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Vinícius Pereira Arantes
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA – SÃO PAULO
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA DE EXTRATOS
VEGETAIS DO CERRADO BRASILEIRO
Vinícius Pereira Arantes
Farmacêutico-Bioquímico
ARARAQUARA
2005
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Vinícius Pereira Arantes
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA – SÃO PAULO
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA DE EXTRATOS
VEGETAIS DO CERRADO BRASILEIRO
Mestrando: Vinícius Pereira Arantes
Orientadora: Prof. Drª Clarice Queico Fujimura Leite
ARARAQUARA
2005
Forma apresentada ao programa de
pós-graduação em Análises
Clínicas da Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho”-
Unesp- Araraquara- São Paulo,
como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Análises Clínicas.
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Vinícius Pereira Arantes
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DEDICO,
Ao ser todo poderoso que em algum momento de sua magnitude desejou
proporcionar estes momentos de felicidade, amor e ciência a minha pequena
sabedoria e ao meu ínfimo conhecimento. DEUS, simplesmente o mentor de
tudo que aqui se encontra...
Aos meus grandiosos pais Agripino de Oliveira Arantes e Erude Pereira
Arantes. Por aceitarem a distância durante estes longos três anos que tenho
dedicado à ciência, pesquisa e docência. Além disto, obrigado por concederem
através do amor a minha existência.
Aos meus queridos avós João Pereira Filho (in memorian) e Clotilde
Ferreira da Silva Pereira. Muito obrigado por terem motivado sempre a esta e
diversas outras conquistas. Palavras e gestos que a minha memória, tenho
certeza guardarão por toda a eternidade, muito obrigado!
Minha grande Irmã Ana Célia Arantes dos Santos, ao meu cunhado e
amigo José Maria dos Santos e a pequena Maria Fernanda dos Santos, que
veio com o intuito de trazer alegria e vida a nossa família. E também a você
pequenino João Agripino que hora maravilhosa. Vocês também auxiliaram neste
trabalho!
A minha namorada Patrícia Dolfini, a Ivone Tomeleri Dolfini e Ricardo
Dolfini. Obrigado pela atenção e respeito!
Aos professores que auxiliaram durante o início, os primeiros passos,
gestos e paciência. A vocês amigos professores é que tenho o prazer de dividir
a minha vitória com vocês: Geraldo Emilio Vicentini, Marcelo Antonio Dubuc,
Ricardo de Melo Germano, Carlos Augusto Pereira, Paulo Pereira, Mariza
Barion Romagnolo, Danil Agar Rocha Rúbio, Fátima Machado, Érica Valentini
Pepliascov Pereira, Aldolino Zermiani, Evaldo Bertoldi, Roberto José Linarth (in
memorian), Emerson Luis Botelho Lourenço, Irinéia Paulina Baretta, Antonio
Marcus Paes, Samira, Marcela, Nelton, Francisco, Elizabethe, Marlene, Marcos,
Gislaine, Sandra. Tantos foram aqueles que neste trabalho seria impossível
agradecer a todos, a vocês infinitamente obrigado!
Aos funcionários da Universidade Paranaense – Unipar.
Aos funcionários da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
Filho”- Unesp Araraquara- São Paulo. Em especial ao setor de pós-graduação e
companheiros do laboratório: Carol Malaspina, Karina, Ivone, Célio e Will.
Que a ciência possa gerar cada vez mais dúvidas e incertezas, para que
a cada trabalho, tenhamos novas perguntas e que a cada pergunta possamos
ter nova resposta. E que assim a ciência possa prosperar entre perguntas e
respostas. Muito obrigado!!!
Vinícius Pereira Arantes
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AGRADECIMENTOS
A professora Drª Clarice Queico Fujimura Leite. Pessoa incrível que não
mediu esforços para auxiliar, ensinar e trabalhar o conhecimento científico, além
das inúmeras dúvidas oriundas do trabalho laboratorial. Orientação,conquistas e
vitórias é assim que resumo todo o nosso convívio. Muito obrigado!
A Drª Daisy Nakamura Sato, incrível pesquisadora que abriu inúmeras
portas na vigência de minhas dúvidas sobre microbiologia.
A professora Drª Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro, que
acolheu as minhas dúvidas e soube ensinar cultivo de células e outras
atividades inerentes ao estudo com micobactérias.
Ao professor Drº Wagner Villegas, agradeço pela enorme atenção e os
extratos gentilmente cedidos e testados neste trabalho.
Vinícius Pereira Arantes
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O Senhor é o meu pastor
O Senhor é o meu pastor; nada me faltará.
Ele me faz repousar em pastos verdejantes.
Leva-me para junto das águas de descanso; refrigera-me a alma.
Guia-me pelas veredas da justiça por amor do seu nome.
Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não temerei mal
nenhum,
Porque tu estás comigo; o teu bordão e o teu cajado me consolam.
Preparas-me uma mesa na presença dos meus adversários, unges-me a
cabeça com óleo;
O meu cálice transborda.
Bondade e misericórdia certamente me seguirão por todos os dias de
minha vida;
E habitarei na casa do senhor para todo o sempre.
Salmo 23
João Pereira Filho (In memorian)
“Um dos últimos momentos que oramos juntos celebramos a benção deste salmo, foi
possível celebrar a sua força e contemplar o teu semblante. A saudade é grande, gostaria
muito que estivesse aqui comemorando comigo todas estas vitórias, que o senhor nunca
deixou desfarçar que torcia por mim. Hoje continuo a orar e a pedir que dentre as inúmeras
facetas que a vida nos guarda um dia possa novamente contemplar a sua face e dar um
abraço forte e dizer quanta falta a sua presença me faz.” Até um dia!
De seu neto
Vinícius Pereira Arantes
Vinícius Pereira Arantes
6
SUMÁRIO
Página
Lista de Abreviaturas. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 08
Lista de Tabelas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
Resumo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
Abstract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
1.0 Introdução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.1 Mycobacterium tuberculosis e outras micobactérias que não
tuberculosis (MOTT) de importância médica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
1.2 Quimioterapia da Tuberculose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.3 Pesquisa de novas alternativas terapêuticas para Tuberculose. . . . 24
1.4 Método de Determinação do perfil de sensibilidade utilizando
Alamar Blue Assay – MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
2.0 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.1 Objetivos Gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2 Objetivos Específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.0 Material e Métodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1 Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.1 Extratos Vegetais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2 Droga de Referência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3 Cepas do gênero Mycobacterium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3.1 Cepa padrão de Mycobacterium tuberculosis. . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3.2 Cepa padrão de Mycobacterium avium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Vinícius Pereira Arantes
7
3.3.3 Cepa padrão de Mycobacterium fortuitum. . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.0 Metodologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.1 Preparo de suspensões bacilares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.2 Técnica de Microdiluição utilizando Alamar Blue Assay – MABA. . . 33
4.3 Padronização do tempo de leitura para a técnica do MABA. . . . . . .
5.0 Resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
36
6.0 Discussão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
7.0 Conclusão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
8.0 Referências Bibliográficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
9.0 Anexos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Vinícius Pereira Arantes
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LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
ATCC American Type Culture Collection
BCG
BAAR
BACTEC
Bacilo Calmette Guérin
Bacilo Álcool-ácido Resistente
Método Radiométrico para detecção de crescimento bacteriano
CIM Concentração Inibitória Mínima
ºC Graus Celsius
DOTS Directly Observed Treatment Short Course
DCM Diclorometano
DMSO Dimetilsulfóxido
E M B Etambutol
ETH Etionamida
HIV Human Immunodeficiency virus
INH Isoniazida
LJ Lowenstein Jensen
MAC Complexo Mycobacterium avium
MGIT Mycobacterium Growth Indicator Tube
mL Mililitro
MOTT Micobactérias outras que não Mycobacterium tuberculosis
mg Miligrama
MABA Microplate Alamar Blue Assay
OMS Organização Mundial da Saúde
OPAS Organização Panamericana de Saúde
Vinícius Pereira Arantes
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PBS Tampão fosfato (PBS)
PCT Programa de Controle da Tuberculose
PNCT-MS Plano Nacional de Controle da Tuberculose- Ministério da Saúde
PZA Pirazinamida
RMP Rifampicina
SM Estreptomicina
TB Tuberculose
TB-MDR Tuberculose “Multi Drug Resistant”
µL
Microlitro
µg
Micrograma
Vinícius Pereira Arantes
10
ÍNDICE DE TABELAS
Apresentação das Tabelas
Pág
Tabela I
Relação dos extratos vegetais, parte do vegetal utilizado, agente extrator e
concentração dos extratos utilizados para determinação da atividade
antimicobacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
Tabela II
Tabela III
Padronização do tempo de leitura da técnica do MABA para as cepas de
M.tuberculosis, M.avium, M fortuitum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. tuberculosis H37R
v
A
TCC 27294 pela técnica do MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
36
Tabela IV
Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. avium ATCC 25291
pela técnica do MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
Tabela V
Tabela VI
Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. fortuitum ATCC
6841pela técnica do MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Determinação da Concentração Mínima Inibitória para as cepas de M. tuberculosis,
M.avium e M. fortuitum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
39
Vinícius Pereira Arantes
11
RESUMO
ARANTES, V.P. Estudo da Atividade Antimicobacteriana de Extratos
Vegetais do Cerrado Brasileiro.Araraquara. 2005 (Mestrado em Análises
Clínicas) Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – Unesp.
A Tuberculose (TB) continua sendo um grave problema de saúde pública,
considerada a principal causa de morte em países subdesenvolvidos de grande
população e baixo padrão sanitário. Atualmente o aumento do número de
casos em paises subdesenvolvidos e desenvolvidos está associado à queda da
qualidade de vida, aglomerações, infecções pelo “Human Immunodeficiency
Vírus” (HIV) e “Acquired Immunodeficiency Syndrome” (AIDS). Apesar da
eficácia dos esquemas terapêuticos utilizados atualmente, nos últimos anos
tem-se observado, um aumento na incidência de tuberculose causada pelo M.
tuberculosis resistente aos esquemas preconizados para o tratamento da
doença, o que reflete falha no emprego dos referidos programas pré-
estabelecidos como eficazes. A busca constante por produtos biologicamente
ativos e capazes de combater o M. tuberculosis tem promovido a descoberta
de novos compostos capazes de eliminar micobactérias, que sejam menos
tóxicos, efetivos e que possam ser menos indutores de resistência, podendo
associar dose e redução do número de abandono ao tratamento. Este trabalho
tem como principal objetivo determinar o efeito antimicobacteriano de extratos
vegetais da biota brasileira, frente a cepas padrão de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv – ATCC 27294, Mycobacterium avium ATCC 25291,
Mycobacterium fortuitum ATCC 6841. A metodologia de Microplate Alamar Blue
Assay (MABA), foi empregado com o intuito de pesquisar atividade
antimicobacteriana, sendo determinado Concentração Mínima Inibitória
correspondente a inibir 90% das células viáveis. Os resultados apresentados
são promissores, frente à Cepa padrão de M.tuberculosis e M. avium,
M.fortuitum destaca-se a grande atividade do extrato de Quassia amara
(agente extrator: diclorometano) e Syngonanthus macrolepsis (agente extrator:
clorofórmio) com CIM inferior a 200µg/ml para as três espécies testadas.
