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UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
ESTUDO DA EXPRESSÃO DA p16INK4 EM LESÕES
PRECURSORAS ESCAMOSAS DO CÂNCER DO COLO UTERINO
ALESSANDRA EIFLER GUERRA GODOY
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Pretto Serafini
Co-orientadora: Profª. Drª. Jovana Mandelli
CAXIAS DO SUL
2005
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2
ALESSANDRA EIFLER GUERRA GODOY
ESTUDO DA EXPRESSÃO DA p16INK4 EM LESÕES
PRECURSORAS ESCAMOSAS DO CÂNCER DO COLO UTERINO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia da
Universidade de Caxias do Sul, visando a
Obtenção do grau de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador:
Prof. Dr. Eduardo Pretto Serafini
Co-orientadora:
Profª. Drª. Jovana Mandelli
CAXIAS DO SUL
2005
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ALESSANDRA EIFLER GUERRA GODOY
ESTUDO DA EXPRESSÃO DA p16INK4 EM LESÕES
PRECURSORAS ESCAMOSAS DO CÂNCER DO COLO UTERINO
Orientador
Prof. Dr. Eduardo Pretto Serafini
Co-Orientadora:
Profª. Dra. Jovana Mandelli
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da
Universidade de Caxias do Sul, visando obtenção de grau de Mestre em
Biotecnologia.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 4 DE AGOSTO DE 2005.
Prof. Dr. Eduardo Pretto Serafini
Profª. Dra. Jovana Mandelli
Prof. Dr. Celso Piccoli Coelho
Profª. Dra. Maria Isabel Edelweiss
Profª.Dra. Bernardete Nonenmacher
4
AGRADECIMENTOS
Ao orientador Prof. Dr. Eduardo Pretto Serafini pelo constante incentivo,
sempre indicando a direção a ser tomada.
À co-orientadora Profª. Dra. Jovana Mandelli pelo incentivo e constante
disposição em ajudar, desde os pequenos detalhes até os grandes questionamentos.
Aos colaboradores Dr. Ms. Renato Luís Rombaldi e Dra. Sônia Madi, sem os
quais o desenvolvimento clínico não seria possível.
Aos bolsistas Francine Hehn de Oliveira, Sheila Calleari, Aline Salvatti,
Roberta Versetti, Rochelle Pierozan e Bruno Serafini pela constante dedicação e precioso
auxílio que prestaram, nas mais diversas fases de desenvolvimento deste projeto.
Às colegas do Laboratório de Patologia da Universidade de Caxias do Sul,
Nilza Losquiavo e Kamille Losquiavo pelo incansável apoio e auxílio.
À Profª. Dra. Luisa Lina Villa por sua inestimável participação com sugestões e
críticas.
Aos colegas Leonardo Rapone Motta e Luciane Bertuol de Moura pelo
companherismo, por suas críticas e sugestões e pelas intermináveis discussões, das quais
todos saímos vencedores.
Ás colegas Morgana Roman e Anelise Vigolo pela ajuda entusiasmada durante
todos estes meses.
Ao Núcleo de Estudo e Apoio à Pesquisa Biomédica (NEAPB) pelo auxílio na
definição da metodologia estatística.
A toda minha família, em especial ao meu marido, Humberto Tomazi Godoy e
aos meus filhos, Betina, Manoela e Lorenzo, por me darem o privilégio de ter estas fontes
inesgotáveis de inspiração.
5
ÍNDICE
RESUMO 14
ABSTRACT 16
1. INTRODUÇÃO 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20
2.1 O CÂNCER DO COLO UTERINO 20
2.2 LESÕES PRECURSORAS 23
2.3 O HPV E O CÂNCER DO COLO UTERINO 32
2.4 O VÍRUS 35
2.5 O GENOMA VIRAL E OS ONCOGENES 38
2.6 A PROTEÍNA p16INK4 E O CICLO CELULAR 40
2.7 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DA INFECÇÃO PELO HPV E DAS LESÕES
RELACIONADAS AO VÍRUS 47
2.7.1 CITOPATOLOGIA 48
2.7.2 HISTOPATOLOGIA 50
2.7.3 GENITOSCOPIA 51
2.7.4 IMUNOHISTOQUÍMICA 53
2.7.5 HIBRIDIZAÇÃO MOLECULAR 54
2.7.6 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 55
3. MATERIAIS E MÉTODOS 57
3.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA 57
3.2 CITOPATOLOGIA 59
3.3 HISTOPATOLOGIA 61
3.4 DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE HPV-DNA 63
3.5 IMUNOHISTOQUÍMICA 67
3.5.1 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA p16INK4 68
3.6 ANÁLISE DOS DADOS 72
6
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 73
4.1 RESULTADOS DESCRITIVOS DA AMOSTRA 73
4.2 RESULTADOS DA CITOPATOLOGIA 76
4.3 RESULTADOS DA HISTOPATOLOGIA 78
4.4 RESULTADOS DA PCR GENÉRICA PARA HPV-DNA 79
4.5 RESULTADOS DA IMUNOHISTOQUÍMICA PARA p16INK4 82
4.5.1 MÉTODOS PROPOSTOS PELA LITERATURA 83
4.5.1.1 MÉTODO BINÁRIO 83
4.5.1.2 MÉTODO SEMI - QUANTITATIVO
E POR ESCORE 84
4.5.2 MÉTODO PROPOSTO 86
4.5.2.1 MÉTODO QUANTITATIVO POR PERCENTUAL 86
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 93
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95
7. ANEXOS 112
7.1 ANEXO 1: PROTOCOLO PARA ANÁLISE E CARACTERIZAÇÃO
INDIVIDUAL DA AMOSTRA 112
7.2 ANEXO 2: TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO E
ESCLARECIDO 114
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:Positividade de HPV-DNA relacionada ao diagnóstico histopatológico
(n=115). 81
Tabela 2: Expressão da p16INK4 por imunohistoquímica relacionada ao diagnóstico
histopatológico utilizando método binário (n = 115) (p < 0,001 entre os
grupos LEIBG e LEIAG). 83
Tabela 3: Método semi-quantitativo e por escore para graduação da expressão da
p16INK4 por imunohistoquímica (n = 115) (p < 0,001 na comparação entre
os grupos formados por LEIBG e LEIAG). 85
Tabela 4: Expressão da p16INK4 em lesões precursoras do câncer do colo uterino
(classificação de Richart), de acordo com o diagnóstico histopatológico e
resultados de HPV-DNA por PCR (percentagens de casos mostradas entre
parênteses). 89
8
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Equivalências entre as classificações e nomenclaturas utilizadas na histologia e
citologia das lesões precursoras e invasivas do colo uterino. 32
9
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1: Peça cirúrgica mostrando grande carcinoma do colo uterino (modificado de Kumar
et al., 2005). 21
Fig. 2: Comparação entre uma célula superficial normal (à esquerda) e uma célula
intermediária com núcleo aumentado e irregularidade nuclear (400x, HE). 25
Fig 3: Presença de dois coilócitos, um deles binucleado, no centro da foto (100x, HE).25
Fig.4: Célula binucleada no centro, célula com macronucleose e irregularidade nuclear à
direita e abaixo (1000x, HE). 26
Fig.5: a) e b) Grupos de células mostrando intensa hipercromasia, indentações nucleares e
inversão da relação núcleo citoplasma (1000x e 400x, HE). 27
Fig. 6: Características histológicas arquiteturais das NIC 1, NIC 2 e NIC 3, comparadas
com epitélio normal (modificada de Kumar et al.,2005). 30
Fig. 7: Co-fatores na carcinogênese do colo uterino. 34
Fig. 8: Representação esquemática do genoma do HPV-16, mostrando os genes da região
inicial (E1 a E8), da região tardia (L1 e L2) e da região regulatória (LCR) (Munger
& Howley, 2002). 37
Fig. 9: Desenho esquemático mostrando ciclo celular e algumas proteínas reguladoras
(modificado de Kumar, et al. 2005). 41
Fig.10: Desenho esquemático mostrando ciclo celular padrão e a ação de diversas proteína
da família INK (Alberts,et al., 1997). 44
10
Fig. 11: Estratégias em métodos diagnósticos relacionados às lesões e à infecção pelo
HPV. 48
Fig. 12: a) Visão colposcópica de LEIBG no lábio anterior, em branco, após a aplicação de
ác. Acético 3%; b) LEIAG em ambos lábios, coradas em amarelo, após aplicação
de Lugol. 52
Fig. 13: a) Aplicação do anticorpo primário; b) aplicação do anticorpo biotinilado
secundário; c) aplicação da estreptovidina 54
Flg. 14: Fluxograma de atendimento das pacientes no Ambulatório de Patologia do Trato
Genital Inferior (APTGI) do AMCE/UCS. 58
Fig. 15: a) Célula de aspecto imaturo, com macronucleose e irregularidade nuclear, em
comparação com outras células intermediárias normais; b) grupo de três coilócitos
(400x, Pap). 60
Fig. 16: Histopatologia: a) epitélio normal; b) NIC 3 (100x, HE). 62
Fig. 17:Histopatologia:a) NIC 2; b)epitélio infectado pelo HPV (100x, 1000x, HE).62
Fig. 18: Fluxograma de determinação da presença de HPV-DNA em amostras cérvico-
vaginais. 63
Fig.19: Fluxograma da determinação de HPV-DNA nas amostras embebidas em
parafina. 64
Fig. 20: Correlação entre os métodos de graduação da p16INK4. 69
Fig. 21: Expressão da p16INK4 por imunohistoquímica: a) coloração negativa; b) coloração
fortemente positiva (100% de células coradas); c) Coloração fortemente positiva
(50% de células coradas); d) coloração fortemente positiva,demonstrando método
de contagem (82% de células coradas). 71
11
Fig. 22: Fluxograma de condução das amostras. 73
Fig.23: Presença de exame citopatológico prévio. 76
Fig. 24: Distribuição dos exames conforme diagnóstico histopatológico (n=110). 77
Fig.25: Distribuição dos casos conforme diagnóstico histopatológico utilizando a
classificação preconizada por Richart (n=144). 78
Fig.26: Distribuição da presença de HPV-DNA por PCR. 79
Fig.27: Fotomicrografia de um caso mostrando postividade intensa para p16INK4 (100%),
dividida em 4 quadrantes, para contagem de células 87
Fig.28: Distribuição dos casos conforme o percentual de células positivas para p16INK4,
relacionada aos grupos de diagnóstico citopatológico. 87
12
LISTA DE ABREVIATURAS
HPV - Papilomavírus humano
DNA - ácido desoxirribonucléico
RNA - ácido ribonucléico
NIC - neoplasia intra-epitelial cervical
PAP - teste de Papanicolaou
PCR - reação em cadeia da polimerase
CDK - quinases dependentes de ciclina
pRb- proteína do retinoblastoma
LEIBG- lesão escamosa intra-epitelial de baixo grau
LEIAG- lesão escamosa intra-epitelial de alto grau
JEC - junção escamo-colunar
HE - hematoxilina-eosina
CIS - carcinoma “in situ”
E2F - fator de elongação 2
CDC - center of disease control and prevention (USA)
SIDA - síndrome da imunodeficiência adquirida
INCA – Instituto Nacional do Câncer
E - região inicial (“early”)
L - região Tardia (“late”)
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences
UCS - Universidade de Caxias do Sul
AMCE – Ambulatório Central
Pb - pares de bases
TRIS - solução de hidroximetil amino metano
EDTA - solução de bissódico hidratado
TE - solução tampão (Tris + EDTA)
13
TBE - solução tampão (Tris + EDTA + ac.bórico)
PBS - solução salina tamponada com fosfato
CGA - campo de grande aumento (400x)
APTGI – Ambulatório de Patologia do Trato Genital Inferior
TEP - solução detergente (Tris + EDTA + proteinase K)
14
RESUMO
O câncer de colo uterino é uma das neoplasias de maior incidência em todo o
mundo, inclusive no Brasil. O desenvolvimento da neoplasia cervical é uma rara
conseqüência a longo prazo da infecção viral por certos tipos de Papilomavírus humano
(HPV) em associação com outros fatores. Sabe-se que a fase invasora do carcinoma do
colo uterino é precedida pelas lesões precursoras. Entretanto, nem todas as mulheres
infectadas pelo HPV irão desenvolver lesões precursoras e um número ainda menor chegará
à fase invasora. Muitos pesquisadores ao redor do mundo têm buscado um biomarcador que
possa separar estes grupos e indicar quais mulheres possuem maior risco para o
desenvolvimento da doença invasora. A proteína p16INK4, bem como outros marcadores
do ciclo celular, mostra-se superexpressa nas lesões precursoras do câncer do colo uterino
e tem sido tratada como um provável marcador biológico de progressão destas lesões. O
objetivo do estudo foi identificar a expressão da p16INK4 em lesões precursoras do câncer
do colo uterino, através da técnica de imunohistoquímica, correlacionando esta com o grau
das lesões e com a presença de infecção por HPV. O material analisado constituiu-se de
amostras de colo uterino de 144 mulheres, atendidas em ambulatório de ginecologia
(AMCE-UCS), no período de dezembro/2003 a maio/2005. Foram realizados os
procedimentos diagnósticos de citopatologia, histopatologia, pesquisa de HPV-DNA por
PCR e pesquisa da expressão da p16INK4 por imunohistoquímica. A prevalência de HPV-
DNA na amostra, incluindo-se grupo controle, foi de 66,7% e a prevalência da expressão da
p16INK4 no mesmo grupo foi de 55,0%. O percentual de células coradas pela p16INK4
variou 10 e 100%, tanto no grupo constituído por amostras de NIC1/HPV quanto no grupo
constituído por NIC 2/NIC 3. A expressão da p16INK4 no grupo NIC 1/HPV foi de 48,3%
enquanto que no grupo NIC 2/NIC 3 foi de 94,3%, com p < 0,001, mostrando clara
diferença entre os grupos. Embora este estudo não seja conclusivo para definir a p16INK4
como biomarcador de progressão das lesões pré-malignas do colo uterino, ele é muito
15
indicativo desta situação em vista da forte associação da expressão da p16INK4 com as
lesões precursoras, notadamente NIC 2 e NIC3.
16
ABSTRACT
Cervical cancer is one of the most frequent malignancies worlwide, including
Brazil. The development of cervical is a long term consequence of papilloma virus
infection, in association with other factors. Pre-malignant intraepithelial lesions precede
invasive cervical cancer however not all women HPV infected will develop pre-malignant
lesions and only a small number os these will reach the invasive phase of disease. The
search for a marker to foresse which lesions will develop to invasive cancer is a matter of
concern of several research groups around the world. Several cell cycle markers have been
studied for these purpose among them the p16INK4 protein which is overexpressed in
cervical pre-malignant lesions. The aim of the present study was it analyse the expression
of the p16INK4 protein by imunohistochemistry in pre-malignant lesions of the uterine
cervix. Samples of 144 women from a public female ambulatory in the period of dec/2003
to may/2005 were included in the study. Cytopathology, histopathology and presence of
HPV-DNA were correlated with p16INK4 expression. HPV-DNA was found in 66,7% of
the samples, inlcuding negative controls. p16INK4 prevalence was 55% in the same group.
NIC 1/HPV and NIC 2/ NIC 3 group showed a 10 to 100% variation on the percentage of
p16INK4 positive cells. The expression of p16INK4 was 48,3% in NIC 1/ HPV samples
and 94,3% in NIC 2/ NIC 3 samples (p<0,001) showing a clear cut difference between
these two groups. Although our results are not conclusive to define p16INK4 as a marker of
17
neoplastic progression they showed a strong association of the expression of p16INK4 with
premalignant cervical lesions in special with the higher grade ones (NIC 2/ NIC 3).
