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2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTI-
NOCICEPTIVA DE EXTRATOS E LIGNANAS
ISOLADOS DE Phyllanthus amarus
CANDIDA APARECIDA LEITE KASSUYA
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Farmacologia, Centro de
Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Santa Catarina, como
requisito parcial para a obtenção de título
de Doutor em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. João Batista Calixto
FLORIANÓPOLIS - SC
Janeiro - 2006
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3
KASSUYA, Candida Aparecida Leite. Atividade antiinflamatória e anti-
nociceptiva de extratos e lignanas isolados de Phyllanthus amarus.
Florianópolis, 2006. 108p. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Curso de Pós
graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadora: João Batista Calixto.
Defesa: 24/01/2006.
O extrato hexânico (EH) obtido do Phyllanthus amarus reduziu a nocicepção
em modelos experimentais de dor aguda e crônica em camundongos, sendo
que o mecanismo analgésico poderia estar relacionado possivelmente com a
modulação do receptor TRPV1. Este estudo demonstrou que o EH, a fração
rica em lignanas, e as lignanas filtetralina, nirtetralina ou nirantina foram
efetivos em inibir o edema, a migração celular e/ou a produção de IL-1β. O
mecanismo de ação da nirantina parece envolver o receptor para fator de
ativação plaquetário, enquanto que para a nirtetralina o perfil farmacológico
parece envolver a interação com receptor para endotelina-1. Apesar deste
trabalho ainda não ter caracterizado o princípio ativo responsável pelas ações
anti-nociceptivas, a filtetralina, a nirtetralina e a nirantina parecem ser as
responsáveis pelas ações antiinflamatórias do P. amarus.
[Phyllanthus amarus] [fração rica em lignanas] [Nirantina] [Nirtetralina]
[Filtetralina] [Inflamação] [Nocicepção] [adjuvante completo de Freund]
[Formalina] [TRPV1] [fator de ativação plaquetário] [endotelina-1].
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a grande honra e prazer de ter o professor João
Batista Calixto como orientador. Dentre outras coisas, agradeço o professor
Calixto: por ter me mostrado que o crescimento profissional depende da
disposição, paciência e dedicação; pela preocupação constante e cobrança;
pela plena disposição para tirar dúvidas e atendimento; pelos valiosos
ensinamentos; e pelo carinho e amizade oferecidos neste período.
Agradeço também a professora Vera Lúcia Rehder e seu grupo, pelo
fornecimento dos extratos, frações e compostos isolados de P. amarus, pela
ajuda, compreensão e colaboração nesta tese.
Aos doutores Juliano Ferreira, Tânia Mazzuco, Octávio Menezes Jr,
Danielle Duma, pela imensa ajuda para realização deste projeto e
principalmente pela verdadeira amizade demonstrada nestes anos.
Ao CNPq, FAPESP e CAPES pelo apoio financeiro.
5
DEDICATÓRIA
Ao grande amor da minha vida: Roberto Mikio Kassuya por todo o
carinho, amor, por sempre acreditar em mim e me apoiar nas escolhas que fiz
e por sempre me incentivar a nunca desistir dos meus sonhos.
Aos meus pais: Toshi Sakate e Pedro Antônio, Yoshio Kassuya (in
memoriam) e Iwako Kassuya por sempre estarem ao meu lado.
Aos professores do Departamento de Farmacologia, em especial ao Dr.
Anicleto Poli, Dr. Jamil Assreuy, Dr. Reinaldo Takahashi, Dr. Giles Rae e
Dra. Rosa Maria Nicolau, pelo aprendizado e amizade.
Aos funcionários do Departamento de Farmacologia, em especial a Rita
Maria Palma, a Sandra Regina B. de Oliveira, a Diana Lenzi, a Pedro Paulo de
Souza, a Redna, pelo carinho e amizade.
Aos meus amigos de laboratório: Valfredo Schlemper, Eunice André,
Carlos Eduardo Vitor, Rafaela Claudino, Edinéia Lemos, Allison Freire, Daniela
Leite, Daniela Cabrini, Michel Otuki, Janice, pela amizade e por tornarem este
período de pós-graduação agradáveis e memoráveis.
Aos meus queridos amigos da pós-graduação na UFSC: Sílvia Dal Bol,
Maria Fernanda Werner, Daniel Fernandes, Jarbas Motta Siqueira Jr.,
Valdelúcia, Inácio, Mariana A. Hort, Sofia Júrgensen, Rui Daniel, Luciano pela
troca de informações e amizade.
6
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas.............................................................................. i
Lista de Tabelas...................................................................................... ii
Lista de Anexos...................................................................................... ii
Lista de Figuras....................................................................................... iii
Resumo................................................................................................... v
Abstract................................................................................................... vi
1. INTRODUÇÃO........................................................................................ 1
2. OBJETIVOS............................................................................................ 24
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 25
3.1. Análises fitoquímicas.............................................................................. 25
3.1.1.
Isolamento, identificação química e rendimento dos constituintes do P.
amarus....................................................................................................
25
3.2. Avaliação farmacológica......................................................................... 26
3.2.1. Animais................................................................................................... 26
3.2.2. Modelos experimentais de dor................................................................ 26
3.2.2.1. Alodínia mecânica induzida pelo adjuvante completo de Freund (CFA) 26
3.2.2.2. Lesão parcial do nervo ciático................................................................. 28
3.2.2.3. Alodínia mecânica induzida pelo fator de ativação plaquetário (PAF).... 29
3.2.2.4. Alodínia mecânica induzida pela carragenina......................................... 29
3.2.2.5. Nocicepção induzida pela formalina....................................................... 30
3.2.2.6. Nocicepção induzida pela capsaicina..................................................... 31
3.2.2.7. Nocicepção induzida pela endotelina-1 (ET-1) ...................................... 32
3.2.3. Modelos experimentais de inflamação.................................................... 32
3.2.3.1. Edema induzido pelo CFA...................................................................... 32
3.2.3.2. Edema induzido por outros agentes inflamatórios.................................. 33
3.2.3.3. Pleurisia induzida pelo PAF.................................................................... 34
3.2.4. Medidas relacionadas ao processo inflamatório ou doloroso................. 35
3.2.4.1. Atividade da mieloperoxidase (MPO)...................................................... 35
3.2.4.2.
Quantificação da interleucina-1β (IL-1β).................................................
36
3.2.4.3.
Ensaio de união específica para [
3
H]-PAF em córtex cerebral de
camundongos..........................................................................................
37
3.2.4.4.
Ensaio de união específica para [
3
H]-BK em íleo de ratos.....................
38
3.2.4.5.
Ensaio de união específica para [
3
H]-resiniferatoxina (RTX) em
medula espinhal de ratos........................................................................
39
3.2.4.6.
Expressão da enzima COX-2 pelo ensaio de Western Blot....................
40
3.2.5. Drogas e reagentes................................................................................. 41
3.2.6. Análise estatística................................................................................... 42
4. RESULTADOS....................................................................................... 43
4.1. Efeito antiinflamatório e anti-nociceptivo de extrato hexânico e frações
obtidos do P. amarus..............................................................................
43
4.1.1. Efeito na alodínia mecânica induzida pelo CFA...................................... 43
4.1.2. Efeito na alodínia mecânica induzida pela Cg........................................ 45
4.1.3. Efeito na alodínia mecânica induzida por neuropatia............................. 45
4.1.4. Efeito na nocicepção induzida pela formalina......................................... 47
4.1.5. Efeito na nocicepção induzida pela capsaicina....................................... 47
4.1.6. Efeito no ensaio de união específica para [
3
H]-RTX em medula
espinhal de ratos.....................................................................................
49
4.1.7. Efeito sobre o edema induzido pelo CFA................................................ 49
7
4.1.8. Efeito sobre o edema induzido Cg.......................................................... 51
4.2.
Efeito antiinflamatório das lignanas isoladas do P. amarus....................
51
4.2.1. Efeito sobre o edema induzido pela Cg.................................................. 51
4.2.2. Efeito sobre o aumento da atividade da MPO induzido pela Cg............. 54
4.2.3.
Efeito sobre o aumento dos níveis de IL-1β induzido pela Cg................
55
4.2.4. Efeito sobre o aumento da expressão da enzima COX-2 induzido pela
Cg............................................................................................................
57
4.3. Mecanismo de ação da ET-1 nas respostas antiinflamatórias das
lignanas isoladas do P. amarus..............................................................
58
4.3.1. Efeito no edema induzido pela ET-1....................................................... 58
4.3.2. Efeito sobre a nocicepção induzida pela ET-1........................................ 60
4.4. Mecanismo de ação do PAF nas respostas antiinflamatórias das
lignanas isoladas de P. amarus..............................................................
64
4.4.1. Efeito no edema induzido pelo PAF........................................................ 64
4.4.2.
Efeito do EH e das lignanas isolados do P. amarus no ensaio de união
específica do [
3
H]-PAF em córtex cerebral de camundongos................
68
4.4.3. Efeito da nirantina sobre a pleurisia induzida pelo PAF.......................... 70
4.4.4. Efeito da nirantina sobre o aumento da atividade da MPO induzido
pelo PAF.................................................................................................
70
4.4.5. Efeito da nirantina sobre a alodínia induzida pelo PAF.......................... 73
4.5. Mecanismo de ação de outros mediadores sobre as respostas
antiinflamatórias dos EH e FRL obtidos de P. amarus...........................
73
4.5.1. Efeito no edema induzido por outros mediadores inflamatórios............. 73
4.5.2. Efeito no ensaio de união específica para [
3
H]-BK em córtex cerebral
de camundongos.....................................................................................
74
5. DISCUSSÃO 75
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 91
7. ANEXOS 108
8
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES - antiinflamatórios não esteroidais
BK - bradicinina
CFA - adjuvante completo de Freund
Cg - carragenina
COX - ciclooxigenase
D.O. - densidade óptica
DEX - dexametasona
DMSO - dimetilsulfóxido
EGTA - ácido bis (2-aminoetil) etilenoglicol- N, N, N´, N´-tetraacético
EH - extrato hexânico
EPM - erro padrão da média
ET-1 - endotelina-1
F1 - fração 1
F2 - fração 2, rica em ácidos
F3 - fração 3
FRL - fração rica em lignanas
i.pl. - intraplantar
IL1-β - interleucina 1β
MPO - mieloperoxidase
PAF - fator de ativação plaquetário
PBS - salina tamponada com fosfatos
PG - prostaglandina
PMSF - fluoreto de fenitilmetilsulfonil
RTX - resiniferatoxina
TNF-α - fator de necrose tumoral-α
9
LISTA DE TABELAS
1. Efeito do tratamento com dexametasona (DEX), BQ-123, WEB2170,
aspirina ou com as lignanas hipofilantina e filantina isoladas de P.
amarus sobre o edema de pata induzido pela injeção i.pl. de Cg após
60 min...................................................................................................
54
2. Efeito do tratamento local com a filtetralina, nirtetralina, nirantina
isoladas do P. amarus, do WEB2170 ou do BQ-123 sobre o edema
induzido pela injeção i.pl. de PAF avaliado 60 min após a injeção do
PAF.........................................................................................................
68
3.
Efeito do tratamento com EH ou FRL obtidas de P. amarus, sobre o
edema induzido pela injeção intraplantar de bradicinina (BK),
histamina ou susbtância P (SP)..............................................................
74
LISTA DE ANEXOS
1. Kassuya CAL, Silvestre AA, Rehder VL, Calixto JB. Anti-allodynic and
anti-oedematogenic properties of the extract and lignans from
Phyllanthus amarus in models of persistent inflammatory and
neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 2003, 478:145-153.........................
109
2. Kassuya CAL, Leite, DFP, de Melo, LV, Rehder VL, Calixto JB. Anti-
inflammatory properties of extract, fraction and lignans isolated from
Phyllanthus amarus. Planta Medica, 2005, 71 (8): 721-6.......................
118
3. Kassuya CAL, Silvestre A, Menezes-de-Lima Jr. O, Marotta DM,
Rehder VLG, Calixto JB. Antiinflammatory and antiallodynic actions of
the lignan niranthin isolated from Phyllanthus amarus. Evidence for
interaction with platelet activating factor. Manuscrito submetido à
publicação...............................................................................................
124
10
LISTA DE FIGURAS
1.
Fotos de um exemplar de P. amarus cedidas pela Professora Vera L.
Rehder na casa de vegetação do CPQBA – UNICAMP.........................
4
2.
Estrutura química das lignanas isoladas de P. amarus………………….
10
3. Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH) ou com a
fração rica em lignanas (FRL) obtidos do P. amarus sobre a alodínia
mecânica (A) induzida pela injeção intraplantar de CFA e do
tratamento via oral com EH, FRL, fração F1 (F1), fração 2 (F2) ou
fração F3 (F3) obtidos do P. amarus sobre a alodínia mecânica (B)
induzida pela injeção intraplantar de Cg em camundongos…………….
44
4.
Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH) obtido do P.
amarus ou com a gabapentina sobre a alodínia mecânica induzida
pela contricção parcial do nervo ciático (OP)..........................................
46
5.
Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH), fração rica
em lignanas (FRL), fração F1 (F1), fração 2 (F2) ou fração F3 (F3)
obtidos do P. amarus e da aspirina (ASA) sobre a primeira (A) e
segunda fase (B) da nocicepção induzida pela injeção intraplantar de
formalina em camundongos....................................................................
48
6. Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH), fração 2
(F2) ou fração F3 (F3) obtidas do P. amarus e do tratamento
subcutâneo com a capsaicina sobre a nocicepção induzida pela
injeção intraplantar de capsaicina em camundongos (A) e efeito do
extrato hexânico (EH) ou da fração F3 obtidos do P. amarus e da
capsaicina sobre a união específica da [
3
H]-RTX em preparações de
medula espinhal de rato.........................................................................
50
7. Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH) ou com a
fração rica em lignanas (FRL) obtidos do P. amarus sobre o edema
induzido pela injeção intraplantar de CFA (A) ou do tratamento por via
oral com EH, FRL, fração F1 (F1), fração 2 (F2), fração F3 (F3)
obtidos do P. amarus sobre o edema induzido pela injeção intraplantar
de Cg em camundongos (B)...................................................................
52
8.
Efeito do tratamento via oral com a filtetralina (FILT) (A), nirtetralina
(NIRT) (B) ou com a nirantina (NIRA) (C) isoladas do P. amarus sobre
o edema de pata induzido pela injeção intraplantar de Cg em
camundongos, após 30, 60, 120 e 240 min............................................
53
9. Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH), fração rica
em lignanas (FRL), com a filtetralina (FILT), nirtetralina (NIRT),
nirantina (NIRA) obtidos de P. amarus, ou com a dexametasona
(DEX) sobre o aumento da atividade da MPO (A) e sobre o aumento
da produção de IL-1β (B) induzido pela injeção intraplantar de Cg em
camundongos..........................................................................................
56
10. Imunodetecção dos níveis da proteína COX-2 (71-72 kDa) em
camundongos que receberam tratamento oral com o extrato hexânico
(EH) ou com a fração rica em lignanas (FRL) ou com as lignanas
filtetralina (FILT), nirtetralina (NIRT) ou nirantina (NIRA) obtidos de
P. amarus após injeção intraplantar de Cg em camundongos...............
57
11.
Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH) na dose de
59
11
100 mg/kg (A) ou em diferentes doses de EH (B) e o tratamento via
oral com a fração rica em lignanas (FRL) na dose de 100 mg/kg (C) e
de diferentes doses de FRL (D) após 15 min da injeção intraplantar de
ET-1 em camundongos...........................................................................
12. Efeito do tratamento via oral com a filtetralina (FILT) na dose de 10
µmol/kg (A) ou em diferentes doses de FILT (B) e o tratamento via
oral com nirtetralina (NIRT) na dose de 10 µmol/kg (C) e de diferentes
doses de FILT (D) após 15 min da injeção intraplantar de ET-1 em
camundongos..........................................................................................
61
13. Efeito do tratamento por via intraplantar com a filtetralina (FILT, A),
nirtetralina (NIRT, B) e com BQ123 (C) no edema induzido pela
injeção intraplantar de ET-1 em camundongos......................................
62
14. Efeito do tratamento por tratamento via intraplantar com a filtetralina
(FILT), nirtetralina (NIRT) ou nirantina (NIRA) isoladas do P. amarus
ou do BQ-123 sobre a nocicepção induzido pela injeção intraplantar
de ET-1 em camundongos......................................................................
63
15.
Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH) na dose de
100 mg/kg (A) ou em diferentes doses de EH (B) e o tratamento via
oral com a fração rica em lignanas (FRL) na dose de 100 mg/kg (C) e
de diferentes doses de FRL (D) após 60 min da injeção intraplantar de
PAF em camundongos............................................................................
65
16.
Efeito do tratamento via oral na dose de 10 µmol/kg com filtetralina
(FILT) (A), nirtetralina (NIRT) (B) ou nirantina (NIRA) (C) sobre o
edema de pata induzido pela injeção intraplantar de PAF em
camundongos..........................................................................................
66
17. Efeito do tratamento por via intraplantar com a filtetralina (FILT, A),
nirtetralina (NIRT, B), nirantina (NIRA, C) e com WEB2170 (C) no
edema induzido pela injeção intraplantar de PAF em camundongos.....
67
18. Efeito do extrato hexânico (EH), da fração rica em lignanas (FRL), da
filtetralina (FILT), nirtetralina (NIRT), nirantina (NIRA) sobre o ensaio
de união específica do [
3
H]-PAF preparações de córtex cerebral de
camundongos (A) e curva concentração-resposta de inibição para a
nirantina ou do WEB2170 sobre ensaio de união específica do [
3
H]-
PAF em preparações de córtex cerebral de camundongos (B)..............
69
19.
Efeito do tratamento via oral com a nirantina (NIRA, 100 µmol/kg) ou
com o tratamento via intraperitoneal do WEB2170 (1,7 µmol/kg) sobre
o extravasamento protéico induzidos pela injeção intratorácica de PAF
em camundongos....................................................................................
71
20. Efeito do tratamento intraplantar com nirantina ou com o WEB2170
sobre o aumento da atividade da MPO induzido pela injeção
intraplantar de PAF em camundongos (A) e efeito do tratamento
intraplantar com a nirantina (60 nmol/pata) ou com o WEB2170 (30
nmol/pata) sobre a alodínia mecânica induzida pela injeção i.pl. de
PAF em ratos (B)....................................................................................
72
21.
Efeito do extrato hexânico (EH) ou da fração rica em lignanas (FRL)
obtidos do P. amarus sobre a união específica para [
3
H]-BK em
preparações de íleo de rato....................................................................
74
12
Resumo
O estudo realizado durante o desenvolvimento desta tese demonstrou que o
tratamento prolongado por via oral com o extrato hexânico (EH) obtido do
Phyllanthus amarus reduziu a nocicepção em modelos experimentais de dor
aguda e crônica em camundongos. A propriedade analgésica do EH em
modelos de dor experimental aguda parece estar relacionada com a fração 3 e
possivelmente envolve a modulação do receptor TRPV1, uma vez que tanto o
EH como a fração 3 deslocaram o ensaio de união específica para a [
3
H]-
resiniferatoxina em preparações de medula espinhal de rato. Este estudo
demonstrou também que o EH e a fração rica em lignanas, bem como as
lignanas filtetralina, nirtetralina ou nirantina administrados por via sistêmica ou
local foram efetivos em inibir alguns parâmetros inflamatórios, incluindo o
edema, a migração celular e/ou a produção de IL-1β. Além disso, foi também
demonstrado que a nirantina parece apresentar efeito antiinflamatório e anti-
nociceptivo através da inibição do receptor para fator de ativação plaquetário
(PAF), uma vez que apresenta perfil semelhante ao WEB2170 (antagonista de
receptor para PAF), além de ambos terem deslocado a união específica do
[
3
H]-PAF em preparação de córtex cerebral de camundongos, de modo
concentração-dependente. Por outro lado, a nirtetralina apresenta perfil
farmacológico que sugere a interação com receptor para endotelina-1 (ET-1).
Nossos resultados mostram que a nirtetralina apresenta perfil antiinflamatório e
anti-nociceptivo semelhante ao antagonista do receptor ET
A
, o BQ-123,
corroborando com resultados da literatura que demonstraram que a nirtetralina
desloca a união específica para
125
I-ET-1 em membranas de células de ovário
de hamster chinês (CHO) transfectadas com receptor ET
A
. Os resultados do
presente estudo são, portanto, relevantes uma vez que o P. amarus é uma
planta amplamente utilizada pela população e até o presente momento poucos
princípios ativos desta planta foram estudados. Apesar deste trabalho ainda
não ter caracterizado o princípio ativo responsável pelas ações anti-
nociceptivas, a filtetralina, a nirtetralina e a nirantina parecem ser as
responsáveis pelas ações antiinflamatórias do P. amarus.
