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PAPEL DA DINÂMICA DO FLUXO DE PRÓTONS NA SINALIZAÇÃO
DAS DIFERENTES FASES DA INTERAÇÃO MICORRÍZICA
ARBUSCULAR
ALESSANDRO COUTINHO RAMOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JUNHO – 2005
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PAPEL DA DINÂMICA DO FLUXO DE PRÓTONS NA SINALIZAÇÃO
DAS DIFERENTES FASES DA INTERAÇÃO MICORRÍZICA
ARBUSCULAR
ALESSANDRO COUTINHO RAMOS
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Produção Vegetal
Orientador: Prof. Arnoldo Rocha Façanha
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JUNHO - 2005
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PAPEL DA DINÂMICA DO FLUXO DE PRÓTONS NA SINALIZAÇÃO
DAS DIFERENTES FASES DA INTERAÇÃO MICORRÍZICA
ARBUSCULAR
ALESSANDRO COUTINHO RAMOS
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Doutor em Produção Vegetal
Aprovada em 23 de Junho de 2005
Comissão Examinadora:
_________________________________________________________________
Dra Elke Jurandy Bran N. Cardoso (Ph.D., Plant Pathology) – ESALQ/USP
________________________________________________________________________
Dr. Márcio Rodrigues Lambais (Ph.D., Biological Sciences) – ESALQ/USP
________________________________________________________________
Dr. Ricardo Bressan-Smith (D.Sc. Fisiologia Vegetal) – UENF
________________________________________________________________
Dr. Arnoldo Rocha Façanha (D.Sc., Química Biológica) – UENF
Orientador
“O ser humano vivencia a si mesmo, seus
pensamentos como algo separado do resto do
universo – numa espécie de ilusão de ótica de sua
consciência. E essa ilusão é uma espécie de prisão
que nos restringe a nossos desejos pessoais,
conceitos e ao afeto por pessoas mais próximas.
Nossa principal tarefa é a de nos livrarmos dessa
prisão, ampliando o nosso círculo de compaixão para
todos os seres vivos e toda a natureza em sua
beleza. Ninguém conseguirá alcançar completamente
esse objetivo, por outro lado, lutar pela sua realização
já é por si só parte de nossa liberação e o alicerce de
nossa segurança interior”.
Albert Einstein
BIOGRAFIA
Alessandro Coutinho Ramos, filho de Antônio de Pádua Clemente Ramos
e Maria Etelvina Coutinho Ramos, nasceu na cidade de Viçosa, Minas Gerais, no
dia 10 de Agosto de 1974. Em 1995, ingressou como bolsista de iniciação
científica no Departamento de Microbiologia da UFV sob orientação da Dr.ª Maria
Catarina Megumi Kasuya; em 1998 no Departamento de Engenharia Florestal sob
orientação do Dr. Carlos Cardoso Machado e em Janeiro de 2000 graduou-se em
Agronomia pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas Gerais. Em
Setembro de 2001, obteve o título de Mestre em Produção Vegetal pela
Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) sob orientação do Dr. Marco
Antônio Martins. Em Agosto de 2001, sob orientação do Dr. Arnoldo Rocha
Façanha iniciou o doutorado na UENF e no período de Novembro de 2002 a
Outubro de 2003, realizou o doutorado sandwich no Instituto Gulbenkian de
Ciência, Oeiras, Portugal, sob a co-orientação do Dr. José Alberto Feijó.
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar presente em todos os momentos da minha vida, me
conferindo força e energia para superar todos os desafios pessoais e
profissionais, e por permitir que eu me torne uma pessoa melhor. Por ter me
concedido uma família maravilhosa que mesmo distantes permanecemos unidos.
Aos meus pais, Antônio de Pádua e Maria Etelvina que mesmo nas
dificuldades sempre investiram na minha educação, mostraram-me a distinção
entre o certo e o errado e acima de tudo carinho, compreensão e incentivo em
todas etapas da minha vida.
À minha esposa Adriana, pelo seu amor, carinho, dedicação e constante
paciência desde a minha graduação.
À minha irmã Gláucia, ao Léo e os meus sobrinhos Ana Vitória e
Leonardo, pelo carinho e apoio.
Aos meus primos de Campos: Pedro, Auxiliadora, Adriano e Anne pelo
apoio, preocupação e acolhimento em sua casa desde a minha chegada a
Campos.
Aos amigos do laboratório de microbiologia do solo (Micorrizas) da UFV,
especialmente à Maria Catarina M. Kasuya pelos ensinamentos durante a
iniciação científica e o apoio constante.
A Carlos Cardoso Machado pela amizade e por possibilitar a continuidade
do meu treinamento de iniciação científica me convidando para trabalhar em seu
grupo de pesquisa.
v
Ao meu orientador Arnoldo Rocha Façanha (O Mentor), por despertar-me
o amor à ciência, pelos ensinamentos que tanto contribuíram no meu
amadurecimento como pessoa e pesquisador. Acima de tudo pela dedicação,
incentivo e respeito mútuo mantido desde que nos conhecemos.
Ao meu ex-orientador Marco Antônio Martins pela paciência e
compreensão nos momentos difíceis do mestrado e doutorado, por ter
possibilitado a minha vinda para a UENF e o estádio em Portugal. Muito obrigado!
Ao Dr. José Alberto Feijó por ter me aceito em seu grupo de investigação,
pela paciência, crédito, amizade, incentivo e aos ensinamentos não só de
eletrofisiologia, mas também do funcionamento da ciência mundial.
Aos amigos do Plant Development Lab: Catarina Certal, Leonor, Sofia,
Jörg, Silvia, Margarida, Ana Maria, Catarina Silva, Nuno, Zé Antão, Daniel e
Liliana pelo apoio, carinho e amizade deste a minha chegada em Portugal, pelas
ajudas constantes que tanto contribuíram na minha adaptação e por termos
vivenciados vários momentos de alegria e descontração. Obrigado a Silvia Costa
pela paciência e atenção durante os treinamentos na Vibrating Probe.
A todos do Instituto Gulbenkian de Ciência e que tornaram muito
agradável o nosso dia-a-dia e especialmente ao Joaquim, Diniz, Suzana, Helena,
Sara, Paula, Moisés Mallo, Leonor, Sérgio, Jacinto, Filipa, Marta, Alexis, Vívian,
Alex e Margarida. Às técnicas Ana Homem, Ana Gaspar, Marisa pelo carinho,
atenção. À Beatriz, Moisés e Simone pelo apoio, carinho e alegria nos
momentos de descontração que passamos juntos.
Ao Dr. António Coutinho e ao Engenheiro José Mario Leite pela dedicação
ao ajudar-me nos momentos necessários.
Aos meus amigos da UENF e também padrinhos de casamento, Lúcia
Gracinda e Luizão, Luciana Konda, Luciana e Silvaldo, Josane e Marco Antônio,
Marco e Meire, e Karla pela amizade e carinho.
Ao Dr. Lev Okorokov pelas suas críticas e sugestões durante o exame de
qualificação que indiretamente contribuíram na descrição deste trabalho.
À Drª. Anna Okorokova-Façanha e às suas filhas Katarina e Natália pela
amizade, carinho e receptividade em sua casa durante as discussões da tese com
Arnoldo.
À Drª. Elke Cardoso e ao Dr. Márcio Lambais que se deslocaram numa
viagem cansativa de Piracicaba até Campos para participarem da banca,
vi
agradeço pelas valiosas críticas e sugestões que muito contribuíram para a
melhoria deste trabalho.
Ao Dr. Ricardo Bressan-Smith pelas valiosas críticas e sugestões, desde
o projeto de tese de doutorado e que muito contribuíram para a melhoria deste
trabalho.
Ao Dr. Fábio Lopes Olivares pela amizade, alegria e aos constantes
ensinamentos científicos e pessoais.
A todos os professores do CCTA e CBB pelos ensinamentos e estímulos
durante o curso.
Aos amigos do Laboratório de Solos (LSOL/CCTA) e laboratório de
Biologia Celular e Tecidual (LBCT/CBB) pelo ótimo convívio desde o mestrado.
Aos ex-companheiros de república: Thiébaut e Juares pela amizade e
apoio constante.
Aos amigos do grupo de pesquisas em bioenergética: Inga, Leonardo,
Luiz César, Michelle, Tatiana, Liane, Josimara e Jomar. Especialmente a
Leonardo Campaneli, co-orientado de iniciação científica, pela amizade e ajuda
nos experimentos.
A todos amigos da UENF pela amizade e convívio agradável.
A Antônio Amaral e as secretárias da Pós-Graduação em Produção
vegetal (Fátima, Luciana e Patrícia) pela atenção dispensada.
Ao CNPq pelo financiamento deste projeto concedido ao Dr. Arnoldo
Façanha e à Universidade Estadual do Norte Fluminense pela bolsa de
doutorado, estrutura e oportunidades geradas para consolidar a minha formação.
A Capes pela Bolsa sandwich concedida possibilitando a minha estadia
em Portugal e o aprendizado da eletrofisiologia.
.
SUMÁRIO
BIOGRAFIA ------------------------------------------------------------------------------------------iii
AGRADECIMENTOS ------------------------------------------------------------------------------iv
LISTA DE FIGURAS --------------------------------------------------------------------------------x
LISTA DE QUADROS E TABELAS ---------------------------------------------------------- xvi
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ------------------------------------------------xvii
RESUMO ------------------------------------------------------------------------------------------- xvi
ABSTRACT ----------------------------------------------------------------------------------------xviii
1. INTRODUÇÃO -------------------------------------------------------------------------------1
2. REVISÃO DE LITERATURA--------------------------------------------------------------4
2.1 A associação micorrízica arbuscular ------------------------------------------------------4
2.2 Interfaces simbióticas nas micorrizas arbusculares -----------------------------------8
2.3 Relação entre bombas de H
+
e o transporte de nutrientes na interação
micorrízica arbuscular---------------------------------------------------------------------------- 10
2.5 A técnica da microssonda vibrátil e o crescimento celular polarizado ---------- 17
2.6 Alterações morfológicas em hifas de FMAs em resposta a sinais da planta
hospedeira ------------------------------------------------------------------------------------------ 19
viii
3. MATERIAL E MÉTODOS---------------------------------------------------------------- 21
3.1 Material biológico, isolamento e desinfestação dos esporos---------------------- 21
3.2 Obtenção e cultivo das raízes transgênicas (RTs) ---------------------------------- 22
3.3 Extração do fluido apoplástico de raízes (FAR) de trevo--------------------------- 24
3.4 Determinação dos fluxos protônicos extracelulares --------------------------------- 25
3.5 Preparo do substrato e plantio de plantas de milho --------------------------------- 27
3.6 Isolamento e purificação das vesículas de membrana plasmática e vacuolar 28
3.7 Determinação da atividade ATPásica e Pirofosfatásica---------------------------- 30
3.8 Determinação da atividade de fosfohidrolases no fluido apoplástico de raízes
de trevo ---------------------------------------------------------------------------------------------- 31
4. RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------- 33
4.1 Análises durante a fase assimbiótica --------------------------------------------------- 33
4.1.1 Padrão do fluxo de H
+
em azigosporos-------------------------------------------- 33
4.1.2 Padrão do fluxo de H
+
e o papel das ATPases em hifas esporofíticas ---- 33
4.1.3 Efeitos de fosfato e sacarose sobre o fluxo de H
+
de hifas laterais--------- 38
4.1.4 Relação entre morfogênese de hifas, crescimento e comportamento do
fluxo de H
+
em função do fosfato e sacarose.------------------------------------------- 38
4.2 Análises durante a fase Pré-simbiótica------------------------------------------------- 43
4.2.1 Efeitos do fluido apoplástico de raiz hospedeira sobre o fluxo de H
+
das
hifas esporofíticas ------------------------------------------------------------------------------ 43
4.2.2 Atividades fosfohidrolásicas presentes no fluido apoplástico de raízes de
trevo------------------------------------------------------------------------------------------------ 45
4.3 Análises durante a fase simbiótica------------------------------------------------------- 47
4.3.1 Caracterização do fluxo de H
+
em células auxiliares e hifas extra-
radiculares de G. margarita colonizando raízes transgênicas de trevo ----------- 47
4.3.2 Viabilidade do uso de raízes transgênicas para expressar o real fluxo de
H
+
em sistemas não-transgênicos e para o estudo da simbiose micorrízica ---- 48
ix
4.3.3 Influência da micorrização sobre a atividade das bombas de prótons em
regiões colonizadas ou não do sistema radicular de milho -------------------------- 52
5. DISCUSSÃO-------------------------------------------------------------------------------- 61
5.1 Perfil do fluxo de H
+
em azigosporos e hifas esporofíticas ------------------------ 61
5.2 Efeito de inibidores das ATPases do tipo P sobre o fluxo de H
+
----------------- 63
5.3 Análise morfológica-------------------------------------------------------------------------- 66
5.4 Efeitos de P
i
e Sac no fluxo de H
+
e na morfologia das hifas --------------------- 67
5.5 Efeito do fluido apoplástico de raiz (FAR) sobre o fluxo de H
+
de hifas
esporofíticas---------------------------------------------------------------------------------------- 70
5.6 Caracterização inicial de enzimas presentes no fluido apoplástico de raízes de
trevo -------------------------------------------------------------------------------------------------- 73
5.7 Modulação da atividade das bombas de prótons em regiões distintas do
sistema radicular pela colonização micorrízica -------------------------------------------- 76
5.8 Plasmodesmas: Interação célula-célula entre fungos micorrízicos arbusculares
e raízes de plantas hospedeiras--------------------------------------------------------------- 79
6. CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------------------------- 81
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS -------------------------------------------------- 83
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Classificação taxonômica dos fungos micorrízicos arbusculares (Fonte:
http://invam.caf.wvu.edu/myc_info/taxonomy/phyl)..................................................5
Figura 2. A, Esquema da estrutura de um arbúsculo em uma célula cortical
vegetal e a formação das interfaces de troca. O espaço entre a membrana peri-
arbuscular e a parede do arbúsculo é chamado de interface arbuscular ou espaço
apoplástico. Círculos vermelhos representam a localização das H
+
-ATPases da
membrana peri-arbuscular e os triângulos verdes as H
+
-ATPases do FMA. B,
Esquema do transporte bi-direcional de nutrientes na interface arbuscular,
enfatizando os transportes primários e secundários em células de plantas e
fungos. As H
+
-ATPase de membrana plasmática do fungo e da planta são
responsáveis pela extrusão unidirecional de íons H
+
às expensas da quebra da
molécula de ATP (Transporte primário de H
+
). Assim, o gradiente eletroquímico
gerado pelas ATPases impulsionam o transporte de P
i
, Sacarose (Sac), Glicose
(Gli), Frutose (Fru) e outros nutrientes (por exemplo Nitrato e aminoácidos) via
transportadores de membrana (transporte secundário). Fósforo inorgânico (P
i
)
absorvido do solo pelas hifas extraradiculares são convertidos em grânulos de
polifosfato para serem transportados e próximo a membrana do arbúsculo são
convertidos em P
i
novamente e transportados para a interface arbuscular, onde se
ligam aos H
+
para serem transportados para as células corticais da planta
hospedeira. O gradiente de H
+
criado, ativa a abertura de canais de K
+
em ambas
membranas. Em troca, a planta repassa sacarose fotossintetizada à interface
arbuscular, sofrendo degradação pela atividade de invertases e convertida em Gli
e Fru que são transportadas para as células do FMA e posteriormente atingindo
as rotas metabólicas para a síntese de lipídeos ou glicogênio. O excesso de
sacarose nas células da planta pode ser re-utilizado o metabolismo novamente...9
Figura 3. Modelos estruturais da P-H
+
-ATPase (A) adaptado de Portillo (2000); V-
H
+
-ATPase (B) adaptado de Forgac (1999); e V-H
+
-PPase (C) adaptado de
Maeshima (2000). As P-H
+
-ATPase possui 10 domínios transmembrana e a V-H
+
-
PPase possui 14 (números). A V-H
+
-ATPase é uma proteínas com várias
xi
subunidades (letras maiúsculas e minúsculas) e não possui domínios
transmembrana como as anteriores. ......................................................................12
Figura 4. Curva de calibração da microssonda vibrátil seletiva ao H
+
antes (■) e
após (ο) a adição de 20 µL do fluido apoplástico de raízes de trevo.....................27
Figura 5. Determinação do fluxo de H
+
em esporos de G. margarita usando uma
microssonda vibrátil seletiva a H
+
. (A) Micrografia de um azigosporo ativo. As
setas indicam a direção do fluxo de H
+
em cada região do esporo. (B)
Representação gráfica dos valores médios dos fluxos de H
+
medidos em 8 locais
diferentes (0-7) ao redor do esporo, antes (barras claras) e após (barras escuras)
a germinação (n=6). O local 4 representa a região de emissão de tubos
germinativos exibindo superiores efluxos de H
+
(setas amarelas) e na região
oposta à de germinação predominando influxos (setas brancas). Barras
representam o desvio padrão da média no intervalo de confiança de 95%. .........34
Figura 6. Fluxo de H
+
ao longo de hifas laterais. (A) Representação gráfica típica
dos dados exportados do programa ASET. Setas indicam as distâncias de
posicionamento da sonda a partir do ápice das hifas de G. margarita (n=10). O
eixo “X” representa os intervalos de tempo (min) durante as medições de cada
ponto analisado. (B) Fluxo de H
+
medidos na presença de 5 µM de ortovanadato,
um inibidor específico das H
+
-ATPases de membrana plasmática. Os valores
negativos correspondem aos influxos de H
+
, e positivos aos efluxos. Linhas cinzas
no fim das curvas A e B representam as referências do fluxo de H
+
no meio de
cultura. (C) Imagem obtida por microscopia do tipo DIC (ampliação 60X)
mostrando marcações escuras ou grânulos densos (*) e algumas vesículas
localizadas no ápice da hifa. As pontas de setas indicam o posicionamento da
sonda e os números descrevem as distâncias do ápice da hifa (µm). ..................37
Figura 7. Perfil do fluxo de H
+
ao longo de hifas G. margarita, na presença
(quadrados claros) ou ausência (quadrados escuros) de eritrosina B e sua
semelhança com o pH citossólico (pHc), descrito por Jolicoeur et al. (1998),
analisado sob condições semelhantes às usadas neste experimento (linha
pontilhada representa os dados plotados de Jolicouer et al., 1998). Os maiores
efluxos de H
+
foram encontrados na faixa entre 10 e 20 µm, coincidindo com a
área de maior inibição pela eritrosina B e com os valores de pHc mais alcalinos. A
área pontilhada descreve as regiões mais suscetíveis a eritrosina B....................37
Figura 8. Efeitos de P
i
e Sac sobre os fluxos de H
+
de hifas. (A) Valor médio de
efluxos de H
+
em diferentes faixas ao longo de hifas de G. margarita crescendo
em meio com fosfato e suplementado (+Sac) ou não (-Sac) com sacarose (n=7).
(B) Perfil do fluxo de H
+
em meio sem fosfato sob as mesmas condições de
sacarose citadas acima (n=6). Barras representam o desvio padrão da média no
intervalo de confiança de 95%................................................................................39
Figura 9. Efeitos da disponibilidade de fosfato e sacarose sobre a septação,
ramificação, números de tubos germinativos e velocidade de crescimento das
hifas. (A) Representação gráfica dos parâmetros morfológicos calculados de
observações em lupa estereoscópica de pelo menos seis esporos germinados
para cada condição. “a”, visualização gráfica da velocidade de crescimento de
hifas de G. margarita em função do status nutricional. (B) Esquemas plotados
xii
sobre imagens de esporos germinados em condições diferentes de P
i
e Sac
representando o crescimento das hifas no meio M. As taxas de crescimento das
hifas foram medidas coletando-se imagens de 15 em 15 seg, num intervalo de 30
min, obtendo-se um time-lapse. As velocidades de crescimento das hifas foram
medidas usando o software MetaMorph versão 4.55 (Imaging Universal, Chester
Ocidental, PA). Os dados coletados foram exportados ao Microsoft Excel 9.0 para
as análises. Barras representam o desvio padrão da média no intervalo de
confiança de 95%....................................................................................................40
Figura 10. Representação esquemática do fluxo de H
+
relacionado ao
desenvolvimento assimbiótico do FMA G. margarita. O comprimento das setas
(escalas indicadas na figura) é representativo da magnitude do fluxo em cada
posição da sonda. Efluxos de H
+
são representados por setas de amarelas e
influxos por setas brancas. Os quadros superiores ilustram as estruturas fúngicas
analisadas: Hifas laterais septadas (A) ou não (B); (C) segmento de um tubo
germinativo apresentando três sítios de emergência de hifas, caracterizado por
efluxo de H
+
nos ápices. .........................................................................................42
Figura 11. Efeito da adição de fluido apoplástico de raízes (FAR) transgênicas de
trevo sobre o fluxo de H
+
de hifas laterais de Gigaspora margarita, crescendo em
meio M com ou sem 35 µM P
i
. 10 FAR e 20 FAR representam respectivamente as
doses de 10 e 20 µL de fluido apoplástico aplicadas. Inicialmente foi determinado
o fluxo de H
+
nas hifas laterais (controle) e posteriormente adicionou-se 10 µL de
FAR, aguardou-se 10 minutos e reiniciou-se as análises. O mesmo foi realizado
para a dose de 20 µL. Barras representam o desvio padrão da média no intervalo
de confiança de 95%. .............................................................................................44
Figura 12. Efeito da adição de fluido apoplástico de raízes trevo aquecido (95°C/ 5
min), sobre o fluxo de H
+
de hifas esporofíticas. O controle é representado pelas
colunas brancas e o tratamento com FAR aquecido pelas colunas pretas. Barras
representam o desvio padrão da média no intervalo de confiança de 95%. .........45
Figura 13. Caracterização da atividade de fosfohidrolases presentes no fluido
apoplástico de raízes transgênicas de trevo (Trifolium repens L.) crescendo em
meio M. Os valores expressam a média das atividades de hidrólise dos substratos
(n=3): adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), pirofosfato (PP
i
) e
polifosfato (PolyP)...................................................................................................46
Figura 14. Efeito do pH sobre a atividade de fosfohidrolases presentes no fluido
apoplástico de raízes transgênicas de trevo (Trifolium repens L.) crescendo em
meio M. Os valores expressam a atividade específica de hidrólise dos substratos:
adenosina 5`trifosfato (ATP), adenosina 5`difosfato (ADP), pirofosfato (PP
i
) e
polifosfato (PolyP). Barras representam o desvio padrão da média no intervalo de
confiança de 95% (n=3)..........................................................................................46
Figura 15. Visão de uma célula auxiliar do FMA G. margarita durante a sua fase
simbiótica colonizando raízes transgênicas de trevo, ilustrando a presença de
efluxos de H
+
(setas pretas) dependente da atividade de H
+
-ATPases. Isto foi
comprovado pela adição de 5 µm de eritrosina B, a qual neutralizou
completamente as atividades de efluxos................................................................48
xiii
Figura 16. Visualização do desenvolvimento de raízes secundárias transgênicas
de trevo em cultura axênica. A- Coifa (C), Meristemática (Me), Alongamento (Al);
B- Pêlos Radiculares (PR); C- Diferenciada (Dif) aos 30 dias após a multiplicação.