18
1. INTRODUÇÃO
O câncer do colo uterino é uma das neoplasias de maior incidência em todo o
mundo, inclusive no Brasil, sendo responsável por milhares de mortes a cada ano, grande
parte delas ocorrendo em mulheres em plena idade produtiva. Ao longo dos últimos
cinqüenta anos, diversos pesquisadores têm estudado esta neoplasia, chegando ao ponto de
tornar-se uma das mais bem conhecidas. Sabe-se, até o momento, que a fase invasora do
carcinoma do colo uterino é precedida por uma fase intra-epitelial, caracterizada como
“lesões precursoras” ou “pré-malignas”. Sabe-se, também, que nem todas as mulheres que
desenvolvem estas “lesões precursoras” irão evoluir para carcinoma invasor. Somente uma
pequena parcela irá comportar-se desta maneira. Nos últimos anos, tem-se presenciado um
esforço muito grande da ciência em tentar identificar, dentre as “lesões precursoras” , as
que irão evoluir para a fase invasora do câncer. Entretanto, apesar dos esforços, ainda não
foi possível identificar este pequeno grupo.
A p16INK4 é uma proteína que participa do ciclo celular , estando
superexpressada em uma série de neoplasias, inclusive carcinoma do colo uterino.
O objetivo geral do presente estudo é verificar a expressão da p16INK4 em
lesões precursoras do câncer do colo uterino em pacientes da região nordeste do Rio
Grande do Sul, correlacionando a expressão da p16INK4 por imuno-histoquímica em
19
lesões precursoras do câncer do colo uterino com os achados dos métodos convencionais
(citologia e histopatologia).
20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. O CÂNCER DO COLO UTERINO
O câncer do colo uterino constitui problema de grande impacto populacional, já
que o tumor incide em mulheres jovens, em idade fértil e profissionalmente ativas. As
lesões neoplásicas do colo uterino associam-se a fatores como falta de higiene, elevado
número de parceiros sexuais e baixo nível sócio-econômico, fatores estes responsáveis pela
sua incidência em muitos países subdesenvolvidos (Miranda et al., 2000).
Há cerca de 50 anos, o câncer do colo uterino representava a primeira causa de
morte por neoplasia maligna em mulheres em todo o mundo, o que despertou o interesse de
vários grupos de investigadores. Hoje, a neoplasia do colo uterino é a mais bem estudada e
conhecida entre todas as neoplasias, sendo bem estabelecidos fatores de risco e lesões
precursoras, cujo diagnóstico pode ser feito mais precocemente, diminuindo a morbidade e
mortalidade e aumentando a taxa de cura (Miranda et al. 2000).
No mundo todo, o câncer de colo uterino ocupa o segundo lugar, perdendo apenas
para as neoplasias de pele. O diagnóstico precoce das lesões precursoras do carcinoma do
colo uterino, bem como seu tratamento, deve diminuir a incidência de neoplasias invasoras.
O colo uterino é um dos órgãos mais estudados do corpo humano, não só pela alta
21
incidência de neoplasias, mas também pela relativa facilidade de acesso dos meios de
investigação (Rivoire et al., 1993; Eluf Neto,1998; O´Shaughnessy et al.,2002).
No Brasil, excluindo-se as neoplasias não-melanocíticas de pele, o câncer de colo
uterino (fig. 1) ocupa o primeiro lugar entre as neoplasias em mulheres. O Rio Grande do
Sul é o único estado em que o câncer de colo uterino ocupa o segundo lugar, com taxa
estimada para o ano de 2005, de 33,96/100.000 mulheres, sendo que a neoplasia maligna
mais freqüente em mulheres é o carcinoma da mama, cuja taxa estimada para o ano de 2005
é de 92,5/100.000 mulheres. Segundo estimativas do Instituto Nacional do Câncer (INCA),
o Rio Grande do Sul é o estado que possui a mais alta taxa estimativa de câncer do colo
uterino em todo o Brasil (INCA, 2005). Esta taxa representa a ocorrência de 21 mil novos
casos de câncer do colo uterino em 2005, ficando atrás apenas da mama (49 mil) e dos
tumores de pele não-melanoma (57 mil) em mulheres (INCA, 2005).
Fig.1: Peça cirúrgica mostrando grande carcinoma de colo uterino (modificado de Kumar et al.,2005).
22
Parkin et al. (2001) estimaram para o ano de 2000, 10 milhões de novos casos de
câncer no mundo, sendo 471 mil de colo uterino, ocupando o 2º lugar em mulheres
(Parkin et al., 2001), o que representa 12% de todas as neoplasias em mulheres. Quase a
metade delas vão morrer da doença (Yuenyao & Ramirez, 2002). Estima-se que,
mundialmente, duas em cada 100 mulheres terão câncer do colo do útero antes de
completarem 80 anos. Cerca de 95% deles poderiam ser curados, se tratados precocemente
(Rivoire et al. 1993). A mortalidade por câncer do colo uterino é consideravelmente
menor que a incidência. Em países desenvolvidos, a sobrevida média estimada em 5 anos
varia de 59 a 69%. Em países em desenvolvimento, os casos são encontrados em estágios
relativamente avançados e, conseqüentemente, a sobrevida média é de cerca de 49% em 5
anos, que também é a média mundial (INCA, 2005).
Em 2001, estima-se ter havido 13 mil casos novos de câncer cervical somente
nos Estados Unidos (Parkin et al. 1999). No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA)
previa 16.480 novos casos de câncer de colo do útero e 4.110 óbitos para o ano de 2003. De
acordo com dados absolutos sobre a mortalidade por câncer do INCA, o câncer de colo de
útero foi responsável pela morte de 3.953 mulheres no Brasil em 2000. Entretanto, esses
números podem estar subestimados em vista da subnotificação de novos casos, do alto
número de óbitos notificados com causas mal definidas e dos casos notificados com
informações insuficientes (Instituto Nacional do Câncer – INCA, 2004).
23
2.2 LESÕES PRECURSORAS
No início do século XX, a observação das semelhanças morfológicas entre as
células do carcinoma de colo uterino francamente invasor e as células de áreas adjacentes
ao tumor, diferindo das primeiras apenas pela ausência de invasão, representou o marco
inicial na identificação das lesões precursoras do câncer do colo uterino (Miranda et al.,
2000).
Em 1932, Broders reintroduziu o termo carcinoma “in situ” (CIS), o qual foi
primeiramente utilizado por Schottlander e Kermauner, referindo-se àquelas lesões nas
quais há um grande número de alterações morfológicas restritas ao epitélio, não se
evidenciando ruptura da camada basal (Wright et al.,1994; Miranda et al., 2000). Em 1956,
foi introduzido o termo displasia para designar lesões de caráter progressivo dentro de um
espectro, tendo em um extremo as células epiteliais normais e, no outro, as do carcinoma
“in situ” (normal > displasia leve > displasia moderada > displasia severa/carcinoma “in
situ” > carcinoma invasor). No final da década de 60, Richart introduziu o termo neoplasia
intra-epitelial cervical (NIC) para referir-se ao espectro de alterações intra-epiteliais que se
iniciariam com a displasia leve e culminariam com o carcinoma “in situ” e, daí, passando a
invadir os tecidos, rompendo a camada basal do epitélio (Miranda et al., 2000). Esta relação
temporal foi descrita por Smith e Pemberton (Wright et al., 1994).
O termo neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) foi proposto por Richart e Barron
em 1969, devido à concepção da natureza progressiva das lesões que levariam ao câncer
cervical invasor. O termo neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) representa uma lesão
24
histológica do epitélio cervical (Wright, et al., 1994). É um termo abrangente que engloba
todos os precursores do carcinoma escamoso da cérvice uterina (Barrasso & Guillemotonia,
1999). Por definição, é assintomática e identificada mais comumente após a detecção de
células disceratóticas
1
em exame citológico de rotina (Buckley, 1995).
Em dezembro de 1988, um pequeno grupo de especialistas, liderados por Kurman
e Solomon, introduziram a nomenclatura conhecida como Sistema de Bethesda para
utilização nos relatórios diagnósticos de lesões pré-malignas do colo uterino, na rotina da
citopatologia (Kurman, 2004).
No sistema de Bethesda, lesões intra-epiteliais escamosas compreendem um
espectro de anormalidades encontradas e restritas ao epitélio escamoso, associadas ao
papilomavírus humano (HPV), as quais representam as lesões precursoras do câncer do
colo uterino. No sistema de Bethesda, este espectro está dividido em: lesão escamosa intra-
epitelial de baixo grau (LEIBG) e de alto grau (LEIAG). As LEIBG englobam diversas
alterações celulares chamadas de “efeito citopático viral” (coilocitose) e a displasia leve,
também chamada de neoplasia intraepitelial cervical 1 (NIC 1), na nomenclatura proposta
por Richart. As LEIAG englobam as displasias moderada, severa e o carcinoma “in situ”,
ou NIC 2, 3 e carcinoma “in situ” (Wright, 2004).
O diagnóstico de alterações citopáticas virais e displasia leve (LEIBG) obedece aos
seguintes critérios (Wright, 2004) (figs.2;3;4):
- presença de células isoladas ou em grupos;
- alterações citológicas confinadas as células superficiais;
1
Células disceratóticas são comumente observadas em infecção pelo HPV. Mostram-se em grupos
tridimensionais, eosinofílicos, com núcleo picnótico (Schneider &Schneider, 1998).
25
- aumento nuclear maior que três vezes a área do núcleo de uma célula
intermediária normal;
- vários graus de hipercromasia, acompanhados de variações na forma e número
dos núcleos; presença de binucleação e multinucleação;
- cromatina uniformemente distribuída, por vezes granular;
- nucléolo geralmente ausente;
- bordas citoplasmática distintas;
- presença de coilocitose (cavitação perinuclear);
- presença de orangeofilia.
Fig. 2: Comparação entre uma célula superficial normal (à esquerda) e uma célula intermediária
(seta) com núcleo aumentado e irregularidade nuclear (400x, coloração de Papanicolaou).
↓
26
Fig.3: Presença de dois coilócitos, um deles binucleado, no centro da foto (100x, coloração de
Papanicolaou).
Fig.4 Célula binucleada no centro (seta), célula com macronucleose e irregularidade nuclear à direita
e abaixo (1000x, Papanicolaou).
Para o diagnóstico de LEIAG (NIC 2, 3 e carcinoma “in situ”) tem-se os seguintes
critérios, segundo Wright et al. (2004) (fig. 5):
↓
27
- alterações citológicas afetam células menos maduras que aquelas vistas nas
LEIBG;
- as células ocorrem isoladas, em grupos, ou em pequenos agregados de aspecto
sincicial;
- hipercromasia nuclear acompanhada por intensa variação nuclear tanto em
forma quanto em tamanho;
- marcado aumento da relação núcleo/citoplasma;
- cromatina grosseira e granular;
- contorno nuclear irregular por vezes formando indentações;
- nucléolo geralmente ausente, mas pode estar presente eventualmente;
- aparência citoplasmática variável , mas pode aparecer com aspecto imaturo e
denso.
Fig.5: A e B) grupos de células mostrando intensa hipercromasia, indentações nucleares e inversão da relação
núcleo citoplasma (seta) (1000x e 400x, coloração de Papanicolaou).
A B
↓
28
Segundo a noção básica da história natural da neoplasia de colo uterino, NIC1,
NIC2 e NIC3 seriam estágios de uma única doença, constituindo um contínuo em fases
progressivas da doença. Tal afirmação tem sido questionada, uma vez que estudos mostram
que, na maioria das mulheres com diagnóstico de NIC 2 e NIC 3, não se havia detectado
alterações sugestivas de NIC1 em seus testes anteriores. O resultado foi interpretado como
indicação de que NIC 1 e NIC 2/ NIC3 representariam distintos processos de doença, nos
quais NIC 1 seria a manifestação morfológica da infecção pelo HPV, enquanto que, NIC2/
NIC3 constituiriam, além da própria manifestação morfológica da infecção pelo HPV, a
verdadeira lesão precursora do carcinoma do colo uterino (Schiffman, 1995).
A terminologia das lesões intra-epiteliais cervicais tem evoluído ao longo dos anos e
continuam se modificando nos dias de hoje. Segundo Rosai et al., (1996), algumas
premissas básicas caracterizam estas lesões:
1 – Praticamente todos os carcinomas invasores são precedidos por um estágio no
qual as células anormais são confinadas ao epitélio (estágio intra-epitelial);
2 – As lesões intra-epiteliais compartilham muitas características citológicas com o
estágio invasivo, como, por exemplo, aumento do tamanho nuclear, irregularidades e
hipercromasia nuclear, aumento da atividade mitótica e alteração do padrão de maturação,
existindo, ainda, diminuição ou ausência de glicogênio;
3 – As células de lesões invasoras mostram diversas anormalidades morfológicas
que estão relacionadas a alterações citogenéticas, ploidia de DNA
2
, proliferação celular e
2
Quantidade de DNA de cada célula (Alberts, et al., 1997)
29
alterações moleculares. Lesões de baixo grau costumam ser euplóides
3
ou
poliplóides
4
,enquanto que as lesões de alto grau costumam ser aneuplóides
5
. Relação
similar tem sido demonstrada no que diz respeito à expressão aberrante de várias
queratinas, proteína p53 e oncogene “ras”. As evidências sugerem a existência de uma
seqüência de eventos que, em alguns casos, leva à progressão da doença e, em outros, pára
e até mesmo regride;
4 – Na maioria dos casos, as lesões envolvem, não o epitélio escamoso nativo e,
sim, as áreas de metaplasia
6
, localizadas na zona de transformação (Rosai et al., 1996).
As NICs usualmente desenvolvem-se em epitélio escamoso metaplásico da zona de
transformação. As lesões vão desde neoplasia intra-epitelial leve, também chamada de NIC
1, até a severa, ou NIC 3. A diferenciação da NIC raramente é uniforme ao longo da área
afetada e tende a ser mais leve adjacente ao epitélio ectocervical e mais severa adjacente ao
epitélio endocervical. Uma mulher com disceratose persistente no exame citológico, tem
um risco 28 vezes maior de desenvolver um carcinoma invasor, quando comparada com
aquelas cujas alterações foram revertidas com tratamento (McIndoe et al., 1984;
O´Shaughnessy et al., 2002).
3
Quantidade de DNA normal de uma célula humana (2n) (Alberts, et al.,1997).
4
Quantidade acima do normal de DNA em uma célula etc., múltiplo de n (Alberts et al.,1997).
5
Quantidade acima do normal de DNA em uma célula, não sendo múltiplo exato de n (Rubin & Farber,
1999).
6 Substituição do epitélio maduro (no caso, glandular) por outro da mesma linhagem, também maduro (no
caso, escamoso) (Brasileiro Filho, et al.,2000).
30
As NICs são compostas por uma população heterogênea de células com grande
diversidade em relação ao seu grau de maturação, proliferação e atipia. Com a classificação
das NICs, as lesões são graduadas em 1, 2 e 3, correspondendo à displasia leve, moderada
e severa/carcinoma “in situ”. Clinicamente, a distinção mais importante é entre NIC1 (lesão
escamosa intra-epitelial de baixo grau) e NIC 2 e 3 ( lesão escamosa intra-epitelial de alto
grau), pois são tratadas de maneiras diferentes. As NICs têm sido tradicionalmente
graduadas de acordo com a espessura de comprometimento do epitélio escamoso normal
por células parabasais proliferadas anormais (na espessura), considerando-se também atipia
nuclear e figuras de mitose (Kurman et al.,1992).
As neoplasias intra-epiteliais cervicais são caracterizadas por proliferação e
maturação celulares anormais, com presença de atipias nucleares (Kurman et al., 1992). As
anormalidades como: aumento nuclear, aumento da relação núcleo/citoplasma,
pleomorfismo e hipercromasia, estão presentes em níveis variáveis do epitélio a partir da
camada basal com presença de mitoses atípicas. A atividade mitótica está freqüentemente
aumentada. Embora as mitoses atípicas sejam encontradas nas NIC 1, são vistas com
maior freqüência nas NICs 2 e 3 (Kurman et al., 1992). As figuras de mitose normais
variam em número e não afetam o diagnóstico (Buckley, 1995).
