( PDF ) Estudos moleculares da selenocisteína sintase(SELA) de Escherichia coli

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO

ESTUDOS MOLECULARES DA SELENOCISTEÍNA SINTASE

(SELA) DE ESCHERICHIA COLI

Alexandre Cassago

SÃO CARLOS – SP

2005

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO

ESTUDOS MOLECULARES DA SELENOCISTEÍNA SINTASE

(SELA) DE ESCHERICHIA COLI

Alexandre Cassago

SÃO CARLOS – SP

2005

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Genética e Evolução do

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da

Universidade Federal de São Carlos, como parte dos

requisitos para a obtenção do título de Mestre em

Genética e Evolução, área de concentração:

Genética e Evolução.

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária da UFSCar

C343em

Cassago, Alexandre.

Estudos moleculares da Selenocisteína Sintase (SELA)

de Escherichia coli / Alexandre Cassago. -- São Carlos :

UFSCar, 2005.

87 p.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

Carlos, 2005.

1. Biologia molecular. 2. Selenocisteína Sintase. 3.

Selenocisteína. I. Título.

CDD: 574.88 (20

)

iii

Prof. Dr. Otavio Henrique Thiemann

PROFESSOR ORIENTADOR

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao professor Dr. Otavio Henrique Thiemann pela forma concisa e

previdente na elaboração dos projetos destinados a seus alunos, bem como a

sua mente aberta para novas parcerias o que possibilita uma maior explanação

e aprendizagem frente aos novos desafios. Agradeço também pela confiança,

atenção e amizade, fundamentais para realização desse trabalho e dos muitos

outros ainda a serem realizados juntos.

Ao Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto

de Física de São Carlos – USP, ao Programa de Pós Graduação em Genética

e Evolução – UFSCar, bem como a CAPES pela oportunidade de realizar este

trabalho.

À Rosemari A. T. Curilla , Regiane Ribeiro e Tatiane T. Callegario secretárias

do Programa de Genética e Evolução pela dedicação e ajuda.

À Profa. Dra Íris Torriani e ao Dr. Cristiano L. P. de Oliveira do Laboratório

Nacional de Luz Síncrotron pela pronta colaboração fundamental para

realização deste trabalho.

À Profa. Dra. Heloísa Sobreiro S. de Araújo do Laboratório de Fármacos e

Bioquímica da Universidade Federal de São Carlos pelo colaboração junto a

produção de anticorpos policlonais.

À Profa. Dra. Ana Paula Ulian de Araújo do Grupo de Biofísica Molecular do

Instituto de Física – USP por sua atenção e sempre disponibilidade nas

inúmeras discussões.

Às amigas Dra. Andréa S. Costa, Dra. Elisete Correa, Dra. Daniella NeoJustino,

Dra. Sandra Pfister e mestra Patrícia A. Possik pela introdução à biologia

molecular e formação ao longo de toda minha Iniciação Científica. A amizade

desenvolvida ao longo de todos esses anos foi fundamental em momentos

decisivos da minha vida.

À amiga Dra. Raquel Kelly Bortoleto Bugs por suas aulas sobre purificação de

proteínas e amizade ao longo da convivência no laboratório.

Ao amigo e companheiro de bancada Ney Ribeiro Leite pelas inúmeras

discussões e trabalhos conjuntos.

Às amigas Elisandra M. Rodrigues e Susana A. Sculaccio pela amizade e apoio

na chegada ao laboratório de Cristalografia.

Aos meus amigos do laboratório e fora dele pela ajuda, paciência e amizade.

À Carolina A. de Guzzi por suas sugestões e revisões, companheirismo,

paciência e amor ao longo de nossas vidas.

À minha família: meu pai Hermínio Cassago Júnior pelo exemplo acadêmico, a

minha mãe Maria Rita de Vasconcelos Cassago por sua personalidade

estrovertida e forte e a minha irmã Ana Paula Cassago, por sua determinação.

Todos modelos que tento seguir e moldar meu caráter, personalidade e vida

durante o curto período de aprendizagem nesse mundo.

A Deus presente em todos os momentos de nossa vida.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1: Esquema ilustrando o tRNA e suas respectivas regiões........................................02

Figura 1.2: Aminoacilação do tRNA por aaRSs........................................................................03

Figura 1.3: Aminoacil-tRNA sintetases......................................................................................04

Figura 1.4: Representação dos aminoácidos Cisteína e Selenocisteína..................................05

Figura 1.5: Diagrama esquemático na forma de trevo da estrutura do tRNA

sec

uca

....................06

Figura 1.6a: Etapas envolvidas na biossíntese e incorporação de selenocisteínas.................08

Figura 1.6b: Esquema detalhado da conversão do aminoácido serina em selenocisteína pela

enzima Selenocisteína Sintase (SELA)......................................................................................09

Figura 1.7: Seqüência de nucleotídeos e respectivos aminoácidos da proteína SELA............11

Figura 1.8: Imagens obtidas da proteína SELA pela técnica de microscopia eletrônica de

transmissão................................................................................................................................12

Figura 1.9: Diagrama representativo do equipamento de Espalhamento Dinâmico de Luz

(DLS)..........................................................................................................................................17

Figura 1.10: Luz circularmente polarizada à direita..................................................................19

Figura 1.11: Espectros do dicroísmo circular............................................................................22

Figura 1.12: Diferença de fase entre raios incidentes e espalhados........................................24

Figura 1.13: Problema inverso do espalhamento......................................................................25

Figura 1.14: Curva de correlação entre a função p(r) altura e o número de linhas com

comprimentos r e r+dr................................................................................................................26

Figura 1.15: Comparações entre funções de p(r) de uma esfera, um elipsóide prolato e um

elipsóide oblato de mesmo raio de giro......................................................................................27

Figura 4.1: Etapas envolvidas na purificação da proteína SELA de Escherichia coli................48

Figura 4.2: Esquema representativo da digestão do vetor pUC19-selC com a enzima Bst N1 e

posterior transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

.................................................................................56

Figura 5.1: Amplificação do gene selA de Escherichia coli.......................................................57

Figura 5.2: Caracterização dos transformantes pET28a-selA e pET29a-selA..........................58

Figura 5.3: Alinhamento utilizando Blastn no modo Dot-Plot (NCBI) das seqüências selA

clonadas nos respectivos vetores de expressão pET29a e pET28a..........................................59

Figura 5.4: Expressão da proteína SELA..................................................................................59

Figura 5.5: Etapas da purificação da proteína SELA anteriormente a sua aplicação em coluna

aniônica DEAE Sepharose Fast Flow........................................................................................60

Figura 5.6: Purificação da proteína SELA utilizando coluna aniônica DEAE Sepharose Fast

Flow............................................................................................................................................61

Figura 5.7: Comparação dos rendimentos resultantes da purificação da proteína SELA

utilizando as colunas aniônicas DEAE Sepharose Fast Flow e Hi Trap Q HP .........................62

vii

Figura 5.8: Concentração da proteína SELA após purificação em coluna aniônica Hi Trap Q

HP..............................................................................................................................................63

Figura 5.9: Nova estratégia de purificação da proteína SELA utilizando colunas de troca iônica

Hydroxyapatite e posterior Hi Trap Q HP...................................................................................64

Figura 5.10: Titulação dos anticorpos anti-SELA produzidos em camundongos (Mus

musculus)...................................................................................................................................65

Figura 5.11: Imunobloting utilizando anticorpo anti-SELA – 3 produzido em camundongos Mus

musculus e extratos celulares de Leishmania major, Trypanosoma cruzi e Homo

sapiens.......................................................................................................................................66

Figura 5.12: Ensaio de DLS utilizando proteína SELA purificada [0,1 mg/mL] diluída em

tampão I’ contendo 10% de glicerol...........................................................................................67

Figura 5.13: Espectro de CD utilizando proteína SELA purificada [0,1 mg/mL] diluída em

tampão I’ contendo 10% de glicerol...........................................................................................68

Figura 5.14: Curvas experimentais obtidas nos experimentos de SAXS para a proteína

decamérica SELA:......................................................................................................................69

Figura 5.15: Determinação da estrutura global da proteína decamérica SELA........................70

Figura 5.16: Amplificação do gene de inserção selenocisteína tRNA

sec

uca

(selC)....................71

Figura 5.17: Caracterização dos transformantes pUC19-selC.................................................72

Figura 5.18: Alinhamento utilizando Blastn no modo Dot-Plot (NCBI) da seqüência T7 – selC

clonadas no vetor de clonagem pUC19.....................................................................................72

Figura 5.19: Transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

..........................................................................73

Figura 5.20: Amplificação por RT-PCR do gene de inserção selenocisteína tRNA

sec

uca

...........74

viii

ÍNDICE DE TABELA

Tabela 1.1: Enzimas aminoacil-tRNA sintetases.......................................................................04

Tabela 4.1: Programa utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificação

do gene selA de Escherichia coli a partir de DNA genômico.....................................................37

Tabela 4.2: Programa utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para

seqüênciamento das clonagens do inserto selA nos respectivos vetores pGEM-T, pET28a+ e

pET29a+.....................................................................................................................................42

Tabela 4.3: Programa utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificação

do gene de Inserção Selenocisteína tRNA

sec

uca

+ região promotora T7....................................54

Tabela 4.4: Programa utilizado na Reação de Transcrição Reversa para verificação do produto

relativo a transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

....................................................................56

Tabela 5.1: Desconvoluções obtidas pelo programa SELCON-2 a partir do espectro de

CD..............................................................................................................................................68

Tabela 5.2: Parâmetros obtidos a partir dos ensaios da proteína decamérica SELA

(SAXS)........................................................................................................................................70

ÍNDICE

I. INTRODUÇÃO .............................................................................................1

1.1. O Ácido Ribonucléico Transportador (tRNA)............................................1

1.2. Aminoacil-tRNA Sintetases ......................................................................2

1.3. Mecanismo de Biossíntese e Incorporação do aminoácido

Selenocisteína nas Proteínas em Procariontes...............................................5

1.4. Selenocisteína Sintase (SELA) ..............................................................10

1.5. Selênio ...................................................................................................12

1.6. Selenoproteínas .....................................................................................13

1.7. Determinação Estrutural de Proteínas ...................................................16

1.7.1. Espalhamento Dinâmico de Luz..........................................................16

1.7.2. Dicroísmo Circular...............................................................................18

1.7.3. Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo ..........................................22

1.7.4. Difração de Raios X em Cristais de Proteínas ....................................28

1.8. Desenvolvimento de Fármacos Capazes de Bloquear a Biossíntese de

Selenocisteína...............................................................................................29

II. OBJETIVOS..............................................................................................31

III. JUSTIFICATIVA E PERSPECTIVAS.......................................................32

IV. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................34

4.1. Materiais.................................................................................................34

4.2. Métodos..................................................................................................36

4.2.1. Amplificação do gene Selenocisteína Sintase (selA)...........................37

4.2.2. Clonagem do inserto selA ao vetor pGEM-T.......................................37

4.2.3. Clonagem do inserto selA aos vetores pET28a+ e pET29a+..............38

4.2.4. Transformação de células E. coli competentes...................................39

4.2.5. Caracterização das cepas recombinantes...........................................40

4.2.6. Seqüenciamento dos plasmídeos recombinantes ...............................41

4.2.7. Primeiros ensaios de expressão da proteína SELA ............................42

4.2.8. Primeiros ensaios de purificação da proteína SELA ...........................43

4.2.9. Padronização de um novo protocolo de purificação da proteína SELA

......................................................................................................................46

4.2.10. Esquemas de purificação utilizados ..................................................48

4.2.11. Produção de Anticorpos Policlonais anti-SELA .................................49

4.2.12. Titulação dos Anticorpos Produzidos ................................................49

4.2.13. Busca de Formas Homólogas da Proteína SELA a partir de

Anticorpos Policlonais ...................................................................................50

4.2.14. Determinação Estrutural da Proteína SELA ......................................50

4.2.14.1. Espalhamento Dinâmico de Luz.....................................................50

4.2.14.2. Dicroísmo Circular..........................................................................51

4.2.14.3. Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo .....................................52

4.2.15. Amplificação do gene de Inserção Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC) 53

4.2.16. Clonagem do inserto selC em vetores de clonagem .........................54

4.2.17. Seqüenciamento dos plasmídeos recombinantes .............................55

4.2.18. Transcrição in vitro e purificação do tRNA

sec

uca

.................................55

4.2.19. Verificação do tRNAsecuca transcrito por RT-PCR...........................56

V. RESULTADOS..........................................................................................57

5.1. Resultados referentes ao gene Selenocisteína Sintase (selA)...............57

5.1.1. Amplificação do gene selA ..................................................................57

5.1.2. Caracterização dos transformantes pET28a-selA e pET29a-selA ......57

5.1.3. Seqüenciamento dos recombinantes pET28a-selA e pET29a-selA ....58

5.2. Resultados referentes à proteína Selenocisteína Sintase (SELA) .........59

5.2.1. Primeiros ensaios de expressão da proteína SELA ............................59

5.2.2. Primeiros ensaios de purificação da proteína SELA ...........................60

5.2.3. Padronização de um novo protocolo de purificação da proteína SELA

......................................................................................................................61

5.2.4. Titulação dos Anticorpos Produzidos ..................................................65

5.2.5. Busca de Formas Homólogas da Proteína SELA a partir de Anticorpos

Policlonais .....................................................................................................66

5.2.6. Espalhamento Dinâmico de Luz..........................................................66

5.2.7. Dicroísmo Circular...............................................................................67

5.2.8. Difração de Raios X a Baixo Ângulo....................................................69

5.3. Resultados referentes ao Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC) ...................70

5.3.1 Amplificação do gene Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC).......................70

5.3.2. Clonagem do inserto selC em vetores de clonagem ...........................71

5.3.3. Seqüenciamento dos recombinantes pUC19-selC..............................72

5.3.4. Transcrição in vitro e purificação do tRNA

sec

uca

...................................73

VI. DISCUSSÃO............................................................................................75

VII. PERSPECTIVAS FUTURAS ..................................................................79

VIII. REFERÊNCIAS .....................................................................................80

xii

RESUMO

O estudo de processos de tradução atrai o interesse de diversos grupos

de pesquisa pelo seu papel central no metabolismo geral da célula. Em

particular o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como o

selenocisteína e o pirrolisina, que resultam na expansão do código genético

dos tradicionais 20 aminoácidos para atualmente um total de 22 aminoácidos.

O aminoácido selenocisteína representa a principal forma biológica do

elemento selênio, sendo sua síntese e sua incorporação co-traducional em

selenoproteínas uma resposta a um códon de terminação UGA em fase de

leitura através de uma complexa maquinaria molecular.

Em Escherichia coli as principais proteínas envolvidas nessa via são:

Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação de Selenocisteína (SELB

ou EFSec), Selenofosfato Sintetase (SELD) além de um tRNA

sec

próprio dessa

via denominado tRNA de Inserção de Selenocisteína (SELC).

A proteína SELA alvo de estudo deste trabalho, foi primeiramente

purificada por Forchhammer em 1991 e o único trabalho estrutural até agora

realizado foi desenvolvido por Engelhardt em 1992, a partir da técnica de

escaneamento por microscopia eletrônica de Transmissão (STEM). Possuindo

um monômero de aproximadamente 50kDa a proteína SELA assume uma

configuração espacial homodecamérica, em que cada dímero é capaz de ligar-

se a um tRNA

sec

portando o aminoácido serina que será convertido em

selenocisteína, numa reação dependente do cofator enzimático piridoxal

5’fosfato.

Nesse trabalho foi possível o desenvolvimento de um novo protocolo de

purificação para a proteína SELA, reduzindo consideravelmente os passos e

conseqüente tempo na obtenção da proteína purificada. Também aumentando

os rendimentos obtidos pela literatura, de 1mg/mL a partir de 10 litros, para

aproximadamente 4,5mg/mL a partir de 3 litros de cultura bacteriana.

Quanto aos experimentos estruturais foi possível a partir de

xiii

Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) a predição da massa molecular em

aproximadamente 442kDa, por Dicroísmo Circular (CD) a predição das

estruturas secundárias como predominantemente constituída por hélices-α e

experimentos de Espalhamento de raio X a Baixo Ângulo (SAXS), a

determinação da estrutura global da proteína SELA com um diâmetro máximo

de 185Å, sua massa molecular em aproximadamente 527kDa e um raio de giro

de 67,3Å.

xiv

ABSTRACT

The study of translation processes attracts the interest of a wide range of

research groups due to its main role in general cellular metabolism. In

particular, the investigation of new amino acid residues, such as selenocysteine

and pyrrolysin, which result in an expansion of the genetic code from the

traditional 20 residues to a total of 22 residues up to the current time. The

amino acid, selenocysteine represents the main biological form of the selenium

element and its synthesis and co-translational incorporation into selenoproteins

are due to an in-frame UGA stop codon using complex molecular machinery.

On Escherichia coli, the main proteins involved in this pathway are:

Selenocysteine Synthase (SELA), Selenocysteine Elongation Factor (SELB or

EFSec), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a tRNA

sec

uca

specific for this

pathway named Selenocysteine Insertion tRNA (SELC).

The SELA protein, the subject of this study, was firstly purified by

Forchhammer in 1991 and the sole structural analysis realized to this day was

developed by Engelhardt in 1992, using the Scanning Transmission Electron

Microscope (STEM) technique. With a monomer of approximately 50kDa, SELA

assumes an homodecamerical spatial configuration, each dimmer capable of

binding to a tRNA

sec

uca

with the serine amino acid which will be converted in

selenocysteine, in a reaction dependant of the enzymatic cofactor piridoxal

5’fosfato.