................................................................................................................................50
Figura 17. Similaridade no perfil do fluxo de H
+
durante as fases iniciais do
desenvolvimento de raízes secundárias de Medicago truncatula (A), Eucaliptus
globulus (B) e raízes transgênicas de Trifolium repens (C). C (Coifa), Me
(Meristemática), Al (Alongamento), PR (Pêlos Radiculares), Dif (Diferenciada)
referem-se as regiões ao longo do sistema radicular analisadas e REF é o valor
de fluxo de H
+
usado como referência baseado no meio de cultura......................51
Figura 18. Fotos obtidas com uma lupa estereoscópica no aumento de 10X
evidenciando as estruturas externas de G. margarita colonizando raízes
transgênicas de Trevo (Trifolium repens L). As setas indicam as células auxiliares
e as pontas de setas, hifas infectivas septadas (A, D) e ramificadas na superfície
radicular. .................................................................................................................52
Figura 19. Taxa de colonização micorrízica (%) de duas regiões do sistema
radicular de plantas de milho, aos 30 e 60 d.a.i.. Médias seguidas de mesma letra
não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As colunas com
letras maiúsculas comparam as médias entre as épocas analisadas e as com
minúsculas comparam as médias numa mesma época.........................................53
Figura 20. Atividade ATPásica de membrana plasmática sensível a vanadato (∆
Vanadato), aos 30 e 60 d.a.i., em duas regiões do sistema radicular de plantas de
milho não-inoculadas (C) ou inoculadas com Gigaspora margarita (Gm). Médias
seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade. As barras com letras maiúsculas comparam as médias entre
tratamentos, numa mesma região da raiz e as com letras minúsculas comparam
médias entre as regiões da raiz, num mesmo tratamento. ....................................55
Figura 21. Atividade ATPásica vacuolar sensível a nitrato (∆ Nitrato), aos 30 e 60
d.a.i., em duas regiões do sistema radicular de plantas de milho não-inoculadas
(C) ou inoculadas com Gigaspora margarita (Gm). Médias seguidas de mesma
letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As barras com
letras maiúsculas comparam as médias entre tratamentos, numa mesma região
da raiz e as com letras minúsculas comparam médias entre as regiões da raiz,
num mesmo tratamento. .........................................................................................56
Figura 22. Atividade PPásica vacuolar sensível a potássio (∆ Potássio), aos 30 e
60 d.a.i., em duas regiões do sistema radicular de plantas de milho não-
inoculadas (C) ou inoculadas com Gigaspora margarita (Gm). Médias seguidas de
mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As
barras com letras maiúsculas comparam as médias entre tratamentos numa
mesma região da raiz e as com letras minúsculas comparam médias entre as
regiões da raiz, num mesmo tratamento. ...............................................................57
Figura 23. Fotomicrografia de secção transversal de raízes de milho UENF 506-6
colonizadas por G. margarita. A, Visão geral mostrando a colonização do
parênquima cortical por hifas e arbúsculos (setas), aumento de 560x. B, Detalhe
xiv
da colonização de células do parênquima cortical por estruturas infectivas do
fungo micorrízico, exibindo células hipertróficas, aumento de 790X. ....................58
Figura 24. Eletromicrografia de transmisão de detalhe de uma célula do
parênquima cortical exibindo estruturas vesiculares no espaço periplasmático (ep)
localizado entre a parede celular (pc) e a membrana plasmática (mp) em contato
com uma hifa intercelular (h) de G. margarita. .......................................................59
Figura 25. Eletromicrografia de transmisão de detalhe da junção entre a
endoderme (e) e uma célula do parênquima cortical. Notar comunicação
simplástica por meio de plasmodesmas (Seta) entre as células em um sítio de
degradação da parede celular por hifas infectivas.................................................60
Figura 26. Efeito da adição de 10 e 20 µL do fluido apoplástico de raízes (FAR) de
trevo sobre o pH do meio de medição dos fluxos de H
+
em hifas de Gigaspora
margarita, usando uma microssonda vibrátil seletiva ao H
+
. A adição do FAR não
afetou o pH do meio de referência em ambas doses utilizadas. As barras
representam o desvio padrão da média no intervalo de confiança de 95% (n=5).71
Figura 27. Resumo geral descrevendo as regiões do sistema radicular de plantas
de milho inoculadas com G. margarita, com suas respectivas estimulações () ou
inibições () na atividade das bombas de prótons. ................................................79
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1. Composição dos diferentes meios de cultivos das raízes transgênicas
de trevo (Trifolium repens). Após o preparo o pH foi ajustado para 5,7 e
posteriormente autoclavados por 15 minutos.........................................................23
Quadro 2. Concentração dos nutrientes nos diferentes meios de cultivos das
raízes transgênicas de trevo (Trifolium repens) .....................................................24
Quadro 3. Solução nutritiva aplicada nas plantas de milho inoculadas ou não com
FMAs (Snowball e Robson, 1984 – citado por Brundrett et al., 1994) e
concentrações finais dos macronutrientes .............................................................32
Tabela 1. Fluxo de H
+
médios e os seus respectivos erros padrões, em hifas
septadas de Gigaspora margarita durante as fases assimbiótica e simbiótica
(colonizando raízes transgênicas de trevo). Cada posição da sonda representa
uma região da hifa analisada (esporofítica ou extra-radicular) como demonstrado
abaixo. *, significativo e
ns
, não significativo a 1% de probabilidade......................49
Tabela 2. Porcentagem de inibição (-) ou estimulação (+) das atividades
Vanadato-dependente da H
+
-ATPase de membrana plasmática (P-ATPase),
Nitrato-dependente da H
+
-ATPase vacuolar (V-ATPase) e Potássio-dependente
da H
+
-PPase vacuolar (V-PPase) em membranas purificadas isoladas de duas
regiões (A, B) do sistema radicular de milho, inoculado com Gigaspora margarita.
Os dados das atividades enzimáticas são expressos em porcentagem do controle
não-inoculado..........................................................................................................54
Tabela 3. Porcentagem de estimulação (%) do efluxo de H
+
em hifas de G.
margarita após adição de duas doses de fluido apoplástico de raízes (RAF) e em
função do status de P
i
que o FMA se desenvolveu................................................71
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
λ
Comprimento de onda
ADP Adenosina 5'-difosfato
ATP Adenosina 5'-trifosfato
C Controle (tratamento não inoculado)
Gm Gigaspora margarita (tratamento inoculado)
H
+
Prótons
FAR Fluido apoplástico de raízes
d.a.i. Dias após a inoculação
EDTA Ácido etileno-diamino tetracético
FMA Fungo micorrízico arbuscular
P-H
+
-ATPase ou P-ATPase Próton ATPase de membrana plasmática
V-H
+
-PPase Próton pirofosfatase vacuolar
V-ATPase ou V-ATPase Próton ATPase vacuolar
µm
micrômetros
nm nanômetros
P
i
Fosfato inorgânico
PP
i
Pirofosfato inorgânico
PoliP ou PolyP Polifosfato inorgânico
Sac Sacarose
MOPS Ácido 3-(N-morfino) propano sulfônico
TCA Ácido tricloroacético
Tris Tris-(hidroximetil) aminometano
RESUMO
RAMOS, Alessandro C. DS- Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, Junho de 2005. PAPEL DA DINÂMICA DO FLUXO DE PRÓTONS NA
SINALIZAÇÃO DAS DIFERENTES FASES DA INTERAÇÃO MICORRÍZICA
ARBUSCULAR. Orientador: Prof. Arnoldo Rocha Façanha; Co-orientador: José
Alberto Feijó.
Evidências mostraram que alguns sinais externos e outros endógenos podem
desencadear uma ativação diferencial dos fluxos de H
+
através das membranas
biológicas, como uma das primeiras respostas das células de plantas e fungos.
Neste trabalho, o fluxo líquido de H
+
, ao longo de hifas do fungo micorrízico
arbuscular Gigaspora margarita, foi determinado durante o seu crescimento
assimbiótico usando a técnica da microssonda vibrátil seletiva a H
+
. Um padrão foi
observado, o qual continha domínios específicos de ativação do fluxo de H
+
possivelmente desempenhando um papel na organização do crescimento celular
apical, e na ramificação e emergência de hifas. Posteriormente, constatou-se que
a ativação dos efluxos de H
+
e a morfogênese da hifa mostraram ser sensíveis à
disponibilidade de fósforo inorgânico (P
i
) e sacarose (Sac) no meio de
crescimento. A exclusão de P
i
do meio promoveu aumentos significativos nos
efluxos de H
+
localizados, principalmente, na região sub-apical da hifa. Em meio
de cultivo sem Sac, foi também observado aumento nos efluxos de H
+
quando
comparado com hifas crescendo em meio completo. A adição de ambos,
xviii
vanadato ou eritrosina B, inibidores das H
+
-ATPases do tipo P, aboliu a maioria
dos efluxos em todas as condições analisadas. Porém, o efeito da eritrosina B foi
restrito, principalmente, ao ápice das hifas, enquanto vanadato inibiu
completamente o padrão global de efluxo de H
+
, mas exercendo um efeito menor
no ápice das hifas. O tratamento dos esporos com fluido apoplástico de raízes
(FAR) de trevo, uma planta micotrófica, aumentou fortemente o efluxo de H
+
na
região apical da hifa, independente do status de P
i
do fungo. Porém, nenhum
efeito do FAR foi observado quando este foi aquecido a 90°C, sugerindo que
substâncias termo-sensíveis presentes no FAR sejam responsáveis pela ativação
nos efluxo de H
+
. No desenvolvimento simbiótico, descrevemos originalmente a
presença de pequenos fluxos de H
+
nas células auxiliares, os quais foram inibidos
completamente por eritrosina B e as hifas extra-radiculares apresentaram efluxos
de H
+
superiores aos obtidos no desenvolvimento assimbiótico. Uma inibição da
atividade ATPásica do tipo P de raízes colonizadas com G. margarita ocorre nos
momentos iniciais, e a estimulação das PPases foi observada na mesma região
compreendendo as zonas apicais, meristemática e de elongamento. A análise por
microscopia eletrônica de transmissão, de células arbusculadas, mostrou que nos
momentos da penetração da hifa fúngica na parede celular, ocorreu a formação
de plasmodesmas. Acreditamos que a presença destas estruturas em células
colonizadas, possa contribuir no mecanismo de troca bi-direcional de nutrientes
na interação entre plantas e fungos micorrízicos arbusculares. Os dados deste
trabalho, sugerem que alterações espaço-temporais do fluxo de H
+
das hifas e
raízes colonizadas poderiam delinear uma sinalização por pH, nos momentos
iniciais do desenvolvimento assimbiótico, para reconhecimento e infecção no
hospedeiro, e na simbiose refletindo no grau de colonização.
Fonte financiadora: UENF, CAPES, CNPq e International Foundation for Science
(IFS)
ABSTRACT
RAMOS, Alessandro C. DS.- Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, June 2005. THE ROLE OF PROTON FLUX DYNAMICS IN THE
SIGNALING OF THE DIFFERENT PHASES OF ARBUSCULAR MYCORRHIZAL
INTERACTION. Supervisior: Prof. Arnoldo Rocha Façanha; Co-supervisior: José
Alberto Feijó.
Evidences have shown that some environmental and endogenous signals can
elicit a differential activation of membrane H
+
fluxes as one of the primary
responses of plant and fungal cells. In this work, the net flux of H
+
around hyphae
of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita during its asymbiotic
growth was determined using an H
+
-specific vibrating probe. A pattern was
observed which contained specific domains of H
+
flux activation that seems to play
an organizational role in the hyphal emergence, branching and apical cell growth.
Further, the activation of the H
+
effluxes and the hyphal morphogenesis were
shown to be sensitive to the inorganic phosphorus (P
i
) and sucrose (Suc) supply.
The exclusion of P
i
from the medium promoted the highest H
+
effluxes located
mainly at the hyphal subapical region. Likewise, in a medium without Suc, an
enhanced H
+
efflux was also observed when compared with hyphae grown in
complete nutrient medium. Addition of either vanadate or erythrosin B, P-type
ATPases inhibitors, abolished most of H
+
effluxes under all conditions analyzed.
However, the effect of erythrosin B was mainly restricted to the hyphal apex,
xx
whereas vanadate fully inhibited the overall pattern of H
+
efflux around hyphae, but
exerting a lesser effect on the hyphal tip. The treatment of spores with root
apoplastic fluid (RAF) of clover, a mycotrophic plant, strongly increased the H
+
efflux at the hyphal apical region, independently on fungal P
i
status supplied in the
M medium. However, no RAF effect was observed after RAF was heated at 90°C,
suggesting that a thermo-sensitive substance is responsible for the activation of
hyphal H
+
efflux. During symbiotic development, the H
+
efflux of auxiliary cells
were fully inhibited by erythrosin B, and extraradicular hyphae showed the H
+
efflux superior to
that of asymbiotic hyphae. An inhibition of P-type ATPase in roots
colonized with G. margarita occurred in the first moments, while there was
stimulation of PPase activity in the same region near to the apical, meristematic
and elongation zones. The transmission electron microscopy of the arbusculated
cells showed the plasmodesmata formation in the cell wal, right after, the fungal
penetration. We believe that the presence of these structures in colonized cells
may contribute to the bidirectional exchange mechanism during the interaction of
plants and arbuscular mycorrhizal fungi. Our data suggest that spatial and
temporal alterations in colonized roots and hyphal H
+
fluxes might delineate a pH
signaling for penetration and host recognition during symbiosis reflecting on the
intraradical fungal growth.
Supported by: UENF, CAPES, CNPq and International Foundation for Science
(IFS)
1. INTRODUÇÃO
As micorrizas arbusculares são associações simbióticas mutualistas
formadas entre fungos da ordem Glomales e raízes de aproximadamente 80%
das plantas vasculares terrestres (Smith e Read, 1997).
Nesta associação, a planta hospedeira supre o fungo com açúcares
derivados do processo de fotossíntese, e em troca, este aumenta a capacidade
da planta em absorver água e vários nutrientes do solo, principalmente fosfato
inorgânico (P
i
) (Smith e Gianinazzi-Pearson, 1988; Smith et al., 2003). Em
plantas, a sacarose (Sac) é a principal forma na qual o carbono fixado é
translocado através do floema para as raízes, mas, uma vez no apoplasto
radicular a Sac é hidrolisada por invertases exógenas produzindo hexoses para
utilização pelo fungo micorrízico arbuscular (FMA) (Shachar-Hill et al., 1995;
Smith and Smith, 1997). Durante esta simbiose, apenas a hifa intra-radicular
apresenta uma absorção de hexose, mas a absorção de glicose foi também
observada em tubos germinativos no estádio assimbiótico, embora os fungos
apresentem apenas um metabolismo basal (Pfeffer et al., 1999; Bago et al., 1999;
Bago et al., 2002). Por outro lado, foi relatado que altas concentrações de Sac
podem induzir efeitos negativos tanto para o desenvolvimento assimbiótico quanto
simbiótico (Mosse, 1959; Mugnier e Mosse, 1987). Do mesmo modo, altas
concentrações de P
i
na planta também podem inibir rapidamente a interação
micorrízica (Gianinazzi-Pearson e Gianinazzi, 1983). Então, P
i
e Sac, os principais
nutrientes trocados entre os simbiontes, também podem ser considerados como
2
importantes fatores que influenciam o crescimento de hifas e a interação
micorrízica arbuscular.
Até o momento, há apenas algumas evidências sobre a sinalização
durante os eventos iniciais da interação micorrízica, responsáveis pelo
reconhecimento e desenvolvimento das estruturas intra-radiculares dos FMAs.
Ayling et al. (2000) demonstraram uma hiper-polarização na membrana
plasmática de hifas de Gigaspora margarita em resposta a extrato de raiz
hospedeira, sugerindo que as fases iniciais da interação aconteçam via efeitos
diretos na membrana da hifa. Testes em condições axênicas com exsudatos
solúveis ou extratos de raízes hospedeiras altamente micotróficas, por exemplo,
Trifolium repens, mostraram estímulos significativos no crescimento e ramificação
de hifas (Graham, 1982; Carr et al., 1995; Gianinazzi-Pearson et al., 1989; Nair et
al., 1991). Já exsudatos radiculares extraídos de Lupinus spp, uma planta não
hospedeira, não induziram o crescimento pré-simbiótico das hifas de FMAs, ou
simplesmente inibiram (Oba et al., 2002). Desta forma, o estudo do fluido
apoplástico de raízes e de proteínas específicas nele contidas, como as apirases,
podem fornecer novas informações sobre os sinais que regulam o
desenvolvimento pré-simbiótico dos FMAs.
As apirases são enzimas envolvidas no catabolismo do ATP, e
conseqüentemente, na regulação do pool de ATP intra e extracelular. Quatro
genes codificando apirases em Medicago truncatula (Mtapy1 a 4) tiveram
aumentos significativos nos níveis de transcritos após a inoculação com rizóbio
(Cohn et al., 2001) e foi descrito que certas classes de apirases de apoplasto se
ligam a fatores Nod tendo a sua atividade estimulada (Day et al., 2000). Como as
micorrizas arbusculares e a interação leguminosas-rizóbio possuem rotas
sinalizadoras comuns (Gianinazzi-pearson, 1996, Harrison, 1999), acredita-se que
as apirases possam atuar similarmente na sinalização de ambas associações.
Recentes trabalhos demonstraram que níveis milimolares de ATP suprimem o
crescimento de raízes (Tang et al., 2003), bem como inibem a germinação de
grãos de pólen de Arabidopsis thaliana (Steinebrunner et al., 2003). Quando as
apirases são super-expressas, estes efeitos são minimizados (Tang et al., 2003),
e ocorre um aumento na absorção de P
i
(Thomas et al., 1999).
Neste trabalho, analisamos o perfil do fluxo de H
+
em hifas e azigosporos
de Gigaspora margarita Becker & Hall, durante os desenvolvimentos assimbiótico
3
e pré-simbiótico, usando uma microssonda vibrátil específica ao íon H
+
; e durante
o
desenvolvimento simbiótico, foi analisada a atividade das bombas de H
+
após
extração das proteínas membranares por centrifugação diferencial.
Este trabalho teve como objetivo responder questões fundamentais que
emergiram da hipótese inicial, “A dinâmica do fluxo de H
+
tem um papel crucial na
sinalização ocorrida nas fases da interação micorrízica arbuscular”; (i) Como as
oscilações no fluxo de H
+
das hifas de G. margarita podem influenciar as fases de
desenvolvimento deste FMA? (ii) Qual o efeito dos principais nutrientes trocados
na simbiose (P
i
e Sac) sobre a dinâmica dos fluxos de H
+
e o desenvolvimento de
hifas esporofíticas? (iii) Quais os efeitos de fatores radiculares sobre o fluxo de H
+
de hifas esporofíticas? (iv) Qual a participação das bombas de H
+
dos FMA e das
plantas no controle do fluxo de H
+
e desenvolvimento da interação micorrízica?
Existiria uma regulação espacial e temporal das bombas durante a micorrização?
(v) Existiriam mudanças estruturais específicas relacionadas ao estabelecimento
da interação micorrízica arbuscular?
Os dados contidos neste trabalho de tese demonstram que os fluxos de
íons H
+
, em alguns domínios específicos das hifas esporofíticas, são influenciados
fortemente pela presença de P
i
, Sac, e fluido apoplástico de raiz, sendo que estes
efeitos parecem estar relacionados a uma ativação diferencial das H
+
-ATPases e
de transportadores da membrana plasmática fúngica.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A associação micorrízica arbuscular
Os primeiros estudos descrevendo a associação micorrízica são datados
de 1840, mas somente em 1885 o termo micorrizas foi inicialmente proposto pelo
botânico alemão Albert Bernard Frank que denominou de micorriza (do grego,
mykes = fungo e rhiza = raiz) a associação simbiótica mutualista entre raízes de
plantas e fungos específicos do solo. O termo simbiose foi introduzido por Anton
de Bary em 1879, que se refere a organismos “vivendo juntos” e neste sentido
amplo, engloba situações que variam do parasitismo ao mutualismo (Harrison,
1998).
Dentre as simbioses que ocorrem entre plantas e microrganismos, a
formação de micorrizas é a mais comum, especialmente as denominadas
micorrizas arbusculares. Os fungos desta associação são pertencentes a ordem
Glomales e agrupam-se em 7 gêneros, com aproximadamente 160 espécies
descritas (Figura 1; fonte: Invam, 2004). Dentre os grupos de plantas, as
micorrizas arbusculares ocorrem em 83% das dicotiledôneas, 79% das
monocotiledôneas e praticamente em todas as gimnospermas (Wilcox, 1991).
Estudos com observações de fósseis de plantas da era Devoniana
sugerem que a micorriza arbuscular existem à aproximadamente 400 milhões de
anos, sendo considerada como um fator crítico na colonização da terra pelas
5
plantas (Pirozynski e Dalpée, 1989; Remy et al., 1994), demonstrando a
importância das micorrizas na sobrevivência e evolução das plantas.
GLOMACEAE
GigasporaEntrophospora Acaulospora ScutellosporaGlomus
ACAULOSPORACEAE GIGASPORACEAE
PARAGLOMACEAE
Paraglomus
Archaeospora
ARCHAEOSPORACEAE
GLOMINEAE GIGASPORINEAE
GLOMALES
Figura 1- Classificação taxonômica dos fungos micorrízicos arbusculares (Fonte:
http://invam.caf.wvu.edu/myc_info/taxonomy/phyl)
A maioria das plantas vasculares depende em níveis variados dos FMAs
para melhoria de sua condição nutricional. As espécies que só crescem na
presença da simbiose micorrízica são chamadas micotróficas obrigatórias. Por
outro lado, as micotróficas facultativas crescem bem em solos férteis sem a
presença da associação e em solos pobres em nutrientes são favorecidas pelos
fungos. O aumento na produtividade de várias culturas, foi relacionado com a
colonização das suas raízes com FMAs, incluindo milho (Sylvia et al., 1993),
sorgo (Raju, 1990), soja (Cardoso, 1985; Bethlenfalvay, 1988; Nogueira e
Cardoso, 2000) e tomate (Benabdellah, 1999).
Na simbiose micorrízica arbuscular, a interação tem início quando a hifa
do fungo surgindo dos esporos ou de raízes adjacentes colonizadas, entra em
contato com a superfície da raiz e se diferencia para formar o apressório, o qual é
a via de penetração na raiz. Uma vez dentro da raiz, o fungo pode crescer
intercelularmente ao longo do córtex, mas não invade a região meristemática e o
tecido vascular (Smith e Smith, 1997). Embora a hifa fúngica penetre na parede
6
celular das células (Harrison, 1998; Harrison, 1999), ela não penetra na
membrana plasmática da planta, a qual se estende para circundar os arbúsculos
(Gianinazzi-Pearson, 1996; Smith e Smith, 1997). Com o crescimento interno na
raiz, o fungo ainda mantém o micélio externo que se ramifica no solo. A hifa
externa absorve nutrientes e os transporta para estruturas internas, sendo
posteriormente liberados na raiz da planta hospedeira (Siqueira e Franco, 1988;
Gianinazzi-Pearson, 1996; Harrison, 1998).
Quanto aos vários benefícios conferidos à planta hospedeira pela
micorrização, considera-se que o principal é o aumento na absorção e
translocação de fósforo em solos de baixa fertilidade (Cardoso, 1985; Mcarthur e
Knowles, 1993), além de outros nutrientes como nitrogênio, enxofre, zinco e cobre
(Cooper, 1984; Marschner e Dell, 1994; Nogueira e Cardoso, 2003). Outros
benefícios também são relatados, tais como maior absorção de água e
conseqüente tolerância ao stress hídrico (Sylvia e Jarstfer, 1992; Sylvia et al.,
1993), aumento da taxa fotossintética, maior crescimento das plantas (Sánchez-
Dias et al., 1990), maior resistência a doenças (Newsham et al., 1995), produção
de fitormônios (Dannenberg et al., 1992), melhor estruturação do solo e
conseqüente melhor crescimento do sistema radicular (Bethlenfalvay e Barea,
1994).