A maturação anormal do epitélio se manifesta pela perda da polaridade e
desorganização arquitetural. O grau de maturação é inversamente relacionado com a
severidade da lesão. As células parabasais imaturas possuem relação núcleo/citoplasma
invertida. A maturação costuma ocorrer nas camadas mais superficiais, nas quais as células
adquirem citoplasma mais eosinofílico (Kurman et al., 1992). Nas NIC 1 (fig.6), a
31
maturação citoplasmática ocorre nos 2/3 mais superficiais do epitélio. Na NIC 2, a
maturação citoplasmática é limitada ao terço superior do epitélio. Já na NIC 3, a maturação
citoplasmática, que é mínima, ocorre apenas em pequena porção do terço superficial do
epitélio, ou está ausente (Buckley, 1995).
NORMAL NIC 1 NIC 2 NIC 3
Fig. 6: Características histológicas arquiteturais das NIC 1, NIC 2 e NIC 3, comparadas com epitélio
normal (modificada de Kumar et al.,2005).
A atipia nuclear é a marca registrada das neoplasias intra-epiteliais cervicais e,
geralmente, tomam duas formas: coilocitose e discariose. A forma que ocorre mais
freqüentemente nas camadas mais superficiais e é a manifestação da infecção pelo HPV,
também chamada de coilocitose. A coilocitose pode ser confundida com epitélio escamoso
normal com proeminente vacuolização citoplasmática. Entretanto, além das atipias
nucleares presentes nos coilócitos, estes se apresentam como uma alteração focal, enquanto
que as células vacuoladas do epitélio normal estão presentes ao longo de uma grande e mal
definida área de epitélio (Kurman et al., 1992).
32
A outra forma de atipia, também chamada de discariose, está presente nas camadas
mais profundas do epitélio, nas NIC 1, e ocupa progressivamente níveis mais superficiais
do epitélio conforme avança para NIC 2 e NIC3. Estas células atípicas têm aumento da
relação núcleo/citoplasma, condensamento de cromatina, hipercromasia e pleomorfismo
nuclear (Kurman et al., 1992). Se a proliferação está confinada ao terço inferior do epitélio,
a lesão é classificada como NIC1. Os dois terços superiores do epitélio contêm células
maduras e outras anormais, com cromatina condensada e núcleos pleomórficos. Nesta
categoria estão incluídas, também, as lesões caracterizadas por coilocitose com mínima
proliferação na camada basal ou, até mesmo, sem proliferação da camada basal (Kurman et
al., 1992).
Quando a proliferação das células parabasais atípicas envolve entre 1/3 e 2/3 da
espessura do epitélio, a lesão é classificada como NIC 2 e, mais de 2/3 da espessura do
epitélio escamoso, como NIC 3 (lesão escamosa intra-epitelial de alto grau, conforme
classificação citológica de Bethesda) (Kurman et al., 1992). As nomenclaturas utilizadas
para diagnóstico das lesões e a equivalência entre as mesmas estão apresentadas no quadro
1.
As alterações associadas ao HPV, tais como coilócitos e multinucleação, são vistas
mais freqüentemente associadas a NIC 1 e NIC 2 e costumam ser mais discretas ou
ausentes em NIC 3, provavelmente reflexo da integração do HPV ao genoma das células
(Buckley, 1995).
33
Tradicional Richart (histologia) Bethesda (citologia)
Normal Normal Negativo
HPV HPV LEIBG
Displasia Leve NIC 1
Displasia Moderada NIC 2 LEIAG
Displasia Severa NIC 3
Carcinoma “in situ”
Carcinoma invasor Carcinoma Invasor Carcinoma invasor
Quadro 1: Equivalências entre as classificações e nomenclaturas utilizadas na histologia e citologia das lesões
precursoras e invasivas do colo uterino.
2.3 O HPV E O CÂNCER DO COLO UTERINO
Uma das maiores descobertas em etiologia do câncer em seres humanos foi o
reconhecimento de que o câncer cervical é uma conseqüência da infecção por alguns tipos
de HPV. Em termos de saúde pública, este achado é quase tão importante quanto a
descoberta da associação entre o fumo e o câncer de pulmão, ou a infecção crônica pelos
vírus da hepatite B ou da hepatite C e o risco de câncer de fígado (Bosch, et al., 2002).
A infecção pelo papiloma-vírus humano (HPV) tem sido estabelecida como a
causa principal das neoplasias intra-epiteliais cervicais (NICs) e do câncer cervical
(Kjellberg et al., 2000; van der Graaf et al., 2002). Além disso, é considerada uma das
doenças sexualmente transmissíveis (DST) mais comuns ao redor do mundo (Sedlacek,
34
1999; Falls,1999, Ledger et al., 2000), sendo detectada em quase 100% das lesões pré-
neoplásicas e neoplásicas do colo uterino (Murphy et al., 2003). Em 1996, o “Center for
Disease Control and Prevention” (CDC – Centro de Controle e Prevenção de Doenças /
USA) estimava em 500 mil a 1 milhão de casos novos por ano de infecção pelo HPV,
enquanto estimava 80mil novos casos de SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida),
200 a 500 mil casos novos de herpes, 100 mil casos de sífilis e 200 mil casos de gonorréia
(Okada et al., 1999).
Os fatores de risco (fig.7) associados à progressão da doença (carcinogênese), isto é,
progressão da infecção pelo HPV para transformação das células do epitélio, dando origem
às lesões precursoras e posteriormente ao câncer do colo uterino, incluem comportamento
sexual de alto risco, infecção persistente pelo papiloma-vírus humano (HPV), fumo,
imunossupressão e baixa condição sócio-econômica (Rivoire et al., 1993; Yuenyao &
Ramirez, 2002).
O comportamento sexual de alto risco diz respeito a diversas práticas, tais como:
idade precoce da primeira relação sexual (coitarca precoce), múltiplos parceiros sexuais
(mais de três em um período de 12 meses), não utilização de preservativos, elevada
paridade (número elevado de filhos) e ocorrência de outras DSTs (doenças sexualmente
transmissíveis) tais como sífilis, chlamidia, gardnerella, trichomonas e herpes (Rivoire et
al.,1993; Yuenyao & Ramirez 2002).
35
Fig. 7: Co-fatores na carcinogênese do colo uterino.
Apesar da infecção pelo HPV ser extremamente freqüente e estar implicada como
fator etiológico do câncer do colo uterino, muitos fatos fundamentais com relação à
história natural, condições de infecção e risco de progressão para lesões pré-cancerosas ou
cancerosas não são bem conhecidas (Sedlacek,1999). O comportamento biológico das
lesões induzidas pelo vírus depende do tipo de HPV envolvido. Os tipos 16, 18 e 31, ditos
HPV de alto risco oncogênico, estão mais associados a lesões de NIC 2, NIC 3 e
carcinoma invasor (Miranda et al.,2000).
36
Estudos epidemiológicos têm demonstrando que o HPV está presente em
virtualmente 100% das mulheres com câncer do colo uterino. Por outro lado, grande parte
das mulheres que têm diagnóstico de infecção pelo HPV, freqüentemente curam suas
infecções de modo espontâneo e, apenas uma minoria, desenvolve infecção persistente e
evolui para lesões pré-neoplásicas (Eluf Neto,1998). Isso leva a crer que, sob ponto de vista
do comportamento biológico, trata-se de uma doença, com duas patogenias, uma delas
“infectante” e a outra “transformante” (Schiffman, 1995). Entretanto, estes estudos
indicam que o papel etiológico do HPV é pouco claro e a relação temporal entre causa e
conseqüência pouco conhecida (Keating et al., 2000; van der Graaf et al., 2002). Uma vez
que a maioria das pacientes com infecção pelo HPV não vai desenvolver lesões invasoras, a
infecção por HPV isolada é provavelmente insuficiente para completar a transformação
neoplásica das células cervicais, sugerindo o envolvimento de outros eventos genéticos e
epigenéticos na carcinogênese (Dong et al., 2001).
2.4 O VÍRUS
O HPV pertence à família Papilomaviridae, gênero Papillomavirus (Howley et al.,
2001; de Villiers et al., 2004). São vírus não-envelopados, de simetria icosaédrica, com
diâmetro aproximado de 55nm, com DNA de dupla fita circular com cerca de 8.000 pares
de bases (pb). São de alta espécie-especificidade e nenhum deles foi ainda cultivado em
culturas celulares. Já foram identificados mais de 100 tipos de vírus do papiloma humano,
distribuídos em dois grupos: HPV cutâneo e HPV de mucosa, constituindo o mais diverso
37
grupo de vírus DNA envolvidos em doenças humanas (Giarrè et al., 2001; Murphy et al.,
2003). Os HPV que infectam mucosa têm predileção pelo trato genital e estão subdivididos
em dois grupos: os chamados de baixo risco para o desenvolvimento de câncer (tipos 6 ,
11, 40, 42, 44, 61), relacionados a lesões benignas exofíticas, e os de alto risco oncogênico
(tipos 16, 18 e 31), relacionados às lesões intra-epiteliais e invasoras do colo uterino
(Stoler, 1996; Villa, 1998; Candeias & Racz, 1999; Sedlacek, 1999).
Em diferentes estudos, baseados em PCR (reação em cadeia da polimerase), o HPV
foi encontrado em 44% a 77% das NIC1, 69 a 91 % das NIC2 , 86 a 100% das NIC3 e de
68 a 98% dos carcinomas invasores. O HPV 16 é o mais freqüentemente relacionados às
NICs e, em 20 a 30% dos casos, há associação entre eles. (Bergeron, et al., 1992;
Kellokoski, et al., 1992; Goldsborough, et al., 1992; Wieland & Pfister, 1999).
De importância fundamental é a constatação de que os tipos mais comumente
associados aos tumores benignos, na sua grande maioria, não são os mesmos encontrados
nos tumores malignos (Villa,1998).
O genoma de diversos papilomavírus, tanto animais como humanos, já foram
inteiramente seqüenciados. O genoma do vírus (fig. 8) é dividido em três regiões
(Romanos et al., 2002):
° Região Inicial (E – “early”), que codifica para as proteínas envolvidas na
replicação do DNA viral e transformação celular (E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 e E8);
° Região Tardia (L – “late”), que codifica para as proteínas do capsídeo viral (L1 e
L2);
38
Fig. 8: Representação esquemática do genoma do HPV-16, mostrando os genes da região inicial (E1
a E8), da região tardia (L1 e L2) e da região regulatória (LCR) (Munger & Howley, 2002).
° Região Regulatória (LCR – “long control region”), onde se encontram a origem
de replicação e os elementos para a transcrição e replicação viral.
39
2.5 GENOMA VIRAL E ONCOGENES
A infecção da célula pelo HPV se manifesta por alterações na função ou na
expressão dos genes do hospedeiro e a detecção destas alterações pode ter um importante
papel na triagem e seguimento das pacientes infectadas. Diferentes tipos de HPV têm
diferentes níveis de associação com o câncer e estes níveis, presumivelmente, refletem a
variação da potência de suas respectivas oncoproteínas virais, codificadas pelos genes E6 e
E7. A interação destes genes com o hospedeiro levam à desregulação do ciclo celular,
manifestando-se pela expressão anormal de proteínas associadas ao ciclo celular, tais
como Ki-67, ciclina E e p16INK4 (Keating et al., 2001).
O genoma do HPV é composto por 9 a 10 genes, sendo 7 a 8 na região precoce (E)
e dois na região tardia (L). Os genes precoces estão envolvidos na replicação viral (E1 e
E8), no controle da transcrição (E2 e E8), na maturação do vírus e alteração da matriz
intracelular (E4) e no estímulo da proliferação e transformação celulares (E5, E6 e E4). A
região tardia compreende dois genes, L1 e L2, que representam as proteínas principal e
secundária do capsídeo, respectivamente. (Villa, 1998).
Em geral, o câncer se desenvolve como uma conseqüência de um número de
alterações genéticas que levam à ativação de oncogenes ou à inativação de genes
supressores do tumor. A inativação destes genes supressores pode ser feita por diversos
processos que incluem mutações puntiformes e/ou deleção cromossomal (Dong et al.,
2001). As mutações dos genes supressores de tumor Rb e P53 foram associadas a doenças
malignas hereditárias (retinoblastoma, síndrome de Li-Fraumeni) e têm sido encontradas,
em diferentes percentagens, em tumores malignos esporádicos, tais como carcinoma
40
pulmonar de pequenas células, osteossarcoma, câncer de mama, de bexiga e de cólon
(Wieland & Pfister, 1999).
A inativação de proteínas nucleares pRb e p53, mais do que a mutação dos genes
correspondentes, tem um papel essencial na carcinogênese induzida pelo HPV. Isso se
deve, principalmente, pelo fato do HPV induzir alterações no funcionamento das proteínas
nucleares pRb e p53, mesmo na presença de seus respetivos genes perfeitamente normais
(Wieland & Pfister, 1999).
As mutações no gene Rb ou inativações da proteína pRb causam proliferação
celular desordenada. A desregulação ou a proliferação é um degrau do desenvolvimento
multi-escalonado dos tumores malignos (Wieland & Pfister, 1999).
As razões para as diferenças de potencial oncogênico de cada tipo de HPV na
carcinogênese cervical permanecem obscuras. Entretanto, supõe-se que os oncogenes
virais E6 e E7 têm um importante papel nas diferenças de potencial oncogênico de cada
tipo de HPV. As oncoproteínas codificadas pelos genes E6 e E7 têm a habilidade de repetir
as proteínas reguladoras da célula hospedeira, especialmente os produtos dos genes
supressores tumorais P53 e da PRb. Estas alterações levam à degradação e à inativação
funcional da pRb pelo produto do gene E7. (Sano et al., 1998).
A proteína celular p53, codificada pelo gene P53, localizado no cromossomo 17,
suprime a transcrição de alguns genes celulares, porém seu maior efeito supressor de
tumor é devido à ativação transcricional dos genes que mantêm a estabilidade genômica.
Havendo dano do DNA celular, a expressão de p53 é estimulada, o que, por sua vez,
ativa a expressão de certos genes celulares como o P21, o qual leva à interrupção do ciclo
celular na fase G1 (G = “gap”ou lacuna) ou induz à apoptose (Wieland & Pfister, 1999).
41
A proteína p16INK4, produto do gene CDKN2A, é uma proteína inibidora de
quinase dependente de ciclina (CDK) (proteína supressora tumoral). Sua função é
desacelerar o ciclo celular por inativação das quinases dependentes de ciclina (CDK), que
fosforilam a proteína do retinoblastoma (Rb). Alguns estudos têm demonstrado que a
expressão da p16INK4 é marcadamente influenciada pela expressão da proteína Rb. A
superexpressão da proteína p16INK4 tem sido demonstrada em carcinomas do colo uterino
devido à inativação funcional da pRb pela oncoproteína E7 do HPV. (Sano et al., 1998;
Agoff, et al., 2003).
Vários estudos têm demonstrado que a inativação da pRb é recíproca com a
expressão da p16INK4, às vezes mostrando-se em co-expressão. (Sano et al., 1998; Agoff,
et al., 2003).
2.6 PROTEÍNA p16INK4 E CICLO CELULAR
As células se reproduzem pela duplicação de seus conteúdos e, então, dividem-se
em duas. Este ciclo de divisão celular é a maneira pela qual todos os seres vivos são
reproduzidos. Antigamente, o ciclo celular era monitorado apenas pela observação de
eventos de segregação cromossômica à microscopia óptica. Recentemente, estudos
mostraram que há um sistema-controle do ciclo celular (fig.9), dependente de uma série de
proteínas que coordenam o ciclo como um todo (Alberts et al., 1997).
42
Fig. 9: Desenho esquemático mostrando ciclo celular e algumas proteínas reguladoras ( modificado
de Kumar, et al. 2005).
O ciclo celular é dividido em quatro fases principais, denominadas: período S, G1,
G2 e M e um compartimento fora do ciclo celular, denominado G0. Os períodos S, G2 e M
consomem tempo mais ou menos constante e a passagem de uma fase para a outra é feita
através de um ponto de parada também denominado de ponto de checagem (“check-point”).
