( PDF ) Bolores deteriorantes em queijo parmesão

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CAMPUS DE ARARAQUARA

BOLORES DETERIORANTES EM QUEIJO PARMESÃO

JOSÉ SEBASTIÃO CORRÊA NETO

DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM ALIMENTOS E

NUTRIÇÃO

ÁREA DE CIÊNCIAS DOS ALIMENTOS

Orientador: Professor Dr. José Paschoal Batistuti

Co-orientador: Professora Dra. Maria José S. Mendes Gianinni

ARARAQUARA - SP

2005

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COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. José Paschoal Batistuti

(Orientador)

. Marta Hiromi Taniwaki

(Membro)

. Alice Tanaka

(Membro)

Araraquara, 30 de Setembro de 2005.

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Vivo e trabalho todos os dias da minha vida para

ser uma pessoa comum num país desenvolvido ao

invés de um privilegiado em uma sociedade do terceiro

mundo.

A Renata, minha parceira no amor, na vida e neste trabalho.

Para Você, Elas e Ele.

Sol, luz.

A vida sempre brilha,

Brilha vida nossa.

É sol, é luz que passa, ultrapassa.

Que brilha de nós em nós.

Juntos,

Vidas a brilhar também conosco.

Vocês são sois,

Luzes,

São vidas que sempre brilharão.

A minha família, Renata,

Jordana, Claudia e Luiz

Henrique, pela competência de

me realizarem como marido e

pai.

Agradeço

A toda vida e energia do universo que sempre conspiram a nosso favor;

Ao Prof. Dr. José Paschoal Batistuti pela orientação e amizade durante a

realização deste trabalho e do curso de mestrado;

À Prof

. Dr

. Maria José S. Mendes Gianinni pela co-orientação, amizade e

abertura para a parte prática fosse realizada no laboratório de micologia;

Ao Laticínios Scala na figura dos seus Diretores, da Superintendência e da

Gerência da Garantia da Qualidade pelo apoio financeiro e pela confiança

depositada na realização deste trabalho;

Aos demais funcionários do Laticínios Scala que contribuíram para a

realização deste trabalho;

Aos membros da banca Dr

. Marta Hiromi Taniwaki e Dr

. Alice Tanaka ,

pelas correções e pelas presenças na banca examinadora;

À Elaine e Rosangela do laboratório de micologia pela disponibilidade e

orientação durante a parte prática do trabalho;

Aos colegas do laboratório de micologia pela cooperação e incentivo;

Aos meus pais, Luiz Fabiano e Carminha, pelas muitas acolhidas no

conforto de seu lar durante a realização do curso de mestrado;

Ao Sr. Rafael Lofrano pelo encaminhamento inicial na área de alimentos.

A todos, meus cordiais e sinceros agradecimentos.

Lista de Abreviaturas

% - porcentagem

C - grau centígrado

µL - microlitro

AA - ácido acético glacial

APHWW - American Publich Health of Water and Wastwater

APPCC - Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle

BPF - Boas Práticas de Fabricação

- centímetro quadrado

- centímetro cúbico

CREA - Agar Creatina Sacarose

CYA - Agar Czapek Extrato de Levedura

DG 18% - Agar Glicerol Dicloran 18%

DRBC - Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol

g - grama

kg - quilograma

- metro quadrado

MEA - Agar Extrato de Malte

mL - mililitro

mm - milímetro

m/m - massa por massa

NSA - Agar Nitrato Sacarose

- oxigênio

PCA - Agar Padrão de Contagem

PDA - Agar Batata Dextrose

PCC - Ponto Crítico de Controle

pH - potencial hidrogeniônico

PNQL - Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite

p/v - peso por volume

rpm - rotações por minuto

SAB - Agar Sabouraud Sacarose

UFC - unidade formadora de colônia

UFC/g - unidade formadora de colônia por grama

UFC/cm

- unidade formadora de colônia por centímetro quadrado

UFC/cm

- unidade formadora de colônia por centímetro cúbico

YESA - Agar Sacarose Extrato de Levedura

v/v - volume por volume

Lista de Figuras

Figura 1 – Fluxograma de produção do queijo parmesão. 30

Figura 2 – Comparação das contagens de bolores e leveduras nas amostras

de ar em relação ao padrão sugerido. 48

Figura 3 – Correlação entre o tempo de maturação e a presença de bolores

no queijo parmesão. 53

Figura 4 – Correlação entre o tempo de maturação e a presença de

Penicillum no queijo parmesão.

Figura 5 – Crescimento do agente deteriorante nos meios de cultura MEA,

CREA e CYEA. 59

Figura 6 – Crescimento do agente deteriorante nos meios de cultura NSA e

MEA + 0,5% AA. 60

Figura 7 – Características morfológicas microscópicas do agente deteriorante.

Lista de Quadros

Quadro 1 - Esquema dos tratamentos e coleta de amostras. 31

Quadro 2 - Quantidade de material amostrado e diluições aplicadas nos

respectivos tratamentos. 32

Quadro 3 - Temperatura e pH dos materiais amostrados. 76

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Comparação múltipla das médias do total de fungos no leite,

insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras–frias de

maturação) em UFC/g. 42

Tabela 2 - Comparação múltipla das médias do total de fungos nas formas,

superfícies dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em

UFC/cm

. 43

Tabela 3 - Comparação múltipla das médias do total de fungos nas amostras

de ar da fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica, sala de

fabricação e câmaras-frias de maturação em UFC/m

. 44

Tabela 4 – Freqüência dos fungos isolados nas etapas de produção da

cadeia produtiva do queijo parmesão. 45

Tabela 5 – Freqüência dos fungos isolados na etapa de maturação do queijo

parmesão. 46

Tabela 6 – Freqüência dos fungos isolados do ar em várias etapas da cadeia

produtiva do queijo parmesão.- 47

Tabela 7 – Freqüência relativa e número de ocorrência dos bolores isolados

em todos os tratamentos. 49

Tabela 8 - Comparação múltipla das médias do total de bolores no leite,

insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras–frias de

maturação) em UFC/g. 50

Tabela 9 - Comparação múltipla das médias do total de bolores nas formas,

superfícies dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em

UFC/cm

. 51

Tabela 10 - Comparação múltipla das médias do total de bolores nas

amostras de ar da fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica,

sala de fabricação e câmaras-frias de maturação em UFC/m

. 52

Tabela 11 – Soma das contagens dos organismos nas amostras das

superfícies dos queijos nas três câmaras-frias. 53

Tabela 12 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillum no leite,

insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras–frias de

maturação) em UFC/g. 55

Tabela 13 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillum nas

formas, superfícies dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores

em UFC/cm

. 56

Tabela 14 - Comparação múltipla das médias do total de Penicillum nas

amostras de ar da fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica,

sala de fabricação e câmaras-frias de maturação em UFC/m

. 57

Tabela 15 - Identificação de Pencillium isolado das manchas de queijos com

defeitos de qualidade. 59

Tabela 16 - Local de isolamento das diversas cepas do gênero Penicillium

dentro da cadeia produtiva do queijo parmesão. 62

Resumo

O presente trabalho teve como objetivo subsidiar tecnicamente o programa de

controle de qualidade de uma indústria de queijo parmesão onde alguns queijos

aparentavam estarem contaminados por bolor. Todas as análises realizadas foram

estrategicamente planejadas visando esclarecer quais os fatores que contribuíam

para a ocorrência dos bolores dentro do processo de produção. Com esta

finalidade foram amostrados, desde o leite na fazenda, até a maturação dos

queijos em câmaras-frias. Também foram avaliadas as condições ambientais

internas e externas da fábrica em questão. Os bolores isolados foram quantificados

e identificados através de análise morfológica e demais provas complementares.

