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EDINÉIA LEMOS DE ANDRADE
CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA IN VITRO E IN VIVO DE
SUBSTÂNCIAS NATURAIS COMO ATIVADORAS DO
RECEPTOR TRPA1 EM ROEDORES
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-graduação em Farmacologia do
Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa
Catarina, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. João Batista
Calixto
Florianópolis - SC
2006
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ANDRADE, Edinéia Lemos de. Caracterização farmacológica in vitro e in
vivo de substâncias naturais como ativadoras do receptor TRPA1 em
roedores. Florianópolis, 2006. 111 p. Dissertação (Mestrado em Farmacologia)
– Curso de Pós-graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa
Catarina.
Orientador: Prof. Dr. João Batista Calixto
Defesa: 20/02/2006.
O receptor TRPA1 (receptor de potencial transitório com domínios anquirina 1),
um membro da família de canais catiônicos TRP (receptor de potencial
transitório), é expresso em um subgrupo de neurônios do gânglio da raiz dorsal
co-localizado com o receptor TRPV1 (receptor de potencial transitório vanilóide
1) e em neurônios do gânglio do nervo trigêmeo, do gânglio nodoso e em
terminações periféricas que inervam a bexiga urinária. Tendo em vista o
envolvimento deste receptor em diversos processos sensoriais, o presente
estudo avaliou o efeito e o possível mecanismo de ação decorrente da ativação
do receptor TRPA1 em roedores através de estudos in vitro e in vivo. Nos
estudos in vitro, a exposição da bexiga isolada de rato aos agonistas do
receptor TRPA1, isotiocianato de alila ou cinamaldeído, causou resposta
contrátil dependente de cálcio externo, da liberação de taquicininas e de
prostaglandina E
2
, mas não de fibras colinérgicas e purinérgicas. A resposta
contrátil induzida pelos agonistas dos receptores TRPA1 (cinamaldeído) ou
TRPV1 (capsaicina) foi significativamente aumentada em ratos com cistite
quando comparada com animais controle. Nos estudos in vivo utilizando
camundongos, a injeção intraplantar dos agonistas do receptor TRPA1 causou
nocicepção espontânea dependente da dose, da liberação de histamina de
mastócitos e da ativação de fibras sensíveis à capsaicina. Porém este efeito
parece não envolver a ativação de fibras simpáticas e a liberação de
substância P. Portanto, os resultados obtidos mostram que o estudo do
envolvimento do receptor TRPA1 nos sistemas sensoriais e dos mecanismos
envolvidos na ativação deste receptor são promissores na perspectiva de se
desenvolver novas estratégias terapêuticas úteis no tratamento de distúrbios
dolorosos.
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“Não deixe que a saudade sufoque,
que a rotina acomode,
que o medo impeça de tentar.
Desconfie do destino e acredite em você.
Gaste mais horas realizando
que sonhando,
fazendo que planejando,
vivendo que esperando
porque, embora
quem quase morre esteja vivo,
quem quase vive já morreu.”
(Luiz Fernando Veríssimo)
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Osny e Amália, por todo apoio e incentivo durante todas as
fases da minha vida.
Ao meu amado Júlio que suportou a minha ausência e esteve do meu lado em
todos os momentos, incondicionalmente.
Aos meus irmãos que de maneiras diferentes me incentivaram.
Ao professor João Batista Calixto, por ter me concedido a oportunidade de
ingressar neste curso e principalmente pela valiosa orientação, da qual sempre
terei orgulho.
Ao professor Juliano Ferreira pela sua paciência, dedicação e auxílio desde o
início.
Aos professores do programa de Pós-Graduação que demonstraram a arte de
ensinar
Aos professores da graduação em Farmácia e Bioquímica da UEPG, onde tudo
começou e especialmente aos professores Josiane Madalozzo, Paulo Roberto
Fávero e Everson Augusto Krum que foram exemplos de ética e dedicação e
que despertaram em mim o desejo pelo conhecimento.
A todos os colegas de trabalho pela boa convivência e especialmente àqueles
que me auxiliaram neste projeto, com sugestões, discussões e
questionamentos importantes para a realização do mesmo.
A todos os funcionários deste departamento que através de seus trabalhos
ajudaram a manter e melhorar as condições de trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...................................................................................... I
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................... IV
RESUMO........................................................................................................ V
ABSTRACT.................................................................................................... VII
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 01
1.1. Canais iônicos de potencial transitório - TRP......................................... 01
1.2. Estudo de fibras sensoriais através da capsacina.................................. 03
1.3. Descoberta do receptor vanilóide........................................................... 06
1.4. Identificação do receptor TRPA1 e seus ligantes................................... 10
1.4.1. Localização do receptor TRPA1.......................................................... 15
1.5. Elucidação do papel funcional do receptor TRPA1................................. 16
2. OBJETIVOS............................................................................................... 20
2.1. Objetivo geral.......................................................................................... 20
2.2. Objetivos específicos.............................................................................. 20
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 21
3.1. Animais.................................................................................................... 21
3.2. Experimentos in vitro...............................................................................
22
3.2.1. Bexiga isolada de rato.......................................................................... 22
3.2.2. Curvas concentração-resposta cumulativa e não-cumulativa para as
respostas contráteis induzidas pelos agonistas de receptores TRPV1 e
TRPA1............................................................................................................
23
3.2.3. Dessensibilização das respostas contráteis induzidas pelos
agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1.....................................................
24
3.2.4. Análise dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil induzida
pela ativação do receptor TRPA1..................................................................
24
3.2.5. Ensaio de união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina em
membrana de medula espinhal de rato..........................................................
26
3.2.6. Liberação de prostaglandina E
2
e substância P em resposta à
exposição da bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila.......................
27
3.2.7. Cistite química induzida por ciclofosfamida......................................... 28
3.3. Experimentos in vivo...............................................................................
28
3.3.1. Curvas dose-resposta para a nocicepção induzida pelos agonistas
de receptores TRPV1 e TRPA1.....................................................................
28
3.3.2. Decurso temporal para a nocicepção induzida pelo isotiocianato de
alila.................................................................................................................
29
3.3.3. Estudo dos mecanismos periféricos envolvidos na nocicepção
induzida pela ativação do receptor TRPA1....................................................
29
3.3.3.1. Participação das fibras aferentes sensíveis à capsaicina na
resposta nociceptiva induzida pelos agonistas do receptor TRPA1..............
30
3.3.3.2. Participação das fibras simpáticas na resposta nociceptiva
induzida pelo isotiocianato de alila.................................................................
31
3.3.3.3. Participação dos mastócitos na resposta nociceptiva induzida
pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1...........................................
31
3.3.3.4. Participação da substância P e do receptor NK
1
para as
taquicininas na resposta nociceptiva produzida pelos agonistas de
receptores TRPV1 e TRPA1.........................................................................................
32
3.4. Drogas..................................................................................................... 33
3.5. Análise estatística................................................................................... 35
4. RESULTADOS........................................................................................... 36
4.1. Experimentos in vitro...............................................................................
36
4.1.1. Análise das respostas contráteis induzidas pelos agonistas de
receptores TRPV1 e TRPA1 na bexiga isolada de rato.................................
36
4.1.2. Dessensibilização das respostas contráteis induzidas pelos
agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1 na bexiga isolada de rato...........
37
4.1.3. Efeito do antagonista não seletivo de receptores TRP vermelho de
rutênio, sobre as respostas contráteis induzidas pelos agonistas de
receptores TRPV1 e TRPA1 na bexiga isolada de rato.................................
41
4.1.4. Participação do cálcio externo nas respostas contráteis induzidas
pela ativação do receptor TRPA1 na bexiga urinária isolado de rato............
43
4.1.5. Participação de canais de sódio, de receptores colinérgicos e
purinérgicos nas respostas contráteis induzidas pela ativação do receptor
TRPA1 na bexiga isolado de rato..................................................................
44
4.1.6. Influência das taquicininas sobre as respostas contráteis induzidas
pelos agonistas do receptor TRPA1 na bexiga isolado de rato.....................
45
4.1.7. Dosagem dos níveis de substância P em resposta à exposição da
bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila..............................................
46
4.1.8. Participação das ciclooxigenases nas respostas contráteis induzidas
pelos agonistas do receptor TRPA1 na bexiga isolada de rato.....................
47
4.1.9. Dosagem dos níveis de prostaglandina E
2
em resposta à exposição
da bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila.........................................
48
4.1.10. Efeito do antagonista seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791
sobre as respostas contráteis induzidas pelos agonistas de receptores
TRPV1 e TRPA1, prostaglandina E
2
e substância P na bexiga isolada de
rato.................................................................................................................
49
4.1.11. Ensaio de união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina em
membrana de medula espinhal de rato..........................................................
52
4.1.12. Influência do tratamento com ciclofosfamida sobre as respostas
contráteis induzidas pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1..........
53
4.2. Experimentos in vivo...............................................................................
54
4.2.1. Curvas dose-resposta para a nocicepção induzida pelos agonistas
de receptores TRPV1 e TRPA1 e decurso temporal para a nocicepção
induzida pelo isotiocianato de alila.................................................................
54
4.2.2. Papel das fibras aferentes sensíveis à capsaicina na nocicepção
induzida pelos agonistas do receptor TRPA1 e das fibras simpáticas na
nocicepção induzida pelo isotiocianato de alila.............................................
55
4.2.3. Efeito de antagonistas de receptores TRPV1 na nocicepção
induzida pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1.............................
56
4.2.4. Participação dos mastócitos na resposta nociceptiva induzida pelos
agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1.....................................................
59
4.2.5. Participação da substância P e do receptor NK
1
para as taquicininas
na resposta nociceptiva produzida pelos agonistas de receptores TRPV1 e
TRPA1............................................................................................................
61
5. DISCUSSÃO.............................................................................................. 63
5.1. Estudos in vitro........................................................................................
63
5.2. Estudos in vivo........................................................................................
78
6. CONCLUSÃO............................................................................................ 84
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 88
8. ANEXO..................................................................................................... 111
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Modelo estrutural dos canais iônicos TRP...................................... 01
Figura 2. Modelo estrutural dos canais iônicos TRPV1 e TRPA1.................. 10
Figura 3. Temperaturas médias de ativação dos receptores TRPA1,
TRPM8 e TRPV1............................................................................................
12
Figura 4. Estruturas químicas da capsaicina, resiniferatoxina, isotiocianato
de alila e cinamaldeído...................................................................................
14
Figura 5. Curvas concentração-resposta obtidas pelo método cumulativo e
não-cumulativo para os efeitos contráteis induzidos pela capsaicina,
isotiocianato de alila ou cinamaldeído em bexiga isolada de rato.................
37
Figura 6. Dessensibilização do efeito contrátil induzido pela capsaicina,
isotiocianato de alila ou cinamaldeído em bexiga isolada de rato.................
38
Figura 7. Efeito contrátil induzido pelo isotiocianato de alila ou pelo
cinamaldeído em preparações dessensibilizadas com capsaicina e efeito
contrátil induzido pela capsaicina em preparações dessensibilizadas com
isotiocianato de alila ou cinamaldeído em bexiga isolada de rato.................
40
Figura 8. Efeito contrátil induzido pelo isotiocianato de alila em
preparações dessensibilizadas com cinamaldeído e efeito contrátil
induzido pelo cinamaldeído em preparações dessensibilizadas com
isotiocianato de alila em bexiga isolada de rato.............................................
41
Figura 9. Curva concentração-resposta para o antagonista vermelho de
rutênio, na contração induzida pela capsaicina ou pelo isotiocianato de
alila e influência do vermelho de rutênio na resposta contrátil induzida pelo
cinamaldeído na bexiga isolada de rato.........................................................
42
Figura 10. Influência da presença ou ausência de cálcio externo sobre
resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído
na bexiga isolada de rato...............................................................................
43
Figura 11. Influência do bloqueador de canal de sódio tetradotoxina sobre
a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo
cinamaldeído na bexiga isolada de rato.........................................................
44
Figura 12. Influência do antagonista de receptores colinérgicos atropina e
do antagonista de receptores purinérgicos suramina sobre a resposta
contrátil induzida pelo isotiocianato de alila na bexiga isolada de rato..........
45
Figura 13. Influência dos antagonistas seletivos dos receptores NK
1
, NK
2
e
NK
3
sobre a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo
cinamaldeído na bexiga isolada de rato.........................................................
46
Figura 14. Liberação de substância P induzida pelo isotiocianato de alila
em bexiga isolada de rato..............................................................................
47
Figura 15. Influência do antagonista não seletivo de ciclooxigenases
indometacina sobre a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila
ou pelo cinamaldeído na bexiga isolada de rato............................................
48
Figura 16. Liberação de prostaglandina E
2
induzida pelo isotiocianato de
alila (100 µM) em bexiga isolada de rato.......................................................
49
Figura 17. Influência do antagonista seletivo do receptor TRPV1 SB
366791 sobre a resposta contrátil induzida pela capsaicina, isotiocianato
de alila, cinamaldeído, PGE
2
ou substância P na bexiga isolada de rato......
51
Figura 18. Ensaio de competição para a união específica da [
3
H]-
resiniferatoxina na medula espinhal de ratos induzidos pela capsaicina,
isotiocianato de alila ou cinamaldeído............................................................
52
Figura 19. Influência do tratamento com ciclofosfamida sobre a resposta
contrátil induzida pela capsaicina, isotiocianato de alila ou cinamaldeído na
bexiga isolada de rato....................................................................................
53
Figura 20. Curva dose-resposta para a nocicepção espontânea induzida
pela injeção i.pl. de capsaicina, isotiocianato de alila ou de cinamaldeído e
decurso temporal para a nocicepção espontânea causada pela injeção i.pl.
de isotiocianato de alila..................................................................................
55
Figura 21. Influência do tratamento neonatal com capsaicina sobre a
resposta nociceptiva causada pela injeção i.pl. de isotiocianato de alila ou
de cinamaldeído e influência do tratamento com guanetidina sobre a
resposta nociceptiva causada pela injeção i.pl. de isotiocianato de alila.......
56
Figura 22. Influência do tratamento i.pl. com os antagonistas de receptores
TRPV1 vermelho de rutênio, capsazepina ou SB 366791 sobre a
nocicepção induzida pela capsaicina ou isotiocianato de alila.......................
58
Figura 23. Influência do tratamento prévio dos animais com o degranulador
de mastócitos composto 48/80 por 4 dias consecutivos, sobre a resposta
nociceptiva induzida pela injeção i.pl. de capsaicina, isotiocianato de alila
ou composto 48/80 no quinto dia...................................................................
60
Figura 24. Influência do tratamento i.pl. com o antagonista de receptores
H
1
para a histamina
pirilamina, sobre a resposta nociceptiva causada pela
injeção i.pl. de capsaicina ou de isotiocianato de alila...................................
61
Figura 25. Influência do tratamento i.pl. com o antagonista de receptores
NK
1
FK 888 sobre a resposta nociceptiva induzida pela injeção i.pl. de
capsaicina ou isotiocianato de alila e liberação tecidual de substância P
causada pela injeção i.pl. de capsaicina ou isotiocianato de alila..................
62
Figura 26. Mecanismo proposto para a resposta contrátil induzida pela
ativação do receptor TRPA1 em bexiga isolada de rato................................
86
Figura 27. Mecanismo proposto para a resposta nociceptiva induzida pela
ativação do receptor TRPA1 em pata de camundongo.................................
87
LISTA DE ABREVIATURAS
µM - micromolar
nM - nanomolar
pg - picograma
CE
50
- concentração efetiva de 50%
CI
50
- concentração inibitória de 50%
E.P.M - erro padrão da média
NKA - neurocinina A
NKB - neurocinina B
NK
1
- receptor para as taquicininas
NK
2
- receptor para as taquicininas
NK
3
- receptor para as taquicininas
CAP - capsaicina
ITCA - isotiocianato de alila
CIN - cinamaldeído
EP - receptores EP para a prostaglandina E
2
TRP - receptor de potencial transitório
TRPV1 - TRP vanilóide 1
TRPV2 - TRP vanilóide 2
TRPA1 - TRP com domínios tipo Anquirina 1
TRPM8 - TRP tipo melastatina 8
ANKTM1 - proteína transmembrana com domínios tipo anquirina
p120 - proteína isolada de fibroblastos com 120 KDa
B
2
- receptor B
2
para a bradicinina
RNAm - RNA mensageiro
HEK - células renais embrionárias humanas
CHO - células de ovário de hamster chinês
CGRP - peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
AMPc - adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
ATP - trifosfato de adenosina
EDTA - ácido etilenodiaminotetracético
V
RESUMO
O presente estudo avaliou através do emprego de abordagens
farmacológicas in vitro e in vivo, alguns dos mecanismos envolvidos na
ativação do receptor TRPA1 (receptor de potencial transitório com domínios
anquirina 1), um membro da família de canais catiônicos TRP (receptor de
potencial transitório). De forma semelhante ao agonista do receptor TRPV1
(receptor de potencial transitório vanilóide 1), a capsaicina, os agonistas do
receptor TRPA1, o isotiocianato de alila e o cinamaldeído, causaram contração
da bexiga isolada de rato dependente de cálcio externo. Esta resposta foi
susceptível a dessensibilização. O vermelho de rutênio, um antagonista não-
seletivo dos receptores TRP, reduziu de forma significativa a resposta contrátil
induzida pela capsaicina, pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído. O
antagonista seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791, foi capaz de inibir
completamente a resposta contrátil induzida pela capsaicina, enquanto reduziu
parcialmente o efeito produzido pelos agonistas do receptor TRPA1. Ademais,
a contração induzida pelo isotiocianato de alila foi significativamente reduzida
pelos antagonistas dos receptores taquicinérgicos NK
1
, NK
2
e NK
3
,
tetrodotoxina e indometacina, mas não pela atropina ou suramina. Por outro
lado, a contração causada pelo cinamaldeído foi inibida pelos antagonistas de
receptores NK
1
e NK
2,
tetrodotoxina ou indometacina. Em contraste à
capsaicina, o isotiocianato de alila e o cinamaldeído não interferiram com a
união específica do agonista [
3
H]-resiniferatoxina em membranas de medula
espinhal de rato. A exposição da bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila
causou aumento dos níveis de prostaglandina E
2
e de substância P na solução
nutritiva. A resposta contrátil induzida pela capsaicina ou pelo cinamaldeído na
bexiga isolada de rato foi significativamente aumentada em ratos com cistite,
em relação aos animais controle.