Após a fase M, as células estáveis deixam o ciclo celular e passam ao compartimento G0,
também chamado de não-replicativo, do qual vão sair ao serem estimuladas, retornando ao
ciclo na fase G1 (Brasileiro Filho et al., 2000).
A fase S é a fase de síntese do ciclo celular, na qual ocorre a replicação do DNA. A
fase M corresponde à fase mais dramática, na qual acontece a mitose (divisão celular
propriamente dita). O intervalo entre o término da mitose e o início da síntese é chamado
CDK4/CDK2
43
de G1 e o intervalo, entre o final da síntese e o início da mitose, é chamado de G2. As fases
G1 e G2 propiciam um tempo adicional para o crescimento celular (Alberts et al., 1997).
O sistema-controle do ciclo celular é um dispositivo bioquímico que opera
ciclicamente, construído a partir de uma série de proteínas que interagem entre si e que
induzem e coordenam os processos dependentes essenciais responsáveis pela duplicação e
divisão celulares. Em um ciclo celular padrão, o sistema-controle é regulado por
interrupções que podem parar o ciclo nos pontos de parada (“check-points”) (Alberts et
al., 1997). Estas interrupções são importantes para permitir que o sistema-controle do ciclo
celular seja regulado por sinais provenientes do meio ambiente. Estes controles ambientes,
em geral, agem sobre um dos dois principais pontos de checagem celular: em G1, antes de
entrar em fase S e, em G2, no início da mitose (Sherr, 1996; Alberts et al., 1997).
O ciclo celular é controlado por uma série de proteínas reguladoras, denominadas
ciclinas, cujas concentrações sobem e descem durante o ciclo celular, formando um
complexo com outra classe de proteínas presentes, as quinases, denominadas de CDK. Os
complexos ciclina – quinases fosforilam várias proteínas do substrato envolvidas na
iniciação da duplicação do DNA, na formação de fusos mitóticos e em outros eventos do
ciclo celular (Alberts et al., 1997; Brasileiro Filho et al., 2000; Contran et al., 2001).
A formação, ativação e separação dos complexos ciclina-CDKs são os eventos
fundamentais que coordenam o ciclo celular. As ciclinas são assim chamadas porque elas
sofrem um ciclo de síntese e degradação em cada ciclo de divisão celular (Alberts et al.,
1997). As CDKs são funcionantes apenas quando ligadas às ciclinas (Brasileiro Filho et al.,
2000).
44
Uma vez iniciado o ciclo celular, ele não progride automaticamente. Os pontos
estratégicos de “parada” do ciclo, os chamados “check-points”, só são ultrapassados
mediante estímulos apropriados. Portanto, existem vários fatores que estimulam o ciclo
celular e muitos outros que tendem a inibi-lo. Entre estes, os mais estudados são algumas
proteínas inibidoras do complexo CDK- ciclina, como por exemplo, a p21 e a p16INK4
(Brasileiro Filho et al., 2000).
Vários estudos têm demonstrado que o produto de dois genes precoces (E) do HPV,
o E6 e E7 , são proteínas transformadoras do vírus e estão diretamente envolvidas na
indução da proliferação benigna e transformação maligna das células do hospedeiro (Giarré
et al., 2001; Dong et al., 2001). A capacidade destes genes de imortalizar queratinócitos é
explicada pela sua habilidade em interagir e neutralizar a função da pRb (Giarré et al.,
2001; Dong et al., 2001). A pRb, ciclina D, CDK4 e p16INK4 são as quatro chaves que
regulam o ciclo celular normal, sendo que qualquer uma delas pode estar mutada em
células tumorais (Cotran et al., 1999). Em células quiescentes, a pRb é hipofosforilada e
associada com E2F (fator de elongação 2). Quando expostas a sinais mutagênicos, a
transcrição de genes codificadores de ciclinas é iniciada. A seguir, há a inativação das
quinases dependentes de ciclina 4 e 6 (CDK4 e CDK6), as quais fosforilam a pRb na fase
do ciclo celular G1, causando a liberação do E2F. Por fim, o E2F, livre e ativado, promove
a transcrição de um grupo de genes que codificam proteínas essenciais para a progressão
do ciclo celular. Uma vez que a ativação de CDK4 e CDK6 representa a chave para o ciclo
celular, existe um grande número de mecanismos que regulam a atividade destas quinases.
Em particular, alguns membros da família de proteínas INK4, tais como p16, p15, p18 e
p19, associam-se às CDK4 e CDK6 para inibir a sua atividade (fig. 10). A expressão
45
ectópica de p16INK4 leva ao acúmulo de pRb hipofosforilado, seqüestro de E2F e
conseqüente parada do ciclo celular na fase G1 (Sherr, 1996; Huschtscha & Reddel, 1999;
Giarré et al., 2001).
Fig.10: Desenho esquemático mostrando ciclo celular padrão e a ação de diversas proteína da família INK
(Alberts,et al., 1997).
A interação do gene E7 do HPV 16 com a proteína pRb é análoga da fosforilação
mediada por CDKs e resulta na liberação de E2F e estímulo para entrada em fase S do
ciclo celular, mesmo na ausência de CDK4 e CDK6 e na presença de níveis elevados de
p16INK4, a qual tem a função de inibir esta progressão (Giarré et al., 2001; Murphy et al.,
2003).
46
A p16INK4 é codificada pelo gene P16INK4 (também conhecido como CDKN2A)
e sua função é inibir os complexos CDK4 e CDK6, as quais, por sua vez, regulam o ponto
de checagem da fase G1 do ciclo celular (Sano et al., 1998; Kubo et al., 1999). É uma
proteína produto de um gene de supressão tumoral, por vezes descrito como gene supressor
tumoral múltiplo. O lócus humano INK4a/ARF é localizado no cromossomo 9p21. A
indicação mais precoce de que a ruptura da função da p16INK4 pode estar associada com
imortalidade, vem da observação de que a deleção do gene P16INK4 é comum em
linhagens de células tumorais imortais (Huschtscha & Reddel, 1999).
A perda da função da p16INK4 é análoga à inativação da pRb em células com
imortalidade induzida por vírus de DNA, como, por exemplo, o HPV. Isto não é
surpreendente, uma vez que a ação da p16INK4 é inibir a inativação da pRb pelas CDKs.
Logo, espera-se que a perda funcional da p16INK4 tenha conseqüências similares à perda
funcional pela pRb (Huschtscha & Reddel, 1999; Munro, et al.,1999).
Estudos têm demostrado que o nível de p16INK4 aumenta em células em estado
senescente, ou seja, ocorre acúmulo do p16INK4 em vários tipos celulares como
fibroblastos, células epiteliais e linfócitos T. É possível que o aumento dos níveis de
p16INK4 possa ser devido ao progressivo encurtamento dos telômeros (Huschtscha &
Reddel, 1999; Shay & Wright, 2004).
Isto está relacionado ao conceito básico de que as células têm uma capacidade
limitada para se multiplicarem. Após um número fixo de divisões, as células estacionam em
um estágio terminal sem capacidade de se dividir, conhecido como senescência. A maneira
como as células em proliferação podem contar o número de divisões ainda está sendo
investigado, mas uma das teorias é a do encurtamento dos telômeros, os quais diminuiriam
47
um pouco a cada divisão, até parada do ciclo (Bodnar et al.,1998; Munro et al.,1999;
Tsuitsui et al.,2002; Kumar et al.,2005).
Com base na observação de que elevados níveis de p16INK4 acompanham a
senescência celular, a perda da expressão do P16INK4 está associada com aumento da fase
proliferativa do ciclo celular. Dado que a senescência é uma importante barreira para a
carcinogênese, é de se esperar que a inativação da p16INK4 seja um passo essencial no
processo de carcinogênese (Serrano et al., 1997; Zhu et al., 1998; Lin et al., 1998;
Huschtscha & Reddel 1999). O mecanismo de acúmulo de p16INK4 em células que se
aproximam da senescência ainda é desconhecido e requer elucidação (Huschtscha &
Reddel 1999).
A perda da expressão da p16INK4, devido à metilação está associada com uma
progressão finita do ciclo celular e perda da função pRb, devido à expressão da
oncoproteína E7 do HPV, resultando em fuga para a senescência. Parece que a pRb e a
p16INK4 agem na mesma via para o controle do ciclo celular, uma vez que a p16INK4
mantém a pRb em estágio inibitório por inibir a fosforilação da pRb pelas CDKs (Reddel et
al., 2000; Murphy et al.,2003).
Segundo Sano et al., (1998), estudos têm demonstrado que a inativação da pRb,
ocasionada pelas oncoproteínas virais, leva a um contínuo aumento da expressão da
p16INK4 em vários tipos de câncer, inclusive do colo uterino.
As evidências indicam que a senescência representa a maior barreira para a
carcinogênese. Entretanto, a forma como ela ocorre ainda permanece enigmática. A
imortalização não é suficiente para a carcinogênese, mas um pré-requisito necessário para o
48
acúmulo de número razoável de alterações genéticas necessárias para a malignidade
(Reddel et al., 2000).
É importante caracterizar os elementos que envolvem o envelhecimento e
senescência dos queratinócitos, os quais precedem a expressão de p16INK4. Estudos
preliminares parecem demonstrar que a p16INK4 não é expressa durante a renovação e
estratificação normal do epitélio escamoso in vivo (Rheinwald et al., 2002).
2.7 OS MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DA INFECÇÃO PELO HPV E DAS
LESÕES RELACIONADAS AO VÍRUS
Os métodos diagnósticos da infecção pelo HPV e das lesões relacionadas ao vírus
dividem-se em dois grandes grupos, conforme a figura 11: aqueles utilizados para
determinar a presença de lesões relacionadas ao HPV e aqueles utilizados para determinar a
presença de infecção viral (HPV-DNA). A infecção viral freqüentemente é concomitante
com a presença de lesão. Entretanto, nem sempre a presença de HPV-DNA ocorre
juntamente com uma lesão. Em muitos casos, temos a infecção viral, sem manifestação
morfológica qualquer, o que é chamado de infecção latente.
Ao primeiro grupo pertencem a citopatologia, histopatologia, genitoscopia e a
imuno-histoquímica. Estes métodos são utilizados, na maior parte das vezes, em conjunto.
Sabe-se que a sensibilidade da citopatologia para o diagnóstico de alterações citopáticas
virais é considerada baixa (ao redor de 40%) Ao segundo grupo, pertencem a captura de
híbridos e a reação em cadeia da polimerase (PCR).
49
Fig. 11: Estratégias em métodos diagnósticos relacionados às lesões e à infecção pelo HPV.
2.7.1 CITOPATOLOGIA
O exame citopatológico, também chamado de teste de Papanicolaou (Pap) tem sido
utilizado desde os anos 40 para avaliação citológica das células cervicais (Papanicolaou,
1942). O sucesso de programas de rastreamento em grande escala, utilizando o teste de
Papanicolaou com o objetivo de reduzir os índices de câncer invasor do colo uterino, tem
sido propagado na literatura. E, sem dúvida, é o teste de rastreamento com melhor relação
custo-benefício já inventado e utilizado de rotina na prática ginecológica (Falls, 1999).
LESÕES
RELACIONADAS
AO HPV
CITOPATOLOGIA
HISTOPATOLOGIA
COLPOSCOPIA
IMUNO-HISTOQUÍMICA
INFECÇÃO PELO
HPV
PCR
CAPTURA DE HÍBRIDOS
OUTROS
50
Em 1988, um pequeno grupo de indivíduos, “experts” em citologia e histologia,
reuniram-se em um encontro realizado em Bethesda, Maryland, com objetivo de
desenvolver um sistema de interpretação para o teste de Papanicolaou, o qual fosse capaz
de traduzir para o médico clínico as alterações citológicas de forma clara e relevante. O
resultado deste primeiro encontro foi adotado pelo National Institute of Health (USA) com
o objetivo de uniformizar os resultados citológicos, mais tarde conhecido como sistema de
Bethesda (Falls, 1999; Solomon et al., 2002; Solomon et al., 2004).
O sistema de Bethesda visa três grandes objetivos (Kurman et al., 2004):
- a terminologia deve comunicar ao paciente informação clínica relevante;
- a terminologia deve ser uniforme e com razoável reproducibilidade por
diferentes patologistas, em diferentes laboratórios ao redor do mundo;
- deve refletir o entendimento corrente da neoplasia cervical.
O sistema de Bethesda estipula a adequabilidade da amostra, presença de infecções
e classifica as anormalidades celulares como lesões escamosas intra-epiteliais. Essas
últimas são divididas em dois grandes grupos: lesões escamosas intra-epiteliais de baixo
grau (compreendendo alterações por HPV e neoplasia intra-epitelial cervical I (NIC I)) e
lesões escamosas intra-epiteliais de alto grau (compreendendo as neoplasias intra-epiteliais
cervicais (NIC) 2 e 3 e carcinoma “in situ”) (Falls,1999). Um terceiro grupo, denominado
atualmente ASC, anteriormente denominado de ASCUS, que significa “alterações em
células escamosas de significado indeterminado”, foi, na última atualização da classificação
de Bethesda, dividido em duas formas: ASC-US, utilizado para aquelas situações nas quais
as alterações são quantitativamente ou qualitativamente escassas e o chamado ASC-H,
51
utilizado nas situações onde não se pode afastar a possibilidade de lesão escamosa intra-
epitelial de alto grau (Kurman & Solomon, 1994; Solomon & Nayar, 2004).
Como já foi dito, o teste de Papanicolaou é o melhor indicador custo- benefício para
a detecção de lesões do colo uterino. Quando é identificada a presença de coilócitos
associados a atipias nuclares, falhas de maturação, hiperceratose, binucleação e
disceratose, a correlação com o teste de PCR (reação em cadeia da polimerase) para
detecção de HPV-DNA é excelente. O teste de Papanicolaou é, ainda, um excelente
indicador para o câncer invasivo, uma vez que a variação de interpretação interobservador
das lesões de alto grau é muito pequena. Devido ao fato da atipia citológica ser
determinada de forma subjetiva, a reprodutibilidade dos diagnósticos de alterações
celulares mais leves é baixa (Kato et al., 1995; Sedlacek, 1999). Nos últimos anos, têm-se
estudado um melhoramento desta técnica, chamada de citologia de meio-líquido.
2.7.2 HISTOPATOLOGIA
O diagnóstico histopatológico das alterações associadas ao HPV é de grande
importância, pois nele baseia-se, na prática assistencial, a maior parte das decisões
terapêuticas das lesões causadas pelo HPV e de suas conseqüências no trato genital (Di
Loreto & Alves, 1998). O diagnóstico da lesão deve ser obtido por métodos morfológicos,
sendo o padrão-ouro o diagnóstico em produto de biópsias ou produto de ressecção por
cirurgia ou alças diatérmicas. A relevância do estudo histopatológico está não apenas em
corroborar o diagnóstico de infecção pelo HPV, mas em situá-la no contexto das lesões de
eventual capacidade de evolução para neoplasia, através da graduação da lesão, seguimento
52
e avaliação da resposta ao tratamento. O exame histológico é, ainda, grande parâmetro para
aferição da qualidade da citopatologia. As amostras teciduais oferecem a oportunidade de
correlação direta entre o dano morfológico arquitetural e celular com a presença de
moléculas indicadoras das múltiplas faces da biologia da infecção (Di Loreto & Alves,
1998).
Embora alguns autores tenham relatado elevado nível de concordância diagnóstica
interobservador, ainda existe considerável discrepância, principalmente nas lesões
limítrofes, uma vez que, do ponto de vista morfológico, estas alterações formam um
espectro (Di Loreto & Alves, 1998). Embora as características histológicas das neoplasias
cervicais intra-epiteliais sejam bem conhecidas, aplicações inconsistentes dos critérios
morfológicos, bem como a existência de alterações escamosas e glandulares que
mimetizam lesões, podem resultar em significante variabilidade interobservador e intra-
observador (Keating et al., 2001).