On this work it was possible to develop a new purification protocol for the

SELA protein, considerably reducing the steps and consequently the time

involved for obtaining purified protein. The process also yielded better protein

production when compared to literature, from 1mg/ml starting with 10 liters to

approximately 4.5mg/ml starting with 3 liters of bacterial medium.

As for the structural experiments, it was possible to predict by Dynamic

Light Scattering (DLS) the molecular mass as about 442kDa, Circular Dichroism

(CD) predicted the secondary structure as mainly composed by α-helices and

Small Angle X-ray Scattering (SAXS) showed the global structure of SELA with

a maximum diameter of 185Å, a molecular mass of about 527kDa and a radius

of gyration of 67.3 Å

I. INTRODUÇÃO

1.1. O Ácido Ribonucléico Transportador (tRNA)

Uma seqüência de ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) é incapaz de

traduzir sozinha sua seqüência de ribonucleotídeos para uma seqüência de

aminoácidos, constituintes das proteínas. Assim, moléculas importantes como

os ácidos ribonucléicos transportadores (tRNA) são necessários para esse

processo denominado de tradução (Alberts et al., 2002).

O primeiro tRNA foi descoberto em 1965 por Robert Holley, um tRNA de

76 ribonucleotídeos responsável pelo transporte do aminoácido alanina.

Atualmente sabe-se que os tRNAs são seqüências de ribonucleotídeos de

tamanho variável, entre 60 a 95 ribonucleotídeos, que esquematicamente

assumem a forma de uma folha de trevo, devido a seqüências complementares

ao longo de sua fita simples capazes de formar quatro ramos (Voet et al., 1999)

(Figura 1.1). É também sabido da existência de pelo menos um tRNA para

cada tipo de aminoácido e que os tRNA possuem alguns ribonucleotídeos

modificados pós-transcricionalmente que possibilitam seu reconhecimento

tanto pelas moléculas de ácido ribonucléico ribossômico (rRNA) quanto pelas

respectivas aminoacil-tRNA sintetases (aaRS) (Voet et al., 1999).

Os tRNAs também possuem características comuns uns com os outros

como por exemplo o grupamento fosfato 5’ terminal; o número de nucleotídeos

complementares que formam os quatro ramos da estrutura esquemática de

trevo; além da seqüência CCA com um grupamento OH na extremidade 3’

terminal (Voet et al., 1999) (Figura 1.1).

Cada uma das quatro alças da estrutura do tRNA recebe um nome

específico, assim sendo: região do braço D; região do braço Anticódon; região

variável; região do braço TψC além de uma haste que compartilha a seqüência

5’ e 3’ do tRNA, que recebe o nome de braço aceptor. No braço aceptor ocorre

a ligação do aminoácido ao grupamento OH na extremidade 3’ terminal,

enquanto que a região anticódon ocorre a interação entre tRNA e mRNA no

interior dos ribossomos (Voet et al., 1999; Alberts et al., 2002) (Figura 1.1).

1.2. Aminoacil-tRNA Sintetases

As aminoacil-tRNA sintetases (aaRSs) são uma família de enzimas que

asseguram a correta ligação entre um aminoácido e seu tRNA correspondente

gerando um conjunto de tRNAs aminoacilados essenciais para o processo de

síntese protéica.

As aaRSs realizam a reação de aminoacilação em duas etapas: primeiro

uma molécula de ATP reage com o aminoácido resultando na adenilação desse

aminoácido e liberação de difosfato. Na segunda etapa da reação, ocorre a

transferência do aminoácido ativado para o tRNA liberando assim o

aminoacil-tRNA e AMP (Nelson and Cox, 2000) (Figura 1.2). Devido as

similaridades de reação catalisadas pelas aaRSs e as similaridades estruturais

dos tRNAs era suposto que todas as aaRSs proviessem de um ancestral

comum e deveriam assim estar estruturalmente relacionadas, entretanto essas

enzimas possuem diferenças em seu tamanho e estrutura tridimensional,

sendo classificadas em dois grupos (Classe I e II - Tabela 1.1 e Figura 1.3)

(Voet et al., 1999; Kim et al.,2003).

Figura 1.1: Esquema ilustrando o

tRNA

Phe

e suas respectivas regiões.

Na extremidade 3’ terminal ligado a

hidroxila um resíduo de aminoácido

(Phe). Modificado de Molecular Biology

of The Cell 4

Ed – Alberts et al., 2002

p. 337.

Cada aaRS possui cavidades precisas para o ATP e o seu respectivo

aminoácido. As aaRS de classe I reconhecem a seqüência anticódon para

inserir o respectivo aminoácido, geralmente maior e hidrofóbico, enquanto que

as aaRS de classe II não interagem com a região anticódon. A configuração

estrutural do tRNA é mais importante do que a própria seqüência, sendo que os

principais pontos de interação ocorrem com a região anticódon e região

aceptora. É devido a isso que uma aaRS pode reconhecer mais de um tRNA

para um dado aminoácido (Alberts et al., 2002).

Figura 1.2: Aminoacilação do

tRNA por aaRSs. Nas aaRS de

classe I o aminoácido é

transferido inicialmente para a

hidroxila 2’ e posteriormente, por

uma reação de transesterificação

passa à hidroxila 3’. Nas aaRSs

de classe II a aminoacilação

ocorre diretamente na hidroxila 3’.

(Extraído de Lehninger Principles

of Biochemistry 3

Ed. – Nelson

and Cox, 2000 p. 1040)

SUBCLASSE CLASSE I CLASSE II SUBCLASSE

Ia IRS ARS IIa

LRS PRS

VRS HRS

CRS SRS

MRS TRS

RRS GRS

Ib QRS NRS IIb

ERS DRS

KRS-I KRS-II

Ic YRS FRS IIc

WRS

TABELA 1.1: Enzimas aminoacil-tRNA sintetase (XRS) agrupada em classe I e II conforme

ligação ao grupamento OH da ribose do aminoácido e em subclasses a, b e c segundo

características presentes nos aminoácidos. Modificado de Kim et al., 2003.

Figura 1.3: Aminoacil-tRNA sintetases. Ambas as enzimas de classe I (A) e II (B) estão

mostradas ligadas ao seu tRNA (em verde). O ATP ligado esta indicado em vermelho. A:

Gln-tRNA sintetase de E. coli, uma típica aaRS monomérica de classe I. B: Asp-tRNA

sintetase de levedura, uma típica aaRS dimérica de classe II. (Extraído de Lehninger

Principles of Biochemistry 3

Ed. – Nelson and Cox, 2000 p. 1043)

1.3. Mecanismo de Biossíntese e Incorporação do aminoácido

Selenocisteína nas Proteínas em Procariontes

O selenocisteína é o vigésimo primeiro aminoácido descrito na literatura

e presente em grande número de enzimas distribuídas nas três linhagens

descendentes (eubactérias, arqueobactérias e eucariotos) do ancestral

primordial comum (Forchhammer et al., 1991a ; Böck et al., 1991; Stadtman,

1991). Sua constituição é muito similar ao aminoácido cisteína, diferindo pela

substituição do elemento enxofre pelo selênio em sua cadeia lateral (Figura

1.4).

Em Escherichia coli a formação e incorporação do aminoácido

selenocisteína deve-se a uma complexa via de biossíntese cujas principais

proteínas envolvidas são: Selenocisteína Sintase (SELA), Fator de Elongação

de Selenocisteína (SELB ou EFSec), Selenofosfato Sintetase (SELD), serina-

tRNA

ser

Sintetase (SRS), além de um tRNA próprio denominado tRNA de

Inserção de Selenocisteína (SELC) (Leinfelder et. al., 1988b). Em revisões

mais recentes também foi verificada a necessidade de uma seqüência

específica que promove uma alça (stem-loop), denominada de Seqüência de

Inserção Sec (SECIS) (Low and Berry, 1996; Hatfield and Gladyshev, 2002) e

em alguns organismos, eucariotos, proteínas auxiliares denominadas Proteína

Ligante ao SECIS-2 (SBP2) (Copeland et. al., 2000; Hatfield and Gladyshev,

2002; Low et. al., 2000).

O tRNA

sec

uca

de Escherichia coli codificado pelo gene de Inserção de

Selenocisteína tRNA

sec

uca

(selC) possui 95 ribonucleotídeos (Leinfelder et al.,

Figura 1.4: Representação dos

aminoácidos Cisteína (A) e

Selenocisteína (B). Observar a

substituição do elemento Enxofre

pelo Selênio na cadeia lateral.

A B

1988a) e através da enzima serina-tRNA sintetase é capaz de ligar-se a um

aminoácido serina (Böck, et al., 1991). Em sua região anticódon é encontrada a

seqüência UCA complementar ao códon de terminação UGA (Figura 1.5).

Após a aminoacilação do tRNA

sec

uca

para seril-tRNA

sec

uca

, (Figura 1.6a –

etapa 1 a 2) a serina será convertida em selenocisteína pela ação da enzima

Selenocisteína Sintase (SELA), uma proteína decamérica, cujo monômero

possui aproximadamente 50 KDa (Böck et al., 1991; Low and Berry, 1996)

(Figura 1.6a – etapa 3). Cada monômero da proteína SELA está ligado

covalentemente com uma molécula de Piridoxal 5’-Fosfato, um cofator

enzimático responsável pela interação com o seril-tRNA

sec

uca

, formando dessa

maneira uma base de Schiff (ligação dupla entre um nitrogênio e um carbono)

entre o grupamento amino α do resíduo de serina e o grupamento azo-formil do

piridoxal, resultando na eliminação de uma molécula de água e síntese de uma

molécula intermediária denominada de aminoacrilil-tRNA

sec

uca

. A partir desse

composto intermediário o aminoácido insaturado pode tautomerisar para uma

forma instável imino que espontaneamente hidrolisa a piruvato e amônia.

Alternativamente a dupla ligação pode ser reduzida por um agente redutor

(borohidrato de potássio, KBH

) para a formação de alanil-tRNA

sec

uca

. O passo

seguinte consiste na transferência do selênio reduzido e ativado para a

Figura 1.5: Diagrama esquemático na

forma de trevo da estrutura do tRNA

sec

uca

de Escherichia coli. Essa estrutura

permite a observação das regiões

complementares (dupla fita), além da

seqüência anticódon UCA complementar

ao códon de terminação UGA, bem

como uma longa região variável.

(Extraído de Tormay et al., 1994)

molécula intermediária (aminoacrilil-tRNA

sec

uca

), resultando no vigésimo

primeiro aminoácido Selenocisteína (Forchhammer and Böck, 1991b) (Figura

1.6b).

O selênio é obtido a partir de selenito (um sal com o ânion divalente

SeO

-2

) ou de selenocisteínas pela proteína Selenotransferase ou

Selenocisteína Liase respectivamente que reduzem o selênio capaz de ser

utilizado pela proteína com função enzimática Selenofosfato Sintetase (SELD)

(Burk, 1991), aproximadamente 37 kDa (Leinfelder et al., 1990), numa reação

dependente de ATP, que fosforila o selênio a selenofosfato, dando

continuidade a biossíntese do aminoácido selenocisteína e evitando que a

célula sofra intoxicação por excesso de selênio (Ehrenreich, 1992; Lacourciere

and Stadtman, 2001) (Figura 1.6a – etapa B).

A incorporação do aminoácido selenocisteína juntamente as seqüências

polipeptídicas das selenoproteínas deve-se a ação de uma proteína, com

características similares ao fator de elongação EF-Tu, denominada de Fator de

Elongação SELB, de aproximadamente 68 kDa (Forchhamer, Leinfelder and

Böck, 1989). Entretanto para que haja tal incorporação é necessária a

existência de uma alça (stem-loop) derivada de seqüências complementares de

ribonucleotídeos, denominada SECIS seguida ao códon de terminação UGA na

seqüência do mRNA possibilitando uma ligação mais eficiente da proteína

SELB - selenocisteil-tRNA

sec

uca

a fita de mRNA e ao ribossomo (Lescure et al.,

2002) (Figura 1.6a – etapa 4).

Figura 1.6a: Etapas envolvidas na biossíntese e incorporação de selenocisteínas

conforme descrito no texto. A etapa 3 pode ser visualizada em detalhe na figura

1.3.3b na

página seguinte.

Figura 1.6b: Esquema detalhado da conversão do aminoácido serina em selenocisteína

pela enzima Selenocisteína Sintase (SEL

) parcialmente representada em azul. Também

indicado ligado à enzima SELA o cofator enzimático Piridoxal 5’- Fosfato: 1- Ligação do

seril-tRNA

sec

uca

ao cofator piridoxal 5’-fosfato. 2- liberação de uma molécula de água com a

formação de um composto intermediário (aminoacrilil-tRNA

sec

uca

). Nessa etapa o composto

intermediário pode tautomerisar liberando Piruvato (espontaneamente), ou devido a um

agente redutor (borohidratado de potássio) liberar alanil-tRNA

sec

uca

. 3- transferência do

selênio reduzido e ativado à molécula intermediária, resultando no selenocisteil-tRNA

sec

uca

4- liberação do aminoácido selenocisteína, disponibilizando a enzima SEL

e o cofator

Piridoxal 5’- Fosfato para reinício do ciclo. Modificado de Forchhammer and Böck, 1991b.

1.4. Selenocisteína Sintase (SELA)

A proteína Selenocisteína Sintase (SELA) de Escherichia coli é uma

proteína com função enzimática de 464 resíduos de aminoácidos e massa

molecular aproximada de 50,667 kDa como mostrado na figura 1.7. Entretanto

a proteína SELA na forma nativa apresentou migração em gel filtração um

tamanho aproximado de 600 kDa (Forchhammer et al., 1991a).

A estrutura tridimensional da Selenocisteína Sintase pôde ser melhor

estudada por Engelhardt et al., 1992, através de experimentos utilizando

microscopia eletrônica de transmissão capazes de demonstrar que a SELA é

composta de um anel simetricamente quintuplicado, (cinco bi-lóbulos distintos).

Juntando-se as informações obtidas por Forchhammer et al., 1991a e

Engelhardt et al., 1992, foi possível sugerir que a SELA não era uma proteína

possuidora de cinco monômeros bi-lobulados, mas de dez monômeros. Os

estudos de Engelhardt et al., 1992, também conseguiram determinar um

diâmetro de 19 nm com um buraco central de 4 nm. As dimensões de cada

subunidade de aproximadamente 8,5 nm e sua espessura de 5-6 nm

(Figura 1.8).

Figura 1.7: Seqüência de nucleotídeos e respectivos aminoácidos da proteína SELA.

Modificado de Forchhammer et al., 1991a.

Estudos utilizando microscopia eletrônica de transmissão (do inglês

Scanning Transmission electron microscope – STEM) (Figura 1.8) possibilitou o

cálculo da massa estimada da SELA em aproximadamente 493

20 kDa, com

95% de confiabilidade. Sabendo que cada monômero possui uma massa

aproximada de 50,667 kDa e que cada monômero está ligado covalentemente

a uma molécula de piridoxal 5’-fosfato (FW 265,2 ), obtem-se uma massa de

509,322 kDa . Podendo concluir que a SELA de Escherichia coli é uma

proteína homodecamérica constituída por cinco subunidades diméricas como

sugerido pela Figura 1.8.

A enzima Selenocisteína Sintase forma complexos altamente estáveis

com moléculas seril-tRNA

sec

uca

quando comparada com o seril-tRNA

ser

(Forchhammer et al., 1991a ; Böck et al., 1991) e estudos de Engelhardt et al.,

1992 demonstraram que apenas uma molécula de seril-tRNA

sec

uca

liga-se por

subunidade dimérica de maneira independente (não cooperativa) e randômica.

1.5. Selênio

O Selênio é um mineral não metálico encontrado no solo e plantas como

arroz, trigo, castanha do Pará, também pode ser encontrado em mariscos e

carnes (Nacional Câncer Institute).

Como um micronutriente essencial na dieta de muitas formas de vida,

incluindo humanos e outros mamíferos, benefícios significativos com relação à

Figura 1.8: Imagens da proteína SELA

obtidas pela técnica de microscopia

eletrônica de transmissão utilizando

como marcador acetato de urânio.

A- ilustrando a simetria encontrada na

enzima SELA. B- vista lateral

mostrando uma subunidade dimérica.

C e D representam vista frontal e

lateral respectivamente da enzima

SELA ligada ao composto

intermediário aminoacrilil-tRNA

sec

uca

(Reproduzido de Engelhardt et al.,

1992)

saúde são atribuídos a esse elemento, assim como: agente quimiopreventivo

contra câncer devido a sua ação antioxidante capaz de controlar os danos

celulares que podem conduzir ao câncer (Nacional Câncer Institute); fortes

evidência como redutor da expressão viral; na prevenção contra doenças

cardíacas e outras desordens cardiovasculares e musculares; retardamento no

progresso de imunodeficiência de pacientes humanos portadores de Síndrome

da Imunodeficiência Adquirida, AIDS; evidências de participação no

desenvolvimento de mamíferos; na reprodução masculina; no processo de

envelhecimento (Hatfield and Gladyshev, 2002) dentre outros.

A essencialidade de selênio em sistemas biológicos é reconhecida

desde 1950, em que a deficiência de tal elemento implica em inúmeras

patologias acima citadas (Burk, 1991).

