglutinina. Cada valor representa a porcentagem média da viabilidade
±
EPM dos
eventos detectados por citometria de fluxo dos experimentos contendo óleo essencial e o obtido
no controle (n=3).
0.0
0.5
1.0
1.5
Controle
E20
Ba
Bc
Bd
Bg
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
(µl/ml)
Índice de Proliferação
Figura 15. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre a
proliferação de linfócitos humanos
. Mononucleares obtidos de sangue periférico
foram tratados com as concentrações indicadas de óleo essencial de
B. articulata
(
Ba
),
B. crispa
(
Bc)
,
B. dracunculifolia
(
Bd
) e
B. gaudichaudiana
(
Bg
), e incubados a 37°C,
por cinco dias, em atmosfera de CO
2
. Cada coluna representa a média ± EPM do
índice de proliferação obtido da relação entre o número de eventos detectados por
citometria de fluxo na região R2 dos experimentos contendo óleo essencial e o número
obtido no controle (não tratado) de, pelo menos, três experimentos independentes,
realizados em triplicata. E20 indica a concentração de etanol (20µl/ml) usada para
incorporação dos óleos essenciais no meio, usada para monitorar o efeito do solvente.
60
0
1
2
3
4
PHA
E20+PHA
Ba
Bc
Bd
Bg
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
(µl/ml)
*
*
Índice de proliferação
Figura 16. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis sobre a
proliferação de linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina
.
Mononucleares (MNC) obtidos de sangue periférico foram tratados com fitohemaglutinina
(PHA) e com concentrações indicadas de óleo essencial de
B. articulata
(
Ba
),
B. crispa
(
Bc)
,
B. dracunculifolia
(
Bd
) e
B. gaudichaudiana
(
Bg
) e incubados a 37°C, por cinco
dias, em atmosfera de CO
2
. Cada coluna representa a média do índice de proliferação
obtido da relação entre o número de eventos detectados, por citometria de fluxo, na
região R2 dos experimentos contendo óleo essencial e o número obtido no controle de,
pelo menos, três experimentos independentes, realizados em triplicata. *
p ≤
0,05 em
relação a MNC tratados com PHA e 20
µ
l/ml de etanol (E20+PHA).
Simultaneamente, a capacidade desses óleos essenciais em interferir com a
transformação blástica foi avaliada, observando-se o deslocamento dos MNC da
região R1 para a R2 no citômetro de fluxo, cujos resultados estão demonstrados na
Tabela 7. De forma geral, observou-se que, quando incubadas somente com os
óleos essenciais, a maioria das células permaneceu na região R1, independente da
concentração, com a população em R2 não ultrapassando 25%.
Análise de citocentrifugados dessas populações demonstrou que mais de
90% dessas células permaneceram com morfologia de linfócitos, confirmando os
dados obtidos por citometria de fluxo (Tabela 8), sugerindo que os óleos essenciais,
por si só, não têm a habilidade de induzir MNC humanos a proliferar (Figura 15).
Entretanto, quando expostos, simultaneamente a PHA (Figura 16), o aumento do
número de células em R2 foi evidente, passando esses a constituir a população
predominante. Este comportamento também foi confirmado pela análise morfológica
de citocentrifugados corados, com predominância da população de blastos em todas
as culturas onde PHA estava presente (Tabela 8).
61
Tabela 7. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis
sobre a transformação blástica de linfócitos humanos estimulados ou não
por fitohemaglutinina.
Transformação blástica (%)
Controle
17,8
±
2,8
+ PHA
80,2
±
2,8
Etanol 20µ
µµ
µl/ml
16,2
±
3,4
+ PHA
83,5
±
4,2
Óleo essencial
10
-4
µ
µµ
µl/ml 10
-3
µ
µµ
µl/ml 10
-2
µ
µµ
µl/ml
B. articulata
19,7
±
4,6 17,8
±
4,0 18,4
±
3,8
+ PHA
80,6
±
2,4 81,7
±
1,8 81,7
±
1,8
B. crispa
14,2
±
4,2 22,0
±
3,4 25,8
±
7,3
+ PHA
67,7
±
4,5 67,3
±
5,1 67,0
±
5,3
B. dracunculifolia
15,1
±
4,9 17,5
±
3,7 19,8
±
3,6
+ PHA
80,9
±
2,9 80,4
±
3,3 81,5
±
2,5
B. gaudichaudiana
19,8
±
2,0 19,1
±
7,8 19,5
±
6,8
+ PHA
72,2
±
1,4 69,3
±
4,0 64,4
±
9,1
Células mononucleares (MNC) obtidas de sangue periférico foram expostas à concentrações
indicadas de óleo essencial de
espécies de
Baccharis
, incubados a 37°C, por cinco dias, em
atmosfera de CO
2
. Em alguns experimentos, os MNC foram, simultaneamente, expostos à
fitohemaglutinina (PHA). Cada coluna representa a porcentagem média
±
EPM dos valores
resultantes da relação entre R1 e R2, descrita na sessão de Material e Métodos, obtidos por
citometria de fluxo (n=3).
Reforçando ainda esses dados, foi observado diminuição no número médio
de AgNOR por célula após exposição dos linfócitos aos óleos essenciais de
espécies de
Baccharis
, na concentração de 10
-2
µ
l/ml, concomitantemente com o
mitógeno PHA (Figura 17). O efeito foi similar para os quatro óleos essenciais
avaliados, onde para
B. articulata
, o número médio de AgNOR foi de 1,71
±
0,28 [n=2;
F
(5,9)=17,35;
p
<0,01]. Já para
B. crispa
1,76
±
0,05 (n=3;
F
(5,9)=17,35;
p
<0,01), para
B.
dracunculifolia
1,80
±
0,0 [n=2;
F
(5,9)=17,35;
p
<0,05] e, finalmente, para
B.
gaudichaudiana
1,74
±
0,13 [n=3;
F
(5,9)=17,35;
p
<0,01].
62
Tabela 8. Influência de óleos essenciais de Baccharis sobre a morfologia de
linfócitos, avaliada em citocentrifugados corados com May-Grunwald-Giemsa.
Linfócitos (%) Blastos (%)
Controle
85 15
+ PHA
30 70
Etanol 20µ
µµ
µl/ml
89 11
+ PHA
15 85
10
-4
µ
µµ
µl/ml 10
-3
µ
µµ
µl/ml 10
-2
µ
µµ
µl/ml
Óleos essenciais
Linfo
(%)
Blastos
(%)
Linfo
(%)
Blastos
(%)
Linfo
(%)
Blastos
(%)
B. articulata
99 01 97 03 98 02
+ PHA
06 94 09 91 09 91
B. crispa
- - - - - -
+ PHA
43 57 44 56 45 55
B. dracunculifolia
94 06 96 04 95 05
+ PHA
22 78 18 82 19 81
B. gaudichaudiana
- - - - - -
+ PHA
34 66 42 58 46 54
Mononucleares (MNC) obtidos de sangue periférico foram expostos à concentrações de óleo
essencial de espécies de
Baccharis
como indicado, incubados a 37°C, por cinco dias, em atmosfera
de CO
2
. Em alguns experimentos, os MNC foram simultaneamente expostos à fitohemaglutinina. A
morfologia de linfócitos (linfo) e linfoblastos (blastos) foi avaliada em citocentrifugados corados com
May-Grunwald-Giemsa, sob imersão em microscópio comum. Cada valor representa a média de dois
experimentos, onde um mínimo de 100 células foi observado por experimento. (-): não realizado.
Com a finalidade de se esclarecer o comportamento induzido pelos óleos
essenciais, experimentos com o óleo de
B. dracunculifolia
foram realizados. Dessa
forma, em alguns, PHA foi adicionada às culturas de MNC previamente incubadas
por 24 horas com o óleo essencial, na concentração de 10
-2
µl/ml e, em outros, o
óleo essencial foi adicionado após 72 horas de incubação dos MNC com PHA.