2.7.2 COLPOSCOPIA
A colposcopia é um exame de imagem utilizado para avaliação do aparelho genital,
tanto feminino quanto masculino, com ampliação entre 3 e 30 vezes. O aparelho óptico
utilizado para exame foi idealizado por Hinselmann e Von Franque entre os anos de 1924 e
1925, em Hamburgo (Torres & Riopelle, 1993),
Durante a 2ª Guerra Mundial, devido ao Nazismo, criou-se uma barreira para a
difusão da técnica. Entretanto, em alguns países, tais como Espanha, Itália, Brasil, França e
Suíça, a colposcopia continuou a se desenvolver (Dexeus et al., 2002).
53
Atualmente, o exame colposcópico é realizado com o auxílio de um
videocolposcópio, com fonte de luz fria e presença de filtro verde, por médico treinado.
A inspeção do colo uterino é feita através da colocação de espéculo e visualização
do colo uterino, primeiramente sem adição de qualquer componente químico e, a seguir,
com adição de solução de ácido acético 3% e solução iodo-iodetada (Lugol), prova
chamada de Teste de Schiller (fig.12). A solução de ácido acético 3% provoca coagulação
das proteínas das células alteradas, corando-as de branco. Tal alteração não é observada em
células normais. Já a solução iodo-iodetada cora intensamente o glicogênio contido nas
células normais, originando uma coloração marron escura no colo uterino normal. Por outro
lado, as células alteradas não são impregnadas pelo Lugol e permanecem com uma
coloração amarelo-ouro.
Fig. 12: A) visão colposcópica de área de epitélio branco no lábio anterior, após aplicação de ác. Acético 3%;
B) área de epitélio alterado, em ambos lábios, corada de amarelo, após aplicação de Lugol.
A
B
54
As alterações de coloração provocadas pelo uso destas duas soluções guiam o
examinador para a realização da biópsia nas áreas alteradas.
2.7.4 IMUNO-HISTOQUÍMICA
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica usada para localizar antígenos
específicos em células ou tecidos, baseada em reconhecimento antígeno-anticorpo. Este
método já tem uma longa história, que iniciou em meados de 1940, quando Coons
desenvolveu as técnicas de imunoflorescência para detectar antígenos em cortes de tecido
congelado. Entretanto, apenas no início dos anos 90, o método encontrou aplicação geral na
patologia cirúrgica (Taylor et al., 2002).
Um anticorpo é uma molécula glicoproteica produzida por linfócitos B, que é
capaz de reconhecer antígenos com alta especificidade. Antígeno é uma molécula que,
reconhecida pelo anticorpo, desencadeia uma resposta imunológica (Alberts, 1997; Ferreira
& Rocha, 2004). A especificidade dos anticorpos pelo antígeno, faz deles poderosas
ferramentas para o biologista molecular (Albers, 1997). A produção de um anticorpo por
um animal é induzida especificamente pela presença de um antígeno (Taylor et al.,2002).
Esta identificação poderá ser vista à microscopia óptica de transmissão, de acordo com
vários procedimentos, em que se incluem os que empregam imunocomplexos enzima-
antienzima e métodos com marcação prévia, como a avidina-biotina-peroxidase (Filho &
Alves, 1998).
55
Em tese, os anticorpos monoclonais podem ser considerados mais específicos,
já que reconhecem apenas o epítopo para o qual se dirigem. Em contrapartida, os
anticorpos policlonais geralmente permitem sistemas de detecção mais sensíveis por
reconhecerem uma coleção de sítios (Filho & Alves, 1998).
Este método baseia-se no reconhecimento de algumas características
antigênicas através do uso de anticorpos monoclonais contra a p16INK4 (Filho & Alves,
1998). O kit histológico CINtecp16INK4 contém os reagentes necessários para um
procedimento completo de imuno-histoquímica, para ser realizado em amostras embebidas
em parafina e fixadas em formalina.
Este kit é baseado nos sistema EnVision, um sistema de detecção em dois
passos, baseado em um polímero solúvel em água, ao qual são conjugados os anticorpos
secundários (fig.13).
O sistema EnVision proporciona uma reação imuno-histoquímica rápida,
simples e livre de biotina, baseada na utilização da tecnologia dos polímeros. O sistema
EnVision é usado com anticorpos primários de coelho ou rato. Este sistema é fácil de usar,
em função de ser composto por poucas etapas de realização e com períodos de incubação
curtos. Além disso, elimina as reações cruzadas com biotina tecidual.
Fig.13: A: aplicação do anticorpo primário; B: aplicação do polímero enzimático.
A
B
56
2.7.5 A HIBRIDIZAÇÃO MOLECULAR
As técnicas de hibridização molecular atuam, genericamente, com “sondas”, que são
fragmentos conhecidos de seqüências nucleotídicas de DNA ou dos RNA viral e que são
colocadas na presença das células pesquisadas em uma amostra de interesse, ocorrendo
reações “de hibridização” ou “anelamento”, quando as seqüências de bases são
complementares entre si (Filho & Alves, 1998).
A detecção desses fragmentos conhecidos de DNA viral, pode revelar não apenas
uma infecção pelo HPV, mas informar também qual o tipo viral.
A captura de híbridos é apenas um dos métodos de hibridização molecular
utilizados. Uma de suas vantagens é a elevada sensibilidade e especificidade. O método
utilizado é semelhante às reações imuno-enzimáticas tipo ELISA, com preparo de reações
em micro-placas, cuja sensibilidade, quando associada à citopatologia, mostra índices que
oscilam entre 90 a 100% (Filho & Alves, 1998). Trata-se de um imuno-ensaio não-
radioativo que usa sondas de RNA para detectar fita única de DNA-alvo e ele pode
identificar a presença de 14 tipos freqüentes de HPV anogenital (Zahm, 1999).
O método se baseia em uma hibridização molecular convencional, em que
diferentes tipos de soluções de sondas não radioativas de ácidos ribonucléicos (RNA) são
colocados a reagir com amostras desnaturadas que contém o DNA pesquisado: uma com os
57
tipos de baixo risco/grupo A (HPVs 6, 11, 42, 43 e 44), e outra com nove tipos de alto
risco/grupo B (HPVs 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 e 56) (Zahm, 1999).
Após a hibridização, as moléculas de DNA ligadas às sondas de RNA adicionadas,
contendo os “híbridos”, são colocadas em tubo recoberto com anticorpos específicos,
marcados com fosfatase alcalina. A detecção da reação é feita por quimioluminescência e
mensurada em unidades relativas de luz (Zanm, 1999).
2.7.6 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A PCR é um método poderoso para amplificação de quantidades diminutas de
seqüências específicas de DNA-alvo em diversas milhões de vezes. Para realizar-se a PCR,
podem ser usados esfregaços citológicos, lavados, biópsias transoperatórias de congelação
ou tecidos embebidos em parafina. O DNA-alvo, nestes espécimes, deve ser isolado. Isso
pode ser feito por uma digestão não-iônica detergente / protease ou por congelamento e
aquecimento do material celular (Filho & Alves, 1998; Zahm & Schneider, 1999).
É necessário que a seqüência-alvo de nucleotídeos seja conhecida, de modo que
gere iniciadores de oligonucleotídeos apropriados de 20 a 25 bases de comprimento que
pareiam regiões específicas do DNA-alvo. Após o anelamento destes iniciadores, a ação de
uma DNA polimerase termoestável, como por exemplo a Taq polimerase, realizará a
síntese da fita de DNA alvo. A concentração do DNA-alvo cresce exponencialmente. Após
35 ciclos, mais de 10 trilhões de cópias de DNA-alvo podem ser produzidas. Portanto, tão
pouco quanto 10 a 100 moléculas de DNA podem ser amplificadas (Filho & Alves, 1998;
Zahm & Schneider, 1999).
58
Espécimes como esfregaços citopatológicos, lavagens, biópsias por congelação ou
tecidos embebidos em parafina são adequados. O DNA-alvo nestes espécimes deve ser
isolado. Isso pode ser feito com uma digestão não-iônica detergente/protease ou por
congelamento e aquecimento do material celular. Para realizar a PCR é necessário o
preparo de uma solução contendo:
- amostra de DNA a ser amplificada;
- um par de iniciadores específicos que definem a região-alvo do DNA a ser
amplificada;
- DNA polimerase termoestável;
- todos os 4 deoxirribunucleotídeos;
- tampão para estabilizar a DNA polimerase termoestável contendo MgCl2, KCl e
Tris-HCl, pH 8,3.
A concentração de vários componentes varia para os diferentes tipos de PCR. A
PCR é um processo termo-cíclico que inclui três etapas: primeiro, durante a
desnaturação (a 95°C), a fita dupla de DNA-alvo é separada em fitas únicas.
Segundo, os iniciadores se anelam ao DNA alvo (cerca de 55°C). Os dois
iniciadores anelam especificamente as suas seqüências complementares de DNA-
alvo de fita única. A distância entre os dois iniciadores é geralmente de umas poucas
centenas de nucleotídeos. Terceiro, a extensão do iniciador é desempenhada por
uma DNA polimerase termoestável (a 72°C). A DNA polimerase gera fitas “filhas”
de DNA que atravessam a região entre os dois iniciadores.
Ambas fitas simples iniciais de DNA, por conseguinte são convertidas em 4
fitas simples, as quais servem como modelo para o ciclo seguinte de PCR. A PCR é
59
geralmente concluída após 35 a 40 ciclos. Subseqüentemente, a amplificação de
PCR é detectada em eletroforese de gel de agarose contendo brometo de etídio e
visualizado em luz ultra-violeta ou gel de poliacrilamida corado com solução de
nitrato de prata (Zahm, et al., 1999).
60
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
DETERMINAR A EXPRESSÃO DA p16INK4 POR IMUNO-
HISTOQUÍMICA EM LESÕES ESCAMOSAS PRECURSORAS DO CÂNCER DO
COLO UTERINO.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
3.2.1 CORRELACIONAR A EXPRESSÃO DA p16INK4 POR IMUNO-
HISTOQUÍMICA EM LESÕES PRECURSORAS ESCAMOSAS DO CÂNCER DO
COLO UTERINO COM OS ACHADOS DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS
(CITOPATOLOGIA E HISTOPATOLOGIA);
3.2.2 ESTABELECER O USO DA p16INK4 COMO MÉTODO
ALTERNATIVO PARA O DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS INTRA-EPITELIAIS
CERVICAIS;
3.3.3 CORRELACIONAR A EXPRESSÃO DA p16INK4 COM A
PRESENÇA DE HPV-DNA (VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO) NAS LESÕES;
61
3.3.4 ESTABELECER A p16INK 4 COMO POSSÍVEL BIOMARCADOR DE
PROGRESSÃO DE LESÕES DE COLO UTERINO.
62
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
O material analisado para o estudo da expressão da p16INK4 consistiu de amostras
retrospectivas de fragmentos de colo uterino de 144 pacientes, produto de biópsias
incisionais, de um universo de 269, no período de dezembro/2003 a maio/2005. As
pacientes foram atendidas no Ambulatório de Patologia do Trato Genital Inferior (APTGI)
do Ambulatório Central (AMCE) da Universidade de Caxias do Sul (UCS), no estado do
Rio Grande do Sul.
O Ambulatório de Patologia do Trato Genital Inferior do AMCE/UCS é uma
unidade de referência secundária no fluxograma do Programa de Saúde da Mulher da
Secretaria Municipal de Saúde de Caxias do Sul, Rio Grande do Sul. Esta unidade atende
mulheres referidas por apresentarem algum tipo de alteração em método de rastreio
(“screening”) para a prevenção de câncer do colo do útero, geralmente com a presença de
alterações no exame citopatológico convencional. No entanto, algumas pacientes são
atendidas no APTGI do AMCE/UCS de forma primária.
No estudo foram incluídas mulheres a partir da análise do material de biópsia, a
qual foi realizada em função de uma alteração em exame citopatológico prévio de rastreio
ou por estarem em avaliação de seguimento pós-tratamento. Não foram feitas restrições
quanto à idade das pacientes examinadas. Foram excluídos os casos de lesão glandular e
lesão invasora quaisquer. As pacientes submetidas apenas à coleta de secreção cérvico-
63
vaginal foram excluídas do estudo. Ao contrário, as pacientes submetidas apenas a biópsia
dirigida, sem coleta de secreção cérvico-vaginal, permaneceram incluídas no estudo.
As pacientes tinham sido atendidas de acordo com o fluxograma estabelecido pelo
APTGI do AMCE/UCS (fig. 14).
Fig. 14: Fluxograma de atendimento das pacientes no Ambulatório de Patologia do Trato Genital
Inferior (APTGI) do AMCE/UCS.
No primeiro atendimento, as pacientes foram submetidas a colposcopia.
As amostras de secreção cérvico-vaginal foram coletadas através de exame
especular do colo uterino, com o uso de espéculo não-lubrificado, com movimento de
rotação de 360° de escova de coleta para obtenção de material endocervical e da superfície
do colo, fundo de saco e paredes vaginais, o qual foi armazenado em tubo de ensaio estéril,
64
contendo tampão TE (0,60g de Tris - Hidroximetil Amino Metano e 0,19g de EDTA -
Bissódico Dihidratado, com volume completado para 500mL de água destilada, acertando
o pH para 8,0 com Ácido Clorídrico - HCl) para a realização de técnicas de biologia
molecular. A seguir, foi realizada uma ou mais biópsias dirigidas do colo uterino, a critério
do examinador, quando na presença de alteração macroscópica da superfície do colo
uterino. As alterações foram detectadas a olho nu e com colposcópio, utilizando-se até 16
aumentos. A primeira inspeção é livre e, a seguir, foi aplicada solução de ácido acético 3%
e solução de iodo-iodetado (Teste de Schiller). A realização da colposcopia neste trabalho
teve o objetivo apenas de guiar a biópsia. O material coletado no momento da biópsia foi
acondicionado em frascos contendo solução de formalina 10% (formaldeído) para posterior
envio e análise em laboratório de anatomia-patológica.
No momento da coleta, foi solicitado às pacientes que assinassem o Termo de
Consentimento Informado e Esclarecido, submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade de Caxias do Sul (Anexo 2), assim como o restante do projeto.
O termo de consentimento diz respeito apenas à coleta de secreção cérvico-vaginal
para realização de técnicas de biologia molecular, uma vez que os demais procedimentos
são os estabelecidos pelo fluxograma de procedimentos do Ambulatório de Patologia do
Trato Genital Inferior e só foram realizados quando necessário para a avaliação e
tratamento das pacientes. Além disso, trata-se de estudo retrospectivo, baseado em material
estocado nos laboratórios de Patologia e de Biologia Molecular da Universidade de Caxias
do Sul.
65
4.2 CITOPATOLOGIA
Os exames citopatológicos coletados em lâmina de vidro foram processados de
acordo com o método descrito por Papanicolaou (1942), com posterior análise por
microscopia óptica convencional de transmissão, realizada por dois médicos patologistas
7
,
em separado. Os casos duvidosos, ou discordantes, foram avaliados por um terceiro médico
patologista
8
.
Os exame citopatológicos foram revistos e classificados de acordo com o
preconizado pela classificação de Bethesda (Solomon & Nayar, 2004).
A orientação da classificação é a seguinte: casos “negativos”, quando não foi
observada nenhuma alteração citológica significativa; “LEIBG”, quando observadas
alterações celulares compatíveis com displasia leve/NIC 1 e infecção pelo HPV (fig. 15);
“LEIAG”, quando observadas alterações celulares compatíveis com displasia
moderada/NIC 2 e severa/NIC 3; “carcinoma invasor”, quando mostraram sinais de invasão
da camada basal e, por fim, “ASC” para os casos com atipias de significado indeterminado.
Fig. 15: A) Célula de aspecto imaturo, com macronucleose e irregularidade nuclear, em comparação com
outras células intermediárias normais; B) grupo de três coilócitos (400x, Pap).