A maneira como o selênio se distribui nas células é incorporando-se ao

aminoácido selenocisteína como descrito pela via de incorporação de selênio

no item 1.3, e posteriormente incorporado em selenoproteínas, que serão

discutidas no item 1.6. Além das selenoproteínas o selênio pode ser inserido

em proteínas de maneira não específica, pela substituição do enxofre do

aminoácido metionina resultando em selenometioninas encontrado em cereais

e gramíneas. Ou ainda em proteínas ligantes ao selênio (Selenium-Binding

Proteins), em que tais proteínas ligam-se fortemente ao selênio (Hatfield and

Gladyshev, 2002; Lyn Patrick, 2004). De outra maneira o selênio em grandes

quantidades e na sua forma livre é altamente tóxico (Burk, 1991).

1.6. Selenoproteínas

A forma ativa do selênio encontra-se incorporado em proteínas

denominadas Selenoproteínas, através do aminoácido selenocisteína como

descrito no item 1.3. Devido a isso, as selenoproteínas têm despertado

interesse e atualmente é sabido da existência de inúmeras selenoproteínas em

bactérias, arqueobactérias e eucariontes (Low and Berry, 1996). Dentre essas

selenoproteínas foram descritas pelo menos seis em bactérias, três em

arqueobactérias e um número crescente em eucariotos (Böck et. al., 1991; Low

and Berry, 1996). Revisões mais atualizadas indicaram sendo de 20 (Hatfield

and Gladyshev, 2002) a 25 (Kryukov et. al., 2003) proteínas contendo

selenocisteína em mamíferos.

O número de selenoproteínas conhecidas tem aumentado muito nos

últimos anos e com exceção da proteína Selenofosfato Sintetase não há

sobreposição entre os selenoproteomas (todas as selenoproteínas de um

organismo) de procariotos e eucariotos. Selenoproteínas de bactérias e

arqueobactérias estão envolvidos primeiramente em processos catabólicos

utilizando o selênio como catalisador em várias reações de redução (Hatfield

and Gladyshev, 2002). Enquanto que selenoproteínas de eucariotos participam

de processos antioxidantes e anabólicos. O que sugere uma origem

independente para os selenoproteomas de procariotos e eucariotos (Hatfield

and Gladyshev, 2002).

Apesar das selenoproteínas não terem seqüências homólogas,

estruturas similares ou funções relacionadas, à localização de selenocisteínas

(Sec) nessas proteínas parece estar limitada a apenas algumas posições,

sendo restrita a apenas um aminoácido selenocisteína em eubactérias e um ou

dois selenocisteínas em arqueobactérias e eucariotos (Hatfield and Gladyshev,

2002), com exceção da selenoproteína P encontrada em eucariotos e que pode

ter de 11 a 17 selenocisteínas ao longo de sua seqüência (Rother et. al., 2001).

A localização desse aminoácido Sec também é importante, pois situa-se no

sítio ativo das proteínas, sendo que sua substituição por outro aminoácido

como serina ou cisteína resulta na perda ou redução drástica da atividade

enzimática (Zinoni et. al.,1987; Axley et. al., 1991).

As selenoproteínas mais estudadas em procariotos são referentes ao

complexo formiato-hidrogênio liase, encontrado em Escherichia coli, e

responsável pela decomposição do ácido fórmico a hidrogênio e dióxido de

carbono, sendo uma importante via fermentadora em condições anaeróbicas

(Axley et. al., 1990). Esse complexo é formado por duas proteínas: Formiato

desidrogenase H (FDH

) envolvido na formação do gás e a Formiato

desidrogenase N (FDH

) envolvido na transferência de elétrons do formiato

para a Nitrato redutase (Leinfelder et. al., 1988).

Nas arqueobactérias, como Methanococcus vannielii, também é

encontrado a selenoproteína Formato Desidrogenase, capaz de decompor o

ácido fórmico a dióxido de carbono e metano, através da fermentação

anaeróbica. Entretanto nesses organismos uma forma alternativa de Formato

Desidrogenase, sem selenocisteínas incorporadas ao longo da cadeia

polipeptídica, também foi verificada, possibilitando a sobrevivência em meios

contendo ou não selênio (Jones and Stadtman, 1981).

Em eucariotos a presença de selenoproteínas é essencial para o

desenvolvimento, como demonstrado que a falta do gene selC resulta na morte

embrionária (Hatfield and Gladyshev, 2002). A seguir serão citadas três das

principais selenoproteínas encontradas em humanos.

A primeira selenoproteína identificada foi a Glutationa Peroxidase (GPx),

que catalisa a oxidação de glutationas reduzidas e permite a redução do

peróxido de hidrogênio à água, prevenindo a peroxidação lipídica e danos

celulares (Lyn Patrick, 2004). São encontradas pelo menos cinco formas de

Glutationa Peroxidase, localizadas em tecidos específicos em humanos como:

GPx clássico, encontrado apenas no citosol celular; GPx gastrintestinal,

encontrado no fígado e no trato gastrintestinal, GPx plasma, encontrado no

plasma e na tireóide; Hidroperóxido Fosfolipídico Glutationa Peroxidase

(PHGPx), encontrada em membranas celulares e as GPx de núcleos

espermáticos, localizadas no núcleo de espermatozóides (Lyn Patrick, 2004).

Selenoproteína P, encontrada em sua grande maioria na circulação

sanguínea atuando também como uma enzima antioxidante e transportadora

de selênio visto da grande quantidade de selenocisteínas incorporados em sua

seqüência polipeptídica (Rother et. al., 2001; Lyn Patrick, 2004).

Tireodoxina Redutase (TR), uma proteína com função enzimática capaz

de degradar peróxidos e hidroperóxidos no exterior de membranas celulares e

responsáveis por danos no DNA, morte celular e atrofia dos tecidos, também

são atuantes na regulagem de vitaminas com C e K3 (Lyn Patrick, 2004). As

TR são expressas em todos os tecidos eucarióticos, sendo sua inibição letal

(Hatfield and Gladyshev, 2002).

A função da maioria das selenoproteínas ainda não é conhecida, sendo

sua caracterização uma das direções a serem seguidas pelos pesquisadores

de selenoproteínas (Hatfield and Gladyshev, 2002).

1.7. Determinação Estrutural de Proteínas

A importância de se determinar estruturalmente um composto é vasta,

seja esse composto destinado ao desenvolvimento de novos materiais, seja ele

uma biomolécula de interesse farmacológico. É sabido que as distâncias entre

os átomos dessas moléculas bem como sua configuração eletrônica tem

grande influência nas relações exercidas por ela dentro de seus sistemas de

atuação.

No caso de biomoléculas de interesses farmacológicos poder determinar

a localização de grupos específicos, bem como modificar ou substituir tais

grupos, tem grande importância na elucidação de interações entre eles e o

sistema biológico que tais compostos fazem parte.

Na determinação estrutural de compostos podem ser utilizados métodos

químicos e físicos como os métodos espectrométricos (massa, infravermelho,

ultravioleta, ressonância) que pode gerar inúmeras informações que

combinadas auxiliam muito os estudos da molécula em questão. Entretanto tais

metodologias em alguns casos podem gerar mais de um modelo estrutural

criando inúmeras dificuldades para os passos subseqüentes.

Dentre os métodos espectrométricos o Espalhamento Dinâmico de Luz e

o Dicroísmo Circular são amplamente utilizados gerando informações

importantes para métodos posteriores e mais precisos como o de

Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo e a Difração de Raios X em cristais

de proteínas.

1.7.1. Espalhamento Dinâmico de Luz

O Espalhamento Dinâmico de Luz, do inglês Dynamic Light Sacattering

(DLS), é uma técnica capaz de analisar biomoléculas de interesse em solução,

podendo abranger uma ampla variação na concentração dessas moléculas.

Como é sabido, macromoléculas quando em solução apresentam-se em

movimento Browniano e quando uma fonte de radiação é direcionada a essas

moléculas ocorrem pequenas diferenças na freqüência da radiação detectada

em relação a onda emitida, diferença essa resultantes do efeito Doppler.

Assim, as partículas em movimento Browniano são responsáveis pelas

variações da intensidade de luz espalhada (Berne and Pecora, 1976).

A intensidade do espalhamento depende da posição da partícula e do

detector (Figura 1.9). Uma mudança na posição da partícula é acompanhada

pela mudança na medida da intensidade de luz espalhada. O conhecimento

destas intensidades distintas permite obter informações a respeito do

movimento das partículas, ou seja, do coeficiente de difusão e dimensões das

macromoléculas, através de uma função de correlação. A função de correlação

das intensidades medidas (uma medida indireta do coeficiente de difusão das

partículas), é obtida a partir de uma curva de correlação da intensidade que

exibe um decaimento exponencial (Berne and Pecora, 1976).

Dessa forma nos experimentos de DLS, o raio da partícula é deduzido a

partir do coeficiente da difusão e pela equação de Stokes-Einstein que

descreve o “atrito” para uma esfera compacta no meio viscoso. Entretanto, na

prática nem sempre macromoléculas são esféricas e o raio calculado a partir

do coeficiente de difusão oferece uma estimativa do tamanho aparente da

partícula hidratada, isto é, com sua camada de solvatação, denominado assim,

raio hidrodinâmico (partícula e sua camada de solvatação) (Berne and Pecora,

1976).

1.7.2. Dicroísmo Circular

A técnica de Dicroísmo Circular, do inglês Circular Dichroism, (CD) é

capaz de detectar as diferenças de interações moleculares, a baixas

concentrações, utilizando uma luz polarizada. Isso ocorre porque toda molécula

que apresenta quiralidade é opticamente ativa, promovendo interações

distintas na luz polarizada que a incide (Fasman, 1996).

Quando a luz é polarizada linearmente, o campo elétrico apresenta

direção constante e sua amplitude varia, enquanto que na polarização circular

o módulo do vetor campo elétrico é constante e a direção é variada (Fasman,

1996).

Desta maneira um feixe de luz polarizado consiste de dois feixes de luz

plano-ortogonal de 90

que estão fora de fase por π/2, em que a variação do

vetor elétrico na direção da propagação executa uma volta completa em um

comprimento de onda ou no período de onda de luz. A luz pode ser

circularmente polarizada para direita (rcp) ou para esquerda (lcp) (Fasman,

1996) (Figura 1.10).

Figura 1.9: Diagrama representativo

do equipamento de Espalhamento

Dinâmico de Luz (DLS). Modificado de

Dynamic Light Scattering with

Applications to Chemistry - Berne and

Pecora, 2000 p. 6.

Os sinais analisados em CD referem-se às diferenças entre as

absorções da luz circularmente polarizadas a esquerda e as circularmente

polarizadas a direita. Essas diferenças de absorções da luz são extremamente

úteis nas análises de biomoléculas, pois geram informações importantes a

Figura 1.10: Luz circularmente polarizada à direita : A- Os vetores elétricos ortogonalmente polarizados

emitidos a 90

estão fora de fase (π/2). B- Os componentes x e y estão representados no ponto ao longo

do eixo z enumerado de 1 a 4 em A, junto com seus resultados. C- A soma do vetor em (b) foi projetada

sobre um plano normal na direção z, demonstrando que a extremidade do vetor do campo elétrico segue

uma via circular quando examinada ao longo da direção de propagação, observada junto a fonte de luz.

D- Representa a luz polarizada circularmente a direita, mostrando o vetor do campo elétrico em função da

posição junto a direção de propagação. Notar que o topo ou a extremidade do vetor do campo elétrico

representa uma hélice transmitido à direita. Com referência A - C, notar que um

observador em um

ponto fixo no eixo z, olhando através da fonte de luz, verá o ponto 1 primeiro seguido do 4. Para este

observador, o vetor do campo elétrico parecerá girar no sentido horário na direção da propagação em

função do tempo. Na luz circularmente polarizada a esquerda, a extremidade do vetor do campo elétrico

representa uma hélice transmitida a esquerda, e um observador no eixo z olhando através da fonte de luz

verá no vetor do campo elétrico a rotação no sentido anti-horário (Circular Dichroism and the

conformacional analysis of biomolecules, Fasman,1996 p. 27).

respeito de suas estruturas secundárias, através de um espectro de CD

(Fasman, 1996).

Como é sabido a estrutura secundária de uma proteína tem unidade

peptídica planar e rígida, mas apresenta liberdade rotacional entre suas

unidades, decorrente dos ângulos existentes entre NH e C’=O (ângulos phi θ e

psi ψ). Dessa maneira as estruturas secundárias, juntamente com o núcleo

protéico, formado por aminoácidos preferencialmente hidrofóbicos, promovem

uma arquitetura rígida e estável, com uma certa flexibilidade sendo

consideradas as partes melhores definidas da estrutura protéica (Branden e

Tooze, 1999).

O espectro de CD de uma proteína, em sua forma nativa, para cada

comprimento de onda é a soma da contribuição de cada uma das componentes

da estrutura em análise. Esse espectro pode ser dividido em região UV próxima

250-300 nm, capaz de monitorar as contribuições dos aminoácidos aromáticos

e das pontes dissulfetos e na região UV distante, 190-250 nm, monitora as

transições das cadeias peptídicas da proteína (Fasman, 1996).

No espectro de UV distante é possível monitorar e estimar a composição

e mudanças conformacionais das estruturas secundárias (hélices α, folhas β,

voltas β e seqüências aleatórias) (Fasman, 1996) (Figura 1.11).

Hélices α: descrita pela primeira vez por Linus Pauling em 1951 como

uma estrutura estável e energeticamente favorável nas proteínas, ocorrendo

quanto uma extensão de aminoácidos consecutivos possuem pares de ângulos

θ e ψ aproximadamente -60º e -50º. Possuem 3,6 resíduos de aminoácidos

por volta com ligações de hidrogênio C’=O e NH geralmente no resíduo n e

n+4 respectivamente. Entretanto, mais raramente a espiral pode ser mais

compacta resultado na variação das ligações de hidrogênio n+5 (hélice π) ou

n+3 (hélice 3

). As hélices α são polares e praticamente se localizam na

superfície da proteína, podendo nas proteínas globulares ter um comprimento

variável desde 4-5 resíduos a mais de 14 aminoácidos, com um giro de mão

direita em que todas as ligações de hidrogênio possuem a mesma direção

devido as unidades peptídicas estarem alinhadas na mesma orientação ao

longo do eixo da hélice e resultando na extremidade C-terminal, uma carga

negativa e na extremidade N-terminal com uma carga positiva (resultante do

momento dipolar encontrado na unidade peptídica) (Branden and Tooze, 1999).

Folhas β: constituída a partir da combinação de várias regiões da cadeia

polipeptídica (fitas β) e diferentemente das hélices α não são formadas por uma

região contínua e enrolada, mas distendida e plana. As fitas β usualmente são

formadas de 5 a 10 resíduas longos, alinhados adjacentes umas das outras

pelas ligações de hidrogênio. Folhas β formadas por várias fitas β apresentam-

se dobradas sucessivamente acima e abaixo do plano da folha (dobra no c

) e

podendo interagir dos seguinte modos com as fitas β:

todas as fitas sendo paralelas;

fitas antiparalelas alternadamente,

com fitas mistas, isto é, fitas paralelas e antiparalelas numa mesma folha

(Branden and Tooze, 1999).

Voltas: muitas proteínas são constituídas a partir de combinações e

estruturas secundárias (hélices α e folhas β) que são conectadas por regiões

denominadas voltas (loops), regiões estas de comprimento variável e forma

irregular. A cadeia principal dessas voltas geralmente não formam ligações de

hidrogênio entre elas, e assim ficam expostas ao solvente. Dessa forma os

resíduos encontrados nessas regiões expostas, geralmente carregados ou

polares, podem ser usados em vários esquemas de predições, com alta

confiabilidade quando comparada as estruturas α e β. Com sua ação conectora

entre as estruturas secundárias as voltas freqüentemente participam na

formação de sítios de ligação e nos sítios ativos da enzima (Branden and

Tooze, 1999).

1.7.3. Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo

Assim, como descrito nas abordagens de DLS e CD a metodologia de

Espalhamento de raios X a Baixo Ângulo (SAXS) utiliza materiais em soluções

permitindo uma análise detalhada da estrutura global da molécula.

A técnica de SAXS fornece informações estruturais, assim como

predições de estruturas quaternárias em oligômeros e verificações de possíveis

diferenças entre as estruturas no estado cristalino e em soluções (Svergun et.

al., 1994).

Essa técnica utiliza-se das heterogeneidades das densidades

eletrônicas, resultantes da incidência de raios X com comprimento de onda

variando na faixa de 1 a 10Å, dependendo do problema a ser estudado. As

Figura 1.11: Espectros do dicroísmo

circular para α-hélice (vermelho), folha

β (verde) e uma região de seqüência

aleatória (não periódica) (preto) para

uma cadeia polipeptídica. (Circular

Dichroism and the conformacional

analysis of biomolecules, Fasman,1996).

dimensões características obtidas em SAXS variam da ordem de 10 a 1000 Å,

em que numerosos tipos de materiais podem ser analisados nessa escala,

como: ligas metálicas, copolímeros, colóides, micelas, micro-emulsões,

materiais nanoporosos e soluções de macromoléculas biológicas como

proteínas, ribossomos, ácidos nucléicos, vírus dentre muitas outras. A

eficiência do espalhamento aumenta linearmente com o número atômico para

raios X sendo que os valores de resolução obtidos situam-se freqüentemente

entre 20 - 30 Å sendo capaz para se determinar a forma aproximada, bem

como o volume ocupado por subdomínios e grupos atômicos da proteína (Dias,

2004).

Macromoléculas biológicas são essencialmente compostas por átomos

leves (H, C, N, O e P) e uma vez estando solubilizadas em água ocorre pouca

diferença na densidade eletrônica, entre a molécula e o solvente, produzindo

um espalhamento muito fraco. Entretanto esse espalhamento pode ser

melhorado com o uso de feixes de raios X produzidos por fontes síncrotron,

que possuem fluxos de fótons muito maiores do que aparelhos de raios X

convencionais (Dias, 2004).