O IP obtido para MNC incubados previamente com o óleo essencial e 24
horas depois acrescidos de PHA (
Bd
t0
+PHA
t24
) foi de 1,15
±
0,07 [
F
(4,11)=15,64;
p
<0,05] e, para a população previamente incubada por 72 horas com o mitógeno e
posteriormente acrescida do óleo essencial (
Bd
t72
+PHA
t0
), o IP foi de 1,28
±
0,1
[
F
(4,11)=15,64;
p
<0,01], sendo ambos significativos em relação ao grupo tratado
apenas com etanol, com IP de 1,67±0,07 (E20
t0
+PHA
t24
) e 1,91±0,07 (E20
t72
+PHA
t0
)
(Figura 18), enquanto para a PHA o IP obtido foi de 2,15±0,2. Estes resultados
sugerem que os óleos essenciais interferem tanto na fase de ativação de linfócitos
como na de proliferação, e que outras investigações devem ser realizadas para o
esclarecimento do mecanismo de ação.
63
0
1
2
3
4
PHA
E20+PHA
Ba
*
*
*
*
Bc
Bd
Bg
N°médio de AgNORs/célula
*
Figura 17. Efeito in vitro de óleos essenciais de espécies de Baccharis
sobre a formação de AgNOR em linfócitos humanos estimulados por
fitohemaglutinina.
Mononucleares humanos foram incubados por cinco dias na
presença de PHA e com 10
-2
µl/ml de óleo essencial de
B. articulata
(
Ba
),
B.
crispa
(
Bc)
,
B. dracunculifolia
(
Bd
) e
B. gaudichaudiana
(
Bg
). Citocentrifugados
foram corados para revelação de AgNOR, como descrito na sessão de Material e
Métodos. As colunas representam o n° médio de AgNOR
±
DP/célula (n=2-3,
experimentos independentes). *
p ≤
0,05 em relação a MNC tratados com PHA e
20
µ
l/ml de etanol (E20+PHA).
0
1
2
3
PHA
E20
t0
+PHA
t24
Bd
t0
+PHA
t24
E20
t72
+PHA
t0
Bd
t72
+PHA
t0
>99,0 93,0 >99,0 97,2 >99,0 Viabilidade (%)
*
#
Índice de Proliferação
Figura 18. Efeito in vitro do óleo essencial de B. dracunculifolia sobre a
proliferação de linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina.
Mononucleares obtidos de sangue periférico foram tratados com 10
-2
µ
l/ml de óleo
essencial de
B. dracunculifolia
e, após 24 horas, adicionou-se fitohemaglutinina (PHA)
(t
24
); em outros experimentos, incubou-se as células com PHA por 72 horas e, em
seguida, adicionou-se o óleo essencial (t
72
), as culturas foram incubadas a 37°C, por
cinco dias, em atmosfera de CO
2
. Cada coluna representa a média ± EPM do índice de
proliferação obtido da relação entre o número de eventos detectados por citometria de
fluxo na região R2 dos experimentos contendo etanol ou óleo essencial e o número
obtido no Controle (não tratado) de, pelo menos, três experimentos independentes,
realizados em triplicata. *
p ≤
0,05 em relação a etanol incubado 24 horas antes da PHA
(E20
t0
+PHA
t24
). #
p ≤
0,05 em relação a etanol acrescentado 72 horas após a adição
de PHA (E20
t72
+PHA
t0
). ANOVA, seguida do teste de Tukey.
64
Muitos compostos derivados de plantas utilizadas na medicina popular têm
sido relatados com atividade imunomodulatória e existe um crescente interesse na
identificação e caracterização dessas substâncias (Atal
et al.
, 1986; Lee
et al.
, 1995;
Sharma
et al.
, 1994; Wang
et al.
, 1991).
Com relação à atividade imunomodulatória de óleos essenciais, merecem
destaques os estudos com o óleo essencial de
Anethum graveolens
,
Mentha piperita
e
Pinus sylvestres
, os quais demonstraram inibição dose-dependente da atividade
mitótica de linfócitos humanos incubados com PHA (Lazutka
et al.
, 2001). O oposto
foi observado para a fração do óleo essencial de
Azadirachta indica
, denominado
NIM-76 que, quando testada
in vitro
, promoveu a proliferação de linfócitos na
presença de PHA, efeito imunoestimulatório que também foi observado com
linfócitos isolados de baço de ratos tratados com o óleo (SaiRam
et al.
, 1997).
Interessante ressaltar que há relatos de que compostos monoterpenóides
possuem diferentes modos de ação em relação a células procarióticas e
eucarióticas. Enquanto para células bacterianas são tóxicos, para células
eucarióticas modificam a apoptose e diferenciação, interferem com as modificações
após tradução de proteínas celulares e induzem ou inibem enzimas hepáticas
detoxificantes (Loza-Tavera, 1999).
Portanto, monoterpenos presentes nos óleos essenciais das espécies de
Baccharis
estudadas, como linalool,
α
-terpineol, mirceno e limoneno, podem ser os
responsáveis pelos efeitos observados, por interferirem nos mecanismos envolvidos
com a proliferação de linfócitos. Além disso, é possível que as variações de efeitos
observadas entre as espécies possa derivar da diferença existente entre os
constituintes e/ou suas quantidades.
4.6 ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE
Baccharis
SOBRE O
CRESCIMENTO BACTERIANO
As doenças infecciosas representam um grave e crescente problema de
saúde mundial. Mudanças contínuas de hábitos sociais, avanços tecnológicos e
alterações relacionadas aos próprios microorganismos têm contribuído,
simultaneamente, para o surgimento de novas doenças e para o reaparecimento de
doenças antes controladas (Cohen, 2000). Muitos dos microorganismos que causam
danos à saúde humana possuem resistência à drogas pelo uso inadequado dos
antibióticos. Dessa forma, há a necessidade de se encontrar novas substâncias que
65
possam combatê-los e seria interessante se essas drogas fôssem provenientes de
fontes naturais locais (Sartoratto
et al.
, 2004).
Assim, estudou-se a influência dos óleos essenciais de
Baccharis
sobre o
crescimento bacteriano de cepas padrões de
Enterococcus faecalis
,
Staphylococcus
aureus
,
Pseudomonas aeruginosa
e
Escherichia coli
, bactérias potencialmente
patogênicas ao homem e tidas como agentes responsáveis por quadros infecciosos
comuns. Neste contexto,
Staphylococcus aureus
é agente causador de uma miríade
de lesões cutâneas (bolhas, carbúnculos e impetigo), além de faringite, endocardite,
pneumonia e intoxicação alimentar. Constitui a principal causa de infecção de
pacientes com queimaduras graves e feridas cirúrgicas e só é superado pela
Escherichia coli
como causa principal de infecção hospitalar (Cotran
et al.
, 1994). O
Enterococcus faecalis
causa principalmente endocardite e infecções do trato urinário
(Cotran
et al.
, 1994).
Como ilustrado na Tabela 9, os óleos essenciais inibiram o crescimento das
bactérias gram-positivas
Staphylococcus aureus
e
Enterococcus faecalis
, de forma
dose-dependente, mas não tiveram efeito sobre as gram-negativas. Em geral, o
efeito inibitório foi maior sobre
S. aureus
(Figura 19), à exceção daquele observado
para o óleo essencial de
B. articulata
(10
µ
l), que demonstrou maior atividade sobre
E. faecalis
(15,50
±
0,71 mm).
B. dracunculifolia
, por sua vez, foi a espécie que
demonstrou maior atividade sobre
S.
aureus
na maior concentração avaliada, com
halo de inibição de 15,50
±
1,32 mm.