Palavras-chave: Tuberculose, Tratamento, HIV, AIDS.
Vinícius Pereira Arantes
12
ABSTRACT
ARANTES, V. P. Studying of antimycobactericide activity of vegetal
extracts from Brazilian’s “Cerrado”. Araraquara. 2005 (Master in Clinical
Analysis) State University “Julio de Mesquita Filho” – Unesp.
Tuberculosis (TB) is still a serious problem of public health, considered the main
cause of death in undeveloped Countries of great population and low hygiene
standard. In the present moment the increase in the number of cases at
undeveloped and developed Countries is associated to the drop of life quality,
agglomerations, infections from “Human immunodeficiency Virus” (HIV) and
“Acquired immunodeficiency Syndrome” (AIDS). In spite of the present
efficiency of the used therapeutics schemes, in the last years has been
observed, an increase in the tuberculosis incidence caused by the M.
tuberculosis resistant to the recommended schemes of treatment for the
disease, which reflects in failures on the use of the referred programs pre-
established as effectives. The constant search for products biologically actives
and capable of fighting the M. tuberculosis has promoted the discovery of new
compounds capable of eliminating mycobacteries, that are less toxic, effectives
and that can be less inducer of resistance, letting associate dose and reduction
in the number of treatment abandonment. This survey has the main purpose to
determine the antimycobactericide effect of vegetal extracts from the Brazilian
biota, in front of the strain standard of Mycobacterium tuberculosis H37Rv –
ATCC 27294, Mycobacterium avium ATCC 25291, Mycobacterium fortuitum
ATCC 6841. The methodology of Microplate Alamar Blue Assay (MABA) was
used in the intention to search for antimycobactericide activity, having
established a Minimal Inhibitory Concentration correspondent to inhibit 99% of
the viable cells. The presented results are promising, in front of the strain
standard of M. tuberculosis and M. avium, M. fortuitum stands out the great
activity of the Quassia amara extract (extractor agent: dichloromethane) and
Syngonanthus macrolepsis (extractor agent: Chloroform) with MIC below
200µg/ml in the three tested species.
Key words: Tuberculosis, Treatment, HIV, AIDS.
Vinícius Pereira Arantes
13
1.INTRODUÇÃO
A tuberculose pulmonar é uma doença infecciosa causada por
micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis, M. bovis, M. africanum , Mycobacterium microti e M. canetti) é
transmitida de homem a homem por aerossóis produzidos durante a
expectoração (AMERICAN THORACIC SOCIETY AND CENTERS FOR
DISEASE CONTROL, 1990; ALCAIDE et al.,1997; BLOOM & SMALL,1998;
ROXO,1997).
As micobactérias pertencem ao gênero Mycobacterium, único
representante da família Mycobacteriaceae, apresenta-se na forma de bacilos
curvos ou retos, com 0,2 a 0,7 µm de largura por 1,0 a 10,0 µm de
comprimento e possui a propriedade de álcool-ácido resistência, devido a
grande quantidade de lipídios presentes em sua parede celular. São aeróbios e
classificados de acordo com o seu tempo de crescimento, sendo considerados
de crescimento rápido quando requerem menos de 7 dias para produzir
colônias visíveis, e de crescimento lento, aquelas que requerem mais de 7 dias
para produzir colônias visíveis quando inoculadas em meios de cultura sólidos
( KONEMAN et al,2001; AL-HAJJAJ et al.,2001; BARRETO et al.,1994;
FREIRE,1989; HART et al.,1996).
A tuberculose pulmonar é uma doença que tem a sua magnitude ligada
à situação socio-econômica da região ou do país (ROBBINS et al. 1996;
HIJJAR et al.,2001; RAVIGLIONE et al., 1997; DANNENBERG, 1993).
Atualmente com o advento da AIDS, a coinfecção TB/HIV tem provocado um
impacto na epidemiologia da tuberculose em todo o mundo, fato observado em
Vinícius Pereira Arantes
14
países desenvolvidos e em desenvolvimento, principalmente nas Américas
(GARCIA et al., 1995; MAcKENNA et al., 1998; CANTRELL et al., 2001;
SNIDER et al., 1998; BOSHOFF& MIZRAHI, 2000; KUMAR et al., 2001;LIU et
al.,1998).
A epidemia de AIDS e o controle insuficiente da tuberculose apontam
para a necessidade de medidas enérgicas e eficazes de saúde pública. A
emergência de focos de tuberculose multirresistente (TBMDR), tanto nos
Estados Unidos da América, no início dos anos noventa, quanto atualmente,
nos países que compunham a antiga União Soviética, tem mobilizado o mundo
para a questão da tuberculose (DALCOMO et al., 1998; COOPER et al.,1993).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que existam anualmente
1,9 milhões de mortes por tuberculose, 98% delas em países em
desenvolvimento e cerca de 350.000 mortes em casos de associação da
tuberculose com a AIDS. O número anual de novos casos de tuberculose é
estimado em cerca de 8,7 milhões, sendo que 80% estão concentrados em 22
países, dentre eles o Brasil. A TBMDR está presente em 63 países que
participaram do inquérito mundial, realizado no período de 1994-1999 (WHO,
2002; FAIRCHILD & OPPENHEIMER,1998).
A Organização Mundial da Saúde expressa que no ano de 2020
aproximadamente um bilhão de pessoas em todo o mundo estejam infectadas,
200 milhões adoeçam e 35 milhões morram (WHO,1997). Os casos de
tuberculose estimados pela OMS acredita-se que metade sejam notificados,
situação que traduz a insuficiência das políticas de saúde e controle. Nos 22
países com maior carga de tuberculose, a estimativa é de 6.910.000 casos. A
Índia ocupa o primeiro lugar, com 1.856.000 novos casos anualmente, e o
Vinícius Pereira Arantes
15
Brasil atualmente ocupa o 15º lugar com 129.000 casos por ano (HIJJAR et al.,
2001), com cerca de 30 milhões de morte por tuberculose (BRASIL. Ministério
da Saúde, 1999).
A região das Américas alberga 7% do total mundial de casos de
tuberculose. No Brasil, estima-se que ocorram cerca de 129.000 casos novos
por ano, dos quais apenas 90.000 casos novos são notificados oficialmente. O
Estado de São Paulo, responsável pelo maior número absoluto de casos novos
com um coeficiente de incidência de 50/100.000 habitantes e cerca de 1.500
óbitos por ano, notificou 20.125 casos novos no ano de 2001.
(BRASIL.Ministério da Saúde, 2002).
O Brasil é um dos quatro países com maior número absoluto de casos
de tuberculose no mundo. O total em 2001, segundo o Sistema Único de Saúde
(SUS), é de 103.029 casos. A incidência da doença é de 60,68 /100.000
habitantes (SANT’ANNA, et al., 2002). O percentual de tuberculosos no grupo
de 0-14 anos situa-se entre 6% e 7% do total de casos notificados, a baixa taxa
de positivos dentre este grupo é explicada pela dificuldade de confirmação
baciloscópica nesta idade. A incidência de meningite tuberculosa a forma mais
grave desta doença, o grupo de 0-4 anos é o mais atingido, coeficiente de
0,9/100.000 habitantes (BRASIL. Ministério da Saúde, 1993).
Entre as capitais brasileiras, as cidades do Rio de Janeiro, Porto Velho,
Rio Branco, Recife e São Paulo, apresentam as maiores taxas de mortalidade
que variam de 4,6 a 10,2 óbitos por 100.000 habitantes (ZACARIAS et al.,
1994). Segundo dados oficiais do Ministério da Saúde, em 1999 foram
notificados 91.800 casos novos de tuberculose. É de conhecimento que estes
representam 75% a 80% da incidência total, estima-se cerca de 130.000 novos
Vinícius Pereira Arantes
16
casos anualmente e deste montante diagnosticado cerca de 75% são curados
(DOLIN et al.,1994; ROSEMBERG, 1990).
O Centro de Prevenção e Controle de Doenças dos Estados Unidos
(CDC) já em 1994 projetou aumentos na incidência global da tuberculose na
ordem de 36 e 58% para os anos 2000 e 2005 respectivamente (DOLIN et al.,
1994; CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 1993). A
Organização Mundial da Saúde fez uma estimativa de 30.000.000 de mortes
por tuberculose nos próximos dez anos e calcula que pelo menos 8.000.000 de
casos novos de tuberculose ocorreram no ano passado (WHO, 1997;
RAVIGLIONE et al., 1997).
A tuberculose tem aumentado nos últimos 10 anos, associada aos três
importantes fatores emergenciais, a pobreza enquadra-se como sendo o
primeiro deles, o segundo é considerado a associação entre tuberculose e
HIV/AIDS e o terceiro fator o aumento considerável nos casos de resistência a
drogas antituberculosas. O HIV é fator de risco para a tuberculose, já que o
vírus desencadeia fator de imunodeficiência no paciente infectado, acredita-se
existir atualmente cerca de 4,4 milhões de pacientes infectados
simultaneamente com HIV e tuberculose no mundo (FIGUEROA & LÓPEZ,
2000).
A co-infecção pelo HIV e M. tuberculosis atualmente vem sendo estudada
em inúmeros países, onde ocorrem as duas infecções de forma simultânea e
que naturalmente representa problemas para aos órgãos de saúde pública
(FIUZA & AFIÚNE,1993). Podemos admitir que as chances de um indivíduo HIV
positivo em desenvolver a doença em comparação a um indivíduo normal é de
Vinícius Pereira Arantes
17
25 vezes maior (BILLO, 1995; CHAISSON & STOKIN, 1989; BENETUCCI et al.,
1992).
Estima-se que 500.000 pessoas infectadas pelo HIV vivem na América
Latina, onde em algumas regiões urbanas segundo Organização Mundial de
Saúde (OMS) são considerados locais de emergência mundial contra a
tuberculose (LIMA & MADI,1988; LOURES,1995). As cidades do Rio de Janeiro
(RJ) e de Rio Grande (RS),pertencem à área regional de alta prevalência para
tuberculose. Segundo a OMS a tuberculose e a AIDS juntas constituem, hoje,
uma calamidade sem precedentes na história. Em 1999, cerca e 1/3 dos
infectados pelo HIV, o eram também pelo bacilo de koch, segundo a atualidade
o maior fator de risco para o desenvolvimento da tuberculose em pessoas
previamente contaminadas (BOFFO et al. 2004; HIJJAR et al., 2001).