13
Abstract
In the present study, it was shown that prolonged oral treatment with hexane
extract (HE) obtained from Phyllanthus amarus reduced the nociception in
experimental models of acute and chronic pain in mice. The analgesic property
of HE in experimental models of acute pain could be due to the F3 fraction and
possibly involves TRPV1 receptor modulation, since both HE and F3 fraction
displaced the specific binding of [
3
H]-resiniferatoxin in the rat spinal cord. This
work also showed that HE and fraction-rich lignans, as well as lignans such as
phyltetralin, nirtetralin and niranthin administered by systemic or local pathways
were effective in inhibiting some of the inflammatory parameters, including
edema, cell influx and/or IL-1β production. Moreover, it was shown that
niranthin exerts its antiinflammatory and anti-nociceptive effects through the
inibibition of platelet activating factor (PAF). Niranthin showed similar responses
to WEB2170 (the antagonist of PAF receptor). In addition, niranthin and
WEB2170 displaced, in a concentration-dependent manner, the specific binding
of [
3
H]-PAF in the mouse cerebral cortex. On the other hand, nirtetralin
exhibited pharmacological responses that suggested an interaction with
endothelin-1 (ET-1) receptor. The present result showed that NIRT exhibited
antiinflammatory and anti-nociceptive effects similar to those of BQ-123 (ET
A
receptor antagonist), corroborating the data from the literature that showed that
nirtetralin achieved a specific binding of
125
I-ET-1 in transfected cells with ET
A
receptors of Chinese hamster ovary. These results are extremely relevant
because the plants of P. amarus species are widely used in folk medicine in
Brazil and many other countries, but up to the present little have been
discovered about the main active principles of these plants. This work did not
characterize the main principle responsible for the antinociceptive properties;
however phyltetralin, nirtetralin and niranthin seem to be responsible for the
antiinflamatory actions of P. amarus.
14
1. INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são freqüentemente utilizadas com o intuito de
substituir ou auxiliar as terapias convencionais no tratamento de várias
doenças. Entre outros fatores, a preferência na utilização das plantas
medicinais decorre da facilidade de obtenção e do baixo custo. Porém, sabe-se
que as plantas medicinais apresentam ampla diversidade de metabólitos
secundários com diferentes atividades biológicas (FARNSWORTH et al., 1985;
SIMÕES, 2003), justificando a necessidade de um aprofundamento no
conhecimento das propriedades das espécies vegetais e sua utilização na
formulação de medicamentos. O maior problema para sua utilização
terapêutica no tratamento convencional das diversas doenças é a falta de
dados científicos que comprovem a eficácia e a segurança dos medicamentos
preparados a partir das plantas medicinais.
Apesar da preferência das grandes indústrias farmacêuticas pelo
desenvolvimento de medicamentos pela via sintética, nas últimas décadas
observa-se ainda um grande interesse do mercado pelo potencial terapêutico
das plantas medicinais (para revisão ver: CALIXTO et al., 1998; CALIXTO et
al., 2000; KOEHN e CARTER, 2005). Tal fato é comprovado pela evidência de
que hoje cerca de 25% das drogas prescritas no mundo são obtidas direta ou
indiretamente de plantas. Além disso, cerca de 49% das drogas desenvolvidas
entre 1981 a 2002 foram obtidas a partir de produtos naturais, ou análogos
semi-sintéticos ou ainda compostos sintéticos baseados em produtos naturais
(para revisão ver: KOEHN e CARTER, 2005).
Ainda que os medicamentos derivados de plantas tenham uma boa
aceitação pela população e estejam presentes no mercado farmacêutico,
15
apenas uma pequena parcela das plantas medicinais possui dados científicos
que comprovem sua eficácia e seu espectro toxicológico, assim como garantia
de qualidade do produto. Considerando-se os diversos metabólitos secundários
presentes nas plantas, as principais categorias de medicamentos derivados de
plantas são os terpenóides, glicosídeos, alcalóides e outros tipos. Como
exemplos relevantes de medicamentos obtidos de plantas, podemos mencionar
a morfina (Papaver somniferum), a digoxina (Digitalis sp.), o taxol (Taxus
brevifolia), o quinino (casca da Chinchona sp), a vincristina e a vinblastina
(Catharanthus roseus), dentre outros (RATES, 2001). Assim, na terapêutica
moderna, as plantas medicinais fornecem o substrato para a produção de
compostos biologicamente ativos ou compostos passíveis de modificações e
otimizações estruturais que dão origem às entidades químicas.
Dentro deste contexto, o Brasil é um país privilegiado, pois ocupa o
primeiro lugar dentre os 17 países mais ricos do mundo em biodiversidade,
detendo cerca de 23% do total de espécies existentes no planeta (RATES,
2001). A imensa variedade de espécies de plantas, animais e microorganismos
existentes no ecossistema brasileiro, sem dúvida apresenta um importante
diferencial para o desenvolvimento de medicamentos (KATO, 2001). Dentro
desta imensa variedade de espécies encontram-se as plantas do gênero
Phyllanthus conhecidas popularmente como quebra-pedras, arrebenta-pedras,
erva-pombinha, saxifraga, filanto, arranca-pedra, fura-parede ou conami (para
revisão ver: UNANDER et al., 1992; CALIXTO et al. 1998), que serão
abordados a seguir.
16
1.1. A Família Euphorbiaceae, o gênero Phyllanthus e a espécie
Phyllanthus amarus
As plantas pertencentes ao gênero Phyllanthus (Euphorbiaceae)
compreendem cerca de 550 a 750 espécies distribuídas nos países tropicais e
subtropicais (para revisão ver: UNANDER et al., 1992, 1995; CALIXTO et al.
1998), sendo que cerca de uma centena dessas espécies são encontradas no
Brasil (TORRES et al., 2003; DE SILVA e DE SALES, 2004). Este gênero é
dividido em subgêneros: Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Phyllanthus,
Eriococcus, Conami, Gomphidium, Botryanthus, Xylophylla, Phyllanthodendron
(para revisão ver: UNANDER et al., 1992, 1995; CALIXTO et al. 1998).
Em geral as plantas do subgênero Phyllanthus possuem porte herbáceo.
Os caules medem entre 50 a 60 cm de altura, sendo delgados e flexíveis. Os
frutos, dotados de três compartimentos, contêm seis sementes, duas das quais
em cada uma das divisões (DE SILVA e DE SALES, 2004). Existe grande
semelhança entre espécies desse gênero dificultando a classificação e a
caracterização botânica destas plantas. Como exemplo disto observa-se na
literatura que por muitos anos o P. amarus foi classificado como P. niruri L.
(para revisão ver: UNANDER et al, 1990). Além disso, as plantas classificadas
como P. amarus receberam outras denominações ao longo da história: P.
amarus Schun. (LANETTI et al., 1980), P. niruri L. var. amarus ou como P.
amarus Schumach. & Thonn. (nomenclatura mais recente). Apesar da
semelhança do P. amarus com o P. niruri e P. abnormis, existem algumas
características que identificam a espécie P. amarus, tais como as
inflorescências bissexuais com duas flores (estaminada e pistilada) possuindo
17
estames completamente unidos, flores e sementes com estrias longitudinais
semiconcêntricas (Figura 1) (para revisão ver: UNANDER et al., 1992; DA
SILVA e DE SALES, 2004).
Figura 1: Foto de um exemplar de P. amarus cedida pela Professora Vera L.
Rehder na Casa de Vegetação do CPQBA – UNICAMP
1.1.1. Propriedades terapêuticas do Phyllanthus sp
As plantas do gênero Phyllanthus são tradicionalmente utilizadas para
tratar distúrbios menstruais, diabetes, herpes, gonorréia, disenteria, icterícia,
asma, infecções brônquicas e genitourinárias, assim como afecções renais,
incluindo os problemas relacionados a cálculos renais e/ou biliares (UNANDER
et al., 1992, 1995; CALIXTO et al., 1998). Em função de seu grande uso
popular, estas plantas vêm sendo estudadas cientificamente em vários países.
Uma atenção particular foi dada ao subgênero Phyllanthus, cujas espécies têm
sido investigadas através de estudos fitoquímicos, farmacológicos pré-clínicos
e clínicos, permitindo assim comprovar, pelo menos em parte, seus efeitos
atribuídos pela medicina popular (para revisão ver: BACCHI, 1984; UNANDER
et al., 1995; CALIXTO et al., 1998). O gênero Phyllanthus contém espécies que
18
foram popularmente consagradas para o tratamento terapêutico na litíase
urinária (para revisão ver: UNANDER et al., 1990, 1992, 1995) e por esta razão
tanto as espécies de Phyllanthus sp como outras plantas deste gênero são
conhecidas como quebra-pedras. Além disso, estas plantas apresentam a
habilidade de crescer entre as rachaduras do solo ou cimento, dando a
impressão de que a planta “quebra a pedra”.
Estudos clínicos realizados com o chá das partes aéreas do P. niruri
(Santos, 1990) demonstraram a eficácia dessa planta no tratamento do cálculo
renal, um efeito que foi associado à interferência no crescimento e agregação
dos cristais na urina humana sugerindo papel potencial na prevenção do
desenvolvimento e tratamento do cálculo. Estudos realizados em animais
(BARROS et al., 2003) demonstraram que o extrato aquoso de P. niruri foi
capaz de prevenir o crescimento de cálculos de oxalato de cálcio implantados
na bexiga urinária de ratos. CAMPOS e SCHOR (1999) demonstraram que o
extrato do P. niruri inibiu a internalização (endocitose) de cristais de oxalato de
cálcio em células medulares do ducto renal de cão de forma dependente da
concentração, sugerindo que tais mecanismos poderiam contribuir para
explicar as ações benéficas desta planta no tratamento da nefrolitíase.
FREITAS et al. (2002) verificaram que o extrato aquoso de P. niruri foi eficaz
em inibir o crescimento dos cristais de oxalato de cálcio nos rins e que este
efeito parece ser independente das alterações que ocorrem na excreção do
citrato e do magnésio na urina.
Além do principal uso popular para o tratamento de cálculos renais e
urinários, algumas espécies de plantas do gênero Phyllanthus são utilizadas
também para o tratamento de infecções intestinais, diabetes e hepatite.
19
Estudos farmacológicos pré-clínicos, bem como raros ensaios clínicos,
demonstraram que os extratos de várias espécies de plantas do gênero
Phyllanthus apresentaram ações anti-virais, especialmente em relação ao vírus
da hepatite B (SHEAD et al., 1992). Além disso, têm sido relatadas ações
hepatoprotetoras dos princípios ativos das plantas desse gênero
(SATYANARAYAN et al., 1988; SINGH et al., 1989), como a filantina e a hipo
filantina (SYAMASUNDAR et al., 1985). Com base na medicina popular, a
espécie do gênero Phyllanthus mais utilizada para o tratamento da icterícia e
hepatite é o P. amarus (para revisão ver: UNANDER et al., 1990, 1992; ASHA
et al., 2004).
Assim, os extratos de P. amarus apresentaram importantes efeitos
farmacológicos tanto nos estudos realizados in vitro como in vivo contra
doenças que acometem o fígado (hepatites), no tratamento da dor, da
inflamação, estados alérgicos e do câncer, e contra o vírus da imunodeficiência
adquirida (HIV) (para revisão ver: CALIXTO et al., 1998; RAJESHKUMAR et al.,
2002; NOTKA et al., 2003; LEVY et al., 2004).
1.1.2. Estudos farmacológicos de espécies de Phyllanthus
Tendo em vista as manifestações de dores fortes associadas com a
litíase reno-ureteral, nosso grupo de pesquisa estudou algumas espécies de
plantas do gênero Phyllanthus visando verificar suas possíveis ações
antinociceptivas. Inicialmente, demonstrou que os extratos do P.
corcovadensis, P. urinaria, P. tenellus, P. sellowianus, P. niruri, P. caroliniensis,
P. fraternus, P. stipulatus, P. amarus e P. orbiculatus administrados tanto por
via intraperitoneal quanto por via oral, apresentaram atividade antinociceptiva
20
em vários modelos de dor em camundongos (GORSKI et al., 1993; SANTOS et
al. 1995a; 2000; CECHINEL FILHO et al. 1996). O possível mecanismo
antinociceptivo envolveria o sistema taquicinérgico, mas não a interação com o
sistema opióide (GORSKI et al., 1993; SANTOS et al., 1995 a, b). Para melhor
entender o mecanismo de ação do extrato de P. urinaria, foram realizados
estudos “in vitro” na bexiga e na traquéia isoladas de cobaia. Quando o extrato
do P. urinaria foi testado, na traquéia isolada de cobaia sem epitélio, observou-
se ação contrátil dependente da concentração usada, sendo esse efeito
antagonizado pela indometacina (PAULINO et al., 1996) e pelos antagonistas
dos receptores NK
1
e NK
2
das taquicininas (FK888 e SR48968,
respectivamente), bem como pelo vermelho de rutênio. No mesmo estudo, foi
também demonstrado que, empregado em maior concentração, o extrato do P.
urinaria causou relaxamento na musculatura lisa da traquéia de cobaia pré-
contraída pelo carbacol ou sob tônus espontâneo. Este relaxamento foi
antagonizado de maneira dependente da concentração pelo bloqueador não
seletivo de canal de potássio tetraetilamônio, bem como por glibenclamida, um
bloqueador de canal de potássio sensível ao ATP. Contudo, a neurotoxina
apamina, um bloqueador de canal de potássio de baixa condutância modulado
por cálcio, não afetou o relaxamento induzido pelo extrato de P. urinaria na
traquéia de cobaia. Assim, os canais de potássio modulados por ATP, mas não
aqueles de baixa condutância ativados por cálcio, parecem ser importantes
para a manifestação da resposta relaxante induzida pelo extrato P. urinaria na
traquéia de cobaia.
Dando seqüência a esses estudos, DIAS et al. (1995) demonstraram que
o extrato de P. urinaria também foi capaz de causar contração da veia porta
21
isolada de ratos. Os mesmos autores mostraram que a resposta contrátil do
extrato nessa preparação foi dependente do cálcio extracelular, sendo
insensível a bloqueadores de canal de cálcio do tipo L e N. Contudo, a
atropina, a ioimbina, a guanetidina, o prazosin, mas não a indometacina, foram
capazes de antagonizar, de forma significativa, as respostas contráteis
causadas pelo extrato do P. urinaria na veia porta isolado de ratos (DIAS et al.,
1995). No entanto, a ação relaxante do extrato, a exemplo do demonstrado por
PAULINO et al. (1996) na traquéia de cobaia, foi antagonizada pela
glibenclamida, TEA, apamina, mas não por inibidor de óxido nítrico ou pelo azul
de metileno. Esses resultados estenderam os dados anteriores e mostraram
que a ação relaxante do extrato de P. urinaria na veia porta de ratos, parece
ser dependente da ativação de canais de potássio modulados por ATP, e
diferentemente do encontrado na traquéia, os canais de potássio de baixa
condutância, ativados por cálcio, parecem ser importantes para a resposta
relaxante induzida pelo extrato na veia porta de ratos (DIAS et al., 1995).
1.1.3. Phyllanthus sp na resposta inflamatória
Existem poucos relatos na literatura sobre as ações antiinflamatórias das
plantas do gênero Phyllanthus. Entretanto, alguns estudos têm descrito o
potencial antiinflamatório do P. amarus (KIEMER et al., 2003, RAPHAEL e
KUTTAN, 2003). Recentemente, foi demonstrado que a administração
intragástrica do extrato metanólico de P. amarus (50-1000 mg/kg) foi capaz de
inibir significativamente o desenvolvimento de lesões gástricas induzidas por
etanol (8 mg/kg), bem como o edema de pata induzido pela carragenina (Cg)
em ratos (RAPHAEL e KUTTAN, 2003). Mais recentemente, KIEMER et al.
22
(2003) demonstraram que o extrato hidroalcoólico e o hexânico obtidos do P.
amarus atuavam em alvos importantes para a reação inflamatória (KIEMER et
al., 2003).
1.1.4. Substâncias derivadas do Phyllanthus sp
O estudo dos constituintes químicos presentes no subgênero
Phyllanthus iniciou-se há algumas décadas (para revisão ver: BACCHI et al.,
1984). Grande esforço tem sido realizado para a identificação e isolamento da
ampla grande variedade de substâncias químicas presentes neste gênero (para
revisão ver: CALIXTO et al. 1998). Várias destas substâncias como
flavonóides, taninos, alcalóides, cumarinas, lignanas e terpenos foram descritos
como sendo as principais responsáveis pelas ações antivirais, hipoglicemiante,
antiespasmódica e antialérgicas dos Phyllanthus sp. A complexidade das
misturas de compostos e a presença de vários compostos em baixa
concentração dificultam a identificação e o isolamento dos produtos químicos
naturais. Distintas condições ambientais podem afetar a constituição química
da planta e interferir na interpretação dos dados dos espectros das estruturas
não complexas (para revisão ver: CALIXTO et al. 1998).
O P. niruri L. é uma das espécies mais estudadas no que se refere aos
constituintes químicos (para revisão ver: BACCHI et al., 1984; CALIXTO et al.
1998). Entretanto, a real identidade das plantas investigadas originalmente
torna-se confusa, uma vez que as diferentes plantas deste subgênero
apresentavam muitas vezes mesma denominação (para revisão ver:
UNANDER et al., 1990). Dentre os diversos compostos químicos identificados
no P. niruri L. podemos citar lignanas como as hipofilantina, filantina
23
(SOMANADANDHU et al., 1993), nirantina, nirtetralina e filtetralina
(ANJANEYULU et al., 1973; para revisão ver: CALIXTO et al., 1998)(Figura 2).
Figura 2: Estrutura química das lignanas isoladas de P. amarus.
Além das lignanas, outros metabólitos secundários incluindo os
flavonóides quercetina, astralgina, isoquercetina e rutina, taninos, esteróides e
saponinas foram identificados no P. niruri L. var. amarus (LANETTI et al., 1980;
para revisão ver BACCHI et al., 1984). Outros exemplos são os ácidos graxos
incluindo os ácidos ricinoléico, linoléico e o linolênico (para revisão ver BACCHI
et al., 1984).
1.1.5. Lignanas presentes nas plantas do gênero Phyllanthus
Apesar das propriedades antiinflamatórias, imunomoduladoras e anti-
nociceptivas serem algumas das diversas ações biológicas das plantas do
MeO
MeO
OMe
OMe
OMe
OMe
Nirtetralina Nirantina
Filtetralina
FilantinaHipofilantina
O
O
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
O
O
OMe
OMe
MeO
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
OMe
MeO
MeO
OMe
MeO
O
O
OMe
OMe
OMe
24
gênero Phyllanthus, de acordo com a literatura, até o presente momento os
compostos responsáveis por estas ações permanecem ainda em grande parte
desconhecidos.
O termo lignóide é uma designação genérica, que caracteriza
micromoléculas, cujo esqueleto é formado exclusivamente pelo grupo
fenilpropânico (C
6
– C
3
)n. Os lignóides podem ser subdivididos em: lignanas;
neolignanas, alolignanas, norlignanas, oligolignóides, heterolignóides. As
lignanas são dímeros formados através do acoplamento oxidativo de álcoois
cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos (SIMÕES, 2003). Algumas
lignanas possuem atividades farmacológicas e/ou imunológicas, podendo
possuir também propriedade antiinflamatória, anti-tumoral, anti-mitótica, anti-
viral, antiaterosclerótica e/ou citotóxica para alguns tipos de parasitas
(MACRAE e TOWERS, 1984) e antialérgicas (ROW et al., 1964).
Dentre as várias classes de compostos químicos presentes na planta
P. amarus, as lignanas foram uma das primeiras classes a serem descritas. As
lignanas isoladas de outras plantas possuem várias atividades farmacológicas
incluindo a inibição do receptor do fator de ativação plaquetária (PAF), o
antagonismo do receptor para endotelina-1 (ET-1), bem como a inibição do
fator nuclear kappa B (NFκB) (HUSSAIN et al., 1995; CHO et al., 2002;
HWANG et al., 2003; LEE et al., 2003). Sabe-se que estes efeitos poderiam
explicar, pelo menos em parte, as atividades analgésica e antiiflamatória da
P. amarus.
Apesar das lignanas nirtetralina, hipofilantina, filantina, filtetralina e
nirantina, isoladas do P. amarus (ver suas estruturas na figura 2), terem sido
identificadas há mais de uma década, pouco se sabe sobre suas ações
25
farmacológicas. Entretanto, o fato de que extratos das plantas do gênero
Phyllanthus apresentam ações anti-nociceptivas e ainda que extratos do P.
amarus possuírem propriedades antiinflamatórias sugere que as lignanas
presentes nessa espécie possam ser de interesse para o estudo farmacológico
em modelos de experimentais de inflamação e de dor.
1.2. Aspectos farmacológicos da inflamação e da dor
1.2.1. Inflamação
A palavra inflamação é derivada do “estado de se estar inflamado”.
Inflamar significa “colocar fogo” o que implica na cor vermelha, na possibilidade
de aquecimento e na geração de dor (para revisão ver: TROWBRIGDE e
EMLING, 1996). A resposta inflamatória é um mecanismo benéfico e fisiológico
pelo qual o organismo se defende contra infecções e tenta reparar danos
teciduais ou perda de função (para revisão ver: LAWRENCE et al., 2002).
Assim, o processo inflamatório agudo pode ser definido como um conjunto de
alterações bioquímicas e celulares que ocorrem em resposta a estímulos
inespecíficos, tais como infecções ou danos teciduais (para revisão ver:
HANSSON, 2005). As reações inflamatórias locais são caracterizadas por
aumento do fluxo sangüíneo e da permeabilidade vascular, seguida de
dilatação venular e acúmulo de células do processo inflamatório,
caracterizando os quatro sinais típicos da presença de inflamação: rubor
(hiperemia), tumor (edema), calor (aumento da temperatura local) e dor, como
descritas por Cornelius Celsus, no início da era Cristã (para revisão ver:
GILROY et al., 2004). O quinto sinal da inflamação, que é a perda da função do
26
tecido ou órgão lesado, associado com reações crônicas foi descrito
posteriormente por VIRCHOW no século XIX (citado em KALISCH, 1975).
As causas que levam à inflamação são múltiplas e de natureza variável.
São reconhecidos os seguintes tipos de agentes que causam inflamação:
agentes biológicos (como bactérias, vírus, protozoários); agentes químicos
(como ácidos, álcalis, terebentina, formaldeído, carragenina); agentes físicos
(como calor excessivo, frio exagerado, radiação ultravioleta e ionizante,
eletricidade, traumatismos, fraturas, incisões) e agentes imunes (exposição a
antígenos provocando ativação da resposta imunológica do hospedeiro).