Os resultados in vivo mostraram que, da mesma forma que a capsaicina,
a injeção intraplantar de isotiocianato de alila ou cinamaldeído causou
nocicepção espontânea dependente da dose em camundongos. A nocicepção
induzida pela capsaicina ou pelo isotiocianato de alila foi reduzida pelo
vermelho de rutênio ou pela capsazepina, antagonistas não seletivos do
VI
receptor TRPV1, mas não pelo antagonista seletivo de receptores NK
1
, o FK
888. O antagonista seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791, inibiu somente a
resposta nociceptiva provocada pela capsaicina, mas não aquela provocada
pelo isotiocinato de alila. O tratamento neonatal de camundongos com
capsaicina atenuou a nocicepção induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo
cinamaldeído. A degranulação prévia de mastócitos pelo composto 48/80 ou o
tratamento com o antagonista de receptores histaminérgico H
1
para a
histamina, pirilamina, também inibiram de maneira significativa a resposta
nociceptiva causada pela capsaicina ou pelo isotiocianato de alila. Em
conjunto, estes resultados mostram que o isotiocianato de alila e o
cinamaldeído induzem contração da bexiga isolada de ratos e nocicepção
espontânea em camundongos. A resposta contrátil da bexiga é dependente de
cálcio extracelular e da liberação de taquicininas e prostaglandina E
2
. Por outro
lado, a nocicepção espontânea parece depender da ativação de fibras
sensíveis à capsaicina e da liberação de histamina de mastócitos.
VII
ABSTRACT
The present study evaluated by use in vitro e in vivo pharmacological
approaches some mechanisms involved in the activation of TRPA1 receptor
(transient receptor potential ankyrin-like 1), a member of the TRP (transient
potential receptor) ion channel family. Similar to the TRPV1 receptor agonist
(transient receptor potential vanilloid 1) capsaicin, the agonists for TRPA1
receptor, allyl isothiocyanate and cinnamaldehyde, caused a external calcium-
dependent contraction of rat isolated urinary bladder. This response was
susceptible to desensitization. Ruthenium red, a non-selective TRP receptor
antagonist, significantly reduced the contractile response induced by capsaicin,
allyl isothiocyanate or cinnamaldehyde. The selective TRPV1 receptor
antagonist SB 366791 was able to completely inhibit capsaicin-induced
contractile response, whereas it partially reduced the effect produced by TRPA1
receptor agonists. In addiction, the contraction induced by allyl isothiocyante
was significantly reduced by NK
1
, NK
2
and NK
3
tachykinin receptor antagonists,
tetrodotoxin, and indomethacin, but not by atropine or suramin. On the other
hand, the contraction caused by cinnamaldehyde was inhibited by NK
1
, NK
2
receptors antagonists, tetrodotoxin or indomethacin. In contrast to capsaicin,
allyl isothiocyanate and cinnamaldehyde did not interfere with [
3
H]-
resiniferatoxin specific binding sites in membranes of rat spinal cord. The rat
isolated urinary bladder exposition to allyl isothiocyanate caused an increase of
prostaglandin E
2
and substance P levels in nutritive solution. The contractile
response induced by capsaicin or by cinnamaldehyde in rat isolated urinary
bladder was significantly enhanced in rats with cystitis in relation to control
animals.
Our in vivo results showed that, similarly to capsaicin, intraplantar
injection of allyl isothiocyanate or cinnamaldeyde caused spontaneous and
dose-dependent nociception. Capsaicin or allyl isothiocyanate-induced
nociception was reduced by ruthenium red or capsazepine, but not by NK
1
receptor antagonist FK 888. The selective TRPV1 receptor antagonist SB
366791 inhibited capsaicin-evoked nociceptive response, but not that triggered
by allyl isothiocyanate. Neonatal treatment of mice with capsaicin attenuated
VIII
either allyl isothiocyanate- or cinnamaldehyde-induced nociception. Previous
mast cells degranulation by compound 48/80 or the treatment with the H
1
histaminergic receptor antagonist pyrilamine also significantly inhibited the
nociceptive response caused by capsaicin or by allyl isothiocyanate. Taken
together, these results shows that allyl isothiocyanate and cinnamaldehyde
induced contraction of rat isolated urinary bladder and spontaneous nociception
in mice. The bladder contractile response is dependent on extracellular calcium,
tachykinin and prostaglandin E
2
release. On the other hand, the spontaneous
nociception appears to be dependent on capsaicin-sensitive fibers activation
and histamine release from mast cells.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Canais iônicos de potencial transitório - TRP
O genoma humano codifica centenas de canais que permitem a
passagem de íons através de camadas lipídicas impermeáveis. Enquanto
transportadores consomem energia para construir gradientes de concentração
e diferenças de potencial, os canais iônicos gastam esta energia tanto quanto
um interruptor pode liberar a energia armazenada em uma pilha. Pequenas
mudanças de conformação causam a abertura do canal e permitem que
dezenas de milhões de íons permeiem através do poro do canal (para revisão
ver: Clapham, 2003). A identificação e a caracterização de canais iônicos são
cruciais para uma melhor compreensão da atividade celular tanto em situações
fisiológicas como em quadros patológicos, uma vez que os mesmos
desempenham um papel central na homeostase do organismo. Baseado neste
propósito, Minke (1977) estudando fotoreceptores de moscas do gênero
Drosophila identificou um mutação neste inseto que resultava em uma corrente
transitória em resposta à luz, em contraste à corrente sustentada da Drosophila
não mutante. Análises futuras mostraram que esses animais possuíam uma
mutação em um canal de entrada de cálcio, mais tarde denominado receptor
de potencial transitório (TRP). Após a descoberta deste primeiro canal TRP,
muitos outros membros da mesma família foram descobertos e apresentaram
uma variedade de funções biológicas que englobam desde a fototransdução à
detecção de estímulos mecânicos, térmicos, nocivos, paladar e ferormônios
(para revisão ver: Clapham, 2003; Calixto et al., 2005).
2
Esta nova família de canais iônicos foi subdividida em quatro classes
principais: TRPC (família TRP Canônica), TRPM (família TRP Melastatina),
TRPV (família TRP Vanilóide) e TRPA (família TRP com domínios repetidos
relacionados à Anquirina). Todos os canais TRP são subunidades
polipeptídicas com seis domínios transmembranares que normalmente se
unem como tetrâmeros para formar poros. Os poros geralmente se localizam
entre os domínios transmembranares cinco e seis e são permeáveis a cátions
de maneira não seletiva (para revisão ver: Clapham, 2003; Montell, 2003)
(Figura 1).
Figura 1. Modelo estrutural dos canais iônicos TRP (Adaptado de Clapham,
2003).
A família de canais iônicos TRP contribui para mudanças na
concentração de cálcio
intracelular por prover vias de entrada de cálcio, por
modular a força de direção para a entrada de cálcio e provavelmente também
por prover vias intracelulares para liberação deste íon de organelas celulares
(Pedersen et al., 2005). Estas propriedades são importantes, pois alterações na
Extracelular
Intracelular
3
concentração de cálcio citosólico livre desempenham um papel central em
muitos processos celulares incluindo a contração muscular, a liberação de
transmissores, proliferação celular, transcrição de genes e morte celular
(Berridge et al., 2000).
A caracterização de muitos dos canais TRP decorreu da busca de alvos
moleculares para substâncias de ocorrência natural, especialmente aquelas
derivadas de plantas, tais como a pimenta e a mostarda, cujos compostos
isolados, capsaicina e isotiocianato de alila, permitiram a identificação do
receptor TRPV1 e TRPA1, respectivamente. Em relação à capsaicina, além de
contribuir na identificação do receptor TRPV1, este composto tem sido utilizado
como uma importante ferramenta no estudo de fibras sensoriais.
1.2. Estudo de fibras sensoriais através da capsaicina
A capsaicina é um componente ativo pungente de espécies do gênero
Capsicum (família Solanaceae) (para revisão ver: Szallasi e Blumberg, 1999).
O pesquisador húngaro, Nicholas Jancsó, foi o primeiro a postular que a
capsaicina atuaria em um receptor envolvido na transmissão da dor. Em 1949,
Jancsó demonstrou que a aplicação de capsaicina na pele humana causava
rápida sensação de dor em queimação além de vasodilatação. Esse fenômeno
foi seguido pelo desenvolvimento rápido de um estado refratário, denominado
dessensibilização, onde a pele tratada apresentava-se relativamente resistente,
não somente à capsaicina, mas também a outros agentes químicos irritantes e
ao calor nocivo (Jancsó e Jancsó-Gabor, 1949; Jancsó, 1955). Mais tarde,
Jancsó e colaboradores (1968; 1977) demostraram que a administração
sistêmica de capsaicina em ratos adultos, e mais especificamente em ratos
4
neonatos, causava degeneração seletiva de neurônios sensoriais de pequeno
diâmetro. Assim a dor, a dessensibilização e a degeneração produzida pela
capsaicina foram atribuídas à estimulação de um subgrupo específico de fibras
sensoriais que também seriam sensíveis a irritantes químicos e calor nocivo.
Este fato contribuiu grandemente para o conhecimento da organização
do processamento da dor, pois se tem mostrado que alguns tipos de dor e de
inflamação são mediados pela ativação de uma população restrita de neurônios
sensoriais que compõem as fibras aferentes primárias. Atualmente, sabe-se
que a informação proveniente da ativação de receptores periféricos presentes
em fibras sensoriais que inervam tecidos cutâneos ou viscerais, ascendem às
estruturas supra-espinhais através da medula espinhal (para revisão ver:
Caterina e Julius, 2001; Hunt e Mantyh, 2001). Os corpos celulares destas
fibras estão localizados nos gânglios trigeminal, nodoso e da raiz dorsal. Além
disso, existe um grande número de subpopulações de fibras que na maioria
dos casos respondem a tipos particulares de estimulação nociva (capazes de
produzir lesão tecidual) e inócua (incluindo o tato e a propriocepção).
Anatomicamente, há dois grandes grupos de fibras sensoriais: as fibras A
mielinizadas e as fibras C não mielinizadas. Os corpos celulares de neurônios
com maior diâmetro e mielinizados dão origem a fibras Aβ. Estas fibras
apresentam uma velocidade de condução rápida que detectam estímulos
inócuos (aplicados, por exemplo, na pele, músculos e articulações) e então não
contribuem para a dor. Por outro lado, a maioria das fibras sensoriais de
pequeno diâmetro denominadas fibras C não mielinizadas e as fibras Aδ
finamente mielinizadas são geralmente sensíveis à estimulação nociva. Por
5
esta característica os terminais periféricos livres destas fibras são conhecidos
como nociceptores.
Outro aspecto importante oriundo dos estudos com a capsaicina foi a
descoberta que a estimulação de subtipos de fibras aferentes primárias pode
causar a liberação de substâncias vasoativas, especialmente neuropeptídeos
(Holzer, 1988). De fato, a ativação das terminações periféricas e centrais de
grande parte das fibras C e de uma pequena população de fibras Aδ
(conhecidas genericamente como fibras sensíveis à capsaicina) pode liberar
taquicininas (substância P, neurocininas A ou B) e o peptídeo relacionado ao
gene da calcitonina (CGRP) (Holzer, 1988). A ação destes mediadores em
células alvos através da interação com seus receptores específicos está
envolvida com vários processos fisiopatológicos, como a regulação da
produção de muco pelo estômago e a indução de sinais clássicos da
inflamação (um fenômeno conhecido como inflamação neurogênica) (Holzer,
1988; Richardson and Vasko, 2002). Sabe-se hoje que a inflamação
neurogênica possui um papel importante na patologia de muitas doenças
(Helyes et al., 2003).
A neurotoxicidade seletiva causada por agonistas do receptor vanilóide,
especialmente a capsaicina, tem valor terapêutico. A aplicação tópica de
preparações contendo capsaicina vem sendo utilizada clinicamente como
analgésico adjuvante no tratamento da dor em pacientes com neuralgia pós-
herpética, neuropatia diabética, síndrome de dor pós-mastectomia, osteoartrite
e artrite reumatóide. A administração intravesical de capsaicina também é
usada no tratamento de certos transtornos da bexiga urinária como
hiperreflexia, hipersensibilidade da bexiga urinária e cistite intersticial (Szallasi
6
e Blumberg, 1999; Szallasi e Fowler, 2002; Moldwin e Sant, 2002). Estes
achados salientam a importância da capsaicina como ferramenta farmacológica
no entendimento do sistema somatosensorial e como protótipo no
desenvolvimento de fármacos.
1.3. Descoberta do receptor vanilóide
Apesar dos avanços com relação aos estudos com a capsaicina, faltava
ainda elucidar o exato alvo molecular pelo qual a capsaicina exercia suas
ações. Tendo em vista que a capsaicina apresentou seletividade de ação sobre
um subgrupo específico de neurônios sensoriais, uma hipótese seria que certos
neurônios sensoriais poderiam expressar um receptor específico para esta
substância. Em 1975, Szolcsanyi e Jancsó-Gabor descreveram o primeiro
modelo de receptor para explicar a exata relação estrutura-atividade para uma
atividade semelhante à capsaicina. Desta maneira, a pesquisa para sítios de
união específicos para a capsaicina foi iniciada usando diidrocapsaicina
radiomarcada ou sondas de fotoafinidades semelhantes à capsaicina (Szebeni
et al., 1978; James et al., 1988). Porém, estes estudos não obtiveram
resultados promissores, devido a capsaicina ser extremamente lipofílica e
apresentar potência relativamente baixa (Szallasi e Blumberg, 1999).
Um avanço neste estudo do sítio de ligação da capsaicina ocorreu com a
descoberta da resiniferatoxina, um diterpeno extremamente irritante presente
no látex seco da planta Euphorbia resinifera, um cacto nativo do Marrocos
(Euphorbiaceae) (Hergenhahn et al., 1975; para revisão ver: Appendino e
Szallasi, 1977). A resiniferatoxina é esterificada com um ácido homovanílico no
carbono 20, uma característica essencial para sua atividade irritante. Como o
7
grupamento homovanílico também é uma característica estrutural crítica da
capsaicina, foi postulado que a resiniferatoxina e a capsaicina poderiam
apresentar um mecanismo de ação comum (Szallasi e Blumberg, 1989). De
fato, uma importante dessensibilização cruzada entre resiniferatoxina e
capsaicina foi observada em experimentos in vivo e in vitro. Devido à
capsaicina e análogos da resiniferatoxina compartilharem um grupamento
homovanílico essencial para a bioatividade, estas substâncias de ocorrência
natural foram posteriormente chamadas de vanilóides (Szallasi e Blumberg,
1990a).
A resiniferatoxina produz várias ações farmacológicas semelhantes às
da capsaicina, incluindo pungência, inflamação neurogênica e diminuição da
temperatura corporal (Szallasi e Blumberg, 1989). No entanto, o efeito
dessensibilizante da resiniferatoxina é até mil vezes mais potente do que o
observado para a capsaicina. Esse último aspecto possibilitou o estudo do sítio
de ação da capsaicina. As evidências iniciais mostravam que a resiniferatoxina
marcada radioativamente ligava-se a sítios específicos no gânglio da raiz
dorsal de rato, uma ligação que era deslocada competitivamente e
seletivamente pela capsaicina (Szallasi e Blumberg, 1990b).
Subsequentemente, sítios de união específica para a resiniferatoxina
(chamados de receptor vanilóide) foram detectados na medula espinhal e em
vários tecidos periféricos, como por exemplo, bexiga urinária, uretra, mucosa
nasal e cólon de várias espécies incluindo rato, cobaia, camundongo, hamster,
porco e humanos (Szallasi e Blumberg, 1991, 1993; Szallasi et al., 1993).
Um novo avanço no estudo do suposto receptor vanilóide foi a clonagem
do mesmo. Usando uma estratégia inovadora, o grupo de pesquisa liderado por
8
David Julius isolou o DNA complementar (cDNA) codificador da proteína
sensível à capsaicina (Caterina et al., 1997). No primeiro passo deste estudo,
células eucarióticas foram transfectadas com frações de cDNA isolado de
neurônios sensoriais de rato e a visualização do cálcio intracelular foi usada
para identificar as células que responderam à capsaicina. Quando uma fração
positiva foi encontrada, ela foi dividida em frações menores até o isolamento de
um cDNA codificador do receptor (Caterina et al., 1997). O gene do receptor
vanilóide (chamado inicialmente de VR1 e posteriormente de TRPV1) de rato
codifica um polipeptídeo com 838 aminoácidos com características estruturais
similares a outros canais TRP (Caterina et al., 1997). Além da capsaicina, este
receptor se mostrou sensível ao pH ácido (≤ 5,9) e ao calor (≥ 43°C) (Caterina
et al., 1997; Tominaga et al., 1998). Recentemente, demonstrou-se que o
TRPV1 pode ser estimulado por algumas substâncias lipídicas endógenas
chamadas de endovanilóides, como a anandamida e derivados da
lipooxigenase (Zygmunt et al., 1999; Hwang et al., 2000, Calixto et al., 2005). O
receptor TRPV1 foi identificado em terminações e corpos celulares de
neurônios do gânglio da raiz dorsal e do gânglio trigeminal, bem como em
alguns tipos de células não neuronais (para revisão ver Planells-Cases et al.,
2005).
A clonagem do receptor vanilóide permitiu o desenvolvimento de animais
com deleção do gene que codifica o receptor TRPV1. Estes camundongos
nocautes apresentaram respostas normais a estímulos mecânicos nocivos,
sensibilidade térmica reduzida no local da inflamação, mas não apresentaram
resposta nociceptiva quando foram tratados com agonistas vanilóides (Caterina
9
et al., 2000; Davis et al., 2000). Deste modo, o receptor TRPV1 parece ser um
integrador da transmissão dos estímulos dolorosos químicos e térmicos.
O receptor TRPV1 foi o primeiro receptor sensível à temperatura
(termoreceptor) a ser identificado do ponto de vista molecular (Figura 2).