Os efeitos do fósforo na micorrização são estudados há muito tempo, e
sabe-se que ele atua no estabelecimento e regulação da simbiose e também na
distribuição e composição de espécies nos solos (Lambais e Cardoso, 1990;
Antunes e Cardoso, 1991; Sylvia, 1999). Em geral, solos com baixa disponibilidade
de P
i
são favoráveis a micorrização, condição onde a planta pode obter o maior
benefício desta simbiose. Níveis elevados de P
i
são inibitórios ao estabelecimento
da simbiose e a efetividade simbiótica pode não se expressar adequadamente se a
concentração de P
i
na solução do solo for elevada (Abott et al., 1984; Antunes e
Cardoso, 1991). Os mecanismos que regulam a colonização do fungo em função
dos níveis de P
i
intra e extracelular ainda não foram elucidados.
Ainda é controverso o real mecanismo de inibição da colonização
micorrízica pela disponibilidade de P
i
. Woolhouse (1975) propôs que lectinas
presentes nas raízes poderiam inibir o crescimento de fungos. As fosfatases de
expressão intra e extracelular funcionam como uma resposta comum da planta à
deficiência de P
i
(Fries et al., 1998). Segundo Woolhouse (1975), as plantas ao
7
induzirem a expressão de fosfatases nas raízes neutralizariam as lectinas,
possivelmente, através de associação direta com essas proteínas, permitindo
assim, a invasão e o crescimento do fungo no córtex radicular. O próprio fungo
também poderia atuar ativamente neste processo, já que elevada atividade
fosfatásica tem sido evidenciada no vacúolo de hifas terminais de FMAs (Tisserant
et al., 1993). Um segundo mecanismo, proposto por Ratnayake et al. (1978),
baseia-se no fato da permeabilidade das membranas das células radiculares poder
ser influenciada pela maior ou menor absorção de P
i
. A alta absorção de P
i
pela
planta favoreceria a biossíntese de fosfolipídeos que, por serem constituintes das
membranas, reduziriam sua permeabilidade e por conseqüência, a exsudação de
açúcares e aminoácidos na rizosfera, diminuindo a atividade dos propágulos
(germinação e crescimento micelial), e finalmente, a penetração e a colonização
radicular (Graham et al., 1981; Schwab et al., 1983). Também postula-se que um
aumento da disponibilidade de P
i
no solo e, por conseguinte, de sua absorção e
translocação na planta, promova um estímulo da taxa fotossintética, aumentando a
exportação de triose-fosfato do cloroplasto para o citossol, onde a sacarose é
sintetizada, podendo ser acumulada no vacúolo ou translocada para as raízes via
floema. Concentrações elevadas de sacarose nas raízes coincidem com uma baixa
taxa de colonização micorrízica (Siqueira e Franco, 1988; Fernándes et al., 1997).
Ao contrário do que foi observado por Fernándes et al. (1997) e citado por
Siqueira e Franco (1988), plantas de soja inoculadas com Glomus fasciculatum
crescendo sob altas concentrações de P
i
apresentaram reduzidos teores de
sacarose, amido e açúcares redutores, comparados ao controle em ambos folha e
raízes (Packovsky, 1989). Por outro lado, Syvertsen e Graham (1999) não
encontraram diferenças no teor de amido sob alto P
i
, em ambas folha e raiz. Em
plantas de Citrus, baixos teores de sacarose foram encontrados em raízes
micorrizadas (Graham et al., 1997). Já o aumento no status de P
i
na planta,
crescendo sob alto P
i
, também foi associado com o decréscimo no conteúdo de
carboidratos solúveis nas raízes micorrizadas (Graham et al., 1981). Em termos de
enzimas sacarolíticas, a atividades da sacarose sintase e de invertases são
estimuladas pela colonização micorrízica, e a análise molecular mostrou que genes
da sacarose sintase mostraram ser super-expressos em raízes de milho
micorrizadas sob baixo P
i
e suprimidos em condições de alto P
i
(Ravnskov et al.,
2003).
8
A controvérsia na literatura é se a concentração de P
i
no solo estaria
inibindo a micorrização mais pela falta de açúcares solúveis no ambiente radicular
(Graham et al., 1981; Packovsky, 1989; Graham et al., 1997; Syvertsen e Graham,
1999), excesso (Siqueira e Franco, 1988; Fernándes et al., 1997) ou pelo
incremento na atividade de enzimas específicas de defesa, como quitinases, sob
alto P
i
(Lambais e Mehdy, 1995; Lambais e Mehdy, 1996).
2.2 Interfaces simbióticas nas micorrizas arbusculares
A colonização das raízes pelos fungos micorrízicos arbusculares (FMAs)
inicia uma cascata de eventos celulares e moleculares, os quais levam a uma
integração morfo-funcional entre as células de plantas e fungos. Diferentes tipos
de interfaces podem ser criados durante a interação micorrízica arbuscular sendo
dependente do modo pelo qual o fungo penetra ou não na célula hospedeira. As
interfaces intercelulares são formadas por hifas crescendo entre as células do
córtex radicular, e as intracelulares quando a hifa intercelular penetra na parede
celular da célula hospedeira e se desenvolve dentro da mesma, formando
estruturas tais como “coils” e arbúsculos. Esta denominação “intracelular” requer
um novo ajuste conceitual, uma vez que na associação simbiótica não ocorre o
rompimento da membrana plasmática da planta, que é um evento característico
de interações parasíticas.
Com a penetração da hifa fúngica na célula cortical hospedeira, uma nova
membrana plasmática da planta é sintetizada, extendendo-se ao longo da
membrana plasmática original, sempre que o fungo está no apoplasto celular.
Quando a hifa intercelular nas camadas corticais mais internas diferencia-se em
arbúsculos, esta membrana plasmática do hospedeiro modificada, referida como
membrana peri-arbuscular, é separada da membrana do arbúsculo pela “interface
simbiótica” ou “interface arbuscular”, sendo este último no caso das micorrizas
arbusculares (Figura 2A). Os arbúsculos são considerados sítios-chaves na
formação da interface simbiótica e no movimento bi-direcional de carbono e
nutrientes orgânicos e inorgânicos.
9
Célula Cortical
Arbúsculo
Parede Celular
Membrana Plasmática
Membrana Peri-arbuscular
Parede do Arbúsculo
Membrana do Arbúsculo
A
Gli/
Fru
P
i
-
H
+
ATP
ADP+P
i
-
ATP
ADP+P
i
-
Sac
Gli/Fru
Gli/Fru
Glicogênio Lipídeos
Metabolismo
Polifosfato
P
i
-
P
i
-
K
+
K
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
Sac
invertases
H
+
H
+
H
+
H
+
K
+
PP
PP
PP
PP
PP
PP
PP
PP
PoliPases
Interface
arbuscular
Célula Cortical da Planta
Célula do Fungo Micorrízico
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
P
i
-
H
+
H
+
B
Gli/
Fru
P
i
-
H
+
ATP
ADP+P
i
-
ATP
ADP+P
i
-
Sac
Gli/Fru
Gli/Fru
Glicogênio Lipídeos
Metabolismo
Polifosfato
P
i
-
P
i
-
K
+
K
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
Sac
invertases
H
+
H
+
H
+
H
+
K
+
PP
PP
PP
PP
PP
PP
PP
PP
PoliPases
Interface
arbuscular
Célula Cortical da Planta
Célula do Fungo Micorrízico
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
P
i
-
H
+
H
+
P
i
-
H
+
H
+
B
Figura 2. A, Esquema da estrutura de um arbúsculo em uma célula cortical
vegetal e a formação das interfaces de troca. O espaço entre a membrana peri-
arbuscular e a parede do arbúsculo é chamado de interface arbuscular ou espaço
apoplástico. Círculos vermelhos representam a localização das H
+
-ATPases da
membrana peri-arbuscular e os triângulos verdes as H
+
-ATPases do FMA. B,
Esquema do transporte bi-direcional de nutrientes na interface arbuscular,
enfatizando os transportes primários e secundários em células de plantas e
fungos. As H
+
-ATPase de membrana plasmática do fungo e da planta são
responsáveis pela extrusão unidirecional de íons H
+
às expensas da quebra da
molécula de ATP (Transporte primário de H
+
). Assim, o gradiente eletroquímico
10
gerado pelas ATPases impulsionam o transporte de P
i
, Sacarose (Sac), Glicose
(Gli), Frutose (Fru) e outros nutrientes (por exemplo Nitrato e aminoácidos) via
transportadores de membrana (transporte secundário). Fósforo inorgânico (P
i
)
absorvido do solo pelas hifas extraradiculares são convertidos em grânulos de
polifosfato para serem transportados e próximo a membrana do arbúsculo são
convertidos em P
i
novamente e transportados para a interface arbuscular, onde
se ligam aos H
+
para serem transportados para as células corticais da planta
hospedeira. O gradiente de H
+
criado, ativa a abertura de canais de K
+
em ambas
membranas. Em troca, a planta repassa sacarose fotossintetizada à interface
arbuscular, sofrendo degradação pela atividade de invertases e convertida em Gli
e Fru que são transportadas para as células do FMA e posteriormente atingindo
as rotas metabólicas para a síntese de lipídeos ou glicogênio. O excesso de
sacarose nas células da planta pode ser re-utilizado o metabolismo novamente.
Toth et al. (1990) mostraram que a contribuição da interface arbuscular
em raízes de milho inoculadas com Glomus fasciculatum, podendo alcançar uma
área de 60.292 µm
2
. É suposto que a disponibilidade de carbono na interface
possa regular a localização, distribuição e função dos arbúsculos no córtex
radicular. Smith e Read (1997) sugerem que a presença de diferentes interfaces
(arbuscular e intercelular) possa conferir uma separação funcional e espacial dos
diferentes processos de transporte na simbiose micorrízica arbuscular. Deste
modo, as interfaces intercelulares e as arbusculares possuiriam a mesma
estrutura básica ao nível celular e bioquímico, predominando uma região
apoplástica separando as membranas de ambos simbiontes (Figura 2A). Embora
a composição e estrutura do apoplasto possam afetar os processos de absorção
e translocação de nutrientes entre os simbiontes, o movimento de nutrientes entre
estes pode ser controlado por ambos, mas as proteínas de membrana da planta
atuam mais eficientemente no controle da troca de solutos dentro e fora das
células colonizadas (Figura 2B).
2.3 Relação entre bombas de H
+
e o transporte de nutrientes na interação
micorrízica arbuscular
O vacúolo das plantas superiores é uma organela com acidez elevada
que ocupa grande parte da célula, com diâmetro entre 50 e 100 µm. O caráter
ácido no interior do vacúolo é mantido por duas bombas de H
+
distintas: H
+
-
ATPase (ATPase do tipo V ou V-H
+
-ATPase) e H
+
-PPase (V-H
+
-PPase). O
11
gradiente de H
+
gerado por estas bombas, energiza os transportadores ativos
secundários de íons inorgânicos, açúcares e ácidos orgânicos (Figura 3B, C)
(Taiz e Taiz, 1991, Futai et al.; 2000; Nishi e Forgac, 2002).
Já, Tanto em plantas quanto em fungos, a absorção de nutrientes ocorre,
principalmente, via transportadores específicos encontrados nas membranas de
células de raízes e hifas. Esses transportadores executam um transporte ativo de
macro e micronutrientes do solo para o interior da célula, geralmente contra um
gradiente de concentração (Morsomme e Boutry, 2000). Para tanto, os
transportadores secundários necessitam de um aporte de energia que é fornecido
pelos sistemas de transporte primário de prótons, constituídos essencialmente
pelas adenosina-5'-trifosfatases (H
+
-ATPases do tipo P).
As H
+
-ATPases são enzimas de membrana que acoplam à energia da
hidrólise de ATP à formação de um gradiente eletroquímico de H
+
através da
membrana (Figura 3A) (Sze, 1985; Serrano, 1985; Sze et al., 1999). A força
proton-motriz gerada é requerida pelos transportadores secundários para
energizar e regular o transporte de nutrientes para o interior das células de fungos
e plantas (Figura 2B), onde são acumulados em concentrações muito superiores
às disponíveis nos solos (Morsomme e Boutry, 2000). Outras funções das
bombas são justamente atuar na tolerância a salinidade, regulação do pH
citoplasmático (Serrano, 1989; Portillo e Serrano, 1989; Nathan e Willian, 1999;
Portillo, 2000) e na expansão celular (Rayle e Cleland, 1992)
A H
+
-ATPase de membrana plasmática da planta é codificada por uma
família multigênica. Doze genes foram identificados anteriormente em Arabidopsis
thaliana (Harper et al., 1994; Houlné e M. Boutry, 1994; Palmgreen, 2001). Nove
genes foram identificados em Nicotiana plumbaginifolia (Boutry et al., 1989;
Oufattole et al., 2000). Em tomate, foram identificados sete genes (Boutry et al.,
1989; Mito et al., 1996), e dois em Oryza sativa (Wada et al., 1992; Ookura et al.,
1994). Em fungos foram identificados dois genes em Saccharomyces cerevisiae
(Schlesser et al., 1988; Serrano et al., 1986), dois em Schizosaccharomyces
pombe (Ghislain e Goffeau, 1991) e cinco em Glomus mosseae (Ferrol at al.,
2000a). Dado os seus múltiplos papéis fisiológicos e o alto consumo de ATP pelas
H
+
-ATPases de membrana plasmática, é esperado que estas enzimas sejam
finamente reguladas. De fato, muitos dados já foram obtidos, os quais marcam as
propriedades regulatórias sobre a transcrição, tradução e níveis enzimáticos
12
(Morsomme e Boutry, 2000). Por exemplo, duas isoformas de H
+
-ATPase de S.
cereviseae estão sob controle transcricional (Ghislain e Goffeau, 1991) e
apresentam características bioquímicas diferenciadas (Suply et al., 1993).
1 2 4
5
8
9
10
3 6 7
NH
2
ATP
H
+
1 2 4
5
8
9
10
3 6 7
NH
2
ATP
H
+
A A
A
B
B
B
D
F
c
V
0
V
1
d
H
G
C
c’
a
E
c’’
A A
A
B
B
B
D
F
c
V
0
V
1
d
H
G
C
c’
a
E
c’’
NH
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
NH
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
B
C
A
1 2 4
5
8
9
10
3 6 7
NH
2
ATP
H
+
1 2 4
5
8
9
10
3 6 7
NH
2
ATP
H
+
A A
A
B
B
B
D
F
c
V
0
V
1
d
H
G
C
c’
a
E
c’’
A A
A
B
B
B
D
F
c
V
0
V
1
d
H
G
C
c’
a
E
c’’
NH
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
NH
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
B
C
A
Figura 3. Modelos estruturais da P-H
+
-ATPase (A) adaptado de Portillo (2000); V-
H
+
-ATPase (B) adaptado de Forgac (1999); e V-H
+
-PPase (C) adaptado de
Maeshima (2000). As P-H
+
-ATPase possui 10 domínios transmembrana e a V-H
+
-
PPase possui 14 (números). A V-H
+
-ATPase é uma proteínas com várias
13
subunidades (letras maiúsculas e minúsculas) e não possui domínios
transmembrana como as anteriores.
A diversidade de funções biológicas suportadas pelas H
+
-ATPases e a
multiplicidade de fatores que afetam a sua atividade fazem emergir a pergunta se
certas isoformas são especializadas para trabalhar sob condições ambientais
específicas ou em tipos de células específicos, tecidos ou órgãos. A expressão
diferencial das isoformas tem sido estudada por vários métodos, inclusive
imunodetecção, análise de Northern blot, hibridização in situ e técnicas de genes
repórteres.
Estudos imunológicos sugerem que a H
+
-ATPase se acumula em tecidos
particulares da planta ou em tipos de células como o ápice radicular, pêlos e
epiderme radicular, células-guardas e de transferência, e também em células do
estelo. Em alguns casos, foi observada distribuição assimétrica dentro da célula
(Parets-Soler et al., 1990; Jahn et al., 1998). Estes estudos apontaram os tipos de
células em que a expressão das H
+
-ATPases era alta, mas eles não distinguiram
entre as várias isoformas. A situação era diferente com a detecção in situ de
AHA3 (uma isoforma de H
+
-ATPase) marcado em Arabidopsis introduzido em
plantas transgênicas que possibilitaram a detecção específica desta isoforma em
células companheiras (De Witt e Sussman, 1995). Woolhouse (1975), em suas
especulações sobre o transporte de nutrientes na simbiose micorrízica, sugeriu
que o fosfato era liberado passivamente pela membrana plasmática do arbúsculo
dentro da interface apoplástica e então absorvido pelo hospedeiro pelos co-
transportadores localizados na membrana plasmática da planta, sendo estes
dependentes e mediados por mecanismos de transporte ativo (Figura 2B). Já no
que tange ao tráfego de açúcares, Woolhouse (1975) também propôs que os
carboidratos de uma forma similar ao fosfato, porém em direção contrária, são
liberados passivamente na interface apoplástica, através da membrana
plasmática célula vegetal, e então ativamente transportados para o interior das
células fúngicas pelos sistemas de co-transportadores (açúcar-H
+
) da membrana
do arbúsculo (Figura 2B). Atualmente, alguns trabalhos utilizando a técnica de
Ressonância Magnética Nuclear têm mostrado que a glicose, ao invés da frutose
e sacarose pode ser o carboidrato preferencial importado pelo fungo (Shachar-Hill
et al., 1995; Pfeffer et al., 1999).
14
Estudos citoquímicos das ATPases, foram realizados por Marx et al.
(1982) e Gianinazzi-Pearson et al. (1991). Eles demonstraram a presença de uma
forte marcação da atividade ATPásica na membrana peri-arbuscular, na
membrana plasmática de hifas extra-radiculares e intercelulares, e também na
base dos arbúsculos, no entanto, nas finas ramificações dos arbúsculos e nas
células adjacentes foram fracas ou ausentes. Estes resultados levaram os autores
a especular sobre uma participação ativa das hifas intercelulares nos processos
de absorção de carbono do apoplasto hospedeiro, sugerindo uma separação
espacial entre a transferência de P
i
e carbono na interface arbuscular (Figura 2B).
Estudos com sondas indicadoras de pH demonstraram que essa interface
consiste num compartimento altamente ácido (Guttenberger, 2000). Esta acidez
provavelmente resulta da atividade das H
+
-ATPases associadas às membranas, a
qual fornece a força para a absorção de fosfato e outros nutrientes pelas células
arbusculadas. Ao nível molecular, Murphy et al. (1997), isolaram um gene
homólogo à H
+
-ATPase que mostrou ser um regulador da atividade durante a fase
de estabelecimento da simbiose em plantas de cevada (Hordeum vulgare)
colonizadas por Glomus intraradices. Posteriormente, Gianinazzi-Pearson et al.
(2000) detectaram que a micorrização induziu atividade de promotores
relacionados a dois genes de H
+
-ATPases (pma2 e pma4) em células corticais de
raízes de tabaco contendo arbúsculos.
Ramos (2001) trabalhando com vesículas purificadas de membrana
plasmática isoladas de raízes de milho, inoculadas ou não com Glomus clarum ou
Gigaspora margarita, observou que nos eventos iniciais da interação micorrízica
(30 dias após a inoculação) ocorria inibição da atividade ATPásica específica. Já
no estabelecimento da colonização fúngica, as raízes colonizadas apresentaram
atividades enzimáticas superiores às encontradas no tratamento não inoculado e
foi dependente do FMA envolvido (Ramos, 2001). Analisando a atividade
ATPásica em frações microssomais, sob as mesmas condições do estudo acima,
uma ativação significativa foi encontrada em vesículas oriundas de raízes
colonizadas em todas épocas estudadas, desaparecendo a inibição encontrada
em frações purificadas de membrana plasmática (Ramos et al., 2005). Bago et al.
(1997), estudaram a atividade ATPásica de membrana plasmática de vesículas
microssomais em raízes micorrizadas de girassol (Helianthus annuus) e cebola
(Allium cepa), encontrando um decréscimo da atividade com o tempo, sendo este
15
maior em plantas não inoculadas. Segundo Benabdellah et al. (1999) respostas
de crescimento de plantas de tomate à colonização micorrízica, foram diferentes
dependendo do FMA envolvido. A porcentagem de colonização correlacionou-se
com a atividade ATPásica de membrana plasmática e plantas inoculadas com
Glomus mosseae tiveram maior atividade enzimática. O FMA poderia estar
atuando na regulação das ATPases, especificamente, aumentando a eficiência de
acoplamento entre hidrólise de ATP e transporte de H
+
. Porém, os mecanismos
envolvidos nesta regulação ainda permanecem desconhecidos. Recentemente,
complementando os estudos anteriores, Krajinski et al. (2002) revelaram a
presença de um gene de H
+
-ATPase tecido-específico em Medicago truncatula, o
qual é expresso apenas em células radiculares contendo arbúsculos e que não
ocorreu em outros tecidos.
2.4 As H
+
-ATPases de membrana plasmática dos fungos micorrízicos
arbusculares
Devido ao caráter biotrófico obrigatório dos FMAs, os avanços nos
estudos da regulação das bombas de prótons são escassos, principalmente nos
diferentes estádios do seu desenvolvimento. Um estudo citoquímico realizado por
Lei et al. (1991), durante a fase assimbiótica e pré-simbiótica, parece ser a
primeira descrição da presença de atividade de H
+
-ATPases nas hifas de FMAs.
Entretanto, o seu estudo com inibidor da enzima mostrou dúvida quanto à
presença da ATPase. Uma atividade ATPásica, segundo Lei et al. (1991), na
presença de exsudatos radiculares e CO
2
correlacionou-se positivamente com a
absorção de
32
P por tubos germinativos de Gigaspora margarita. Isto pode ser
relacionado aos estudos de Harrison e van Buuren (1995), que isolaram um gene
que codificava uma proteína transportadora de fosfato por sistema simporte de
alta afinidade, da hifa extra-radicular de Glomus vesiforme.
Em Glomus mosseae, há publicado cinco genes parcialmente clonados
codificando isoformas de H
+
-ATPases, e a sua caracterização molecular está em
andamento (Ferrol at al., 2000a). Segundo Ferrol et al. (2000a,b) em fungos
micorrízicos, como em outros fungos, a H
+
-ATPase de membrana plasmática é
codificada por uma família multigênica. O papel fisiológico destas ATPases no
desenvolvimento do fungo e da simbiose ainda não esta claro, apenas o
16
conhecimento mais aprofundado das interfaces simbióticas. O isolamento da
membrana peri-arbuscular e um estudo refinado do funcionamento e regulação
das proteínas transportadoras de açúcares e dos sistemas secundários de
transporte de H
+
, poderá comprovar se a hexose oriunda da planta hospedeira é
transferida ao fungo por um sistema ativo ou passivo. Harrison (1996) detectou
um aumento na expressão do gene codificando uma proteína transportadora de
monossacarídeos (Mtst1) em células corticais de raízes de Medicago truncatula
altamente colonizadas por Glomus mosseae. No fungo ectomicorrízico Amanita
muscaria, um transportador simporte monossacarídeo/H
+
, é provavelmente o
responsável pela absorção de hexose em ambos estádios de vida livre e
simbiótico (Wiese et al, 2000). Recentemente, foi descoberto que o açúcar
preferencial do fungo micorrízico não é a sacarose (Bago et al., 2002), mas sim, a
glicose. Isto é muito interessante, pois mostra que realmente as plantas são os
únicos organismos que translocam açúcar na forma de sacarose.