Os componentes básicos de um processo inflamatório envolvem eventos
vasculares e celulares, mediadores derivados de células e da ativação
plasmática, que produzem os sinais clássicos da inflamação descritos
anteriormente. As alterações vasculares iniciam-se imediatamente e
desenvolvem-se durante as primeiras horas após o estímulo inflamatório. Elas
consistem em vasodilatação, aumento do fluxo sangüíneo, aumento da
permeabilidade vascular e exsudação de plasma (WILLIAMS et al., 1983). Em
condições normais a microcirculação apresenta baixíssima permeabilidade a
macromoléculas. As proteínas plasmáticas circulam muito lentamente entre
sangue e tecidos e retornam ao sangue através dos vasos linfáticos. Esta
situação muda dramaticamente durante o processo inflamatório. A
microcirculação torna-se permeável a macromoléculas e fluídos vindos do
sangue, causando edema tecidual (para revisão ver: GILROY et al., 2004).
Os eventos celulares são marcados pela saída das células circulantes
da luz do vaso e a migração de leucócitos para o sítio inflamatório. Esse
fenômeno segue algumas fases como captura, rolamento dos leucócitos pelo
27
endotélio, adesão firme e transmigração (MUNRO, 1993; SPRINGER, 1994;
WAHL et al., 1996). Todas estas etapas do processo de migração leucocitária
são dependentes da expressão pelos leucócitos e pelas células endoteliais de
moléculas denominadas moléculas de adesão e de mediadores quimiotáticos
(SPRINGER, 1994; WEBER, 2003). A mobilização adequada dos leucócitos
circulantes para o sítio inflamado é fundamental para a defesa do organismo, já
que estas células podem desenvolver suas ações de fagocitose e destruição de
agentes patogênicos levando à resolução do processo. Os leucócitos
circulantes migram seletivamente e em número significativo para o tecido
inflamado no decorrer do processo. Em uma resposta inflamatória aguda, e
logo nos estágios iniciais, há acúmulo predominante de neutrófilos, enquanto
que as células mononucleares são observadas mais tardiamente durante a
fase aguda, bem como nos processos crônicos. A migração de eosinófilos
também pode ocorrer em processos inflamatórios, estando principalmente
associada a processos alérgicos e infecções parasitárias. Algumas das células
envolvidas já estão presentes no tecido afetado tais como: células endoteliais,
células mesoteliais, mastócitos, eosinófilos, macrófagos e alguns linfócitos
(SIBILLE e REYNOLDS, 1990; SAMPSON 2000; BROCHE e TELLADO, 2001;
BOYTON e OPENSHAW, 2002).
Além da dor derivada do processo inflamatório, podemos citar outros
tipos de dor como nociceptiva, neurogênica e a neuropática (para revisão ver:
MILLAN, 1999). Além disso, outras manifestações dolorosas como a
hiperalgesia (sensibilidade exacerbada à um estímulo doloroso) ou a alodínia
(dor em resposta à um estímulo não doloroso), são freqüentes em pacientes
acometidos de dor. Em termos de duração, a dor pode ser aguda ou crônica. A
28
dor aguda está associada com uma lesão tecidual recente, ativação de
nociceptores e pode desaparecer até mesmo antes da cura do dano tecidual
(para revisão ver: CARR e GOUDAS, 1999; PARK e VASKO, 2005). Por outro
lado, a dor crônica pode se perpetuar por meses ou anos, se caracteriza em
relação à persistência e alterações adaptativas, o que muitas vezes dificulta o
tratamento (para revisão ver: IADAROLA e CAUDLE, 1997; BESSON, 1999).
A percepção dolorosa a um determinado estímulo nocivo tem como
propósito biológico alertar o organismo sobre algum perigo no ambiente,
incluindo a resposta comportamental de proteger o organismo contra possível
lesão (CHENG et al., 2002). A transmissão da dor envolve uma interação
complexa de estruturas centrais e periféricas desde a pele, vísceras ou outros
tecidos até o córtex cerebral (FURST, 1999). Os estímulos nocivos tais como
calor, frio, compressão intensa ou substâncias químicas endógenas ou
exógenas potencialmente nocivas, ativam as terminações nervosas livres e
periféricas de fibras aferentes sensoriais delgadas do tipo C e Aδ, chamadas de
nociceptores. Estas fibras são formadas por neurônios cujos corpos celulares
encontram-se nos gânglios da raíz dorsal (DRG) e trigeminal, e são
responsáveis pela condução das informações nociceptivas até o corno dorsal
da medula espinhal e o núcleo trigeminal pars caudalis na ponte,
respectivamente (para revisão ver: DRAY e PERKINS, 1997; RUSSO e
BROSE, 1998; BESSON, 1999, PARK e VASKO, 2005). Imediatamente, um
reflexo de retirada mediado pela medula espinhal é desencadeado no intuito de
remover a região do corpo ameaçada (WATKINS e MAIER, 2002). Nas lâminas
superficiais do corno dorsal da medula espinhal, as terminações dos
nociceptores liberam vários neurotransmissores que estimulam neurônios de
29
segunda ordem. Estes neurônios formam vias que irão distribuir informações
para circuitos cerebrais responsáveis pela produção das sensações dolorosas
(para revisão ver: CRAIG, 2003; HUNT e MANTYH, 2001; PARK e VASKO,
2005).
Embora diversos mecanismos moleculares envolvidos na sensibilização
central tenham sido estabelecidos recentemente, aqueles responsáveis pela
sensibilização periférica ainda não foram completamente elucidados.
Entretanto, o conhecimento da biologia molecular acerca dos diversos
receptores e vias transducionais envolvidos na gênese da nocicepção
permitiram um extraordinário progresso no entendimento do mecanismo de
ação de diversos neurotransmissores e, consequentemente, de drogas que
atuam na modulação central e periférica da nocicepção. Os mecanismos
envolvidos na transdução neuroquímica da dor geralmente envolvem a
interação dos mediadores inflamatórios e/ou nociceptivos com canais iônicos
de membrana dependente de voltagem, canais iônicos operados por receptor,
receptores associados à tirosina quinase, ou com receptores de membrana que
usualmente encontram-se acoplados a proteínas G (para revisão ver: RANG et
al., 1994; LEVINE e TAIWO, 1994; WOOD e DOCHERTY, 1997; MILLAN,
1999; PARK e VASKO, 2005).
Os neutrófilos, os eosinófilos, os mastócitos, os macrófagos dentre
outras células são capazes de produzir vários mediadores inflamatórios e/ou
nociceptivos como histamina, serotonina, PGs, leucotrienos (LTs), PAF,
citocinas, quimiocinas, fator de necrose tumoral (TNF-α) e numerosas
proteases entre outros. Estes mediadores podem estar relacionados tanto com
a inflamação quanto com a dor.
30
1.2.2. Alguns mediadores inflamatórios e nociceptivos
Eicosanóides - Os principais eicosanóides envolvidos tanto na geração
da inflamação como também da dor, são os Leucotrienos (LTs) e as
prostaglandinas (PGs). As PGs e os LTs promovem vasodilatação, aumento da
permeabilidade vascular e edema nos sítios de inflamação, enquanto que na
dor podem causar hiperalgesia à estímulos mecânico, químico ou térmico (para
revisão ver: VANE e BOTTING, 1998). Os eicosanóides são produtos do
processamento do ácido araquidônico (AA) que normalmente é encontrado
esterificado a fosfolipídios de membrana, de onde é liberado por ação de
fosfolipases, como a fosfolipase A
2
(PLA
2
). Os AA podem sofrer metabolização
pelas vias das enzimas, ciclooxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX) para
produzir uma grande família de eicosanóides.
A COX é uma enzima bifuncional, com atividade de ácido graxo
(catalisando a conversão do AA em prostaglandina G
2
- PGG
2
) e atividade de
prostaglandina hidroperoxidase (catalisando a conversão da PGG
2
em
prostaglandina H
2
- PGH
2
). A PGH
2
é convertida, através de diferentes enzimas
com especificidade celular, nas prostaglandinas PGE
2
, PGF
2α
, PGD
2
, PGI
2
e no
tromboxano A
2
, entre outras (para revisão ver: VANE e BOTTING, 1998).
Em 1971, VANE demonstrou que o principal mecanismo de ação dos
antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs) era a propriedade de bloquear a
síntese de prostanóides através da inibição da atividade da COX. Este fato
implicou diretamente alguns eicosanóides como pró-inflamatórios. Vários anos
se passaram até a descoberta da existência de pelo menos duas isorformas de
COX envolvidas na ação não específica dos AINEs, a COX-1 e a COX-2. Como
a COX-2 é uma enzima expressa por células envolvidas em processos
31
inflamatórios, foi correlacionada como sendo a maior responsável pela
produção de prostanóides nos processos inflamatórios e dolorosos. As LOXs
originam os LTs, o ácido hidroeicosatetraenóico (HETE) e as lipoxinas. Os LTs
são produzidos, predominantemente, por células inflamatórias como leucócitos
polimorfonucleares, macrófagos e mastócitos.
Fator de Ativação Plaquetário (PAF) - Outra via de ativação é a
hidrólise do ácido araquidônico para formar o lisofosfolipídio. O lisofosfolipídio
pode ser acetilado formando o PAF. O PAF é um potente lipídio bioativo que
atua por ligação específica em receptor acoplado à proteína G (para revisão
ver: ISHII e SHIMIZU, 2000).
O termo PAF foi denominado pelo fato deste lipídeo ser o responsável
pela agregação de plaquetas (para revisão ver: ISHII e SHIMIZU, 2000), além
de ser um dos mais potentes fatores quimiotáxicos in vitro e in vivo
principalmente para eosinófilos e neutrófilos. O PAF apresenta várias funções
patofisiológicas, alguns dos efeitos biológicos do PAF incluem ativação
plaquetária, estimulação neutrofílica, contração da musculatura lisa, aumento
da permeabilidade vascular com formação de edema (para revisão ver: ISHII e
SHIMIZU, 2000). Foi demonstrado que tanto a injeção intraplantar (i.pl.) de PAF
em ratos (DALLOB et al., 1987; BONNET et al., 1981) como a injeção intratecal
em camundongos (MORITA et al, 2004) podem causar alodínia ou hiperalgesia
mecânica. Contudo, o mecanismo de ação pelo qual o PAF exerce suas ações
na dor ainda não está bem estabelecido.
Cininas - As cininas representam um grupo importante de moléculas
envolvidas nas doenças inflamatórias, como na pancreatite, peritonite, artrite
reumatóide, asma, desordens do trato genito-urinário, além de dor e
32
hiperalgesia, e inflamação neurogênica (para revisão ver: CALIXTO et al.,
2004). A produção de cininas, no sítio inflamatório, resulta em vasodilatação,
extravasamento plasmático e aderência de neutrófilos, em conseqüência de
uma ação direta sobre o endotélio da microvasculatura, ou ainda indireta,
através da liberação de outras substâncias pró-inflamatórias.
Estes peptídeos exercem seus efeitos biológicos através da ativação dos
receptores B
1
e B
2
. Enquanto as cininas são os agonistas endógenos para o
receptor B
2
, a des-Arg
9
-BK e a des-Arg
10
-calidina são agonistas preferenciais
para o B
1
. Ambos os receptores pertencem à superfamília de receptores
acoplados à proteína G com sete domínios transmembranares (Gαg/11 e Gαi)
(para revisão ver: CALIXTO et al., 2004). O receptor B
2
é constitutivo e está
presente em tecidos centrais e periféricos. Estes parecem estar implicados na
maioria das ações fisiológicas das cininas. O receptor B
1
é geralmente ausente
em tecidos normais e animais saudáveis, mas pode ser induzido e super
expresso durante uma lesão tecidual ou administração de alguns mediadores
inflamatórios (SIEBECK et al., 1998).
Endotelinas - As endotelinas constituem uma família de peptídeos
sendo eles ET-1, ET-2 e ET-3. As endotelinas exercem suas ações através da
interação com receptores ET
A
, ET
B
ou ET
C
. Estes mediadores peptídicos estão
relacionados ao desenvolvimento de diversos processos fisiopatológicos,
incluindo aqueles que envolvem hipertensão, inflamação e dor, dentre outros
(FILEP et al., 1995; para revisão ver: SCHIFFRIN, 2005). A produção/secreção
de ETs pode ser estimulada, por LPS, Cg, citocinas, fatores de crescimento e
autacóides (KLEMM et al., 1995; para revisão ver: RAE e HENRIQUES, 1998).
A administração destes peptídeos induz contorções abdominais em roedores,
33
hiperalgesia mecânica em ratos e incapacitação articular em cães e ratos
(RAFFA e JACOBY, 1991; FERREIRA et al., 1989; DE-MELO et al., 1998). Em
humanos, tanto a injeção intradérmica como a endovenosa de ET-1 induz
respostas dolorosas (FERREIRA et al., 1989; DAHLOF et al., 1990). A injeção
i.pl. de ET-1 em camundongos induz uma resposta comportamental nociceptiva
per se caracterizada pelo ato de lamber a pata (MENENDEZ et al., 2003;
PIOVEZAN et al., 2000) e induz a formação de edema (PIOVEZAN et al.,
2000), sendo estas respostas dependentes exclusivamente da ativação de
receptores do tipo ET
A
(PIOVEZAN et al., 2000). Entretanto, os mecanismos
envolvidos nas respostas induzidas pela ET-1 permanecem desconhecidos.
1.2.3. Fármacos utilizados no controle da inflamação e da dor
Atualmente, vários medicamentos encontram-se disponíveis para uso
clínico como analgésicos e/ou antiinflamatórios, como os corticosteróides, os
opióides e os AINEs. Os glicocorticóides possuem grande amplitude de ações
farmacológicas, dentre elas, seus efeitos antiinflamatórios e imunosupressores,
inibindo tanto as manifestações iniciais quanto as tardias do processo
inflamatório (para revisão ver: ADCOCK et al., 2005). Apesar destas classes de
substâncias apresentarem excelentes propriedades antiinflamatórias (com
exceção dos opióides) e serem utilizadas na terapêutica clínica, seu uso produz
importantes efeitos colaterais. Tal fato encoraja a busca por substâncias com
menos efeitos indesejáveis e com maior seletividade de ação antiinflamatória
e/ou analgésica.
Em relação aos AINEs, sua principal molécula-alvo é a enzima COX. A
inibição da atividade das COXs (COX-1 constitutiva, COX-2 induzida, ou
34
ambas) é um dos principais mecanismos de ação de diversos fármacos,
analgésicos e antiinflamatórios, especialmente os AINEs como o ácido
acetilsalicílico (aspirina
®
) e a indometacina. Desta forma, seu efeito
antiinflamatório deve-se principalmente à inibição da produção de
prostaglandinas como a prostaglandina E
2
(PGE
2
), PGD
2
e PGI
2
, bem como
dos tromboxanos (TXs)(para revisão ver: SAFAYHI, 1997; FITZGERALD,
2003).
Como a COX-2 é uma enzima expressa por células envolvidas em
processos inflamatórios, foi correlacionada como sendo a maior responsável
pela produção de prostanóides nos processos inflamatórios e dolorosos. A
partir daí a busca por inibidores seletivos de COX-2 se tornou intensa. Assim,
foram desenvolvidos inibidores seletivos da COX-2 da primeira geração,
incluindo o celecoxib (Celebrex
®
; Pharmacia), e o rofecoxib (Vioxx
®
; Merck) que
foram aprovados pela “Food and Drug Administration” (FDA) para o tratamento
da artrite (para revisão ver: FITZGERALD, 2003). Foram desenvolvidos
também os inibidores seletivos para COX-2 de segunda geração como o
valdecoxib
®
(Bextra; Pfizer), etoricoxib
®
(Arcoxia; Merck) e o lumiracoxib
®
(Prexige; Novartis) (para revisão ver: FITZGERALD, 2003).
Entretanto, um estudo demonstrava que o Vioxx poderia causar sérios
eventos cardiovasculares como ataque cardíaco e infarto (BOMBARDIER et al.,
2002). Apesar disto, a comercialização do Vioxx continuou e após 18 meses de
uso contínuo, vários indivíduos experimentaram os eventos cardiovasculares
descritos acima. FITZGERALD (2003) demonstrou que rofecoxib e o celecoxib
reduziam além dos níveis de PGE
2
, os níveis de prostaciclina (PGI
2
).
Anteriormente, a produção da PGI
2
parecia ser realizada somente pela COX-1,
35
entretanto esta proposição estava completamente errada, uma vez que foi
demonstrado que a COX-2 é a principal produtora de PGI
2
(para revisão ver:
FITZGERALD, 2004). A PGI
2
pode causar inibição da agregação plaquetária,
indução da vasodilatação e prevenção à proliferação cardiovascular em células
musculares lisas in vitro. Os inibidores não seletivos de COX inibem tanto
síntese de PGI
2
como também de tromboxano A
2
, enquanto que os inibidores
seletivos da COX-2 inibem somente a produção da PGI
2
. A produção de
tromboxano A
2
fica intacta podendo induzir a agregação plaquetária,
vasoconstrição e proliferação vascular. Em longo prazo a redução da PGI
2
e o
aumento da tromboxano devem predispor os pacientes ao risco de infarto do
miocárdio e outros problemas cardiovasculares. Assim, a Merck anunciou a
retirada voluntária do mercado, em todo o mundo, do medicamento Vioxx,
indicado para o tratamento da artrite e dor aguda.
Por outro lado, o mecanismo pelo qual atuam os fármacos
antiinflamatórios esteroidais, como a dexametasona e a hidrocortisona, está
relacionado principalmente à inibição da migração celular para a área afetada,
através da supressão da expressão de moléculas de adesão, ou da indução da
síntese de uma proteína inibidora de fosfolipase A
2
(enzima responsável pela
liberação de ácido araquidônico e consequentemente da ativação da produção
de PGs, tromboxano e leucotrienos) a anexina-1 (também conhecida como
lipocortina). Um outro mecanismo de ação dos corticosteróides ocorre através
da ativação de receptores nucleares para glicocorticóides que regulam a
transcrição de alguns genes de resposta primária, incluindo os que expressam
a COX-2 e o óxido nítrico sintase. O complexo esteróide-receptor também é
capaz de promover inibição da transcrição de um grande número de citocinas
36
envolvidas na inflamação crônica, destacando-se principalmente a interleucina-
1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral (TNF-α). Além disso, os corticosteróides
podem ainda promover uma repressão da síntese dos receptores das citocinas,
como dos receptores da IL-2 (para revisão ver: BARNES e ADCOK, 1993;
FLOWER e ROTHWELL, 1994; VANE e BOTTING, 1998; MILLAN, 1999).
Além disso, outros mecanismos de ação podem ser evidenciados para
drogas analgésicas e antiinflamatórias como: 1) atuação como falsos
substratos: análogos de precursores naturais dos ácidos graxos podem servir
de inibidores competitivos da formação de PGs e produtos da ação das
lipoxigenases; 2) Atuação em receptores de mediadores inflamatórios; 3)
bloqueio de canais de cálcio ou inibindo a calmodulina, diminuindo, assim, a
liberação de ácido araquidônico e sua conseqüente metabolização; 4) inibição
de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio e a peroxidação lipídica; 5)
atuação também por imunossupressão ou por imunoestimulação, estimulando
a fagocitose e assim, promovendo aumento da remoção de moléculas que
provocam danos ao tecido afetado.
Assim sendo, o presente estudo procurou investigar através de testes
farmacológicos in vivo e in vitro as possíveis ações antinociceptivas e
antiinflamatórias de extratos, frações e lignanas isoladas do P. amarus,
analisando também seus possíveis mecanismos de ação.
37
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar se o
extrato hexânico (EH), as frações derivadas do EH, bem como as lignanas
filtetralina, nirtetralina, nirantina, hipofilantina e filantina obtidos do P. amarus
apresentam efeito anti-nociceptivo e/ou antiinflamatório em modelos
experimentais. Além disso, também constitui objetivo do presente estudo
investigar, com auxílio de técnicas farmacológicas e de dosagens bioquímicas,
alguns dos mecanismos que poderiam estar correlacionados às ações
antinociceptivas e/ou antiinflamatórias do EH, das frações e das lignanas.
2.2. Objetivos específicos
- Avaliar se o tratamento prolongado com o EH ou com a fração rica em
lignanas (FRL) obtidos do P. amarus apresenta ações anti-nociceptiva e/ou
antiinflamatória em modelos experimentais de dor e inflamação.
- Avaliar se a atividade anti-nociceptiva e/ou antiinflamatória do EH se
correlaciona com as frações do EH (fração 1, fração 2, fração 3 e FRL) obtidos
do P. amarus em modelos experimentais de dor e inflamação.
- Avaliar a ação do EH, FRL e das lignanas obtidos do P. amarus em relação a
parâmetros inflamatórios como edema, aumento da atividade da
mieloperoxidase, aumento da IL-1β e a alteração na expressão da enzima
COX-2 induzidos pela carragenina.
- Avaliar se o efeito anti-nociceptivo e/ou antiinflamatório do EH, da FRL, ou
das lignanas obtidas do P. amarus estariam relacionados com a interação
direta ou indireta sobre mediadores inflamatórios, como a ET-1, PAF ou BK.
38
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Análises fitoquímicas
3.1.1. Isolamento, identificação química e rendimento dos constituintes do
P. amarus
A planta P. amarus foi cultivada no Centro de Pesquisas Químicas,
Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da UNICAMP (Campinas, SP) e identificada
botanicamente pela Dra. Grady L. Webster (Departamento de botânica,
Universidade da Califórnia, Davis, EUA), sendo que uma excicata (Phyllanthus
amarus Schumach & Thonn.) foi depositada no herbário do Instituto de Biologia
da UNICAMP (Campinas, SP) com o código UEC 127.411.