Posteriormente, vários outros membros da família TRP foram identificados,
incluindo outros termoreceptores. Em 1999, um receptor vanilóide relacionado
ao TRPV1 insensível à capsaicina e ativado por calor intenso foi clonado e
chamado de TRPV2 (Caterina et al., 1999). Porém, faltava ainda identificar
termoreceptores que detectassem temperaturas inferiores. Utilizando a mesma
lógica usada na descoberta do receptor TRPV1 foram procurados transcritos
expressos por neurônios sensoriais que eram sensíveis a um outro produto
natural, o mentol. O mentol é um monoterpeno conhecido por sua característica
de produzir frescor. Desta forma, um termoreceptor sensível ao mentol e ao frio
inócuo foi identificado por dois diferentes grupos de pesquisa e chamado de
TRPM8 (Peier et al., 2002; McKemy et al., 2002). Recentemente, um novo
termoreceptor da família TRP sensível ao frio nocivo, mas não ao mentol, foi
identificado e denominado de TRPA1 (Story et al., 2003) (Figura 2).
10
Figura 2. Modelo estrutural dos canais iônicos TRPV1 e TRPA1 (Adaptado de
Caterina et al., 1997 e Jaquemar et al., 1999).
1.4. Identificação do receptor TRPA1 e seus ligantes
O receptor TRPA1 (inicialmente nomeado de p120, ANKTM1 ou TRPN1)
foi inicialmente identificado como uma proteína que é perdida depois da
transformação oncogênica de fibroblastos humanos (Jaquemar et al., 1999).
Estruturalmente, o receptor TRPA1 é uma proteína com seis domínios
transmembrana, com ambas as porções amino e carboxi terminal intracelulares
e com múltiplos domínios relacionados à proteína anquirina na sua porção
amina terminal. O RNAm que traduz o receptor TRPA1 estava presente em
fibroblastos normais mantidos em cultura, mas não em células transformadas
pela infecção com o vírus SV40 ou em várias linhagens de células de tumor
mesenquimais. O gene correspondente foi identificado no cromossomo 8
humano que codifica uma proteína de 1119 aminoácidos. Inicialmente, o papel
fisiopatológico descrito para este canal seria um papel direto ou indireto na
transdução de sinal e no controle do crescimento, visto que o aumento da sua
11
expressão em células eucarióticas interferiu com o crescimento normal
(Jaquemar et al., 1999).
Independente deste estudo, o grupo de pesquisa liderado por Ardem
Patapoutian procurava transcritos estruturalmente relacionados aos canais
TRP que fossem sensíveis ao frio mais intenso. Pelo uso de uma combinação
de métodos de bioinformática e análise de expressão este grupo chegou ao
mesmo transcrito obtido de fibroblastos (Story et al., 2003). Assim, o TRPA1 foi
caracterizado como sendo um termoreceptor expresso em subgrupos de
neurônios sensoriais ativado pelo frio nocivo (Story et al., 2003). As correntes
provocadas pelo decréscimo da temperatura em células CHO (células de
ovário do hamster chinês) ou ovócitos de Xenopus expressando o TRPA1
apresentaram marcada dessensibilização e sensibilidade ao vermelho de
rutênio, um bloqueador não seletivo de canais TRP. Estes resultados indicaram
que o TRPA1 é um canal catiônico não seletivo com características similares a
muitos canais TRP descritos previamente (Story et al., 2003). Porém, a
estimulação pelo frio do TRPA1 aumenta a concentração de cálcio intracelular
com uma temperatura de ativação menor do que aquela requerida para ativar o
canal TRPM8. Análises quantitativas mostraram que células expressando
TRPA1 exibiram uma escala maior de temperaturas de ativação (12-24°C) com
uma temperatura média de 17±3°C. Por outro lado, células expressando
TRPM8 apresentaram um limiar de ativação em temperaturas em torno de 19-
24°C com uma temperatura média de ativação de 22±1°C (Story et al., 2003)
(Figura 3).
12
Figura 3. Temperaturas médias de ativação dos receptores TRPA1, TRPM8 e
TRPV1.
Muitos canais TRP são ativados ou modulados por receptores para
neurotransmissores ou fatores de crescimento (para revisão ver: Clapham,
2003). O TRPA1 parece ser um canal operado por receptor visto que a
aplicação de carbacol em células HEK293 co-expressando os receptores
TRPA1 e muscarínico induziu entrada de corrente e um aumento no influxo de
cálcio, sensíveis ao bloqueio pelo vermelho de rutênio (Jordt et al., 2004). Em
adição, o receptor TRPA1 pode ser ativado pela bradicinina através do receptor
B
2
(Bandell et al., 2004). A interação entre receptores metabotrópicos e canais
iônicos TRP pode ser mediada por substâncias produzidas pela ativação da
fosfolipase C ou fosfolipase A
2
(para revisão ver: Clapham, 2003). De fato,
células CHO expressando o TRPA1 são sensíveis ao diacilglicerol, ácido
araquidônico e aumento de cálcio intracelular (Bandell et al., 2004; Jordt et al.,
2004).
De maneira análoga ao TRPV1, algumas substâncias derivadas de
plantas são também capazes de estimular o receptor TRPA1, tais como os
13
isotiocianatos (compostos presentes no óleo de mostarda, no wasabi, na couve
de bruxelas, na alcaparra e no rabanete), a alicina (presente no alho), o
tetrahidrocanabinol (composto psicoativo da maconha) e o cinamaldeído
(encontrado nas cascas de canela) (Bandell et al., 2004; Jordt et al., 2004,
Macpherson et al., 2005, Calixto et al., 2005) (Figura 4). Além destes, outros
compostos naturais ativam o receptor TRPA1, como o eugenol (presente no
óleo de cravo), gingerol (composto presente no gengibre) e o metil salicilato
(presente no óleo de gualtéria) (Bandell et al., 2004), porém são capazes
também de ativar os receptores TRPM8 e TRPV1.
As mostardas preta e marrom são as sementes maduras e secas de
Brassica nigra ou Brassica juncea (família Cruciferae) (Evans, 1996). A
semente de mostarda produz depois da maceração com água de 0,7 a 1,3% de
óleo volátil. O óleo volátil contém mais de 90% de isotiocianato de alila, seu
principal componente. Por outro lado, o cinamaldeído é o principal constituinte
do óleo essencial obtido da Cinnamomum cassia ou Cinnamomum zeylanicum
(família Lauraceae) conhecida popularmente como canela. O óleo de canela é
um líquido amarelo a marrom com odor característico e aromático e um gosto
doce e pungente, sendo muito usado com fins aromáticos em alimentos,
chicletes e cremes dentais (Evans, 1996).
Para caracterizar ativadores do receptor TRPA1, o óleo de mostarda foi
aplicado em neurônios sensoriais do gânglio do nervo trigêmeo. Uma grande
porcentagem dos neurônios cultivados mostrou um rápido e acentuado
aumento na concentração de cálcio intracelular livre. As respostas provocadas
pelo óleo de mostarda foram eliminadas quando o cálcio foi removido do meio
extracelular, consistente com um mecanismo envolvendo influxo de cálcio
14
O
N CS
através da membrana plasmática (Jordt et al., 2004). Da mesma maneira,
células CHO expressando TRPA1 estimuladas com isotiocianato de alila e
cinamaldeído (Bandell et al., 2004) e células HEK293 expressando TRPA1
humano estimuladas com isotiocianato de alila (Jordt et al., 2004) mostraram
um aumento acentuado no cálcio intracelular livre após a aplicação destes
compostos. Além disso, o isotiocianato de alila produziu uma corrente
acentuada e reversível através da membrana de ovócitos de Xenopus
expressando TRPA1 (Jordt et al., 2004).
Capsaicina Resiniferatoxina
Isotiocianato de alila Cinamaldeído
Figura 4. Estruturas químicas da capsaicina, resiniferatoxina, isotiocianato de
alila e cinamaldeído.
N
H
O
OCH
3
OH
O
OH
OMe
O
OH
H
O
O
O
N
H
O
OCH
3
OH
O
OH
OMe
O
OH
H
O
O
O
15
1.4.1. Localização do receptor TRPA1
Os canais TRPA1 são encontrados em um subgrupo de neurônios do
gânglio da raiz dorsal co-localizados com os canais TRPV1, mas não com os
canais TRPM8 (Story et al., 2003). Neste sentido, foram identificados neurônios
sensoriais sensíveis ao frio nocivo (com uma temperatura de ativação de
14,8±2,8°C) e que também responderam à capsaicina e ao calor (45°C) foram
identificados, indicando a expressão do receptor TRPA1. Esses neurônios
diferiram dos neurônios sensíveis ao frio e ao mentol (temperatura de ativação
de 24±4°C). Além disso, o receptor TRPA1 não é expresso em neurônios
altamente mielinizados, mas está presente em neurônios que contêm o CGRP
e a substância P, sugerindo sua expressão por fibras Aδ e C sensíveis à
estímulação nociva (Story et al., 2003). Além de neurônios do gânglio da raiz
dorsal, o receptor TRPA1 também é expresso em neurônios do gânglio do
nervo trigêmeo e do gânglio nodoso (Nagata et al., 2005). Estudos quantitativos
realizados em camundongos adultos demonstraram que o TRPA1 é expresso
em 56% dos neurônios do gânglio da raiz dorsal, 36% dos neurônios do gânglio
do nervo trigêmeo e 28% dos neurônios do gânglio nodoso. O receptor TRPA1
não é expresso somente nos corpos celulares de neurônios sensoriais, mas
também em terminações periféricas como aquelas que inervam a bexiga
urinária (Nagata et al., 2005). Além dos neurônios sensoriais, o RNAm
codificador da proteína que compõe o TRPA1 é encontrado em neurônios
simpáticos do gânglio cervical superior de camundongos (Smith et al., 2004) e
em células ciliadas que formam a membrana basilar da cóclea (Nagata et al.,
2005). Devido a esta última localização, foi proposto que o receptor TRPA1
poderia estar envolvido na mecanotransdução necessária para respostas
16
auditivas em mamíferos (Corey et al., 2004). No entanto, serão necessários
estudos adicionais para avaliar o papel funcional do receptor TRPA1.
1.5. Elucidação do papel funcional do receptor TRPA1
Como os receptores TRPA1 e TRPV1 são expressos nas mesmas fibras
sensoriais, modelos experimentais in vivo e in vitro aplicados ao estudo do
receptor TRPV1 poderiam ser relevantes para o estudo do receptor TRPA1.
Dentre os modelos in vivo podemos destacar a dor induzida pela aplicação de
capsaicina na pele de humanos (Witting et al., 1998; Petersen e Rowbotham,
1999) e a nocicepção causada pela injeção de capsaicina na pata de roedores
(Sakurada et al., 1992; Gilchrist et al., 1996). A injeção intraplantar de
capsaicina em camundongos ou ratos produz nocicepção espontânea além de
hipersensibilidade dolorosa após estímulos térmicos, químicos ou mecânicos
previamente nocivos (hiperalgesia) ou inócuos (alodínia) (Sakurada et al.,
1992; Gilchrist et al., 1996; Piovezan et al., 1998). A nocicepção espontânea
causada pela capsaicina em camundongos parece depender da ativação direta
do receptor TRPV1 em fibras sensoriais, pois pode ser bloqueado pela
degeneração seletiva de fibras sensíveis à capsaicina, por antagonismo do
receptor TRPV1 e por quelantes de cálcio, mas não por inibidores de várias
vias de sinalização como da fosfolipase C, fosfolipase A
2
, proteína quinase C,
ciclooxigenase ou lipooxigenase (Santos e Calixto, 1997; Ferreira et al., 2004).
Além dos modelos in vivo, vários modelos in vitro são utilizados para o
estudo do receptor TRPV1, incluindo o influxo de cálcio e as correntes
produzidas pela capsaicina em culturas de neurônios do gânglio da raiz dorsal
(Bauer et al., 1993; Passmore, 2005) e do gânglio trigeminal (Liu e Simon,
17
2003; Hou et al, 2002) ou ainda através das respostas contráteis induzida por
agonistas vanilóides em várias preparações de órgãos isolados de ratos,
cobaias, camundongos e hamsters (Patacchini et al, 1990; Maggi et al., 1988;
Maggi et al., 1987). As preparações de bexiga isolada têm sido amplamente
utilizadas no estudo do receptor TRPV1, devido à grande inervação sensorial
que este órgão recebe.
A bexiga é um músculo liso oco revestido por uma membrana mucosa
chamada de urotélio. Sua parede muscular é formada por células musculares
lisas, as quais formam o músculo detrusor (Andersson e Arner, 2004). A bexiga
urinária possui duas funções importantes: armazenamento e esvaziamento de
urina. Todos os componentes do trato urinário inferior precisam ser
coordenados para permitir o armazenamento e eliminação da urina da bexiga.
Esta coordenação é atingida por um controle neural complexo, no qual a
atividade aferente do trato urinário inferior exerce um papel importante. A
maioria dos aferentes envolvidos no processo de micção são fibras Aδ
mielinizadas e fibras C não mielinizadas, que ascendem através do nervo
pélvico conduzindo a informação proveniente da ativação de receptores
presentes na parede da bexiga para a medula espinhal (Andersson, 2002).
Lesões ou doenças do sistema nervoso, assim como medicamentos e
transtornos em órgãos periféricos podem produzir disfunções no esvaziamento
da bexiga, gerando sintomas de urgência, freqüência e eventualmente
incontinência que constituem a síndrome da hiperatividade da bexiga, que
ocorre devido a contrações involuntárias do músculo detrusor da bexiga
durante a fase de estocagem (Abrams et al., 2002). Outra patologia bastante
freqüente é a cistite intersticial, uma doença inflamatória crônica caracterizada
18
pelo aumento da freqüência e da urgência urinária, noctúria e dor suprapúbica
(Bouchelouche e Nordling, 2003).
A instilação intravesical de capsaicina ou de resiniferatoxina tem sido
utilizada tanto no tratamento da hiperatividade como da hipersensensibilidade
da bexiga e no tratamento da cistite intersticial (Szallasi e Blumberg, 1999;
Szallasi e Fowler, 2002; Moldwin e Sant, 2002) devido ao fato de que estes
compostos causam dessensibilização de fibras C que inervam a bexiga. Sabe-
se que os receptores TRPV1 expressos numa subpopulação de aferentes
primários da bexiga de mamíferos estão envolvidos na regulação do reflexo de
esvaziamento normal e patológico (Maggi et al. 1989; Maggi, 1996). Evidências
preliminares indicam que em bexiga de rato, um mecanismo sensível à
capsaicina regula o limiar de micção, possivelmente por enviar informação ao
sistema nervoso central sobre o grau de distensão do músculo detrusor
(Santicioli et al. 1986). Estudos iniciais demonstram que a capsaicina provoca
liberação de taquicininas e/ou de CGRP no tecido da bexiga urinária de rato,
hamster e cobaia (Maggi, 1995; Giuliani et al., 2001). Os efeitos motores
produzidos pela capsaicina no músculo liso da bexiga são, na maior parte,
atribuídos à liberação de taquicininas, uma vez que a resposta contrátil à
capsaicina é prevenida não somente pela dessensibilização provocada pela
própria capsaicina ou pela desnervação extrínseca crônica do órgão, mas
também pela administração de antagonistas de taquicininas (Maggi et al., 1985,
1991; Benkó et al., 2003).
Desta forma, investigamos no presente estudo, o papel fisiológico e
patológico exercido pelo receptor TRPA1 in vitro através da contração induzida
pelos agonistas do receptor TRPA1, o isotiocianato de alila e o cinamaldeído,
19
na bexiga isolada de rato. Além disso, a participação do receptor TRPA1 in vivo
foi avaliada através da nocicepção induzida pela injeção intraplantar dos
agonistas do receptor TRPA1 em camundongos. Tendo em vista que os
receptores TRPV1 e TRPA1 encontram-se localizados nas mesmas fibras
sensoriais, as respostas obtidas foram comparadas às produzidas pelo
agonista do receptor TRPV1, a capsaicina.
20
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito e o possível mecanismo de
ação decorrente da ativação do receptor TRPA1 em roedores, através de
técnicas bioquímicas e farmacológicas in vitro e in vivo.
2.2. Objetivos específicos
- Verificar se os agonistas do receptor TRPA1, o isotiocianato de alila e o
cinamaldeído, causam contração na bexiga urinária isolada de rato e
nocicepção em camundongos;
- Caracterizar alguns dos mecanismos envolvidos nas respostas contráteis e
nociceptivas induzidas pela ativação do receptor TRPA1;
- Investigar o papel do receptor TRPA1 em condições patológicas da bexiga,
como na cistite induzida pela ciclofosfamida;
- Comparar as respostas contráteis e nociceptivas causadas pelo isotiocianato
de alila e pelo cinamaldeído com aquelas produzidas pelo agonista do
receptor TRPV1, a capsaicina;
- Avaliar a possível liberação de prostaglandina E
2
induzida pelo isotiocianato
de alila in vitro e de substância P in vitro e in vivo.
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS
Os experimentos foram realizados em ratos Wistar machos (350-400 g)
e em camundongos Swiss machos (30-40 g), criados pelo Biotério Central da
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Os animais foram mantidos
em temperatura controlada (22±2ºC) e ciclo claro/escuro de 12 horas, com
água e ração fornecidas ad libitum. Para os experimentos in vivo, os
camundongos foram ambientalizados no laboratório pelo menos 2 horas antes
do experimento. Para os experimentos in vitro, realizados em ratos, não foi
necessária a ambientalização prévia. Os experimentos foram conduzidos de
acordo com as normas de manuseio de animais de laboratório e considerações
éticas para o estudo da dor (Zimmermann, 1983). Os protocolos experimentais
utilizados neste estudo foram aprovados pela Comissão de Ética no uso de
animais (262/CEUA) da Universidade Federal de Santa Catarina (processo nº
23080.035334/2003-16/UFSC).
22
3.2. EXPERIMENTOS IN VITRO
3.2.1 Bexiga isolada de rato
Os ratos Wistar machos foram sacrificados por overdose de barbitúrico
(pentobarbital de sódio, 100 mg/kg, i.p.). Após a laparotomia, a bexiga urinária
foi rapidamente removida e transferida para uma placa de petri contendo
solução nutritiva de Krebs-Henseleit (composição mmol/l: NaCl 119,0; KCl 4,7;
MgSO
4
1,5; CaCl
2
2,5; NaHCO
3
25,0; KHPO
4
1,2 e glicose 11,0; pH 7,4). A
bexiga urinária foi seccionada em quatro partes de aproximadamente 10 mm
de comprimento e 3 mm de largura e foi limpa do tecido conectivo e gorduras
aderentes. Em seguida cada preparação foi transferida para uma cuba de vidro
contendo 5 ml de solução de Krebs-Henseleit, aquecida a 37ºC e aerada com
uma mistura de 95% de O
2
e 5% de CO
2
, onde foi suspensa através de dois
fios de algodão, um em cada extremidade do tecido, sendo que um dos fios foi
conectado a um transdutor de força (TRI-201-Letica Scientific Instruments,
Espanha). A preparação foi submetida a uma tensão basal de 1 g e as
mudanças de tensão isotônica foram registradas em polígrafo (TRI-201-Letica
Scientific Instruments, Espanha).
