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ESTUDO DE AMOSTRAS DE
STAPHYLOCOCCUS
COAGULASE-
NEGATIVA QUANTO A FORMAÇÃO DE BIOFILME
ADILSON CESAR ABREU BERNARDI
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, câmpus de Araraquara –
UNESP, como parte dos requisitos para a
obtenção do grau Doutor em Análises
Clínicas (Área de Microbiologia Clínica).
ARARAQUARA
Estado de São Paulo-Brasil
2005
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Milhares de livros grátis para download.
2
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
ESTUDO DE AMOSTRAS DE
STAPHYLOCOCCUS
COAGULASE-NEGATIVA
QUANTO A FORMAÇÃO DE BIOFILME
ADILSON CESAR ABREU BERNARDI
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, câmpus de Araraquara –
UNESP, como parte dos requisitos para a
obtenção do grau Doutor em Análises
Clínicas (Área de Microbiologia Clínica).
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto
ARARAQUARA
Estado de São Paulo-Brasil
2005
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3
Candidato: Adilson César Abreu Bernardi
Título da Tese: Estudo de amostras de Staphylococcus coagulase
negativa quanto a formação de biofilme
A Comissão julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese
de Doutorado, em sessão pública realizada a 13/12/2005, considerou o candidato:
( X ) Aprovado ( ) Reprovado
1) Presidente: Prof. Dr Antonio Carlos Pizzolitto
2) Examinador: Profª. Drª Isabel Yoko Ito
3) Examinador: Prof. Dr Sérgio Aparecido Torres
4) Examinador: Prfª Drª Maria de Lourdes Ribeiro de Souza
5) Examinador: Prfª Drª Clarice Queico Fujimura Leite
4
Bernardi, Adilson César Abreu
B523e Estudo de amostras de Staphylococcus coagulase negativa quanto a
formação de biofilme / Adilson César Abreu Bernardi. – Araraquara, 2005.
144 f.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual
Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências
Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Análises
Clínicas
Orientador: Antonio Carlos Pizzolitto
. 1.Slime. 2.Operon ica 3.Staphylococcus epidermidis .4.Fatores de
virulência. 5.Microbiologia clínica . I. Pizzolitto, Antonio Carlos, orient.
G
5
Pesquisa realizada no
NAC - Núcleo de Atendimento à
Comunidade, Laboratório “Prof. Antonio Longo” - Setor de Microbiologia
Clínica - da Unidade Auxiliar Integrada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
câmpus de Araraquara, - UNESP,
Laboratório de Análises Clínicas João Paulo
II, da cidade de Fernandópolis-SP, Laboratório de Microscopia Eletrônica,
Instituto de Química, câmpus de Araraquara, - UNESP, Laboratório de Biologia
Molecular e Celular de Microrganismos FCF-Câmpus de Araraquara, - UNESP,
com o SUPORTE FINANCEIRO proveniente do NAC.
6
DEDICATÓRIA
Pietra e Paola
Se a solidão valesse, as leis de Deus não fariam o
nascimento de vocês na terra entre duas criaturas (papai e mamãe),
convertendo vocês em terceira e quarta pessoa para construirmos um grupo
maior.
.........................................
AMO VOCÊS
À minha esposa Patrícia, meu eterno
reconhecimento e gratidão pelo aceite e compreensão dispensados
durante minhas constantes ausências da família, para realização do curso
de Doutorado.
...............................................
TE AMO
7
G
h
nyhkljptlu{vzGlzwljphpzG
À Profa. Dra. ELISABETH LOSHCHAGIN PIZZOLITTO, por sua grande inspiração,
presença de espírito, sabedoria e amizade.
Foi uma pena não podido tê-la como co-orientadora.
Ao Prof. Dr. ANTONIO CARLOS PIZZOLITTO, por sua valiosa orientação,
sabedoria, amizade e dedicação.
O Sr. me servirá de exemplo no decorrer de minha carreira.
8
Aos amigos Beth e Pizzolitto
Será sempre eterno meu agradecimento por tudo que vocês direta
ou indiretamente fizeram por mim.
Vocês são muito importantes na minha vida.
9
Aos meus pais, Arnaldo e Ignêz
Que me ensinaram a caminhar pelo lado bom da vida.
Aos meus irmãos, Arnaldo, André, Aldo e Adélia que me serviram de exemplo.
À minha madrasta Helena pelo incentivo.
Ao meu sogro Cléo e minha sogra Maria Helena pelo estímulo e apoio.
Aos amigos do invisível que constantemente me orientam e me inspiram nas
dificuldades da jornada.
À DEUS e a JESUS por me darem o foco de luz.
Aos
Staphylococcus
sp. por me ajudarem a concluir este trabalho e auxiliar na
ciência. Vocês são realmente incríveis!!!!!!
10
Minha MÃE, meu irmão ALDO, tia CRISTINA e CLÉO: que não há mais nada que
nos separe a não ser um véu que os tornem invisíveis aos meus olhos materiais
11
A funcionária do setor de Microbiologia Clínica do CRD/NAC:
Benedita Reis de Abreu, pela colaboração profissional e pessoal dadas a este
trabalho.
Benê você é uma pessoa muito importante!!
Sem o seu capricho e amor dedicado à microbiologia este trabalho
não teria graça!!!!
12
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13
autor anônimo.
14
DADOS CURRICULARES
ADILSON CESAR ABREU BERNARDI
1 – DADOS PESSOAIS
Nascimento: 27.11.68
Nacionalidade: Brasileiro
Naturalidade: Araras – SP
Estado Civil: Casado
Filiação: Arnaldo Bernardi
Ignez App. de Abreu Bernardi
Profissão: Farmacêutico-Bioquímico
CRF-8 : 16.837
Documento de Identidade: RG 16.872.447-SP
Cadastro de Pessoa Física: 099 025 598-08
Endereço: Avenida Frederico de Marco, 336, Araraquara, SP
2 – FORMAÇÂO ACADÊMICA
Farmacêutico-Bioquímico pela Universidade de Ribeirão Preto-SP
Concluída em 1992
3 – CURSO CONCLUÍDO
Mestrado em Análises Clínicas pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
campus de Araraquara-UNESP.
Início: março de 1997.
Data de Defesa Dissertação: 13.12.2000
Título: Identificação de cocos aeróbicos gram-positivos, catalase-positiva com
implicação em processos infecciosos específicos.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Pizzolitto
15
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1-INTRODUÇÃO
........................................................................................................26
1.1-Revisão da literatura............................................................................................28
1.1.1-Virulência bacteriana............................................................................28
1.1.2-Fatores do hospedeiro nas infecções estafilocócicas..........................32
1.1.3-Fatores que comandam a aderência inicial dos Staphylococcus
coagulase-negativa as superfícies.................................................................35
1.1.4-Importância clínica da adesão estafilocócica.......................................38
1.1.5-Associação da produção de biofilme com infecções clínicas...............40
1.1.6-Constituição do slime............................................................................43
1.1.7-Prevenção das infecções estafilocócicas relacionadas ao uso de
implantes médicos.........................................................................................48
2-OBJETIVOS
............................................................................................................52
3-MATERIAL E MÉTODO
..........................................................................................53
3.1-Casuística.............................................................................................................53
3.2-Meios de cultura e reagentes...............................................................................53
3.3-Sistemas comerciais de identificação de cocos Gram-positivos catalase
positiva................................................................................................................54
3.4-Métodos...............................................................................................................55
3.4.1-Identificação dos microrganismos.....................................................................55
16
3.4.2-Identificação dos Staphylococcus sp................................................................55
3.4.2.1-Staphylococcus sp.............................................................................55
3.4.2.2-Teste da coagulase livre (prova em tubo).........................................55
3.4.2.3-Teste da coagulase conjugada (prova em lâmina)............................56
3.4.2.4-Resistência a bacitracina...................................................................56
3.4.2.5-Resistência a novobiocina.................................................................57
3.4.2.6-Resistência a polimixina B.................................................................57
3.4.2.7-Teste de hidrólise do pyrrolidonyl-β-naphylamide (PYR)..................57
3.4.2.8-Teste da utilização aeróbica dos carboidratos..................................58
3.5-Caracterização fenotípica das amostras de Staphylococcus coagulase-negativa
usando ágar vermelho Congo.............................................................................59
3.5.1-Produção de slime.............................................................................................59
3.6-Aderência de Staphylococcus coagulase-negativa em placa de poliestireno......60
3.7-Produção de biofilme sobre superfície abiótica....................................................61
3.7.1-Preparação da suspensão bacteriana...............................................................61
3.7.2-Produção in vitro de biofilme em cateter venoso central de poliuretano...........61
3.8-Detecção de resistência em Staphylococcus coagulase-negativa.......................62
3.8.1-Resistência a oxacilina......................................................................................62
3.9-Métodos moleculares para pesquisa de genes de virulência icaA e icaD em
Staphylococcus coagulase-negativa...................................................................63
3.9.1-Caracterização molecular de Staphylococcus coagulase-negativa..................63
3.9.1.1-Extração de DNA genômico..............................................................63
3.9.1.2-Amplificação de DNA pela reação de polimerase em cadeia (PCR).64
4-RESULTADOS
........................................................................................................66
17
4.1-Identificação das amostras de Staphylococcus coagulase-
negativa...............................................................................................................66
4.2-Detecção de resistência em Staphylococcus coagulase-
negativa...............................................................................................................67
4.3-Produção de Slime...............................................................................................69
4.4-Aderência de Staphylococcus coagulase-negativa em placa e
poliestireno..........................................................................................................72
4.5-Formação do biofilme pelas amostras de Staphylococcus coagulase-negativa..75
4.6-Detecção dos genes icaA e icaD determinada por PCR......................................81
4.7-Perfil de resistência de Staphylococcus coagulase-
negativa...............................................................................................................88
5-DISCUSSÃO
...........................................................................................................91
6-CONCLUSÕES
.....................................................................................................106
7-REFERÊNCIAS
.....................................................................................................108
8-APÊNDICE
18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
-Reação a oxacilina entre as espécies de Staphylococcus coagulase-
negativa......................................................................................................67
Tabela 2
-Freqüência das amostras de Staphylococcus coagulase-negativa
resistentes a oxacilina................................................................................68
Tabela 3
-Produção de slime entre as espécies de Staphylococcus coagulase-
negativa......................................................................................................70
Tabela 4
-Freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa
produtoras e não produtoras de slime detectado em ágar vermelho
Congo.........................................................................................................71
Tabela 5
-Densidade óptica das reações de aderência entre as espécies de
Staphylococcus coagulase-negativa..........................................................72
Tabela 6
-Freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase negativa forte e
fracamente aderentes a placa de poliestireno...........................................74
Tabela 7
-Formação do biofilme entre as espécies de Staphylococcus coagulase-
negativa.....................................................................................................75
Tabela 8
-Freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa
formadoras de biofilme...............................................................................76
Tabela 9
-Presença de genes icaA e icaD entre as espécies de Staphylococcus
coagulase-negativa....................................................................................84
Tabela 10
-Freqüência de expressão dos genes icaA e icaD entre as espécies de
Staphylococcus coagulase-negativa........................................................85
Tabela 11
-Comparação de resultados obtidos após estudo fenotípico e genotípico
entre as espécies de Staphylococcus coagulase-negativa......................86
19
Tabela 12
-Distribuição das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa nas
amostras clínicas......................................................................................87
Tabela 13
-Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das 27 cepas de
Staphylococcus coagulase-negativa........................................................88
Tabela 14
-Distribuição das amostras clínicas em relação aos microrganismos e ao
teste de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos.........................90
20
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
-Organização genética do grupamento do gene ica.....................................46
Figura 2-
Freqüência de amostras de Staphylococcus coagulase-negativa..............66
Figura 3
-Colônias negras de amostras produtoras de slime em ágar vermelho
Congo.........................................................................................................69
Figura 4
- Colônias vermelhas de amostars não produtoras de slime em ágar
vermelho Congo.........................................................................................69
Figuras 5A e 5B
- Teste de aderência em placa de poliestireno...............................73
Figura 6
-Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S.epidermidis
sobre superfície abiótica (cateter)..............................................................77
Figura 7
- Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S.haemolyticus
sobre superfície abiótica (cateter)..............................................................77
Figura 8
- Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S.warneri sobre
superfície abiótica (cateter)........................................................................78
Figura 9
- Micrografia eletrônica de varredura (X7500) de biofilme de S.lugdunensis
sobre superfície abiótica (cateter)..............................................................78
Figura 10
- Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S.xylosus
sobre superfície abiótica (cateter)............................................................79
Figura 11
- Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S.hominis
sobre superfície abiótica (cateter)............................................................79
Figura 12
- Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S.schleiferi
sobre superfície abiótica (cateter)............................................................80
Figura 13
- Micrografia eletrônica de varredura (X2000) de biofilme de
S.saprophyticus sobre superfície abiótica (cateter)..................................80
21
Figura 14A e 14B
-Gel analítico PCR para gene icaA...............................................82
Figura 15A e 15B
-Gel analítico PCR para gene icaD...............................................83
22
RESUMO
Os Staphylococcus coagulase-negativa, particularmente, os Staphylococcus
epidermidis são a causa mais freqüente de infecções relacionadas ao cateter por
sua habilidade em aderir a uma superfície e entre si (aderência intercelular)
formando biofilme em multicamadas sobre superfícies de polímeros. O objetivo do
presente estudo foi avaliar cepas hospitalares de Staphylococcus coagulase-
negativa isoladas de cateteres intravenosos, quanto à resistência a oxacilina,
produção de slime, aderência ao poliestireno, habilidade de formar biofilme sobre
superfícies abióticas (cateter esterilizado) e a presença de genes icaAD. Na presente
pesquisa, a presença de icaA e icaD foi determinada pelo método PCR, em uma
coleção de 27 amostras Staphylococcus coagulase-negativa (10 Staphylococcus
epidermidis, 4 S. haemolyticus, 2 S. hominis, 2 S. lugdunensis, 1 S. saprophyticus, 1
S. schleiferi, 2 S. xylosus e 4 S. warneri). Os genes icaAD foram detectados em dez
cepas S. epidermidis. A habilidade de formar slime foi testada em placas contendo
ágar vermelho Congo, no qual foram observadas colônias negras em 10 cepas S.
epidermidis, 4 S. haemolyticus, 4 S. warneri, 2 S. xylosus e 1 S. chromogenes. A
aderência dos Staphylococcus coagulase-negativa ao poliestireno foi observada em
19 cepas, incluindo: 10 S. epidermidis, 3 S. haemolyticus, 3 S. warneri, 2 S. xylosus,
1 S. chromogenes. A habilidade dos Staphylococcus coagulase-negativa de formar
biofilme com agrupamento de cocos envoltos em substância amorfa foi observada
por microscópio eletrônico de varredura sobre superfície abiótica em 10 S.
epidermidis, 3 S. haemolyticus, 2 S. hominis, 2 S. lugdunensis, 1 S. saprophyticus, 1
S. schleiferi, 2 S. xylosus e 3 S. warneri. O teste de resistência a oxacilina mostrou 9
cepas S. epidermidis resistentes a oxacilina, 3 S. haemolyticus, 3 S. warneri, 1 S.
23
xylosus e 1 S. chromogenes. O antibiograma mostrou que 100% Staphylococcus
coagulase-negativa eram sensíveis a vancomicina e 88,88% resistentes a pencilina.
A detecção de slime, a habilidade de aderir e formar biofilme foi observada na
maioria das amostras Staphylococcus coagulase-negativa sugerindo alta incidência
de amostras com potencial patogênico em ambiente hospitalar. As mesmas
amostras que produziram slime, resistência a oxacilina e formaram biofilme eram
resistentes a mais de seis antibióticos. A presença dos genes de adesão intercelular
(icaAD) foi detectada na maioria das amostras Staphylococcus coagulase-negativa,
exceção para S. saprophyticus e S. scheleiferi, sugerindo que estas amostras não
tem homologia com S. epidermidis.
Palavras-chave: slime, operon ica, Staphylococcus epidermidis, fatores de virulência,
24
ABSTRACT
Coagulase-negative Staphylococcus, particularly, Staphylococcus epidermidis are
frequent cause of infections associated with catheters and is attributed to the
attachment ability on a surface and each other (intercellular adhesion) forming a
multilayered biofilm on polymeric surfaces. The objective of the present study was to
evaluate coagulase-negative Staphylococcus strains isolated from intravenous
catheters by oxacillin resistance, slime production (qualitative method) and
spectrophotometric assay (quantitative method), ability to form biofilm on abiotic
surfaces (steriled catheter) and the presence of icaAD genes. In the present study
icaA and icaD were determined by PCR method, in a collection of 27 coagulase-
negative Staphylococcus (10 Staphylococcus epidermidis, 4 S. haemolyticus, 2 S.
hominis, 2 S. lugdunensis, 1 S. saprophyticus, 1 S. schleiferi, 2 S. xylosus and 4 S.
warneri). The icaA genes were detected in nine S. epidermidis and icaD in ten. The
slime-producing ability was determined by culture on Congo red agar plates in which
slime-producing strains formed black colonies in 10 S. epidermidis, 4 S.
haemolyticus, 4 S. warneri, 2 S. xylosus and 1 S. chromogenes, while nonslime-
forming ones develop red colonies. The quantitative assay of coagulase-negative
Staphylococcus was observed in 19 strains, including: 10 S. epidermidis, 3 S.
haemolyticus, 3 S. warneri, 2 S. xylosus, 1 S. chromogenes. The ability of coagulase-
negative Staphylococcus to form biofilm embedded in an amorphous substance was
observed by scanning electronic microscope on abiotic surface in 10 S. epidermidis,
3 S. haemolyticus, 2 S. hominis, 2 S. lugdunensis, 1 S. saprophyticus, 1 S. schleiferi,
2 S. xylosus and 3 S. warneri. The oxacillin resistance was observed in 9 strains S.
epidermidis, 3 S. haemolyticus, 3 S. warneri, 1 S. xylosus and 1 S. chromogenes. All
25
strains of staphylococci were susceptible to vancomycin and 88.88% penicillin
resistant. The slime detection, the ability to stick and to form biofilm was observed in
most of the Staphylococcus coagulase-negative strains, which suggests high
incidence of strains with pathogenic potential in nosocomial environment. The same
strains that produced slime, resistance to oxacilln and formed biofilm were multi drug
resistant. The presence of the icaAD genes of intercellular adhesion were detected in
most of the strains Staphylococcus coagulase-negative, exception for S.
saprophyticus and S. schleiferi, sugesting that these strains do not have homology
with S. epidermidis.
Key words: slime, operon ica, Staphylococcus epidermidis, virulence factors
26
1 - INTRODUÇÃO
Os Staphylococcus estão distribuídos na natureza, e fazem parte da
microbiota normal da mucosa e da pele de mamíferos e aves. O gênero é composto
por 40 espécies e 24 sub-espécies. Em geral, os Staphylococcus apresenta uma
relação benigna ou simbiótica com o hospedeiro; entretanto pode tornar-se
patogênico quando ganha acesso aos tecidos por meio de traumatismos da barreira
cutânea, inoculação por agulhas, ou implantação direta por próteses médicas
(corpos estranhos).
