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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
José Inácio Lemos Monteiro Carvalho
Participação dos receptores canabinóides cerebrais
na tolerância rápida e aguda do álcool.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Farmacologia do Centro de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Santa Catarina como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Profª Drª Gina Struffaldi Morato
Florianópolis-SC
2006
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CARVALHO, J.I.L.M. Participação dos receptores canabinóides cerebrais na tolerância rápida e aguda
do álcool. Florianópolis, 2005. 97p. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Curso de Pós-graduação em
Farmacologia, Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadora: Gina Struffaldi Morato
Defesa: 17/02/2006.
Evidências sugerem que o sistema de [neurotransmissão endocanabinóide] modula o consumo de [álcool]. Trabalhos prévios do
laboratório mostraram o desenvolvimento de [tolerância rápida] cruzada entre [etanol] e ∆
9
-tetrahidrocannabinol, porém pouco se sabe
sobre o envolvimento desse sistema de neurotransmissão na [tolerância ao etanol]. Diante disso, o presente estudo apresentou como
objetivo inicial estudar o envolvimento dos [receptores canabinóides (CB1) cerebrais] nas [tolerâncias rápida e aguda ao etanol].
Observou-se que a administração sistêmica (i.p.) e intracerebroventricular (i.c.v.) do antagonista CB1 SR141716 (SR) bloquearam o
desenvolvimento da [tolerância rápida] à incoordenação motora induzida por [etanol], sendo esse efeito revertido pelo agonista CB1
WIN55,212-2. Nos experimentos de [tolerância aguda], a administração i.c.v. de SR reduziu as concentrações plasmáticas de [álcool],
efeito revertido por WIN55,212-2, sem no entanto interferir no prejuízo motor. Para tentar compreender se a redução das concentrações
plasmáticas de [álcool] era devida a uma maior eliminação da droga, foram realizadas avaliações cardiovasculares e dosagem de [etanol]
na urina. A administração i.c.v. de SR não alterou o volume urinário, porém reduziu a concentração de [etanol] na urina do grupo tratado
com a maior dose (4µg). A administração i.p. de etanol reduziu a pressão arterial (PA) de ratos anestesiados, não alterando a freqüência
cardíaca (FC). A administração i.c.v. de SR (2µg) não alterou os valores cardiovasculares basais (PA e FC), porém aumentou
significativamente a FC dos animais tratados com etanol. Tomados em conjunto, os dados do presente estudo sugerem um envolvimento
importante dos [receptores CB1 cerebrais] na [tolerância] e sensibilidade ao [etanol], bem como nas alterações cardiovasculares e nas
concentrações plasmáticas de [etanol].
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"Serei eu, porque nada é impossível,
Vários trazidos de outros mundos e,
No mesmo ponto espacial sensível
Que sou eu, sendo eu por estar aqui?”
Fernando Pessoa
À minha mãe Isabel, à minha avó Izabel e à minha tia
Isolina por me ensinarem que, para atingir meus objetivos, duas
questões são fundamentais: dedicação própria e ajuda dos outros.
Às professoras Gina e Setsuko por despertarem e
alimentarem minha paixão por farmacologia e neurociências.
AGRADECIMENTOS
Agradecer é um gesto de humildade: por reconhecer que tudo que foi conquistado
só foi possível por causa da ajuda de muitos e, um exercício de memória: na tentativa de
lembrar das muitas pessoas que foram importantes para que objetivos fossem convertidos
em bons resultados.
Em primeiro lugar gostaria de agradecer a uma “Força Superior” que, quando
pequeno, fui ensinado a chamar de Deus. Apesar de não acreditar algumas vezes, sempre
que pedi ajuda e força, eu a recebi, muitas vezes sem saber de onde.
À minha querida mãe Isabel que sempre me ensinou, através de seus atos, a
importância de buscar as coisas nas quais acredito e me dedicar para conquistá-las. Por me
ensinar que o importante é “o ser” e não “o ter” e, que guardar rancor das pessoas é sempre
mais prejudicial a mim mesmo. Enfim, por tudo de bom que existe em mim agradeço, pelo
amor, pelo incentivo e por oferecer, mesmo com muito sacrifício, uma excelente educação.
À minha avó Izabel, pelo excelente exemplo de simplicidade e bondade, pelas
palavras sábias e pelos ensinamentos.
À minha tia Isolina, que sempre foi uma mãe, por todo carinho e incentivo e por
possibilitar que eu continuasse os estudos e viesse para Florianópolis.
Aos meus irmãos: Camila, Carina, Tarcisio, Jivago e, principalmente, Chiara, pelo
enorme incentivo e pelas demonstrações de carinho, mesmo “estranhas” às vezes.
Aos meus tios Zeca, Iraci, Ivanilde e Irene que, mesmo longe, sempre torceram
pelo meu sucesso.
À minha orientadora, professora Gina, por me aceitar sem me conhecer, por me
incentivar mesmo quando nada ia bem e não havia resultados e, principalmente, por
valorizar meu trabalho e minha pessoa, ajudando-me em tudo sempre.
À professora Setsuko, por me dar acesso ao meio científico ao abrir as portas do
Laboratório de Neurofisiologia, quando todas as outras me tinham sido fechadas, pelo
enorme incentivo e pela valorização do meu trabalho e da minha pessoa.
À professora Vânia e a seu aluno Enéas pelo incentivo, pelas dicas e pela enorme
ajuda durante a preparação para a seleção do mestrado.
Aos amigos de laboratório: Rafael Varaschin, Maristela, Leonardo, Marcos,
Fabiana, Rafael Mariano e Saulo, por me ajudarem em tudo e por permitirem que esse
trabalho fosse realizado, por toda ajuda nos experimentos, pelos momentos de
descontração, pela amizade, pelo incentivo. Obrigado, o trabalho é nosso, reconheço isso.
Aos professores do departamento de farmacologia: Giles, por quebrar paradigmas
e dogmas aprendidos na graduação; Calixto e Marta, por me darem oportunidade de
descobrir “dotes artísticos”; Rogério, pela amizade e pelas discussões espirituais; Thereza,
pelo incentivo; Rosa, por ceder equipamentos utilizados nas coletas urinárias de álcool;
Pádua, pela amizade e incentivo principalmente no encaminhamento do doutorado;
Anicleto, pela preocupação e auxílio nas dosagens bioquímicas; Jamil, pelas excelentes
“dicas” e sugestões e por ceder espaço e equipamentos utilizados na segunda fase de
experimentos e ao professor Reinaldo pela amizade, pela valorização do meu trabalho e
pelas excelentes sugestões.
Aos amigos do Laboratório do Óxido Nítrico por toda a ajuda na segunda fase de
experimentos, em especial ao amigo Daniel, não apenas por realizar os experimentos
cardiovasculares, mas principalmente, por torcer para que as coisas “fluíssem bem”, por
ficar feliz com os bons resultados e por valorizar meu trabalho, enfim pela enorme ajuda e
pela amizade.
Aos demais amigos do departamento, em especial aos amigos dos laboratórios de
sistema nervoso central pelo excelente convívio, pelas brincadeiras e pela amizade.
Aos funcionários do departamento de farmacologia, secretárias, bioteristas (Pedro
e Redna, especialmente) e serventes que ofereceram as condições necessárias para o
desenvolvimento do meu mestrado.
À professora Rosângela e à sua aluna Valdelúcia, do departamento de Bioquímica,
pela gentileza em ceder seu laboratório e seus equipamentos para que as dosagens
bioquímicas fossem realizadas no período em que o espectrofotômetro da farmacologia
estava descalibrado.
Aos funcionários do Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Universitário
pela gentileza em ceder o espaço e os equipamentos para realização dos primeiros cortes
histológicos.
Aos amigos da turma da UFPA, em especial ao pessoal do Laboratório de
Neurofisiologia do Sistema Visual, pela amizade e incentivo.
Aos amigos da “terrinha” Castanhal por acreditarem em mim, mais que eu
mesmo, às vezes, e por sempre estarem dispostos a dar apoio moral, principalmente nos
momentos de “crises depressivas”.
Aos amigos Felipe, Ronaldo, Emanuelle, Simoni, Luciana, Clarissa, Evanir,
Ernani, Almir e Adriano que me apoiaram e me incentivaram de alguma forma durante esse
tempo em Florianópolis, pelas brincadeiras e pelos momentos de discussões filosóficas.
Às amigas Graziele e Eliana, pela amizade, pelo apoio enorme e pelas discussões
que me ajudaram na escrita do trabalho.
Aos amigos Ricardo, Laydiane, Paula, Natalle, Jairo, Fabiano e Lilian pela força e
pela amizade, apesar do tempo e da distância.
Às pessoas que se dedicam à ciência, em especial pesquisadores que se dedicam
ao estudo do Sistema Nervoso Central. Aos pesquisadores que estudam modelos de
alcoolismo e/ou sistema endocanabinóide, por oferecerem o embasamento teórico para que
objetivos fossem determinados, resultados interpretados e discutidos e, conclusões
propostas. Gostaria de agradecer em especial à pesquisadora Lena Kristoffersen do
“Norwegian Institute of Public Health Division of Forensic Toxicology and Drug Abuse”
pela gentileza em enviar seus trabalhos e por se dispor a ajudar e esclarecer dúvidas em
relação à dosagem alcoólica, principalmente nas amostras de urina.
À Indústria Farmacêutica Sanofi-Aventis pela doação do antagonista SR141716,
essencial para a realização desse trabalho.
À CAPES, ao CNPq e à FAPESC pelo auxílio financeiro.
Aos animais utilizados nesse estudo que, apesar de serem considerados por alguns
seres inferiores a nós, nos auxiliam na compreensão de fenômenos biológicos que ocorrem
também em humanos.
Enfim, a todos que foram importantes antes e durante o tempo em que essa
dissertação foi desenvolvida. Obrigado a todos!
i
SUMÁRIO
Lista de abreviações iv
Lista de Figuras vi
Resumo vii
Abstract viii
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Dados históricos. 1
1.2. Farmacocinética do etanol. 4
1.3. Efeitos do álcool sobre os principais sistemas orgânicos. 7
1.4. Efeitos do etanol no sistema nervoso central. 10
1.5. Canabinóides e sistema endocanabinóide. 13
1.6. Modulação dos efeitos do etanol pelo sistema endocanabinóide. 19
1.7. O fenômeno da tolerância. 20
2. OBJETIVOS 24
2.1. Objetivo geral. 24
2.2. Objetivos específicos iniciais. 24
2.3. Objetivos específicos secundários. 24
3. MATERIAL E MÉTODOS 25
3.1. Animais. 25
3.2. Drogas e reagentes. 25
ii
3.3. Cirurgia estereotáxica. 26
3.4. Teste do plano inclinado. 27
3.5. Dosagem alcoólica. 29
3.6. Registros de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC). 31
3.7. Procedimentos experimentais. 32
3.7.1. Experimento 1: efeito da administração sistêmica
do antagonista canabinóide SR141716 na tolerância rápida ao etanol. 32
3.7.2. Experimento 2: efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.)
do antagonista canabinóide SR141716 na tolerância rápida ao etanol. 33
3.7.3. Experimento 3: efeito da administração do agonista
canabinóide WIN55,212-2 após a administração do antagonista
SR141716 na tolerância rápida ao etanol. 34
3.7.4. Experimento 4: efeito da administração de diferentes doses
de etanol na tolerância aguda. 35
3.7.5. Experimento 5: efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.)
do antagonista CB1 na tolerância aguda ao etanol. 35
3.7.6. Experimento 6: efeito da administração do agonista CB1
após a administração do antagonista na tolerância aguda ao etanol. 36
3.7.7. Experimento 7: efeito da administração central do antagonista CB1
na concentração de etanol na urina. 36
3.7.8. Experimento 8: efeito da administração central do antagonista CB1
nas alterações cardiovasculares promovidas pelo etanol. 37
3.8. Perfusão e histologia. 37
3.9. Análise gráfica e estatística. 38
iii
4. RESULTADOS 40
4.1. Efeito da administração sistêmica de SR141716
na tolerância rápida ao etanol. 40
4.2. Efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.) de SR141716
na tolerância rápida ao etanol. 41
4.3. Efeito da administração do agonista canabinóide (WIN 55,212-2)
Sobre o efeito do antagonista CB1 na tolerância rápida ao etanol. 43
4.4. Tolerância aguda para diferentes doses de etanol. 44
4.5. Efeito da administração i.c.v. de SR141716
na tolerância aguda ao etanol. 46
4.6. Influência do agonista canabinóide (WIN 55,212-2) na redução
das concentrações sangüíneas de etanol causada pelo SR141716. 46
4.7. Efeitos da administração de SR141716
na concentração de etanol na urina. 49
4.8. Efeitos da administração i.c.v. de SR141716
nas alterações cardiovasculares promovidas pelo etanol. 50
5. DISCUSSÃO 52
6. CONCLUSÕES 67
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68
iv
LISTA DE ABREVIAÇÕES
2-AG endocanabinóide 2-araquidonilglicerol
∆
9
-THC delta -9- tetrahidrocanabinol
ADH enzima álcool dehidrogenase
ALDH enzima aldeídol dehidrogenase
ANOVA Análise de variância
bpm batimentos por minuto
CB1 receptor canabinóide CB1
CEBRID Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas Psicotrópicas
CYP2E1 subtipo de enzima citocromo oxidase
DAG diacilglicerol
DGL diacilglicerol lipase
DSM-I Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders I
E etanol
EPM erro padrão da média
FC freqüência cardíaca
GABA
A
receptor ionotrópico do ácido γaminobutírico (GABA)
G
i/0
proteína G inibitória
HDL lipoproteínas de alta densidade
i.c.v. intracerebroventricular
i.m. intramuscular
i.p. intraperitoneal
Lyso-PL 2-araquidonil-lisofosfolipídio (precurssor do 2-AG)
v
MEOS sistema microssômico de oxidação do etanol
NMDA n-metil-d-aspartato (receptor ionotrópico do glutamato)
PA pressão arterial
PLC fosfolipase C
S salina
SR antagonista canabinóide SR141716
WIN agonista canabinóide WIN55,212-2
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Modelo esquemático das reações enzimáticas responsáveis
pelo metabolismo hepático do etanol e acetaldeído. 6
Figura 2: Sinalização retrógrada dos endocanabinóides no hipocampo. 17
Figura 3: Distribuição de receptores canabinóides CB1 no cérebro de rato. 18
Figura 4: Teste do plano inclinado. 28
Figura 5: Exemplo de uma curva padrão típica de dosagem alcoólica. 31
Figura 6: Fenômeno da tolerância rápida. 40
Figura 7: Efeito da administração sistêmica de SR141716 na tolerância rápida. 42
Figura 8: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 na tolerância rápida. 43
Figura 9: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 e
WIN55,212-2 na tolerância rápida. 44
Figura 10: Efeito da administração de diferentes doses de etanol
na tolerância aguda. 45
Figura 11: Efeito da administração i.c.v. de SR141716
na tolerância aguda ao etanol. 47
Figura 12: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 e
WIN55,212-2 na tolerância aguda. 48
Figura 13: Efeito da administração intracerebroventricular
do antagonista CB1 na concentração de etanol na urina. 49
Figura 14: Efeito da administração intracerebroventricular do
antagonista CB1 nas alterações cardiovasculares promovidas
pela administração sistêmica de etanol. 51
vii
RESUMO
Evidências sugerem que o sistema de neurotransmissão endocanabinóide modula o
consumo de álcool. Trabalhos prévios do laboratório mostraram o desenvolvimento de
tolerância rápida cruzada entre etanol e ∆
9
-tetrahidrocannabinol, porém pouco se sabe sobre
o envolvimento desse sistema de neurotransmissão na tolerância ao etanol. Diante disso, o
presente estudo apresentou como objetivo inicial estudar o envolvimento dos receptores
canabinóides (CB1) cerebrais nas tolerâncias rápida e aguda ao etanol. Observou-se que a
administração sistêmica (i.p.) e intracerebroventricular (i.c.v.) do antagonista CB1
SR141716 (SR) bloquearam o desenvolvimento da tolerância rápida à incoordenação
motora induzida por etanol, sendo esse efeito revertido pelo agonista CB1 WIN55,212-2.
Nos experimentos de tolerância aguda, a administração i.c.v. de SR reduziu as
concentrações plasmáticas de álcool, efeito revertido por WIN55,212-2, sem no entanto
interferir no prejuízo motor. Para tentar compreender se a redução das concentrações
plasmáticas de álcool era devida a uma maior eliminação da droga, foram realizadas
avaliações cardiovasculares e dosagem de etanol na urina. A administração i.c.v. de SR não
alterou o volume urinário, porém reduziu a concentração de etanol na urina do grupo
tratado com a maior dose (4µg). A administração i.p. de etanol reduziu a pressão arterial
(PA) de ratos anestesiados, não alterando a freqüência cardíaca (FC). A administração i.c.v.
de SR (2µg) não alterou os valores cardiovasculares basais (PA e FC), porém aumentou
significativamente a FC dos animais tratados com etanol. Tomados em conjunto, os dados
do presente estudo sugerem um envolvimento importante dos receptores CB1 cerebrais na
tolerância e sensibilidade ao etanol, bem como nas alterações cardiovasculares e nas
concentrações plasmáticas de etanol.
viii
ABSTRACT
An increasing body of evidence suggests that the endocannabinoid signaling system
modulates ethanol consumption. Our previous studies have shown the development of rapid
cross tolerance between ethanol and ∆
9
- tetrahydrocannabinol. However there is a paucity
of data regarding the involvement of the endocannabinoid system on ethanol tolerance.