Quando a energia dos fótons incidentes é bem diferente da energia de

ligação dos elétrons, esses elétrons comportam-se como se fossem livres e

essas partículas livres, carregadas e oscilantes produzem ondas espalhadas,

coerentes com a onda incidente, em todas as direções. Todas as ondas

secundárias possuem a mesma freqüência, mas podem ter diferentes fases

devido à diferença de caminho (Oliveira, 2001).

Devido à alta freqüência das ondas é somente possível detectar as

intensidades espalhadas dependentes com o ângulo de espalhamento, que

deve ser menor de 5º (2θ < 5º) (Figura 1.12). Essa dependência angular entre

a amplitude de espalhamento e densidade eletrônica do centro espalhador é

correlacionada pela transformada de Fourier. Sendo que a principal diferença

entre uma estrutura obtida por difração de cristais e na técnica de SAXS ocorre

devido à estrutura cristalina apresentar um arranjo periódico nas três

dimensões com um grande número de repetições, enquanto que em um meio

de espalhamento em solução as partículas não estão ordenadas

periodicamente, isto é, as partículas estão imersas com orientação arbitrárias e

distâncias irregulares entre si (em movimento browniano), o que pode ser

compensado pelo grande número de partículas (Oliveira, 2001). Essa diferença

na organização molecular reflete em modificações nas análises da

transformada de Fourier que para sistemas periódicos corresponde a Série de

Fourier, isto é, uma expansão da estrutura periódica a uma sistema periódico

de funções. Enquanto que para sistemas não periódicos de espalhamento em

solução, corresponde a Integral de Fourier, isto é, uma expansão de estruturas

não periódicas a um sistema de funções periódicas (Oliveira, 2001).

Devido a esses ajustes existe uma perda de informação em

experimentos a baixo ângulo, devido à média realizada sobre todas as

orientações no espaço. O que não limita o estudo de sistemas monodispersos

e polidispersos, sendo possível à determinação do tamanho, forma e em

algumas circunstâncias, a estrutura interna (sistemas monodispersos).

Enquanto que para sistemas polidispersos é obtida uma função de distribuição

de tamanhos desde que uma forma da partícula seja assumida.

Figura 1.12: Diferença de fase entre raios

incidentes e espalhados através dos

pontos P e O. Em que s

vetor incidente, s

vetor espalhado e 2θ o ângulo de

espalhamento entre os vetores s

e s.

(modificado de Small angle X-ray

scattering, Glatter and Kratky, 1982 p19.)

Dessa forma através da função de distribuição de pares de distâncias

(FDPD), diretamente relacionada com a intensidade de espalhamento

mensurável é possível resolver o problema inverso de espalhamento como

visualizada na figura 1.13. Dessa maneira a partir de uma partícula com

estrutura tridimensional pode-se calcular sua correspondente FDPD e a

intensidade espalhada. O problema inverso de espalhamento é a tentativa para

obter o tamanho, forma e estrutura interna da partícula alvo a partir da

intensidade de espalhamento medida. Apesar desse problema não possuir

solução única, a FDPD é de muita ajuda combinada aos métodos numéricos de

recuperação tridimensional de estruturas a partir de curvas de espalhamento.

Inicialmente a partícula é subdividida em um número infinitamente

grande de elementos idênticos de volume, o que se deve a proporcionalidade

Figura 1.13: Problema inverso do espalhamento. (Newtron, X-ray and light scattering,

Lindner and Zemb, 1991)

da função p(r) ao número de linhas com comprimentos r e r + dr que são

encontradas na combinação de qualquer elemento com volume i e qualquer

outro elemento de volume k da partícula (Figura 1.14). No caso em que as

partículas não são homogêneas, deve ser considerada a diferença obtida na

intensidade eletrônica.

Quando os espalhamentos partem de sistemas monodispersos alguns

parâmetros são obtidos diretamente da curva de intensidade espalhada sem a

necessidade de tratamentos exaustivos dos dados obtidos, assim como:

Massa Molecular – é possível seu cálculo pela relação da intensidade a

ângulo zero (I

) dividida pelo produto da concentração da solução (C) e massa

da molécula em questão (m) é igual a uma constante (k). Se usarmos a mesma

relação para uma molécula conhecida e igualarmos as constantes teremos de

maneira indireta a massa aproximada da molécula alvo.

Raio de Giro – capaz de medir o grau de uma dada partícula se

comportar como uma esfera compacta em um meio aquoso. Dessa maneira

através da Lei de Guinier é possível determinar o raio de giro em que as

origens dos vetores é tomado no centro de massa da partícula.

Volume Hidrodinâmico – é necessário o cálculo do volume hidratado

devido às macromoléculas em solução apresentarem uma fina camada de

Figura 1.14: Curva de correlação

entre a função p(r) altura e o número

de linhas com comprimentos r e r+dr.

(Newtron, X-ray and light scattering,

Lindner and Zemb, 1991)

água em sua superfície (camada de solvatação). Dessa maneira o volume

hidratado é calculado pela divisão da intensidade espalhada pela diferença de

densidades eletrônica.

Utilizando-se da função de distribuição de distâncias (PDDF), isto é, p(r)

e a função de intensidade I(h), somada as informações de massa molecular,

raio de giro e volume hidrodinâmico é possível realizar uma varredura completa

a respeito da forma e estrutura das partículas espalhadoras, isto é, das

macromoléculas de interesse.

Partindo-se de um padrão esférico bem conhecido, as diferenças obtidas

na curva pela função p(r) são capazes de predizerem a forma estrutural da

macromolécula como observado na figura 1.15.

Quanto mais é alterado da forma esférica para estruturas alongadas uni

ou bidimensionalmente, mais o máximo da função se desloca para valores

menores de r (r = R = D/2) ao mesmo tempo em que temos um aumento de D

(a máxima dimensão da partícula).

Essas análises também são utilizadas nas predições de estruturas

poliméricas, entretanto nesses casos a especificação quanto a sua forma em

dímero, trímero e assim por diante, isto é, a imposição de restrições quanto a

simetria dessas partículas será de extrema importância na determinação

tridimensional dessa macromolécula.

Figura 1.15: Comparações entre

funções de p(r) de uma esfera ( ),

um elipsóide prolato ( ) e um

elipsóide oblato ( ) de mesmo raio

de giro. (Small angle X-ray scattering,

Glatter and Kratky, 1982 p. 179)

1.7.4. Difração de Raios X em Cristais de Proteínas

Quando estudamos biomoléculas de interesse a técnica que atualmente

fornece maior informação e precisão é a difração de raios – X, uma técnica

física que fornece de maneira precisa, utilizando–se amostras de tamanho

mínimo cristalizadas, um grande número de informações estruturais (Malta,

2003).

Entretanto a cristalização de proteínas é um processo que envolve

múltiplos parâmetros divididos em três passos clássicos: nucleação,

crescimento e estabilização do crescimento. Nesse caminho até a cristalização

é preciso atenção quanto à cinética das reações nas soluções protéicas

devendo-se evitar que durante o processo de diminuição da solubilidade dessa

não precipite ao invés de cristalizar. Dessa forma devem-se preferir processos

em que as diminuições da solubilidade ocorram de forma lenta (Dias, 2004).

A estabilidade das macromoléculas biológicas em solução está baseada

nas competições entre as interações solvente-soluto e as interações

intramoleculares e que podem ser modificadas através dos seguintes

parâmetros: Temperatura, capaz de alterar a desordem das moléculas de

solvente; pH, pode alterar as concentrações de H

e OH

, isto é, alterar a

protonação e desprotonação dos grupos de macromoléculas; Sais, podem

atuar na força iônica das moléculas; Competidores de ligações de hidrogênio,

em altas concentrações competem com as ligações de hidrogênio da água e

ligações de hidrogênio das macromoléculas; Aditivos hidrofóbicos, capazes de

interagir diretamente com regiões hidrofóbicas das macromoléculas ou alterar

as características do solvente; Solventes orgânicos, modificam a constante

dielétrica (Dias, 2004).

Muitas são as técnicas utilizadas na cristalização de macromoléculas,

sendo o mais freqüente, a Técnica de Difusão a Vapor, em que a solução

protéica por ficar pendurada, “hanging drop” ou num poço “sitting drop”. Nessa

técnica uma pequena gota, 2-10 µL de proteína é misturada com um volume

similar de solução de cristalização e colocada de forma vedada do meio

externo num recipiente contendo 500-1000 µL de solução de cristalização. A

solução de cristalização é formada por um tampão, sal e um agente

precipitante. A diferença entre a concentração de soluto entre a gota e o

reservatório de solução cristalizante direciona esse sistema, devido a diferença

de potencial químico, há um equilíbrio de concentrações entre a gota e a

solução do reservatório, através da difusão da fase de vapor da solução menos

concentrada, a gota, para a mais concentrada, o reservatório. Esse equilíbrio

varia de 2-10 dias, no caso de soluções contendo sal até a 25 dias quando

usado soluções contendo PEG (Polietilenoglicol) (Dias, 2004).

1.8. Desenvolvimento de Fármacos Capazes de Bloquear a Biossíntese de

Selenocisteína

O aminoácido selenocisteína está presente em grande número de

enzimas provenientes de eubactérias, arqueobactérias e eucariontes

(Forchhammer et al., 1991a), sendo incorporado nas proteínas segundo

algumas características próprias como explicado no item 1.3.

O desenvolvimento de fármacos inibidoras das aminoacil-tRNA

sintetases, ou ainda de substratos capazes de se ligarem competitivamente ou

de maneira irreversível a biomoléculas envolvidas na via biossintética da

selenocisteína poderiam bloqueá-la .

Trabalhos como de KIM (2003) e TAO and SCHIMMEL (2000)

abordaram vários pontos na tentativa de bloquear reações catalisadas pelos

aaRSs como: interromper a ligação de substrato-aaRSs, através de substratos

análogos de aminoácidos e ATP, pois o reconhecimento específico dos tRNA

pelos aaRSs, possibilita o desenvolvimento de inibidores específico; bloquear o

segundo estágio da reação aminoácido-tRNA, pela geração de uma enzima

que mimetize a reação intermediária da adenilação do aminoácido; o

desenvolvimento de antibióticos contra aaRSs, pois ao longo da evolução os

aaRSs acumularam ampla variedade estrutural.

O desenvolvimento de fármacos capazes de bloquear a síntese de

aminoácidos é bastante promissor não apenas devido às diferenças

encontradas nas aaRSs dos diferentes organismos vivos, mas devido à

abundância de informações das seqüências e estruturas que podem servir de

substrato para estudos nessa área.

Assim, o estudo da proteína SELA, uma proteína com função enzimática

importante na biossíntese do selenocisteína em bactérias E. coli pode auxiliar

na compreensão da estrutura e atuação dessa enzima.

II. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um novo

protocolo de purificação da proteína Selenocisteína Sintase (SELA) de

Escherichia coli bem como sua caracterização molecular e bioquímica da,

através de estudos estruturais utilizando-se as técnicas de espalhamento

dinâmico de luz, dicroísmo circular e por meio de espalhamento de raios-X a

baixo angulo. Além des ensaios referentes à enzima SELA, interações in vitro

com o tRNA

sec

uca

, responsável pelo transporte do Selenocisteína até a tradução

em selenoproteínas serem pretendidos, na tentativa de identificar as interações

SELA-tRNA

sec

uca

. Abordagem que poderá vir a contribuir no esclarecimento do

mecanismo enzimático da SELA na síntese de selenocisteínas. Em conjunto

com outras abordagens experimentais e integrado a outros projetos de

pesquisa dentro de uma linha seguida pelo nosso grupo, a dissertação

apresentada vem a contribuir no entendimento dos mecanismos estruturais e

moleculares da síntese de selenocisteínas. A descrição dos diversos objetivos

inicialmente proposto neste projeto encontra-se enunciados a seguir:

1. Clonagem do gene selA de Escherichia coli;

2. Estabelecimento de um protocolo de expressão e purificação da proteína

SELA;

3. Produção de anticorpos policlonais, a partir da proteína pura, para testes

utilizando outras espécies para verificação de reação cruzada e possível

identificação de homólogos;

4. Caracterização estrutural:

a. Por espalhamento de luz dinâmica (DLS)

b. Por análise de dicroísmo circular (CD)

c. Por espalhamento de luz a baixos ângulos (SAXS)

5. Clonagem do gene selC de Escherichia coli;

6. Transcrição in vitro e purificação do tRNA

sec

uca

para posterior ensaios de

interação com a proteína SELA.

III. JUSTIFICATIVA E PERSPECTIVAS

A via de síntese de selenocisteínas e sua incorporação co-traducional

em fase com comuns UGA de terminação representa uma via complexa e

intrigante presente em todos os organismos estudados. O entendimento dos

mecanismos enzimáticos envolvidos nessa via, através do estudo das enzimas

participantes, representa uma área de grande interesse. A enzima SELA

participa de forma central nessa via, sendo que seu gene (selA) foi apenas

identificado em bactérias, não tendo sido identificado em outros organismos por

buscas de similaridade seqüencial. Este intrigante fato desperta maior interesse

sobre esta enzima, pois pode representar uma divergência na evolução da via

de síntese de selenoproteínas com importantes conseqüências.

O presente trabalho faz parte de uma linha de pesquisa estabelecida em

nosso grupo com o objetivo de estudar a via de síntese de selenocisteínas

através de seus componentes enzimáticos.

Nenhum estudo estrutural, com exceção de ENGELHADT (1992) foi

realizado sobre a SELA até o presente momento. Apesar da técnica utilizada

STEM ter possibilitado a determinação aproximada da massa, dimensões e

forma da proteína SELA, esta apresentou um baixo grau de resolução não

permitindo o detalhamento tanto da estrutura da proteína SELA com da

interação dela com o respectivo tRNA

sec

uca

Apesar do interesse na cristalização e elucidação da estrutura 3D da

SELA, este representa um desenvolvimento futuro do trabalho. Uma

contribuição importante deste trabalho foi o estudo estrutural da SELA por

técnicas de espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS), o

espalhamento dinâmico de luz (DLS) e dicroísmo circular (CD). Técnicas que

podem ser realizadas sem a necessidade da obtenção de cristais de proteína.

O espalhamento de raios-X a baixos ângulos, mais freqüentemente

denominado de SAXS (Small Angle X-ray Scattering) é uma técnica

experimental que permite o estudo de características estruturais de “partículas”

ou mais geralmente de “heterogeneidades de densidade eletrônica” de

dimensões coloidais (entre 1 e 100 nm). ualquer processo de espalhamento

elástico dos raios-X é sempre caracterizado por uma relação inversa entre o

tamanho dessas heterogeneidades e o ângulo de espalhamento. Dessa forma,

para partículas de tamanho maior que as distâncias interatômicas e para uma

radiação incidente de 1,5Ǻ, o espalhamento produzido se limita a ângulos

baixos, entre 0,1° e 5°.

O espalhamento de raios-X a baixos ângulos é amplamente utilizado

para estudos estruturais de baixa resolução de macromoléculas em solução.

Com esta técnica pode-se obter informações detalhadas sobre raio de giro,

volume, superfície molecular e estado de oligomerização da SELA. Cálculos ab

initio do enovelamento molecular por anelamento simulado ou técnica de

algoritmos genéticos também podem ser utilizados. Estas técnicas vem sendo

trabalhadas pelo grupo em seus estudos preliminares de proteínas

estruturalmente desconhecidas.

IV. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Materiais

Foram utilizados para clonagens do DNA referente aos genes de

Escherichia coli para a proteína Selenocisteína Sintase (SELA) e para o ácido

ribonucléico transportador (tRNA

sec

uca

) os plasmídeos pGEM-T (Promega),

pET28a+, pET29a+ (Novagen) e pUC19 (Fermentas Life Sciences).

As enzimas de restrição Nde I, Hind III, Eco RI, Xba I, Bst NI, enzima

Ligase T4, enzima Taq DNA Polimerase, enzima Platinum Taq DNA Polimerase

“High Fidelity”, enzima T7 RNA Polimerase e seus respectivos tampões e

cofatores (Invitrogen Life Technologies, New England Biolabs, Promega),

também foram utilizados nas reações de transcrição in vitro inibidores de

RNAse e Pirofosfatase, para a reação de RT-PCR o Kit Qiagen OneStep RT-

PCR (Qiagen), bem como para demais soluções e técnicas reagentes

provenientes da Merk e Sigma Chemical Co.

Cepas bacterianas Escherichia coli DH5α, BL21, ER2566 competentes

por cloreto de cálcio. Meios de cultura líquidos e sólidos para crescimento

bacteriano LB e LB-ágar, antibióticos ampicilina e kanamicina.

Estufa (Precision) e agitador (Innova 4430 Incubator Shaker) para cultivo

bacteriano, espectrômetro (Hitachi U-2000 Spectrophotometer), sonicador (550

Sonic Dismembrator Fisher Scientific), centrífuga Sorvall RC Plus (Ou Pont),

cubas de eletroforese horizontais e verticais e para purificação de proteínas

AKTA Explore Automated Liquid Chromatography System (Amersham

Bioscience).

Também foram utilizados para extrações de DNA: DNAzol

Reagent

Genomic Dna Isolation Reagent (Life Technologies), Wizard

Genomic DNA

Purification Kit (Promega) e Dneasy

Tissue Kit (Qiagen) para DNA genômico e

Wizard

Plus SV Minipreps DNA Purification Systtem Kit (Promega) para DNA

plasmideal; para recuperação e purificação de DNA de géis de agarose

Eppendorf Perfect Gel Cleanup Kit (Eppendorf).