1.1. Mycobacterium tuberculosis e micobactérias outras que não
tuberculosis (MOTT) de importância médica.
O gênero Mycobacterium é formado por bacilos imóveis, com alta
porcentagem de lipídios na parede, que conferem resistência a desinfetantes e
antibióticos, bem como, a característica de álcool-ácido-resistência. O gênero
Mycobacterium compreende cerca de 100 espécies, 25 identificadas como
sendo patogênicas ao homem uma diversidade de espécies, de grande
distribuição na natureza. Alem do complexo Mycobacterium tuberculosis (M.
microti, M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) existem espécies saprófitas e
outras que atuam como patógenos oportunistas causando enfermidades
denominadas de micobacterioses (CORTINAS et al., 2002; POZNIAK et
al.,1996; RAYNAUD et al., 1998).
Vinícius Pereira Arantes
18
Em 1882, Koch descreveu o agente causal da tuberculose humana
(SHEPPARD,2001). Pouco tempo depois, diversos autores comunicaram o
isolamento de outras espécies de micobactérias responsáveis por infecções
animais. Strauss em 1891 descreveu o agente causal da tuberculose aviária e
quatro anos depois Johne descreve o bacilo causador da Enterite Hipertrófica
Bovina. Em 1901 Marmoreck diferenciou os agentes responsáveis por
causarem a tuberculose humana, bovina e aviária de outras espécies, que
denominou de “Micobactérias paratuberculosis”. Logo mais foram isoladas
amostras de micobactérias do solo e de amostras humanas, que em
determinadas situações são chamadas de oportunistas (MANZANO et al., 1998;
SANT´ANNA, 2002; SANT’ANNA, et al., 2002).
As espécies de micobactérias outras que não tuberculosis (MOTT) mais
isoladas no Brasil são: Complexo M. avium-intracellulare (MAC), M. fortuitum,
M. cheloneae, M. kansasii e M. scrofulaceum (LEITE et al., 1995 (a); LEITE &
TELAROLLI, 1997; LEITE et al., 1998) causando principalmente doença
pulmonar e ganglionar, sendo que estas e outras MOTT são isoladas com
maior freqüência em pacientes soropositivos para o vírus da AIDS
(BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; LEITE et al., 1995 (a); LEITE, et al., 1998;
WREN et al., 1998).
Nesses pacientes geralmente a doença é disseminada e fatal em curto
espaço de tempo (BARBER et al., 1991; FALKINHAM III, 1996;
RUNYON,1958). Trabalhos recentes destacam cada vez mais a prevalência de
MOTT em pacientes HIV positivos (HIRSCHMAN, 1990; STRATTON, 1992;
GIAYETTO & CABRERA, 1994; VON REYN, et al., 1996; FALKINHAM III,
1996; LEITE et al., 1998). LEITE, et al. 1995 (a) destacam o isolamento de M.
Vinícius Pereira Arantes
19
avium-intracellulare, M. fortuitum e M. chelonae de pacientes internados no
setor de Tisiologia do SESA em Araraquara-SP, sendo que a maior incidência
das micobacterioses por MOTT foi encontrada em pacientes soropositivos para
o HIV. Além dos pacientes HIV positivos, os imunocompetentes também
desenvolvem as micobacterioses e novas espécies como, por exemplo: M.
celatum, M.mucogenicum sp. nov. e M.heidelbergense sp. nov. tem sido
isoladas de material clínico (HAAS et al., 1993; BUX-GEWEHER et al., 1998;
MUÑOZ et al., 1998).
Como estas e outras espécies podem ser isoladas de solo, águas e
outras fontes naturais (COSTALLAT et al., 1977; LEVY-FREBAULT & DAVID,
1983; GRAHAM-JR et al., 1988; LEITE et al., 1995; HAAS & FATTAL, 1990;
SCHULZE-RÖBBECKE et al., 1991; STOSÁREK et al., 1993; FALKINHAM III,
1996; NEUMANN et al., 1997; LEITE, et al., 1998; FALKINHAM III, 1998),
deve-se ter cautela ao atribuir a estas espécies a responsabilidade pela
etiologia da doença. Já no caso de M. tuberculosis seu isolamento mesmo em
cultura mista exclui a possibilidade de outra espécie ser o agente causal da
infecção (BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; FALKINHAM III, 1996).
As infecções causadas pelo complexo M. avium-intracellulare em
pacientes imunocompetentes são principalmente pulmonares e disseminadas
(HIRSCHMAN, 1990; ELLNER et al., 1991; COOK, 1991; VON REYN et al.,
1996; FALKINHAM III, 1996), são descritos casos em grandes centros como
Estados Unidos, França, África, Itália, Alemanha, Espanha, Áustria e outros
(HORSBURG, et al. 1991; HORSBURG, 1991; NASSOS et al., 1991; GARCIA
GARCIA et al., 1995; DABORN et al.,1996) e no Brasil e América Latina (LEITE
Vinícius Pereira Arantes
20
et al., 1995; LEITE & TELAROLLI, 1997; GARCIA GARCIA et al., 1995; LEITE
et al. 1998).
O complexo M. avium-intracellulare pode ser isolado de
ambientes naturais, como água, solo com muita matéria orgânica, baixo pH e
pouco O
2
dissolvido (FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III, 1998). Em
laboratório, requer pH em torno de 5 a 5.5 para seu melhor desenvolvimento e
também temperaturas no intervalo de 42 a 45ºC (COSTALLAT et al., 1977;
GRAHAM-JR et al., 1988; FALKINHAM III, 1996).
Existem muitos casos de M. kansasii isolados de amostras
clínicas (LEVY-FREBAULT & DAVID, 1983; STRATTON, 1992; LEITE et al.,
1995; FALKINHAM III, 1996; ALCAIDE et al., 1997; LEITE et al., 1998) é uma
micobactéria de crescimento lento, fotocromogênica, que exige temperaturas
em torno de 32ºC a 42ºC, catalase positiva, reduz nitrato a nitrito e hidrolisa o
tween 80. As cepas com catalase fortemente positiva são as mais virulentas
(FALKINHAM III, 1996).
São descritos relatos de isolamento de M. kansasii de fontes de
água naturais e tratadas, existe a hipótese de contaminação por aerossol
(LEVY-FREBAULT & DAVID, 1983; FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III,
1998). As infecções são geralmente causadas em pacientes com doenças de
base de origem pulmonar, câncer ou por alcoolismo (LEVY-FREBAULT &
DAVID et al., 1989; FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III, 1998). Segundo
FALKINHAM III (1996), M. kansasii pode fazer parte da microbiota normal de
plantas e é também encontrado em águas. Possui crescimento lento, pode
crescer a 42ºC, não hidroliza Tween 80 e possui muitas características comuns
com M. avium, sendo diferenciado através de pigmentação, urease e catalase,
Vinícius Pereira Arantes
21
testes positivos para M. kansasii (KENT & KUBICA, 1985; DAVID et al., 1989;
BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; FALKINHAM III, 1996; GOODFELLOW &
MAGEE, 1998; HEIFETS & JENKINS, 1998).
Infecções causadas por M. scrofulaceum são historicamente relatadas
em linfadenite cervical em crianças, mas existem casos de infecção pulmonar,
geralmente associados à doenças de base e predisposição do hospedeiro
(bronquite crônica, enfisema, câncer, pneumonia). Tem sido descrito aumento
de casos de infecção por esta espécie, associados com o crescente número de
casos de AIDS (DELABIE et al., 1991; STRATTON, 1992; FALKINHAM III,
1996; LEITE et al., 1998).
As espécies M. fortuitum e M. chelonae segundo GOODFELOW &
MAGEE (1998) são consideradas micobactérias de crescimento rápido,
patogênicas, podendo causar infecções pulmonares, de pele e tecidos
(FALKINHAM III, 1996). Existem muitos casos relatados de M. fortuitum e M.
chelonae causando infecções pulmonares, de córnea e outras (LEITE et al.,
1995; WALLACE et al. 1991; BARBER et al., 1991; STRATTON, 1992; LEITE
et al., 1995; FALKINHAM III, 1996; LEITE et al., 1998). M. fortuitum, cresce a
43ºC, enquanto M. chelonae não cresce a 43ºC (KENT & KUBICA, 1985;
DAVID et al., 1989; BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; FALKINHAM III, 1996;
GOODFELLOW & MAGEE, 1998; HEIFETS & JENKINS, 1998; CONVILLE &
WITEBSKY, 1998; MUÑOZ et al., 1998). M. fortuitum, M. chelonae têm sido
isolados de muitas fontes naturais, em rios, lagos, mar, solo e também de
outras fontes como águas de hospitais, gelo e máquinas de gelo, águas de
piscicultura e aquários e de fontes termais (LEITE et al., 1989; FALKINHAM III,
1996; FALKINHAM III, 1998, LEITE et al., 1998).
Vinícius Pereira Arantes
22
1.2. QUIMIOTERAPIA DA TUBERCULOSE
O esquema terapêutico preconizado pelo Ministério da Saúde (MS) em
1979 é composto por isoniazida, rifampicina e pirazinamida, durante dois meses
e isoniazida e rifampicina mantidos por mais quatro meses (Esquema I)
(BRASIL. Ministério da Saúde,1999; TELLES et al.,1997;VERONESI &
FOCACCIA,1996). O tratamento pode ser dividido em duas fases, a primeira
chamada de ataque e a segunda de manutenção sob a finalidade de evitar
resistência microbiana e persistência bacilar (BRASIL. Ministério da Saúde,
2002; DINIZ et al. 1995). As drogas têm locais diferentes de ação, a rifampicina
(RMP) e isoniazida (INH) são eficazes em população bacilares de crescimento
rápido, já em populações bacilares intracelulares o emprego da pirazinamida
(PZA) é fundamental (BRASIL.Ministério da Saúde, 2002). No fracasso do
esquema I é indicado o esquema de retratamento (Esquema IR) que é
composto por Rifampicina (RMP), Isoniazida (INH), Pirazinamida (PZA),
Etambutol (EMB), durante dois meses e Rifampicina (RMP), Isoniazida (INH) e
Etambutol (EMB) durante quatro meses. Caso os esquemas I e IRI venham a
falhar é possível instalar o esquema III, composto por Estreptomicina (SM),
Etionamida (ETH), Etambutol (EMB), Pirazinamida (PZA), que compreendem
três meses e a segunda fase é composta por Etionamida (ETH) e Etambutol
(EMB) durante nove meses (SCHECHTER, 2001). A resistência do M.
tuberculosis aos medicamentos utilizados relaciona-se as mutações genéticas
das populações bacilares, variando normalmente de acordo com a droga.