7
Eduardo Pretto Serafini e Alessandra Eifler Guerra Godoy
8
Guilherme Portela Coelho
A B
66
Um grupo de pacientes foi classificado como “não tendo exame citopatológico”,
que compreendem as pacientes atendidas de forma primária e aquelas pacientes que foram
referidas ao Ambulatório de Patologia do Trato Genital Inferior por outras unidades
sanitárias, as quais realizaram previamente o exame citopatológico. Em função da
impossibilidade destas lâminas serem revisadas pelos mesmos observadores das demais,
utilizando-se os mesmos critérios aplicados ao restante da amostra, optou-se por considerar
estas pacientes como não tendo realizado exame citopatológico prévio.
4.3 HISTOPATOLOGIA
Os exames anátomo-patológicos foram processados pelo método de rotina de
embebição em parafina e preparação de cortes histológicos de 3µm de espessura,
utilizando-se coloração padrão pela Hematoxilina-Eosina (HE) com posterior análise por
microscopia óptica convencional de transmissão, realizada por dois médicos patologistas
9
,
em separado. Os casos duvidosos, ou discordantes, foram avaliados por um terceiro médico
patologista
10
.
9
Eduardo Pretto Serafini e Alessandra Eifler Guerra Godoy
10
Guilherme Portela Coelho
67
A análise das lâminas obedeceu a critérios histológicos propostos por Richart
(Richart, 1990), sendo que o material foi classificado como: “normal”, na ausência de
quaisquer alterações celulares ou arquiteturais (fig.16a); “NIC 1”, quando detectadas
alterações celulares tais como hipercromasia, irregularidade nuclear, mitoses, condensação
de cromatina, perda da polarização e desarranjo arquitetural restritas ao terço inferior do
epitélio; “NIC 2” (fig.17 a), quando estas alterações estavam confinadas a 2/3 do epitélio;
“NIC 3” (fig.16 b), quando toda a espessura do epitélio mostrava alterações celulares; e,
por fim, “HPV” (fig.17 b), quando foram detectadas alterações celulares compatíveis com
infecção pelo vírus, tais como coilocitose, disceratose, macronucleose, binucleação ou
multinucleação e anfofilia.
As alterações presentes em cada caso foram listadas em um protocolo individual
(Anexo 1).
Fig. 16: Histopatologia: A) epitélio normal; B) NIC 3 (100x, HE).
A
B
68
Fig. 17:Histopatologia: A) NIC 2; B) epitélio infectado pelo HPV (100x, 1000x, HE).
A
B
69
4.4 DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE HPV-DNA
A determinação da presença de HPV – DNA foi feita através do método da
reação em cadeia da polimerase (PCR) em dois grupos de amostras. Um deles foi
constituído por 145 amostras embebidas em parafina e, outro, por 124 amostras de coleta
de secreção cérvico-vaginal conservadas em tampão TE e congeladas em freezer 20°C
negativos. O DNA das amostras, obtidas de esfregaço de colo uterino, foi isolado e
purificado através do uso do kit GFX Genomic Blood
DNA Purification Kit (Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ, USA), conforme instruções do fabricante (fig.18).
Fig. 18: Fluxograma de determinação da presença de HPV-DNA em amostras cérvico-vaginais.
Secreção Cérvico-vaginal
Extração de DNA
(kit GFK Genomic Blood
Amersham Biosciences, USA)
PCR
GH20 e PCO4 (β-globina humana)
PGMY 09/11 (HPV)
70
O material proveniente de blocos de parafina foi submetido a cortes histológicos
com 8µm de espessura. A retirada da parafina foi feita de duas formas: química e térmica.
Na retirada da parafina pelo método químico, os cortes histológicos foram acrescidos de
1mL de xilol e incubado a 65°C por 15 minutos. Após este tempo, o material foi
centrifugado e lavado em sucessivos banhos de álcool, em concentrações decrescentes, com
o objetivo de desparafinizar a amostra. Após a lavagem, o sobrenadante foi desprezado e
deixou-se secar o “pellet” a temperatura ambiente (fig. 19).
Fig.19: Fluxograma da determinação de HPV-DNA nas amostras embebidas em parafina.
Amostras
p
rovenientes de blocos de
p
arafina
Retirada da Parafina
Método Químico Método Térmico
Extração do DNA
Método Orgânico
Acetato de Amônia
K
it Wizard
Genomic DNA Purification
(Promega, USA)
PCR
GH20 e PCO4 (β-globina humana)
PGMY 09/11 (HPV)
71
Na retirada da parafina através de aquecimento, cada amostra, acrescida de 200µL
de tampão de digestão, foi levada ao forno de microondas por 4 ciclos de 15 segundos,
agitando-se vigorosamente entre cada um deles. As amostras foram submetidas, então, a
centrifugação durante 10 minutos, ao final da qual removeu-se a parafina sobrenadante,
adicionando-se 200µL de TEP (6,05g Tris-HCl, 3,72g EDTA, 50µL Triton X-100,
completar para 10mL com água destilada). Ambos métodos de retirada de parafina
(químico e térmico) foram utilizados em todas as amostras.
Após esta etapa, procedeu-se a extração de DNA das amostras. A extração foi feita
de duas maneiras: utilizando-se o kit Wizard
Genomic, DNA Purification Kit (Promega
Corporation, Madison, Wi, USA), conforme instruções do fabricante ou o método orgânico.
O método orgânico constituiu no seguinte: cada amostra foi acrescida 200µL de
enzima de digestão e 200µL de TEP e incubada em banho a 50°C por 48 horas, sendo
agitada ocasionalmente. Ao fim das primeiras 24 horas de banho, foi acrescentado mais
50µL de TEP. Após o período de incubação, procedeu-se a inativação da enzima de
digestão, com elevação da temperatura do banho a 96°C, por 15 minutos. Foi adicionado
200µL de Acetato de Amônia 6M, pH 8,5. A amostra foi agitada em vortex e após
centrifugada. O sobrenadante (que contém DNA) foi transferido para um tubo novo e o
restante foi desprezado. No novo tubo foi adicionado 600µL de isopropanolol PA frio,
misturando com cuidado e incubando em freezer 70°C negativos, por 2 horas. Após a
incubação, a amostra foi centrifugada por 15 minutos. A seguir, a fase líquida foi
cuidadosamente desprezada, adicionando-se 600µL de etanol 70%, misturando por
inversão. A amostra foi então centrifugada por 15 minutos. Este passo, que tem como
72
objetivo lavar o DNA, foi repetido 3 vezes. Por fim, a fase líquida foi desprezada,
deixando-se secar o “pellet” sobre papel absorvente. Uma vez seco, o DNA foi
ressuspendido em 50µL de tampão TE, pH 7,5 e armazenado em freezer 20°C negativos.
Após a extração do DNA, utilizando-se quaisquer dos métodos, as amostras
foram submetidas à PCR, utilizando-se o conjunto de iniciadores genéricos para HPVs,
PGMY 09/11 (Gravitt et al., 2000), capazes de amplificar 450 pares de bases (pb) do gene
L1 de diversos tipos de HPVs genitais. À mesma PCR foram adicionados os iniciadores
GH20 e PCO4 (Saiki et al., 1988) que amplificam 268 pb do gene da β-globina humana,
servindo como controle interno para avaliação da integridade e suficiência de DNA de cada
amostra.
A reação em cadeia da polimerase foi realizada em um volume de reação de 20
µL, formada por uma solução equimolar de cada um dos iniciadores genéricos PGMY
09/11 na concentração de 25 µM de cada oligonucleotídeo, iniciadores GH20 e PCO4
(20mM de cada iniciador), 15 mM de 10x PCR Buffer, 4 mM de MgCl2, 100 µM de dCTP,
100 µM de dGTP, 100 µM de dATP, 100 µM de dTTP e 0,2µL de AmpliTaq Gold
DNA
Polymerase (Roche, New Jersey,USA).
A amplificação foi realizada em um tubo único, através da utilização de 40
ciclos em termociclador (PTC – 100 Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Waltham,
Massachusetts, USA). Cada ciclo inclui 1 minuto de desnaturação a 95°C, 1 minuto de
anelamento a 55°C e 1 minuto de alongamento da cadeia a 72°C. O primeiro ciclo foi
estendido por 13 minutos de desnaturação a 95°C. O último passo de alongamento da
cadeia a 72°C foi procedido por 5 minutos, modificado de Gravitt et al (2000).
73
Foram incluídos controles positivos e negativos na reação. Os controles
positivos usados foram DNA de plasmídio, contendo genoma completo de HPV,
gentilmente cedidos pela Dra. Luisa Lina Villa (Instituto Ludwig para Pesquisa do Câncer –
São Paulo). O controle negativo utilizado é um tubo com a mistura da reação, porém sem
DNA.
Os amplicons foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5% (1,05g
de agarose dissolvido em 75mL de TBE 0,5x), acrescido de 4µL de brometo de etídio a
10mg/mL. O tampão TBE 0,5x foi preparado usando 5,5g de ácido bórico, 10,8g de Tris,
0,925g de EDTA e 2 litros de água destilada. A eletroforese foi conduzida em tampão 0,5x
TBE pH 8,3 a aproximadamente 110V constantes. O marcador de peso molecular
φX174/Hae III (Invitrogen, Frederick, Mariland, USA) foi aplicado em cada gel. Os géis
foram visualizados e analisados sob luz ultravioleta.
4.5 IMUNO-HISTOQUÍMICA
No material histopatológico (blocos de parafina com amostras de colo uterino) foi
realizado exame imuno-histoquímico para detecção da proteína p16INK4. Foram feitos
cortes histológicos com 4 micra de espessura, montados em lâminas de vidro com
extremidade fosca, sialanizadas. As lâminas sialanizadas foram preparadas em uma bateria
composta por um banho de acetona (500ml) por 30 segundos, seguindo de um banho de 5
minutos em uma solução composta de 475ml de acetona acrescidos de 25ml de
aminopropiltrimetoxisilano 97% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany). Após, foram
74
realizados mais dois banhos em 500ml de acetona por 30 segundos cada, seguidos de
secagem em estufa a 40°C.
O processo de imuno-histoquímica, pelo sistema EnVision, foi realizado utilizando-
se Cintec p16INK4 Histology Kit (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark), conforme
instruções do fabricante, seguindo as seguintes etapas:
a) desparafinização: remoção da parafina por aquecimento;
b) reidratação: banhos sucessivos com xilol, etanol 95% e etanol 70%;
c) reconhecimento dos epítopos através do uso de solução própria contida no kit;
d) reconhecimento da peroxidase através do uso do reagente próprio presente no
kit;
e) aplicação do anticorpo primário (p16INK4 rato anti-humano, clone E6H4) ou do
reagente para controle negativo;
f) aplicação do DAB;
g) contracoloração com hematoxilina de Mayer.
4.5.1 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA p16INK4
A expressão da p16INK4 através de imuno-histoquímica produz padrões de
coloração marcantes. As células que apresentam expressão da p16INK4, mostram-se
coradas de marrom, podendo esta coloração ser visualizada tanto no núcleo, quanto no
citoplasma. Por outro lado, as células normais coram-se apenas pela hematoxilina utilizada
na contra-coloração, que produz uma tonalidade azulada.
75
A análise da coloração para p16INK4 foi feita utilizando-se vários métodos,
conforme figura 20:
Fig. 20: correlação entre os métodos de graduação da p16INK4.
a) método binário: reação negativa, quando menos de 5% das células da lesão se
coraram e reação positiva, quando mais que 5% das células se coraram;
b) método semi-quantitativo: reação negativa, quando 0 a 5% das células são
coradas; reação focal ou fracamente positiva, quando menos de 60% das células
são coradas; reação difusamente/ fortemente positiva, quando mais de 60% das
células são coradas (Sano, et al., 1998; Keating et al., 2001);
c) método por escore: reação negativa, quando 0 a 5% das células são coradas;
reação positiva, uma cruz (+), quando 25% a 50% das células foram coradas;
76
reação positiva, duas cruzes (++), quando 50% a 75% das células foram
coradas; reação positiva, três cruzes (+++), quando mais de 75% das células
foram coradas (Klaes et al., 2001; Murphy, 2002; Agoff et al., 2003; Wang et
al.,2004);
d) método por percentagem de células coradas: esta graduação avalia o percentual
de células coradas (positivas) em relação ao total de células da lesão. Este
método foi feito tomando-se como base os quatro (4) melhores campos de
grande aumento (400x) de cada caso. Foram feitas 4 fotomicrografias, através de
fotomicroscopia óptica, impressas em papel. Cada fotografia foi dividida em
quatro quadrantes, sendo realizada a contagem manual das células para obtenção
do valor que corresponde à percentagem. Até o momento, a utilização de
método semelhante a este para avaliação da expressão da p16INK4 em lesões de
colo uterino não foi descrito na literatura.
A análise da expressão da p16INK4 foi realizada por dois patologistas
11
, em
separado, utilizando-se as quatro metodologias, com objetivo de comparar os métodos,
avaliando qual demonstra melhores resultados. A figura 21 mostra alguns exemplos da
coloração para p16INK4 através de imuno-histoquímica.
11
Eduardo Pretto Serafini e Alessandra Eifler Guerra Godoy
77
C D
Fig. 21: Expressão da p16INK4 por imunohistoquímica: A) coloração negativa; B)
coloração fortemente positiva (98% de células coradas); C) Coloração fortemente
positiva (50% de células coradas); D) coloração fortemente positiva, demonstrando
método de contagem (82% de células coradas) (400x, imuno-histoquímica, sistema
EnVision, contra-coloração com hematoxilina).
A
B
58 coradas/70
células =
82%
78
4.6 ANÁLISE DE DADOS
Os dados foram analisados e processados pelo programa SPSS - Statistical Package
for the Social Sciences – Windows, versão 12.0.
Os dados foram primeiramente descritos em relação à freqüência, utilizando-se
estatística descritiva. A análise estatística da correlação entre os grupos foi feita através de
testes não-paramétricos, utilizando-se teste de Tukey e Kruskall Wallis.
79
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 RESULTADOS DESCRITIVOS DA AMOSTRA
O estudo incluiu 144 amostras de pacientes atendidas no Ambulatório de Patologia
do Trato Genital Inferior, pertencente ao Ambulatório Central da Universidade de Caxias
do Sul, de um universo de 269 pacientes atendidas entre os meses de dezembro/2003 e
maio/2005. Na primeira etapa, as amostras foram selecionadas de acordo com o resultado
inicial da biópsia histopatológica (fig. 22).
Fig. 22: Fluxograma de condução do experimento.
80
As lâminas das biópsias de cada paciente foram revisadas para classificação da
amostra dentro dos critérios histopatológicos estabelecidos (vide Anexo 1) e para
verificação da adequabilidade do material, basicamente em relação a sua integridade e
suficiência para a realização de todos os testes.
A seguir, terminada a 1ª etapa, de caráter classificatório, as 269 amostras foram
encaminhadas para a extração de DNA humano. Nesta 2ª etapa, as amostras estavam
divididas em dois grandes grupos: um deles, constituído por 145 espécimes originados em
blocos de parafina e, outro grupo, constituído por 124 casos de material originado em
secreção cérvico-vaginal, armazenada em tubo de ensaio estéril contendo tampão TE e
congeladas a 20°C negativos.
Na 3ª etapa, procedeu-se a PCR para identificação do HPV-DNA, utilizando-se
os iniciadores genéricos para HPV, PGMY 09/11 (Gravitt et al., 2000), bem como os
iniciadores GH20 e PCO4 (Saiki et al.,1988) que amplificam o gene da β-globina humana,
servindo como controle interno para avaliação da integridade e suficiência do DNA de cada
amostra. Dos 145 casos que constituíram o grupo de material originado em blocos de
parafina, o gene da β-globina humana foi identificado em 34 casos, correspondendo a
23,44% das amostras embebidas em parafina. Resultados semelhantes foram descritos por
Serth et al. (2000) e comentados por Srinivasan, et al. (2002). Srinivasan, et al. (2002)
apontam que provavelmente o grande responsável pelos resultados pobres na extração de
DNA humano das amostras embebidas em parafina esteja relacionado à fixação em
formoladeído (formol 10%). Vários estudos têm sugerido que a perda de material genético
pela ação do formolaldeído, possa chegar a 70%, dependendo da temperatura do
81
conservante, do tempo de fixação (que não deve ser superior a 6 horas), da concentração
de sal e do pH, o qual, quanto mais baixo, piores são os resultados (Srinivasan et al., 2002;
Cross, et al.,1990; Bramwell & Burns, 1988; Yagi et al.,1996; Diaz-Cano & Brady, 1997).