Para a realização das amplificações dos materiais genético bem como

reações de transcrição in vitro de tRNAs termocicladores PTC-100

Programmable Thermal Controller (MJ RESEARCH, INC) e oligonucleotídeos

sintetizados a partir de seqüências disponíveis em banco de dados

(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/).

Oligonucleotídeos para amplificação do gene Selenocisteína Sintase

(selA):

SELA3–E1 5’ ACTGTATCATATGACAACCGAAACGCGTTTC CTCTATAG 3'

SELA–E2 5’ TAGCTAAGCTTTCATTTCAACAACATCTCCAAAAACCG 3’

Oligonucleotídeo interno a seqüência do gene Selenocisteína Sintase

(selA) para reação de seqüenciamento:

SELA – I3 5’ TACTGGCTAAGATCGACCAGCGAGCCACTG 3’

Oligonucleotídeos para amplificação do gene de Inserção Selenocisteína

– tRNA

sec

uca

SELC-1 5’ ACGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGAAGATCGTCGT

CTCCGGTGAGGCGGCTGGACTTCAAATCCAGTTG 3’

SELC-2 5’ ACTCTAGACCTGGGGAAGATCACAGGAGTCGAACCTGCCC

GGGACCGCTGGCGGCCCCAACTGGATTTGAAGTCCAG 3’

SELC-1b 5’ GGAAGATCGTCGTCTCCGGTGAGG 3’

SELC-2b 5’ TGGCGGAAGATCACAGGAGTCG 3’

O registro do DNA manipulado foi realizado através de câmera digial

Kodak Digital Science DC120 (KODAK).

Todas as subclonagens obtidas foram seqüenciadas em seqüenciador

automático ABI Prism

377 DNA Sequencer. Para as realizações de

seqüenciamento utilizou-se os oligonucleotídeos comerciais localizados nos

respectivos vetores de clonagem, além de “Sequencing Reagent Premix”,

“Formamide Loading Dye” (Amershan Pharmacia Biotech) para reações de

amplificações e ressuspensão para posterior aplicação em gel de

seqüenciamento.

Para purificação da proteína SELA colunas de cromatografia de troca

iônica Deae Sepharose Fast Flow, Hi Trap Q HP (Amersham Bioscience) e

Hydroxyapatite (Bio-Rad - ceramic type II). E coluna Hi Trap Desalting

(Amersham Bioscience), para retirada do sal da solução protéica.

Para concentração da proteína SELA concentradores 10000 MWCO

(Millipore).

A produção de anticorpos policlonais foi realizada em camundongos Mus

musculus.

E os ensaios estruturais de Espalhamento Dinâmico de Luz - DLS

(Protein Solution DynaPro), Dicroísmo Circular - CD (Circular Dichroism J-720

Spectropolarimeter – Jasco) e Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo –

SAXS utilizando o feixe de radiação eletromagnética a partir de fonte

Síncrotron (LNLS).

4.2. Métodos

Toda a metodologia de manipulação de DNA e microrganismos foi

realizada como descrito em SAMBROOK and RUSSEL (2001). A metodologia

de expressão e purificação da proteína SELA foi seguida segundo

FORCHHAMMAN et al. (1991a), acrescidas de modificações descritas no item

4.2.9 deste trabalho. A produção de anticorpos policlonais foi feita segundo

HARLOW and LANE (1988). A transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

foi realizada

segundo AMBERG et al. (1996), acrescidas de algumas modificações descritas

no item 4.2.18 deste trabalho.

4.2.1. Amplificação do gene Selenocisteína Sintase (selA)

O gene para Selenocisteína Sintase (selA) foi obtido a partir de DNA

genômico extraído e purificado de Escherichia coli DH5α, utilizando-se

oligonucleotídeos (SELA3-E1 e SELA-E2) descrito no item 4.1, que

flanqueassem as extremidades do gene acrescidos de seqüências

reconhecidas por enzimas de restrição que facilitassem a posterior

subclonagem aos vetores de expressão pET28a+ e pET29a+.

Para a reação de amplificação foram utilizados 300ng do DNA genômico

molde de Escherichia coli, 2,5 unidades da enzima de amplificação Platinum

High Fidelity e 5,0µL de seu respectivo tampão para uma concentração final de

[1X], foram adicionados também 1,0µL de dNTPs [10mM], 1,5µL de MgSO

[50mM] e 1,0µL de ambos os oligonucleotídeos (SELA3-E1, SELA-E2)

[100pMol/µL], resultando em um volume final de 50µL, que foi amplificado em

termocilcador PTC-100

, conforme descrito na tabela 4.1:

AMPLIFICAÇÃO GENE SELA

CICLO

1x 30x 1x

T (

95 95 55 68 4

TEMPO

2 min 45 s 30 s 1,5 min indefinido

O fragmento de 1392 pb amplificado foi purificado de gel de agarose 1%,

utilizando o Kit Eppendorf Perfect Gel Cleanup, obtendo-se uma concentração

final de aproximadamente 200ng/µL.

4.2.2. Clonagem do inserto selA ao vetor pGEM-T

O inserto selA amplificado conforme descrito no item 4.2.1 foi

previamente adenilado para posterior ligação ao vetor de clonagem pGEM-T.

Para a reação de adenilação foram utilizados 5µL do DNA amplificado

Tabela 4.1: Programa utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

para amplificação do gene selA de Escherichia coli a partir de DNA genômico.

[100ng/µL], 1,0µL de enzima Taq DNA Polimerase [5U/µL] e 1,0µL de seu

respectivo tampão para uma concentração final de [1X], foram adicionados

também 0,5µL de dATP [1mM], 0,5µL de MgSO

[50mM], resultando em um

volume final de 10µL. A reação permaneceu a 70

C por 30 minutos.

O inserto adenilado é então ligado ao vetor de clonagem pGEM-T

adicionado-se a reação 3,0µL do DNA adenilado [50ng/µL], 1,0µL do vetor

[50ng/µL] respeitando a proporção recomendada 3 : 1 (insertos : vetor), 1,0µL

enzima T4 DNA Ligase [1U/µL] e 5,0µL de seu respectivo tampão para uma

concentração final [1X], resultando em um volume final de 10µL que

permaneceu ligando aproximadamente 16 horas a 4

4.2.3. Clonagem do inserto selA aos vetores pET28a+ e pET29a+

A escolha dos vetores de expressão pET28a+ e pET29a+ deve-se aos

ótimos resultados de expressão promovidos por tais vetores que utilizam-se de

uma região promotora T7 anteriormente localizada ao inserto do gene em

estudo e a um bom sistema de controle de indução através da variação da

quantidade ministrada do indutor Isopropyl-Thio-B-D-Galactopyranoside

(IPTG). Outra vantagem desses vetores encontra-se na presença de uma

seqüência codificante para um grupo de 6 histidinas localizados 5’ e 3’

respectivamente ao gene de estudo. Na construção pET28a-selA uma cauda

de histidina é codificada na região N-Terminal da proteína para posterior auxílio

durante sua purificação. Essa cauda de histidina é separada do gene por uma

região de reconhecimento pela enzima Trombina para posterior clivagem e

retirada dessa cauda após a purificação da proteína SELA. Na construção

pET29a-selA apesar de uma seqüência codificante de 6 histidinas ser encontra

na região 3’ ao gene inserido, essa não é codificada pela presença de um

códon de terminação presente no final da seqüência do gene selA.

Inicialmente o inserto selA amplificado conforme descrito no item 4.2.1

foi digerido utilizando-se as enzimas de restrição Nde I e Hind III que

flanqueiam suas extremidades. Para a reação de digestão utilizou-se

aproximadamente 6µg do inserto amplificado, 1,0µL de enzima Hind III

[10U/µL], 0,5µL de enzima Nde I [20U/µL] e 3,0µL de tampão React 2 para uma

concentração final [1X] resultando em um volume final de 30µL de reação que

permaneceu a 37

C por 3 horas.

Do mesmo modo os vetores pET28a+ e pET29a+ foram digeridos

utilizando-se as mesmas enzimas que flanqueiam o inserto selA. Dessa forma

para a reação de digestão foram utilizado aproximadamente 2,6µg do DNA

plasmideal pET28a+ e pET29a+, 0,5µL de enzima Hind III [10U/µL] e Nde I

[20U/µL] e 2,0µL de tampão react 2 para uma concentração final [1X]

resultando em um volume final de 20µL de reação que permaneceu a 37

C por

3 horas.

O inserto digerido foi então ligado ao vetor digerido com sítios de

clonagens complementares. A reação de ligação de aproximadamente 16

horas a 16

C, utilizou aproximadamente 350ng de DNA plasmideal digerido,

250ng de inserto digerido, 1,0µL de enzima T4 DNA Ligase [3U/µL] e 2,0µL do

seu respectivo tampão para uma concentração final de [1X] resultando em um

volume final de 20µL de reação.

4.2.4. Transformação de células E. coli competentes

As células competentes de E. coli DH5α, BL21 e ER2566, pelo método

do cloreto de cálcio, mantidas estocadas congeladas a –80

C, foram utilizadas

para receber as ligações do gene selA junto aos vetores de clonagem pGEM-T,

pET28a+ e pET29a+ assim como cepas de E. coli DH5α utilizadas para

receber a ligação do gene selC junto aos vetores pGEM-T e pUC19.

Alíquotas de 30µL de células competentes foram descongeladas em

gelo, 10µL da ligação foi adicionado e homogeneizado cuidadosamente no tubo

de células. Em seguida a mistura permaneceu em banho maria 42

C por 90

segundos e transferida em seguida ao gelo onde permaneceu por 5 minutos.

260µL de meio LB foi adicionado a mistura que permaneceu sob leve agitação

por 1 hora a 37º

C. Decorrido esse tempo 100µL da mistura foi plaqueada em

meio sólido LB-ágar com seu respectivo antibiótico. Os 200µL restantes foram

concentrado 4X (5000rpm por 2 minutos) e plaqueado em uma segunda placa.

No caso da ligação utilizando-se o vetor pGEM-T e pUC19 o antibiótico

em questão foi ampicilina [100µg/mL], para vetores pET28a+ e pET29a+ o

antibiótico requerido foi kanamicina [25µg/mL]. Além do antibiótico as placas

que receberam cepas contendo o inserto+pGEM-T devem conter 0,5mM de

IPTG (Isopropyl-Thio-B-D-Galactopyranoside) e 80µg/mL de X-Gal (5-Bromo 4-

Cloro 3-Indocyl β-D-Galactosídeo).

4.2.5. Caracterização das cepas recombinantes

Após a transformação das cepas de E. coli segundo descrito no item

4.2.4 as colônias resultantes necessitam de confirmação quanto à aquisição do

plasmídeo recombinante.

Para cepas que receberam produto de ligação+pGEM-T uma primeira

seleção é feita visualmente pela coloração das colônias transformadas.

Colônias azuis (não recombinantes) e colônias brancas (recombinantes). A

análise pela coloração das colônias é muito eficiente, devido ao inserto ligado

ao vetor pGEM-T retirar de fase o gene para a β-Galactosidase impedindo sua

transcrição e evitando que o X-Gal seja degradado o que resultaria na

coloração brancas das colônias recombinantes. Entretanto, é preciso ater-se

que algumas vezes o inserto clonado no vetor pGEM-T não altera a fase de

leitura para o gene β-Galactosidase e mutações ou mesmo a ausência de

códons de terminação do inserto podem resultar em recombinantes com

coloração levemente azuis.

Além da análise por coloração tanto cepas que possuem ligação

inserto+pGEM-T como inserto+demais vetores descrito no item 4.1 foram

analisadas utilizando a técnica de PCR de colônia ou análise de restrição

utilizando enzimas que flanqueiam o gene. Posteriormente os plasmídeos

recombinantes foram submetidos a seqüênciamento como descrito no item

4.2.6.

Na técnica de PCR de colônia, as colônias crescidas em meio sólido LB-

ágar após transformação são crescidas em meio líquido LB por

aproximadamente 14 horas, 250rpm 37

C. Decorrido esse tempo alíquotas de

5µL das culturas crescidas são misturadas com outras alíquotas formando

pequenos grupos de 5 colônias. A cada grupo é adicionado 25µL de água para

posterior ser fervido por 5-10 minutos para rompimento da parede celular e

liberação do material genético ao meio. Em seguida uma reação de PCR é

preparada, utilizando 5µL da mistura de DNA e oligonucleotídeos capazes de

alinharem ao vetor em questão. Dessa maneira caso o inserto esteja presente

em alguma colônia do grupo analisado uma amplificação referente ao seu

tamanho mais uma pequena seqüência da região de múltipla clonagem

(polilinker) será visualizada posteriormente em gel de agarose, caso o vetor de

clonagem não tenha recebido o inserto em estudo, apenas a região de múltipla

clonagem será amplificada indicando a ausência do inserto. A técnica de PCR

de colônia é muito utilizada devido a sua fácil, rápida e precisa análise na

busca de colônias recombinantes.

4.2.6. Seqüenciamento dos plasmídeos recombinantes

As amostras pGEMT-selA, pET28a-selA e pET29a-selA selecionadas

pela técnica de PCR de colônia foram seqüenciadas utilizando

oligonucleotídeos comerciais presentes nos vetores de clonagem pGEM-T,

pET28a+ e pET29a+. Devido ao tamanho do gene em questão e a limitação da

técnica de seqüenciamento, oligonucleotídeos sense SELA3-E1 (anterior ao

gene clonado), reverso SELA-E2 (posterior ao gene clonado) e um

oligonucleotídeo reverso interno ao gene SELA-I3 foram utilizados para que

todo o gene pudesse ser seqüenciado e assim verificado a ocorrência de

possíveis mutações.

Na reação e seqüenciamento utilizou-se aproximadamente 500ng do

DNA plasmideal recombinante, 2,0µL de “Sequencer Reagent Premix” (uma

mistura de dNTPs, ddNTPs e enzima), 10pmol do oligonucleotídeo em questão,

completando a reação com água milli-Q autoclavada para um volume final de

10µL. O fragmento de interesse foi amplificado em termociclador conforme o

ciclo abaixo:

PCR DE SEQÜENCIAMENTO

CICLO

1x 35x 1x

T (

96 96 55 68 4

TEMPO

2 min 20 s 15 s 1 min indefinido

Após a amplificação a amostra foi purificada com a adição de 80µL de

isopropanol 75%, permanecendo em repouso (protegido da luz e a temperatura

ambiente) por 15 minutos. Decorrido esse tempo a amostra foi centrifugada 45

minutos a 13000rpm. O sobrenadante é descartado e 200µL de etanol 70%

gelado é adicionado ao tubo. A amostra foi novamente centrifugada 10 minutos

a 13000rpm. O sobrenadante é descartado e após a secagem do material a

temperatura ambiente, a amostra é ressuspendida em 3µL de “Formamide

Loading Dye” para posterior aplicação em gel de seqüênciamento.

4.2.7. Primeiros ensaios de expressão da proteína SELA

Após a clonagem e confirmação das construções recombinantes

pET28a- selA e pET29a-selA, cepas de expressão BL21 foram transformadas

conforme descrito no item 4.2.4. Para os primeiros ensaios de expressão e

purificação foi dado preferência a construção pET29a-selA devido a ausência

da cauda de histidina (descrito no item 4.2.3).

Dessa maneira um pré-inóculo de 5mL contendo cepas BL21

transformadas com a construção pET29a-selA foram cultivadas em meio de

cultura líquido LB aproximadamente 14 horas sob agitação de 250rpm a 37

com seu respectivo antibiótico kanamicina [25µg/mL]. Da mesma forma um

controle negativo de cepas BL21 transformadas com pET29a+ foi cultivado.

Após atingida a saturação do meio de cultura uma alíquota de 50µL

(1:100) de cada um dos pré-inóculos foi transferido para um novo tubo de

LB+kanamicina [25µg/mL] que permaneceu por 2 horas sob agitação de

Tabela 4.2: Programa utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

para seqüênciamento das clonagens do inserto selA nos respectivos vetores

pGEM-T, pET28a+ e pET29a+.

250rpm a 37

C. Decorrido esse tempo 0,1mM do indutor IPTG foi adicionado

aos tubos de cultura para início da expressão que prolongou-se por 2 horas

sob mesmas condições de agitação e temperatura.

Terminado o período de indução as culturas foram centrifugadas por 5

minutos a 4000rpm. Os precipitados foram ressuspendidos em 500µL de

tampão G (50mM Fosfato de Potássio pH7,4; 1mM de EDTA; 3mM de DTT)

contendo 0,6mM de PMSF e alíquotas referente a cada um dos precipitados

ressuspendidos foram retiradas e misturadas a tampão TA [3X] contendo β-

mercaptoetanol na proporção 1 : 2 (amostra : tampão) e colocadas sob gelo

para posterior análise em SDS-PAGE 15%. Ao precipitado ressuspendido

(construção pET29a-selA) foi adicionado [3mg/mL] de Lisozima permanecendo

em repouso sob gelo por 30 minutos para facilitar o rompimento da parede

celular. Decorrido esse tempo a amostra foi sonicada com 4 pulsos de 15

segundos cada (intensidade 4) e intervalos entre eles de 30 segundo.

Novamente uma alíquota foi retirada após a sonicação para verificação de

eventuais perdas da proteína em estudo.

