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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CAMPUS DE ARARAQUARA
Atividade mutagênica e ativadora da resposta
imune celular induzidas por Byrsonima crassa
Niedenzu e Byrsonima intermedia A.Juss.
(Malpighiaceae)
CÁSSIA REGINA PRIMILA CARDOSO
Dissertação para a obtenção do título de MESTRE em Análises Clínicas
Orientadora: Profª. Drª. Eliana Aparecida Varanda
ARARAQUARA – SP
2006
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TERMO DE APROVAÇÃO
NOME DA CANDIDATA: Cássia Regina Primila Cardoso
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
MESTRE: Atividade mutagênica e ativadora da resposta imune celular
induzidas por Byrsonima crassa Niedenzu e Byrsonima intermedia A.Juss.
(Malpighiaceae)
A Comissão examinadora do trabalho de Defesa de Mestrado, em sessão
pública realizada a 21/02/2006, considerou a candidata
(X) APROVADA ( ) REPROVADA
PRESIDENTE E ORIENTADORA: Profª. Drª. Eliana Aparecida Varanda
INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP – Araraquara,
SP.
SEGUNDO EXAMINADOR: Profª.Drª.Beatriz Maria Machado de Medeiros
INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP – Araraquara,
SP.
TERCEIRO EXAMINADOR: Profª.Drª. Denise Crispim Tavares
INSTITUIÇÃO: Universidade de Franca, UNIFRAN – Franca, SP.
ARARAQUARA, 21 de fevereiro de 2006
Dados Curriculares
Cássia Regina Primila Cardoso
DADOS CURRICULARES
DADOS PESSOAIS
NOME Cássia Regina Primila Cardoso
NASCIMENTO 21/07/1976
NATURALIDADE Osasco – SP
NACIONALIDADE brasileira
ESTADO CIVIL solteira
FILIAÇÃO:
PAI Júlio Junes Cardoso
MÃE Maria Aparecida Primila Cardoso
DOCUMENTO DE IDENTIDADE 26441380-5
CADASTRO DE PESSOA FÍSICA 27895371860
ENDEREÇO RESIDENCIAL Rua Agostinho Sonego, 409
Campus Ville – CEP: 14810-737
Araraquara – São Paulo
Dados Curriculares
Cássia Regina Primila Cardoso
FORMAÇÃO ACADÊMICA
BACHAREL EM FARMÁCIA, CURSO DE FARMÁCIA-
BIOQUÍMICA CONCLUÍDO EM 1999 NA FACULDADE DE
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DO CAMPUS DE
ARARAQUARA DA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA.
MESTRE EM ANÁLISES CLÍNICAS DO PROGRAMA DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS, CONCLUÍDO EM
21 DE FEVEREIRO DE 2006 NA FACULDADE DE CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS DO CAMPUS DE ARARAQUARA DA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA.
ESTÁGIOS
• Estágio de Docência na Disciplina de Farmacognosia do Departamento de Princípios
Naturais e Toxicologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP/Araraquara.
Orientadora: Profª.Drª. Raquel Regina Duarte Moreira
• Estágio de Treinamento no Laboratório Didático de Informática da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas – UNESP/Araraquara. Coordenador: Engenheiro Márcio Pereira de Toledo
Bolsista PAE
• Estágio de Treinamento no Laboratório de Citologia Clínica do Departamento de Análises
Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP/Araraquara. Orientadora:
Profª.Drª. Cristiane Pienna Soares
Bolsista PAE
• Estágio de Treinamento no Laboratório de Imunologia Clínica do Departamento de
Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP/Araraquara.
Orientadora: Profª.Drª. Iracilda Zeppone Carlos
Bolsista PAE
• Estágio de Treinamento no Laboratório de Parasitologia Clínica do Departamento de
Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP/Araraquara.
Orientador: Prof.Dr. João Flávio Giazzi
Dados Curriculares
Cássia Regina Primila Cardoso
TRABALHOS CIENTÍFICOS
TRABALHOS APRESENTADOS
WORKSHOPS
• CARDOSO, C.R.P.; CARLOS, I.Z.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA,
E.A.; Atividade mutagênica e ativação da resposta imune induzidas por extratos de
Byrsonima crassa e Byrsonima intermedia. VI Workshop de Plantas Medicinais da
UNESP/Botucatu, Botucatu – SP, 2004.
• CARDOSO, C.R.P.; Controle de qualidade microbiológico de drogas vegetais. VII
Encontro Regional de Biomedicina do IB da UNESP/Botucatu, Botucatu – SP, 2004.
• CARDOSO, C.R.P.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.A.; Atividade
mutagênica induzida por extratos de Byrsonima crassa e Byrsonima intermedia.
Workshop de Plantas Medicinais da UNESP/Botucatu, Botucatu – SP, 2004.
SIMPÓSIOS
• CARDOSO, C.R.P.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.A.; Atividade
mutagênica induzida por extratos de Byrsonima fagifolia. I Simpósio do Biota/Fapesp,
Águas de Lindóia - SP, 2005.
• CARDOSO, C.R.P.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.A.; Atividade
mutagênica induzida por extratos de Byrsonima fagifolia. I Simpósio de Plantas
Medicinais da UNICAMP – Campinas - SP, 2005.
• CARDOSO, C.R.P.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.A.; Atividade
mutagênica induzida por extratos de Byrsonima crassa e Byrsonima intermedia. I
Simpósio de Plantas Medicinais da UNICAMP – Campinas - SP, 2005.
Dados Curriculares
Cássia Regina Primila Cardoso
CONGRESSOS
• CARDOSO, C.R.P.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.A.; Atividade
mutagênica induzida por extratos de Byrsonima crassa, Byrsonima intermedia e frações
do extrato metanólico de Byrsonima intermedia. 51º Congresso Brasileiro de Genética –
Águas de Lindóia – SP, 2005.
• CARDOSO, C.R.P.; SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.A.; Atividade
mutagênica e ativação da resposta imune induzidas por extratos de Byrsonima crassa,
Byrsonima intermedia. VII Congresso Brasileiro de Mutagênese, Carcinogênese e
Teratogênese Ambiental - Natal – RN, 2005.
TRABALHOS PUBLICADOS
• CARDOSO, C.R.P.; NOGUEIRA, M.E.I.; BISO, F.I.; LONGO, M.C.; dos SANTOS,
L.C.; VARANDA, E.A.; Investigation of genotoxic and antigenotoxic activities of
Melampodium divaricatum in Salmonella typhimurium. Toxicology in vitro, article in
press, 2005.
TRABALHOS SUBMETIDOS À PUBLICAÇÃO
• CARDOSO, C.R.P.; VARANDA, E.A.; CÓLUS, I.M.S.; BENARDI, C.C.;
SANNOMIYA, M.; VILEGAS, W.; Genotoxic activity promoted by amentoflavone and
methanolic extract of Byrsonima crassa Niedenzu. Submetido à Revista Toxicology,
27/01/2006, Ms. Nº.: TOX-06-48.
Apresentação
Cássia Regina Primila Cardoso
Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Mutagênese do Departamento de
Ciências Biológicas e no Laboratório de Imunologia Clínica do Departamento de Análises
Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista (UNESP)
- Campus de Araraquara.
Dedicatória
Cássia Regina Primila Cardoso
Aos meus pais, Júlio e Maria Aparecida,
Aos meus pais, Júlio e Maria Aparecida, Aos meus pais, Júlio e Maria Aparecida,
Aos meus pais, Júlio e Maria Aparecida,
Que
Que Que
Que apesar de tantas dificuldades, se
apesar de tantas dificuldades, seapesar de tantas dificuldades, se
apesar de tantas dificuldades, sempre me apoiaram e
mpre me apoiaram e mpre me apoiaram e
mpre me apoiaram e
incentivaram,
incentivaram,incentivaram,
incentivaram,
me fazendo
me fazendo me fazendo
me fazendo acreditar q
acreditar qacreditar q
acreditar que
ueue
ue
essa conquista, até
essa conquista, até essa conquista, até
essa conquista, até
então um sonho
então um sonhoentão um sonho
então um sonho aparentemente inatingível
aparentemente inatingível aparentemente inatingível
aparentemente inatingível, poderia ser
, poderia ser , poderia ser
, poderia ser
possível... E esse sonho tão nosso
possível... E esse sonho tão nossopossível... E esse sonho tão nosso
possível... E esse sonho tão nosso,
,,
, hoje se tornou uma realidade
hoje se tornou uma realidade hoje se tornou uma realidade
hoje se tornou uma realidade
de valor inestimável...
de valor inestimável...de valor inestimável...
de valor inestimável...
A minha irmã Ana Paula,
A minha irmã Ana Paula, A minha irmã Ana Paula,
A minha irmã Ana Paula,
Amiga verdadeira e grande companheira, em todos o
Amiga verdadeira e grande companheira, em todos oAmiga verdadeira e grande companheira, em todos o
Amiga verdadeira e grande companheira, em todos os
s s
s
momentos...
momentos...momentos...
momentos...
Aos meus sobrinhos Raphael e Phillipe,
Aos meus sobrinhos Raphael e Phillipe,Aos meus sobrinhos Raphael e Phillipe,
Aos meus sobrinhos Raphael e Phillipe,
Doces presenças infantis, que tanta alegria traz
Doces presenças infantis, que tanta alegria trazDoces presenças infantis, que tanta alegria traz
Doces presenças infantis, que tanta alegria trazem
emem
em a
a a
a
minha existência...
minha existência...minha existência...
minha existência...
MINHA FAMÍLIA, MINHA VIDA...
MINHA FAMÍLIA, MINHA VIDA...MINHA FAMÍLIA, MINHA VIDA...
MINHA FAMÍLIA, MINHA VIDA...
MUITO OBRIGADA POR ESTAREM SEMPRE COMIGO!
MUITO OBRIGADA POR ESTAREM SEMPRE COMIGO!MUITO OBRIGADA POR ESTAREM SEMPRE COMIGO!
MUITO OBRIGADA POR ESTAREM SEMPRE COMIGO!
Dedicatória
Cássia Regina Primila Cardoso
À minha
À minha À minha
À minha orientadora
orientadoraorientadora
orientadora
Profª.Drª.Eliana Aparec
Profª.Drª.Eliana AparecProfª.Drª.Eliana Aparec
Profª.Drª.Eliana Aparecida Varanda,
ida Varanda, ida Varanda,
ida Varanda,
Uma mulher admirável...
Uma mulher admirável...Uma mulher admirável...
Uma mulher admirável...
Por ter acreditado em meu desempenho e ter me
Por ter acreditado em meu desempenho e ter me Por ter acreditado em meu desempenho e ter me
Por ter acreditado em meu desempenho e ter me
incentivado na busca do constante aperfeiçoamento...
incentivado na busca do constante aperfeiçoamento...incentivado na busca do constante aperfeiçoamento...
incentivado na busca do constante aperfeiçoamento...
Dedicatória
Cássia Regina Primila Cardoso
À
À À
À Profª.Drª. Iracilda Zeppone Carlos
Profª.Drª. Iracilda Zeppone CarlosProfª.Drª. Iracilda Zeppone Carlos
Profª.Drª. Iracilda Zeppone Carlos
Pela importante colaboraç
Pela importante colaboraçPela importante colaboraç
Pela importante colaboração e disponibilidade de
ão e disponibilidade deão e disponibilidade de
ão e disponibilidade de
conhecimen
conhecimenconhecimen
conhecimentos,
tos,tos,
tos, fundamentais para a realização desse
fundamentais para a realização desse fundamentais para a realização desse
fundamentais para a realização desse
trabalho...
trabalho...trabalho...
trabalho...
Agradecimentos
Cássia Regina Primila Cardoso
Agradecimento a DEUS
Agradecimento a DEUSAgradecimento a DEUS
Agradecimento a DEUS
Senhor
SenhorSenhor
Senhor... Nesse momento, quero apenas agradecer...
Pois em muitos momentos apenas pedi...
Pedi paz
pazpaz
paz ao coração... Deu-me paciência para alcançá-la.
Pedi força
forçaforça
força ao meu corpo cansado... Deu-me disposição para
superar-me.
Pedi riqueza
riquezariqueza
riqueza... Deu-me sabedoria, para reconhecê-la nas
coisas simples.
Pedi poder
poderpoder
poder... Deu-me perseverança na busca de meus
objetivos.
Pedi luz.
luz.luz.
luz... Deu-me visão espiritual para não me perder no
caminho da vida.
Pedi aleg
alegaleg
alegria
riaria
ria... Deu-me compreensão das dificuldades, para
não cair no abatimento.
Senhor
SenhorSenhor
Senhor... Nesse momento, quero apenas agradecer...
Por que me ensinaste que a verdadeira fé
féfé
fé pode fazer brotar,
mesmo do pó, a mais bela flor...
Sabes que sou pequena, mas a Ti me entrego... Faze em mim
a Tua vontade, e que eu a compreenda, aceite e realize com
devoção...
C
CC
Cássia Regina Primila
ássia Regina Primila ássia Regina Primila
ássia Regina Primila Cardoso
CardosoCardoso
Cardoso
Agradecimentos
Cássia Regina Primila Cardoso
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
À Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros,
À Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros, À Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros,
À Profª. Drª. Beatriz Maria Machado de Medeiros, pelo valioso
pelo valioso pelo valioso
pelo valioso
incentivo desde o
incentivo desde o incentivo desde o
incentivo desde o tempo em que participar desse trabalho era
tempo em que participar desse trabalho era tempo em que participar desse trabalho era
tempo em que participar desse trabalho era
ainda um sonho.
ainda um sonho.ainda um sonho.
ainda um sonho.
À Profª.Drª.
À Profª.Drª.À Profª.Drª.
À Profª.Drª.
Raquel Regina Duarte Moreira, pela amizade desde
Raquel Regina Duarte Moreira, pela amizade desde Raquel Regina Duarte Moreira, pela amizade desde
Raquel Regina Duarte Moreira, pela amizade desde
a época de graduação e hoje, nesse trabalho, me ajudando na
a época de graduação e hoje, nesse trabalho, me ajudando na a época de graduação e hoje, nesse trabalho, me ajudando na
a época de graduação e hoje, nesse trabalho, me ajudando na
“arte de trabalhar com as plantas”.
“arte de trabalhar com as plantas”.“arte de trabalhar com as plantas”.
“arte de trabalhar com as plantas”.
À Profª.Drª. Ilce
À Profª.Drª. Ilce À Profª.Drª. Ilce
À Profª.Drª. Ilce Mara Cólus, pela a
Mara Cólus, pela aMara Cólus, pela a
Mara Cólus, pela amizade e valiosa
mizade e valiosa mizade e valiosa
mizade e valiosa
contribuição.
contribuição.contribuição.
contribuição.
Ao Prof.Dr. Wagner Vilegas e à Profª.Drª. Lourdes
Ao Prof.Dr. Wagner Vilegas e à Profª.Drª. LourdesAo Prof.Dr. Wagner Vilegas e à Profª.Drª. Lourdes
Ao Prof.Dr. Wagner Vilegas e à Profª.Drª. Lourdes Campaner dos
Campaner dos Campaner dos
Campaner dos
Santos
SantosSantos
Santos,
, ,
, por dispor
por disporpor dispor
por disporem
emem
em cordialmente todo o
cordialmente todo o cordialmente todo o
cordialmente todo o conhecimento em prol
conhecimento em prol conhecimento em prol
conhecimento em prol
da realização desse trabalho.
da realização desse trabalho.da realização desse trabalho.
da realização desse trabalho.
À Drª. Miriam Sanno
À Drª. Miriam SannoÀ Drª. Miriam Sanno
À Drª. Miriam Sannomiy
miymiy
miya
aa
a, pelo valioso trabalho conjunto e
, pelo valioso trabalho conjunto e , pelo valioso trabalho conjunto e
, pelo valioso trabalho conjunto e
suporte qu
suporte qusuporte qu
suporte quanto ao conhecimento químico das espécies de
anto ao conhecimento químico das espécies de anto ao conhecimento químico das espécies de
anto ao conhecimento químico das espécies de
Byrsonima.
Byrsonima.Byrsonima.
Byrsonima.
Ao Prof.
Ao Prof.Ao Prof.
Ao Prof.
Dr
DrDr
Dr.
..
.
Luis Victor
Luis Victor Luis Victor
Luis Victor do Sacramento
do Sacramento do Sacramento
do Sacramento (Botânica) e Profª.
(Botânica) e Profª.(Botânica) e Profª.
(Botânica) e Profª.
Drª.
Drª. Drª.
Drª.
Rosangela
Rosangela Rosangela
Rosangela Gonçalves Machado
Gonçalves Machado Gonçalves Machado
Gonçalves Machado (Toxicologia
(Toxicologia(Toxicologia
(Toxicologia), pela amizade,
), pela amizade, ), pela amizade,
), pela amizade,
apoio e sugestões.
apoio e sugestões.apoio e sugestões.
apoio e sugestões.
À Profª.
À Profª.À Profª.
À Profª.
D
DD
Drª. Thais Maria Bauab
rª. Thais Maria Bauabrª. Thais Maria Bauab
rª. Thais Maria Bauab e à Profª. Drª. Clarice Q
e à Profª. Drª. Clarice Q e à Profª. Drª. Clarice Q
e à Profª. Drª. Clarice Queico
ueico ueico
ueico
Fujimura Leite, pela amizade e colaboração durante toda a
Fujimura Leite, pela amizade e colaboração durante toda a Fujimura Leite, pela amizade e colaboração durante toda a
Fujimura Leite, pela amizade e colaboração durante toda a
realização desse trabalho.
realização desse trabalho.realização desse trabalho.
realização desse trabalho.
Agradecimentos
Cássia Regina Primila Cardoso
A todos os
A todos osA todos os
A todos os professores do Departamento de Ciências Biológicas,
professores do Departamento de Ciências Biológicas, professores do Departamento de Ciências Biológicas,
professores do Departamento de Ciências Biológicas,
Departamento de Princípios Naturais e Toxicologia e
Departamento de Princípios Naturais e Toxicologia e Departamento de Princípios Naturais e Toxicologia e
Departamento de Princípios Naturais e Toxicologia e
Departamento de Análises Clínicas dessa unidade
Departamento de Análises Clínicas dessa unidade Departamento de Análises Clínicas dessa unidade
Departamento de Análises Clínicas dessa unidade que, de
que, de que, de
que, de
inúmeras formas e em muitas situações, contribuíram de
inúmeras formas e em muitas situações, contribuíram de inúmeras formas e em muitas situações, contribuíram de
inúmeras formas e em muitas situações, contribuíram de
maneira valiosa para o meu aperfeiçoamento durante esse
maneira valiosa para o meu aperfeiçoamento durante esse maneira valiosa para o meu aperfeiçoamento durante esse
maneira valiosa para o meu aperfeiçoamento durante esse
trabalho.
trabalho.trabalho.
trabalho.
À Profª.Drª. Maria S
À Profª.Drª. Maria SÀ Profª.Drª. Maria S
À Profª.Drª. Maria Stella Gonçalves Raddi e aos pós
tella Gonçalves Raddi e aos póstella Gonçalves Raddi e aos pós
tella Gonçalves Raddi e aos pós-
--
-graduandos
graduandos graduandos
graduandos
Verônica e Rodrigo, pela realização dos experimentos que
Verônica e Rodrigo, pela realização dos experimentos que Verônica e Rodrigo, pela realização dos experimentos que
Verônica e Rodrigo, pela realização dos experimentos que
comple
complecomple
complementaram e enriqueceram o conteúdo desse trabalho.
mentaram e enriqueceram o conteúdo desse trabalho.mentaram e enriqueceram o conteúdo desse trabalho.
mentaram e enriqueceram o conteúdo desse trabalho.
À Marisa Campos Polesi Placeres, pela amizade e extrema
À Marisa Campos Polesi Placeres, pela amizade e extrema À Marisa Campos Polesi Placeres, pela amizade e extrema
À Marisa Campos Polesi Placeres, pela amizade e extrema
disponibilidad
disponibilidaddisponibilidad
disponibilidade, paciência e contribuição n
e, paciência e contribuição ne, paciência e contribuição n
e, paciência e contribuição na realização dos
a realização dos a realização dos
a realização dos
experimentos imunológicos.
experimentos imunológicos.experimentos imunológicos.
experimentos imunológicos.
À Edinéia, Marisa e Silvia
À Edinéia, Marisa e SilviaÀ Edinéia, Marisa e Silvia
À Edinéia, Marisa e Silvia, pela amizade e auxílio no
, pela amizade e auxílio no , pela amizade e auxílio no
, pela amizade e auxílio no
desenv
desenvdesenv
desenvolvimento de metodologias e preparo de materiais no
olvimento de metodologias e preparo de materiais no olvimento de metodologias e preparo de materiais no
olvimento de metodologias e preparo de materiais no
Laboratório de Mutagênese.
Laboratório de Mutagênese.Laboratório de Mutagênese.
Laboratório de Mutagênese.