Entretanto, alguns autores, como Cooper, et al. (2004), relatam uma boa qualidade de
DNA de amostras extraídas de material embebido em parafina, com sucesso em cerca de
80% dos casos e Unger et al. (1998) relataram sucesso em extração de DNA-HPV de
material embebido em parafina, variando entre 64 a 94,1%, estando relacionado ao tempo
de estocagem do material.
Dos 124 casos que constituíram o grupo de material originado em secreção
cérvico-vaginal, a identificação do gene da β-globina humana foi possível em 100% das
amostras. No total, a realização de PCR para identificação de HPV-DNA foi possível em
158 casos.
A 4ª etapa constituiu-se da realização de imuno-histoquímica para p16INK4 em
144 casos, nos quais foi possível realizar com sucesso a etapa 3. Foram excluídos 14
casos, a saber: 6 casos classificados como normais histologicamente e que constituiriam
parte do grupo controle, cujo resultado da PCR genérica foi positiva para HPV-DNA e 8
casos, nos quais o material foi insuficiente para a confecção das lâminas de imuno-
histoquímica para p16INK4.
82
5.2 RESULTADOS DA CITOPATOLOGIA
Foram revistos os exames citopatológicos das 144 pacientes incluídas no
estudo. Destas, 34 pacientes (23,6%) não tinham exame citopatológico prévio (fig.23)
Neste grupo, estão incluídas as pacientes atendidas de forma primária e as pacientes que
tiveram seu exame citopatológico realizado em outra unidade básica de saúde, conforme
comentado anteriormente.
J sem citopatológico J com citopatológico
Fig.23: Presença de pacientes com exame citopatológico prévio.
34
110
0
20
40
60
80
100
120
Número de Casos
(23,6%)
(76,4%)
83
As 110 pacientes restantes tiveram seus exames citopatológicos, realizados
previamente, revisados por dois patologistas
12
. Destes, 55 (50,0%) foram classificados
como negativos, 36 (32,7%) foram classificados como LEIBG e 12 (10,9%) foram
classificados como LEIAG. Uma paciente (0,9%) foi classificada como carcinoma invasor
e 6 (5,4%) foram classificadas como ASC (atipias em células escamosas de significado
indeterminado), conforme detalhado na figura 24.
Fig.24: Distribuição dos casos conforme diagnóstico citopatológico. (n=110)
12
Eduardo Pretto Serafini e Alessandra Eifler Guerra Godoy
55
36
12
1
6
0
10
20
30
40
50
60
Negativos LEIBG LEIAG Ca invasor ASC
Número de Casos
(50%)
(32,7%)
(10,9%)
(0,9%) (5,4%)
84
5.3 RESULTADOS DA HISTOPATOLOGIA
A figura 25 mostra a distribuição da amostra conforme o diagnóstico
histopatológico, utilizando-se a nomenclatura preconizada por Richart (Richart, 1990).
Das 144 amostras, 29 (20,1%) foram classificadas como normais e
constituíram o grupo controle, 40 (27,8%) foram classificadas como infecção pelo HPV, 22
(15,3%) foram descritas como NIC 1, 15 (10,4%) como NIC 2 e 38 (26,4%) como NIC 3.
Fig.25: Distribuição dos casos conforme diagnóstico histopatológico utilizando a classificação preconizada
por Richart (n=144).
38
15
22
40
29
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Normal HPV NIC 1 NIC 2 NIC 3
Número de Casos
(20,1%)
(27,8%)
(15,3%)
(10,4%)
(26,4%)
85
5.4.RESULTADOS DA PCR GENÉRICA PARA HPV-DNA
Os 144 casos mostraram amplificação para o gene da β-globina humana
(100%), confirmando a adequabilidade da amostra em relação à quantidade e integridade
do material genético.
Com relação ao HPV-DNA, incluindo-se o grupo controle, a freqüência de vírus foi
de 66,7% (96 casos), enquanto que 33,3% (48 casos) não mostraram amplificação dos 450
pb do gene L1 de diversos tipos de HPVs genitais (fig.26). Não foi observada a
amplificação do controle negativo utilizado na reação, descartando-se a hipótese de
contaminação da reação.
Fig.26: Distribuição da presença de HPV-DNA por PCR.
48
96
0
20
40
60
80
100
120
Número de Casos
(33,3%)
(66,7%)
PCR negativa
HPV-DNA
PCR positiva
HPV-DNA
86
A prevalência do HPV-DNA, quando utilizadas técnicas de biologia molecular,
como é o caso da PCR, varia de acordo com o grau da alteração apresentada pela paciente,
partindo de 15% em mulheres que não apresentaram evidência de lesão nos exames
citopatológico de triagem e histopatológico (Nonnenmacher et al., 2002) a 99,7% em
pacientes com neoplasia intraepitelial cervical (Walboomers et al., 1999).
O percentual de HPV-DNA detectado no presente estudo (66,7%) corrobora os
achados de Cavalcanti et al., (2000), no Rio de Janeiro, no qual foram estudadas 514
mulheres assintomáticas ou com lesões pré-malignas, obtendo resultado positivo para
HPV-DNA em 66,7% dos isolados.
Excluindo-se o grupo controle, constituído por 29 amostras, todas estas com PCR
negativa para HPV-DNA, a freqüência do vírus em pacientes com lesão sobe para 83,4%
(96 casos/115). Estes resultados estão em concordância com Muñoz et al., (1996) que
verificaram que a prevalência de HPV em mulheres é maior nas áreas com altas incidências
de carcinoma de cérvice uterina (Brasil e Colombia) do que em áreas de baixa incidência
(Espanha).
Syrjänen et al., (2004) mostraram percentuais bem inferiores em um estudo
conduzido na União Soviética. Neste estudo, a prevalência de HPV-DNA foi de 36,6%, em
média. Entretanto, a taxa de detecção de HPV-DNA aumenta proporcionalmente com a
gravidade da lesão, chegando a 91,7% em pacientes com NIC 3/ LEIAG. Por outro lado,
Lin et al.,(2000) relataram a ocorrência de 53,0% de DNA-HPV em lesões precursoras
diversas.
87
Os achados de Syrjänen, et al., (2004) encontram paralelo neste estudo, no qual,
considerando-se apenas os casos de NIC 2/NIC3 (LEIAG), a prevalência de DNA-HPV é
de 96,2% (51/53) e de 72,4% (45/62) se forem considerados apenas os casos de HPV/NIC1
(LEIBG).
A tabela 1 mostra a distribuição da presença de HPV-DNA, relacionada com
o diagnóstico histopatológico no universo de lesões (n=115), em números absolutos e
percentuais.
Lesão por
HPV
NIC 1 NIC 2 NIC 3
HPV-DNA
Positivo
29 (25,2%) 16 (13,9%) 14 (12,1%) 37 (32,1%)
HPV-DNA
Negativo
11 (9,5%) 6 (5,2%) 1 (0,8%) 1 (0,8%)
Tabela 1:Positividade de HPV-DNA relacionada ao diagnóstico histopatológico. (n=115)
A PCR falhou na detecção de HPV-DNA em dois casos dos 51 que compreendem
as pacientes com NIC 2 / NIC 3, representando 3,7%. À luz do conceito de que o carcinoma
escamoso de colo uterino está ligado ao HPV em virtualmente 100% dos casos, essa falha
de 3,7% está discretamente elevada.
Syrtänen et al., (2004) relatam resultados ainda piores, com falha próximo a 20%
nos casos de LEIAG (NIC 2 e NIC 3). Sem dúvida, o pequeno número de cópias do
genoma viral e a baixa qualidade das amostras em questão, devem ter tido importante papel
nestes resultados. Entretanto, esses falsos-negativos tendem a ser um verdadeiro problema
88
clínico se, no futuro, os métodos de detecção de HPV-DNA forem usados isoladamente
como método de rastreamento (“screening”).
5.5 RESULTADOS DA IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA p16INK4
A análise imuno-histoquímica para p16INK4 foi realizada nos 144 casos que
compõe a amostra. A quantificação da expressão foi feita de diversas formas, basicamente
utilizando-se 4 métodos, divididos em dois grandes grupos, a saber: um grupo constituído
por três métodos descritos na literatura (a,b e c) e, outro, constituído por método que está se
propondo (d):
a) método binário: negativo e positivo;
b) método semi-quantitativo: negativo, fracamente positivo e fortemente positivo;
c) escore: negativo, 1+/3+, 2+/3+ e 3+/3+;
d) percentual de células coradas.
Nos 29 casos que compõem o grupo controle (classificados como normais), a
coloração para p16INK4 foi negativa tanto em epitélio normal e estroma, quanto nas células
metaplásicas e inflamatórias. Este achado é idêntico ao relatado por Murphy et al. (2003)
em um estudo com 154 mulheres na Irlanda. Este achado indica que a p16INK4 está
relacionadas a células, cujo DNA está alterado, não sendo expressa em células normais.
89
5.5.1 MÉTODOS DESCRITOS NA LITERATURA
5.5.1.1 MÉTODO BINÁRIO
A positividade para p16INK4 no universo das 144 pacientes foi de 55% (80
casos/144), semelhante ao encontrado por Hu et al. (2005). A distribuição em relação ao
diagnóstico histopatológico, excetuando-se o grupo controle, está demonstrada na tabela 2,
em números absolutos e percentuais. Considerando-se apenas as lesões intraepiteliais, a
expressão de p16INK4 foi positiva em 69,5% dos casos, que corrobora os achados de Agoff
et al., (2003) que relatam positividade de 76,5%.
LEIBG LEIAG
HPV NIC 1 NIC 2 NIC 3
p16INK4
21 (18,2%) 11 (9,5%) 2 (1,7%) 1 (0,8%)
Negativa 32 (56,7%) P< 0,689 3 (5,7%) P< 0,894
p16INK4
10 (16,5%) 11 (9,5%) 13 (11,3%) 37 (32,1%)
Positiva 30 (48,3%) 50 (94,3%)
Tabela 2 : Expressão da p16INK4 por imunohistoquímica relacionada ao diagnóstico histopatológico
utilizando-se o método binário (n = 115) (p < 0,001 entre os grupos LEIBG e LEIAG).
A tabela 2 mostra, também, nítida diferença entre a expressão da p16INK4 nas
LEIBG (HPV / NIC 1), cuja média de positividade foi de 48,3% e nas LEIAG (NIC 2 e
NIC 3), cuja média de positivdade foi de 94,3% (p < 0,001). A análise estatística destes
dados por métodos não-paramétricos, mostra segundo o teste de Tukey e o teste de
Kruskal-Wallis, significativa diferença entre estes dois grupos. Os mesmos testes não
paramétricos foram aplicados para verificar se havia diferença estatística entre NIC 1 e
90
HPV e entre NIC 2 e NIC 3. Os valores de “p” nestas comparações foram, respectivamente,
0,689 e 0,894, mostrando que não são estatitisticamente diferentes. Observa-se, também,
que a p16INK4 está fortemente relacionada com lesões precursoras, notadamente NIC 2 e
NIC 3. Estes achados estão em concordância com Hu et al., (2005) que relatam
positividade (expressão) da p16INK4 de 44 % em NIC 1 e 97% em NIC 2 e NIC 3 e
concordam parcialmente com Bozzetti et al., (2005), que relatam positividade de 90% dos
casos de NIC 1 e 100% dos casos de NIC 2 em amostra composta por 30 casos de lesões
intraepiteliais.
Klaes et al., (2001) encontraram resultados discretamente mais elevados em um
estudo incluindo 139 neoplasias intraepiteliais cervicais, conduzido na Alemanha. Nestes
estudo, foram relatados percentuais de positividade de 60% em NIC 1 e 100% em NIC 2 /
NIC 3.
5.5.1.2 MÉTODOS SEMI-QUANTITATIVO E POR ESCORE
Os métodos semi-quantitativo e por escore foram utilizados em conjunto, uma
vez que, já na análise dos primeiros casos, demonstraram resultados bastante semelhantes,
quando avaliados em separado. Ambos têm características semi-quantitativas, embora a
utilização do método de escore vise diferenciar mais os grupos resultantes. Entretanto,
ambos mostram-se subjetivos, sendo que as classificações 2+/3+ e 3+/3+ do método de
escore correspondem a uma mesma classificação no método semi-quantitativo (fortemente
positivo). Ambos são métodos subjetivos e mostraram grande variabilidade intra e
interobservador neste estudo.
91
Apesar destas características indesejáveis, ambos buscam diferenciar subgrupos
de casos dentro daqueles classificados como “positivos”, conforme pode ser observado na
tabela 3. Especula-se se, casos classificados como fortemente positivos / 3+/3+, poderão
ter evolução diferente daqueles classificados como fracamente positivos / 1+/3+. Isto seria
especialmente interessante nas LEIBG, visto que a expressão da p16INK4 poderia,
eventualmente, ser utilizada como ferramenta adicional na resolução do dilema entre tratar
ou não tratar pacientes com LEIBG, fazendo da p16INK4 um biomarcador para progressão
da doença.
LEIBG LEIAG
HPV NIC 1 NIC 2 NIC 3
p16INK4 Negativa 21 (18,2%) 11 (9,5%) 2 (1,7%) 1 (0,8%)
p16INK4 Positiva 1+/3+ 11 (9,5%) 7 (6,0%) 5 (4,3%) 4 (3,4%)
p16INK4 Positiva 2+/3+ 4 (3,4%) 3 (2,6%) 4 (3,4%) 10 (8,6%)
p16INK4 Positiva 3+/3+ 4 (3,4%) 1 (0,8%) 4 (3,4%) 23 (20%)
19/40 11/22 P<0,650 13/15 37/38 P<0,789
Tabela 3: Método semi-quantitativo e por escore para graduação da expressão da p16INK4 por
imunohistoquímica (n = 115) (p < 0,001 na comparação entre os grupos formados por LEIBG e LEIAG).
A tabela 3 demonstra que a intensidade da coloração pela p16INK4 tende a
aumentar proporcionalmente à gravidade da lesão, vendo-se que em um extremo encontra-
se as amostras com lesão ocasionada pela infecção pelo HPV, nas quais a expressão da
92
p16INK4 foi negativa ou apenas fracamente positiva em 80% dos casos. No extremo
oposto, estão as NIC 3, nas quais a expressão da p16INK4 foi fortemente positiva, 2+/3+ e
3+/3+ em 86% dos casos.
Isto traduz uma significativa relação entre o grau da lesão e a intensidade da
expressão da p16INK4 com p < 0,001 pelo teste de Kruskall-Wallis. Os mesmos testes não
paramétricos foram aplicados para verificar se havia diferença estatística entre os grupos
NIC 1 e HPV e entre NIC 2 e NIC 3. Os valores de “p” nestas comparações foram,
respectivamente, 0,650 e 0,789, mostrando que não são estatitisticamente diferentes.
Estes dados corroboram os achados de Branca et al., (2004) em uma série de 152
NIC na Itália e de Kalof, et al., (2005) em uma série de 44 casos de NIC nos Estados
Unidos. Entretanto, não há diferença estatística entre os casos classificados como HPV e os
como NIC 1, assim como tampouco há diferença entre NIC 2 e NIC 3.
5.5.2 MÉTODO PROPOSTO
5.5.2.1 MÉTODO QUANTITATIVO POR PERCENTUAL
O método quantitativo de percentual de células coradas foi utilizado na tentativa de
diferenciar, com maior precisão e menor subjetividade, pacientes dentro de um mesmo
grupo. A revisão da literatura não mostrou a utilização deste método em colo uterino. Este
não era um objetivo proposto no início do projeto. Entretanto, a análise dos resultados,
93
através dos métodos descritos na literatura, mostrou dados subjetivos e com baixa
especificidade, uma vez que se mostram positivos em um grande número de casos.