Thus, the aim of this study is to investigate the involvement of CB1 receptors on
development of rapid and acute tolerance to ethanol in rats. It was observed that systemic
(i.p.) and intracerebroventricular (i.c.v.) injections of CB1 receptor antagonist SR141716
(SR) blocked rapid tolerance to ethanol, and this effect was reverted by CB1 receptor
agonist WIN55,212-2 (WIN). On acute experiments, the i.c.v. injection of SR reduced
blood ethanol concentration (BEC), an effect reverted by WIN, without affecting animal
motor performance. In order to verify if the reduction in BEC caused by SR was correlated
with higher elimination of ethanol, we performed a cardiovascular evaluation and the
measurement of urine ethanol concentrations. The i.c.v. administration of SR did not affect
urinary volume, but it reduced ethanol urine concentration when used at the higher dose
(4µg). The i.p. administration of ethanol reduced blood pressure (BP) in anesthetized rats,
but it did not altered heart rate (HR). The i.c.v. administration of SR (2 µg) did not affect
basal cardiovascular values, but increased HR of rats treated with ethanol. Taken together,
the present results suggest that the endocannabinoid system are involved in development of
ethanol tolerance, as well as in cardiovascular changes and ethanol blood concentrations.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Dados históricos
O consumo de substâncias psicoativas é praticado pelo homem há milhares de
anos, estando associado a questões geográficas, econômicas e sócio-culturais. Dentre as
drogas de uso mais antigo destacam-se o álcool etílico (etanol) e os derivados da Cannabis
sativa (canabinóides) que, segundo estimativas, datam de aproximadamente 10.000 anos
atrás.
Acredita-se que a bebida alcoólica teve origem na Pré-História (Masur, 1984)
provavelmente durante o período Neolítico com o aparecimento da agricultura. A partir de
um processo de fermentação natural, o ser humano passou a consumir e a atribuir diferentes
significados ao álcool. Sociedades antigas como celtas, gregos, romanos, egípcios e
babilônios registraram de alguma forma o consumo e a produção de bebidas alcoólicas.
O solo e o clima na Grécia e em Roma eram especialmente ricos para o cultivo da
uva e fabricação do vinho. Os gregos e romanos conheciam a fermentação do mel e da
cevada, porém o vinho era a bebida mais difundida nos dois impérios tendo importância
social, religiosa e terapêutica. Na Grécia Antiga, o dramaturgo Eurípedes (484 a.C. - 406
a.C.) mencionou nas “Bacantes” duas divindades de primeira grandeza para os humanos:
Deméter, a deusa da agricultura que fornece alimentos sólidos para nutrir os humanos, e
Dionísio, o Deus do vinho e da festa (Baco para os Romanos). Apesar do vinho participar
ativamente das celebrações sociais e religiosas greco-romanas, o abuso de álcool e a
embriaguez alcoólica já eram severamente censurados pelos dois povos (Vallee, 1994).
Os egípcios deixaram documentadas nos papiros as etapas de fabricação,
produção e comercialização da cerveja e do vinho. Eles também acreditavam que as
2
bebidas fermentadas eliminavam germes e parasitas, devendo ser usadas como
medicamentos, especialmente na luta contra parasitas provenientes das águas do Nilo.
Na Idade Média, a comercialização do vinho e da cerveja cresceu, assim como
sua regulamentação. A intoxicação alcoólica deixou de ser apenas condenada pela igreja
passando a ser considerada como pecado por esta instituição.
Durante a Renascença iniciou-se a fiscalização dos cabarés e tabernas, sendo
estipulados horários de funcionamento destes locais. Os cabarés e tabernas eram
considerados locais onde as pessoas podiam se manifestar livremente e o uso de álcool
estava presente nos debates políticos que mais tarde desencadearam a Revolução Francesa.
O fim do século XVIII e o início da Revolução Industrial foram acompanhados de
mudanças demográficas e de comportamentos sociais na Europa. Foi durante este período
que o uso excessivo de bebida passou a ser visto por alguns como uma doença ou
desordem. Na primeira metade do século XIX, estudiosos estabeleceram diferenças entre
bebidas destiladas e fermentadas, em especial o vinho. Neste sentido Pasteur, em 1865, não
encontrando germes maléficos no vinho, declarou que esta era a mais higiênica das
bebidas. No início do século XX, alguns países, como a França, estabeleceram a idade de
18 anos, como mínima para o consumo de álcool. Em janeiro de 1920, o Estado Americano
decretou a Lei Seca que teve duração aproximada de 12 anos. Esta Lei proibia a fabricação,
venda, troca, transporte, importação, exportação, distribuição, posse e consumo de bebida
alcoólica e foi considerada por muitos como um desastre para a saúde pública e economia
americanas. Em 1952, a primeira edição do DSM-I (Diagnostic and Statistical Manual of
Mental Disorders) incluiu o alcoolismo como doença a ser tratada (adaptado de: CISA -
Centro de Informações sobre Saúde e Álcool. História do Álcool. Disponível em: <
http://www.cisa.org.br
>. Acesso em 10/12/2005).
3
Por outro lado, a Cannabis era utilizada para a obtenção de fibras, óleo, sementes,
consumidas como alimento e por suas propriedades alucinógenas. A planta parece ser
originária da China, apesar de outras evidências apontarem para a Ásia Central. O famoso
“Pen Tsao Ching”, farmacopéia escrita em 100 d.C., baseada nas compilações de plantas
com propriedades farmacológicas do imperador Shen Nung (2737 a.C.), mostra que os
chineses já conheciam há alguns milênios as propriedades alucinógenas da Cannabis.
Nesses períodos, a utilização da planta estava intrinsecamente ligada ao misticismo e ao
curandeirismo (Grinspoon, 1995).
Ainda atualmente, a maconha possui grande influência sobre a cultura hindu.
Segundo tradição popular da Índia, a planta fora um presente dos deuses aos homens, capaz
de provê-los de prazer, coragem e atender a seus desejos sexuais. A planta teria brotado
pela primeira vez quando gotas do néctar dos deuses (Amrita) se derramaram sobre a Terra.
Nos Himalaias indianos e no Tibet as preparações a base de Cannabis encontram grande
importância no contexto religioso. Sadhus (homens sagrados) dedicam sua vida à deusa
Shiva, não possuem qualquer bem e praticam ioga e meditação, sendo o consumo de
maconha parte de seus rituais (adaptado de: Programa Álcool e Drogas (PAD) do Hospital
Israelita Albert Einstein. Site Álcool e Drogas sem Distorção. História da Maconha.
Disponível em: <www.einsten.br/alcooledrogas
>. Acesso em 10/12/2005).
Apesar de bastante antigo, o uso e abuso de etanol e Cannabis permanecem nos
dias atuais, sendo influenciados por aspectos geográficos e principalmente culturais. Sabe-
se que o etanol é a droga psicoativa mais consumida no Ocidente. Entretanto, seu uso é
praticamente inexistente no Oriente Médio. No Ocidente o uso de etanol é lícito ao
contrário do uso de Cannabis. No Oriente Médio ocorre o oposto, o uso de Cannabis é
4
aceito e considerado sagrado, ainda hoje, sendo, contudo, o uso de álcool proibido e
punido.
No Brasil, estatísticas do I Levantamento Domiciliar sobre o Uso de Drogas
Psicotrópicas feito pelo CEBRID em 2001 reforçam a influência cultural no consumo de
drogas. O álcool é a substância psicotrópica mais consumida no Brasil, apresentando uma
prevalência de 68,7% de uso na vida dos entrevistados. Já a maconha é a terceira droga
mais usada com prevalência de 6,9%.
Em virtude do uso difundido e abrangente, problemas relacionados ao álcool são
mais relatados que os problemas promovidos pelo uso de Cannabis no Brasil. Dados do
levantamento do CEBRID apontam diversos problemas decorrentes do uso de álcool:
tempo gasto em atividades relacionadas à droga (4,4%), freqüência de consumo elevada
acima da pretendida (9,4%), tolerância mencionada como necessidades maiores da droga
para obtenção de efeitos similares (5,8%), riscos físicos na execução de atividades sobre o
efeito da droga (6,2%), problemas pessoais relativos ao trabalho, família ou amigos (7,1%)
e ainda insucesso nas tentativas de parar ou diminuir o consumo (14,5%) estão presentes na
vida de muitos brasileiros.
1.2. Farmacocinética do etanol.
Os efeitos centrais do etanol estão diretamente relacionados aos níveis
plasmáticos após o consumo da droga. Existem três aspectos básicos que determinam a
farmacocinética do álcool: sua absorção, que ocorre no estômago e principalmente no
intestino delgado, sua distribuição pela circulação sangüínea e seu metabolismo e
eliminação.
5
Após administração por via oral, uma parcela do etanol sofre metabolismo de
primeira passagem no estômago por ação da enzima álcool dehidrogenase gástrica, o
restante chega ao trato intestinal onde é facilmente absorvido pelas paredes do intestino
delgado, de onde é distribuído por todo o corpo através da circulação sistêmica (Matsumoto
& Fukui, 2002; Caballeria, 2003). Após absorção, o álcool sofre metabolismo oxidativo no
fígado, sendo transformado em acetaldeído (metabólito tóxico) e posteriormente em acetato
(Lieber, 1997; Salaspuro, 1999).
A figura 1 ilustra, de maneira esquemática, as três reações de oxidação
responsáveis pelo metabolismo do etanol a acetaldeído, e a reação responsável pela
degradação do acetaldeído a acetato. O metabolismo hepático do etanol é catalizado
principalmente pela enzima álcool dehidrogenase (ADH), apresentando o composto
nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado (NAD
+
) como cofator. Existem diversas
isoformas de ADH que variam de classes I a VII, sendo as classes I, II e IV mais eficazes
no metabolismo do álcool (Matsumoto & Fukui, 2002; Caballeria, 2003). A conversão do
etanol a acetaldeído pela ADH é uma reação de oxidação que reduz o cofator NAD
+
a
NADH.
O sistema microssômico de oxidação do etanol (MEOS) constitui o segundo
mecanismo capaz de oxidar o álcool. A enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1), principal
representante deste sistema, converte etanol a acetaldeído através da redução do cofator
NAD
+
. Este sistema tem pequena contribuição no metabolismo do álcool quando
concentrações plasmáticas são menores que 10 mM, porém pode ter sua atividade
aumentada em conseqüência do consumo de grandes quantidades de álcool, contribuindo
com 50% do total do etanol metabolizado com concentrações plasmáticas de 100 mM
(Matsumoto et al., 1994). Após uso crônico de álcool, ocorre um aumento na transcrição da
6
enzima CYP2E1 favorecendo o metabolismo pelo sistema microssômico (Badger et al.,
1993). A catalase presente nos peroxissomos também pode converter etanol a acetaldeído,
porém apenas experimentos “in vitro” têm demonstrado esse fenômeno, sendo descartada
a importância dessa via no metabolismo hepático (Matsumoto & Fukui, 2002; Caballeria,
2003). Entretanto, estudos recentes têm mostrado uma participação importante dessa via no
metabolismo de etanol no cérebro (Tampier & Quintanilla, 2003).
Figura 1: Modelo esquemático das reações enzimáticas responsáveis pelo metabolismo hepático do etanol e
acetaldeído. Adaptado de Caballeria, 2003.
O acetaldeído, formado após degradação inicial do etanol, é tóxico ao organismo
e sofre rápido metabolismo oxidativo pela forma mitocondrial da enzima aldeído
dehidrogenase (ALDH) com redução do cofator NAD
+
a NADH. Assim como a ADH, a
ALDH também apresenta diversas isoformas. Algumas isoformas de ADH e ALDH, por
apresentarem metabolização menos eficiente de álcool ou acetadeído, estão associadas à
Aldeído
Dehidrogenase
Álcool
Dehidrogenase
7
suscetibilidade aumentada aos efeitos desagradáveis e menor risco de desenvolver
dependência (Matsumoto & Fukui, 2002; Caballeria, 2003).
1.3. Efeitos do álcool sobre os principais sistemas orgânicos.
Após absorção, o etanol é amplamente distribuído através da circulação
sangüínea, exercendo efeitos em praticamente todos os tecidos. Algumas das diversas ações
sistêmicas do etanol encontram-se resumidas abaixo.
Grande parcela dos alcoolistas crônicos desenvolve sérios problemas hepáticos. A
suscetibilidade a hepatite e cirrose é influenciada por fatores como genética, sexo, dieta e
doenças hepáticas co-existentes. A maioria dos danos hepáticos é atribuída a produtos
provenientes do metabolismo hepático do etanol. No fígado, a lesão tecidual pode ser
causada diretamente por bioprodutos do metabolismo ou por inflamação induzida por esses
compostos químicos. A exposição do fígado a toxinas bacterianas também pode contribuir
para doenças hepáticas decorrentes do uso crônico de etanol. Progressivamente, o dano
hepático promovido pelo álcool pode evoluir para fibrose tecidual e cirrose hepática
(Maher, 1997).
No tecido pancreático o etanol pode promover inflamações (pancreatites) fatais
após uso crônico. Essas inflamações podem ser resultantes do bloqueio dos ductos
pancreáticos menores ou da destruição tecidual promovida por enzimas digestivas. Além
disso, bioprodutos do metabolismo do etanol podem danificar membranas das células
pancreáticas (Apte et al., 1997).
O consumo de etanol pode ser benéfico ou prejudicial ao sistema cardiovascular
dependendo da quantidade ingerida e das características do consumo. Diversos mecanismos
moleculares e celulares estão envolvidos nos efeitos benéficos do consumo moderado de
8
etanol. Dentre eles é importante mencionar o aumento da concentração sangüínea de
lipoprotreínas de alta densidade (HDL), alterações na agregação plaquetária e a estimulação
da dissolução de coágulos sangüíneos. Sendo assim, há dados sugerindo que o consumo
moderado de etanol pode ser útil na prevenção de doenças cardiovasculares como a doença
arterial coronariana e infarto do miocárdio. Embora o consumo leve a moderado de álcool
apresente efeito benéfico, consumo crônico pode promover danos ao sistema cardiovascular
como distúrbios do músculo cardíaco, alterações do ritmo cardíaco (arritmias) e
hipertensão, dentre outros (Zakhari, 1997; Lucas et al., 2005). Agudamente, a
administração de etanol promove redução na pressão arterial devido a vasodilatação e
diminuição da resistência vascular periférica (Puddey et al., 2001).
Alcoólicos freqüentemente são acometidos por doenças infecciosas e têm maior
predisposição a alguns tipos de câncer, indicando que o consumo crônico de etanol pode ser
prejudicial ao sistema imunológico. O álcool inibe a fagocitose e a destruição de
microorganismos invasores pelos macrófagos, monócitos e neutrófilos. O consumo agudo
ou crônico de etanol altera a produção de citocinas (mediadores importantes na resposta
imunológica), prejudicando a resposta imune contra agentes específicos e a memória
imunológica através de linfócitos T e B. Em alcoólicos crônicos, essas alterações resultam
em suscetibilidade aumentada a infecções bacterianas (turberculose e pneumonia, por
exemplo) e virais como AIDS (Szabo, 1997).
Alterações morfológicas e funcionais podem ocorrer nas células sangüíneas após
uso excessivo e crônico de etanol. Pode-se observar inibição da produção de células
sangüíneas (hematopoese) ou produção de células precursoras anormais incapazes de
originar células maduras e funcionais. Alcoolistas freqüentemente apresentam anemia
resultante da destruição prematura dos eritrócitos. O etanol também pode interferir com as
9
células brancas (leucócitos) prejudicando a resposta imune conforme mencionado acima. A
função plaquetária e de outros componentes do sistema de coagulação também podem ser
afetados pelo uso repetido de álcool (Ballard, 1997).
Alterações no sistema endócrino promovidas pelo álcool podem promover amplas
conseqüências no corpo todo. Distúrbios hormonais promovidos pelo etanol podem resultar
em anormalidades cardiovasculares e problemas no sistema reprodutor tanto em homens
quanto em mulheres. Além disso, podem ocorrer doenças ósseas e distúrbios na função
imune decorrentes de alterações hormonais (Emanuele & Emanuele, 1997).
No trato gastrintestinal, o etanol pode afetar diversas estruturas, prejudicando, por
exemplo, o funcionamento dos músculos que separam o esôfago do estômago e
promovendo azia e desconforto. Danos na mucosa esofágica que aumentam os riscos de
câncer nessa estrutura são comuns após uso crônico de etanol. No estômago, o álcool pode
interferir com secreção de ácido gástrico e com a atividade das células musculares vizinhas.
Prejuízos na contratilidade dos intestinos delgado e grosso podem resultar em diarréia que é
freqüente em alcoólicos. O etanol também pode inibir a absorção de nutrientes no intestino
delgado e aumentar o transporte de toxinas através das paredes intestinais, promovendo
dano hepático e de outros tecidos (Bode & Bode, 1997).