Aos meus amigos (e companheiros de jornada!) do Laboratório
Aos meus amigos (e companheiros de jornada!) do Laboratório Aos meus amigos (e companheiros de jornada!) do Laboratório
Aos meus amigos (e companheiros de jornada!) do Laboratório
de Mutagênese: Ana Paula, Fabiana, Maira
de Mutagênese: Ana Paula, Fabiana, Mairade Mutagênese: Ana Paula, Fabiana, Maira
de Mutagênese: Ana Paula, Fabiana, Maira, Mariana, Flávio,
, Mariana, Flávio, , Mariana, Flávio,
, Mariana, Flávio,
Walcl
WalclWalcl
Walclécio e, com especial carinho, ao Fábio e à Soraya, q
écio e, com especial carinho, ao Fábio e à Soraya, qécio e, com especial carinho, ao Fábio e à Soraya, q
écio e, com especial carinho, ao Fábio e à Soraya, que
ue ue
ue
acompanharam
acompanharamacompanharam
acompanharam
minhas atividades com precioso apoio e são um
minhas atividades com precioso apoio e são um minhas atividades com precioso apoio e são um
minhas atividades com precioso apoio e são um
exemplo a ser seguido na “vida acadêmica”.
exemplo a ser seguido na “vida acadêmica”.exemplo a ser seguido na “vida acadêmica”.
exemplo a ser seguido na “vida acadêmica”.
Ao Luis Eduardo dos Santos, pela amizade e auxílio no es
Ao Luis Eduardo dos Santos, pela amizade e auxílio no esAo Luis Eduardo dos Santos, pela amizade e auxílio no es
Ao Luis Eduardo dos Santos, pela amizade e auxílio no estágio
tágio tágio
tágio
de
de de
de docência realizado
docência realizadodocência realizado
docência realizado no Laboratório de Farmacognosia
no Laboratório de Farmacognosia no Laboratório de Farmacognosia
no Laboratório de Farmacognosia,
, ,
,
período esse que me trouxe muitos
período esse que me trouxe muitosperíodo esse que me trouxe muitos
período esse que me trouxe muitos conhecimentos.
conhecimentos. conhecimentos.
conhecimentos.
Aos funcionários da biblioteca: Moacir, Irani, Ana Cristina,
Aos funcionários da biblioteca: Moacir, Irani, Ana Cristina, Aos funcionários da biblioteca: Moacir, Irani, Ana Cristina,
Aos funcionários da biblioteca: Moacir, Irani, Ana Cristina,
Maximili
MaximiliMaximili
Maximiliano, Laura, Ana Lúcia, Sônia, K
ano, Laura, Ana Lúcia, Sônia, Kano, Laura, Ana Lúcia, Sônia, K
ano, Laura, Ana Lúcia, Sônia, Keila, Natalina...
eila, Natalina...eila, Natalina...
eila, Natalina...
Pela
PelaPela
Pela
amizade e por tornarem
amizade e por tornarem amizade e por tornarem
amizade e por tornarem nosso trabalho de pesquisa uma prática
nosso trabalho de pesquisa uma prática nosso trabalho de pesquisa uma prática
nosso trabalho de pesquisa uma prática
agradável e muito satisfatória.
agradável e muito satisfatória.agradável e muito satisfatória.
agradável e muito satisfatória.
Agradecimentos
Cássia Regina Primila Cardoso
À Aparecida Bernadete
À Aparecida Bernadete À Aparecida Bernadete
À Aparecida Bernadete Jesus
Jesus Jesus
Jesus (Berna
(Berna(Berna
(Berna), pela constante
), pela constante ), pela constante
), pela constante
disponibilidade e apoio.
disponibilidade e apoio.disponibilidade e apoio.
disponibilidade e apoio.
Às funcionárias da seção de pós
Às funcionárias da seção de pósÀs funcionárias da seção de pós
Às funcionárias da seção de pós-
--
-graduação, Cláudia, Sônia,
graduação, Cláudia, Sônia, graduação, Cláudia, Sônia,
graduação, Cláudia, Sônia,
Laura...
Laura... Laura...
Laura... Pelo
PeloPelo
Pelo apoio sempre carinhoso, inestimável orientação e
apoio sempre carinhoso, inestimável orientação e apoio sempre carinhoso, inestimável orientação e
apoio sempre carinhoso, inestimável orientação e
por sempre serem “as flores do meu buquê”...
por sempre serem “as flores do meu buquê”...por sempre serem “as flores do meu buquê”...
por sempre serem “as flores do meu buquê”...
A todos os professores do curso
A todos os professores do curso A todos os professores do curso
A todos os professores do curso de graduação da Faculdade de
de graduação da Faculdade de de graduação da Faculdade de
de graduação da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da UNESP, por terem contribuído para
Ciências Farmacêuticas da UNESP, por terem contribuído para Ciências Farmacêuticas da UNESP, por terem contribuído para
Ciências Farmacêuticas da UNESP, por terem contribuído para
minha formação como profissional e como ser humano.
minha formação como profissional e como ser humano.minha formação como profissional e como ser humano.
minha formação como profissional e como ser humano.
A todos os funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
A todos os funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas A todos os funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
A todos os funcionários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
da UNESP, cujo trabalho conjunto
da UNESP, cujo trabalho conjunto da UNESP, cujo trabalho conjunto
da UNESP, cujo trabalho conjunto proporciona a form
proporciona a formproporciona a form
proporciona a formação de
ação de ação de
ação de
uma instituição de qualidade ímpar.
uma instituição de qualidade ímpar.uma instituição de qualidade ímpar.
uma instituição de qualidade ímpar.
Aos colegas de graduação da 67ª Turma, pela
Aos colegas de graduação da 67ª Turma, pela Aos colegas de graduação da 67ª Turma, pela
Aos colegas de graduação da 67ª Turma, pela amizade...
amizade... amizade...
amizade...
Embora cada um de nós tenha seguido o seu caminho, os
Embora cada um de nós tenha seguido o seu caminho, os Embora cada um de nós tenha seguido o seu caminho, os
Embora cada um de nós tenha seguido o seu caminho, os
momentos bons estarão sempre em minha lembrança.
momentos bons estarão sempre em minha lembrança.momentos bons estarão sempre em minha lembrança.
momentos bons estarão sempre em minha lembrança.
Ao Programa Biota
Ao Programa Biota Ao Programa Biota
Ao Programa Biota –
––
– Fapesp, pela iniciativa de promo
Fapesp, pela iniciativa de promo Fapesp, pela iniciativa de promo
Fapesp, pela iniciativa de promover um
ver um ver um
ver um
trabalho integrado em prol da utilização sustentável da
trabalho integrado em prol da utilização sustentável da trabalho integrado em prol da utilização sustentável da
trabalho integrado em prol da utilização sustentável da
Biodiversidade.
Biodiversidade.Biodiversidade.
Biodiversidade.
À minha querida e verdadeira amiga, Mariana Carina Frigieri,
À minha querida e verdadeira amiga, Mariana Carina Frigieri, À minha querida e verdadeira amiga, Mariana Carina Frigieri,
À minha querida e verdadeira amiga, Mariana Carina Frigieri,
pela serenidade e companheirismo com que dividiu comigo os
pela serenidade e companheirismo com que dividiu comigo os pela serenidade e companheirismo com que dividiu comigo os
pela serenidade e companheirismo com que dividiu comigo os
momentos alegres e os difíceis, quando moramos juntas, e
momentos alegres e os difíceis, quando moramos juntas, emomentos alegres e os difíceis, quando moramos juntas, e
momentos alegres e os difíceis, quando moramos juntas, e por
por por
por te
tete
ter
r r
r
sido a maior incentivadora na busca desse sonho.
sido a maior incentivadora na busca desse sonho.sido a maior incentivadora na busca desse sonho.
sido a maior incentivadora na busca desse sonho.
A todos os meus amigos, dentro e fora da Universidade, que
A todos os meus amigos, dentro e fora da Universidade, que A todos os meus amigos, dentro e fora da Universidade, que
A todos os meus amigos, dentro e fora da Universidade, que
sempre estiveram comigo,
sempre estiveram comigo, sempre estiveram comigo,
sempre estiveram comigo, nos momentos bons ou nas
nos momentos bons ou nas nos momentos bons ou nas
nos momentos bons ou nas
dificuldades, com inestimável apoio.
dificuldades, com inestimável apoio.dificuldades, com inestimável apoio.
dificuldades, com inestimável apoio.
Agradecimentos
Cássia Regina Primila Cardoso
A todos aqueles que, direta ou indiretamente me au
A todos aqueles que, direta ou indiretamente me auA todos aqueles que, direta ou indiretamente me au
A todos aqueles que, direta ou indiretamente me auxiliaram na
xiliaram na xiliaram na
xiliaram na
realização desse trabalho e de um grande sonho...
realização desse trabalho e de um grande sonho...realização desse trabalho e de um grande sonho...
realização desse trabalho e de um grande sonho...
OBRIGADA!
OBRIGADA! OBRIGADA!
OBRIGADA!
Epígrafe
Cássia Regina Primila Cardoso
“De uma simples folha faço um chá”... D
“De uma simples folha faço um chá”... D“De uma simples folha faço um chá”... D
“De uma simples folha faço um chá”... Deste, um remédio...
este, um remédio... este, um remédio...
este, um remédio...
Do
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Do remédio, obtenho uma cura..
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Quantos milagres estão guarda
Quantos milagres estão guardaQuantos milagres estão guarda
Quantos milagres estão guardados na Natureza!”
dos na Natureza!”dos na Natureza!”
dos na Natureza!”
Jacob Melo
Jacob MeloJacob Melo
Jacob Melo
Resumo
ResumoResumo
Resumo
Resumo
Cássia Regina Primila Cardoso
Considerando a pesquisa de novas moléculas farmacologicamente ativas, orientada pelo uso
tradicional das plantas com finalidade terapêutica, o presente trabalho avaliou os efeitos genotóxicos e
de ativação do sistema imunológico em duas espécies de plantas do gênero Byrsonima: Byrsonima
crassa e Byrsonima intermedia. Essas espécies são plantas de uso popular, pertencentes à flora do
Cerrado Brasileiro, utilizadas pela população para disfunções gástricas e diarréias. Foram realizados
ensaios para a caracterização da mutagenicidade dos extratos, através do Teste de Ames (TA),
utilizando-se linhagens geneticamente modificadas de Salmonella typhimurium e de ativação da
resposta imune celular, utilizando-se cultura de macrófagos de exsudato peritoneal (PEC) de
camundongos Swiss, avaliando a liberação celular de Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) e Óxido
nítrico (NO), importantes moduladores da resposta inflamatória. Foi verificado que somente o extrato
metanólico de B.crassa apresentou atividade mutagênica positiva na linhagem TA98, com e sem
ativação metabólica. Analisando-se as frações aquosa e acetato de etila, verificou-se que o composto
provavelmente responsável pela atividade mutagênica do extrato metanólico está presente na fração
acetato. Testes realizados com os compostos isolados dessa fração (catequina, galato de metila,
querecetina -3-O-β-D-galactopiranosídeo, quercetina-3-O-α-arabinopiranosídeo e amentoflavona)
revelaram ação mutagênica da amentoflavona e indícios de mutagenicidade da quercetina
arabinopiranosídeo. Nos ensaios imunológicos, verificou-se que os extratos de B.crassa e
B.intermedia promoveram estímulo da liberação de NO por macrófagos de camundongos em níveis
reduzidos, assim como a fração aquosa do extrato metanólico de B.crassa. A fração acetato de etila
do extrato metanólico de B.crassa apresentou atividade estimuladora significativa para a liberação de
NO e TNF-α. Esses resultados indicam que os compostos presentes nessa fração são capazes de
estimular a atividade celular em geral, além de interferir em sua constituição genética, de acordo com
os resultados obtidos nos ensaios de mutagenicidade.
■ PALAVRAS-CHAVE: Byrsonima crassa; Byrsonima intermedia; extrato metanólico; fração acetato de etila;
galato de metila; quercetina; óxido nítrico; fator de necrose tumoral-α; mutagenicidade; teste de Ames.
Abstract
AbstractAbstract
Abstract
Abstract
Cássia Regina Primila Cardoso
Considering the research of active new molecules, leaded by the traditional use of plants
with therapeutic proposal, this paper tested the genotoxic effects and the activation of the immune
system in two species of Byrsonima: Byrsonima crassa and Byrsonima intermedia. These are popular
use species that belong to the Brazilian Cerrado, utilized by population to gastric dysfunctions and
diarrheas. Many assays were done to give the characterization of mutagenicity of the extracts,
through the Ames test (TA) using a line of genetic changed Salmonella typhimurium and the
activation of the cellular response, using a culture of peritoneal macrophages from Swiss mice, to test
the cell liberation of the Tumor Necrosis Factor-apha (TNF-α) and Nitric Oxide (NO), important
modulators on the inflammation response. It was verified that only the methanolic extract of B.crassa
presented positive mutagenic activity in the line TA98, with and without metabolic activation.
Analyzing the watering and ethyl acetate portions, it was checked that the substance that probably is
responsible by the mutagenic activity of the methanolic extract is present on the ethyl acetate portion.
Assays achieved with isolated compounds from this portion - (+)-catechin, methyl galate, quercetin-3-
O-β-D-galactopyranoside, quercetin-3-O-α-L-arabinopyranoside and amentoflavone – discovered
mutagenic activity of amentoflavone and mutagenicity signals of quercetin-3-O-α-L-
arabinopyranoside. On this immunologic assays, it was observed that the B.crassa and B.intermedia
extracts did not promote the stimulation of leaving NO and TNF-α by macrophages of mouse, just live
the watering portion from B.crassa methanolic extract. The ethyl acetate B.crassa portion presented
stimulated and relevant activity to the liberation of NO and TNF-α. These results indeed that the
substances present in this portion are able to stimulate the cell activity in general, and moreover
interfere on its genetic constitution, according to the results obtained on the mutagenic assays.
■ KEYWORDS: Byrsonima crassa; Byrsonima intermedia; methanolic extract; ethyl acetate portion; methyl
galate; quercetin; nitric oxide; tumor necrosis factor-alpha; mutagenicity; Ames test.
Lista de Figuras
Cássia Regina Primila Cardoso
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Byrsonima crassa Niedenzu..................................................................................38
Figura 2. Byrsonima intermedia A.Juss................................................................................38
Figura 3. Óxido nítrico sintetase (isoformas) – (DUSSE, 2003)...........................................42
Figura 4. Reação bioquímica da síntese de NO (Adaptado de MacMiccking et al.,
1997).......................................................................................................................................43
Figura 5. Fluxograma para a obtenção dos extratos de B.crassa (Bc) e B.intermedia
(Bi)..........................................................................................................................................51
Figura 6. Representação esquemática para a obtenção das frações e compostos isolados do
extrato metanólico das folhas de Byrsonima crassa Niedenzu..............................................53
Figura 7. Teste de Ames (esquema) – A) sem ativação metabólica; B) com ativação
metabólica...............................................................................................................................57
Figura 8. Esquema de obtenção das células de exudato peritoneal de camundongos Swiss
para os ensaios imunológicos.................................................................................................59
Figura 9. Esquema do ensaio de liberação de NO por macrófagos peritoneais de
camundongos Swiss................................................................................................................61
Figura 10. Esquema de obtenção dos sobrenadantes das culturas de PEC em presença de
extratos e frações de B.crassa e B.intermedia........................................................................63
Figura 11. Esquema do ensaio de liberação de TNF-α por macrófagos peritoneais de
camundongos Swiss................................................................................................................64
Figura 12. Produção de óxido nítrico (NO) em cultura de macrófagos peritoneais de
camundongos na presença dos extratos e frações de B.crassa Niedenzu e B.intermedia
A.Juss.....................................................................................................................................75
Lista de Figuras
Cássia Regina Primila Cardoso
Figura 13. Produção de TNF-α em cultura de macrófagos peritoneais de camundongos na
presença de extratos e frações de B.crassa Niedenzu e B.intermedia
A.Juss.....................................................................................................................................77
Lista de Tabelas
Cássia Regina Primila Cardoso
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Atividade mutagênica expressa pela média ± desvio padrão do número de
revertentes/placa nas linhagens bacterianas TA98, TA100, TA97a e TA102 expostas aos
extratos de Byrsonima crassa, em várias concentrações, com metabolização (+S9) ou sem
metabolização (-S9)..................................................................................................................70
Tabela 2. Atividade mutagênica expressa pela média ± desvio padrão do número de
revertentes/placa nas linhagens bacterianas TA98, TA100, TA97a e TA102 expostas às
frações aquosa e acetato de etila de Byrsonima crassa, em várias concentrações, com
metabolização (+S9) ou sem metabolização (-S9)...................................................................71
Tabela 3. Atividade mutagênica expressa pela média ± desvio padrão do número de
revertentes/placa na linhagem bacteriana TA98 exposta aos compostos isolados da fração
acetato do extrato metanólico de Byrsonima crassa, em várias concentrações, com
metabolização (+S9) e sem metabolização (-S9)......................................................................72
Tabela 4. Atividade mutagênica dos extratos de Byrsonima intermedia A.Juss. em linhagens
de S. typhimurium, em presença (+S9) e ausência (-S9) de ativação
metabólica.................................................................................................................................73
Lista de Abreviaturas e Siglas
Cássia Regina Primila Cardoso
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcEt: acetato de etila
°C: graus Celsius
µmols: micromols
µg: micrograma
µL: microlitro
µM: micromolar
AcOEt: acetato de etila
AIDS: síndrome da imunodeficiência adquirida
ANOVA: análise de variância
Bi: Byrsonima intermedia A.Juss.
Bc: Byrsonima crassa Niedenzu (IK)
bio: biotina
cm: centímetro
CC: cromatografia em coluna
CCD: cromatografia em camada delgada
cNOS: óxido nítrico sintetase constitutiva
CO
2
: dióxido de carbono
DMSO: dimetilsulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucléico
ECHCl
3
: extrato clorofórmico
Lista de Abreviaturas e Siglas
Cássia Regina Primila Cardoso
EMeOH: extrato metanólico
EMeOH 80%: extrato metanol/água 80:20
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
eNOS: óxido nítrico sintetase endotelial
FAPESP: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
Fr.: fração
g: grama
G-6-P: glicose-6-fosfato
h: horas
H
2
O: água
H
2
O
2
: água oxigenada
his: histidina
HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência
IFN-γ: interferon-gama
IL-1: interleucina-1
iNOS: óxido nítrico sintetase induzível
IQ/UNESP: Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
K: potássio
kg: kilograma
LPS: lipopolissacarídeo
M: molar
mg: miligrama
Lista de Abreviaturas e Siglas
Cássia Regina Primila Cardoso
Mg: magnésio
MeOH: metanol
MS: espectrometria de massas
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADP: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NaNO
2
: nitrito de sódio
ng: nanogramas
NHA: N
G
-hidroxi-L-arginina
nm: nanômetro
nmols: nanomols
nNOS: óxido nítrico sintetase neuronal
NO: óxido nítrico
NO
2
-
: nitrito
NOS: óxido nítrico sintetase
NPD: 4-nitrofenilenodiamina
NP/PEG: Natural product/polyethylenoglicol
PBS: solução salina tamponada com fosfato
PEC: células de exudato peritoneal
pg: picogramas
RM: razão de mutagenicidade
RMN: ressonância magnética nuclear
Lista de Abreviaturas e Siglas
Cássia Regina Primila Cardoso
RNA: ácido ribonucléico
rpm: rotações por minuto
RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura – série 1640)
RPMI-1640-C: Roswell Park Memorial Institute (meio de cultura – série 1640) completo
TA: Teste de Ames
TNF-α: Fator de necrose tumoral – alfa
U: unidades
UNESP: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
UV: ultra-violeta
VN: solução de vermelho neutro
v/v: volume por volume
Sumário
Cássia Regina Primila Cardoso
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................31
1.1. Aspectos gerais sobre o uso de Plantas Medicinais ...............................................32
1.2. Flora do Cerrado Brasileiro ...................................................................................35
1.2.1. Byrsonima crassa Niedenzu ...................................................................36
1.2.2. Byrsonima intermedia A. Juss ................................................................37
1.3. Mutagenicidade ......................................................................................................39
1.4. Resposta imunológica ............................................................................................40
II. OBJETIVOS ......................................................................................................................46
III. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................48
3.1. Obtenção do material vegetal.................................................................................49
3.2. Obtenção dos extratos, frações e compostos isolados de B. crassa Niedenzu e B.
intermedia A.Juss..........................................................................................................49
3.2.1. Obtenção dos extratos de B. crassa Niedenzu e B. intermedia
A.Juss................................................................................................................49
3.2.2. Obtenção das frações do extrato metanólico de B. crassa
Niedenzu...........................................................................................................50
3.2.3. Obtenção dos compostos isolados a partir da fração acetato de etila do
extrato metanólico de B. crassa Niedenzu........................................................52
3.3. Teste de Ames........................................................................................................54
3.3.1. Extratos, frações e compostos isolados...................................................54
3.3.2. Linhagens de Salmonella typhimurium
...................................................54
Sumário
Cássia Regina Primila Cardoso
3.3.3. Manutenção e estoque das cepas, verificação das características
genéticas............................................................................................................55
3.3.4. Preparo dos inóculos de Salmonella typhimurium..................................55
3.3.5. Meios de cultura......................................................................................55
3.3.6. Preparo da mistura S9 .............................................................................56
3.3.7. Controles .................................................................................................56
3.3.8. Ensaios de mutagenicidade .....................................................................56
3.4. Ensaios imunológicos ............................................................................................57
3.4.1. Animais ...................................................................................................57
3.4.2. Obtenção de células peritoneais (PEC) ...................................................58
3.4.3. Ensaios de citotoxicidade ........................................................................59
3.4.4. Determinação da liberação de Óxido Nítrico ..........................................60
3.4.5. Determinação da liberação do Fator de Necrose Tumoral-alfa ...............61
3.4.5.1. Obtenção do sobrenadante ..........................................................61
3.4.5.2. Bioensaio para TNF-α.................................................................62
3.5. Análise estatística...................................................................................................64
3.5.1. Teste de Ames.........................................................................................64
3.5.2. Ensaios imunológicos .............................................................................65
IV. RESULTADOS.................................................................................................................66
4.1. Teste de Ames com extratos, frações e compostos isolados de B. crassa
Niedenzu.......................................................................................................................67
4.2. Teste de Ames com extratos de B.intermedia A.Juss............................................68
Sumário
Cássia Regina Primila Cardoso
4.3. Ensaios de citoxicidade..........................................................................................74
4.4. Ensaios de liberação de Óxido Nítrico com extratos e as frações de B. crassa
Niedenzu.......................................................................................................................74
4.5. Ensaios de Liberação de Óxido Nítrico com extratos de B. intermedia
A.Juss............................................................................................................................74
4.6. Ensaios de Liberação de TNF-α com extratos e frações de B. crassa
Niedenzu.......................................................................................................................76
4.7. Ensaios de Liberação de TNF-α com extratos de B.intermedia A.Juss.................76
V. DISCUSSÃO.......................................................................................................................78
VI. CONCLUSÕES ................................................................................................................96
VII. REFERÊNCIAS ..............................................................................................................98
VIII. APÊNDICE ..................................................................................................................110
I. Introdução
I. IntroduçãoI. Introdução
I. Introdução
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
32
1.1. Aspectos gerais sobre o uso de plantas medicinais
As plantas são mundialmente empregadas na medicina popular e apesar do uso
indiscriminado das mesmas, até hoje são escassos os estudos sobre as suas constituições
químicas e atividades biológicas. A literatura descreve inúmeras atividades biológicas
relacionadas com os compostos encontrados nessas preparações tradicionais, principalmente
os fenólicos (MONTOURO et al., 2005). Há muitos anos, as plantas são de grande
importância no tratamento de algumas doenças e, dessa forma, o estudo da constituição
química tem contribuído para que alguns fármacos potentes tenham sido descobertos
(SANNOMIYA et al., 2004). Ervas medicinais são empregadas na fabricação de
medicamentos e na medicina tradicional ao longo de gerações (LOPES et al., 2000). Extratos
vegetais e seus constituintes isolados podem ser usados na fabricação de produtos terapêuticos
industrializados, com vários objetivos (MARQUES, 2002). Relatos revelam que cerca de
80% da população mundial utiliza plantas com finalidade terapêutica (FETROW & AVILA,
2000).
A indústria de produtos fitoterápicos tem apresentado, em geral, um crescimento anual
de 25% em seus lucros (FETROW & AVILA, 2000). Além disso, o desenvolvimento de um
fitoterápico pode ser obtido com custos menores que um fármaco sintético (YUNES et al.,
2001). Em muitos países com cultura diversificada, o uso de plantas medicinais tem crescido
na última década, generalizando-se em todos os quadrantes do mundo. Nos EUA, por
exemplo, aproximadamente 25% das prescrições contêm compostos originados de plantas
(YAMADA, 1998). Em Cuba, a rica flora do país permite vasta tradição no uso de
fitoterápicos (VIZOSO et al., 2002). Já na África do Sul, o uso comum e medicinal de plantas
é vasto, com grande produção e obtenção de extratos, movimentando setores da economia
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
33
(VERSCHAEVE et al., 2004). Na Alemanha, vários fitoterápicos já foram liberados no
mercado e 70% dos profissionais de saúde prescrevem esses produtos aos pacientes, mantendo
um dos maiores mercados mundiais de drogas de origem vegetal (FETROW & AVILA,
2000). No Brasil, muitas plantas são utilizadas como extratos, emplastos e infusões, sem
evidências científicas que comprovem a eficácia desses tratamentos (HOLETZ et al., 2002).
Embora seja o quinto maior consumidor mundial de remédios, possua grande riqueza natural e
amplo patrimônio étnico-cultural, o mercado farmacêutico brasileiro é dominado por
multinacionais (LOPES, 2004).
Em grande parte, os efeitos gerados pelos constituintes de uma planta no organismo
vivo são verificados baseando-se nos conhecimentos populares de uso repetitivo e tradicional.
Sabe-se que os vegetais e frutas possuem classes de agentes fitoquímicos com diversas ações
terapêuticas, como efeitos antioxidantes, antimutagênicos e até anticarcinogênicos
(KUSAMRAN et al., 1998; NAKAMURA et al., 1998). Existem muitos estudos que
enfatizam a atividade antimutagênica de plantas (NOGUEIRA et al., 2005). Também existem
diversos estudos relacionados com a ação benéfica de plantas na modulação da resposta
imunológica (LOPES et al., 2004). Pae et al. (2003), por exemplo, estudaram extratos de
Catalpa ovata G. Don., tradicional planta ornamental da Coréia e verificaram importante ação
inibitória da liberação de óxido nítrico e fator de necrose tumoral-α por macrófagos, o que
caracteriza sua ação antiinflamatória. Enfim, os extratos de muitas plantas podem ser usados
no tratamento de várias doenças humanas (YEN et al., 2001).
Apesar de muitas ações benéficas das plantas, é importante verificar que alguns de
seus constituintes podem ser tóxicos ao organismo, e o metabolismo vegetal também pode
gerar metabólitos com esta mesma atividade. Segundo AMES (1983), elementos presentes
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
34
em vegetais da dieta humana, além de outros tidos como medicinais, apresentam substâncias
nocivas para o organismo.
De acordo com estudos de Marques et al. (2003), o extrato hidroalcoólico de Ocotea
duckei, rico em alcalóides, mostrou-se indutor de mutagenicidade. Varanda et al. (2002),
verificaram que extratos de Brosimum gaudichaudii apresentaram efeitos genotóxicos, através
de teste de Ames e culturas de células CHO. Ferreira & Vargas (1999) verificaram que os
extratos de algumas plantas usadas na medicina popular do sul do Brasil apresentaram
atividade mutagênica. Nesses extratos foram encontrados flavonóides, taninos e
antraquinonas.
Ensaios de genotoxicidade de curta duração tornaram-se rotina para a avaliação do
potencial mutagênico de agentes químicos. Existem também muitos ensaios para avaliação
das alterações imunológicas, baseando-se na quantificação e identificação de mediadores
produzidos pelas células, facilitando a compreensão dos processos bioquímicos que ocorrem
na inflamação. Existem casos em que estes agentes químicos podem provocar liberações
excessivas de mediadores pelas células, gerando citotoxicidade (ROITT et al., 2003).
Segundo Marques (2002), frações metanólicas de Styrax camporum Pohl, uma árvore
do cerrado brasileiro, foram capazes de induzir a liberação do TNF-alfa, além de estimular a
enzima óxido nítrico sintetase induzível (iNOS), responsável pela produção de NO, por
macrófagos peritoneais de camundongos in vitro. Burger et al. (1997), verificaram que
extratos de Echinacea purpurea também são capazes de induzir a secreção celular de TNF-
alfa.
Frente aos exemplos citados sobre os efeitos adversos de algumas plantas usadas como
medicinais, verifica-se a importância da expansão dos estudos sobre os riscos e benefícios do
uso das mesmas. Atualmente, o Projeto Temático Biota, financiado pela FAPESP, reúne
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
35
pesquisadores nas áreas química, farmacológica e biológica, com o objetivo de pesquisar
novas moléculas farmacologicamente ativas, obtidas de plantas pertencentes à flora brasileira.
Outros objetivos desse projeto também envolvem a tentativa de conciliar o conhecimento
popular e científico, além de promover a estruturação do manejo sustentável da biodiversidade
no país.
1.2. Flora do Cerrado Brasileiro
No Brasil, existe uma flora bastante diversificada, em toda a sua extensão, com
vegetações de diferentes características e cujos princípios ativos são desconhecidos. De um
modo geral, as matas nativas são as maiores representações da riqueza de espécies da flora
brasileira. No Estado de São Paulo, são características as vegetações do Cerrado e Mata
Atlântica, com grande quantidade de espécies a serem estudadas, muitas delas de uso popular.
Esse dado reforça a necessidade da realização de estudos que caracterizem essas plantas
quanto ao potencial farmacológico, biológico e tóxico (NAPOLITANO et al., 2005).
A família Malpighiaceae é formada por aproximadamente 800 espécies, distribuídas
em 60 gêneros, de ocorrência em regiões tropicais (Norte, Nordeste e Região Central do
Brasil), América Central e Guianas. No Nordeste brasileiro, ocorrem diversas espécies dos
gêneros Byrsonima, Camarea, Galphimia, Stigmaphyllom e Peixotoa. Apesar desse grande
número de espécies vegetais, pouco é conhecido acerca da constituição química da família.
Poucos trabalhos na literatura reportam a presença, em geral, de triterpenos, flavonóides e
esteróides em algumas espécies (DAVID & SANTOS, 2003). Esses vegetais apresentam
diferentes tipos de habitat, frutos e caracteres citogenéticos. Em geral, as espécies arbustivas e
arbóreas são muito comuns (LOMBELLO & MARTINS, 2003).
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
36
No Brasil, a maior parte das espécies da família Malpigliaceae é conhecida por ser
utilizada com finalidade terapêutica e como alimento. Desse modo, há uma crescente
necessidade de mais estudos fitoquímicos com essas espécies (DAVID & SANTOS, 2003).
As espécies do gênero Byrsonima são conhecidas popularmente como “muricis” e, em
geral, são plantas nativas do norte, nordeste e região central do Brasil, podendo também ser
encontradas em algumas regiões serranas do Sudeste. São plantas com caracteres típicos das
plantas do cerrado, geralmente arbóreas, com galhos retorcidos e porte médio, podendo chegar
a 5 metros de altura. Os “muricis” do Brasil são muitos e variados, distinguindo-se pelas
cores e locais de ocorrência. Assim, são conhecidos como “murici branco”, “murici amarelo”,
“murici vermelho”, “murici da chapada”, “murici do brejo”, “murici da mata”, entre outros.
São plantas de fácil adaptação, se desenvolvendo bem em solos areno-argilosos, com clima
quente e boa ventilação. A fase de floração e frutificação ocorre durante todo o ano,
dependendo da ocorrência das chuvas. Muitas espécies de murici fornecem frutos bastante
consumidos e apreciados (por exemplo, a reputada acerola, rica em vitamina C), que são base
da alimentação de algumas populações nas mais variadas preparações culinárias (no Nordeste,
por exemplo, frutos da espécie Byrsonima crassifolia, amassados com farinha, fornecem a
“cambica de murici”, rica em gorduras e de alto teor nutritivo). O cultivo e colheita dessas
plantas ainda são bastante rudimentares, não existindo dados e parâmetros agronômicos
seguros. No Estado do Pará, por exemplo, há um grande interesse em desenvolver pesquisas
agronômicas com os muricizeiros, devido ao grande consumo das frutas dessas plantas nessa
região (PIMENTEL GOMES, 2005).
1.2.1. Byrsonima crassa Niedenzu
Byrsonima crassa Niedenzu pertence à Família Malpighiaceae, Gênero Byrsonima. É
conhecida popularmente como “murici vermelho” ou “murici do cerrado”. Suas folhas e
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
37
cascas são utilizadas na medicina popular em tratamento de infecções cutâneas, picadas de
cobra, disfunções gástricas e diarréias (BRITO et al., 2003). O estudo fitoquímico dos
extratos da espécie, através de metodologias espectroscópicas, resultou no isolamento da
mistura de ácido gálico e galato de metila, quercetina-3-O-alfa-L-piranosídeo e a mistura de
quercetina-3-O-beta-D-glucopiranosídeo e quercetina-3-O-beta-D-galactopiranosídeo
(FONSECA et al., 2005). A avaliação do perfil cromatográfico de frações dos extratos
revelou a presença de catequinas e flavonóides (RODRIGUES et al., 2004). Da infusão de
folhas de B.crassa, foram isolados compostos extremamente polares, como derivados
fenólicos, que possuem diversas atividades biológicas, como imunomodulação, proteção
contra o câncer e doenças cardiovasculares. Além desses, foram isolados também catequinas
e flavonóides, que possuem atividade antioxidante, importante em algumas doenças
degenerativas, como Alzheimer (MONTOURO et al., 2005). A Figura 1 mostra a espécie
Byrsonima crassa Niedenzu (murici do cerrado ou murici vermelho).
1.2.2. Byrsonima intermedia A.Juss.
De um modo geral, a espécie Byrsonima intermedia (Malpighiaceae), conhecida como
“murici amarelo”, possui um perfil botânico bastante semelhante à Byrsonima crassa.
Baseando-se em estudos etnofarmacológicos, se podemos dizer que as folhas e o tronco dessa
planta são utilizados popularmente para diarréias, disfunções gástricas e úlceras
(SANNOMIYA et al., 2004). O estudo fitoquímico revelou a presença de catequinas,
derivados da quercetina, ácido gálico e galato de metila e outros compostos isolados
(SANNOMIYA et al., 2004). A Figura 2 mostra o aspecto da planta Byrsonima intermedia
(murici amarelo).
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
38
Figura 1. Byrsonima crassa Niedenzu
(murici do cerrado)
Imagem obtida por scaneamento da planta
Autor da foto: Drª Miriam Sannomiya
Figura 2. Byrsonima intermedia A.Juss.
(murici amarelo)
Imagem obtida do site: www.google.com
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
39
1.3. Mutagenicidade
Mutações são definidas como qualquer alteração permanente no DNA e podem
acontecer em células germinativas ou somáticas; envolvem mutações cromossômicas e
mutações gênicas. A mutagenicidade é a capacidade de um agente químico ou físico causar
alterações genéticas. Esses agentes podem ser mutágenos primários interagindo diretamente
com a molécula de DNA, ou mutágenos secundários que, sofrendo reações metabólicas no
organismo vivo, tornam-se mutagênicos (VARELLA et al., 2004).
Os estudos de genotoxicidade e anti-genotoxicidade com plantas têm crescido
juntamente com o aumento do uso terapêutico e com o interesse em comprovar a eficácia das
mesmas nas mais diversas finalidades farmacológicas (JIMÉNEZ et al., 2005). Muitas plantas
utilizadas por grande número de pessoas podem possuir propriedades farmacológicas e,
simultaneamente, também estar causando alterações no DNA (MARQUES et al. 2003).
É bem documentando que mutações gênicas atuam em etapas da carcinogênese e que
os ensaios que detectam componentes genotóxicos permitem identificar substâncias com risco
potencial à saúde humana. O teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium, também
conhecido como Salmonella/microssomo, ou Teste de Ames, é uma das metodologias mais
utilizadas atualmente para detectar substâncias genotóxicas (VARELLA et al., 2004), sendo
validado em larga escala por diversos laboratórios (MORTELMANS & ZEIGER, 2000;
RIBEIRO et al., 2004). Nesse ensaio, são utilizadas linhagens de Salmonella typhimurium
que, na presença do agente mutagênico, revertem seu caráter auxotrófico para a síntese de
histidina, crescendo em meios que não possuem este aminoácido. Os crescimentos das
colônias revelam uma mutação reversa induzida pelo agente, e a contagem caracteriza a ação
mutagênica em função da concentração utilizada (ZEIGER, 2001). Foram estabelecidas
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
40
relações entre a atividade mutagênica de agentes químicos ou físicos e a capacidade dos
mesmos de induzir o câncer em ensaios com animais (MARON & AMES, 1983).
Cada tipo de linhagem bacteriana apresenta diferentes mutações no operon histidina, o
que permite diferenciar mecanismos de ação, ou seja, diferentes mutações causadas pelos
agentes químicos. As mutações podem ser substituições de bases ou do tipo frameshift
(AMES, 1983; MORTELMANS & ZEIGER, 2000).
1.4. Resposta imunológica
A inflamação é fundamentalmente uma resposta de defesa do organismo, visando
destruir, amenizar ou circunscrever a ação de um agente agressor (MARQUES, 2002).
A resposta imune é mediada por uma variedade de células e moléculas solúveis que
estas células secretam. Entre essas células, podemos destacar os macrófagos, células teciduais
originadas do monócito do sangue periférico (ROITT et al., 2003). No processo inflamatório,
os macrófagos promovem a eliminação de agentes estranhos por fagocitose e pela liberação de
substâncias, como por exemplo, produtos reativos de nitrogênio, como o óxido nítrico (NO)
(NAPOLITANO et al., 2005).
A interação entre macrófagos e linfócitos na resposta imunológica desencadeia
mudanças morfológicas e funcionais na membrana do macrófago, alterando as suas
propriedades gerais, inclusive de locomoção e aderência, secreção de substâncias quimioativas
e fagocitose, no sítio de ação (MARQUES, 2002).
O NO é um mediador que regula as respostas imunes humorais e celulares na
inflamação, possuindo tanto propriedades antiinflamatórias quanto pró-inflamatórias,
dependendo do tipo e da fase da inflamação (MOILANEN & VAPAATALO, 1995). É
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
41
produzido em muitos tecidos pela enzima óxido nítrico sintetase (NOS) durante a
transformação catalítica da L-arginina em citrulina. Três isorformas da óxido nítrico sintetase
já foram identificadas: a neuronal (nNOS), a endotelial (eNOS) e a induzível (Figura 3),
expressa principalmente em macrófagos (NAPOLITANO et al., 2005). A reação bioquímica
acontece em duas etapas (Figura 4). Na primeira, há formação de um composto intermediário,
a N
G
-hidroxi-L-arginina (NHA). Na segunda etapa, ocorre a conversão da NHA em NO e L-
citrulina (ACHIKE & KWAN, 2003). O NO produzido por macrófagos tem papel crucial nos
processos imunológicos antimicrobianos, antitumorais e antivirais (PUNTUREE et al., 2004).
Existe, porém, um tênue limite de concentração tissular entre a não toxicidade às células do
hospedeiro e a toxicidade necessária para a ação contra agentes invasores (FLORA FILHO &
ZILBERSTEIN, 2000). O controle apropriado da homeostase do NO faz com que este
mediador seja útil em eventos fisiológicos ou, por outro lado, seja citotóxico, devido a uma
geração excessiva (ACHIKE & KWAN, 2003). Citocinas secretadas por linfócitos ativados
regulam s síntese de NO pelos macrófagos (MOILANEN & VAPAATALO, 1995).
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
42
Figura 3. Óxido nítrico sintetase (isoformas) – (DUSSE, 2003).
Óxido nítrico sintetase (NOS)
CONSTITUTIVA INDUZÍVEL
n-NOS
i-NOS
e-NOS
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
43
Figura 4. Reação bioquímica da síntese de NO (adaptado de MacMiccking et al., 1997).
L-arginina
NHA
NOS
NOS
NO
-
2
NADPH
O
2
NADP
+
H
2
O
0.5 NADPH
O
2
0.5 NADP
+
H
2
O
L-citrulina
NO
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
44
O Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) é uma citocina multifuncional, que possui
funções centrais na inflamação aguda ou crônica, na resposta antitumoral (induzindo à morte
apoptótica) e nas infecções (PALLADINO et al., 2003). As principais células produtoras de
TNF-α são os monócitos e macrófagos (EIGLER et al., 1997).
Em geral, a ação do TNF-α pode ser benéfica ou maléfica, se produzido em altos
níveis. Além da sua ação direta em células teciduais, pode favorecer a produção de outros
mediadores da resposta inflamatória (PARHAM, 2001). Vários estudos têm sido descritos
nos últimos anos, discutindo o papel do TNF-α em algumas patologias, como sepse,
meningites bacterianas, AIDS, artrite reumatóide e outras (GIBSON, 2004; METHE, 2004;
SCHACHNA, 2004).
Com relação à sua função sobre a indução da morte de células tumorais, podemos
caracterizar as proteínas da família TNF como ligantes de superfície celular, que interferem no
mecanismo de ativação da cascata apoptótica via caspases, ou como proteína secretada
(exemplo, o TNF-α). Além disso, o TNF age sobre a musculatura lisa vascular, promovendo
o relaxamento do tônus celular, além de também estar envolvido na produção de substâncias
vasodilatadoras endógenas, como o próprio NO, por indução da enzima óxido nítrico sintetase
(MARQUES, 2002).
Atualmente, ensaios de liberação de NO em cultura de macrófagos fornecem
importantes dados sobre a modulação imunológica ou capacidade citotóxica, dependendo de
sua concentração. Altos níveis de produção de TNF-alfa e NO refletirão o potencial de
estimulação imunológica, e o excesso pode contribuir para a indução de patologias
inflamatórias (PUNTUREE et al., 2004).