A análise da seqüência de fragmentos gênicos obtidos por PCR
identificaram 5 diferentes clones em Glomus mosseae (GmHA1, GmHA2,
GmHA3, GmHA4, GmHA5) codificando H
+
-ATPases de membrana (Ferrol et al.
2000a). Estes dados indicam que em fungos micorrízicos, como em outros
organismos, a H
+
-ATPase de membrana plasmática é codificada por uma família
multigênica. Hibridização por Southern Blot do DNA genômico de G. mosseae
com cada clone dos genes, obtidos por PCR, demonstrou que os cinco genes
representam, individualmente, um gene diferente de G. mosseae, e não de
contaminantes do esporo. A análise filogenética mostrou que GmHA5 em termos
de evolução é diferenciado dos demais genes (Ferrol et al., 2000b).
O papel fisiológico de duas isoformas (GmHA5 e GmPMA1) de H
+
-
ATPase de membrana plasmática durante as diferentes fases do desenvolvimento
da simbiose micorrízica foi estudado por Requena et al. (2003). Os autores
encontraram uma alta conservação do domínio catalítico das H
+
-ATPases de
membrana plasmática, e que GmPMA1 é altamente relacionado filogeneticamente
apenas ao GmHA5, e este a nenhum outro gene (GmHA1 – GmHA4). GmPMA1
foi mais expresso durante o desenvolvimento assimbiótico, sendo a sua
expressão não alterada quando o FMA entra em simbiose. Entretanto, GmHA5
teve uma alta acumulação de transcritos durante a fase de formação de
apressório. Em termos dos efeitos dos principais nutrientes envolvidos na
17
simbiose, a expressão de GmHA5 mostrou ser estimulada por fosfato e inibida por
sacarose (Requena et al., 2003).
2.5 A técnica da microssonda vibrátil e o crescimento celular polarizado
Com o advento da técnica da microssonda vibrátil seletiva à íon pode-se
estudar as oscilações transientes de um determinado íon sem danificar o material
de estudo. Em meados do século XX, foi realizada a primeira aplicação biológica
da microssonda vibrátil (Bluh e Scott, 1950), sendo posteriormente usada na
determinação de fluxos iônicos em músculos esqueléticos (Davies, 1966). O
sistema foi aprimorado quando foi acoplado um amplificador no aparelho (Jaffe e
Nucitelli, 1974). Isto fez com que a sensibilidade aumentasse fortemente,
resultando num método de medida das correntes extracelulares de baixa
magnitude na superfície de uma membrana biológica, sem causar qualquer dano
ao material em estudo, e ficou conhecida como “Wire-probe”, também chamada
de Vibrating voltage probe (em português, microssonda vibrátil sensível à
voltagem). A técnica forneceu um método prático de demonstrar as correntes
elétricas totais em diversos organismos e por um período fecundo de pesquisas
gerou diversos modelos sobre o papel das correntes elétricas em células vegetais
e animais. Um refinamento da técnica foi obtido com a adaptação de
microcomputadores e medidas bi-dimensionais (Shipley e Feijó, 1999).
Uma importante limitação da microssonda sensível a voltagem é a análise
do comportamento de um íon e a sua implicância nas correntes. Para isso é
necessário o uso de ensaios de substituição com a adição de inibidores
específicos da atividade de canais e bombas, para a determinação da
contribuição individual de um dado íon. Assim, uma melhoria na técnica foi a
utilização de ionóforos específicos na ponta das micropipetas, ao invés dos
originais eletrodos de metais. Esta técnica avançada é chamada de íon-selective
vibrating probe (em português, microssonda vibrátil seletiva a íon).
Resumidamente, este método foi desenvolvido para medir íons individuais que
carreiam uma corrente elétrica (como as medidas com wire-probe),
complementando as técnicas que medem correntes totais. A maioria das
aplicações biológica envolve estudos das dinâmicas de íons importantes tais
como prótons, cálcio ou potássio, devido a sua relevância nos processos
fisiológicos e de desenvolvimento.
18
O uso desta última técnica tem fornecido dados relevantes sobre o papel
do fluxo de íons ou das correntes elétricas de um determinado íon no crescimento
polarizado de raízes (Kochian et al., 1992; Felle, 1998, 2001), pêlos radiculares
(Cárdenas et al., 1999; 2000) e tubos polínicos (Feijó et al., 1999a; 2001; 2004;
Zonia et al., 2002).
O crescimento apical é o processo de crescimento celular predominante
em hifas fúngicas, tubos polínicos e pêlos radiculares de vegetais superiores.
Esse tipo de crescimento envolve a extensão polarizada da célula e distensão da
parede celular na região adjacente ao pólo de alongamento (Feijó et al., 2001).
Dado a importância deste processo, um crescente interesse tem surgido
no que se refere ao estudo de sua regulação e mecanismo de ação. Várias
evidências sugerem que gradientes iônicos intra e extracelulares, principalmente
de H
+
e Ca
2+
, são elementos chaves na regulação do crescimento polarizado em
células de fungos e plantas. Enquanto a influência do gradiente de pH externo
sobre o alongamento celular é amplamente aceita, a participação de um gradiente
de pH citoplasmático no processo é bem mais controversa (Parton et al., 1997;
Feijó et al., 1999). Por outro lado, a regulação mediada por gradiente de Ca
2+
citoplasmático é bem documentada em vários eventos de alongamento celular
(Malhó et al., 1995). Várias evidências sugerem que existem padrões para
oscilações do Ca
2+
citoplasmático com duração e localização específicas para um
dado estímulo e resposta, definidas como "Ca
2+
signatures". Tal variabilidade
confere especificidade ao sinal de cálcio, tornando possível que este simples íon
possa desencadear uma multiplicidade de respostas a diferentes estímulos numa
mesma célula. Essa descoberta tem impulsionado o estudo das variações de
moléculas sinalizadoras em células vivas e em tempo real, como forma de
elucidar fenômenos de transdução de sinais associados com respostas a
estresses, ciclo de vida e interações parasitárias ou simbióticas em diferentes
organismos (Feijó et al., 1999). As “H
+
signatures" ainda não foram estabelecidas,
e é possível que no caso do crescimento e reconhecimento da raiz hospedeira
pelo FMA, possa ser mediada por micro-gradientes de H
+
na rizosfera.
19
2.6 Alterações morfológicas em hifas de FMAs em resposta a sinais da
planta hospedeira
A emissão do tubo germinativo em esporos de fungos micorrízicos
arbusculares (FMA) e a invasão das hifas na epiderme e córtex radicular também
envolvem processos de crescimento apical, modificações da parede celular da
planta adjacente a hifa, e provavelmente das defesas da planta.
Os FMAs são organismos biotróficos obrigatórios necessitando da raiz da
planta hospedeira para sustentar seu crescimento. Um esporo de FMA, apesar de
ser capaz de germinar na ausência da raiz, possui somente uma limitada
capacidade de crescimento nessas condições (Harrison, 1999). Isto parece ser
devido à importância dos sinais da planta nos estádios iniciais da formação da
simbiose.
Exsudatos radiculares têm mostrado estimular o crescimento e ramificação
da hifa do fungo em baixas concentrações de certos compostos
flavonóides/isoflavonóides. Flavonóides são constituintes dos exsudatos
radiculares de algumas plantas e são capazes de promover o crescimento da hifa
(Nair et al., 1991; Nagahashi et al., 1996; Giovannetti, 1997). Estes compostos
são exsudados por raízes de diversas espécies, mas apenas os de plantas
hospedeiras estimulam o crescimento de hifas de FMAs (Bécard et al., 1988;
1990).
Em contato com a raiz, o fungo diferencia-se para formar apressório na
superfície das células epidérmicas (Nair et al., 1991; Giovannetti et al., 1993;
Nagahashi et al., 1996). Foi demonstrado que Gigaspora margarita é capaz de
formar apressório em fragmentos de células epidérmicas (Nagahashi e Douds,
1997). Este experimento indicou que uma parede celular sozinha é suficiente para
estimular a formação de apressório e que sinais secretados das raízes não são
necessários. Além disso, paredes celulares não hospedeiras, como as de
beterraba, não possibilitam o desenvolvimento de apressório. Portanto, concluiu-
se que a morfologia da epiderme não é suficiente para induzir a diferenciação de
apressório e que sinais endógenos devem estar presentes na parede hospedeira
(Harrison, 1999). Isto é suportado pelas observações que apressórios formam
somente em fragmentos de paredes celulares epidérmicas e não em células de
outras partes da raiz, como as células do córtex e células vasculares. O
apressório que se forma nos fragmentos de paredes celulares hospedeiras não
20
desenvolvem completa penetração da hifasugerindo que o próximo estádio de
desenvolvimento requer células intactas (Nagahashi e Douds, 1997). Assim,
paredes celulares epidérmicas sinalizam a formação de apressório e o próximo
passo é elucidar os componentes específicos da parede celular que ativam a
resposta. Dentro deste contexto, ressalta-se a importância nos estudos do fluído
apoplástico de raízes, caracterizando as proteínas presentes por meio de análise
proteômica e as enzimas com função sinalizadora.
Após a formação do apressório, o fungo penetra na raiz e procede a
colonização do córtex e se diferencia para formar os arbúsculos. Plantas
mutantes, nas quais os fungos são capazes de formar apressório, mas incapazes
para penetrar a raiz, têm sido identificadas em leguminosas. Alguns desses
mutantes podem estar sem um sinal de entrada e a clonagem de genes mutantes
tem um potencial de fornecer a percepção dentro da sinalização neste estádio da
simbiose.
Já os fatores de nodulação, descritos inicialmente como promotores da
associação entre plantas e bactérias diazotróficas simbióticas, também têm sido
descritos como indutores da interação FMA-planta (Xie et al., 1995) e reguladores
da distribuição de carboidratos em raízes micorrizadas (Xie et al., 1998).
Entretanto, as rotas de sinalização associadas a esses estímulos químicos ainda
não foram exploradas.
Tal qual ocorre com outros sistemas, é esperado que a dinâmica de
distribuição dos íons H
+
esteja envolvida nos eventos celulares relacionados ao
reconhecimento e desenvolvimento da interação simbiótica entre plantas e FMAs.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material biológico, isolamento e desinfestação dos esporos
Os esporos de Gigaspora margarita Becker & Hall (BEG 34) foram
adquiridos da Biorize® (BEG, Dijon-França). Esta espécie de FMA foi escolhida
devido aos seus esporos serem grandes (diâmetro >150 µm) comparados a
espécies do gênero Glomus. Isto facilitou as manipulações no microscópio
durante a medição dos fluxos de H
+
. Além disso, esta espécie já foi usada em
outros estudos fisiológicos e eletrofisiológicos do desenvolvimento assimbiótico de
FMAs (Lei et al., 1991; Ayling et al., 2000).
Os esporos foram lavados em água destilada e selecionados com auxílio
de uma lupa por cor e tamanho, para uma prévia uniformização da germinação, e
posteriormente colocados em tubos à vacuo. O processo de desinfestação foi
realizado como descrito por Bécard e Fortin (1988) com algumas modificações.
Em uma câmara de fluxo laminar, os esporos foram tratados com uma
solução de cloramina-T 2% (p/v) filtrada em filtro Milipore
®
com porosidade de
0,22 µm, por um período de 15 minutos. A solução foi retirada com auxílio de
pipeta Pasteur até o nível dos esporos, quando adicionou-se uma mistura de
antibióticos constituída de Estreptomicina 200 mg mL
-1
e Gentamicina 100 mg mL
-
1
, por um período de 50 minutos, sendo essa solução de antibiótico trocada a
cada dez minutos. Os esporos foram colocados em frascos de vidro esterilizados
com a solução de antibiótico acima e incubados por um período de 5 dias a 4°C.
22
Os esporos esterilizados foram colocados em placas de petri de 4,5 cm
de diâmetro (Willco Wells B.V.), com 2 mL de meio mínimo (Quadro 1)
autoclavado, pH 5,5- 5,7 (pH 5,9-6,0 após autoclavagem) e incubados a 26°C
(BOD), no escuro, por 5 a 7 dias para germinar. Outras placas foram conservadas
em geladeira para ensaios futuros. Incubando as placas na posição normal, com o
fundo para baixo, faz com que o tubo germinativo cresça diretamente sob a
superfície do meio de cultura, numa posição adequada às observações
microscópicas para o posicionamento da microssonda vibrátil.
3.2 Obtenção e cultivo das raízes transgênicas (RTs)
As raízes transgênicas (RTs) de trevo (Trifolium repens) foram obtidas do
laboratório de solos da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Elas foram
multiplicadas em meio MS sólido pH 5,5-5,7, adicionando um segmento de 3 cm de
raízes e cultivadas a 25°C. As RTs crescidas em meio MS foram transferidas para
meio mínimo e posteriormente efetuou-se a inoculação com esporos germinados
de Gigaspora margarita.
Os quadros 1 e 2 mostram a composição e a concentração dos nutrientes
nos meios de cultivo: MS e Mínimo.
Placas de Petri (8 cm em diâmetro) preenchidas com 15 mL de meio
Mínimo solidificado (0.25% Phytagel) foram usadas como câmaras de cultura de
RTs para análises de microscopia e do fluxo de H
+
em estruturas extra-
radiculares. Quatro a seis esporos de G. margarita foram colocados, sob
condições estéreis, em cima das RTs e incubadas a 25°C por 3 meses, para as
análises. As placas foram incubadas normalmente e assim o geotropismo
negativo do tubo germinativo de G. margarita foi explorado para dirigir o
crescimento da hifa para a superfície do meio M.
23
Quadro 1. Composição dos diferentes meios de cultivos das raízes transgênicas
de trevo (Trifolium repens). Após o preparo o pH foi ajustado para 5,7 e
posteriormente autoclavados por 15 minutos
MÍNIMO (MM) Murashige & Skoog (MS)
Macronutrientes
(mg mL
-1
)
NH
4
NO
3
- 1650
KNO
3
80 1900
CaCl
2
. 2 H
2
O - 440
MgSO
4
. 7 H
2
O 731 370
KH
2
PO
4
4,8 170
KCl 65 -
Ca(NO
3
)
2
. 4 H
2
O 228 -
Micronutrientes
(mg mL
-1
)
MnSO
4
. 1 H
2
O 6 22,3
ZnSO
4
. 7 H
2
O 2,65 8,6
H
3
BO
3
1,5 6,2
KI 0,75 0,83
Na
2
MoO
4
. 2 H
2
O 0,0024 0,25
CuSO
4
. 5 H
2
O 0,13 0,025
CoCl
2
6 H
2
O - 0,025
Outros
(mg mL
-1
)
Na
2
EDTA . 2 H
2
O - 37,3
NaFe EDTA 8 -
FeSO
4
7 H
2
O - 27,8
Glicina 3 3
Ácido nicotínico 0,5 0,5
Piridoxina.HCl 0,1 0,1
Tiamina.HCl 0,1 0,1
Mio-inositol 50 50
Sacarose 10000 10000
Phytagel 2500 2500
24
Quadro 2. Concentração dos nutrientes nos diferentes meios de cultivos das
raízes transgênicas de trevo (Trifolium repens)
Nutriente MÍNIMO (M) Murashige & Skoog (MS)
Concentração
___________________
mM
___________________
N 2,70 60,03
P 0,035 1,249
K 1,701 20,045
Mg 2,965 1,501
S 2,975 1,728
Mn 0,030 0,099
Ca 0,965 2,994
Cl 0,9326 5,987
I 0,004 0,005
Zn 0,009 0,029
B 0,024 0,1
Cu 0,5 x 10
-3
0,1 x 10
-3
Mo 0,9 x 10
-5
0,001
Fe 0,0216 0,099
Na 0,021 0,102
Co - 0, x 10
-3
3.3 Extração do fluido apoplástico de raízes (FAR) de trevo
As RTs de trevo foram multiplicadas em meio mínimo (M) líquido e
incubadas por 30 dias nas mesmas condições citadas no item anterior, e
posteriormente realizou-se o processo de extração do fluido apoplástico.
A extração do FAR de trevo foi feita de acordo com Hammond-Kosack
(1992), com as modificações de Souza (2002). As raízes foram separadas das
plantas, pesadas (40-50g), lavadas com água corrente e arrumadas em feixes
envolvidos por parafilm. Segmentos de raízes com aproximadamente 2,5 cm
foram cortados e lavados com ddH
2
O para remover detritos da superfície e/ou
25
contaminação citoplasmática, e acondicionados em seringas plásticas de 25 mL
encaixadas dentro de tubos do tipo Falcon. Nestes foi adicionado uma solução
contendo PMSF 1 mM e EDTA 1 mM em ddH
2
O, até um volume final de 20 mL.
As raízes foram infiltradas a vácuo por 2 min a 4°C. O exesso de água foi
eliminado por gravidade e as raízes foram centrifugadas a 800 x g por 15 minutos
a 4°C. O FAR foi recolhido, filtrado com Millipore (0,2 µm de porosidade) para
remoção de microrganismos e posteriormente armazenado em ultrafreezer a -
80°C. A quantificação de proteínas foi realizada pelo método de Bradford (1979).
3.4 Determinação dos fluxos protônicos extracelulares
O fluxo extracelular de prótons foi medido ao redor do azigosporo e ao
longo de hifas secundárias de Gigaspora margarita usando uma microssonda
vibrátil seletiva ao próton (Kühtreiber e Jaffe, 1990; Kochian et al., 1992; Feijó et
al., 1999; Vissenberg et al., 2001). Eletrodos foram produzidos de microcapilares
de borosilicato com diâmetro exterior de 1,5 mm e 1,12 mm de diâmetro interior
(www.sutter.com), utilizando o aparelho Puller Flaming Brown, Sutter P-98 (Sutter
Instruments, Novato, CA). Posteriormente, os microeletrodos foram colocados sob
um suporte de vidro coberto por um becker de vidro (1 L) e secos em estufa à
250º C por 3 horas. Após este período, realizou-se a silanização dos
microcapilares, por exposição a vapor de N, N-dimetiltrimetilsilamina (C
5
H
15
NSi,
Fluka 41716), ainda na estufa por 20 minutos e deixados para secar por mais 3
horas, na mesma temperatura. Após a vaporização com silano (C
5
H
15
NSi), os
microeletrodos foram preenchidos com uma solução de eletrólito (100 mM para
Cl
-
; 15 mM KCl e 40 mM KH
2
PO
4
para o H
+
), correspondente a uma coluna de 1,5
mm do eletrodo. Após esta etapa, foram preenchidos na ponta, com uma coluna
de 20 a 25 µm do coquetel seletivo, contendo o ionóforo respectivo ao H
+
(Fluka,
Milwaukee, WI). Para estabelecer o contato elétrico com o meio, foi inserido na
extremidade basal do microeletrodo, um suporte com um eletrodo de Ag/AgCl
(World Precision Instruments, Inc.). Um eletrodo de referência, composto de uma
ponte de KCl 3M líquido, fechada na extremidade com um polímero
semipermeável (World Precision Instruments), foi inserido no meio de banho da
amostra. Sinais foram medidos pelo amplificador (www.applicablelectronics.com),
26
sendo a vibração e o posicionamento do eletrodo obtidos através de motores
posicionais (stepper-motors), os quais permitem um movimento tridimensional. O
controle dos motores, a aquisição de dados e o seu processamento preliminar
foram ajustados no software ASET (Science Wares [East Falmouth, MA] –
www.sciencewares.com). A calibração dos eletrodos foi realizada por medição do
potencial (mV) registrado em três soluções contendo o íon em estudo, com
concentração conhecida: 0,1 mM, 1 mM e 10 mM; dado que as concentrações
abrangem as condições dos meios utilizados.
A coleta dos dados da microssonda vibrátil seletiva, realizada pelo
software ASET, fornece a informação necessária para calcular o fluxo iônico em
um determinado ponto [x, y, z] do espaço, por meio da lei de Fick (J = D (dc/dx)).
O coeficiente de difusão (D) é um valor tabelado para cada íon (de acordo com
Handbook of Chemistry and Physics, Chemical Rubber Co.). A diferença espacial
(dx) resulta do cálculo da distância entre os dois pontos em que foram realizadas
as medições das concentrações para cálculo do fluxo (10 µm). A diferença de
concentração (dc) é um vetor que varia ao longo do ensaio. Em cada ponto, a
concentração pode ser calculada a partir do valor de mV registrado no dado ponto
e da equação previamente determinada para o ionóforo durante ao processo de
calibração.
Durante as análises dos efeitos do fluido apoplástico de raízes (FAR) de
trevo sobre o fluxo de H
+
de tubos germinativos de G. margarita, foi adicionado
10µL ou 20 µL de FAR e aguardou-se 10 min até uma total mistura das alíquotas
no meio de cultura. Uma análise prévia demonstrou que o fluido de raízes e o seu
modo de extração não afetavam a sensibilidade da sonda (Figura 4). O pH do
meio M durante as medidas também não foi alterado, mantendo-se em 5,99 (±
0,086) como exemplificado na figura 19. O mesmo procedimento foi realizado nos
estudos com os inibidores: vanadato e eritrosina B.
27
y = 23.712Ln(x) + 293.43 R
2
= 1.00
y = 24.813Ln(x) + 300.77 R
2
= 0.99
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
0.0001 0.001 0.01
Concentração de H
+
(mM)
mV
antes da adição do FA
após a adição do FA
Figura 4. Curva de calibração da microssonda vibrátil seletiva ao H
+
antes (■) e
após (ο) a adição de 20 µL do fluido apoplástico de raízes de trevo.
3.5 Preparo do substrato e plantio de plantas de milho
Como substrato, utilizou-se areia lavada e solo argiloso na proporção 1:1
(V/V). O solo, classificado como um Cambissolo, foi coletado no campus da
UENF, seco ao ar, destorroado e passado em peneira 2 mm. Após preparada, a
mistura foi autoclavada a 120°C por 2 horas e uma amostra do solo foi coletada
para análise química e física.
O resultado da análise foi o seguinte: pH em H
2
O = 5,5; P (Mehlich-1)= 6
mg dm
-3
; K= 148 mg dm
-3
; Ca = 20 mmol
c
dm
-3
; Mg = 13 mmol
c
dm
-3
; Al = 0,0
mmol
c
dm
-3
; H + Al = 18 mmol
c
dm
-3
; Na = 1,4 mmol
c
dm
-3
; C= 0,54 %; M.O.
(matéria orgânica) = 9,3 g dm
-3
; SB (soma de bases) = 38 mmol
c
dm
-3
; T (CTC
total) = 56 mmol
c
dm
-3
; t (CTC efetiva) = 38 mmol
c
dm
-3
; m (saturação de alumínio)
28
(%) = 0; V (Saturação de bases) = 68%; Areia fina = 75%, Silte = 11%; Argila
14%.
O inóculo fúngico foi multiplicado em vasos de 5 L, utilizando Brachiaria
brizantha como planta hospedeira, em substrato esterilizado que continha areia e
solo (1:1, v/v), preparado como citado anteriormente. Foram adicionados 50g do
inóculo de Gigaspora margarita, composto de raízes colonizadas, hifas e esporos.
As sementes de milho foram desinfestadas por imersão em solução de
hipoclorito de sódio 0,5%, por 5 minutos e lavadas sucessivamente com água
destilada esterilizada.
A inoculação do milho foi feita no plantio, aplicando-se 100g do inóculo
multiplicado a 3 cm abaixo da superfície do solo. O tratamento não inoculado com o
FMA, recebeu da mesma forma 100g do inóculo, porém autoclavado. Semearam-
se oito sementes por vaso e 10 dias após a germinação fez-se um desbaste
deixando apenas cinco plantas por vaso. Vasos plásticos com capacidade para 3 L
foram usados como recipientes. A umidade durante o experimento foi mantida
próxima à capacidade de campo do substrato, utilizando-se água desionizada.
