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i
Universidade do Estado de Santa Catarina
Centro de Ciências Agroveterinárias
CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS
POR VITRIFICAÇÃO
___________________________________________________
Rodrigo Marques dos Santos
CAV-UDESC
Lages, SC, Brasil
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ii
CAV-UDESC
Dissertação de Mestrado
CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS POR
VITRIFICACÃO
Rodrigo Marques dos Santos
Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias
Lages, SC, Brasil
2005
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iii
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária
Renata Weingärtner Rosa – CRB 228/14ª Região
(Biblioteca Setorial do CAV/UDESC)
Santos, Rodrigo Marques dos
Criopreservação de ovócitos bovinos por
vitrificação / Rodrigo Marques dos Santos –
Lages, 2005.
29 p.
Dissertação (mestrado) – Centro de Ciências
Agroveterinárias / UDESC.
1. Vácuo 2. Nitrogênio super-resfriado 3.
Vitrifica
ç
ão
iv
CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS POR
VITRIFICAÇÃO
Por
Rodrigo Marques dos Santos
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Ciências
Veterinárias, Área de concentração em Reprodução Animal, do
Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade do
Estado de Santa Catarina (CAV-UDESC), como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Lages, SC, Brasil.
2005
v
UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGROVETERINÁRIAS
CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A comissão Examinadora, abaixo relacionada,
aprova a Dissertação de Mestrado
CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS POR VITRIFICAÇÃO
Elaborada por
Rodrigo Marques dos Santos.
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias
COMISSÃO EXAMINADORA
Dr. Alceu Mezzalira
(Presidente/Orientador) –CAV/UDESC
Dra. Lígia M. Cantarelli Pegoraro
EMBRAPA – Clima Temperado
Dr. Marcel Frajblat
UNIVALI
Lages, janeiro de 2005.
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS .................................................................. viii
LISTA DE TABELAS................................................................... ix
LISTA DE ABREVIAÇÕES......................................................... x
RESUMO ...................................................................................... xi
ABSTRACT .................................................................................. xii
1 – INTRODUÇÃO ......................................................................
1
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................
2
2.1 – Características biológicas e sensibilidade dos ovócitos ao
resfriamento ...................................................................................
2
2.2 – Vitrificação ........................................................................... 4
2.3 – Evolução e estágio atual da vitrificação de ovócitos ............ 5
2.4 - Utilização do vácuo sobre o Nitrogênio (N
2
) líquido ........... 6
2.5 – Metodologias empregadas na vitrificação de ovócitos ........ 7
3 – MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................
9
3.1 – Obtenção dos ovócitos ......................................................... 10
3.2 – Grupos experimentais ........................................................... 10
3.3 – Vitrificação e reaquecimento ............................................... 11
3.4 – Produção de vácuo sobre o N
2
Líquido ............................... 11
3.5 – Produção in vitro dos embriões ........................................... 12
3.5.1 – Maturação in vitro ............................................................ 12
3.5.2 – Fecundação in vitro .......................................................... 13
3.5.3 – Cultivo in vitro .................................................................. 13
3.6 – Delineamento experimental e análise estatística .................. 13
vii
4 – RESULTADOS ....................................................................... 14
4.1 – Produção de vácuo/Temperatura .......................................... 14
4.2 – Taxa de clivagem ................................................................. 14
4.3 – Taxa de blastocistos............................................................. 15
5 – DISCUSSÃO .........................................................................
17
6 – CONCLUSÕES
20
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................
21
8- ANEXOS ..................................................................................
28
viii
AGRADECIMENTOS
Inicialmente agradeço a Deus, por me proporcionar este momento.
Agradeço aos meus pais, Abadi e Nair, que muitas vezes renunciaram seus sonhos em
favor dos meus, ofereço esta nova conquista em reconhecimento aos seus esforços,
muito obrigado!
Agradeço a Quéli, minha noiva, pela compreensão, companheirismo e principalmente
pelo apoio e incentivo em todas as horas.
Agradeço ao Prof. Dr. Julio Viegas, por ter me iniciado na pesquisa, ofereço esta
conquista.
Agradeço a Dra. Lígia M. C. Pegoraro, pelo incentivo e exemplo profissional.
Agradeço ao Prof. Alceu Mezzalira pela oportunidade, apoio e orientação durante a
realização deste trabalho.
Aos amigos, Sandro, Gilvânio, Rodrigo Donatti, Luis Fernando, Lederson, Edson e
Otávio, pelo incentivo e amizade.
À equipe do laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem, Diego,
Joana Claudia, Marcos, Marcio, Jader, Fabiano, Fernanda, Dennys e Kelyn, obrigado
pelo convívio.
Ao Frigorífico Verdi e Fox, especialmente ao senhor Valdecir Ferreira, pela
colaboração na obtenção do material utilizado neste trabalho.
Ao centro de Ciências Veterinárias da Universidade do Estado de Santa Catarina, pela
disponibilização de sua infra-estrutura para realização deste trabalho.
Ao Conselho Brasileiro de Pesquisa (CNPq), pelo financiamento do projeto.
A coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES), pelo suporte
da bolsa de pesquisa.
Um agradecimento especial, a todas as outras pessoas que colaboraram direta ou
indiretamente na realização deste trabalho.
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Taxas de clivagem e de blastocistos de embriões bovinos derivados de
ovócitos maturados (MII) e imaturos (VG), vitrificados em nitrogênio líquido
submetido ao vácuo ou atmosfera normal de pressão.....................................15
Tabela 2 – Taxas de clivagem e de blastocistos de ovócitos bovinos vitrificados
imaturos ou após maturação ............................................................................16
Tabela 3 – Taxas de clivagem e de blastocistos de ovócitos bovinos (VG e MII),
vitrificados em nitrogênio líquido submetido ao vácuo ou atmosfera
normal..............................................................................................................16
x
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANOVA – Análise de Variância.
CCO’s – Complexo Cumulus-Ovócitos.
DMSO – Dimetil Sulfóxido.
EG – Etileno Glicol.
FSH – Hormônio Folículo Estimulante.
GL-tip – Gel Loading Tip.
LF-Líquido Folicular.
LH – Hormônio Luteinizante.
M II – Metáfase II.
OPS – Open Pulled Straw.
PBS – Phosphated Buffered Saline Solution.
SEE – Soro de Égua em Estro.
SOFaaci – Synthetic Oviduct Fluid with amino acids and sodium citrate.
SSV – Solid Surface Vitrification.
TCM 199 - Tissue Culture Medium.
VG – Vesícula Germinativa.
xi
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias
Centro de Ciências Agroveterinárias - CAV
Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC
CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS POR VITRIFICAÇÃO
AUTOR: RODRIGO MARQUES DOS SANTOS
ORIENTADOR: PROF. Dr. ALCEU MEZZALIRA
Lages, SC, 12 de janeiro de 2005.