Com uso agudo, o etanol apresenta um efeito diurético bem conhecido devido à
inibição da secreção do hormônio antidiurético (Ragland, 1990; Rodrigo et al., 1998). Após
uso crônico de etanol, observam-se modificações na estrutura e função renal, prejuízo na
habilidade dos rins em regular o volume e a composição dos fluidos e eletrólitos corporais,
além de prejuízos no equilíbrio ácido-base. O álcool também pode prejudicar os
mecanismos hormonais que regulam a função renal. Alterações ligadas aos danos hepáticos
10
podem aumentar os efeitos prejudiciais do álcool nos rins podendo resultar em falência
renal (Epstein, 1997).
1.4. Efeitos do etanol no sistema nervoso central.
Como visto acima, o etanol pode afetar diversos sistemas orgânicos, entretanto, os
efeitos mais marcantes da droga devem-se a ações nos neurônios. O álcool é um depressor,
com alguns efeitos semelhantes ao de outras substâncias depressoras como hipnótico-
sedativos e anestésicos. Apesar da infinidade de efeitos no cérebro, o etanol apresenta baixa
potência, observando-se o início dos efeitos apenas com concentrações plasmáticas de 5–10
mmol/L relativamente elevadas quando comparadas com outras drogas (Davies, 2002). De
maneira oposta ao efeito depressor, em concentrações sangüíneas abaixo de 50 mg/dl, o
etanol apresenta efeitos semelhantes ao de drogas estimulantes, isso ocorre provavelmente
pela inibição de sinapses inibitórias, resultando em sensações de excitação e euforia,
podendo promover agitação e agressividade. Com o aumento da concentração plasmática
(50 mg/dl – 100mg/dl) observam-se os efeitos depressores: distúrbios no equilíbrio,
concentração e tempo de resposta aumentado. Níveis plasmáticos mais elevados (100 – 150
mg/dl) promovem ataxia, dificuldade na articulação de palavras e prejuízos na função
motora e mental, incluindo distúrbios na memória de curta duração. Concentrações mais
altas levam progressivamente à perda dos sentidos (200 – 300 mg/dl), coma e morte por
parada respiratória (acima de 500 mg/dl) (Pohorecky & Brick, 1988).
Em virtude de sua estrutura molecular simples e elevada lipossolubilidade,
durante muitos anos acreditou-se que os efeitos do etanol no cérebro fossem devidos a
alterações na fluidez da matriz lipídica de membranas neuronais (Tabakoff & Hoffman,
1983). Embora a influência do etanol sobre as membranas celulares seja comprovada, esta
11
ação ocorre apenas em concentrações muito elevadas de etanol, não sendo observadas com
concentrações farmacologicamente relevantes (Wing et al., 1982; Nie et al., 1989).
Sendo assim, nos últimos anos muitos pesquisadores têm se dedicado a estudar
ações do álcool em proteínas celulares. Sabe-se atualmente que os principais alvos
moleculares do etanol são canais iônicos ativados por ligantes ou voltagem-dependentes
(Littleton & Little, 1994; Tabakoff & Hoffman, 1996; Chandler et al., 1998; Harris, 1999),
podendo também ser mensageiros intracelulares (Macdonald, 1995; Pandey, 1998).
Dentre os alvos protéicos do etanol destacam-se os receptores GABA
A
(
Aguayo et
al., 2002; Roberto et al., 2003), receptores NMDA (Lovinger et al., 1989; Ron, 2004)
e não
NMDA (Woodward, 2000; Carta et al., 2003) do glutamato, receptores serotonérgicos
(Lovinger & White, 1991; Lovinger et al., 2000), glicinérgicos (Mihic et al., 1997) e
nicotínicos centrais (Hodges et al., 1991; Cardoso et al., 1999), bem como canais de cálcio
ativados por voltagem (Wang et al., 1994; Widmer et al., 1998) e canais de potássio
retificadores acoplados a proteínas G (Kobayashi et al., 1999; Lewohl et al., 1999).
Os efeitos depressores do etanol são devidos principalmente a ações nos dois
maiores receptores ionotrópicos presentes no cérebro (GABA
A
e NMDA). O etanol
aumenta a condutância dos canais GABA
A
ao íon cloreto promovendo um aumento de
correntes inibitórias e potencializando a neurotrasnmissão GABAérgica (Allan & Harris,
1986; Suzdak et al., 1986; Weiner & Valenzuela, 2006), efeito revertido pelo antagonista
benzodiazepínico Ro15-4513 sugerindo um sítio de ação do etanol nesse sítio modulatório
(Suzdak et al., 1986; Harris, 1990). Os receptores NMDA são bloqueados pelo álcool,
ocorrendo diminuição do influxo de cátions por esse receptor e redução da excitabilidade
neuronal (Michaelis & Michaelis, 1994; Woodward, 2000; Kumari & Ticku, 2000). Além
disso, canais de cálcio ativados por voltagem são bloqueados pela administração aguda de
12
etanol contribuindo ainda mais para diminuição da excitabilidade neuronal, uma vez que
esses canais estão envolvidos na fusão e liberação de vesículas de neurotransmissores
(Wang et al., 1994; Widmer et al., 1998).
Assim como outras drogas de abuso, o uso crônico de álcool pode levar a
dependência, caracterizada pela compulsão pelo uso da droga e perda no controle da
ingestão da mesma (Nestler et al., 2004). Diversas neuroadaptações podem ser promovidas
pela ingestão crônica de etanol, principalmente nos sistemas GABAérgico e
glutamatérgico. Caso o consumo seja interrompido, essas neuroadaptações são
desbalanceadas e pode ser estabelecido um quadro clínico conhecido como síndrome de
abstinência, caracterizada por efeitos contrários aos promovidos pela droga e devida
principalmente a potenciação da neurotransmissão glutamatérgica. Em alcoólicos, a
abstinência ao etanol é caracterizada por tremores, convulsões e alucinações, e pelo
comportamento compulsivo de busca pela droga (“fissura”), ocorrendo geralmente de 6 a
48 h após a ingestão do último drinque (Hoffman & Tabakoff, 1994). Esses sintomas
podem ser fisiológicos e psicológicos e podem originar-se de diferentes substratos neurais
(Koob et al., 1992; Myrick & Anton, 1998; Saitz, 1998; Zaleski et al., 2004). Delirium
Tremens é uma síndrome mais séria que inclui confusão profunda, alucinações e severas
instabilidades autonômicas, podendo ocorrer cerca de 48-96 h após o último drinque
(Trevisan et al., 1998; DeBellis et al., 2005).
Diversos estudos têm sido feitos com objetivo de desenvolver drogas eficazes no
tratamento do alcoolismo. O dissulfiram é uma das drogas mais antigas e atua inibindo a
atividade da enzima aldeído dehidrogenase, aumentando as concentrações de acetaldeído
circulantes após a ingestão de bebidas alcoólicas, promovendo assim uma série de efeitos
13
desagradáveis como náuseas, vômitos, dores de cabeça e rubor facial. Trata-se de um
condicionamento aversivo que tem eficácia questionada (Masur & Del Porto, 1982).
Outro composto que tem sido utilizado na clínica é o acamprosato que atua
principalmente na redução de sintomas de abstinência através de interações com receptores
glutamatérgicos (Boothby & Doering, 2005; De Witte et al., 2005; Scott et al., 2005). Dois
compostos que reduzem o reforço positivo e a sensação prazerosa promovida pelo consumo
de álcool têm sido propostos como tratamentos úteis da dependência ao etanol. A
naltrexona, antagonista opióide em uso clínico desde 1990, atua diminuindo a sensação
prazerosa relacionada ao consumo de etanol, diminuindo também os episódios de
“recaídas”, provavelmente por inibir vias opioidérgias que modulam o sistema de
recompensa cerebral (Volpicelli et al., 1997; Spanagel & Zieglgansberger, 1997; Modesto-
Lowe & Fritz, 2005). Outro composto é o antagonista canabinóide SR141716, que modula
vias opioidérgicas, GABAérgicas e dopaminérgicas da via mesolímbica, parecendo
também ser útil na redução do consumo de etanol (González et al., 2004; Manzanares et
al., 2005).
1.5. Canabinóides e sistema endocanabinóide.
Os compostos derivados de Cannabis apresentam diversos efeitos centrais e
periféricos. Dentre os principais efeitos periféricos destacam-se hipotensão, taquicardia e
imunossupressão. Os efeitos centrais incluem sensações de euforia, relaxamento e
alterações sensoriais visuais e auditivas bem como estimulação do apetite, em doses baixas.
Já em doses elevadas, ocorre prejuízo motor e cognitivo, efeito hipotérmico e analgésico,
não ocorrendo, entretanto, depressão cardio-respiratória (para revisão ver Adams & Martin,
1996; Ameri, 1999; Iversen, 2003; Freund et al., 2003).
14
Com o isolamento e caracterização do principal composto psicoativo da Cannabis
(∆
9
-THC) por Gaoni e Mechoulam, em 1964, diversos pesquisadores sugeriram uma ação
inespecífica desta substância sobre membranas celulares neuronais por alterar a fluidez das
mesmas (Laurent & Roy, 1975; Roth & Willians, 1979; Bruggemann & Melchior, 1983),
de maneira similar ao que era sugerido para compostos de solubilidade elevada como o
etanol (mencionado anteriormente) e anestésicos gerais. Entretanto, em 1988, Devane et al.
detectaram sítios de ligação para o ∆
9
-THC no cérebro (receptores CB1) e, dois anos mais
tarde, esses receptores foram clonados por Matsuda et al. (1990). Posteriormente, também
foram identificados receptores periféricos (receptores CB2) presentes em células do
sistema imune (Munro et al., 1993). Após a descoberta de CB1 e CB2, passou-se a assumir
que os efeitos do ∆
9
-THC poderiam ser mediados por receptores específicos. A partir de
então diversos estudos se voltaram para identificar possíveis ligantes endógenos para esses
receptores, fato que aconteceu em 1992 com o ligante anandamida (Devane et al., 1992) e
alguns anos mais tarde com o 2-araquidonilglicerol (2-AG) (Mechoulam et al., 1995) que
atualmente são os dois ligantes endocanabinóides mais estudados e bem caracterizados (Di
Marzo et al., 1998; Piomelli, 2003).
As etapas bioquímicas envolvidas na biossíntese de anandamida e 2-AG foram
caracterizadas, pouco após a identificação desses compostos (Di Marzo et al., 1994; Di
Marzo et al., 1996; Bisogno et al., 1997; Stella et al., 1997) e sabe-se hoje que os mesmos
são dois derivados de fosfolipídeos de membrana originados pela degradação dos mesmos
por fosfolipases específicas as quais são ativas pelo íon cálcio. A síntese de anandamida
ocorre após clivagem da fosfatidiletalonamina, catalisada pela enzima N-aciltransferase, ao
precursor N-araquidonil-fosfatidilenalomina que pode ficar armazenado na membrana e ser
convertido a anandamida por uma fosfolipase D ativada por Ca
2+
(Di Marzo et al., 1994;
15
Piomelli, 2003). Já o ligante 2-AG parece ter duas vias biossintéticas importantes: uma que
degrada fosfatidilinositol a 1,2-diacilglicerol (DAG) (etapa catalisada pela fosfolipase C,
PLC) seguida da formação de 2-AG originado a partir do DAG pela catálise por uma
diacilglicerol-lipase (DGL). A segunda via bioquímica que pode originar 2-AG também
ocorre em duas etapas, uma que é catalisada pela fosfolipase A1 originando 2-araquidonil-
lisofosfolipídio (Lyso-PL) a partir de fosfatidilinositol e a outra que origina 2-AG a partir
de Lyso-PI por ação da Lyso-PLC (Di Marzo ei al, 1996; Bisogno et al., 1997; Stella et al.,
1997; Piomelli, 2003).
Os endocanabinóides, ao contrário da maioria dos neurotransmissores, não são
armazenados em vesículas, porém seu processo de síntese e liberação imediata também é
promovido por concentrações aumentadas do íon cálcio. Estes derivados lipídicos são
liberados de acordo “com a demanda”, difundindo-se passivamente após serem
sintetizados. A duração da ação da anandamida e do 2-AG é muito curta em virtude de um
processo de captação e degradação bastante eficiente que utiliza transportadores
microssômicos e enzimas específicas. É interessante mencionar que o metabolismo ocorre
no meio intracelular, e assim a transmissão endocanabinóide pode ser intensificada por
drogas que bloqueiam o transportador microssômico envolvido na captação neuronal
desses ligantes (Di Marzo et al., 1998; Piolmelli, 2003).
Após síntese e liberação, os endocanabinóides ativam receptores CB1 cerebrais
através dos quais exercem seus efeitos inibitórios. Os receptores CB1 pertencem à família
de receptores acoplados à proteína G inibitória (G
i/0
), apresentando 7 domínios
transmembrana e sítio de ligação extracelular (para o ligante) e intracelular (para a proteína
G acoplada). O sistema de neurotransmissão endocanabinóide apresenta função
neuromodulatória inibitória atuando como mensageiro retrógrado (ver figura 2). Após a
16
síntese pelos neurônios pós-sinápticos, os endocanabinóides se difundem passivamente
podendo agir em receptores pré-sinápticos e bloquear a entrada de Ca
2+
. Esse evento
celular pode ocorrer através da interação direta de subunidades βγ da proteína G ou via
indireta pela abertura de canais de K
+
e conseqüente hiperpolarização, resultando na
inibição da fusão e liberação de vesículas de neurotransmissores (para revisão consultar Di
Marzo et al., 1998; Schlicker & Kathmann, 2001; Wilson & Nicoll, 2002; Kreitzer &
Regehr, 2002; Piomelli, 2003). Além desses, diversos outros alvos moleculares têm sido
sugeridos para os endocanabinóides: a anandamida pode atuar em receptores vanilóides
TRPV1, bloquear diretamente canais de cálcio, dentre outras ações (Di Marzo et al., 2002).
Alguns pesquisadores sugerem ainda, a existência de um subtipo de receptor ainda não
caracterizado (“CB3”) para explicar ações mediadas por agonistas canabinóides que ainda
permanecem em camundongos nocautes para o receptor CB1, bem como para explicar
ações que não são mediadas por drogas com ações clássicas em CB1 (Piomelli, 2003;
Freund et al., 2003).
Os receptores CB1 centrais encontram-se amplamente distribuídos pelo encéfalo
(figura 3), sendo os receptores metabotrópicos mais abundantes. Sua localização está
condizente com os efeitos psicotrópicos observados após administração de agonistas CB1,
sendo presentes em maior densidade em estruturas relacionadas ao controle motor (estriado
e córtex cerebelar), no hipocampo (área envolvida em processos de aprendizagem e
memória) e ao longo do córtex cerebral explicando a diversidade de efeitos sensoriais.
Além disso, a ausência de receptores CB1 no tronco encefálico justifica a ausência de
depressão cardiovascular e respiratória mesmo após administração de elevadas doses de
agonistas CB1 (Howlett et al., 1990; Breivogel & Childers, 1998; Freund et al., 2003).
17
Figura 2: Sinalização retrógrada dos endocanabinóides. No esquema está representada a síntese de
endocanabinóides, promovida pela entrada de cálcio no soma do neurônio pós-sináptico. Após a síntese, os
endocanabinóides se difundem e podem atuar em receptores CB1 promovendo bloqueio da entrada de cálcio
nas terminações axonais pré-sinápticas. Adaptado de Wilson & Nicoll, 2002.
18
Figura 3: Distribuição de receptores canabinóides CB1 no cérebro de rato. Regiões com tons mais fortes de
cinza representam maiores densidades de receptores CB1 vistas no córtex cerebral e cerebelar (Cer), no
hipocampo (Hipp), caudado putâmem (CPu), globo pálido (GP), núcleo entopenducular (EP) e na parte
reticulada da substância nigra (SNr). Praticamente não se observam receptores CB1 no tronco encefálico (Br
Stem). Adaptado de Herkenhan. Laboratory of Cellular and Molecular Regulation, IRP. National Institute of
Mental Health. Disponível em:<http://intramural.nimh.nih.gov/lcmr/sfn/cannabis.html>. Acesso em
20/06/2005.
Em relação ao envolvimento do sistema endocanabinóide na regulação de funções
motoras, diversos trabalhos têm mostrado interações desse sistema com os sistemas
glutamatérgico, GABAérgico e dopaminérgico, e muitos estudos têm sugerido um
envolvimento dos canabinóides endógenos em distúrbios psicomotores como Parkinson e
Coréia de Huntington, sendo considerados alvos farmacológicos potenciais no tratamento
dessas doenças (para revisão ver: Rodriguez de Fonseca et al., 1998; Giuffrida et al., 1999;
Sañudo-Peña et al., 1999; Giuffrida & Piomelli, 2000; Julian et al., 2003; van der Stelt &
Di Marzo, 2003).