Quanto mais drogas forem utilizadas de forma inadequada, mais resistência irá
aparecer. A multiresistência é estabelecida no Brasil, como a falência dos
Vinícius Pereira Arantes
23
esquemas I e III e ou resistência a importantes drogas usuais como RMP, INH,
SM, EMB e ou PZA (JARDIM et al.,2001).
O aparecimento de inúmeras cepas resistentes de Mycobacterium
tuberculosis é alarmante, tendo em vista que poucos fármacos efetivos
enquadram o arsenal terapêutico para tuberculose. Em pesquisa realizada no
CDC durante o primeiro trimestre de 1991, foram encontrados isolados de
Mycobacterium tuberculosis resistentes a, no mínimo, uma droga
antituberculosa em 14,9% dos casos; 3,3% dos isolados eram resistentes a
isoniazida e rifampicina. Em certas localidades, sobretudo na cidade de Nova
York, foram recuperadas cepas resistentes a, no mínimo, uma droga, incluindo
resistência emergente as fluoroquinolonas, em 33% dos casos, e a incidência a
isoniazida e a rifampicina foi de 19%. A evolução aleatória da resistência das
micobactérias às drogas independe da exposição aos agentes antimicrobianos
(KONEMAN et al. 2001; KRITSKI et al.,1993; LEITE et al., 1995; OLIVEIRA,
1994; ISEMAN, 1993).
Quando da associação tuberculose/Aids, a resistência do bacilo da
tuberculose aos diferentes fármacos utilizados, está diretamente relacionada
com a influência dirigida pela imunodeficiência gerada pelo HIV. A depleção dos
linfócitos T e conseqüentemente de linfócitos T auxiliares CD4+, a inibição de
resposta proliferativa e estímulos mitogênicos ou antigênicos desencadeados
por proteína transmembrana gp41, diminuição gradual de reação de
sensibilidade ao teste tuberculínico, linfócitos TCD4 inferior a 50 mm
3
inúmeros
fatores que cooperam para o comprometimento da tuberculose (TIERNEY JR et
al., 2001).
Vinícius Pereira Arantes
24
1.3 PESQUISA DE NOVAS ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA
TUBERCULOSE
A população mundial utiliza as plantas como medicamentos desde a pré-
história. Existem relatos do homem de Neandertal há cerca de 60.000 anos, do
emprego de plantas com atividades medicinais para o tratamento de
enfermidades humanas. Em meio ao desenvolvimento de cepas resistentes aos
quimioterápicos e as infecções causadas por micobactérias não pertencentes
ao complexo Mycobacterium tuberculosis, que naturalmente não respondem ao
tratamento preconizado para tuberculose pulmonar. (WOLINSKY, 1992;
BURMAN, 1997; COHN et al., 1997).
Inúmeras plantas foram testadas e detectadas algumas substâncias com
atividade contra micobactérias e até outros microrganismos (DI STASI,
1996).Alguns óleos essenciais também foram testados e determinados sua
atividade micobactericida.O estudo de plantas com atividade micobactericida é
alvo de inúmeros pesquisadores, que além de determinar compostos ativos
contra micobactérias patogênicas de crescimento rápido, alegam atualmente de
detectar também compostos ativos às espécies de crescimento lento e as
MOTT que são causas importantes de infecções em imunodeprimidos (ABBOT
& SMITH,1981; BRASIL. Ministério da Saúde ,2002)
A toxicidade evidenciada pelos fármacos é alta e inclui, hepatoxicidade,
neurotoxicidade, leucopenia, eosinafilia, febre, náuseas, vômitos entre outros. O
problema da adesão aos quimioterápicos utilizados no tratamento da
tuberculose e das reações colaterais provocadas por eles tem levado os
pesquisadores à busca de alternativas terapêuticas para a tuberculose. Nos
últimos anos pesquisadores de inúmeras áreas têm dispensado atenção à
Vinícius Pereira Arantes
25
pesquisa de princípios ativos em extratos brutos de plantas e suas frações com
atividade antibacteriana (GRINBAUM et al.,1995; SALTINI et al.,1993;
ZACARIAS et al.,1994).
Atualmente, produtos naturais são responsáveis diretamente ou
indiretamente por cerca de 40% dos fármacos disponíveis no mercado, sendo
70% antibióticos e antitumorais (CALIXTO& YUNES, 2001). O estudo de
plantas pode envolver pesquisas diferentes como comprovação da identidade
botânica, determinação de composição química e da ação farmacológica e
determinação das estruturas químicas ativas envolvidas. Estudos são
condicionados aos requisitos de qualidade e ausência de toxicidade dos
princípios ativos vegetais (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).
As plantas através de vias metabólicas secundárias produzem
compostos como os alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas,
glicosídeos, terpenos, poliacetilenos e substâncias oleosas, que por vezes, são
específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies (CECHINEL FILHO
& YUNES, 1998). Várias espécies de plantas têm sido pesquisadas em
algumas classes como os terpenóides (CANTRELL et al., 2001) e fisalinas
(PIETRO et al., 2000; JANÚARIO et al., 2002) tem sido verificado atividade
biológica contra micobactérias. Os estudos evidenciam a importância dos
extratos vegetais e seus componentes na síntese de novos produtos
farmacêuticos que possam ser eficientes no combate às infecções,atividades
bactericida, antifúngica, espasmogênica e antiprotozoário associadas aos
triterpenóides (ácido betulínico e lupeol), flavonóides (hiperina), quercetina,
sulfonoglicosídeo, esteróides aromáticos, aminoácidos e proantocianinas
(CALIXTO et al., 2001).
Vinícius Pereira Arantes
26
As plantas e seus produtos já eram utilizados no tratamento das
doenças infecciosas há muitos anos atrás. O conhecimento dos efeitos
benéficos de certas plantas no tratamento de moléstias faz parte dos acervos
populares desde a mais remota Antigüidade (ANDRADE et
al.,1994;BRUNETON,1993;BURMAN,1997). Não há dúvidas de que as plantas
são excelentes fontes de agentes terapêuticos de todos os tipos. Essas
substâncias de origem vegetal são biodegradáveis e renováveis, características
de grande interesse na sociedade atual, especialmente quando se pensa não
apenas na ocupação sustentável de uma região, mas sim de todo o planeta e,
ainda, na conscientização das populações a fim de garantir um ecossistema
viável no futuro.
Segundo CALIXTO & YUNES (2001) diversas espécies de plantas foram
descritas com atividade micobactericida. Sendo que alguns compostos como
terpenóides, fisalinas, Glabrol e alguns Compostos fenólicos tem sido
descobertos compostos com atividade bactericida, antifúngica, espasmogênica
e antiprotozoário associadas aos triterpenóides (ácido betulínico e lupeol),
flavonóides (hiperina), quercetina, sulfonoglicosídeo, esteróides aromáticos,
aminoácidos e proantocianinas (TUBERCULOSIS DRUG SCREENING
PROGRAM, 2001).
Os Flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos,
terpenos, poliacetilenos e substâncias oleosas, que por vezes, são específicos a
determinadas famílias, gêneros ou espécies (CECHINEL FILHO & YUNES,
1998). Outros compostos como os terpenóides (CANTRELL et al., 2001) e
fisalinas (PIETRO et al., 2000; JANÚARIO et al., 2002) são responsáveis por
atividade biológica contra micobactérias.
Vinícius Pereira Arantes
27
1.4. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE
UTILIZANDO ALAMAR BLUE ASSAY -MABA
Quando se estuda a ação antimicrobiana de substâncias provenientes de
plantas, geralmente são testadas várias bactérias Gram positivas e Gram
negativas. Porém, raramente as micobactérias são estudadas devido a
dificuldade do manuseio, crescimento lento e falta de laboratório adequado para
processar este microrganismo que é considerado de nível 3 em relação a
periculosidade (BRASIL.Ministério da Saúde, 1994). A descoberta de novas
drogas representa um desafio principalmente com relação às substâncias com
atividade contra as micobactérias, as quais têm crescimento lento, são
patogênicas e sua parede rica em lipídio representa verdadeira proteção contra
os agentes agressores.
Em relação à polaridade, os extratos vegetais apolares são pouco
estudados, pois requerem uso de solventes, e meios de culturas especiais para
a concretização do trabalho experimental. No entanto devido à alta
porcentagem de lipídios na parede das micobactérias, são os extratos e
principio ativo apolar, os mais promissores em relação à atividade
antimicobacteriana.
A célula micobacteriana se diferencia das demais eubactérias pela
constituição de sua parede celular. Esta possui alto conteúdo lipídico (60% do
peso seco das células), destacando-se os ácidos micólicos por suas
características singulares e importância nos mecanismos de patogenicidade
(GANGADHARAM,1998; ABBOT & SMITH,1981; GRANGE, 1998;
GOODFELOW & MAGEE, 1998; JAWETZ et al.,2000). Neste estudo é de
grande interesse testar extratos vegetais apolares, que podem apresentar
Vinícius Pereira Arantes
28
melhor atividade antimicobacteriana, devido a maior facilidade destes
compostos ativos em penetrar na parede de micobactérias.
A determinação do perfil de sensibilidade de cepas de Mycobacterium
frente a compostos quimioterápicos, pode ser realizado por metodologias
diferentes. O método das concentrações absolutas que também é referido
como a determinação da concentração inibitória mínima, o método da
proporção de resistência e, ainda, o método das proporções (KANTOR &
LAZLO, 1998).
O método das proporções é utilizado no Brasil, incorporando-se as
drogas antituberculose utilizadas no esquema terapêutico convencional em
meio de Lowenstein-Jensen, no entanto os resultados fornecidos pelo uso
desta metodologia oferecem resultados tardiamente, ocorrendo após 28 dias
de incubação dos meios de cultura em estufa a 37
o
C (BRASIL.Ministério da
Saúde, 1999).
O Alamar Blue (Resazurina) é composto capaz de indicar através óxido-
redução à presença de crescimento microbiano. Atualmente muito empregado
para determinar perfil de sensibilidade microbiano frente a fármacos sintéticos e
naturais, principalmente frente ao gênero Mycobacterium. A utilização do MABA,
frente a outras técnicas tem como benefícios à rapidez nos resultados, custo,
sensibilidade, possibilidade de testar inúmeros compostos, técnica colorimétrica
de fácil manejo, reprodutibilidade, emprego de quantidade reduzida de extratos
vegetais comparados a outras técnicas (COLLINS & FRANZBLAU, 1997;
FRANZBLAU et al., 1998; JANUÁRIO et al., 2002).