23
3.2.2. Curvas concentração-resposta cumulativa e não-cumulativa para as
respostas contráteis induzidas pelos agonistas de receptores TRPV1 e
TRPA1
Após o período de estabilização de 1 hora, durante a qual a solução
nutriente foi renovada a cada 15 minutos, todas as preparações foram expostas
a uma única concentração sub-máxima de carbacol (0,1 µM), sendo que esta
concentração resultou em contração média de 1,15 g de tensão, a qual foi
considerada 100% de contração. Em seguida, a solução de Krebs foi renovada
seguida por um período de equilíbrio de 15 minutos. Decorrido este período, as
preparações foram expostas a concentrações crescentes e cumulativas de
capsaicina (0,001-0,3 µM), isotiocianato de alila (0,001-3000 μM) ou
cinamaldeído (0,001-3000 μM). Cada concentração da droga foi adicionada ao
banho, quando o platô do efeito decorrente da concentração anterior
administrada estivesse estabelecido. Em outra etapa de experimentos, após
observação de uma possível dessensibilização, foram realizadas curvas
concentração-resposta através do método não-cumulativo, sendo que cada
concentração da droga foi adicionada ao banho somente após a substituição
da solução nutriente e intervalo de 30 minutos entre as exposições. A droga
permaneceu em contato com a preparação tempo suficiente para obter um
platô decorrente da concentração aplicada.
24
3.2.3. Dessensibilização das respostas contráteis induzidas pelos
agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1
Para confirmar o fenômeno de dessensibilização das respostas
contráteis, após o período de equilíbrio, as preparações foram submetidas
repetidamente a uma única concentração máxima de capsaicina (0,3 µM),
isotiocianato de alila (1 mM) ou cinamaldeído (3 mM), a intervalos de 30
minutos. Também foi avaliada a possibilidade de dessensibilização cruzada
entre os agonistas dos receptores TRPV1 e TRPA1 e entre os agonistas do
receptor TRPA1, nas mesmas concentrações e tempo anteriormente utilizados.
3.2.4. Análise dos mecanismos envolvidos na resposta contrátil induzida
pela ativação do receptor TRPA1
Com o objetivo de identificar alguns dos mecanismos envolvidos na
contração da bexiga isolada de rato devido a ativação do receptor TRPA1, a
resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila (100 µM) ou pelo
cinamaldeído (300 µM) foi obtida na ausência ou na presença de vermelho de
rutênio (antagonista não seletivo de receptores TRP, 10-100 µM para o
isotiocianato de alila e 100 µM para o cinamaldeído, sendo apenas uma
concentração do vermelho de rutênio testada por preparação), SB 366791
(antagonista seletivo do receptor TRPV1, 10 µM), FK 888 (1 µM) , SR 48968 (1
µM) e SR 142801 (0,1 µM) (antagonistas seletivos dos receptores NK
1
, NK
2
e
NK
3
para as taquicininas, respectivamente), tetrodotoxina (bloqueador de canal
de sódio, 1 µM), e indometacina (inibidor não seletivo de ciclooxigenases, 1
25
µM). O antagonista de receptor muscarínico atropina (1 µM) e o antagonista de
receptores purinérgicos suramina (300 µM) foram testados somente na
contração induzida pelo isotiocianato de alila.
Com o objetivo de estudar a contribuição do cálcio exógeno na resposta
contrátil induzida pelos agonistas do receptor TRPA1 na bexiga isolada de rato,
após a obtenção de uma resposta contrátil controle ao isotiocianato de alila e
ao cinamaldeído, em solução de Krebs normal, as preparações foram
transferidas para solução de Krebs sem cálcio e contendo o quelante de cálcio,
ácido etilenoglicol-bis-(β-amino-etil eter) N, N’ tetra acético (EGTA, 1 mM), na
qual elas permaneceram por 20 minutos. Durante este período, a solução
nutritiva sem cálcio foi renovada a cada 5 minutos, sendo então realizada uma
nova contração ao isotiocianato de alila, em meio sem cálcio. Após a realização
dessa contração, as preparações foram novamente transferidas para a solução
de Krebs normal por 30 minutos, e novas contrações ao isotiocianato de alila e
ao cinamaldeído foram obtidas.
Em alguns experimentos foi avaliada a participação do receptor TRPV1
na contração induzida pela prostaglandina E
2
ou pela substância P. Para tal, a
bexiga urinária de rato foi contraída com prostaglandina E
2
(3 µM) ou com
substância P (0,01 µM) na presença ou não do antagonista do receptor TRPV1
SB 366791 (10 µM). Quando foi realizada contração da bexiga urinária com a
substância P, inibidores de peptidases (captopril 3 µM e fosforamidon 1 µM)
foram adicionados ao banho por 20 minutos para evitar a degradação da
substância P exógena. As concentrações dos agonistas utilizadas foram
obtidas a partir de dados da literatura (Palea et al., 1998; Dias et al., 1995).
26
3.2.5. Ensaio de união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina em
membrana de medula espinhal de rato
A união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina foi realizada como
descrito previamente (André et al., 2006; Otuki et al., 2005). Para a obtenção
das membranas, medulas espinhais de ratos foram removidas e
homogeneizadas em tampão de homogeneização gelado (pH 7,4) contendo: 5
mM de KCl ; 5,8 mM de NaCl; 2 mM de MgCl
2
; 0,75 mM de CaCl
2
; 137 mM
de sacarose e 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfônico
(HEPES). O homogenato foi primeiramente centrifugado por 10 minutos a
1.000 x g a 4ºC. O precipitado resultante foi descartado e o sobrenadante
centrifugado a 35.000 x g por 30 min a 4ºC. O precipitado resultante da
centrifugação foi ressuspendido em tampão de homogeneização e estocado a -
70ºC, até o dia do experimento.
O experimento foi realizado em duplicata, com volume final de 500 µl,
contendo tampão de homogeneização, com 0,25 mg/ml de albumina sérica
bovina, membrana (100 µg proteína/ml) e 50 pM de [
3
H]-resiniferatoxina na
presença ou ausência de capsaicina (10 µM), isotiocianato de alila (10-1000
µM), cinamaldeído (10-1000 µM) ou seus veículos (etanol 0,01% e tween 80
0,01%). Para a medida da união inespecífica, 100 nM de resiniferatoxina não-
radioativa foi incubado em alguns tubos. A reação da união específica foi
iniciada com a transferência dos tubos para um banho com água a 37ºC, por
60 minutos. Decorrido este período, a reação foi finalizada pela transferência
dos tubos para um recipiente contendo gelo. Cem microgramas de
glicoproteína ácida bovina α
1
foram adicionados em cada tubo para reduzir a
27
união inespecífica. Finalmente, o radioligante ligado e livre foram separados
por centrifugação a 20.000 x g por 15 minutos a 4ºC. A radioatividade foi
medida no precipitado obtido, por contagem em cintilador. A união específica
foi calculada como a diferença da união específica total e inespecífica. A
porcentagem da ligação específica nessas condições foi de aproximadamente
70%. Os experimentos foram realizados em duplicata e repetidos 3 vezes.
3.2.6. Liberação de prostaglandina E
2
e substância P em resposta à
exposição da bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila
A liberação basal e a alteração dos níveis de prostaglandina E
2
e
substância P após a adição de isotiocianato de alila (100 µM) foi quantificada
através de imunoensaio enzimático (ELISA) de acordo com as instruções do
fabricante (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, EUA). Foi utilizado o
mesmo protocolo descrito anteriormente para os estudos funcionais de
contração e as amostras de solução nutritiva de Krebs foram coletadas
diretamente das cubas de órgão isolado, com o auxílio de micro-pipeta (500 µl).
As amostras foram obtidas de preparações basais ou após serem estimuladas
com isotiocianato de alila (100 µM) por 1 minuto para a dosagem de
prostaglandina E
2
e 3 minutos para a dosagem de substância P e congeladas
rapidamente em nitrogênio líquido e estocadas a -70ºC até o dia dos
experimentos (no máximo 1 semana).
Para a realização da dosagem de substância P, inibidores de peptidases
(captopril 3 µM e fosforamidon 1 µM) foram adicionados ao banho por 20
minutos para evitar a degradação da substância P e as amostras congeladas
28
foram liofilizadas e novamente estocadas até o dia dos experimentos. As
amostras foram reconstituídas em tampão do ensaio, sendo as amostras
basais concentradas 5 vezes e as amostras estimuladas com o isotiocianato de
alila concentradas 10 vezes, para otimizar a detecção pelo método utilizado.
Os resultados das dosagens foram expressos em pg por ml, sendo os
resultados da dosagem de substância P devidamente ajustados pelo fator de
concentração.
3.2.7. Cistite química induzida por ciclofosfamida
A indução de cistite química pela ciclofosfamida foi realizada em ratos
adultos machos. A ciclofosfamida foi administrada 24 h antes do experimento
(150 mg/kg, intraperitonial) para indução da cistite na forma aguda (Chopra et
al., 2005). O grupo controle recebeu um volume correspondente de solução
fisiológica (0,9%). Os animais foram sacrificados e a bexiga urinária foi
rapidamente removida e submetida ao mesmo protocolo experimental descrito
previamente para avaliar as respostas contráteis à capsaicina (0,03 µM),
isotiocianato de alila (100 µM) ou ao cinamaldeído (300 µM).
3.3. EXPERIMENTOS IN VIVO
3.3.1. Curvas dose-resposta para a nocicepção induzida pelos agonistas
de receptores TRPV1 e TRPA1
Após a adaptação dos animais ao aparato experimental, o qual consiste
de um funil de vidro invertido, os camundongos receberam 20 µl na superfície
29
plantar de capsaicina (0,01-100 nmol/pata), isotiocianato de alila (0,1-100
nmol/pata) ou cinamaldeído (1-100 nmol/pata) e foram colocados
imediatamente após a injeção novamente nos funis. Grupos separados de
animais receberam uma injeção intraplantar de veículo apropriado (PBS
acrescido de etanol não excedendo 0,095% e tween 80 não excedendo
0,005%). O tempo (em segundos) que cada animal despendeu lambendo,
agitando ou erguendo a pata injetada foi registrado por um período de 5
minutos e considerado como índice de nocicepção.
3.3.2. Decurso temporal para a nocicepção induzida pelo isotiocianato de
alila
Após o período de adapatação, os animais receberam 20 µl na
superfície plantar de isotiocianato de alila e foram colocados imediatamente
após a injeção em funis de vidro invertidos. Grupos separados de animais
receberam uma injeção intraplantar de veículo apropriado (PBS acrescido de
0,0005% de etanol e 0,0005% de tween). O tempo que cada animal despendeu
lambendo, agitando e erguendo a pata tratada foi registrado (em segundos), a
cada minuto por um período de 5 minutos.
3.3.3. Estudo dos mecanismos periféricos envolvidos na nocicepção
induzida pela ativação do receptor TRPA1
Para avaliar o envolvimento do receptor TRPV1 nas respostas induzidas
pela capsaicina ou isotiocianato de alila, os animais receberam na pata direita
30
vermelho de rutênio (inibidor não seletivo TRPV1: 1 ou 10 nmol/pata,
respectivamente), capsazepina (antagonista não seletivo TRPV1: 0,03-1 ou 1-
10 nmol/pata, respectivamente) ou SB 366791 (antagonista seletivo TRPV1: 1
nmol/pata), co-administrado com capsaicina ou com isotiocianato de alila.
3.3.3.1. Participação das fibras aferentes sensíveis à capsaicina na
resposta nociceptiva induzida pelos agonistas do receptor TRPA1
Para explorar o papel de fibras sensíveis à capsaicina sobre a resposta
nociceptiva induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído,
camundongos machos neonatos (com 48 horas de vida) receberam injeção
subcutânea de capsaicina (50 mg/kg) ou veículo (10% etanol e 10% tween em
salina tamponada com fosfato-PBS), conforme descrito previamente por
Gamse (1982). O tratamento foi realizado com o propósito de induzir
degeneração irreversível das fibras aferentes primárias sensíveis à capsaicina
(Holzer, 1991). Os animais foram utilizados seis a sete semanas após o
tratamento neonatal.
Com o objetivo de comprovar se realmente ocorreu a degeneração
destas fibras sensoriais, os animais foram submetidos ao teste de limpeza dos
olhos como descrito por Ikeda e colaboradores (2001). Resumidamente, 20 μl
de uma solução de capsaicina 0,01% (p/v) foi instilado dentro de um dos olhos,
e o número de movimentos de limpeza que ocorreram no período subseqüente
de 1 minuto foi contado. Os animais que limparam seus olhos no máximo 5
vezes foram considerados dessensibilizados.
31
3.3.3.2. Participação das fibras simpáticas na resposta nociceptiva
induzida pelo isotiocianato de alila
Para analisar a participação das fibras simpáticas na nocicepção
induzida pelo isotiocianato de alila, realizou-se uma simpatectomia através do
tratamento dos camundongos com guanetidina (30 mg/kg, i.p.) 3 dias antes da
administração intraplantar com o isotiocianato de alila, como descrito
previamente (Malmberg e Basbaum, 1998; Ferreira et al., 2005 ).
3.3.3.3. Participação dos mastócitos na resposta nociceptiva induzida
pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1
Para avaliar a participação de mastócitos na indução dos efeitos
nociceptivos causados pela isotiocianato de alila ou pela capsaicina, foi
injetado na pata direita de cada animal o composto 48/80, um degranulador de
mastócitos (Mousli et al., 1990) ou PBS durante 4 dias consecutivos. As doses
do composto 48/80 utilizadas foram 1, 3, 10 e 10 µg/pata no primeiro, segundo,
terceiro e quarto dia, respectivamente (Frighetto, 2004). No quinto dia, a
mesma pata recebeu uma injeção de capsaicina (0,1 nmol/pata) ou
isotiocianato de alila (1 nmol/pata) e então foi avaliada a resposta nociceptiva.
Em outro grupo de animais, avaliou-se o efeito nociceptivo do composto 48/80
(10 µg/pata), o qual serviu como controle funcional do método.
Além disso, para confirmar a participação da histamina nas respostas
nociceptivas da capsaicina e do isotiocianato de alila, o antagonista do receptor
H
1
para a histamina pirilamina (400 µg/pata) foi co-administrado com capsaicina
ou isotiocianato de alila.
32
3.3.3.4. Participação da substância P e do receptor NK
1
para as
taquicininas na resposta nociceptiva produzida pelos agonistas de
receptores TRPV1 e TRPA1
Para avaliar a participação do receptor NK
1
, na resposta nociceptiva
induzida pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1, o antagonista seletivo
do receptor NK
1
FK 888 (1 nmol/pata) foi co-administrado com capsaicina ou
isotiocianato de alila.
Também foi realizada a medida dos níveis de substância P após o
estímulo com capsaicina ou isotiocianato de alila. Um minuto após a
administração intraplantar de capsaicina, isotiocianato de alila ou veículo, os
camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e as patas
injetadas foram perfundidas de acordo com o método descrito por Rocha e
Silva e Antonio (1960), com pequenas modificações. Um tubo de polietileno
duplo foi inserido no espaço subcutâneo da pata e 150 µl de PBS (adicionado
dos inibidores de peptidases captopril 3 µM e fosforamidon 1 µM, para evitar a
degradação da substância P) foram perfundidos pelo tubo mais delgado a uma
taxa de 100 µl/min. O lavado foi coletado através do tubo mais grosso e
utilizado para a quantificação dos níveis de substância P através de
imunoensaio enzimático específico (ELISA) de acordo com as instruções do
fabricante (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, EUA).
33
3.4. DROGAS
As seguintes drogas foram usadas: capsaicina, isotiocianato de alila,
cinamaldeído, composto 48/80, guanetidina, pirilamina, vermelho de rutênio,
resiniferatoxina, tetrodotoxina, carbacol, atropina, EGTA, α
1
glicoproteína ácida
bovina, substância P, captopril, fosforamidon (todas obtidas da Sigma, St.
Louis, EUA), capsazepina e SB 366791 (Tocris Cookson Inc., EUA), suramina
sódica (Germanin
®
, Bayer, Leverkusen, Alemanha). A [
3
H]-resiniferatoxina (37
Ci/mmol) foi adquirida da Perkin Elmer Life Sciences (Washington, EUA),
ciclofosfamida (Genuxal
®
, Baxter Oncology, EUA), prostaglandina E
2
(Cayman
Chemical Company, Ann Arbor, EUA). O antagonista do receptor NK
2
SR
48968 e o antagonista do receptor NK
3
SR 142801 foram gentilmente
fornecidos pela Sanofi Recherche (Montpellier, França). O antagonista do
receptor NK
1
FK 888 foi gentilmente fornecido pela Fujisawa Pharmaceutical
(Osaka, Japão).
As soluções estoque de FK 888, SR 48968, SR 142801, SB 366791,
PGE
2
, capsaicina, tetrodotoxina foram preparadas em etanol absoluto,
armazenados em tubos plásticos siliconizados e mantidos a -20ºC. Soluções
de isotiocianato de alila e cinamaldeído foram feitas em etanol e tween 80 e
foram preparadas no dia do experimento. As demais drogas foram dissolvidas
em água destilada (experimentos in vitro) ou PBS (experimentos in vivo). Nos
experimentos in vitro as concentrações finais de etanol e tween não excederam
0,1% e 0,06%, respectivamente. Em todos os experimentos pelo menos um
experimento controle foi realizado na presença do veículo usado para diluir as
drogas. Os veículos utilizados não apresentaram qualquer efeito sobre o tônus
34
das preparações, sobre as contrações ou ainda sobre a resposta nociceptiva
induzida pelos agonistas.