Os estudos de análises fitoquímicas, isolamento e identificação de
compostos isolados foram realizados pela Dra. Vera L. G. Rehder (CPQBA-
UNICAMP) como previamente descrito (ANJANEYULU et al., 1973;
SOMANABANDHU et al., 1993). Inicialmente foram analisados
farmacologicamente o extrato hexânico (EH), bem como as frações: FRL (F4-5,
fração rica em lignanas), F1 (fração 1), F2 (fração ácidos, rica em ácidos de
cadeia longa) e a F3 (fração 3). Posteriormente, as lignanas isoladas filtetralina,
nirtetralina, nirantina, hipofilantina e filantina (peso molecular: 416, 430, 432,
430 e 430, respectivamente) também foram avaliadas.
O EH do P. amarus foi preparado pela extração do material pulverizado,
com um rendimento de 5,5%. A FRL apresentou rendimento de 25% a partir do
EH. As lignanas presentes na FRL foram purificadas por métodos
cromatográficos. Os rendimentos obtidos na etapa de purificação das lignanas
39
foram de 1,9% para filtetralina; 0,8% para nirtetralina; 1,9% para nirantina;
5,9% para hipofilantina e 13,7% para filantina.
3.2. Avaliação farmacológica
3.2.1. Animais
Para a realização dos experimentos foram utilizados camundongos
suíços machos (25-35 g) e ratos Wistar machos (160-250 g) mantidos no
Biotério Setorial do Departamento de Farmacologia, em temperatura (22 ± 2
°C) e umidade controlada (60-80%), ciclo claro/escuro de 12 horas e com livre
acesso a água e ração. Os animais foram retirados do biotério e mantidos no
laboratório para adaptação por um período de pelo menos 1 h antes do início
dos experimentos, sendo utilizados somente uma vez em cada teste. Os
experimentos foram conduzidos de acordo com as orientações para os
cuidados com animais de laboratório e considerações éticas com os protocolos
experimentais aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da
Universidade Federal de Santa Catarina (processo n°263/CEUA).
3.2.2. Modelos experimentais de dor
3.2.2.1. Alodínia mecânica induzida pelo adjuvante completo de Freund
(CFA)
O modelo de alodínia mecânica persistente causada pela injeção
intraplantar contendo 20 µl de solução do adjuvante completo de Freund (CFA)
40
foi utilizado para avaliar o possível efeito anti-alodínico do EH ou da FRL
obtidos de P. amarus.
Os camundongos foram colocados em caixas de acrílico transparente
sobre uma plataforma com fundo de tela de arame durante 2 horas para a
aclimatização, sendo a reatividade basal ou a alodínia mecânica avaliadas pelo
contato da pata traseira com filamentos de von Frey (Stoelting, Chicago, EUA)
de 0,4 g. A estimulação basal dos animais (antes da injeção de CFA) com
filamento de von Frey de 0,4 g resultou em uma freqüência de retirada da pata
em torno de 20%. Os animais foram estimulados por 10 aplicações
consecutivas de 1 segundo (BORTOLANZA et al., 2002).
Assim, no dia anterior à aplicação de CFA a resposta basal de todos os
animais foi avaliada. Dez horas após a injeção do CFA verificou-se o
aparecimento da alodínia mecânica. Logo após a constatação do
desenvolvimento da alodínia mecânica, os animais foram tratados por via oral
com o EH ou com a FRL obtidos do P. amarus (100 mg/kg, 2 vezes ao dia),
enquanto que o grupo controle recebeu apenas o veículo (1% de Tween 80)
por administração oral. Seis horas após a primeira dose de tratamento, a
alodínia mecânica foi avaliada em intervalos de 24 horas (aproximadamente às
14:00 h de cada dia), até o 15
o
dia do experimento. Os animais foram tratados
com o EH e a FRL obtidos de P. amarus ou com o veículo, do 2
o
ao 6
o
dia
(após a injeção de CFA) com uma pausa do 7
o
ao 11
o
dia, recebendo
novamente o tratamento entre o 12
o
e o 15
o
dia.
41
3.2.2.2. Lesão parcial do nervo ciático
Para realização deste experimento foram utilizados camundongos
machos, previamente anestesiados por via intraperitoneal com hidrato de cloral
7 % (10 ml/kg). Brevemente, foi feita uma incisão na coxa, o nervo ciático foi
exposto próximo à trifurcação ciática e ligado em volta de aproximadamente 1/3
a 1/2 da porção dorsal, com fio de sutura 8.0, conforme o procedimento
descrito em ratos por SELTZER et al. (1990) e adaptado para camundongos
por MALMBERG e BASBAUM (1998). Em um grupo separado de animais, o
nervo ciático foi exposto, mas não envolto com fio de sutura (falso-operados).
No dia anterior à cirurgia, os animais foram submetidos ao teste de Von
Frey (filamento 0,4) para caracterização da resposta basal e a medida foi
realizada conforme descrito no item anterior.
Cinco dias após a cirugia, foi verificado o aparecimento da alodínia
mecânica. Uma vez estabelecida alodínia, os animais foram tratados por via
oral com o EH ou com a FRL obtidos do P. amarus (100 mg/kg, 2 vezes ao
dia), a gabapentina (70 mg/kg, 2 vezes ao dia), ou somente o veículo (1% de
Tween 80). A alodínia mecânica foi então avaliada a partir da sexta hora após a
primeira dose de tratamento e a cada 24 horas (aproximadamente às 14:00 h
de cada dia), até o 20
o
dia do experimento. Os animais foram tratados com o
EH ou com a FRL obtidos de P. amarus ou com o veículo, do 7
o
ao 11
o
dia
(após a mononeuropatia) com uma pausa do 11
o
ao 15
o
dia, recebendo
novamente o tratamento entre o 15
o
e o 19
o
dia.
42
3.2.2.3. Alodínia mecânica induzida PAF
A alodínia mecânica induzida pelo PAF foi avaliada de forma similar
àquela descrita para avaliação da reatividade basal ou da alodínia mecânica
induzida pela injeção intraplantar de CFA em camundongos, sendo modificada
de BORTOLANZA et al. (2002) para ratos. Assim, após a aclimatização e
medida do basal da freqüência de retirada com filamento de von Frey de 2,0 g,
grupos distintos de ratos receberam uma injeção i.pl. de PAF (10 nmol/pata)
em conjunto com a nirantina (60 nmol/pata) ou com o antagonista de receptor
para PAF, o WEB2170 (30 nmol/pata). A alodínia mecânica foi avaliada em
diferentes intervalos de tempo (0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 h) após a injeção do PAF. O
aparecimento da alodínia mecânica foi verificada após a primeira medida da
freqüência de retirada da pata decorrente da estimulação com o filamento de
Von Frey.
3.2.2.4. Alodínia mecânica induzida pela carragenina (Cg)
Neste modelo, a avaliação do limiar nociceptivo por estimulação
mecânica foi realizada antes (basal) e 3 h após a injeção i.pl. de Cg (300
µg/pata) pelo método de up and down (DIXON, 1991). Este método foi
padronizado para medir (em mg) o limiar da alodínia mecânica de cada
camundongo seguindo a metodologia descrita por CHAPLAN et al. (1994). Os
camundongos foram colocados em caixas de acrílico transparente sobre uma
plataforma com fundo de tela de arame, possibilitando o acesso da pata
traseira do animal com os filamentos de von Frey. Após a aclimatização dos
animais, foi utilizada uma série de filamentos de 0,008 a 6,0 g aplicados em
ordem crescente ou decrescente para determinar 50% do limiar de retirada da
43
pata (limiar 50%) (DIXON, 1991). O primeiro filamento da série testado foi o de
0,4 g na pata posterior direita. Foram realizadas 6 avaliações com intervalos de
10 s. A ausência de resposta levou à utilização de outro filamento de maior
massa e assim sucessivamente. Havendo retirada ou lambida da pata pelo
animal, um filamento de menor massa foi aplicado após um intervalo de 2 min.
O limiar de retirada da pata (50% do limiar) foi calculado de acordo com Dixon
(1991).
Para a avaliação da medida do limiar nociceptivo, os camundongos
foram tratados via oral com EH, FRL, F1, F2 ou F3 (100 mg/kg) ou somente
com veículo (1% de Tween 80) (0,1 ml/10 g). Uma hora depois, os animais
receberam na pata direita, 20 µl de Cg (300 µg/pata) diluída em salina
tamponada com fosfato (PBS, composição mmol/L: NaCl 137, KCl 2,7 e
tampão fosfato 10) ou somente PBS.
3.2.2.5. Nocicepção induzida pela formalina
Uma hora antes da indução da nocicepção espontânea, os animais
receberam por via oral EH, FRL, F1, F2, F3 (100 mg/kg), aspirina (300 mg/kg)
ou somente com veículo (1% de Tween 80) (0,1 ml/10 g).
O procedimento foi realizado conforme descrito por HUNSKAAR et al.
(1985). Os animais foram colocados individualmente sob funis de vidro
transparente por um período de adaptação de no mínimo 20 min. Em seguida,
cada animal recebeu uma injeção i.pl. contendo 20 µl de solução de formalina a
2,5 % (0,92 % de formaldeído) na pata posterior direita. Logo após a injeção da
formalina, os animais foram colocados individualmente, sob funil de vidro
invertido, ao lado de um espelho para facilitar a observação. O tempo que
44
animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina foi
avaliado durante 30 min, sendo este período considerado indicativo de
nocicepção. Este modelo permite avaliar duas fases de sensibilidade dolorosa:
a primeira fase, que ocorre durante os primeiros 5 min após a injeção de
formalina (dor de origem neurogênica); e a segunda fase, que ocorre entre 15 a
30 min após a formalina, representando a resposta tônica à dor, acompanhada
de uma resposta inflamatória, ambas as fases estão relacionadas à liberação
de mediadores inflamatórios (HUNSKAAR e HOLE, 1987).
3.2.2.6. Nocicepção induzida pela capsaicina
Uma hora antes da indução da nocicepção espontânea, grupos de
camundongos foram tratados por via oral com o EH, F2 ou F3 (100 mg/kg) ou
somente com veículo (1% de Tween 80) (0,1 ml/10 g). Como controle positivo,
os animais foram tratados com a injeção subcutânea de capsaicina (20
µmol/kg) 30 min antes da indução da nocicepção espontânea.
Este modelo permite avaliar a nocicepção de origem neurogênica. O
procedimento foi realizado conforme descrito por SAKURADA et al. (1992) para
estudos de compostos que atuam sobre a dor de origem neurogênica. Os
animais foram colocados individualmente sob funis de vidro transparente por
um período de adaptação de no mínimo 20 min. Em seguida, cada animal
recebeu uma injeção i.pl. contendo 20 µl de solução de capsaicina (1 nmol) ou
do veículo, na pata posterior direita. O tempo em que o animal permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada com capsaicina foi cronometrado por
um período de 5 min e considerado como indicativo de nocicepção.
45
3.2.2.7. Nocicepção induzida pela endotelina-1 (ET-1)
O procedimento foi realizado conforme descrito por PIOVEZAN et al.
(2000). Os animais foram colocados individualmente sob funis de vidro
transparente por um período de adaptação de no mínimo 20 min. Em seguida,
cada animal recebeu uma injeção i.pl. contendo 20 µl de solução de ET-1 (100
pmol) com veículo (0,15% de etanol) ou somente com o veículo. O tempo em
que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com ET-1 foi
cronometrado por um período de 20 min e considerado como indicativo de
nocicepção. Grupos distintos de camundongos receberam co-tratamento via
i.pl. com filtetralina ou nirantina (30 nmol/pata), ou BQ-123 (antagonista de
receptor ET
A
) ou nirtetralina (1 nmol/pata).
3.2.3. Modelos experimentais de inflamação
3.2.3.1. Edema induzido pelo CFA
O edema persistente causado pela injeção i.pl. contendo 20 µl de
solução com o CFA na pata direita de camundongos foi utilizado para avaliar o
possível efeito antiedematogênico do EH e da FRL obtidos de P. amarus.
O edema de pata induzido pelo CFA foi medido inicialmente após dez
horas da injeção. Após a primeira medida, os camundongos foram tratados
com o EH ou com a FRL de P. amarus ou com o veículo. As medidas foram
feitas 1 vez ao dia (aproximadamente às 14:00 h), até o 15
o
dia após a
aplicação de CFA. Com o início do tratamento, os animais foram avaliados 6 h
após a primeira dose do dia. O tratamento seguiu do 2
o
ao 6
o
dia (após a
injeção do CFA), reiniciou no 12
o
e seguiu até o 15
o
dia. O aumento de volume
46
da pata foi medido com pletismômetro (Ugo Basile). A diferença entre o volume
das patas direita e esquerda foi quantificada (em µl) e tomada com índice de
edema de acordo com a técnica descrita para medida em pletismômetro por
FERREIRA et al. (1978) e modificada para camundongos por HENRIQUES et
al. (1987).
3.2.3.2. Edema induzido por outros agentes inflamatórios
Grupos distintos de camundongos foram tratados por via oral com o
EH, FRL, F1, F2 ou F3 (100 mg/kg), filtetralina (até 100 µmol ou 41,6 mg/kg),
nirtetralina (até 100 µmol ou 43,0 mg/kg), nirantina (até 100 µmol ou 43,0
mg/kg), filantina (até 100 µmol ou 41,8 mg/kg), hipofilantina (até 100 µmol ou
43,0 mg/kg) ou com veículo. Após uma hora, os animais receberam na pata
direita 20 µl de PBS contendo um dos agentes inflamatórios: Cg (300 µg), BK
(3 nmol), substância P (30 nmol), ET-1 (30 pmol), histamina (100 nmol) ou
PAF (3 nmol). Além do tratamento via oral, grupos distintos de camundongos
receberam também as lignanas filtetralina, nirtetralina ou nirantina
concomitantemente a injeção com os agentes inflamatórios (Cg, PAF ou ET-1)
via intraplantar (0,3-30 nmol/pata). A pata esquerda recebeu o mesmo volume
de PBS e foi utilizada como controle. O aumento de volume da pata foi medido
conforme descrito no item anterior. A porcentagem de inibição foi calculada 15
(apenas para ET-1), ou 60 min após a injeção i.pl. dos agentes inflamatórios.
Nos experimentos com BK, os animais foram pré-tratados com um inibidor da
cininase II, o captopril (5 mg/kg, 1 h, s.c), a fim de evitar a degradação das
cininas (Corrêa e Calixto, 1993).
47
Outros grupos de experimentos foram realizados com o intuito de
comparar os efeitos dos tratamentos testados com a ação antiinflamatória de
drogas conhecidas. Assim, os animais foram tratados com a dexametasona
(DEX, 0,5 mg/kg, via subscutânea 4 horas antes da injeção i.pl. da Cg), a
aspirina (300 mg/kg, via oral 1 hora antes da injeção i.pl. da Cg), o BQ-123 (1
nmol/pata, concomitantemente com a injeção i.pl. da ET-1) ou o WEB2170 (30
nmol/pata, concomitantemente com a injeção i.pl. do PAF).
3.2.3.3. Pleurisia induzida pelo PAF
Uma hora antes da indução da pleurisia, os camundongos foram
tratados por via oral com a nirantina (100 µmol/kg) ou por via intraperitoneal
com o antagonista de PAF, o WEB2170 (8 mg/kg). A pleurisia foi realizada
como descrito previamente por SPECTOR (1956) e modificada para
camundongos (HENRIQUES et al., 1990). Para a indução da pleurisia, o PAF
(1,9 nmol/cavidade em 100µL) foi administrado por via intratorácica no lado
direito da cavidade pleural do camundongo utilizando-se uma agulha adaptada.
Outro grupo distinto de animais recebeu injeção intratorácica de salina estéril e
foi utilizado como controle. Os animais foram sacrificados 3 h após a injeção de
PAF, sendo a cavidade pleural aberta e lavada com 1 ml de PBS contendo
heparina (10 UI/mL).
Quantificação da exsudação protéica – O volume de exsudação foi
medido utilizando-se uma pipeta automática e o valor multiplicado pela
quantidade de proteínas totais por ml, quantificada pelo método de Bradford,
(BRADFORD, 1976) para obtenção do valor total de proteína por cavidade.
48
3.2.4. Medidas relacionadas ao processo inflamatório ou doloroso
3.2.4.1. Atividade da mieloperoxidase (MPO)
Para avaliação indireta do acúmulo de neutrófilos, grupos de
camundongos receberam tratamento oral com o EH ou com a FRL (100
mg/kg), filtetralina, nirtetralina, nirantina (100 µmol/kg) ou com o veículo uma
hora antes da injeção i.pl. de Cg, ou com DEX (0,5 mg/kg, tratamento
subcutâneo) 4 h antes da Cg. Outros grupos de animais foram tratados com a
nirantina (30 nmol/pata) ou o WEB2170 (30 nmol/pata) concomitantemente
com a injeção i.pl. de PAF (3 nmol/pata). Grupo distinto de animais recebeu
somente injeção i.pl. de PBS. Seis horas após a injeção de Cg, ou 1, 2, 3 ou 4
horas após a injeção de PAF, ou somente do PBS, os animais foram
sacrificados e a pele das suas patas foi removida. As amostras para a medida
da atividade da MPO foram preparadas como descrito por DE YOUNG et al.
(1989). Os tecidos foram homogeneizados em 0,5 ml de tampão fosfato (80
mM, pH de 5,4) contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio e
centrifugado 12000 g, por 15 min, a 4 ºC. Trinta µl de sobrenadante das
amostras foram pipetados em uma microplaca de 96 poços. Para o ensaio,
200 µl de uma solução contendo 100 µl PBS (80 mM, pH de 5,4), 85 µl de
PBS (0,22 M, pH de 5,4) e 15 µl de peróxido de hidrogênio (0,017%) foram
adicionados em cada poço. A reação foi iniciada pela adição de 20 µl de
tetrametilbenzidina (18,4 mM, em 8% de dimetilformamida). A placa foi
incubada a 37 ºC por 3 minutos e a reação foi terminada pela adição de 30 µl
de acetado de sódio (1,46 M, pH de 3,0). A atividade enzimática foi
determinada colorimetricamente e expressa como mDO/mg proteína, sendo
49
utilizado um leitor de ELISA (EL808, Bio-Tek Instruments, Inc.) com filtro de
630 nm. Os experimentos foram realizados 3 vezes em duplicatas. A
determinação protéica dos homogenatos foi feita através da absorção
ultravioleta no comprimento de onda de 280 nm em cubetas de quartzo,
assumindo que 1 unidade de absorbância 280 nm=1 mg de proteína.
3.2.4.2. Quantificação da Interleucina-1β (IL-1β)
Grupos distintos de camundongos receberam tratamento oral com o EH,
com a FRL (100 mg/kg), filtetralina, nirtetralina, nirantina (100 µmol/kg) ou
veículo uma hora antes da injeção i.pl. de Cg. Como controle positivo, a DEX
(0,5 mg/kg, injeção subcutânea) foi administrada 4 h antes da Cg. Grupo
distinto de animais recebeu somente injeção i.pl. de PBS. Os animais foram
sacrificados 6 h após a indução do edema de pata pela Cg. Para a
quantificação dos níveis de IL-1β foi utilizado um protocolo previamente
descrito por PINHEIRO e CALIXTO (2002) com pequenas modificações. Assim,
a pele das suas patas posteriores foi removida e homogeneizada em um
tampão PBS contendo 0,05% de Tween 20, 0,1 mM de fluoreto de
fenitilmetilsulfonil (PMSF), 0,1 mM cloreto de benzametônio, 10 mM de ácido
etilenodiaminotetracético e 20 µM de aprotinina e centrifugado a 3000 g por 10
min. O sobrenadante foi coletado e estocado para posterior análise (-70 ºC). Os
níveis teciduais de IL-1β foram quantificados utilizando um kit de ELISA (R&D
System, EUA), segundo as instruções do fabricante.
50
3.2.4.3. Ensaio de união específica para [
3
H]-PAF em córtex cerebral de
camundongos
O ensaio de união específica para o [
3
H]-PAF foi realizado como
descrito previamente por MARCHESELLI et al. (1990). Para a obtenção das
membranas, os córtices cerebrais de camundongos foram removidos e
homogeneizados em tampão gelado (pH de 7,4) contendo: 50 mM de Tris-HCl;
250 mM sacarose; 2 mM EGTA; 5 mM MgCl
2
; 0,1 mM PMSF; 10 µg/ml de
aprotinina. O homogenato foi primeiramente centrifugado por 10 minutos, 272
g, a 4 ºC. O sobrenadante foi centrifugado a 1000 g por 10 min, a 4 ºC.
Novamente, o sobrenadante foi centrifugado a 12000 g por 20 min, a 4 ºC. O
precipitado resultante foi ressuspenso no tampão descrito acima. O
experimento foi realizado em duplicata, com volume final de 500 µl, em tampão
(pH de 7,4) contendo: 10 mM de Tris-HCl; 5 mM MgCl
2
; 2 mM EGTA, 0,1 mM
PMSF; 10 µg/ml de aprotinina, com 0,25 mg/ml de BSA, contendo a preparação
de membranas de córtex cerebral de camundongos (90 µg/proteína) e 1 nM de
[
3
H]-PAF na presença ou ausência de EH ou da FRL (100 µg/ml), filtetralina,
nirtetralina, nirantina ou WEB2170 (0,1 - 100 µM), ou de PAF não radioativo (1
nM, união inespecífica). Após 30 min de incubação (25 ºC), a reação foi
interrompida por filtração. Os filtros foram lavados três vezes com 2 ml de
tampão gelado e colocados em frascos de vidro contendo líquido de cintilação
para posterior leitura. A união específica foi calculada como a diferença entre
os valores de união total e inespecífica. Este ensaio foi realizado em duplicata
de 4 experimentos diferentes.