Bolores representaram apenas 3,44% do total de UFC porem mais significantes

como contaminantes e deteriorantes. As amostras úmidas apresentaram altas

contagens de leveduras, que representaram 95,13% das UFC quantificadas e

1,44% das UFC não puderam isoladas para identificação. Entre os bolores isolados

constatou-se a presença de 14 diferentes gêneros: Penicillium, Aspergillus,

Cladosporium, Rhizopus, Fusarium, Aureobasidium, Chrysosporium, Alternaria,

Epicoccum, Helminthosporium, Geotrichum, Gliocladium, Nigrospora e Rizomucor.

Destes, Penicillium e Aspergillus foram os gêneros mais ocorrentes com uma

freqüência de 53,16% e 41,33% respectivamente. Contudo, somente o gênero

Penicillium, provavelmente a espécie Penicillium roqueforti, foi isolado das

manchas escuras que comprometiam visualmente a qualidade dos queijos.

Palavras-chave: contaminação fúngica, Penicillium, queijo parmesão, controle de

qualidade, amostras ambientais.

Abstract

The basic idea of this work was to support technically the quality control program in

a Brazilian Parmesan cheese-making factory where some cheese were looking

spoilage by mould. A microbiological check-up was made following the entire chain

of Parmesan production. Sampling starts with milk production at farm and finishing

with the cheeses at the ripping-room in the industry. Also environmental conditions

were analyzed by internal and external air sampling. The fungi were identified by

morphology analyses and other supplementary tests. The results showed a much

higher frequency of yeast (95.13%) than moulds (3.44%). It was not possible to

isolate for identification 1.44% of the CFU. In all treatments were found 14 different

genera of moulds: Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Rhizopus, Fusarium,

Aureobasidium, Chrysosporium, Alternaria, Epicoccum, Helminthosporium,

Geotrichum, Gliocladium, Nigrospora e Rizomucor. The genera Penicillium and

Aspergillus were the most presents with a relative frequency of 53.16% and 41.33%

respectively. The identifications procedures showed up the specie Penicillium

roqueforti as the probably organism isolated from the dark spot on the spoiled

cheese.

Key words: Fungi spoilage, Penicillium, Parmesan cheese, quality control,

environmental analyses.

SUMÁRIO

Resumo

Abstract

1. Introdução

............... 17

2. Objetivos

............... 19

3. Revisão Bibliográfica

............... 20

3.1. Segurança Alimentar e Controle de Qualidade

............... 20

3.2. O Queijo Parmesão

............... 21

3.3. Os Fungos e os Queijos

............... 22

3.4. Conservantes Antifúngicos

............... 24

3.5. Micotoxinas

............... 24

3.6. Análise de Bolores em Alimentos

............... 25

3.7. Contaminação por Bolores na Indústria de Alimentos

............... 27

3.8. Contaminação Ambiental

............... 27

4. Materiais e Métodos

............... 29

4.1. Materiais

............... 33

A. Leite cru ............... 33

B. Insumos ............... 33

C. Leite pasteurizado ............... 34

D. Massa de queijo ............... 34

E. Agentes intervenientes ............... 34

F. Queijo parmesão antes da maturação ............... 34

G. Queijo parmesão na maturação ............... 35

H. Ar ambiental ............... 36

I. Salmoura ............... 36

J. Queijos contaminados ............... 37

4.2. Métodos ............... 37

A. Coleta de amostras ............... 37

B. Contagem em placas ............... 37

C. Identificação ............... 38

D. Ar ambiental ............... 38

E. Salmoura ............... 39

F. Agentes intervenientes ............... 39

G. Análises complementares ............... 39

H. Análises de dados ............... 39

5. Resultados ............... 41

5.1. Bolores e Leveduras ............... 41

5.2. Bolores ............... 52

5.3.

Penicillium

............... 53

5.4. Identificação do Agente Deteriorante ............... 57

6. Discussão ............... 52

7. Conclusões ............... 66

8. Referências Bibliográficas ............... 68

ANEXOS ............... 75

1. Introdução

Fungos de várias espécies são citados na literatura cientifica como agentes

deteriorantes de queijo, devendo ser considerados nos programas de garantia da

qualidade e segurança alimentar das indústrias (FRANCO et al., 1999).

Dependendo da espécie, a contaminação fúngica pode constituir--se em

potencial problema de segurança alimentar devido à produção de micotoxinas, mas

também, acarretar prejuízos econômicos devido a alterações nas características

dos produtos (KURE et al., 2001; KURE et al., 2004). Os principais problemas que

comprometem as qualidades comerciais de vários tipos de queijos em todo o

mundo são alterações da aparência, do aroma, do sabor e da textura.

Nas várias etapas do processo será de extrema importância monitorar a

presença dos bolores para as indústrias que queiram ter um eficiente controle da

qualidade em suas linhas de produção. O longo processo de maturação do queijo

parmesão requer especial atenção quanto à deterioração por fungos, pois os

queijos acabam ficando mais expostos ao seu ataque e de outros organismos

deteriorantes neste período.

Consciente das informações acima mencionadas, o presente trabalho

procurou rastrear através de análises micológicas toda a cadeia produtiva de uma

indústria de queijo parmesão no Brasil. As informações levantadas irão subsidiar

tecnicamente o programa de controle de qualidade da indústria, onde alguns

queijos aparentavam-se contaminados por bolor.

Tendo como base o programa de APPCC em implantação na empresa, as

amostras foram coletadas em locais estratégicos, desde o leite na fazenda até os

queijos em maturação nas câmaras-frias, afim de que fossem quantificadas e

identificadas todas as possíveis ocorrências de fungos deteriorantes.

O trabalho de identificação dos bolores foi direcionado principalmente para o

gênero Penicillium, cujas análises preliminares indicavam como o agente causador

das manchas escuras presentes nos queijos visualmente deteriorados. Estas

manchas eram apontadas pelo controle de qualidade como o principal fator de

comprometimento da qualidade do produto final destinado ao mercado, na época

de realização deste estudo.

Conhecer o “inimigo” e sua procedência são informações fundamentais para

qualquer estratégia visando à prevenção e o controle de contaminações

microbianas nas indústrias de alimentos.

2. Objetivos

O objetivo do presente trabalho foi quantificar e identificar a incidência de

bolores deteriorantes nas várias etapas do processamento de uma indústria de

queijo parmesão.

3. Revisão Bibliográfica

3.1. Segurança Alimentar e Controle de Qualidade

Seguindo uma tendência mundial (GARRETT et al., 1998) a partir da década

de 90 tornou-se obrigatório, nas indústrias de alimentos do Brasil, a implantação e

aplicação dos programas de BPF (BRASIL, 1997b) e o APPCC (BRASIL, 1998). A

obrigatoriedade destes programas ocasionou uma maior demanda por informações

microbiológicas pelas indústrias, sendo que os autores UNTERMANN, (1998);

BOCCAS et al., (2001); HEGGUM, (2001), ressaltam ser de grande importância, ter

em mãos informações microbiológicas consistentes para o planejamento dos

programas de segurança alimentar em plantas fabris.