Devido ao grande número de produtos naturais usados na medicina tradicional e
popular, em muitos países, torna-se importante a caracterização da atuação desses compostos
Introdução
Cássia Regina Primila Cardoso
45
bioativos sobre o sistema imune, e no que se refere aos macrófagos, a avaliação da liberação
de NO e TNF-α são bastante consideráveis (CHOI & HUANG, 2005). Alguns trabalhos têm
sido desenvolvidos para estabelecer a ativação da resposta imune por compostos de origem
vegetal. Estudos de Lopes et al. (2005) revelaram a atividade antiinflamatória da espécie
Alchornea glandulosa, planta do cerrado brasileiro, que inibiu consideravelmente a liberação
de NO e TNF- α por macrófagos.
II. Objetivos
II. ObjetivosII. Objetivos
II. Objetivos
Objetivos
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47
Os objetivos do trabalho foram:
2.1. Avaliação da possível atividade mutagênica dos extratos clorofórmicos,
metanólicos e hidroalcoólicos de Byrsonima crassa e Byrsonima intermedia, das frações
acetato de etila e aquosa do extrato metanólico de B.crassa e as substâncias puras isoladas da
fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa, através de Teste de Ames,
empregando as linhagens TA100, TA98, TA97a e TA102 de Salmonella typhimurium;
2.2. Avaliação do potencial de ação destes extratos e frações sobre o sistema
imunológico, avaliando in vitro a possível interferência dos mesmos na produção de
mediadores da resposta imune celular, com enfoque na produção de óxido nítrico (NO) e
Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α).
III. Material e Métodos
III. Material e MétodosIII. Material e Métodos
III. Material e Métodos
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
49
3.1. Obtenção do material vegetal
As folhas de Byrsonima crassa Niedenzu foram coletadas do Porto Nacional do
Estado do Tocantins, Brasil, pela Profª Drª Clélia A. Hiruma-Lima. A autenticidade da
amostragem foi feita pelo Prof. Eduardo Ribeiro dos Santos, por comparação com arquivos do
Herbário da Universidade do Tocantins. A espécie padrão está depositada sob o registro no.
3377, no Herbário do Instituto de Biociências da Universidade do Tocantins.
As folhas de Byrsonima intermedia A.Juss. foram colhidas em Pratânia, São Paulo,
Brasil. A identificação taxonômica foi estabelecida sob a referência nº. 24164, pelo Instituto
de Biociências da UNESP de Botucatu.
3.2. Obtenção dos extratos, frações e compostos isolados de B. crassa Niedenzu e
B. intermedia A.Juss.
Os extratos, frações e compostos isolados de B. crassa e B. intermedia fazem parte da
relação de plantas do projeto Biota - FAPESP. As extrações foram realizadas no Instituto de
Química da UNESP-SP, sob a coordenação do Prof. Dr. Wagner Vilegas.
3.2.1. Obtenção dos extratos de B. crassa Niedenzu e B. intermedia A.Juss.
Aproximadamente 2 kg de folhas da planta foram secos, triturados em moinho de
facas e submetidos à exaustiva extração por maceração, em um recipiente com tampa, com
clorofórmio, metanol e uma mistura hidroacoólica de metanol a 80%, 48 horas cada solvente,
à temperatura ambiente e com agitação ocasional, com finalidade de evitar possíveis perdas de
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
50
compostos químicos da matéria prima vegetal. Após os processos de extração, foi feita
filtração em papel e o restante de solvente foi retirado sob pressão reduzida, obtendo-se os
extratos clorofórmico, metanólico e metanólico a 80% secos, nas proporções (v/v) de 2,69,
7,91 e 4,79 g, respectivamente. Da mesma quantidade de folhas de B. intermedia, sob a
mesma metodologia, foram obtidos extratos clorofórmico (16,7g), metanólico (85,2g) e
hidroalcoólico (29,6g) secos.
3.2.2. Obtenção das frações do extrato metanólico de B. crassa Niedenzu
Análises por cromatografia em camada delgada do extrato juntamente com padrões de
catequinas [(+)-catequina, (-)-epicatequina], flavonóides (rutina e quercetina) e revelação com
reagentes específicos (NP/PEG, anisaldeído sulfúrico, iodo, UV em 254 e 365 nm) indicaram
a presença de taninos, catequinas e flavonóides. A indicação da presença de saponinas foi
verificada pela formação de espuma persistente quando da agitação de uma alíquota do extrato
em um tubo de ensaio com água (SIMÕES et al., 2000). O extrato metanólico foi fracionado
com uma mistura de acetato de etila e água (1:1 v/v), em três vezes. Uma porção de 10 g do
extrato metanólico foi ressuspensa em água e extraída sucessivamente com acetato de etila
(três tempos), produzindo a fração acetato de etila (4,8g) e a fração aquosa (3,0g). Análises
por CCD mostraram que os flavonóides permaneceram majoritariamente na fase AcOEt
enquanto que os derivados catequínicos e taninos permaneceram na fase aquosa.
A Figura 5 mostra o esquema de obtenção dos extratos de B. intermedia A.Juss. e
Byrsonima crassa Niedenzu.
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
51
Figura 5. Fluxograma para a obtenção dos extratos de B.crassa (Bc) e B.intermedia (Bi).
2,0 Kg
folhas de Bc e Bi
Extração por maceração
em CHCl
3
ECHCl
3
TORTA
Extração com
MeOH
EMeOH
TORTA
Extração com
MeOH/H
2
O 80:20
v/v
EMeOH 80%
TORTA
Material e Métodos
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52
3.2.3. Obtenção dos compostos isolados a partir da fração acetato de etila do extrato
metanólico de B.crassa Niedenzu
A porção AcOEt (4,30g) foi dissolvida em 15 mL de MeOH e submetida à
centrifugação. O sobrenadante (4,1 g) foi fracionado em coluna de Sephadex LH-20 (57 cm X
3,0 cm d.i.) empregando como eluente metanol. Obtiveram-se 183 frações de 20 mL cada, as
quais foram reunidas em 26 grupos de frações após análises cromatográficas por CCD
(Apêndice A).
A purificação de Fr. 50-60 (112mg) em coluna de sílica gel (18 cm x 1,0 cm d.i.),
empregando como FM CHCl
3
/MeOH 75:25 (v/v) resultou no isolamento dos compostos ácido
gálico e galato de metila, confirmados por RMN e CCD (revelação com anisaldeído
sulfúrico). Purificação da Fr. 136-141 (95 mg) em coluna de celulose utilizando-se como
eluente a mistura de CHCl
3
/MeOH 80:20 (v/v) permitiu o isolamento da amentoflavona
(4,0mg). Análise cromatográfica por CCD e revelação com NP/PEG mostraram mancha de
coloração amarelo-ouro indicando um flavonóide. Essa substância também foi confirmada
por MS e RMN. O fracionamento sucessivo de Fr. 86-87 (122mg) em coluna de celulose e
sílica gel resultou no isolamento uma mistura de compostos. Esta mistura quando revelada em
anisaldeído sulfúrico produzia uma única mancha de vermelho intenso. Por RMN, detectou-
se a presença de (+)-catequina e (-)-epicatequina. Após o fracionamento de Fr. 86-87 (54mg),
como citado anteriormente, obteve-se um composto cuja análise cromatográfica por CCD e
revelação em NP/PEG indicou um flavonóide. As análises por RMN revelaram a presença de
quercetina-3-O-β-D-galactopiranosídeo. Analisando-se Fr. 93-95 (69mg) era possível
observar a presença de um sólido amarelo. Assim, adicionou-se metanol e centrifugou-se. A
análise por CCD do sólido centrifugado apresentou uma mancha alaranjada após revelação
com NP/PEG, coloração característica de flavonóides. A análise por RMN e outras
Material e Métodos
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53
metodologias permitiu identificar o composto como sendo de quercetina-3-O-α-L-
arabinopiranosídeo. A Figura 6 mostra o esquema para obtenção das frações e compostos
isolados do extrato metanólico das folhas de B.crassa Niedenzu.
Figura 6. Representação esquemática para a obtenção das frações e compostos isolados do
extrato metanólico das folhas de Byrsonima crassa Niedenzu.
Extrato
metanólico
seco
Fração
Aquosa
Fração
Acetato
Coluna de
celulose/CCD/MS/RMN
Sílica gel/ CC/RMN
HPLC/UV
Ressuspensão em água, partição
com a mistura acetato de etila e
água (1:1 v/v)
Ácido Gálico
Galato de Metila
Quercetina -O- α- D -
arabinopiranosídeo
Quercetina- 3-O-β-D-
galactopiranosídeo
(+)-catequina
(-)-epicatequina
Amentoflavona
Coluna de
celulose/CCD/MS/RMN
Catequinas
Taninos
saponinas
Material e Métodos
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54
3.3. Teste de Ames
3.3.1. Extratos, frações e compostos isolados
Os extratos, frações e compostos isolados foram inicialmente dissolvidos em DMSO,
de acordo com o limite de solubilidade de cada um. As concentrações empregadas variaram
entre 0,6 - 33,5 mg/placa para os extratos (metanólico, metanol/água e clorofórmico) de
B.crassa; 0,4 - 8,82 mg/placa para as frações (acetato de etila e aquosa) de B.crassa; 0,06 –
1,31 para os compostos isolados (quercetina-3-O-β-D-galactopiranosídeo, quercetina-3-O-α-
L-arabinopiranosídeo, amentoflavona, catequina e galato de metila) de B.crassa e 0,17 - 13,50
mg/placa para os extratos (metanólico, metanol/água e clorofórmico) de B.intermedia. As
concentrações foram padronizadas em ensaios preliminares de toxicidade. A toxicidade era
evidenciada pela redução no número de colônias revertentes e alteração do “background”.
3.3.2. Linhagens de Salmonella typhimurium
Foram utilizadas as linhagens TA98, TA97a, TA100 e TA102 de Salmonella
typhimurium, gentilmente cedidas pelo Dr. Bruce Ames, da Universidade Berkeley,
Califórnia, USA. A cepa TA98 apresenta mutação no gene D (hisD3052), e detecta
compostos mutagênicos que deslocam o quadro de leitura do DNA. A cepa TA100 apresenta
mutação his G46, e detecta agentes que causam substituições, principalmente em pares G-C.
A cepa TA102 contém a mutação no gene hisG, detectando agentes químicos e radiações,
além de agentes cross-link, como a mitomicina C. A cepa TA97a também detecta mutágenos
do tipo frameshift, apresentando mutação no gene hisD6610 (Maron & Ames, 1983).
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
55
3.3.3. Manutenção e estoque das cepas, verificação das características genéticas
As cepas foram estocadas em tubos para congelamento (1,5mL) a –70ºC, para
manutenção das características genéticas. Para cada 0,9mL de cultura, foram acrescidos
0,1mL de DMSO, substância crioprotetora.
As características genéticas das cepas foram verificadas antes da estocagem, de acordo
com as metodologias de Maron & Ames, (1983).
3.3.4. Preparo dos inóculos de S. typhimurium
Com alça de inoculação, pequena quantidade de cultura estoque foi semeada em 30
mL de caldo nutriente (Oxoid nº2), incubado a 37ºC por 12-16hs, com agitação de 160 g, de
modo a obter densidade de 1-2 x10
9
bactérias/mL.
3.3.5. Meios de cultura
Os meios foram preparados de acordo com Maron & Ames (1983).
Foi utilizado Agar mínimo glicosado (20g de glicose, 15 g de Bacto-agar, 950mL de
água destilada), acrescido de meio Vogel Bonner “E” 50x concentrado (10g de sulfato de
magnésio, 100g de ácido cítrico, 175g de fosfato de sódio e amônio, 500g de fosfato de
potássio dibásico, 670mL de água destilada), na proporção de 980/20 mL, respectivamente.
O agar de superfície foi composto de 0,5g de cloreto de sódio, 0,6g de Bacto-Agar e
100mL de água destilada, acrescido de 10mL de solução de L-histidina 0,096g/mL (Sigma) e
D-biotina 0,123mg/mL (Sigma).
Os meios foram preparados e esterilizados em autoclave a 121ºC por 15 min.
Material e Métodos
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56
3.3.6. Preparo da mistura S9
Foi utilizada a fração microssomal S9 de fígado de ratos induzidos com arocloror
1254, um indutor de enzimas (MOLTOX, USA). Esta fração revela se o agente teste precisa
ser metabolizado para se tornar mutagênico. À fração liofilizada foram acrescidas soluções de
cloreto de Mg 0,4M, cloreto de K 0,4 M, glicose-6P 1M, beta-NADP 0,1M, tampão fosfato
0,2M e água destilada, todos mantidos em gelo durante o experimento.
3.3.7. Controles
O controle negativo foi feito com o solvente dos extratos vegetais (DMSO). Os
controles positivos, para confirmação da reversão, foram 4-nitrofenilenodiamina (NPD) para
TA98 e TA97a, azida sódica para TA100 e mitomicina C para TA102. Nos ensaios com
ativação metabólica, foram usados 2-antramine para TA98, TA97a e TA100 e 2-
aminofluoreno para TA102.
3.3.8. Ensaios de mutagenicidade
Foi usada a metodologia de pré-incubação, com e sem ativação metabólica (Figura 8),
desenvolvida por Maron e Ames (1983). Diferentes concentrações dos extratos vegetais foram
misturadas a 0,1mL de cultura de bactérias e 0,5 mL de tampão fosfato pH 7,4 (ou 0,5 mL da
mistura S9 em ensaios com ativação metabólica) e incubadas por 20-30 minutos a 37° C.
Após esse tempo, adicionou-se 2mL de agar superfície (“top agar”) suplementado com traços
de histidina e biotina, homogeneizou-se levemente e plaqueiou-se em meio mínimo
glicosado. Após solidificação do “top-agar”, as placas foram incubadas por 48 horas, a 37 °C.
Após esse período, foi realizada a contagem do número de colônias revertentes por placa. O
Material e Métodos
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57
ensaio foi realizado em triplicata. A Figura 7 mostra o esquema do ensaio de mutagenicidade,
com e sem ativação metabólica.
Figura 7. Teste de Ames (esquema) – A) sem ativação metabólica; B) com ativação
metabólica.
3.4. Ensaios Imunológicos
3.4.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos de 6 semanas, pesando entre 18 e 25
gramas, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP,
situado na cidade de Araraquara. Estes foram mantidos em gaiolas de policarbonato, com
Linhagem
Tampão
DMSO(C-)
Mutágeno (C+)
Linhagem
DMSO(C-)
Mutágeno (C+)
Mistura S9
Incubação
30’ 37°C
Incubação
30’ 37°C
MEIO Agar mínimo
Glicosado
MEIO Agar mínimo
Glicosado
Incubação 48 horas
Incubação 48 horas
Top Agar com
Traços de His e Bio
Leitura
Contagem de colônias revertentes
Top Agar com
Traços de His e Bio
A)
B)
Substância teste
Substância teste
Homogeneização
Leitura
Contagem de colônias revertentes
Material e Métodos
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58
água e ração (Purina) “ad libitum” em local climatizado (23
0
± 2
0
C, 56 + 2% de umidade
relativa do ar), com controle de claro e escuro a cada período de 12 horas.
3.4.2. Obtenção de Células Peritoneais (PEC)
Os camundongos foram inoculados, intraperitonealmente, com 3 mL de solução de
tioglicolato de sódio (Difco) a 3%. Após três dias, os animais foram sacrificados em câmara
de vidro contendo clorofórmio. Após a morte e exposição do peritôneo, abrindo-se a pele do
animal, injetou-se 5,0 mL de tampão fosfato estéril (PBS pH 7,2), com seringa e agulha
estéreis, realizando-se leve massagem manual. As células foram coletadas do peritôneo com a
mesma seringa e agulha e acondicionadas em um tubo estéril (Corning, Inc), sendo mantidas
em banho de gelo. Para o preparo da suspensão celular, centrifugou-se três vezes a 200 g
durante 5 minutos em centrífuga (Fanem) à temperatura ambiente. As células sedimentadas
foram resuspensas em meio de cultura RPMI – 1640 (Sigma) suplementado com 5% de soro
fetal bovino, 1U/mL de estreptomicina, 1U/mL de penicilina e 5x10
-2
M β-mercaptoetanol e
assim designado como RPMI completo (RPMI–1640–C). O número de células foi
determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco, Germany),
utilizando-se corante vital líquido de Lázarus, sendo ajustado para a concentração de 5x10
6
células/mL em meio RPMI completo. As células assim ajustadas foram incubadas em estufa a
37
0
C, com tensão constante 5 % CO
2
(Forma Scientific) para formação do tapete celular, ou
seja, cultura de macrófagos peritoneais. A Figura 8 mostra o esquema de obtenção das PEC.
Material e Métodos
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59
Figura 8. Esquema de obtenção das células de exudato peritoneal de camundongos Swiss
(PEC) para os ensaios imunológicos.
3.4.3. Ensaios de citotoxicidade
Os ensaios de viabilidade celular foram realizados no Laboratório de Microbiologia
Clínica do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
UNESP, sob a coordenação da Profª.Drª. Maria Stella Gonçalves Raddi. A metodologia
empregada foi a do Vermelho Neutro (BORENFREUND & PUERNER, 1985; BALBICH &
& BORENFREUND, 1998). O potencial tóxico foi avaliado após o contato por 18h de
100µL de cultura de macrófagos peritoneais a 5x10
6
células/m|L com 100µL de cada extrato e
fração de B.crassa e B.intermedia nas concentrações 15, 31, 62, 125, 200, 250, 280, 350, 400
e 500 µg/mL. O meio livre de células foi desprezado e 100µL de uma solução de vermelho
Camundongos machos
25-30 gramas, 6-8 semanas
-Inóculo 3 mL de tioglicolato de sódio (3%)
IP;
-72 h de estímulo;
-sacrifício;
-lavagem peritonial com 5mL (PBS) e coleta
celular;
Lavagem com PBS e
centrifugação (3x, 400 rpm, 5’)
RPMI completo
Cálculo para ajuste celular,
incluindo diluição em Líquido de
Lázarus, contagem em Câmara de
Newbauer e complementação do
volume com meio RPMI completo...
Suspensão celular
Ensaios Biológicos...
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
60
neutro (VN) 0,05 mg/mL diluído em RPMI-1640 foram adicionados à placa de cultura e
incubados por 3 h em estufa (Forma Scientific, Inc.), a 37°C e com tensão constante de CO
2
a
5%. Após lavagem com PBS, as células viáveis foram coradas e solubilizadas com 100µL de
uma solução de ácido acético e etanol. A leitura da absorbância foi feita a 540 nm, com um
filtro de referência de 620 nm. Os ensaios de citotoxicidade do DMSO também foram
realizados, utilizando porcentagens do solvente em meio RPMI-1640, variando de 0-10 %.
Verificou-se que a viabilidade celular foi satisfatória até uma concentração de 2% de DMSO,
com uma viabilidade celular de 99,89%. As preparações dos extratos e frações de B.crassa e
B.intermedia utilizadas nos ensaios imunológicos não possuíram mais que 2% de DMSO.
3.4.4. Determinação da liberação de Óxido Nítrico
A suspensão celular de macrófagos peritoneais de camundongos ajustada a 5x10
6
cels/mL e os extratos vegetais foram diluídos em meio RPMI completo nas maiores
concentrações não tóxicas, determinadas nos ensaios de citotoxicidade. Foram utilizados
100µl da suspensão celular/cavidade e 100µl da diluição de cada extrato em placa estéril de 96
cavidades planas. Em outras cavidades foram acondicionados 100µl de LPS de E.coli
sorotipo 0111: B4 a 10µg/mL em meio RPMI-1640C, como controle positivo ou 100µl de
meio sem a presença de extrato, como controle negativo. Incubou-se a placa em estufa a 37ºC,
com tensão constante de CO2 a 5% por 24 horas. Após esse período, foram transferidos 50µl
para nova placa e adicionados, em cada cavidade, mais 50µl de reagente de Griess, composto
de N-(1-naftil)-etilenodiamino (Merck), sulfonilamida (Merck) e ácido ortofosfórico
(Mallinckrodt Chemical) (GREEN et al., 1982). Após 10 min. de incubação à temperatura
ambiente, a leitura foi feita em espectrofotômetro UV/Visível (Multiskan Ascent Labsystem
Research Tech. Div., Helsinki, Finland), com filtro de 540nm. As concentrações de nitrito
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
61
foram obtidas a partir de uma curva padrão prévia, preparada com concentrações µmolares
conhecidas de NaNO
2
. A Figura 9 mostra o esquema do ensaio de determinação de NO.
Figura 9. Esquema do ensaio de liberação de NO por macrófagos peritoneais de
camundongos Swiss.