Entretanto, a atividade inibitória observada foi inferior àquela promovida pelos
antibióticos padrões recomendados pelo NCCLS, ensaiados sob condições
metodológicas semelhantes. É provável que essas diferenças resultem do fato de
que os antibióticos usados são substâncias com elevado grau de pureza, em
contraste com os óleos essenciais investigados, os quais possuem grande variedade
de compostos quimicamente distintos em sua composição, como demonstrado na
introdução deste trabalho.
Além disso, a variação observada na intensidade dos efeitos promovidos
pelas diferentes espécies de
Baccharis
pode ser resultante da capacidade de
difusão de cada óleo essencial no ágar, onde substâncias com potencial
antibacteriano poderiam ficar retidas no papel de filtro.
66
Tabela 9. Atividade antibacteriana dos óleos essenciais de B. articulata, B.
crispa, B. dracunculifolia e B. gaudichaudiana sobre bactérias gram-positivas.
Halo de inibição (mm)
Microrganismos
1,25µl 2,5µl 5µl 10µl
Baccharis articulata
Staphylococcus aureus
9,50±0,71 11,00±0,00 12,17±0,29 13,67±1,15
Enterococcus faecalis —
7,00±0,00 7,50±0,71 15,50±0,71
Baccharis crispa
Staphylococcus aureus
12,00±2,83 12,00±1,41 14,00±0,00 14,50±0,71
Enterococcus faecalis —
7,00±0,00 8,00±0,00 8,00±0,00
Baccharis dracunculifolia
Staphylococcus aureus
12,00±2,83 13,00±2,83 14,33±2,08 15,50±1,32
Enterococcus faecalis — —
8,00±0,00 8,50±0,71
Baccharis gaudichaudiana
Staphylococcus aureus
9,50±2,12 9,75±1,25 11,00±1,41 11,00±1,41
Enterococcus faecalis — — Traços —
Controle
Halo de inibição (mm)
S. aureus E. faecalis E. coli P. aeruginosa
Controle
(concentração)
NCCLS
Obtidos
NCCLS
Obtidos
NCCLS
Obtidos
NCCLS
Obtidos
Ampicilina (10 µg)
27-35 35
NA
NA
16-22 20
NA
NA
Aztreonam (30 µg)
NA
NA NA
NA
28-36 32 23-29 26
Eritromicina (15 µg)
22-30 26
NA
NA NA
NA NA
NA
Oxacilina (1 µg)
18-24 26
NA
NA NA
NA NA
NA
Sulfametoxazol e
trimetroprima (25 µg)
NA
NA
> 20 31
NA
NA NA
NA
Ticarcilina e Ac.
clavulânico
(75/10 µg)
29-37
NT NA
NA
24-30 25 20-28 24
Tobramicina (10 µg)
19-29 25
NA
NA
18-26 19 19-25 24
Etanol absoluto*
(10µl)
— — — —
Óleos essenciais de espécies de
Baccharis
, nas concentrações indicadas, foram incorporados em
discos de papel de filtro (6mm) e distribuídos sobre ágar Mueller Hinton contendo suspensão de
E.
faecalis
,
S. aureus
,
P. aeruginosa
e
E. coli
de acordo com a concentração 0,5 da escala de
McFarland, correspondente a 1,5
×
10
8
UFC/ml. Após 24 horas de incubação a 36°C, observou-se a
formação de halos de inibição, cujos diâmetros foram determinados em mm com o auxílio de uma
régua. Os valores representam a média
±
1DP de dois experimentos independentes e incluem o
diâmetro dos discos. (—): ausência de halo de inibição, (NA): não apropriado, (NT): não testado, (*):
solvente utilizado para incorporação dos óleos essenciais. Antibióticos recomendados pelo NCCLS
foram usados como controle de sensibilidade das estirpes bacterianas.
67
Figura 19. Atividade antibacteriana dos óleos essenciais de espécies de Baccharis.
As fotos
representam os efeitos dos óleos essenciais de
B. articulata
,
B. crispa
,
B. dracunculifolia
e
B.
gaudichaudiana
, nas concentrações de 1,25 - 10µl, sobre o crescimento da bactéria gram-positiva
S.
aureus
através do teste de difusão em ágar Mueller Hinton (
A
). Em destaque, o efeito obtido para o
óleo essencial de
B. dracunculifolia
(
B
).
Embora com discrepâncias nos espectros de atividade e potência, efeitos
antimicrobianos de óleos essenciais têm sido relatados. Por exemplo, Nakati (1994)
demonstrou que bactérias gram-positivas são mais sensíveis à sua ação inibitória
sobre o crescimento, em contraste com Deans e Ritchie (1987), os quais não
encontraram diferenças de ação sobre bactérias gram-negativas e gram-positivas.
Vários fatores podem contribuir para estas diferenças, como a volatilidade e a pobre
solubilidade da maioria dos óleos essencias, principalmente quando se utiliza
métodos de difusão ou diluição dessas misturas em meio microbiológico geralmente
de natureza aquosa. Diferenças na composição dos óleos como já citado, assim
como no processamento das amostras, também podem influenciar as propriedades
antimicrobianas, uma vez que relacionam-se com o perfil e concentração de ativos
(Delaquis
et al.
, 2002), e pouco se sabe sobre os efeitos de interações entre
constituintes individuais, considerando que estas podem acarretar efeitos aditivos,
sinérgicos ou mesmo antagonistas (Davidson e Parish, 1989).
Neste contexto, destilação fracionada dos óleos essenciais de
Anethum
graveolens
,
Coriandrum sativum
e
Eucalyptus dives
demonstrou que a inibição e o
espectro da atividade antimicrobiana das frações diferiu e, em alguns casos,
excedeu à do óleo essencial bruto, sugerindo complexas interações entre os
A
B
68
componentes. Isto foi evidente para o óleo de
Anethum graveolens
, o qual,
possuindo quantidades equivalentes de
D
-limoneno e carvone, demonstrou pouca
atividade quando comparada à fração enriquecida com
D
-limoneno para os
microorganismos testados (Delaquis
et al.
, 2002). Outros relatos, ainda, indicam o
limoneno como mais ativo contra bactérias gram-positivas e fungos em comparação
à bactérias gram-negativas (Baratta
et al.
, 1998; Griffin
et al.
, 1999). Interessante é o
fato de que
D
-limoneno é um composto que foi detectado com particular relevância
no óleo essencial de
B. dracunculifolia
. Além disso, óleo essencial de
B. notosergila
,
cujos principais componentes incluem
α
-pineno, limoneno,
β
-cariofileno e
espatulenol, todos presentes em quantidades variáveis nas espécies estudadas,
demonstraram atividade antibacteriana discreta tanto para bactérias gram-positivas
quanto gram-negativas (Cobos
et al.
, 2001). Portanto, é possível que a presença
desses compostos tenha contribuído para os efeitos microbicidas observados.
Efeitos tóxicos à estrutura e função da membrana geralmente são utilizados
para explicar a ação antimicrobiana de óleos essenciais (Andrews
et al.
, 1980;
Knobloch
et al.
, 1988; Uribe
et al.
, 1985) e, em muitos casos, tem-se indicado que
sua atividade é devida à presença de monoterpenos (Beylier, 1979; Knobloch
et al.
,
1988; Morris
et al.
, 1979), os quais parecem exercer danos à membrana (Sikkema
et
al.
, 1995) que, pelo seu caráter lipofílico, causam partição de suas estruturas,
resultando em expansão, aumento de fluidez e inibição de enzimas (Sikkema
et al.
,
1994a).
A inibição para
S.
aureus
foi similar para os óleos essenciais das espécies
estudadas, as quais possuem limoneno, linalool,
α
-terpineol,
β
-elemeno,
β
-
cariofileno,
epi
β
-santaleno,
γ
-gurjuneno,
γ
-muuroleno, biciclogermacreno,
α
-
muuruleno,
γ
-cadineno,
δ
-cadineno,
α
-calacoreno, ledol e espatulenol em sua
composição, os quais possivelmente tenham colaborado para a ação antimicrobiana
observada.