51
3.2.4.4. Ensaio de união específica para [
3
H]-BK em íleo de ratos
Os experimentos foram realizados conforme descrito por MANNING et
al. (1986). Ratos machos foram sacrificados e tiveram os íleos retirados e
imersos em tampão TES 25 mM (pH de 6,8) contendo fenantrolina 1 mM
(tampão A). O tecido foi homogeneizado em tampão de sacarose (0,25 M) e
centrifugado (2500 g) por 10 min a 4 ºC. O precipitado formado foi ressuspenso
e centrifugado por 2500 g por 10 min a 4 ºC. Os sobrenadantes resultantes da
primeira e da segunda centrifugação foram misturados, sendo esta mistura
centrifugada a 47000 g por 30 min a 4 ºC. O pellet resultante foi ressuspenso
em tampão TES 25 mM (pH de 6,8) contendo fenantrolina 1 mM, bacitracina
140 µg/ ml, captopril 1 mM, ditiotreitol 1 mM e BSA 1%. Os ensaios de união
específica de [
3
H]-BK foram realizados em duplicata em um volume total de
350 µl contendo 125 µl de membrana (0,4 mg de proteína), tampão B e 1,0 nM
de ligante radioativo [
3
H]-BK na presença e na ausência do EH ou da FRL (300
µg/ml), ou BK não radioativa (1 µM, união inespecífica). Após 90 min de
incubação (25 ºC), a reação foi interrompida por filtração. Os filtros foram
lavados oito vezes com 1 ml de tampão TRIS/ HCl 50 mM (pH de 7,4) gelado e
colocados em frascos de vidro contendo líquido de cintilação para posterior
leitura em cintilador beta (Packard, modelo Tri-Carb 1600 TR). A união
específica foi calculada como a diferença entre os valores de união total e
inespecífica. Este ensaio foi realizado em duplicata de 3 experimentos
diferentes.
52
3.2.4.5. Ensaio de união específica para [
3
H]-resiniferatoxina (RTX) em
medula espinhal de ratos
O ensaio de união específica para a [
3
H]-RTX foi realizado como
descrito previamente por SZALLASI et al. (1998). Para a obtenção das
membranas, a medula espinhal de ratos foi removida e homogeneizada em
tampão de homogeneização gelado (pH de 7,4) contendo: 5 mM de KCl; 5,8
mM de NaCl; 2 mM de MgCl
2
; 0,75 mM de CaCl
2
; 12 mM de glicose; 137 de
sacarose e 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanesulfônico
(HEPES). O homogenato foi primeiramente centrifugado por 10 minutos, a
1000 g, 4 ºC. O precipitado resultante foi descartado e o sobrenadante
centrifugado a 35000 g por 30 min, a 4 ºC. O precipitado resultante foi
ressuspenso em tampão de homogeneização e estocado a –70 ºC, até o dia do
experimento.
O experimento foi realizado em duplicata, com volume final de 500 µl,
contendo tampão de homogenização, com 0,25 mg/ml de BSA, membrana (100
µg/proteína), 50 pM de [
3
H]-RTX, na presença e na ausência do EH ou da F3
(100 µg/ml) ou da capsaicina (3 µM). Para a medida da união inespecífica, 100
nM de RTX não-radioativa foram adicionados aos tubos. A reação de união
específica foi iniciada com a transferência dos tubos para um banho com água
a 37 ºC. Sessenta minutos após a incubação, a reação foi finalizada pela
transferência dos tubos para um recipiente contendo gelo. Cem microgramas
de glicoproteína ácida bovina α
1
foram adicionados em cada tubo para reduzir
a união inespecífica. Finalmente, o radioligante ligado e livre foi separado por
centrifugação por 15 minutos, a 20000 g, a 4 ºC. A radioatividade foi medida no
precipitado obtido, por contagem em cintilador. A união específica foi calculada
53
como a diferença da união total e inespecífica. Este ensaio foi realizado em
duplicata de 3 experimentos diferentes.
3.2.4.6. Expressão da enzima COX-2 pelo ensaio de Western Blot
Grupos distintos de camundongos receberam o tratamento oral com o
EH ou a FRL (100 mg/kg), filtetralina, nirtetralina, nirantina (100 µmol/kg) ou
veículo 1 h antes da Cg, ou uma injeção subcutânea de DEX (0,5 mg/kg) 4 h
antes da Cg. Os animais foram sacrificados 6 h após a injeção de Cg, sendo o
material processado seguindo a metologia descrita por LEAL et al. (2002). O
tecido subcutâneo da pata foi removido e homogenizado em tampão de lise
gelado (HEPES 10 mM (pH de 7,9)), contendo: 1,5 mM de MgCl
2
, 10 mM de
KCl, 0,5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 0,5 mM de ditiotreitol, 50
mM de NaF 2 mM de Na
3
VO
4
e 10 µg/ml de aprotinina), para obtenção do
extrato citossólico (Sabourin et al., 2002). O homogenato foi centrifugado a
10000 g por 30 min e o sobrenadante foi separado como a fração citossólica
das preparações. A determinação da concentração de proteínas das amostras
foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). As frações
citossólicas dos extratos obtidos foram submetidas à eletroforese em gel
desnaturante e SDS-poliacrilamida (10-12%) e transferidas para membrana de
fluoreto de polivinilideno. Após a transferência, a membrana foi bloqueada e
posteriormente incubada com anticorpo policlonal para a COX-2. A
visualização das proteínas foi realizada utilizando anticorpo secundário
específico conjugado à peroxidase e as bandas imunorreativas foram
visualizadas usando-se um kit de quimioluminescência (ECL, Amersham
Pharmacia Biotech, Inglaterra) e filme radiográfico.
54
3.2.5. Drogas e reagentes
Foram utilizadas as seguintes drogas ou sais: carragenina (lambda IV),
bradicinina, aspirina, histamina, adjuvante completo de Freund (CFA),
capsaicina, WEB2170, AM281, aprotinina A, albumina sérica bovina (BSA),
cloreto de benzametônio, ácido etilenodiaminotetracético, dexametasona,
aspirina, brometo de hexadeciltrimetilamônio, tetrametilbenzidina, peróxido de
hidrogênio, anticorpo policlonal de coelho contra a iNOS, Tween 80, Fluoreto
de fenilmetilsulfonila, Trizma, sucrose, ditiotreirol, Fluoreto de fenilmetilsulfonil,
EGTA, cloreto de benzametônio e α
1
glicoproteína ácida bovina foram
adquiridos da Sigma (E.U.A.), [
3
H]-fator de ativação plaquetária foi obtido da
Amersham (UK), o fator de ativação plaquetária foi obtido da Bachem
Bioscience Inc. (EUA); substância P foi obtida da Tocris (Reino Unido);
endotelina-1 e BQ-123 foram adquiridos da American Peptide Co (E.U.A.),
dimetilformamida e formaldeído foram obtidos da Merck Biosciences
(Alemanha), o hidrato de cloral foi adquirido da Vetec (Brasil), a gabapentina foi
obtida da Neurontin (Park-Davis, Brasil); anticorpo policlonal de boi contra a
COX-2, anticorpo policlonal de cabra contra a actina e anticorpo anti IgG de
coelho, de boi e de cabra ligados à peroxidase (Santa Cruz Biotechnology,
EUA). A membrana de PVDF foi adquirida da Millipore (E.U.A.). O kit de ELISA
para a IL-1β foi adquirido da R&D systems (E.U.A.). A [
3
H]-RTX foi obtida da
Perkin Elmer Life Sciences (EUA). O restante dos sais e compostos foram
adquiridos de companhias com comprovada certificação de qualidade.
As soluções estoque (0,1-1 M) para a maioria da drogas, inclusive as
lignanas purificadas, foram preparadas em etanol ou dimetilsulfóxido (DMSO),
exceto para o WEB2170 que foi diluído em DMSO. O PAF foi preparado em
55
solução de BSA 0,1%. Todas as drogas foram armazenadas em tubos
siliconizados, mantidas a -20 ºC (quando necessário) e diluídas na
concentração desejada no dia dos experimentos. As concentrações finais de
etanol ou de DMSO, quando aplicados separadamente, não apresentaram
nenhum efeito significativo em alterar as respostas inflamatórias ou
nociceptivas ou as respostas in vitro.
3.2.6. Análise Estatística
Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média
(EPM), exceto para os valores das DI
50
ou de CI
50
(dose ou concentração do
EH, FRL, lignanas ou do WEB2170 necessárias para reduzir em 50% as
respostas inflamatórias em relação ao grupo controle ou de deslocamento da
união específica de [
3
H]-PAF em membranas de córtex cerebral de
camnundongos) que são representados como a média geométrica
acompanhada de seu respectivo intervalo de confiança de 95%. Os dados
foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do
teste de Student-Newman Keuls ou de Dunnett. Valores de P menores do que
0,05 (P < 0,05) foram considerados como indicativos de significância. Para os
experimentos de união específica, a curva concentração-resposta de
deslocamento foi expressa como porcentagem (%) do controle. A análise
estatística foi realizada pelo teste t de Student. A concentração dos compostos
que produziu 50% do efeito máximo (IC
50
) foi obtida pelo programa GraphPad
Prism Software, San Diego, CA, U.S.A.
56
4. RESULTADOS
4.1. Efeito antiinflamatório e anti-nociceptivo de extrato hexânico e
frações obtidos do P. amarus
4.1.1. Efeito na alodínia mecânica induzida pelo CFA
A injeção i.pl. de CFA foi capaz de induzir uma alodínia mecânica de
longa duração em camundongos, caracterizada pelo aumento significativo na
freqüência de retirada da pata após estimulação mecânica com filamento de
Von Frey (Figura 3A). A alodínia mecânica foi observada a partir do 1
o
dia
após a aplicação de CFA e persistiu por pelo menos 15 dias. O tratamento
diário com o EH (100 mg/kg, 2 vezes ao dia, v.o.), diminuiu significativamente a
alodínia mecânica a partir do 1
o
dia de tratamento com o EH e atingiu uma
inibição máxima de 76±7 % o 4
o
dia. A suspensão do tratamento com o EH no
6
o
dia após a injeção de CFA, re-estabeleceu a alodínia mecânica em 2 dias. O
tratamento com o EH foi reiniciado no 12
o
dia após o CFA e mantido até o 15
o
dia, voltando a causar marcada ação anti-alodínica. Diferentemente do EH, a
FRL obtida do P. amarus não foi capaz de reduzir significativamente a alodínia
mecânica induzida pelo CFA (Figura 3A).
57
3 6 9 12 150
0
50
100
*
*
**
*
*
*
*
*
CFA
FRL+CFAEH+CFA
Tempo após a injeção do CFA (dias)
tratamento 100 mg/kg (v.o., 2×dia)
tratamento 100 mg/kg (v.o., 2×dia)
Basal
Frequência de
estimulação (%)
A
B
0
600
1200
Veículo EH FRL F1 F2 F3
*
+ Cg (300 µg/pata)
*
*
Limiar 50% (mg)
PBS
Alodínia mecânica -CFA
Alodínia mecânica -Cg
Figura 3. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH) ou com a
fração rica em lignanas (FRL) obtidos do P. amarus sobre a alodínia mecânica
(A) induzida pela injeção intraplantar de CFA e do tratamento via oral com o EH,
FRL, fração F1 (F1), fração 2 (F2) ou fração F3 (F3) obtidos do P. amarus sobre a
alodínia mecânica (B) induzida pela injeção intraplantar de Cg em camundongos.
Após a injeção de CFA (A), os animais foram tratados com EH ou com a FRL (ambos
na dose de 100 mg/kg, 2 × dia) durante dois períodos de tempo (dias 2-6 e dias 12-15,
conforme indicado na figura). No modelo de nocicepção induzida pela Cg (B), os
animais foram tratados previamente (1 h antes, todos com dose única de 100 mg/kg)
com o EH, FRL, F1, F2 ou com a F3 e a alodínia foi medida 3 h após a Cg. Cada
ponto representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais. A análise estatística dos resultados
foi feita comparando todos os grupos experimentais (nos diferentes tempos) utilizando
a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de Student-Newman
Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo CFA ou da Cg (*p<0,05,
**p<0,01). Todos os grupos experimentais diferiram dos valores basais após o
tratamento com CFA ou com Cg, exceto o grupo que recebeu apenas PBS.
58
4.1.2. Efeito na alodínia mecânica induzida pela Cg
A injeção i.pl. de Cg foi capaz de induzir alodínia mecânica na pata de
camundongos 3 h após a aplicação deste agente inflamatório, com redução do
limiar 50 % de aproximadamente 1000 mg (basal) para valores próximos a 100
mg (Figura 3B). O tratamento dos animais com o EH, com a F3 ou com a F2,
causou redução na queda do limiar de alodínia mecânica induzido pela Cg. As
porcentagens de inibição foram de 81±20 % para o EH, 79±9 % para a F3 e de
75±8 % para a F2. Tanto a FRL como a F1 não alteraram significativamente a
queda do limiar mecânico induzido pela injeção i.pl. de Cg (Figura 3B).
4.1.3. Efeito na alodínia mecânica induzida por neuropatia
A ligação parcial do nervo ciático produziu alodínia mecânica prolongada
na pata ipsilateral (Figura 4). A instalação da alodínia mecânica foi verificada 5
dias após a cirurgia, alcançando o máximo no dia 7
o
e persistindo além do 20
o
dia após a cirurgia (Figura 4). Similar ao tratamento dos animais operados com
gabapentina (70 mg/kg, v.o.), a administração do EH do P. amarus (100 mg/kg,
v.o., 2 vezes ao dia) reduziu significativamente (71±10 %) a alodínia mecânica
quando avaliada no segundo dia. Esta inibição persistiu por até 1 dia após a
interrupção do tratamento (Figura 4).
Entretanto, o tratamento dos animais operados com a FRL obtida do P.
amarus não afetou a alodínia mecânica induzida pela mononeuropatia. A
suspensão do tratamento com o EH de P. amarus ou com a gabapentina no
11
o
dia reduziu o efeito anti-alodínico dos mesmos.
59
20181615141312111098765B
0
50
100
**
*
**
*
**
*
**
**
**
*
19
17
**
**
**
**
**
**
*
*
**
**
**
**
*
Veículo+OP
EH+OP
Gabapentina+OP
Basal
tratamento 70-100 mg/kg
(v.o., 2×dia)
tratamento 70- 100 mg/kg
(v.o., 2×dia)
Tempo após lesão de nervo (dias)
Frequência de
estimulação
(%)
Figura 4. Efeito do tratamento via oral com o extrato hexânico (EH) obtido do P.
amarus ou com a gabapentina sobre a alodínia mecânica induzida pela
contricção parcial do nervo ciático (OP). Após a neuropatia, os animais foram
tratados com o EH ou com a gabapentina (na dose de 100 mg/kg ou 70 mg/kg,
respectivamente, 2 × dia) durante dois períodos de tempo (dias 6-11 e dias 15-19,
conforme indicado na figura). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 6 animais. A
análise estatística dos resultados foi feita comparando todos os grupos experimentais
(nos diferentes tempos) utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida
pelo teste de Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo
operado tratado com o veículo (*p<0,05, **p<0,01). Todos os grupos experimentais
diferiram dos valores basais após mononeuropatia, exceto o grupo que recebeu
apenas veículo.
60
Entretanto, quando o tratamento com o EH ou com a gabapentina foi
reiniciado no 15
o
dia, observou-se um marcante efeito anti-alodínico que se
mantido até a próxima suspensão do tratamento (Figura 4).
4.1.4. Efeito na nocicepção induzida pela formalina
O tratamento por via oral com o EH, as frações F2 e F3 obtidas de P.
amarus (100 mg/kg) reduziu significativamente tanto a fase neurogênica (0 a 5
min), quanto a fase inflamatória (15 a 30 min) da nocicepção induzida pela
formalina. Na primeira fase, a inibição foi de 55±3, 36±4 e 40±5 % e na
segunda fase foi de 37±7, 36±7 e 33±8 %, respectivamente (Figura 5A e 5B).
A administração por via oral da FRL (100 mg/kg) e a aspirina (300 mg/kg), mas
não da fração F1 (100 mg/kg), causaram inibição na fase inflamatória, mas
não na fase neurogênica da nocicepção induzida pela formalina. A inibição
observada foi 65±7 % e de 73±9 %, respectivamente (Figura 5B).
4.1.5. Efeito na nocicepção induzida pela capsaicina
O tratamento subcutâno com capsaicina (20 µmol/kg) foi capaz de
inibir (97±4 % de inibição) significativamente a nocicepção induzida pela
injeção intraplantar de capsaicina (1nmol). Similarmente, os resultados
apresentados na Figura 6A demonstram que o EH, e as frações F2 e F3
obtidos do P. amarus, administrados por via oral (100 mg/kg), 1 h antes,
apresentaram efeitos anti-nociceptivos significativos quando avaliados no
modelo da nocicepção induzida pela capsaicina. A inibição máxima
observada, em relação à resposta controle, foi de 65±5, 44±4 e 58±3
%,respectivamente (Figura 6A).
61
0
35
70
Veículo EH FRL F1 F2 F3 ASA
***
**
*
(100mg/kg) (300mg/kg)
Formalina (0,92 %)
Tempo de reação (s)
0
150
300
Veículo EH FRL F1 F2 F3 ASA
**
**
*
***
(100mg/kg) (300mg/kg)
Formalina (0,92 %)
Tempo de reação (s)
***
A
B
Primeira fase
Segunda fase
Figura 5. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH), fração
rica em lignanas (FRL), fração F1 (F1), fração 2 (F2) ou fração F3 (F3) obtidos do
P. amarus e da aspirina (ASA) sobre a primeira (A) e a segunda fase (B) da
nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina em camundongos.
Neste modelo de nocicepção induzida pela formalina, os animais foram tratados
previamente (1 h antes, todos com dose única de 100 mg/kg e somente a ASA com
300 mg/kg) com o EH, FRL, F1, F2, F3 e com a ASA e a nocicepção espontânea foi
medida de 0-5 min (na primeira fase) e de 15-30 min (na segunda fase) após a injeção
intraplanter de formalina (0,92%). Cada ponto representa à média ± E.P.M. de 5-7
animais. A análise estatística dos resultados foi feita comparando todos os grupos
experimentais (nos diferentes tempos) utilizando a análise de variância de uma via
(ANOVA) seguida pelo teste de Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem
estatisticamente do grupo formalina (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).
62
4.1.6. Efeito no ensaio de união específica para [
3
H]-RTX em medula
espinhal de ratos
A capsaicina (3 µM) foi capaz de causar redução significativa da ligação
específica da [
3
H]-RTX em membranas de medula espinhal de ratos. Com uma
inibição de 73±7 %. Semelhantemente, A Figura 6B demonstra que tanto o EH
(100 µg/ml), quanto à fração F3 (100 µg/ml) foram capazes de deslocar a
ligação específica da [
3
H]-RTX em membranas de medula espinhal de ratos
(Figura 6B). A percentagem de deslocamento em relação ao grupo controle foi
de 76±9 e de 89±10 %, respectivamente.
4.1.7. Efeito sobre o edema induzido pelo CFA
Uma única injeção i.pl. de CFA foi capaz de causar um aumento no
volume do edema de pata por vários dias em camundongos (Figura 7A). Esse
aumento foi observado a partir do 1
o
dia após a aplicação de CFA e persistiu
por pelo menos 15 dias (Figura 7A). O tratamento diário com o EH (100 mg/kg,
2 vezes ao dia, v.o.) 24 h após a injeção de CFA, diminuiu significativamente o
edema a partir do 1
o
dia de tratamento e atingiu inibição máxima de 53±3% no
4
o
dia. A suspensão do tratamento com o EH no 6
o
dia após a injeção de CFA
restabeleceu o edema 2 dias após a retirada do tratamento com o EH. O
tratamento com EH foi reiniciado no 12
o
dia após o CFA e mantido até o 15
o
dia, voltando a apresentar ação anti-edematogênica. Similarmente, a FRL inibiu
o edema de pata induzido pelo CFA, com inibição de 39±9 % no 4
o
dia após a
injeção de CFA (Figura 7A).
63
0
35
70
Veículo Veículo EH F2 F3 Capsaicina
***
**
100mg/kg, v.o 20µmol/kg, s.c
Capsaicina (1 nmol)
A
*
Tempo de reação (s)
***
0
50
100
Veículo EH F3 Capsaicina
100µg/ml 3 µM
***
***
***
B
União específica do
[
3
H]-RTX
(% do controle)
Figura 6. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH), fração 2
(F2) ou com a fração F3 (F3) obtidos do P. amarus e do tratamento subcutâneo
com a capsaicina sobre a nocicepção induzida pela injeção intraplantar de
capsaicina em camundongos (A) e efeito do EH ou da fração F3 obtidos do
P. amarus e da capsaicina sobre a união específica para a [
3
H]-resiniferatoxina
(RTX) em preparações de medula espinhal de rato. No modelo de nocicepção
induzida pela capsaicina, os animais foram tratados previamente (1 h antes, todos com
dose única de 100 mg/kg) com o EH, F2 ou com a F3. O tratamento subcutâneo com a
capsaicina (20 µmol/kg) foi realizado 30 min antes da injeção intraplantar de
capsaicina. A nocicepção espontânea foi medida de 0-5 min. Para a Figura A, cada
ponto representa a média ± E.P.M. de 7 animais e para a Figura B, cada ponto
representa a média ± E.P.M. de 3 experimentos. A análise estatística dos resultados
foi feita comparando todos os grupos experimentais (nos diferentes tempos) utilizando
a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de Student-Newman
Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo capsaicina ou controle (*p<0,05,
**p<0,01, ***p<0,001).
64
4.1.8. Efeito sobre o edema induzido pela Cg
A injeção i.pl. de Cg (300 µg) produziu edema significativo quando
analisado até 4 h após a injeção. Os resultados da Figura 7B demonstram que
o tratamento oral com o EH, FRL ou com a F1 (100 mg/kg) reduziu o edema
quando avaliada 3 h após a injeção i.pl. de Cg. As inibições foram de 41±6%
para o EH, 46±7% para FRL e de 39±4% para a F1. Entretanto, as frações F3 e
F2 não foram capazes de inibir de maneira significativa o edema induzido por
este agente inflamatório (Figura 7B).