3.4.5. Determinação da liberação do Fator de Necrose Tumoral (TNF-alfa)
3.4.5.1. Obtenção do sobrenadante
A suspensão celular de 5x10
6
células/mL como previamente descrita, foi incubada
com a concentração ideal de cada extrato e fração. Os controles foram os mesmos utilizados
Suspensão celular
Placa de fundo plano de 96 cavidades
-Extratos (concentração
de trabalho);
-LPS (C+):1ug/mL
-RPMI (C-)
Incubação estufa 37ºC
, CO2 constante a 5%, 24 hs
50 uL do sobrenadante...
Solução de GRIESS...
Leitura da densidade ótica em
Espectrofotômetro UV/visível (540 nm)...
100
µL
100µL
Placa de fundo plano de 96 cavidades
Incubação a temperatura ambiente por 10’
Obs: a calibração do
equipamento é previamente
determinada com
concentrações conhecidas
de nitrito de sódio, em
RPMI, estabelecendo-se a
curva padrão de calibração...
Expressão em micromols/conc.celular/cavidade
Material e Métodos
Cássia Regina Primila Cardoso
62
na determinação de NO. Após incubação de 24 horas em estufa a 37
°
C, com tensão constante
5% CO
2
, a placa foi centrifugada a 4ºC por 20 min a 1000 g e os sobrenadantes estocados em
freezer a –20°C até o momento da determinação do TNF-alfa. A Figura 10 mostra o esquema
para a obtenção dos sobrenadantes das PEC na presença dos extratos e frações.
3.4.5.2. Bioensaio para TNF-alfa
O ensaio baseia-se na capacidade do TNF-alfa em lisar células tumorais (CARSWELL
et al., 1975). As células utilizadas foram da linhagem L929, cultivadas em meio Eagle, com
7,5% de soro fetal bovino (Cultilab) inativado.
As células L929 foram contadas em câmara de Neubauer e ajustadas a uma densidade
de 4x10
5
cels/mL de meio RPMI –1640C e acondicionadas em uma placa (100 µL/cavidade) e
incubadas 18 h a 37ºC, em tensão constante de CO
2
5%. Após incubação, 100µl dos
sobrenadantes das culturas de macrófagos incubados com os extratos, obtidos anteriormente,
foram adicionados em cada cavidade e novamente incubados por 24 horas, nas mesmas
condições anteriores. Os sobrenadantes foram então desprezados e as células coradas com
cristal violeta (0,2% em metanol 20%), por 30 min em temperatura ambiente. A seguir, foi
adicionado lauril-sulfato de sódio para solubilizar as células coradas e a absorbância de cada
orifício foi obtida a 495nm em leitor de ELISA (Multiskan Ascent Labsystem). A Figura 11
mostra o esquema do bioensaio para TNF-α.
Material e Métodos
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63
Figura 10. Esquema de obtenção dos sobrenadantes das culturas de PEC em presença dos
extratos e frações de B.crassa e B.intermedia.
Suspensão celular
50uL, em placa de fundo plano de 96 cavidades,
incubados por 1h, para a aderência celular (37ºC,
CO2 constante a 5%.)
50u
PLACA
Incubação estufa 37ºC, CO2 constante a 5%, 24 h
PLACA
Centrifugação em centrífuga refrigerada a 4 graus, 1000g,
10’
Estoque em freezer a -20ºC até o
ensaio...
-Extratos (concentração de
trabalho);
-LPS (C+):1ug/mL
-RPMI (C-)
SOBRENADANTE
Material e Métodos
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64
Figura 11. Esquema do ensaio de liberação de TNF-α por macrófagos peritoneais de
camundongos Swiss.
3.5. Análise Estatística
3.5.1. Teste de Ames
Os dados foram analisados com o programa estatístico SALANAL, elaborado e
gentilmente cedido pelo Dr. L.Myers, do Research Triangule Institute, Carolina do Norte,
USA, através da Dra. Maria Inês Sato (CETESB). Este programa permite avaliar o efeito
dose-resposta pelo cálculo da variância (ANOVA-Test F) entre as médias do controle
Células da linhagem L929
Meio Eagle com soro fetal bovino inativado(7,5%)
Repique*(30 h)
Contagem em Newbauer, ajuste com meio RPMI
Placa (100uL)
Incubação 18h, 37ºC, CO2 constante a 5%
Formação de “tapete celular”
-Extratos (concentração de
trabalho);
-Actinomicina D (1ug/mL)
Incubação 24h, 37ºC, CO2 constante a 5%
Plac
Sobrenadante
Células aderidas
Violeta cristal 0,2% em
metanol a 20%
Lauril sulfato 1%
30’ a temperatura ambiente
“Solubilização das células”
Leitura em leitor de ELISA a 495nm
Obs: a calibração do equipamento é
previamente determinada com
concentrações conhecidas de TNF
alfa recombinante, estabelecendo-se
a curva padrão de calibração...
Material e Métodos
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65
negativo e os testes, seguindo uma regressão linear. Foram também calculadas as razões de
mutagenicidade (RM), que são a média do número de revertentes do teste
(espontâneos+induzidos) dividida pela média de revertentes do controle negativo. O teste foi
considerado positivo quando a RM foi maior ou igual a dois em pelo menos duas
concentrações e houve um efeito dose-resposta significativo. O teste foi negativo quando não
induziu aumento significativo de revertentes e suas RM foram menores que dois.
3.5.2. Ensaios imunológicos
A análise estatística foi realizada através de análise de variância (ANOVA), utilizando
o teste Tukey, através do programa Graph Pad Instat. O nível de significância de 5% foi
considerado significativo. Não existem, na literatura, até o momento, resultados que
evidenciem valores exatos para referenciais normais para NO e TNF-alfa. Dessa forma, são
empregados parâmetros comparativos entre os valores detectados na amostra e os valores
detectados no controle positivo LPS. De maneira geral, foram consideradas elevadas as
concentrações de NO e TNF-alfa maiores que 50% daquela liberada no controle positivo
(LPS).
IV. Resultados
IV. ResultadosIV. Resultados
IV. Resultados
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
67
4.1. Teste de Ames com extratos, frações e compostos isolados de B.crassa
Niedenzu
Tabela 1 mostra os resultados obtidos com os extratos de B.crassa. O extrato
metanólico apresentou atividade mutagênica positiva nos ensaios com a linhagem TA98 sem
ativação metabólica, ou seja, apresentou valores dose-resposta significativos e valores de RM
maiores que dois para as duas concentrações. Após a metabolização, a dose-resposta ainda foi
significativa em algumas concentrações, porém os valores de RM foram menores ou próximos
a dois. Esses resultados demonstram que a atividade mutagênica desse extrato é reduzida pela
metabolização das enzimas hepáticas. Com a linhagem TA100, também houve dose-resposta
significativa em ausência de metabolização, porém, com valores de RM menores que dois.
Não foram observados resultados positivos nas demais linhagens testadas, com ou sem
ativação metabólica.
O extrato hidroalcoólico apresentou indícios de mutagenicidade apenas com a
linhagem TA98 sem metabolização, sendo negativos os demais resultados. O extrato
clorofórmico apresentou resultados negativos com todas as linhagens, com ou sem ativação
metabólica.
Pelo fato de somente o extrato metanólico ter induzido mutagenicidade positiva,
procedeu-se a avaliação das frações aquosa e acetato de etila, obtidas a partir desse extrato. A
Tabela 2 mostra os resultados obtidos. Não foram observados resultados positivos quanto à
atividade mutagênica, porém, a fração acetato apresentou valores de RM de até 1,7 e efeito
dose-resposta significativo em todas as concentrações, sugerindo que compostos responsáveis
pela mutagenicidade estejam presentes nessa fração.
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
68
Os resultados obtidos com os compostos catequina, galato de metila, quercetina
galactopiranosídeo, quercetina arabinopiranosídeo e amentoflavona, extraídos da fração
acetato do extrato metanólico de B.crassa testados com a linhagem TA98 estão na Tabela 3. O
ensaio foi realizado com a quercetina pura (Sigma), com a finalidade de compararmos seu
potencial mutagênico com as quercetinas ligadas a açúcares, presentes na fração. Verificamos
que, nas maiores concentrações testadas, a quercetina arabinopiranosídeo apresentou fortes
indícios de mutagenicidade, com significância dose-resposta e RM próximos a dois sem
ativação metabólica. Após a metabolização, a atividade mutagênica foi reduzida,
permanecendo a significância dose-resposta nas duas maiores concentrações testadas. A
quercetina galactopiranosídeo não apresentou atividade mutagênica nas concentrações
testadas, que foram inferiores àquelas testadas com a quercetina arabinopiranosídeo, devido à
pequena quantidade de composto isolado disponível para os testes. Já a amentoflavona
apresentou atividade mutagênica em duas concentrações testadas, com sinais de toxicidade na
concentração 1,12 mg/placa. Após a metabolização, permaneceu a atividade mutagênica, com
pequena redução no número de colônias revertentes nas mesmas concentrações testadas sem
S9. O indício de toxicidade não foi evidenciado na concentração 1,12 mg/placa.
4.2. Teste de Ames com extratos de B. intermedia A.Juss.
Os resultados do extrato metanólico dessa espécie apresentaram efeito dose-resposta
significativo na maioria das concentrações testadas apenas com a linhagem TA98, com e sem
ativação metabólica. Nas maiores concentrações testadas com essa linhagem, os valores de
RM chegaram a 1,7, o que evidencia indícios de mutagenicidade. Com a linhagem TA100,
também se verificou efeito dose resposta significativo e valores de RM até 1,6, evidenciando
indícios de mutagenicidade apenas nos testes sem metabolização. Os extratos hidroalcoólico
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
69
e clorofórmico não apresentaram atividade mutagênica em todas as linhagens testadas. A
Tabela 4 mostra os resultados dos ensaios de mutagenicidade obtidos com os extratos de
B.intermedia.
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
70
Tabela 1. Atividade mutagênica expressa pela média ± desvio padrão do número de revertentes/placa nas linhagens bacterianas TA98, TA100, TA97a e TA102
expostas aos extratos de Byrsonima crassa, em várias concentrações, com metabolização (+S9) ou sem metabolização (-S9).
Tratamentos
(mg/placa)
Revertentes/placa com linhagens de Salmonella typhimurium
TA98 TA97a TA100 TA102
- S9
a
+S9
b
- S9
a
+S9
b
- S9
c
+S9
b
- S9
c
+S9
d
MeOH
0 28 ± 2,3 40± 8,6 125 ± 3,1 133 ± 1,2 195 ± 14,1 194±1,0 249 ± 42,0 248± 12,6
1,2 35 ± 4,6 (1,2) - 125 ± 1,2 (1,0) 131± 1,2 (0,9) 217 ± 26,1 (1,1) - 199 ± 15,2 (0,8) 232± 9,5 (0,9)
2,5 36 ± 4,4 (1,3) 43± 9,0 (1,1) 125 ± 3,2 (1,0) 130 ± 2,0 (0,9) 206 ± 18,0 (1,1) 189± 0,6 (0,9) 188 ± 10,0 (0,8) 234± 5,9 (0,9)
5,3 33 ± 3,2 (1,2) - 126 ± 2,1 (1,0) 134± 0,6 (1,0) 236 ± 14,6 (1,2) 192± 1,2 (0,9) 197 ± 4,2 (0,8) 243± 17,4 (1,0)
7,5 - 61± 3,5* (1,5) 118 ± 2,3 (0,9) 133± 1,0 (1,0) - 195± 0,6 (1,0) -
10,6 50 ± 2,7* (1,8) - - - 320 ±12,0* (1,6) 198± 2,0 (1,0) 232 ± 5,5 (0,9) 239± 6,0 (1,0)
15,9 61 ± 4,2* (2,2) 61± 3,5* (1,5) - - 342 ±17,5* (1,8) 198± 1,2 (1,0) 276 ± 14,2 (1,1) 263± 10,1 (1,2)
21,2 64 ± 3,1* (2,3) 76± 11,1* (1,9) - - 347 ±17,0* (1,8) 232± 1,2 (1,2) 292 ± 10,0 (1,2) 286± 7,8 (1,2)
MeOH/H
2
O
0 48± 8,4 53 ± 2,3 125 ± 3,1 133 ± 1,2 187 ± 22,9 194±1,0 249± 42,0 248± 12,6
0,6 - - 125 ± 0,6 (1,0) 131± 4,6 (0,9) 197± 4,1(1,0) 187± 6 1 (0,9) 238 ± 26,4 (0,9) 234± 7,4 (0,9)
1,2 - - 127± 1,2 (1,0) 133± 1,0 (1,0) 174 ± 5,5(0,9) 182± 9,2 (0,9) 240 ± 10,1 (0,9) 240± 6,7 (1,0)
2,5 51± 3,1 (1,1) 52 ± 6,1 (0,9) 128± 2,0 (1,0) 129± 1,2 (0,9) 172 ± 2,1(0,9) 185± 8,3 (0,9) - 231± 7,0 (0,9)
4,2 - 54 ± 3,6 (1,0) - 130± 2,0 (0,9) - 180± 2,5 (0,9) 246 ± 3,6 (1,0) -
6,3 - - 120 ± 2,3 (0,9) - 175 ± 12,1(0,9) - 236 ± 10,9 (0,9) 242± 17,6 (1,0)
8,4 71± 2,0* (1,5) 54 ± 3,5 (1,0) - 133± 1,2 (1,0) 170 ± 20,5(0,9) 184± 1,1(0,9) - -
13,5 - - - - - - 213 ± 16,8 (0,9) 259± 8,2 (1,0)
16,7 74± 3,5* (1,5) 56 ± 2,9 (1,1) - - - - - -
25,1 83± 6,1* (1,7) 56 ± 3,2 (1,1) - - - - - -
33,5 83± 6,4* (1,7) 57 ± 6,0 (1,1) - - - - - -
CHCl
3
0 28 ± 2,3 40± 8,6 125 ± 3,1 133 ± 1,2 155± 4,3 194±1.0 249 ± 42,0 248± 12,6
0,2 - - 123 ± 1,2 (1,0) 127± 1,2 (0,9) - - - -
0,4 - - 119 ± 1,2 (0,9) 129± 0,6 (0,9) - - - -
0,7 32 ± 1,2 (1,1) - 118 ± 2,0 (0,9) 134± 1,7 (1,0) 161 ± 1,5 (1,0) 198± 1,0 (1,0) 260 ± 30,7 (1,0) 246± 2,7 (1,0)
1,5 32 ± 2,0 (1,1) 32± 6,7 (0,8) 117 ± 1,2 (0,9) 135±1,0 (1,0) 162 ± 7,1 (1,1) 195±15,6 (1,0) 213 ± 20,9 (0,9) 250± 14,6 (1,0)
3,0 33 ± 3,0 (1,2) - - 135± 1,0 (1,0) 164 ± 9,6 (1,1) 196± 9,2 (1,0) 240 ± 34,2 (1,0) 264± 8,0 (1,1)
6,0 33 ± 2,3 (1,2) 36± 4,2 (0,9) - - 163 ± 2,1 (1,1) 204± 6,0 (1,0) 283 ± 14,0 (1,1) 265± 2,0 (1,1)
9,0 34 ± 2,1 (1,2) 31± 8,0 (0,8) - - 168 ± 4,7 (1,1) 216± 5,3 (1,1) 301 ± 12,8 (1,2) 270± 7,6 (1,1)
12,0 34 ± 2,1 (1,2) 34± 2,7 (0,9) - - 165 ± 6,1 (1,1) - 286 ± 15,7 (1,2) 267± 4,4 (1,1)
Controle + 920±8.6 817±1,8 812±1,7 914±9,5 951±7,8 586±6,7 1021±2,1 1129±6,0
MeOH (Extrato metanólico); CHCl
3
(Extrato clorofórmico); MeOH/H
2
O (Extrato metanol/água); 0=controle negativo (DMSO=100 µl/placa); Controle + → -S9: 4-nitro-o-fenilenodiamina (5 µ
g/placa) para TA98
e TA97a; Azida sódica (1.25 µg/placa) para TA100 e mitomicina (0.5 µg/placa) para TA102. +S9 → 2-antramine (0.125 µg/placa) foi usado em todas as linhagens. * P < 0.05 (AN
OVA). Os valores em
parênteses=razões de mutagenicidade.
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
71
Tabela 2. Atividade mutagênica expressa pela média ± desvio padrão do número de revertentes/placa nas linhagens bacterianas TA98, TA100, TA97a e TA102
expostas às frações aquosa e acetato de etila de Byrsonima crassa, em várias concentrações, com metabolização (+S9) ou sem metabolização (-S9).
0= controle negativo (DMSO – 100 µL/placa). Controle+: controle Positivo:
a
NPD (4-nitro-o-fenilenodiamina - 10.0 µg/placa);
b
2-Antramine (1.25 µg/placa);
c
Azida
sódica (1.25 µg/placa);
d
Mitomicina (0.5 µg/placa). *P < 0.05 (ANOVA). Os valores em parênteses+razões de mutagenicidade.
Tratamentos
mg/placa
Fração aquosa
Revertentes/placa em linhagens de Salmonella thypimurium
TA98 TA97a TA100 TA102
- S9
a
+S9
b
- S9
a
+S9
b
- S9
c
+S9
b
- S9
d
+S9
b
0 22 ± 1,0 46±1.0 125 ± 3,1 133 ± 1,2 147±5,2 190 ± 2,0 276±21,8 272±2,0
0,54 24 ± 0,6(1,1) - 123±1,0(0,9) - - 195 ± 1,0(1,0) 285±5,2(1,0) -
1,11 25 ± 0,6(1,1) 42±1,7(0,9) 127±1,2(1,0) 129±0,6(0,9) 165±2,7(1,1) 198 ± 1,0(1,0) 286±1,5(1,0) 270±2,0(0,9)
2,22 25 ± 0,6(1,1) 42±0,6(0,9) 119±.0,6(0,9) 132±2,1(1,0) 163±2,7(1,1) 202 ± 1,0(1,1) 283±8,5(1,0) 274±1,0(1,0)
4,41 26 ± 1,0(1,2) 44±1,7(1,0) 123±1,0(0,9) 133±4,2(1,0) 162±3,5(1,1) 211 ± 1,0(1,1) 292±11,0(1,1) 277±3,1(1,0)
8,82 27 ± 1,2(1,2) 45±1,0(1,0) 125±1,2(1,0) 131±1,2(0,9) 159±1,2(1,1) 212 ± 1,0(1,1) 306±19,1(1,1) 277±1,2(1,0)
Controle+ 328±6,0 238±1,5 812±1,7 914±9,5 1269±10,8 673±5,0 1168±6,6 1631±2,6
Fração acetato
0 22 ± 1,0 46±1,0 125 ± 3,1 133 ± 1,2 147±5,2 190 ± 2,0 257 ±13,9 272±2,0
0,42 27 ± 0,6(1,2)* - 121±0,6(0,9) - - 199 ± 1,0(1,1) 255 ±21,0(1,0) -
0,84 32 ± 2,5(1,5)* 44±1,2(1,0) 122±0,6(0,9) 127±0,6(0,9) 181±8,7(1,2) 213 ± 1,0(1,1) 250 ±12,6(1,0) 268±5,5(0,9)
1,71 34 ± 1,0(1,6)* 45±1,2(1,0) 124±0,6(1,0) 129±1,2(0,9) 189±2,0(1,3) 219 ± 1,0(1,2) 262 ±26,3(1,0) 267±3,1(0,9)
3,42 34 ± 1,5(1,6)* 47±1,0(1,0) 123±1,2(0,9) 133±1,2(1,0) 177±9,5(1,2) 220 ± 1,0(1,2) 273 ±15,7(1,1) 275±2,3(1,0)
6,81 37 ± 1,2(1,7)* 49±0,6(1,2) 127±1,2(1,0) 131±0,0(1,0) 181±9,5(1,2) 220 ± 0,5(1,2) 270 ±7,0(1,1) 277±1,2(1,0)
Controle+ 328±6,0 238±1,5 812±1,7 914±9,5 1269±10,8 673±5,0 1168±6,6 1631±2,6
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
72
Tabela 3. Atividade mutagênica expressa pela média ± desvio padrão do número de revertentes/placa na
linhagem bacteriana TA98 exposta aos compostos isolados da fração acetato do extrato metanólico de Byrsonima
crassa, em várias concentrações, com metabolização (+S9) e sem metabolização (-S9).