Após o 10° dia de germinação, aplicaram-se 200 mL de uma solução nutritiva
(Quadro 3), uma vez por semana, em todos os tratamentos.
A taxa de colonização micorrízica foi avaliada em duas regiões do sistema
radicular como descrito na figura 27 e determinada pelo método da interseção em
placas de Petri reticuladas, como descrito por Giovannetti e Mosse (1980), após
coloração com azul de metileno, conforme técnica descrita por Phillips e Hayman
(1970). Fragmentos de raízes foram cortados na região de maior colonização pelo
FMA, aos 30 dias após a inoculação; fixados e utilizados para microscopia ótica e
eletrônica de transmissão, pelo colaborador Dr Fábio Lopes Olivares (LBCT-
UENF)
3.6 Isolamento e purificação das vesículas de membrana plasmática e
vacuolar
O procedimento para isolamento de vesículas de membrana plasmática e
tonoplasto das raízes de milho inoculadas ou não com G. margarita, foi realizado
por centrifugação diferencial, como descrito por Gianinni e Briskin (1987) e com
as modificações de Façanha e de Meis (1998).
29
As amostras de tecidos frescos de raízes foram cortadas em duas regiões
do sistema radicular de plantas de milho. A região A compreendia a zona
correspondente à zona de emissão de raízes laterais e maior freqüência de pêlos
radiculares; a região B foi caracterizada por envolver as regiões de alongamento,
meristemática e da coifa, tendo uma baixa freqüência de pêlos. Essas partes das
raízes foram pesadas, cortadas em pequenos pedaços e homogeneizadas em
meio tamponado (tampão de extração) usando gral e pistilo. As concentrações
finais dos reagentes no tampão de extração foram as seguintes: Sacarose 250
mM, Glicerol 10%, DTT 2 mM, EDTA 5 mM, PVP-40 0,5%, KCl 150 mM, BSA
0,13%, PMSF 2 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 M. As soluções usadas na preparação
de extração foram mantidas em geladeira e toda a manipulação inclusive as
centrifugações foram realizadas à 4°C. O pH foi monitorado durante a
homogeneização, mantendo-se entre 7,6 e 8,0. Após maceração o homogenato
foi filtrado, através de 4 camadas de gase e submetido à primeira centrifugação
em uma centrífuga HITACHI himac CP, a 800 x g por 15 minutos, para remoção
de células não rompidas e núcleos. O sobrenadante foi coletado e submetido a
uma nova centrifugação, em uma centrífuga HITACHI himac CP 85b, a 100000 x
g por 40 minutos. O precipitado (pélete), que corresponde à fração microssomal
não purificada, foi ressuspendido com 1 mL de uma solução tampão (meio de
ressuspenção) contendo: Glicerol 15%, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, HEPS-KOH 10
mM (pH 7,6) e EDTA 1mM. Com isso obteve-se a fração microssomal
ressuspendida. Posteriormente esta fração passou por um processo de
purificação, separando as vesículas de membrana plasmática e tonoplastos por
densidade.
A purificação das vesículas de membrana plasmática e tonoplastos, foi
realizada como descrito por Serrano (1989), onde 1 ml da fração microssomal
ressuspendida foi aplicada sobre um gradiente descontínuo bifásico de sacarose
nas concentrações de 30 e 46% (p/p). Este gradiente foi preparado através de
uma solução de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), EDTA 1mM, DTT 1 mM e sacarose nas
respectivas concentrações (30 ou 46%). Adicionaram-se 1,5 mL de cada solução
(30 e 46%) e 1 mL da fração microssomal ressuspendida em tubos de centrífuga
com capacidade de 4 mL. O gradiente preparado anteriormente com fração
microssomal foi centrifugado a 100000 x g (HITACHI himac CP 85b,) durante uma
hora e meia. Após centrifugação, a banda contendo as vesículas de membrana
30
plasmática purificadas, localizava-se na face 46%, enquanto, vesículas de
tonoplastos situavam-se em 30%. Coletou-se as bandas em tubos criogênicos
com capacidade de 1,5 mL que foram estocados em ultra-freezer a -70°C. As
proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1979), usando BSA como
padrão.
3.7 Determinação da atividade ATPásica e Pirofosfatásica
As atividades H
+
-ATPase e H
+
-PPase foram determinadas pelo método
descrito por Fiske e Subbarrow (1925), com as modificações de Façanha e de
Meis (1998).
A metodologia consistiu na determinação de P
i
liberado durante a
hidrólise do ATP por 30 minutos, à 30°C. A reação foi iniciada com adição da
proteína em estudo (Membrana plasmática ou tonoplasto) no meio de reação e
paralisada com a adição de ácido tricloroacético (TCA) numa concentração final
de 5%. Posteriormente adicionou-se 0,5 mL de uma solução de Molibidato de
Amônio + Acido Ascórbico (100:1) e após 10 min efetuou-se a leitura das
amostras em espectrofotômetro SHIMADZU UV-120 no comprimento de onda de
750 nm.
As concentrações finais dos reagentes no meio de reação para atividade
ATPásica em vesículas de membrana plasmática foram as seguintes: MOPS-
KOH pH 6,5 50 mM; MgSO4 3 mM; KCl 100mM; ATP 1mM e proteína 0,03
mg/mL. Em vesículas de tonoplastos substituímos o tampão MOPS-KOH pH 6,5
por MOPS-KOH pH 7,0 e avaliamos a atividade ATPásica usando como substrato
o ATP, e pirofosfatásica usando o pirofosfato (PP
i
). Todas as proteínas
adicionadas para iniciar a reação estavam numa concentração final de 0,03
mg/mL.
As atividades hidrolíticas foram calculadas subtraindo as atividades totais
das atividades na presença do inibidor específico de casa enzima, expressando
como ∆Vanadato no caso da ATPase de membrana plasmática (0,2 mM
vanadato), ∆Nitrato para a ATPase vacuolar e ∆Potássio para a pirofosfatase.
31
3.8 Determinação da atividade de fosfohidrolases no fluido apoplástico de
raízes de trevo
As atividades das fosfohidrolases foram determinadas pelo método descrito
por Fiske e Subbarrow (1925) e os passos foram seguidos como citado no item
anterior. A metodologia consistiu na determinação de P
i
liberado durante a
hidrólise de cada substrato fosfatado ATP, ADP, PP
i
e PolyP aos 0, 5, 8, 10, 12,
15, 20 25, 30, 50 minutos, em banho-maria, a 36°C. As concentrações finais dos
reagentes no meio de reação para as atividades das fosfohidrolases foram as
seguintes: MOPS-KOH pH 6,0 50 mM; MgSO4 3 mM; KCl 100mM e proteína
0,02-0,03 mg/mL. Também foi adicionado cada substrato das enzimas nas suas
respectivas concentrações finais: ATP 1mM, PP
i
0,1 mM, ADP 1 mM, Polifosfato
0,8 mM. A concentração de proteínas no fluido apoplástico foi muito baixa (0,08 -
0,14 mg mL
-1
), o que exigia um grande volume de raízes para a extração do
mesmo. Para o estudo do pH ótimo de cada atividade enzimática, utilizou-se
tampão nos diferentes pHs: 4,0; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 8,0.
32
Quadro 3. Solução nutritiva aplicada nas plantas de milho inoculadas ou não com
FMAs (Snowball e Robson, 1984 – citado por Brundrett et al., 1994) e
concentrações finais dos macronutrientes
Concentração
Inicial
Concentração
Final
Quantidade
adicionada
Composição
Química
Macronutrientes
a
-----------M-----------
----------mM----------
--------mL
-1
--------
KH
2
PO
4
.
H
2
O 0,01 0,264 26
NH
4
NO
3
1 1,25 1,25
CaCl
2
.
4H
2
O 1 1 1
K
2
SO
4
0,5 0,5 1
MgSO
4
.
7 H
2
O 1 0,024 0,024
Micronutrientes
b
----------mM----------
----------µM----------
--------mL
-1
--------
Micronutrientes - - 1,00
H
3
BO
3
13,3 13,3 -
MnCl
2
. 4 H
2
O 7 7 -
ZnSO
4
. 7 H
2
O 2 2 -
CuSO
4
. 5 H
2
O 0,5 0,5 -
(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O
0,086 0,086 -
Na
2
FeEDTA
c
82,35 - 1,00
Concentrações finais dos macronutrientes na solução nutritiva
---------------------------------------------ppm--------------------------------------------
N P K S Ca Mg
35 8,2 77,5 28,5 40,08 0,58
a
Soluções de macronutrientes independentes;
b
Solução contendo todos micronutrientes (exceto Ferro);
c
Solução de Fe-EDTA independente, adicionada por último;
pH ajustado para 5,6 e o volume completado para 1L.
4. RESULTADOS
4.1 Análises durante a fase assimbiótica
4.1.1 Padrão do fluxo de H
+
em azigosporos
Uma clara distribuição polarizada dos fluxos de H
+
foi encontrada nos
esporos, em que a região de emergência de tubos germinativos apresentou
domínios de efluxos de H
+
e a região oposta a esta foi caracterizada por domínios
de influxos (Figura 5A). A magnitude dos fluxos de H
+
foi superior nas fases que
antecedem a germinação (esporos não germinados), e diminuiu progressivamente
após o aparecimento de tubos germinativos (Figura 5B).
A distribuição polarizada do fluxo de H
+
indica os locais de aparecimento
de tubos germinativos e ajusta-se com o anterior padrão de campo elétrico
observado em esporos de Gigaspora margarita (Berbara et al., 1995). Esporos
senescentes não exibiram nenhuma atividade de fluxo de H
+
(dados não
mostrados).
4.1.2 Padrão do fluxo de H
+
e o papel das ATPases em hifas esporofíticas
Os fluxos de H
+
de hifas laterais de G. margarita foram analisados, de
cinco a sete dias após a germinação. Hifas ativas exibiram corrente citoplasmática
e uma velocidade de crescimento média de 1.6 µm min
-1
.
34
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6 7
Probe position
0
1
2
3
4
5
6
7
EFLUXO
INFLUXO
0 1 2 3 4 5 6 7
Posição da Sonda
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6 7
Probe position
0
1
2
3
4
5
6
7
EFLUXO
INFLUXO
0 1 2 3 4 5 6 7
Posição da Sonda
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
B
A
5
3
4
1
7
2
0
6
Antes da germinação Após a germinação
Figura 5. Determinação do fluxo de H
+
em esporos de G. margarita usando uma
microssonda vibrátil seletiva a H
+
. (A) Micrografia de um azigosporo ativo. As
setas indicam a direção do fluxo de H
+
em cada região do esporo. (B)
Representação gráfica dos valores médios dos fluxos de H
+
medidos em 8 locais
diferentes (0-7) ao redor do esporo, antes (barras claras) e após (barras escuras)
a germinação (n=6). O local 4 representa a região de emissão de tubos
germinativos exibindo superiores efluxos de H
+
(setas amarelas) e na região
oposta à de germinação predominando influxos (setas brancas). Barras
representam o desvio padrão da média no intervalo de confiança de 95%.
35
As medidas do efluxo de H
+
ao redor de hifas laterais alcançaram os
níveis máximos de 0,96 pmol cm
-2
min
-1
, entre 10 e 40 µm do ápice, e então
diminuiu para 0,36 pmol cm
-2
min
-1
, em 200 µm (Figura 6A). A microssonda vibrátil
é acoplada a um microscópio invertido, permitido assim, a visualização da
disposição e movimentos de estruturas internas de tubos germinativos. No ápice
da hifa, foram observados vesículas e pequenos grânulos escuros similares às
estruturas previamente descritas por Jolicoeur et al. (1998), as quais estavam
movendo-se seguindo a corrente citoplasmática na região sub-apical, situada
entre 10 e 40 µm (Figura 6C). A membrana ao redor desta região corresponde à
mesma em que foram encontrados os maiores efluxos de H
+
(Figura 6A).
De forma a investigar a participação das H
+
-ATPases naqueles fluxos de
H
+
descritos nas hifas laterais, foram adicionados ao meio de cultura, durante as
medições, dois inibidores desta enzima nas concentrações finais de 5 µM para o
ortovanadato de sódio e 350 µM para eritrosina B (Cocucci e Marré, 1984; Wach e
Graber, 1991). A adição de ortovanadato em concentrações de 5 µM aboliu os
efluxos de H
+
ao redor da hifa, permanecendo um pequeno efluxo no ápice da hifa
(Figura 6B). Por outro lado, os maiores efeitos inibitórios da eritrosina B foram
encontrados na região apical da hifa (0 a 20 µm do ápice) e os efluxos de H
+
nas
regiões posteriores ao ápice da hifa foram praticamente não afetados por este
inibidor, mas foram inibidos completamente pelo ortovanadato (Figura 6B e 7).
36
0
10
20
40
60
30
50
0
10
20
40
60
30
50
-0.06
-0.05
-0.04
-0.03
-0.02
-0.01
0
0.01
0.02
0.03
0.04
246 261 276
EFFLUX
INFLUX
B
C
A
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 4 8 12 16 20 24 28 32
EFFLUX
INFLUX
*
0
10
20
30
40
60
150
200
0
10
20
40
60
75
200
150
250
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
Tempo (min)
EFLUXO
INFLUXO
INFLUXO
EFLUXO
37
Figura 6. Fluxo de H
+
ao longo de hifas laterais. (A) Representação gráfica típica
dos dados exportados do programa ASET. Setas indicam as distâncias de
posicionamento da sonda a partir do ápice das hifas de G. margarita (n=10). O
eixo “X” representa os intervalos de tempo (min) durante as medições de cada
ponto analisado. (B) Fluxo de H
+
medidos na presença de 5 µM de ortovanadato,
um inibidor específico das H
+
-ATPases de membrana plasmática. Os valores
negativos correspondem aos influxos de H
+
, e positivos aos efluxos. Linhas cinzas
no fim das curvas A e B representam as referências do fluxo de H
+
no meio de
cultura. (C) Imagem obtida por microscopia do tipo DIC (ampliação 60X)
mostrando marcações escuras ou grânulos densos (*) e algumas vesículas
localizadas no ápice da hifa. As pontas de setas indicam o posicionamento da
sonda e os números descrevem as distâncias do ápice da hifa (µm).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tip distance (
µ
µµ
µ
m)
H
+
Flux (pmol cm
-2
min
-1
)
6.65
6.70
6.75
6.80
6.85
6.90
6.95
7.00
7.05
7.10
+ Erythrosin
- Erythrosin
pH
c
C
y
t
o
s
o
l
i
c
p
H
- Eritrosina B
+ Eritrosina B
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
pH Citossólico
Distância da ponta (µ
µµ
µm)
Figura 7. Perfil do fluxo de H
+
ao longo de hifas G. margarita, na presença
(quadrados claros) ou ausência (quadrados escuros) de eritrosina B e sua
semelhança com o pH citossólico (pHc), descrito por Jolicoeur et al. (1998),
analisado sob condições semelhantes às usadas neste experimento (linha
pontilhada representa os dados plotados de Jolicouer et al., 1998). Os maiores
efluxos de H
+
foram encontrados na faixa entre 10 e 20 µm, coincidindo com a
38
área de maior inibição pela eritrosina B e com os valores de pHc mais alcalinos. A
área pontilhada descreve as regiões mais suscetíveis a eritrosina B.
4.1.3 Efeitos de fosfato e sacarose sobre o fluxo de H
+
de hifas laterais
Os efeitos de P
i
e Sac sobre os fluxos de H
+
foram investigados usando
esporos germinados cultivados em meio M completo (Bécard e Fortin, 1988)
variando apenas o status de P
i
e Sac (+P
i
+Sac; -P
i
+Sac; +P
i
-Sac; -P
i
-Sac). As
concentrações de P
i
e Sac no meio M foram de 35 mM e 29,2 mM,
respectivamente. A exclusão de Sac ou P
i
do meio promoveu um aumento do
efluxo de H
+
, principalmente, na região de sub-apical da hifa, em comparação
com os fluxos obtidos em hifas crescendo em meio M completo (barras escuras
na Figura 8A). No ápice das hifas, a ausência de P
i
levou a redução dos efluxos
de H
+
, independente do status de Sac (Figura 8 A, B). Os maiores efluxos foram
observados na presença de Sac e na ausência de P
i
, sendo localizados,
principalmente, na região sub-apical entre 10 e 40 µm do ápice (Figura 8B).
4.1.4 Relação entre morfogênese de hifas, crescimento e comportamento do
fluxo de H
+
em função do fosfato e sacarose.
Os parâmetros morfológicos e de crescimento foram analisados em
função do conteúdo de P
i
e Sac do meio de cultura para comparar o perfil de
ativação do fluxo de H
+
. Como ocorrido com o fluxo iônico, a taxa de crescimento
das hifas, ramificações e septação foram sensíveis à adição de P
i
e Sac (Figura
9). Porém, esta adição de P
i
e Sac não promoveram mudanças no número de
tubos germinativos emergidos. Um aumento na ramificação das hifas junto com a
formação de novas hifas e grau de septação apresentaram o mesmo
comportamento das velocidades de crescimento das hifas em resposta a não
disponibilidade de P
i
e Sac. A exclusão de qualquer um destes nutrientes do meio
de cultura levou a uma estimulação no crescimento de hifas. Além disso, o
crescimento de hifas foi inferior em meio com P
i
e Sac e a formação de
ramificações nas hifas e septos também foi afetada (Figura 9A e B).
39
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 - 5 . 10 - 40 . 75 - 300 .
-Suc
+Suc
B
- FOSFATO
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 - 5 . 10 - 40 . 75 - 300 .
-Suc
+Suc
B
- FOSFATO
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 - 5 . 10 - 40 . 75 - 300 .
-Suc
+Suc
A
+ FOSFATO
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 - 5 . 10 - 40 . 75 - 300 .
-Suc
+Suc
A
+ FOSFATO
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
Faixas ao longo da hifa (µ
µµ
µm)
-Sac
+Sac
-Sac
+Sac
Figura 8. Efeitos de P
i
e Sac sobre os fluxos de H
+
de hifas. (A) Valor médio de
efluxos de H
+
em diferentes faixas ao longo de hifas de G. margarita crescendo
em meio com fosfato e suplementado (+Sac) ou não (-Sac) com sacarose (n=7).
(B) Perfil do fluxo de H
+
em meio sem fosfato sob as mesmas condições de
sacarose citadas acima (n=6). Barras representam o desvio padrão da média no
intervalo de confiança de 95%.
40
A
B
- P
i
- Sac
- P
i
+Sac
+P
i
- Sac
+P
i
+Sac
- P
i
- Sac
- P
i
+Sac
+P
i
- Sac
+P
i
+Sac
Tratamentos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
.-P-S .+P-S .-P+S .+P+S
N° Ramificações, Septos e Tubos germinativos
N° Ramificações
N° Septos
N° Tubos germinativos
- P
i
+Sac +P
i
+Sac-P
i
-Sac +P
i
-Sac
-P
i
-Sac +P
i
-Sac
- P
i
+Sac
+P
i
+Sac
a
A
B
- P
i
- Sac
- P
i
+Sac
+P
i
- Sac
+P
i
+Sac
- P
i
- Sac
- P
i
+Sac
+P
i
- Sac
+P
i
+Sac
- P
i
- Sac
- P
i
+Sac
+P
i
- Sac
+P
i
+Sac
- P
i
- Sac
- P
i
+Sac
+P
i
- Sac
+P
i
+Sac
Tratamentos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
.-P-S .+P-S .-P+S .+P+S
N° Ramificações, Septos e Tubos germinativos
N° Ramificações
N° Septos
N° Tubos germinativos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
.-P-S .+P-S .-P+S .+P+S
N° Ramificações, Septos e Tubos germinativos
N° Ramificações
N° Septos
N° Tubos germinativos
- P
i
+Sac +P
i
+Sac-P
i
-Sac +P
i
-Sac
-P
i
-Sac +P
i
-Sac
- P
i
+Sac
+P
i
+Sac
a
Figura 9. Efeitos da disponibilidade de fosfato e sacarose sobre a septação,
ramificação, números de tubos germinativos e velocidade de crescimento das
hifas. (A) Representação gráfica dos parâmetros morfológicos calculados de
41
observações em lupa estereoscópica de pelo menos seis esporos germinados
para cada condição. “a”, visualização gráfica da velocidade de crescimento de
hifas de G. margarita em função do status nutricional. (B) Esquemas plotados
sobre imagens de esporos germinados em condições diferentes de P
i
e Sac
representando o crescimento das hifas no meio M. As taxas de crescimento das
hifas foram medidas coletando-se imagens de 15 em 15 seg, num intervalo de 30
min, obtendo-se um time-lapse. As velocidades de crescimento das hifas foram
medidas usando o software MetaMorph versão 4.55 (Imaging Universal, Chester
Ocidental, PA). Os dados coletados foram exportados ao Microsoft Excel 9.0 para
as análises. Barras representam o desvio padrão da média no intervalo de
confiança de 95%.
É bem conhecido, que esta ativação nas mudanças morfológicas são
críticas para exploração do solo pelo fungo e em busca das raízes da planta
hospedeira (Giovannetti et al., 1994; Giovannetti, 1997; Smith e Read, 1997; Bago
et al., 1998). Estes dados aliados aos de fluxo de H
+
delineiam uma possível
sinalização por pH, em que sítios de ativação do efluxo de H
+
parecem
desempenhar um papel na organização da emergência, na ramificação de hifas e
no crescimento polarizado.
A figura 10 apresenta uma representação esquemática que resume o
padrão do fluxo H
+
durante o desenvolvimento assimbiótico do FMA. É possível
projetar um padrão para o crescimento polarizado, em que domínios de efluxos de
H
+
ficam situados à frente de cada local de emergência de uma nova hifa, nas
regiões apical e sub-apical, enquanto domínios de fortes influxos ocorreram nas
ramificações e nas hifas primárias.
42
Figura 10. Representação esquemática do fluxo de H
+
relacionado ao
desenvolvimento assimbiótico do FMA G. margarita. O comprimento das setas
(escalas indicadas na figura) é representativo da magnitude do fluxo em cada
posição da sonda. Efluxos de H
+
são representados por setas de amarelas e
influxos por setas brancas. Os quadros superiores ilustram as estruturas fúngicas
analisadas: Hifas laterais septadas (A) ou não (B); (C) segmento de um tubo
germinativo apresentando três sítios de emergência de hifas, caracterizado por
efluxo de H
+
nos ápices.
43
4.2 Análises durante a fase Pré-simbiótica
4.2.1 Efeitos do fluido apoplástico de raiz hospedeira sobre o fluxo de H
+
das hifas esporofíticas
Alguns trabalhos sugerem a propriedade dos fatores radiculares, tais
como o fluido apoplástico de raízes (FAR) e exsudatos radiculares, de promover
aumentos na ramificação de hifas (Graham, 1982; Graham, 1982; Gianinazzi-
Pearson et al., 1983; Carr et al., 1995), e o crescimento e produção de hifas
terciárias (Douds e Nagahashi, 2000).
O perfil do fluxo de H
+
em hifas laterais de G. margarita mostrou ser
estimulado pela adição de fluido apoplástico de raízes transgênicas de trevo, mas
esta ativação variou com a presença ou não de P
i
no meio de cultivo em que o
FMA se desenvolvia (Figura 11). Em meio com P
i
, as hifas apresentavam
pequenas atividades de efluxo de H
+
, mas após a adição de 10 e 20 µL do FAR,
aumentos significativos foram observados, de maneira dose-dependente (Figura
11A). Estes maiores efluxos foram detectados, principalmente, nas regiões
apicais da hifa. Por outro lado, em meio sem P
i
, estes estímulos foram inferiores
aos observado na presença de P
i
(Figura 11B). Aparentemente, isto se deve ao
fato de os efluxos de H
+
das hifas serem estimulados pela ausência de P
i
, como
acontece nas raízes crescendo sob baixa disponibilidade de P
i
(Mimura, 1995;
Roghothama, 1999). Estes resultados mostram que o fosfato desempenha um
papel de modulador na percepção do sinal do hospedeiro pela hifa esporofítica.