4.2. Efeito antiinflamatório das lignanas isoladas do P. amarus
4.2.1. Efeito sobre o edema induzido pela Cg
Como a FRL foi efetiva em inibir significativamente o edema de pata
induzido pela Cg (Figura 7B), foram testadas também as lignanas purificadas
do P. amarus, assim como o EH e a FRL. O tratamento por via oral com as
lignanas filtetralina, nirtetralina ou nirantina (100 µmol ou 43 mg/kg, v.o) reduziu
significativamente o edema induzido pela Cg. As porcentagens de inibição para
as maiores doses testadas (43 mg/kg que corresponde a 100 µmol/kg) foram
de 40±5% para a filtetralina, 56±7% para a nirtetralina e 59±8% para a nirantina
aos 60 min após a injeção i.pl. de Cg, respectivamente (Figura 8).
65
0
60
120
Veículo EH FRL F1 F2 F3
**
**
**
+ Cg (300 µg/pata)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
A
B
3 6 9 12 150
0
115
230
*
*
**
*
*
*
*
**
*
CONTROLE
FRL
EH
*
*
*
tratamento 100 mg/kg
(v.o., 2×dia)
tratamento 100 mg/kg
(v.o., 2×dia)
Tempo após a injeção de CFA (dias)
Variação no
v
olume da pata (
µ
l)
Edema - CFA
Edema - Cg
Figura 7. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH) ou com a
fração rica em lignanas (FRL) obtidos do P. amarus sobre o edema induzido pela
injeção intraplantar de CFA (A) ou do tratamento via oral com EH, FRL, fração F1
(F1), fração 2 (F2), fração F3 (F3) obtidos do P. amarus sobre o edema induzido
pela injeção intraplantar de Cg em camundongos (B). Após a injeção de CFA (A),
os animais foram tratados com o EH ou com a FRL (ambos na dose de 100 mg/kg, 2 ×
dia) durante dois períodos de tempo (dias 2-6 e dias 12-15, conforme indicado na
figura). Após a medida da alodínia, o edema de pata foi medido nos mesmos animais
por pletismometria. No modelo de edema induzido pela Cg (B), os animais foram
tratados previamente (1 h antes, todos com dose única de 100 mg/kg) com o EH, FRL,
F1, F2 ou com a F3. 3 h após a injeção de Cg foi medida a alodínia mecânica e o
edema dos mesmos animais. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais.
A análise estatística foi feita comparando todos os grupos experimentais (nos
diferentes tempos) utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo
teste de Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo CFA
ou da Cg (*p<0,05, **p<0,01).
66
0 30 60 120 240
0
75
150
Cg
**
**
**
**
Cg + FILT
Tempo após Cg (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
A
B
C
0 30 60 120 240
0
75
150
Cg
**
**
Cg + NIRT
Tempo após Cg (min)
0 30 60 120 240
0
75
150
Cg
**
**
Cg + NIRA
*
Tempo após Cg (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
Edema Cg × FILT
Edema Cg × NIRT
Edema Cg × NIRA
Figura 8. Efeito do tratamento por via oral com a filtetralina (FILT) (A), nirtetralina
(NIRT) (B) ou com a nirantina (NIRA) (C) isoladas do P. amarus sobre o edema de
pata induzido pela injeção intraplantar de Cg em camundongos, após 30, 60, 120
e 240 min. O tratamento dos animais com FILT, NIRT ou NIRA (todos na dose de 100
µmol/kg) foi realizado 1 h antes da injeção de Cg e o edema foi avaliado 30, 60, 120
ou 240 min após a injeção de Cg. Cada ponto representa à média ± E.P.M. de 5-7
animais. A análise estatística foi feita comparando todos os grupos experimentais
utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-
Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo Cg (*p<0,05,
**p<0,01).
67
Apesar de todas as lignanas apresentarem estruturas químicas muito
semelhantes, nem a filantina nem a hipofilantina (100 µmol/kg, v.o.) foram
capazes de causar inibição significativa sobre o edema de pata induzido pela
Cg (Tabela 1). No entanto, o edema de pata induzido pela injeção i.pl. de Cg
foi inibido pelo tratamento subcutâneo com a DEX (0,5 mg/kg, 4 h antes da
injeção i.pl. de Cg), assim como pela administração oral de aspirina (300
mg/kg, 1 h antes da injeção i.pl. de Cg), ou ainda, pela administração
intraplantar de WEB2170 (30 nmol/pata) ou pelo BQ-123 (1 nmol/pata)
(administrados concomitantemente com a Cg) (Tabela 1).
Tabela 1 – Efeito do tratamento com dexametasona (DEX), BQ-123, WEB2170,
aspirina ou com as lignanas hipofilantina e filantina isoladas de P. amarus sobre
o edema de pata induzido pela injeção i.pl. de Cg após 60 min.
TRATAMENTO DOSE/VIA DE
ADMINISTRAÇÃO
INIBIÇÃO DO EDEMA
(%)
Dexametasona 0,5 mg/kg (s.c)
79 ± 2**
Aspirina 300,0 mg/kg (v.o.)
47 ± 5*
BQ-123 1,0 nmol (pata)
72 ± 10**
WEB2170 30,0 nmol (pata)
32 ± 5*
Hipofilantina 43,0 mg/kg (v.o.)
5 ± 2
Filantina 43,0 mg/kg (v.o.)
10 ± 7
Cada grupo representa a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais
*P<0,05, **P<0,01, comparado com o controle (Cg) (ANOVA de uma via seguido pelo
teste de Dunnett).
4.2.2. Efeito sobre o aumento da atividade da MPO induzido pela Cg
A injeção de Cg (300 µg/pata) aumentou em cerca de 7 vezes a
atividade da MPO quando comparado com os valores de animais tratados
apenas com PBS (Figura 9A). A injeção subcutânea prévia de DEX (0,5 mg/kg,
68
4 h antes) reduziu significativamente a atividade da enzima MPO (82±7 %). Da
mesma forma, o tratamento dos animais com o EH ou com a FRL do P. amarus
(100 mg/kg, v.o.) produziu inibição significante da atividade da MPO (54±4 e
44±8 %, respectivamente) (Figura 9A). Além disso, a filtetralina, a nirtetralina
ou a nirantina (100 µmol/kg) quando administrada por via oral também reduziu
o aumento da atividade da MPO induzido pela injeção i.pl. de Cg (66±4, 65±3 e
58±5 % de inibição, respectivamente) (Figura 9A).
4.2.3. Efeito sobre o aumento dos níveis de IL-1β induzido pela Cg
A injeção i.pl. de Cg em camundongos promoveu aumento expressivo
dos níveis teciduais da IL-1β quando comparado aos de animais que
receberam PBS (cerca de 8 vezes) (Figura 9B). O tratamento subcutâneo
prévio dos animais com DEX (0,5 mg/kg) inibiu significativamente o aumento da
IL-1β (91±7 %). O tratamento dos animais com o EH ou com a FRL obtidos de
P. amarus (100 mg/kg), assim como com a nirtetralina (100 µmol/kg) também
foi capaz de reduzir significativamente a produção de IL-1β induzida pela Cg
(56±11, 60±9 e 65±9 %, respectivamente). Entretanto, nem a filtetralina nem a
nirantina foram efetivas em reduzir os níveis de IL-1β em animais que
receberam a injeção i.pl. de Cg (Figura 9B).
69
0
1000
2000
PBS Veículo EH FRL FILT NIRT NIRA DEX
##
**
6 h após Cg (300 µg/pata)
**
**
**
**
**
Atividade da MPO
mDO/mg de proteína
0
2000
4000
PBS Veículo EH FRL FILT NIRT NIRA DEX
##
*
6 h após Cg (300 µg/pata)
**
*
*
IL-1
β
(pg/ml)
A
B
MPO - Cg
IL-1β - Cg
Figura 9. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH), fração
rica em lignanas (FRL), com a filtetralina (FILT), nirtetralina (NIRT), nirantina
(NIRA) obtidos de P. amarus, ou com a dexametasona (DEX) sobre o aumento da
atividade da MPO (A) e sobre o aumento da produção de IL-1β (B) induzido pela
injeção intraplantar de Cg em camundongos. Uma hora antes da injeção i.pl. de
Cg, animais foram tratados com EH ou com a FRL (ambas na dose de 100 mg/kg,
v.o.), FILT, NIRT ou NIRA (todos na dose de 100 µmol/kg, v.o.) e o tratamento via
subcutâneo com DEX (na dose de 0,5 mg/kg) foi efetuado 4 h antes da injeção de Cg.
Após 6 horas da injeção de Cg, os animais foram sacrificados para a coleta de
material para as dosagens. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais. A
análise estatística foi feita comparando todos os grupos experimentais utilizando a
análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman Keuls.
*Grupos que diferem estatisticamente do grupo Cg (*p<0,05, **p<0,01). Após o
tratamento com Cg, o grupo tratado com veículo diferiu do grupo que recebeu PBS na
pata (##p<0,01).
70
4.2.4. Efeito sobre o aumento da expressão da enzima COX-2 induzido
pela Cg
A injeção i.pl. de Cg em camundongos aumentou de maneira relevante a
expressão das enzimas COX-2 nos tecidos cutâneo e subcutâneo da pata
edemaciada. Este aumento foi verificado 6 h após a injeção i.pl. de Cg. A
Figura 10 juntamente com a análise de densitometria (resultado não mostrado)
demonstraram que a administração oral do EH ou da FRL (100 mg/kg) e das
lignanas filtetralina, nirtetralina ou nirantina (100 µmol/kg) não foram capazes
de alterar de maneira significativa o aumento da expressão da COX-2 induzido
pela Cg.
PBS Veículo EH FRL NIRA NIRT FILT
Cg (300 µg/pata)
Figura 10 - Imunodetecção dos níveis da proteína COX-2 (71-72 kDa) em
camundongos que receberam tratamento oral com o extrato hexânico (EH) ou
com a FRL ou com as lignanas filtetralina (FILT), nirtetralina (NIRT) ou nirantina
(NIRA) obtidos de P. amarus após injeção intraplantar de Cg em camundongos.
Uma hora antes da injeção i.pl. de Cg, animais foram tratados com EH ou com a FRL
(ambas na dose de 100 mg/kg, v.o.), FILT, NIRT ou NIRA (todos na dose de 100
µmol/kg, v.o.). Após 6 horas da injeção de Cg, os animais foram sacrificados. A
imunodetecção da actina (47 kDa) foi utilizada como controle interno. Figura
representativa de 3 experimentos similares.
COX- 2
Actina
71
4.3. Mecanismo de ação da ET-1 nas respostas antiinflamatórias das
lignanas isoladas do P. amarus
4.3.1. Efeito no edema induzido pela ET-1
A ET-1 (30 pmol) foi capaz de causar uma resposta edematogênica com
duração maior que 90 minutos após sua injeção i.pl., de acordo com resultados
previamente publicados (PIOVEZAN et al., 2000). A administração oral do EH
ou da FRL (100 mg/kg) foi efetiva em causar redução do edema de pata
induzido pela ET-1 sendo a inibições de 72±11 e 78±6 %, respectivamente
(Figura 11). O valor médio da DI
50
para o tratamento por via oral com o EH foi
de 67,0 (60,9–74,9) mg/kg, enquanto que para a FRL foi de 55,5 (45,1 – 68,4)
mg/kg. Tanto a porcentagem de inibição como os valores de DI
50
foram
calculados 15 min após a injeção de ET-1, para todos os extratos e lignanas
isoladas de P. amarus.
A administração por via oral das lignanas filtetralina ou nirtetralina (1 - 30
µmol/kg) também causou inibição do edema induzido pela ET-1. Com inibição
de 75±5 e 50±4 %, respectivamente (Figura 12). Por outro lado, a
administração da lignana nirantina (30 µmol/kg) não foi capaz de inibir o edema
induzido pela ET-1 (resultado não mostrado). O valor médio da DI
50
calculada
para o tratamento por via oral com a filtetralina foi de 1,9 (1,1–3,5) mg/kg
enquanto que para a nirtetralina foi de 1,8 (1,1–3,0) mg/kg (Figura 12).
O edema induzido pela ET-1 foi também significantemente inibido pelo
tratamento com o BQ-123 (1 nmol/pata) com inibição de 80±4 % (15 min após
a injeção i.pl. de ET-1) (Figura 13C.
72
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
**
EH + ET-1
**
**
*
*
Tempo após a ET-1 (min)
Variação no
volume da pata (
µ
L)
0
50
100
Veículo 10 30 100
EH (mg/kg, v.o.)
*
**
+ ET-1 (30 pmol/pata)
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
**
FRL + ET-1
**
**
**
**
**
Tempo após a ET-1 (min)
Variação no
volume da pata (
µ
L)
0
50
100
Veículo 10 30 100
FRL (mg/kg, v.o.)
**
+ ET-1 (30 pmol/pata)
**
A
B
C
D
Edema ET-1 × EH
Edema ET-1 × FRL
Edema ET-1 × EH
Edema ET-1 × FRL
Figura 11. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH) na dose
de 100 mg/kg (A) ou em diferentes doses de EH (B) ou o tratamento por via oral
com a fração rica em lignanas (FRL) na dose de 100 mg/kg (C) e de diferentes
doses de FRL (D) após 15 min da injeção intraplantar de ET-1 em camundongos.
O tratamento dos O tratamento dos animais com o EH ou com a FRL (ambos na dose
de 10-100 mg/kg, v.o.) foi realizado 1 h antes da injeção de ET-1 e a avaliação do
edema foi realizado 5, 15, 30, 45, 60 ou 90 min após a injeção de ET-1. Cada ponto
representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais. A análise estatística foi realizada
comparando todos os grupos experimentais utilizando a análise de variância de uma
via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem
estatisticamente do grupo ET-1 (*p<0,05, **p<0,01).
73
Para comparação com o BQ-123, as lignanas filtetralina e nirtetralina
foram administradas por via i.pl. (0,1-1,0 nmol/pata) e foram também capazes
de reduzir de maneira significativa o edema de pata induzido pela ET-1, sendo
a inibição observada de 63±8% para a filtetralina e de 82±6 % para a
nirtetralina (Figura 13). De forma semelhante ao tratamento sistêmico dos
animais, o tratamento i.pl. com a lignana nirantina (30 nmol/pata) não inibiu o
edema induzido pela ET-1 (resultado não mostrado).
4.3.2. Efeito sobre a nocicepção induzida pela ET-1
A injeção i.pl. de 100 pmol de ET-1 produziu aumento significativo no
tempo do comportamento nociceptivo em camundongos após observação
durante 20 min. A Figura 14 demonstra que o tratamento i.pl. com a nirtetralina
(1 nmol/pata), similarmente ao antagonista seletivo de receptor ET
A
, o BQ-123
(1 nmol/pata), reduziu o tempo do comportamento nociceptivo causado pela
ET-1, quando administrado concomitantemente. As porcentagens de inibição
foram de 72±8 % para a nirtetralina e de 69±10 % para o BQ-123. No entanto,
nem o tratamento i.pl. com a nirantina (30 nmol/pata) ou com a filtetralina (30
nmol/pata) foram capazes de inibir a resposta nociceptiva induzida pela ET-1
(Figura 14).
74
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
*
FILT + ET-1
**
**
*
*
Tempo após a ET-1 (min)
Variação no
volume da pata (
µ
L)
A
C
B
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
*
NIRT + ET-1
**
**
*
*
*
Tempo após a ET-1 (min)
Variação no
volume da pata (
µ
L)
D
0
50
100
Veículo 1 3 10 30
+ ET-1 (30 pmol/pata)
*
**
FILT (µmol/kg, v.o.)
**
0
50
100
Veículo 1 3 10 30
+ ET-1 (30 pmol/pata)
**
**
NIRT (µmol/kg, v.o.)
*
Edema ET-1 × FILT
Edema ET-1 × FILT
Edema ET-1 × NIRT
Edema ET-1 × NIRT
Figura 12. Efeito do tratamento por via oral com a filtetralina (FILT) na dose de 10
µmol/kg (A) ou com diferentes doses de FILT (B) e o tratamento via oral com
nirtetralina (NIRT) na dose de 10 µmol/kg (C) e de diferentes doses de FILT (D)
após 15 min da injeção intraplantar de ET-1 em camundongos. O tratamento dos
animais com a FILT ou com a NIRT (ambos na dose de 1-30 µmol/kg, v.o.) foi
realizado 1 h antes da injeção de ET-1 e a avaliação do edema foi realizada 5, 15, 30,
45, 60 ou 90 min após a injeção de ET-1. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de
5-7 animais. A análise estatística foi efetuada comparando todos os grupos
experimentais utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo
teste Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo ET-1
(*p<0,05, **p<0,01).
75
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
*
FILT (1 nmol/pata) + ET-1
*
*
*
*
Tempo após a ET-1 (min)
Variação no
volume da pata (
µ
L)
A
C
B
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
***
NIRT (0,1 nmol/pata) + ET-1
***
***
***
***
***
Tempo após a ET-1 (min)
0 30 60 905 15 45
0
50
100
ET-1
***
BQ123 (1 nmol/pata) + ET-1
***
***
***
***
***
Tempo após a ET-1 (min)
Variação no
volume da pata (
µ
L)
Edema ET-1 × FILT
Edema ET-1 × NIRT
Edema ET-1 × BQ123
Figura 13. Efeito do tratamento por via intraplantar com a filtetralina (FILT, A),
nirtetralina (NIRT, B) e com o BQ123 (C) no edema induzido pela injeção
intraplantar de ET-1 em camundongos. O tratamento dos animais com a FILT, a
NIRT ou com BQ123 (na dose de 1, 0,1 e 1 nmol/pata respectivamente) foi realizado
concomitante com a injeção de ET-1 (30 pmol/pata) e a avaliação do edema foi
realizada 5, 15, 30, 45, 60 ou 90 min após a injeção de ET-1. Cada ponto representa a
média ± E.P.M. de 5-7 animais. A análise estatística foi efetuada comparando todos os
grupos experimentais utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida
pelo teste Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo ET-
1 (*p<0,05, ***p<0,001).
76
0
50
100
Veículo FILT (30) NIRT (1) NIRA (30) BQ-123 (1)
**
**
+ ET-1 (100 pmol/pata)
Tempo de reação (s)
nmol/pata
Nocicepção -ET-1
Figura 14. Efeito do tratamento por via intraplantar com a filtetralina (FILT),
nirtetralina (NIRT) ou nirantina (NIRA) isoladas do P. amarus ou BQ-123 sobre a
nocicepção induzida pela injeção intraplantar de ET-1 em camundongos. Os
animais foram tratados localmente com FILT ou NIRA (ambas na dose de 30
nmol/pata) ou com NIRT ou BQ-123 (ambos na dose de 1 nmol/pata) no mesmo
momento da injeção i.pl. de ET-1 (100 pmol/pata). A análise estatística foi realizada
comparando todos os grupos experimentais utilizando a análise de variância de uma
via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem
estatisticamente do grupo veículo+ET-1 (**p<0,01).
77
4.4. Mecanismo de ação do PAF nas respostas antiinflamatórias das
lignanas isoladas do P. amarus
4.4.1. Efeito no edema induzido pelo PAF
O PAF é relatado como um mediador lipídico importante e também está
envolvido no edema de pata induzido pela Cg (MERLOS et al., 1990). Nossos
resultados confirmaram estes dados uma vez que o antagonista de receptor do
PAF, o WEB2170, foi efetivo em reduzir (32±5 %) o edema induzido pela Cg
(Tabela 1). O PAF (3 nmol/pata) produziu edema de pata em camundongos. O
tratamento por via oral com o EH ou com a FRL (100 mg/kg) causou inibição de
29±4 e 75±9 %, respectivamente (Figura 15). O valor médio da DI
50
para a
FRL foram de 90,5 (80,5 – 101,8) mg/kg. A administraçao da filtetralina,
nirtetralina ou nirantina (10 µmol/kg, v.o.) também foi efetiva em inibir o edema
de pata induzido pelo PAF (65±5, 57±11, 53±7 %, respectivamente) (Figura
16). Os valores médios das DI
50s
foram de 3,2 (2,6 – 3,9) mg/kg para a
filtetralina; 4,7 (2,8 – 8,1) mg/kg para a nirtetralina e de 6,1 (4,4 – 8,5) mg/kg
para a nirantina.
O antagonista seletivo do receptor de PAF, o WEB2170 quando co-
administrado intraplantarmente (30 nmol/pata) reduziu em 52±7 % o edema
induzido pelo PAF (Figura 17). Para comparação com o WEB2170, as lignanas
filtetralina, nirtetralina e nirantina foram administradas também por via i.pl. (30
nmol/pata), apresentando as inibições relatadas na Tabela 2 e na Figura 17,
sendo a nirantina a lignana mais eficaz em reduzir o edema induzido pelo PAF.