Este estudo teve como objetivo avaliar a vitrificação de ovócitos bovinos com o
emprego de nitrogênio líquido em atmosfera normal ou submetido ao vácuo. Com um
equipamento artesanal o nitrogênio foi submetido a uma pressão de vácuo de 300
mmHg durante 45 segundos, quando sua temperatura decresceu para -200°C. Os
ovócitos foram vitrificados após 22 horas de maturação (Maturados - MII) em
nitrogênio resfriado (G1), ou nitrogênio normal (G2), ou logo após a seleção (Imaturos
- VG), em nitrogênio resfriado (G3), ou nitrogênio normal (G4). Para a vitrificação os
ovócitos foram inicialmente expostos a uma solução com 10% EG + 10% DMSO,
durante 30 segundos, e logo em seguida, a uma solução de vitrificação com 20% EG +
20% DMSO + 0,3 M Sacarose, durante 20 segundos. Grupos de 3 a 4 ovócitos foram
envasados em cada OPS, que a seguir era mergulhada no nitrogênio. O reaquecimento
foi realizado através da exposição por cinco minutos a cada concentração (0,30 e
0,15M) de sacarose. A fecundação (D0) foi realizada com 2 x 10
6
espermatozóides/mL,
selecionados por ‘‘Swim-up’’ e incubados por 18 a 22 horas. Os prováveis zigotos
foram cultivados em placas de quatro poços em meio SOFaaci, a 39ºC, com 5% CO2 e
umidade saturada. As taxas de clivagem (D2) e de blastocistos (D8) observadas foram
de 53,6% e 10,6% no G1, 43,5% e 6,7% no G2, 41,2% e 8,8% no G3 e 33,9% e 4,2%
no G4. O nitrogênio super-resfriado, por ação do vácuo, proporcionou maiores taxas de
desenvolvimento embrionário após a vitrificação de ovócitos bovinos imaturos ou
maturados.
Palavras chave: Vácuo; Nitrogênio resfriado; Vitrificação; Criopreservação; Ovócitos
bovinos.
xii
ABSTRACT
Master’s Dissertation
Curso de Mestrado em Ciências Veterinárias
Centro de Ciências Agroveterinárias - CAV
Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC
CRYOPRESERVATION OF BOVINE OOCYTES BY VITRIFICATION
AUTHOR: RODRIGO MARQUES DOS SANTOS
ADVISER: PROF. Dr. ALCEU MEZZALIRA
Lages, SC. January, 12, 2005.
The aim of this study was to evaluate the vitrification procedure performed with liquid
nitrogen submitted to vacuum or normal atmosphere. With a home made pump, liquid
nitrogen was submitted to 300 mmHg vacuum pressure for 45 seconds when its
temperature decreased to -200°C. Oocytes were vitrified after 22 hours maturation
(Maturated - MII) in cooled nitrogen (G1) or normal nitrogen (G2), or just after
selection (Immature - GV), with cooled nitrogen (G3), or normal nitrogen (G4).
Vitrification was performed by 30 seconds exposure to a 10% EG + 10% DMSO
solution, and just after to a 20% EG + 20% DMSO + 0.3M Sucrose, vitrification
solution, for 20 seconds. Groups of 3 or 4 oocytes were loaded in each OPS and
directly plunged in liquid nitrogen. The warming was performed by 5 minutes exposure
steps to decreasing concentrations (0.3 and 0.15M) sucrose solution. Fertilization (Day
0) was performed with 2 x 10
6
spermatozoa/mL selected by Swim-up procedure and
incubated for 18-22 hours. Presumptive zygotes were cultured in 4 well dishes with
SOFaaci medium, at 39ºC, with 5% CO
2
and saturated humidity. The cleavage (Day 2)
and blastocyst (Day 8) rates observed were 53.6% and 10.6% in G1, 43.5% and 6.7% in
G2, 41.2% and 8.8% in G3 and 33.9% and 4.2% in G4. The vacuum cooled nitrogen
provides higher developmental rates following vitrification of immature and maturated
bovine oocytes.
Key words: Vacuum, Cooled nitrogen, Vitrification, Cryopreservation, Bovine oocytes.
1
1- INTRODUÇÃO:
A modernização da pecuária vem requerendo o aprimoramento e o
desenvolvimento de novas tecnologias em diversas áreas do conhecimento. A
reprodução é uma das áreas que tem determinado o crescimento da atividade, tornando-
a mais competitiva e assim mais lucrativa. Dentre as biotecnologias relacionadas à
reprodução, tem destaque a criopreservação, principalmente de ovócitos. Esta técnica é
capaz de alavancar o desenvolvimento da pecuária, já que permitindo a preservação,
maximiza o material genético de uma fêmea, como já acontece com a criopreservação
do sêmen no macho. A otimização da técnica possibilitará a formação de bancos de
germoplasma, mantendo a variabilidade genética entre as raças e também preservando
raças que poderão ter importância no futuro. A possibilidade de preservar espécies
selvagens em extinção, mantendo a diversidade genética animal, também é um fato a
ser considerado. Além da preservação da biodiversidade animal, a criopreservação tem
enorme importância na reprodução humana, como ferramenta auxiliar para o tratamento
de diversos transtornos de fertilidade. Finalmente, a criopreservação representa ainda
um apoio essencial na produção de embriões, na engenharia genética e nos
procedimentos de transferência nuclear e clonagem de embriões.
Dentre as metodologias para criopreservação de ovócitos, a vitrificação tem sido
apontada como uma importante alternativa, sendo sua viabilidade demonstrada em
várias espécies, especialmente em bovinos. Nos últimos anos a pesquisa tem indicado
que o aumento da velocidade de resfriamento e reaquecimento proporciona maior
sobrevivência aos ovócitos criopreservados e isto é obtido através das metodologias de
vitrificação. Os resultados obtidos com a criopreservação de ovócitos bovinos,
especialmente os imaturos, são ainda muito baixos e pouco atrativos economicamente.
Assim, o grande desafio é buscar um protocolo para melhorar e estabilizar os resultados,
estabelecendo um método que possa ser aplicado para criopreservação de ovócitos de
todas as espécies.
Este estudo teve como objetivo avaliar a utilização de um equipamento artesanal para
produzir uma condição de vácuo, bem como avaliar o efeito do nitrogênio líquido
2
submetido ao vácuo, na vitrificação de ovócitos bovinos imaturos e maturados,
através da metodologia OPS.
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA:
2.1 – Características biológicas e sensibilidade dos ovócitos ao resfriamento:
O congelamento de embriões é uma prática bem sucedida, porém na
criopreservação de ovócitos os resultados ainda são pobres. Isto é ocasionado
principalmente pelas baixas taxas de sobrevivência, fecundação e desenvolvimento
embrionário. As maiores diferenças entre embriões e ovócitos são as características da
membrana plasmática, presença de grânulos corticais e a metáfase II da meiose com seu
sistema de fusos (Chen et al., 2003).
Comparando com embriões, o volume dos ovócitos é bem maior e por essa
razão a relação superfície/volume celular é menor, dificultando assim, a sua
desidratação (Fabbri et al., 2000). Além disso, os ovócitos apresentam um alto teor
lipídico e um baixo coeficiente de permeabilidade. A elevada concentração e a variada
distribuição dos lipídios intracelulares podem induzir a nucleação de gelo intracelular o
que é associado à alta sensibilidade ao congelamento (Parks; Ruffing, 1992).
Após a fecundação ocorre um aumento de cálcio (Ca) livre no citoplasma, modificando
a força iônica e o potencial de membrana (Gook et al., 1993). Estas alterações levam a
uma mudança de conformação, facilitando a permeação de crioprotetores e água nos
embriões, promovendo desidratação, reduzindo a formação intracelular de gelo e
determinando maior taxa de sobrevivência. O incremento de resistência da membrana
plasmática também intensifica a tolerância à pressão osmótica durante o reaquecimento.