A pesquisa da atividade antimicobacteriana de extratos vegetais é
realizada preferencialmente pela técnica de microdiluição em placa, empregada
Vinícius Pereira Arantes
29
para determinar a CIM do extrato em inibir o bacilo e empregamos o Alamar
Blue como revelador da sensibilidade bacteriana as drogas (COLLINS &
FRANZBLAU, 1997; FRANZBLAU et al., 1998; BOLLELA et al., 1999), sendo
denominada pela técnica do MABA (Microplate Alamar Blue Assay). A técnica
do MABA tem sido empregada por diversos autores para determinar atividade
antimicobacteriana de princípios ativos naturais (PIETRO et al., 2000;
JANUÁRIO et al., 2002) e de novas drogas sintéticas (PÍCON et
al.,2002;ANDRADE et al.,1994;BURMAN,1997,CANTRELL et al.,2001;CUNHA
et al., 1994;HARDMAN & LIMBIRD,1996; HINOU et al.,1989;JANUÁRIO et al.,
2002; KUBO,1993; COWAN,1999). Nesta técnica é determinada a
Concentração Mínima Inibitória (CIM), necessária para matar 90% das células
bacterianas. Entretanto a técnica do MABA não permite avaliar a atividade
antimicobacteriana das drogas sobre as micobactérias internalizadas em
macrófago.
Vinícius Pereira Arantes
30
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS:
Avaliar a atividade antibacteriana In vitro de extratos vegetais de plantas
do cerrado Brasileiro frente à cepas padrões de Mycobacterium tuberculosis
H37Rv – ATCC 27294, Mycobacterium avium ATCC 25291 e Mycobacterium
fortuitum ATCC 6841
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
2.2.1 – Determinar Concentração Mínima Inibitória de extratos vegetais
frente a cepa de M.tuberculosis, M.fortuitum e M.avium. Utilizando a técnica do
Microplate Alamar Blue Assay – MABA.
2.2.2 – Comparar os resultados de sensibilidade das espécies de
micobactérias obtidos pela metodologia de Alamar Blue (Microplate Alamar Blue
Assay) frente aos diferentes extratos utilizados.
Vinícius Pereira Arantes
31
3. MATERIAL E METODOS
3.1. AMOSTRAS
Os extratos utilizados neste trabalho, integram o Projeto Temático Biota-
Fapesp, os mesmos foram confeccionados e gentilmente cedidos pelo
Dr. Wagner Villegas, Instituto de Química – Unesp – Araraquara.
3.1.1. EXTRATOS VEGETAIS
Tabela I. Relação dos extratos vegetais, parte do vegetal utilizado,
agente extrator e concentração dos extratos utilizados para determinação da
atividade antimicobacteriana. A metodologia de preparo dos extratos é
apresentada no anexo: método 03.
Planta
Parte do
vegetal
Agente Extrator Solução Estoque
(mg/mL)
1. Ananas ananassoides Folhas DCM 115mg/ml
2. Ananas ananassoides
Folhas Metanol 630mg/ml
3. Byrsonima cinera
Folhas Metanol 292mg/ml
4. Byrsonima crassa
Folhas Clorofórmio 177mg/ml
5. Byrsonima crassa
Folhas Etanólico 70% 494mg/ml
6. Byrsonima crassa
Aéreas Clorofórmio 228mg/ml
7. Byrsonima fagifolia
Folhas Metanol 419mg/ml
8. Cissus suscicaulis
Folhas Clorofórmio 159/mg/ml
9.Curatella americana
Cascas Clorofórmio 173mg/ml
10.Davilla elliptica
Folhas DCM 211mg/ml
11.Eriocaulon ligulatum
Escapos Clorofórmio 500mg/ml
12.Leiothrix flavescens
Escapos Clorofórmio 206mg/ml
13.Mouriri pusa
Folhas DCM 224mg/ml
14.Mouriri pusa
Folhas Metanol 729mg/ml
15.Quassia amara
Cascas DCM 53mg/ml
16.Solanum cernuum
Folhas DCM 225mg/ml
17.Strychnos pseudoquina
Folhas Metanol 70% 679mg/ml
18.Strychnos pseudoquina
Folhas DCM 183mg/ml
19.Syngonanthus artrothichus
Escapos DCM 195mg/ml
20.Syngonanthus bissulcatus
Capitulo Etanólico 214mg/ml
21.Syngonanthus macrolepsis
Escapos DCM 163mg/ml
22Syngonanthus macrolepsis
Escapos Clorofórmio 199mg/ml
23.Syngonanthus xerantemoides
Escapos Etanólico 718mg/ml
24.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 729mg/ml
25.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 500 mg/ml
26.Turnera ulmifolia
Flores Hexano 87mg/ml
27.Turrnera ulmifolia
Folhas DCM 260mg/ml
Vinícius Pereira Arantes
32
3.2. DROGA DE REFERÊNCIA
Foram utilizadas soluções estoque de isoniazida (INH - Sigma) de
concentração 10 mg/mL em água destilada.
3.3. CEPAS DO GÊNERO Mycobacterium
3.3.1 Cepa padrão de M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294
3.3.2 Cepa padrão de M.avium ATCC 25291
3.3.3 Cepa padrão de M.fortuitum ATCC 6841
As cepas foram então mantidas em meio inclinado de Lowenstein-
Jensen até o momento do uso.
4.0 METODOLOGIA
4.1 PREPARO DAS SUSPENSÕES BACILARES
Para a realização da técnica do MABA, foram utilizadas culturas de M.
tuberculosis, M.avium e M.fortuitum. Cada cepa foi mantida em meio de
Lowenstein – Jensen (LJ) até o momento do uso, para obtenção da quantidade
ideal de microrganismo. De cada cepa foi retirada uma alçada de bactérias,
que corresponde a 5,0mg de peso seco bacteriano e incubado em meio de
Middlebrook 7H9 e incubado por 10 dias a 37ºC.
Após obtenção de quantidade ideal de microrganismo, as micobactérias
foram transferidas para tubos Falcon de 10 ml e centrifugadas a 3.000 Rpm
Vinícius Pereira Arantes
33
durante 30 minutos. O sedimento foi então resuspendido e lavado duas vezes
com tampão PBS pH 7.0, acrescido de Tween 80 estéril.
4.2 TÉCNICA DE MICRODILUIÇÃO UTILIZANDO ALAMAR BLUE
ASSAY (MABA) COMO REVELADOR (COLLINS & FRANZBLAU, 1998).
Para a realização da técnica de microdiluição pela metodologia do MABA,
foi utilizada placa estéril de 96 orifícios. Nas colunas de 1e 12 em linhas de A a
H foram adicionados 200 µL de água destilada estéril, perfazendo a
necessidade de evitar provável evaporação dos compostos a serem testados.
Os orifícios presentes nas linhas de A a D da coluna 11 receberam 200
µL de meio Middlebrook 7H9, os orifícios correspondentes de E a H da coluna
11 receberam 100 µL de meio Middlebrook 7H9. Os orifícios correspondentes
da linha A de colunas de 2 a 10 receberam 150 µL de meio Middlebrook 7H9 e
os de linha B a H referentes a coluna 2 a 10, receberam 100 µL de Middlebrook
7H9.
Foram então adicionados os extratos diluídos a serem testados. Todos os
extratos foram diluídos para que estivessem na concentração inicial de 16.000
µg/ml. A linha A e B da microplaca e colunas de 2 a 10, procede-se nova
diluição e os extratos partem da diluição de 4.000 µg/ml (linha A);4.000
µg/ml(linha B);2.000 µg/ml (linha C);1.000 µg/ml(linha D);500 µg/ml (linha E);250
µg/ml (linha F);125 µg/ml (linha G);62.5 µg/ml (linha H).
Os orifícios de coluna 2 a 10 da linha A receberam 50 µL da diluição de
16.000 µg /ml. Os orifícios de linhas B referentes às colunas de 2 a 9 receberam
100 µL de extrato e a coluna 10 a droga padrão (Isoniazida 10mg/ml). Após a
Vinícius Pereira Arantes
34
homogeneização da linha B, procede à diluição de linha B a H de colunas de 2 a
10, ao final desprezar volume de 100 µl.
Ao final ser adicionado a suspensão bacilar diluída 1:25 referente a
escala n.1 de MacFarland realizada após protocolo de obtenção da suspensão
bacilar. Os orifícios de colunas de 2 a 10 e linhas de B a H receberam volume
de 100 µl de suspensão bacilar, os orifícios das linhas E a H, referentes à
coluna 11 receberam 100 µl da suspensão bacilar, com o intuito de ser controle
positivo para micobactérias.
As placas então foram seladas com filme de polietileno e incubadas em
estufa bacteriológica a 37ºC ,no quinto dia de incubação os orifícios A -11 e E –
11, receberam 25 µl de solução reveladora de Alamar Blue na proporção 1:1 e
solução de Tween 80 a 10% para a cepa de M. tuberculosis, quarto dia para a
cepa de M.avium e três dias para a cepa de M.fortuitum. As placas então foram
reincubadas por 24 horas a 37ºC. A presença de cor rósea indica crescimento
microbiano e a presença de coloração azul, indica ausência de crescimento
microbiano, para as cores intermediárias as placas foram reincubadas por mais
24 horas. Os extratos apresentados neste trabalho foram submetidos frente as
três cepas padrão e testados em triplicata.
Vinícius Pereira Arantes
35
4.3 PADRONIZAÇÃO DO TEMPO DE LEITURA PARA A TÉCNICA DO
MABA
Para a realização da técnica do MABA, foi necessário padronizar o tempo
de adição da solução reveladora (óxido-redução) solução de Alamar Blue. Em
virtude do emprego de cepas diferentes (M. tuberculosis, M. avium e M.
fortuitum),tempo de geração diferentes, detivemos a necessidade de implantar
tempo de adição específico da solução de Alamar Blue para cada espécie
testada.
Para determinar a dia ideal de adição da solução de Alamar Blue,
realizamos cultura das referidas cepas em placas de 96 Wells, na diluição de
1:25 a partir da escala nº1 de Mac-Farland. A partir de 24 horas de incubação
adicionamos 25µL da solução de MABA na coluna A, novamente incubamos e
realizamos a leitura após 24 horas.Para os testes negativos adicionamos 25µL
de solução de Alamar Blue na coluna B e incubamos por mais 24 horas,
sucessivamente até a determinação do ponto de viragem da solução de Alamar
Blue para a coloração rosa (Vide anexo:Método 06)
Tabela II – Padronização do tempo de leitura da técnica do MABA para
as cepas de M.tuberculosis, M.avium e M.fortuitum.