69
5 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial biológico dos óleos
essenciais de
B. articulata
,
B. dracunculifolia
,
B. crispa
e
B. gaudichaudiana
,
espécies comuns no Paraná e conhecidas popular e coletivamente como carquejas,
usando modelos
in vitro
clássicos.
Nestes modelos, essencialmente constituídos por misturas aquosas, a
primeira etapa foi a incorporação dos óleos essenciais por meio de solventes
orgânicos tradicionais. Dentre esses, tanto o etanol como o DMSO mostraram-se
eficientes, permitindo obter uma coletânea de dados, a qual revelou alguns aspectos
interessantes com relação às atividades biológicas investigadas. Os resultados
apresentados e as considerações que deles puderam ser derivadas permitiram
concluir que:
•
concentrações superiores a 10
-2
µl/ml dos óleos essenciais das espécies de
Baccharis
são tóxicas para leucócitos humanos
•
os óleos essenciais de
B. articulata
e
B. dracunculifolia
têm atividade
antiinflamatória, inibindo significativamente a quimiotaxia de granulócitos
humanos induzida por caseína
•
os óleos essenciais de
B. dracunculifolia
e
B. gaudichaudiana
são dotados
de potencial imunomodulatório, uma vez que inibem a proliferação de
linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina, por atuarem,
possivelmente, sobre os mecanismos de ativação e proliferação celulares
•
os óleos essenciais têm ação bactericida contra bactérias gram positivas,
impedindo o crescimento de
Staphylococcus aureus
e
Enterococcus
faecalis.
Durante esses estudos, observou-se, também, que o perfil cromatográfico do
óleo essencial de
B. dracunculifolia
obtido por HPLC, na faixa do UV se mantém
após exposição à temperatura de 37°C por um período de até cinco dias, permitindo
estudos de atividades biológicas
in vitro
usando células humanas. Outro aspecto
importante observado foi o de que o DMSO inibe significativamente a proliferação de
linfócitos humanos por atuar, provavelmente, sobre os mecanismos de ativação
celular, sendo seu uso impróprio para incorporação de óleos essenciais em meio
aquoso quando se deseja investigar atividades imunomodulatórias com MNC
humanos.
Embora estudos mais aprofundados sejam necessários, os resultados
apresentados neste trabalho constituem uma base rica de dados inéditos ainda não
70
relatados referentes às atividades biológicas de óleos essenciais de espécies de
Baccharis
, sendo uma fonte preliminar de informações científicas importantes que
estimulam investigações futuras.
71
REFERÊNCIAS
Abe, S.; Maruyama, N.; Hayama, K.; Inouye, S.; Oshima, H. e Yamaguchi, H. (2004).
Suppression of neutrophil recruitment in mice by geranium essential oil.
Mediators
Inflamm 13
: 21-24.
Akaike, S.; Sumino, M.; Sekine, T.; Seo, S.; Kimura, N. e Ikegami, F. (2003). A new
ent
-clerodane diterpene from the aerial parts of
Baccharis gaudichaudiana
.
Chem
Pharm Bull 51
: 197-199.
Alonso, J. R. (1998). Tratado de fitomedicina - bases clínicas e farmacológicas.
Buenos Aires, Isis.
Andrews, R. E.; Parks, L. W. e Spence, K. D. (1980). Some effects of Douglas fir
terpenes on certain microorganisms.
Appl Environ Microbiol 40
: 301-304.
Assenmacher, M.; Manz, R.; Miltenyi, S.; Scheffold, A. e Radbruch, A. (1995).
Fluorescence-activated cytometry cell sorting based on immunological
recognition.
Clin Biochem 28
: 39-40.
Atal, C. K.; Sharma, M. L.; Kaul, A. e Khajuria, A. (1986). Immunomodulating agents
of plant origin. I. Preliminary screening.
J Ethnopharmacol 41
: 185-192.
Baratta, M. T.; Dorman, H. J. D.; Deans, S. G.; Figueiredo, A. C.; Barroso, J. G. e
Ruberto, G. (1998). Antimicrobial and antioxidant properties of some commercial
essential oils.
Flavour Frag J. 13
: 235-244.
Barroso, G. M. (1975-6).
Rodriguésia
28: 3.
apud
Verdi, L. G. 2005.
Beylier, N. (1979). Bacteriostatic activity of some Australian essential oils.
Perfumer
and Flavourist 4
: 23-25.
Bier, O. (1977). Bacteriologia e Imunologia. São Paulo, Melhoramentos.
Bokoch, G. M. (1995). Chemoattractant signaling and leukocyte activation.
Blood 86
:
1648-1660.
Brostoff, J. e Male, D. K. (1994). Clinical immunology - an illustrated outline. London,
Mosby.
Brunner, K. T.; Mauel, J.; Cerottini, J. C. e Chapuis, B. (1968). Quantitative assay
of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target
cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.
Immunol 14
: 181-196.
Burgermeister, E.; Endl, J. e Scheuer, W. V. (2003). Activation of cytosolic
phospholipase A2 in human T-lymphocytes involves inhibitor-kappaB and
mitogen-activated protein kinases.
Eur J Pharmacol 466
: 169-180.
Burt, S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications
in foods - a review.
Int J Food Microbiol 3
:223-253.
Buss, A. D. e Waigh, R. D. (1995). Burger's medical chemistry and drug discovery. In
Natural compounds as leads for new pharmaceuticals. Oxford, John Woley &
Sons.
Canet, V.; Montmasson, M. P.; Usson, Y.; Giroud, F. e Brugal, G. (2001). Correlation
between silver-stained nucleolar organizer region area and cell cycle time.
Cytometry 43
: 110-116.
Cantrell, D. A. e Smith, K. A. (1984). The interleukin-2 T-cell system: a new cell
growth model.
Science 224
: 1312-1316.
Cardillo, M. R. (1992). Ag-NOR technique in fine needle aspiration cytology of
salivary gland masses.
Acta Cytol 36
: 147-151.
Carneiro, M. A. A. e Fernandes, G. W. (1996). Ciência Hoje.
Herbivoria 20
: 35-39.
72
Cassatela, M. A. (1995). The production of cytokines by polymorphonuclear
neutrophils.
Immunol Today 16
: 21-26.
Choi, S. Y.; Chae, H. D.; Park, T. J.; Ha, H. e Kim, K. T. (1999). Characterization of
high affinity neurotensin receptor NTR1 in HL-60 cells and its down regulation
during granulocytic differentiation.
Br J Pharmacol 126
: 1050-1056.
Chung, C. Y.; Potikyan, G. e Firtel, R. A. (2001). Control of cell polarity and
chemotaxis by Akt/PKB and PI3 kinase through the regulation of PAKa.
Mol Cell
7
: 937-947.
Civin, C. I. e Loken, M. R. (1987). Cell surface antigens on human marrow cells:
dissection of hematopoietic development using monoclonal antibodies and
multiparameter flow cytometry.
Int J Cell Cloning 5
: 267-288.
Cobos, M. I.; Rodriguez, J. L.; Oliva, M. L.; Demo, M.; Faillaci, S. M. e Zygadlo, J. A.
(2001). Composition and antimicrobial activity of the essential oil of
Baccharis
notosergila
.
Planta Med 67
: 84-86.
Cohen, M. L. (2000). Changing patterns of infectious disease.
Nature 406
: 762-767.
Cooper, H. L. (1972). Studies on RNA metabolism during lymphocyte activation.
Transplant Rev 11
: 3-38.
Corrêa, M. P. (1984). Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas.
Vol 1-6. Rio de Janeiro, Imprensa Nacional.
Cotran, R. S.; Kumar, V. e Robbins, S. L. (1994). Pathologic basis of disease
Philadelphia, W.B. Saunders.