No método quantitativo por percentual que está se propondo, cada amostra foi
fotografada em quatro diferentes campos e suas células foram contadas, identificando-se o
percentual de células que mostraram expressão pela p16INK4 em relação às células que não
mostravam esta característica, como ilustra a figura 27.
Fig.27: Fotomicrografia de um caso, mostrando positividade intensa para p16INK4 (99%), dividida
em quatro quadrantes, para a contagem de células (400x, imuno-histoquímica, sistema EnVision,
contracoloração com hematoxilina).
215 céls
neoplásicas
coradas/ 228
células
neoplásicas =
99%
94
A distribuição percentual das amostras está demonstrada na figura 28 em relação às
LEIBG em relação às LEIAG.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
J LEIBG J LEIAG
Fig. 28 Distribuição dos casos conforme a percentual de células positivas para a p16INK4,
relacionada aos grupos de diagnóstico citopatológico.
Como já foi comentado, a comparação de grupos de diagnóstico histopatológico e a
expressão da p16INK4 não mostrou diferença significativa entre NIC 1 e HPV e entre NIC
2 e NIC 3.
A análise do gráfico contido na figura 28, mostra, primeiramente, que a distribuição
das percentagens de células coradas desenham curvas inversamente proporcionais. As
LEIBG apresentam uma grande parcela de casos negativos, sendo que 60% delas possuem
positividade menor que 50%. Entretanto, 40% dos casos de LEIBG mostram forte
positividade para p16INK4, com algumas amostras chegando a 100% de células coradas.
O inverso ocorre quando se analisa o grupo das LEIAG. Neste grupo há
pouquíssimos casos (6) que tenham mostrado negatividade para p16INK4 ou positividade
29
9
33
1
4
33
1
5
1
2
1111
4
3
8
10
12
10
0
5
10
15
20
25
30
35
Número de Casos
95
menor que 50% de células coradas, o que representa 11,3% dos casos de LEIAG. Isto
significa dizer que 88,6% dos casos de NIC 2 / NIC 3 são positivos para p16INK4 com
percentagens acima de 50%, entre os quais se observa grande quantidade de casos com
100% de células expressando a p16INK4, confirmando, mais uma vez, a forte relação da
expressão desta proteína com o grau da lesão.
Resultados semelhantes são relatados por Klaes et al., (2001) que encontraram 60%
de positividade para p16INK4 em NIC 1 e 100% de positividade em NIC 2/NIC 3, em um
universo de 47 e 92 casos, respectivamente. Distribuição semelhante foi observada por
Sano et al., (1998), que relataram resultados muito parecidos, embora estes autores utilizem
métodos semi-quantitativos, assim como Klaes et al., (2001).
Para testar o quanto a expressão da p16INK4 nas lesões precursoras está associada
com a presença de HPV-DNA, foi correlacionada a positividade desta proteína com
resultados de PCR para HPV-DNA. Os resultados estão sumarizados na tabela 4.
Nº Casos PCR - PCR +
P16INK4
Neg
P16INK4
fraco
P16INK4
forte
HPV 40 11 (27,5%) 29 (72,5%) 21 (52,5%) 11 (27,5%) 8 (20%)
NIC 1 22 6 (27,2%) 16 (72,7%) 11 (50%) 7 (31,8%) 4 (18,1%)
NIC 2 15 1 (6,6%) 14 (93,3%) 2 (13,3%) 5 (33,3%) 8 (53,3%)
NIC 3
38 1 (2,7%) 37 (97,3%) 1 (2,7%) 4 (10,5%) 33 (86,8%)
Tabela 4: Expressão da p16INK4 em lesões precursoras do câncer do colo uterino (classificação de
Richart) de acordo com diagnóstico histopatológico e resultados de HPV-DNA por PCR (percentagens
amostradas entre parênteses).
96
Com base na tabela 4, vemos que dos 62 casos diagnosticados como LEIBG (NIC
1/HPV), 45 foram positivos para HPV-DNA, representando 72,5%. Estes resultados são
semelhantes aos descritos por Klaes et al., (2001), que relataram positividade de 63,8% de
HPV-DNA em NIC 1. Nos 17 casos restantes (27,4%) não foi possível identificar HPV-
DNA. Dentre estes 17 casos negativos para HPV-DNA, 10 (58,8%) apresentaram
imunohistoquímica para p16INK4 também negativa, enquanto que 7 (41,1%) mostraram
positividade para a expressão da p16INK4. Interessante observar que dentre estes 7 casos, 5
(71,4%) mostram positividade muito fraca para a proteína, da ordem de 10 a 20% de
células coradas e apenas 1 caso (14,2%) mostrou forte positividade para p16INK4, com
cerca de 65% de células coradas.
Ao contrário, Klaes et al., (2001) mostraram forte positividade para p16INK4 em
100% dos casos diagnosticados como NIC 1 e que mostraram HPV – DNA negativo
(n=17), embora estes autores tenham utilizado método semi-quantitativo para avaliar a
expressão da p16INK4.
Apesar do número reduzido de casos que se mostraram negativos para HPV-DNA
na PCR, estes resultados servem para mostrar que a PCR não deve ser utilizada como
método único de diagnóstico ou seguimento de pacientes, visto que em cerca de 25% dos
casos, não é possível se identificar o HPV-DNA e que, em 11,2% (7/62) deste grupo, a
p16INK4 foi positiva, mostrando que já houve transformação celular, embora não tenha
sido possível isolar o DNA viral.
Questiona-se agora, qual o significado para estas mulheres, cujas amostras
atingiram elevados percentuais de expressão da p16INK4. Teriam elas vírus mais
97
agressivos que as demais? A evolução da sua doença seria mais rápida? Ou, ainda, estes
resultados representam que estas pacientes, mesmo tendo lesões morfologicamente
características de NIC 1/HPV, já teriam alterações moleculares que fariam seu
comportamento biológico evolutivo ser semelhante aos de uma NIC 2/ NIC 3?
Com relação ao grupo das LEIAG (n = 53), a PCR detectou HPV-DNA em 51
casos (96,2%). Cruzando-se este achado com a expressão da p16INK4, observa-se que em
um dos casos com PCR negativa para DNA viral, a expressão da p16INK4 foi fortemente
positiva, com 80% das células coradas e no outro caso a imunohistoquímica foi negativa.
Os resultados descritos mostram-se superiores aos de Klaes et al., (2001), que relataram
75% de positividade para HPV-DNA e 100% de positividade para p16INK4, nas NIC 2 e
NIC 3, com n= 92.
Estes achados demonstram que a associação entre biologia molecular (PCR) e
imunohistoquímica, principalmente com a utilização de método de graduação quantitativo
por percentual, pode ser muito útil para auxiliar no diagnóstico diferencial de lesões do colo
uterino. A simples positividade da p16INK4 nas lesões não é suficiente para discriminar
grupos, uma vez que um número tão alto quanto 69,5% das lesões mostraram algum grau
de positividade. Entretanto, analisando-se os gráficos das figuras 27 e 28, os quais referem
o percentual de células coradas, vê-se que, nas LEIAG, a maior parte dos casos apresenta
altos percentuais de células coradas, acima de 50%. O inverso ocorre nas LEIBG, nas quais
apenas uma pequena parcela dos casos mostram percentual de positividade superior a 50%.
O número de lesões precursoras que se apresentam negativas para HPV-DNA na
PCR pode dever-se a dois principais motivos. Que estes casos sejam realmente negativos
para DNA viral ou que, em alguns destes casos, o protocolo utilizado não foi capaz de
98
detectar o DNA viral. Esta última afirmação tende a ser a verdadeira, uma vez que algumas
amostras estavam armazenadas há alguns meses ou anos e sabe-se que este tempo de
armazenamento influencia a qualidade do DNA extraído (McGhee & von Hippel, 1977;
Bramwell & Burns, 1988; Cross et al.,1990; Yagi et al., 1996; Diaz-Cano & Brady, 1997;
Srinivasan et al., 2002).
Muitos destes questionamentos ainda não têm resposta, sendo necessários estudos
de seguimento destas pacientes para determinar se a p16INK4 é apenas um bom marcador
de lesões de alto grau ou se poderá predizer a evolução das lesões.
Achado interessante foi observado relacionando-se a expressão da p16INK4 com
resultados de exames citopatológicos. Das 6 pacientes classificadas com ASC, 5 mostraram
biópsias com resultado de lesão intra-epitelial, sendo 3 com NIC 3, 1 com NIC 2 e 1 com
HPV. A expressão da p16INK4 foi fortemente positiva em todos os casos (100%) deste
grupo. Bisgaard et al.,(2005) relataram 18% de positividade para p16INK4 em pacientes
com diagnóstico citopatológico prévio de ASC, em um estudo realizado na Dinamarca, com
49 casos de pacientes com este diagnóstico. A negatividade deste biomarcador em um
determinado caso não exclui a presença de lesão e/ou infecção pelo vírus. Por outro lado, a
positividade para p16INK4 indica possível transformação neoplásica, estando
estreitamente relacionada às lesões de alto grau (NIC 2 e NIC 3). São necessários mais
estudos, com um número maior de casos de exames citopatológicos classificados como
ASC e a correlação com a p16INK4, para que isto possa ser afirmado categoricamente.
Entretanto, parece ser possível dizer que a p16INK4 seja um importante biomarcador que
auxilie no diagnóstico diferencial de alterações duvidosas e das lesões designadas como
ASC (atipias em células escamosas de significado indeterminado).
99
6. CONCLUSÕES
9 A expressão da p16INK4 em lesões precursoras do câncer do colo uterino,
excetuando-se o grupo controle, foi de 69,5% dos casos e na população total (quando
inclui-se o grupo controle), foi de 55%.
9 A expressão deste marcador nas LEIBG foi da ordem de 48,3% dos casos e em
LEIAG, chegou a 94,3% dos casos estudados. Estes dados mostram forte correlação da
expressão da p16INK4 com NIC 2 e NIC 3, com intensa coloração. Isto demonstra a
estreita associação da expressão desta proteína com lesões pré-malignas, especialmente
as de alto grau.
9 Apesar do pequeno grupo de pessoas com exame citopatológico classificado como
ASC, a p16INK4 mostrou que pode ser muito útil como método auxiliar ou alternativo
no diagnóstico diferencial destes casos. Este resultado pode indicar que a p16INK4
possa ser um importante biomarcador para definição diagnóstica em casos que a
presença de lesão é questionável, ou duvidosa.
9 A expressão da p16INK4 relaciona-se fortemente com a presença de HPV-DNA em
lesões precursoras, principalmente nas LEIAG ( NIC 2/ NIC 3). Neste grupo, a
associação destes métodos diagnósticos é muito importante para uma maior cobertura
(abrangência ) diagnóstica.
100
9 A utilização de vários métodos de avaliação da expressão da p16INK4 mostrou que há
ainda muitas perguntas para serem respondidas. A simples positividade da p16INK4 nas
lesões não é suficiente para discriminar grupos. Este achado pode indicar que não basta
apenas diagnóstico qualitativo (positivo ou negativo), mas pode ser importante um
diagnóstico quantitativo. É necessário maior estudo neste sentido, mas os achados
podem indicar que, elevados percentuais de positividade em células de lesões, possam
estar relacionados a uma progressão tumoral.
9 Entretanto, ainda é necessário estudo de seguimento de pacientes, principalmente no
que se refere ao grupo formado pelas lesões classificadas como NIC 1 / HPV, cuja
expressão da p16INK4 foi acima de 50% das células neoplásicas, por vezes chegando a
100%, à semelhança do observado nas lesões classificadas como NIC 2 / NIC 3. Ainda
não se sabe o que significa este achado nas LEIBG. Especula-se que possa estar
relacionado à persistência da infecção por vírus de alto risco oncogênico.
9 O presente estudo não estabelece a p16INK4 como biomarcador de progressão tumoral,
mas, sim, indica esta proteína como biomarcador de lesões de alto grau e de
transformação neoplásica celular, o que, indiretamente, está relacionado à progressão de
lesões do colo uterino.
101
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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119
8. ANEXOS
ANEXO 1
PROTOCOLO PARA CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE INDIVIDUAL DA
AMOSTRA
Nº ORIGINAL: Nº TRABALHO:
TIPO DE PEÇA: ( ) CONE ( ) BIÓPSIA NºBIOL.MOLECULAR:
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS
a) ATRIBUÍDAS AO HPV:
( ) COILOCITOSE
( ) DISCERATOSE
( ) MACRONUCLEOSE
( ) BINULEAÇÃO
( ) IRREGULARIDADES NUCLEARES / NÚCLEO EM “ AMEIXA”
b) DISPLASIA:
( ) AUMENTO DA RELAÇÃO NÚCLEO CITOPLASMA
( ) PLEOMORFISMO
120
( ) HIPERCROMASIA
( ) MITOSES
( ) PERDA DA POLARIDADE
( ) PERDA DO SENTIDO DE MATURAÇÃO ( DESARRANJO ARQUITETURAL)
c) RELAÇÃO DAS ALTERAÇÕES COM A CAMADA BASAL:
( ) 1/3 PROFUNDO
( ) 2/3 DO EPITÉLIO
( ) TODA A ESPESSURA DO EPITÉLIO
DIAGNÓSTICO FINAL
( ) NIC 1/ HPV
( ) NIC 2
( ) NIC 3 ( ) NORMAL (CONTROLE)
PCR PARA HPV
( ) POSITIVA ( ) NEGATIVA ______________________
P16INK4
( ) NEGATIVA ( ) FRACAMENTE POSITIVA
( ) FORTEMENTE POSITIVA _____________________
PORCENTAGEM DE CÉLULAS POSITIVAS NA LESÃO:______________
121
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO E ESCLARECIDO PARA
COLETA DE MATERIAL DE LESÃO DE COLO UTERINO
Sra. __________________________________________________, o Ambulatório
de Trato Genital Inferior do Ambulatório Central da Universidade de Caxias do Sul, está
realizando pesquisa em lesões do colo uterino que podem estar sendo causadas por um
vírus chamado Papilomavírus humano, ou HPV.
Para identificarmos o vírus é necessário que se faça a coleta de material como
uma pequena escova de plástico diretamente da lesão, a qual posteriormente será analisada
em laboratório. Esta coleta poderá causar dor de discreta intensidade e pequeno
sangramento.
Esta pesquisa tem como objetivo diagnosticar as lesões de colo uterino
causadas pelo HPV, bem como, identificar qual dos tipos de HPV ocorrem com mais
freqüência na nossa região, para que melhor possamos orientar e tratar todos os acometidos
por esta doença.
Gostaríamos de esclarecer que o HPV pode estar presente nas genitálias
masculinas e femininas, sendo considerado fator de risco para o desenvolvimento de
doenças que precedem o câncer de pênis, da vulva, da vagina e do colo uterino.
122
A sua participação nesta pesquisa é sigilosa. Somente os médicos envolvidos
diretamente com a pesquisa é que saberão do resultado, sendo sua privacidade resguardada,
não sendo relacionas com sua pessoa. Caso a presença de HPV-DNA seja detectada, a
senhora será informada e a equipe médica utilizará tal dado para melhor acompanhamento
do seu caso.
Este exame não lhe trará despesas e a qualquer momento podemos retirar tal
consentimento para participar da pesquisa. Neste caso, seu acompanhamento será
continuado pelos médicos, sem nenhum constrangimento.
O seu contato para qualquer dúvida será o Dr. Eduardo Pretto Serafini, através
do telefone 218-2100 ramal 2541 ou poderá ser encontrado pela parte da tarde no Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde, localizado no bloco S da Universidade de Caxias do Sul.
Eu, ________________________________________________ estou
suficientemente esclarecida e autorizo as coletas de material da lesão do meu colo uterino
com a finalidade de pesquisar a presença do vírus HPV.
_________________________________________________
Assinatura
Caxias do Sul, ______ de ______________________ de 200___.
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