Estes fatores explicam a razão dos embriões serem mais tolerantes ao resfriamento e
reaquecimento do que os ovócitos (Chen et al., 2003).
Outro fator que está envolvido com as particularidades da criopreservação de
ovócitos são os danos causados no sistema de fusos meióticos durante a
criopreservação. Ovócitos maturados (metáfase II) apresentam um sistema de fusos
formados por microtúbulos que são constituídos pela polimerização por dímeros de
3
Tubulina α e β (Zhou et al., 2002). Os microtúbulos são organizados do centro para os
pólos e os cromossomos ancorados aos pares, em forma de barril (Maro et al., 1986).
Os fusos meióticos são cruciais para eventos como fecundação, término da meiose,
formação de segundo corpúsculo polar, migração do pro-núcleo e formação do primeiro
fuso mitótico. A desorganização do fuso meiótico resulta em dispersão cromossomal,
impossibilita a fertilização e interrompe o desenvolvimento embrionário (Eroglu et al.,
1998).
A exposição de ovócitos maturados (metáfase II) às altas concentrações de
crioprotetores pode induzir as injúrias nos fusos meióticos durante os procedimentos de
congelamento e reaquecimento em baixas temperaturas, levando a uma redução da
viabilidade destas estruturas (Chen et al., 2000). Uma alternativa proposta para evitar
estes danos é a criopreservação de ovócitos imaturos em fase de vesícula germinativa,
porém estes apresentam menor condutividade hidráulica (Agca et al., 1997). Também é
freqüente o rompimento das junções intercomunicantes do ovócito com as células do
cumulus oophurus, que são fundamentais na cooperação metabólica durante o
desenvolvimento e maturação ovocitária, parecendo ser este o principal sítio das lesões
durante o congelamento (Hochi et al., 1997).
Estudos recentes realizados por Men et al. (2003) indicaram a possibilidade de
que em parte os baixos resultados verificados na criopreservação de ovócitos poderiam
ser devidos a apoptose. O processo de apoptose é um mecanismo de degeneração
necessário para o desenvolvimento normal e homeostase dos tecidos. Segundo Wyllie
(1980), este processo pode ser ativado em resposta a uma variedade de causas não
fisiológicas, como temperatura, toxicidade, oxidação e radiação. Características
morfológicas podem ser observadas nas células em apoptose, como a marginalização da
cromatina e a formação de corpos de apoptose (Wyllie, 1997).
Diante das características particulares dos ovócitos, é importante que uma
metodologia adequada às suas características seja empregada durante a criopreservação.
A vitrificação pode ser considerada como a alternativa mais adequada e viável por
proporcionar grande velocidade de resfriamento e reaquecimento, com reduzido tempo
de exposição, além do pequeno volume de crioprotetor.
4
2.2 - Vitrificação:
Vitrificação é a solidificação de uma solução em baixas temperaturas, sem a
formação de cristais de gelo (Vajta, 2000). O fenômeno é obtido com o aumento
extremo da viscosidade, que requer grande velocidade de resfriamento e o uso de
soluções crioprotetoras que impeçam a formação de cristais de gelo e aumentem a
viscosidade em baixas temperaturas. Algum grau de vitrificação acontece em qualquer
processo de criopreservação, com o aumento da concentração das soluções ao redor dos
ovócitos ou embriões, determinadas pela retirada gradual da água na forma de gelo
(Rall et al., 1984). Em criobiologia, o termo vitrificação se refere ao processo onde a
solução inteira que contém a amostra biológica vitrifica completamente. O sucesso da
vitrificação está relacionado com a capacidade de permeação, a concentração, o tempo
de exposição e o volume do crioprotetor, que devem ser adequados para impedir a
formação de cristais de gelo intracelular sem, entretanto, provocar lesões de efeito
osmótico ou tóxico (Rall; Fahy, 1985).
A estratégia da vitrificação é diferente do congelamento lento ou tradicional,
uma vez que no congelamento lento a taxa de resfriamento possibilita manter um
equilíbrio entre os vários fatores que podem resultar em injúrias, como a formação de
cristais de gelo, fratura da zona, alterações de organelas intracelulares e do
citoesqueleto (Massip, 1989; Dobrinsky, 1996; Kasai, 1997; Martino, 1996a; Saha,
1996). Na vitrificação, se elimina totalmente a formação de cristais de gelo intracelular,
porém como conseqüência negativa do processo, existe uma grande probabilidade de
ocorrer quase todos os danos, com exceção dos causados pela cristalização de gelo.
Para contornar esses problemas, principalmente tóxicos e osmóticos, utilizam-se
associações de diferentes crioprotetores. O emprego de substâncias químicas menos
tóxicas, a combinação de duas ou três substâncias, incluindo pelo menos uma
permeável, é um ponto chave para diminuir os danos na vitrificação (Fahy, 1984; Rall,
1989; Massip, 1995; Kasai, 1990; Smorag, 1994; Palasz, 1996).
Por outro lado, a vitrificação resultou em algumas conseqüências positivas, além
da eliminação total da formação de cristais de gelo. O aumento da velocidade de
resfriamento reduziu os danos produzidos pelas gotas lipídicas intracelulares,
principalmente as contidas nas membranas e no citoesqueleto, por atravessar mais
rapidamente as faixas críticas (+15°C a –5°C) de temperatura (Dobrinski, 1996;
Martino, 1996b; Isachenko, 1998; Zeron, 1999).
5
A maioria dos atuais métodos de vitrificação está baseada no contato direto da
solução crioprotetora com o nitrogênio líquido, sendo que o modo mais simples para
estabelecer este contato é a imersão direta de embriões ou ovócitos no nitrogênio
líquido. Isto foi sugerido por Landa; Tepla (1990) para embriões de camundongos, e a
partir daí utilizado para embriões e ovócitos bovinos (Riha, 1991; Yang, 1999; Papis,
1999). Baseado nos resultados da vitrificação de embriões de Drosophila (Steponkus,
1990; Mazur, 1992), ovócitos bovinos foram vitrificados com o auxílio de grades de
microscopia eletrônica, onde foram depositados, seguindo-se a imersão em nitrogênio
líquido (Martino, 1996b; Arav, 1997). A taxa de resfriamento calculada foi de 14.000 a
24.000°C/minuto, semelhante às obtidas por Vajta et al. (1997) utilizando palhetas de
0,25 mL estiradas e abertas (OPS), aproximadamente 20.000°C/minuto. Velocidades
semelhantes também foram obtidas utilizando outras metodologias de vitrificação,
Mezzalira et al. (1999) utilizando micropipetas de vidro, Lane et al. (1999) utilizando
cryoloop e Matsumoto et al. (2001) utilizando nylon mesh.
Velocidades ainda maiores podem ser atingidas com a eliminação do efeito
isolante, determinado pela exposição ao vapor do nitrogênio líquido em ebulição o que
é obtido pelo contato com uma superfície metálica resfriada “solid-surface vitrification”
(Dinnyés et al., 1999).