Para as agroindústrias de laticínios é desejável que os programas de

garantia de qualidade comecem já nas fazendas fornecedoras de leite e se

estendam até o consumidor final (HEGGUM, 2001) visto que com a globalização

da economia, os problemas de segurança alimentar e contaminação microbiológica

dos alimentos, deixaram de ser apenas uma questão operacional ou de saúde

pública, e também passaram a ser um requisito fundamental para a competição

nos mercados (ARVANITOYANNIS & MAUROPOULOS, 2000). Atento a estas

questões, em 2002 o governo brasileiro transformou em lei o Programa Nacional

de Melhoria da Qualidade do Leite - PNQL que tem como objetivo principal

melhorar a qualidade do leite consumido no Brasil (BRASIL, 2002).

O risco da cadeia produtiva do queijo vir a ser acometida por uma

contaminação microbiológica começa na produção do leite, passando pelas etapas

de armazenagem na fazenda, transporte, armazenagem na indústria,

pasteurização, fabricação, maturação, embalagem, transporte para o consumidor,

exposição no ponto de venda até o armazenamento pelo consumidor final,

(ANVANITOYANNIS & MAUROPOULOS, 2000).

3.2. O Queijo Parmesão

O primeiro relato da produção artesanal de queijos no Brasil data de 1875,

na região da Serra da Mantiqueira no Estado de Minas Gerais (HOMEWOOD &

HESS, 1993). Atualmente vários tipos de queijos são produzidos aqui, sendo o

parmesão um dos mais representativos.

Tecnologicamente, o parmesão é um legítimo representante do grupo dos

queijos italianos. Sua difusão pelo mundo ocorreu juntamente com a migração

italiana sendo que o queijo Parmigiano Reggiano original é produzido com leite cru

numa região restrita do Vale do Pó, na Itália (BATTISTOTI & CORRADINI, 1996).

As principais características do queijo parmesão são: Queijo duro com teor

de umidade entre 30 e 40% , teor de gordura na matéria seca não menor que 32%,

tamanho entre 4 e 20 Kg, agentes proteolíticos provenientes de bactérias

termofílicas fermentadoras de ácido láctico e tempo de maturação longo, entre 12 e

24 meses (BATTISTOTI & CORRADINI, 1996). Todas estas características estão

dentro das especificações previstas pela legislação brasileira que regulamenta a

produção e comercialização de queijos do tipo parmesão (BRASIL, 1997a).

3.3. Os Fungos e os Queijos

Na matriz dos alimentos, os fungos podem se desenvolver em pHs menores

que 2 e maiores que 9, a maioria cresce em temperaturas entre 5 e 35

C e em

atividade de água de 0,85 ou menor (MISLIVEC et al., 1992).

Leveduras dos gêneros: Candida, Debariomyces, Issatchenkia,

Kluyveromyces, Rhodotorula e Saccharomyces podem ser agentes potenciais de

deterioração microbiana em produtos lácteos (FRANCO et. al, 1999). Os bolores,

porem, são os mais importantes deteriorantes dos queijos duros e semiduros

(FILTENBORG et al., 2000).

No entanto deve-se destacar que algumas espécies de fungo fazem parte do

processo tecnológico da fabricação de queijo. Como o Geotrichum candidum em

queijos moles como Brie e Cammembert, o Penicillium cammembert responsável

pelas características de aroma e sabor do queijo Cammembert, o P. roqueforti e P.

glaucum, fungos azuis usados na fabricação dos queijos Stilton, Roquefort e

outros, o Mucor rasmusen, usando em queijos noruegueses do tipo Gammelost

(FURTADO, 2003).

O trabalho de NIELSEN et al., (1998) também mostra que alguns fungos

usados como “starter”, atuam como inibidores dos bolores deteriorantes nos queijo

aos quais são adicionados.

Os gêneros Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botrytis, Byssochlamys,

Cladosporium, Claviceps, Colletotrichum, Geotrichum, Monilia, Mucor, Neurospora,

Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis, Sporotrichum, Thamnidium e Chrysosporium

são citados por FRANCO et al., (1999) como os principais bolores contaminantes

dos alimentos.

Já FILTENBORG et al., (1996) destacam as espécies Penicillium commune

e P. nalgiovense como os principais fungos deteriorantes dos queijos.

Em trabalho visando identificar os bolores que contaminavam queijos

noruegueses semiduros, KURE & SKAAR, (2000) isolaram os gêneros Penicillium,

Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicocum, Geotrichum, Mucor, Phoma e

Ulocladium.

Em outro estudo Penicillium (13 espécies), Acremonium, Aspergillus sp,

Cladosporium sp, Eurotium sp, Geothichum sp, Mucor sp, Phoma sp e Trichoderma

também foram isolados de queijos noruegueses (KURE et al., 2001). P. commune

e P. palitans foram às espécies mais encontradas. Estas espécies são

reconhecidas como ancestrais selvagens de P.cammembert que acabaram

desenvolvendo mecanismos para colonizarem os queijos devido a sua utilização no

processo de fabricação do queijo Cammembert.

Em nosso meio, o gênero Penicillium também predominou como

contaminante em amostra de queijos parmesãos obtidos em supermercados da

região de Campinas - SP (TANIWAKI & DENDER, 1992).

3.4. Conservantes Antifúngicos

O ácido sórbico, o ácido benzóico, a natamicina, o sulfeto de sódio e o

tiabendazol estão entre os conservantes antifúngicos mais usados em alimentos

(NIELSEN & DE BOER, 2000). Contudo, algumas espécies de fungo, além de se

mostrarem resistentes ao efeito preservativo do ácido sórbico, também podem

metabolizar o conservante, transformando-o em compostos que alteram o sabor

em certos tipos de queijos (FILTENBORG et al., 1996). Estas reações podem

comprometer a qualidade e a aceitação comercial dos produtos em questão.

P. solium produz compostos que alteram o sabor na manteiga, sugerindo

que isto também seja possível de acontecer em queijos com alto teor de gordura

(KURE et al., 2001).

O tipo de embalagem, a composição da atmosfera de armazenamento e

maturação, o tipo de queijo, o tipo de leite, os ácidos orgânicos originados como

produto do metabolismo durante a maturação, a temperatura de armazenamento e

outros, são todos fatores que irão influenciar o potencial de desenvolvimento dos

fungos deteriorantes nos queijos (FILTENBORG et al., 1996; KURE & SKAAR,

2000; KURE et al. 2001; TANIWAKI et al., 2001a).

3.5. Micotoxinas

A produção de micotoxinas é outro ponto importante na questão da

contaminação de alimentos por fungos. Segundo FILTENBORG et al., (1996), a

mais importante micotoxina encontrada em queijos até a data de seu trabalho foi

esterigmatocistina, porém muitas outras, como o ácido ciclopiazônico, a

rugucovasina A e B e a ocratoxina A podem ser potencialmente importantes

(FRISVAD & THRANE, 2000).

Queijos inoculados com Aspergullus flavus, P. roqueforti e P. commune

apresentaram produção de aflatoxina B1 e B2, roquefortine C e ácido

ciclopiazônico, respectivamente. Destes, os maiores teores foram encontrados nos

queijos armazenados em atmosfera com ar. As atmosferas modificadas com baixos

teores de O

inibiram drasticamente a produção de toxinas (TANIWAKI et al.,

2001).

O trabalho de BARBIERI et. al, (1994) mostrou a ocorrência eventual de

aflatoxina M1 em amostras de queijo parmesão italiano.