Interessantemente, o BQ-123 quando administrado intraplantarmente, também
reduziu o edema induzido pela injeção i.pl. de PAF, com inibição de 50±9 %
(Tabela 2).
78
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
**
**
*
*
FRL + PAF
Tempo após PAF (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
A
B
C
D
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
*
*
EH + PAF
*
*
Tempo após PAF (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
0
55
110
Veículo 30 100 300
+ PAF (3 nmol/pata)
*
**
EH (mg/kg, v.o.)
0
55
110
Veículo 10 30 100 300
+ PAF (3 nmol/pata)
*
**
FRA (mg/kg, v.o.)
**
Edema PAF × EH
Edema PAF × EH
Edema PAF × FRL
Edema PAF × FRL
Figura 15. Efeito do tratamento por via oral com o extrato hexânico (EH) na dose
de 100 mg/kg (A) ou em diferentes doses de EH (B) e o tratamento via oral com a
fração rica em lignanas (FRL) na dose de 100 mg/kg (C) e de diferentes doses de
FRL (D) após 60 min da injeção intraplantar de PAF em camundongos. O
tratamento dos animais com EH ou FRL (ambos na dose de 10-300 mg/kg, v.o.) foi
realizado 1 h antes da injeção de PAF e a avaliação do edema foi realizado 30, 60,
120 ou 240 min após a injeção de PAF. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5-
7 animais. A análise estatística foi feita comparando todos os grupos experimentais
utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-
Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo PAF (*p<0,05,
**p<0,01).
79
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
*
*
*
NIRT + PAF
*
Tempo após PAF (min)
A
B
C
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
*
**
FILT + PAF
*
*
**
Tempo após PAF (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
**
**
NIRA + PAF
*
Tempo após PAF (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
Edema PAF × FILT
Edema PAF × NIRT
Edema PAF × NIRA
Figura 16. Efeito do tratamento por via oral na dose de 10 µmol/kg com
filtetralina (FILT) (A), nirtetralina (NIRT) (B) ou nirantina (NIRA) (C) sobre o edema
de pata induzido pela injeção intraplantar de PAF em camundongos. O tratamento
dos animais com FILT, NIRT ou NIRA (todos na dose de 10 µmol/kg, v.o.) foi realizado
1 h antes da injeção de PAF e a avaliação do edema foi realizado 30, 60, 120 ou 240
min após a injeção de PAF. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais.
A análise estatística foi realizada comparando todos os grupos experimentais
utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-
Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo PAF (*p<0,05,
**p<0,01).
80
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
*
*
*
NIRT (30 nmol/pata) + PAF
*
Tempo após PAF (min)
A
B
C
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
FILT (30 nmol/pata) + PAF
*
*
Tempo após PAF (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
**
**
NIRA (30 nmol/pata) + PAF
**
Tempo após PAF (min)
Variação no
volume da pata (
µ
l)
**
Edema PAF × FILT
Edema PAF × NIRT
Edema PAF × NIRA
0 30 60 120 240
0
55
110
PAF
**
**
WEB2170 (30 nmol/pata) + PAF
**
**
Tempo após PAF (min)
Edema PAF × WEB2170
D
Figura 17. Efeito do tratamento por via intraplantar com a filtetralina (FILT, A),
nirtetralina (NIRT, B), nirantina (NIRA, C) e com WEB2170 (C) no edema induzido
pela injeção intraplantar de PAF em camundongos. O tratamento dos animais com
FILT, NIRT, NIRA ou WEB2170 (todos na dose de 30 nmol/pata) foi realizado
concomitantemente com a injeção intraplantar de PAF (3 nmol/pata) e a avaliação do
edema foi realizado 30, 60, 120 ou 240 min após a injeção de PAF. Cada ponto
representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais. A análise estatística foi realizada
comparando todos os grupos experimentais utilizando a análise de variância de uma
via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem
estatisticamente do grupo PAF (*p<0,05, **p<0,01).
81
Tabela 2 – Efeito do tratamento local com a filtetralina, nirtetralina,
nirantina isoladas do P. amarus, do WEB2170 ou do BQ-123 sobre o
edema induzido pela injeção i.pl. de PAF avaliado 60 min após a injeção
do PAF.
TRATAMENTO DOSE/VIA DE
ADMINISTRAÇÃO
INIBIÇÃO DO EDEMA
(%)
Filtetralina 30,0 nmol/pata
34,0 ± 8,0*
Nirtetralina 30,0 nmol/pata
42,0 ± 3,0*
Nirantina 30,0 nmol/pata
78,0 ± 5,0**
WEB2170 30,0 nmol (pata)
60,0 ± 3,0**
BQ-123 1,0 nmol/pata
50,0 ± 9,0**
Cada grupo representa a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais
*P<0,05, **P<0,01, diferem significativamente do controle (Cg) (ANOVA de uma via
seguido pelo teste de Dunnett).
4.4.2. Efeito do EH e das lignanas isolados do P. amarus no ensaio de
união específica para o [
3
H]-PAF em córtex cerebral de camundongos
A Figura 18A demonstra que tanto o EH (30 µg/ml), quanto a FRL (30
µg/ml) ou a nirantina (0,1-30 µM) foram capazes de deslocar a ligação
específica do [
3
H]-PAF em membranas de córtex cerebral de camundongos
(Figura 18A). Entretanto, a filtetralina e a nirtetralina (30,0 µM) não foram
capazes de alterar a ligação do [
3
H]-PAF (Figura 18B). O WEB2170 (0,1–10
µM), assim como a nirantina (1–30 µM) deslocaram a união específica do [
3
H]-
PAF de modo dependente da concentração com inibição máxima para o
WEB2170 (10 µM) de 97% e para a nirantina (30 µM) de 98% (Figura 18A). O
valor médio da CI
50s
para o WEB2170 foi de 0,3 (0,1-0,5) µM, enquanto que
para a nirantina foi de 6,5 (4,3-8,7) µM (Figura 18B).
82
0
50
100
Veículo EH FRL FILT NIRT NIRA WEB2170
**
**
**
**
100µg/ml 30µM 10µM
União especifica
[
3
H]-PAF (%)
1 100C 0,1 0,3 3 10 30
100
50
0
NIRANTINA
WEB2170
CONTROLE
Concentração (µM)
União específica
[
3
H]-PAF (%)
A
B
Figura 18. Efeito do extrato hexânico (EH), da fração rica em lignanas (FRL), da
filtetralina (FILT), nirtetralina (NIRT), nirantina (NIRA) sobre o ensaio de união
específica do [
3
H]-PAF em preparações de córtex cerebral de camundongos (A) e
curva concentração-resposta de inibição para a nirantina ou do WEB2170 sobre
ensaio de união específica do [
3
H]-PAF em preparações de córtex cerebral de
camundongos (B). Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 3 experimentos. A
análise estatística foi efetuada comparando todos os grupos experimentais utilizando a
análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman Keuls.
*Grupos que diferem estatisticamente do grupo controle (*p<0,05, **p<0,01).
83
4.4.3. Efeito da nirantina sobre a pleurisia induzida pelo PAF
A administração intratorácica de PAF (1,9 nmol/cavidade) em
camundongos aumentou o extravazamento plasmático na cavidade pleural 30
minutos após a injeção quando comparados aos animais injetados com veículo
(Figura 19). A administração intraperitoneal de WEB2170 (1,7 µmol ou 8
mg/kg) ou o tratamento oral com nirantina (100 µmol ou 43 mg/kg) reduziu
significativamente a exsudação induzida pelo PAF, com inibição de 20±3 %
para a nirantina e de 45±5 % para o WEB2170 (Figura 19).
4.4.4. Efeito da nirantina sobre o aumento da atividade da MPO induzido
pelo PAF
O PAF (3 nmol/pata) induz o aumento da atividade da MPO 2, 3 e 4 h
após a injeção i.pl. deste mediador inflamatório, quando comparado aos
animais controle (Figura 20A). Duas horas após a co-injeção do PAF,
juntamente com o WEB2170 (30 nmol/pata) reduziu significativamente a
atividade da MPO (36±6 % de inibição). Da mesma maneira, o co-tratamento
com a nirantina (30 nmol/pata) produziu uma inibição significativa na atividade
da MPO (53±12 %) (Figura 20A). Similarmente, o tratamento dos animais via
i.pl. com o WEB2170 ou a nirantina foram capazes de inibir o aumento da
atividade da MPO 3 horas após a injeção de PAF (Figura 20A).
84
0
900
1800
*
***
Sal Controle NIRA WEB2170
100 µmol/kg 1.7mmol/kg
(v.o.) (i.p.)
30 min depois da injeção de PAF
(1,9 nmol/cavidade)
#
Extravasamento
proteíco
(mg/cavity)
Figura 19. Efeito do tratamento oral com a nirantina (NIRA, 100 µmol/kg) ou via
intraperitoneal com o WEB2170 (1,7 µmol/kg) sobre o extravasamento protéico
induzido pela injeção intratorácica de PAF em camundongos. O tratamento dos
animais com nirantina ou com WEB2170 foi realizado 1 hora antes da aplicação
intratorácica de PAF (1,9 nmol/cavidade). Para a avaliação do extravasamento
protéico os animais foram sacrificados após 30 minutos. Cada ponto representa a
média ± E.P.M. de 6 animais. A análise estatística foi realizada comparando todos os
grupos experimentais utilizando a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida
pelo teste Student-Newman Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo
PAF (*p<0,05, **p<0,01).
85
0 1 2 3 4
0
900
1800
Controle
WEB2170 (30 nmol/pata)
*
*
*
*
Nirantina (30 nmol/pata)
Atividade da MPO
mDO por proteína (mg)
A
B 0,5 1 2 4 6 8
0
20
40
60
80
Controle
WEB2170 (30 nmol/pata)
Tempo após a injeção de PAF (h)
**
*
**
Nirantina (60 nmol/pata)
**
**
*
*
*
B
Frequência de
resposta (%)
Figura 20. Efeito do tratamento intraplantar com nirantina (30 nmol/pata) ou com
o WEB2170 (30 nmol/pata) sobre o aumento da atividade da MPO induzido pela
injeção intraplantar de PAF em camundongos (A) e efeito do tratamento
intraplantar com a nirantina (60 nmol/pata) ou com o WEB2170 (30 nmol/pata)
sobre a alodínia mecânica induzida pela injeção intraplantar de PAF em ratos
(B). Grupos distintos de animais foram co-tratados com injeção do PAF (3 nmol/pata)
com a NIRA (30 nmol/pata), o WEB2170 (30 nmol/pata) ou o veículo. Após 1, 2, 3 e 4
horas da injeção do PAF, os diferentes grupos de animais foram sacrificados para a
coleta de material para a dosagem da atividade da MPO. Para a avaliação da alodínia
mecânica (B), o tratamento dos animais com NIRA ou com WEB2170 foi realizado
concomitantemente com a injeção de PAF (10 nmol/pata) na pata dos ratos. Os
animais apresentavam alodínia mecânica após 0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 h após injeção
intraplantar de PAF. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 5-7 animais. A
análise estatística foi executada comparando todos os grupos experimentais utilizando
a análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman
Keuls. *Grupos que diferem estatisticamente do grupo PAF (*p<0,05, **p<0,01). Após
o tratamento com controle, o grupo tratado com veículo diferiu do grupo que recebeu
PBS na pata.
86
4.4.5. Efeito da nirantina sobre a alodínia induzida pelo PAF
A injeção i.pl. de PAF (10 nmol) na pata de ratos produziu alodínia
mecânica com duração maior que 8 h após a injeção, quando comparado com
o grupo de animais que recebeu somente veículo i.pl. (Figura 20B). O
tratamento local com o WEB2170 (30 nmol/pata) reduziu a alodínia induzida
pela injeção intraplantar de PAF com inibição máxima de 91±9 %, 30 min após
a injeção do lipídeo. Inibição similar foi verificada nos animais tratados por via
oral com a nirantina (60,0 nmol/pata), com inibição máxima de 96±4 %
observada 30 min após da injeção de PAF. Ao contrário do WEB2170, a
niratina causou inibição da alodinia até 6 h após a sua administração (Figura
20B).
4.5. Mecanismo de ação de outros mediadores sobre as respostas
antiinflamatórias dos EH e FRL obtidos de P. amarus
4.5.1. Efeito no edema induzido por outros mediadores inflamatórios
O edema de pata induzido pela BK foi significativamente reduzido pelo
tratamento com o EH (100 mg/kg, v.o.) com inibição significativa de 31±7 %, ou
pela FRL (100 mg/kg, v.o.) com inibição de 50±6 %. Entretanto, o EH ou a FRL
(100 mg/kg, v.o.) não foram capazes de reduzir significativamente o edema
induzido pela histamina ou pela substância P (Tabela 3).
87
4.5.2. Efeito no ensaio de união específica para [
3
H]-BK em córtex cerebral
de camundongos
A Figura 21 demonstra que tanto o EH quanto a FRL (300,0 µg/ml) não
foram capazes de deslocar a ligação específica do [
3
H]-BK nas membranas de
íleo de ratos.
Tabela 3 – Efeito do tratamento com EH ou FRL obtidas de P. amarus,
sobre o edema induzido pela injeção intraplantar de bradicinina (BK),
histamina ou substância P (SP)
TRATAMENTO INIBIÇÃO MÁXIMA (%)
EDEMA INDUZIDO
PELA BK
EDEMA INDUZIDO
PELA HISTAMINA
EDEMA INDUZIDO
PELA SP
EH
(100 mg/kg, v.o.)
31 ± 7* 5 ± 2 23 ± 10
FRL
(100 mg/kg, v.o.)
50 ± 6* 7 ± 1 20 ± 8
Cada grupo representa a média ± E.P.M. de 4 – 6 animais
*P<0,05, diferem significativamente do controle (BK, histamina ou SP) (ANOVA de
uma via seguido pelo teste de Dunnett).
0
50
100
Veículo EH FRL
300µg/ml
União específica do
[
3
H]-BK
(% do controle)
Figura 21. Efeito do extrato hexânico (EH) ou da fração rica em lignanas (FRL)
obtidos do P. amarus sobre a união específica para [
3
H]-BK em preparações de
íleo de rato. Cada ponto representa a média ± E.P.M. de 3 experimentos. A análise
estatística foi feita comparando todos os grupos experimentais utilizando a análise de
variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste Student-Newman Keuls.
88
5. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo demonstram que o tratamento
prolongado por via oral com o EH do P. amarus reduziu de maneira significativa
a alodínia mecânica persistente causada pela neuropatia ou pela administração
intraplantar de CFA. Além disto, o EH e as frações F2 ou F3 foram efetivos em
inibir significativamente a alodínia mecânica causada pela carragenina, a
nocicepção espontânea induzida pela formalina (ambas fases) ou pela
capsaicina em camundongos. Este estudo demonstrou também que o EH e a
FRL foram eficientes em inibir o edema de longa duração induzido pelo CFA,
bem como o edema agudo induzido pela Cg. Os resultados do presente estudo
são relevantes uma vez que o P. amarus pertence a um gênero de plantas
amplamente utilizadas na medicina popular tanto no Brasil, como em muitos
outros países, embora relativamente poucos estudos científicos validem a
maioria das indicações do uso popular desta planta. Assim, poucas substâncias
com propriedades anti-nociceptivas e antiinflamatórias foram, até o presente,
isoladas e identificadas nas plantas deste subgênero.
Atualmente, várias doenças ainda permanecem com sua etiologia
desconhecida ou apresentam múltiplos fatores que contribuem para a
permanência da doença no organismo. Algumas dessas doenças podem
apresentar um caráter inflamatório e/ou doloroso persistente, sendo tratadas
com a utilização de alguns medicamentos classicamente utilizados na
inflamação e/ou dor como os AINES, corticosteróides, opióides, e derivados, na
tentativa de melhorar a sintomatologia geral do paciente (GUPTA e DUBOIS,
2002). Assim, a descoberta de novas substâncias com atividade analgésica
89
e/ou antiinflamatória é ainda um aspecto altamente desejável e de enorme
importância para a utilização clínica. Várias evidências demonstram que um
grande número de medicamentos utilizados terapeuticamente é derivado direta
ou indiretamente de produtos naturais, especialmente de plantas superiores,
sendo uma fonte inesgotável de possibilidades para a descoberta de novos
medicamentos (KOEHN e CARTER, 2005). Entretanto, várias dificuldades são
encontradas por aqueles que desejam estudar as ações das plantas medicinais
em sistema biológico, como por exemplo, a escolha de modelos experimentais,
obtenção de extratos padronizados, dificuldade de obtenção e isolamento e
identificação das substâncias ativas. Além disso, muitas doenças estão
associadas a múltiplos fatores, dificultando a escolha de um alvo específico
para o estudo (COOKSON, 2004).
Estudos anteriores realizados em nosso laboratório demonstraram que
extratos obtidos das folhas do Phyllanthus sp, inclusive do P. amarus,
apresentaram propriedades anti-nociceptivas em vários modelos experimentais
(CALIXTO et al., 1998; SANTOS et al., 2000). Foi também descrito
anteriormente que o extrato hidroalcoólico do P. amarus apresentava ação anti-
nociceptiva em modelos de nocicepção induzida pela formalina, capsaicina ou
por contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (SANTOS et al., 2000).
O presente estudo evidencia que, além de suas ações anti-nociceptivas em
modelos experimentais de dor, o EH de P. amarus apresentou também ações
antialodínicas em modelo de alodínia mecânica persistente causada por
neuropatia ou pela administração intraplantar de CFA. Este estudo demonstrou
que as frações F2 ou F3 parecem estar correlacionadas com as ações anti-
nociceptivas do EH. Além do EH e da fração F3 inibirem significativamente os
90
modelos experimentais de dor, resultados deste trabalho demonstraram que o
EH e a fração F3 foram efetivos em deslocar o ensaio da união de [
3
H]-RTX de
sítios específicos de ligação provavelmente do receptor vanilóide (TRPV1) em
membranas de medula espinhal de ratos. Apesar da existência de inúmeros
alvos relevantes para o estudo do possível mecanismo anti-nociceptivo dos
extratos do Phyllanthus sp, nossos estudos foram direcionados inicialmente
para investigação do possível envolvimento na modulação do receptor TRPV1.
Várias substâncias de origem natural são ligantes do TRPV1, como capsaicina
(Capsicum sp), a RTX (Euphorbia resinifera), os capsaicinóides (capsiato,
piperina, eugenol), produtos do gengibre (shogaol, gingerol, zingerona,
paradol), ácidos graxos (ácido ricinoléico), canabinóides e dialdeídos
insaturados (cinamodial, cinamosmolideo) (STERNER e SZALLASI, 1999;
CALIXTO et al., 2005). Ademais, o receptor TRPV1 está envolvido em
processos dolorosos e tanto a capsaicina como a RTX podem causar
pungência, inflamação neurogênica e diminuição da temperatura corporal em
modelos animais (SZALLASI e BLUMBERG, 1989). Além do envolvimento do
receptor TRPV1 na dor, este receptor desempenha um importante papel na
inflamação ou estados inflamatórios, pois alguns mediadores inflamatórios
podem modular este receptor como a bradicinina, PGs, ATP, NGF e glutamato.
Por fim, a própria capsaicina é utilizada clinicamente para o tratamento de
diversas doenças incluindo a hiper-reflexia ou hipersensibilidade da bexiga
urinária, estados de dor neuropática, como neuralgia pós-herpética, dor
neuropática causada pela diabetes, síndrome da dor pós-mastectomia,
osteoartrite e artrite reumatóide (SZALLASI e BLUMBERG, 1999). Embora
tenhamos testado alguns compostos isolados presentes na fração F3 do P.
91
amarus, como lignanas, o ácido linoléico e o ácido esteárico (resultados não
mostrados), nenhum destes compostos parece ser responsável pela ação anti-
nociceptiva do EH ou da fração F3. Estes compostos apresentaram pouca ou
nenhuma ação in vitro ou in vivo, quando comparadas às ações do EH ou da
fração F3 (resultados não mostrados). Assim, sugere-se que o EH e a fração
F3 poderiam apresentar seus efeitos anti-nociceptivos provavelmente por
conterem substâncias que modulem o funcionamento do receptor TRPV1 e
estudos estão sendo realizados na tentativa de encontrar as substâncias
responsáveis por estas ações.
Além disso, o EH apresentou pronunciado efeito antiinflamatório,
inibindo não somente o edema, mas também a migração de neutrófilos
avaliada indiretamente através da atividade da enzima MPO. Neste último
aspecto, nossos resultados estão de acordo com os descritos na literatura, os
quais demonstraram recentemente através de estudos in vitro, evidências de
uma atividade antiinflamatória para o extrato de P. amarus (KIEMER et al.,
2003). Além disso, um efeito antiedematogênico foi descrito para o extrato de
P. amarus quando analisado no modelo de edema causado pela injeção i.pl. de
Cg em ratos (RAPHAEL e KUTTAN, 2003). A possível ação antiinflamatória
dos constituintes químicos presentes nesta planta vem sendo demonstrada,
porém o(s) princípio(s) ativo(s) responsável (is) pelas ações anti-nociceptivas e
antiinflamatórias ainda não haviam sido estudados.
O fracionamento do EH do P. amarus originou algumas frações com
diferentes perfis cromatográficos. Classes de metabólitos secundários com
atividade antiinflamatória e/ou anti-nociceptiva poderiam estar presentes nestas
frações. Dentre estas classes, as lignanas são especialmente importantes em
92
função das diversas atividades biológicas a elas atribuídas e também por
inibirem parâmetros inflamatórios (LEE et al., 2003; KÜPELI et al., 2003;
MACRAE e TOWERS, 1984, GOTTLIEB, 1991). Desta forma, algumas frações
do EH, inclusive a FRL, foram testados em modelos experimentais de
nocicepção e de inflamação, com o objetivo de identificar e de isolar o(s)
princípio(s) ativo(s) responsável(is) por esses efeitos.