35
3.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados estão apresentados como a média ± erro padrão (E.P.M)
da média, exceto para os valores de CE
50
/DE
50
ou CI
50
/DI
50
(concentração ou
dose de agonista necessária para produzir 50% da resposta contrátil ou
nociceptiva, relativa ao efeito máximo, ou a concentração ou a dose de
antagonista necessária para reduzir a resposta em 50% relativa ao valor
controle, respectivamente), que são expressos como médias geométricas
acompanhadas por seus respectivos limites de confiança (95%). As
porcentagens de inibição são expressas como a média ± E.P.M das inibições
obtidas em cada experimento individual no máximo da resposta contrátil ou
nociceptiva. Para os experimentos in vivo, a análise estatística dos resultados
obtidos foi realizada através do teste t de Student não pareado ou análise da
variância (ANOVA) seguida pelo teste de Dunnett ou Student–Newmann–Keuls
quando apropriados. Para os experimentos in vitro a análise estatística dos
resultados obtidos foi realizada por teste t de Student pareado e não pareado
ou análise da variância (ANOVA) seguida pelo teste de Dunnett. Os valores de
P menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados estatisticamente
significantes. Os valores de CE
50
/DE
50
e CI
50
/DI
50
foram determinados por
análise de regressão linear de experimentos individuais usando o programa
GraphPad 4.0 (GraphPad, EUA).
36
4. RESULTADOS
4.1. EXPERIMENTOS IN VITRO
4.1.1. Análise das respostas contráteis induzidas pelos agonistas de
receptores TRPV1 e TRPA1 na bexiga isolada de rato
Na fase inicial dos experimentos, após o período de equilíbrio, as
preparações foram expostas a uma concentração de 0,1 µM de carbacol. A
seguir, foram lavadas com solução de Krebs e, após o retorno à linha de base,
foram realizadas curvas concentração-resposta, por meio do método
cumulativo, para o agonista do receptor TRPV1 capsaicina (0,001-0,3 µM) e
para os agonistas do receptor TRPA1 isotiocianato de alila (0,001-3000 µM) e
cinamaldeído (0,001-3000 µM) (Figura 5A). A adição de concentrações
cumulativas e crescentes dos agonistas causou contração tônica gradativa que
foi dependente da concentração. Os efeitos máximos (E
max
) (em comparação à
resposta ao carbacol) e as CE
50
produzidas pela capsaicina, isotiocianato de
alila e cinamaldeído foram de 132,6 ± 17,4%; 130,5 ± 25,4% e 69,5 ± 8,4%, e
0,01 (0,007-0,06); 41,1 (7,6-221,3) e 372,4 (46,2-2999,1) µM, respectivamente.
Além disso, foram construídas curvas concentração-resposta por meio
do método não cumulativo (Figura 5B). Utilizando este método foi observado
um aumento na eficácia, mas não na potência dos agonistas. Os valores de
CE
50
foram de 0,04 (0,02-0,07); 63,1 (46,5-89,3) e 220 (162,2-299,2) µM e os
efeitos máximos foram de 206,6 ± 30,6%; 374,1 ± 51% e 231,4 ± 24,1% para
capsaicina, isotiocianato de alila e cinamaldeído, respectivamente.
37
Figura 5. Curvas concentração-resposta obtidas pelo método cumulativo (A) e não-cumulativo
(B) para os efeitos contráteis induzidos pela capsaicina (0,001-0,3 µM), isotiocianato de alila
(0,001-3000 µM) ou cinamaldeído (0,001-3000 µM) em bexiga isolada de rato. Os resultados
são expressos como porcentagem da contração induzida por 0,1 μM de carbacol. Cada ponto
representa a média ± E.P.M. de 4-6 experimentos.
4.1.2. Dessensibilização das respostas contráteis induzidas pelos
agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1 na bexiga isolada de rato
Para confirmar o possível fenômeno de dessensibilização, as
preparações foram submetidas a aplicações repetidas de concentrações
máximas de capsaicina (0,3 µM), isotiocianato de alila (1 mM) ou cinamaldeído
(3 mM), a intervalos de 30 minutos entre cada aplicação. A dessensibilização
completa da resposta contrátil ao isotiocianato de alila ou ao cinamaldeído foi
observada já na segunda exposição aos agonistas do receptor TRPA1 (Figura
6B e C), enquanto que a dessensibilização completa da resposta contrátil
induzida pela capsaicina foi observada somente na quarta aplicação deste
38
agonista do receptor TRPV1 (Figura 6A). Já a exposição sucessiva ao carbacol
(0,1 µM) não causou dessensibilização da resposta contrátil (Figura 6D).
Figura 6. Dessensibilização do efeito contrátil induzido pela capsaicina (0,3 µM, A),
isotiocianato de alila (1 mM, B) ou cinamaldeído (3 mM, C), mas não do efeito contrátil induzido
pelo carbacol (0,1 µM, D) em bexiga isolada de rato. Os resultados são expressos como
porcentagem da contração induzida por 0,1 μM de carbacol. Cada coluna representa a média
de 4-6 experimentos e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os asteriscos denotam os níveis de
significância. **P<0,01, comparado com a primeira contração (ANOVA de uma via seguida pelo
teste de Dunnett para A e teste t de Student não pareado para B e C).
Para avaliar uma possível dessensibilização cruzada entre os agonistas
testados, as preparações foram submetidas a três aplicações de capsaicina e
na quarta aplicação receberam isotiocianato de alila ou cinamaldeído. A
contração induzida pelo isotiocianato de alila foi significantemente atenuada
39
(31,1 ± 7,3%) e a contração induzida pelo cinamaldeído foi totalmente abolida
(100%) em bexigas urinárias dessensibilizadas à capsaicina, quando
comparados com preparações que não foram previamente dessensibilizadas
(Figura 7A e B). Nas preparações submetidas à aplicação de isotiocianato de
alila ou cinamaldeído e posteriormente expostas à capsaicina, foram
observadas reduções das contrações à capsaicina de 100% e 50 ± 8,5%,
respectivamente (Figura 7C e D).
40
Figura 7. Efeito contrátil induzido pelo isotiocianato de alila (ITCA, 1 mM) (A) ou pelo
cinamaldeído (CIN, 3 mM) (B) em preparações dessensibilizadas com capsaicina (CAP, 0,3
µM) e efeito contrátil induzido pela capsaicina (0,3 µM) em preparações dessensibilizadas com
isotiocianato de alila (1 mM) (C) ou cinamaldeído (3 mM) (D) em bexiga isolada de rato. Os
resultados são expressos como porcentagem da contração induzida por 0,1 μM de carbacol.
Cada coluna representa a média de 4-6 experimentos e as linhas verticais indicam o E.P.M. Os
asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05, **P<0,01, comparado com a contração
induzida pela capsaicina, isotiocianato de alila ou cinamaldeído, sem dessensibilização prévia
(teste t de Student não pareado).
Também foi analisada a possível dessensibilização cruzada entre os
agonistas TRPA1. Desta forma, a exposição prévia ao isotiocianato de alila
aboliu a resposta contrátil ao cinamaldeído. Da maneira semelhante, quando as
preparações foram expostas ao cinamaldeído e em seguida submetidas à
aplicação de isotiocianato de alila, houve redução da resposta contrátil do
isotiocianato de alila em 68,1 ± 8,8% (Figura 8A e B).
41
Figura 8. Efeito contrátil induzido pelo isotiocianato de alila (1 mM) em preparações
dessensibilizadas com cinamaldeído (CIN, 3 mM) (A) e efeito contrátil induzido pelo
cinamaldeído (3 mM) em preparações dessensibilizadas com isotiocianato de alila (ITCA, 1mM)
(B) em bexiga isolada de rato. Os resultados são expressos como porcentagem da contração
induzida por 0,1 μM de carbacol. Cada coluna representa a média de 4-6 experimentos e as
linhas verticais representam o E.P.M. Os asteriscos denotam os níveis de significância.
**P<0,01, comparado com a contração induzida pelo isotiocianato de alila e cinamaldeído, sem
dessensibilização prévia (teste t de Student não pareado).
Como foi observado que todos os agonistas produziram
dessensibilização, nos experimentos seguintes foi utilizada uma única
concentração sub-máxima de capsaicina (0,03 µM), isotiocianato de alila (100
µM) ou de cinamaldeído (300 µM).
4.1.3. Efeito do antagonista não seletivo de receptores TRP vermelho de
rutênio, sobre as respostas contráteis induzidas pelos agonistas de
receptores TRPV1 e TRPA1 na bexiga isolada de rato
A Figura 9 demonstra que as contrações induzidas pela capsaicina (0,03
µM) ou pelo isotiocianato de alila (100 µM) na bexiga urinária isolada de rato
42
foram inibidas, de maneira dependente da concentração, pelo vermelho de
rutênio (1-100 µM). As CI
50
obtidas foram 2,2 (1,8-2,8) e 22,1 (17,8-27,5) µM
para capsaicina e para o isotiocianato de alila, respectivamente. Além disso, o
vermelho de rutênio (100 µM) reduziu amplamente a contração induzida pelo
cinamaldeído (300 µM) (inibição de 85,7 ± 14,3%).
Figura 9. Curva concentração-resposta para o antagonista vermelho de rutênio (1-100 µM), na
contração induzida pela capsaicina (0,03 µM) ou pelo isotiocianato de alila (100 µM) (A) e
influência do vermelho de rutênio (100 µM) na resposta contrátil induzida pelo cinamaldeído
(300 µM) (B) na bexiga isolada de rato. Os resultados são expressos como porcentagem da
contração induzida pelo carbacol (0,1 µM). Cada ponto representa as médias e as linhas
verticais os E.P.M. de 4-6 experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. *P
<0,05, **P<0,01, comparado com os valores controle (ANOVA de uma via seguida pelo teste
de Dunnett para a capsaicina e isotiocianato de alila e teste t de Student não pareado para o
cinamaldeído).
43
4.1.4. Participação do cálcio externo nas respostas contráteis induzidas
pela ativação do receptor TRPA1 na bexiga urinária isolado de rato
Para avaliar a contribuição do cálcio externo nas respostas contráteis
induzidas pelo isotiocianato de alila (100 µM) e cinamaldeído (300 µM), alguns
experimentos foram realizados em meio contendo solução de Krebs sem cálcio
e com adição de EGTA (1 mM, agente quelante do cálcio). De modo
semelhante ao descrito para a capsaicina (Maggi et al., 1989), a resposta
contrátil induzida pelo isotiocianato de alila e cinamaldeído foram totalmente
abolidas (Figura 10A e B). Quando as preparações foram transferidas para
uma solução de Krebs normal (contendo 2,5 mM de cálcio), a contração
causada pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído foi recuperada.
Figura 10. Influência da presença ou ausência de cálcio externo sobre a resposta contrátil
induzida pelo isotiocianato de alila (100 µM, A) ou pelo cinamaldeído (300 µM, B) na bexiga
isolada de rato. Os resultados são expressos como porcentagem da contração induzida pelo
carbacol (0,1 µM). Cada coluna representa as médias e as linhas verticais os E.P.M. de 4-6
experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. **P<0,01, comparado com os
valores controle (teste t de Student não pareado).
44
4.1.5. Participação de canais de sódio, de receptores colinérgicos e
purinérgicos nas respostas contráteis induzidas pela ativação do receptor
TRPA1 na bexiga isolado de rato
Os resultados da Figura 11 (A e B) demonstram que a incubação das
preparações com tetrodotoxina (bloqueador de canal de sódio, 1 μM), foi capaz
de reduzir de maneira significativa as contrações induzidas pelo isotiocianato
de alila (100 µM) ou pelo cinamaldeído (300 µM) (27,9 ± 6,9% e 38,1 ± 8,8%,
respectivamente). Estes resultados diferem daqueles obtidos com a capsaicina
que não tem sua resposta contrátil reduzida pela tetrodotoxina (Patacchini et
al., 1990).
Figura 11. Influência do bloqueador de canal de sódio tetradotoxina (0,1 µM) sobre a resposta
contrátil induzida pelo isotiocianato de alila (100 µM, A) ou pelo cinamaldeído (300 µM, B) na
bexiga isolada de rato. Os resultados são expressos como porcentagem da contração induzida
pelo carbacol (0,1 µM). Cada coluna representa as médias e as linhas verticais os E.P.M. de 4-
6 experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05, comparado com os
valores controle (teste t de Student não pareado).
45
Por outro lado, a atropina (antagonista muscarínico, 1 µM) e a suramina
(antagonista purinérgico, 300 µM) não foram capazes de alterar a resposta
contrátil induzida pelo isotiocianato de alila na bexiga urinária isolada de rato
(Figura 12A e B). Desta forma, estes antagonistas não foram testados na
resposta contrátil do cinamaldeído.
Figura 12. Influência do antagonista de receptores colinérgicos atropina (1 µM, A) e do
antagonista de receptores purinérgicos suramina (300 µM, B) sobre a resposta contrátil
induzida pelo isotiocianato de alila na bexiga isolada de rato. Os resultados são expressos
como porcentagem da contração induzida pelo carbacol (0,1 µM). Cada coluna representa as
médias e as linhas verticais os E.P.M. de 4-6 experimentos.
4.1.6. Influência das taquicininas sobre as respostas contráteis induzidas
pelos agonistas do receptor TRPA1 na bexiga isolado de rato
A seguir, investigou-se a possível participação das taquicininas,
incluindo a substância P, a neurocinina A e a neurocinina B, nas respostas
contráteis induzidas pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído na bexiga
isolada de rato. Os resultados da Figura 13A demonstram que o FK 888
46
(antagonista do receptor NK
1
, 1 μM), o SR 48968 (antagonista do receptor NK
2
,
1 μM) e o SR 142801 (antagonista do receptor NK
3
, 0,1 μM), foram capazes de
inibir de forma significativa a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de
alila na bexiga isolada de rato (inibições de 29,4 ± 5,8; 35,9 ± 7,5 e 35,2 ± 8,3
%, respectivamente). Porém, somente o FK 888 (antagonista do receptor NK
1
,
1 µM) e o SR 48968 (antagonista do receptor NK
2
, 1 µM) foram capazes de
alterar a resposta contrátil induzida pelo cinamaldeído (inibições de 36,2 ±
7,1% e 36,8 ± 6,7%) (Figura 13B).
Figura 13. Influência dos antagonistas seletivos dos receptores NK
1
(FK 888, 1 μM), NK
2
(SR
48968, 1 μM) e NK
3
(SR 142801, 0,1 μM) sobre a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato
de alila (100 μM) (A) ou pelo cinamaldeído (300 μM) (B) na bexiga isolada de rato. Os
resultados são expressos como porcentagem da contração induzida pelo carbacol (0,1 µM).
Cada coluna representa as médias e as linhas verticais os E.P.M. de 4-6 experimentos. Os
asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05, **P<0.01, comparado com os valores
controle (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett).
4.1.7. Dosagem dos níveis de substância P em resposta à exposição da
bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila
Como os resultados anteriores demonstraram a participação de
taquicininas na contração induzida pelo isotiocianato de alila, avaliamos a
47
seguir os níveis da substância P na solução nutritiva de Krebs. Em condições
basais, foram detectados níveis discretos de substância P na solução nutritiva
que banhava a bexiga urinária. Por outro lado, quando as preparações foram
estimuladas com isotiocianato de alila (100 µM) por 3 minutos, houve aumento
significativo na liberação de substância P na solução de Krebs (Figura 14).
Figura 14. Liberação de substância P induzida pelo isotiocianato de alila (100 µM) em bexiga
isolada de rato. As concentrações de substância P foram quantificadas por ELISA como
descrito em material e métodos. Cada coluna representa a média e as linhas verticais o E.P.M.
para 6 experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05, comparado
com os valores controle (test t de Student pareado).
4.1.8. Participação das ciclooxigenases nas respostas contráteis
induzidas pelos agonistas do receptor TRPA1 na bexiga isolada de rato
Para avaliar a participação das ciclooxigenases nas respostas contráteis
induzidas pelo isotiocianato de alila e pelo cinamaldeído na bexiga urinária
isolada de rato, as preparações foram incubadas previamente com
indometacina (inibidor não seletivo de ciclooxigenases, 1 µM). De modo
semelhante ao descrito para a capsaicina (Pinna et al., 1994), este inibidor foi
48
capaz de reduzir de forma significativa as contrações induzidas pelo
isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído com inibições de 31,6 ± 6,5% e 48,9
± 9,0%, respectivamente (Figura 15A e B).
Figura 15. Influência do antagonista não seletivo de ciclooxigenases indometacina (1 µM) sobre
a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila (100 μM, A) ou pelo cinamaldeído (300
μM, B) na bexiga isolada de rato. Os resultados são expressos como porcentagem da
contração induzida pelo carbacol (0,1 µM). Cada coluna representa as médias e as linhas
verticais os E.P.M. de 4-6 experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância.
*P<0,05, **P<0,01, comparado com os valores controle (teste t de Student não pareado).
4.1.9. Dosagem dos níveis de prostaglandina E
2
em resposta à exposição
da bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila
A partir do resultado obtido, analisou-se se a prostaglandina E
2
poderia
ser o metabólito de ciclooxigenases envolvido na resposta contrátil do
isotiocianato de alila. Através da determinação dos níveis deste prostanóide na
solução de Krebs, observamos que, mesmo em condições basais, houve uma
grande produção constitutiva de prostaglandina E
2
na bexiga urinária quando
49
mantida em banho de órgão isolado. Quando as preparações foram
estimuladas com isotiocianato de alila (100 µM) houve aumento significativo na
liberação de prostaglandina E
2
para a solução de Krebs-Henseleit (Figura 16).
Figura 16. Liberação de prostaglandina E
2
induzida pelo isotiocianato de alila (100 µM) em
bexiga isolada de rato. As concentrações de prostaglandina E
2
foram quantificadas por ELISA
como descrito em material e métodos. Cada coluna representa a média e as linhas verticais o
E.P.M. para 6 experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05,
comparado com os valores controle (teste t de Student pareado).
4.1.10. Efeito do antagonista seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791
sobre as respostas contráteis induzidas pelos agonistas de receptores
TRPV1 e TRPA1, prostaglandina E
2
e substância P na bexiga isolada de
rato
A figura 17A demonstra que a contração induzida pela capsaicina na
bexiga urinária isolada de rato foi abolida (inibição de 100%) pela incubação
prévia com SB 366791 (10 µM). Já as contrações induzidas pelo isotiocianato
de alila ou pelo cinamaldeído foram somente parcialmente reduzidas (inibições
50
de 38,2 ± 4,9% e 34,3 ± 4,8%, respectivamente) na presença do SB 366791
(Figura 17B e C).