Até 1975, os Staphylococcus coagulase-negativa eram agrupados junto
com a espécie Staphylococcus albus e a espécie Staphylococcus epidermidis,
distintos da espécie Staphylococcus aureus por sua inabilidade em coagular o
plasma. Baseado em suas características e sua suposta importância na virulência,
os Staphylococcus coagulase-negativa foram freqüentemente descritos como
avirulentos.
Sua patogenicidade têm sido reconhecida apenas recentemente e
fatores específicos envolvidos na sua patogênese estão apenas, agora sendo
explorados. O aumento da incidência de infecção causada por esta bactéria pode
estar atribuída em sua particular afinidade em materiais implantáveis que estão
integradas na medicina moderna.
Atualmente, os Staphylococcus coagulase-negativa igualam-se aos
Staphylococcus aureus e mesmo já o ultrapassou em relatos de doenças infecciosas
hospitalares ou como causa primária das infecções das feridas externas.
O aumento no uso de implantes médicos, cateteres intravasculares e
outras tecnologias invasivas em pacientes debilitados e imunossuprimidos trazem
27
consigo os Staphylococcus coagulase-negativa como patógeno hospitalar resultando
em considerável morbidade e gasto médico para seu tratamento. Ainda mais, os
Staphylococcus coagulase-negativa tem-se tornado resistentes aos antibióticos, aos
mais recentes tratamentos, tornando as cepas com níveis moderados de resistência
a vancomicina.
28
1.1 - REVISÃO DA LITERATURA
1.1.1 – VIRULÊNCIA BACTERIANA
Após o nascimento, um indivíduo adquire certos microrganismos que
podem se tornar permanentes ou temporariamente associados a ele; a estes
microrganismos chamamos de microbiota normal, muitos dos quais desempenham
importante função para o hospedeiro (MURRAY et al., 2004).
Para as bactérias, o corpo humano representa um conjunto de nichos
ambientais que lhes fornecem o calor, a umidade e o alimento necessário a seu
crescimento.
As bactérias adquiriram traços genéticos que as tornam capazes de
penetrar (invadir) no hospedeiro, permanecer em determinado nicho colonizando-o,
ter acesso a fontes alimentares (enzimas degradáveis) e escapar do processo de
eliminação pelas respostas protetoras imunes e não imunes (MURRAY et al., 2004;
SCHAECHTER & EISENSTEIN, 2002).
Muitos dos mecanismos empregados pelas bactérias para manter seu
nicho e os subprodutos do crescimento bacteriano são incompatíveis com o sistema
do hospedeiro. Muitas destas características genéticas consistem em fatores de
virulência que aumentam a capacidade da bactéria de causar doença (SALYERS &
WHITT, 1994; ZANON & MARANGONI, 1998).
Tanto a infecção quanto à doença resulta de interações entre estes
microrganismos e seus hospedeiros. Algumas vezes, uma infecção produz efeitos
não observáveis, mesmo que o hospedeiro tenha seus tecidos invadidos. Com maior
freqüência quando, uma infecção produz distúrbios observáveis no estado de saúde
do hospedeiro, ocorre o que chamamos de doença infecciosa. Quando uma infecção
29
causa doença, seus efeitos variam de moderados a graves (BLACK, 2002; BROOKS
et al., 2000).
Os patógenos possuem diferentes capacidades de alterar o estado de
saúde de um indivíduo, isto é, eles mostram diferentes graus de patogenicidade
(capacidade de produzir doença). A patogenicidade de um microrganismo consiste
na capacidade de penetrar num hospedeiro, se multiplicar em seu interior e evitar
ser atingido pelas suas defesas (MURRAY et al, 2004; BLACK, 2002; BROOKS et
al., 2000) .
Um importante fator na patogenicidade é o número de organismos que
penetra no corpo. Se este número for pequeno, as defesas do hospedeiro podem
ser capazes de eliminar os organismos antes que eles possam causar doença. Se
ocorrer em grande número, eles podem superar as defesas e causar doença
(HARVILL & MILLER, 2000).
Quando nos referimos na intensidade da doença produzida por um
patógeno chamamos de virulência (grau de patogenicidade) e esta varia entre as
espécies microbianas. A virulência é sempre multifatorial, já que o processo de
infecção é invariavelmente complexo. Diversos fatores de virulência (aderência,
invasão, subprodutos do crescimento, toxinas, superantígeno, indução de
inflamação excessiva, evasão das defesas e resistência aos antibióticos) devem
entrar em ação em cada estágio do processo para que um microrganismo
patogênico provoque doença e alguns pontos devem ser questionados para um
determinado patógeno como: quais os fatores de virulência envolvidos na instalação
da doença; como esses fatores estão envolvidos na instalação da doença e se os
genes de virulência são regulados, ou seja, se existe, sinais especiais do ambiente
que induzem o microrganismo a ativar ou a inibir a expressão dos genes de
30
virulência (BLACK, 2002; BROOKS et al., 2000; KONEMAN et al., 2001; MURRAY et
al., 2004; QUINN, et al., 1997).
Alguns agentes freqüentemente causam doenças quando alcançam um
hospedeiro susceptível, outros causam doenças somente em raras ocasiões e
normalmente em hospedeiros com as defesas debilitadas. Dentre estes últimos,
podemos citar as espécies Staphylococcus coagulase-negativa, que fazem parte da
microbiota normal da nossa pele vivendo em equilíbrio e representam o maior
componente da microbiota cutânea; por muito tempo os pesquisadores os
descreveram como protótipo de microrganismo avirulento (MENICHETTI, 2005).
Como possuem baixo poder patogênico, são reconhecidos como
oportunistas e já há alguns anos vários estudos mostram os mecanismos pelos
quais os Staphylococcus coagulase-negativa são capazes de causar infecções
graves e irreversíveis associadas aos biomateriais. A produção de um muco
(polissacarídeo extracelular) com conseqüente formação do biofilme é o principal
fator para a aderência e colonização destes biomateriais. As bactérias nos biofilmes
são ligadas dentro da rede de polissacarídeos, substância mucóide, que mantém as
células unidas e ligadas à superfície (BADDOUR et al., 1991; BLACK, 2002;
BROOKS et al., 2000; MURRAY et al., 2004; NOVICK & MUIR, 1999;
SCHAECHTER & EISENSTEIN, 2002).
Apenas na década de 1980, os pesquisadores começaram a dar maior
atenção para o isolamento dos Staphylococcus coagulase-negativa em sítios
estéreis por apresentarem algo mais do que um simples contaminante de cultura
(LOWY & HAMMER, 1983; CHRISTENSEN et al., 1993). Os Staphylococcus
coagulase-negativa podem ser divididos em dois grupos dependendo da
sensibilidade ou resistência a novobiocina. Os Staphylococcus que são da
31
microbiota humana sensível a novobiocina incluem os Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis
e os resistentes a novobiocina são as espécies Staphylococcus saprophyticus e os
Staphylococcus xylosus (HEILMANN & PETERS, 2000; von EIFF et al., 2002)
Os Staphylococcus coagulase-negativa, são reconhecidos como
clinicamente importantes, principalmente quando estão envolvidos em infecções de
próteses e equipamentos médicos que geram doenças graves e morte e esta
capacidade em causarem doença era inesperada, principalmente por representarem
um grupo de microrganismo avirulento (CHRISTENSEN et al., 1982; 1993;
CHRISTENSEN et al., 1994).
Dados do “National Nosocomial Infection Surveillence System”
mostraram que de janeiro de 1990 a maio de 1999 os Staphylococcus coagulase-
negativa foram os patógenos mais comuns descritos (37,3% comparando com
12,6% para os Staphylococcus aureus) isolados de bacteriemias e em pacientes
especiais (COSTA et al., 2004; von EIFF et al., 2002).
CHRISTENSEN et al., 1994, descreveram que, desde 1960 quando
Baird-Parker notou a produção de um material mucóide por várias cepas de
Staphylococcus coagulase-negativa, iniciava-se o estudo do slime (biofilme
bacteriano). Vários pesquisadores (HUSSAIN et al., 1993; FOSTER & Mc DEVITT
1994; von EIFF et al., 1998; HEILMANN & PETERS, 2000) observaram que o slime
é constituído de um material aderente, mucóide, que se deposita nas próteses
médicas, importante na patogênese das infecções pelo uso destes materiais
Os Staphylococcus coagulase-negativa, particularmente o
Staphylococcus epidermidis, são os maiores causadores de infecções de próteses
médicas do que outros microrganismos; é a causa principal de infecção por
32
cateteres intravasculares (CHEESBOUGER et al., 1986; JONES et al., 1986;
SHERETZ et al., 1983), válvula cerebral (GEORGE et al., 1979; ODIO et al., 1984),
válvula cardíaca (DOUGHERTY et al., 1986; GNANN e COBBS, 1985; KARCHMER
et al., 1983; MARPLES et al., 1985) aparelhos ortopédicos (FITZGERALD et al.,
1985; INMAN et al., 1984; IVEY et al., 1990) marca-passo cardíaco artificial
(BADDOUR et al., 1990; CHOO et al., 1981; KLUG et al., 2003; RUITER et al.,
1985), cateter de diálise peritoneal (BADDOUR et al., 1986; GOKAL et al., 1987;
McALLISTER et al., 1987; WEST et al., 1986) e aparelhos protéticos em geral
(BANDYK et al, 1984; GRISTINA et al, 1988).
Ao contrário, quando descrevemos os Staphylococcus coagulase-
positiva (S. aureus), sabemos de sua capacidade de invadir e infectar tecidos,
mesmo que façam parte da microbiota normal da pele, sendo assim reconhecido
como protótipo de microrganismo virulento (KLOOS & MUSSELWHITE, 1975; LOWY
& HAMMER, 1983).
1.1.2 - FATORES DO HOSPEDEIRO ENVOLVIDOS NAS INFECÇÕES
ESTAFILOCÓCICAS
Nos dias de hoje, é impossível imaginar a medicina moderna sem os
implantes médicos, o seu uso indispensável e as vantagens deste tipo de
intervenção médica para o paciente por muitas vezes salvando vidas, mas
complicações não poderiam deixar de acontecer. Uma das complicações mais
freqüentes e significativas do implante cirúrgico é a manifestação da infecção do
tecido ao redor do implante, sendo que, a conseqüência da infecção para o paciente
33
resulta no aumento de dias de internação, sepsis e até a morte (DAVEY &
O’TOOLE, 2000; PRINTZEN, 1996).
As superfícies de muitas bactérias apresentam uma rede de cargas
elétricas negativas e contém componentes lipídicos que confere uma superfície
hidrofóbica. Forças eletrostáticas e hidrofóbicas não específicas são importantes
para a fixação das bactérias em materiais protéticos (WILKS & SISSONS, 1997).
Fatores de aderência, fatores de colonização, adesinas, ou ainda antígenos de
aderência são componentes estruturais das células bacterianas que as capacitam
colonizar, sobreviver e multiplicar-se em um dado tecido de seus hospedeiros ou
superfícies (
http://www.delphianos.com.br).
Bactérias gram-positivas que colonizam humanos, expressam múltiplas
proteínas de superfície com propriedades adesivas. Estas adesinas equipam as
bactérias com uma função complementar de ligação que facilita seu crescimento e
sobrevivência aos diferentes sítios do hospedeiro de acordo com os receptores
disponíveis, competição microbiana e resposta imunológica não só facilitando a
colonização como também a invasão (CHHATWAL & JENKINSON, 2002).
É o que acontece com os Staphylococcus sp. que expressam na sua
superfície receptores específicos que interagem com adesinas específicas do
hospedeiro (CHHATWAL & JENKINSON, 2002). Muitas proteínas de parede celular
dos Staphylococcus são relatadas e recentemente uma fímbria com estrutura
protéica com função de ligação dos Staphylococcus coagulase-negativa a materiais
implantáveis foi descrita (HUEBNER & GOLDMANN, et al., 1999). A adesão é um
pré-requisito para os Staphylococcus coagulase-negativa causarem doenças
invasivas e podem ser mediadas por moléculas adesivas do hospedeiro que se
encontram adsorvidas no polímero dos implantes Estas adesinas, compreendem
34
proteínas e glicoproteinas, componentes do plasma, plaquetas, tecido conjuntivo e
membranas basais (HUSSAIN et al., 2001; VAUDAUX et al., 1994; von EIFF et al.,
2002). Proteínas de adesão celular regulam processos essenciais e promovem
sinais que afetam a morfologia, a motilidade, a expressão gênica e a sobrevivência
celular (BUSTANJI et al., 2003)
A maioria das proteínas do hospedeiro que interagem com os
Staphylococcus e promovem a aderência quando em contato com uma superfície
são a fibronectina, fibrinogênio, fibrina, colágeno, laminina, vitronectina,
trombospondina, elastina e plasminogênio (ALCARÁZ et al., 2003; BALDASSARI et
al., 1997; BUSTANJI et al., 2003; CHRISTENSEN et al., 1994.; DICKINSON et al.,
1995; 2000; FALLGREN et al., 2001; HARTFORD et al., 2001; HUSSAIN et al.,
2001; PRINTZEN, 1996; VAUDAUX et al., 1994; von EIFF et al., 2002). A
fibronectina é uma proteína de matriz extracelular que está distribuída nos tecidos de
vertebrados e é um importante mediador de invasão bacteriana e de infecções
persistentes dos Staphylococcus coagulase-negativa por encontrarem-se aderidos
no polímero adsorvido sobre fibronectina (BUSTANJI et al., 2003; CHHATWAL,
2002; FOSTER & McDEVITT, 1994; HARTFORD et al.; 2001 HUSSAIN et al., 2001;
PEACOCK et al., 1999; von EIFF et al., 2002). Estudos in vitro, mostram que o ácido
lipoteicóico, um constituinte essencial da parede celular, auxilia aumentando o
processo de aderência por ligarem as células dos Staphylococcus a coágulos de
fibrina, bem como as plaquetas aderidas na superfície de plástico do material
facilitam esta aderência (CHRISTENSEN et al., 1994; HUSSAIN et al., 2001;
NILSDOTTER-AUGUSTINSSON et al., 2005).
Uma vez em contato, os fluidos corpóreos imediatamente cobrem toda
superfície do material de implante, primeiramente proteínas do soro e plaquetas,
35
formando uma camada condicionante modificando as propriedades de superfície
auxiliando na aderência celular (CÁRLEN et al., 2001; CHRISTENSEN, 1989;
CHRISTENSEN et al., 1994; HARTFORD et al., 2001).
Esta habilidade dos Staphylococcus em ligarem-se especificamente a
estas proteínas é descrita como um fator de virulência (NILSDOTTER-
AUGUSTINSSON et al., 2005).
Pesquisadores observaram que antes do implante do material seria
necessário realizar um pré-tratamento deste com soro ou plasma para inibir a
aderência da maioria das cepas de Staphylococcus coagulase-negativa in vitro
(CHRISTENSEN et al., 1994).
Um outro aspecto importante na resposta do hospedeiro às infecções
estafilocóccicas é a migração direta de fagócitos para o foco infeccioso que age
como um estímulo. O estabelecimento de um foco inflamatório promove a liberação
de mediadores humorais que atrai e modula os componentes da resposta celular
(VAUDAUX et al., 1994).
1.1.3 - FATORES QUE COMANDAM A ADERÊNCIA INICIAL DOS
Staphylococcus
COAGULASE-NEGATIVA AS SUPERFÍCIES
A aderência bacteriana é um fator importante na contaminação de
materiais de implante e depende das características da superfície da célula
bacteriana e da natureza do substrato (material do polímero) (AN & FRIEDMANN,
1997; CORDERO et al., 1996; MERRITT et al., 1999; SCHWANK et al., 1998; von
EIFF et al., 2002). Sabe-se que a colonização em superfícies inanimadas,
implantadas no hospedeiro ou testadas in vitro pelos Staphylococcus coagulase-
36
negativa, requer a passagem por vários estágios (CHRISTENSEN et al., 1994;
EGINTON et al., 1995; MERRITT et al., 1997). O primeiro estágio da colonização, a
exposição, ou fase de chegada é realmente importante na determinação da infecção
por microrganismos e é reversível (CHRISTENSEN et al., 1994; KLOSS &
MUSSELWHITE, 1975; MORALES et al., 2004).
Além disso, a suspensão de células microbianas fará com que algumas
destas células entrem em contato com o material de implante sob ação de forças do
tipo quimiotáticas, gravitacional, do fluxo do fluido na superfície e forças não
específicas de características fisicoquímicas da superfície bacteriana e da superfície
do material que incluem as forças de van de Waals, forças eletrostáticas, tensão
superficial e de hidrofobicidade superficial (CHRISTENSEN et al., 1994; MAKI,
1994).
A aderência inicial é promovida pela presença de sítios únicos
existentes na superfície do material e variações na hidrofobicidade, irregularidades
superficiais e a presença de proteínas plasmáticas adsorvidas na superfície do
material (camada condicionante) e o acúmulo deste material formam camadas
dando origem ao biofilme. Uma vez as células bacterianas aderidas à superfície do
material de implante, servem de sinal ou de alvo para receptores bacterianos
específicos se ligarem (CHRISTENSEN et al., 1994; GELOSIA et al., 2001).
Esta fase de colonização é de fundamental interesse para os
pesquisadores, porque muitas destas forças podem ser modificadas na fabricação
de novos materiais médicos, minimizando a adesão bacteriana e conseqüentemente
à infecção.
O segundo estágio ou fase de imobilização é acompanhado pela
multiplicação local dos Staphylococcus coagulase-negativa com a formação de um
37
crescimento superficial aderente protegido por uma camada de polissacarídeo
extracelular denominada de slime produzido nesta fase (ALCARÁZ et al., 2003;
FREEMAN et al., 1989; GELOSIA et al., 2001; HUSSAIN et al., 1992; 2001;
KOTILAINE, 1990; MORALES et al., 2004; SHIRO et al., 1994).
As raras células de Staphylococcus coagulase-negativa que aderirem a
superfície do material a estes sítios únicos irão colonizar com sucesso esta
superfície pela produção do slime. O slime estabiliza as associações células a
células e célula na superfície permitindo o acúmulo bacteriano ao material médico
finalizando o estágio de colonização a superfície (CHRISTENSEN et al., 1994).
Em virtude das variações das fases ou modulação fenotípica, as
células filhas que não estão ligadas a colônia pelo slime encontram-se livres e
prontas a fixarem-se a novos sítios e repetir o processo de colonização
(CHRISTENSEN et al., 1994).