A administração por via oral e prolongada de 100 mg/kg da FRL obtida
do P. amarus resultou em inibição significativa e duradoura do edema de pata,
exibindo um perfil de resposta semelhante ao observado para o EH desta
planta no modelo de inflamação persistente induzido pelo CFA. Desta forma,
podemos sugerir que a ação antiinflamatória do EH observada neste modelo
poderia estar relacionada, pelo menos em parte, à presença das lignanas,
também contidas na FRL. De maneira interessante, a FRL não apresentou
atividade inibitória em relação à alodínia mecânica induzida pelo CFA. Dessa
forma, é possível sugerir que a atividade anti-nociceptiva presente no EH do P.
amarus observada no modelo de indução da alodínia mecânica pela injeção
i.pl. de Cg ou pelo CFA parece derivar da presença de outros constituintes
químicos ainda não identificados presentes no extrato, como demonstrado para
as frações F2 ou F3. Apesar da FRL inibir significativamente a segunda fase da
formalina, esta ação parece derivar da propriedade antiinflamatória da FRL,
uma vez que várias substâncias antiinflamatórias clássicas, como a
indometacina, naproxeno, dexametasona, hidrocortisona, induzem inibição
significativa da segunda fase da nocicepção induzida pela formalina
(HUNSKAAR e HOLE, 1987). Assim, a propriedade anti-nociceptiva da FRL, no
modelo de nocicepção induzido pela formalina, parece estar relacionada
93
diretamente ao fato desta fração inibir a inflamação, não parecendo estar
envolvida em mecanismos que exercem efeitos diretos no nociceptor.
Corroborando os resultados sobre a inibição do edema prolongado
induzido pela injeção i.pl. de CFA pelo EH, a administração da FRL pela via
oral (60 min antes) também foi capaz de inibir significativamente o edema
induzido pela injeção i.pl. de Cg. Assim, o fracionamento do EH do P. amarus
originou frações que inibiram a nocicepção (F2 ou F3), bem como aquelas que
inibiram o edema induzido pela Cg (F1 ou FRL). Portanto, devido à
possibilidade de isolamento e a purificação de lignanas presentes na FRL e
também pelo importante efeito inibitório obtido sob o edema induzido pela
injeção i.pl. de CFA ou de Cg observado em nossos resultados, resolvemos
explorar as ações antiinflamatórias da FRL, bem como das lignanas purificadas
do P. amarus.
As lignanas obtidas da FRL do P. amarus foram: filtetralina, nirtetralina,
nirantina, hipofilantina e filantina. Como citado anteriormente na Introdução,
hipofilantina e filantina foram isoladas e identificadas por SOMANABANDHU et
al. (1993), enquanto que a filtetralina, nirtetralina e nirantina haviam sido
isoladas por ANJANEYU et al. (1973). Nossos estudos demonstram que a hipo
filantina e filantina são as lignanas que se apresentaram maior concentração
nesta planta, quando comparadas com os demais presentes no P. amarus.
Entretanto, no presente estudo, nem a filantina e tampouco a hipofilantina
apresentaram ações antiinflamatórias quando avaliadas sobre o edema
induzido pela Cg e por isso não foram testadas nos demais modelos.
A Cg é uma mistura de polissacarídeos derivados de algas marinhas,
sendo um dos irritantes não-específicos mais amplamente utilizados para a
94
indução e o estudo da inflamação e para o desenvolvimento de drogas com
ação antiinflamatória. Existem várias evidências experimentais indicando que o
amplo mecanismo de ação da Cg neste modelo envolve a ativação do sistema
complemento, produção de IL-1β (DRELON et al., 1994), liberação de PAF
(HWANG e LAM, 1986), liberação de histamina, serotonina, BK, prostanóides
(DI ROSA e SORRENTINO, 1970), além da produção de NO, bem como da
ativação e aumento da expressão de várias enzimas cujo os produtos são pró-
inflamatórios, como por exemplo a COX-2 e a iNOS (POSADAS et al., 2004).
Por estas e outras ações, uma das características marcantes da Cg é a sua
capacidade de aumentar o influxo de neutrófilos para o sítio inflamatório. O pré-
tratamento dos animais com a aspirina ou com a DEX (compostos
antiinflamatórios conhecidos e usados no presente estudo como controles
positivos) foi capaz de inibir em maior ou menor grau as respostas inflamatórias
induzidas pela Cg. Nossos resultados demonstraram que a administração oral
de EH, FRL, bem como das lignanas purificadas de P. amarus (filtetralina,
nirtetralina ou nirantina) causaram pronunciado efeito antiinflamatório na
inflamação induzida pela injeção i.pl. de Cg. Assim, o presente trabalho mostra
pela primeira vez que as lignanas filtetralina, nirtetralina e nirantina podem ser
os princípios ativos mais relevantes ou responsáveis pela atividade
antiinflamatória presente no P. amarus.
Na fase inicial do processo inflamatório, os neutrófilos são
reconhecidamente um dos principais componentes celulares presentes no sítio
inflamatório. Estas células podem migrar para o sítio inflamado e liberar
enzimas proteolíticas, espécies reativas de oxigênio, proteínas catiônicas e
outros mediadores pró-inflamatórios (LAWRENCE et al., 2002). O aumento da
95
atividade da MPO é um importante indicativo da progressão do processo
inflamatório (DE YOUNG et al., 1989). De acordo com nossos resultados,
conforme já descrito na literatura (PINHEIRO e CALIXTO, 2002), a DEX foi
eficaz em inibir o influxo de neutrófilos para a pata inflamada. Da mesma forma,
tanto os extratos, como as lignanas purificadas do P. amarus filtetralina,
nirtetralina e nirantina inibiram significativamente a atividade da enzima MPO
no modelo de edema induzido pela injeção i.pl. de Cg, confirmando assim suas
ações antiinflamatórias.
Após um estímulo nocivo, vários tipos celulares presentes no tecido
produzem e/ou liberam citocinas pró-inflamatórias. A citocina IL-1β pode ser
produzida por células dendríticas, melanócitos, fibroblastos ou leucócitos
(GRONE et al., 2002). Esta citocina é responsável pela indução de moléculas
de adesão, liberação de outras citocinas e expressão da COX-2, entre outras
proteínas pró-inflamatórias (MURPHY et al., 2000). Conseqüentemente, a
inibição do efeito da IL-1β nas patas de camundongos poderia reduzir o edema
e a migração de neutrófilos causada pela injeção i.pl. de Cg. Dados da
literatura demonstram que compostos que interferem com a síntese, liberação
e/ou com as ações da IL-1β apresentam relevante efeito antiinflamatório
(OLUYOMI et al., 1995; GRAHAM et al., 1997; PINHEIRO e CALIXTO, 2002).
O presente estudo demonstra ainda, que o EH, FRL ou a lignana nirtetralina
isolados do P. amarus, administrados por via oral, foram capazes de reduzir de
maneira significativa os níveis locais de IL-1β após injeção i.pl. de Cg. O
tratamento com as lignanas purificadas também diminuiu a atividade da MPO
na pata inflamada. Assim, a provável causa da queda dos níveis de IL-1β
observada na pata inflamada após o tratamento com produtos de P. amarus,
96
poderia estar associada com a inibição na migração de neutrófilos ou mesmo a
produção de IL-1β em macrófagos residentes, causada por estes tratamentos.
A busca pelo esclarecimento do mecanismo de ação antiinflamatória dos
extratos do P. amarus levou KIEMER et al. (2003) à realização de
experimentos em células de fígado de rato, em macrófagos RAW 264,7, e no
plasma humano ou de camundongos. Este mesmo estudo revelou que as
ações antiinflamatórias dos extratos de P. amarus em cultura de células pode
ser, pelo menos em parte, conseqüência de uma ação inibitória dos princípios
ativos presentes no P. amarus sobre a expressão das enzimas COX-2 e iNOS
in vitro. Este efeito ocorre pela inibição do fator transcricional nuclear-κB.
Diferentemente, nossos dados mostram que os tratamentos por via oral de
camundongos com extratos ou com as lignanas obtidas do P. amarus não
foram capazes de prevenir de maneira significativa o aumento da expressão da
enzima COX-2 induzida pela injeção i.pl. de Cg in vivo. Para a realização do
ensaio do Western blot para a enzima COX-2, foram utilizadas doses de
extratos e lignanas que foram capazes de inibir o edema induzido pela injeção
i.pl. de Cg, a atividade MPO, bem como o aumento dos níveis de IL-1β.
Entretanto, não podemos desconsiderar que a administração oral de doses
mais elevadas dos extratos ou lignanas de P. amarus talvez possam inibir a
expressão da COX-2 in vivo.
Vários mediadores inflamatórios liberados pela Cg podem contribuir para
a manutenção e a amplificação do processo inflamatório. A identificação de
substâncias capazes de interagir com alvos moleculares responsáveis pela
amplificação do processo inflamatório constitui um campo de pesquisa bastante
interessante. Desta forma, este constitui o principal objetivo no estudo de
97
compostos naturais com possível atividade antiinflamatória. Nossos resultados
demonstraram que o tratamento por via oral com o EH ou com a FRL na dose
de 100 mg/kg inibiu significativamente o edema induzido pela injeção i.pl. de
ET-1, PAF ou BK. Estes resultados sugerem a existência de substâncias que
estariam interagindo direta ou indiretamente com os receptores e/ou ações do
PAF, ET-1 ou BK, reduzindo assim suas ações inflamatórias.
A descoberta de substâncias que antagonizam o receptor e/ou ação
para a ET-1 ou para o receptor para o PAF parece ser uma estratégia válida
para tratar doenças de origem inflamatória (EVANGELOU, 1994). A utilização
de antagonistas seletivos para a ET-1, por exemplo, é capaz de inibir a
migração de neutrófilos e também inibir a produção de IL-1β em modelo
experimental de peritonite em camundongos (GETTING et al., 2004) ou de
colite em ratos (PADOL et al., 2000). O primeiro antagonista de receptor para
ET-1 aprovado pela “Food and Drug Administration” foi o bosentan (Tracleer
TM
)
para o tratamento da hipertensão arterial pulmonar (para revisão ver: NAEIJE
et al., 2005). Recentemente, o Xinlay
TM
(atrasentan), outro antagonista de
receptor para a ET-1, da Abbott foi submetido à aprovação na “Food and Drug
Administration” como nova promessa para o tratamento do câncer de próstata
(para revisão ver: BERRY e EISENBERGER, 2005, HERMANN et al., 2006).
Em humanos, tanto a injeção intradérmica quanto endovenosa de ET-1 induz
respostas dolorosas (FERREIRA et al., 1989; DAHLOF et al., 1990). A injeção
i.pl. de ET-1 em camundongos induz uma resposta comportamental nociceptiva
per se caracterizada pelo ato de lamber a pata (PIOVEZAN et al., 2000;
MENENDEZ et al., 2003) associada à formação de edema (PIOVEZAN et al.,
2000), sendo estas respostas dependentes exclusivamente da ativação de
98
receptores do tipo ET
A
(PIOVEZAN et al., 2000). A administração oral (10
µmol/kg) ou local (0,1-1 nmol/pata) das lignanas filtetralina ou nirtetralina, mas
não da nirantina, foi efetiva em inibir de maneira significativa o edema induzido
pela injeção i.pl. de ET-1. É interessante comentar ainda que o estudo de
HUSSAIN et al. (1995) demonstrou que a nirtetralina isolada do P. niruri
apresentava seletividade para induzir o deslocamento da [
125
I]-ET-1 de sítios
específicos de ligação em membranas de células CHO que expressavam o
receptor ET
A
humano, mas não aquelas de células que expressavam ET
B
.
Apesar destas lignanas ligarem-se ao receptor para ET-1 (ET
A
), não haviam,
até aquele momento, estudos farmacológicos avaliando suas atividades
biológicas in vivo, o que desestimulou a continuidade desses estudos.
Contrariamente, o presente estudo demonstra que o antagonista de receptor
ET
A
, o BQ-123, e também a lignana nirtetralina, causaram pronunciada redução
do edema e nocicepção induzido pela ET-1, bem como do edema de pata
induzido pela Cg ou pelo PAF. Adicionalmente, o fato da nirtetralina deslocar o
ensaio a [
125
I]-ET-1 de sítios específicos de ligação evidencia um possível
antagonismo sobre o receptor ET
A
. Isto poderia explicar o efeito inibitório da
nirtetralina sobre a inflamação induzida pela injeção i.pl de Cg, tendo em vista
que a Cg induz liberação de ET-1 na pata posterior do rato (BERTELLI et al.,
1992). Entretanto, é pouco provável que a filtetralina exerça um antagonismo
seletivo em receptores ET
A
, uma vez que sua injeção i.pl. não causou inibição
da nocicepção induzida pela injeção i.pl. de ET-1. Apesar de nossos resultados
avançarem substancialmente a respeito do provável mecanismo pelos quais
esses compostos exercem seus efeitos antiinflamatórios, o mecanismo preciso
de ação da filtetralina permanece ainda inconclusivo. Porém, para a nirtetralina,
99
o antagonismo para receptor ET
A
parece ser o mecanismo mais provável para
suas ações antiinflamatórias.
Numerosas substâncias de origem natural e sintética administradas por
via oral têm demonstrado ação anti-PAF em diferentes modelos experimentais.
Muitas destas substâncias são lignanas oriundas de plantas como:
kadsurenona, o primeiro antagonista competitivo descoberto para receptor de
PAF, isolada da planta Piper futokadsurae; yangambina, lignana isolada da
planta Ocotea duckei (JESUS-MORAIS et al., 2000); magnone A and B,
isoladas da planta Magnolia fargesii (JUNG et al., 1998); dentre outras. Assim,
o PAF tornou-se um importante alvo para nossos estudos, pois é um mediador
lipídico que desempenha importante papel na regulação de vários estados
inflamatórios. Foi demonstrado que o PAF contribui para o aparecimento de
alodínia e hiperalgesia em roedores (BONNET et al., 1981; DALLOB et al.,
1987; MORITA et al., 2004). O fato de que o EH, a FRL e as lignanas isoladas
de P. amarus (filtetralina, nirtetralina ou nirantina) inibiram o edema induzido
pela injeção i.pl. de PAF não implica necessariamente em um mecanismo
direto de interação via receptor de PAF. Foi demonstrado que o PAF pode
induzir a liberação de outras substâncias envolvidas no processo inflamatório
(JANCAR et al., 1987). Antagonistas do receptor para o PAF, como o
WEB2170, são capazes de inibir o edema induzido pelo PAF ou mesmo por
outros agentes inflamatórios, como a Cg (HENRIQUES et al., 1990). Assim, o
EH, a FRL e as lignanas poderiam estar agindo diretamente no receptor do
PAF, ou mesmo interferindo com a liberação e/ou ação de outros agentes
inflamatórios liberados após a injeção i.pl. de PAF.
100
Algumas evidências adicionais obtidas no presente estudo parecem
relacionar a ação dos compostos isolados do P. amarus diretamente ao
receptor de PAF. Assim sendo, evidencia-se que o EH, a FRL e a lignana
nirantina foram eficazes em causar deslocamento do [
3
H]-PAF de sítios
específicos em membranas de córtex de camundongo. Estes resultados
deixam claro que a nirantina se comporta como um antagonista do receptor de
PAF, apresentando um perfil de inibição semelhante ao exercido pelo
WEB2170 no edema induzido pela Cg e pelo PAF. Todavia, essa lignana foi
cerca de 5 vezes mais potente que o WEB2170 em inibir as ações inflamatórias
do PAF no edema de pata em camundongos e seu efeito foi muito mais
prolongado. Por outro lado, ela foi cerca de 21 vezes menos potente em
deslocar a união específica do [
3
H]-PAF em preparações de córtex cerebral de
camundongos. Além disso, o WEB2170 e também a lignana nirantina quando
administrados pela via i.pl. não inibiram o edema induzido pela ET-1,
demonstrando certo grau seletividade in vivo. Para o teste de seletividade in
vitro para o receptor de PAF, adotamos ensaios de união específica para
receptores de glicocorticóide (resultados não mostrados). Para ambos, a
concentração de 30 µM de nirantina, que desloca 85% da união específica de
[
3
H]-PAF em membranas de córtex cerebral de camundongos, não foi capaz de
alterar significativamente a ligação dos radioligantes em seus respectivos
receptores para glicocorticóides (resultados não mostrados). Em relação à
filtetralina ou à nirtetralina, o mecanismo de ação não parece envolver o
bloqueio direto do receptor para PAF, uma vez que elas não alteraram o ensaio
de união do [
3
H]-PAF em sítios específicos. No caso da nirtetralina, obteve-se
inibição significativa do edema induzido pela injeção i.pl. de PAF, tanto quando
101
ela foi administrada via oral quanto pela via i.pl. Na Tabela 2 pode-se verificar
que além do antagonista para o receptor do PAF, o antagonista para receptor
de ET-1, o BQ-123, inibiu signicativamente o edema induzido por PAF. Alguns
trabalhos demonstram que o PAF pode causar a liberação de outros
mediadores inflamatórios (JANCAR et al., 1987). Assim, o fato da nirtetralina
inibir as ações do PAF pode estar relacionado a um mecanismo indireto de
ação e não diretamente sobre o receptor de PAF.
Ademais, alguns trabalhos evidenciam a possibilidade da existência de
mais de um receptor para o PAF (HERBERT et al., 1997). Esta hipótese,
juntamente com a variabilidade entre espécies, poderia explicar porque alguns
antagonistas para o receptor de PAF não conseguem ter o mesmo perfil de
atividade de outros. Um exemplo foi reportado pelo trabalho de HENRIQUES et
al. (1990), onde o WEB2086 não apresentou nenhum efeito em inibir as ações
exsudativas bem como a migração celular, induzidas pelo PAF ou pela Cg na
pleura de camundongos. Por outro lado, o WEB2170 inibiu efetivamente o
extravasamento plasmático induzido pelo PAF após uma hora da injeção
(HENRIQUES et al., 1990). De maneira similar ao WEB2170, a nirantina
administrada via oral foi capaz de antagonizar as ações de extravasamento
plasmático induzido pelo PAF na pleura, mas não de inibir a migração
leucocitária (Figura 17).
As cininas são outro grupo de mediadores implicados nas respostas
nociceptivas e inflamatórias que avaliamos no presente trabalho. Estes
peptídeos têm sido amplamente estudados durante os últimos anos, e a
participação destes nos processos fisiopatológicos é cada vez mais
evidenciada, especialmente na inflamação e na indução da nocicepção
102
(CALIXTO et al., 2000, 2004). Tanto o EH como a FRL causaram inibição
pronunciada do edema de pata induzido pela injeção i.pl. de BK. Entretanto,
ambos o EH e a FRL (300 µM) falharam em deslocar a união específica da
[
3
H]-BK em membranas de íleo de rato (Figura 19). Estes resultados excluem a
participação direta destes extratos e/ou compostos de interagirem com o
receptor B
2
para a BK. A ação antiedematogênica destes extratos poderia
derivar de ação indireta em outros receptores e/ou vias transducionais, uma
vez que as ações inflamatórias da BK envolvem a liberação de outros
mediadores inflamatórios.
Os resultados do presente estudo demonstram ainda que os extratos
bem como as lignanas isoladas do P. amarus podem interferir com diversas
vias e/ou receptores envolvidos no processo inflamatório e/ou nociceptivo.
Entretanto, para cada lignana que deriva destes extratos parece haver
interação com mecanismos de ação distinta no processo inflamatório.
A nirantina parece apresentar efeitos antiinflamatórios através da
inibição do receptor de PAF uma vez que esta lignana apresenta perfil
antiinflamatório semelhante ao WEB2170 (antagonista seletivo do receptor
para o PAF) e ainda desloca a união específica de [
3
H]-PAF. Em relação à
nirtetralina, o mecanismo de ação mais provável é o antagonismo do receptor
ET-1, tendo em vista que ela foi efetiva deslocar a união específica para [
125
I]-
ET-1 (HUSSAIN et al., 1995), além de ter apresentado perfil antiinflamatório
semelhante ao antagonista BQ-123 (presente estudo). Para a filtetralina, o
mecanismo exato de ação permanece indeterminado.
Em resumo, os resultados do presente estudo evidenciam que os
extratos, frações e as lignanas, especialmente a nirtetralina, filtetralina e
103
nirantina isolados de P. amarus apresentam ações antiinflamatória tanto em
modelos experimentais de inflamação aguda como crônica. Em relação ao
efeito antiinflamatório, este pode ser atribuído, pelo menos em parte, à
presença no EH das lignanas nirtetralina, filtetralina e nirantina envolvendo a
inibição de mediadores inflamatórios como BK, ET-1 ou PAF. Além disso,
nossos dados demonstram que a lignana nirtetralina administrada in vivo
antagonizou de maneira expressiva as respostas inflamatórias e nociceptivas
causadas pela ET-1. No entando, no caso da nirtetralina o principal alvo de
ação parece ser o receptor de PAF. Em relação à dor, o EH, a fração F2 e a F3
demontraram efeitos anti-nociceptivos em modelos experimentais de dor.
Entretanto, os resultados evidenciam que os compostos que apresentam ações
anti-nociceptivas estão presentes nas F2 e F3 e o mecanismo de ação
analgésica destes compostos poderia estar relacionado com a modulação do
receptor TRPV1. Estes resultados sugerem que os extratos do P. amarus
possuem composto(s) capaz(es) de se ligar em receptores TRPV1, sendo de
grande importância para perspectiva do estudo dos compostos derivados de P.
amarus na nocicepção.
104
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