Crocker, J. (1990, 92). Nucleolar organiser regions. In Pathology of the nucleus, U.
J.C.E. (ed). Berlin, New York, Spring-Verlag.
Crocker, J.; Boldy, D. A. e Egan, M. J. (1989). How should we count AgNORS?
Proposals for a standardized approach.
J Pathol 158
: 185-188.
Dacie, J. D. e Lewis, S. M. (1995). Practical haematology. Edinburgh, Churchill
Livingstone.
Davidson, P. M. e Parish, M. E. (1989). Methods for testing the efficacy of
antimicrobials.
Food Technol 52
: 148-154.
De Oliveira, S. Q.; Dal-Pizzol, F.; Gosmann, G.; Guillaume, D.; Moreira, J. C. e
Schenkel, E. P. (2003). Antioxidant activity of
Baccharis articulata
extracts:
isolation of a new compound with antioxidant activity.
Free Radic Res 37
: 555-
559.
Deans, S. G. e Ritchie, G. (1987). Antibacterial properties of plant essential oils.
Int.
J. Food Microbiol. 5
: 165-180.
Dekker, L. V. e Segal, A. W. (2000). Signals to move cells.
Science 287
: 982-985.
Delaquis, P. J.; Stanich, K.; Girard, B. e Mazza, G. (2002). Antimicrobial activity of
individual and mixed fractions of dill, cilantro, coriander and eucalyptus essential
oils.
Int J Food Microbiol 74
: 101-109.
Derenzini, M.; Pession, A. e Trere, D. (1990). Quantity of nucleolar silver-stained
proteins is related to proliferating activity in cancer cells.
Lab Invest 63
: 137-140.
Derenzini, M. e Ploton, D. (1991). Interphase nucleolar organizer regions in cancer
cells.
Int Rev Exp Pathol 32
: 149-192.
Derenzini, M.; Romagnoli, T.; Mingazzini, P. e Marinozzi, V. (1988). Interphasic
nucleolar organizer region distribution as a diagnostic parameter to differentiate
benign from malignant epithelial tumors of human intestine.
Virchows Arch B Cell
Pathol Incl Mol Pathol 54
: 334-340.
73
Dervan, P. A.; Gilmartin, L. G.; Loftus, B. M. e Carney, D. N. (1989). Breast
carcinoma kinetics. Argyrophilic nucleolar organizer region counts correlate with
Ki67 scores.
Am J Clin Pathol 92
: 401-407.
Dupont, P. (1966).
Bull. Soc. Bretogne 41
: 141.
apud
Verdi, L. G. 2005.
Eldin, S. e Dunford, A. (2001). Fitoterapia na atenção primária à saúde. São Paulo,
Manole.
Feske, S.; Draeger, R.; Peter, H. H.; Eichmann, K. e Rao, A. (2000). The duration of
nuclear residence of NFAT determines the pattern of cytokine expression in
human SCID T cells.
J Immunol 165
: 297-305.
Fullas, F.; Hussain, R. A.; Chai, H. B.; Pezzuto, J. M.; Soejarto, D. D. e Kinghorn, A.
D. (1994). Cytotoxic constituents of
Baccharis gaudichaudiana
.
J Nat Prod 57
:
801-807.
Gaines, H.; Andersson, L. e Biberfels, G. (1996). A new method for measuring
lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow
cytometry.
J Immunol Methods 195
: 63-72.
Gery, I.; Gershon, R. K. e Waksman, B. H. (1972). Potentiation of the T-lymphocyte
response to mitogens. I. The responding cell.
J Exp Med 136
: 128-142.
Gery, I. e Waksman, B. H. (1972). Potentiation of the T-lymphocyte response to
mitogens. II. The cellular source of potentiating mediator(s).
J Exp Med 136
: 143-
155.
Gillis, S.; Ferm, M. M.; Ou, W. e Smith, K. A. (1978). T cell growth factor: parameters
of production and a quantitative microassay for activity.
J Immunol 120
: 2027-
2032.
Goodpasture, C. e Bloom, S. E. (1975). Visualization of nucleolar organizer regions
im mammalian chromosomes using silver staining.
Chromosoma 53
: 37-50.
Greaves, M. e Janossy, G. (1972). Elicitation of selective T and B lymphocyte
responses by cell surface binding ligands.
Transplant Rev 11
: 87-130.
Griffin, S. G.; Wyllie, S. G.; Markham, J. L. e Leach, D. N. (1999). The role of
structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial
activity.
Flavour Frag J. 14
: 322-332.
Gustafson, J. E.; Liew, Y. C.; Chew, S.; Markham, J.; Bell, H. C.; Wyllie, S. G. e
Warmington, J. R. (1998). Effects of tea tree oil on
Escherichia coli
.
Lett Appl
Microbiol 26
: 194-198.
Hall, P. A.; Crocker, J.; Watts, A. e Stansfeld, A. G. (1988). A comparison of
nucleolar organizer region staining and Ki-67 immunostaining in non-Hodgkin's
lymphoma.
Histopathol 12
: 373-381.
Hall, P. A. e Levison, D. A. (1990). Review: assessment of cell proliferation in
histological material.
J Clin Pathol 43
: 184-192.
Hayes, A. J. e Markovic, B. (2002). Toxicity of Australian essential oil
Backhousia
citriodora
(
Lemon myrtle
). Part 1. Antimicrobial activity and in vitro cytotoxicity.
Food Chem Toxicol 40
: 535-543.
Heywood, V. H. (1993). Flowering plants of the world. New York, Oxford University
Press.
Hindler, J. (1998). In Antimicrobial susceptibility testing. Essential procedures for
clinical microbiology. Washington, Asm Press.
Homolka, J.; Ziegenhagen, M. W.; Gaede, K. I.; Entzian, P.; Zissel, G. e Muller-
Quernheim, J. (2003). Systemic immune cell activation in a subgroup of patients
with idiopathic pulmonary fibrosis.
Respiration 70
: 262-269.
74
Howell, W. M. e Black, D. A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer: a 1-step method.
Experientia 36
:
1014-1015.
Ivanyi, J. L.; Kiss, A. e Telek, B. (1992). Nucleolar organizer regions in acute and
chronic leukaemias.
Acta Histochem 93
: 453-461.
Jacquet, B.; Canet, V.; Giroud, F.; Montmasson, M. P. e Brugal, G. (2001).
Quantitation of AgNORs by flow versus image cytometry.
J Histochem Cytochem
49
: 433-438.
Janeway, C. A. (2002). Imunologia: o sistema imunológico na saúde e na doença.
Porto Alegre, Artmed.
Janossy, G. e Greaves, M. F. (1972). Lymphocyte activation. II. discriminating
stimulation of lymphocyte subpopulations by phytomitogens and heterologous
antilymphocyte sera.
Clin Exp Immunol 10
: 525-536.
Jarvis, B. B.; Mokhtari-Rejali, N.; Schenkel, E. P.; Barros, C. S. e Matzenbacher, N. I.
(1991). Trichothecene mycotoxins from brazilian
Baccharis
species.
Phytochem
30
: 789-797.
Johansson, S.; Goransson, U.; Luijendijk, T.; Backlund, A.; Claeson, P. e Bohlin, L.
(2002). A neutrophil multitarget functional bioassay to detect anti-inflammatory
natural products.
J Nat Prod 65
: 32-41.
Joly, A. B. (1967). Botânica: introdução a taxonomia vegetal, 7 ed. São Paulo, Cia
Editora Nacional.
Junera, H. R.; Masson, C.; Geraud, G. e Hernandez-Verdun, D. (1995). The three-
dimensional organization of ribosomal genes and the architecture of the nucleoli
vary with G1, S and G2 phases.
J Cell Sci 108 ( Pt 11)
: 3427-3441.
Juven, B. J.; Kanner, J.; Schved, F. e Weisslowicz, H. (1994). Factors that interact
with the antibacterial action of thyme essential oil and its active constituents.