Uma outra etapa de nossos experimentos foi avaliar se a contração
induzida pelo isotiocianato de alila poderia ativar indiretamente o receptor
TRPV1 através da liberação de prostanóides e taquicininas e conseqüente
estimulação de seus respectivos receptores. A Figura 17 (D e E) demonstra
que a incubação prévia das preparações com o antagonista seletivo do
receptor TRPV1, SB 366791 (10 µM), não foi capaz de interferir com a
contração induzida pela prostaglandina E
2
(3 µM) ou pela substância P (0,01
µM).
51
Figura 17. Influência do antagonista seletivo do receptor TRPV1 SB 366791 (10 µM) sobre a
resposta contrátil induzida pela capsaicina (0,03 μM, A), isotiocianato de alila (100 μM, B),
cinamaldeído (300 µM, C), prostaglandina E
2
(3 μM, D) ou substância P (0,01 μM, E) na bexiga
isolada de rato. Os resultados são expressos como porcentagem da contração induzida pelo
carbacol (0,1 µM). Cada coluna representa as médias e as linhas verticais os E.P.M. de 4-6
experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05, **P<0,01, comparado
com os valores controle (teste t de Student não pareado).
52
4.1.11. Ensaio de união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina em
membrana de medula espinhal de rato
Para verificar se a inibição produzida pelo antagonista do receptor
TRPV1 poderia estar relacionada com uma possível interação direta do
isotiocianato de alila ou do cinamaldeído com o receptor vanilóide, realizamos
experimentos de união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina. A Figura 18
demonstra que os agonistas do receptor TRPA1 isotiocianato de alila e
cinamaldeído (10, 100 e 1000 µM) não foram capazes de interferir com a união
específica da [
3
H]-resiniferatoxina em preparações de membrana da medula
espinhal de rato. Por outro lado, a capsaicina (10 µM) causou significante
deslocamento com inibição de 66,1 ± 5,9% no sítio de ligação da [
3
H]-
resiniferatoxina.
Figura 18. Ensaio de competição para a união específica da [
3
H]-resiniferatoxina na medula
espinhal de ratos induzidos pela capsaicina (CAP), isotiocianato de alila (ITCA) ou
cinamaldeído (CIN). Cada coluna representa as médias e as linhas verticais os E.P.M. de 3
experimentos realizados em duplicata. Os asteriscos denotam os níveis de significância.
*P<0,05, comparado com os valores controle (ANOVA de uma via seguida pelo teste de
Dunnett).
53
4.1.12. Influência do tratamento com ciclofosfamida sobre as respostas
contráteis induzidas pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1
A figura 19 (A, B e C) demonstra que a cistite aguda induzida pela
ciclofosfamida (150 mg/kg, i.p.) em ratos, aumentou de maneira significativa as
respostas contráteis induzidas pela capsaicina (0,03 µM) ou pelo cinamaldeído
(300 µM). Em contraste, a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de alila
(100 µM) não foi alterada.
Figura 19. Influência do tratamento com ciclofosfamida (150 mg/kg, i.p.) sobre a resposta
contrátil induzida pela capsaicina (0,03 µM, A), isotiocianato de alila (100 µM, B) ou
cinamaldeído (300 µM, C) na bexiga isolada de rato. Cada coluna representa as médias e as
linhas verticais os E.P.M. de 4-6 experimentos. Os asteriscos denotam os níveis de
significância. *P<0,05, comparado com os valores controle obtidos de animais tratados com
salina (teste t de Student não pareado).
54
4.2. EXPERIMENTOS IN VIVO
4.2.1. Curvas dose-resposta para a nocicepção induzida pelos agonistas
de receptores TRPV1 e TRPA1 e decurso temporal para a nocicepção
induzida pelo isotiocianato de alila
A administração intraplantar de capsaicina (0,01-1 nmol/pata),
isotiocianato de alila (0,1-100 nmol/pata) ou cinamaldeído (1-100 nmol/pata)
em camundongos produziu nocicepção espontânea que foi dependente da
dose empregada (Figura 20A). Os valores médios estimados para DE
50
com os
limites de confiança 95% para a capsaicina, isotiocianato de alila e para o
cinamaldeído foram 0,05 (0,04-0,07); 0,6 (0,4-0,8) e 7,1 (6,1-8,2) nmol e os
efeitos nociceptivos máximos foram 140 ± 8; 111 ± 30 e 129 ± 16 s,
respectivamente. O decurso temporal da resposta nociceptiva ao isotiocianato
de alila apresentou um pico de resposta no primeiro minuto seguinte após a
aplicação, a qual diminuiu até o desaparecimento quase completo no quinto
minuto (Figura 20B).
As doses submáximas de 0,1, 1 e 10 nmol/pata de capsaicina,
isotiocianato de alila e cinamaldeído, respectivamente, foram escolhidas para a
realização dos experimentos subsequentes para evitar estimulação
supramáxima e conseqüente desconforto desnecessário ao animal.
55
Figura 20. Curva dose-resposta para a nocicepção espontânea induzida pela injeção i.pl. de
capsaicina (0,01-1 nmol/pata), isotiocianato de alila (0,1-100 nmol/pata) ou de cinamaldeído (1-
100 nmol/pata) (A). Decurso temporal para a nocicepção espontânea causada pela injeção i.pl.
de isotiocianato de alila (1 nmol/pata) (B). Cada ponto da curva representa a média e as linhas
verticais o E.P.M. de 6-8 animais.
4.2.2. Papel das fibras aferentes sensíveis à capsaicina na nocicepção
induzida pelos agonistas do receptor TRPA1 e das fibras simpáticas na
nocicepção induzida pelo isotiocianato de alila
O tratamento neonatal de camundongos com capsaicina reduziu a
resposta nociceptiva induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído
(95,9 ± 4,1% e 52,3 ± 9,8%, respectivamente), quando comparadas com os
animais que receberam veículo no período neonatal. Por outro lado, a
simpatectomia química produzida pela guanetidina (30 mg/kg, i.p., 3 dias
antes) não alterou a resposta nociceptiva induzida pelo isotiocianato de alila
(Figura 21C).
56
Figura 21. Influência do tratamento neonatal com capsaicina (50 mg/kg, s.c.) sobre a resposta
nociceptiva causada pela injeção i.pl. de isotiocianato de alila (1 nmol/pata, A) ou de
cinamaldeído (10 nmol/pata, B) e influência do tratamento com guanetidina (30 mg/kg, i.p.)
sobre a resposta nociceptiva causada pela injeção i.pl. de isotiocianato de alila (1 nmol/pata,
C). Cada coluna representa as médias e as linhas verticais o E.P.M. de 6-8 camundongos. Os
asteriscos denotam os níveis de significância (A e B) *P<0,05, **P<0,01, comparado com os
animais neonatos tratados com veículo # (ANOVA de uma via seguida pelo Teste de Student-
Newmann-Keuls).
4.2.3. Efeito de antagonistas de receptores TRPV1 na nocicepção induzida
pelos agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1
A co-administração do bloqueador não seletivo de receptores TRP
vermelho de rutênio (1 nmol/pata) reduziu de maneira significativa a
nocicepção induzida pela capsaicina (0,1 nmol/pata) ou pelo isotiocianato de
alila (1 nmol/pata), com inibições de 83,4 ± 9,4% e 84,3 ± 9,4%,
57
respectivamente (Figura 22A e B). Além disso, a co-administração de baixas
doses do antagonista não seletivo do receptor TRPV1, a capsazepina (0,3 e 1
nmol/pata) reduziu de maneira significativa a nocicepção induzida pela
capsaicina (0,1 nmol/pata) (72,4 ± 1,3%, 72,2 ± 10,6%, respectivamente).
Porém, somente uma alta dose de capsazepina (10 nmol/pata) foi capaz de
reduzir significativamente (88 ± 11%) a nocicepção induzida pelo isotiocianato
de alila (1 nmol/pata) (Figura 22C e D). Além disso, foi também avaliado o
efeito da administração conjunta do antagonista seletivo do receptor TRPV1, o
SB 366791 com capsaicina ou com isotiocianato de alila. A Figura 22 (E e F)
demonstra que o SB 366791 (1 nmol/pata) foi capaz de reduzir
significativamente (68,2 ± 5,5%) a nocicepção induzida pela capsaicina (0,1
nmol/pata), mas não aquela induzida pelo isotiocianato de alila (1 nmol/pata).
58
Figura 22. Influência do tratamento i.pl. com os antagonistas de receptores TRPV1 vermelho de
rutênio (1 nmol/pata, A e B), capsazepina (1 nmol/pata, C e D) ou SB 366791 (1 nmol/pata, E e
F) sobre a nocicepção induzida pela capsaicina (0,1 nmol/pata) ou isotiocianato de alila (1
nmol/pata). Cada coluna representa as médias e as linhas verticais o E.P.M. de 6-8
camundongos. Os asteriscos denotam os níveis de significância. *P<0,05, *P<0,01 comparado
os animais tratados com capsaicina ou isotiocianato de alila # (ANOVA de uma via seguida
pelo teste de Dunnett para C, D e Student-Newmann-Keuls para os demais).
59
4.2.4. Participação dos mastócitos na resposta nociceptiva induzida pelos
agonistas de receptores TRPV1 e TRPA1
A degranulação prévia de mastócitos causada pela administração de
composto 48/80 (1, 3, 10 e 10 µg/pata) por 4 dias consecutivos inibiu
significativamente a resposta nociceptiva produzida pelo isotiocianato de alila
(67,9 ± 10,3%) ou pela capsaicina (44,9 ± 12,2%) (Figura 23A e B). Da mesma
forma, a resposta nociceptiva ao próprio composto 48/80 foi inibida de maneira
significativa (66,3 ± 13,5%) (Figura 23C).
60
Figura 23. Influência do tratamento prévio dos animais com o degranulador de mastócitos
composto 48/80 (1+3+10+10 µg/pata) por 4 dias consecutivos, sobre a resposta nociceptiva
induzida pela injeção i.pl. de capsaicina (0,1 nmol/pata, A), isotiocianato de alila (1 nmol/pata,
B) ou composto 48/80 (10 µg/pata, C) no quinto dia. Cada coluna representa as médias e as
linhas verticais o E.P.M. de 6-8 camundongos. Os asteriscos denotam os níveis de significância
*P<0,05 comparado ao controle capsaicina, isotiocianato de alila e composto 48/80 #. (ANOVA
de uma via seguida pelo teste de Student-Newmann-Keuls).
A partir deste resultado, avaliou-se o efeito do antagonista H
1
para a
histamina pirilamina (400 µg/pata) sobre a resposta nociceptiva induzida pela
capsaicina (0,1 nmol/pata) ou pelo isotiocianato de alila (1 nmol/pata). A figura
24 (A e B) demonstra que a co-administração da pirilamina foi capaz de reduzir
de maneira significativa a nocicepção induzida pela capsaicina ou pelo
61
isotiocianato de alila, com inibições de 57,0 ± 9,9% e 75,4 ± 5,9%,
respectivamente.
Figura 24. Influência do tratamento i.pl. com o antagonista de receptores H
1
para a histamina
pirilamina (400 µg/pata), sobre a resposta nociceptiva causada pela injeção i.pl. de capsaicina
(0,1 nmol/pata, A) ou de isotiocianato de alila (1 nmol/pata, B). Cada coluna representa as
médias e as linhas verticais o E.P.M. de 6-8 camundongos. Os asteriscos denotam os níveis de
significância *P<0,05 comparado aos controles capsaicina e isotiocianato de alila #. (ANOVA
de uma via seguida pelo teste de Student-Newmann-Keuls).
4.2.5. Participação da substância P e do receptor NK
1
para as taquicininas
na resposta nociceptiva produzida pelos agonistas de receptores TRPV1
e TRPA1
A co-administração do antagonista seletivo de receptores NK
1
, o FK 888
(1 nmol/pata) não foi capaz de alterar a resposta nociceptiva induzida pela
capsaicina (0,1 nmol/pata) ou pelo isotiocianato de alila (1 nmol/pata) (Figura
25A e B).
62
Concordando com estes resultados, não foi observado aumento dos
níveis de substância P no lavado de tecido subcutâneo da pata após a injeção
intraplantar de capsaicina (0,1 nmol/pata) ou isotiocianato de alila (1 nmol/pata)
(Figura 25C).
Figura 25. Influência do tratamento i.pl. com o antagonista de receptores NK
1
FK 888 (1
nmol/pata) sobre a resposta nociceptiva induzida pela injeção i.pl. de capsaicina (0,1
nmol/pata, A) ou isotiocianato de alila (1 nmol/pata, B). Cada coluna representa as médias e as
linhas verticais o E.P.M. de 6-8 camundongos. Em C está representada a liberação tecidual de
substância P causada pela injeção i.pl. de capsaicina (0,1 nmol/pata) ou isotiocianato de alila (1
nmol/pata). As concentrações de substância P foram quantificadas por ELISA como descrito
em material e métodos. Cada coluna representa as médias e as linhas verticais o E.P.M. para 6
experimentos.
63
5. DISCUSSÃO
5.1. Estudos in vitro
Os resultados obtidos nesta série de experimentos permitiram
caracterizar algumas das vias de transdução decorrentes da ativação do
receptor TRPA1 em bexiga isolada de rato. Desta forma, um dos principais
achados foi que os agonistas do receptor TRPA1, isotiocianato de alila e
cinamaldeído, de maneira semelhante ao agonista TRPV1 capsaicina,
causaram contração dependente da concentração na bexiga isolada de rato. O
isotiocianato de alila foi cerca de 3 vezes mais potente e 60% mais eficaz que o
cinamaldeído em induzir resposta contrátil na bexiga de rato de acordo com a
análise das CE
50
e efeitos máximos em curvas não-cumulativas. Reforçando a
idéia de que estas substâncias estão atuando em receptores TRPA1 para
produzir seus efeitos contráteis, a concentração usada de isotiocianato de alila
e cinamaldeído neste estudo foi similar àquela utilizada para avaliar o aumento
de cálcio intracelular em células CHO expressando TRPA1 (Bandell et al.,
2004). Porém, diferentemente dos nossos achados, estes autores, utilizando
técnicas eletrofisiológicas relataram que ambos os agonistas, isotiocianato de
alila e cinamaldeído, apresentaram a mesma eficácia em induzir aumento de
cálcio intracelular. Esta discrepância pode ser explicada, pelo menos em parte,
pelo valor subestimado do efeito máximo obtido em nosso estudo, pois
concentrações de cinamaldeído maiores que 3 mM não puderam ser testadas
devido à limitação de solubilidade.
Comparando as respostas contráteis mediadas pelo receptor TRPV1 e
TRPA1 na bexiga isolada de rato, a capsaicina foi cerca de 4 mil vezes mais
potente que o isotiocianato de alila em induzir respostas contráteis, embora o
64
isotiocianato de alila foi tão eficaz quanto a capsaicina em induzir contração
quando analisadas curvas concentração-resposta cumulativas. Estes
resultados confirmam resultados prévios de Patacchini e colaboradores (1990)
os quais observaram através de curvas concentração-resposta cumulativas,
que o isotiocianato de alila foi menos potente, porém tão eficaz quanto a
capsaicina em induzir respostas contráteis na bexiga de rato. Por outro lado,
quando foram realizadas curvas concentração-resposta não cumulativas, os
resultados revelaram que a eficácia, mas não a potência dos compostos
testados foi pronunciadamente aumentada. Tem sido sugerido que a redução
da eficácia de certos agonistas, quando os experimentos são realizados
através do método de curvas concentração-resposta cumulativas em
comparação com o método de curvas concentração-resposta não cumulativas,
poderia ser explicada pelo processo de dessensibilização rápida do receptor.
Neste sentido, dessensibilizações semelhantes foram observadas para
diferentes receptores quando curvas cumulativas foram construídas, entre eles
o receptor NK
1
para a substância P em preparações de brônquio humano
(Naline et al., 1996), o receptor 5HT
2
para a serotonina em preparações de veia
porta de rato (Lemberger et al., 1984) e o receptor AII para a angiotensina em
preparações de bexiga urinária de coelho (Anderson et al., 1984).
Nesse contexto, resultados deste estudo e de outros prévios mostraram
que a estimulação prolongada ou repetida com capsaicina resulta em uma
marcada dessensibilização do receptor TRPV1 (Docherty et al., 1996;
Tominaga et al., 1998). Além disso, observamos uma rápida dessensibilização
das respostas contráteis na bexiga de rato após estimulação repetida com
concentrações máximas de isotiocianato de alila ou de cinamaldeído. No
65
entanto, estudos prévios falharam em demonstrar qualquer dessensibilização
das respostas ao isotiocianato e ao cinamaldeído em células CHO e em células
HEK293 expressando TRPA1 (Bandell et al., 2004; Jordt et al., 2004). Porém,
Nagata e colaboradores (2005) demostraram que o isotiocianato de alila pode
produzir desensibilização ou não, dependendo do potencial de membrana em
que a célula se encontra. De fato, a corrente induzida pelo isotiocianato de alila
em células HEK 293 expressando TRPA1 dessensibiliza células
hiperpolarizadas, mas não células despolarizadas, à ativação subseqüente pelo
agonista. Este estudo pode explicar a falha na demonstração de
dessensibilização das respostas ao isoticianato de alila nos experimentos
anteriores, pois estes foram conduzidos em células não hiperpolarizadas.
Nossos resultados confirmam aqueles descritos por Patacchini e
colaboradores (1990), os quais demonstraram que ambos, a capsaicina e o
isotiocianato de alila, produziram dessensibilização dos seus efeitos contráteis
na bexiga de rato. Além disso, observou-se no presente estudo que as
preparações dessensibilizadas pela capsaicina não responderam ao
cinamaldeído, mas responderam parcialmente ao isotiocianato de alila. Outro
dado interessante aqui demonstrado foi a dessensibilização completa ao
cinamaldeído em preparações expostas previamente ao isotiocianato de alila e
a dessensibilização incompleta ao isotiocianato de alila em preparações
previamente expostas ao cinamaldeído. Estes resultados sugerem que o
cinamaldeído e a capsaicina usam o mesmo subgrupo de fibras sensoriais para
produzir seus efeitos contráteis, mas o isotiocianato de alila talvez estimule um
subgrupo adicional distinto de fibras. De fato, Bandell e colaboradores (2004)
demonstraram que o cinamaldeído ativou 39% de neurônios do gânglio da raiz
66
dorsal ativados pelo frio, mas somente 1% de neurônios insensíveis ao frio,
enquanto o isotiocianato de alila ativou 63% da população responsiva ao frio e
12% da população insensível ao frio. Desta maneira, o cinamaldeído ativa
preferencialmente um subgrupo de neurônios adultos do gânglio da raiz dorsal
ativados pelo frio que apresentam um perfil de resposta funcional tipo TRPA1.