DISTRIBUIÇÃO DO RECEPTOR CANABINÓIDE CB1
19
1.6. Modulação dos efeitos do etanol pelo sistema endocanabinóide.
Álcool e canabinóides compartilham grande parte de seus efeitos. Etanol e
canabinóides promovem sensação de euforia e relaxamento em baixas doses, promovendo
prejuízos motores e cognitivos como também hipotermia em doses mais elevadas (Hollister
& Gillespie, 1970; Heishman et al., 1997). Apesar dos relatos antigos dos efeitos similares,
pouco se compreendia sobre possíveis mecanismos de ação que poderiam explicá-los,
acreditava-se que as duas drogas agiam de maneira inespecífica alterando a fluidez de
membrana neuronais (Laurent & Roy, 1975; Roth & Willians, 1979; Bruggemann &
Melchior, 1983; Tabakoff & Hoffman, 1983).
A compreensão desse processo foi iniciada, talvez por acaso, quando
pesquisadores relataram, em trabalhos independentes, que a administração crônica de etanol
aumentava concentrações de ésteres de ácidos graxos (produtos provenientes da degradação
de lipídios de membrana) em diversos tecidos inclusive no cérebro (Laposata & Lange,
1986; Hungund et al., 1988). Anos mais tarde, após a identificação dos endocanabinóides,
Basavarajappa e Hungund (1999) demonstraram que aqueles metabólitos lipídicos com
produção aumentada pelo etanol eram utilizados para produção de anandamida em células
granulares de cerebelo. Posteriormente, foi demonstrado que o etanol pode inibir a
degradação desse endocanabinóide através do bloqueio do transportador microssômico
(Basavarajappa et al., 2003). Outros estudos mostraram quantidades aumentadas do
endocanabinóide 2-araquidonilglicerol (2-AG), após exposição crônica ao etanol
(Basavarajappa et al., 2000). Com relação aos efeitos do álcool em receptores CB1, sabe-
se que o consumo ou tratamento crônico diminui a expressão desses receptores em diversas
áreas cerebrais (Basavarajappa et al., 1998; Ortiz et al., 2004), além de prejudicar a
20
transdução do sinal por diminuir a afinidade desse receptor a sua proteína G (Basavarajappa
& Hugund, 1999).
Diversos estudos comportamentais sugerem que o sistema endocanabinóide
modula os efeitos do etanol no sistema de recompensa cerebral, sendo que o bloqueio do
receptor CB1 reduz o consumo (Arnone et al., 1997; Colombo et al., 1998; Freedland et al.,
2001; Gessa et al., 2005) e a preferência (Hungund et al., 2003; Poncelet et al., 2003; Wang
et al., 2003) ao álcool, além de inibir a liberação de dopamina no núcleo accumbens
promovida pela administração de etanol e relacionada com a sensação de prazer promovida
pela droga (Hungund et al., 2003). Diversos estudos têm mostrado ainda, diferenças na
expressão de receptores CB1 cerebrais entre linhagens que diferem no consumo (Ortiz et
al., 2004; Manzanares et al., 2005) e na sensibilidade (Hungund & Basavarajappa, 2000)
aos efeitos do etanol. Além disso, o consumo de álcool e o reforço promovido pela droga
são menores em camundongos nocautes para o receptor CB1 (Hungund et al., 2003).
Diante dessas evidências, diversos estudos têm sugerido que o sistema de neurotransmissão
endocanabinóide modula alguns efeitos do etanol sobre o sistema nervoso central
(Hungund & Basavarajappa, 2000; Basavarajappa & Hungund, 2002; Basavarajappa &
Hungund, 2005; Manzanares et al., 2005).
1.7. O fenômeno da tolerância
A tolerância a drogas é um fenômeno caracterizado por redução nos efeitos após
administração repetida, sendo necessário o aumento da dose para promover os mesmos
efeitos iniciais. É um fenômeno adaptativo pelo qual a homeostase do organismo é
relativamente mantida na presença da droga. Pode ser promovida por alterações que
facilitam a metabolização e eliminação da droga (tolerância disposicional ou
21
farmacocinética) e por adaptações neuronais (tolerância funcional ou neuroadaptativa)
(Snell et al., 1996; Kalant, 1996; Nestler, 2004). Alguns autores mostram evidências que a
tolerância comportamental é influenciada por fatores dependentes de aprendizado
associativo (condicionamento pavloviano) e aprendizado sob efeito da droga (prática
intoxicada) (Larson & Siegel, 1998: Lê & Kalant, 1992). Outro tipo de neuroadaptação
ocorrida após uso crônico de etanol é a sensibilizaçaõ também referida anteriormente como
tolerância reversa, na qual ocorre aumento dos efeitos estimulantes do etanol ao contrário
da tolerância, em que se observa diminuição dos efeitos depressores (Lister, 1987;
Wolffgramm et al., 1990; Quadros et al., 2005).
A tolerância a diversos efeitos do álcool, como ataxia, hipotermia, rubor facial e
sonolência se desenvolve rapidamente, mesmo após uma única dose, tornando-se mais
evidente com o consumo crônico, sendo que alguns indivíduos chegam a suportar uma dose
tão alta quanto 400 mg/dl sem apresentar sintomas grosseiros de sedação. De maneira
similar a outras drogas, entretanto, a tolerância não se desenvolve de modo uniforme aos
diversos efeitos. Não há tolerância aos efeitos cardio-respiratórios (elevando o risco de
morte por superdosagem) e dados demonstrando tolerância aos efeitos reforçadores são
controversos (Kalant, 1996; Berridge, 2003; Fadda & Rossetti, 1998).
Segundo o curso temporal em que se desenvolve, a tolerância ao álcool pode ser
classificada em aguda, rápida ou crônica. Tolerância aguda refere-se à diminuição do efeito
após uma única exposição (Kalant et al., 1971; Radlow, 1994). Tolerância rápida pode ser
observada em uma segunda exposição, 8 a 24 horas após o término dos efeitos da primeira
(Crabbe, 1979; Khanna et al., 1992; 1996). Já a tolerância crônica pode ser observada ao
longo de dias ou semanas de exposição (Kalant, 1971, Littleton, 1980).
22
A tolerância aguda foi descrita pela primeira vez em 1919 por Mellanby em
estudos clínicos. Este pesquisador observou que os efeitos depressores do etanol
diminuíram ao longo do tempo, mesmo mantendo os níveis séricos de etanol através de
infusão intravenosa (Kalant et al., 1971). Diversos estudos têm se voltado para tentar
compreender e elucidar possíveis mecanismos envolvidos neste tipo de tolerância (Khanna
et al., 1990; 1991; Tampier et al., 2000). Atualmente, tolerância aguda é definida como um
processo neuroadaptativo observado após administração única de etanol, no qual observa-
se diminuição dos efeitos promovidos pela droga mesmo com concentrações de etanol
circulantes maiores ou equivalentes às observadas no período inicial da análise. Assim,
diversos autores têm sugerido que a tolerância aguda envolve processos inatos de
adaptação aos efeitos do etanol (principalmente depressores), podendo contribuir para o
desenvolvimento de dependência ao etanol (Khanna et al., 1990; 1991; Tampier et al.,
2000; Tampier & Quintanilla, 2002).
Já a tolerância rápida foi um modelo experimental proposto pela primeira vez em
1979 por Crabbe para estudar a tolerância ao etanol. O modelo consiste de duas
administrações de etanol, verificando-se redução nos efeitos depressores do etanol já numa
segunda administração de etanol realizada de 8 a 24h após a primeira (Khanna et al., 1996).
Apesar de ser proposta em 1979, foi a partir da década de 1990 que diversos estudos
começaram a estudar possíveis mecanismos envolvidos nesse tipo de tolerância (Khanna et
al., 1991; 1992; 1993; 1996). Atualmente, já foi demonstrado que diversas características
da tolerância rápida se assemelham bastante à tolerância crônica. Dentre essas
características comuns, é importante ressaltar o desenvolvimento de tolerância rápida
cruzada entre álcool e barbitúricos de baixa solubilidade, similarmente ao que ocorre de
forma crônica (Khanna et al., 1991; 1992). Além disso, diversos estudos verificaram que
23
fatores comportamentais como influência da prática sobre o efeito da droga (prática
intoxicada), bem como processos de aprendizado e memória são importantes nesses dois
tipos de tolerância, sendo que antagonistas de receptores NMDA bloquearam tanto a
ocorrência de tolerância rápida quanto de crônica (Morato & Khanna, 1996). Por isso, o
paradigma da tolerância rápida tem sido considerado como um índice da tolerância crônica
(Khanna et al., 1991b; Khanna et al., 1992).
Diversos sistemas de neurotransmissão e receptores podem modular a tolerância
ao etanol. Estudos evidenciaram envolvimento do receptor NMDA (Khanna & Kalant,
1991; Morato & Khanna, 1996; Khanna et al., 2002), de receptores GABAérgicos
(Taberner, 1989; Toki et al., 1996; Homanics et al., 1998; Chandler et al., 1998),
serotonérgicos (Lê et al., 1981; Feller et al., 1993; Khanna et al., 1994, Khanna et al.,
2002), opióides (Quintanilla & Tampier, 2000; Varaschin et al., 2005) e recentemente, os
sistemas dopaminérgico e adenosinérgico (Batista et al., 2005). No entanto, não se conhece
o papel do sistema endocanabinóide no desenvolvimento de tolerância ao etanol.
Muitos trabalhos têm mostrado que o sistema endocanabinóide pode modular o
reforço promovido pelo etanol e reduzir o consumo desta droga (Arnone et al., 1997;
Colombo et al., 1998; Gessa et al., 2005). Sabendo-se que drogas eficazes na redução do
consumo interferem na tolerância ao álcool (Quintanilla & tampier, 2000), considerando que
ocorre tolerância cruzada entre etanol e ∆
9
-THC (Newman et al., 1972; Macavoy & Marks,
1975; Sprague & Craigmill, 1976; Marks & MacAvoy, 1989) e ainda, sabendo que o sistema
endocanabinóide modula funções motoras (Rodrigues de Fonseca et al., 1998; Giuffrida et
al.,1999; Julian et al., 2003; van der Stelt & Di Marzo, 2003), o presente estudo propõe como
hipótese que o bloqueio de receptores canabinóides CB1 pode interferir na tolerância rápida e
aguda à incoordenação motora produzida pelo etanol.
24
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral:
O objetivo geral do presente estudo foi verificar o envolvimento dos receptores
canabinóides CB1 cerebrais nas tolerâncias rápida e aguda ao efeito de incoordenação
motora promovido pelo etanol em ratos.
2.2. Objetivos específicos iniciais:
Os objetivos específicos iniciais deste trabalho foram:
a) Estudar os efeitos da administração central e sistêmica do antagonista
canabinóide CB1 (SR141716) na tolerância rápida ao etanol em ratos;
b) Verificar se o efeito do antagonista canabinóide na tolerância rápida ao etanol
poderia ser revertido pela administração do agonista canabinóide (WIN55,212-2);
c) Verificar o efeito do bloqueio central dos receptores CB1 pelo SR141716 na
tolerância aguda ao etanol em ratos e se esse efeito poderia ser revertido pela administração
do agonista canabinóide WIN55,212-2.
2.3. Objetivos específicos secundários:
Diante de alguns resultados observados na primeira série de experimentos, a
segunda etapa do presente estudo apresentou como objetivos específicos adicionais:
a) Avaliar os níveis alcoólicos urinários após administração i.c.v. de SR141716;
b) Verificar o efeito da administração i.c.v. de SR141716 nas alterações
cardiovasculares promovidas pelo etanol em ratos anestesiados.
25
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais:
Foram utilizados ratos Wistar machos fornecidos pelo Biotério Central da
Universidade Federal de Santa Catarina, com pequenas variações de idade (3.0 ± 0,5
meses) e peso (330 ± 50 g). Os animais foram mantidos em gaiolas de polietileno branco
(42 cm x 24 cm x 17 cm), em número de 6 por caixa, com livre acesso a água e ração
granulada. A temperatura (23 ± 2º C) e a luminosidade (ciclo de luz 12 /12 h) foram
rigorosamente controladas. Com o intuito de minimizar variações circadianas, todos os
experimentos comportamentais foram realizados no período de 11 às 18 h. O manuseio dos
animais obedeceu às recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociências e
Comportamento, sendo o protocolo experimental submetido e aprovado pelo Comitê de
Ética para Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (protocolo nº
259/CEUA/UFSC, Proc. 23080.001030/2001-85).
3.2. Drogas e reagentes:
Etanol foi obtido da Merck (Hawthorne, NY, EUA). TRIS (hidroximetil) amino
metano, Tween 80 P.S. (Polissorbato 80), hidrato de cloral e azul de Evans foram obtidos
da Vetec Química Fina Ltda. (Rio de Janeiro). Formaldeído solução (HCHO) e ácido
perclórico (HClO
4
, PA 69-72%) foram obtidos da F. Maia Ind. E Com. Ltda. Solução
fisiológica de cloreto de sódio (NaCl 0.9%) foi obtida do Lab. Tayuma Ltda. Resina
acrílica e líquido acrílico autopolimerisáveis foram obtidos da Dental VIPI Ltda, Ind. e
Com. de Prod. Odont. Heparina sódica foi obtida da Cristália Prod, Quim. Farm. Ltda.
Cloridrato de lidocaína a 3% com norepinefrina 1:5000 foi obtido da Probem Prod. Farm.
26
Ltda. Dopaser (Xilazina, 200 mg/ 10 ml) e Dopalen (ketamina, 1000 mg/10 ml foram
obtidos da VetBrands do Brasil (Sespo Indústria e Comércio Ltda., Jacareí, SP). SR141716
(Rimonabant) foi gentilmente cedido pela Sanofi-Aventis. WIN-(+)-55,212-2, ADH
(Alcohol Dehydrogenase, 15000UI), β-NAD (β-nicotinamide adenine dinucleotide) e salina
tamponada (Phosphate buffered saline tablets, 0,01M, ) foram obtidos da Sigma Chemical
Co. (Saint Louis, MO, EUA).
As drogas administradas por via intracerebroventricular foram diluídas com
Tween 1% em salina tamponada e administradas (num volume de 1 µL) com o auxílio de
um injetor de aço inox com 11 mm de comprimento e 0,3 mm de espessura acoplado a um
tubo de polietileno (P100) e microseringas (Hamilton Co., 10 µL, Reno, NV, EUA)
conectadas a uma bomba de infusão (modelo BI-2200, Insight, Ribeirão Preto, SP). Todas
as microinjeções foram realizadas numa taxa de infusão constante de 2 µL/min e esperou-se
30 s após a injeção para retirada do injetor como medida de assegurar dispersão da solução
no cérebro. Em todos os experimentos o etanol foi diluído em solução salina numa
concentração de 14% p/v e administrado por via intraperitoneal.
3.3. Cirurgia estereotáxica:
Os animais foram anestesiados com uma mistura de ketamina (75 mg/Kg) e
xilazina (15 mg/Kg) administrada num volume de 1,5 ml/Kg via intraperitoneal (i.p.),
doses adaptadas de Jho et al., 2003. Após perda total dos reflexos, fez-se a tricotomia na
cabeça seguida de imobilização dos animais em um aparelho estereotáxico (Stoelting,
Wood Dale, IL, EUA), a calota craniana foi exposta por meio de uma incisão na pele, de
aproximadamente 1,5 cm de diâmetro. O periósteo foi retirado e a calota craniana secada
com H
2
O
2
a 10%. Com o auxílio de uma broca ortodôntica (nº 6) foram feitos dois furos na
27
calota craniana para fixação de parafusos. Em seguida, um terceiro furo foi feito para
implantação de uma cânula guia no ventrículo lateral direito, sendo o posicionamento da
mesma calculado por meio de estimativas em relação ao bregma (ponto de encontro entre
as suturas sagital e lambdóide utilizado como referencial anatômico). As coordenadas
utilizadas (AP -0.8 mm, ML -1.5 mm e DV -3.5 mm) tiveram como referência parâmetros
do Atlas de Paxinos & Watson (1997) e foram ajustadas ao peso do animal.
Cânulas de aço inoxidável de 10 mm de comprimento e 0,7 mm de diâmetro
externo, previamente confeccionadas a partir de tubos de aço (Acerinox Ind. e Com. de
Aço Inox S/A., São Paulo – SP), foram introduzidas no ventrículo cerebral direito. Após
implantação, a cânula e os parafusos foram fixados ao crânio com resina acrílica
autopolimerisável. Mandris de 0,3 mm de diâmetro foram introduzidos nas cânulas para
evitar a obstrução das mesmas durante o período de recuperação dos animais. Após o
procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos em local aquecido até a recuperação da
anestesia, posteriormente alojados em gaiolas específicas com água e ração ad libitum e
acompanhados diariamente até a realização dos experimentos uma semana após a cirurgia
estereotáxica.
3.4. Teste do plano inclinado:
Nos experimentos comportamentais, o prejuízo motor promovido pelo etanol foi
avaliado no teste do plano inclinado (Arvola et al., 1958), modificado por Quintanilla &
Tampier (2000). O aparato consiste em uma plataforma retangular móvel recoberta por
uma grade metálica que é inclinada manualmente de 0 a 90º num intervalo aproximado de
5 segundos. No momento do teste, o animal foi colocado sobre a grade tendo o focinho
voltado para a parte de cima. Uma parede de acrílico transparente evita a saída do animal
28
da plataforma, permitindo ao observador verificar o ângulo de queda do animal (figura 4).