2.3 – Evolução e estágio atual da vitrificação:
O fenômeno da vitrificação foi primeiramente investigado por Luyet em 1937,
onde foi observado o potencial de certos crioprotetores em solidificarem sem a
formação de cristais de gelo. Durante os primeiros estudos não estava claro como o
procedimento de vitrificação poderia ser estabelecido. A vitrificação requer taxas muito
altas de resfriamento e ao mesmo tempo proteção de substâncias potencialmente
tóxicas, o que inicialmente levou a uma substituição deste por outros métodos de
criopreservação. Rall; Fahy (1985) demonstraram pela primeira vez que embriões
murinos poderiam ser criopreservados pela vitrificação, sendo que a partir dos
resultados alcançados com a vitrificação de embriões de Drosophila (Steponkus, 1990;
Mazur, 1992), a vitrificação passou a ser uma alternativa viável para criopreservação,
de ovócitos. Subseqüentemente, foi reconhecido que as soluções para vitrificação
6
poderiam ser mais adequadas para a preservação de células e tecidos vivos do que as
soluções que cristalizam, diminuindo os danos durante o resfriamento e reaquecimento
(Kuleshova et al., 2002).
A partir da vitrificação de ovócitos bovinos em grades de microscopia
eletrônica, imersas diretamente em nitrogênio líquido (Martino et al., 1996b; Arav;
Zeron, 1997), seguido do desenvolvimento da tecnologia utilizando palhetas de 0,25
mL estiradas e abertas (OPS) (Vajta et. al., 1997), obteve-se um grande aumento na
taxa de resfriamento, com resultados significativos, indicando a vitrificação como
método potencial de criopreservação, principalmente de ovócitos. O aumento na
velocidade de resfriamento determinou a redução no tempo de exposição aos
crioprotetores, com redução dos danos. Assim foi possível o uso de menores
concentrações de crioprotetores com a conseqüente redução da toxidade. Estes
resultados geraram uma grande procura por novos métodos, que aumentaram as taxas
de resfriamento com sucesso notável (Hamawaki, 1999; Papis, 1999), sendo alcançado,
por conseguinte, um avanço considerável na criopreservação de ovócitos e embriões.
Os novos protocolos de vitrificação resultaram em um avanço considerável em
certas áreas da embriologia, sendo que os mais significativos foram na criopreservação
de ovócitos bovinos. Recentemente resultados promissores foram obtidos com a
vitrificação de ovócitos imaturos com a metodologia OPS (Vieira et al., 2002). Esses
resultados associados ao nascimento de produtos saudáveis e normais, após vitrificação
de ovócitos imaturos, abrem uma nova perspectiva para a criopreservação destas
estruturas.
Outra área que a vitrificação passou a ter importância é a da clonagem de
embriões. A vitrificação de embriões bovinos em fase de pré-compactação não
diminuiu a capacidade de desenvolvimento e os blastômeros foram prosperamente
utilizados como doadores para transferência nuclear (Booth, 1998; Peura, 1999).
2.4 – Utilização do vácuo sobre o nitrogênio líquido:
Uma das formas de se obter maiores velocidades de resfriamento é a aplicação
de vácuo sobre o nitrogênio líquido. A redução da pressão sobre o nitrogênio líquido
com volume constante, induz o super-resfriamento, baixando a temperatura de -196°C
7
para até -210°C (Arav et al., 2000; Nowshari; Brem, 2001), quando se forma uma
espécie de floculação, denominada “slush.” Esta condição persiste por alguns minutos
após o final da aplicação do vácuo, possibilitando a vitrificação de amostras. Ocorre
ainda a supressão da ebulição ou a redução da liberação de vapor, quando da imersão
da palheta neste nitrogênio líquido.
A vitrificação de ovócitos no nitrogênio líquido submetido ao vácuo
proporciona um grande incremento na velocidade de resfriamento, principalmente na
faixa de temperatura (entre +20 e -40°C), o que pode reduzir estes danos, e assim
proporcionar maior viabilidade destas estruturas após o reaquecimento. Nowshari;
Brem (2001) utilizando um equipamento de vácuo (Vit-Master
®
; Mini Tübe,
Landeshut, Germany) obtiveram um incremento na taxa de resfriamento de 5.300 para
10.300°C/minuto, utilizando a metodologia OPS.
2.5 – Metodologias empregadas na vitrificação de ovócitos:
A técnica de vitrificação teve uma grande evolução, principalmente, devido ao
desenvolvimento de novas metodologias, sendo que todas elas buscaram uma maior
velocidade de resfriamento e reaquecimento.
Martino et al. (1996b) e Arav et al. (1997) utilizaram a vitrificação com o
emprego de grades de microscopia eletrônica, onde é colocada a solução de vitrificação
contendo as estruturas. Devido ao contato direto da grade com o nitrogênio líquido e o
pequeno volume de solução (1 a 2µl), este método proporciona uma rápida taxa de
resfriamento e reaquecimento, apresentando ainda a vantagem de possibilitar a
criopreservação de um grande número de estruturas simultaneamente.
A técnica de vitrificação usando “Nylon Mesh” descrita por Matsumoto et al.
(2001) consiste no uso de uma tela de nylon com 60µm de espessura, confeccionadas
em forma triangular, para facilitar o manuseio é amarrado um fio de algodão no nylon
mesh. O nylon mesh contendo as estruturas a serem criopreservadas é mergulhado
diretamente no nitrogênio líquido.
Mezzalira et al. (1999) utilizaram micropipetas de vidro confeccionadas através
do aquecimento e estiramento de tubos de vidro (micro-hematócrito) até obter um
diâmetro interno próximo a 0,35mm. Estas micropipetas são utilizadas abertas e o
envase das estruturas é feito por capilaridade. Uma vantagem da sua utilização é o seu
8
menor diâmetro em relação às OPS (0,87mm), o que deve proporcionar maior
velocidade de resfriamento, além de facilitar o manuseio, realizado com elas próprias.
O método de vitrificação descrito por Dinnyés et al. (1999), “Solid-Surface
Vitrification” (SSV), consiste em colocar os ovócitos em uma solução de equilíbrio,
seguindo-se a passagem por três pequenas gotas de solução de vitrificação, quando são
colocados diretamente sobre uma superfície metálica pré-resfriada (-150 a -180°C),
parcialmente submersa em nitrogênio. O processo é realizado em menos de 30
segundos.
O método de vitrificação Cryoloop desenvolvido por Lane et al. (1999), é
realizado através de uma espécie de laçada com 20µm de largura aproximadamente,
utilizando um fio com 0,5 a 0,7mm de diâmetro. O cryoloop é imerso na solução de
vitrificação para formar um “filme”, onde as estruturas a serem criopreservadas são
depositadas, quando o cryoloop é mergulhado no nitrogênio líquido.
O método GL-tip (Gel-Loading Tip) foi descrito por Tominag et al. (2001),
onde as estruturas são primeiramente colocadas em uma solução de equilíbrio por 2
minutos e em seguida transferidas para solução de vitrificação e envasadas por
capilaridade para o gel contido na extremidade de uma palheta. É utilizado em torno de
0,7µl de solução de vitrificação e as estruturas ficam expostas a esta solução por 30
segundos, quando o GL-tip é mergulhado no nitrogênio.
O método “cryotop” descrito por Kuwayama et al. (2000), consiste em uma
palheta de 0,25mL com a extremidade em forma de bisel, onde a solução de vitrificação
contendo a estrutura a ser criopreservada é depositada em uma pequena gota na parede
desta palheta, que a seguir é mergulhada diretamente no nitrogênio líquido. A taxa de
resfriamento obtida com este método é de aproximadamente 23.000°C/min.