O isotiocianato de alila é capaz de ativar esta mesma população além de um
grande número de neurônios insensíveis ao frio. Isto mostra que o
cinamaldeído foi mais específico que o isotiocianato de alila em estimular
neurônios do gânglio da raiz dorsal. Estes resultados levaram estes autores a
sugerir que o isotiocianato de alila poderia ativar outro receptor ou um subtipo
diferente do receptor TRPA1. Estudos adicionais ainda são necessários para
elucidar este ponto.
Ambos TRPA1 e TRPV1 são canais que permitem influxo de cátions,
principalmente cálcio e sódio nas células (Jordt et al., 2004; Caterina et al.,
1997). Em nossos experimentos observamos que a retirada do cálcio do meio
extracelular aboliu completamente a resposta contrátil induzida pelos agonistas
TRPA1 isotiocianato de alila e cinamaldeído, sugerindo que a contração
induzida por estes agonistas na bexiga isolada de rato é totalmente
dependente do influxo de cálcio extracelular. O mecanismo para a ativação de
fibras sensoriais e a liberação de substância P da bexiga de cobaia induzida
pela capsaicina também requer a presença de cálcio extracelular (Maggi et al.,
1989), sugerindo que a função do receptor TRPV1 também é dependente de
cálcio. Em adição, estes autores observaram que a exposição a um meio sem
cálcio
e contendo o quelante de cálcio EDTA protege os terminais periféricos de
fibras sensoriais da dessensibilização pela capsaicina. Isto se deve, pelo
67
menos em parte, pela prevenção ou redução da entrada de cálcio durante a
primeira exposição à droga. Esta conclusão está de acordo com resultados
prévios, mostrando que o vermelho de rutênio, o qual possui a propriedade de
bloquear a entrada de cálcio
em tecidos neurais, impede a liberação de
substância P induzida pela capsaicina na bexiga de cobaia e protege fibras
sensorias da dessensibilização (Maggi et al., 1988). Assim, além do cálcio ser
essencial para a ativação de receptores sensoriais como o TRPV1, presente na
bexiga de várias espécies de mamíferos (Avelino et al., 2002), ele parece
exercer um papel importante na prevenção da dessensibilização observada
para a capsaicina.
O domínio formador do poro do TRPV1 tem resíduos de aminoácidos
carregados negativamente que unem cátions e o inibidor de receptores TRP, o
vermelho de rutênio (Garcia-Martinez et al., 2000). O vermelho de rutênio é um
corante inorgânico policatiônico que bloqueia vários membros da família de
canais iônicos TRP (Alexander et al., 2004). Nossos resultados mostram que o
vermelho de rutênio foi capaz de abolir a contração induzida pela capsaicina e
inibir a contração induzida pelo isotiocianato de alila e pelo cinamaldeído na
bexiga isolada de rato. Além disso, o vermelho de rutênio foi mais potente em
inibir a resposta contrátil do agonista do receptor TRPV1 do que dos agonistas
do receptor TRPA1, característica observada também em células expressando
o receptor TRPV1 ou TRPA1 (Garcia-Martinez et al., 2000; Nagata et al.,
2005). Estes resultados mostram que os agonistas dos receptores TRPA1 e
TRPV1 permitem o influxo de cálcio para induzir contração na bexiga.
A contração induzida pela capsaicina na bexiga isolada de rato é
associada com a estimulação de fibras sensoriais primárias na parede da
68
bexiga através de uma despolarização resistente a tetrodotoxina (bloqueador
de canal de sódio) (para revisão ver: Maggi e Meli, 1986, 1988).
Diferentemente da capsaicina, a tetrodotoxina foi capaz de inibir a resposta
contrátil induzida pelo isotiocianato de alila e pelo cinamaldeído. Resultados
semelhantes foram demonstrados por Patacchini e colaboradores (1990) na
bexiga de rato in vitro utilizando o isotiocianato de alila.
Tem sido sugerido que a ativação de fibras colinérgicas e purinérgicas
contrai a bexiga através de um mecanismo sensível a tetradotoxina (Burnstock
et al., 1978; Downie et al., 1997). A acetilcolina e o ATP (trifosfato de
adenosina) são neurotransmissores envolvidos na transmissão neuromuscular
excitatória na bexiga de mamíferos. Ferguson e colaboradores (1997)
apresentaram a primeira evidência de que o ATP poderia estar envolvido na
sinalização sensorial da bexiga. Vários estudos sugerem que múltiplos
receptores excitatórios purinérgicos estão presentes na bexiga de coelho, gato
e rato. A resposta do músculo detrusor ao ATP parece ser mediada pela
ativação do receptor P2X (receptor acoplado a canal iônico) que promove
influxo de cálcio extracelular, embora a uridina trifosfato e a adenosina 5-O-(2-
tiodifosfato) atuariam através de receptores P2Y
2
ou P2Y
4
(receptores
acoplados a proteína G) para induzir contrações do músculo liso através da via
de sinalização fosfolipase C e liberação de cálcio intracelular (Andersson e
Arner, 2002). O músculo detrusor da bexiga de várias espécies também possui
receptores muscarínicos, com preponderância dos subtipos M
2
e M
3
(Chess-
Williams, 2002; Eglen et al., 1996; Hegde e Eglen, 1999; Sigala et al., 2002;
Yamaguchi et al., 1996)
.
Os receptores M
3
são responsáveis principalmente
pela contração necessária para a micção normal (Chess-Williams, 2002;
69
Choppin, 2002; Fetscher et al., 2002, Hegde e Eglen, 1999). O papel funcional
do receptor M
2
no músculo detrusor normal não está claro. Por outro lado, em
certas doenças, os receptores M
2
podem contribuir para a contração da bexiga.
As funções do receptor muscarínico podem ser alteradas em diferentes
desordens urológicas como na obstrução do fluxo, hiperatividade do músculo
detrusor sem causa neurogênica declarada (idiopática) e diabetes (Andersson
e Arner, 2004). Nossos resultados mostraram que o isotiocianato de alila não
parece estimular as fibras colinérgicas e purinérgicas da bexiga, pois a
atropina, um antagonista de receptores muscarínicos e a suramina, um
antagonista de receptores purinérgicos, não foram capazes de alterar sua
resposta contrátil.
Outro componente sensível à tetrodotoxina na bexiga de rato poderia ser
terminações de fibras sensoriais que liberam neuropeptídeos em resposta a
reflexos axonais (Patacchini et al., 1990). De fato, observamos um importante
papel de neuropeptídeos nas contrações induzidas pelo isotiocianato de alila e
cinamaldeído na bexiga de rato. As taquicininas são uma família de
neuropeptídeos estritamente relacionados, denominados neuropeptídeos,
sendo os membros mais conhecidos a substância P, a neurocinina A (NKA) e a
neurocinina B (NKB). As taquicininas são largamente distribuídas no sistema
nervoso central e periférico de mamíferos. Terminais nervosos periféricos
sensíveis à capsaicina têm sido considerados como a principal fonte de
taquicininas em nível periférico (Jancsó et al., 1977; Maggi e Meli, 1988;
Lundberg, 1996; Patacchini et al., 1998). Porém, evidências recentes mostram
que existem outras fontes neuronais e não neuronais de taquicininas na
periferia. A substância P e a neurocinina A são codificadas pelo gene
70
preprotaquicinina-A (PPT-A) (Nawa et al., 1984; Carter and Krause, 1990) e a
neurocinina B codificada pelo gene preprotaquicinina-B (PPT-B) (Kotani et al.,
1986; Page et al., 2000). Apesar da substância P poder ser expressa
separadamente da neurocinina A, a expressão da neurocinina A é sempre
acompanhada pela expressão da substância P. Isto significa que, em muitas
ocasiões, a substância P e a neurocinina A serão sintetizadas e co-liberadas
tanto a nível central como periférico (Takeda et al., 1990; Maggi, 2000). No
sistema urinário, as taquicininas não estão envolvidas na motilidade normal,
mas parecem ser responsáveis pela hipermotilidade, hipersensibilidade,
inflamação e pelas mudanças na permeabilidade urotelial que são
desenvolvidas em modelos fisiopatológicos. A bexiga urinária de rato contém
discretas quantias de substância P e neurocinina A, enquanto que o nível de
neurocinina B é ainda menor (Takeda et al., 1990; Tateishi et al., 1990).
Também foi observado que a substância P e a neurocinina A foram
praticamente equipotentes em estimular a contração da bexiga isolada de rato
e a neurocinina B foi 3 a 4 vezes menos potente que a substância P em
estimular esse efeito (Maggi et. al., 1987).
Os três tipos de receptores sobre os quais as taquicininas exercem suas
ações são denominados NK
1
, NK
2
e NK
3
.
Estes três receptores possuem
seletividade moderada pelas taquicininas endógenas. A substância P, a
neurocinina A e a neurocinina B atuam como agonistas totais nos três
receptores embora apresentem interação preferencial para os receptores NK
1
,
NK
2
e NK
3
, respectivamente (Mussap et al., 1993; Regoli et al., 1994; Maggi,
2000; Lecci e Maggi, 2003). A ordem de potência para o receptor NK
1
é SP>
71
NKA > NKB, enquanto que para o receptor NK
2
é NKA > NKB > SP e para o
receptor NK
3
é NKB > NKA > SP (Regoli et al.,1994; Maggi, 2000).
Os receptores NK
1
podem ser encontrados nos vasos sanguíneos e no
urotélio de várias espécies, embora sua expressão em células musculares
pareça ser restrita a ratos e cobaias (Candenas et al., 2005). Os receptores
NK
2
estão localizados no músculo detrusor e em lâminas suburoteliais da
bexiga rato, porém apenas no músculo detrusor da bexiga de várias outras
espécies de mamíferos (Nimmo et al., 1992; Carstairs et al., 1993; Lecci and
Maggi, 2001). Estudos sobre transdução de sinal em células transfectadas com
o receptor NK
2
têm mostrado que este receptor ativa múltiplos sistemas de
segundos mensageiros, induzindo a cascata do fosfatidilinositol, acúmulo de
AMPc e aumento no metabolismo do ácido araquidônico (Eistetter et al. 1991,
1993; Arkinstall et al. 1994). A estimulação de receptores NK
2
também é
acoplada ao acúmulo de fosfato de inositol em bexiga de rato, hamster e
cobaia (Martin et al., 1997; Suman-Chauhan et al., 1990; Torrens et al., 1995).
O RNAm do receptor NK
3
foi detectado na bexiga de rato. Interessantemente, a
união da neurocinina B ao receptor NK
3
foi diminuída depois de uma
ganglionectomia, mas não após a remoção cirúrgica dos neurônios aferentes
primários sensíveis à capsaicina sugerindo uma expressão em nervos
parassimpáticos pós-ganglionares (Nimmo et al., 1992). A expressão e o papel
funcional deste receptor são controversos, pois alguns autores observaram
aumento da motilidade da bexiga sob a aplicação local de agonistas seletivos e
outros não (para revisão ver Lecci e Maggi, 2001).
No presente estudo, foi demonstrado que na bexiga isolada de rato, o
isotiocianato de alila produz contração que é reduzida na presença de
72
antagonistas de receptores NK
1
, NK
2
e NK
3
, sugerindo que a liberação de
substância P, neurocinina A e neurocinina B medeia, pelo menos em parte, a
contração induzida pelo isotiocianato de alila. Confirmando a participação das
taquicininas neste processo, a aplicação de isotiocianato de alila na bexiga de
rato induz aumento nos níveis de substância P no líquido nutritivo do órgão.
Nossos resultados reforçam um estudo recente no qual foi demonstrado que o
isotiocianato de alila e a alicina (um outro agonista TRPA1) induziram
relaxamento de segmentos de artéria mesentérica in vitro, através da liberação
de neuropeptídeos de fibras nervosas sensíveis à capsaicina que inervam o
músculo liso vascular (Bautista et al., 2005). Em adição, estudos realizados por
Story e colaboradores (2003) demonstraram que o receptor TRPA1 é expresso
em neurônios sensoriais que contêm substância P, além de CGRP. A
participação das taquicininas na resposta contrátil induzida pela capsaicina na
bexiga de rato foi evidenciada através da observação de uma co-liberação de
substância P e neurocinina A de terminais sensoriais nervosos após a
estimulação com capsaicina (Maggi et al, 1985,1991; Benkó et al., 2003).
Diferente do observado para o isotiocianato de alila, o antagonista NK
3
não foi capaz de alterar a contração mediada pelo cinamaldeído. Como
discutido anteriormente, este resultado novamente sugere que o cinamaldeído
não estimula todos os subgrupos de fibras sensoriais ativadas pelo
isotiocianato de alila. As fibras sensoriais ativadas pelo cinamaldeído poderiam
expressar substância P e neurocinina A, mas não neurocinina B. De fato, Hua e
colaboradores (1985) observaram que a substância P e a neurocinina A, mas
não a neurocinina B, estavam presentes em nervos sensoriais sensíveis à
capsaicina de vários órgãos periféricos de cobaia. Além disso, Brecha e
73
colaboradores (1989) observaram que os genes preprotaquicininas são
expressos diferencialmente em populações de células específicas da retina de
rato, sugerindo que uma população de células pode expressar somente
substância P e neurocinina A e não expressar neurocinina B. Estes resultados
reforçam a idéia de que a substância P e a neurocinina A são co-expressas nas
mesmas fibras, pois têm origem na mesma molécula precursora, enquanto a
neurocinina B é originada de um precursor diferente.
Prostanóides são liberados da bexiga por distensão e por trauma
mecânico e inflamação da mucosa. Tem sido sugerido que os prostanóides
estão envolvidos na regulação da função normal da bexiga, como por exemplo,
na micção, sendo também potentes espasmogênicos (Quinn et al., 2004). De
fato, a prostaglandina E
2
contrai o músculo detrusor isolado sugerindo sua
contribuição para a manutenção do tônus muscular (Andersson and Arner,
2004). Além disso, os prostanóides também estão envolvidos na fisiopatologia,
como por exemplo, na hiperatividade da bexiga. Provavelmente os
prostanóides não atuam como mensageiros efetores sobre o reflexo de micção,
mas como neuromoduladores da neurotransmissão aferente e eferente
(Andersson e Hedlun, 2002). Este mecanismo de ação poderia ser um
componente importante da estimulação por agonistas de receptores NK
2
do
reflexo de micção (Maggi et al. 1991; Kibble e Morrison 1996a, 1996b). Além
disto, Tramontana e colaboradores (2000) demonstraram que a ativação dos
receptores NK
2
leva à síntese e liberação de prostaglandina E
2
na bexiga de
hamster e prostanóides gerados pela ativação deste receptor amplificam o
efeito contrátil direto de agonistas de receptores NK
2
.
74
Desta forma, investigamos se metabólitos derivados da ciclooxigenase
poderiam estar envolvidos na contração induzida pelos agonistas do receptor
TRPA1 na bexiga isolada de rato. Os resultados mostram que a inibição da via
das ciclooxigenases causada pela indometacina reduziu a contração induzida
pelo isotiocianato de alila e pelo cinamaldeído. Além disso, a exposição das
preparações de bexiga ao isotiocianato de alila produz um rápido aumento nos
níveis de prostaglandina E
2
no líquido de nutrição do órgão, uma ação que
parece estar bem correlacionada com o efeito contrátil do isotiocianato de alila
nestas preparações. Como mencionado anteriormente, foi demonstrado que a
ativação de receptores NK
2
determina a síntese e a liberação de prostanóides
da bexiga de hamster (Tramontana et al., 2000). Assim, o aumento dos níveis
de prostaglandina E
2
poderia ser secundário a liberação de taquicininas. Por
outro lado, Pinna e colaboradores (1994) demostraram que a resposta contrátil
da bexiga isolada de rato à capsaicina não é alterada pela indometacina,
apesar de ser parcialmente mediada pela ativação do receptor NK
2
. Desta
forma parecem existir mecanismos adicionais para a estimulação da
ciclooxigenase na bexiga urinária e outros estudos devem ser realizados para
elucidar este ponto.
Um outro achado importante obtido no decorrer do nosso estudo foi que
a contração induzida pelo isotiocianato de alila e pelo cinamaldeído foi
parcialmente reduzida, enquanto a resposta à capsaicina foi abolida pelo
antagonista seletivo do receptor TRPV1 SB 366791 na bexiga isolada de rato.
Há pelo menos três hipóteses para explicar este resultado. Primeiramente, o
isotiocianato de alila e o cinamaldeído poderiam interagir diretamente com o
receptor TRPV1. No entanto, esta idéia parece pouco provável, tendo em vista
75
que em concentrações de 10 a 1000 µM o isotiocianato de alila e o
cinamaldeído não foram capazes de interferir com a união específica da [
3
H]-
resiniferatoxina em membrana de medula espinhal de rato. De fato, dados da
literatura têm mostrado que ambos os compostos não foram capazes de ativar
o influxo de cálcio em células transfectadas com o receptor TRPV1 (Bandell et
al., 2004). Segundo, alguns mediadores liberados pela estimulação das
preparações com o isotiocianato de alila ou cinamaldeído poderiam estimular
indiretamente o receptor TRPV1. De fato, é bem conhecido que vários
receptores metabotrópicos ativam o receptor TRPV1 através de mecanismos
indiretos, tais como fosforilação ou remoção do bloqueio por fosfoinositídeos
(para revisão ver: Calixto et al., 2005). Novamente, esta hipótese parece não
ser provável, pelo menos no que se refere aos receptores EP ou NK
1
, pois
observamos que o antagonista do receptor TRPV1, o SB 366791, não foi capaz
de alterar a contração induzida pela prostaglandina E
2
ou pela substância P na
bexiga de rato. Finalmente, o SB 366791 poderia interagir diretamente com o
receptor TRPA1 para inibir a resposta contrátil induzida pelo isotiocianato de
alila e cinamaldeído. Para validar esta hipótese seriam necessários estudos em
células recombinantes expressando este receptor.