J
Appl Bacteriol 76
: 626-631.
Knobloch, K.; Pauli, A.; Weis, N. e Weigand, H. (1988). Antibacterial activity and
antifungal properties of essential oil components.
J Essential Oil Res 1
: 119-128.
Kristensen, F.; Walker, C.; Joncourt, F.; Bettens, F. e de Weck, A. L. (1982). Human
lymphocyte proliferation. I. Correlation between activated and proliferating T-
lymphocytes.
Immunol Lett 5
: 59-63.
Kubbies, M.; Schindler, D.; Hoehn, H. e Rabinovitch, P. S. (1985). Cell cycle kinetics
by BrdU-Hoechst flow cytometry: an alternative to the differential metaphase
labelling technique.
Cell Tissue Kinet 18
: 551-562.
Kumazawa, S.; Yoneda, M.; Shibata, I.; Kanaeda, J.; Hamasaka, T. e Nakayama, T.
(2003). Direct evidence for the plant origin of Brazilian propolis by the observation
of honeybee behavior and phytochemical analysis.
Chem Pharm Bull (Tokyo) 51
:
740-742.
Lavabre, M. (1997). Aromaterapia: a cura pelos óleos essenciais., 4 ed. Rio de
Janeiro, Record.
Lazutka, J. R.; Mierauskiene, J.; Slapsyte, G. e Dedonyte, V. (2001). Genotoxicity of
dill (
Anethum graveolens
L.), peppermint (
Mentha piperita
L.) and pine (
Pinus
sylvestris
L.) essential oils in human lymphocytes and
Drosophila melanogaster
.
Food Chem Toxicol 39
: 485-492.
Lee, C.; Liu, Q. H.; Tomkowicz, B.; Yi, Y.; Freedman, B. D. e Collman, R. G. (2003).
Macrophage activation through CCR5- and CXCR4-mediated gp120-elicited
signaling pathways.
J Leukoc Biol 74
: 676-682.
75
Lee, G. I.; Ha, J. Y.; Min, K. R.; Nakagawa, H.; Tsurufuji, S.; Chang, I. M. e Kim, Y.
(1995). Inhibitory effects of oriental herbal medicines on IL-8 induction in
lipopolysaccharide-activated rat macrophages.
Planta Med 61
: 26-30.
Lee, G. R.; Foerster, J.; Lukens, J.; Paraskevas, F.; Greer, J. P. e Rodgers, G. M.
(1999a). Wintrobe's clinical hematology, 10 ed. Philadelphia, Lippincott Williams &
Wilkins.
Lee, W.; Kim, Y.; Lee, K. Y.; Kang, C. S.; Lee, K. S.; Shim, S. I. e Han, K. (1999b).
AgNOR of human interphase cells in relation to acrocentric chromosomes.
Cancer Genet Cytogenet 113
: 14-18.
Leek, R. D.; Alison, M. R. e Sarraf, C. E. (1991). Variations in the occurrence of
silver-staining nucleolar organizer regions (AgNORs) in non-proliferating and
proliferating tissues.
J Pathol 165
: 43-51.
Lewis, S. L. e Van Epps, D. E. (1983). Demonstration of specific receptors for
fluoresceinated casein on human neutrophils and monocytes using flow
cytometry.
Inflammation 7
: 363-375.
Lomas, D. A.; Ip, M.; Chamba, A. e Stockley, R. A. (1991). The effect of in vitro and
in vivo dexamethasone on human neutrophil function.
Agents Actions 33
: 279-
285.
Lorente, I.; Ocete, M. A.; Zarzuelo, A.; Cabo, M. M. e Jimenez, J. (1989). Bioactivity
of the essential oil of
Bupleurum fruticosum
.
J Nat Prod 52
: 267-272.
Loza-Tavera, H. (1999). Monoterpenes in essential oils. Biosynthesis and properties.
Adv Exp Med Biol 464
: 49-62.
Lyons, A. B. (2000). Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric
measurement of CFSE dye dilution.
J Immunol Methods 243
: 147-154.
Macey, M. G. (1994). Flow cytometry - clinical applications. Oxford, Blackwell
Scientific Publications.
Mackai, I. R. e Rosen, F. S. (2000). T-cell function and migration.
New Engl J Med
343
: 1020-1034.
Makman, M. H.; Bilfinger, T. V. e Stefano, G. B. (1995). Human granulocytes contain
an opiate alkaloid-selective receptor mediating inhibition of cytokine-induced
activation and chemotaxis.
J Immunol 154
: 1323-1330.
Malagarriga Heras, R. D. P. (1976).
Mem Soc Cienc Nat 23
: 129.
apud
Verdi, L. G.
2005.
Mamaev, N. N. e Mamaeva, S. E. (1990). Nucleolar organizer region activity in
human chromosomes and interphase nuclei of normal, leukemic, and tumor cells
as evaluated by silver staining.
Int Rev Cytol 121
: 233-266.
Manfron, J.B. Comunicação pessoal em agosto de 2005.
Mans, D. R.; da Rocha, A. B. e Schwartsmann, G. (2000). Anti-cancer drug discovery
and development in Brazil: targeted plant collection as a rational strategy to
acquire candidate anti-cancer compounds.
Oncologist 5
: 185-198.
Margni, R. A. (1990). Inmunologia e inmunoquímica. Buenos Aires, Médica
Panamericana.
Martin, S.; Padilla, E.; Ocete, M. A.; Galvez, J.; Jimenez, J. e Zarzuelo, A. (1993).
Anti-inflammatory activity of the essential oil of
Bupleurum fruticescens
.
Planta
Med 59
: 533-536.
Maruyama, N.; Sekimoto, Y.; Ishibashi, H.; Inouye, S.; Oshima, H.; Yamaguchi, H. e
Abe, S. (2005). Suppression of neutrophil accumulation in mice by cutaneous
application of geranium essential oil.
J Inflamm (Lond) 2
: 1.
76
McConnell, E. J.; Wagoner, M. J.; Keenan, C. E. e Raess, B. U. (1999). Inhibition of
calmodulin-stimulated (Ca2+ + Mg2+)-ATPase activity by dimethyl sulfoxide.
Biochem Pharmacol 57
: 39-44.
Merchant, D.; Kahn, R. e Murphy, W. (1964). Handbook of cell and organ culture,
Broken Arrow, Burgess Publishing.
Michel, M. C. (1998). Concomitant regulation of Ca2+ mobilization and G13
expression in human erythroleukemia cells.
Eur J Pharmacol 348
: 135-141.
Midorikawa, K.; Banskota, A. H.; Tezuka, Y.; Nagaoka, T.; Matsushige, K.; Message,
D.; Huertas, A. A. e Kadota, S. (2001). Liquid chromatography-mass spectrometry
analysis of propolis.
Phytochem Anal 12
: 366-373.
Molt, O. e Trka, A. (1983).
Porfum. Kostmet. 64
: 488.
apud
Verdi, L. G. 2005.
Morris, J. A.; Khettry, A. e Seitz, E. W. (1979). Antimicrobial activity of aroma
chemicals and essential oils.
J Am Oil Chem Soc 56
: 595-603.
Mors, W. B.; Rizzini, C. T. e Pereira, N. A. (2000). Medicinal plants of Brazil.
Michigan, Reference Publications.
Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays.
J Immunol Methods 65
: 55-63.
Myers, R. L. (1995). Immunology - a laboratory manual. Dubuque, WCB Publishers.
Nakatani, N. (1994). Antioxidative and antimicrobial constituents of herbs and spices.
Dev. Food Sci. 34
: 251-271.
NCCLS M100-S14 (2004). Performance Standars for Antimicrobial Susceptibility
Testing. An NCCLS Informational Supplement,
24
: 66-67. 40 ed. NCCLS, Wayne,
Pa.