A velocidade de resfriamento quando uma palheta é mergulhada em nitrogênio
líquido depende de vários fatores, tais como: o volume de substâncias crioprotetoras ao
redor dos embriões, o diâmetro interno da palheta, a densidade da parede da palheta e a
forma do contato direto entre o nitrogênio líquido e a solução contendo a estrutura. A
metodologia OPS descrita por Vajta et al. (1997), utiliza uma palheta de inseminação
artificial de 0,25 mL aquecida e estirada até ficar com metade do seu diâmetro original,
reduz consideravelmente estes fatores. Os ovócitos e embriões são envasados nas OPS
pelo efeito capilar e a taxa de resfriamento quando se mergulha a OPS diretamente no
nitrogênio líquido é aproximadamente de 20.000°C/min (Vajta, 1998a). O tempo
9
requerido para equilíbrio-resfriamento é de 7 minutos e reaquecimento-rehidratação é
de 15 minutos.
Uma vantagem do uso das OPS é a velocidade com que as estruturas podem ser
envasadas e recuperadas, reduzindo o tempo de exposição dos embriões a
concentrações muito altas de crioprotetores (Beebe et al., 2002). Outra vantagem é o
uso de volumes muito pequenos, que ajudam a reduzir os danos na zona pelúcida que
ocorrem durante o resfriamento e reaquecimento.
A maioria das técnicas está baseada no contato direto do nitrogênio líquido e a
solução crioprotetora contendo os ovócitos ou embriões, que pode ser uma fonte de
contaminação (Tedder, 1995; Fountain, 1997). Estes perigos podem ser evitados
utilizando-se nitrogênio líquido filtrado ou envasando as estruturas em um recipiente
hermético estéril antes do armazenamento (Vajta, 1998b; Lane, 1999). Com a
metodologia OPS é possível a aplicação estéril da vitrificação, utilizando-se nitrogênio
filtrado e posteriormente depositando a OPS dentro de uma palheta de 0,5 mL pré-
resfriada em nitrogênio líquido. Esta palheta é lacrada evitando assim a contaminação
durante o seu armazenamento.
Embora com grande diversidade metodológica e constituindo-se numa
alternativa promissora, a vitrificação de ovócitos ainda não proporciona resultados
economicamente atraentes, sendo necessárias investigações que possibilitem a
adequação do método e a obtenção de maiores taxas de sobrevivência e viabilidade
embrionária.
3 - MATERIAIS E MÉTODOS:
O experimento foi conduzido no laboratório de reprodução animal Prof. Assis
Roberto de Bem, localizado no Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade
do Estado de Santa Catarina, em Lages SC.
Exceto onde indicado, todos os reagentes foram obtidos da Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MO, USA). Nas manipulações de ovócitos e embriões foram utilizadas
placas de quatro poços obtidas da Nunc. S/A (Roskilde, Denmark).
10
3.1 - Obtenção dos ovócitos:
Os ovários bovinos eram provenientes do frigorífico Fox, localizado nas
proximidades do perímetro urbano de Lages SC e do frigorífico Verdi, localizado no
município de Pouso Redondo SC, distante 100 km do laboratório. Os ovários foram
transportados até o laboratório à temperatura de 29-35°C em PBS (Phosphated buffered
saline solution), adicionado de penicilina (65 mg/L) e estreptomicina (50 mg/L). O
tempo de transporte do frigorífico até o laboratório foi em média de 4 horas, sendo
estes, transportados em recipiente isotérmico.
Os complexos cumulus-ovócitos (CCOs) foram aspirados através de uma bomba
de vácuo, de folículos de 2 a 8 mm, os quais foram puncionados utilizando-se uma
agulha 19G (Venescalp®, Feira de Santana, BA), acoplada a um tubo de ensaio com
capacidade de 15 mL (Corning, NY, USA). Após a punção, o líquido folicular aspirado
permaneceu por 5-10 minutos no tubo de ensaio para ocorrer a decantação, sendo em
seguida removido o sedimento através de uma pipeta de Pasteur, e após depositado em
placas de Petri (100x15mm, Corning, NY, USA) para ser realizada a busca dos CCOs.
A busca, seleção e manutenção dos CCOs foram realizadas em líquido folicular
(LF), segundo Lehmkull et al. (2001). Foram utilizados apenas CCOs com citoplasma
homogêneo e totalmente envoltos por camadas de células compactas do cumulus.
3.2 – Grupos experimentais:
Os CCOs foram aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais e um
grupo controle. Cada grupo foi constituído por 15 a 18 ovócitos em cada repetição,
sendo realizadas dez repetições.
O primeiro grupo (G1) foi constituído por 174 ovócitos maturados, vitrificados
em nitrogênio (N
2
) líquido submetido ao vácuo, o segundo grupo (G2) foi constituído
por 170 ovócitos maturados, vitrificados em nitrogênio líquido em atmosfera normal de
pressão, o terceiro grupo (G3) foi constituído por 172 ovócitos imaturos, vitrificados
em nitrogênio líquido submetido ao vácuo, e o quarto grupo (G4) foi constituído por
175 ovócitos imaturos, vitrificados em nitrogênio líquido em atmosfera normal de
11
pressão. A cada rotina, um grupo de ovócitos foi submetido ao cultivo para controle
(n=282), sem vitrificar.
3.3 - Vitrificação e reaquecimento:
Os procedimentos de vitrificação e reaquecimento foram realizados sobre mesas
aquecidas a 37°C em sala climatizada a 25°C. O protocolo de vitrificação foi adaptado
de Vajta et al. (1998a), com soluções modificadas pelo uso de soro de égua em estro
(SEE). Três a quatro ovócitos foram envasados em cada OPS, sendo primeiramente
expostos por 30 segundos a uma solução de equilíbrio, composta por 10% de Etileno
Glicol (EG) + 10% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) em meio de manutenção (TCM 199
sais Earle tamponado com Hepes) com 20% de SEE e, em seguida transferidos para a
solução de vitrificação, composta por 20% de EG + 20% de DMSO + 0,5 M de
sacarose em meio de manutenção com 20% de SEE. Dentro de um período de 20
segundos os CCOs foram envasados e mergulhados num ângulo de 45 graus,
diretamente no nitrogênio líquido em atmosfera normal de pressão ou submetido ao
vácuo, conforme o tratamento.
Para o reaquecimento, cada OPS foi exposta ao ar (sala climatizada a 25°C) por
quatro segundos, sendo em seguida mergulhada em uma solução de 0,30 M de
Sacarose, em meio de manutenção, acrescido de 10% de SEE. Os CCOs permaneceram
nesta solução por 5 minutos, quando foram transferidos para uma solução de 0,15 M de
Sacarose, em meio de manutenção, por mais 5 minutos, antes de serem transferidos
para o meio de manutenção com 10% de SEE.
3.4 - Produção do vácuo sobre o nitrogênio (N
2
) líquido:
A produção de vácuo sobre o nitrogênio líquido foi realizada através de uma
bomba de vácuo adaptada através de mangueiras de silicone a um recipiente de acrílico
hermeticamente fechado, sendo que no interior deste foi colocado outro recipiente de
isopor com aproximadamente 300mL de nitrogênio líquido.