São necessários fatores adicionais para o crescimento acumulativo e
formação do biofilme pelos Staphylococcus coagulase-negativa e uma proteína
extracelular de 140 KDa chamada de proteína associada ao acúmulo (AAP) têm sido
descrita como essencial no crescimento acumulativo na superfície dos polímeros e
está envolvida no processo de aderência e é o componente chave do
desenvolvimento do biofilme em superfícies mas, sua exata função não está ainda
bem definida (MORALES et al., 2004).
Todas bactérias produzem múltiplas adesinas e algumas são reguladas
a nível transcripcional permitindo que os microrganismos escolham a forma séssil ou
plantônica, dependendo das diferenças influencias do meio. O processo da
formação do biofilme e seu desprendimento pode ser regulado por comunicação
célula a célula e pela densidade da população formada. Dentro do biofilme maduro
38
há diferenças no crescimento bacteriano, produção metabólica, pH, taxa de
crescimento, nível de oxigênio, síntese de polímeros extracelulares entre outras
situações que permitem a estabilidade e a persistência do biofilme (MORALES et al.,
2004)
1.1.4 - IMPORTÂNCIA CLÍNICA DA ADERÊNCIA DE ESTAFILOCOCOS
Clínicos que tratam infecções bacterianas relacionadas a implantes e
outras infecções crônicas tem definido estes casos como uma nova categoria de
doenças infecciosas que diferem bastante das síndromes bacterianas agudas
predominantes até a metade do último século (COSTERTON et al., 2003; DONLAN,
2001).
Considerando a variedade de materiais usados na construção de
próteses médicas e de localizações anatômicas para implantá-los, fica difícil
entender por que em particular um grupo de microrganismos avirulentos emergem
como causa primária de infecções, ou sobre esta questão, por que a quantidade de
próteses médicas infectadas pelos Staphylococcus coagulase-negativa é maior do
que as infecções causadas por Staphylococcus aureus (CHRISTENSEN et al., 1994;
von EIFF et al., 2001; VUONG & OTTO, 2002).
Este paradoxo tem sido o objeto de extensivas pesquisas e
investigações por mais de uma década. Uma explicação para este tropismo é que
cepas patogênicas de Staphylococcus coagulase-negativa têm a capacidade, não
comum, de aderir e colonizar estas próteses médicas, mais particularmente
superfícies lisas, formando um filme aderente conhecido como slime. Embora a
produção do slime é uma das explicações para este tropismo a colonização destas
39
próteses médicas é complexa e um processo que envolve várias etapas
(ALTOPARLAK et al., 2004; FREBOURG et al., 2000; CHRISTENSEN et al., 1994;
MERRITT et al., 1997; YASSIEN & KHARDORI, 2001). A importância clínica e a
função patogenética dos Staphylococcus coagulase-negativa foram primeiro
reconhecidas no início de 1960 em infecção de válvula cérebro-espinhal. Ainda na
década de 60, o taxonomista Baird-Parker notou a produção de um material mucóide
por várias cepas de Staphylococcus coagulase-negativa. Bayston & Penny em 1972,
observaram que algumas cepas de Staphylococcus coagulase-negativa produziam
um exopolissacarídeo mucóide de importância clínica com potencial indicador de
virulência (CHRISTENSEN et al., 1994; FREEMAN et al., 1989; HEINZELMANN et
al., 1997) Vários outros pesquisadores também observaram a presença deste
material mucóide relacionado à patogênese de processos infecciosos
(AMMENDOLIA et al., 1999; CHRISTENSEN at al., 1994; FARBER et al., 1990;
ISHAK et al., 1985; KOTILAINEN, 1990).
Christensen, et al., 1994, descrevem que o termo slime foi descrito por
Jones et al, em 1963 que observaram o fenômeno pela primeira vez e evita confusão
com o termo material mucóide que sugere tanto material de origem animal ou um
material químico específico ou seja, mucopolissacarídeo.
Hoje, o termo slime, por alguns autores, é descrito como biofilme,
composto por produtos bacterianos e do hospedeiro, de diferentes composição
química (ARCIOLA et al., 2001; GELOSIA et al., 2001; GERKE et al., 1998;
McKENNEY et al., 1998).
Visto que os Staphylococcus coagulase-negativa residem normalmente
na pele, a produção do slime e de outros mecanismos de aderência poderiam
auxiliar o microrganismo a evitar sua dessecação e auxiliar sua aderência na
40
superfície do cabelo e da pele. Por outro lado, os mecanismos de aderência a
superfícies lisas promovem a transferência das bactérias da pele para implantes e
outros objetos, desse modo, promovendo a disseminação bacteriana pela
manipulação destes materiais.
Conseqüentemente, a associação de matérias médicos com a
produção de slime pelos Staphylococcus coagulase-negativa, deve ser um acidente
natural onde estes microrganismos por engano, trocaram seu hábitat natural pelo
microambiente de materiais médicos.
Portanto, a produção de slime deve ser uma resposta adaptativa de
algumas cepas na presença de corpos estranhos e todo processo que envolve
desde a adesão bacteriana até a formação do biofilme é um fator importante na
virulência destes microrganismos (VOGEL et al., 1999).
1.1.5 - ASSOCIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE BIOFILME COM INFECÇÕES
CLÍNICAS
Na década de 70, mesmo com alguns relatos não foi dada muita
atenção ao fato e apenas em 1980, pesquisadores do mundo começaram a
reconhecer os Staphylococcus coagulase-negativa como patógeno comum,
especificamente relacionado a sepse hospitalar pelo uso de cateter e um dos pré-
requisitos para infecções crônicas associadas ao uso de polímeros pelos
Staphylococcus é a aderência à sua superfície (GOTZ, 2002).
Em investigações de sepse relacionada ao uso de cateter, Christensen
et al. (1982,1985) observaram que cepas isoladas de casos clínicos, de
Staphylococcus coagulase-negativa quando inoculadas em tubos de plásticos
41
contendo caldo de soja tríptica cobriam a parede do tubo por uma espessa camada
viscosa observada após coloração, formando um filme residual de bactéria
denominada de slime. Com o intuito de quantificar esta aderência, o método foi
substituído por placas de poliestireno de micro-poços em U e a leitura medida por
densidade óptica com um espectofotômetro automático do filme aderente corado.
Outros métodos de detecção, como técnicas bioquímicas e genéticas
usadas para estudar a formação do biofilme nos Staphylococcus têm sido revistas,
como a de detecção de um fenótipo através da observação de colônias positivas ou
negativas para a produção do slime pelo método do ágar vermelho Congo descrito
por Freeman et al., 1999 (ARCIOLA et al., 2001; HUSSAIN et al., 1992; GOTZ,
2002).
Nos últimos anos vários fatores têm sido identificados por influenciarem
ou induzirem a produção do biofilme por condições que são potencialmente tóxicas
para a célula bacteriana e observaram a ativação do biofilme por um aumento da
osmolaridade, ação de fatores ambientais como o meio, a presença de carboidratos,
limitação de ferro, tensão de CO
2
, oxigenação, ação de detergentes, de antibióticos,
uréia, etanol, stress oxidativo, ácido oléico, anaerobiose e altas temperaturas
(CRAMTON et al., 2001; GOTZ, 2002; RACHID et al., 2000; SELAHATTIN et al.,
2000). Um último passo da infecção por corpos estranhos é fortemente afetada pela
reação inflamatória e defesas do hospedeiro (VANDECASTEELE et al., 2003).
Como observado, a produção de biofilme está sujeita a variações, e por
não saber sua real composição e função é descrita como um marcador de virulência,
mas, dados epidemiológicos e experimentais sugerem que a produção do biofilme
contribui com propriedades de virulência do microrganismo em promover a
42
colonização de materiais médicos (BALDASSARI et al., 1997; CHRISTENSEN et al.,
1994; ZIEBUHR et al., 1999).
A infecção é a maior complicação associada com o uso de materiais
implantáveis, como os cateteres. Os Staphylococcus coagulase-negativa são os
patógenos mais importantes nestas infecções e sua patogênese está correlacionada
na habilidade de algumas cepas em produzir grandes quantidades de slime
(BALDASSARI et al., 1997)
A cura de infecção relacionada ao uso de biomateriais pelos
Staphylococcus coagulase-negativa requer a remoção do biomaterial infectado e
completo desbridamento do tecido lesado bem como uma revisão da terapia
antibiótica (GOTZ, 2002).
Durante décadas mais recentes, o uso de próteses médicas tem
crescido claramente e concomitantemente o risco de infecções associadas tem
aumentado drasticamente. Muitas destas próteses são colonizadas por bactérias
capazes de desenvolver biofilmes. A maioria dos biofilmes associados à infecção
são formados por uma simples espécie bacteriana com exceção nos cateteres
urinários e próteses vocais (MORALES et al., 2004; VUONG & OTTO, 2002).
Cepas hospitalares tem um potencial maior em formar biofilme devido à
importante presença do gene ica e outros determinantes de virulência, desta
maneira refletindo a diversidade etiológica das infecções pelos Staphylococcus
coagulase-negativa (FITZGERALD et al., 2005).
Costerton et al., 2003, descrevem que os biofilmes estão envolvidos na
disseminação da doença dentro do corpo de indivíduos infectados e quando se fala
em distribuição hematogênica da infecção, deve-se especificar se as unidades
infecciosas são células plantônicas ou fragmentos do biofilme por diferenciarem-se
43
em propriedades de resistência antibiótica e características de aderência. Células
plantônicas são desprendidas do biofilme maduro e são geralmente sensíveis aos
antibióticos e aderem a certos tecidos e superfícies inertes com considerável avidez.
Por esta razão, faz-se o uso de terapia profilática para prevenir a colonização de
implantes médicos recentemente implantados por bactérias plantônicas introduzidas
pela corrente sanguínea por procedimentos rotineiros como escovação dos dentes
ou mesmo manipulação da cavidade bucal. Por outro lado, a maioria das células que
se desprendem do biofilme desenvolvem-se em válvulas cardíacas (ocasionando
endocardite) ou cateteres vasculares estão na forma de fragmentos de biofilme
embutido em uma matriz e são muito resistentes aos antibióticos, por esta razão,
baixas doses de antibiótico não previne a disseminação da bactéria. Nas doenças
com biofilme o melhor caminho para prevenir este processo é o tratamento com altas
doses de antibiótico e a remoção da prótese vascular (COSTERTON et al, 2003).
1.1.6 - CONSTITUIÇÃO DO
SLIME
Os polissacarídeos bacterianos têm sido objeto de estudo
principalmente por suas propriedades como as de interação parasita-hospedeiro,
como determinante imunológico ou por sua capacidade adesiva e representam 65%
do material extracelular (CHRISTENSEN, 1989).
Podem ser classificadas de acordo com sua fonte, biossíntese,
estruturas, propriedades físicas (características de adsorção, solubilidade, trocas
iônicas, viscosidade, formação de gel e interação polímero-polímero) ou biológica.
Os componentes extracelulares e de superfície celular mais comum são a glicose,
44
galactose, manose, fucose, ramnose, glicosamina, galactosamina, ácido glicurônico
e galacturônico, proteínas, ácidos nucléicos e lipídeos (CHRISTENSEN, 1989).
Muitas moléculas têm sido identificadas com o envolvimento direto do
processo de adesão célula a célula e é possível colocá-las em dois maiores grupos:
carboidratos poliméricos e proteínas poliméricas. A nível bioquímico, a adesina
polissacarídica extracelular tem função essencial na aderência inicial e na adesão
intercelular (formação do biofilme) (MORALES et al., 2004; ZHANG et al., 1998).
Christensen et al., 1994 relataram que Peters et al., 1987 foram os
primeiros pesquisadores que tentaram purificar o slime e descobriram que a
substância que intervém a adesão dos Staphylococcus coagulase-negativa a
superfícies lisas em camadas bacterianas é um polissacarídeo extracelular chamada
de, “substância extracelular do slime” (ESS), que se encontra presente em
abundância nos extratos do slime.
Há vários outros polissacarídeos que compõe o slime, mas um
polissacarídeo específico de alto peso molecular que tem a mesma função da
cápsula bacteriana e intervém a aderência inicial da bactéria na superfície do
polímero é chamado de polissacarídeo capsular/adesina (PS/A) (ARCIOLA et al.,
2001; FARBER et al., GOTZ, 2002; 1990; SHIRO et al., 1994) e é descrito como
componente da superfície celular e da camada do biofilme protegendo a bactéria
das defesas do hospedeiro e da fagocitose e está envolvido no primeiro passo da
adesão primária, acompanhada da proliferação das células em grupamentos
multicamadas (ARCIOLA et al., 2001; FARBER et al., 1990; GERKE et al., 1998;
HANDKE et al., 2004; HUEBNER et al., 1999; McKENNEY et al., 1998). Hoje, o
PS/A é conhecido como PNAG (poli-succinil-glicosamina) e estudos o descrevem
45
como um forte candidato na produção de vacina contra doenças estafilocócicas
(BALDASSARI et al., 1996; HANDKE et al., 2004).
Em um segundo passo, há a formação de grandes grupos celulares
que são associados com a produção do polissacarídeo intercelular/adesina chamado
de PIA que é um homopolímero linear de até 130 resíduos de
β
-1,6-glicosamina N-
acetilado (15% a 20% diacetilados) composto por duas frações polissacarídicas:
polissacarídeo I (>80%) e polissacarídeo II (< 20%) estruturalmente relacionado ao
polissacarídeo I com baixa quantidade de resíduos não N-acetilados D-glicosamina,
fosfato e éster ligado a sucsunato, sendo aniônico (MORALES et al., 2004). O PIA é
localizado na superfície celular mediado por produtos do gene cromossomal ica
(intercelular adhesion) que corresponde a quatro genes de adesão intercelular, icaA,
icaD, icaB e icaC, e um gene regulador, icaR organizados em uma estrutura operon
(fig.1) envolvidos na produção deste polissacarídeo e codificam quatro proteínas que
são necessárias para a síntese do PIA que são, IcaA, IcaD, IcaB e IcaC (ARCIOLA
et al., 2001; CAFISO et al., 2004; CONLON et al., 2002; FITZGERALD et al., 2005;
JOHANNES et al., 2001 GERKE et al., 1998; GOTZ, 2002; 1998; HUEBNER &
GOLDMANN et al., 1999; MACK et al., 1996, 1999, 2000; McKENNEY et al., 1998;
MORALES et al., 2004; NILSDOTTER-AUGUSTINSSON et al., 2005; O´GARA &
HUMPHREYS, 2001; ZIEBUHR et al., 1999).
Estudos epidemiológicos mostram que a produção do PIA está
correlacionado com a infecção originada pelo uso de próteses médicas (VUONG et
al., 2004).
Desta maneira a formação do biofilme é dependente da presença e
expressão do grupo de genes icaADBC (ZIEBUHR et al., 1999, 2000; GERKE et al.,
1998).
46
ica
R
ica
D
ica
B
ica
C
ica
A
Figura 1 – organização genética do grupamento do gene
ica
O PIA é envolvido no acúmulo celular dos
Staphylococcus
coagulase-
negativa nas superfícies, na hemaglutinação e também age como adesão
intercelular em vidro e outras superfícies hidrofílicas e é distinto do PS/A (ARCIOLA
et al., 2001; CAFISO et al., 2004; GERKE et al., 1998; HUEBNER& GOLDMANN,
1999; Mc KENNEY et al., 1998).
Também é descrito que o PS/A e o PIA dividem em sua constituição
um mesmo arranjo de β-1-6-glicosamina diferindo em um substituinte primário no
grupo amino e tamanho molecular, mostrando que ambos são produzidos de
proteínas codificadas no
lócus
ica
. A síntese do polissacarídeo capsular-PS/A é
mediada por um operon ica que uma vez ativado, um polissacarídeo de adesão
intercelular-PIA é sintetizado (ARCIOLA et al., 2001; GERKE et al., 1998; HUBNER
& GOLDMANN, 1999; LITRAN et al., 2002; McKENNEY et al., 1998; OTTO & GÖTZ,
2001; von EIFF et al., 2002).
A importância do PIA na patogênese das infecções pelos
Staphylococcus
coagulase-negativa em cateteres intravasculares tem sido
confirmado em experimentos realizados em animais (NILSDOTTER-
AUGUSTINSSON et al., 2005; RUPP et al., 1999a,b).
GOTZ, 2002 após estudos com cepas produtoras de PIA, descreve que
a produção do
slime
é influenciada por vários parâmetros e que em certas cepas há
47
uma variação, chamada de variação fenotípica e especula-se que esta variabilidade
contribui para a sobrevivência bacteriana em condições adversas.
O’gara & Humphreys, 2001, descrevem que há vários estudos
realizados para se saber a real função de cada proteína Ica. Supostamente sabe-se
que são proteínas transmembrana, porque são compostas de aminoácidos
hidrofóbicos em alta porcentagem formando um potencial de hélice transmembrana
e que estão localizadas na membrana celular (DOBINSKY et al., 2002).
IcaA representa atividade catalítica N-acetilglicosaminatranferase e que
sozinha tem baixa atividade transferase mas, quando é co-expressa com IcaD
apresenta atividade total sintetizando resíduos longos de 10-20 oligômeros de
β
1,6-
N-acetil glicosamina (DOBINSKY et al., 2002; GALDBART et al., 2000; GOTZ,
2002). Longos oligômeros de até 130 resíduos são formados na presença de IcaC;
IcaB está presente principalmente no sobrenadante das culturas e codifica uma
proteína que catalisa reações de diacetilação durante a biossíntese do PIA e é
secretado quando da necessidade de IcaC que sintetiza longos oligômeros; Ica C
não tem atividade bem definida, mas deve estar envolvida no transporte
transmembrana por ser uma proteína integrante da membrana, não tendo atividade
essencial para a síntese do PIA (DOBINSKY et al. , 2002; GOTZ, 2002).
Recentemente, pesquisadores identificaram uma substância conhecida
como poli-gama-DL-ácido glutâmico ou PGA que protege o patógeno dos
mecanismos de defesas naturais do hospedeiro e que está presente nos
Staphylococcus epidermidis que sobrevivem em implantes médicos. Relata-se ainda
que a formação do biofilme não depende do PGA, mas que quando presente à
produção do biofilme é maior. O que estes pesquisadores buscam é uma vacina
48
para inativar o efeito do PGA pois ele é à base do desenvolvimento de doenças
estafilocócicas (KOCIANOVA, et al., 2005).
1.1.7 - PREVENÇÃO DAS INFECÇÕES ESTAFILOCÓCICAS
RELACIONADAS AO USO DE IMPLANTES MÉDICOS
Nas infecções decorrentes do uso de implantes médicos pelos
Staphylococcus coagulase-negativa a formação do biofilme é considerada como o
principal fator de virulência em razão que os mecanismos de defesa do hospedeiro,
bem como a ação quimioterápica antibacteriana tornam-se ineficazes, devido ao
biofilme proteger as células estafilocócicas ficando difícil a cura destas infecções
(MINTO et al., 1999; von EIFF et al., 1999, 2001).