Posteriormente verificamos a ativação dos receptores TRPA1 e TRPV1
na bexiga de rato durante uma situação patológica, a cistite induzida por
ciclofosfamida. A ciclofosfamida é um fármaco usado sozinho ou em
combinação com outros para o tratamento de doenças neoplásicas (Levine e
Richie, 1989). Porém, a cistite hemorrágica é um efeito adverso
freqüentemente observado com o uso de ciclofosfamida (West, 1997). A
incidência deste efeito adverso é relacionada à dosagem e pode ser em torno
76
de 75% em pacientes que recebem altas doses intravenosas de ciclofosfamida.
Os efeitos adversos urológicos variam de sintomas de esvaziamento da bexiga
irritativos transitórios, incluindo aumento da freqüência urinária, disúria,
urgência e desconforto suprapúbico (Gray et al., 1986). Têm sido relatados
casos de fibrose e necrose da bexiga, contratura, refluxo vesicouretral e uma
taxa de mortalidade de 4% entre os pacientes com hemorragia maciça do
órgão (Levine e Richie 1989; West 1997). Os sintomas podem ser
demonstrados dentro de 24 horas após uma única dose (Gray et al., 1986). A
urotoxicidade deste citostático não é baseada na sua atividade alcalinizante,
mas na formação de metabólitos 4-hidroxi, em particular a acroleína,
excretados pelos rins (Kurovski e Wagner 1997).
A ativação do receptor TRPV1 resulta em sensação de dor e aumenta a
atividade reflexa de órgãos como a bexiga urinária (Szolcsanyi, 1977; Ishizuka
et al., 1994). Assim, Birder e colaboradores (2002) demonstraram que
camundongos nocautes para o receptor TRPV1 apresentaram alterações da
função normal da bexiga como a redução na sinalização sensorial para a
medula espinhal e no reflexo de esvaziamento da bexiga. Além disso, dados
recentes mostram que a dessensibilização de aferentes da bexiga sensíveis à
capsaicina pela instilação intravesical de resiniferatoxina bloqueou a
hiperreflexia da bexiga e a instilação intravesical da capsazepina reduziu
significativamente esta hiperreflexia, indicando que os aferentes da bexiga
sensíveis à capsaicina e o receptor TRPV1 estão envolvidos no
desenvolvimento da hiperalgesia e hiperatividade observadas em ratos tratados
com ciclofosfamida (Dinis et al., 2004).
77
Nossos resultados mostram que a cistite induzida pela ciclofosfamida
levou a um aumento das respostas contráteis da bexiga isolada de rato à
capsaicina e ao cinamaldeído, evidenciando uma participação importante dos
receptores TRPV1 e TRPA1 na cistite. Interessantemente, o envolvimento das
fibras C onde estes receptores estão localizados, já foi sugerido na
hiperatividade da bexiga, que ocorre em pacientes com cistite intersticial
(Chancellor e Yoshimura, 2004). No entanto, a resposta contrátil induzida pelo
isotiocianato de alila não foi alterada em animais com cistite, sugerindo
novamente que este composto poderia estar ativando um outro tipo de fibra
sensorial e/ou receptor e que a expressão deste receptor não apresenta-se
aumentada ou talvez esteja até mesmo reduzida nesta condição patológica.
Coletivamente, os resultados in vitro mostram que a estimulação do
receptor TRPA1 com agonistas, produz contração graduada da bexiga de rato
através da estimulação de neurônios sensoriais e da liberação de
neuropeptídeos e de prostanóides. O fato dos agonistas do receptor TRPA1
induzirem uma dessensibilização mais rápida deste receptor que a causada
pela capsaicina no receptor TRPV1 em preparações de bexiga, pode sugerir
que o uso de agonistas TRPA1 poderia ser também eficaz para o tratamento
dos estados de hiperreflexia e hiperalgesia da bexiga.
A observação da exacerbação dos efeitos contráteis da capsaicina e do
cinamaldeído no modelo experimental da cistite sugere uma expressão
aumentada destes receptores, o que poderia através do desenvolvimento de
antagonistas para o receptor TRPA1 ou mesmo através da capacidade de
dessensibilização deste receptor, viabilizar melhores tratamentos para as
78
disfunções da bexiga que envolvem um processamento anormal da informação
aferente proveniente da ativação de fibras sensíveis à capsaicina.
5.2. Estudos in vivo
Além de estudos in vitro, foram realizados estudos in vivo para o melhor
entendimento dos mecanismos envolvidos na ativação do receptor TRPA1.
Nossos resultados mostram que a capsaicina, o isotiocianato de alila e o
cinamaldeído provocaram efeito nociceptivo dependente da dose quando
injetados na pata de camundongos. É interessante observar que os agonistas
dos receptores TRPV1 e TRPA1 produziram nocicepção espontânea na
mesma ordem de potência que induziram resposta contrátil na bexiga isolada
de rato. Porém, a diferença entre as potências foi menos intensa nos estudos in
vivo, pois a capsaicina foi cerca de 10 vezes mais potente que o isotiocianato
de alila e 100 vezes mais potente que o cinamaldeído em provocar nocicepção
No entanto, diferentemente dos resultados obtidos in vitro, todos os agonistas
apresentaram a mesma eficácia em provocar resposta nociceptiva. O
isotiocianato de alila foi escolhido para a realização dos experimentos
posteriores devido ao fato de ser mais potente que o cinamaldeído em provocar
nocicepção. Nossos resultados estão de acordo com Bandell e colaboradores
(2004) que também observaram resposta nociceptiva à injeção intraplantar de
cinamaldeído em camundongos. Além disso, muitos estudos já haviam
demonstrado que o óleo de mostarda produzia nocicepção em animais
experimentais e em humanos. De fato, a administração tópica ou intra-articular
de óleo de mostarda produz hiperalgesia em ratos (Jiang et al., 1998; Silva et
al., 1997) e a administração intraretal produz nocicepção visceral em
79
camundongos (Laird et al., 2001). A aplicação tópica de óleo de mostarda
também é capaz de causar dor em humanos (Cervero et al., 1996).
Nossos resultados mostraram que o efeito nociceptivo produzido pela
capsaicina e pelo isotiocianato de alila foi reduzido significativamente pelo
vermelho de rutênio. Diferentemente dos estudos in vitro, a mesma dose de
vermelho de rutênio apresentou eficácia semelhante em inibir a resposta
nociceptiva do agonista do receptor TRPV1 quando comparado ao agonista do
receptor TRPA1. Estes resultados mostram que os agonistas dos receptores
TRPA1 e TRPV1 ativam influxo de íons para produzir nocicepção.
Posteriormente, investigamos o papel do receptor TRPV1 na nocicepção
causada pelo isotiocianato de alila. Experimentos iniciais foram realizados
utilizando o antagonista não seletivo para o receptor TRPV1, a capsazepina. A
co-administração de uma alta dose de capsazepina (10 nmol/pata) com o
isotiocianato de alila reduziu significativamente a resposta nociceptiva deste
agonista. Por outro lado, a dose de 1 nmol/pata de capsazepina reduziu
amplamente a nocicepção causada pela capsaicina, sem alterar
significantemente a resposta ao isotiocianato de alila. Estes resultados podem
indicar que na dose de 10 nmol/pata a capsazepina poderia estar agindo por
um mecanismo não específico. De fato, evidências recentes têm mostrado que
a capsazepina é um antagonista não seletivo do receptor TRPV1, pois também
é capaz de inibir o receptor TRPM8 (Behrendt et al., 2004), bloquear canais de
cálcio ativados por voltagem (Docherty et al., 1997) e receptores nicotínicos da
acetilcolina (Liu e Simon, 1997) na mesma concentração que é usada para
bloquear o receptor TRPV1.
80
Tendo em vista que os resultados com a capsazepina não foram
esclarecedores com respeito à participação do receptor TRPV1 na nocicepção
mediada pelo isotiocianato de alila, utilizamos um novo e potente antagonista
seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791 (Gunthorpe et al., 2004). Observou-
se então que a co-administração deste antagonista reduziu significativamente a
nocicepção mediada pela capsaicina, mas não aquela causada pelo
isotiocianato de alila. Em contraste aos dados in vitro, estes resultados
fortemente sugerem que o receptor TRPV1 não participa da resposta
nociceptiva causada pelo isotiocianato de alila. Confirmando estes achados,
camundongos nocautes para o receptor TRPV1 apresentam hiperalgesia
mecânica causada por óleo de mostarda, sugerindo que a capsaicina e os
isotiocianatos ativam nociceptores através de mecanismos moleculares
distintos (Caterina et al., 2000). Reforçando esta idéia, Bandell e colaboradores
(2004) demonstraram que o comportamento nociceptivo produzido pela injeção
intraplantar de cinamaldeído é semelhante em animais normais e nocautes
para o receptor TRPV1. Da mesma forma, o edema de orelha em
camundongos provocado por isotiocianato de alila desenvolveu-se de maneira
normal em camundongos nocautes para o receptor TRPV1 (Bánvölgyi et al.,
2004).
Em alguns experimentos investigamos os tipos celulares envolvidos na
resposta nociceptiva causada pelo isotiocianato de alila. O tratamento neonatal
de animais com capsaicina tem sido muito usado para degenerar as fibras
aferentes primárias sensíveis à capsaicina (Holzer, 1991; Ferreira et al., 2004).
Tem sido demonstrado que este tratamento reduz a nocicepção causada pela
capsaicina em camundongos e ratos e reduz a expressão do receptor TRPV1
81
no gânglio da raiz dorsal (Ferreira et al., 2004; André et al., 2004). O tratamento
de camundongos neonatos com capsaicina reduziu de maneira acentuada a
nocicepção mediada pelo isotiocianato de alila e pelo cinamaldeído em animais
adultos. Esses resultados indicam que os agonistas do receptor TRPA1 e o
agonista do receptor TRPV1 ativam o mesmo subgrupo de fibras sensoriais
para produzir nocicepção. De fato, as respostas inflamatórias produzidas pela
capsaicina e pelo óleo de mostarda mostram dessensibilização cruzada
(Jancsó et al., 1977; Simons et al., 2003).
Além de neurônios sensoriais, o RNAm para o receptor TRPA1 é
expresso em neurônios simpáticos (Smith et al., 2004). Sabe-se que fibras
simpáticas estão envolvidas no desenvolvimento da dor inflamatória e
neuropática, pois liberam mediadores pró-nociceptivos como a noradrenalina e
prostaglandinas (Safieh-Garabedian et al., 1997; 2002). Interessante, a
nocicepção causada pelo isotiocianato de alila parece não envolver a
estimulação de fibras simpáticas, uma vez que a simpatectomia química
produzida pela guanetidina não afetou a resposta nociceptiva.
Nossos resultados também mostram que a degranulação prévia de
mastócitos pelo tratamento com o composto 48/80 reduziu a nocicepção
causada pelo isotiocianato de alila e pela capsaicina. Além disso, a nocicepção
induzida pelo isotiocianato de alila ou pela capsaicina foi reduzida
significativamente pelo antagonista do receptor H
1
para a histamina, a
pirilamina. Os dados obtidos para a capsaicina concordam com os achados de
Massaad e colaboradores (2004) que demonstraram que o tratamento
intraplantar com o antagonista de receptores H
1
prometazina inibiu a
hiperalgesia induzida pela injeção intraplantar de capsaicina em ratos.
82
Uma possível explicação para a participação dos mastócitos na
nocicepção induzida pela capsaicina ou pelo isotiocianato de alila seria a
suposta expressão do receptor TRPV1 e do receptor TRPA1 em mastócitos.
De fato, o receptor TRPV1 foi detectado em cultura de mastócitos (Stokes et
al., 2004) e em mastócitos da pele humana (Stander et al., 2004). Assim, a
capsaicina poderia estimular diretamente os mastócitos a liberar histamina. Um
mecanismo de ação direta semelhante poderia ser sugerido para o
isotiocianato de alila, porém a expressão do receptor TRPA1 em mastócitos
ainda não foi estudada. Além deste mecanismo direto, os ativadores do
receptor TRPA1 e do receptor TRPV1 poderiam estimular as terminações de
fibras aferentes primárias e consequentemente liberar mediadores que
poderiam ativar mastócitos. Um destes mediadores, a substância P, poderia
ativar mastócitos levando a liberação de histamina e de várias citocinas (Ansel
et al., 1993). Além disso, evidências anatômicas sugerem uma comunicação
entre fibras aferentes primárias sensíveis à capsaicina e mastócitos (Crivellato
et al., 1991; Suzuki et al., 1999). Assim, a substância P poderia por mecanismo
dependente ou independente da ativação do receptor NK
1
estimular mastócitos
(Ansel et al., 1993; Dimitriadou et al., 1997; Okada et al.,1999; Suzuki et al.,
1999).
No presente estudo demonstramos que o antagonista do receptor NK
1
, o
FK 888, não afetou a resposta nociceptiva causada por doses sub-máximas de
isotiocianato de alila (1 nmol/pata) ou capsaicina (0,1 nmol/pata). O presente
resultado contrasta com os dados obtidos por Santos e Calixto (1997), que
demonstraram a participação do receptor NK
1
na nocicepção causada por dose
supra-máxima de capsaicina (5 nmol/pata). Porém, o presente estudo está de
83
acordo com os achados de Petersen e colaboradores (1997) que
demonstraram que a injeção intradérmica de uma dose sub-máxima de
capsaicina produz dor, mas não libera substância P, na pele de humanos.
Assim, a interação entre mastócitos e fibras sensorias mediada pela ativação
do receptor NK
1
parece não explicar o desenvolvimento de nocicepção nos
nossos experimentos.
Além da ativação via receptor, a substância P pode também degranular
mastócitos por uma interação direta de seus resíduos básicos da porção N-
terminal com a membrana dos mastócitos (para revisão ver: Maggi, 1997). Um
estudo realizado por Columbo e colaboradores (1996) demonstrou que a
substância P degranula mastócitos da pele humana através de um mecanismo
dependente de proteína quinase C e sensível à toxina pertussis, o qual não é
afetado por um potente antagonista do receptor NK
1
,
suportando então uma via
independente de receptor, através de uma proteína G sensível a toxina
pertussis. Porém, este mecanismo indireto também não parece explicar a
nocicepção causada pelo isotiocianato de alila ou pela capsaicina, pois o
tratamento com estas substâncias não foi capaz de aumentar os níveis de
substância P em dializados de pata de camundongos. Assim, a interação entre
mastócitos e aferentes primários que produz nocicepção espontânea em
camundongos não pode ser explicado pela liberação de substância P dos
aferentes primários. Desta forma, estudos complementares devem ser
realizados para investigar se outros mediadores químicos participam deste
processo ou de o mesmo ser causado pela ativação direta de mastócitos por
agonistas TRPA1 ou TRPV1.
84
Em conjunto, os resultados in vivo mostram que o receptor TRPA1 está
presente em terminais nervosos sensoriais sensíveis à capsaicina, cuja
estimulação por agonistas do receptor TRPA1 provoca resposta nociceptiva.
Em adição, esta resposta nociceptiva parece envolver a participação de
mastócitos, através da liberação de histamina. Desta forma, a elucidação da
participação deste receptor na nocicepção é importante para o entendimento
de doenças associadas com processos dolorosos. De fato, um estudo recente
demonstrou que a expressão do receptor TRPA1 é aumentada em neurônios
do gânglio da raiz dorsal após a inflamação periférica e que a diminuição desta
expressão previne e reverte a hiperalgesia ao frio induzida pela lesão de nervo
ou inflamação (Obata et al., 2005). Estes dados mostram de maneira clara um
importante papel do receptor TRPA1 na hiperalgesia ao frio nocivo, um sintoma
da dor inflamatória e neuropática.
6. CONCLUSÃO
Analisados em conjunto, os resultados obtidos in vitro e in vivo no
presente trabalho permitem concluir que os agonistas do receptor TRPA1
causam efeito contrátil dependente da concentração na bexiga urinária de rato
através da estimulação de fibras sensoriais e esta ação depende do influxo de
cálcio externo e da liberação de taquicininas e de metabólitos de
ciclooxigenase, provavelmente prostaglandina E
2
, sendo independente da
ativação do sistema colinérgico e purinérgico. Nossos resultados sugerem que
os agonistas do receptor TRPA1 não interagem diretamente com os receptores
TRPV1 para produzir suas ações, considerando que eles não são capazes de
deslocar a união da [
3
H]-resiniferatoxina com o receptor TRPV1. Além disso, os
85
agonistas do receptor TRPA1 produziram resposta nociceptiva dependente da
dose quando injetados na pata de camundongos. Este efeito ocorre através da
estimulação de fibras sensoriais sensíveis à capsaicina e da liberação de
histamina de mastócitos. Porém, este efeito nociceptivo não parece envolver a
ativação de fibras simpáticas ou depender da liberação de substância P. O
estudo do envolvimento do receptor TRPA1 nos sistemas sensoriais e dos
mecanismos envolvidos na ativação deste receptor são promissores na
perspectiva de se desenvolver novas estratégias terapêuticas úteis no
tratamento de distúrbios dolorosos.
86
Figura 26. Mecanismo proposto para a resposta contrátil induzida pela ativação
do receptor TRPA1 em bexiga isolada de rato
87
Figura 27. Mecanismo proposto para a resposta nociceptiva induzida pela
ativação do receptor TRPA1 em pata de camundongo
88
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Tateishi, K., Kishimoto, S., Kobayashi, H., Kokube, K., Matsuoka, Y. Distribution
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Tominaga, M., Caterina, M.J., Malmberg, A.B. Rosen, T.A., Gilbert, H., Skinner,
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Tramontana, M., Catalioto, R.M., Lecci, A., Maggi, C.A. Role of prostanoids in
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2
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West, N.J. Prevention and treatment of hemorrhagic cystitis. Pharmacother.,
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110
Witting, N., Svensson, P., Arendt-Nielsen, L., Jensen, T.S. Differential effect of
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Yamaguchi, O., Shishido, K., Tamura, K., Ogawa, T., Fujimura, T., Ohtsuka, M.
Evaluation of mRNAs encoding muscarinic receptor subtypes in human
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Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain
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Zygmunt, P.M., Petersson, J., Andersson, D.A., Chuang, H., Sorgard, M., Di
Marzo, V., Julius, D., Hogestatt, E.D. Vanilloid receptors on sensory nerves
mediate the vasodilator action of anandamide. Nature, 400: 452-457, 1999.
111
8. ANEXO
Parte dos resultados da presente dissertação está publicada em:
Andrade, E.L., Ferreira, J., André, E, Calixto, J.B. Contractile mechanisms
coupled to TRPA1 receptor activation in rat urinary bladder. Biochem.
Pharmacol., 72: 104-114, 2006.
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