No mundo todo há uma preocupação cada vez maior em se avaliar os níveis

de micotoxinas nos mais variados tipos de alimentos e produtos agrícolas

(BOYSEN et al., 2000), porém atualmente a legislação brasileira de alimentos não

fixa parâmetros para a presença de micotoxinas no parmesão (BRASIL, 2001).

3.6. Análise de Bolores em Alimentos

As propriedades bioquímicas dos alimentos restringem o desenvolvimento

dos microorganismos a poucas espécies específicas, fazendo com que as técnicas

de identificação e isolamento tendam a ser também cada vez mais restritivas às

espécies fúngicas com que se deseja trabalhar (DE BOER & BEUMER, 1999).

Meios de cultura diferenciados foram introduzidos para análise de fungos em

alimentos, como, o PCA com antibióticos, o DRBC e o PDA com antibióticos.

Atualmente estes são os meios mais indicados para a contagem de bolores e

leveduras em placa (MISLIVEC et al., 1992; SILVA et al., 2001).

O trabalho de TANIWAKI et al. (2001b) mostrou que os meios DRBC, PDA e

DG18 são equivalentes para a contagem de fungos em alimentos.

TANIWAKI et al. (2001a) empregou o CYA para crescimento de isolados de

Mucor plumbeus, Fusarium oxysporium, Byssochlamys fulva, P. commune, P.

roqueforti e A. flavus. O MEA para Byssochlamys nívea e o CYA mais 20% de Agar

Sacarose para Eurorium chevalieri.

O YESA, CREA e o NSA foram usados para crescimento e identificação das

espécies de Penicillium. SAB para as espécies do gênero Geotrichum, e PDA para

os gêneros Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicocum, Mucor, Phoma e

Ulocladium Acremonium, Aspergillus Eurotium e Trichoderma (KURE & SKAAR,

2000; KURE et al., 2001).

Para os gêneros Penicilium, Aspergillus e Fusarium, a identificação

morfológica vem sendo substituída por métodos que identificam os metabólitos

secundários, a produção de iso-enzimas, características fisiológicas, características

ecológicas, suscetibilidade a drogas e técnicas moleculares (FILTENBORG et al.,

1996).

Além da escolha e execução correta dos procedimentos de isolamento,

quantificação e identificação, o bom êxito de qualquer trabalho científico em

microbiologia, dependerá muito dos cuidados com a amostragem. As amostras

devem ser coletadas em recipientes assépticos e o volume coletado nunca deverá

ultrapassar três quartos da capacidade total do recipiente (SILVA et al., 2001). O

transporte até o laboratório deve ser feito a uma temperatura entre 0 e 4,4

C. e as

amostras processadas num prazo máximo de 36 horas após sua coleta (MESSER

et al., 1992). Amostras de “swab” devem ser analisadas em 24 horas (SVEUM et

al., 1992).

3.7. Contaminação por Bolores na Indústria de Alimentos

Nas indústrias são muitas as fontes potenciais de contaminação pós-

pasteurização a serem analisadas nos programas de garantia da qualidade e

segurança alimentar. O ar, a salmoura, a superfície de equipamentos e os filmes

plásticos de embalagem foram os materiais amostrados por KURE et al., (2004),

para identificar as fontes de contaminação por bolores em uma linha de produção

de queijo. Os manipuladores e os equipamentos (LUIZ, 2000; FRANCO et al.,

1996) bem como insetos sinantrópicos também podem ser fontes de contaminação

fúngica na indústria de alimentos (CARLILE et al., 2001).

3.8. Contaminação Ambiental

A contaminação ambiental é outro ponto relevante (FRANCO et al., 1996).

Esporos de alguns fungos ambientais resistem ao estresse de serem transportados

pelo ar e sobrevivem em baixa atividade de água, podendo assim, colonizar vários

tipos de construções (STETZENBACH, 1998).

Quando as instalações estão situadas em regiões rurais, os fungos

provenientes do ar externo podem se tornar importantes agentes contaminantes

dos ambientes internos (STETZENBACH, 1998).

Penicillium, Aspergillus, Fusarium entre outros, são alguns gêneros de

fungos deteriorantes de alimentos, também citados por LARONE, (1996) como

contaminantes ambientais.

Para fábricas de laticínios, RADMORE & LUCK, (1984) citados em

SCHOLTE et al., (2000), consideraram como “bons” os ambientes com contagem

total de bolores e leveduras menores que 100 UFC/cm

e “pobres” os ambientes

cujas contagens forem superiores a 1000 UFC/cm

Para melhor avaliar as condições ambientais, as amostras de ar devem ser

coletadas nos ambientes externos e internos do prédio em questão, e se possível,

com o uso de amostradores com fluxo de ar forçado (STETZENBACH, 1998). A

correlação entre a presença de microrganismo nos alimentos e as condições

ambientais devem ser bem avaliadas nos programas de garantia da qualidade,

principalmente no caso do queijo parmesão, visto que estes são submetidos a

longos períodos de maturação e acabam ficando mais expostos ao ataque de

microorganismos deteriorantes, como os bolores e as leveduras (SCHOLTE et al.,

2000).

4. Materiais e Métodos

Para o isolamento, quantificação e identificação dos fungos, foram coletadas

amostras em vários pontos da indústria e na fazenda fornecedora de matéria-

prima. A seleção dos pontos de amostragem na indústria levou em consideração

as etapas mais significativas em relação aos aspectos de segurança alimentar

conforme fluxograma de produção representado na Figura 1.

Foram realizados ensaios pilotos para a determinação dos meios de cultura

e diluições a serem empregadas nos diversos materiais amostrados. De cada

ponto de amostragem coletaram-se cinco amostras. Depois de quantificados e

isolados os fungos foram identificados morfologicamente e testes complementares

foram realizados quando necessário. O esquema da coleta das amostras

especificando os locais, os materiais, as etapas do processo e as datas estão

resumidos no Quadro 1.

As quantidades amostradas e as diluições aplicadas aos respectivos

tratamentos se encontram no Quadro 2.

Figura 1 – Fluxograma de produção do queijo parmesão.

Preparo

Fermento Lático

Leite Pasteurizado

Resfriamento

Coagulação

Inoculação Isca

Corte da

Coalhada

Preparo do

Soro fermento

Quebra Coagulo

Prensagem

Recepção

PCC 2

(B)

Cloreto de

Cálcio

Acondicionamento

Estocagem Estocagem

Inoculação Fermentação Diluição Dosagem

Fermentação

Agitação/cozimento

Coalho

Creme Massa

Mex./cozime

nto

Soro

Enformagem

Blocagem

Emplacagem

Prensagem 2

Prensagem

Viragem

Pré-prensagem

Ponto

Maturação

Secagem

Resfriamento

Recepção

Estocagem

Prep. da

Salmoura

Cloreto de Sódio

Salga

Expedição Limpeza

Embalagem

Mexedura/corte

Coagulação

Enchimento

Pasteurização

PCC 3

(B)

Padronização

Estocagem

Resfriamento

Filtração

Recepção do

Leite

PCC 1

(B,Q, FR)

Quadro 1 - Esquema dos tratamentos e coleta de amostras.