A natureza da estrutura do biofilme e atributos fisiológicos dos
organismos no biofilme confere uma resistência inerente aos agentes
antimicrobianos mesmo se estes agentes são antibióticos, desinfetantes ou
germicidas contra estes microrganismos no estado planctônico. Desta maneira a
concentração de antibiótico necessária para matar a bactéria no biofilme pode ser
quatro vezes mais alta (MORALES et al., 2004).
Vários autores descrevem que a produção de biofilme tem implicações
terapêuticas, pois observaram uma ligação entre a produção do biofilme e a
persistência da infecção e falhas no tratamento antibiótico (STEWART &
COSTERTON, 2001; ZIEBUHR et al., 2000). A este respeito, uma vez formado o
biofilme, removê-lo por meio de antibióticos tem mostrado ser muito difícil. Por outro
lado, isto é devido à falência terapêutica de muitos antibióticos em tratar infecções
estafilocócicas crônicas e também ao fato de que a maioria dos isolados hospitalares
49
de Staphylococcus coagulase-negativa serem multirresistentes com um constante
aumento desta resistência (MORALES et al., 2004; RACHID et al., 2000).
Os mecanismos responsáveis para a resistência devem estar
associado à baixa penetração do agente antimicrobiano através da matrix do
biofilme; inativação dos agentes antimicrobianos por enzimas presentes no biofilme;
modificação no desenvolvimento dos microrganismos no biofilme; trocas fisiológicas
devido ao modo de crescimento e variação da expressão genética sofrida pelos
microrganismos presente no biofilme podem comandar a baixa sensibilidade
fenotípica contra antimicrobianos (MACK et al., 2002; MORALES et al., 2004;
POLONIO et al., 2001; VUONG & OTTO, 2002; von EIFF et al., 1999).
Estudos, analisaram a influencia de concentrações subinibitórias de
antibióticos na formação de biofilmes e que a expressão do operon ica pode ser
fortemente aumentada por uma mistura de estreptogramina com dalfopristin e pela
tatraciclina que tem sido eficientes no tratamento infecções sérias causadas por
cocos gram-positivos multirresistentes devido aos antibióticos exibirem efeitos na
estrutura da célula e na expressão de genes de virulência (GOTZ, 2002; KONCKRO
et al., 2000; MORALES et al., 2004; RACHID et al., 2000).
Por outro lado, Yassien & Khardori, 2001 estudaram a interação de
quatro fluoroquinolonas diferentes e sua ação nos biofilmes formados e observaram
que a erradicação do polissacarídeo extracelular tem mostrado um aumento da
penetração do agente antimicrobiano no biofilme.
Devido à maioria das infecções ocasionadas pelos Staphylococcus
coagulase-negativa serem de natureza hospitalar, não é de se surpreender que se
tornem altamente resistentes a múltiplos antibióticos, especialmente a meticilina que
exclui a terapia a outros beta-lactâmicos e que freqüentemente também são aos
50
macrolídeos, lincosaminas, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas. O tratamento de
escolha para as infecções causadas por estes microrganismos é freqüentemente a
vancomicina. Devido à emergência a resistência a vancomicina aos Enterococcus sp
e aos Staphylococcus sp a recomendação é que o uso desta droga promove o
desenvolvimento de cepas resistentes a todos os antibióticos (ALCARÁZ et al.,
2003; FERREIRA et al., 2002; PARK et al., 2001, von EIFF et al., 2001).
A experiência clínica com infecção estafilocócicas aos polímeros
mostra claramente que os mecanismos de defesas do hospedeiro tão bem como
quimioterapia antibacteriana são freqüentemente incapazes de curar esta infecção,
apesar do uso de agentes antimicrobianos com comprovada atividade in vitro.
Trabalhos experimentais mostram que o slime extracelular produzido reduz a
resposta quimiotática dos polimorfonucleares neutrófilos, reduz a atividade fagocítica
de macrófago peritoneal em animal de experimentação e inibe a proliferação de
polimorfonucleares neutrófilos humanos após simulação com imunomoduladores
policlonais (von EIFF et al., 1999; MORALES et al., 2004).
Pesquisas futuras tem como objetivo o desenvolvimento de estratégia
para inibir a adesão e colonização bacteriana em cateteres implantáveis. Uma
destas pesquisas é o uso de cateteres embebidos com agentes antimicrobianos
sozinho ou em combinação com passagem de uma corrente elétrica alta (O’GARA &
HUMPHREYS, 2000; MORALES et al., 2004).
A geração de eletrólitos como os prótons, anions hidroxilados, reativos
intermediários do oxigênio, hidrogênio e oxigênio aparecem aumentando a morte
bacteriana pelo antibiótico de células bacterianas aderidas à superfície do polímero
é conhecida como efeito bioelétrico (COSTERTON et al, 1995; MORALES et al.,
2004).
51
O conhecimento de mecanismos moleculares que determinam a
formação do biofilme permitirá o projeto de novas estratégias em bloquear a
expressão dos genes diretamente envolvidas na aderência do microrganismo, o
desenvolvimento de próteses sintetizadas com novos materiais que permitem o
estabelecimento do biofilme e o uso de próteses com sua superfície embebida por
agentes antimicrobianos (MORALES et al., 2004).
Todas estas medidas devem ser necessárias para prevenir e tratar
infecção relacionada ao uso dos cateteres desde que a eliminação do biofilme
bacteriano apenas pelo uso de antibiótico é muito difícil (MORALES et al., 2004).
Lewis, 2001 relata que a habilidade dos antimicrobianos em inibir o
crescimento do biofilme indica que eles são capazes de difundirem-se por entre o
biofilme e agir normalmente contra seu alvo. Por que estão as células não morrem?
Este é o principal problema e enigma que precisa ser resolvido.
52
2 - OBJETIVOS
Estudar cepas de estafilococos coagulase-negativa isolados de ambiente biótico
hospitalar, os fatores correlacionados com a virulência como:
1) Produção de polissacarídeo extracelular.
2) Formação de biofilme sobre superfície abiótica.
3) Associação entre produção de polissacarídeo extracelular, a origem e a
identidade das espécies dos estafilococos coagulase-negativa.
4) Determinar a sensibilidade a oxacilina e relacionar com a produção de
polissacarídeo extracelular.
53
3 - MATERIAL E MÉTODO
3.1 - CASUÍSTICA
Foram isoladas 27 amostras de Staphylococcus coagulase-negativa de
cateter venoso central obtidas do estudo: “COLONIZAÇÃO DE CATETERES
VENOSOS CENTRAIS POR BIOFILME MICROBIANO” Tese de Doutorado do aluno
Anísio Storti do programa de Pós-Graduação em Análises Clínicas da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas, campus de Araraquara-UNESP, (dados não publicados).
Todos os procedimentos laboratoriais foram desenvolvidos no
Laboratório de Microbiologia Clínica do CRD/NAC (Centro de Referência Diagnóstica
Integrado ao Núcleo de Atendimento à Comunidade) da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara-UNESP, com exceção da Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV), que foi realizada no Laboratório de Físico-Química
do Instituto de Química do Câmpus de Araraquara-UNESP.
3.2 - MEIOS DE CULTURA E REAGENTES
Os meios de cultura desidratados, relacionados a seguir, das marcas
comerciais DIFCO (Becton Dickinson; Sparks, USA), MERCK (Darmstadt, Germany),
BBL (Becton Dickinson; Cockeysville; USA), OXOID (Hampshire, England) foram
preparados de acordo com as especificações dos fabricantes: Ágar Müeller Hinton,
Caldo Mueller Hinton, Ágar Base Sangue (TSA Blood Agar Base), Ágar cérebro
coração, Caldo de Infusão Cérebro e Coração, Caldo de Soja Tríptica e Ágar Base
Vermelho de Fenol. As formulações encontram-se apêndice A.
54
Sais, ácidos, corantes, açúcares e demais reagentes eram de
procedência bioMÉRIEUX (Rio de Janeiro, Brasil), MERCK (Darmstadt, Germany),
SIGMA (Sigma-Aldrich Chemical; São Paulo, Brasil) REAGEN (Quimibrás Indústrias
Químicas; Rio de Janeiro, Brasil), DIFCO (Becton Dickinson; Sparks, USA),
PROBAC (São Paulo, Brasil), Fluka (Chemika; Switzeland).
Os discos de antimicrobianos eram de procedência CECON (São
Paulo, Brasil).
As soluções de etanol (v/v) nas concentrações de 15, 30, 50, 70, 95, e
100%, bem como as soluções do tampão fosfato (0,2M; 0,2M(pH7,1); 0,1M (pH7,1) e
0,1M-glutaraldeído 2,5% utilizadas na técnica de microscopia eletrônica de varredura
foram preparadas no setor de Microbiologia Clínica do Laboratório de Análises
Clínicas “Prof. Antonio Longo” do CRD/NAC Unidade Auxiliar Integrada à Faculdade
de Ciências Farmacêuticas - UNESP, câmpus de Araraquara, São Paulo.
Os tampões e soluções utilizados para extração do DNA genômico e reação
PCR foram preparados no Laboratório de Biologia Molecular e Celular de
Microrganismos do Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas - UNESP, câmpus de Araraquara, São Paulo. As formulações
encontram-se apêndice B.
3.3.–SISTEMAS COMERCIAIS DE IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-
POSITIVOS CATALASE POSITIVA
Sistema APIStaph (bio-Mérieux, La Balme, Les Grottes, França).
55
3.4.- MÉTODOS
3.4.1 – IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Os cocos Gram-positivos com a característica de agrupamentos
irregulares (cachos de uva), sugestivos de Staphylococcus sp., foram identificados
de acordo com Kloss & Schleifer (1975), modificado por Kloos & Bannerman (1999),
adaptado por Bernardi et al. (2001) utilizando as seguintes provas bioquímico-
fisiológicas: resistência à bacitracina; novobiocina, polimixina, teste da coagulase
livre e ligada, PYR e carboidratos: sacarose, manose, trealose, manitol, celobiose,
maltose e xilose (MURRAY et al., 1999, 2003; MacFADDIN et al., 2000) e pelo
sistema APISTaph (bio-Mérieux-Jacarépagua, Rio de Janeiro, Brasil).
3.4.2 – IDENTIFICAÇÃO DOS
STAPHYLOCOCCUS
3.4.2.1-
Staphylococcus
sp
Kloos e Scheleifer (1975), modificado por Kloos e Bannerman (1995, 1999);
adaptado por Bernardi et al. (2001); Murray et al. (1995, 1999, 2003) e
MacFaddin (2000)
3.4.2.2-Teste da coagulase livre (prova em tubo)
MacFaddin (2000)
Foi preparada a suspensão do Staphylococcus sp., em tubos de vidro
esterilizados (13x100mm) contendo 0,5mL de caldo BHI e adicionado de 0,5mL de
plasma citratado. Homogeneizada suavemente sem agitar. Os tubos foram
56
incubados em banho-maria a 37°C por 4 horas. De modo idêntico, foram realizados
controles utilizando-se cepas de Staphylococcus coagulase positiva e negativa. A
prova foi considerada positiva quando houve a formação de coágulo, de qualquer
intensidade.
Como controle positivo foram usadas cepas Staphylococcus aureus
ATCC 12600 e como controle negativo Staphylococcus epidermidis ATCC 14990,
conforme as recomendações de MacFaddin (2000).
3.4.2.3-Teste da coagulase ligada (prova em lâmina)
MacFaddin (2000)
Foi colocada sobre uma lâmina de vidro uma gota de solução
fisiológica esterilizada e com auxílio de uma alça bacteriológica, suspendeu-se um
pouco do crescimento bacteriano a ser testado até obter-se uma suspensão
homogênea. A seguir foi adicionada uma gota de plasma citratado e homogeneizado
para observar a formação ou não de grumos em período em 5-20 segundos. O teste
da coagulase ligada foi considerado negativo quando não foi observada a formação
de grumos em 3 a 4 minutos.
3.4.2.4-Resistência à bacitracina
MacFaddin (2000); Murray et al. (1995, 1999, 2003)
Foi semeada com swab na superfície do ágar Mueller Hinton, a
suspensão bacteriana em estudo, com turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala de
McFarland. Após a secagem foi colocado um disco de bacitracina (A) de
57
0,04unidades-U (CECON-São Paulo, Brasil) sobre a semeadura. Foi incubado por
18-24 horas em estufa bacteriológica a 35-37
o
C. A ausência de um halo de inibição,
ou zona de inibição com mais de 10mm de diâmetro ao redor do disco, indica que a
prova foi positiva, isto é, o microrganismo era resistente à bacitracina. A prova
negativa ou sensibilidade quando a zona de inibição do crescimento bacteriano é
maior que 10mm de diâmetro ao redor do disco. Esta prova diferencia o gênero
Micrococcus do gênero Staphylococcus.
3.4.2.5-Resistência à novobiocina
Murray et al. (1995, 1999, 2003)
Foi semeada com swab na superfície do ágar Mueller Hinton, uma
suspensão bacteriana com turvação semelhante ao tubo 0,5 da escala de
McFarland, após a secagem foi colocado um disco contendo 5µg de novobiocina
(CECON-São Paulo, Brasil) sobre a semeadura, incubado por 18-24 horas em estufa
bacteriológica a 35-37
o
C. Prova positiva (resistência): halo de 16mm ou menor.
Prova negativa (sensibilidade): halo maior do que 16mm.
3.4.2.6-Resistência à polimixina B
Murray et al. (1995, 1999, 2003)
Foi semeado com swab na superfície do ágar Mueller Hinton, uma
suspensão bacteriana com turvação semelhante ao tubo 0,5 da escala de
MacFarland, após a secagem foi colocado um disco padronizado contendo 30
Polimixina B (CECON-São Paulo, Brasil) sobre a semeadura, incubado por 18-24
58
horas em estufa bacteriológica a 35-37
o
C. Prova positiva (resistência): halo de
10mm ou menor. Prova negativa (sensibilidade): halo maior do que 10mm.
3.4.2.7-Teste de hidrólise pyrrolidonyl- -naphthylamide (PYR)
MacFaddin (2000) ;Murray et al. (1995, 1999, 2003)
Sobre o crescimento do microrganismo, em ágar Mueller Hinton de 18-
24 horas, foi colocado um disco de PYR (PROBAC-São Paulo-Brasil) e a placa
reincubada a 35-37
o
C por 4 horas. Após este período o disco foi retirado e
depositado sobre uma lâmina e colocado sobre ele uma gota do reagente PYR. O
aparecimento de uma cor vermelho-cereja em um minuto indica que a prova é
positiva e a não mudança da cor do reagente indica reação negativa.
3.4.2.8-Teste da utilização aeróbia dos carboidratos
Murray et al. (1995, 1999, 2003)
As cepas de Staphylococcus foram caracterizadas segundo a espécie,
de acordo com a utilização dos carboidratos sacarose, manose, trealose, manitol,
celobiose, maltose e xilose todas de procedência MERK (Darmstadt, Alemanha).
Estes testes foram realizados em Ágar-Base Vermelho de Fenol (DIFCO),
suplementado com 1% do respectivo carboidrato. Foi inoculado o microrganismo a
ser testado no meio suplementado com o carboidrato específico e incubado em
estufa bacteriológica a 35-37
o
C por até 24 horas. Leitura: Prova positiva:
crescimento do microrganismo com viragem do pH do meio de cultura (vermelho
para amarelo).
Prova negativa: crescimento sem alteração de cor.
59
3.5 - CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CEPAS DE
STAPHYLOCOCCUS
COAGULASE-NEGATIVA USANDO ÁGAR VERMELHO CONGO
3.5.1. PRODUÇÃO DE
SLIME
A produção de
slime
foi verificada em placas contendo
ágar vermelho Congo (Congo red agar), de acordo com Freeman et
al
.
(1989)
As cepas isoladas de Staphylococcus coagulase-negativa foram
semeadas por esgotamento com alça bacteriológica em Ágar Vermelho Congo
contido em placas (90x15mm) e incubadas em aerobiose a 37°C, em estufa
bacteriológica, por 24 horas a temperatura ambiente por 18 horas. Após este
período foi realizada a leitura das placas para verificar a produção de slime. A
presença de colônias negras com consistência cristalina seca indica um resultado
positivo, isto é, colônia produtora de slime. As colônias não produtoras de slime, são
vermelhas e indicam resultado negativo para produção de slime.
60
3.6 – ADERÊNCIA DE
STAPHYLOCOCUS
COAGULASE-NEGATIVA EM PLACAS
DE POLIESTIRENO
As medidas de aderência dos estafilococos foi realizada em caldo de
soja triptica com glicose 0,25% (TSB), de acordo com Christensen et al. (1985)
As cepas de Staphylococcus coagulase-negativa foram inoculadas em
tubos com tampa de rosca (13x100mm–PYREX) contendo 3,0mL de caldo TSB com
0,25% de glicose e incubados a 35-37°C, em estufa bacteriológica, por uma noite.
Após este período a cultura em TSB de estafilococos coagulase-negativa foi diluída
a 1:100 em um novo TSB. A seguir alíquotas de 200µL de cada cultura diluída foram
transferidas para cada um dos poços (wells) (96 poços com fundo em U) da placa de
poliestireno esterilizada. A seguir estas placas foram incubadas por 18 horas a 37°C.
Após este período, o conteúdo de cada poço foi delicadamente aspirado com uma
pipeta automática multicanal (FINNPIPETTE-LABSYSTEMS), os poços foram
lavados quatro vezes com 200µL de tampão fosfato salina (PBS) (pH 7,2). A
secagem da placa foi realizada em estufa a 60°C por 1 hora. A seguir, os poços
foram corados com Cristal Violeta de Gram (LABORCLIN) por 1 minuto e lavados
com água de torneira. Antes da leitura em cada poço da placa foi adicionada uma
solução a 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS).
A densidade óptica (D.O.) dos filmes bacterianos aderidos e corados foi
lida com o auxílio de um leitor para ELISA (MULTISKAN ASCENT V1.24 254-
00724T–LABSYSTEMS) em filtro de 570nm.
As leituras foram divididas em 3 categorias de acordo com a reação de
aderência das bactérias: não aderente (D.O.
61
0,120 a 0,240nm) e fortemente aderente (D.O.
al., 1985.
3.7. PRODUÇÃO DE BIOFILME SOBRE SUPERFÍCIE ABIÓTICA
A produção in vitro de biofilmes de Staphylococcus coagulase-negativa
foi realizada de acordo com Pizzolitto (1997).
Foram utilizados segmentos de 0,5cm de cateter venoso central de
vialon esterilizado (Código 384917, 14GX30cm, i-Cath B-D
®
) e sem uso.