A bomba de vácuo permaneceu em funcionamento durante aproximadamente 45
segundos para cada OPS, sendo desligada no momento de mergulhar a OPS no
12
nitrogênio líquido submetido ao vácuo. Em seguida a OPS foi transferida para outro
recipiente contendo nitrogênio líquido em atmosfera normal, onde permanecia até o
reaquecimento.
O nitrogênio líquido foi submetido a uma pressão de vácuo de 300 mmHg
durante 45 segundos aferido através de um vacuômetro (FANEM LTDA, São Paulo,
Brasil), quando sua temperatura atingiu -200°C aferida através de termômetro digital
Ioptherm 48 (IOPE – Inst. de Precisão Ltda, São Paulo, Brasil).
3.5 – Produção in vitro dos embriões:
3.5.1 – Maturação in vitro:
A maturação foi realizada em meio TCM 199-Sais de Earle (Gibco BRL,
Paisley, NK) adicionado de 26,2mM de NaHCO3, 25mM de Hepes, 0,2mM de Piruvato
de Sódio com 0,01UI de FSH/mL (Folltropin - Bioniche, Canada), 0,5µg/mL de LH
(Lutropin – Bioniche, Canada) e 10% de SEE.
Os grupos 1 e 2, compostos por ovócitos maturados, foram submetidos a
maturação por 22 horas em estufa (Haeraeus Instruments GmbH, Germany) a 39°C
com atmosfera de 5% de CO2 e umidade saturada. Em seguida foi realizada a retirada
parcial das células do cumulus, com a utilização da enzima Hialuronidase (0,5UI/µl)
durante dois minutos. Logo após o desnudamento parcial dos ovócitos dos grupos 1 e 2,
estes foram vitrificados, reaquecidos e submetidos a mais 2 horas de maturação,
totalizando 24 horas de maturação.
Os grupos 3 e 4, compostos de ovócitos imaturos, foram vitrificados,
reaquecidos, e em seguida, submetidos a maturação por 24 horas, em estufa a 39°C com
atmosfera de 5% de CO2 e umidade saturada.
O grupo controle foi submetido a 24 horas de maturação sob as mesmas
condições dos grupos experimentais.
13
3.5.2 – Fecundação in vitro:
Após as 24 horas de maturação foi realizada a fecundação dos grupos
experimentais e do grupo controle, com sêmen congelado de um touro da raça Red
Angus, sendo os espermatozóides selecionados pelo método de migração ascendente
“Swim-up”, em meio TALP-SPERM. Os CCOs foram incubados com 2,0 X 10
6
espermatozóides/mL por um período de 18 horas em estufa a 39°C em 5% de CO
2
e
umidade saturada, em meio TALP-FERT adicionado de 30µg/mL de Heparina,
30µg/mL de Penicilinamina, 15µM de Hipotaurina e 1µM de Epinefrina.
3.5.3 – Cultivo in vitro:
Dezoito horas após a fecundação procedeu-se a remoção das células do cumulus
através de agitação mecânica e a transferência dos prováveis zigotos para uma placa de
quatro poços contendo 400µl de meio SOFaaci, suplementado com 5% de SEE,
mantido sob óleo mineral. Após 24 horas de cultivo em estufa a 39°C em 5% de CO
2
e
umidade saturada, realizou-se a avaliação da clivagem, sendo mantida na placa somente
as estruturas clivadas. Em seguida a placa contendo as estruturas clivadas foi incubada
em estufa a 39°C com 5% de CO
2
, 5% de O
2,
90% de nitrogênio
durante o período de
cultivo remanescente (162 horas).
A viabilidade embrionária in vitro foi determinada através da avaliação das
taxas de clivagem e de blastocistos, obtidas as 48 e 192 horas após a fecundação,
respectivamente.
3.6 – Delineamento experimental e análise estatística:
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado e a análise
das taxas de clivagem e de blastocistos foi realizada através da análise de variância
(ANOVA) e teste de comparação de médias pelo método Bonferroni, com nível de
14
significância de 5%. Todas as avaliações foram efetuadas sobre o número inicial de
ovócitos utilizados.
4 – RESULTADOS:
4.1 – Produção de vácuo / Temperatura:
Com 45 segundos de funcionamento da bomba, a pressão de vácuo no
nitrogênio líquido foi de 300 mmHg, obtendo-se uma temperatura de -200°C no
momento da imersão da OPS. Foi observada uma diminuição da vaporização do
nitrogênio líquido submetido ao vácuo, não sendo, porém, observado a sua floculação
(slushing).
4.2 – Taxa de clivagem:
A taxa média de clivagem do grupo controle foi de 78,7%. Como demonstrado
na tabela 01, dentre os grupos criopreservados o melhor percentual de clivagem foi
obtido com ovócitos maturados e vitrificados com vácuo (G1 - 53,6%), que foi superior
(P<0,05) aos demais grupos. Não foram observadas diferenças nos grupos que
utilizaram ovócitos imaturos vitrificados com vácuo (G3 - 41,2%) ou atmosfera normal
(G4 -33,9%). O emprego do vácuo na vitrificação de ovócitos imaturos (G3)
possibilitou a obtenção de taxas de clivagem semelhantes às obtidas com ovócitos
maturados e vitrificados em atmosfera normal (G4).
Quando não se considerou o efeito do vácuo, (Tabela 2), as taxas de clivagem
para ovócitos VG (37,5%) e MII (48,5%) foram semelhantes (P>0,05), demonstrando
que não houve efeito do estágio de maturação.
15
4.3 – Taxa de Blastocistos:
A taxa média de blastocistos obtida no grupo controle foi de 30,8%. Com
ovócitos vitrificados após a maturação, maior taxa de blastocistos (P<0,05) foi obtida
com a utilização do nitrogênio líquido sob vácuo (10,6%) em relação ao nitrogênio
líquido em atmosfera normal de pressão (6,7%), como pode ser observado na tabela 01.
TABELA 1. Taxas de clivagem e blastocistos de embriões bovinos derivados de
ovócitos maturados (MII) e imaturos (VG), vitrificados em nitrogênio
líquido submetido ao vácuo ou em atmosfera normal de pressão.
Tratamentos
Repetições
Ovócitos
n
Clivagem
(%)
Blastocistos
(%)
G1 MII / Vácuo 10 174 53,6
a
10,6
a
G2 MII / Pressão Normal 10 170 43,5
b
6,7
bc
G3 VG / Vácuo 10 172 41,2
bc
8,8
ab
G4 VG / Pressão Normal 10 175 33,9
c
4,2
c
a,b,c
Diferentes letras na mesma coluna indicam diferença estatística (P<0,05).
Como demonstra a tabela 01, também com ovócitos imaturos a utilização do
vácuo proporcionou um aumento significativo na taxa de blastocistos de 4,2% para
8,8%, índice este que é semelhante ao obtido após vitrificação de ovócitos maturados
(10,6%). Quando se empregou nitrogênio líquido em atmosfera normal, também não se
observou diferença (P<0,05) na taxa de blastocistos, após a vitrificação de ovócitos
imaturos ou maturados, entretanto estes resultados foram inferiores àqueles obtidos
com o emprego de vácuo (Tabela 01).
Como demonstrado na tabela 02, quando apenas o estágio de maturação foi
considerado, não foi observada diferença estatística (P<0,05) entre as taxas de
blastocistos obtidas de ovócitos vitrificados imaturos (6,8%) ou após a maturação
(8,9%).