Posteriormente, este ângulo foi transformado num índice de prejuízo motor percentual de
acordo com a equação matemática:
Prejuízo motor (%) = Basal – a
x 100
Basal – α
Onde: a = ângulo de queda do animal no momento do teste;
α = ângulo de queda de um animal anestesiado (aproximadamente 36º);
Basal = ângulo de queda antes de qualquer tratamento (normalmente 90º)
Figura 4: Teste do plano inclinado. O aparato consiste em uma grade metálica inclinada manualmente de 0 a
90º em relação ao plano horizontal em aproximadamente 5 s. O ângulo de queda foi verificado e convertido
em um índice de prejuízo motor percentual. No exemplo mostrado, observa-se o desempenho de um animal
antes de qualquer tratamento, permanecendo agarrado à grade metálica mesmo na inclinação máxima de 90º
correspondente a uma ausência de prejuízo motor (prejuízo motor (%) = 0).
29
3.5. Dosagem alcoólica:
O método utilizado para dosagem de etanol foi modificado e adaptado de outros
trabalhos (Kristoffersen et al., 2005; Kristoffersen & Smith-Kielland, 2005).
Imediatamente após a coleta, amostras de 50 µL de sangue ou de urina foram
colocadas em tubos plásticos contendo 1 ml de uma solução de ácido perclórico a 3% para
precipitação de proteínas. Em seguida, os tubos foram vedados com parafilme e
armazenados à temperatura de 4º C até o momento da dosagem. No dia da dosagem
alcoólica, as amostras foram centrifugadas a 5000 RPM durante 5 minutos em uma
centrífuga com rotor de “eppendorf” (Z 320, HERMLE, Labortechnik GmbH, Alemanha).
Após a centrifugação das amostras, uma solução contendo 1 mg de enzima álcool
dehidrogenase (15000 UI, Sigma, EUA) e 100 mg de β-nicotinamida adenina dinucleotídeo
oxidado (β-NAD
+
, Sigma, EUA) foi preparada em 100 ml de tampão TRIS 0.5 M pH= 8,8.
Para estimativa das concentrações de etanol presentes nas amostras, a cada dia de dosagem,
foi realizada uma curva padrão com 8 concentrações da “solução-padrão” contendo
concentrações conhecidas de etanol (39,5 - 553 mg/dl) diluídas em água destilada.
Após a centrifugação das amostras e preparo das “soluções-padrão”, um volume
de 50 µL (similar ao das mostras) de água destilada (branco) ou de cada solução padrão foi
colocado em tubos plásticos com ácido perclórico. Para a dosagem, 40 µL de cada solução
(branco, soluções padrões, ou sobrenadante de cada amostra centrifugada) foram colocados
em tubos contendo 1 ml da solução que continha enzima (ADH) e cofator (β-NAD
+
) e
agitados em seguida. Depois de 15 minutos, foi realizada a leitura no espectrofotômetro
(Spectrophotometer U-2001, Hitachi) no comprimento de 340 nm (UV) começando pelos
brancos em duplicada onde foi “zerada” a leitura para descartar absorbâncias inespecíficas.
30
Depois disso, foi medida a densidade óptica de cada solução, começando pelos padrões (em
duplicata) seguidos das amostras a serem dosadas.
Ao final de cada dosagem os valores de densidade óptica dos padrões foram
analisados juntamente com suas concentrações conhecidas e foram feitas análises de
regressão linear simples no programa Instat
®
3.01 para Windows (Graph Pad Software,
San Diego, CA, EUA) com o objetivo de verificar se os dados apresentavam uma
inclinação de 45º típica de uma regressão linear. A análise de pontos também foi realizada,
sendo que curvas com valores de r
2
< 0,98 foram desconsideradas e as amostras novamente
dosadas. O método utilizado na dosagem consiste na conversão de álcool a acetaldeído pela
enzima álcool dehidrogenase, na presença da forma oxidada do cofator que é reduzida na
reação enzimática.
Concentrações crescentes de etanol estão diretamente relacionadas com
densidades ópticas maiores devido ao aumento da forma reduzida do cofator. Ocorre uma
estabilização da reação cerca de 10 minutos após o início da mesma conforme demonstrado
por alguns estudos (Kristoffersen et al., 2005). Sendo assim, a leitura das amostras foi
realizada no espectrofotômetro 15 minutos após o início da reação. A validação do método
já foi demonstrada mesmo para detecção de concentrações muito baixas de etanol, sendo
utilizado como rotina em análises toxicológicas em amostras de sangue e/ou urina de seres
humanos (Kristoffersen & Smith-Kielland, 2005). Na figura 5, encontra-se demonstrada a
representação gráfica de uma “curva-padrão” típica.
31
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Etanol (mg/dl)
Densidade Óptica
Figura 5: Exemplo de uma curva padrão típica de dosagem alcoólica (r
2
= 0.9977). No eixo das ordenadas
representada a densidade óptica e no eixo das abscissas representada a concentração de etanol em mg/dl.
3.6. Registros de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC):
Para os registros de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC), os animais
foram anestesiados com uma mistura de ketamina (100 mg/Kg) e xilazina (20 mg/Kg)
injetada por via intramuscular (i.m.). A associação dessas drogas foi capaz de promover
uma anestesia profunda, sem nenhuma depressão cardiovascular ou respiratória aparente.
Doses de reforço (30 e 7 mg/Kg, i.m., respectivamente de ketamina e xilazina) foram
administradas a cada 60 minutos com o objetivo de manter o estágio profundo de anestesia.
Após a perda total dos reflexos, os animais foram posicionados em decúbito
dorsal sobre uma mesa cirúrgica aquecida (temperatura entre 35 e 36º C), recebendo
administração intraperitoneal (i.p.) do anticoagulante heparina sódica (30 UI, diluída em
salina tamponada), com o objetivo de prevenir a formação de coágulos e obstrução das
cânulas. Para facilitar a respiração espontânea, foi realizada a traqueotomia em todos os
animais. Em seguida, a artéria carótida esquerda foi localizada e separada, de maneira
rápida e cuidadosa, do nervo vago e dos tecidos subjacentes. O fluxo sangüíneo da carótida
foi interrompido na extremidade distal através de ligadura com fio de sutura e o fluxo da
32
extremidade proximal foi temporariamente suprimido por compressão com uma pinça
curva. Na região medial da porção “clampeada” da carótida, foi realizado um pequeno corte
que serviu como via de inserção para um cateter de polietileno (Angiocath
®
, nº 19)
devidamente heparinizado e amarrado firmemente na artéria. Posteriormente, o cateter de
polietileno foi conectado a um transdutor de pressão acoplado ao equipamento de análise de
PA e FC Digi-Med (modelo 190, NY, EUA). Os valores de pressão arterial média (PAM),
sistólica e diastólica (em mmHg) e de freqüência cardíaca (em batimentos por minuto,
bpm) foram registrados a cada 10 segundos em um computador (sistema operacional
Windows 98
TM
, Microsoft Corporation, EUA) por um software de integração Digi-med
(Modelo 200).
Os resultados foram expressos como variações da pressão arterial média (∆PA,
em mmHg) e da freqüência cardíaca (∆FC, em bpm) em intervalos de 10 minutos,
calculados em relação aos valores basais estáveis antes da administração de qualquer droga.
Ao término dos experimentos, todos os animais foram sacrificados com injeção
intracardíaca de altas doses de xilocaína.
3.7. Procedimentos experimentais:
3.7.1. Experimento 1: efeito da administração sistêmica do antagonista canabinóide
SR141716 na tolerância rápida ao etanol.
Inicialmente foi realizado um experimento para verificar se nossos dados relativos
à tolerância rápida estavam compatíveis com outros dados obtidos no laboratório. No
primeiro dia de experimento (dia 1), após habituação e pesagem dos animais, o
desempenho basal dos mesmos foi verificado no plano inclinado. Em seguida foram
33
divididos em dois grupos que receberam etanol (2,7 g/Kg) ou salina i.p. Após 30, 60 e 90
minutos cada animal foi testado no plano inclinado. Os animais retornaram às gaiolas e 24h
após, foram avaliados antes e 30, 60 e 90 minutos após receberem etanol 2,7 g/Kg.
Experimentos seguintes foram realizados para avaliar o efeito do SR141716 sobre
a tolerância rápida. No primeiro dia de experimento (dia 1), após habituação e pesagem dos
animais, o desempenho basal dos mesmos foi verificado no plano inclinado. Em seguida, os
animais foram divididos em 4 grupos que receberam injeção intraperitoneal (i.p., 1 ml/Kg)
de veículo (Tween 80 1% em solução fisiológica) ou antagonista canabinóide CB1
(SR141716, doses 0,5; 1,0 ou 2.0 mg/Kg). Após 15 minutos, cada grupo foi subdividido em
dois (totalizando 8 grupos, N = 10 – 13 cada) que recebeu, também por via i.p., salina (S)
ou etanol (E, 2,7 g/Kg). O prejuízo motor promovido pela administração sistêmica de
etanol foi avaliado 30, 60 e 90 minutos após sua administração. Depois de 24 h (dia 2),
após conferida a medida basal, todos os animais receberam apenas etanol (2,7 g/Kg, i.p.) e
foram novamente testados no plano inclinado nos mesmos intervalos avaliados no primeiro
dia (30, 60 e 90 min). As doses de etanol foram selecionadas de experimentos prévios do
laboratório (Wazlawik & Morato, 2002; 2003) e as doses do antagonista CB1 foram
selecionadas da literatura (Rinaldi-Carmona et al., 1994; Gómez et al., 2002).
3.7.2. Experimento 2: efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.) do
antagonista canabinóide SR141716 na tolerância rápida ao etanol.
Uma semana após a recuperação da cirurgia estereotáxica, os animais foram
habituados e pesados na sala experimental, tendo seus mandris cuidadosamente retirados
com o auxílio de um pequeno alicate. Para minimizar interferências do estresse devido à
manipulação, esperou-se mais 5 minutos até a realização do teste no plano inclinado para
34
verificação da medida basal. Em seguida os animais foram divididos em dois grupos que
receberam por via i.p. salina (S) ou etanol (2,7 g/Kg). Decorridos 5 minutos da injeção
sistêmica, cada um dos grupos foi subdividido em 4 (totalizando 8 grupos, N = 8 – 15
cada), recebendo injeção intracerebroventricular de veículo (Tween 80 1%, em salina
tamponada, PBS) ou antagonista CB1 (SR141716 nas doses de 0,5; 1,0 ou 2,0 µg). As
avaliações no plano inclinado ocorreram 30, 60 e 90 minutos após a injeção sistêmica. No
segundo dia de experimento (dia 2), após verificada a medida basal, todos os animais foram
tratados com etanol (2,7 g/Kg, i.p.) e novamente testados no plano inclinado nos mesmos
intervalos do primeiro dia.
3.7.3. Experimento 3: efeito da administração do agonista canabinóide WIN55,212-2 após
a administração do antagonista SR141716 na tolerância rápida ao etanol.
Após a realização da rotina experimental descrita acima e verificação da medida
basal no plano inclinado, os animais foram divididos em 2 grupos que receberam injeção
sistêmica de salina ou etanol (2,7 g/Kg, i.p.). Em seguida cada grupo foi subdividido em 4
(totalizando 8 grupos, N = 8 – 12 cada) e recebeu duas injeções intracerebroventriculares:
1ª - (5 min após a injeção sistêmica): veículo (Tween 80 1% em PBS) ou antagonista CB1
(SR141716, 1 µg) e 2ª - (imediatamente após a anterior): veículo (Tween 80 1% em PBS)
ou agonista CB1 (WIN55,212-2, 1 µg). O desempenho no plano inclinado foi avaliado
conforme nos experimentos anteriores (30, 60 e 90 min após a injeção de etanol). No dia 2,
apenas etanol (2,7 g/Kg, i.p.) foi administrado a todos os animais e os testes no plano
inclinado foram repetidos.
35
3.7.4. Experimento 4: efeito da administração de diferentes doses de etanol na tolerância
aguda.
De maneira similar aos experimentos prévios de tolerância rápida do laboratório
(Wazlawik & Morato, 2002; 2003), os primeiros estudos de tolerância aguda foram
realizados para selecionar doses de etanol que fossem adequadas para estudar o fenômeno
no modelo do plano inclinado. Para isso, os animais foram divididos em 3 grupos (N = 8
cada) e receberam por via intraperitoneal (i.p.) 2,5; 2,7 ou 3,0 g/Kg de etanol. Após as
injeções foram testados por cinco ocasiões a cada 15 minutos no plano inclinado e,
imediatamente a cada teste, foram coletadas amostras de sangue a partir da cauda dos
animais com o auxílio de uma lâmina de bisturi e capilares heparinizados de 50 µL (pipetas
pré-calibradas, 50 µL, Modulohm A/S, Dinamarca). Os valores obtidos no plano inclinado
foram convertidos para prejuízo motor percentual (ver acima) e as amostras de sangue
foram armazenadas para posterior dosagem alcoólica segundo método descrito acima.
3.7.5. Experimento 5: efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.) do
antagonista CB1 na tolerância aguda ao etanol.
Para verificar um possível envolvimento dos receptores CB1 cerebrais na
tolerância aguda ao etanol, foram utilizados 4 grupos experimentais (N = 7 – 11 cada) que
receberam injeção sistêmica de 3,0 g/Kg de etanol e injeções intracerebroventriculares (5
minutos após a injeção sistêmica) de veículo (Tween 80 1% em PBS) ou antagonista CB1
(SR141716 nas doses de 0,5; 2,0 ou 4,0 µg, i.c.v). Os testes no plano inclinado, bem como
a coleta de amostras de sangue para posterior dosagem alcoólica foram realizados a cada 15
minutos se estendendo até 75 minutos após a administração de etanol.
36
3.7.6. Experimento 6: efeito da administração do agonista CB1 após a administração do
antagonista na tolerância aguda ao etanol.
Com o objetivo de verificar se o efeito do antagonista canabinóide sobre os
experimentos de tolerância aguda poderiam ser revertidos pelo agonista, foram realizados
experimentos com 4 grupos experimentais (N = 7 – 11 cada). Todos os animais receberam
injeção sistêmica de 3,0 g/Kg de etanol e foram tratados após 5 minutos (via i.cv.) com:
veículo (Tween 80 1% em PBS), veículo + SR141716 (2 µg), veículo + WIN55,212-2 ( 1
µg), ou SR141716 (2 µg) + WIN55,212-2 (1 µg). Cada injeção i.c.v foi administrada num
volume de 1µL. Os testes no plano inclinado e coletas de sangue foram realizados a cada 15
minutos conforme os outros experimentos de tolerância aguda.
3.7.7. Experimento 7: efeito da administração central do antagonista CB1 na concentração
de etanol na urina.
Para verificar um possível efeito da administração central do antagonista CB1
sobre a eliminação de etanol na urina. Ratos foram divididos em 3 grupos (N = 5 – 10
cada), que receberam injeção sistêmica de etanol (3,0 g/Kg). Após 5 minutos das injeções
i.p., foram administrados intracerebroventricularmente veículo (Tween 80 1% em PBS), ou
SR141716 (2 ou 4 µg). Após as injeções i.c.v., os animais foram colocados em gaiolas
metabólicas durante 75 minutos (mesmo intervalo de tempo dos experimentos de tolerância
aguda), sendo amostras de urina coletadas em tubos falcom ao final do período. Após a
coleta, os volumes urinários foram estimados por diferenças entre os tubos, pesados antes e
depois do experimento. A densidade da urina foi considerada como 1 mg/ml, logo, cada
grama de peso foi estimada como 1 ml de urina. Amostras de 50 µL de urina foram
colocadas em tubos contendo ácido perclórico para posterior dosagem alcoólica.
37
3.7.8. Experimento 8: efeito da administração central do antagonista CB1 nas alterações
cardiovasculares promovidas pelo etanol.
Com o intuito de verificar se a administração central (i.c.v.) do antagonista CB1
SR141716 poderia interferir nas alterações cardiovasculares promovidas pelo etanol, foram
realizados experimentos de registros de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) em
ratos anestesiados (N = 3 – 7 por grupo), conforme descrito acima. Para isso, após
estabilização do registro, foram realizadas injeções sistêmicas de etanol ou salina e 5
minutos após as injeções sistêmicas, injeções i.c.v. de veículo (Tween 80 1% em PBS) ou
SR141716 (2 µg) foram administradas num volume de 1 µL. As alterações
cardiovasculares foram acompanhadas ao longo de 80 minutos após a primeira injeção,
tendo sido considerados os valores em intervalos de 10 minutos e calculadas diferenças
(∆PA e ∆FC) em relação aos valores basais de cada animal.
3.8. Perfusão e histologia:
Após a realização dos experimentos que fizeram uso de microinjeções cerebrais,
os animais foram profundamente anestesiados com hidrato de cloral e perfundidos
transcardiacamente com solução fisiológica (NaCl 0,9%) seguida de formaldeído a 4% para
fixação dos tecidos. Ao término da perfusão, 5 µL de corante azul de Evans (0,1%) foram
injetados pelas cânulas guias, os cérebros foram removidos e pós-fixados em formaldeído
4% por 24 h. Posteriormente à pós-fixação, com o auxílio de uma lâmina de bisturi, foram
feitos cortes coronais nos locais de implante das cânulas para verificar o posicionamento
correto das mesmas. Os acertos foram visualizados, sem o auxílio de qualquer equipamento
de aumento, como um preenchimento completo do ventrículo lateral direito pelo corante
administrado. Nos experimentos de pressão arterial, o acerto das cânulas foi verificado no
38
tecido fresco após eutanásia dos animais e administração do corante. Eventuais erros no
posicionamento das cânulas implicaram em desconsideração dos resultados obtidos.