3.7.1 - PREPARAÇÃO DA SUSPENSÃO BACTERIANA
As cepas de estafilococos coagulase negativa foram reativados em
3,0mL de BHI incubados de 18-24 horas em estufa de 35-37
o
C. Após este período,
100,0
µ
L do crescimento foi repicado para tubo com tampa de rosca (13x100mm –
PYREX) com 3,0mL de BHI e incubado em estufa a 35-37
o
C até a fase log de
crescimento (2 a 3 horas).
A seguir as amostras foram centrifugadas e o sedimento lavado por
duas vezes com 10,0mL de salina fisiológica esterilizada e as células bacterianas
foram ressuspensas em salina fisiológica esterilizada até atingir densidade óptica
(D.O.) de 1,0 (10
9
células/mL) a 540nm em espectrofotômetro (600 PLUS-FEMTO).
62
3.7.2 – PRODUÇÃO
IN VITRO
DE BIOFILME EM CATETER VENOSO CENTRAL
DE VIALON
Com uma micropipeta automática de 200,0µL uma suspensão do
microrganismo da ordem de 10
9
células/mL foi transferida para tubos cônicos de
poliestireno Falcon (CORNING
®
) esterilizados com capacidade para 50,0mL,
contendo 15,0mL de caldo Mueller Hinton e o segmento de cateter (0,5cm). Os tubos
foram incubados a 35-37
o
C sob agitação constante de 100 rpm em agitador orbital
(TE-420-TECNAL) e após, 72 horas de incubação, os segmentos, foram retirados e
fixados com glutaraldeido 2,5% por 15 minutos, desidratados em séries de solução
alcoólica (15-100%), secos, metalizados com ouro e colados em suportes especiais
do microscópio eletrônico de varredura. O material foi fotografado com filme Neopan
100.
3.8 – DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA EM
STAPHYLOCOCCUS
coagulase-
negativa
3.8.1 - RESISTÊNCIA A OXACILINA
A prova de resistência a oxacilina foi realizada de acordo com o
documento do NCCLS-M2-A7 - 2000.
Vinte mililitros do meio de cultura ágar Mueller Hinton esterilizado foram
transferidos assepticamente para uma placa descartável (CRAL
®
) de 90X15mm de
diâmetro para se obter uma camada de 4,0mm de espessura
Com auxílio de uma agulha bacteriológica 3 a 4 colônias com a mesma
morfologia foram transferidas para 4,0mL de solução fisiológica esterilizada. Após o
63
ajuste do inóculo para 0,5 da escala de McFarland, semeou-se sobre ágar Mueller
Hinton, com swab de algodão, em três direções diferentes de maneira uniforme. A
placa inoculada foi mantida à temperatura ambiente de 3 a 5 minutos. Com auxílio
de pinça esterilizada, o disco de oxacilina 1mcg-OXA (CECON) foi depositado sobre
o meio de cultura com uma leve pressão contra a superfície do meio. As placas
foram incubadas a 35°C durante 24 horas.
A leitura foi realizada medindo-se o halo de inibição ao redor do disco
com auxílio de uma régua milimetrada considerando-se: sensível (≥18mm) e
resistente (
≤
17mm).
3.9. MÉTODOS MOLECULARES PARA PESQUISA DE GENES DE VIRULÊNCIA
ica
A e
ica
D EM
STAPHYLOCOCCUS
COAGULASE-NEGATIVA
3.9.1. Caracterização molecular de
Staphylococcus
coagulase-negativa
3.9.1.1.
Extração do DNA genômico segundo Goering & Winters 1992
modificado
As cepas bacterianas foram crescidas até saturação em 2 mL de caldo
Mueller Hinton a 37 °C por 16-18 horas sob agitação. O volume total da cultura foi
transferido para um tubo de microcentrífuga e submetido à centrifugação a 10.000xg
por um minuto. O sobrenadante foi descartado e as células suspensas em 200µL de
tampão TE pH-8,0 (Tris-HCl pH 8,0 10mM, EDTA 1mM) e então adicionado 25
µ
L de
lisozima (10mg/mL estoque) e incubado a 37°C por cinco minutos. Retirou-se o
sobrenadante e foi adicionado 200µL de SDS a 1% / NaOH 0,2M e levado a banho
64
fervente por 45 segundos para a lise celular, esperou-se esfriar a temperatura
ambiente. Para a extração foi adicionado 600µL de PCI (Fenol:Clorofórmio:Álcool
isoamílico-25:24:1) e agitado em vórtex por 1 minuto e submetido a centrifugação a
13.000xg por10 minutos. Após este procedimento, a fase aquosa foi transferida para
um outro tubo de microcentrífuga a qual foram adicionados 1mL de isopropanolol e
incubado a 37°C por cinco minutos para precipitação do DNA. A mistura foi
centrifugada por 10 minutos a 13.000gx e o sobrenadante desprezado. A seguir, o
tubo foi lavado 3 vezes com 1mL de etanol 75% gelado, homogeneizado por
inversão, desprezado o sobrenadante e levado para secar. O preciptado foi
suspenso em 50
µ
L de TE pH 8,0 e estocado a –20ºC até o momento do uso.
3.9.1.2 - Amplificação de DNA pela reação de polimerase em cadeia
(PCR)
Os fragmentos contendo os genes de interesse foram amplificados, a
partir de DNA genômico de cepas de Staphylococcus coagulase-negativa isoladas
de cateter, por PCR utilizando-se os primers específicos para a amplificação dos
genes em estudo (icaA e icaD). Em um tubo de 200µL foram colocados os pares de
primers para a amplificação dos genes de interesse (1
µ
M): icaA:
2
µ
L de DNA
genômico da cepa em estudo, 0,5µL de tampão Taq, 2µL de MgCl
2
, 1µL dNTPs,
1,3µL Forward, 0,8µL Reverse e 37,4µL de água destilada para um volume final de
50
µ
L; icaD
: 2
µ
L de DNA genômico da cepa em estudo, 0,5
µ
L de tampão Taq, 2
µ
L
de MgCl
2
, 1µL dNTPs, 1,94µL Forward, 1,5µL Reverse e 36µL de água destilada
para um volume final de 50µL.
65
Foram realizados 30 ciclos de amplificação em termociclador
(geneAmp-PCR System 9700) como relatado a seguir:
Desnaturação do DNA – 1 minuto a 94°C;
Hibridização dos primers – 1 minuto a 50°C;
Reação de polimerização – 2 minutos a 72°C;
Após os 30 ciclos, foi realizado mais um ciclo de polimerização de 2 minutos e
os produtos da reação foram mantidos a 4°C . Os fragmentos de DNA amplificados
por PCR foram verificados em gel de agarose 1%.
Primers utilizados nos experimentos deste trabalho:
ica
A
Forward: 5’-TCTCTTGCAGGAGCAATCAA-3’
Reverse: 5’-CCCAGTATAACGTTGGATACC-3’
Tamanho do produto:
188 pb
ica
D
Forward: 5’-ATGGTCAAGCCCAGACAGAG-3’
Reverse: 5’-CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA-3’
Tamanho do produto:
198 pb
66
4 – RESULTADOS
4.1. – Identificação das amostras de
Staphylococcus
coagulase-negativa
Foram estudadas 27 amostras de Staphylococcus coagulase-negativa,
identificadas como: 1 S. saprophyticus (3,70%), 2 S. xylosus (7,41%), 4 S.
haemolyticus (14,81%), 10 S. epidermidis (37,04%), 4 S. warneri (14,81%), 2 S.
lugdunensis (7,41%), 2 S. hominis (7,41%), 1 S. schleiferi (3,70%) e 1 S.
chromogenes (3,70%) como mostra a figura 2.
0
2
4
6
8
10
S.epidermidis
S.warneri
S.haemolyticus
S.homonis
S.xylosus
S.lugdunensis
S.saprophyticus
S.chromogenes
S.schleiferi
Figura 2 –
Freqüência de amostras Staphylococcus coagulase-negativa
O S. epidermidis é considerado o Staphylococcus coagulase-negativa
mais importante na infecção hospitalar e outras espécies associadas com infecções
são: S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. lugdunensis e S. schleiferi.
67
4.2. Detecção de resistência em
Staphylococcus
coagulase-negativa
O resultado de resistência a oxacilina dos 27 Staphylococcus
coagulase-negativa, mostra que 19 (70,37%) apresentaram resistência e 8 (29,62%)
apresentaram sensibilidade conforme mostra Tabela 1.
Tabela 1
–
Reação a oxacilina entre as espécies de Staphylococcus coagulase-negativa
Halo de inibição
Microrganismos
Sensível (
≥
18mm)
Resistente (
≤
17mm)
C
1
S. chromogenis
-
Resistente
E
1
S. epidermidis
-
Resistente
E
2
S. epidermidis
sensível
-
E
3
S. epidermidis
-
Resistente
E
4
S. epidermidis
-
Resistente
E
5
S. epidermidis
-
Resistente
E
6
S. epidermidis
-
Resistente
E
7
S. epidermidis
-
Resistente
E
8
S. epidermidis
-
Resistente
E
9
S. epidermidis
-
Resistente
E
10
S. epidermidis
-
Resistente
Ha
1
S. haemolyticus
sensível
-
Ha
2
S. haemolyticus
-
Resistente
Ha
3
S. haemolyticus
-
Resistente
Ha
4
S. haemolyticus
-
Resistente
Ho
1
S. hominis
sensível
-
Ho
2
S. hominis
sensível
-
L
1
S. lugdunensis
sensível
-
L
2
S. lugdunensis
-
Resistente
Sa
1
S. saprophyticus
-
Resistente
Sc
1
S. schleiferi
sensível
-
X
1
S. Xylosus
-
Resistente
X
2
S. xylosus
sensível
-
W
1
S. warneri
-
Resistente
W
2
S. warneri
sensível
-
W
3
S. warneri
-
Resistente
W
4
S. warneri
-
Resistente
As 8 amostras sensíveis a oxacilina foram: um S. epidermidis, um S.
haemolyticus, um S. lugdunensis, um S. schleiferi, um S. warneri, um S. xylosus e
dois S. hominis.
68
A freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa
resistentes a oxacilina está apresentada na Tabela 2.
Tabela 2 - Freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa resistentes à oxacilina.
Espécies
Resistente
Sensível
S. epidermidis
9 (47,36%)
1 (12,50%)
S. haemolyticus
3 (15,80%)
1 (12,50%)
S. warneri
3 (15,80%)
1 (12,50%)
S.lugdunensis
1 (5,26%)
1 (12,50%)
S. hominis
0 (0,00%)
2 (25,00%)
S. xylosus
1 (5,26%)
1 (12,50%)
S. schleiferi
0 (0,00%)
1 (12,50%)
S. chromogenes
1 (5,26%)
0 (0,00%)
S. saprophyticus
1 (5,26%)
0 (0,00%)
TOTAL
19 (100,00%)
8 (100,00%)
Os Staphylococcus coagulase-negativa resistentes a oxacilina, são
resistentes a todos agentes beta lactâmicos, inclusive penicilina, cefalosporinas e
carbapenens, ou seja, são com freqüência resistentes a outros agentes
antimicrobianos usados comumente. A vancomicina é freqüentemente a droga de
escolha para o tratamento das infecções clinicamente significantes. Uma acurada
detecção da resistência à oxacilina é difícil, todas as células em uma cultura
carreiam a informação genética para a resistência, porém pequeno número pode
expressar a resistência in vitro. Este fenômeno é chamado heteroresistência e
ocorre em estafilococos resistentes a penicilinas penicilinase estáveis, como a
oxacilina. A heteroresistência é um problema para o Laboratório Clínico, porque as
células expressando resistência podem crescer mais lentamente do que a população
sensível. É por isso que o CLSI (NCCLS-2005) recomenda a incubação dos isolados
que estão sendo testados contra oxacilina a 35°C durante 24 horas (2).
69
4.3. Produção de
slime
O resultado da presença de slime investigado em ágar vermelho Congo
está apresentado nas Figuras 3-4 e Tabela 3. Das 27 amostras de Staphylococcus
coagulase-negativa semeadas no ágar vermelho Congo, 21 (77,78%) eram colônias
negras (produtoras de slime) e 6 (22,22%) vermelhas (não produtoras de slime).
Figura 3 - Colônias negras de amostras produtoras de slime em ágar vermelho
Congo
Figura 4 - Colônias vermelhas amostras não produtoras de slime em ágar vermelho
Congo.
70
Tabela 3 – Produção de slime entre as espécies de Staphylococcus coagulase-negativa
Variação de cor em ágar
vermelho Congo
Microrganismos
Negra (produção de slime)
Vermelha (não produção de slime)
C
1
S. chromogenes
negra
-
E
1
S. epidermidis
negra
-
E
2
S. epidermidis
negra
-
E
3
S. epidermidis
negra
-
E
4
S. epidermidis
negra
-
E
5
S. epidermidis
negra
-
E
6
S. epidermidis
negra
-
E
7
S. epidermidis
negra
-
E
8
S. epidermidis
negra
-
E
9
S. epidermidis
negra
-
E
10
S. epidermidis
negra
-
Ha
1
S. haemolyticus
negra
-
Ha
2
S. haemolyticus
negra
-
Ha
3
S. haemolyticus
negra
-
Ha
4
S. haemolyticus
negra
-
Ho
1
S. hominis
-
vermelho
Ho
2
S. hominis
-
vermelho
L
1
S. lugdunensis
-
vermelho
L
2
S. lugdunensis
-
vermelho
Sa
1
S. saprophyticus
-
vermelho
Sc
1
S. schleiferi
-
vermelho
X
1
S. xylosus
negra
-
X
2
S. xylosus
negra
-
W
1
S. warneri
negra
-
W
2
S. warneri
negra
-
W
3
S. warneri
negra
-
W
4
S. warneri
negra
-
A fenotípica produção de slime para todas as amostras em estudo foi avaliada
por cultura em ágar vermelho Congo. Como mostrado na Fig. 3 e Tabela 3, as
amostras produtoras de slime aparecem como colônias negras, e as não produtoras
de slime vermelhas. O ágar vermelho Congo contém sacarose como fonte de
carbono como precursor na formação de slime em amostras de S. epidermidis.
A freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa produtoras
e não produtoras de slime está expressa na Tabela 4.
71
Tabela 4 - Freqüência das espécies Staphylococcus coagulase-negativa produtoras e não produtoras
de slime detectado em ágar vermelho Congo.
Espécies
Produção de
slime
Não produção de
slime
S. epidermidis
10 (47,62%)
0 (00,00%)
S. haemolyticus
4 (19,05%)
0 (00,00%)
S. warneri
4 (19,05%)
0 (00,00%)
S.lugdunensis
0 (00,00%)
2 (33,33%)
S. hominis
0 (00,00%)
2 (33,33%)
S. xylosus
2 (09,52%)
0 (00,00%)
S. schleiferi
0 (00,00%)
1 (16,67%)
S. chromogenes
1 (04,76%)
0 (00,00%)
S. saprophyticus
0 (00,00%)
1 (16,67%)
TOTAL
21 (100,00%)
6 (100,00%)
Todas as amostras de S. epidermidis, S. haemolyticus
,
S. warneri eram
produtoras de slime.
72
4.4 Aderência de
Staphylococcus
coagulase-negativa em placas de
poliestireno.
A avaliação quantitativa da aderência à placa de poliestireno mostrou
que dos 27 Staphylococcus coagulase-negativa, 22 (81,4%) aderiram fortemente e 5
(18,6%) aderiram fracamente ou seja, todas aderiram. Os resultados das leituras das
D.O. do teste estão apresentados na Tabela 5.
Tabela 5 – Densidade óptica das reações de aderência entre as espécies de Staphylococcus
coagulase-negativa
Microrganismos
D.O. do teste de aderência em placa de poliestireno
Fracamente aderente
(0,120 a 0,240nm)
Fortemente aderente
(
≥
0,240nm)
C
1
S. chromogenes
0,000
0,425
E
1
S. epidermidis
0,000
0,442
E
2
S. epidermidis
0,000
0,631
E
3
S. epidermidis
0,000
0,609
E
4
S. epidermidis
0,000
0,363
E
5
S. epidermidis
0,000
0,374
E
6
S. epidermidis
0,000
1,360
E
7
S. epidermidis
0,000
0,755
E
8
S. epidermidis
0,000
0,444
E
9
S. epidermidis
0,000
0,458
E
10
S. epidermidis
0,000
0,397
Ha
1
S. haemolyticus
0,129
0,000
Ha
2
S. haemolyticus
0,000
0,399
Ha
3
S. haemolyticus
0,000
1,070
Ha
4
S. haemolyticus
0,000
0250
Ho
1
S. hominis
0,200
0,000
Ho
2
S. hominis
0,209
0,000
L
1
S. lugdunensis
0,000
0,425
L
2
S. lugdunensis
0,000
0,412
Sa
1
S. saprophyticus
0,000
2,000
Sc
1
S. schleiferi
0,157
0,000
X
1
S. xylosus
0,000
1,040
X
2
S. xylosus
0,000
0,845
W
1
S. warneri
0,134
0,000
W
2
S. warneri
0,000
0,511
W
3
S. warneri
0,000
0,633
W
4
S. warneri
0,000
0,335
73
O teste de aderência à placa de poliestireno está ilustrado em Figura 5 (A e B).
A
Figura 5 (A e B) –
A-
controle negativo (ATCC 12228 – S. epidermidis) e controle
positivo (ATCC 35984 - S.epidermdis).
B-
Ilustração em placa de poliestireno, fundo
em U, da variação da cor azul para as amostras na 1ª fileira: S. xylosus (X
1
), S.
haemolyticus (Ha
2
), S. epidermidis (E
1
), S. xylosus (X
2
), S. epidermidis (E
2
), S.
warneri (W
2
), S. haemolyticus (Ha
3
), S. epidermidis (E
3
-E
7
); na 2ª: S. haemolyticus
(Ha
1
), S. hominis (Ho
2-
Ho
3
), S. warneri (W
1
e W
3
), S. haemolyticus (Ha
4
), S. schleiferi
(Sc
1
), S. saprophyticus (Sa
1
), S. warneri (W
4
), S. lugdunensis (L
2
), S. chromogenes
(C
1
), S. epidermidis (E
8
) e na 3ª: S. epidermidis (E
1
, E
9,
E
10
).
B
Negativo
Positivo
74
A relação entre as amostras fortemente aderentes e fracamente
aderentes está expressa na Tabela 6.
Tabela 6 - Freqüência das espécies de
Staphylococcus
coagulase-negativa forte e fracamente
aderentes a placa de poliestireno.