A cultura sonicada foi centrifugada por 15 minutos a 13000rpm. O

sobrenadante foi transferido para um novo tudo e novamente uma alíquota foi

retirada. O precipitado formado foi lavado com tampão G e ressuspendido em

500µL de tampão G para retirada de nova alíquota.

As amostras aliquotadas foram então fervidas 10 minutos e

posteriormente analisadas em SDS-PAGE 15% para verificação da solubilidade

da proteína SELA.

4.2.8. Primeiros ensaios de purificação da proteína SELA

Os primeiros ensaios de purificação da proteína SELA foram seguidos

como sugerido por FORCHHAMMER et al. (1991a).

Dessa maneira pré-inóculos com cepas BL21 contendo plasmídeo

pET29a+ (controle negativo) e pET29a-selA foram cultivados por

aproximadamente 14 horas em meio contendo antibiótico kanamicina

[25µg/mL]. Após atingido a saturação do meio de cultura dos pré-inóculos

contendo as cepas BL21-pET29a-selA estas foram transferidas para

erlenmeyers contendo meio de cultura LB e kanamicina [25µg/mL] na

proporção 1 : 100 (pré-inóculo : meio de cultura novo). O controle negativo

(cepas BL21-pET29a+) foi transferido para um novo tubo de pré-inóculo

acompanhando o crescimento das cepas do erlenmeyer.

As culturas nos erlenmeyer permaneceram em cultivo até uma

densidade óptica D.O

600ηm

igual a 1, sob agitação constante 250rpm e

temperatura 37º C. Após a D.O ser atingida a cultura foi induzida com 0,1mM

de IPTG por duas horas sob mesma condição de agitação e temperatura.

Após o tempo de indução a cultura induzida foi centrifugada 10 minutos

a 6000rpm, 4

C em um tubo sorvall previamente, pesado para retirada do meio

de cultura LB.

O controle negativo também foi induzido com 0,1mM de IPTG conforme

os tempos utilizados para a cultura do erlenmeyer e centrifugado 5 minutos

4000rpm, 4º C em um tubo falcon para retirada do meio de cultura LB.

Ambos os precipitados (pellets) foram lavados com tampão G (50mM

Fosfato de Potássio pH 7,4; 1mM de EDTA; 3mM de DTT) novamente

centrifugados e secos para posterior ressuspensão em tampão H (50mM

Fosfato de Potássio pH 7,4; 1mM de EDTA; 3mM de DTT; 0,6mM de PMSF;

10µM de Piridoxal 5’-Fosfato). Para cada 1g de precipitado (peso úmido)

adicionar 3mL de tampão H, com relação ao controle negativo, este foi

ressuspendido num volume de 60µL de tampão H respeitando a proporção

calculada através do peso por volume obtida da cultura positiva.

Alíquotas tanto do controle negativo como da cultura positiva foram

retiradas para posterior análises em SDS-PAGE da mesma forma como

descrito no item 4.2.7. As manipulações com o controle negativo terminam

nesse passo.

Ao ressuspendido positivo adicionou-se [10µg /mL] de lisozima que

ficou em repouso 30 minutos sob gelo. Em seguida o ressuspendido foi

sonicado para rompimento das células bacterianas com pulsos de 30 segundos

cada (potência 4) e intervalos de 1 minuto entre eles até que o ressuspendido

bacteriano denso apresentasse mais líquido e homogêneo. Novamente uma

alíquota do sonicado foi retirada e o restante centrifugado por 30 minutos a

30000G, 4

O sobrenadante foi medido, transferido para um novo tubo e aliquotado.

O precipitado é lavado, ressuspendido utilizando o mesmo volume inicial de

tampão H e aliquotado.

Ao sobrenadante foi acrescentado 25% de sulfato de amônio,

previamente macerada, sob leve agitação utilizando um agitador

eletromagnético (pulga eletromagnética). Após a homogeneização a solução é

centrifugada 20 minutos a 20000G, 4

C. O sobrenadante pós-sulfato de

amônio é aliquotado e descartado. O precipitado pós-sulfato de amônio

(contendo a proteína SELA) é ressuspendido em média de 6mL de tampão I

(20mM Fosfato de Potássio pH7,4; 0,5mM de EDTA; 2mM de DTT; 10µM de

Piridoxal 5’-Fosfato) para cada 1 litro de cultura induzido e colocado para

dialisar em 2 litros de tampão I (500mL por duas horas, 500mL por duas horas

e 1L 14 horas ). Após a diálise a solução foi centrifugada 15 minutos a

13000rpm para eliminação que qualquer precipitado. Uma alíquota previamente

e posteriormente a diálise foi retirada e a solução protéica foi aplicada à

colunas de purificação descritas abaixo.

A partir desse ponto a metodologia empregada por FORCHHAMMER et

al. (1991a), utiliza-se de duas colunas de troca iônica, uma coluna de exclusão

de massa molecular (gel filtração) e mais uma etapa de precipitação com 40%

de sulfato de amônio.

Inicialmente a coluna aniônica Deae Sepharose Fast Flow previamente

equilibrada com tampão I é usada para purificação da proteína SELA que deve

ser eluída contra um gradiente linear de cloreto de potássio (20–220mM).

A fração relativa a proteína SELA (em torno de 180mM do gradiente

linear de KCl) é separada e aplicada a segunda coluna de troca iônica BioGel

HTP Hydroxyapatite previamente equilibrada com tampão I. A fração adsorvida

na coluna deve ser eluída contra um gradiente linear de 20–200mM de fosfato

de potássio, capaz de liberar a proteína SELA entre 50–124mM de sal.

A fração relativa à proteína SELA é precipitada com 40% de sulfato de

amônio sob gelo. Após a adição do sulfato de amônio a solução protéica é

centrifugada 20 minutos a 20000G, 4

C e o precipitado é ressuspendido em

4,5mL de tampão I e dialisado por 16h contra tampão I para total solubilização

da proteína SELA.

Após a diálise uma nova centrifugação por 20 minutos a 20000G, 4

C é

realizada para eliminação de possíveis precipitados. A fração solúvel deve ser

aplicada em uma terceira coluna de purificação, a coluna de gel filtração

Sephacryl S300, equilibrada previamente com o tampão J (50mM Fosfato de

Potássio pH7,5; 0,5mM de EDTA; 2mM de DTT; 10µM de Piridoxal 5’-Fosfato).

A fração contendo a proteína SELA é concentrada até aproximadamente

1mg/mL, utilizando-se um saco de diálise contra uma solução de poletileno

glicol 20000.

4.2.9. Padronização de um novo protocolo de purificação da proteína

SELA

Devido a problemas encontrados durante a purificação utilizando a

metodologia desenvolvida por FORCHHAMMER et al. (1991a), apenas parte

desse protocolo foi utilizada, desde a expressão até a precipitação com 25% de

sulfato de amônio, sendo que a partir dessa etapa uma nova metodologia foi

desenvolvida para purificação da proteína SELA como será descrita a seguir.

Dessa maneira o precipitado pós-sulfato de amônio (contendo a proteína

SELA) é ressuspendido em média de 6mL de tampão I’ (20mM Fosfato de

Potássio pH7,4; 10µM de Piridoxal 5’-Fosfato) para cada 1 litro de cultura

induzida, e posteriormente passada pela coluna Hi Trap Desalting previamente

equilibrada em tampão I’ para retirada do sulfato de amônio.

Após a retirada do sulfato de amônio, a solução protéica será passada

na coluna de troca iônica Hydroxyapatite, previamente equilibrada em tampão

I’. Parte da proteína SELA é eluída durante a lavagem da coluna enquanto que

outra parte da proteína SELA é eluída entre 80-100% do gradiente linear de

20–500mM de fosfato de potássio.

A fração contendo a proteína SELA obtida durante a lavagem da coluna

de Hydroxyapatite foi aplicada em uma segunda coluna aniônica Hi Trap Q HP

previamente equilibrada em tampão I’ e eluída durante o gradiente linear de

cloreto de potássio (20–1000mM) em dois picos, entre 443–544mM e 544–

661mM respectivamente.

A fração referente ao pico eluido entre 443–544mM de sal foi passada

novamente na coluna Hi Trap Desalting previamente equilibrada em tampão I’

para retirada do cloreto de potássio e concentrada até 7,5mg/mL.

Esse novo método de purificação foi desenvolvido com a ajuda da Dra.

Raquel Kelly Bortoleto Bugs do Instituto de Física de São Carlos da

Universidade de São Paulo.

4.2.10. Esquemas de purificação utilizados

Figura 4.1: Etapas envolvidas na purificação da proteína SELA de Escherichia coli

descrita no texto item 4.2.8 e 4.2.9. Em A- a partir do método de Forchhamaer et.

al.,1991a; em B- a partir do método desenvolvido neste trabalho.

RESSUSPENSÃO DA

SOLUÇÃO PROTÉICA

PRECIPITADA COM

25% DE SULFATO DE

AMÔNIO

DIÁLISE

COLUNA ANIÔNICA

DEAE SEPHAROSE

FAST FLOW

COLUNA DE TROCA

IÔNICA

HYDROXYAPATITE

PRECIPITAÇÃO COM

40% DE SULFATO DE

AMÔNIO

DIÁLISE

COLUNA DE

EXCLUSÃO DE MASSA

SEPHACRYL S300

CONCENTRAÇÃO ATÉ

1 mg/mL

RESSUSPENSÃO DA

SOLUÇÃO PROTÉICA

PRECIPITADA COM

25% DE SULFATO DE

AMÔNIO

COLUNA DESALTING

COLUNA ANIÔNICA

HI TRAP Q HP

COLUNA DE TROCA

IÔNICA

HYDROXYAPATITE

COLUNA DESALTING

CONCENTRAÇÃO ATÉ

7,5 mg/mL

A B

4.2.11. Produção de Anticorpos Policlonais anti-SELA

Os ensaios na produção de anticorpos policlonais da proteína SELA

foram realizados em colaboração com a Profa. Dra. Heloísa Sobreiro S. de

Araújo no Laboratório de Fármacos e Bioquímica da Universidade Federal de

São Carlos.

Foi usado o protocolo de indução de anticorpos, em que 100-150µL de

proteína SELA (aproximadamente 500µg/mL) diluída em tampão I’ (20mM

Fosfato de Potássio pH7,4; 10µM de Piridoxal 5’-Fosfato) foi homogeneizada

em igual volume do adjuvante completo de Freund para imediata aplicação de

50µL subcultaneamente em três camundongos Mus musculus.

Decorrido no mínimo 45 dias uma nova dose (booster), de 100µL de

proteína SELA [100µg/mL] diluída em tampão I’ foi aplicada na região

peritonial de cada um dos camundongos.

Após dez dias da segunda aplicação os camundongos foram

sacrificados e o sangue coletado permaneceu sob temperatura controlada de

C por 4 horas para sua total coagulação. Após esse período o sangue

coagulado foi centrifugado por 3 minutos a 5000rpm, temperatura ambiente. O

sobrenadante (soro) foi coletado e congelado a -20

C, para posterior titulação.

4.2.12. Titulação dos Anticorpos Produzidos

Os anticorpos policlonais produzidos como descrito no item 4.2.11 foram

titulados contra a proteína alvo SELA de Escherichia coli. A metodologia

utilizada foi semelhante à técnica de Imunobloting descrita em SAMBROOK

and RUSSEL (2001).

Dessa maneira a proteína SELA aplicada em gel SDS 15% e

posteriormente transferidas para uma membrana de nitrocelulose, foi incubada

com os anticorpos produzidos pelos três camundongos (anti-SELA – 1, 2, e 3)

numa diluição 1:5000 (anticorpo : tampão), resultando em três análises

independentes umas das outras. Os passos seguintes seguem conforme

descrito para Imunobloting no item 4.2.13.

Com a verificação positiva dos anticorpos, o anticorpo anti-SELA - 3 por

apresentar melhor especificidade foi titulado até a diluição 1:60000.

4.2.13. Busca de Formas Homólogas da Proteína SELA a partir de

Anticorpos Policlonais

Os ensaios de imunobloting seguem conforme metodologia descrita em

SAMBROOK and RUSSEL (2001).

Inicialmente extrato celulares de Leishmania major [5x10

cel/mL],

Trypanosoma cruzi [ - ] e Homo sapiens [3,2x10

cel/mL] foram lisados através

de choques térmicos, 10 repetições de congelamento em nitrogênio líquido e

descongelamento em banho a 42

C. 20µL do lisado foi aplicado em gel SDS

15%, transferido para membrana de nitrocelulose. A verificação da

transferência pode ser feita corando-se a membrana de nitrocelulose com o

corante de Ponceau.

Após verificação da transferência do lisado celular dos organismos de

interesse, a membrana foi incubada com o anticorpo anti-SELA – 3, na diluição

1:5000 por 2 horas, lavada e incubada por mais 2 horas com anticorpos

comerciais anti IgG de camundongos. Novamente essa membrana é lavada e

revelada para verificação de interações entre anticorpos anti-SELA e proteínas

homólogas a SELA de Escherichia coli.

4.2.14. Determinação Estrutural da Proteína SELA

Nosso trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural da

proteína Selenocisteína Sintase (SELA) através das técnicas de Espalhamento

Dinâmico de Luz, Dicroísmo Circular, Espalhamento de Raios-X a Baixo

Ângulo.

4.2.14.1. Espalhamento Dinâmico de Luz

Variadas concentrações de proteína SELA foram medidas utilizando-se

o software DynaPro Dynamic Light Scattering versão 5.26.60.

Aproximadamente 14µL de proteína SELA diluída em tampão I’ (20mM

Fosfato de Potássio pH7,4; 10µM de Piridoxal 5’-Fosfato) contendo 10% de

glicerol foram medidos nas concentrações protéicas de 0,1 – 7,5mg/mL a

temperatura constante de 4

Os parâmetros utilizados foram:

- modelo molecular de comparação – Ave 24 – 110 KDa;

- solvente – aquoso 10% de glicerol

- tempo de aquisição – 2,5 segundos

- sensibilidade – variação de 80 – 100%

- pH da solução – 7,4

concentração da proteína – de 0,15 – 7mg/mL

As coletas e análises desses dados foram realizadas com a ajuda da

Dra. Raquel Kelly Bortoleto Bugs do Instituto de Física de São Carlos da

Universidade de São Paulo.

4.2.14.2. Dicroísmo Circular

Os ensaios de CD da proteína SELA foram realizados em colaboração

com a Profa. Dra. Leila Maria Beltramini do Grupo de Biofísica Molecular do

Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo e do Dr. Milton

Roque Bugs.

Aproximadamente 300µL de proteína SELA [0,1mg/mL] diluída em

tampão I’ (20mM Fosfato de Potássio pH7,4; 10µM de Piridoxal 5’-Fosfato)

contendo 10% de glicerol foram medidos no espectropolarímetro Jasco J-720,

variando-se o comprimento de onda de 195 – 240 nm, a temperatura constante

de 22

C, com uma média de 16 medidas consecutivas usando uma cubeta de

quartzo de 1mm de caminho óptico.

As análises dos espectros de CD foram realizadas através do programa

Self Consistent (SELLCON-2) (Sreerama and Woody, 2000), que possui um

banco de dados de 33 proteínas distintas usadas para as diferentes análises de

desconvoluções das contribuições espectrais de cada estrutura secundária. O

que é conseguido pelo método matemático de análise de “cluster” (Venyaminov

et. al., 1994), em que o espectro de CD é incluído em uma matriz com dados

espectrais de CD e é selecionada inicialmente uma estrutura de uma proteína

referencial ao acaso. Essa solução primária é substituída por outra em um

processo de repetições sucessivas até que uma auto-consistência seja

alcançada (Sreerama et. al., 2000).

4.2.14.3. Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo

A proteína SELA foi utilizada nos estudos de espalhamento de raios-X a

baixos ângulos objetivando-se a determinação do estado de oligomerização e

de seu envelope molecular. Estes estudos foram realizados em colaboração

com a Profa. Dra. Íris L. Toriani e Dr. Cristiano Luis Pinto de Oliveira no

Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) de Campinas – SP e do aluno

de doutoramento Mario de Oliveira do Instituto de Física de São Carlos da

Universidade de São Paulo.

Toda a parte experimental foi realizada no LNLS, utilizando-se a linha

SAXS, com um comprimento de onda do raio incidente de

=1.488Å. As

distâncias entre amostra e detector utilizadas foram de 1135,2mm e 427mm.

Para aquisição dos dados utilizou-se um detetor 1D sensível à posição (DSP),

e com a ajuda de um multicanal adquiriu-se a curva de intensidade de

espalhamento em função do número de canal.

O espalhamento parasita do ar, janelas e das fendas foi subtraído da

intensidade total espalhada. Foi necessário também ser realizado um

“desmearing”, isto é, uma correção dos dados experimentais para eliminar o

efeito de “borrão” (smearing) introduzido pela janela de entrada dos fótons do

DSP (que era de 8mm).

A solução de proteína SELA utilizada nesse experimento encontrava-se

na concentração de [5,6mg/mL] em sua forma decamérica homogeneamente

diluída em tampão I’ (20mM Fosfato de Potássio pH7,4; 10µM de Piridoxal 5’-

Fosfato) contendo 10% de glicerol, como determinado previamente em ensaios

de DLS.

Devido ao LNLS encontrar-se em fase de implementação as medidas de

SAXS foram realizadas no modo “Single Bunch”, com uma corrente de feixe

variando de 9,0 – 2,0mA e tempos de coleta de aproximadamente 15 minutos,

diferentemente da corrente normal oferecida de 250 – 70mA com tempos de

coletas de aproximadamente 90 segundos.