3.9. Análise gráfica e estatística:
Os resultados de todos os experimentos foram expressos como média ± erro
padrão da média (EPM). A confecção dos gráficos foi feita utilizando-se o programa Graph
Pad Prism
®
4.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA, EUA). As análises estatísticas foram
feitas no programa Statistica
®
para Windows 6.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, EUA).
Nos experimentos realizados para demonstrar a tolerância rápida foi utilizada
análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas, com tratamento (salina ou etanol)
como variável independente, prejuízo motor como variável dependente e o número de
exposições ao modelo nos dois dias foi considerado como fator de repetição. Nos demais
experimentos de tolerância rápida foi utilizada a ANOVA para medidas repetidas, com o
tratamento como variável independente, o prejuízo motor máximo em cada dia como
variável dependente e a exposição ao modelo nos dia 1 e 2 considerada como fator de
repetição.
Nos experimentos de tolerância aguda foi usada ANOVA para medidas repetidas
para comparações temporais no prejuízo motor e na concentração de etanol no sangue,
sendo o tratamento considerado como variável independente e o tempo como fator de
repetição. Para comparações entre grupos, utilizou-se ANOVA de uma via, tendo o
tratamento como variável independente e a área sob a curva total (de concentrações
alcoólicas sangüíneas ou prejuízo motor) como variável dependente.
39
Nos experimentos de dosagem de etanol na urina foi utilizada ANOVA de uma
via, tendo o tratamento como variável independente e volume urinário ou concentração
alcoólica na urina como variáveis dependentes.
Os experimentos que observaram os parâmetros cardiovasculares (PA e FC)
foram analisados estatisticamente por ANOVA de medidas repetidas, tendo o tratamento
como variável independente e tempo como fator de repetição. Em todos os experimentos
utilizou-se o teste de post hoc LSD de Fisher.
40
4. RESULTADOS:
4.1. Efeito da administração sistêmica de SR141716 na tolerância rápida ao etanol.
Os primeiros experimentos foram realizados para mostrar o fenômeno da
tolerância rápida na ausência de qualquer outro tratamento. Conforme mostrado na figura
abaixo, observou-se que apenas os animais tratados com etanol apresentaram prejuízo
motor no primeiro dia, ocorrendo uma diminuição significativa deste prejuízo ao longo do
tempo nas exposições seguintes. No segundo dia, com a administração de etanol a todos os
animais, observou-se que os animais tratados com etanol pela primeira vez apresentaram
prejuízo elevado diferindo significativamente do grupo que recebeu etanol também no dia
anterior. Isto sugere que os animais ficaram tolerantes à segunda exposição ao etanol.
Dia 1
30 60 90
0
25
50
75
100
*
*
#
#
#
Tempo (min)
Prejuízo Motor (%)
Dia 2
30 60 90
0
25
50
75
100
Etanol
Salina
*
*
*
*
#
#
Tempo (min)
Prejuízo Motor (%)
Figura 6: Fenômeno da tolerância rápida. O tratamento com etanol (2,7 g/Kg) promoveu um elevado prejuízo
motor nos animais em relação ao grupo tratado com salina. No segundo dia, os animais tratados com etanol
pela segunda vez apresentaram um prejuízo significativamente menor que o grupo tratado com salina no
primeiro dia. (*) p < 0,05 em comparação com o primeiro momento do teste (30 min), (#) p < 0,05 em
comparação ao outro grupo. ANOVA seguida de teste LSD. Dados expressos como média ± EPM.
41
Nos experimentos seguintes foi considerado apenas o prejuízo motor máximo (30
minutos após tratamento) em cada dia como medida comportamental válida para análise de
tolerância rápida de acordo com outros estudos do laboratório (Wazlawik & Morato, 2002;
2003; Varaschin et al., 2005). Na figura 7, observa-se que no primeiro dia de experimento
apenas os animais tratados com etanol apresentaram prejuízo motor [F
(1, 90)
= 541, 58; p <
0,01], sendo que o tratamento com antagonista CB1, não apresentou efeito sobre o
desempenho motor nas doses administradas [F
(3, 90)
= 1,47; p = 0,23]. No entanto, este
antagonista (doses de 1 e 2 mg/Kg) interferiu com o prejuízo promovido pelo etanol nos
animais tratados com etanol pela segunda vez no dia seguinte na ausência de quaisquer pré-
tratamento [F
(3, 90)
= 3,76; p = 0,01]. Esses resultados sugerem que o SR141716 bloqueia a
tolerância rápida ao efeito de incoordenação motora promovido pelo etanol de modo
dependente de dose.
4.2. Efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.) de SR141716 na
tolerância rápida ao etanol.
A figura 8 ilustra o efeito da administração i.c.v. do antagonista CB1 sobre a
tolerância rápida ao etanol. Observou-se que no primeiro dia de experimento apenas os
animais tratados com etanol apresentaram prejuízo motor [F
(1, 84)
= 212,28; p < 0,01] e o
tratamento com antagonista CB1 não afetou o desempenho motor nas doses administradas
[F
(3, 84)
= 0,96; p = 0,42]. Entretanto, esta droga promoveu efeito no prejuízo motor
promovido pelo etanol [F
(3, 84)
= 2,80; p = 0,04] no segundo dia. No dia 2 quando todos os
animais receberam apenas injeção i.p. de etanol, observou-se redução significativa no
prejuízo motor nos animais tratados com etanol e veículo (i.c.v) no primeiro dia (tolerância
rápida), não ocorrendo esse fenômeno nos animais tratados com etanol e SR141716 (0,5,
42
1,0 ou 2,0 µg) sugerindo um bloqueio da tolerância rápida ao etanol promovido pela
administração i.c.v. do antagonista CB1. Nas doses empregadas o bloqueio foi semelhante.
Dia 1
0
25
50
75
100
*
*
*
*
S
E ESS
SE E
Veículo SR 0.5 mg/Kg SR 1 mg/Kg SR 2 mg/Kg
Prejuízo Motor Máximo (%)
Dia 2
S
E ESS
SE E
Etanol
*
*
Figura 7: Efeito da administração sistêmica de SR141716 na tolerância rápida. No dia 1, o tratamento com
2,7 g/Kg de etanol (E) promoveu um elevado prejuízo motor nos animais em relação ao grupo tratado com
salina (S). No segundo dia, os animais pré-tratados com veículo ou com a menor dose de antagonista (0,5
mg/Kg), apresentaram prejuízo reduzido quando tratados com etanol pela segunda vez, evidenciando a
tolerância rápida. Porém o pré-tratamento com o antagonista CB1 nas maiores doses (1 e 2 mg/Kg) bloqueou
o desenvolvimento de tolerância sendo evidenciado pelo elevado prejuízo motor no segundo dia, mesmo nos
animais tratados com etanol pela segunda vez.. (*) p < 0.05 em comparação ao respectivo controle. ANOVA
com fator tempo (dia 1 e dia 2) como medida repetida, seguida de teste LSD. Dados expressos como média ±
EPM.
43
Dia 1
0
25
50
75
100
Veículo
SR 0.5 µg
SR 1.0 µg
SR 2.0 µg
*
*
*
*
S
E ESS
SE E
Prejuízo Motor Máximo (%)
Dia 2
*
S
E ESS
SE E
Etanol
Figura 8: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 na tolerância rápida. No dia 1, o tratamento com 2,7
g/Kg de etanol (E) promoveu um elevado prejuízo motor nos animais em relação ao grupo tratado com salina
(S). No segundo dia, os animais pré-tratados com veículo apresentaram prejuízo reduzido quando tratados
com etanol pela segunda vez, evidenciando a tolerância rápida. O pré-tratamento com o antagonista CB1 nas
3 doses administradas (0,5 µg, 1 µg e 2 µg) bloqueou o desenvolvimento de tolerância sendo evidenciado
elevado prejuízo motor no segundo dia, mesmo nos animais tratados com etanol pela segunda vez. (*) p <
0.05 em comparação ao respectivo controle. ANOVA para medidas repetidas com fator tempo (dia 1 e dia 2)
como medida repetida, seguida de teste de LSD. Dados expressos como média ± EPM.
4.3. Efeito da administração do agonista canabinóide (WIN 55,212-2) sobre o efeito do
antagonista CB1 na tolerância rápida ao etanol.
Observa-se na figura 9 que no dia 1, apenas os animais tratados com etanol
apresentaram prejuízo motor, sendo o que grupo tratado com etanol e veículo no primeiro
dia apresentou prejuízo motor diminuído no dia 2. O tratamento com 1 µg de SR141716 no
dia 1 bloqueou o desenvolvimento de tolerância, tendo seu efeito revertido por uma dose
de agonista (1 µg) que não apresentou efeito per se sobre a tolerância. A ANOVA sugere
que o agonista canabinóide WIN55,212-2 reverteu o efeito do antagonista SR141716 pela
44
ausência de interação entre os três tratamento [F
(1, 77)
= 0,15; p = 0,70], com doses que não
interferem com o efeito do etanol sobre o prejuízo motor [F
(1, 77)
= 0,28; p = 0,60].
Dia 1
0
25
50
75
100
Veículo + Veículo
SR 1 µg + Veículo
Veículo + WIN 1 µg SR 1 µg + WIN 1µg
S
E ESS
SE E
*
*
*
*
Prejuízo Motor Máximo (%)
Dia 2
*
*
*
S
E ESS
SE E
Etanol
Figura 9: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 e WIN55,212-2 na tolerância rápida. No dia 1, apenas o
tratamento com 2,7 g/Kg de etanol (E) promoveu prejuízo motor. No segundo dia, os animais tratados com
veículo (i.c.v.) apresentaram prejuízo reduzido quando tratados com etanol pela segunda vez, evidenciando a
tolerância rápida. O tratamento com o antagonista CB1 (1 µg) bloqueou o desenvolvimento de tolerância
sendo evidenciado elevado prejuízo motor no segundo dia. A administração imediata de uma dose de agonista
canabinóide WIN55,212 (1 µg) que não teve efeito per se reverteu o bloqueio promovido pelo SR. (*) p <
0.05 em comparação ao respectivo controle. ANOVA seguida de teste LSD.
4.4. Tolerância aguda para diferentes doses de etanol.
Nos primeiros experimentos de tolerância aguda, após a administração sistêmica
de cada uma das 3 doses de etanol, verificaram-se picos de concentração plasmática de
álcool nos 15 minutos iniciais após a injeção intraperitoneal da droga, observando
concentrações sangüíneas constantes ao longo dos 75 minutos de experimentos (figura
10A). Em paralelo, análises de prejuízo motor percentual no plano inclinado mostraram que
o prejuízo motor promovido pelo álcool é máximo no primeiro momento do teste aos 15
45
minutos, diminuindo significativamente ao longo do tempo com repetidas exposições ao
modelo (figura 10B). Análises de área sobre a curva (figura 10, C e D) revelam que
concentrações plasmáticas [F
(2, 21)
= 64,33, p < 0,01, ANOVA de 1 via] e prejuízo motor ao
longo do tempo [F
(2, 21)
= 42,96, p < 0,01, ANOVA de 1 via] foram diretamente
relacionados à dose administrada.
15 30 45 60 75
200
250
300
350
Tempo (min)
Etanol (mg/dl)
15 30 45 60 75
0
25
50
75
100
Tempo (min)
Etanol 3.0 g/Kg
Etanol 2.7 g/kg
Etanol 2.5 g/Kg
Prejuízo Motor (%)
0
5
10
15
20
25
*
*
Área sob a curva (Etanol) x 10
3
0
1
2
3
4
5
Etanol 2,5 g/Kg
Etanol 2,7 g/Kg
Etanol 3,0 g/Kg
*
*
Área sob a curva (PM) x 10
3
A
B
C
D
Figura 10: Efeito da administração de diferentes doses de etanol na tolerância aguda. A) Concentrações
plasmáticas de etanol ao longo do tempo após administração i.p. de uma das 3 doses (2,5; 2,7ou 3,0 g/Kg). B)
Análise temporal do prejuízo motor promovido pela administração de cada dose de administrada. C e D, áreas
sob as curvas da concentração alcoólica sangüínea e prejuízo motor, respectivamente. Dados expressos como
média ± EPM. (*) = p < 0,05 em relação aos demais grupos. ANOVA de 1 via, seguida de teste LSD.
46
4.5. Efeito da administração i.c.v. de SR141716 na tolerância aguda ao etanol.
Na figura 11 encontra-se ilustrado o efeito da administração
intracerebroventricular do antagonista canabinóide SR141716. A ANOVA da área sob a
curva [F
(3, 33)
= 0,01, p = 0,96] sugere que a microinjeção i.c.v. do antagonista CB1 não
interferiu com o prejuízo motor promovido pelo etanol ao longo do experimento (figura
11D). De maneira inesperada, porém, esse tratamento promoveu uma redução significativa
nas concentrações sangüíneas de etanol [F
(3, 33)
= 4,25, p = 0,01] após microinjeções das
duas maiores doses (2 e 4 µg) (figura 11, A e C).
4.6. Influência do agonista canabinóide (WIN 55,212-2) na redução das concentrações
sangüíneas de etanol causada pelo SR141716.
Na figura 12, observa-se que a microinjeção de 1 µg do agonista canabinóide
WIN55,212-2 per se não interferiu com o prejuízo motor [F
(1, 29)
= 0,23, p = 0,63] nem com
as concentrações plasmáticas de etanol [F
(1, 29)
= 0,68, p = 0,41] analisando-se as áreas sob
as curvas pela ANOVA de 1 via. No entanto, o agonista CB1 interagiu de maneira
significativa com o tratamento do antagonista nas concentrações plasmáticas [F
(1, 29)
= 5,67,
p = 0,02] sugerindo uma inversão do efeito do antagonista sem interferir com o prejuízo
motor [F
(1, 29)
= 0,15, p = 0,71].
47
15 30 45 60 75
200
250
300
350
Tempo (min)
Etanol (mg/dl)
15 30 45 60 75
0
25
50
75
100
Veículo
SR 0.5 µg
SR 2.0 µg
SR 4.0 µg
Tempo (min)
Prrejuízo Motor (%)
0
5
10
15
20
25
*
*
Área sob a curva (Etanol) x 10
3
0
1
2
3
4
5
Veículo
SR 0,5 µg
SR 2,0 µg
SR 4,0 µg
Área sob a curva (PM) x 10
3
A
B
C
D
Figura 11: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 na tolerância aguda ao etanol. A) Concentrações
plasmáticas de etanol ao longo do tempo após administração i.p. de 3,0 g/Kg. B) Análise temporal do prejuízo
motor promovido pela administração de etanol. C e D, áreas sob as curvas da concentração alcoólica
sangüínea e prejuízo motor, respectivamente. Dados expressos como média ± EPM. (*) = p < 0,05 em relação
ao grupo controle. ANOVA de 1 via, seguida de teste LSD.
48
15 30 45 60 75
200
250
300
350
Tempo (min)
Etanol (mg/dl)
15 30 45 60 75
0
25
50
75
100
WIN 1 µg
WIN 1 µg + SR 2 µg
Veículo
SR 2 µg
Tempo (min)
Prejuízo Motor (%)
0
5
10
15
20
25
*
Área sob a curva (Etanol) x 10
3
0
1
2
3
4
5
Veículo
SR 2 µg
WIN 1 µg
SR 2 µg + WIN 1µg
Área sob a curva (PM) x 10
3
A
B
C
D
Figura 12: Efeito da administração i.c.v. de SR141716 e WIN55,212-2 na tolerância aguda. A)
Concentrações plasmáticas de etanol ao longo do tempo após administração i.p. de 3,0 g/Kg. B) Análise
temporal do prejuízo motor promovido pela administração de etanol. C e D, áreas sob as curvas da
concentração alcoólica sangüínea e prejuízo motor, respectivamente. Dados expressos como média ± EPM.
(*) = p < 0,05 em relação ao grupo controle. ANOVA de 1 via, seguida de teste LSD.
49
4.7. Efeitos da administração de SR141716 na concentração de etanol na urina.
A figura 13 ilustra o efeito da administração central do antagonista CB1 na
eliminação de etanol pela urina. A ANOVA de 1 via demonstrou que o tratamento i.c.v
com SR141716 não interferiu com a estimativa do volume urinário [F
(2, 20)
= 0,33, p = 0,72]
(figura 13A), porém interferiu significativamente nas concentrações de etanol eliminadas
na urina [F
(2, 20)
= 4,68, p = 0,02], sendo observada uma redução nas concentrações de
etanol com a administração i.c.v. da maior dose do antagonista CB1(figura 13B). Este
experimento sugere que as concentrações de etanol no sangue e na urina, após o tratamento
i.c.v. com o antagonista CB1 (ou veículo), são proporcionais.