Espécies
Forte aderência
Fraca aderência
S. epidermidis
10 (45,45%)
0 (00,00%)
S. haemolyticus
3 (13,64%)
1 (20,00%)
S. warneri
3 (13,63%)
1 (20,00%)
S.lugdunensis
2 (09,10%)
0 (00,00%)
S. hominis
0 (00,00%)
2 (40,00%)
S. xylosus
2 (09,10%)
0 (00,00%)
S. schleiferi
0 (00,00%)
1 (20,00%)
S. chromogenes
1 (04,54%)
0 (00,00%)
S. saprophyticus
1 (04,54%)
0 (00,00%)
TOTAL
22 (100,00%)
5 (100,00%)
75
4.5 Formação do biofilme pelas amostras de
Staphylococcus
coagulase-
negativa sobre superfície abiótica
Das 27 amostras de Staphylococcus coagulase-negativa, 24 (88,88%)
formaram biofilme e 3 (11,11%) não formaram biofilme. O resultado da formação do
biofilme entre as espécies de Staphylococcus coagulase-negativa está apresentado
na Tabela 7.
Tabela 7 – Formação do biofilme entre as espécies de Staphylococcus
coagulase-negativa
Microrganismos
Formação de biofilme em segmentos de cateter
C
1
S. chromogenes
Negativo
E
1
S. epidermidis
Positivo
E
2
S. epidermidis
Positivo
E
3
S. epidermidis
Positivo
E
4
S. epidermidis
Positivo
E
5
S. epidermidis
Positivo
E
6
S. epidermidis
Positivo
E
7
S. epidermidis
Positivo
E
8
S. epidermidis
Positivo
E
9
S. epidermidis
Positivo
E
10
S. epidermidis
Positivo
Ha
1
S. haemolyticus
Positivo
Ha
2
S. haemolyticus
Positivo
Ha
3
S. haemolyticus
Negativo
Ha
4
S. haemolyticus
Positivo
Ho
1
S. hominis
Positivo
Ho
2
S. hominis
Positivo
L
1
S. lugdunensis
Positivo
L
2
S. lugdunensis
Positivo
Sa
1
S. saprophyticus
Positivo
Sc
1
S. schleiferi
Positivo
X
1
S. xylosus
Positivo
X
2
S. xylosus
Positivo
W
1
S. warneri
Negativo
W
2
S. warneri
Positivo
W
3
S. warneri
Positivo
W
4
S. warneri
Positivo
76
A freqüência das espécies formadoras e não formadoras de
biofilme está expressa na Tabela 8.
Tabela 8 - Freqüência das espécies de
Staphylococcus
coagulase-negativa formadoras de biofilme.
Espécies
Formação do biofilme
Ausência de biofilme
S. epidermidis
10 (41,67%)
0 (00,00%)
S. haemolyticus
3 (12,50%)
1 (33,34%)
S. warneri
3 (12,50%)
1 (33,33%)
S.lugdunensis
2 (8,33%)
0 (00,00%)
S. hominis
2 (8,33%)
0 (00,00%)
S. xylosus
2 (8,33%)
0 (00,00%)
S. schleiferi
1 (4,17%)
0 (00,00%)
S. chromogenes
0 (0,00%)
1 (33,33%)
S. saprophyticus
1 (4,17%)
0 (00,00%)
TOTAL
24 (100,00%)
3 (100,00%)
As micrografias apresentadas em figuras de número 6-13 referem-se à
microscopia eletrônica de varredura.
Pode-se observar o biofilme, formado sobre a superfície abiótica
(cateter não usado), após 72 horas de incubação em caldo Mueller Hinton inoculado
com as espécies de
Staphylococcus
coagulase-negativa estudadas. O biofilme
apresenta o aspecto da matriz de polissacarídeo extracelular em “pseudo”
tridimensional.
77
Figura 6
Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de
S. epidermidis
sobre superfície
abiótica (cateter). Notar a presença de massa amorfa envolvendo cocos e formando biofilme (JEOL-
JSM, modelo T330A).
Figura 7
Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de
S.haemolyticus
sobre superfície
abiótica (cateter). Notar a aderência intercelular (JEOL-JSM, modelo T330A).
78
Figura 8
Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de
S. warneri
sobre superfície
abiótica (cateter). Notar aderência intercelular, presença de polissacarídeo extracelular e superfície do
cateter (JEOL-JSM, modelo T330A).
Figura 9
Micrografia eletrônica de varredura (X7500) de biofilme de
S. lugdunensis
sobre superfície
abiótica (cateter). Notar aderência intercelular, agrupamento celular e presença de polissacarídeo
extracelular (JEOL-JSM, modelo T330A).
79
Figura 10
Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de
S. xylosus
sobre superfície
abiótica (cateter). Notar o agrupamento dos cocos envoltos em matriz de polissacarídeo extracelular
(JEOL-JSM, modelo T330A).
Figura 11
Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de
S. hominis
sobre superfície
abiótica (cateter). Notar a matriz de polissacarídeo extracelular que aparece como substância amorfa
(JEOL-JSM, modelo T330A).
80
Figura 12
Micrografia eletrônica de varredura (X5000) de biofilme de S. schleiferi sobre superfície
abiótica (cateter). Notar a aderência intercelular e agrupamentos de cocos inseridos em material
amorfo (EOL-JSM, modelo T330A).
Figura 13
Micrografia eletrônica de varredura (X2000) de biofilme de S. saprophyticus sobre
superfície abiótica (cateter). Notar o agrupamento de cocos (JEOL-JSM, modelo T330A).
81
4.6. Detecção dos genes
ica
A e
ica
D determinada por PCR
Os primers usados para determinar a presença dos genes icaA e icaD foram
baseados na seqüência do genoma de S. epidermidis. Das dez amostras de S.
epidermidis analisadas, 100% apresentaram os genes icaA e icaD, Figuras 14-15 (A
e B) e Tabelas 9-10. Os mesmos primers foram usados para avaliar a amplificação
do DNA isolado de outras espécies de Staphylococcus coagulase-negativa. Não
foram obtidos produtos de amplificação dos genes icaA nas amostras de S.
haemolyticus (amostra Ha
3
), S. saprophyticus (amostra Sa
1
) e S. schleiferi (Sc
1
).
Não foram obtidos os genes icaD produtos do PCR para amostras S. saprophyticus
(amostra Sa
1
) e S. schleiferi (Sc
1
).
A amostra S. epidermidis ATCC 35984 (RP62A) produtora de slime foi
positiva para ambos os genes, fornecendo uma banda de 188-bp para o gene icaA e
198-bp para o gene icaD. A amostra S. epidermidis não produtora de slime ATCC
1228 foi negativa para ambos os genes.
Após determinar o tamanho da banda padrão com marcador de peso
molecular de 200 pares de base (pb), o sistema de analisar imagens determina os
pesos esperados das bandas obtidas por amplificação do DNA extraído de amostras
Staphylococcus coagulase-negativa. As figuras 14 (A-B) e 15 (A-B) mostram a
detecção dos genes icaA e icaD por PCR.
82
Figura 14A – Gel analítico PCR para gene
ica
A. Linha 1: marcador de peso molecular de 200pb;
Linha 2: DNA de
S.epidermidis
ATCC: 35984 produtor de
slime
banda de 188pb; Linha 3: ausência de
banda de amostra de
S.epidermidis
ATCC: 12228 não produtor de
slime
; Linha 4: banda de 188pb
obtido com DNA de amostra de
S.chromogenes
(amostra Ch
1
); Linhas 5-14: bandas de 188pb obtido
com DNA de amostras de
S.epidermidis
(amostras E
1-10
); Linhas 15-16 banda de 188pb obtido com
DNA de amostra de
S.haemolyticus
(amostras Ha
1
-Ha
2
); Linha 17:ausência de banda de amostra de
S.haemolyticus
(amostra Ha
3
); Linha 18: banda de 188pb obtido com DNA de amostra de
S.haemolyticus
(amostra Ha
4
).
Figura 14B – Gel analítico PCR para gene
ica
A. Linha 19: marcador de peso molecular de 200pb;
Linha 20-21: bandas de 188pb obtido com DNA de amostras
S.hominis
(amostras Ho
1
e Ho
2
); Linhas
22-23: bandas de 188pb obtido com DNA de amostra de
S.lugdunensis
; Linha 24: ausência de banda
de amostra de
S.saprophyticus
(amostra Sa
1
); Linha 25: ausência de banda de amostra de
S.schleiferi
(amostra Sc
1
); Linhas 26-27: bandas de 188pb obtido com DNA de amostras de
S.xylosus
(amostras X
1
-X
2
); Linhas 28-31: bandas de 188pb obtido com DNA de amostra de
S.warneri
(amostras W
1
-W
4
).
+ (-) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
200pb
200pb
83
Figura 15A – Gel analítico PCR para gene
ica
D. Linha 1: marcador de peso molecular de 200pb;
Linha 2: DNA de
S.epidermidis
ATCC: 35984 produtor de
slime
banda de 198pb; Linha 3: ausência de
banda de amostra de
S.epidermidis
ATCC: 12228 não produtor de
slime
; Linha 4: banda de 198pb
obtido com DNA de amostra de
S.chromogenes
(amostra Ch
1
); Linha 5-14: bandas de 198pb obtido
com DNA de amostra de
S.epidermids
(amostras E
1
-E
10
); Linhas 15-16 banda de 198pb obtido com
DNA de amostra de
S.haemolyticus
(amostras Ha
1
-Ha
2
).
Figura 15B – Gel analítico PCR para gene
ica
D. Linha 17: marcador de peso molecular de 200pb;
Linha 18-19: banda de 200pb obtido com DNA de
S.haemolyticus
(amostra Ha
3
-Ha
4
); Linha 20-21:
bandas de 200pb obtido com DNA de
S.hominis
(amostras Ho
1
-Ho
2
); Linha 22-23: bandas de 200pb
obtido com DNA de amostras de
S.lugdunenis
(amostras L
1
-L
2
); Linha 24: ausência banda de amostra
de
S.saprophyticus
(amostra Sa
1
); Linha 25: ausência de banda de amostra de
S.schleiferi
(amostra
Sc
1
); Linhas 26-27: bandas de 200pb obtido com DNA de amostras de
S.xylosus
(amostras X
1
-X
2
);
Linhas 28-31: bandas de 200pb obtido com DNA de amostra de
S.warneri
(amostras W
1
-W
4
).
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
+ (-) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
200pb
200pb
84
Tabela 9 – Presença de genes
ica
A e
ica
D entre as espécies
de
Staphylococcus
coagulase-negativa
Microrganismos
Presença dos genes de virulência
ica
A
ica
D
C
1
S
.
chromogenes
Positivo
Positivo
E
1
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
2
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
3
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
4
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
5
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
6
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
7
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
8
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
9
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
E
10
S.
epidermidis
Positivo
Positivo
Ha
1
S.
haemolyticus
Positivo
Positivo
Ha
2
S.
haemolyticus
Positivo
Positivo
Ha
3
S.
haemolyticus
Negativo
Positivo
Ha
4
S.
haemolyticus
Positivo
Positivo
Ho
1
S.
hominis
Positivo
Positivo
Ho
2
S.
hominis
Positivo
Positivo
L
1
S.
lugdunensis
Positivo
Positivo
L
2
S.
lugdunensis
Positivo
Positivo
Sa
1
S.
saprophyticus
Negativo
Negativo
Sc
1
S.
schleiferi
Negativo
Negativo
X
1
S.
xylosus
Positivo
Positivo
X
2
S.
xylosus
Positivo
Positivo
W
1
S.
warneri
Positivo
Positivo
W
2
S.
warneri
Positivo
Positivo
W
3
S.
warneri
Positivo
Positivo
W
4
S.
warneri
Positivo
Positivo
Os produtos de PCR mostram a presença de
ica
A em 24 amostras
Staphylococcus
coagulase-negativa e
ica
D em 25 amostras.
85
A freqüência das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa que
apresentam a presença e não apresentam a presença dos genes icaA e icaD está
mostrada na Tabela 10.
Tabela 10 - Presença dos genes icaA e icaD entre as espécies Staphylococcus coagulase-negativa
Espécies
Presença dos genes
Ausência dos genes
S. epidermidis
10 (50,00%)
0 (00,00%)
S. haemolyticus
3 (15,79%)
1 (25,00%)
S. warneri
4 (21,05%)
0 (00,00%)
S.lugdunensis
0 (00,00%)
0 (00,00%)
S. hominis
0 (00,00%)
0 (00,00%)
S. xylosus
2 (10,53%)
0 (00,00%)
S. schleiferi
0 (00,00%)
1 (25,00%)
S. chromogenes
1 (05,26%)
0 (00,00%)
S. saprophyticus
0 (00,00%)
1 (25,00%)
TOTAL
20 (100,00%)
3 (100,00%)
86
Comparação entre as provas realizadas Tabela 11
Tabela 11. Comparação de resultados obtidos após estudo fenotípico e genotípico
entre as espécies de
Staphylococcus
coagulase-negativa.
Microrganismos
V.Congo
Ader. placa
Biofilme
Oxacilina
ica
A
icaD
C
1
S
.
chromogenes
negra
forte
negativo
resistente
positivo
positivo
E
1
S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E
2
S.
epidermidis
negra
forte
positivo
sensível
positivo
positivo
E
3
S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E
4
S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E
5
S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E
6
S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E7 S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E8 S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E9 S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
E10 S.
epidermidis
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
Ha1 S.
haemolyticus
negra
fraco
positivo
sensível
positivo
positivo
Ha2 S.
haemolyticus
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
Ha3 S.
haemolyticus
negra
forte
negativo
resistente
negativo
positivo
Ha4 S.
haemolyticus
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
Ho1 S.
hominis
vermelho
fraco
positivo
sensível
positivo
positivo
Ho2S.
hominis
vermelho
fraco
positivo
sensível
positivo
positivo
L1 S.
lugdunensis
vermelho
forte
positivo
sensível
positivo
positivo
L2 S.
lugdunensis
vermelho
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
Sa1 S.
saprophyticus
vermelho
forte
positivo
resistente
negativo
negativo
Sc1 S.
schleiferi
vermelho
fraco
positivo
sensível
negativo
negativo
X1 S.
Xylosus
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
X2 S.
xylosus
negra
forte
positivo
sensível
positivo
positivo
W1 S.
warneri
negra
fraco
negativo
resistente
positivo
positivo
W2 S.
warneri
negra
forte
positivo
sensível
positivo
positivo
W3 S.
warneri
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
W4 S.
warneri
negra
forte
positivo
resistente
positivo
positivo
87
Tabela 12. Distribuição das espécies de
Staphylococcus
coagulase-negativa nas amostras de cateter
Cateter
Espécies isoladas
7
E
1
Staphylococcus epidermidis
Ha
2
Staphylococcus haemolyticus
X
1
Staphylococcus xylosus
8
X
2
Staphylococcus xylosus
E
2
Staphylococcus epidermidis
9
W
2
Staphylococcus warneri
11
Ha
3
Staphylococcus haemolyticus
13
E
3
Staphylococcus epidermidis
14
E
4
Staphylococcus epidermidis
E
5
Staphylococcus epidermidis
E
6
Staphylococcus epidermidis
E
7
Staphylococcus epidermidis
16
L
1
Staphylococcus lugdunensis
19
Ho
1
Staphylococcus hominis
Ho
2
Staphylococcus hominis
20
W
1
Staphylococcus warneri
W
3
Staphylococcus warneri
22
Ha
4
Staphylococcus haemolyticus
24
Sc
1
Staphylococcus schleiferi
Sa
1
Staphylococcus saprophyticusi
32
W
4
Staphylococcus warneri
33
L
2
Staphylococcus lugdunensis
40
C
1
Staphylococcus chromogenes
E
8
Staphylococcus epidermidis
61
Ha
1
Staphylococcus haemolyticus
64
E
9
Staphylococcus epidermidis
65
E
10
Staphylococcus epidermidis
Legenda:
C
1
=
Staphylococcus chromogenes,
E
1
-E
10
Staphylococcus
epidermidis, Ha
1
-Ha
4
Staphylococcus
haemolyticus, Ho
1
-
Ho
2
Staphylococcus
hominis, L
1
-L
2
Staphylococcus lugdunensis
, Sc
1
=
Staphylococcus
schleiferi, Sa
1
=
Staphylococcus
saprophyticus, X
1
-X
2
=
Staphylococcus xylosus
, W
1
- W
2
=
Staphylococcus warneri
.
88
4.7. Padrões de resistência dos
Staphylococcus
coagulase-negativa
Os padrões de resistência das espécies de Staphylococcus coagulase-
negativa a 13 antibióticos mais comumente usados na clínica estão mostrados na
Tabela 13.
Tabela 13 - Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das 27 amostras de Staphylococcus
coagulase-negativa
MICRORGANISMOS
ANTIBIÓTICOS
CIP
CLI
CLO
ERI
GEN
LVX
OXA
PEN
RIF
SUT
TEC
TET
VAN
C
1
R
R
S
R
S
R
R
R
S
R
R
S
S
E
1
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
R
S
E
2
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
E
3
S
R
S
R
R
S
R
R
R
S
S
R
S
E
4
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
5
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
6
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
7
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
8
R
S
S
R
S
R
R
R
S
R
S
S
S
E
9
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
R
S
E
10
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
S
S
Ha
1
R
R
S
R
R
R
S
R
S
R
S
R
S
Ha
2
R
S
S
R
R
R
R
R
S
R
R
R
S
Ha
3
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
S
Ha
4
R
R
S
R
R
R
R
R
S
R
S
S
S
Ho
1
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
Ho
2
S
S
S
S
S
S
S
R
S
R
S
R
S
L
1
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
L
2
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
Sc
1
S
R
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Sa
1
R
R
R
R
S
R
R
R
S
R
S
R
S
X
1
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
S
S
S
X
2
S
S
S
R
S
S
S
R
S
S
S
S
S
W
1
S
R
S
R
R
S
R
R
S
R
S
R
S
W
2
S
S
S
R
S
S
S
R
S
S
S
S
S
W
3
S
R
S
R
R
S
R
R
S
R
S
S
S
W
4
R
S
R
S
S
R
R
R
S
S
S
S
S
Legenda:
C
1
=
Staphylococcus chromogenes,
E
1
-E
10
Staphylococcus
epidermidis, Ha
1
-Ha
4
Staphylococcus
haemolyticus, Ho
1
-
Ho
2
Staphylococcus
hominis, L
1
-L
2
Staphylococcus lugdunensis
, Sc
1
=
Staphylococcus
schleiferi, Sa
1
=
Staphylococcus
saprophyticus, X
1
-X
2
=
Staphylococcus xylosus
, W
1
- W
2
=
Staphylococcus warneri
; CIP = Ciprofloxacina, CLI = Clindamicina
CLO = Cloranfenicol, ERI = Eritromicina, GEN = Gentamicina, LVX = Levofloxacina, OXA = Oxacilina, PEN = Penicilina, RIF =
Rifampicina, SUT = Sulfazotrim, TEC = Teicoplanina, TET = Tetraciclina, VAN = Vancomicina.
89
Existe uma diferença na sensibilidade das amostras Staphylococcus
coagulase-negativa. Em 27 amostras analisadas, a freqüência de sensibilidade a
eritromicina foi verificada em cinco amostras de Staphylococcus coagulase-negativa,
incluindo: um S. epidermidis, dois S. hominis, um S. lugdunensis e um S. warneri;
para ciprofloxacina, S. saprophyticus e S. haemolyticus não demonstraram
sensibilidade.