Análises com FAR aquecido à 95ºC por 5 min sugerem que a (s) substância (s)
estimuladora (s) seja (m) termo-sensível (is), uma vez que, nenhuma estimulação
foi observada nos efluxos de H
+
, pelo contrário, ocorreu uma inibição dos efluxos
convertidos a influxos (Figura 12).
44
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
µ
µµ
µ
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Distância da ponta (
µ
µµ
µ
m)
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
Distância do ápice (µ
µµ
µm)
Control 10 FA 20 FA
+ FOSFATO
- FOSFATO
Controle
10 FAR
20 FAR
Figura 11. Efeito da adição de fluido apoplástico de raízes (FAR) transgênicas de
trevo sobre o fluxo de H
+
de hifas laterais de Gigaspora margarita, crescendo em
meio M com ou sem 35 µM P
i
. 10 FAR e 20 FAR representam respectivamente as
doses de 10 e 20 µL de fluido apoplástico aplicadas. Inicialmente foi determinado
o fluxo de H
+
nas hifas laterais (controle) e posteriormente adicionou-se 10 µL de
FAR, aguardou-se 10 minutos e reiniciou-se as análises. O mesmo foi realizado
para a dose de 20 µL. Barras representam o desvio padrão da média no intervalo
de confiança de 95%.
45
-1.4
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 10 20 40 60 80 100 150 200 300
Distância do ápice (µ
µµ
µm)
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
Controle
+FAR aquecido
Figura 12. Efeito da adição de fluido apoplástico de raízes trevo aquecido (95°C/ 5
min), sobre o fluxo de H
+
de hifas esporofíticas. O controle é representado pelas
colunas brancas e o tratamento com FAR aquecido pelas colunas pretas. Barras
representam o desvio padrão da média no intervalo de confiança de 95%.
4.2.2 Atividades fosfohidrolásicas presentes no fluido apoplástico de raízes
de trevo
Iniciamos a investigação das possíveis substâncias ativas presentes no
FAR, estudando as atividades fosfohidrolásicas que podem participar de
diferentes rotas sinalizadoras. A análise da atividade de fosfohidrolases presentes
no FAR mostrou que existe uma alta atividade apirásica extracelular superior até
mesmo a de outras fosfohidrolases como ATPase, PPase e PolyPase (Figura 13).
Estas enzimas são relacionadas com o aumento na absorção de P
i
em plantas e
animais e têm importante papel no catabolismo do ATP. Uma análise do efeito de
diferentes pHs sobre as atividades enzimáticas evidenciou a faixa de pH ótimo
para a hidrolise de ATP (4.0 – 6.0), ADP (5.0 – 6.0), PPi (5.0) e PolyP (4.0 – 6.0)
(Figura 14). O pH das ATPases é condizente ao observado para fosfatases ácidas
em estudos com hifas extracelulares de FMAs (Smith e Read, 1997).
46
y = 0.0585x - 0.0121 R
2
= 0.99
y = 0.0504x + 0.0885 R
2
= 0.98
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
y = 0.0585x - 0.0121 R
2
= 0.98
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
y = 0.0585x - 0.0121 R
2
= 0.99
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Tempo (min)
Atividade hidrolítica (µmol Pi mg ptn
-1
)
ATP ADP
PP
i
PP
i
PolyP
Figura 13. Caracterização da atividade de fosfohidrolases presentes no fluido
apoplástico de raízes transgênicas de trevo (Trifolium repens L.) crescendo em
meio M. Os valores expressam a média das atividades de hidrólise dos substratos
(n=3): adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), pirofosfato (PP
i
) e
polifosfato (PolyP).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
pH
µ
µ
µ
µ
mol Pi mg ptn
-1
min
-1
ATPásica ADPásica
Pirofosfatásica Polifosfatásica
Figura 14. Efeito do pH sobre a atividade de fosfohidrolases presentes no fluido
apoplástico de raízes transgênicas de trevo (Trifolium repens L.) crescendo em
47
meio M. Os valores expressam a atividade específica de hidrólise dos substratos:
adenosina 5`trifosfato (ATP), adenosina 5`difosfato (ADP), pirofosfato (PP
i
) e
polifosfato (PolyP). Barras representam o desvio padrão da média no intervalo de
confiança de 95% (n=3).
4.3 Análises durante a fase simbiótica
4.3.1 Caracterização do fluxo de H
+
em células auxiliares e hifas extra-
radiculares de G. margarita colonizando raízes transgênicas de trevo
Atualmente não se sabe o real papel das células auxiliares de FMAs da
família Gigasporaceae, sendo admitida a sua participação mais como reservatório
de carbono do que como estrutura de absorção de nutrientes. Apesar de não
haver evidência experimental, levantou-se a hipótese de que elas sejam capazes
de gerar novos esporos (Chris Walker - comunicação pessoal). Neste trabalho,
analisamos o perfil do fluxo de H
+
em células auxiliares e hifas extra-radiculares
de Gigaspora margarita colonizando raízes transgênicas de trevo e
compararamos a magnitude dos fluxos na fase simbiótica aos demonstrados
anteriormente durante a fase assimbiótica. Os resultados mostram um pequeno
efluxo de H
+
na ordem de 0.08 - 0.12 pmol cm
-2
min
-1
, ao redor das células
auxiliares de G. margarita (Figura 15), o qual foi inibido totalmente por 5 µM de
eritrosina B (Dados não mostrados). Isto torna possível sugerir que há a presença
de sistemas primários de transporte de H
+
, especificamente de H
+
-ATPases de
membrana plasmática, nestas estruturas externas do FMA durante a fase
simbiótica. Estes dados preliminares sugerem que essas células podem estar
contribuindo para a absorção de nutrientes pelo FMA durante a fase simbiótica.
48
Figura 15. Visão de uma célula auxiliar do FMA G. margarita durante a sua fase
simbiótica colonizando raízes transgênicas de trevo, ilustrando a presença de
efluxos de H
+
(setas pretas) dependente da atividade de H
+
-ATPases. Isto foi
comprovado pela adição de 5 µm de eritrosina B, a qual neutralizou
completamente as atividades de efluxos.
4.3.2 Viabilidade do uso de raízes transgênicas para expressar o real fluxo
de H
+
em sistemas não-transgênicos e para o estudo da simbiose
micorrízica
Já o perfil do fluxo de H
+
da hifa extra-radicular foi significantemente
superior durante a simbiose (Tabela 1). Estes resultados estão corroborando aos
encontrados por Ayling et al. (2000), apesar de ter usado medidas de potencial de
membrana e não microssonda específica a íon.
O uso de raízes transgênicas (RTs) possibilita um estudo da associação
entre fungos micorrízicos e raízes metabolicamente ativas, em condições
controladas, por possibilitar fácil manuseio in vitro, que é impossível de ser feito no
solo (Souza e Berbara, 1999). Estas raízes são desenvolvidas na ausência de
promotores de crescimento, sendo cultivadas por um longo período de tempo,
apresentando estabilidade das características fenotípicas e genotípicas dos
simbiontes envolvidos. Por serem um sistema de cultivo controlado, é possível
realizar o estudo fisiológico de RT colonizadas, principalmente na absorção e
metabolismo de nutrientes (Souza e Silva, 1996).
49
Não existem dados na literatura demonstrando que o fluxo de íons em
raízes transgênicas apresentam o mesmo perfil das não-transgênicas ao longo do
sistema radicular. Nesse contexto, analisamos o perfil do fluxo de H
+
em 4 regiões
de raízes secundárias ativas de plantas de Medicago truncatula, Eucaliptus
globulus e RTs de Trifolium repens, de forma a constatar se o sistema transgênico
pode ser usado nas análises de fluxo de íons de forma a expressar o sistema real
ou natural. Em termos anatômicos, parece não haver diferenças entre as RTs e as
não-transgênicas, sendo as suas regiões funcionais distintas (Figura 16).
Tabela 1. Fluxo de H
+
médios e os seus respectivos erros padrões, em hifas
septadas de Gigaspora margarita durante as fases assimbiótica e simbiótica
(colonizando raízes transgênicas de trevo). Cada posição da sonda representa
uma região da hifa analisada (esporofítica ou extra-radicular) como demonstrado
abaixo. *, significativo e
ns
, não significativo a 1% de probabilidade.
0.5644 (±0.0423)0.3985 (±0.0358)5
SimbióticaAssimbiótica
0.4589 (±0.0352)0.3797 (±0.0235)4
0.5444 (±0.0458)0.4441 (±0.0335)3
0.5932 (±0.0235)0.3762 (±0.0341)2
0.4307 (±0.0112)
0.4229 (±0.0365)1
Posição da
sonda
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
0.5644 (±0.0423)0.3985 (±0.0358)5
SimbióticaAssimbiótica
0.4589 (±0.0352)0.3797 (±0.0235)4
0.5444 (±0.0458)0.4441 (±0.0335)3
0.5932 (±0.0235)0.3762 (±0.0341)2
0.4307 (±0.0112)
0.4229 (±0.0365)1
Posição da
sonda
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
*
*
*
*
ns
50
A
B
C
C
Me
Al
PR
Dif
A
B
C
C
Me
Al
PR
Dif
Figura 16. Visualização do desenvolvimento de raízes secundárias transgênicas
de trevo em cultura axênica. A- Coifa (C), Meristemática (Me), Alongamento (Al);
B- Pêlos Radiculares (PR); C- Diferenciada (Dif) aos 30 dias após a multiplicação.
A figura 17 mostra que existem nas regiões da coifa, meristemática e de
alongamento, fortes domínios de efluxos em ambas raízes, principalmente em RTs
de trevo e raízes de eucalipto. Os domínios de influxos (zonas entre pêlos
radiculares e diferenciadas) são mantidos em todos os tipos de raízes, variando
apenas em magnitude.
Como foi demonstrado na figura 10, existem dois tipos de hifas quanto à
estrutura e septação. Cada tipo funciona de uma forma diferente em termos do
fluxo de H
+
, ambas com efluxo, mas com domínios distintos. Comparando os
fluxos da Figura 17 em RTs, aos da figura 10, levantou-se a dúvida sobre o papel
de cada tipo de hifa nos eventos de penetração no hospedeiro. Observações em
lupa estereoscópica mostraram que as hifas infectivas são aquelas septadas
(Figura 18), pois ocorre intensa ramificação antes da penetração. Isto está de
acordo com diversos estudos prévios usando outros métodos como o
impedimento do contato das raízes com os esporos com o uso de uma membrana
(Giovannetti et al, 1994; Giovannetti, 1997).
51
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
C Me Al PR Dif REF
Região da raiz
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
C Me Al PR Dif
Região da raiz
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
C Me Al PR Dif REF
Região da raiz
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
RT- TREVO
MEDICAGO EUCALIPTO
A
B
C
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
C Me Al PR Dif REF
Região da raiz
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
C Me Al PR Dif
Região da raiz
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
C Me Al PR Dif REF
Região da raiz
Fluxo de H
+
(pmol cm
-2
min
-1
)
RT- TREVO
MEDICAGO EUCALIPTO
A
B
C
Figura 17. Similaridade no perfil do fluxo de H
+
durante as fases iniciais do
desenvolvimento de raízes secundárias de Medicago truncatula (A), Eucaliptus
globulus (B) e raízes transgênicas de Trifolium repens (C). C (Coifa), Me
(Meristemática), Al (Alongamento), PR (Pêlos Radiculares), Dif (Diferenciada)
referem-se as regiões ao longo do sistema radicular analisadas e REF é o valor
de fluxo de H
+
usado como referência baseado no meio de cultura.
Estes resultados mostram que o sistema transgênico funciona semelhante
aos não transgênico no que tange ao fluxo de H
+
. Isto abre um campo para uso
das RTs em estudos in vitro dos efeitos de nutrientes, metais pesados,
52
substâncias específicas e até mesmo da micorrização, servindo como um modelo
representativo de raízes de plantas.
Figura 18. Fotos obtidas com uma lupa estereoscópica no aumento de 10X
evidenciando as estruturas externas de G. margarita colonizando raízes
transgênicas de Trevo (Trifolium repens L). As setas indicam as células auxiliares
e as pontas de setas, hifas infectivas septadas (A, D) e ramificadas na superfície
radicular.
4.3.3 Influência da micorrização sobre a atividade das bombas de prótons
em regiões colonizadas ou não do sistema radicular de milho
As regiões meristemáticas e de alongamento geralmente representam
regiões do sistema radicular em que se encontram as maiores atividades das
bombas de prótons (Jahn et al., 1998) e os maiores efluxos de H
+
(Figura 17),
porém o efeito da colonização micorrízica sobre esse padrão ainda é
desconhecido. Assim, avaliamos em duas regiões do eixo radicular de milho a
53
atividade da H
+
-ATPase do tipo P localizada na membrana plasmática, H
+
-ATPase
do tipo V e H
+
-Pirofosfatase (H
+
-PPase) localizadas na membrana vacuolar, e
também a taxa de colonização micorrízica pelo FMA, G. margarita, aos 30 e 60
dias após a inoculação (d.a.i.).
Aos 30 d.a.i. as raízes apresentaram a predominância de colonização
fúngica em uma região do eixo radicular mais afastada do ápice (15 cm do coleto),
caracterizada pela intensa emergência de raízes laterais e maior freqüência de
pêlos radiculares, denominada de região A. A faixa radicular que compreendia as
regiões de alongamento, meristemática e coifa foi denominada de região B (10-15
cm da coifa). Este modelo foi adotado como padrão na extração das proteínas
membranares e os resultados mostraram uma distinta distribuição espacial da
colonização fúngica sobre a superfície radicular, nos estádios iniciais e mais
avançados da micorrização.
A taxa de colonização micorrízica foi superior na região A, em ambas as
épocas analisadas (Figura 19).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
30 60
Dias após a inoculação (d.a. i.)
Taxa de colonização micorrízica (%)
Região A
Região B
Ba
Aa
Ab
Bb
Figura 19. Taxa de colonização micorrízica (%) de duas regiões do sistema
radicular de plantas de milho, aos 30 e 60 d.a.i.. Médias seguidas de mesma letra
não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As colunas com
letras maiúsculas comparam as médias entre as épocas analisadas e as com
minúsculas comparam as médias numa mesma época.
54
Aos 30 d.a.i., na região A, nenhuma diferença significativa foi encontrada
entre os tratamentos inoculados ou não, para todas enzimas estudadas (Tabela 2).
Os resultados obtidos com vesículas de membrana plasmática mostraram que aos
30 d.a.i., na região B, houve uma inibição de quase 30% na atividade da P-H
+
-
ATPase do tratamento inoculado comparado ao não-inoculado, contudo aos 60
d.a.i. foi observado um estímulo de quase 200% (Tabela 2, Figura 20). No caso das
bombas vacuolares, a V-H
+
-ATPase apresentou o mesmo comportamento da P-H
+
-
ATPase, com isso baixas atividades de hidrólise de ATP foram encontradas na
região B aos 30 d.a.i. (Figura 21). Entretanto, contrário ao observado nas ATPases,
foi observado um estímulo de 161% na atividade da H
+
-PPase da membrana
vacuolar, na mesma região, aos 30 d.a.i. (Figura 22, Tabela 2).
Tabela 2. Porcentagem de inibição (-) ou estimulação (+) das atividades
Vanadato-dependente da H
+
-ATPase de membrana plasmática (P-ATPase),
Nitrato-dependente da H
+
-ATPase vacuolar (V-ATPase) e Potássio-dependente
da H
+
-PPase vacuolar (V-PPase) em membranas purificadas isoladas de duas
regiões (A, B) do sistema radicular de milho, inoculado com Gigaspora margarita.
Os dados das atividades enzimáticas são expressos em porcentagem do controle
não-inoculado
Atividade enzimática (%)
Atividade
Tempo
(d.a.i.)
Região A Região B
30 +15,15
n.s.
-28,77 *
P-ATPase
60 +83,04 * +195,63 *
30 +9,67
n.s.
-6,25
n.s.
V-ATPase
60 +137,39 * +9,87
n.s.
30 -14,78
n.s.
+161,40 *
V-PPase
60 -13,35
n.s.
+40,33
n.s.
n.s.
Não significativo, * Significativo ao nível de probabilidade α = 5% pelo teste F.
Aos 60 d.a.i., a P-H
+
-ATPase teve sua atividade estimulada em quase
85% na região A e 200% na região B, ressaltando a participação das bombas
fúngicas nesta ativação. Quanto às bombas vacuolares, verificou-se somente uma
estimulação na atividade da V-H
+
-ATPase, sendo que no caso da V-H
+
-PPase
não foi significativa.
55
Os resultados indicam que os FMAs podem influenciar negativamente a
atividade das ATPases nos estádio iniciais da colonização, principalmente, nas
regiões posteriores a sua zona de maior colonização (Figura 19, Tabela 2).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
C Gm
Tratamento
Atividade específica (
µ
µ
µ
µ
mol P
i
mg ptn
-1
min
-1
)
Região A
Região B
30 d.a.i.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
C Gm
Tratamento
Atividade específica (
µ
µ
µ
µ
mol P
i
mg ptn
-1
min
-1
)
Região A
Região B
60 d.a.i.
Ab
Ab
Aa
Ba
Aa
Ab
Aa
Aa
Figura 20. Atividade ATPásica de membrana plasmática sensível a vanadato (∆
Vanadato), aos 30 e 60 d.a.i., em duas regiões do sistema radicular de plantas de
milho não-inoculadas (C) ou inoculadas com Gigaspora margarita (Gm). Médias
seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade. As barras com letras maiúsculas comparam as médias entre
tratamentos, numa mesma região da raiz e as com letras minúsculas comparam
médias entre as regiões da raiz, num mesmo tratamento.
56
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
C Gm
Tratamento
Atividade específica (
µ
µ
µ
µ
mol P
i
mg ptn
-1
min
-1
)
Região A
Região B
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
C Gm
Tratamento
Atividade específica (
µ
µ
µ
µ
mol P
i
mg ptn
-1
min
-1
)
Região A
Região B
30 d.a.i.
60 d.a.i.
Aa
Aa
Aa
Ab
Ba
Aa
Aa
Ab
Figura 21. Atividade ATPásica vacuolar sensível a nitrato (∆ Nitrato), aos 30 e 60
d.a.i., em duas regiões do sistema radicular de plantas de milho não-inoculadas
(C) ou inoculadas com Gigaspora margarita (Gm). Médias seguidas de mesma
letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As barras com
letras maiúsculas comparam as médias entre tratamentos, numa mesma região
da raiz e as com letras minúsculas comparam médias entre as regiões da raiz,
num mesmo tratamento.
57
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
C Gm
Tratamento
Atividade específica (
µ
µ
µ
µ
mol P
i
mg ptn
-1
min
-1
)
Região A
Região B
30 d.a.i.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
C Gm
Tratamento
Atividade específica (
µ
µ
µ
µ
mol P
i
mg ptn
-1
min
-1
)
Região A
Região B
60 d.a.i.
Aa
Ba
Ab
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Figura 22. Atividade PPásica vacuolar sensível a potássio (∆ Potássio), aos 30 e
60 d.a.i., em duas regiões do sistema radicular de plantas de milho não-
inoculadas (C) ou inoculadas com Gigaspora margarita (Gm). Médias seguidas de
mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. As
barras com letras maiúsculas comparam as médias entre tratamentos numa
mesma região da raiz e as com letras minúsculas comparam médias entre as
regiões da raiz, num mesmo tratamento.
58
Alterações celulares são encontradas nas células colonizadas por FMA
nas raízes de milho, podendo também interferir na ativação diferencial das
bombas (Figura 23, 24 e 25).
As V-H
+
-ATPases e V-H
+
-PPases estão presentes também em vesículas
da via secretória e podem influenciar no tráfego e na função destas vesículas
(Forgac, 1999; Maeshima, 2000; Sun-Wada et al., 2003; Wilkens et al., 2005). A
análise de ultraestrutura possibilitou visualizar uma intensa vesiculação no espaço
intermembranar entre as células corticais e as hífas de FMA (Figura 24). Pode-se
observar uma alta concentração destas vesículas próximas a plasmalema de uma
célula cortical colonizada.
Figura 23. Fotomicrografia de secção transversal de raízes de milho UENF 506-6
colonizadas por G. margarita. A, Visão geral mostrando a colonização do
parênquima cortical por hifas e arbúsculos (setas), aumento de 560x. B, Detalhe
da colonização de células do parênquima cortical por estruturas infectivas do
fungo micorrízico, exibindo células hipertróficas, aumento de 790X.
59
h
pc
ep
mp
h
pc
ep
mp
Figura 24. Eletromicrografia de transmisão de detalhe de uma célula do
parênquima cortical exibindo estruturas vesiculares no espaço periplasmático (ep)
localizado entre a parede celular (pc) e a membrana plasmática (mp) em contato
com uma hifa intercelular (h) de G. margarita.
60
Figura 25. Eletromicrografia de transmisão de detalhe da junção entre a
endoderme (e) e uma célula do parênquima cortical. Notar comunicação
simplástica por meio de plasmodesmas (Seta) entre as células em um sítio de
degradação da parede celular por hifas infectivas.
5. DISCUSSÃO
Na ausência de uma raiz hospedeira, e até mesmo quando os esporos de
FMA são germinados em meio rico em nutrientes, o crescimento da hifa cessa
após alguns dias ou semanas, dependendo da espécie fúngica e das condições
de cultivo. Este caráter biotrófico obrigatório dos FMAs tem dificultado muito o
estudo do seu desenvolvimento assimbiótico. Aqui, mostramos a primeira
dinâmica do fluxo de H
+
em hifas de G. margarita usando a técnica da
microssonda vibrátil seletiva ao H
+
, que possibilita a detecção em tempo real das
mudanças na atividade de um íon específico na superfície de células vivas. Este
parâmetro mostra-se biologicamente mais consistente que as concentrações
medidas por outras técnicas invasivas (Miller, 1995).
5.1 Perfil do fluxo de H
+
em azigosporos e hifas esporofíticas
Um gradiente eletroquímico assimétrico foi formado ao redor de esporos,
pelos quais pode ser possível estimar o local de emergência de tubos
germinativos (Figura 5). Embora ambos esporos germinados ou não demonstram
a mesma distribuição polarizada dos fluxos de H
+
, a magnitude destes fluxos foi
muito inferior nos germinados. Isto sugere que a ativação do fluxo polarizado de
H
+
, através do corpo do esporo, ocorre especificamente antes da emissão de
tubos germinativos, sugerindo que um sinal iônico pode estar envolvido no
62
desencadeamento deste processo. Assim, uma vez a primeira hifa emergida, este
sinal é atenuado. Este resultado está de acordo com os encontrados por Berbara
et al. (1995) que descreveu um campo elétrico formado no esporo, o qual foi
correlacionado com a direção de germinação do esporo. Porém, os dados obtidos
por Berbara et al. (1995) representaram correntes elétricas totais medidas com
microssonda de uma-dimensão (one-dimension vibrating probe) não seletiva a
íons, e por isso não foi possível discriminar a participação do (s) principal (is) íon
(s) envolvido (s).