Ofner, D.; Hittmair, A.; Marth, C.; Ofner, C.; Totsch, M.; Daxenbichler, G.; Mikuz, G.;
Margreiter, R. e Schmid, K. W. (1992). Relationship between quantity of silver
stained nucleolar organizer regions associated proteins (Ag-NORs) and
population doubling time in ten breast cancer cell lines.
Pathol Res Pract 188
:
742-746.
Oppenheim, M. M. e Rosenstreich, D. L. (1976). Mitogens in immunobiology. New
York, NY Academic Press.
Parham, P. (2001). O sistema imune. Porto Alegre, Artmed.
Park, Y. K.; Alencar, S. M. e Aguiar, C. L. (2002). Botanical origin and chemical
composition of Brazilian propolis.
J Agric Food Chem 50
: 2502-2506.
Pasotti, D.; Mazzone, A. e Ricevuti, G. (1992). Sistema nervoso e sistema
immunitario: ruolo della morfina e dei peptidi oppioidi su alcune funzioni dei
granulociti neutrofili.
Minerva Med 83
: 433-438.
Ploton, D.; Menager, M.; Jeannesson, P.; Himber, G.; Pigeon, F. e Adnet, J. J.
(1986). Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic
proteins of the nucleolar organizer region at the optical level.
Histochem J 18
: 5-
14.
Qu, J.; Hosoi, K.; Shimojima, T.; Oi, T. e Ikeda, K. (1995). Effects of FMLP and LPS
on [Ca2+]i of peritoneal exudate polymorphonuclear leukocytes following onset of
inflammation.
J Periodontal Res 30
: 153-158.
Quesenberry, P. J. e Colvin, G. A. (2001). Hematopoietic stem cells, progenitor cells,
and cytokines. In Hematology, E. Beutler, M. A. Lichtman, B. S. Coller, T. J. Kipps
e U. Seligsohn (eds). New York, McGraw-Hill.
Rabgaoui, N.; Guerin, M. C. e Torreilles, J. (1994). Casein-derived peptides can
modulate the production of 5-hydroxyeicosatetraenoic acid in human neutrophils.
Biochem Cell Biol 72
: 305-311.
77
Rao, A.; Luo, C. e Hogan, P. G. (1997). Transcription factors of the NFAT family:
regulation and function.
Annu Rev Immunol 15
: 707-747.
Rao, Y. V. e Chakrabarti, R. (2005). Stimulation of immunity in Indian major carp
Catla catla
with herbal feed ingredients.
Fish Shellfish Immunol 18
: 327-334.
Raymond, W. A. e Leong, A. S. (1989). Nucleolar organizer regions relate to growth
fractions in human breast carcinoma.
Hum Pathol 20
: 741-746.
Reeves, G. e Todd, I. (2000). Lectures notes on immunology. Oxford, Blackwell
Science.
Reynaud, D.; Demin, P. M.; Sutherland, M.; Nigam, S. e Pace-Asciak, C. R. (1999).
Hepoxilin signaling in intact human neutrophils: biphasic elevation of intracellular
calcium by unesterified hepoxilin A3.
FEBS Lett 446
: 236-238.
Robbers, J. E.; Speedie, M. K. e Tyler, V. E. (1997). Farmacognosia e
Farmacobiotecnologia. São Paulo, Premier.
Robinson, J. P. (1993). Handbook of flow cytometry methods. New York, Willey-Liss.
Roitt, I. M.; Male, D. K. e Brostoff, J. (2003). Imunologia (São Paulo, Manole).
Roussel, P. e Hernandez-Verdun, D. (1994). Identification of Ag-NOR proteins,
markers of proliferation related to ribosomal gene activity.
Exp Cell Res 214
: 465-
472.
SaiRam, M.; Sharma, S. K.; Ilavazhagan, G.; Kumar, D. e Selvamurthy, W. (1997).
Immunomodulatory effects of NIM-76, a volatile fraction from Neem oil.
J
Ethnopharmacol 55
: 133-139.
Santos, N. C.; Figueira-Coelho, J.; Martins-Silva, J. e Saldanha, C. (2003).
Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and
molecular aspects.
Biochem Pharmacol 65
: 1035-1041.
Santos, N. C.; Prieto, M. J. E.; Morna-Gomes, A.; Betbeder, D. e Castanho, M. A. R.
B. (1997). Structural characterization (shape and dimensions) and stability of
polysaccharide/lipid nanoparticles.
Biopolymers 41
: 511-520.
Sartoratto, A.; Machado, A. L. M.; Delarmelina, C.; Figueira, M. G.; Duarte, M. C. T. e
Rehder, V. L. G. (2004). Composition and antimicrobial activity of essential oils
from aromatic plants used in Brazil.
Brazilian Journal of Microbiology 35
: 275-280.
Sawai, M.; Takase, K.; Teraoka, H. e Tsukada, K. (1990). Reversible G1 arrest in the
cell cycle of human lymphoid cell lines by dimethyl sulfoxide.
Exp Cell Res 187
: 4-
10.
Scott, M. J.; Hoth, J. J.; Gardner, S. A.; Peyton, J. C. e Cheadle, W. G. (2003).
Natural killer cell activation primes macrophages to clear bacterial infection.
Am
Surg 69
: 679-686.
Sedgwick, A. D. e Willoughby, D. A. (1985). Iniciation of the inflammatory response
and its prevention. In Handbook of inflammation, I. L. Bonta, M. A. Bray e M. J.
Parnham (eds). New York, Elsevier.
Shapiro, H. M. (1985). Practical flow cytometry. New York, Alan R. Liss.
Sharma, K. e Sharma, O. P. (2001). Analysis of precocenes in the essential oil of
Ageratum spp. by reverse-phase high-performance liquid chromatography.
Phytochem Anal 12
: 263-265.
Sharma, M. L.; Rao, C. S. e Duda, P. L. (1994). Immunostimulatory activity of
Picrorhiza kurroa
leaf extract.
J Ethnopharmacol 41
: 185-192.
Shome, D. K. e Khurana, N. (1999). Distinctive AgNOR patterns of myeloid and
lymphoid blasts in acute leukemia.
Am J Hematol 61
: 149-152.
78
Sibanda, S.; Chigwada, G.; Poole, M.; Gwebu, E. T.; Noletto, J. A.; Schmidt, J. M.;
Rea, A. I. e Setzer, W. N. (2004). Composition and bioactivity of the leaf essential
oil of
Heteropyxis dehniae
from Zimbabwe.
J Ethnopharmacol 92
: 107-111.
Siddiqui, R. A.; Akard, L. P.; Garcia, J. G.; Cui, Y. e English, D. (1999). Chemotactic
migration triggers IL-8 generation in neutrophilic leukocytes.
J Immunol 162
:
1077-1083.
Sikkema, J.; Debont, J. A. e Poolman, B. (1994a). Interactions of cyclic hydrocarbons
with biological membranes.
J Biol Chem 269
: 8022-8028.
Sikkema, J.; Debont, J. A. e Poolman, B. (1995). Mechanisms of membrane toxicity
of hydrocarbons.
Microbiol Rev 59
: 201-222.
Sikkema, J.; Debont, J. A. M. e Poolman, B. (1994b). Interactions of cyclic
hydrocarbons with biological membranes.
J Biol Chem 269
: 8022-8028.
Silva, G. A. A. B.; Siqueira, N. C. S.; Bauer, L. e Santana, B. M. S. (1978). Óleos
essenciais na flora sulriogrande.
Tribuna Farmacêutica 45-46
: 57-60.
Silva, J.; Abebe, W.; Sousa, S. M.; Duarte, V. G.; Machado, M. I. e Matos, F. J.
(2003). Analgesic and anti-inflammatory effects of essential oils of
Eucalyptus
.
J
Ethnopharmacol 89
: 277-283.