As análises dos dados foram realizadas nos seguintes programas:

OriginPro 7,0 para tratamento e normalização dos dados coletados; Gnom,

para os cálculos do raio de giro, massa dentre outros; Gasbor, para gerar o

modelo PDB (Protein Data Bank) da proteína SELA e para visualização do PBD

gerado o programa PyMOL.

4.2.15. Amplificação do gene de Inserção Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC)

O gene de Inserção Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC) foi amplificado a

partir de oligonucleotídeos (SELC-1 e SELC-2) descritos no item 4.1, que

possuem uma região interna complementar de 20 nucleotídeos e seqüências

flanqueadoras de reconhecimento por enzimas de restrição para facilitar a

clonagem em vetores pGEM-T e pUC19. Na seqüência do gene selC também

foi acrescido prontamente a ele uma seqüência promotora T7 e posteriormente

ao gene um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição Bst NI para

posterior utilização nos ensaios de transcrição in vitro.

Para a reação de amplificação foram utilizados 1,0µL dos respectivos

oligonucleotídeos (SELC-1 e SELC-2) [100pmol/µL], 2,5U da enzima de

amplificação Taq rec. Polimerase e 5,0µL de seu respectivo tampão para um

concentração final e [1X], foram adicionados também 1,0µL de dNTP [10mM],

1,5mM de MgCl

[50mM], resultando em um volume final de 50µL que foi

amplificado em termociclador PTC-100

, conforme descrito abaixo:

AMPLIFICAÇÃO GENE SELC

CICLO

1x 30x 1x

T (

96 96 40 72 4

TEMPO

3 min 30 s 30 s 30 s indefinido

O fragmento de 132pb amplificado foi purificado de gel de agarose 2%,

utilizando o Kit Eppendorf Perfect Gel Cleanup, obtendo-se uma concentração

final de aproximadamente 150ng/µL.

4.2.16. Clonagem do inserto selC em vetores de clonagem

O inserto selC amplificado conforme descrito no item 4.2.15 foi

previamente adenilado para facilitar a ligação ao vetor de clonagem pGEM-T,

como descrito para a proteína SELA (item 4.2.2).

Para clonagem em vetor pUC19 o inserto selC foi digerido utilizando-se

as enzimas de restrição Eco RI e Xba I que flanqueiam suas extremidades.

Para a reação de digestão utilizou-se aproximadamente 4µg do inserto

amplificado, 0,5µL de enzima Eco RI [10U/µL], 0.5µL de enzima Xba I [20U/µL],

0.5µL de BSA [100X] e 3,0µL de tampão NEbuffer 2 para uma concentração

final [1X] resultando em um volume final de 30µL de reação que permaneceu a

C por 3 horas.

Do mesmo modo o vetor pUC19 foi digerido utilizando-se as mesmas

enzimas que flanqueiam o inserto selC. A reação de digestão utilizou

aproximadamente 2,5µg do DNA plasmideal pUC 19, 0,5µL de enzima Eco RI

[10U/µL], 0.5µL de enzima Xba I [20U/µL], 0.5µL de BSA [100X] e 2,0µL de

tampão NEbuffer 2 para uma concentração final [1X] resultando em um volume

final de 20µL de reação que permaneceu a 37

C por 3 horas.

A reação de ligação pUC19-selC segue como descrito para o inserto

pET28a-selA e pET29a-selA descritas no item 4.2.3.

Tabela 4.3: Programa utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

para amplificação do gene de Inserção Selenocisteína-tRNA

sec

uca

+ região

promotora T7 totalizando 132pb.

4.2.17. Seqüenciamento dos plasmídeos recombinantes

As amostras pGEMT-selC e pUC19-selC selecionadas pela técnica de

PCR de colônia foram seqüenciadas utilizando oligonucleotídeos comerciais

presentes nos vetores de clonagem pGEM-T e pUC19. Desta forma a

metodologia e reações de seqüenciamento seguem como descrito no item

4.2.6.

4.2.18. Transcrição in vitro e purificação do tRNA

sec

uca

Os ensaios de transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

foram realizados

segundo AMBERG et al. (1996).

Dessa maneira o gene selC amplificado por PCR e o DNA plasmideal

pUC19-selC foram digeridos com a enzima de restrição Bst NI proporcionando

a terminação correta CCA 3’ encontrada nos tRNAs. A reação de ambas as

digestões foram realizadas com aproximadamente 5µg do gene selC (DNA

plasmideal), 2,5µL de enzima Bst NI [10U/µL], 5µL de tampão NEbuffer 2 para

uma concentração final de [1X] e 1µL de BSA [100X] resultando num volume

final de 50µL que permaneceu a 60

C por 4 horas.

Após a digestão gene selC e o DNA plasmideal foram precipitados com

acetato de amônio, segundo o protocolo descrito em SAMBROOK and

RUSSEL (2001) para precipitação de ácidos nucléicos, e ressuspendido em

30µL de água livre de RNAse.

Para a realização da reação de transcrição in vitro os 30µL de DNA

precipitado, 20µL de um mix de rNTP [25mM], 1µL de inibidor de RNAse

[39,8µL/mL], 1µL de enzima T7 RNA polimerase [100Un/µL] e 10µL de tampão

[10X] (tris-HCl 0,4M; NaCl 0,05M; MgCl

0,22M; DTT 0,1M; Spermidine 0,02M)

foram misturados para um volume final de 100µL e incubados a 37

C por 24

horas (Figura 4.2).

As amostras transcritas foram misturadas com tampão de corrida (20mM

MOPS, 1mM EDTA pH 7,0; 31% formamida; 6% formaldeído; 3,5% loading

buffer (2% bromophenol blue; 2% xylene cyanol; 99% glycerol)) na proporção

1:1, desnaturadas a 70

C por 5 minutos e posterior incubação em gelo para

seguida aplicação em gel desnaturante de formaldeído (0,5g agarose; 2,5mL

tampão 10X (200mM MOPS, 10mM EDTA pH 7,0); 1,5mL formaldeído; 20mL

água).

4.2.19. Verificação do tRNAsecuca transcrito por RT-PCR

Para verificação quanto ao tRNA

sec

uca

transcrito no item 4.2.18 foi

realizado uma reação de RT-PCR, isto é, uma transcrição reversa utilizando-se

como molécula molde o produto da transcrição (item 4.2.18), oligonucleotídeos

(SELC-1b e SELC-2b) específicos descritos no item 4.1 e uma mistura de

enzimas presentes no Kit Quiagen OneStep RT-PCR.

Para a reação de transcrição reversa foram utilizados 1,0µL dos

respectivos oligonucleotídeos (SELC-1b e SELC-2b) [100pmol/µL], 2,0µL da

mistura de enzima Qiagen OneStep RT-PCR e 10,0µL de seu respectivo

tampão para um concentração final [1X], foram adicionados também 2,0µL de

dNTP [10mM], 1,0µL inibidor de RNAse [39,8µL/mL] e 10,0µL do transcrito

(item 4.2.18), resultando em um volume final de 50µL que foi amplificado em

termociclador PTC-100

, conforme descrito abaixo:

TRANSCRIÇÃO REVERSA DO tRNA SELC

CICLO

1x 1x 1x 35x 1x 1x

T (

94 50 95 94 50 72 72 4

TEMPO

1 mim 30 mim 15 mim 30 s 30 s 45 s 10 mim indefinido

vetor pUC19 promotor T7 gene Sel C

132 pb

cca 95 rnt

tRNA

sec

transcrito ( selC)

Bst N1

Figura 4.2: Esquema representativo da digestão do vetor pUC19-selC com a enzima Bst

N1 e posterior transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

Tabela 4.4: Programa utilizado na Reação de Transcrição Reversa para verificação do

produto relativo a transcrição in vitro do tRNA

sec

ucs

V. RESULTADOS

5.1. Resultados referentes ao gene Selenocisteína Sintase (selA)

5.1.1. Amplificação do gene selA

Como descrito no item 4.2.1 o gene para Selenocisteína Sintetase (selA)

amplificado e purificado pode ser visualizado em gel de agarose abaixo.

5.1.2. Caracterização dos transformantes pET28a-selA e pET29a-selA

Após a amplificação e purificação do gene selA este foi clonado em

vetores de expressão pET28a+ e pET29a+ conforme descrito no item 4.2.3. Os

recombinantes foram determinados pela técnica de PCR de colônia como

descrito no item 4.2.5 e visualizado em gel de agarose abaixo.

Figura 5.1: Amplificação do gene selA

de Escherichia coli visualizado em gel

de agarore 1% e TAE [1X] corado com

brometo de etídeo. Na coluna 1-

padrão molecular “1Kb Plus DNA

Ladder”; coluna 2- controle negativo e

coluna 3- purificação do gene selA

amplificado por PCR a partir de DNA

genômico de Eschericia coli.

1 2 3

2,0 Kb

1,6 Kb

0 Kb

500

sel

(

1392

)

A B

5.1.3. Seqüenciamento dos recombinantes pET28a-selA e pET29a-selA

Os vetores recombinantes determinados pelas análises de PCR de

colônia foram seqüenciados em seqüenciador ABI Prism

377 como descrito

no item 4.2.6. As seqüências resultantes do seqüenciamento foram analisadas

no programa de alinhamento via Internet MultiAlin (http://prodes.toulouse.inra.fr/

multalin/multalin.html) e Blastn 2.2.10 – NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

blast/bl2seq/wblast2.cgi) como visualizado na figura 5.3 pela representação de

Dot–Plot de identidade.

Figura 5.2: Caracterização dos transformantes pET28a-selA e pET29a-selA visualizada em

gel de agarose 1% e TAE [1X] corado com brometo de etídeo. Em A, PCR de colônia

(grupos de cinco colônias cada) na procura de recombinantes pET28a-selA-,na coluna 1-

padrão molecular “1Kb Plus DNA Ladder”; colunas 2,3,4,6 e 7- amplificação da região de

múltipla-clonagem (≈ 300pb) indicando ausência de recombinantes nesses grupos; na

coluna 5- além da amplificação da região de múltipla clonagem é visualizado amplificação

do gene selA. Nesse grupo novamente foi realizado uma reação de PCR para identificação

de qual colônia possuía o inserto selA. Em B, amplificação de um dos grupos positivos

(colônias individualizadas) para a reação de PCR na busca de recombinantes pET29a-

selA, indicando a presença do gene SelA na colônia referente a coluna 8.

5.2. Resultados referentes à proteína Selenocisteína Sintase (SELA)

5.2.1. Primeiros ensaios de expressão da proteína SELA

Nos primeiros ensaios de expressão da proteína SELA descritos no item

4.2.7, demonstraram que esta apresentava-se solúvel como visualizada no gel

de poliacrilamida 15% abaixo. O mesmo ensaio foi realizado utilizando o

tampão PBS em substituição ao tampão G, com resultados similares (gel não

mostrado).

1 2 3 4 5 6

BSA 67,0 KDa

OVA 45,0 KDa

Ac. Bov 30,0 KDa

IT-Sya 22,46 KDa

Cit. C 13.37 KDa

SELA 50,0 KDa

Figura 5.4: Expressão da proteína SELA, visualizada em SDS-PAGE 15% corado

por Coomassie Blue. Na coluna 1- padrão com suas respectivas massas moleculares

indicados; nas colunas 2- controle negativo (BL21-pET29a+); 3- extrato bruto (BL21-

pET29a-selA); 4- extrato bruto após adição de Lisozima e sonicação; 5- fração

precipitada ressuspendida; 6- sobrenadante indicando que a proteína SELA

encontra-se solúvel. A banda de expressão localizada na altura dos 13 kDa é

resultado de um excesso de Lisozima utilizado durante este ensaio.

Figura 5.3: Alinhamento utilizando Blastn no modo Dot-Plot (NCBI) das seqüências selA

clonadas nos respectivos vetores de expressão pET28a (A) e pET29a (B) seqüênciados

em seqüênciador ABI Prism

377. Nas linhas verticais encontram-se as seqüências dos

vetores e inserto selA (pET28a-selA e pET29a-selA) obtidas após o seqüênciamento,

enquanto que na linha horizontal encontra-se o gene selA disponibilizado no banco de

dados NCBI.

5.2.2. Primeiros ensaios de purificação da proteína SELA

A proteína SELA apresenta-se em grande quantidade solúvel como

visualizada pelas alíquotas coletadas ao longo da primeira etapa de lise e

purificação descrita no item 4.2.8.

Após diálise a fração protéica contendo a proteína SELA foi aplicada na

coluna aniônica DEAE Sepharose Fast Flow, em que parte da proteína SELA

não conseguindo ligar-se a resina foi eluída durante a lavagem da coluna com

tampão I. O restante da proteína SELA que interagiu com a resina foi eluído

durante o gradiente linear entre 216–407mM de KCl.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

67,0 KDa

45,0 KDa

30,0 KDa

22,46 KDa

13.37 KDa

SELA 50,0 KDa

Figura 5.5: Etapas de expressão da proteína SELA anteriormente a sua aplicação em coluna

aniônica DEAE Sepharose Fast Flow, visualizada em SDS-PAGE 15% corado por

Coomassie Blue: na coluna 1- padrão com suas respectivas massas moleculares indicados;

nas colunas: 2- controle negativo (BL21-pET29a+); 3- extrato bruto (BL21-pET29a-selA); 4-

extrato bruto após adição de Lisozima e sonicação; 5- sobrenadante contendo SELA solúvel;

6- fração precipitada; 7- sobrenadante após a adição de 25% de sulfato de amônio; 8- fração

precipitada após a adição de 25% de sulfato de amônio; 9- pré-coluna após diálise; 10-

precipitado após diálise.

As frações de proteína SELA purificadas pela coluna aniônica DEAE

Sepharose Fast Flow foram unidas e aplicadas na segunda coluna de troca

iônica Hydroxyapatite. Entretanto, nem a proteína SELA nem os contaminantes

interagiram com a coluna sendo eluídos durante sua lavagem, inviabilizando os

passos subseqüentes.

5.2.3. Padronização de um novo protocolo de purificação da proteína

SELA

Devido aos passos de purificação da proteína SELA segundo

FORCHHAMMER et al. (1991a) não terem proporcionado resultados como o

esperado, novos testes foram realizados na tentativa de obter a proteína SELA

purificada em grande quantidade.

Inicialmente na tentativa de aumentarem os rendimentos durante a

primeira etapa de purificação por cromatografia, a coluna aniônica Hi Trap Q

HP foi testada, objetivando a redução das perdas de proteína SELA que

ocorriam durante a lavagem da coluna aniônica Deae Sepharose Fast Flow,

como visualizado na figura 5.7.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

67,0 KDa

45,0 KDa

30,0 KDa

22,46 KDa

13.37 KDa

SELA 50,0 KDa

Figura 5.6: Purificação da proteína SELA utilizando coluna aniônica DEAE Sepharose Fast

Flow, visualizada em SDS-PAGE 15% corado por Coomassie Blue: na coluna 1- padrão

com suas respectivas massas moleculares; nas colunas: 2- amostra pré-coluna; 3- fração

de proteína SELA durante lavagem da coluna; 4,9,10- referentes a proteínas

contaminantes; 5,6,7,8- referente a proteína SELA e alguns contaminantes eluídos durante

gradiente linear 216-407mM de KCl.

1 2 3 4 5

67,0 KDa

45,0 KDa

30,0 KDa

22,46 KDa

13.37 KDa

SELA 50,0 KDa

Figura 5.7: Comparação dos rendimentos resultantes da purificação da proteína SELA

utilizando as colunas aniônicas DEAE Sepharose Fast Flow e Hi Trap Q HP. A-

Cromatografia utilizando coluna DEAE Sepharose FF: a seta em vermelho indica grande

quantidade de proteína SELA eluída durante a lavagem da coluna, a seta em azul indica a

proteína SELA eluída durante o gradiente linear de KCl (226-400mM). B- Cromatografia

utilizando coluna Hi Trap: a seta em azul indica a proteína SELA eluída durante gradiente

linear de KCl (332-460mM). C- SDS-PAGE 15% corado por Coomassie Blue: na coluna 1-

padrão com suas respectivas massas moleculares; 2- pré coluna; 3- SELA purificada

utilizando coluna aniônica DEAE Sepharose FF; 4- pré coluna; 5- SELA purificada

utilizando coluna aniônica Hi Trap.

O rendimento de proteína SELA purificada utilizando essa nova coluna

foi melhorado, tanto no aumento da quantidade de proteína SELA, devido a

eliminação das perdas de proteínas durante a lavagem da coluna, como na

qualidade de purificação, devido a eliminação de uma forte banda de proteína

contaminante logo abaixo à proteína SELA, que a coluna DEAE não foi capaz

de eliminar (Figura 5.7c).

Entretanto quando a proteína SELA foi concentrada após sua purificação

na coluna Hi Trap uma grande quantidade de proteínas contaminantes pode

ser observada, além de perdas entre 60-80% de proteína SELA na forma de

precipitados.

Em vista dos resultados obtidos uma nova metodologia capaz de

melhorar a purificação da proteína SELA era necessária. O que foi conseguido

com a utilização primeiramente da coluna de troca iônica Hydroxyapatite e

posterior coluna de troca iônica Hi Trap Q HP devido a seus melhores

resultados quando comparados com a coluna DEAE Sepharose Fast Flow.