Tratamento(mg/placa) TA98 (-S9) TA98 (+S9)
Controle negativo
37 ± 5,6
28 ± 0,7
Catequina
0,04 35 ± 2,5 (0,9) -
0,16 49 ± 0,6 (1,3) 26 ± 4,2 (0,9)
0,48 41 ± 5,2 (1,1) 25 ± 1,4 (0,9)
0,79 - 27 ± 3,5 (0,9)
1,06 51 ± 6,6 (1,4) -
Galato de Metila
0,08 49 ± 8,5 (1,3) 25 ± 1,4 (0,9)
0,25 47 ± 8,9 (1,3) 31 ± 0,7 (1,1)
0,42 54 ± 4,0* (1,5) 34 ± 1,6 (1,2)
1,06 59 ± 3,0* (1,6) -
Quercetina (Sigma)
0,05 1316 ± 121,3**(35,6) 1173 ± 60,8**(41,9)
0,15 1292 ± 49,7**(34,9) 1216 ± 178,9**(43,4)
0,30 1592 ± 42,7**(43,0) 1367 ± 72,1**(48,8)
0,50 1958 ± 94,7**(52,9) 1242 ± 76,3**(44,4)
Quercetina arabinopiranosídeo
0,06 44 ± 3,5 (1,2) 29 ± 2,1(1,0)
0,11 42 ± 3,1 (1,1) 31 ± 2,1(1,1)
0,22
0,44
0,88
1,16
54 ± 4,0 *(1,5)
56±3,5 *(1,5)
65±3,1**(1,8)
71±1,2**(1,9)
30 ± 6,3 (1,1)
27±3,5 (0,9)
35±1,2**(1,3)
40±2,0**(1,4)
Quercetina galactopiranosídeo
0,02 43 ± 2,8 (1,2) -
0,06 44 ± 4,0 (1,2) 30 ± 5,6 (1,1)
0,07 48 ± 3,5 (1,3) 29 ± 2,8 (1,0)
0,10 46 ± 6,4 (1,2) 30 ± 2,8 (1,1)
Amentoflavona
0,28 62 ± 3,4* (1,7) 49 ± 2,8** (1,8)
0,56 99 ± 12,5** (2,7) 61 ± 0,7**(2,2)
0,84 133 ± 10,4** (3,6) 62 ± 1,4**(2,2)
1,12 70 ± 1,7** (1,9) 77 ± 12,7**(2,8)
Controle positivo
1023 ± 41,3 2552 ± 70,0
Controle positivo: Controle + → -S9: 4-nitro-o-fenilenodiamina (5 µg/placa); +S9 → 2-antramine (0,125 µg/placa). * P
< 0.05
(ANOVA) ** P < 0.01 (ANOVA). Os valores em parênteses=razões de mutagenicidade.
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
73
Tabela 4: Atividade mutagênica dos extratos de Byrsonima intermedia A.Juss. em linhagens de S. typhimurium, em presença (+S9) e ausência (-S9) de ativação metabólica.
MeOH (Extrato metanólico); CHCl
3
(Extrato clorofórmico); MeOH/H
2
O (Extrato metanol/água); 0=controle negativo (DMSO=100 µl/placa); Controle + → -S9: 4-nitro-o-fenilenodiamina (5 µg/placa) para TA98 e
TA97a; Azida sódica (1.25 µg/placa) para TA100 e mitomicina (0.5 µg/placa) para TA102. +S9 → 2-antramine (0.125 µg/placa) foi usado em todas as linhagens. *P < 0.05 (ANOVA). Os valores em
parênteses=razões de mutagenicidade
Tratamento
(mg/placa)
Revertentes/placa em linhagens de Salmonella typhimurium
TA98 TA97a TA100 TA102
- S9 +S9 - S9 +S9 - S9 +S9 - S9 +S9
MeOH
0 27 ± 2,3 42± 3,2 125 ± 3,1 133 ± 1,2 197 ± 3,6 194±1,5 249 ± 42,0 248 ± 12,6
0,19 - - 117 ± 0,6 (0,9) 129 ± 1,2 (0,9) - - - -
0,56 - - 121 ± 0,6 (0,9) 134 ± 2,0 (1,0) - - - -
0,73 36 ± 4,7 (1,3) - 125 ± 1,2 (1,0) 133 ± 1,2 (1,0) 162 ± 8,4 (0,8) 194 ± 1,2(1,0) 210 ± 16,5 (0,8) 230 ± 5,3 (0,9)
1,46 40 ± 4,4* (1,5) 52 ± 5,3 (1,3) 123 ± 1,2 (0,9) - 162 ± 10,2 (0,8) 197 ± 1,2(0,9) 217 ± 31,0 (0,9) 234 ± 13,5 (0,9)
2,93 40 ± 4,4* (1,5) 49 ± 3,6 (1,2) 127 ± 3,1 (1,0) - 236 ± 11,2*(1,2) 210 ± 1,2(1,1) 239 ± 15,3 (0,9) 239 ± 5,9 (0,9)
5,83 43 ± 1,5* (1,6) 57 ± 7,6 (1,4) - 133 ± 0,6 (1,0) 238 ± 11,9*(1,2) 215 ± 3,1(1,1) 268 ± 11,5 (1,1) 262 ± 7,5 (1,1)
8,78 44 ± 2,1* (1,6) 59 ± 1,0*(1,4) - 131 ± 1,2 (0,9) 269 ± 6,7*(1,4) 217 ± 1,2(1,1) 269 ± 26,6(1,1) 261 ± 13,7 (1,1)
11,70 45 ± 4,5* (1,7) 71 ± 7,0*(1,7) - - 308 ± 20,7*(1,6) 224 ± 2,0(1,2) 297 ± 8,7 (1,2) 283 ± 4,0 (1,1)
MeOH/H
2
O
0 27 ± 2,3 42± 3,2 125 ± 3,1 133 ± 1,2 197 ± 3,6 194±1,5 249 ± 42,0 248 ± 12,6
0,22 - - 124 ± 2,0 (0,9) 132± 1,5 (0,9) - - - -
0,43 - - 123 ± 2,9 (0,9) 134± 3,2 (1,0) - - - -
0,84 32 ± 3,5 (1,2) - 126 ± 0,6 (1,0) 135 ± 2,7 (1,0) 173 ± 9,0 (0,9) 192 ± 1,5(1,0) 187 ± 5,7(0,8) 254± 10,0(1,0)
1,28 - - 123 ± 4,4 (0,9) 136 ± 3,6 (1,0) - -
1,69 30 ± 2,0 (1,1) 52± 3,9(1,2) 126 ± 2,1 (1,0) - 190 ± 10,9 (0,9) 195 ± 1,0(1,0) 196 ± 14,3 (0,8) 252± 10,6(1,0)
3,38 31 ± 3,1 (1,2) 54± 0,6(1,3) - - 198 ± 6,2 (1,0) 194± 2,7(1,0) 262 ± 12,7(1,1) 254± 10,2(1,0)
6,25 33 ± 4,5 (1,2) 53± 1,0(1,3) - - 213 ± 7,9 (1,1) 190± 1,5(0,9) 263 ± 18,1 (1,1) 257± 13,1(1,0)
10,13 33 ± 5,6 (1,2) 54± 3,2(1,3) - - 210 ± 7,2 (1,1) 197± 1,2(1,0) 287 ± 17,4(1,1) 266± 7,6(1,1)
13,50 33 ± 4,0 (1,2) 57± 2,7(1,4) - - 210 ± 2,3 (1,1) 195 ± 1,2(1,0) 299 ± 27,4(1,2) 275± 6,1(1,1)
CHCl
3
0 27 ± 2,3 42± 3,2 125 ± 3,1 133 ± 1,2 197 ± 3,6 194±1,5 249 ± 42,0 248 ± 12,6
0,17 - - 117 ± 1,2 (0,8) 136 ± 1,0 (1,0) - - - -
0,68 29 ± 4,3 (1,0) - 120 ± 0,6 (0,9) 131 ± 0,6 (0,9) 183 ± 16,5 (0,9) 189 ± 1,5(0,9) 208 ± 45,9 (0,8) 217± 5,1(0,8)
1,02 - - 123 ± 0,6 (0,9) 137 ± 4,9 (1,1) - - - -
1,35 27 ± 1,2 (1,0) 46 ± 2,0 (1,1) 127 ± 1,0 (1,0) 127 ± 1,2 (0,9) 193 ± 4,5 (1,0) 187 ± 0,6(0,9) 197 ± 11,9 (0,8) 219± 4,3(0,9)
2,70 27 ± 1,2 (1,0) 40 ± 1,5 (0,9) 129 ± 1,7 (1,0) 134 ± 3,1 (1,0) 195 ± 7,8 (1,0) 193 ± 4,6 (0,9) 242 ± 13,0 (1,0) 231± 13,1(0,9)
5,40 29 ± 1,2 (1,0) 47 ± 2,1 (1,1) - - 221 ± 9,1 (1,2) 197 ± 2,3(1,0) 255 ± 36,1(1,0) 242± 4,4(0,9)
8,10 27 ± 4,2 (1,0) 51 ± 4,7 (1,2) - - 220 ± 5,3 (1,1) 199 ± 2,7 (1,0) 276 ± 18,6 (1,1) 239±6,8(0,9)
10,80 29 ± 2,3 (1,0) 51 ± 3,0 (1,2) - - 221 ± 12,0 (1,2) 196 ± 0,6(1,0) 316 ± 13,8 (1,3) 269± 2,7(1,1)
Controle+ 612±5,3 815±1,7 812±1.7 914±9,5 909±1,2 790±7,6 1019±3,1 1131±3,6
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
74
4.3. Ensaios de citotoxicidade
Com base nos resultados obtidos nos ensaios de citotoxicidade, as concentrações
utilizadas nos ensaios biológicos foram as seguintes: extrato metanólico de B.crassa (280
µg/mL), extrato metanol/água (400 µg/mL), extrato clorofórmico (200 µg/mL), fração aquosa
(200 µg/mL) e fração acetato (200 µg/mL), extrato metanólico de B.intermedia (350 µg/mL),
extrato metanol/água (500 µg/mL) e extrato clorofórmico (250 µg/mL).
4.4. Ensaios de Liberação de Óxido Nítrico com extratos e as frações de
B.crassa Niedenzu
De acordo com esses resultados obtidos, verificou-se que todos os extratos induziram
a liberação de NO em níveis reduzidos e que o extrato metanólico de B. crassa foi aquele que
estimulou maior liberação de NO pelos macrófagos. Os ensaios para NO também foram
realizados com as frações aquosa e acetato de etila desse extrato (Figura 12). Verificou-se que
a fração acetato de etila estimulou liberação de NO com significância estatística em relação ao
controle negativo. Com relação ao controle positivo (LPS), verificou-se um resultado
significativo, próximo a 50% do valor obtido no controle positivo. A fração aquosa induziu a
liberação de NO em níveis reduzidos.
4.5 Ensaios de liberação de Óxido Nítrico com extratos de B.intermedia A.Juss.
Os resultados obtidos foram avaliados em relação ao controle negativo e positivo.
Demonstraram que houve estímulo para a liberação de NO pelos macrófagos em baixos níveis
na presença dos extratos de B. intermedia. Uma vez que não obtivemos resultados
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
75
significativos com os extratos dessa espécie, não houve prosseguimento dos experimentos
com frações dessa planta, como foram feitos com B. crassa. A Figura 12 mostra os resultados
de liberação de NO por macrófagos peritoneais na presença dos extratos de B. intermedia A.
Juss.
Figura 12. Produção de óxido nítrico (NO) em cultura de macrófagos peritoneais de
camundongos na presença dos extratos e frações de B.crassa Niedenzu e B.intermedia
A.Juss. 0 – (controle negativo, apenas células em RPMI-1640); LPS - (controle positivo, lipopolissacarídeo de
E.coli); B.cr(clorofórmico) – (extrato clorofórmico de B.crassa, 200µg/mL); B.cr(aquosa) – (fração aquosa do
extrato metanólico de B.crassa, 200µg/mL); B.cr(acetato) – (fração acetato de etila do extrato metanólico de
B.crassa, 200µg/mL); B.in(clorofórmico) – (extrato clorofórmico de B.intermedia, 250 µg/mL);
B.cr(metanólico) – (extrato metanólico de B.crassa, 280 µg/mL); B.in(metanólico) – (extrato metanólico de
B.intermedia, 340µg/mL); B.cr(metanol/água) – (extrato metanol/água de B.crassa, 400 µg/mL);
Bin(metanol/água) – (extrato metanol-água de B.intermedia, 500µg/mL).
*p<0,01 quando comparado ao controle negativo (0).
0
B
.
c
r(clorofór
m
i
c
o)
B.cr(
a
quosa)
B.
c
r(acetato)
B.in(cloro
f
órmico)
B.cr(meta
n
ólico)
B
.
in
(
m
e
t
a
nól
ic
o
)
B.cr(
m
eta
n
ol/água)
B
.
in
(
m
e
t
a
no
l/
á
gua
)
LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NO (µmols/5 x 10
5
células)
Tratam ento (µ g/mL)
1 ± 0,02
8,54 ± 0,46
2,00 ± 0,08 2,52 ± 0,31
12,52 ± 0,71
4,11 ± 0,19
8,4 ± 0,39
3,5 ± 0,48
34,33 ± 3,14
*
70,5 ± 3,46 *
1 ± 0,02
8,54 ± 0,46
2,00 ± 0,08 2,52 ± 0,31
12,52 ± 0,71
4,11 ± 0,19
8,4 ± 0,39
3,5 ± 0,48
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
76
4.6. Ensaios de liberação de TNF-α com extratos e frações de B.crassa Niedenzu
Os resultados mostram que estes extratos não estimularam a liberação da citocina
pelos macrófagos peritoneais.
O ensaio com as frações revelou que a fração acetato de etila estimulou a liberação de
TNF-α pelos macrófagos, com significância estatística em relação ao controle negativo. A
Figura 13 mostra os resultados da liberação de TNF-α por macrófagos peritoneais na presença
dos extratos metanólico, clorofórmico, metanol/água e das frações aquosa e acetato de etila do
extrato metanólico de B.crassa Niedenzu. Com relação ao controle positivo (LPS), verificou-
se um resultado próximo a 10% do valor obtido no controle positivo. Portanto, apesar da
fração acetato de etila do extrato metanólico de B. crassa estimular a liberação de TNF-α por
macrófagos, este estímulo não aconteceu em altos níveis.
4.7. Ensaios de liberação de TNF-α com extratos de B.intermedia A.Juss.
A Figura 13 mostra os resultados de liberação de TNF-α por macrófagos peritoneais de
camundongos na presença dos extratos de B.intermedia. Esses extratos não estimularam a
liberação de TNF-α pelos macrófagos, com exceção do extrato metanol/água, que estimulou a
liberação da citocina em baixos níveis.
Resultados
Cássia Regina Primila Cardoso
77
Figura 13. Produção de TNF-α em cultura de macrófagos peritoneais de camundongos
na presença de extratos e frações de B.crassa Niedenzu e B.intermedia A.Juss. 0- (controle
negativo, apenas células em RPMI-1640); LPS – (controle positivo, lipopolissacarídeo de E.coli);
B.cr(clorofórmico) – (extrato clorofórmico de B.crassa, 200µg/mL); B.cr(aquosa) – (fração aquosa do extrato
metanólico de B.crassa, 200µg/mL); B.cr(acetato) – (fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa,
200µg/mL); B.in(clorofórmico) – (extrato clorofórmico de B.intermedia, 250 µg/mL); B.cr(metanólico) –
(extrato metanólico de B.crassa, 280 µg/mL); B.in(metanólico) – (extrato metanólico de B.intermedia,
340µg/mL); B.cr(metanol/água) – (extrato metanol/água de B.crassa, 400 µg/mL); Bin(metanol/água) – (extrato
metanol-água de B.intermedia, 500µg/mL).
*p<0,01 quando comparado ao controle negativo (0).
0
Bcr
(
cl
o
rofó
r
mi
co
)
Bc
r
(aquosa)
Bcr
(
ace
t
ato
)
Bin
(
clorofórmic
o
)
Bcr(metanólico)
Bin
(
metanólico)
Bcr
(
met
a
n
o
l
/
á
g
ua)
Bin
(met
a
n
o
l
/águ
a)
LPS
-5 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
3 5 0
TNF-alfa (pg/mL)
T ra ta m en to (µ g /m L )
0 0 0
32,8 ± 4,2 *
0 3,2 ± 0,2 0 2,8 ± 0,2 2,0 ± 0,2
326,3 ± 15,1
0 0 0
32,8 ± 4,2 *
0 3,2 ± 0,2 0 2,8 ± 0,2 2,0 ± 0,2
V. Discussão
V. DiscussãoV. Discussão
V. Discussão
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
79
Existe uma grande tendência mundial quanto ao uso de medicamentos de origem
vegetal. Estima-se que cerca de um terço da população adulta do mundo Ocidental utilize
terapias alternativas, incluindo plantas medicinais. Essas plantas podem ser utilizadas tanto
em sua forma primária como em misturas. Ao contrário das drogas sintéticas, as drogas de
origem vegetal têm, às vezes, se destacado por serem não tóxicas, possuírem origem natural e
serem usadas há muito tempo na medicina popular (ZHOU et al., 2004). Em geral, plantas
medicinais contêm inúmeras classes de compostos químicos com propriedades
antimutagênicas, antioxidantes, anticarcinogênicas e imunomodulatórias, caracterizando o
potencial farmacológico das mesmas no tratamento de muitas doenças, como infecções,
desordens imunológicas e câncer (LOPES et al., 2004). De maneira surpreendente, compostos
naturais são empregados na terapia alternativa inclusive em desordens mentais,
imunossupressão e epilepsias (PUNTUREE et al., 2004). Além disso, é importante ressaltar
que a descoberta e o desenvolvimento de um novo fármaco sintético envolvem investimentos
altos, enquanto os custos de pesquisa de um novo fitoterápico são bem menores (YUNES et
al., 2001).
Espécies do gênero Byrsonima (Malpighiaceae) estão amplamente distribuídas ao
longo da América Tropical. Essas plantas são conhecidas por suas utilidades populares e
tradicionais. As folhas geralmente são utilizadas na forma de infusões para o tratamento de
úlceras, como diuréticos e para outras enfermidades (BRITO et al., 2003).
Nesse trabalho, foram realizados estudos biológicos com duas espécies do gênero
Byrsonima. A primeira, Byrsonima crassa Niedenzu (IK), é nativa do Brasil e conhecida
popularmente como “murici cascudo” ou “murici vermelho” (SILVA et al., 2001). A outra,
Byrsonima intermedia A.Juss., é conhecida como “murici amarelo” e é amplamente
distribuída na América Latina (SANNOMIYA et al., 2004).
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
80
O principal objetivo desse trabalho foi a pesquisa de novas moléculas
farmacologicamente ativas, considerando-se suas atividades mutagênica e ativadora do
sistema imunológico, já que estes parâmetros são importantes na avaliação do “risco e
benefício” do uso das mesmas, mesmo na medicina popular. É importante lembrar que
muitos compostos presentes nas plantas podem também ser bio-ativados e causar efeitos
adversos (JIMÉNÉZ et al., 2005).
De uma maneira geral, o uso popular de muitas plantas orienta os estudos para a
caracterização de novas drogas vegetais, favorecendo também bons resultados nas pesquisas
realizadas. Atualmente, os estudos etnofarmacológicos sobre uso popular orientam o
isolamento de grande parte dos compostos naturais primários utilizados na indústria
farmacêutica (YUNES e CALIXTO, 2001).
Os estudos fitoquímicos do B. crassa e B.intermedia foram realizados no Laboratório
de Fitoquímica do Departamento de Química Orgânica da UNESP de Araraquara, pela Drª
Miriam Sannomiya e colaboradores, sob a orientação do Profº Dr. Wagner Vilegas. A
investigação fitoquímica do gênero Byrsonima, ao longo do tempo, tem revelado a presença
de esteróides, triterpenos, ésteres aromáticos, aminoácidos, proantocianidinas, flavonóides e
catequinas (BONZANI, 1970; AMARQUAYE et al., 1994; BEJAR et al., 1995; GEISS, 1995;
RASTRELLI et al., 1997; MENDES et al., 1999). A análise fitoquímica das frações do
extrato metanólico das folhas de Byrsonima crassa revelou a presença de taninos e catequinas
na fração aquosa, os quais têm apresentado resultados significativos em estudos realizados
com camundongos na avaliação de disfunções gástricas e diarréias. Na fração acetato de etila,
além da presença de flavonóides, foram isolados os seguintes compostos: amentoflavona,
quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo,quercetina-3-O-β-D-alactopiranosídeo (SANNOMIYA
et al., 2004). Derivados fenólicos, como ácido gálico e galato de metila, foram isolados em
quantidades significativas, sendo comuns ao gênero, uma vez que também foram isolados de
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
81
Byrsonima fagifolia, espécie cujo perfil fitoquímico está sendo definido no momento.
Segundo os autores, esses compostos fenólicos têm despertado grande interesse em
pesquisadores na Europa, principalmente na Itália, onde alguns estudos em andamento têm
demonstrado importante atividade contra o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Alguns
desses compostos são comuns ao extrato metanólico de Byrsonima intermedia, em diferentes
proporções. Estudos simultâneos com outros gêneros encontrados no cerrado brasileiro, como
por exemplo o gênero Alchornea, revelaram a presença de compostos como ácido gálico,
galato de etila e quercetina ligada a diferentes unidades de açúcar (URREA-BULLA et al.,
2004), além de galato de metila e amentoflavona (BRACA et al., 2002), o que indica que estes
compostos são comuns a muitos gêneros pertencentes à flora da região.
Uma vez que o objetivo majoritário das pesquisas esteja voltado para a descoberta de
novas moléculas farmacologicamente ativas, é importante que os estudos fitoquímicos sejam
guiados por ensaios biológicos, in vitro e in vivo, favorecendo a descoberta de protótipos de
novos fármacos e estabelecendo parâmetros que precederão os ensaios pré-clínicos e clínicos
(YUNES e CALIXTO, 2001). E ainda existem muitos compostos naturais a serem estudados
(CANNELL,1998).