Amostras Local Material Etapa do Processo Data *

1 Fazenda Leite cru Ordenha Dia 1

2 Fazenda Leite cru Tanque de expansão Dia 1

3 Caminhão Leite cru Transporte Dia 1

4 Indústria Cloreto de cálcio Enchimento Dia 2

5 Indústria Fermento láctico Inoculação Dia 2

6 Indústria Soro fermentado Fermentação Dia 2

7 Indústria Leite pasteurizado Pasteurização Dia 2

8 Indústria Massa de queijo Blocagem Dia 2

9 Indústria Formas Enformagem Dia 2

10 Indústria Queijo Resfriamento Dia 8

11 Indústria Queijo Salga Dia 8

12 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 1 Dia 38

13 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 1 Dia 38

14 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 1 Dia 38

15 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 1 Dia 38

16 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 1 Dia 98

17 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 1 Dia 98

18 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 1 Dia 98

19 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 1 Dia 98

20 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 1 Dia 188

21 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 1 Dia 188

22 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 1 Dia 188

23 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 1 Dia 188

24 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 2 Dia 38

25 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 2 Dia 38

26 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 2 Dia 38

27 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 2 Dia 38

28 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 2 Dia 98

29 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 2 Dia 98

30 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 2 Dia 98

31 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 2 Dia 98

32 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 2 Dia 188

33 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 2 Dia 188

34 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 2 Dia 188

35 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 2 Dia 188

36 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 3 Dia 38

37 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 3 Dia 38

38 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 3 Dia 38

39 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 3 Dia 38

40 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 3 Dia 98

41 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 3 Dia 98

42 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 3 Dia 98

43 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 3 Dia 98

44 Indústria Queijo + sorbato (superfície) Maturação câmara 3 Dia 188

45 Indústria Queijo + sorbato (profundidade) Maturação câmara 3 Dia 188

46 Indústria Queijo (superfície) Maturação câmara 3 Dia 188

47 Indústria Queijo (profundidade) Maturação câmara 3 Dia 188

48 Fazenda Ar ambiental Ordenha Dia 1

49 Indústria Ar ambiental externo Recepção Dia 2

50 Indústria Ar ambiental Fabricação Dia 2

51 Indústria Ar ambiental Salga Dia 8

52 Indústria Ar ambiental Secagem Dia 8

53 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 1 Dia 38

54 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 1 Dia 98

55 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 1 Dia 188

56 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 2 Dia 38

57 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 2 Dia 98

58 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 2 Dia 188

59 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 3 Dia 38

60 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 3 Dia 98

61 Indústria Ar ambiental Maturação câmara 3 Dia 188

62 Indústria Luvas dos manipuladores Enformagem Dia 2

63 Indústria Água da salga Salga Dia 8

* Dia 1, 27 de maio de 2003; dia 2, 28 de maio de 2003; dia 8, 4 de junho de 2003; 38 dias, 30 de julho; dia 98, 23 de outubro

de 2003 e dia 188, 9 de dezembro de 2003.

Quadro 2 - Quantidade de material amostrado e diluições aplicadas aos respectivos

tratamentos.

Amost.

Material Quantidades Diluição

1 Leite cru * 286,00 276,00 343,00 287,00 230,00 1

2 Leite cru * 261,00 272,00 268,00 222,00 218,00 1

3 Leite cru * 262,00 262,00 286,00 275,00 236,00 10 X

4 Cloreto de cálcio * 354,00 349,00 340,00 374,00 295,00 1

5 Fermento láctico * 199,00 260,00 261,00 276,00 294,00 10 X

6 Soro fermentado * 179,00 261,00 233,00 159,00 193,00 1

7 Leite pasteurizado * 290,00 322,00 302,00 306,00 255,00 1

8 Massa de queijo * 54,00 94,00 72,00 67,00 80,00 10 X

10 Queijo * 102,00 105,00 99,00 73,00 57,00 10 X

11 Queijo * 124,00 90,00 110,00 82,00 83,00 10 X

12 Queijo+sorb. (prof.) * 88,98 86,96 86,09 74,39 78,71 10 X

14 Queijo (prof.) * 85,92 102,5 104,33 91,03 87,75 10 X

16 Queijo+sorb. (prof.) * 60,56 64,19 55,55 56,09 67,45 10 X

18 Queijo (prof.) * 69,83 71,84 69,68 67,72 60,57 10 X

20 Queijo+sorb. (prof.) * 65,8 50,09 63,5 61,97 63,44 10 X

22 Queijo (prof.) * 50,72 56,78 66,7 62,76 71,17 10 X

24 Queijo+sorb. (prof.) * 93,04 64,1 83,05 92,73 86 10 X

26 Queijo (prof.) * 82,35 80,5 56,78 71,59 48,87 10 X

28 Queijo+sorb. (prof.) * 73,52 74 81,12 74,62 71,12 10 X

30 Queijo (prof.) * 73,97 73,4 79,01 66,97 65,48 10 X

32 Queijo+sorb. (prof.) * 78,45 82,39 82,98 82,18 74,05 10 X

34 Queijo (prof.) * 53,49 57,93 55,39 52,13 62,16 10 X

36 Queijo+sorb. (prof.) * 75,65 85,65 84,23 78,21 65,74 10 X

38 Queijo (prof.) * 91,32 86,37 76,33 81,27 88,81 10 X

40 Queijo+sorb. (prof.) * 82,13 79,69 81,5 71,04 71,12 10 X

42 Queijo (prof.) * 84,93 71,25 71,02 79,76 84,4 10 X

44 Queijo+sorb. (prof.) * 72,34 71,4 75,54 67,59 62,84 10 X

46 Queijo (prof.) * 69,57 79,19 87,49 77,77 77,15 10 X

48 Ar ambiental externo ** 25 25 25 25 25 -

49 Ar ambiental externo ** 50 50 50 50 50 -

50 Ar ambiental ** 150 150 150 150 150 -

51 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

52 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

53 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

54 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

55 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

56 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

57 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

58 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

59 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

60 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

61 Ar ambiental ** 100 100 100 100 100 -

63 Água da salga * 370,00 336,00 288,00 301,00 352,00 1

* peso em gramas; ** volume de ar em litros

4.1. Materiais

A. Leite cru

As amostras de leite cru foram retiradas de 5.000 litros provenientes de

quatro ordenhas da mesma fazenda. Esta batelada de leite foi processada em

separado na linha de produção e deste leite foram obtidas 60 peças de queijo

utilizadas no experimento.

Foram considerados os pesos em gramas das amostras de leite para a

realização das análises.

O leite foi amostrado em três etapas diferentes.

Amostra 1: Leite logo após a última ordenha mecânica, antes de chegar no

tanque de expansão.

Amostra 2: Leite de quatro ordenhas das mesmas vacas, já resfriado e

misturado no tanque de expansão da fazenda.

Amostra 3: Leite após o transporte rodoviário a granel da fazenda até a

indústria.

B. Insumos

Considerando que insumos e seu procedimento de manipulação também

podem ser uma fonte de contaminação, foi analisado o cloreto de cálcio, o

fermento láctico e o soro fermento após manipulação (diluição e crescimento).

Estes três insumos são adicionados ao leite pasteurizado na etapa do enchimento.

Amostra 4: cloreto de cálcio.

Amostra 5: fermento láctico.

Amostra 6: soro fermentado.

C. Leite pasteurizado

Foram coletadas amostras de leite pasteurizado antes do processo de

enchimento (amostra 7).

D. Massa de queijo

Foram coletadas cinco porções de massa de queijo provenientes do

processo de coagulação e cozimento. A idéia foi analisar uma possível

contaminação pós-pasteurização e pré-maturação (amostra 8).