O S. haemolyticus apresentou resistência à maioria dos antibióticos
estudados, principalmente à penicilina.
Todas as amostras de Staphylococcus coagulase-negativa eram sensíveis à
vancomicina. A maioria das amostras apresentaram resistência a oxacilina e a
múltiplos antibióticos.
90
Tabela 14 – Distribuição das amostras clínicas em relação aos microrganismos e ao
teste de sensibilidade e resistência aos antimicrobianos
Amostras
Microrganismos
Antibióticos
CIP
CLI
CLO
ERI
GEN
LVX
OXA
PEN
RIF
SUT
TEC
TET
VAN
7
E
1
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
R
S
Ha
2
R
S
S
R
R
R
R
R
S
R
R
R
S
X
1
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
S
S
S
8
X
2
S
S
S
R
S
S
S
R
S
S
S
S
S
E
2
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
9
W
2
S
S
S
R
S
S
S
R
S
S
S
S
S
11
Ha
3
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
S
13
E
3
S
R
S
R
R
S
R
R
R
S
S
R
S
14
E
4
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
5
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
6
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
E
7
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
16
L
1
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
19
Ho
1
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
Ho
2
S
S
S
S
S
S
S
R
S
R
S
R
S
20
W
1
S
R
S
R
R
S
R
R
S
R
S
R
S
W
3
S
R
S
R
R
S
R
R
S
R
S
S
S
22
Ha
4
R
R
S
R
R
R
R
R
S
R
S
S
S
24
Sc
1
S
R
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Sa
1
R
R
R
R
S
R
R
R
S
R
S
R
S
32
W
4
R
S
R
S
S
R
R
R
S
S
S
S
S
33
L
2
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
40
C
1
R
R
S
R
S
R
R
R
S
R
R
S
S
E
8
R
S
S
R
S
R
R
R
S
R
S
S
S
61
Ha
1
R
R
S
R
R
R
S
R
S
R
S
R
S
64
E
9
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
R
S
65
E
10
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
S
S
Legenda: E
1
=
S.epidermidis
; Ha
2
=
S.haemolyticus
; X
1
=
S.xylosus
; X
2
=
S.xylosus
; E
2
=
S.epidermidis
; W
2
=
S.warneri
;
Ha
3
=
S.haemolyticus
; E
3
=
S.epidermidis
; E
4
-E
7
=
S.epidermidis
; L
1
=
S.lugdunensis
; Ho
1
-Ho
2
=
S.hominis
; W
1;
W
3
=
S.warneri
;
Ha
4
=
S.haemolyticus
; Sc
1
=
S.schleiferi
; Sa
1
=
S.saprophyticus
; W
4
=
S.warneri
; L
2
=
S.lugdunensis
; C
1
=
S.chromogenes
;
E
8
=
S.epidermidis
; Ha
1
=
S.haemolyticus
; E
9
=
S.epidermidis
; E
10
=
S.epidermidis
. CIP=Ciprofloxacina; CLI=Clindamicina;
CLO=Cloranfenicol; ERI=Eritromicina; GEN=Gentamicina; LVX=Levofloxacina; OXA=Oxacilina; PEN=Penicilina;
RIF=Rifampicina; SUT=Sulfazotrim; TEC=Teicoplanina; TET=Tetraciclina; VAN=Vancomicina.
91
5. DISCUSSÃO
O hábitat normal dos Staphylococcus coagulase-negativa é a pele e
mucosas de humanos e animais (Heilmann & Peters, 2000).
Para fins de diagnóstico são separados do Staphylococcus aureus pela
inabilidade de produzir coagulase livre. Baseados no teste de resistência a
novobiocina, os Staphylococcus coagulase-negativa foram divididos em dois grupos:
novobiocina resistentes: grupo dos Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus,
S. conhnii e S. xylosus) e novobiocina sensíveis: grupo dos Staphylococcus
epidermidis (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis, S. warneri, S.
simulans, S. auricularis, S. lugdunensis e S. schleiferi). No entanto, a espécie mais
isolada de microbiota normal, bem como de amostras clínicas é o Staphylococcus
epidermidis (Heilmann & Peters, 2000), conforme aconteceu em nosso estudo.
Na presente pesquisa, além do S. epidermidis as outras espécies de
Staphylococcus coagulase-negativa mais isoladas foram: S. haemolyticus, S.
warneri, S. xylosus, S. lugdunensis, S. hominis, S. saprophyticus, S. schleiferi e S.
chromogenes. Distribuindo as espécies de acordo com a resistência a novobiocina,
mostra-se no presente estudo, o seguinte: novobiocina resistentes: S. saprophyticus
e S. xylosus; novobiocina sensíveis: S. epidermidis; S. haemolyticus, S. hominis, S.
warneri, S. lugdunensis, S. schleiferi e S. chromogenes.
A distribuição das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa
isoladas de amostras clínicas (Figura 2), em nosso estudo, foi semelhante ao de
outros estudos para S. epidermidis e S. haemolyticus (Hussain et al., 2000; Petinaki
et al. 2001; Alcaráz et al. 2003). A freqüência de isolamento de S. warneri de
92
amostras clínicas, em nosso estudo, diferiu dos dados apresentados por Alcaráz et
al. (2003), cujo isolamento foi bem menos freqüente, apenas uma cepa.
Porém, todas estas cepas foram isoladas de várias amostras clínicas
com freqüência maior ou menor, como observado por Ieven et al. (1995) e Kleeman
et al. (1993). Entretanto, Alcaráz et al. (2003) mostraram que S. epidermidis, S.
hominis, S. haemolyticus e S. saprophyticus foram mais isolados de amostras
clínicas do que de amostras ambientais.
Os Staphylococcus coagulase-negativa, particularmente o
Staphylococcus epidermidis está entre os microrganismos isolados com mais
freqüência em Laboratórios de Microbiologia Clínica. Dentre a maioria de infecções
atribuídas aos Staphylococcus coagulase-negativa, estão as infecções hospitalares.
A fonte de infecção é a pele e as mucosas e a porta de entrada, freqüentemente, um
cateter intravascular (Heilmann & Peters, 2000).
Os pacientes que usam cateteres ou implantes médicos fabricados
com polímeros (polietileno, poliuretano, borracha de silicone) para fins diagnósticos
ou procedimentos terapêuticos, estão sujeitos a desenvolverem infecção, sendo o
Staphylococcus epidermidis o microrganismo mais isolados nestas infecções,
principalmente a relacionada ao uso destes dispositivos (Heilmann & Peters, 2000).
Na presente pesquisa, as cepas estudadas eram de origem hospitalar
e foram isoladas de cateteres. A maior freqüência de isolamento de espécies de
Staphylococcus coagulase-negativa, observada, era de Staphylococcus epidermidis,
dado concordante com a literatura (Heilmann & Peters, 2000; Hussain et al., 2000;
Petinaki et al., 2001; Alcaráz et al., 2003; Cunha et al., 2004).
No quadro clínico das infecções causadas pelo S. epidermidis não
existem sinais fulminantes de infecção e o curso clínico é mais subagudo ou mesmo
93
crônico e o diagnóstico da infecção é difícil. A terapia para as infecções associadas
aos polímeros é problemática, apesar da apropriada antibioticoterapia, comprovada
eficácia in vitro e boa resposta do hospedeiro; geralmente, não é possível erradicar o
foco infeccioso e para interromper a infecção há necessidade da remoção do cateter.
O S. epidermidis requer a presença de um hospedeiro para causar a infecção e
somente nesta circunstância, ou seja, ecossistema humano cutâneo ou
mucocutâneo, passa de um organismo comensal ou saprófita para patógeno
(Heilmann & Peters, 2000).
As outras espécies dos Staphylococcus coagulase-negativa, que não
S. epidermidis, são comensais de pele humana ou animal e apenas alguns deles
tornam-se patogênicos, em virtude dos avanços da ciência na medicina humana e
veterinária (Lina et al., 2000).
Os avanços nas técnicas de identificação das espécies de
Staphylococcus não-aureus permitiu identificar as espécies com potencial
patogênico em humanos, como: S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. lugdunensis,
S. schleiferi, S. warneri, S. caprae ou em animais: S. intermedius, S. hycus e S.
simulans (Kloos & Bannerman, 1994).
No presente estudo seguiu-se o esquema de identificação
convencional de Kloos & Bannerman (1995) e Ruoff (1999) adaptado por Bernardi et
al. (2001) e Kloos & Schleifer (1975) modificado por Bannerman (2003) e sistema de
identificação APIStaph system (bioMérieux). Na comparação entre os dois métodos
convencionais de identificação e o sistema de referência APIStaph observou-se que
o número de cepas identificadas como S. epidermidis foi correta e semelhante nos
três métodos. Porém, as identificações não foram concordantes na espécie S.
warneri. Cunha et al. (2004) em estudo de comparação entre métodos de
94
identificação (Kloos & Schleifer 1975; Bannerman 2003) e sistema API Staph
mostraram que a sensibilidade do método para identificar S. epidermidis foi de
97,8% de sensibilidade e 100% de especificidade. Para S. warneri 52,9% de
sensibilidade e 98,8% de especificidade. Para S. hominis 75% de sensibilidade e
97,6% especificidade. E para S. haemolyticus 62,5% de sensibilidade e 96,7% de
especificidade.
Bannerman et al. (1993), relataram baixa acurácia de identificação pelo
sistema API Staph das espécies S. warneri e S. hominis.
Cunha et al. (2004) explicaram que este fato pode estar relacionado
com a falta de testes complementares como: resistência à novobiocina, crescimento
anaeróbio em tioglicolato e produção de hemolisina. Ainda, de acordo com este
autor a identificação das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa é ainda
difícil para a maioria dos laboratórios clínicos. O esquema proposto por Kloos e
Schleifer, 1975 é o método de referência usado para identificação das espécies de
Staphylococcus coagulase-negativa, mas, para rotina laboratorial este método é
relativamente trabalhoso e requer a utilização de grande número de testes
bioquímicos.
Ieven et al. (1995) e De Paulis et al. (2003) relataram que a
identificação dos Staphylococcus coagulase-negativa é muito importante para a
determinação de suas características fisiopatológicas, clínicas e estudos
epidemiológicos, uma vez que esses microrganismos são agentes etiológicos de
uma série de processos infecciosos.
Nas últimas décadas houve um aumento e emergência de cepas
Staphylococcus coagulase-negativa resistentes ao antibiótico meticilina,
principalmente em hospitais (Jaffe et al., 2000).
95
A maioria das cepas Staphylococcus coagulase-negativa apresentam
uma proteína ligada à penicilina, a qual diminui a afinidade pelos antibióticos beta-
lactâmicos, constituindo-se em um dos mecanismos de resistência associado com a
oxacilina (meticilina). Outros mecanismos de resistência incluem a hiperprodução da
enzima beta-lactamase (Alcaráz et al., 2003).
O tratamento de escolha para as infecções causadas pelo
Staphylococcus coagulase-negativa, com freqüência é a vancomicina. Devido à
emergência de enterococos resistentes a vancomicina (Bradley et al., 1999) e
estafilococos vancomicina-resistente (Hiramatsu, 1998; Sievert et al., 2002), a
recomendação é reduzir o uso desta droga (Ferreira et al., 2003).
No entanto, Ferreira et al., (2003) mostraram que é importante o
Laboratório Clínico distinguir entre as cepas Staphylococcus coagulase-negativa a
sensibilidade e a resistência à oxacilina, para o controle do uso desnecessário da
vancomicina em hospitais. Alcaráz et al. (2003) relataram que o uso indevido de um
antimicrobiano, no caso vancomicina, apresenta complicações terapêuticas, alto
custo e pode levar à seleção de mutantes resistentes. Dickinson & Archer (2000) e
Raad et al. (1998) estimaram que quase 90% dos estafilococos são penicilina
resistentes e a resistência a oxacilina está aumentando.
Dickinson & Archer (2000) relataram que a resistência a oxacilina
envolve resistência cruzada com todos os outros antibióticos beta-lactâmicos.
Na presente pesquisa, os dados obtidos usando o teste fenotípico para
a detecção da resistência a oxacilina estão apresentados na Tabela 1 e 2. As cepas
de Staphylococcus coagulase-negativa foram avaliadas pelo método de disco
difusão e os dados mostraram que 70,37% das cepas foram resistentes a oxacilina.
Os resultados são concordantes com aqueles obtidos por outros estudiosos (Ferreira
96
et al., 2002; Louie et al., 2001). Dickema et al. (2001) citaram que, mais de 70% dos
Staphylococcus coagulase-negativa no mundo são resistentes a oxacilina e as
cepas hospitalares tornaram-se resistentes a vários outros agentes antimicrobianos.
Ferreira et al. (2003) observaram que os dados nacionais são escassos. Sader et al.
(2001) relataram uma freqüência de 80% de resistência entre os Staphylococcus
coagulase-negativa envolvidos nas infecções de corrente sanguínea. No estudo de
Ferreira et al. (2003) encontraram freqüência de resistência a oxacilina de 64% entre
os Staphylococcus coagulase-negativa isolados de diferentes amostras clínicas.
Christensen et al. (1982) e Peters et al. (1982) relataram que a maioria
das espécies de Staphylococcus coagulase-negativa isoladas de cateteres ou de
próteses produzem grande quantidade de uma substância mucóide extracelular ou
slime, a qual não era detectada em meios de cultura utilizados na rotina em
laboratório.
Christensen et al. (1987) relataram que muitas espécies de bactérias
causadoras de doenças apresentaram espontaneamente, variação fenotípica
durante a colonização de uma superfície caracterizando sua virulência. Estes
pesquisadores, encontraram uma associação entre produção de slime, entre cepas
de Staphylococcus coagulase-negativa que colonizam cateteres e, a patogênese de
infecção por um corpo estranho.
Alcaráz et al., (2003) e Barcs et al. (1989) propuseram que a habilidade
de produzir o slime extracelular pode ser considerada marcador de patogenicidade,
associado com a virulência dos Staphylococcus coagulase-negativa. Muitas cepas
Staphylococcus coagulase-negativa formam um aderente filme bacteriano, o slime,
cuja formação funciona como um fator de virulência. Afirma-se que este é o
mecanismo pelo qual a bactéria adere e coloniza as próteses.
97
Freeman et al. (1989) propuseram o ágar Vermelho Congo, como
método alternativo para detectar a produção de slime em Staphylococcus coagulase-
negativa.
No presente estudo foi usado o ágar Vermelho Congo e a produção de
slime foi detectada em 77,78% das cepas de Staphylococcus coagulase-negativa
(Tabelas 4 e 5). Este meio de cultura permite verificar as modificações fenotípicas
das colônias dos Staphylococcus coagulase-negativa, as quais são categorizadas
pelas cores negra e vermelha. As colônias produtoras de slime apresentam cor
negra e as não produtoras cor vermelha.
Em relação à distribuição das cepas produtoras de slime de amostras
clínicas, os resultados obtidos no presente estudo são semelhantes àqueles
relatados por Galdbart et al. (2000); Rupp & Archer (1994), os quais notaram que o
S. epidermidis coloniza os cateteres. Mostra também que o slime foi detectado em
espécies de Staphylococcus coagulase-negativa, particularmente em
Staphylococcus epidermidis. Alcaráz et al. (2003) relataram que a produção de slime
é uma característica das cepas hospitalares Staphylococcus coagulase-negativa
patogênicas.
Em nosso estudo a origem das cepas era de ambiente hospitalar e
isoladas de cateteres. Para detectar a habilidade destas cepas de produzir slime
foram usados dois métodos: qualitativo e quantitativo.
Stepanovic et al. (2000) notaram que o teste de aderência em placas é
um dos métodos usados com freqüência para quantificar a formação do biofilme
produzido pelos Staphylococcus coagulase-negativa, além de funcionar como um
indicador de patogenicidade.
98
Os dados obtidos, na presente pesquisa, mostraram que ambos os
métodos detectaram slime em todas as cepas Staphylococcus coagulase-negativa
(Tabelas 3 a 6), com exceção para as espécies S. hominis e S. schleiferi os quais
em ágar Vermelho Congo não demonstraram produção de slime e pelo método
quantitativo detectou-se esta produção. Estudos anteriores de Barcs et al. (1989)
mostraram que existe uma alta coincidência na detecção de slime, em
Staphylococcus coagulase-negativa, usando métodos quantitativos e qualitativos. Os
nossos resultados são consistentes com Alcaráz et al. (2003), os quais detectaram a
produção de slime em algumas cepas por um e/ou por outro método.
No presente estudo a análise da capacidade de aderência das
diferentes espécies de Staphylococcus mostrou moderado grau de aderência do S.
haemolyticus (cepa Ha1), S. hominis (cepas Ho1 e Ho2), S. schleiferi (Sc1) e S.
warneri (W1). Os dados apresentados para S. haemolyticus são consistentes com os
resultados obtidos por Stepanovic et al. (2000), os quais mostraram variados graus
de aderência (fraca, moderada e forte) para essa espécie de Staphylococcus.
A Tabela 2 mostra a alta resistência a oxacilina entre as cepas
Staphylococcus coagulase-negativa e também mostra que cepas produtoras de
slime são resistentes a oxacilina, com exceção das cepas S. epidermidis (E2), S.
hominis (Ho1 e Ho2), S. haemolyticus (Ha1), S. lugdunensis (L1), S. schleiferi (Sc1),
S. xylosus (X2) e S. warneri (W2). As 19 cepas de Staphylococcus coagulase-
negativa resistentes a oxacilina e produtoras de slime foram isoladas de cateteres
removidos de pacientes internados em Unidade de Terapia Intensiva. Arciola et al.
(2002) relataram que a produção de slime esta associada com a reduzida
sensibilidade aos antimicrobianos.
99
Mohan et al. (2002) estudaram 192 cepas de Staphylococcus
coagulase-negativa quanto à resistência aos antimicrobianos e observaram que
contra 15 antibióticos mais usados as cepas mostraram multidroga-resistência com
mais de 90% de resistência à penicilina, mais de 50% a cefalexina e ciprofloxacina e
mais de 20% a meticilina. Os autores destacaram a importância da identificação das
espécies e do teste de sensibilidade aos antibióticos para os Staphylococcus
coagulase-negativa de amostras clínicas.
A presente pesquisa mostrou que em relação a resistência aos
antimicrobianos, 19 cepas de Staphylococcus coagulase-negativa (70,37%) foram
resistentes à oxacilina e 24 cepas resistentes à penicilina. Barberis et al. (2001)
consideraram as cepas oxacilina resistentes, também resistentes à penicilina e
ampicilina. De acordo com CLSI (2005) os estafilococos penicilina-sensíveis são
também sensíveis para outras penicilinas, cefalotinas e carbapenens com uso
aprovado pelo FDA para as infecções estafilocócicas.