Em nosso trabalho, inicialmente, foram analisados os extratos metanólicos,
clorofórmicos e hidroalcoólicos (metanol-água 80:20) de B.crassa e B.intermedia. O perfil da
atividade mutagênica direcionou os estudos para o extrato metanólico dessas plantas, já que os
demais extratos não apresentaram resultados significativos, exceto o extrato hidroalcoólico,
que apresentou indícios de mutagenicidade. Segundo a literatura, o metanol parece ser
realmente um dos melhores solventes empregados na obtenção de extratos de plantas, por
extrair maior quantidade de compostos (CALIXTO et al., 2004). Além disso, outros estudos
biológicos realizados simultaneamente por grupos de pesquisa pertencentes ao Projeto Biota
também obtiveram resultados mais promissores com os extratos metanólico dessas espécies.
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
82
Foram realizados ensaios de mutagenicidade com as frações e compostos isolados do extrato
metanólico de B.crassa, uma vez que os ensaios com compostos puros apresentam resultados
que definem mais adequadamente o potencial mutagênico (CHANDA et al., 2004). Além
disso, esses compostos são comuns ao extrato metanólico de B.intermedia. Embora os
ensaios imunológicos tivessem apresentado resultados negativos com os extratos,
prosseguimos os ensaios com as frações aquosa e acetato de etila do extrato metanólico de
B.crassa, acompanhando os ensaios de mutagenicidade.
Para os ensaios de mutagenicidade in vitro, escolhemos o teste de Ames, pois é uma
metodologia relativamente rápida e de alta reprodutibilidade para detectar substâncias
genotóxicas, sendo validado por diversos laboratórios (MORTELMANS & ZEIGER, 2000;
RIBEIRO et al., 2004; VARELLA et al., 2004). Utilizamos as linhagens TA98, TA97a,
TA100 e TA102, capazes de promover uma triagem abrangente de diferentes compostos
mutagênicos primários ou secundários, com vários mecanismos de ação (CHUNG et al.,
2005).
A triagem da toxicidade dos extratos foi realizada com concentrações decrescentes de
cada um deles, para todas as linhagens, pois cada uma apresenta diferente sensibilidade. A
maior concentração não tóxica para todas as linhagens foi o parâmetro de escolha das demais
concentrações menores, já que nos ensaios de mutagenicidade, é importante avaliar a menor
concentração possível de uma substância capaz de causar alterações genéticas (VIANA et al.,
2005). O DMSO foi adicionado aos controles negativos de todos os experimentos, já que
todos os extratos, frações e compostos isolados foram solubilizados nesse solvente, e seria
importante avaliar se o mesmo não estaria interferindo na promoção da mutação reversa,
favorecendo “falsos positivos” com os extratos e demais compostos testados. As
concentrações testadas variaram entre 0,17-33,5mg/placa para os extratos, 0,42-8,82mg/placa
para as frações e 0,02-1,16mg/placa para os compostos isolados.
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
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Os resultados positivos foram caracterizados no extrato metanólico de B.crassa com a
linhagem TA98, que induziu significante aumento da freqüência de revertentes por placa, na
ausência de ativação metabólica. Após a adição da fração S9 ao experimento, obtivemos
indícios de mutagenicidade com TA98. Na linhagem TA100, obtivemos também indícios de
mutagenicidade (-S9). O extrato metanol-água TA98 (-S9) também apresentou apenas
indícios de mutagenicidade. A redução da atividade mutagênica desse extrato, comparada
com a do extrato metanólico, pode ter sido causada pela adição de água, que provavelmente
reduziu a quantidade de compostos mutagênicos extraídos. A fração acetato de etila do
extrato metanólico de B.crassa (-S9) apresentou indícios de mutagenicidade em todas as
concentrações testadas, resultados esses que também despertaram o interesse na continuidade
dos estudos com os compostos isolados a partir dessa fração.
A fração aquosa do extrato metanólico de B.crassa apresentou resultados negativos
para os ensaios de mutagenicidade. Os taninos e catequinas foram os principais compostos
presentes nessa fração. Segundo a literatura, esses compostos apresentaram atividades
antimutagênicas (HUANG et al., 1985; WISEMAN et al., 1997; KAUR et al., 2000).
Os extratos de B.intermedia apresentaram resultados bastante parecidos com extratos
de B.crassa, embora o extrato metanólico tenha apresentado apenas indícios de
mutagenicidade com a linhagem TA98(-S9, +S9) e TA 100 (-S9). Esses resultados eram
esperados, uma vez que os estudos fitoquímicos realizados paralelamente ao nosso trabalho
revelavam grande similaridade na composição química das duas espécies, com muitos
compostos comuns ao gênero Byrsonima (RODRIGUES et al., 2004). A diferença de
atividade mutagênica entre as duas espécies pode ser explicada pela quantidade de compostos
isolados em cada uma delas, os quais provavelmente são os responsáveis pela atividade
mutagênica. Na maioria das vezes, o potencial mutagênico é mais evidente nas espécies
vegetais em que os mutágenos estão presentes em maiores concentrações, uma vez que os
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
84
extratos são misturas complexas, com grande número de compostos químicos diferentes
(CHUNG et al., 2005).
Realizamos os ensaios de mutagenicidade com os compostos isolados presentes no
extrato metanólico de B.crassa para caracterizarmos o potencial mutagênico de cada um deles
e em especial, os derivados da quercetina, uma vez que, segundo a literatura, a quercetina e
outros flavonóides podem causar mutações tipo frameshift por ação direta nas moléculas de
DNA. Ferreira & Vargas (1999) verificaram que os extratos de algumas plantas usadas na
medicina popular do sul do Brasil apresentaram atividade mutagênica, uma vez que estes
contêm principalmente flavonóides, além de outras substâncias. A quercetina tem sido objeto
de numerosos estudos de toxicidade genética e carcinogenicidade, envolvendo diversas
atividades, como mutações reversas, alterações de cromátides irmãs, aberrações
cromossômicas e micronúcleos (GASPAR et al., 1994). As propriedades mutagênicas da
quercetina e outros flavonóides têm sido relatadas em muitos testes de mutagenicidade com
bactérias e mamíferos (RIETJENS et al., 2005). Segundo Okamoto (2005), a quercetina é um
dos flavonóides mais encontrados em vegetais e em frutas, sendo consumida na dieta diária.
Os primeiros relatos de suas características mutagênicas ocorreram em 1970. Divergências
entre estudos de carcinogenicidade da quercetina realizados in vivo, a partir de então,
estabeleceram que seu uso suplementar deveria ser avaliado quanto aos riscos e benefícios
após severas triagens clínicas, afim de garantir a segurança da saúde humana durante seu uso.
Mas é importante salientar que a quercetina apresentou significativo potencial mutagênico em
ensaios in vitro, principalmente pelo teste de Ames.
Realizamos nesse trabalho os ensaios de mutagenicidade com os compostos isolados
do extrato metanólico de B.crassa, utilizando a linhagem TA98, com e sem ativação
metabólica, já que nela obtivemos a maioria dos resultados significativos. Esses ensaios
foram realizados por alguns motivos importantes, entre eles: a) para comprovarmos os relatos
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Cássia Regina Primila Cardoso
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da literatura, com estudos próprios, sobre as atividades mutagênicas da quercetina pura e
avaliarmos a mesma atividade com os derivados que foram isolados no gênero Byrsonima; b)
avaliar o potencial mutagênico de derivados fenólicos puros, como o galato de metila, uma
vez que este composto tem se mostrado muito promissor em estudos relacionados com o
tratamento de enfermidades, como a AIDS; c) verificar qual seria o potencial mutagênico da
amentoflavona, um composto que também foi isolado na fração acetato de etila dos extratos
metanólicos dessas espécies.
Os resultados obtidos com os compostos isolados foram bastante interessantes, uma
vez que refletiram os resultados que obtivemos com os extratos metanólicos das espécies,
assim como as frações acetato de etila e aquosa do extrato metanólico de Byrsonima crassa.
Além disso, nos direcionaram para o composto isolado que provavelmente é o principal
responsável pelo potencial mutagênico dos extratos metanólicos. A catequina isolada nas
espécies não apresentou atividade mutagênica significativa. A atividade mutagênica da
quercetina foi avaliada utilizando-se quercetina pura (Sigma), nas concentrações variando
entre 0,05-0,5 mg/placa, com linhagem de S. typhimurium de interesse (TA98). Os resultados
positivos obtidos evidenciaram seu potencial mutagênico in vitro, com e sem ativação
metabólica. Os derivados glicosilados quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo e quercetina-3-
O-β-D-galactopiranosídeo foram testados em pequenas quantidades disponíveis, com
concentrações variando de 0,02-1,16 mg/placa. Apresentaram uma tendência à
mutagenicidade dependente da concentração. A maior concentração testada de quercetina-3-
O-α-L-arabinopiranosídeo (1,16mg/placa) apresentou indícios de mutagenicidade.
Comparando-se a atividade mutagênica da molécula primária da quercetina com seus
derivados glicosilados, verificamos marcante redução do potencial mutagênico em algumas
concentrações próximas. A quercetina é um mutágeno primário, que se liga diretamente ao
DNA (OKAMOTO et al, 2005). Provavelmente, as moléculas de açúcar ligadas à estrutura
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Cássia Regina Primila Cardoso
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primária da quercetina reduzem a sua capacidade de interagir com o DNA por alterações
conformacionais, restrição de sítio de ligação, entre outros processos. Segundo estudos de
Rietjens et al. (2005), modificações na molécula primária da quercetina, em diferentes pontos
da molécula, promovem alterações, em diferentes níveis, em seu potencial mutagênico.
Verificaram também que existem sítios estratégicos, cuja alteração (principalmente pela
adição de radicais) reduz drasticamente a atividade mutagênica da quercetina. Um importante
sítio avaliado nesse estudo foi o 3OH, onde a substituição da hidroxila por um novo radical
(uma molécula de luteonína) anulou completamente o potencial mutagênico da quercetina.
Após a avaliação das moléculas de quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo e quercetina-3-O-
β-D-galactopiranosídeo, verificamos que as moléculas de açúcar estão ligadas, justamente, no
sítio do terceiro carbono da estrutura primária da quercetina, em substituição à hidroxila. Esse
fato justificaria a redução significativa do potencial mutagênico desses derivados glicosilados,
embora esta não tenha sido anulada, uma vez que existem outros sítios presentes na estrutura
primária que também parecem ser responsáveis pelo marcante potencial mutagênico da
quercetina.
Uma vez verificado que a atividade mutagênica da quercetina é reduzida quando ligada
a diferentes moléculas de açúcar, e a quercetina primária não foi isolada nessas espécies,
restava uma dúvida: “Qual substância potencialmente mutagênica estaria causando os efeitos
observados nos extratos metanólicos e na fração acetato de etila?” Provavelmente, os
derivados glicosilados poderiam estar contribuindo para o potencial mutagênico, mas não
completamente, uma vez que verificamos que a resposta mutagênica depende da concentração
e que os mesmos foram isolados em pequenas quantidades.
Destacamos ainda a grande importância dos testes realizados com os compostos
isolados, pois evidenciamos, dessa forma, que a amentoflavona possui interessante potencial
mutagênico, com e sem ativação metabólica, verificado no teste de Ames. De acordo com os
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
87
estudos de Uddin et al (2004), a amentoflavona e alguns derivados da apigenina têm a
capacidade de causar alterações oxidativas e clivagens no DNA, quando se conjugam com
íons cúpricos. Verificamos também que, após a metabolização com enzimas microssomais
presentes na mistura S9, o potencial mutagênico da amentoflavona diminuiu. Segundo
estudos realizados por Chaudhary & Willet (2006), a própria amentoflavona e outros
flavonóides, como a miricetina, apigenina e quercetina, embora apresentem potencial
mutagênico significativo comprovado in vitro, têm a capacidade de interagir com enzimas
hepáticas CYP1, inibindo a capacidade dessas enzimas de transformar substâncias químicas
em metabólitos intermediários carcinogênicos.
Analisando todos os resultados dos ensaios de mutagenicidade obtidos nesse trabalho,
verificamos que aquelas substâncias que promoveram alterações no DNA o fizeram pelo
mecanismo de deslocamento do quadro de leitura do DNA, detectado através da linhagem
TA98, principalmente. Os extratos metanólicos de B.crassa e B.intermedia também
apresentaram resultados com significância estatística com a linhagem TA100, sem ativação
metabólica. Essa linhagem detecta mutações por substituição de bases no DNA.
No Brasil, o uso de plantas medicinais é bem difundido, principalmente nas áreas
rurais, para o tratamento de muitas enfermidades. Estudos enfocando atividades
antiinflamatórias, antimicrobianas e antitumorais/citotóxicas de algumas plantas têm sido
reportados (HOLETZ et al., 2002; SUYENAGA et al., 2002; SANTOS PIMENTA et al.,
2003). As propriedades imunomodulatórias de muitos extratos de plantas têm sido
amplamente descritas, especialmente quanto às atividades inibitórias da produção de óxido
nítrico e citocinas, como o TNF-α, por macrófagos (RIMBACH et al., 2000; RYU, 2003a;
FERREIRA et al., 2003; RYU et al., 2003b).
Por outro lado, existe também uma forte tendência em se estudar drogas vegetais que
possam participar da modulação do sistema imunológico, avaliando-se a capacidade que esses
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
88
compostos podem ter em promover a liberação de mediadores por macrófagos como, por
exemplo, o NO, TNF-α, H
2
O
2
, entre outros. Diferentes classes de substâncias têm sido
estudadas quanto ao caráter imunoestimulante (MARQUES, 2002). Nesse caso, é importante
lembrar, além do enfoque terapêutico, que muitos compostos podem estimular a liberação de
mediadores imunológicos em altos níveis, causando alterações teciduais e vasculares (CHI et
al., 2003).
O sistema imunológico é um mecanismo complexo de defesa do organismo. Dessa
forma, a pesquisa básica de drogas vegetais com propriedades imunomodulatórias pode ser
feita através de ensaios de estimulação da imunidade inespecífica, como por exemplo, a
produção de citocinas e outras substâncias pelos macrófagos (WILLIAMS, 2001).
Os macrófagos constituem um dos principais componentes do sistema imunológico.
São as primeiras células a serem ativadas para participarem da resposta imune quando o
organismo é confrontado por fatores exógenos de diferentes origens (FORMAN & TORRES,
2001). Nesse caso, uma série de eventos celulares e bioquímicos podem ocorrer, incluindo
alterações no potencial de membrana e fluxo de íons, rearranjo do citoesqueleto, além da
indução de espécies reativas do oxigênio (EROs), destacando-se H
2
O
2
, ânions superóxido e
radicais hidroxila e de nitrogênio (ERNs), destacando-se o NO, além da liberação de citocinas
(LUM, BUTT & LO, 2002). Entre essas citocinas, destacam-se o interferon-gama (IFN-γ),
fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e interleucina-1 (IL-1) (RIMBACH et al., 2000; REIS
et al., 2001; RYU et al., 2003 a).
A enzima óxido nítrico sintetase (NOS), é responsável pela produção de NO em
diferentes locais do organismo, com diversas ações fisiológicas, como contração da
musculatura lisa, reatividade plaquetária, neurotransmissão central e periférica e as ações
citotóxicas sobre as células imunológicas (HOBBS et al., 1999). O NO é um importante
mediador que pode exercer efeitos benéficos ou prejudiciais, dependendo do contexto
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
89
fisiológico (CIRINO et al., 2002). Em geral, o processo fisiológico requer uma ativação
equilibrada dos macrófagos, com o objetivo de induzir a proteção com a mínima agressão às
células do hospedeiro (IGNÁCIO et al., 2001).
O TNF-α é uma citocina com efeitos benéficos e maléficos. Quando liberado pelos
macrófagos, induz proteção em nível local, mas pode causar efeitos nocivos quando liberado
sistemicamente (PARHAM, 2001). É responsável por muitos exemplos de destruição de
células tumorais pelos macrófagos e, em ação conjunta com o INF-γ, destrói tumores
suscetíveis (ROITT et al, 1999).
Atualmente, sabe-se que a atividade não regulada de citocinas e outros mediadores
imunológicos podem levar ao desenvolvimento de quadros imunopatológicos severos,
caracterizados em algumas doenças inflamatórias, como artrite reumatóide, doença
inflamatória intestinal, entre outras (PALLADINO et al., 2003).
Uma vez que a produção de TNF-α por macrófagos ativados é importante na indução
da síntese de NO pela iNOS, os ensaios envolvendo esses mediadores tornam-se importantes
ferramentas na determinação das propriedades imunomodulatórias ou imunoestimulantes de
muitos compostos químicos presentes nas plantas (PUNTUREE et al., 2004).
O conhecimento do papel do NO e do TNF-α em estados fisiológicos e
fisiopatológicos despertou o interesse no entendimento dos mecanismos de ação de
substâncias exógenas na estimulação e/ou modulação da produção desses mediadores,
principalmente quando o objetivo é a descoberta de novas moléculas farmacologicamente
ativas (ACHIKE & KWAN, 2003).
Nesse trabalho, tivemos como objetivo avaliar o potencial imunoestimulante dos
extratos de B.crassa e B.intermedia, ou seja, a possível ação dos compostos químicos
presentes nos extratos dessas plantas na ativação de macrófagos e conseqüente liberação de
NO e TNF-α.
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
90
Uma importante etapa desse trabalho, que antecedeu os ensaios imunológicos, foram
os ensaios de citotoxicidade dos extratos e frações de B.crassa e B.intermedia com os
macrófagos peritoneais murinos. Esses ensaios foram realizados no Laboratório de
Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas da FCF/UNESP, sob a coordenação da
Profª Drª Maria Stella Gonçalves Raddi. A técnica empregada foi a do Vermelho Neutro
(BALBICH & BORENFREUND, 1998), cujo princípio baseia-se na característica do corante
supra vital (cloridrato de 3-amino-m-dimetilamino-2-metilfenazina), uma vez que somente
células vivas o incorporam por pinocitose ou transporte ativo através da membrana
plasmática, acumulando este corante nos lisossomas (MARQUES, 2002). Essa técnica foi
escolhida porque substitui o teste colorimétrico MTT, proposto por Mosmann (1983) para a
avaliação citotóxica de extratos vegetais, uma vez que estes possuem, geralmente, grande
quantidade de substâncias glicosiladas (RIDDEL et al, 1986).
Os ensaios de citotoxicidade também foram realizados com o DMSO, por que os
extratos e frações foram inicialmente solubilizados nesse solvente. De acordo com os
resultados, as diluições dos extratos e frações em RPMI-1640 não ultrapassaram a um limite
de 2 % de DMSO, com a finalidade de evitar interferências nos ensaios imunológicos.
Concentrações crescentes de extratos e frações foram testadas, com a finalidade de determinar
a maior concentração não tóxica. A determinação da maior concentração não tóxica baseou-
se na viabilidade celular, ou seja, uma concentração foi considerada atóxica quando se
verificou viabilidade celular acima de 90%. A escolha das concentrações testadas baseou-se
em outros trabalhos, em que não se observou citotoxicidade representativa variando-se entre
500 e 100 µg/mL (HU et al., 2003; MEHROTRA, 2003).
Com base nos ensaios de citotoxicidade fornecidos, determinamos as concentrações a
serem utilizadas, para cada extrato e fração das plantas, nos ensaios imunológicos. Como o
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
91
objetivo desse trabalho era uma triagem da possível atividade imunoestimulante das espécies,
realizou-se os ensaios imunológicos apenas com a maior concentração não tóxica.
O método de escolha para a determinação do NO foi o de Griess, por consistir em uma
técnica relativamente simples, eficiente e bem documentada (MARQUES, 2002). O princípio
do método envolve a degradação oxidativa do NO em solução aquosa, formando nitrito (NO
2
-
) que é determinado pelo reagente de Griess, que reage primeiramente com a sulfanilamida
(reação de diazotização) em meio ácido, formando um composto intermediário que reage com
o naftiletilenodiamino formando um derivdo azo colorido prontamente monitorado em
espectroscopia de UV/visível com absorbância máxima de 548 nm e pH 2.0. O meio ácido
favorece a reação de diazotização, melhorando o rendimento na leitura espectrofotométrica
(MALINSKI, 1996). O controle positivo escolhido foi o lipopolissacarídeo de E.coli sorotipo
0111: B4 (LPS) por que essa molécula induz o aumento da capacidade funcional das células
imunológicas, favorecendo respostas fisiopatológicas em infecções causadas por bactérias
Gram-negativas e inflamações generalizadas (LANGHANS, 1996). Os macrófagos podem
reconhecer pequenas quantidades de LPS no ambiente, caracterizando essa molécula como um
potente estimulador imunológico (ZWILLING & EISENSTEIN, 1994).