Período de Incubação
(Tempo em dias)
M. tuberculosis M. avium M. frotuitum
1º
- - -
2º -
- -
3º -
- +
4º -
+ +
5º +
+ +
Vinícius Pereira Arantes
36
A tabela apresenta o tempo de incubação necessário para adição da
solução reveladora nas placas. Para o M.tuberculosis foram realizadas no
quinto dia de incubação, quarto dia para M.avium e terceiro dia para M.
fortuitum.
5. RESULTADOS
Os resultados apresentados seguem a faixa de corte preconizada por
COLLINS & FRANZBLAU, (1997) como sendo de 200ug/mL. Todos os testes
foram realizados em triplicata.
Tabela III: Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M.
tuberculosis H37Rv ATCC 27294 pela técnica do MABA.
Planta Parte do vegetal Agente Extrator CIM
(µg/ml)
1. Ananas ananassoides Folhas DCM 2000
2. Ananas ananassoides
Folhas Metanol 2000
3. Byrsonima cinera
Folhas Metanol 250
4. Byrsonima crassa
Folhas Clorofórmio 62,5
5. Byrsonima crassa
Folhas Etanólico 70% 2000
6. Byrsonima crassa
Aéreas Clorofórmio 250
7. Byrsonima fagifolia
Folhas Metanol 500
8. Cissus suscicaulis
Folhas Clorofórmio 62,5
9.Curatella americana
Cascas Clorofórmio 62,5
10.Davilla elliptica
Folhas DCM 2000
11.Eriocaulon ligulatum
Escapos Clorofórmio 500
12.Leiothrix flavescens
Escapos Clorofórmio 62,5
13.Mouriri pusa
Folhas DCM 2000
14.Mouriri pusa
Folhas Metanol 2000
15.Quassia amara
Cascas DCM 62,5
16.Solanum cernuum
Folhas DCM 500
17.Strychnos pseudoquina
Folhas Metanol 70% 2000
18.Strychnos pseudoquina
Folhas DCM 125
19.Syngonanthus artrothichus
Escapos DCM 62,5
20.Syngonanthus bissulcatus
Capitulo Etanólico 4000
21.Syngonanthus macrolepsis
Escapos DCM 500
22.Syngonanthus macrolepsis
Escapos Clorofórmio 62,5
23.Syngonanthus xerantemoides
Escapos Etanólico 1000
24.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 4000
25.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 4000
26.Turnera ulmifolia
Flores Hexano 250
27.Turnera ulmifolia
Folhas DCM 500
Os resultados apresentados pelos extratos 04, 08,09,12,15,18,19 e 22
são promissores apresentando valores de CIM inferior a 200ug/ml.
Vinícius Pereira Arantes
37
A tabela IV apresenta os Concentração Inibitória Mínima (CIM), de
extratos Vegetais, frente a cepa padrão de M. avium.
Tabela IV: Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M.
avium ATCC 25291 pela técnica do MABA.
Planta Parte do vegetal Agente Extrator CIM
(µg/ml)
1. Ananas ananassoides Folhas DCM 2000
2. Ananas ananassoides
Folhas Metanol 2000
3. Byrsonima cinera
Folhas Metanol 500
4. Byrsonima crassa
Folhas Clorofórmio 250
5. Byrsonima crassa
Folhas Etanólico 70% 2000
6. Byrsonima crassa
Aéreas Clorofórmio 500
7. Byrsonima fagifolia
Folhas Metanol 1000
8. Cissus suscicaulis
Folhas Clorofórmio 250
9.Curatella americana
Cascas Clorofórmio 250
10.Davilla elliptica
Folhas DCM 125
11.Eriocaulon ligulatum
Escapos Clorofórmio 250
12..Leiothrix flavescens
Escapos Clorofórmio 500
13.Mouriri pusa
Folhas DCM 4000
14.Mouriri pusa
Folhas Metanol 4000
15.Quassia amara
Cascas DCM 62,5
16.Solanum cernuum
Folhas DCM 250
17.Strychnos pseudoquina
Folhas Metanol 70% 2000
18.Strychnos pseudoquina
Folhas DCM 250
19.Syngonanthus artrothichus
Escapos DCM 125
20.Syngonanthus bissulcatus
Capitulo Etanólico 4000
21.Syngonanthus macrolepsis
Escapos DCM 500
22.Syngonanthus macrolepsis
Escapos Clorofórmio 125
23.Syngonanthus xerantemoides
Escapos Etanólico 2000
24.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 4000
25.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 4000
26.Turnera ulmifolia
Flores Hexano 125
27.Turnera ulmifolia
Folhas DCM 62,5
Os resultados indicam que os extratos 10,15,19,22,26 e 27, são
promissores apresentando atividade antimicobacteriana frente a cepa padrão
de M.avium, apresentando valores de CIM inferior a 200ug/ml.
Vinícius Pereira Arantes
38
A tabela V apresenta os Concentração Inibitória Mínima (CIM), de
extratos vegetais, frente a cepa padrão de M.fortuitum.
Tabela V: Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M.
fortuitum ATCC 6841pela técnica do MABA.
Planta Parte do vegetal Agente Extrator CIM
(µg/ml)
1. Ananas ananassoides Folhas DCM 4000
2. Ananas ananassoides
Folhas Metanol 4000
3. Byrsonima cinera
Folhas Metanol 1000
4. Byrsonima crassa
Folhas Clorofórmio 4000
5. Byrsonima crassa
Folhas Etanólico 70% 4000
6. Byrsonima crassa
Aéreas Clorofórmio 500
7. Byrsonima fagifolia
Folhas Metanol 4000
8. Cissus suscicaulis
Folhas Clorofórmio 1000
9.Curatella americana
Cascas Clorofórmio 4000
10.Davilla elliptica
Folhas DCM 125
11.Eriocaulon ligulatum
Escapos Clorofórmio 500
12.Leiothrix flavescens
Escapos Clorofórmio 1000
13.Mouriri pusa
Folhas DCM 4000
14.Mouriri pusa
Folhas Metanol 4000
15.Quassia amara
Cascas DCM 62,5
16.Solanum cernuum
Folhas DCM 500
17.Strychnos pseudoquina
Folhas Metanol 70% 4000
18.Strychnos pseudoquina
Folhas DCM 500
19.Syngonanthus artrothichus
Escapos DCM 500
20.Syngonanthus bissulcatus
Capitulo Etanólico 4000
21.Syngonanthus macrolepsis
Escapos DCM 1000
22Syngonanthus macrolepsis
Escapos Clorofórmio 125
23.Syngonanthus xerantemoides
Escapos Etanólico 4000
24.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 4000
25.Syngonanthus xerantemoides
Capitulos Etanólico 70% 4000
26.Turnera ulmifolia
Flores Hexano 125
27.Turnera ulmifolia
Folhas DCM 125
Os resultados indicam que os extratos 10,15,22,26 e 27, são promissores
apresentando atividade antimicobacteriana frente a cepa padrão de
M.fortuitum, apresentando valores de CIM inferior a 200ug/ml.
Vinícius Pereira Arantes
39
Tabela VI apresenta a determinação da Concentração Mínima Inibitória
dos extratos vegetais utilizados frente às cepas de M. tuberculosis , M. avium e
M. fortuitum.
Tabela VI- Determinação da Concentração Mínima Inibitória para as cepas de
M. tuberculosis, M.avium e M. fortuitum
Planta
CIM (µg/ml)
M.tuberculosis
CIM (µg/ml)
M. avium
CIM (µg/ml)
M. fortuitum
1. Ananas ananassoides 2000 2000 4000
2. Ananas ananassoides
2000 2000 4000
3. Byrsonima cinera
250 500 1000
4. Byrsonima crassa
62,5 250 4000
5. Byrsonima crassa
2000 2000 4000
6. Byrsonima crassa
250 500 500
7. Byrsonima fagifolia
500 1000 4000
8. Cissus suscicaulis
62,5 250 1000
9.Curatella americana
62,5 250 4000
10.Davilla elliptica
2000 125 125
11.Eriocaulon ligulatum
500 250 500
12.Leiothrix flavescens
62,5 500 1000
13.Mouriri pusa
2000 4000 4000
14.Mouriri pusa
2000 4000 4000
15.Quassia amara
62,5 62,5 62,5
16.Solanum cernuum
500 250 500
17.Strychnos pseudoquina
2000 2000 4000
18.Strychnos pseudoquina
125 250 500
19.Syngonanthus artrothichus
62,5 125 500
20.Syngonanthus bissulcatus
4000 4000 4000
21.Syngonanthus macrolepsis
500 500 1000
22.Syngonanthus macrolepsis
62,5 125 125
23.Syngonanthus xerantemoides
1000 2000 4000
24.Syngonanthus xerantemoides
4000 4000 4000
25.Syngonanthus xerantemoides
4000 4000 4000
26.Turnera ulmifolia
250 125 125
27.Turnera ulmifolia
500 62,5 125
Dentre os extratos que apresentaram atividade antimicobacteriana,
devemos destacar os extratos de número 15 e 22 que apresentaram CIM
inferior a 200 µg/ml para as três cepas analisadas.
Vinícius Pereira Arantes
40
6. DISCUSSÃO
Apesar da terapia antituberculosa datar de 50 anos atrás, o M.
tuberculosis continua sendo um problema de saúde pública mundial. Acredita-se
que 1,7 bilhões de pessoas em todo o mundo foram infectados em 1990
(PARRY & DAVIES,1996; PENNA,1998). A inconsistente eficácia da vacina do
Bacillus Calmette Guerin (BCG), o aumento dos casos de AIDS/tuberculose e
desencadeamento de cepas resistentes, formam um dos pilares que esclarecem
os elevados índices (COOK,1991;PENNA,1998;ABBOT & SMITH,1981). No
Brasil foi possível detectar fatores de risco, tais como a redução da eficiência do
Programa de Controle da Tuberculose (PCT), o uso incorreto da medicação,
abandono ao tratamento, utilização abusiva de álcool e baixo nível de
escolaridade (FREEDMAN & CASADEVALL, 1998; NATAL & ELIAS, 2000;
MELO et al.,1996; MELO et al.,2000; OMS,1987).