16
TABELA 2: Taxas de clivagem e de blastocistos obtidas de ovócitos bovinos
vitrificados imaturos ou após a maturação.
Tratamentos Ovócitos
n
Clivagem
(%)
Blastocistos
(%)
Imaturos VG 347 37,5
a
6,8
a
Maturados MII 344 48,5
a
8,9
a
a
Letras iguais na mesma coluna indicam ausência de diferença estatística (P>0,05).
Na tabela 3, demonstra-se que quando o estágio de maturação não foi
considerado, as taxas de clivagem não diferiram com o emprego do vácuo na
vitrificação de ovócitos bovinos. Entretanto, a taxa de blastocistos foi
significativamente superior (P<0,05) com sua utilização de nitrogênio submetido ao
vácuo (9.7%) em relação à atmosfera normal.
TABELA 3: Taxas de clivagem e de blastocistos obtidas de ovócitos bovinos (VG e
MII), vitrificados em nitrogênio líquido submetido ao vácuo ou
atmosfera normal.
Tratamentos Ovócitos
n
Clivagem
(%)
Blastocistos
(%)
Nitrogênio – Vácuo 346 47,5
a
9,7
a
Nitrogênio – Atmosfera Normal 345 38,7
a
5,4
b
a,b
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (P<0,05).
17
5 – DISCUSS AO:
O super-resfriamento do nitrogênio líquido permite um significativo aumento na
velocidade de resfriamento (até 4 vezes). Neste estudo, o equipamento artesanal
utilizado com este propósito, empregou uma pressão de vácuo de 300 mmHg durante
45 segundos, o que proporcionou um decréscimo da temperatura para -200°C. Esta
queda de temperatura é inferior à obtida por Arav (2000), na criopreservação de
ovócitos bovinos (-210°C) e por Nowshari; Brem (2001), na vitrificação de embriões
de camundongo (-212°C) em estágio de pro-núcleo. Embora não atingindo
temperaturas tão baixas quanto às obtidas pelos demais autores, que utilizaram um
equipamento comercial (Vitmaster®), e mesmo sem observar a floculação (slush) no
nitrogênio líquido, descrita nestes trabalhos, foi observada uma nítida redução da
ebulição, quando da imersão da OPS contendo os ovócitos. Mesmo não sendo possível
aferir a velocidade de resfriamento obtida nestas condições, a redução da ebulição
possibilita uma maior transferência de calor entre a OPS e o nitrogênio líquido,
aumentando a velocidade de resfriamento e assim reduzindo os riscos de injúrias.
A vitrificação é uma das principais alternativas para a criopreservação de
ovócitos. Em função dos melhores resultados obtidos com ovócitos maturados, a
criopreservação de ovócitos imaturos tem sido considerada menos viável e assim menos
investigada (Yang et al., 1998; Le Gal; Massip, 1999). Entretanto, avanços importantes
foram alcançados na última década, com a obtenção de gestações (Otoi et al., 1995;
Yang et al., 1998) e bezerros nascidos, (Kubota et al., 1998; Vieira et al., 2002)
provenientes de ovócitos imaturos criopreservados. Neste estudo, o super-resfriamento
do nitrogênio líquido possibilitou a obtenção de idêntica viabilidade na vitrificação de
ovócitos imaturos ou maturados, demonstrando que é viável se criopreservar ovócitos
imaturos e que a técnica poderá ser largamente empregada num futuro próximo,
flexibilizando os trabalhos de punção folicular, que poderão ser realizados em locais
distantes de laboratórios, com a criopreservação dos ovócitos logo após a coleta. Neste
experimento utilizou-se a associação dos crioprotetores etileno glicol e DMSO, bem
como o contato direto da solução contendo os ovócitos e o nitrogênio líquido. Em
experimentos anteriores, esta tecnologia proporcionou resultados significativos tanto
com ovócitos maturados (Mezzalira et al., 2002;) como imaturos (Vieira et al., 2002).
18
O aumento na velocidade de resfriamento/reaquecimento tem sido apontado
como uma forma de melhorar a eficiência do processo. Resultados expressivos foram
obtidos por Martino et al. (1996a) e Arav (1997) através da vitrificação de ovócitos
bovinos em grades metálicas de microscopia, submergidas diretamente em nitrogênio
líquido, o que possibilitou taxas de resfriamento de 14.000 a 24.000°C/minuto.
Velocidades semelhantes também podem ser obtidas com outras metodologias como as
micropipetas de vidro (Mezzalira et al, 1999), o método cryoloop (Lane et al., 1999), o
método SSV (Dinnyés et al., 1999) e o nylon mesh (Matsumoto et al., 2001).
Entretanto, a metodologia OPS (Vajta et al., 1997), utilizada neste experimento,
proporciona taxa de resfriamento de aproximadamente 20.000°C/minuto, é de fácil
execução, sendo atualmente uma das metodologias mais utilizadas na vitrificação de
ovócitos.
Os índices de clivagem obtidos com ovócitos imaturos (41,2% e 33,9%) neste
estudo demonstraram que houve um avanço na criopreservação dessas estruturas,
ficando próximos aos 50% obtidos por Vajta et al. (1998a) e dos 49,10% de Mezzalira
et al. (2002) com a vitrificação de ovócitos maturados. Também com ovócitos
maturados, os índices de clivagem obtidos neste estudo (53,6% e 43,5%) foram
semelhantes aos obtidos por estes autores. Entretanto, observou-se uma significativa
redução nas taxas de blastocistos, obtendo-se 10,6%, 6,7%, 8,8% e 4,2% para os grupos
1, 2, 3 e 4, respectivamente. Estes resultados confirmam as observações de Fuku et al.
(1995) e Vieira et al. (2002), de que a clivagem não é um parâmetro satisfatório para a
avaliação da viabilidade embrionária após a vitrificação. É possível que danos
imperceptíveis, que não impedem as primeiras clivagens, sejam determinantes na
posterior redução da viabilidade dos embriões.
Também na vitrificação de ovócitos maturados, a utilização do nitrogênio
líquido super-resfriado proporcionou maiores taxas de blastocistos (10,6%) em relação
ao grupo com nitrogênio líquido em atmosfera normal (6,7%). Efeito significativo do
super-resfriamento do nitrogênio líquido também foi observado na vitrificação de
ovócitos imaturos, obtendo-se 8,8% de blastocistos no grupo com vácuo e 4,2% no
grupo sem vácuo. Estes dados confirmam as observações de Arav (2000), de que o
super-resfriamento do nitrogênio líquido proporciona taxas de resfriamento
extremamente altas, com redução dos danos da criopreservação e melhoria da
viabilidade dos ovócitos criopreservados.
19
Contrário aos dados observados neste estudo, Nowshari; Brem (2001)
trabalhando com embriões de camundongo no estágio de pro-núcleo, não observaram
efeito significativo do nitrogênio líquido super-resfriado. Entretanto, os autores
trabalharam com diferente estágio (embrião) e diferentes espécies (camundongos), que
apresentam características distintas dos ovócitos bovinos, o que pode explicar as
diferenças observadas.
Neste estudo, quando se desconsiderou o tipo de nitrogênio utilizado (resfriado
ou não), obteve-se taxas de blastocistos de 6,8% e 8,9% com ovócitos imaturos e
maturados, respectivamente, não sendo observado efeito significativo do estágio de
maturação. Já quando se avaliou o efeito do super-resfriamento do nitrogênio líquido na
vitrificação de ovócitos, desconsiderando-se o estágio de maturação, observou-se uma
taxa de blastocistos de 9,7%, significativamente superior aos 5,4% obtidos com
nitrogênio líquido em atmosfera normal.