A metodologia utilizada para a determinação de TNF-α foi a que se baseia na
propriedade que tem esse mediador de lisar certas linhagens de células tumorais
(CARSWELL et al., 1975; CARLOS et al., 1994). Esta metodologia foi padronizada no
Laboratório de Imunologia da FCF/UNESP para a linhagem tumoral L929 (fibrosarcoma
murino).
Os estudos fitoquímicos realizados no laboratório de Fitoquímica do IQ/UNESP (item
3.2.) demonstraram que esses extratos consistem em misturas bastante complexas de
substâncias químicas. Verificamos que todos os extratos de B.crassa e B.intermedia
estimularam a liberação de NO em baixos níveis. O extrato que promoveu maior ativação de
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
92
macrófagos e liberação de NO foi o extrato metanólico. Por esse motivo, direcionamos os
ensaios imunológicos para as frações acetato de etila e aquosa desse extrato. Os ensaios de
liberação de TNF-α também foram pouco significativos em relação ao controle negativo e
também quanto ao controle positivo, no qual os macrófagos foram estimulados com LPS,
com todos os extratos dessas espécies.
Os resultados obtidos com a fração aquosa foram negativos para NO e TNF-α. A
constituição química dessa fração consiste, principalmente, em catequinas e taninos que,
segundo a literatura, são compostos com atividade imunomoduladora conhecida. A geração de
radicais de oxigênio em monócitos é inibida pela catequina (MIDDLETON JR, 2000;
SOLIMAN, 1998).
A fração acetato de etila, contrariamente, apresentou resultados significativos em
relação ao controle negativo, para NO e TNF-α. Em relação ao controle positivo, o resultado
foi significativo para a liberação de NO, cujo valor foi próximo àquele liberado pelos
macrófagos em presença do LPS. A constituição química dessa fração consiste, basicamente,
de quercetinas glicosiladas (quercetina-3-O-β-D-galactopiranosídeo e quercetina-3-O-α-L-
arabinopiranosídeo), uma mistura de (+)-catequina e (-)-epicatequina, ácido gálico, galato de
metila e amentoflavona (SANNOMIYA et al., 2004).
Os flavonóides são compostos fenólicos que ocorrem naturalmente nas plantas.
Alguns deles possuem atividade imunomodulatória conhecida (BALDWIN JR, 2000). Vários
estudos comprovam a ação inibitória dos flavonóides sobre a produção de NO e TNF-α por
macrófagos. Por exemplo, o resveratrol, presente no vinho tinto, mostrou forte efeito
inibitório na expressão de iNOS e geração de NO por macrófagos ativados (TSAI et al.,
1999); a quercetina mostrou atividade inibitória na superprodução de NO e TNF-α em
macrófagos (MANJEET et al., 1999); muitos outros flavonóides presentes na dieta já foram
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
93
estudados, como a morina, apigenina, ácido elágico, ácido cafeico e curcumina, e todas essas
substâncias apresentaram efeitos supressores dose-dependente sobre a produção de NO
(SOLIMAN, 1998; FANG et al, 2003). Muitas substâncias fenólicas presentes em plantas
medicinais possuem ação antiinflamatória e antioxidante, propriedades estas que se
relacionam com os mecanismos de quimioprevenção sobre a carcinogênese (SURH et al.,
2001). A amentoflavona é um biflavonóide com atividades antifúngicas e antiinflamatórias,
que atua por alguns mecanismos, como supressão do gene de expressão da iNOS, modulação
da síntese de prostraglandinas, inibição de COX-2, inibição do fator de transcrição nuclear
NF-κβ, que é importante na expressão de muitos genes relacionados com a inflamação, entre
outros (BUCAR et al, 1998; KIM et al., 1998; ZIBOH et al., 2002; WOO et al., 2005). A
inibição de TNF-α relacionada à amentoflavona também foi relatada em estudos de Banerjee
et al (2002).
Frente aos estudos citados acima, sugerimos os resultados negativos para a atividade
imunoestimulante encontrados nos extratos metanólicos de B.crassa e B.intermedia, além da
fração aquosa de B.crassa, embora essa propriedade deva ser avaliada através de ensaios de
inibição da liberação desses moduladores por macrófagos na presença desses compostos.
Apenas os ensaios de liberação de NO e TNF-α não são suficientes para a caracterização da
atividade antiinflamatória de um composto.
Contrariamente, a fração acetato de etila apresentou uma atividade ativadora de
macrófagos quanto à produção de NO e TNF-α, apesar de estarem presentes nessa fração
substâncias descritas como sendo inibitórias na produção desses mediadores. A atividade
imunomodulatória dos compostos presentes nessa fração é bem documentada, quando testados
isoladamente. Frente aos resultados obtidos nos ensaios imunológicos com a fração acetato, e
considerando que as matérias primas vegetais são misturas complexas cujas moléculas
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
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interagem quimicamente entre si e com o organismo, podemos dizer que, provavelmente, a
interação entre essas moléculas, nessa fração, poderia estar promovendo uma “nova ação
farmacológica”, a qual não acontece quando cada substância isolada é testada separadamente.
Outro aspecto importante a ser considerado é que o fracionamento de uma mistura complexa
concentra determinados constituintes em cada uma das frações, de acordo com a metodologia
de extração utilizada (YUNES & CALIXTO, 2001). Portanto, podemos dizer que a
concentração proporcional das substâncias puras é maior na fração acetato de etila do que no
extrato metanólico bruto, o que poderia favorecer interações químicas entre essas moléculas
ou ações sinérgicas com características diferenciadas daquelas observadas no extrato inicial.
Analisando os resultados obtidos nos ensaios imunológicos, pergunta-se: -“Teriam os
compostos isolados de plantas as mesmas propriedades imunomodulatórias das preparações
obtidas da planta inteira, dos extratos brutos ou das frações com misturas de alguns compostos
(WILLIAMS, 2001)”? Para responder essa questão, seriam importantes os ensaios
imunológicos com os compostos isolados e com a mistura dos mesmos, na mesma proporção
da fração acetato, com a finalidade de avaliarmos a possível interação química e a
reprodutibilidade dos resultados obtidos anteriormente. Esses ensaios não foram realizados
nesse trabalho, uma vez que não estavam disponíveis quantidades suficientes das substâncias
puras, porém o direcionamento dos experimentos nesse sentido representa uma interessante
proposta para estudos biológicos futuros. Além disso, a determinação de outras citocinas
relacionadas ao processo inflamatório, como o IFN-γ, pode auxiliar na elucidação dos
resultados obtidos nesse trabalho.
Apesar da fração acetato de etila ser responsável pela promoção de uma ação
imunoestimulante significativa, verificamos que a liberação de NO e TNF-α pelos macrófagos
não alcançou o nível considerado excessivo em nosso trabalho, ou seja, esteve abaixo de 50%
da atividade observada no controle positivo. Este resultado é interessante, uma vez que altas
Discussão
Cássia Regina Primila Cardoso
95
concentrações desses mediadores são prejudiciais ao organismo, tornando-se citotóxicas para
as células adjacentes.
Embora os estudos com plantas medicinais sejam recentes, as matérias primas vegetais
constituem uma rica fonte de novas moléculas farmacologicamente ativas (WILLIANS,
2001). Embora o sinergismo farmacológico de uma mistura complexa de compostos seja uma
vantagem, justificando o uso dos fitoterápicos (GOEPEL et al., 1999; YUNES et al., 2001),
destacamos a importância dos ensaios de mutagenicidade com os compostos isolados a partir
da fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa, uma vez que os resultados nos
direcionaram para a substância possivelmente responsável por esses efeitos. Em relação aos
estudos para novas moléculas ativas, destacamos a ação mutagênica da amentoflavona e a
importância da avaliação do risco e benefício na utilização desse composto em outras
atividades biológicas. Sob o aspecto imunológico, os resultados obtidos nesse trabalho foram
muito importantes, uma vez que os extratos não estimularam a liberação de NO e TNF-α e
abriram perspectivas para estudos farmacológicos futuros de novos fitoterápicos
imunoestimulantes e imunomoduladores e ofereceram uma contribuição para consolidar uma
base científica para o uso popular dessas plantas.
VI.
VI. VI.
VI. Conclus
ConclusConclus
Conclusões
õesões
ões
Conclusões
Cássia Regina Primila Cardoso
97
Através dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que:
- Os extratos clorofórmicos de B.crassa e B.intermedia não apresentaram atividade
mutagênica.
- Os extratos hidroalcoólicos de B.crassa e B.intermedia apresentaram indícios de
mutagenicidade; comparando-se com os resultados dos extratos metanólicos, sugerimos que a
adição de água e conseqüente diluição reduziu o potencial mutagênico;
- O extrato metanólico de B.crassa apresentou atividade mutagênica na linhagem
TA98. A fração acetato de etila apresentou fortes indícios de mutagenicidade
- Dos compostos que foram isolados somente a amentoflavona apresentou
mutagenicidade positiva, podendo ser considerada uma das resposnsáveis pelo efeito
genotóxico. O derivado quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo apresentou indícios de
mutagenicidade . A adição de açúcar na molécula da quercetina diminuiu drasticamente sua
mutagenicidade.
- A fração aquosa do extrato metanólico de B.crassa não apresentou atividade
mutagênica e em sua constituição química foram detectados taninos e catequinas
- Os extratos de B.crassa e B.intermedia induziram a liberação de NO e TNF-α por
macrófagos peritoneais murinos em níveis reduzidos;
- A fração aquosa do extrato metanólico de B.crassa não induziu a liberação de NO e
TNF-α;
- A fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa induziu liberação de NO
em altos níveis, ou seja, com valor próximo a 50% do controle positivo. Para TNF-α, houve
indução que, se relacionada com o controle positivo, não foi em altos níveis.
VI
VIVI
VII
II
I.
. .
. Referências
ReferênciasReferências
Referências
Referências
Cássia Regina Primila Cardoso
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Cássia Regina Primila Cardoso
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VIII. Apêndice
VIII. Apêndice VIII. Apêndice
VIII. Apêndice
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
111
APÊNDICE A. CCD do extrato metanólico (EMeOH) e frações obtidas da coluna de Sephadex LH-20.
FM: CHCl
3
/MeOH 75:25 ( v/v), Revelador: anisaldeído sulfúrico, a: frações da coluna, Ex: EMeOH de Bc
Ácido gálico (Bc5), galato de metila (Bc6), quercetina-3-
O
-β-D-galactopiranosídeo (Bc10), quercetina-3-
O
-β-D-
glucopiranosídeo (Bc12), (+)-catequina (Bc8), (-)-epicatequina (Bc9), quercetina-3-
O
-α-L-arabinopiranosídeo (Bc11)
Ex
a
Bc6
Bc5
Bc8 e Bc9
Bc11
Bc10
Bc10 e Bc12
Bc7
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
112
APÊNDICE B. Estrtura das moléculas de ácido gálico e galato de metila, isoladas da fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa Niedenzu.
H
O
O
H
C
O
O
R
O
H
1
2
3
4
5
6
R=H Ácido gálico
R=C
3
Galato de
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
113
APÊNDICE C. Estrutura da molécula de amentoflavona, isolada da fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa Niedenzu.
O
O
H
O
O H
O H
O
O
H
O
O
H
O H
( II)
( I)
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1
'
2
'
3
'
4
'
5
'
6
'
2
"
3
"
4
" 5
"
6
"
7
"
8
"
9
"
1 0
"
1
"'
2
"'
3
'''
4
"'
5
"'
6
"'
Observação: I e II correspondem às unidades de deslocamento molecular trabalhadas na identificação da amentofalvona por RMN.
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
114
APÊNDICE D. Estruturas químicas das moléculas de (+)-catequina, (-)-epicatequina e quercetina ligada a diferentes moléculas de açúcar,
extraídas da fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa
O
O
H
O
O
H
O
R
O
H
O
H
R=
β
ββ
β
-D-galactopiranosídeo
R=
α
αα
α
-L-arabin
opiranosídeo
R
1
=H e
2
=OH,
(+)-catequina
R
1
=OH e
2
=H,
(-)-epicatequina
O
R
2
O
H
H
O
R
1
O
H
O
H
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
115
APÊNDICE E. Cromatograma da fração aquosa do extrato metanólico de B.crassa Niedenzu (HPLC).
RP-18, 250 x 4,60 mm d.i. x 5 µm, FM modo gradiente linear de acetonitrila/água (10-100%) em 30 min, fluxo de 0,8 ml min
-1
, λ 210 nm. Os picos
marcados (1-4) revelam a presença de catequinas e saponinas.
A b s o r b a n c e 2 1 0 . 0 0 n m
0 . 0
0 . 5
1 . 0
1 . 5
2 . 0
2 . 5
A U
5
1 0
1 5 2 0
2 5
m i n u t e s
1
2
3
4
0 . 0
0 . 5
1 . 0
1 . 5
2 . 0
A U
2 0 0
2 5 0
3 0 0
3 5 0
4 0 0
n m
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
116
APÊNDICE F. Cromatograma da fração acetato de etila do extrato metanólico de B.crassa Niedenzu (HPLC).
coluna de fase reversa Phenomenex Luna, C
18
(250 x 4.60 mm I.D., 5 µm); fase móvel: gradiente linear de
Acetonitrila/H
2
O (10-100%) em 30 min, fluxo: 0.8 ml min
-1
, detecção a 254 nm. Pico 1=Amentoflavona, pico 2=
quercetina
-
3
-
O
-
α
-
L
-
arabinopiranosídeo
e pico
3= quercetina
-
3
-
O
-
β
-
D
-
galactopiranosídeo.
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
117
APÊNDICE G. Preparo de soluções, reagentes e meios de cultura
SOLUÇÕES UTILIZADAS NOS ENSAIOS IMUNOLÓGICOS
- Meio RPMI-1640
Utilizar frasco de 1000mL para água milli-Q, acrescentar:
HEPES.............................................2,38g
Bicarbonato de sódio............................2g
Ajustar o pH em 7,0-7,2. Em seguida, completar o volume para 100mL e esterilizar
utilizando membrana de 0,22µm. Após esterilização, aliquotar o meio em frascos de 100mL.
Estocar sob refrigeração a 4°C.
No momento do uso, adicionar penicilina (100U/mL), estreptomicina (100U/mL),
glutamina (2mM), mercaptoetanol (50mM) e 5% de soro fetal bovino.
- Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Solução 1
Na
2
HPO
4
x H
2
).............................................27,4g
Água milli-Q q.s.p......................................386mL
Solução 2
NaH
2
PO
4
x H
2
O.............................................7,88g
Água milli-Q q.s.p........................................114mL
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
118
Solução estoque: preparar, inicialmente, as soluções 1 e 2. Em seguida, misturar as
duas soluções e completar o volume para 100mL com água milli-Q e autoclavar. O pH deve
ser de 7.2. Armazenar sob refrigeração (4°C).
Solução de uso: o modo de preparo está descrito a seguir:
Solução estoque.............................................40 mL
MaCl.................................................................8,5g
Água milli-Q q.s.p......................................1000mL
Ajustar o pH, se necessário, e autoclavar. Armazenar sob refrigeração (4°C).
- Tampão fosfato de potássio
Fosfato dissódico anidro...............................11,46g
Na
2
HPO
4
.7H
2
O.............................................21,57g
Fosfato monopotássico...................................2,65g
Água destilada q.s.p....................................1000mL
Acertar o pH em 7.2.
- Reagente de Griess
Sulfanilamida....................................................1,0g
Naftiletilenodiamina..........................................0,1g
Ácido orto-fosfórico.......................................2,5mL
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
119
Água milli-Q q.s.p.........................................100mL
Dissolver a sulfanilamida e a naftiletilenodiamina. Acrescentar, aos poucos, o ácido
fosfórico. Completar o volume para 100mL. Manter o reagente sob refrigeração (4°C).
Proteger da luz.
- Líquido de Lázarus
Violeta de genciana 1%......................................2mL
Ácido acético glacial..........................................3mL
Água destilada q.s.p.......................................100mL
- Tioglicolato 3%
Colocar 3g do meio em 100mL de água destilada. Distribuir em tubos e autoclavar.
- Solução de LPS
Dissolver 1 mg de LPS em 1 mL de meio RPMI, esterilizar por filtração utilizando
membrana de 0,22µm e armazenar a -20°C. Posteriormente, diluir para a concentração de
1µg/mL, utilizando meio RPMI-1640.
- Meio básico de Eagle (Sigma)
Com sais de Eagle e L-glutamina, na ausência de bicarbonato de sódio. Preparo
segundo recomendações do fabricante e armazenado a 2-8°C.
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
120
SOLUÇÕES UTILIZADAS PARA OS ENSAIOS DE MUTAGENICIDADE
- Caldo nutriente
Meio Oxoid........................................................0,75g
Água destilada q.s.p...........................................30mL
Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- Top agar
Agar.....................................................................1,2g
NaCl.....................................................................1,0g
água destilada q.s.p..........................................200mL
Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- Solução de Histidina/Biotona (0,5mM)
Biotina..........................................................0,00247g
Histidina.......................................................0,00192g
Água destilada (45°C) q.s.p...............................20mL
Autoclavar (121°C, 15 minutos).
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
121
Agar mínimo glicosado (AGM)
Agar.....................................................................7,5g
Água destilada..................................................465mL
Glicose 40%: 50mL/1L de meio (45 mL água destilada + 20g glicose)
VB: 20 mL/1 L de meio
Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- VB (Vogel Bonner E)
Sulfato de magnésio(1)......................................0,75g
Ácido cítrico(2) ..................................................7,5g
Fosfato de potássio dibásico(3)..........................37,5g
Fosfato de sódio e amônio(4)...........................13,13g
Água destilada (45°C)...................................50,25mL
Dissolver os reagentes (1-4) sequencialmente na água, mantendo a temperatura em
45°C (banho quente). Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- Tampão fosfato 0,2M
Solução estoque A:
2,84g (Na
2
HPO
4
)...................................100mL (água destilada)
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
122
Solução estoque B:
2,76g (NaH
2
PO
4
)...................................100mL água destilada)
Solução de uso: Misturar 30 mL da solução A e 7mL da solução B. Ajustar o pH
(7.4). Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- Solução de MgCl 0,4M
MgCl
2
.6H
2
O.............................................8,13g
H
2
O destilada..........................................100mL
Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- Solução de KCl 1,65M
KCl...........................................................12,3g
H
2
O........................................................100mL
Autoclavar (121°C, 15 minutos).
- Solução de glicose 6-fosfato (G-6-P) 1M
G-6-P......................................................2,821g
H
2
O.........................................................10 mL
Apêndice
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123
- Solução NAPD 0.1 M
NAPD...............................................................0,7654g
H
2
O destildada.....................................................10mL
Controle e testes das linhagens de Salmonella typhimurium utilizadas no Teste de
Ames
1) SENSIBILIDADE AO CRISTAL VIOLETA
-1 linhagem por placa;
- agar nutriente (CN + 1,5% agar);
- solução de cristal violeta 0,1% (0,01g/10 mL de água estéril)
- semear com drigalski 0,1mL de suspensão bacteriana
- utilizar 3 discos estéreis
2) SOLUÇÃO DE TETRACICLINA
- HCl 0,02N (14 µL HCl fumegante (Merck) – 10 mL água estéril)
- 0,008g tetraciclina – 1 mL HCl 0,02N
- filtrar a solução de HCl (Millipore) antes de acrescentar o antibiótico
- Trabalhar na capela.
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
124
3) TUBOS DE CONGELAMENTO
- 1mL cultura
- 0,2mL DMSO
- estocar por 24 h à -20°C e passar para -80 °C
4) ENSAIO PARA TESTAR AS CARACTERÍSTICAS GENOTÍPICAS
Ampicilina: Em placa de AGM, usando alça de semeadura, fazer um “V” com o antibiótico e
outro penpendicularmente, outro com a cultura (2 linhagens /placa);
Cristal violeta: antibiograma, 10µL/disco;
Biotina: esparramar 0,1mL da solução de biotina com drigalski, esperar secar e fazer estrias
com a cultura (2 linhagens/placa);
Biotina/histidina: com o mesmo procedimento acima, colocar primeiro a biotina.
5) CONTROLES POSITIVOS
Azida sódica: (25µL para TA 100)
10 mL água.........................0,0005g
NPD: (50µL – TA98)
5mL DMSO..........................0,001g
Antramine: (25µL – TA100, TA98, ensaios com S9)
10mL DMSO......................0,0003g
Apêndice
Cássia Regina Primila Cardoso
125
6) CULTURA (estoque)
- 30mL de caldo nutriente;
- Linhagens (TA): 95 µL de ampicilina (8mg/mL);
- Acrescentar o antibiótico após a esterilização dos meios.
Resistência à ampicilina:
- linhagens por placa;
- NaOH 0,02N (0,024g NaOH – 3 mL água destilada);
Filtrar a solução final em Millipore.
Sensibilidade a luz UV:
- 30 cm por 8 segundos;
- 1 linhagem por placa (100µl de cultura, com drigalski);
- deixar as placas abertas.
Requerimento de HISTIDINA/BIOTINA:
- 2 linhagens por placa;
- AMG;
- BIOTINA (0,5mM): 0,0012g – 100mL água destilada
- HISTIDINA (0,5%): 0,015g – 3 mL água destilada
- autoclave.
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