O contexto entre sensibilidade e resistência de micobactérias aos
diferentes antimicrobianos e a constante evolução da resistência ( SNIDER &
CASTRO, 1998) pode-se dizer que os antimicrobianos que dispomos para a
terapêutica estão fadados aos dialetos históricos.Provavelmente no futuro
encontraremos que medicamentos como INH,RMP e PZA foram úteis ao
tratamento da tuberculose e outras micobacterioses, ou ainda que são
insuficientes para tratar um paciente com doença similar a Tuberculose ou ainda
pelas causas inúmeras de processos infecciosos causados por MOTT
(GARCIA, 1986; BARRETO et al.1994;WHO,1996;WAYNE & KUNBICA,1986;
RODRIGUES et al.,2003)
O conhecimento entre pesquisadores é que se faz necessário a pesquisa
de novos medicamentos para o tratamento da Tuberculose e outras doenças
Vinícius Pereira Arantes
41
causadas por micobatérias. A pesquisa por substâncias ativas contra
micobactérias e por sua vez menos tóxicas, tem motivado e empenhado
pesquisadores na busca de soluções para o tratamento da tuberculose que
desde a antiguidade vem dizimando populações.Os medicamentos chamados
fitoterápicos expressam o estudo por substâncias oriundas de plantas na
necessidade da introdução de novos fármacos (ANDRADE et al.,1994;
BELICKAS,1994; CUNHA et al.,1994; KUBO,1993; RAMAKERS et al.,1994)
Neste estudo, extratos apolares de Byrsonima crassa, Cissus suscicaulis,
Curatella americana, Leiothrix flavescens, Quassia amara, Strychnos
pseudoquina, Syngonanthus artrothicus, e Syngonanthus macrolepsis
apresentaram atividade contra a cepa padrão de M. tuberculosis CIM inferior a
200µg/ml. Para M.avium , valores de CIM inferior a 200µg/mL foram verificados
para os extratos apolares de Davilla elliptica, Quassia amara, Syngonanthus
artrothichus, Syngonanthus macrolepsis, Turnera ulmifolia. Para M. fortuitum
valores de CIM inferior a 200µg/mLforam encontrados apenas nos extratos
apolares de Davilla elliptica, Quassia amara, Syngonanthus macrolepsis, e
Turnera ulmifolia . Para as mesmas plantas analisadas, utilizando agentes
extratores polares (etanólico 70%), foram verificados CIM superiores a 200
µg/m. A elevada concentração de lipídios de alto peso molecular presente na
parede de micobactérias provavelmente funcionou como uma barreira para os
compostos polares,justificando os valores mais promissores para os extratos
apolares (RODRIGUES et al.,2003; TOSSI & ELLNER,1998). Os componentes
ativos, extraídos pelos extratores apolares, sendo compostos lipofílicos
provavelmente puderam permear mais facilmente a barreira lipídica presente na
parede das micobactérias.
Vinícius Pereira Arantes
42
Pelos dados da Tabela VI, é verificado que M. tuberculosis apresentou
maior sensibilidade aos extratos quando comparado ao M. avium e ao M.
fortuitum. Para os extratos de Byrsonima crassa, Curatella americana, Leiothrix
flavescens, Strychnos pseudoquina, Syngonanthus artrothichus e Syngonanthus
macrolepsis, valores crescentes de CIM foram verificados seqüencialmente
para M.tuberculosis, M.avium e M.fortuitum. Este aumento era esperado em
virtude da menor rigidez da parede do M.tuberculosis quando comparada à de
outras duas espécies ( TOSSI & ELLNER, 1998). O M. fortuitum é caracterizado
como sendo o mais resistente e o M. avium como de resistência intermediária
(AL-HAJJAJ et al.,2001)
A Tabela VI, pode-se verificar também que extratos apolares de Davilla
elliptica, Turnera ulmifolia apresentaram atividade contra M.avium e M,
fortuitum, não foram efetivos para M. tuberculosis, fato que também poderia ser
justificado pela diferença na constituição da parede entre as espécies
analisadas.Entretanto devemos salientar que extrato apolares de Quassia
amara e Syngonanthus macrolepsis foram ativos numa CIM inferior a 200µg/mL
para as três cepas estudadas.
Alguns constituintes químicos como os terpenóides, flavonóides, taninos,
cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos, e alcalóides também tem sido
estudados quanto a sua atividade antimicrobiana ( CECHINEL FILHO &
YUNES,1998; CANTRELL et al.,2001).
Os terpenóides são chamados de inseticidas naturais, dentre esta classe
integram os limonóides, limoneno e o mirceno, desempenhando um papel de
proteção às plantas contra a ação de insetos. Alguns terpenóides já foram
testados e apresentaram atividade contra micobactérias (CANTRELL et al.,
Vinícius Pereira Arantes
43
2001). Os terpenos são formados por unidades básicas de isopentenil-
pirofosfato ou isopreno ativo, originando os triterpenos e os sesquiterpenos já
citados na literatura como substâncias dotadas de ação bactericida (PIETRO et
al.,2000; JANUARIO et al., 2002).
Os flavonóides constituem um grande grupo de pigmentos vegetais de
ampla distribuição na natureza, detêm presença abundante em plantas,
desperta segurança e proteção aos vegetais contra a ação nociva de infecções
bacterianas, fúngicas e até mesmo como agente protetor contra a ação dos
raios ultravioleta e atração de polinizadores (BRUNETON,1993;
PELLETIER,1983). Os taninos são polifenóis, associados na medicina popular
para o tratamento de diversas patologias orgânicas tais como, diarréia, feridas,
queimaduras, gastrite, úlcera gástrica, hemorragias, problemas renais e sistema
urinário e processos inflamatórios (BEARTet al., 1985)
As Cumarinas são amplamente distribuídas nos vegetais, mas também
podem ser encontradas em fungos e bactérias, estruturalmente são lactonas
(EVANS,1996). A atividade farmacológica das cumarinas depende
principalmente de seus padrões de substituições. O dicumarol (uma cumarina
modificada) na medicina é utilizada como substância de atividade
anticoagulante, a escoparona (curamina modificada) apresenta atividade
imunossupressora e relaxante vascular e algumas xantonas possuem atividade
antimicrobiana) contra o Mycobacterium tuberculosis. Outras substâncias ainda
pouco estudadas são citadas em alguns artigos científicos, são os chamados
fitóis, um grupo de compostos que pouco interessam ao estudo químico por não
apresentarem diretamente importância para a síntese orgânica, mas estão
Vinícius Pereira Arantes
44
também presentes em algumas plantas contidas neste trabalho ( HARDMAN &
LIMBIRD, 1996; GHOSAL & CHAUDHURI,1975).
As plantas do gênero Byrsonima , possuem em sua constituição uma
quantidade razoável de compostos derivados de Flavonóides, dentre eles os
triterpenos (TEIXEIRA & MACHADO,2000). Estudos realizados anteriormente
determinaram a existência de atividade antibacteriana, antifúngica e
antiprotozoário. Os gêneros Ananás, Cissus, Eriocaulon, Leiothrix, Mouriri,
Quassia, Solanum, Strychnos, Syngonanthus, Turnera. São extratos
promissores, e escolhidos neste trabalho por serem citados na literatura com
algum emprego na medicina popular para causas infecciosas e o presente tem
o intuito de estudar a possível ação antimicobacteriana.
A pesquisa de novas drogas está intimamente ligada a métodos
analíticos que proporcionem a detecção de compostos ativos contra bactérias.
Diferentes técnicas são atualmente utilizadas, dentre elas talvez a mais
conhecida é a diluição de extratos em tubos contendo meios sólidos, técnica de
reprodutibilidade fácil, porém de determinação tardia onde para conseguirmos
realizar a leitura são necessários no mínimo quatro a oito semanas de
incubação(BRASIL.Ministério da Saúde,2002). Outro fator negativo é a
necessidade de grandes volumes de extrato (que são incorporados no meio
sólido). O problema se agrava quando são utilizados meios com ovos como o
LJ e o Ogawa, pois os extratos são adicionados antes da fase de coagulação
do meio, ocasionando aquecimento dos extratos. Caso haja presença de
compostos termolábeis, pode ocorrer alteração da estrutura química com
inativação dos princípios ativos (SIDDIQI et al., 1993). Métodos mais novos
como o sistema BACTEC e o MGIT são empregado na determinação de
Vinícius Pereira Arantes
45
sensibilidade para micobactérias frente a novos compostos, porém as
metodologias apresentam elevado custo e necessita de leitores especializados
(SIDDIQI et al., 1993).
O BACTEC é muito empregado na determinação de sensibilidade para
micobactérias frente a novos compostos, porém a metodologia apresenta
elevado custo e necessita de leitor semi-automatizado, além de ser método
radiométrico envolvendo riscos operacionais. O MGIT também é técnica
revolucionária na análise de perfil de sensibilidade, porém apresenta elevado
custo e indicador radiométrico, impossibilitando o seu emprego rotineiramente
no estudo de compostos novos (SIDDIQI et al., 1993).
A metodologia do MABA empregada neste trabalho oferece inúmeras
facilidades, frente às outras técnicas tradicionais, por apresentar fácil manejo,
reprodutibilidade dos resultados e baixo custo. Sendo uma microtécnica, a
quantidade de extrato utilizada no MABA é bem inferior as demais. Outras
vantagens que podem ser citadas são : menor tempo de espera, não alterar a
constituição dos componentes termolabeis e possibilita avaliar concentrações
múltiplas e diversos extratos simultaneamente (FRANZBLAU et al.,1998)
A metodologia do MABA, foi empregado neste trabalho para os testes
com extratos vegetais utilizando cepa padrão de M. tuberculosis, M. avium M.
fortuitum. Para determinar a atividade de substâncias naturais contra o M.
tuberculosis já é preconizando a incubação de 05 dias para adição da solução
de Alamar Blue (FRANZBLAU et al., 1998). Porém para o emprego das cepas
de M.avium e M. fortuitum foi necessário uma padronização em virtude do
tempo de geração destes microrganismos, ser diferente comparado ao
M.tuberculosis. Assim , foi definido neste trabalho a aplicação do revelador
Vinícius Pereira Arantes
46
Alamar Blue após incubação de 04 dias para M. avium e 03 dias para M.
fortuitum (Anexo: Método 06). Os estudos mostraram a viabilidade da utilização
do MABA mesmo para as micobactérias de crescimento rápido como
M.fortuitum , possibilitando estudo de novas drogas para as MOTT, que mesmo
pertencendo ao gênero Mycobacterium, apresentam sensibilidade diferenciada
em relação ao M.tuberculosis.
Ainda citamos sobre a metodologia do MABA a reprodução fácil dos
resultados, rapidez, confiabilidade, baixo custo e rentabilidade na comparação e
obtenção dos referidos CIM apresentados. A metodologia do MABA foi
facilmente empregada e adaptada a este trabalho já que a presença de
crescimento de microrganismos e períodos de incubação foi facilitada, propicia
emprego de vários extratos, facilitando a comparação entre os diferentes CIM.
O emprego de compostos apolares não exclui a atividade de extratos
polares. A proposta deste trabalho é analisar se a presença de compostos
solúveis e carreados pelos agentes extratores apolares que possam conferir
melhor atividade antimicobacteriana. Assim como parte das plantas testadas,
flores, folhas, escapos, cascas, capítulos podem apresentar compostos ativos.