Na hifa em crescimento, os maiores efluxos de H
+
foram observados na
região sub-apical, entre 10 e 40 µm do ápice da hifa (Figura 6). Alguns resultados
correlatos foram publicados por Jolicoeur et al. (1998), o qual mediram com sonda
fluorescente o pH intracelular de tubos germinativos de G. margarita crescida nas
mesmas condições do presente trabalho. Jolicoeur et al. (1998) encontraram uma
elevada alcalinização do citossol das hifas na mesma faixa onde mostramos as
maiores atividades de efluxos de H
+
(10 a 40 µm do ápice da hifa), em
consonância com isto, o efluxo de H
+
e o pH interno diminuíram com o aumento
da distância do ápice (Figura 7). Os fluxos de H
+
no ápice das hifas não-septadas
ainda precisam ser melhor estudados, pois neste trabalho estes foram medidos
quando a hifa já se ramificara, enquanto que não foram obtidos dados do fluxo de
H
+
no ápice das hifas primárias nos momentos iniciais da sua emissão pelo
esporo. A magnitude dos fluxos de H
+
detectados em hifas de G. margarita (0,2-
2,5 pmol cm
-2
min
-1
) foi muito inferior aos observados em células de plantas, tais
como pêlos radiculares e tubos polínicos (Cárdenas et al., 1999; Cárdenas et al.,
2000; Feijó et al., 1997). Tal diferença pode ser relacionada à natureza,
abundância e/ou balanço existente entre os sistemas primários e secundários de
transporte de H
+
presentes nas membranas plasmáticas de plantas e fungos.
Nestas membranas celulares, o transporte de íons é energizado pelas bombas de
H
+
(H
+
-ATPases do tipo P), que bombeiam o H
+
para fora da célula às custas da
hidrólise de ATP (Portillo, 2000). Ferrol et al. (2000) identificaram cinco genes de
Glomus mosseae (parcialmente clonados) codificando H
+
-ATPases de membrana
plasmática. A análise filogenética mostrou que em fungos micorrízicos, como em
outros fungos e plantas, a H
+
-ATPase de membrana plasmática é codificada por
uma família multigênica. É bem documentada a significância dos FMAs no
aumento da absorção de P
i
em plantas micorrizadas (Smith e Read, 1997;
63
Karandashov e Bucher, 2005), e acredita-se que seja devido a um sinergismo
existente entre as H
+
-ATPases e os transportadores de P
i
que podem ser
modulados espacialmente e temporalmente nas hifas fúngicas durante a simbiose
micorrízica.
5.2 Efeito de inibidores das ATPases do tipo P sobre o fluxo de H
+
Os fluxos de H
+
ao redor das hifas foram susceptíveis ao ortovanadato de
sódio (Na
3
VO
4
) e a eritrosina B, dois inibidores das ATPases do tipo P (Wach e
Graber, 1991). Os efluxos de H
+
nas hifas ativas foram inibidos parcialmente por
350 µM de eritrosina B, mas completamente inibidos por 5 µM de vanadato
(Figura 6B e 7). Entretanto, o fluxo de H
+
localizado no ápice da hifa foi abolido
completamente por ambos vanadato e eritrosina B e a adição de 350 µM deste
último resultou em uma pequena inibição na atividade de efluxo de H
+
na região
sub-apical à 20 µm do ápice (Figura 7). Previamente, foi relatado que duas
isoformas de H
+
-ATPases de leveduras apresentaram sensibilidades diferentes a
estes inibidores (van Dyck et al., 1990; Wach e Graber, 1991). Apesar de a
susceptibilidade do fluxo de H
+
para estes inibidores ser consistente com os fluxos
de H
+
gerados por H
+
-ATPases fúngicas, ainda é necessário um estudo
aprofundado, com imuno-localização e avaliações da expressão da atividade
destas proteínas ao longo da hifa do FMA.
Os nossos dados indicam uma relação entre atividade de efluxo de H
+
dependente das H
+
-ATPases e os valores de pH citossólico obtidos por Jolicoeur
et al. (1998), mas ainda é controversa a ação majoritária das bombas de H
+
como
os principais responsáveis pelo controle do pH citossólico (ver Felle, 1988, 1991,
1998, 2001). Segundo Felle (1998) não apenas as bombas de H
+
mas também os
canais de cátions podem contribuir na regulação do pH extracelular. A técnica
usada neste trabalho detecta a dinâmica local do fluxo extracelular de íons H
+
na
superfície das hifas e com a adição de inibidores específicos podemos discriminar
a contribuição de co-transportadores, fluxo de ácidos orgânicos e íons K, e
principalmente das bombas. A eritrosina B por alterar menos o pH do meio e fluxo
total da hifa, em comparação ao vanadato, mostra um perfil de inibição da H
+
-
ATPase assimetricamente distribuída ao longo da hifa fúngica, como teorizado.
64
Segundo Coccuci e Marré (1986), a eritrosina B seria mais ativa que o vanadato
em inibir atividade ATPásica, por um mecanismo parecido ao do vanadato. Além
disso, a eritrosina B inibe a V-ATPase e não afeta como o vanadato as outras
classes de fosfohidrolases que possuem intermediário fosforilados (Coccuci e
Marré, 1986).
Deve-se ressaltar, que o efluxo de H
+
também pode depender do balanço
de co-transportadores que levam H
+
e outros íons para dentro e fora das células.
Já foi relatado que o vanadato entra nas células por meio do sistema de
transporte de P
i
e inibe o crescimento do fungo Neurospora crassa (Bowman,
1982; Bowman et al., 1983). Assim, no caso do vanadato, a total inibição do
efluxo de H
+
aliado ao pequeno influxo observado na faixa entre 10 e 40 µm
(Figura 1A), poderia representar a atividade de transportadores de P
i
na
membrana, transportando H
+
e vanadato para o interior das células fúngicas,
seguidos pela inibição das H
+
-ATPases. Freqüentemente, as várias espécies de
vanadato que aparecem em função do pH do meio, podem influenciar
diferencialmente na atividade da enzima por diversos mecanismos, entre os quais
induzir stress oxidativo (Aureliano e Gândara, 2005). Entretanto, é de extrema
importância, em futuros estudos, caracterizar precisamente os efeitos das
espécies de vanadato e a sua interação com o nosso sistema. Segundo Aureliano
e Gândara (2005), os estudos com vanadato nos sistemas biológicos são
comparáveis ao fenômeno de um iceberg: existe uma parte invisível,
provavelmente não a mais interessante, mas certamente a maior de todas. O co-
transporte de H
+
junto com outros íons também presentes no meio M, pode
contribuir aos influxos observados após inibição das bombas de H
+
.
A predominância de efluxos de H
+
na região sub-apical pode indicar a
maior abundância e/ou atividade das H
+
-ATPases sobre os co-transportadores
secundários de íons presentes nesta região. Estes dados estão corroborando com
estudos prévios. Por exemplo, usando um método citoquímico para detecção da
atividade de hidrólise de ATP, Lei et al. (1991) descreveram uma atividade
ATPásica sensível a dietilbestrol, localizada principalmente nas regiões anteriores
a 70 µm do ápice da hifa, e que se correlacionou com a absorção de
32
P
i
.
Mais recentemente, Requena et al. (2003) analisaram os efeitos da
disponibilidade dos nutrientes Sac e P
i
na expressão de duas isoformas de H
+
-
ATPases do tipo P do FMA Glomus mosseae (GmPMA1 e GmHA5). Foi descrito
65
que GmPMA1 era altamente expresso durante o desenvolvimento assimbiótico do
FMA, entretanto, a acumulação de transcritos de GmHA5 foi induzida na fase de
formação de apressório (pré-simbiose). Os autores relataram que GmHA5 sofreu
supressão por Sac e induzido por P
i
, enquanto GmPMA1 quase não foi afetado
por estes nutrientes. Porém, uma análise mais detalhada dos dados revela uma
tendência de GmPMA1 ser induzido na presença de Sac também pela ausência
de P
i
. Nos experimentos de Requena et al. (2003) foi utilizado o mesmo meio M e
com as mesmas concentrações de KH
2
PO
4
e Sac (35 µM e 29 mM,
respectivamente) adotadas neste trabalho de tese. Então, é provável que os
maiores efluxos de H
+
encontrados na região sub-apical de hifas crescendo em
meio sem P
i
e na presença de Sac (coluna escura, Figura 8B) poderiam ser
ativados pela isoforma de H
+
-ATPase, GmPMA1, em Gigaspora margarita, como
descrito para Glomus mosseae. Isto é consistente com a noção de que o status
de nutrientes do fungo possa regular a atividade e expressão das H
+
-ATPases ao
longo das hifas (Requena et al., 2003) e que tal regulação pode ser conservada
em diferentes espécies de FMAs.
No entanto, como os H
+
são os maiores responsáveis pelas correntes
geradas numa célula vegetal ou fúngica em crescimento polarizado, os nossos
efluxos no ápice de hifas não-septadas primárias são contrários ao relatado na
literatura em outros organismos celulares como: Achlya (Darryl et al., 1984);
Neurospora crassa (Harold e Caldwell, 1990); Gigaspora margarita (Berbara et al.,
1995), pêlos radiculares (Weisenseel et al., 1979) e tubos polínicos (Feijó et al.,
1997). Todavia, o único trabalho com FMA, mediu correntes elétricas totais
(Berbara et al, 1995) e não usou as mesmas condições experimentais realizadas
neste e em outros trabalhos (Lei et al., 1991; Ayling et al., 2000; Requena et al.,
2003). Medimos os fluxos de H
+
em meio M de cultivo (Quadro 1), meio completo
com macro e micronutrientes e também vitaminas. Darryl et al. (1984), usando a
mesma técnica da microssonda vibrátil, relataram que as correntes de H
+
no ápice
de hifas de Achlya foram moduladas mais pela presença do aminoácido metionina
no meio de cultura do que pelo próprio metabolismo. A retirada de cálcio do meio
alterou o padrão de influxo de correntes ao longo das hifas para efluxo. Os
autores acreditam que transportadores secundários H
+
/metionina estejam
localizados no ápice. Assim, existe a necessidade de estudos futuros sobre os
66
efeitos de diferentes nutrientes do meio M sobre o perfil do fluxo de H
+
na região
apical de hifas de FMAs.
As ATPases desempenham um importante papel no controle do fluxo H
+
nas membranas fúngicas. Além disso, foram descritos pelo menos cinco genes
que codificam de H
+
-ATPase de membrana plasmática em Glomus mosseae
(Ferrol et al., 2000), porém, não há nenhuma informação sobre a expressão ou
regulação da sua atividade em outros fungos micorrízicos. No conjunto, estes
dados reforçam a suposição de que diferentes isoformas de H
+
-ATPase fúngicas
poderiam estar presentes ao longo da hifa e talvez, possam ser recrutadas nas
diferentes fases do desenvolvimento, possivelmente em resposta às diversas
exigências da simbiose (Requena et al., 2003), bem como da assimbiose.
5.3 Análise morfológica
Neste estudo é observado um padrão, em que a ativação do fluxo de H
+
apresenta em domínios específicos, os quais parecem desempenhar um papel
organizacional na emergência de hifas, ramificações e crescimento de celular
apical (Figura 9).
Também é provável que os fluxos de H
+
estejam envolvidos na
organização e movimento daquelas estruturas internas (grânulos escuros
pequenos) no ápice de tubos germinativos (Figura 6C). A natureza destes
grânulos observados no ápice de hifas não foi elucidada neste estudo, mas
sabemos que eles se comportaram como se fosse uma parte ativa da hifa em
alongamento. Em fungos fitopatogênicos, estruturas semelhantes denominadas
“Spitzenkörper” estão presentes no ápice de tubos germinativos e são
considerados marcadores internos fundamentais do crescimento celular
(Bartnicki-Garcia et al., 2000). Hifas asseptadas se estendem pela deposição de
constituintes para formação da nova parede celular e da membrana plasmática no
ápice da hifa, e o seu crescimento polarizado depende do transporte ao ápice de
vesículas derivadas do Golgi contendo enzimas relacionadas a biossíntese de
parede celulares e membranas (Gooday, 1983; Harold e Caldwell, 1990).
Na região sub-apical da hifa, o domínio dos maiores efluxos de H
+
, foi
encontrado um comportamento particular de vesículas internas e grânulos
67
escuros, seguidos de uma intensa corrente citoplasmática bi-direcional. Como os
efluxos de H
+
foram correlacionados com as alterações no pH citossólico da hifa
de G. margarita (Figura 7), e assumindo que este parâmetro exerce forte
influência no tráfico de vesículas internas (Stevens, 1992), e juntos estes eventos
podem representar uma parte fundamental do mecanismo de crescimento celular
polarizado e morfogênese de hifas de FMAs.
5.4 Efeitos de P
i
e Sac no fluxo de H
+
e na morfologia das hifas
Evidências mostraram que a disponibilidade de P
i
e indiretamente a de
Sac podem exercer forte influência na simbiose micorrízica arbuscular. Altas
concentrações de P
i
na solução do solo podem promover efeitos inibitórios no
crescimento de hifas extra e intra-radiculares (Smith e Read, 1997) e no
estabelecimento da interação micorrízica arbuscular. Já a Sac foi relatado diminuir
o crescimento e ramificação de hifas de FMAs durante a fase assimbiótica
(Mosse, 1959; Mugnier e Mosse, 1987). Este fenômeno pode ser correlacionado
aos baixos efluxos de H
+
encontrados em hifas crescidas em meio M completo,
contendo 29 mM Sac e 35 µM P
i
(Figura 8). Realmente, nesta condição, foram
observadas as menores taxas de ramificação e crescimento das hifas (Figura 9),
o qual está de acordo com estudos prévios que relataram um efeito negativo da
Sac na germinação e crescimento de hifas de G. mosseae (Mosse, 1959) e G.
margarita (Siqueira et al., 1982). Por outro lado, os maiores efluxos de H
+
foram
encontrados na região sub-apical de hifas crescidas na ausência de P
i
, mas em
meio contendo Sac. Porém, na ausência de Sac, o nível de P
i
no meio M, não
influenciou os fluxos de H
+
ao longo das hifas (Figura 8). Tal dependência do
efeito estimulatório da exclusão de P
i
nos fluxos de H
+
em função da Sac, sugere
que esta poderia ser usada pelo FMA igualmente durante o desenvolvimento
assimbiótico e simbiótico. Para isto, seria necessário energizar o bombeamento
de H
+
na hifa, o qual seria regulado positivamente em resposta a ausência de P
i
de forma a ativar os transportadores simporter H
+
/P
i
(Harrison e van Buuren,
1995). Estes transportadores em fungos são capazes de absorver P
i
com muito
mais afinidade que os de células de plantas (Harrison e van Buuren, 1995; Smith
et al., 2003; Silveira e Cardoso, 2004). É provável, também, que a alta
68
disponibilidade de P
i
aumente a síntese e metabolismo do ATP no FMA, por
conseguinte promova estimulação da utilização de açúcar pelos fungos. Por outro
lado, não devemos esquecer que as H
+
-ATPases são necessárias para
estabelecer a força próton-motriz requerida para o co-transporte de H
+
e íons PO
4
-
e de outros solutos, inclusive açúcares (Palmgren, 2001; Schachtman et al., 1998;
Raghothama, 1999).
Em plantas sob condições de baixa disponibilidade de P
i
, o P
i
citossólico é
mantido dentro de uma faixa de contração ótima, através de liberação de P
i
do
vacúolo (Mimura, 1995) e estudos com células de leveduras fornecem evidências
para uma situação similar, na qual o pool de P
i
citossólico é mantido pela
remobilização de depósitos vacuolares (Shirahama et al., 1996). Durante a
deprivação do nutriente, o pool de P
i
interno decresce, e em resposta, as raízes
induzem a expressão de transportadores de P
i
de alta afinidade, mudanças na
arquitetura radicular e acidificação da rizosfera, aumentando a atividade de
fosfatases ácidas e promovendo a exsudação de ácidos orgânicos de baixo peso
molecular (Vance et al., 2003). Acredita-se que a baixa disponibilidade de P
i
pode
reduzir a síntese de fosfolipídeos, tornando as membranas celulares de raízes
mais permeáveis (Graham et al., 1981), mas isto deve perturbar a homeostase
iônica da célula e, possivelmente, ocorra apenas sob stress prolongado. Porém,
os nossos dados mostram uma ativação no fluxo extracelular de H
+
das hifas na
ausência de P
i
, como acontece nas raízes (Vance et al., 2003), sugerindo a
presença de um mecanismo de controle nos FMAs similar ao das plantas. Além
disso, o gradiente de H
+
observado nesta condição também mostra que a
membrana deve estar bem preservada estruturalmente.
Outra hipótese é que o P
i
possa afetar negativamente a atividade de
enzimas relacionadas ao metabolismo da sacarose, como acontece durante a
fase simbiótica (Graham et al., 1997; Wright et al., 1998a; Miller et al., 2002). Em
plantas de Citrus, baixos teores de sacarose foram encontrados em raízes
micorrizadas (Graham et al., 1997). Já o aumento na concentração de P
i
na
planta, crescendo sob alto P
i
, também foi associado com o decréscimo no
conteúdo de carboidratos solúveis nas raízes micorrizadas (Graham et al., 1981).
A atividade de enzimas como a sacarose sintase e invertases (citoplasmáticas e
de parede celular), aumentaram paralelamente à taxa de colonização micorrízica
(Wright et al., 1998a; Miller et al., 2002). Estas enzimas têm sido relacionadas à
69
regulação de drenos em tecidos de plantas. Além disso, as suas atividades
aumentam precedendo a estimulação da taxa fotossintética (Miller et al., 2002),
aumento no conteúdo de trealose (carboidrato solúvel específico e exclusivo de
fungos) e dos lipídeos em raízes micorrizadas (Wright et al, 1998a). Os genes da
sacarose sintase mostraram ser super-expressos em raízes de milho micorrizadas
sob baixo P
i
e inibidos em alto P
i
(Ravnskov et al., 2003), coincidindo com as
análises da atividade da enzima (Miller et al., 2002).
É possível que a disponibilidade de P
i
possa modular também a
expressão de invertases durante a fase assimbiótica do FMA, mas até o presente
momento não foi relatada a presença de invertases em hifas esporofíticas de
FMAs. Sutton et al. (1999) por meio de ensaios de absorção e competição de
açúcares em míldios associados à plantas de trigo, mostraram que a Sac é
hidrolisada por invertases do trigo antes da absorção. A utilização de sacarose
pelos fungos ectomicorrízicos Amanita muscaria e Hebeloma crustuliniforme
também depende da atividade de invertases de parede celular do hospedeiro
(Salzer e Hager, 1991). Assim, com a disponibilidade de sacarose haveria uma
maior quantidade de glicose, que é o açúcar fúngico, a ser transportado para o
interior do FMA na interface apoplástica. Para que isto ocorra, seria necessária
uma maior quantidade de H
+
extracelular para o co-transporte H
+
/Glicose,
conseqüentemente uma ativação do fluxo de H
+
, dependente das H
+
-ATPases de
membrana plasmática é requerida.
A maior taxa de crescimento de hifas foi correlacionada com a intensa
septação da hifa crescendo em meio sem P
i
e Sac. Anteriormente, uma intensa
septação nas hifas foi correlacionada como uma resposta comum das hifas ao
estresse nutricional (Smith e Read, 1997) e ao interrompimento do crescimento,
até que sinais do hospedeiro re-orientem o crescimento. Neste caso, a expansão
da hifa parece ser dirigida, principalmente, através de um mecanismo de
crescimento vacuolado. Se o fungo não encontrar a raiz hospedeira para colonizá-
la, ao término do processo hifas esporofíticas laterais aparecem septadas e o
esporo entraria novamente em dormência (Bago et al., 1998). Interessantemente,
as hifas septadas exibem um perfil de fluxo de H
+
semelhante ao daquelas não-
septadas (Figura 6). Entretanto, parece que o FMA pode usar a ativação do efluxo
de H
+
apical como uma resposta para localizar e infectar as raízes hospedeiras,
como acontece em interações patogênicas (van West et al. 2002).
70
5.5 Efeito do fluido apoplástico de raiz (FAR) sobre o fluxo de H
+
de hifas
esporofíticas
As respostas de esporos de G. margarita a fatores radiculares tais como
os presentes no FAR foram previamente estudados em termos da estimulação no
crescimento (Bécard e Piché, 1989) e ramificação do micélio (Graham, 1982; Carr
et al., 1995). Em testes em condições axênicas com exsudatos solúveis ou
extratos de raízes de plantas hospedeiras como por exemplo Trifolium repens
(Nair et al., 1991), foram observados estímulos significativos no crescimento e
ramificação de hifas (Graham, 1982; Elias e Safir, 1987; Gianinazzi-Pearson et al.,
1989). Por outro lado, exsudatos radiculares extraídos de Lupinus spp, uma
planta não hospedeira, não induziram o crescimento pré-simbiótico de hifas de
FMAs, ou simplesmente o inibiram (Oba et al., 2002). Buee et al. (2000)
descreveram o isolamento de um fator ativo (fator de ramificação) contido em
exsudatos radiculares de mais de 11 espécies de plantas micotróficas, e
encontraram que plantas de Medicago, Ervilha e Batata, transgênicas ou não,
possuíam o mesmo fator. Entretanto, plantas não-micotróficas, como das famílias
Chenopodiaceae e Brassicaceae, não apresentavam o fator isolado que induzia
ramificação de hifas durante o desenvolvimento assimbiótico (Buee et al., 2000).
Em termos dos efeitos da adição de FAR de trevo (leguminosa
micotrófica) sobre o perfil do efluxo de H
+
em hifas de G. margarita, uma forte
estimulação foi detectada, principalmente na região apical, variando com o status
de P
i
em que o fungo se desenvolvia (Figura 11). Os menores efluxos de H
+
foram
encontrados na presença de P
i
(como descrito nos itens 4.4 e 5.8, Figura 8), os
quais aumentaram após adição de 10 ou 20 µL de FAR (Figura 11A, Tabela 3).
Entretanto, menores estimulações foram na ausência de P
i
(Figura 11B).
Controles experimentais foram feitos para descartar possíveis artefatos da técnica
da microssonda vibrátil, em que o FAR não afetou a calibração da sonda (Figura
4) ou o pH do meio M, que é usado como referência (Figura 19).
71
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
6.0
6.1
6.2
6.3
6.4
Controle 10 FAR 20 FAR
Referência
pH
Figura 26. Efeito da adição de 10 e 20 µL do fluido apoplástico de raízes (FAR)
de trevo sobre o pH do meio de medição dos fluxos de H
+
em hifas de Gigaspora
margarita, usando uma microssonda vibrátil seletiva ao H
+
. A adição do FAR não
afetou o pH do meio de referência em ambas doses utilizadas. As barras
representam o desvio padrão da média no intervalo de confiança de 95% (n=5).
Tabela 3. Porcentagem de estimulação (%) do efluxo de H
+
em hifas de G.
margarita após adição de duas doses de fluido apoplástico de raízes (RAF) e em
função do status de P
i
que o FMA se desenvolveu
+ FOSFATO
_____________________________________
Distância do ápice (µm)
____________________________________
FAR
0 10 20 30 40 50 75 100 200 300
10 µL 188.8 81.4 54.5 32.4 94.3 72.3 61.9 11.0 34.1 -3.4
20 µL 474.1 339.8 399.3 373.3 496.6 390.4 324.2 205.0 85.0 59.7
- FOSFATO
FAR
_____________________________________
Distância do ápice (µm)
____________________________________
10 µL
203.0 110.6 123.2 71.7 80.0 138.4 230.8 71.47 116.0 107.8
20 µL 244.2 91.9 98.2 102.2 79.7 187.1 289.2 194.2 132.4 124.2
Estudos anteriores sobre os efeitos de fatores radiculares em hifas de
Gigaspora sp complementam os dados obtidos neste trabalho (Jolicoeur et al.,
1998; Ayling et al., 2000; Tamasloukht et al., 2003).