E. Agentes intervenientes

Amostras de cinco formas plásticas e cinco luvas de borracha usadas pelos

colaboradores foram coletadas com “swab”, correspondendo às amostras 9 e 62

respectivamente. Foi uma forma de avaliar se os procedimentos de higienização e

limpeza estavam sendo eficientes quanto à prevenção das contaminações

fúngicas. As formas mediam 4747 cm

e as luvas 836 cm

F. Queijo parmesão antes da maturação

Pedaços de queijo escolhidos ao acaso foram analisados, nas etapas de

resfriamento e salga. Foi uma forma de verificar qual a contribuição destas etapas

para o processo de contaminação fúngica (amostras 10 e 11 respectivamente).

Na câmara de resfriamento os queijos permaneceram por um período de 48

horas a uma temperatura entre 15

C e 18

C e umidade relativa do ar entre 75% e

85%.

Na câmara de salga os queijos permaneceram por 24 horas a uma

temperatura de 10

C e 12

G. Queijo parmesão na maturação

Amostras de queijos parmesão em processo de maturação em câmaras-frias

foram coletadas para análises laboratoriais, visando avaliar se as condições de

armazenamento durante a maturação atuam como fatores de contaminação. Os

queijos usados neste trabalho correspondiam exatamente ao padrão

comercializado pela indústria, com aproximados 23 cm de diâmetro, 14 cm altura e

6 Kg. Sessenta peças de queijos foram divididas em três grupos de vinte peças e

distribuídas em três câmaras-frias diferentes. Das vinte peças de queijo, colocadas

em cada câmara fria, dez foram tratadas somente com álcool etílico e dez tratadas

com uma solução de álcool etílico mais 2% de sorbato de potássio (p/v), conforme

esquema utilizado na rotina da indústria. Dos dez queijos que receberam um dos

tratamentos citados acima (só álcool ou álcool mais sorbato), cinco foram

separados ao acaso para serem amostrados em superfície (swab) e cinco para que

fossem tiradas amostras do interior da peça de parmesão (profundidade).

Cada grupo de cinco queijos foi amostrado aos trinta dias de maturação, aos

sessenta dias e aos cento e oitenta dias respectivamente, correspondendo às

amostras de 12 a 47 conforme esquema do Quadro 1.

Antes de serem colocados nas câmaras-frias, cada peça de queijo recebeu

um banho de imersão numa solução de natamicina a 0,1% (p/v) do produto

comercial (Global Food).

A área amostrada em cada queijo foi de aproximadamente 415 cm

(correspondendo às duas faces).

As câmaras-frias de maturação foram mantidas com temperatura entre 12

C e 15

C e a umidade relativa do ar entre 75% e 85%.

H. Ar ambiental

Amostras do ar foram coletadas na fazenda de produção de leite, no exterior

e interior da fábrica, na sala de salga, na sala de secagem e nas câmaras-frias de

maturação. Elas visavam analisar a correlação entre a contaminação ambiental e

os dados obtidos das amostras nas diversas etapas do processo. Estas se referem

às amostras de 48 até 61 conforme esquema no Quadro 1.

I. Salmoura

Com a finalidade de verificar a qualidade da salmoura quanto à presença de

fungos deteriorantes, foram coletadas amostras de solução salina provenientes dos

tanques de salmoura onde os queijos ficam imersos para processo de salga

(amostra 63).

A concentração salina esteve entre 20

e 21

Baumé.

J. Queijos contaminados

Dois queijos aparentemente contaminados foram embalados a vácuo e

levados ao laboratório para isolamento do agente contaminante. O fungo isolado

das manchas escuras presentes nas cascas destes queijos foi posteriormente

submetido ao processo de identificação. Todo o procedimento para isolamento

deste material foi realizado assepticamente em cabine de fluxo laminar.

4.2. Métodos

A. Coleta de amostras

As amostras foram coletadas sob chama, em garrafas de vidros (leite,

cloreto de cálcio, fermento lácteo, salmoura), sacos plásticos (massa, queijo) e

tubos de ensaio estéreis (swabs), conforme esquema do Quadro 1. Todas as

amostras foram transportadas para o laboratório de Micologia da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP , sob refrigeração conforme

SILVA et al., (2001).

B. Contagem em placas

As amostras de leite, cloreto de cálcio, fermento lácteo e soro fermento

foram diluídas conforme mostra o Quadro 2, e destes materiais foram colhidas

alíquotas de 0,1 mL para inoculação em meio DRBC (Acumedia). As placas em

tréplicas foram incubadas por 5 a 7 dias a 25

C para posterior contagem das UFC

(MISLIVEC et al., 1992; SILVA et al., 2001).

Das amostras de queijo, 25 g foram trituradas em liquidificador com 225 mL

de uma solução de citrato de sódio 2% mais Tween 80 a 1% (p/v). Desta

suspensão (diluição 10

-1

) foram retiradas alíquotas de 0,1 mL e plaqueadas em

meio DRBC. As placas em triplicata foram incubas por 5 a 7 dias a 25

C e depois

contadas como UFC/g (MISLIVEC et al., 1992; SILVA et al., 2001).

Os “swabs” foram mantidos em solução de salina peptonada 0,1% e

plaqueados em meio DRBC sem diluição. As placas em triplicata foram incubadas

por 5 a 7 dias a 25

C e depois contadas as UFC/cm

(MISLIVEC et al., 1992;

SILVA et al., 2001).

C. Identificação

Os bolores isolados foram inicialmente identificados pelas suas

características morfológicas, macro e microscópicas conforme LARONE, (1996).

Após o isolamento, os fungos foram mantidos em SAB com cloranfenicol a

temperatura ambiente e repicados quando necessário. Os fungos do gênero

Penicillium foram isolados e identificados por espécie conforme chave de

identificação proposta por SAMSON et al., (2000). Todos os testes foram

realizados em triplica.

D. Ar ambiental

As amostras de ar foram coletadas com o auxilio de um aparelho de fluxo de

ar forçado marca Millipore, modelo Monitor M AIR T, em meio MEA, conforme

metodologia proposta por SAMSON et al., (2000). Cada placa foi incubada por 5 a

7 dias a 25

C e depois contadas as UFC/m

de ar.

E. Salmoura

Os fungos da salmoura foram isolados segundo metodologia da American

Public Health of Water and Wastewater - APHWW (1998). Alíquotas de 0,1 mL,

sem diluição, foram inoculadas em meio DRBC. A contagem e identificação

realizaram-se da mesma maneira que nos itens B e C.

F. Agentes intervenientes

Os “swabs” utilizados na amostragem das formas e luvas foram analisados

conforme descrito no item C.

G. Análises complementares

No momento da coleta foram realizadas as medidas de pH e temperatura

dos respectivos materiais. Estas medidas estão no Quadro 3 em anexo.

H. Análises de dados

Para a análise dos dados dos tratamentos foram consideradas as médias de

5 repetições. Cada repetição foi realizada em triplicata.

Os resultados obtidos foram tratados estatisticamente pelo teste ANOVA e

submetidos ao teste de Tukey. Também foram realizadas análises da correlação

entre a presença de fungo nos queijos durante a maturação nas câmaras-frias

(amostras: 12 a 47) contra a ocorrência de fungos nas amostras ambientais.