Observou-se neste estudo, a presença de amostras resistentes à
penicilina e sensíveis a oxacilina (Tabela 13 e 14). O documento do CLSI (2005)
relata que estas cepas são resistentes à penicilina penicilinase-lábil, mas sensíveis a
outras penicilinas penicilinase-estável, beta-lactâmicos e beta-lactâmicos associados
com inibidores de beta-lactamase, cefalotinas e carbapenens.
Adicionalmente, o documento CLSI (2005) cita que Staphylococcus
spp. resistentes a oxacilina são resistentes a todos antibióticos beta-lactâmicos
atualmente disponíveis. Desta forma, a sensibilidade ou resistência ao grande
número de antibióticos beta-lactâmicos pode ser deduzida testando apenas
penicilina e oxacilina. O teste de rotina para outras penicilinas, associações dos
inibidores de beta-lactamase, cefalosporinas e carbapenens, não é recomendado.
100
Na presente pesquisa as cepas Staphylococcus coagulase-negativa
resistentes aos antibióticos da classe dos Macrolídeos (eritromicina), Lincosamidas
(clindamicina) foram 22 (81,48%) resistentes à eritromicina e 18 (66,66%) à
clindamicina conforme é mostrado na Tabela 14. Os dados obtidos são consistentes
com estudos de Barberis et al. (2001), que observaram que as cepas oxacilina
resistentes eram freqüentemente resistentes a vários agentes antimicrobianos,
principalmente, eritromicina e clindamicina. Em nosso estudo a porcentagem de
resistência a oxacilina no Brasil é comparável aos obtidos por Del’Alamo et al.
(1999).
Fiebelkorn et al. (2003) e Jorgensen et al. (2004) relataram que a
resistência aos macrolídeos em estafilococos pode ser devido à modificação do alvo
ribossomal e está associada com o fenótipo de resistência macrolideo-lincosamida-
estreptograminaB. A resistência pode ser constitutiva ou induzida após a exposição
ao macrolídeo. Baixos níveis de eritromicina são os mais efetivos indutores da
resistência a clindamicina.
A aderência bacteriana é considerada um fator de virulência, o qual
contribui com as infecções associadas a cateteres e outros dispositivos (Arciola et
al., 2001).
François et al. (1996), sugeriram que a interação da bactéria com
biomateriais desempenham importante papel no progresso de severas infecções
hospitalares.
Peters et al. (1982), Christensen et al. (1993), e Arciola et al. (2001),
notaram que espécies de Staphylococcus coagulase-negativa tem habilidade de
colonizar materiais artificiais, devido a produção de polissacarídeos extracelulares
(slime) e formar biofilme.
101
Observou-se nesta pesquisa que a habilidade de formar biofilme entre
as diversas espécies de Staphylococcus coagulase-negativa foi demonstrada por
microscopia eletrônica de varredura (Figuras 6 a 13). Dados consistentes com
Peters et al. (1982), os quais usando microscopia eletrônica de varredura mostraram
que a aderência dos estafilococos a superfície de cateteres foi seguida de uma
proliferação própria e de produção de slime, material que cobre a colônia bacteriana.
Christensen et al. (1993), colocaram como hipótese que a habilidade do S.
epidermidis de aderir e colonizar um corpo estranho é muito importante na
patogênese da infecção de um corpo estranho. Os resultados de Christensen, em
relação à importância na produção de slime em infecções por S. epidermidis ou
outras cepas de Staphylococcus coagulase-negativa, confirmam os dados obtidos
neste estudo. A importância clínica das cepas produtoras de slime é a facilidade que
elas têm de colonizar cateteres intravenosos e produzir infecção da corrente
sanguínea.
Peters et al. (1982) notaram que o passo mais importante na
patogênese das infecções associadas a corpos estranhos causadas pelo
Staphylococcus epidermidis ou outras espécies de Staphylococcus coagulase-
negativa é a colonização da superfície do polímero formando agrupamentos
celulares em multicamadas, os quais estão embutidos em um material extracelular
amorfo.
Na presente pesquisa, observou-se que os biofilmes formados pelas
espécies de Staphylococcus coagulase-negativa sobre a superfície do cateter,
apresentaram a mesma característica acima descrita, ou seja, agrupamento celular
envolto em substância amorfa, a qual é mais evidente nas eletromicrografias que
mostram o S. epidermidis, S. xylosus e S. hominis (Figuras 6, 10 e 11).
102
Hussain et al. (1993) relataram que infecção devido a presença de
cateter ocorre também pela inoculação de poucas bactérias da pele do paciente
durante o procedimento de inserção do cateter. A bactéria colonizante junto com o
material extracelular, o qual é principalmente composto de ácido teicóico da parede
celular da bactéria e produtos do hospedeiro são referidos como biofilme.
Peters et al. (1981) usando microscopia eletrônica de varredura
demonstraram a presença de biofilme aderente sobre cateter intravascular removido
de paciente.
Vuong & Otto (2002) relataram que a formação de biofilme é considerado o
principal fator de virulência para infecções estafilocócicas.
Heilman & Peters (2000) mostraram que a formação do biofilme sobre
superfície de cateteres é realizado em dois passos: uma aderência rápida da
bactéria à superfície, seguida de uma fase mais prolongada que envolve a
multiplicação bacteriana e aderência intercelular. Atualmente, a formação do biofilme
tem sido estudada por meio de mecanismos moleculares. Vários fatores estão
envolvidos na aderência bacteriana inicial: forças físico-químicas, hidrofobicidade e
proteínas de superfície celular.
Muller et al. (1993) relataram que na fase de proliferação celular,
acumulo de bactérias formando agrupamentos, além de proteína, também está
associada com a aderência inicial, uma estrutura polissacarídica, ou seja, um
polissacarídeo capsular/adesina (PS/A) e produção de slime.
Heilmann & Peters (2000) relataram que após a aderência inicial à
superfície do cateter, a bactéria prolifera e acumula-se agrupada em multicamadas.
A formação de multicamadas requer a aderência intercelular, realizada por uma
103
adesina polissacarídica intercelular (PIA-polysaccharide intercellular adhesin). De
acordo com Mack et al. (1996) PIA representa uma única estrutura polissacarídica.
Arciola et al. (2002) descreram que a síntese do slime é controlado por
um operon ica e que a ativação deste operon é o alvo da síntese da adesina
polissacarídica intercelular-PIA
Fey et al. (1998) mostraram que PIA representa um importante fator de
patogenicidade e funciona como mediador da reação de hemaglutinação. A
hemaglutinina do S. epidermidis está associada com a produção de biofilme e
estrutura do polissacarídeo.
O´Gara & Humphreys (2001) descreveram que a produção do PIA, que
representa a chave do fator de virulência nos Staphylococcus coagulase-negativa,
está associado a um dispositivo de “on↔off” ou fase de variação, empregado por
muitas espécies bacterianas.
Heilmann et al. (1997) relataram que os genes (icaABC) que intervem o
agrupamento celular e a síntese do PIA foram clonados e seqüenciados. Mais tarde,
o gene icaD localizado entre icaA e icaB, também foi identificado. O gene icaA
carreia a N-acetilglicosaminatransferase, e sozinha exibe baixa atividade de
transferase. A co-expressão de icaA junto com icaD aumenta a atividade e síntese
dos oligômeros N-acetilglicosamina.
Arciola et al. (2002) mostraram que técnicas moleculares para
identificação dos genes ica, que codificam a síntese do slime, representa uma
ferramenta muito importante para uma identificação acurada de cepas virulentas
formadoras de slime.
104
Neste estudo a presença dos genes icaA e icaD responsáveis pela
síntese do slime foi investigada em 2 cepas de referência e 27 cepas isoladas de
cateter pelo método PCR.
Ziebuhr et al. (1997) demonstraram que existe uma forte correlação
entre a formação de biofilme e presença do gene de agrupamento ica.
Vuong & Otto (2002) observaram em seus resultados que o gene ica
está presente em amostras relacionadas a infecções e que cepas saprófitas não
expressam estes genes.
No nosso estudo, a presença dos genes icaA e icaD foi demonstrada
por PCR em: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. xylosus e S.
chromogenes, exceção para as cepas S. saprophyticus e S. schleiferi, todas
provenientes de cateter.
Vuong et al. (2003) relataram que o principal mecanismo de virulência
entre os Staphylococcus coagulase-negativa é a formação do biofilme.
Otto (2004) relatou que o potencial de patogenicidade dos Staphylococcus
coagulase-negativa deve-se principalmente a sua capacidade de formar biofilmes
sobre implantes médicos. Em biofilme, as bactérias são protegidas contra
antibióticos e ataques do sistema imune. A formação do biofilme é o fator de
virulência dos Staphylococcus coagulase-negativa mais estudado e compreende a
aderência à superfície do cateter e o agrupamento celular.
Götz (2002) demonstrou que os Staphylococcus spp. formam biofilme
sobre cateteres após uma colonização primária seguida pela aderência e
agrupamento intercelular. O autor acredita que vários fatores estão envolvidos na
aderência primária, a qual depende da interação físico-química da superfície celular
com a superfície abiótica. De acordo com Heilmann et al. (1997) o fator mais
105
importante e mais estudado e que tem influência na aderência primária do S.
epidermidis é a autolisina AtIE, na qual a seqüência repetitiva, presumivelmente,
interage com a superfície abiótica pela interação hidrofóbica.
Mack et al. (2000) mostraram que a segunda fase da formação do
biofilme requer a adesina polissacarídica intercelular (PIA), um homopolímero
parcialmente desacetilado com resíduo N-acetilglicosamina ligado pela ponte 1-6
beta-glicosideo, o qual é produzido pelo locus do gene ica.
Na presente pesquisa detectou-se Staphylococcus coagulase-negativa
formadores de biofilme resistentes a mais de seis antibióticos, os quais foram
considerados multirresistentes. Vuong & Otto (2002) relataram que a formação de
biofilme tem sido considerado o fator de patogenicidade mais importante entre os
Staphylococcus coagulase-negativa, principalmente o S. epidermidis.
Neste estudo destacou-se a importância da identificação correta das
espécies Staphylococcus coagulase-negativa, os fatores de virulência envolvidos em
cepas hospitalares e a resistência aos antimicrobianos. Outras metodologias para a
avaliação dos fatores de patogenicidade destas espécies estão sendo estudados,
bem como técnicas moleculares mais sensíveis estão sendo empregadas para
melhor compreender os mecanismos pelos quais estes microrganismos tornam-se
patogênicos.
106
6 - CONCLUSÕES
1) A avaliação qualitativa da produção de slime por cepas de Staphylococcus
coagulase-negativa em ágar vermelho Congo, mostrou cepas produtoras e não
produtoras de slime. Todas as cepas de S. epidermidis, S. chromogenes, S.
haemolyticus, S. xylosus e S. warneri eram cepas produtoras de slime.
1a) Na avaliação quantitativa da produção de slime por cepas Staphylococcus
coagulase-negativa em placas de poliestireno foram verificadas cepas fraca e
fortemente aderentes. As cepas que apresentaram aderência fraca foram: S.
haemolyticus (Ha
1
), S. hominis (Ho
1
e Ho
2
), S. schleiferi e S. warneri (W
1
). As cepas
fortemente aderentes foram: S. epidermidis (E
1
-E
10
), S. haemolyticus (Ha
2
–Ha
4
), S.
lugdunensis (L
1
–L
2
), S. saprophyticus, S. xylosus (X
1
–X
2
) e S. warneri (W
2
–W
4
).
2) A formação do biofilme (agrupamento de cocos envoltos em slime) sobre a
superfície do cateter foi demonstrada por microscopia eletrônica de varredura para a
maioria das cepas Staphylococcus coagulase-negativa exceção para S.
chromogenes (C
1
), S. haemolyticus (Ha
3
) e S. warneri (W
1
).
3) A maioria das espécies Staphylococcus coagulase-negativa mostraram que houve
associação entre a produção de polissacarídeo extracelular (slime), origem das
cepas e reduzida sensibilidade aos antimicrobianos, sugerindo o potencial
patogênico no ambiente hospitalar.
107
4) A maioria das cepas Staphylococcus coagulase-negativa eram oxacilina
resistentes e estavam associadas à produção de polissacarídeos extracelulares
(slime).
5) A reação PCR usada para detectar os genes de aderência intercelular (icaA e
icaD) em cepas de Staphylococcus coagulase-negativa mostrou a presença dos
genes icaA e icaD em 100% dos isolados com exceção para S. saprophyticus e S.
schleiferi.
5a) Uma cepa de S. haemolyticus e uma de S warneri não apresentaram o gene
icaA, mas o gene icaD.
108
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140
8 – APÊNDICE
8.1 – APÊNDICE A
: Formulação dos meios de cultura utilizados no trabalho.
Ágar Base-Sangue – (MERCK)
Substrato nutritivo...............................................................................................20,0g
Cloreto de sódio...................................................................................................5,0g
Ágar...................................................................................................................15,0g
Água destilada...............................................................................................1000,0mL
pH 6,8
±
0,2 a 25°C
Ágar Mueller-Hinton – (MERCK)
Infusão de carne bovina...........................................................................................2,0g
Hidrolisado de caseína..........................................................................................17,5g
Amido......................................................................................................................1,5g
Ágar......................................................................................................................17,0g
Água destilada.................................................................................................1000,0mL
pH 7,3
±
0,2 a 25°C
Ágar de Cérebro-Coração – (MERCK)
Extrato de cérebro-coração e peptona...............................................................27,5g
D (+) glicose.........................................................................................................2,0g
Cloreto de sódio...................................................................................................5,0g
Hidrogenofosfato di-sódico..................................................................................2,5g
Ágar...................................................................................................................15,0g
Água destilada..............................................................................................1000,0mL
pH 7,3
±
0,2 a 25°C
141
Ágar Vermelho Congo (Freeman
et al.
, 1989)
Ágar de cerebro-coração-BHI (MERCK)..........................................................37,0g
Sacarose (MERCK)..........................................................................................50,0g
Corante vermelho Congo (VETEC)...................................................................0,8g
Água destilada............................................................................................1000,0mL
pH 7,3 ± 0,2 a 25°C
Ao meio esterilizado e resfriado a 55°C foi acrescentando assepticamente
solução aquosa do corante vermelho Congo e sacarose.
Ágar Vermelho de Fenol (utilização de carboidratos) – (DIFCO)
Extrato de carne...............................................................................................1,0g
Peptona proteose Nº 3...................................................................................10,0g
Cloreto de Sódio..............................................................................................5,0g
Vermelho de fenol...........................................................................................0,018g
Ágar1..............................................................................................................5,0g
Água destilada.........................................................................................1000,0mL
pH final 6.8 ±0.2 a 25°C
Infusão de Cérebro-Coração (BHI) – (MERCK)
Extrato de cérebro-coração e peptona..........................................................27,5g
D (+) glicose....................................................................................................2,0g
Cloreto de sódio..............................................................................................5,0g
Hidrogenofosfato di-sódico.............................................................................2,5g
Água destilada..........................................................................................1000,0mL
pH 7,3 ± 0,2 a 25°C
142
Caldo Triptona Soja (TSB) – (DIFCO)
Triptona..........................................................................................................17,0g
Soitona............................................................................................................3,0g
Dextrose..........................................................................................................2,5g
Cloreto de sódio..............................................................................................5,0g
Fosfato di-potássico........................................................................................2,5g
Água destilada..........................................................................................1000,0mL
pH 7,3 ± 0,2 a 25°C
Caldo Mueller-Hinton – (DIFCO)
Infusão de carne bovina...............................................................................300,0g
Ácido de casamino técnico............................................................................17,5g
Amido..............................................................................................................1,5g
Água destilada..........................................................................................1000,0mL
pH 7,3
±
0,2 a 25°C
143
8.2 – APÊNDICE B
: Formulação das soluções utilizadas na pesquisa.
Tampão Fosfato 0,2M (pH 7,1)
Solução A
.......................................................................................................33,00mL
Solução B
.......................................................................................................67,00mL
a) Solução A
Fosfato monossódico 1-hidratado (MERCK).......................................................2,76g
Água destilada.................................................................................................100,0mL
b) Solução B
Fosfato dissódico 12-hidratado (MERCK)............................................................7,17g
Água destilada..........................................qsp..................................................100,0mL
Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,1)
Tampão fosfato 0,2M (pH 7,1)..........................................................................50,00mL
Água destilada..................................................................................................50,00mL
Solução Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,1) – Glutaraldeído a 2,5%
Tampaõ fosfato 0,1M (pH 7,1)..........................................................................48,50mL
Glutaraldeído 50% solução aquosa (FLUKA)....................................................2,50mL
Solução de etanol a 15%
Álcool etílico absoluto P.A. (MERCK)..............................................................15,00mL
Água destilada..................................................................................................85,00mL
144
Solução de etanol a 30%
Álcool etílico absoluto P.A. (MERCK)...............................................................30,00mL
Água destilada..................................................................................................70,00mL
Solução de etanol a 50%
Álcool etílico absoluto P.A. (MERCK)...............................................................50,00mL
Água destilada..................................................................................................50,00mL
Solução de etanol a 70%
Álcool etílico absoluto P.A. (MERCK)...............................................................70,00mL
Água destilada..................................................................................................30,00mL
Solução de etanol a 95%
Álcool etílico absoluto P.A. (MERCK)...............................................................95,00mL
Água destilada....................................................................................................5,00mL
Salina fisiológica a 0,85%
Cloreto de sódio
...............................................................................................0,85g
Água destilada
...........................................................................................100,00mL
Solução de lizosima
Lizosima.............................................................................................................
4mg/mL
Glicose...............................................................................................................
50mM
Na
2
EDTA...........................................................................................................
10mM
Trizma base.......................................................................................................
25mM
145
Os componentes são preparados separadamente, 10 vezes concentrados, em
soluços estoque. No momento do uso, as soluções são diluídas em água Mili Q, a
fim de se atingir a concentração desejada. As soluções de trizma base e Na
2
EDTA
são autoclavadas a 121°C durante 15 minutos, e a solução de glicose, esterilizada
por filtração em membrana filtrante, com poros de 0,22
µ
m de diâmetro.
Tampão Tris-EDTA pH-8,0(TE)
Trisma base..........................................................................................................
10mM
Na
2
EDTA .............................................................................................................
1mM
A solução é preparada após adição de dissolução a quente do Na
2
EDTA em
água Mili Q,, posteriormente acrescenta-se o trizma base e o pH ajustado a 8,0 com
ácido clorídrico.
Mistura corante
Ficol...................................................................................................................
15,00%
Xileno cianol......................................................................................................
0,25%
Azul de bromofenol...........................................................................................
0,25%
Solução de brometo de etídio 5mg/mL
O brometo de etídio é preparado em tampão tris-HCl 50mM, pH 8,5; a solução
é armazenada em frasco escuro e diluída com TEB a uma concentração final de
0,4µg/mL.
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