Lei et al. (1991) encontraram um aumento no crescimento de tubos
germinativos de G. margarita na presença de exsudatos radiculares, e quando foi
adicionado o Dietilbestrol, um inibidor das H
+
-ATPases de membrana plasmática
menos específico que o vanadato, o crescimento reduziu-se em quase 56%.
Apesar disso, em tubos germinativos na ausência de exsudatos, o inibidor não
72
teve efeito. Estes dados com inibidor levam ao pressuposto de que FMAs na fase
assimbiótica não apresentam atividade ATPásica, o que é totalmente improvável,
baseando-se, principalmente, nos resultados deste trabalho de tese e nos
conhecimentos atuais com ferramentas moleculares (Ferrol et al. 2000a; Ferrol et
al, 2000b; Requena et al., 2003).
Resultados semelhantes, com estudos eletrofisiológicos, também
mostraram uma hiperpolarização de hifas de G. margarita simultaneamente à
adição de extratos de raízes hospedeiras ao meio de cultivo (Ayling et al., 2000).
Usando uma sonda fluorescente sensível a pH (BCECF), Jolicoeur et al. (1998)
descreveram uma alcalinização no pH citossólico da região apical de tubos
germinativos de G. margarita (0-20 µm do ápice), quando as hifas estavam
crescendo sob um papel de filtro posicionado sobre raízes hospedeiras, evitando
assim o contato direto com as raízes, mas em pleno contato com os exsudatos
liberados. A limitação desta técnica deriva da impossibilidade de fornecer
informações sobre as alterações de pH nos momentos posteriores à adição do
fator radicular. As respostas imediatas do FMA ao FAR, estimadas por intermédio
do fluxo extracelular de H
+
obtidas nesta tese e as estimulações na expressão de
genes de enzimas mitocondriais encontrados por Tamasloukht et al. (2003),
podem ser detectados minutos após a adição do fator radicular, o que foi
impossível nos estudos com as sondas.
Ainda faltam evidências que associam as rápidas estimulações no efluxo
de H
+
e na expressão de genes, com os eventos que regulam as alterações
celulares na hifa antes da penetração no hospedeiro.
Acreditamos que as ativações no efluxo de H
+
e possivelmente no pH
citossólico, devido à regulação da atividade das bombas de H
+
e dos co-
transportadores, sejam eventos correlatos. Contudo, ambos podem se expressar
sinérgicamente na presença de FAR, desempenhando um papel importante na
sinalização que desencadeia os processos de reconhecimentos dos simbiontes.
73
5.6 Caracterização inicial de enzimas presentes no fluido apoplástico de
raízes de trevo
O contato da hifa do FMA com a raiz hospedeira pela adesão na
superfície radicular induz a formação do apressório, o qual não se forma em
raízes mortas. Esta mudança morfogênica da hifa na superfície das raízes indica
que o FMA interage, primariamente, com a parede celular da planta hospedeira,
mas para que haja reconhecimento funcional, a superfície deve apresentar
atividade metabólica, ou seja, um apoplasto ativo.
O apoplasto tem um papel importante em diversos processos, incluindo a
sinalização intercelular, interação planta-microganismos e no transporte de água e
nutrientes (Yu et al., 2000). Os constituintes de parede celular e o fornecimento de
nutrientes às raízes, influenciam diretamente a composição do fluido apoplástico,
o qual pode afetar a relação planta-microrganismo (Sattelmacher, 2001). Acredita-
se também, que certos constituintes das paredes das plantas quando liberados de
raízes laterais através do córtex e epiderme poderiam agir como sinais ou
estimulantes ao crescimento de hifas de FMAs (Nagahashi et al., 1996).
Assumindo a importância do apoplasto radicular para o reconhecimento e
formação de apressório pela hifa dos FMAs, podemos especular sobre a
presença de moléculas ou compostos específicos com função sinalizadora no
fluido apoplástico.
Dentro deste contexto, a natureza química do sinal responsável pelas
estimulações no efluxo de H
+
das hifas esporofíticas, após adição de FAR de
trevo, ainda não é conhecida, precisando ser estudada de forma a caracterizar a
participação de proteínas/enzimas, hormônios, nutrientes e até mesmo outros
moduladores. Para iniciar os testes sobre a natureza química do sinal contido no
FAR, a amostra de FA foi aquecida a 95°C por 5 minutos e analisamos os efeitos
do novo FAR tratado termicamente sobre o fluxo de H
+
, nas mesmas condições
do controle (não aquecido). Os resultados mostraram que o sinalizador contido no
FAR, provavelmente seja uma substância termo-sensível, pois nenhuma
estimulação na atividade de efluxo de H
+
foi observada, pelo contrário, ocorreu
uma inversão radical (Figura 12).
Souza (2002) estudou o proteoma do fluido intercelular (ou fluido
apoplástico) de raízes de cana-de-açúcar inoculadas ou não com Glomus clarum,
sob alto e baixo P
i
. O autor encontrou que no FAR de plantas não-inoculadas e
74
sob baixo P
i
, como neste estudo, foram detectadas 36 proteínas, sendo 6 destas
proteínas presentes apenas no FA de plantas não-inoculadas e podem
representar proteínas vegetais cujos genes são silenciados em raízes colonizadas
(Souza, 2002). Uma análise comparativa das proteínas de FAR de plantas não-
inoculadas sob baixo P
i
e alto P
i
revelaram que 16 proteínas estão presentes
somente no FAR das não-inoculadas cultivadas em baixo P
i
. Isto sugeriu que
estas 16 proteínas podem desempenhar um papel importante no controle das
micorrizas arbusculares e ainda não foram totalmente caracterizadas (Souza,
2002).
É possível que das 16 proteínas encontradas em cana-de-açúcar, sejam
fosfatases presentes no FAR de trevo. Assim, foi estudado melhor as bases do
envolvimento destas enzimas na sinalização celular planta-FMA. Dentre as
fosfohidrolases estudadas, destacou-se uma forte atividade ADPásica,
comparado às demais (ATPásica, PolyPásica e PPásica) presentes no FAR. Isto
sugere que no FAR pode haver a presença de proteínas com atividade apirásica
(anteriormente chamada de NTPases), ou seja, são enzimas que têm a habilidade
de utilizar tanto ATP e ADP como substrato (Figura 13). Elas são relacionadas
com o aumento na absorção de P
i
em plantas e animais, e têm importante papel
no catabolismo do ATP.
O efeito fisiológico do ATP no crescimento das plantas é bem
documentado.
Estudos anteriores demonstram que a aplicação exógena de ATP pode
modular a abertura estomática in Commelina communis e estimular divisões
nucleares em grãos de pólen de Lilium longiflorum (Jeter et al., 2004). Recentes
resultados demonstraram que níveis micromolares de ADP exógeno aumentam a
taxa de crescimento de pêlos radiculares de Arabidopsis thaliana (Lew e
Dearnley, 2000), e concentrações milimolares de ATP suprimem o crescimento de
raízes (Tang et al., 2003), bem como inibem a germinação de grãos de pólen de
Arabidopsis thaliana (Steinebrunner et al., 2003). Thomas et al. (1999)
estenderam as análises funcionais das apirases e demonstrou que a expressão
gênica de apirases de ervilha em Arabidopsis thaliana resultou em plantas com
maior crescimento e capacidade de transporte de fósforo, quando fornecido na
forma de P
i
ou ATP.
75
A utilização de modelos de sinalização que ocorrem nas simbioses
Leguminosas/Rhizobium, Leguminosas/Bradyrhizobium e interações planta-
patógenos é de extrema importância para o entendimento de eventos sinalizantes
na interação planta-FMA. Vários aspectos relacionados à semelhança na resposta
das interações planta-(Brady)Rhizobium e interação planta-FMA tem sido
sugerido, um deles é com base no fato de que mutantes de ervilha que não são
capazes de desenvolver simbioses típicas e têm a infecção bloqueada num
estádio imediatamente posterior à formação de apressório são também não-
nodulantes (Gianinazzi-Pearson et al., 1996). Assim, como a inibição do
estabelecimento da interação leguminosas-Rhizobium por altos níveis de nitrato,
na associação planta-FMA, altos teores de P
i
são inibitórios (Smith e Read, 1997).
Outras correlações podem ser feitas e vários trabalhos mostram que alguns
genes expressos na associação leguminosas-rizóbio são também expressos na
associação micorrízica arbuscular (Frühling et al., 1997; Albrecht et al., 1998;
Harrison , 1999; Brundrett, 2002; Rodriguez-Llorente et al., 2003; Vieweg et al.,
2004).
Estudos mostram que as apirases também têm participação nas
interações simbióticas leguminosas-Rizóbio. Etzler et al. (1999) relataram a
presença de uma lectina (DB46) em raízes da leguminosa Dolichos biflorus. Esta
lectina DB46 foi encontrada associada a fatores Nod de uma variedade de
rizóbios. Estes fatores Nod são produzidos pelo rizóbio e induzem a
organogênese na associação compatível levando à formação de uma estrutura de
nódulos, nos quais a bactéria reside e fixa nitrogênio (Cohn et al., 1998). Etzler et
al. (1999) mostraram que DB46 tem uma alta afinidade por fatores Nod
produzidos por estirpes de Bradyrhizobium japonicum e Rhizobium sp. que
nodulam D. biflorus. Foi demonstrado que DB46 é uma proteína bifuncional de
ATP por apresentar características lectínicas e enzimáticas de hidrólise de ATP. A
atividade ATPásica foi super estimulada na presença de fatores Nod, sendo
caracterizada como uma ecto-apirase, resultando assim, na mudança em seu
nome de DB46 para LNP – lectina-nucleotídeo fosforilase (Etzler et al., 1999).
Ainda, sobre a interação planta-bactéria, Day et al. (2000) estudaram a expressão
de duas isoformas de apirases (GS50 e GS52), encontrando que estas
pertenciam a classes diferentes. GS50 foi caracterizada como endo-apirase
76
localizada no golgi, já GS52 é uma ecto-apirase, localizada na superfície radicular
(apoplasto), com uma importante função na nodulação.
Estes dados e outros da literatura sugerem que as apirases do fluido
apoplástico de raízes transgênicas de trevo possam atuar estimulando o efluxo de
H
+
em hifas de G. margarita: (1) facilitando a absorção de P
i
pelo FMA (Thomas et
al., 1999), necessitando, assim, de um aumento no transporte primário de H
+
realizado pelas H
+
-ATPases do tipo P para atender as necessidades dos
transportadores secundários de P
i
/H
+
(Thomas et al., 2000); (2) atuando como um
modulador negativo da disponibilidade de ATP, e conseqüentemente do sinal de
ATP no meio extracelular, que é um inibidor do crescimento em plantas e animais
(Lew e Dearnaley, 2000; Steinebrunner et al., 2003; tang et al., 2003); (3) como
agente que se liga a receptores específicos na membrana fúngica (como ocorre
em interações patogênicas) funcionando como elicitores da atividade de efluxo de
H
+
(Xing et al., 1996; Blumwald et al., 1998; Kiba, 2000).
5.7 Modulação da atividade das bombas de prótons em regiões distintas do
sistema radicular pela colonização micorrízica
Estudos prévios demonstraram que a inibição da atividade ATPásica de
membrana plasmática em raiz total de plantas de milho ocorreu durante os 30
dias após a inoculação (Ramos, 2001). Neste estudo mostramos que a inibição
encontrada anteriormente ocorre predominantemente nas regiões de
alongamento, meristemática e coifa, uma zona caracterizada por baixos níveis de
colonização (região B, Figura 20). Isto, possivelmente, se deve ao fato de a
colonização micorrízica estar localizada numa região anterior (Região A), uma
zona de intenso crescimento e demanda de carbono fixado pela fotossíntese. Isto
é suportado pelos trabalhos de Berta e colaboradores em 1993. Segundo Berta et
al. (1993) a atividade do meristema apical das raízes determina o seu
desenvolvimento e arquitetura. Apesar do FMA não penetrar no meristema apical,
este é regulado simplesmente por uma competição por fotoassimilados ou por
sinais a longas distâncias, possivelmente hormonais (Berta et al., 1993).
A hipótese de Bonfante-Fasolo e Perotto (1991) sugere que o FMA infecta
as células corticais da raiz, drenando açúcares nas regiões que precedem a zona
meristemática, com isso há uma redução da disponibilidade de fotoassimilados
77
neste local. Esta diminuição no aporte de açúcares no ápice (Gould et al., 1981)
deve causar depleção do ATP nesta região, o que pode estar relacionado também
com a inibição da atividade H
+
-ATPásica de membrana plasmática evidenciada
neste estudo (Figura 20; Tabela 2). No estudo anterior, este efeito inibitório foi
possivelmente diluído, impedindo a visualização do fenômeno.
Apesar de existirem alguns relatos anteriores de ativação de H
+
-ATPases
após o estabelecimento da associação (60 d.a.i.), estes estudos foram realizados
com microssomos de raízes micorrizadas (McArthur e Knowles, 1993; Bago et al.,
1997; Benabdellah et al., 1999) e não com fração purificada de membrana
plasmática e vacuolar, assim, tal ativação foi observada somente quando as
atividades específicas foram calculadas com base na matéria fresca de raiz
micorrizada. Entretanto, estudos citoquímicos (Marx et al., 1982; Gianinazzi-
Pearson et al., 1991) indicam que a contribuição das ATPases fúngicas e/ou
arbusculares parece ser bem mais significativa em relação ao conteúdo total de
proteína da raiz micorrizada, do que a contribuição da massa do fungo
intraradicular em comparação com a massa vegetal. Assim, a estimulação da
atividade ATPásica obtida somente com base no peso fresco de raiz poderia
consistir somente num somatório das atividades ATPásicas do tipo P e V das
membranas do fungo e da planta que foi exacerbado pela divisão pelo peso
fresco (Ramos et al., 2005). A modulação diferencial da atividade das bombas de
prótons durante o estabelecimento da colonização fúngica pode ser efeito do
aumento na abundância das ATPases localizadas nas membranas peri-
arbusculares e/ou plasmáticas de células adjacentes. Em nossas condições
experimentais conseguimos evidenciar a estimulação mesmo quando calculada
com base na proteína (Figura 20).
Bago et al. (1997) estudaram a atividade ATPásica de membrana
plasmática de vesículas microssomais em raízes micorrizadas de girassol
(Helianthus annuus) e cebola (Allium cepa), encontrando um decréscimo da
atividade com o tempo, sendo esta maior em plantas não inoculadas. Segundo
Benabdellah et al. (1999), respostas de crescimento de plantas de tomate à
colonização micorrízica foram diferentes, dependendo do FMA envolvido. A
porcentagem de colonização foi correlacionada com a atividade ATPásica de
membrana plasmática, em que plantas inoculadas com Glomus mosseae tiveram
maior atividade enzimática. O FMA poderia estar atuando na regulação das
78
ATPases, especificamente, aumentando a eficiência de acoplamento entre
hidrólise de ATP e transporte de H
+
. Porém, as evidências experimentais sobre a
regulação do gradiente eletroquímico de H
+
ainda não foram obtidas.
A estimulação da atividade ATPásica vacuolar e de membrana plasmática aos 60
d.a.i. (Figura 20 e 21) está em acordância com dados moleculares que relatam a
capacidade do FMA de induzir a expressão de genes de H
+
-ATPases de
membrana plasmática da planta hospedeira (Murphy et al., 1997; Gianinazzi-
Pearson et al., 2000), mais especificamente identificada na membrana peri-
arbuscular (Krajinski et al., 2002).
Durante a inibição da atividade de hidrólise de ATP na Região B (aos 30
dias) em plantas inoculadas, um padrão peculiar e inédito de ativação da hidrólise
de pirofosfato (PP
i
) foi observado em ambas regiões, principalmente, na região B
(Tabela 2). Em sistemas vegetais, o PP
i
tem sido considerado um substrato
alternativo ao ATP, podendo ativar o metabolismo em condições de estresse
energético quando ocorre a depleção dos níveis de ATP citossólico (Stitt, 1998).
O consumo da sacarose radicular pelo FMA pode causar um estresse
energético transiente nas células da raiz (Smith e Read, 1997), especialmente nos
estádios iniciais da colonização, quando o equilíbrio da troca de nutrientes entre os
simbiontes ainda não foi estabelecido. Desde que a H
+
-PPase vacuolar é a
principal enzima capaz de hidrolisar PP
i
presente nas membranas microssomais, o
estímulo observado deve estar relacionado com a ativação desta enzima induzida
pela micorrização. Uma hipótese recente descreve um possível acoplamento entre
as duas bombas de prótons vacuolares, onde o gradiente eletroquímico gerado
pela H
+
-PPase energizaria a reversão do ciclo catalítico da H
+
-ATPase,
favorecendo a síntese de ATP (Façanha e De Meis, 1998). Assim, a indução deste
sistema regenerador de ATP, aos 30 dias após a inoculação, pode ser parte da
resposta adaptativa da planta ao estresse decorrente do consumo da sacarose
radicular pelo FMA (Figura 22, Tabela 2). De fato, é conhecido que nos estádios
iniciais do estabelecimento da colonização micorrízica, geralmente, ocorre uma
inibição do crescimento da planta (Smith e Read, 1997; Williams et al., 1987). O
que também pode ser relacionado ao estresse inicial causado pela colonização do
FMA a raiz hospedeira e ao consumo de carbono fotossintetizado pela planta antes
que essa venha a usufruir os benefícios da associação micorrízica. A atividade
PPásica na região B apresentou uma marcante estimulação, aos 30 d.a.i.,
79
aproximadamente 162% (Figura 22, Tabela 2). Em resposta a essa condição, é
possível que este incremento na hidrólise de PP
i
, verificado em raízes colonizadas,
possa refletir o estado energético das células radiculares exauridas de carbono
pelo FMA que se localiza, principalmente, numa região anterior. A figura 27 resume
os efeitos dos FMAs sobre as bombas de prótons em cada região da raiz de milho.
P - ATPase
V - ATPase
Nenhuma
mudança
P - ATPase
V - ATPase
P - ATPase
PPase
A
B
30 d.a.i.
A
B
A
B
30 d.a.i.
P - ATPase
V - ATPase
Nenhuma
mudança
P - ATPase
V - ATPase
P - ATPase
PPase
A
B
30 d.a.i.
A
B
A
B
30 d.a.i.
Figura 27. Resumo geral descrevendo as regiões do sistema radicular de plantas
de milho inoculadas com G. margarita, com suas respectivas estimulações () ou
inibições () na atividade das bombas de prótons.
5.8 Plasmodesmas: Interação célula-célula entre fungos micorrízicos
arbusculares e raízes de plantas hospedeiras
Em células arbusculadas, observou-se que nos momentos da penetração
da hifa fúngica na parede celular, ocorreu à formação de plasmodesmas (Figura
25). Por outro lado, células arbusculadas apresentaram hiperplasia celular (Figura
23), indicando que o vacúolo poderia manter o seu tamanho original e apenas se
deslocaria durante os avanços na formação do arbúsculo. Apesar de não
comprovado cientificamente, a células contendo arbúsculos poderiam ter uma
80
indução no número de plasmodesmas. Com base nos dados deste trabalho, é
proposto que a presença dos plasmodesmas em células arbusculadas, possam
contribuir no mecanismo de troca bi-direcional de nutrientes na interação planta-
FMA. Estudos de Ramos (2001) demonstrou uma inibição da atividade ATPásica
em raízes colonizadas que poderia ser refletida pelo decréscimo do nível de ATP
citossólico, assim, é possível que ocorra uma indução na síntese de plasmodesmas
como ocorre em outros organismos. A constrição de plasmodesmas é regulada
pelo nível de ATP (Cleland et al., 1994). Cleland et al. (1994) usou o inibidor Azida
para induzir o stress por ATP em células de raízes de trigo e demonstraram que a
redução no nível de ATP aumentou em 10X o tamanho do limite de exclusão
(abertura) dos plasmodesmas. A infecção pelo nematóide Criconmella xenoplax
também induz aumentos significativos no limite de exclusão dos plasmodesmas
(Hussey et al., 1992), já no caso de vírus, estes possuem proteínas que se
movimentam através destas estruturas (Olesinski et al, 1996).
Acreditamos que no caso da interação micorrízica arbuscular o FMA possa
produzir certos fatores ou sinais que regulem a função dos plasmodesmas em
células arbusculadas, conferindo uma maior passagem de hexoses para o seu
interior. O aumento dos sintomas de doenças virais em plantas micorrizadas
(Pfleger e Lindeman, 1994) e o decréscimo na atividade ATPásica são consistentes
com a indução de plasmodesmas em células colonizadas, como observado neste
trabalho.
6. CONCLUSÕES
Este estudo apresenta o primeiro mapeamento do perfil do fluxo de H
+
em
FMAs, durante o desenvolvimento assimbiótico. Isto oferece novos elementos para
discussão do controverso papel de gradientes extra e intracelular dos íons H
+
no
controle do crescimento polarizado em células de plantas e fungos (Harold e
Caldwell, 1990; Gibbon e Kropf, 1991; Parton et al., 1997). Embora, nenhuma
correlação direta possa ser estabelecida entre ativação do efluxo de H
+
com o
controle do crescimento apical de hifas, o comportamento global do fluxo de H
+
em
hifas de FMAs se correlacionaram com o padrão de crescimento, ramificação de
tubos germinativos e formação de hifas laterais. O comportamento global do fluxo
de H
+
em hifas de FMAs, delineia uma “assinatura do fluxo de H
+
” (Feijó et al.,
2004) para o padrão de crescimento, em resposta a presença de fatores
radiculares, tal como FA. Previamente, foi proposto que gradientes de pH
citoplasmático não eram requeridos para o crescimento apical em células de
plantas e fungos (Parton et al., 1997). Porém, evidências crescentes mostraram
que íons H
+
também podem ser importantes funcionalmente, como regulador de
sinalização (Feijó et al., 2004). Mudanças de pH externo podem servir como
indicadores do estabelecimento da interação fungo-hospedeiro e ser
correlacionado com o crescimento de hifas (Felle et al., 2004). É possível que,
como descrito para fungos patogênicos (van West et al., 2002), sinais elétricos
possam aumentar ou anular os sinais químicos mediando respostas táticas de
alcance limitado pelos FMAs, que são importantes para o reconhecimento do
82
hospedeiro. Assim, especulamos que uma ativação diferencial e de distribuição
das bombas eletrogênicas e transportadores membranares poderiam
desempenhar um papel neste fenômeno eletrostático. Estudos das moléculas
sinalizadoras contidas no apoplasto e a determinação da natureza do ativador do
efluxo de H
+
de hifas de G. margarita poderá fornecer novas informações sobre as
oscilações no fluxo de H
+
e os eventos iniciais da interação micorrízica arbuscular.
O fluxo de H
+
em zonas específicas das raízes são influenciados pela modulação
diferencial das bombas de H
+
. Aliado a isto, especulamos que micro-gradientes de
pH possam ser formados entre as hifas dos FMAs e zonas das raízes
hospedeiras, que liberam sinais apoplásticos (tal como a atividade de apirases) e
estes, por sua vez, ativam o efluxo de H
+
das hifas e por fim o seu crescimento
polarizado em direção a sítios ativos das raízes. A comunicação planta-FMA
requer estudos mais aprofundados dos sinalizadores da interação nas fases
assimbiótica e pré-simbiótica, bem como, da participação dos plasmodesmas na
troca bi-direcional de nutrientes durante a simbiose.
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