5. Resultados

5.1. Bolores e Leveduras

De maneira geral a freqüência de leveduras (95,13%) foi maior do que a de

bolores (3,44%). Do total das unidades formadoras de colônias contadas em todas

as amostras, 1,44% das ocorrências não puderam ser identificadas.

As Tabelas 1, 2 e 3 mostram a comparação das médias da ocorrência de

bolores e leveduras em todas as amostras em UFC/g, UFC/cm

e UFC/m

respectivamente, de acordo com as características de cada material amostrado nos

diversos tratamentos.

Nas Tabelas 4, 5 e 6 tem-se as distribuição das freqüências absolutas e

relativas de ocorrências dos microorganismos isolados neste trabalho e sua

distribuição dentro da cadeia de produção do queijo parmesão. A analise dos

dados da Tabela 5 mostra uma freqüência absoluta de apenas 9% (soma das

freqüências relativas nas câmaras 1, 2 e 3) para as leveduras isoladas diretamente

dos queijos. A maior parte das leveduras foram isoladas dos outros materiais

amostrados, especialmente daqueles que apresentavam altos teores de umidade.

Vale lembrar, que os queijos em maturação foram submetidos a 3 amostragens em

tempos diferentes, enquanto outros materiais foram amostrados apenas uma única

vez.

A Figura 2 mostra a comparação entre as contagens de fungos obtidas nas

amostras de ar deste trabalho em relação a um padrão sugerido pela literatura.

Nesta figura e na Tabela 3, podemos notar que a sala de fabricação, a câmara de

secagem e a câmara de maturação 2 foram os ambientes internos que excederam

as contagens consideradas como “pobre”. A pior situação parece ser na câmara de

maturação 2 onde as contagens foram predominante de bolores.

Tabela 1 - Comparação múltipla das médias da contagem total de fungos no leite, insumos,

massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras-frias de maturação) e na salmoura

em UFC/g.

n Média

Tratamento: 1 Leite ordenha 5

1 X 10

Tratamento: 2 Leite tanque 5

3,7 X 10

Tratamento: 3 Leite caminhão 5

9,4 X 10

Tratamento: 4 Cloreto de Cálcio 5 < 10

Tratamento: 5 Fermento láctico 5

3,4 X 10

Tratamento: 6 Soro fermento 5

9,1 X 10

Tratamento: 7 Leite pasteurizado 5 < 10

Tratamento: 8 Massa de queijo 5

4,3 X 10

a,b

Tratamento: 10 Queijo resfriamento 5

5,8 X 10

Tratamento: 11 Queijo salga 5

1 X 10

Tratamento: 12 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 30 dias 5 < 100

Tratamento: 14 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 30 dias 5 < 100

Tratamento: 16 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 60 dias 5 < 100

Tratamento: 18 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 60 dias 5 < 100

Tratamento: 20 Queijo câmara 1 c/ sorbato profund. - 180 dias 5 < 100

Tratamento: 22 Queijo câmara 1 s/ sorbato profund. - 180 dias 5 < 100

Tratamento: 24 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 30 dias 5 < 100

Tratamento: 26 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 30 dias 5 < 100

Tratamento: 28 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 60 dias 5 < 100

Tratamento: 30 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 60 dias 5 < 100

Tratamento: 32 Queijo câmara 2 c/ sorbato profund. - 180 dias 5

1,2 X 10

Tratamento: 34 Queijo câmara 2 s/ sorbato profund. - 180 dias 5 < 100

Tratamento: 36 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 30 dias 5 < 100

Tratamento: 38 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 30 dias 5 < 100

Tratamento: 40 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 60 dias 5

4,9 X 10

Tratamento: 42 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 60 dias 5 < 100

Tratamento: 44 Queijo câmara 3 c/ sorbato profund. - 180 dias 5

3,7 X 10

Tratamento: 46 Queijo câmara 3 s/ sorbato profund. - 180 dias 5 < 100

Tratamento: 63 Água da salga 5 < 100

1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (=5%)

Tratamentos

Tabela 2 - Comparação múltipla das médias da contagem total de fungos nas formas,

superfície dos queijos em maturação e das luvas dos manipuladores em UFC/cm

Média

Tratamento: 9 Formas 5 1,20

Tratamento: 13 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 30 dias 5 0,00

Tratamento: 15 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 30 dias 5 0,00

Tratamento: 17 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 60 dias 5 0,00

Tratamento: 19 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 60 dias 5 0,00

Tratamento: 21 Queijo câmara 1 c/ sorbato swab - 180 dias 5 0,03

Tratamento: 23 Queijo câmara 1 s/ sorbato swab - 180 dias 5 0,13

Tratamento: 25 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 30 dias 5 0,00

Tratamento: 27 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 30 dias 5 0,00

Tratamento: 29 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 60 dias 5 0,10

Tratamento: 31 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 60 dias 5 0,14

Tratamento: 33 Queijo câmara 2 c/ sorbato swab - 180 dias 5 0,44

Tratamento: 35 Queijo câmara 2 s/ sorbato swab - 180 dias 5 0,27

b, c

Tratamento: 37 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 30 dias 5 0,07

Tratamento: 39 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 30 dias 5 0,00

Tratamento: 41 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 60 dias 5 0,14

Tratamento: 43 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 60 dias 5 0,46

Tratamento: 45 Queijo câmara 3 c/ sorbato swab - 180 dias 5 0,23

c, d

Tratamento: 47 Queijo câmara 3 s/ sorbato swab - 180 dias 5 0,44

Tratamento: 62 Luvas 5 0,45

1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (=5%)

Tratamentos

Os valores da Tabela 2 se referem às contagens obtidas nas placas e depois divididas pela área

amostrada de cada material. Porém as contagens brutas obtidas ficaram dentro dos limites de

detecção do método.

Tabela 3 - Comparação múltipla das médias do total de fungos nas amostras de ar da

fazenda, plataforma de recebimento de leite na fábrica, sala de fabricação e câmaras-frias

de maturação em UFC/m

n Média

Tratamento: 48 Ar fazenda 5

1,4 X 10

Tratamento: 49 Ar plataforma 5

3,4 X 10

Tratamento: 50 Ar fabricação 5

1,2 X 10

Tratamento: 51 Ar salga 5

3,5 X 10

Tratamento: 52 Ar secagem 5

1,1 X 10

Tratamento: 53 Ar câmara 1 - 30 dias 5

1,9 X 10

Tratamento: 54 Ar câmara 1 - 60 dias 5

5 X 10

Tratamento: 55 Ar câmara 1 - 180 dias 5

5 X 10

Tratamento: 56 Ar câmara 2 - 30 dias 5

2,6 X 10

Tratamento: 57 Ar câmara 2 - 60 dias 5

1,9 X 10

Tratamento: 58 Ar câmara 2 - 180 dias 5

1,2 X 10

Tratamento: 59 Ar câmara 3 - 30 dias 5

1,5 X 10

Tratamento: 60 Ar câmara 3 - 60 dias 5

1,3 X 10

Tratamento: 61 Ar câmara 3 - 180 dias 5

9,1 X 10

1 Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (=5%)

Tratamentos

Tabela 4 – Freqüência dos fungos isolados nas etapas de produção da cadeia produtiva do

queijo parmesão.