Estes dados demonstram que o super-resfriamento do nitrogênio líquido, obtido
pela submissão ao vácuo, proporciona maior viabilidade embrionária, possivelmente
por aumentar a velocidade de resfriamento, reduzindo os danos da vitrificação tanto em
ovócitos maturados como imaturos.
20
6 – CONCLUSÕES:
Os dados obtidos neste estudo permitem concluir que:
- O emprego de vácuo para resfriar o nitrogênio líquido proporciona maior viabilidade
na vitrificação de ovócitos bovinos.
- A utilização da vitrificação com nitrogênio líquido super-resfriado possibilita a
obtenção de idêntica viabilidade com ovócitos bovinos imaturos ou maturados.
- O equipamento utilizado para a produção de vácuo com 300 mmHg de pressão
negativa tem baixo custo, é eficiente e proporciona um decréscimo na temperatura do
nitrogênio de 4˚C, reduzindo as características de ebulição do mesmo.
- A metodologia de vitrificação empregada neste estudo é de fácil aplicação,
proporcionando resultados satisfatórios na criopreservação de ovócitos bovinos,
imaturos e maturados.
- Novos estudos devem ser conduzidos com objetivo de melhorar as taxas de
desenvolvimento embrionário, viabilizando economicamente o processo.
21
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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28
ANEXOS –
RESUMOS APRESENTADOS NA XVIII REUNIÃO ANUAL DA SBTE 2004 –
Barra Bonita – SP Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento) s/p (errata)
VITRIFICAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS EM NITROGÊNIO LÍQUIDO
COM ATMOSFERA NORMAL OU VÁCUO.
(Dados parciais)
Santos, R.M
1
.; Barreta, M
1
.; Mezzalira, J.C
1
.; Paulini, F
1
.; Cruz, F.B
1
.; Vieira, A.D
2
.; Mezzalira,
A
1
.
1
Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem – CAV Universidade
do Estado de Santa Catarina –UDESC Lages SC Brasil E-mail m[email protected]
2
Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS – Porto Alegre RS
Para avaliar o efeito do vácuo e da maturação, 203 ovócitos bovinos imaturos e 196
maturados foram vitrificados em nitrogênio líquido com atmosfera normal ou vácuo. Os
ovócitos do grupo I (Imaturos/vácuo) e grupo II (Imaturos/atmosfera normal) foram
vitrificados logo após a seleção. Já os ovócitos do grupo III (maturos/vácuo) e grupo IV
(maturos/atmosfera normal) foram maturados por 22 horas em meio TCM 199 sais de
Earle, com 10% de soro de égua em estro (SEE), à 39°C, com 5% de CO
2
, quando
foram parcialmente desnudados com Hialuronidase (0,5UI/µL de meio) por 2 minutos e
vitrificados. Os grupos foram expostos por 30 segundos a uma solução de 400µl de
TCM-Hepes com 10% de SEE, 50µL de EG e 50µL de DMSO, e a seguir transferidos
para a solução de vitrificação, composta por 300µL de sacarose 0,8M em TCM-Hepes
com 20% de SEE, acrescido de 100µL EG e 100µl de DMSO. Foram envasados grupos
de 3-4 ovócitos em palhetas estiradas e abertas (OPS). O vácuo foi produzido por 1
minuto de acionamento de uma bomba acoplada a um recipiente de acrílico revestido
com isopor, hermeticamente fechado, que continha o nitrogênio líquido. O
reaquecimento foi realizado com exposições (5 minutos) à concentrações decrescentes
de sacarose (0,30M e 0,l5M). Após a maturação, todos os ovócitos foram fecundados
com 2 x 10
6
espermatozóides/mL, selecionados por migração ascendente (Swim-up) em
meio Talp-Sperm, sendo incubados com os ovócitos por 18-22 horas, em 400µL de
meio Talp-Fert, adicionado de 30µg/mL de heparina. O cultivo foi realizado em meio
SOFaaci. A taxa de clivagem (D2) e blastocistos (D8) observada foi 48,0 e 11,1% para
o Grupo imaturos/vácuo, 40,0% e 4,8% para o Grupo imaturos/atmosfera normal, 53,0 e
13,2% para o Grupo maturos/vácuo e 39,0 e 8,0% para o Grupo maturos/atmosfera
normal. Observou-se taxas mais elevadas de embriões nos grupos que utilizaram a
vitrificação em nitrogênio submetido ao vácuo.
Apoio Financeiro: CNPq
29
VITRIFICATION OF BOVINE OOCYTES IN LIQUID NITROGEN WITH
VACUUM OR NORMAL ATMOSPHERE. (Partial results)
Santos, R.M
1
.; Barreta, M
1
.; Mezzalira, J.C
1
.; Paulini, F
1
.; Cruz, F.B
1
.; Vieira, A.D
2
.; Mezzalira,
A
1
.
1
Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem – CAV Universidade
do Estado de Santa Catarina –UDESC Lages SC Brazil E-mail m[email protected]
2
Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS – Porto Alegre RS
To evaluate the effect of the vacuum and maturation status, immature and matured
oocytes were randomly allocated to four groups and vitrified in liquid nitrogen with
normal or vacuum atmosphere. The immature oocytes of Group I (immature/vacuum)
and Group II (immature/normal atmosphere) were vitrified just after selection. The
oocytes from Group III (matured/vacuum) and Group IV (matured/normal atmosphere)
were submitted to 22 hours maturation in TCM 199 Earle salts medium, with 10% mare
estrous serum (SEE), at 39°C, with 5% CO
2
and 95% humidity. Then, they were
partially denuded, with use of Hyaluronidase (0,5UI/µL of medium) for 2 minutes and
vitrified. All oocytes were exposed for 30 seconds to a solution containing 400µL of
TCM-Hepes with 10% SEE, 50µL EG and 50µL DMSO. Just after, they were
transferred to a vitrification solution composed by 300µL of sucrose 0,5M in TCM-
Hepes with 20% of SEE, added of 100µL EG and 100µL DMSO. Groups of 3-4 oocytes
were loaded in open pulled straws (OPS) and vitrified. The vacuum was produced by 1-
minute suction of a bomb coupled to an acrylic recipient, covered with Styrofoam, that
contained the liquid nitrogen. Rewarming was performed by exposure (5 minutes) to
decreasing sucrose concentrations (0.30M and 0.l5M). After the maturation, all oocytes
were submitted to fertilization with semen selected by swim-up procedure, in TALP-
Sperm medium, with 2 x 10
6
spermatozoa/mL, and the incubation time with oocytes
was 18-22 hours, in 400µl of Talp-Fert medium, with 30µg/mL of heparin. The culture
was performed in SOFaaci medium, and cleavage and blastocyst rates evaluated.
Cleavage and blastocyst rates were 48.0 and 11.1% for immature/vacuum Group, 40.0%
and 4.8% for immature/normal atmosphere Group, 53.0 and 13.2% for mature/vacuum
Group and 39.0 and 8.0% for mature/normal atmosphere Group. The results
demonstrate high rates in groups vitrified in nitrogen submitted to vacuum.
Financial support: CNPq