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Volume Urinário (ml)
250
300
350
400
450
Veículo
SR 2 µg
*
SR 4 µg
Etanol (mg/dl)
A B
Figura 13: Efeito da administração intracerebroventricular do antagonista CB1 na concentração de etanol na
urina coletada durante 75 minutos após a injeção de etanol. Observa-se que a administração do antagonista
CB1 não interferiu com o volume urinário (A), porém reduziu significativamente, na maior dose
administrada, as concentrações de etanol na urina (B). Dados expressos como média ± EPM. (*) p < 0,05,
ANOVA de 1 via seguida de teste LSD.
50
4.8. Efeitos da administração i.c.v. de SR141716 nas alterações cardiovasculares
promovidas pelo Etanol.
Ainda considerando o efeito da administração aguda de SR141716 (i.c.v.) em
reduzir as concentrações de etanol no sangue, o próximo experimento foi realizado para
verificar se alterações na pressão arterial ou na freqüência cardíaca promovidas pela droga
poderiam, explicar uma maior metabolização. Em animais anestesiados e com registros de
pressão arterial e freqüência cardíaca estáveis, a ANOVA para medidas repetidas revelou
que a administração sistêmica de etanol (3 g/Kg) reduziu significativamente a pressão
arterial [F
(1, 15)
= 70,12, p < 0,01], sem promover alterações na freqüência cardíaca. O
tratamento com SR141716 per se não interferiu na PA [F
(1, 15)
= 2,50, p = 0,13] nem na FC
[F
(1, 15)
= 1,68, p = 0,21]. No entanto, a administração i.c.v de SR141716 elevou
significativamente a FC no grupo tratado com etanol [F
(1, 15)
= 4,81, p = 0,04] sem alterar a
PA [F
(1, 15)
= 1,71, p = 0,21]. Observa-se na figura 14 que o tratamento com etanol na dose
de 3 g/Kg promove elevada queda de pressão arterial sem alterar a freqüência cardíaca de
ratos anestesiados, observa-se também que o antagonista CB1 não promoveu qualquer
alteração nem na PA nem na FC, porém após tratamento com o etanol promoveu uma
elevação significativa de freqüência cardíaca acompanhada de alterações de pressão arterial
que apesar de não diferir do grupo tratado com etanol e veículo também não diferiu dos
grupos tratados com salina, evidenciada pelo teste LSD.
51
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-60
-40
-20
0
20
SR 141716
*
*
*
*
*
*
*
*
Tempo (min)
∆
∆
∆
∆
PA (mmHg)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-10
10
30
50
70
Etanol + SR 2 µg
Etanol + Veículo
Salina + SR 2 µg
SR 141716
Salina + Veículo
*
*
*
*
*
*
Tempo (min)
∆
∆
∆
∆
FC (bpm)
A
B
Figura 14: Efeito da administração intracerebroventricular do antagonista CB1 nas alterações
cardiovasculares promovidas pela administração sistêmica de etanol. (A) Alterações na pressão arterial
expressas como diferenças de pressão em relação aos valores basais (PA, em mmHg). (*) p < 0,05 (grupo
tratado com etanol + veículo em relação aos grupos tratados com salina). (B) Alterações na freqüência
cardíaca expressas como diferenças de freqüência em relação aos valores basais (∆FC, em bpm). (*) p < 0,05,
em relação à medida inicial dentro do mesmo grupo. Dados expressos como média ± EPM. Análises
estatísticas com ANOVA para medidas repetidas, seguida do teste LSD.
52
5. DISCUSSÃO
Diversos estudos têm verificado efeito do antagonista CB1 SR141716 na redução
de propriedades reforçadoras do etanol, diminuindo o consumo (Arnone et al., 1997;
Colombo et al., 1998; Hungund et al., 2003) e a preferência ao álcool (Hungund et al.,
2003; Poncelet et al., 2003; Wang et al., 2003), entretanto, este é o primeiro estudo
mostrando os efeitos do antagonista CB1 no desenvolvimento de tolerância ao etanol em
ratos. Esses resultados divergem parcialmente de resultados prévios em que o antagonista
CB1 não afetou o desenvolvimento de tolerância rápida em camundongos testados no
modelo do “rotarod” sobre o desenvolvimento de tolerância rápida (Da Silva et al 2001).
No entanto os diferentes resultados obtidos podem ser explicados pelas diferenças
metodológicas entre os dois estudos, tais como espécie, modelo utilizado e doses
empregadas do antagonista canabinóide.
Confirmando dados anteriores do laboratório (Wazlawik & Morato, 2002; 2003,
Varaschin et al., 2005), os resultados deste estudo mostraram que os animais tratados por
via sistêmica com 2,7 g/Kg de etanol apresentaram um prejuízo motor elevado em
comparação com os animais tratados com salina. Este prejuízo diminuiu significativamente
ao longo do tempo, sendo maior na primeira exposição ao teste (30 minutos após a injeção
de etanol). Observou-se também, no segundo dia, uma redução significativa do prejuízo
motor nos animais que receberam etanol na mesma dose (2,7 g/Kg) pela segunda vez,
evidenciando o desenvolvimento de tolerância rápida, efeito não observado nos animais
controles. Como as diferenças mais significativas entre os dois grupos ocorreram no
primeiro momento do teste (30 minutos), no qual o prejuízo motor foi mais evidente, o
prejuízo motor nesse intervalo em cada dia foi usado como medida comportamental válida
53
para estudar a tolerância rápida. Este tipo de interpretação está condizente com outros
trabalhos que utilizaram o prejuízo motor máximo nos dois dias do teste para avaliar a
tolerância rápida ao efeito de incoordenação motora promovida pela administração
sistêmica de etanol (Khanna et al., 1996; Wazlawik & Morato, 2002; 2003, Varaschin et
al., 2005).
Com respeito aos efeitos do bloqueio do receptor CB1 na tolerância rápida este
estudo mostrou que a administração sistêmica do antagonista CB1 SR141716 bloqueou, de
maneira dependente da dose, o desenvolvimento de tolerância rápida. Além da localização
predominante no SNC, sabe-se que existem receptores CB1 periféricos que poderiam
justificar alguns dos efeitos sistêmicos desse antagonista (Gómez et al., 2002). No entanto,
o bloqueio da tolerância rápida obtido com a administração i.c.v. do antagonista
canabinóide SR141716 reforça o envolvimento de receptores canabinoides centrais nesse
fenômeno. Além disso, o agonista canabinóide WIN55,212-2 microinjetado em dose que
não apresenta efeitos per se por via i.c.v., subseqüentemente ao SR141716, impediu o
bloqueio da tolerância rápida pelo antagonista canabinóide CB1. Assim, o bloqueio da
tolerância rápida pelo antagonista canabinóide parece ser específico e não uma
conseqüência da influência de endocanabinóides em outros alvos moleculares (Di Marzo et
al., 2002), como o receptor “CB3”, sugerido por alguns pesquisadores como possível
subtipo de receptor canabinóide (Piomelli, 2003; Freund et al., 2003). Já que existe uma
predominância de receptores CB1 no sistema nervoso central, o uso do agonista
WIN55,212-2 pela via i.c.v. reforçou o envolvimento de receptores CB1 no bloqueio da
tolerância rápida promovido pelo SR141716. Em conjunto esses dados sugerem que o
sistema endocanabinóide participa no desenvolvimento de tolerância rápida ao etanol por
mecanismos envolvendo os receptores CB1 centrais.
54
Tem sido sugerido que o desenvolvimento de tolerância rápida é um fenômeno
dependente do aprendizado (Bitran & Kalant, 1991; Khanna et al., 1996), uma vez que e
exposição do animal ao teste depois (mas não antes) da injeção sistêmica de etanol é
necessária para o desenvolvimento da tolerância rápida (Khanna et al., 1996). Além disso,
drogas que prejudicam processos de aprendizado, como antagonistas do receptor NMDA
(Khanna et al., 1994; Morato & Khanna, 1996), e inibidores da síntese de óxido nítrico
(Wazlawik & Morato, 2002; 2003), bloquearam a aquisição de tolerância, sugerindo o
envolvimento de fatores ligados ao aprendizado e de processos de plasticidade sináptica em
seu desenvolvimento. No entanto, os resultados do presente estudo não parecem ser
decorrentes de um prejuízo no aprendizado causado pelo antagonista canabinóide nas doses
empregadas já que há evidências sugerindo uma ação facilitadora do aprendizado e
memória pelo bloqueio CB1 (Wolff & Leander, 2003; Takahashi et al., 2005).
Apesar de diversos efeitos similares entre etanol e canabinóides tais como
hipotermia, incoordenação motora, analgesia e prejuízos de memória (Hollister & Gillespie,
1970; Heishman et al., 1997) serem conhecidos há bastante tempo, foi após a descoberta
(Devane et al., 1988) e clonagem (Matsuda et al., 1990) dos receptores canabinóides, a
identificação de ligantes endógenos (Devane et al., 1992) e a caracterização de suas vias
biossintéticas (Di Marzo et al., 1994; Di Marzo et al., 1996; Bisogno et al., 1997; Stella et
al., 1997) que diversos estudos verificaram possíveis ações do etanol nesse sistema de
neurotransmissão, sugerindo-se que alguns efeitos do álcool poderiam ser mediados por
receptores canabinóides centrais (Hungund & Basavarajappa, 2000; Basavarajappa &
Hungund, 2002; Basavarajappa & Hungund, 2005). Os resultados comportamentais
apresentados no presente estudo estão condizentes com diversos trabalhos que mostraram
desenvolvimento de tolerância crônica cruzada entre etanol e ∆
9
-THC (Newman et al.,
55
1972; Macavoy & Marks, 1975; Sprague & Craigmill, 1976; Siemens & Doyle, 1979;
Marks & MacAvoy, 1989) e com um trabalho recente do grupo que estendeu o
desenvolvimento de tolerância cruzada entre álcool e ∆
9
-THC também para a tolerância
rápida à incoordenação motora causada pelo álcool (Da Silva et al., 2001). Considerando
que ocorre tolerância cruzada entre o endocanabinóide anandamida e o ∆
9
-THC (Pertwee et
al., 1993; Fride, 1995), e que o etanol leva ao aumento de anandamida nas sinapses
(Basavarajappa & Hungund, 1999), pode-se sugerir que o desenvolvimento de tolerância
cruzada entre etanol e ∆
9
-THC seja em parte devido à potenciação da neurotransmissão
endocanabinóide promovida pelo álcool (Hungund & Basavarajappa, 2000; Basavarajappa
& Hungund, 2002; Basavarajappa & Hungund, 2005).
Conforme mencionado na introdução deste trabalho, as estruturas cerebrais
envolvidas no sistema motor (substância nigra pars compacta e pars reticulada, caudado-
putâmem, globo pálido, córtex motor, córtex cerebelar) contém alta densidade de receptores
canabinóides CB1 (Howlett et al., 1990; Breivogel & Childers, 1998). Diversos estudos
têm sugerido uma regulação do sistema motor pelo sistema canabinóide endógeno
modulando tanto sinapses excitatórias glutamatérgicas quanto inibitórias GABAérgicas
(Rodrigues de Fonseca et al., 1998; Giuffrida et al.,1999; Giufrida et al., 2000; Julian et al.,
2003; van der Stelt & Di Marzo, 2003). Tanto o etanol como os canabinóides prejudicam o
desempenho motor, e, como já mencionado, a administração crônica de álcool promove
uma potenciação da neurotransmissão endocanabinóide. Por isso, alguns autores têm
sugerido que adaptações no sistema de neurotransmissão endocanabinóide podem ser
importantes para o desenvolvimento de tolerância ao álcool (Hungund & Basavarajappa,
2000; Basavarajappa & Hungund, 2002; Basavarajappa & Hungund, 2005). Portanto, é
56
concebível supor que o bloqueio da tolerância rápida a incoordenação motora causada pelo
etanol seja decorrente de uma ação do SR141716 no sistema motor.
Do ponto de vista molecular há evidências de que a tolerância ao etanol envolve
diversos processos neuroadaptativos em diversos sistemas de neurotransmissão. Essas
neuroadaptações podem ser rápidas ou lentas, envolvendo desde eventos de fosforilação de
subunidades de receptores até diminuição de expressão de determinados subtipos dessas
subunidades (Loh & Ball, 2000; Ron, 2004). Dentre os sistemas de neurotransmissão mais
envolvidos nas neuradaptações promovidas pela administração de etanol, destacam-se o
glutamatérgico, principalmante através do receptor NMDA, e o GABAérgico,
principalmente com o receptor GABA
A
(Chandler et al., 1998).
Sabe-se que alterações moleculares rápidas (fosforilações) ou lentas (alterações de
expressões de subunidades) nos receptores NMDA ou GABA
A
são as mais envolvidas com
o desenvolvimento de tolerância e sensibilidade aos efeitos depressores do etanol, uma vez
que esses são os dois principais sistemas de neurotransmissão envolvidos nos efeitos
depressores do etanol. Alterações rápidas como fosforilações podem promover
sensibilidade diminuída ao longo de uma única exposição ao etanol, ocorrendo diminuição
dos efeitos inibitórios do álcool sobre os receptores NMDA, ou ainda sensibilidade
aumentada dos receptores GABA
A
após uma única administração (Grobin et al., 1998; Loh
& Ball, 2000; Krystal et al., 2003; Ron, 2004).
Adicionalmente, uma vez que o sistema de neurotransmissão endocanabinóide
regula a liberação de diversos neurotransmissores e que pode interferir com cascatas de
transdução intracelular, poderia direta ou indiretamente interferir em eventos moleculares
importantes no desenvolvimento de tolerância rápida. Por exemplo, os antagonistas
endocanabinóides inibem a liberação de dopamina no núcleo accumbens (Hungund et al,
57
2003; Perra etal, 2005). Sabe-se que a dopamina, ao atuar em receptores dopaminérgicos,
promove aumento da expressão da proteína DARPP-32, a qual reduz a sensibilidade de
receptores NMDA aos efeitos depressores do etanol (Maldve et al., 2002). Como o sistema
endocabinóide pode modular neurônios dopaminérgicos, além dos glutamatérgicos e
GABAérgicos, em estruturas relacionadas ao controle motor, é possível que o uso de
antagonistas CB1 interfira em processos neuroadaptativos envolvidos no desenvolvimento
de tolerância ao etanol através do sistema dopaminérgico.
Outro possibilidade interessante para explicar de modo especulativo a participação
do receptor CB1 na tolerância rápida ao etanol é o fato de diversos subtipos de receptores
(δ opióide, CB1, D2 da dopamina) acoplados a proteína Gi/0 apresentarem a propriedade de
estimular (através do dímero βγ da proteína G dissociada) as isoformas de adenilato ciclase
subtipos II e IV, promovendo inicialmente aumento das concentrações de AMPc que pode
ativar proteínas cinases, e, após 5 horas, aumentar a expressão de diversos genes, pela
ativação de fatores de transcrição, especialmente CREB (Yao et al, 2003). Deste modo, é
possível que a ativação de receptores CB1 module mecanismos de transdução de outros
receptores, através da ativação de proteínas cinases resultante da ativação de isoformas da
adenilato ciclase via dímero βγ da proteína G dissociada, ou através da alteração da
expressão de subunidades de receptores envolvidos na sensibilidade aos efeitos depressores
do etanol.
Como já relatado previamente, a tolerância rápida tem sido proposta como um
modelo para predizer aspectos relevantes da tolerância crônica ao etanol (Khanna et al.,
1991; 1992; 1996). Assim, com base em nosso estudo e em evidências da literatura é
possível sugerir um papel do sistema endocanabinóide e dos receptores CB1 centrais no
desenvolvimento da tolerância crônica ao etanol.
58
Um segundo enfoque do presente estudo foi avaliar o efeito do bloqueio CB1
central na tolerância aguda ao etanol. Observou-se que, paralelamente ao retorno à
coordenação motora normal dos animais ao longo dos 75 min de experimento, a
concentração alcoólica sangüínea permaneceu elevada, caracterizando o fenômeno de
tolerância aguda (Kalant et al., 1971; LeBlanc et al., 1975; Khanna et al, 2002; Radlow,
1994). Esta redução do prejuízo motor com concentrações circulantes de álcool inalteradas
ao longo do tempo foi observada com as três doses de etanol administradas sugerindo que a
tolerância aguda parece ser um fenômeno tempo-dependente e “treino-dependente”, porém
não dose-dependente, conforme já havia sido sugerido por trabalhos anteriores (Lê &
Kalant, 1992; Radlow, 1994; Khanna et al., 2002).
A administração i.c.v. do antagonista SR141716 não interferiu com o prejuízo
motor promovido pelo etanol em comparação com o grupo controle, porém as maiores
doses causaram redução estatisticamente significante nas concentrações plasmáticas de
etanol. Assim, esses resultados sugerem que o bloqueio do receptor CB1 não interfere na
tolerância aguda ao etanol. No entanto, algumas diferenças em relação a estudos da
literatura serão discutidas a seguir.