Silva Júnior, A. A. (1997). Plantas medicinais e aromáticas (CD-ROM). Itajaí, Epagri.
Silva, M. O. R. (1978). Brief history of inflammation. In Handbook of experimental
pharmacology, J. R. Vane e S. H. Ferreira (eds). New York, Springer-Verlag.
Simões, C. M. O. e Spitzer, V. (2000). Óleos Essenciais. In Farmacognosia - da
planta ao medicamento., C. M. O. Simões, E. P. Schenkel, G. Gosman, J. C. P.
Mello, L. A. Mentz e P. R. Petrovick, eds. (Porto Alegre/Florianópolis,
Universidade UFRGS/UFSC).
Simoes-Pires, C. A.; Queiroz, E. F.; Henriques, A. T. e Hostettmann, K. (2005).
Isolation and on-line identification of antioxidant compounds from three Baccharis
species by HPLC-UV-MS/MS with post-column derivatisation.
Phytochem Anal
16
: 307-314.
Smith, C. W.; Hollers, J. C.; Patrick, R. A. e Hassett, C. (1979). Motility and
adhesiveness in human neutrophils. Effects of chemotactic factors.
J Clin Invest
63
: 221-229.
Smith, K. A. e Cantrell, D. A. (1985). Interleukin 2 regulates its own receptors.
Proc
Natl Acad Sci U S A 82
: 864-868.
Springer, T. A. (1994). Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte
emigration: the multi-step paradigm.
Cell 76
: 301-314.
Springer, T. A. (1995). Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation
and leukocyte emigration.
Ann Rev Physiol 57
: 827-872.
Takeda, I. J. M. e Farago, P. V. (2001). Vegetação do parque estadual de Vila Velha:
Guia de campo. Curitiba, Serzegraf.
Teodoro-Luis, L. (1955).
Contr. Inst. Geobiol. (Brasil) 5
: 1.
apud
Verdi, L. G. 2005.
Trama, J.; Lu, Q.; Hawley, R. G. e Ho, S. N. (2000). The NFAT-related protein
NFATL1 (TonEBP/NFAT5) is induced upon T cell activation in a calcineurin-
dependent manner.
J Immunol 165
: 4884-4894.
Trere, D. (2000). AgNOR staining and quantification.
Micron 31
: 127-131.
Trere, D.; Farabegoli, F.; Cancellieri, A.; Ceccarelli, C.; Eusebi, V. e Derenzini, M.
(1991). AgNOR area in interphase nuclei of human tumours correlates with the
proliferative activity evaluated by bromodeoxyuridine labelling and Ki-67
immunostaining.
J Pathol 165
: 53-59.
79
Trere, D.; Migaldi, M. e Trentini, G. P. (1995). Higher reproducibility of morphometric
analysis over the counting method for interphase AgNOR quantification.
Anal Cell
Pathol 8
: 57-65.
Trere, D.; Pession, A. e Derenzini, M. (1989). The silver-stained proteins of
interphasic nucleolar organizer regions as a parameter of cell duplication rate.
Exp Cell Res 184
: 131-137.
Trere, D.; Pession, A.; Montanaro, L.; Chieco, P. e Derenzini, M. (1997). AgNOR
protein expression and tumor growth rate of human carcinoma xenografts
growing subcutaneously in nude mice.
Eur J Histochem 41 Suppl 2
: 153-154.
Tuteja, R. e Tuteja, N. (1998). Nucleolin: a multifunctional major nucleolar
phosphoprotein.
Crit Rev Biochem Mol Biol 33
: 407-436.
Ultee, A.; Bennik, M. H. e Moezelaar, R. (2002). The phenolic hydroxyl group of
carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus.
Appl Environ Microbiol 68
: 1561-1568.
Uribe, S.; Ramirez, J. e Pena, A. (1985). Effects of beta-pinene on yeast membrane
functions.
J Bacteriol 161
: 1195-1200.
Verdi, L. G.; Brighente, I. M. C. e Pizzolatti, M. G. (2005). Gênero
Baccharis
(Asteraceae): aspectos químicos, econômicos e biológicos.
Química Nova 28
: 85-
94.
Wang, F. I.; Yang, J. W.; Hung, S. Y. e Pan, I. J. (2001). In vitro migratory responses
of swine neutrophils to
Actinobacillus pleuropneumoniae.
Exp Anim 50
: 139-145.
Wang, J. Z.; Mao, X. J.; Ito, H. e Shimura, K. (1991). Immunomodulatory activity of
polysaccharide from
Acanthopanax obovatus
roots.
Planta Med 57
: 335-336.
Wilkinson, P. C. (1974). Surface and cell membrane activities of leukocyte
chemotactic factors.
Nature 251
: 58-60.
Wilkinson, P. C. (1988). Micropore filter methods for leukocyte chemotaxis.
Methods
Enzymol 162
: 38-50.
Wilkinson, P. C. (1996). Cell Locomotion and chemotaxis: basic concepts and
methodological approaches.
Methods 10
: 74-81.
Wilkinson, P. C. (1998). Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.
J Immunol
Methods 216
: 139-153.
Wilkinson, P. C. e Haston, W. S. (1988). Chemotaxis: an overview.
Methods Enzymol
162
: 3-16.
Woolf, A. (1999). Essential oil poisoning.
J Toxicol Clin Toxicol 37
: 721-727.
Zentay, Z.; Sharaf, M.; Qadir, M.; Drafta, D. e Davidson, D. (1999). Mechanism for
dexamethasone inhibition of neutrophil migration upon exposure to
lipopolysaccharide in vitro: role of neutrophil interleukin-8 release.
Pediatr Res 46
:
406-410.
Zhang, X. Q. e Eyzaguirre, C. (1999). Effects of hypoxia induced by Na2S2O4 on
intracellular calcium and resting potential of mouse glomus cells.
Brain Res 818
:
118-126.
80
ANEXOS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
a) A proposta deste projeto é estabelecer um painel de ensaios biológicos in vitro, que possam,
de forma dinâmica, demonstrar atividades biológicas de constituintes de plantas medicinais
tradicionalmente utilizadas pela população e, simultaneamente contribuir para a elucidação dos
mecanismos celulares e moleculares envolvidos.
b) Caso você participe da pesquisa, será necessário doar uma amostra de sangue a qual será
obtida por punção venosa de uma de suas veias, localizadas na região da prega do cotovelo. A
quantidade de sangue por você doada será destinada à separação dos leucócitos para
padronização e realização de ensaios biológicos.
c) Como em qualquer outro diagnóstico clínico-laboratorial, você poderá experimentar alguns
leves desconfortos relacionados a essa coleta, porém de ordem passageira.
d) Estão garantidas todas as informações pertinentes ao projeto que você queira obter, antes,
durante e depois do estudo.
e) A sua participação neste estudo é voluntária. Você tem a liberdade de se recusar a participar
do estudo ou, se aceitar participar, retirar seu consentimento a qualquer momento.
f) Se qualquer informação relacionada ao estudo for divulgada em relatório ou publicação, isto
será feito sob forma codificada, para que a confidencialidade do doador seja mantida.
g) Em caso de necessidade, você poderá comunicar-se imediatamente com Almeriane Maria
Weffort-Santos, nos telefones 3360 4087 ou 3232 4037.
h) Todas as despesas necessárias para a realização dessa pesquisa (exames, etc...) não
são
de responsabilidade do doador.
i) Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro.
j) Quando os resultados forem publicados, não aparecerá seu nome e, sim, um código.
Eu,____________________________________________, abaixo assinado, li o texto acima e
compreendi a natureza e o objetivo desse estudo do qual fui convidado a participar. Eu entendi
que sou livre para interromper minha participação no estudo a qualquer momento sem justificar
minha decisão e concordo voluntariamente em participar deste estudo.
_______________________________ __/__/__
Assinatura do doador Data
_______________________________ __/__/__
Assinatura do Pesquisador Data
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