Local Material Organismo Freq. relativa Freq. Absoluta

Leveduras 98,6% 0,07%

Leite da ordenha

Aspergillus

1,4% 0,001%

Leveduras 97,7% 0,25%

Fazenda

Leite tanque expansão

Aspergillus

2,3% 0,006%

Leite do caminhão Leveduras 100% 0,66%

Cloreto de cálcio # # #

Fermento lácteo Leveduras 100% 19,0%

Soro fermento Leveduras 100% 0,57%

Leite pasteurizado

Penicillium

100% 0,001%

Massa de queijo Leveduras 100% 30,1%

Formas Leveduras 100% 8,9%

Queijo resfriamento Leveduras 100% 19,2%

Leveduras 97,3% 0,03%

Queijo na salga

Cladosporium

2,7% 0,001%

Leveduras 99,8% 2,1%

Luvas

Aureobasidium

0,002% 0,000004%

Leveduras 95,2% 0,02%

Área de produção

Água da salga

Chrysosporium

0,05% 0,000009%

Tabela 5 – Freqüência dos fungos isolados na etapa de maturação do queijo parmesão.

Local Material Organismo Freq. relativa Freq. Absoluta

Aspergillus

19,6%

0,009%

Penicillium

0,24%

0,000001%

Leveduras 80,1%

0,04%

Chrysosporium

0,001%

0,000000002%

Câmara 1

Queijo (superfície e

profundidade)

Alternaria

0,001%

0,0000000005%

Leveduras 96,0%

5,2%

Aspergillus

1,5%

0,08%

Câmara 2

Queijo (superfície e

profundidade)

Penicillium

1,7%

0,09%

Penicillium

7,0%

0,46%

Leveduras 53,7%

3,6%

Aspergillus

2,1%

0,14%

Cladosporium

0,6%

0,04%

Câmara 3

Queijo (superfície e

profundidade)

Gliocadium

0,000008%

0,000001%

Tabela 6 – Freqüência dos fungos isolados do ar em várias etapas da cadeia produtiva do

queijo parmesão.

Local Organismo Freq. Relativa Freq. Absoluta

Cladosporium

52,9%

0,69%

Leveduras 25,7%

0,33%

Fusarium

8,6%

0,11%

Penicillium

1,4%

0,02%

Ar da fazenda

Alternaria

1,4%

0,02%

Cladosporium

81,4%

0,65%

Chrysosporium

3,5%

0,03%

Epicoccum ssp

2,3%

0,02%

Leveduras 4,7%

0,04%

Helminthosporium

2,3%

0,02%

Alternaria

1,2%

0,01%

Penicillium

2,3%

0,02%

Ar da plataforma

Fusarium

2,3%

0,02%

Nigrospora

0,14%

0,003%

Aspergillus

2,9%

0,068%

Cladosporium

8,8%

0,21%

Ar da sala de fabricação

Levedura 88,0%

2,1%

Cladosporium

52,9%

0,17%

Levedura 25,7%

0,08%

Fusarium

8,6%

0,028%

Penicillium

1,4%

0,005%

Ar da sala de salga

Alternaria

1,4%

0,005%

Cladosporium

0,19%

0,000%

Ar da câmara de secagem

Leveduras 98,7%

2,4%

Aspergillus

56,4%

0,44%

Penicillium

19,9%

0,3%

Fusarium

0,7%

0,005%

Levedura 2,4%

0,02%

Geotrichum

1,8%

0,003%

Chrysosporium

1,8%

0,003%

Ar da câmara 1

Rhizomucor

0,47%

0,001%

Aspergillus

30,2%

4,4%

Penicillium

18,8%

2,7%

Cladosporium

0,31%

0,05%

Levedura 0,17%

0,03%

Ar da câmara 2

Rhyzopus

0,53%

0,2%

Aspergillus

7,7%

0,045%

Penicillium

24,7%

0,15%

Levedura 67,0%

0,4%

Ar da câmara 3

Cladosporium

0,6%

0,003%

500,00

1.000,00

1.500,00

2.000,00

2.500,00

zend

Ar plataforma

Ar fabric

aca

alga

Ar sec

gem

Ar câma

1 - 30

dias

Ar câmara 1 - 60

ias 2

âma

a 1

80 d

ias

Ar câm

2 - 30 dias

r câm

2 - 60 d

ias

Ar câmara 2 - 180 dias

âma

3 - 30 dia

Ar câma

0 dias

âmara 3 - 180

ias

Padrão "pobre"

rã

bom"

amostras de ar

contagem em UFC/m

de ar

Bolores Leveduras

Figura 2 – Comparação das contagens de bolores e leveduras nas amostras de ar em

relação ao padrão sugerido por RANDMORE & LUCK, (1984) citados em SCHOLTE et

al.,(2000).

5.2. Bolores

Neste trabalho foram identificados 14 diferentes gêneros de bolores. Eles

representaram apenas 3,44% da freqüência absoluta dos fungos presentes em

todas as amostras. Destes 53,16% foram do gênero Penicillium com 50

ocorrências e 41,33% do gênero Aspergillus com 19 ocorrências. Os outros

gêneros isolados foram: Cladophiadophora, Rhizopus, Fusarium, Aureobasidium,

Chrysosporium, Alternaria, Epicoccum, Helminthosporium, Geotrichum,

Gliocladium, Nigrospora e Rhizomucor conforme a Tabela 7. Helminthosporium,

Epicoccum, Fusarium, Geotrichum Rhizomucor e Rhizopus foram bolores isolados

somente das amostras ambientais.

Nas Tabelas de 8 a 10 estão as comparações das médias de ocorrência de

bolores em todas as amostras em UFC/g, UFC/cm

e UFC/m

respectivamente, de

acordo com as características de cada material amostrado nos diversos

tratamentos.

O tratamento com sorbato de potássio parece pouco alterar a questão da

contaminação dos queijos por bolores, pois não há diferenças significativas entre

as amostras, conforme dados das Tabelas 8 e 9.

Tabela 7 – Freqüência relativa e número de ocorrência dos bolores isolados em todos os

tratamentos.

Gêneros Nº de ocorrências

Freqüência

Penicillium spp

50 53,161%

Aspergillus spp

19 41,333%

Cladosporium spp

10 4,534%

Rhizopus spp

1 0,343%

Fusarium spp

5 0,215%

Aureobasidium spp

1 0,143%

Chrysosporium spp

5 0,100%

Alternaria spp

4 0,057%

Epicoccum spp

1 0,029%

Helminthosporium spp

1 0,029%

Geotrichum spp

1 0,014%

Gliocladium spp

1 0,014%

Nigrospora spp

1 0,014%

Rhizomucor spp

1 0,014%

1 Refere-se ao número de vezes que um determinado gênero foi identificado

independentemente das contagens de UFC.

2 Leva em conta a contagem total de UFC de cada um dos diferentes gêneros isolados.

Tabela 8 – Comparação múltipla das médias da contagem total de bolores no leite,

insumos, massa, nos queijos (resfriamento, salga e nas câmaras-frias) e na salmoura em

UFC/g.

n Média

Tratamento: 1 Leite ordenha 5 < 10

Tratamento: 2 Leite tanque 5 < 10

Tratamento: 3 Leite caminhão 5 < 100

Tratamento: 4 Cloreto de Cálcio 5 < 10

Tratamento: 5 Fermento láctico 5 < 100

Tratamento: 6 Soro fermento 5 < 10

Tratamento: 7 Leite pasteurizado 5 < 10

Tratamento: 8 Massa de queijo 5 < 100

Tratamento: 10 Queijo resfriamento 5 < 100

Tratamento: 11 Queijo salga 5 < 100