Há evidências de que diferentes classes de drogas bloqueiam a tolerância aguda ao
etanol pelo fato de prejudicarem a recuperação motora dos animais sem, no entanto,
afetarem as concentrações alcoólicas sangüíneas (Quintanilla & Tampier, 2000; Khanna et
al, 2002). Mesmo nos estudos concluindo que uma droga não afetou (Khanna et al., 1992),
ou que estimulou a tolerância aguda (Khanna et al., 2002) não houve diferenças
significantes nos níveis sanguíneos de etanol entre os grupos experimentais e controle.
Embora o sangue periférico tenha sido usado para avaliar a alcoolemia no presente estudo,
vários trabalhos mostraram que não há diferenças entre os níveis de álcool no sangue e no
59
cérebro medidos ao mesmo tempo após a administração i.p. de etanol (Gostomzyk et al.,
1969; LeBlanc et al, 1975; Tabakoff et al., 1986) especialmente em intervalos maiores que
10 min (Sunahara et al., 1978). Além disso, no presente estudo observa-se que o prejuízo
motor varia de acordo com a concentração sangüínea de álcool (ver figura 10). Assim, uma
vez que na presença do bloqueio CB1 a alcoolemia estava baixa, mas a performance motora
dos animais estava inalterada, é possível sugerir que estes se encontravam mais sensíveis ao
efeito depressor do etanol. Esse resultado está consistente com trabalhos que verificaram
maior sensibilidade para os efeitos hipotérmicos, locomotores e hipno-sedativos do etanol
em camundongos nocautes para o receptor CB1 em comparação com os selvagens (Naasila
et al., 2004).
Diversos trabalhos têm mostrado que a sensibilidade aos efeitos depressores do
álcool está inversamente relacionada ao consumo (Harris et al., 1995; Hodges et al., 1999;
Olive et al., 2000; Bowers & Wehner, 2001), sendo que linhagens menos sensíveis aos
efeitos depressores do etanol tendem a consumir mais álcool (Kurtz et al., 1996; Tampier et
al., 2000). Nesse contexto, poderia ser especulado que a redução do consumo de etanol
promovida pela administração do antagonista CB1 relatada em outros estudos (Arnone et
al., 1997; Colombo et al., 1998; Gallate & McGregor, 1999; González et al., 2004) também
poderia decorrer da maior sensibilidade ao efeito depressor do álcool causada pelo
antagonista, e não apenas à redução das propriedades reforçadoras do etanol sugerido pelos
autores (Colombo et al., 1998; Hungund et al., 2003). Além disso, é possível sugerir que as
alterações observadas após a injeção i.c.v. de antagonista CB1 no modelo da tolerância
aguda relatadas aqui tenham ocorrido de modo semelhante no primeiro dia de teste no
modelo de tolerância rápida, o que explicaria em parte o bloqueio deste último tipo de
tolerância pelo antagonista CB1.
60
A redução da alcoolemia pelo bloqueio CB1 via i.c.v. está de acordo com
resultados empregando uma dose alta (10 mg/Kg) de SR141716 por via i.p. em ratos Wistar
tratados com etanol. No entanto, discorda de estudos nos quais essa droga não alterou os
níveis alcoólicos sanguíneos em “ethanol-preferring sP rats” (Colombo et al., 1998), bem
como discorda de estudos com camundongos nocautes para receptor CB1, nos quais houve
maior alcoolemia após a administração de uma dose elevada de álcool (5 g/Kg) em
comparação com os selvagens (Lallemand & De Witte, 2005). Entretanto, as diferenças
existentes entre os resultados da literatura e os deste estudo podem ser devidas aos
diferentes protocolos experimentais, doses, espécies e linhagens empregados. Reforçando a
participação de receptores CB1 na redução da alcoolemia pelo SR141716, a administração
i.c.v. do agonista canabinóide WIN55,212-2 subsequentemente ao antagonista impediu esse
efeito, sem interferir na performance motora dos animais. É pouco provável que os efeitos
aqui descritos sejam decorrentes de uma ação do antagonista em receptores CB1 periféricos
porque as doses empregadas (0,5 – 4 µg) não são efetivas quando administradas
sistemicamente (Rinaldi-Carmona et al., 1994). Em conjunto com os trabalhos citados
acima, nossos resultados sugerem uma participação importante de receptores CB1 centrais
na regulação das concentrações plasmáticas do etanol. Este é o primeiro estudo a observar
alterações na alcoolemia após microinjeções centrais do antagonista CB1.
A redução da alcoolemia pela administração central de SR141716 poderia ser
resultante do efeito desse antagonista em diferentes etapas farmacocinéticas do etanol.
Como a absorção do etanol ocorre após os minutos iniciais da administração i.p.dessa droga
(Czaja & Kalant, 1961) e as administrações i.c.v. do SR141716 foram feitas 5 min após as
administrações i.p. sugerimos que o efeito do antagonista na etapa de absorção deva ser de
61
menor importância. Por isso neste trabalho verificou-se se a administração i.c.v. do
antagonista CB1 poderia aumentar a eliminação de etanol pela urina. Devido a razões
metodológicas, apenas uma coleta urinária foi feita durante 75 min (tempo igual ao do
experimento de tolerância aguda) após a injeção de etanol. O efeito diurético do etanol
(Ragland, 1990; Rodrigo et al., 1998) promovido pela inibição da secreção de vasopressina
através do bloqueio de canais de cálcio nas terminações nervosas da neurohipófise (Wang
et al., 1991) ocorre apenas em doses moderadas (Pohorecky, 1985) sendo que doses mais
elevadas podem apresentar o efeito oposto, justificando em parte a dificuldade na coleta de
amostras de urina nesse estudo. As concentrações elevadas de etanol obtidas na urina foram
consistentes com as concentrações teóricas devido ao pequeno volume urinário (em torno
de 1 ml) comparado com o volume sanguíneo total (cerca de 70 ml) de um rato adulto, que
resulta num percentual urinário abaixo de 5% do total de álcool absorvido. Outros autores
obtiveram concentrações urinárias de etanol menores, com concentrações sangüíneas
equivalentes às apresentadas aqui (Badger et al., 2005), porém isso pode ser explicado
porque usaram animais fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, e a dosagem de etanol feita
na urina de 24 horas.
A administração central do antagonista CB1 não interferiu no volume urinário, mas
como na alcoolemia, promoveu concentrações de álcool menores na urina. Embora existam
evidências de que a anandamida diminua a taxa de filtração glomerular renal pela
diminuição da pressão sangüínea de vasos locais mediada pelo receptor CB1 (Koura et al.,
2004), nenhum estudo demonstrou, até o momento, uma regulação da filtração glomerular
por receptores canabinóides cerebrais. Nossos resultados contrariam a hipótese de que a
menor alcoolemia apresentada pelos animais tratados com SR141716 seria devida à
eliminação aumentada de etanol na urina. Concluiu-se apenas que as concentrações de
62
álcool na urina, nos grupos tratados ou não com antagonista CB1, correlacionam-se com os
níveis sangüíneos de álcool.
A interferência direta do bloqueio CB1 central no metabolismo hepático do etanol
não foi avaliada no presente estudo. No entanto, foi realizado um experimento adicional
para verficar se a redução da alcoolemia promovida pela injeção i.c.v. do antagonista CB1
poderia ser decorrente de alterações cardiovasculares que pudessem sugerir aumento no
débito cardíaco, o qual explicasse uma maior eliminação e/ou metabolização de álcool, na
presença do SR141716. Em animais anestesiados, com registros de pressão arterial (PA) e
freqüência cardíaca (FC) estáveis, a administração i.c.v. de SR141716 ou do veículo não
alterou os valores basais de PA e FC ao longo de 80 minutos de experimento. O etanol
causou uma redução significativa na PA dos animais tratados i.c.v com veículo (controles),
a qual não foi compensada com uma elevação reflexa da FC. Estes resultados estão
condizentes com outros estudos mostrando que a administração de etanol intravenosa ou
diretamente no núcleo do trato solitário (NTS) inibe a resposta reflexa, possivelmente por
um bloqueio de receptores NMDA do NTS (el-Mas & Abel-Rahman, 1992; el-Mas &
Abel-Rahman, 1993). Com a administração de etanol, a PA média é reduzida
provavelmente devido a vasodilatação dos vasos de resistência (Puddey et al., 2001), porém
a FC permanece inalterada possivelmente devido à inibição da resposta barorreflexa pelo
etanol.
De modo diferente ao ocorrido com o grupo controle, a administração i.c.v. de
SR141716 cinco minutos após a injeção de álcool causou uma queda de PA seguida do
aumento significativo da FC. Alguns trabalhos têm mostrado que o sistema
endocanabinóide e o receptor CB1 podem estar envolvidos na resposta barorreflexa através
da ativação de receptores presentes em estruturas do tronco encefálico, principalmente o
63
NTS. Há evidências de que a administração de SR141716 no NTS aumenta a duração do
barorreflexo (Rademacher et al., 2003) e, ao contrário, a microinjeção de anandamida
diminui a resposta barorreflexa (Seagard et al., 2004; 2005). Diante de nossos resultados e
das evidências da literatura é possível sugerir que o sistema canabinóide e o receptor CB1
centrais modulem, pelo menos em parte, os efeitos do etanol no sistema cardiovascular.
Este é o primeiro estudo sugerindo um envolvimento do sistema endocanabinóide central
nos efeitos do etanol sobre o sistema cardiovascular, possivelmente por ações envolvendo
receptores CB1 do NTS (Rademacher et al., 2003; Seagard et al., 2004; 2005).
Esta abordagem, no entanto, não permitiu sugerir algum aumento no débito
cardíaco que explicasse uma maior eliminação e/ou metabolização de álcool, na presença
do SR141716. Entretanto alguns aspectos deste experimento merecem ser discutidos.
Inicialmente é importante ressaltar que para a medida dos parâmetros cardiovasculares os
animais encontravam-se anestesiados. Durante o procedimento experimental da tolerância
aguda, no entanto, os animais ao serem manipulados para a medida comportamental e a
punção da cauda, poderiam ter alterações mais significativas, tanto na PA quanto na FC, em
decorrência de um estresse moderado. Sabendo que a taquicardia em resposta ao estresse
também é inibida pelo etanol por um mecanismo regulado por receptores NMDA do NTS
(Varga et al., 1996) e que os endocanabinóides podem modular o sistema cardiovascular
através de receptores CB1 dessa estrutura cerebral (Rademacher et al., 2003; Seagard et al.,
2004; 2005), é possível que nos animais acordados as alterações cardiovasculares
promovidas pela injeção i.c.v. do antagonista CB1 fossem mais pronunciadas. Porém, por
inviabilidade técnica os parâmetros cardiovasculares não foram testados nos animais
submetidos no plano inclinado.
64
Há evidências de que o sistema endocanabinóide tem um papel importante na
regulação de comportamentos defensivos relacionados a situações estressantes (para
revisão; Valverde, 2005; Witkin et al., 2005; Wotjak, 2005; Viveros et al., 2005). Além
disso, sabe-se que aumentos da pressão arterial e da oxigenação tecidual hepática estão
relacionados a aumentos da metabolização de etanol, fenômeno conhecido como
hipermetabolismo hepático. Desta forma seria possível especular se as alterações
cardiovasculares promovidas pela administração central do antagonista CB1 poderiam
facilitar e/ou acelerar a degradação do etanol pelo fígado por aumentar o fluxo sangüíneo e
a oxigenação tecidual. O hipermetabolismo hepático de etanol é um fenômeno adaptativo
que ocorre geralmente após exposições crônicas ao álcool (Mendelson & Mello, 1966;
Videla & Israel, 1970), mas também pode ocorrer agudamente após tratamento com doses
elevadas dessa droga (Yuki & Thurman, 1980; Thurman et al., 1982). Entre os fatores
envolvidos no hipermetabolismo hepático o principal é o aumento da utilização de oxigênio
pelos hepatócitos. Sabe-se que níveis plasmáticos aumentados de epinefrina, norepinefrina,
corticosterona e glucagon correlacionam-se de maneira positiva com o aumento do
metabolismo (Yuki & Thurman, 1980; Yuki et al., 1980). O aumento da oxigenação
hepática e respiração mitocondrial elevam as concentrações da forma oxidada da
nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD
+
), cofator importante e limitante da degradação
enzimática do álcool pela álcool-dehidrogenase (ADH). Além disso, o fluxo aumentado de
oxigênio pode favorecer a metabolização do álcool por outras vias como a do sistema de
oxidação microssômico P-450, bem como a via da catalase (Thurman & Mckenna, 1975;
Thurman et al., 1976; Thurman & Scholz, 1977).
Dessa forma, se a hipótese de que na situação experimental da avaliação da
tolerância aguda os animais encontravam-se mais estressados, e face aos trabalhos da
65
literatura sobre o hipermetabolismo hepático, seria possível especular se a elevação da
freqüência cardíaca por administração i.c.v. de SR141716 após o etanol poderia favorecer o
metabolismo do etanol por aumentar a oxigenação hepática.
Ainda com relação ao estresse, já foi demonstrado que eventos estressantes
repetidos ou intensos podem alterar as concentrações plasmáticas de etanol, provavelmente
por reduzir a absorção da droga (Wallgren & Tirri, 1963). No presente estudo houve
maiores variações nas concentrações plasmáticas observadas no período inicial (15
minutos) nos grupos tratados apenas com etanol e, principalmente, nos experimentos com
administrações centrais. Mas como já mencionado, o efeito da injeção i.c.v. de SR 141716
na absorção não foi avaliado.
Para concluir, é importante ressaltar que o etanol por ser uma molécula simples
que apresenta vários alvos moleculares no sistema nervoso central, pode afetar
praticamente todos os sistemas de neurotransmissão e promover uma grande quantidade de
efeitos mediados centralmente. No presente estudo, verificamos a manipulação de apenas
um desses sistemas, o endocanabinóide, porém indiretamente pode-se estar interferindo na
regulação de outros, principalmente pelo fato de os endocanabinóides atuarem como
neuromoduladores inibitórios da liberação de praticamente todos os neurotransmissores,
sendo conhecidos como mensageiros retrógrados (Di Marzo et al., 1998; Wilson & Nicoll,
2002; Piomelli, 2003).
Há evidências de que diversos sistemas de neurotransmissão podem atuar em
conjunto modulando efeitos do etanol e assim, têm sido sugeridos tratamentos combinados
de drogas que atuam em diferentes sistemas na redução do consumo de álcool (Myers &
Lankford, 1996; Rezvani et al., 2000; Heyser et al., 2003; Stromberg, 2004; Gallate et al.,
2004), como o uso de baixas doses dos antagonistas opióide naltrexona e canabinóide
66
SR141716 (Gallate et al., 2004; Manzanares et al., 2005). Sabe-se que existem diversas
interações nesses dois sistemas nos efeitos moleculares e comportamentais promovidos
pelo álcool (para revisão ver Manzanares et al., 2005). Em estudos do nosso laboratório
verificou-se que o antagonista opióide naltrexona bloqueia o desenvolvimento da tolerância
rápida à incoordenação motora promovida por etanol (Varaschin et al., 2005), estendendo o
efeito de bloqueio da tolerância aguda observado por Quintanilla et al. (2000). No presente
trabalho verificamos que administração central do antagonista CB1 bloqueou a tolerância
rápida, não interferiu no desenvolvimento da tolerância aguda, mas parece ter aumentado a
sensibilidade a incoordenação motora induzida por etanol após uma única exposição.
Em conjunto, os resultados desse estudo mostram a complexidade de efeitos do
etanol no sistema nervoso central, em particular no sistema endocanabinóide, sugerindo que
o mesmo participa em processos adaptativos centrais, bem como interfere nas
concentrações plasmáticas de etanol e nos efeitos cardiovasculares mediados centralmente.
67
6. CONCLUSÕES
• As administrações sistêmica e intracerebroventricular do antagonista canabinóide
CB1 SR141716 bloquearam a tolerância rápida a incoordenação motora induzida
por etanol, sugerindo um efeito centralmente mediado. Esse efeito foi revertido pelo
agonista canabinóide, sugerindo uma ação mediada pelos receptores CB1 cerebrais.
• O bloqueio central do receptor CB1 reduziu as concentrações plasmáticas de álcool
após administração aguda, sem afetar a coordenação motora, sugerindo que não
afetou o desenvolvimento de tolerância aguda ao etanol. Esse efeito na alcoolemia
foi revertido pelo agonista WIN55,212-2, sugerindo um efeito mediado pelos
receptores CB1 cerebrais.
• O bloqueio central dos receptores CB1 pelo antagonista SR141716 não alterou o
volume urinário de ratos tratados com etanol, mas reduziu a concentração de etanol
na urina em relação ao grupo controle.
• A administração sistêmica de etanol reduziu a pressão arterial em ratos anestesiados
sem alterar a freqüência cardíaca. O bloqueio CB1 central por SR141716 numa dose
que não alterou os valores cardiovasculares basais (PA e FC), aumentou
significativamente a freqüência cardíaca em ratos anestesiados e tratados com
etanol, sugerindo uma possível participação dos receptores CB1 nas alterações
cardiovasculares promovidas pelo álcool.
• Tomados em conjunto, os dados do presente trabalho, sugerem um envolvimento
importante dos receptores CB1 cerebrais na tolerância e sensibilidade ao etanol,
bem como na frequência cardíaca e nas concentrações plasmáticas de etanol.
68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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