Porém neste trabalho salientamos que para a espécie M. tuberculosis, só
detivemos atividade antimicobacteriana (CIM inferior a 200µg/mL) utilizando
agentes extratores apolares. Os agentes extratores polares como etanólico 70%
detivemos CIM superiores a 200 µg/mL. Para as cepas de M.avium e
M.fortuitum repetimos a boa atuação dos extratos apolares e onde foram
empregados agentes extratores de baixa polaridade, perfazendo a justificativa
de que compostos lipofílicos possam permear mais facilmente a barreira lipídica
presente na parede das micobactérias.
Vinícius Pereira Arantes
47
7.0 CONCLUSÃO
• A técnica do MABA utilizada neste trabalho, confirma o fácil
manuseio da metodologia, sua real reprodutibilidade e a fácil
comparação entre os resultados entre as três cepas padrão do
gênero Mycobacterium que foram submetidas aos testes.
• A técnica de microdiluição é uma técnica que pode ser
facilmente empregada para avaliar um grande número de
extratos.
• Os extratos apolares apresentaram melhor CIM, justificando e
comprovando a importância de utilização de agentes extratores
apolares, na obtenção de compostos lipofílicos.
• A cepa de Mycobacterium tuberculosis apresenta sensibilidade
maior a alguns extratos, em relação às cepas de Mycobacterium
avium e Mycobacterium fortuitum.
• Podemos concluir que a atividade de CIM utilizando a cepa de
Mycobacterium tuberculosis,apresentou menores CIM os
extratos do gênero: Byrsonima, Cissus, Leiothrix, Quassia,
Strychnos, Syngonanthus. E por sua vez os agentes extratores
utilizados foram Clorofórmio e Diclorometano.
• Os CIMs referentes a cepa de Mycobacterium avium , são
atribuídos aos gêneros : Davilla, Quassia, Syngonanthus,
Turnera. Os agentes extratores utilizados foram: Diclorometano,
Clorofórmio e Hexano.
Vinícius Pereira Arantes
48
• Os CIMs referentes a cepa de Mycobacterium fortuitum, são
atribuídos aos gêneros: Davilla, Quassia, Syngonanthus,
Turnera. E os agentes extratores utilizados são: Diclorometano,
Clorofórmio e Hexano.
• Neste estudo foi possível comprovar que os extratos polares,
não apresentaram efeito antimicobacteriano e
conseqüentemente CIM desfavorável e superior a 200µg/ml. Um
exemplo é que em todas os extratos de Syngonanthus
macrolepsis, obtido com agente extrator etanólico não
apresentou efeito de CIM inferior a 200µg/ml, porém com a
utilização de clorofórmio como agente extrator foi apresentado
CIM , inferior a 200µg/ml. Comprovando a necessidade do
estudo de extratos apolares.
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Vinícius Pereira Arantes
67
LISTA DE ANEXOS
Vinícius Pereira Arantes
68
Método-1
Preparo Dos Meios De Cultivo: Lowenstein – Jensen (Lj)
1) Composição
Fosfato monopotássico anidro ( KH
2
PO
4
) ----------------------2.4g
Sulfato de magnésio (MgSO
4
.7H
2
O)------------------------------0.5g
Ácido cítrico-------------------------------------------------------------0.5g
L-asparigina-------------------------------------------------------------3.6g
Fécula de batata--------------------------------------------------------30g
Glicerol-------------------------------------------------------------------9.6g
Água destilada---------------------------------------------------------600ml
Ovos integrais homogeneizados--------------------------------1000ml
Verde malaquita, 2% aquosa---------------------------------------20ml.
2) PREPARO
Dissolver os sais e a asparigina em água, realizar todo procedimento
em erlenmeyer de 2000ml, adicionar a fécula de batata, levar ao fogo até que
a fécula de batata se dissolva. Adicionar o glicerol e autoclavar a 121ºC por 30
minutos. Esfriar a temperatura ambiente, manter em estufa 37ºC para teste de
esterilidade.
Os ovos devem ser limpos, utilizando água e sabão 5% e em seguida
escovados e submersos em álcool a 70% por 6 horas. Utilizando luvas,
quebrar os ovos em batedeira (estéril), homogeneizar os ovos, filtrar em 4
camadas de gaze estéril, em funil estéril, para uma proveta (estéril) onde se
mede o volume necessário de ovos homogeneizados.
Adicionar os ovos filtrados à mistura de sais e fécula de batata,
adicionar o verde malaquita e agitar até completa dissolução.
Vinícius Pereira Arantes
69
3) Distribuição Do Meio Nos Tubos Com Tampa Rosca
Os tubos utilizados são de tampa rosca 16 X 125 mm, sendo o meio
distribuído num volume de 5 a 7 ml por tubo.
4) Coagulação Do Meio
Os tubos são coagulados em estufa com temperatura de 80ºC, por 60
minutos, os tubos são inclinados, com as tampas semi abertas para que a
água evapore. Após coagulação, os tubos devem ser incubados a 37ºC por 48
horas para teste de esterilidade com tampas ligeiramente frouxas, com a
finalidade de eliminar água.
Vinícius Pereira Arantes
70
Método – 2
Meio De Cultivo: Middlebrook 7h9
1) Composição Do Meio
Citrato férrico amoniacal -------------------------------------------0.04g
Fosfato dissódico------------------------------------------------------2.5g
Fosfato monopotássico-----------------------------------------------1.0g
Sulfato de magnésio-------------------------------------------------0.05g
Sulfato de amônio------------------------------------------------------0.5g
L – glutamato------------------------------------------------------------0.5g
Piridoxina----------------------------------------------------------------0.01g
Biotina----------------------------------------------------------------0.0005g
Citrato de sódio-------------------------------------------------------0.01g
Cloreto de cálcio--------------------------------------------------0.0005g
Sulfato de zinco---------------------------------------------------0.0001g
Sulfato de cobre---------------------------------------------------0.0001g
Tween 80--------------------------------------------------------------0.5 ml
Glicerol------------------------------------------------------------------5.0ml
Água destilada q.s.p----------------------------------------------1.000ml
OADC
Albumina bovina fração V---------------------------------------------5.0g
Dextrose------------------------------------------------------------------2.0g
Catalase--------------------------------------------------------------0.0003g
Água destilada--------------------------------------------------------100ml
Vinícius Pereira Arantes
71
2) Preparo Do Meio de cultura Middlebrook 7H9
O meio de cultura Middlebrook 7H9 é adicionado de glicerol a 50% e de
Tween 80 a 20% para evitar a formação de grumos de micobactérias durante o
período de incubação em estufa a 37
o
C.
Para o preparo de 100 mL do meio de cultura foram utilizados:
Middlebrook 7H9 .......................................... 0,47g
Água destilada ............................................... 90,0 mL
Tween 80 a 20% ............................................ 250 µL
Glicerol a 50% ............................................... 400 µL
O meio foi autoclavado a 121
o
C durante 15 minutos e, após o
resfriamento, acrescentado 10,0 mL do suplemento OADC, para a
determinação da Concentração Inibitória Mínima.
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72
Método – 3
Método De Solubilização Dos Extratos Brutos Vegetais
1) Procedimento
- Pesar o extrato bruto na balança;
- Anotar a massa na respectiva folha do caderno;
- Transferir a massa num frasco apropriado e colocar inicialmente 1,5 mL
do solvente (DMSO);
- Submergir o frasco com extrato bruto e o solvente no aparelho de ultra-
som;
- Ligar o aparelho durante 5 minutos e transcorrido o tempo, repousar a
solução durante 1 dia na geladeira;
- Ligar o aparelho por mais 5 minutos;
- Repetir o procedimento, 5 em 5 minutos acrescentando 0,5 mL nestes
intervalos, até que o extrato solubilizar completamente. Deve-se anotar o
tempo transcorrido e o volume utilizado;
- Pode-se utilizar o shake, para facilitar na solubilização.
Aparelho de ultra-som
- Completar o volume até o local indicado no aparelho com água;
- Completar o volume sempre que a água aproxima do limite da água
permitida; (pode-se colocar o cano de plástico para cima, não a
necessidade de preencher a água);
- Concluído o experimento, descartar a água;
- Limpar o aparelho.
Informações:
DMSO
DMSO: dimetil sulfóxido
C
2
H
6
SO MM=78,13g/mol
Ponto de congelamento=18ºC (facilmente congelado, descongela
vagarosamente na temperatura ambiente)
Vinícius Pereira Arantes
73
Método – 4
Solução De Alamar Blue
(preparação de solução final 120 uL) – 2 pocinhos
- Adicionar num tubo 900 uL de H
2
0 destilada estéril e 100 uL de tween
80;
- Volume final anterior 1000 ul de solução A;
- Prepar numa razão volume:volume;
- Retirar 60 uL de solução A;
- Adicionar num tubo;
- Retirar 60 uL de Alamar Blue;
- Razão 1:1;
- Acrescentar no tubo anterior;
- Solução final 120 uL.
(preparação de solução final 4000 uL) – todos os pocinhos: 2 placas
- 1800 uL de H
2
0 destilada estéril no tubo;
- 200 uL de tween 80;
- 2000 uL de alamar blue;
- Homogeneizar;
- 25 uL em cada weels, menos na coluna 1 e 12;
- Ficar 24h para verificar o resultado.
Vinícius Pereira Arantes
74
Método 5
Tampão PBS (10X)
· 80g NaCl (Merck)
· 20g KCl (Merck)
· 14.4g Na2HPO4.2H2O (Merck)
· 4g KH2PO4 (Merck)
· H2O milli-Q até perfazer um litro
· Ajustar o pH 7.4.
Vinícius Pereira Arantes
75
Método 6
Padronização do tempo de leitura para a técnica do MABA
Padronização para M.tuberculosis
Técnica:
- A coluna de número 1e12 apenas recebe 200uL de água destilada estéril, de
linhas A-H
- A coluna número de 2 a 10 linha A 150ul de meio Middlebrook 7H9
- A coluna de 2-10 e linhas de B a H receberam 100 µl de meio Middlebrook 7H9
- Foi adicionado 50µL de suspensão bacteriana 1:25 a partir da escala nº 1 de
Mac-Farland nos Wells da coluna de 2-10 e linhas de B-H
- A placa foi incubada a 37ºC
A coluna 2 = tempo zero
- A coluna 3 = recebe 25µL de solução de Alamar Blue após 24horas de
incubação (teste negativo- permanece azul)
- A coluna 4 = recebe 25µL após 48 horas de incubação (teste negativo)
- A coluna 5 = recebe 25µL após 72 horas de incubação (teste negativo)
- A coluna 6 = recebe 25µL após 96 horas de incubação (teste negativo)
- A coluna 7 = recebe 25µL após 120 horas de incubação (teste positivo) –
modificação da coloração de azul para rosa. Leitura realizada período
vespertino.
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