Além disso o EDTA foi removido das soluções tampões devido a sua ação

quelante extremamente prejudicial para a resina de cálcio presente na coluna

de Hydroxyapatite.Dessa forma um novo protocolo de purificação como

descrito no item 4.2.9 foi testado e os resultados podem ser visualizados na

1 2 3

22,46 KDa

13.37 KDa

45,0 KDa

30,0 KDa

67,0 KDa

SELA 50,0 KDa

Figura 5.8: Concentração da proteína SELA após purificação em coluna aniônica Hi Trap

Q HP, visualizado em SDS-PAGE 15% corado por Coomassie Blue: coluna 1- padrão com

suas respectivas massas moleculares; 2- proteína SELA concentrada a 2mg/mL; 3-

proteína SELA concentrada a 4mg/mL.

figura 5.9.

Figura 5.9: Nova estratégia de purificação da proteína SELA utilizando colunas de troca iônica

Hydroxyapatite e posterior coluna Hi Trap Q HP. A- Cromatografia utilizando coluna Hydroxyapatite:

a seta em azul indica parte da proteína SELA eluída durante a lavagem da coluna, a seta em

vermelho indica parte da proteína SELA eluída durante gradiente linear de fosfato de potássio (400-

500mM). B- Cromatografia utilizando coluna Hi Trap: a seta em azul e a seta em vermelho

indicando o primeiro e segundo pico de proteína SELA eluído entre 443-544mM e 544-661mM

respectivamente do gradiente linear de KCl. C- SDS-PAGE 15% corado por Coomassie Blue: 1-

padrão com suas respectivas massas moleculares; 2- pré coluna; 3- proteína SELA eluída durante

lavagem da coluna Hydroxyapatite; 4- proteína SELA eluída 80-100% gradiente linear de fosfato de

potássio na coluna de Hydroxyapatite; 5 e 8- nenhuma proteína eluída; 6,7- proteína SELA eluída

durante gradiente linear KCl na coluna Hi Trap, 443-544mM e 544-661mM respectivamente; 9, 10-

proteína SELA referente a eluição da coluna 6 concentrada a 2mg/mL e 7,5mg/mL respectivamente.

67,0 kDa

45,0 kDa

30,0 kDa

22,46 kDa

13,37 kDa

1 23456789

SELA 50,0 kDa

Neste novo protocolo de purificação além da redução dos passos e

consideravelmente do tempo na obtenção da proteína purificada como

visualizado no item 4.2.10, foi possível aumentar o rendimento da proteína

SELA de 1mg/mL a partir de 10L para 4,5mg/mL a partir de 3L de cultura

bacteriana, um aumento de 15 vezes comparados com o resultados obtidos na

literatura.

5.2.4. Titulação dos Anticorpos Produzidos

Os anticorpos produzidos e titulados como descrito nos itens 4.2.11 e

4.2.12 respectivamente, podem ser visualizados na figura 5.10 em que

inicialmente foram testados em baixas diluições (1:5000) para verificação da

existência de anticorpos e de suas respectivas especificidades.

O anticorpo anti-SELA – 3 por apresentar menores reações cruzadas foi

titulado até uma diluição 1:60000.

Figura 5.10: Titulação dos anticorpos anti-SELA produzidos em camundongos (Mus

musculus): na coluna 1- marcador de peso molecular corado com Ponceau; em 2, 3 e 4-os

respectivos anticorpos anti-SELA – 1, 2 e 3 na diluição 1:5000; de 5 a 10- o anticorpo anti-

SELA – 3, nas titulações de 1:10000 a 1: 60000.

5.2.5. Busca de Formas Homólogas da Proteína SELA a partir de

Anticorpos Policlonais

Foram realizados ensaios de Imunobloting para busca de formas

homólogas em células de Leishmania major, Trypanosoma cruzi e Homo

sapiens visto que até o momento a proteína SELA apenas é descrita em

eubactéias.

Entretanto como visualizado na figura 5.11 até o momento não foi

possível a detecção de proteínas homólogas nesses organismos.

5.2.6. Espalhamento Dinâmico de Luz

Os ensaios de DLS foram capazes de estimarem a massa molecular

hidratada da proteína decamérica SELA em aproximadamente 442 kDa a partir

do raio hidrodinâmico de 6,32ηm (Figura 5.12). A medida foi realizada

utilizando-se proteínas na concentração de [0,1mg/mL] e sensibilidade do

aparelho ajustada para 100%, o que resultou em grande espalhamento durante

as coletas das medidas do experimento. O ideal seria ter ajustado a

67,0 KDa

45,0 KDa

30,0 KDa

22,46 KDa

13.37 KDa

SELA 50,0 KDa

Figura 5.11: Imunobloting utilizando anticorpo anti-SELA – 3 produzido em camundongos

Mus musculus e extratos celulares de Leishmania major, Trypanosoma cruzi e Homo

sapiens: em 1 e 10- marcadores de peso molecular; em 2- controle positivo proteína SELA;

em 5- extrato celular de Leishmania major; em 7- extrato celular de Trypanosoma cruzi; em

9- extrato celular de Homo sapiens.

sensibilidade para 60%, resultando em medidas mais confiáveis. Apesar do

histograma apresentar uma escala decrescente de colunas, essa solução pode

ser tida como homogênea e comportando-se dessa maneira devido à

excessiva sensibilidade como mencionado. Essa amostra foi posteriormente

utilizada para ensaios de CD.

5.2.7. Dicroísmo Circular

Os ensaios de CD foram capazes de identificar hélices α como estrutura

secundária predominante na proteína SELA (Figura 5.13). As medidas foram

realizadas utilizando-se proteínas na concentração de [0,1mg/mL],

primeiramente analisadas por DLS para atestar sua homogeneidade.

Figura 5.12: Ensaio de DLS utilizando proteína SELA purificada [0,1mg/mL] diluída em

tampão I’ contendo 10% de glicerol. O histograma mostra o raio hidrodinâmico de 6,32ηm e

a estimativa da massa molecular hidratada de 442 kDa.

200 210 220 230 240

-30

-20

-10

Ellipticity (mdeg)

λ (nm)

Sela

A partir do espectro acima análises de desconvoluções foram realizadas

pelo programa SELCON-2 e seus respectivos resultados são ilustrados na

tabela 5.1 abaixo.

Estrutura secundária Estimativa Erro

Hélices - α 0.77 0.06

Folhas - β 0.04 0.03

Turn 0.07 0.01

Elementos de estruturas não regulares 0.12 0.05

Figura 5.13: Espectro de CD utilizando proteína SELA purificada [0,1mg/mL] diluída em tampão I’

contendo 10% de glicerol. O espectro de CD realizado de 195 – 250nm em cubeta com caminho

óptico de 1mm com uma média de 16 medidas a 22

Tabela 5.1: Desconvoluções obtidas pelo programa SELCON-2 a partir do espectro de CD realizado

com a proteína SELA entre 195 – 250nm, uma média de 16 medidas a 22

5.2.8. Difração de Raios X a Baixo Ângulo

Os ensaios de SAXS foram capazes de determinar a estrutura global da

proteína SELA na concentração de [5,6mg/mL] como visualizado na curva de

espalhamento experimental e da função de distribuição de distâncias

(Figura 5.14).

Figura 5.14: Curvas experimentais obtidas nos experimentos de SAXS para a proteína

decamérica SELA: Em A- curva experimental de espalhamento da proteína SELA; em

B- curva teórica da distribuição de Distâncias.

A partir dos dados acima obtidos foi possível determinar o raio de giro,

massa, diâmetro máximo, bem como, a estrutura global da proteína SELA

utilizando-se os programas Gnom e Gasbor (Figura 5.15) e (tabela 5.2).

Parâmetros SAXS

Diâmetro (Å) 185

Massa Molecular (kDa) 527 +/-28

Raio de Giro (Å) 67,3 +/-0,3

5.3. Resultados referentes ao Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC)

5.3.1 Amplificação do gene Selenocisteína-tRNA

sec

uca

(selC)

Como descrito no item 4.2.15 o gene de Inserção Selenocisteína-

tRNA

sec

uca

(selC) amplificado e purificado pode ser visualizado em gel de

Figura 5.15: Determinação da estrutura global da proteína decamérica SELA a partir

da média espacial de 10 modelos calculados independentemente e visualizados em

diferentes ângulos.

Tabela 5.2: Parâmetros obtidos a partir dos ensaios da proteína decamérica SELA a

partir da média espacial de 10 modelos calculados independentemente.

agarose 2%.

5.3.2. Clonagem do inserto selC em vetores de clonagem

Após a amplificação e purificação do gene selC este foi clonado em

vetores pGEM-T e pUC19 conforme descrito no item 4.2.16. Os recombinantes

foram determinados pela técnica de PCR de colônia como descrito no item

4.2.5. Dessa forma como visualizada para subclonagens pUC19-selC na figura

5.17 , as colônias negativas apresentam uma amplificação de 76pb referente a

região de múltipla-clonagem e colônias positivas apresentam 208pb (soma de

76pb multiplaclonagem +132 gene Sel C e região promotora T7)

300 pb

200 pb

100 pb

1 2

selC (132 pb)

Figura 5.16: Amplificação do gene de

inserção selenocisteína tRNA

sec

uca

(selC)

visualizado em gel de agarose 2% e TAE

[1X] corado com brometo de etídeo. Na

coluna 1- padrão molecular “1Kb Plus

DNA Ladder”; coluna 2- purificação do

gene selC e sua região promotora T7

amplificado por PCR a partir de

oligonucleotídeos específicos.

5.3.3. Seqüenciamento dos recombinantes pUC19-selC

Os vetores recombinantes determinado pelas reações de PCR de

colônia foram seqüênciados em seqüênciador ABI Prism

377 como descrito

no item 4.2.6 e os respectivos alinhamentos podem ser visualizadas abaixo.

300 pb

200 pb

100 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

selC (132 pb)

Figura 5.17: Caracterização dos transformantes pUC19-selC visualizados em gel

de agarose 2% e TAE [1X] corado com brometo de etídeo. Na coluna 1- padrão

molecular “1Kb Plus DNA Ladder”; coluna 6 e 7- amplificações positivas (208pb)

pUC19-selC; colunas 2 a 5 e 8 a 14- amplificações negativas (76pb) pUC19.

Figura 5.18: Alinhamento utilizando Blastn no modo Dot-Plot (NCBI) da seqüência T7 –

selC clonadas no vetor de clonagem pUC19 seqüênciado em seqüênciador ABI Prism

377. Devido ao pequeno tamanho do fragmento clonado apenas o oligonucleotídeo M13

sense do vetor pUC19 foi utilizado e sendo capaz de percorrer os 132 nucleotídeos da

região promotora T7 ligada ao gene Sel C.

5.3.4. Transcrição in vitro e purificação do tRNA

sec

uca

O produto da transcrição in vitro realizados tanto com o gene selC como

com o DNA plasmideal pUC19-selC digeridos e purificados como descrito no

item 4.2.18 pode ser visualizado no gel de desnaturante de formaldeído (Figura

5.19).

Para verificação quanto ao produto transcrito no item 4.2.18 uma reação de

RT-PCR foi realizada (item 4.2.19) confirmando a transcrição do tRNA

sec

uca

Escherichia coli como pode ser visualizado na figura 5.20.

300 rb

200 rb

100 rn

1 2 3

tRNA

sec

(95 rb)

Figura 5.19: Transcrição in vitro do tRNA

sec

uca

visualizado em gel desnaturante de

formaldeído e TAE [1X] corado com brometo de etídeo. Na coluna 1- padrão

molecular “0,1-2,0 Kb RNA Ladder”; 2- transcrição do tRNA

sec

uca

(95

ribonucleotídeos) a partir do gene selC amplificado por PCR e digerido com

enzima Bst NI e 3- transcrição do tRNA

sec

uca

a partir do DNA plasmideal pUC19-

selC digerido com enzima Bst NI.

300 pb

200 pb

100 pb

1 2 3

selC (95 pb)

Figura 5.20: Amplificação por RT-PCR do gene de inserção selenocisteína

tRNA

sec

uca

(selC) visualizado em gel de agarose 2% e TAE [1X] corado com

brometo de etídeo. Na coluna 1- padrão molecular “1Kb Plus DNA Ladder”;

coluna 2- amplificado a partir da transcrição utilizando o gene selC como molde

e 3- amplificado a partir da transcrição utilizando o DNA plasmideal pUC19-

selC como molde.

VI. DISCUSSÃO

Tendo em vista da universalidade da via de biossíntese e incorporação

do aminoácido selenocisteína, isto é, presente em eubactérias, arqueobactérias

e eucariotos, através de inúmeras proteínas atualmente identificadas e

classificadas de forma geral como selenoproteínas e seu intrigante mecanismo

de incorporação através do códon de terminação (UGA) auxiliado por uma

complexa interação entre proteínas e moléculas de RNA têm despertado

interesse no sentido de caracterizar as proteínas atuantes nesta via.

Como descrito no tópico 1.3 da introdução desse trabalho são

necessárias algumas proteínas para que a biossíntese e incorporação do

aminoácido selenocisteína ocorram, tais como SELA, SELB, SELD além de um

tRNA próprio (tRNA

sec

uca

) e uma seqüência específica localizada no mRNA

denominada SECIS, quando em procariotos (Leinfelder, 1988). Entretanto,

quando essa via é comparada com a encontrada em arqueobactérias e em

eucariotos novas particularidades são descritas como: a posição e seqüências

específicas da seqüência SECIS, a necessidade de mais uma proteína

denominada de SBP2 e a ausência da proteína SELA.

A posição assumida pela seqüência SECIS em procariotos ocorre ao

longo da seqüência traduzível do mRNA, logo seguida ao códon de

terminação/inserção

Sec

UGA. Comparado com as SECIS de arqueobactérias e

eucariotos localizadas na região não traduzível jusante (3’ UTR) a

aproximadamente 25 e de 51-111 nucleotídeos após o códon de terminação

respectivamente, bem como a presença de seqüências específicas de

reconhecimento encontradas ao longo das SECIS (Liu et. al., 1998; Hatfield et.

al., 2002; Korotkov et. al., 2002; Rother et. al., 2001).

Em eucariotos também foi verificado a existência da Proteína ligante a

Seqüência SECIS (SBP2) capaz de ligar-se a proteína SELB portando o

tRNA

sec

uca

carregando o respectivo aminoácido selenocisteína a seqüência

SECIS localizada na região 3’ UTR, encaminhando ao ribossomo o

selenocisteil-tRNA

sec

uca

, dando continuidade ao processo de incorporação do

selenocisteína a selenoproteínas (Hatfield and Gladyshev, 2002; Atkins and

Gesteland, 2000). Entretanto o que permanece ainda obscuro em

arqueobactérias e eucariotos é como ocorre a conversão do aminoácido

precursor serina no vigésimo primeiro aminoácido selenocisteína, visto da

ausência da proteína SELA ou de formas homólogas desta nesses organismos

(Low and Berry, 1996).

A proteína SELA foi identificada e purificada no início da década de 90

(Forchhammer et. al., 1991) e desde então nenhuma forma homóloga a ela foi

encontrada em nenhum outro organismo que não fosse procarioto.

Tendo em vista da importância do elemento selênio na dieta dos

organismos vivos e sabendo que sua forma ativa encontra-se incorporado

especificamente as selenoproteínas sob a forma do aminoácido selenocisteína,

como detalhado no tópico 1.5 e 1.6 dessa dissertação. Este estudo visa à

caracterização molecular e estrutural da proteína Selenocisteína Sintase de

Escherichia coli, visto que o único trabalho estrutural com essa proteína ter sido

realizado em 1992 por Engelhardt, através de microscopia eletrônica de

transmissão (STEM), gerando bons dados quanto às dimensões e massa

aproximada da proteína SELA, mas dados pouco elucidativos quanto sua

estrutura e interação com o respectivo selenocisteil–tRNA

sec

uca

devido as

limitações dessa técnica.

No decorrer deste trabalho, uma nova metodologia de purificação da

proteína SELA foi sugerida com várias vantagens comparada com a descrita

pela literatura (Forchhammer et. al., 1991) (tópico 4.2.8). Nessa nova

metodologia os dois passos de diálises são substituídos pela passagem da

proteína de interesse em coluna Hi Trap Desalting, agilizando em muito o

processo de retirada do sal da solução protéica. A coluna de troca iônica DEAE

Sepharose FF foi substituída pela coluna aniônica Hi Trap Q HP, capaz de reter

em sua resina uma quantidade superior de proteína SELA quando comparada

a coluna anterior. E por fim a ordem da utilização das colunas foi alterada,

sendo primeiramente utilizado a coluna de troca iônica de Hydroxyapatite e

posteriormente a coluna Hi Trap, como descrito no tópico 4.2.9 e no

sumarizado no esquema 4.2.10. Tal alteração resultou na separação de duas

populações de proteína SELA, uma eluída durante a lavagem da coluna e

posteriormente utilizada nos passos subseqüentes e uma segunda fração de

proteína SELA eluída em 500mM de fosfato de potássio e que em

aproximadamente 30 minutos após a saída da coluna apresenta-se

completamente precipitada. Também eliminou a necessidade de uma segunda

precipitação com 40% de sulfato de amônio e passagem por uma terceira

coluna (gel filtração).

É suposto que a super expressão da proteína SELA resultasse em uma

população de proteínas mau enoveladas e que durante as fases de

concentrações após a utilização de apenas a coluna Hi Trap, durante a

purificação, ajudasse na alta taxa de proteína precipitadas (até 80%), visto que

essa coluna foi incapaz de separar essas duas populações de proteínas SELA

e além de apenas a utilização dessa coluna resultar em altos graus de

proteínas contaminantes.

Dessa maneira o desenvolvimento de um novo protocolo de purificação

além da redução dos passos e conseqüentemente do tempo na obtenção da

proteína purificada, foi possível o aumento do rendimento da proteína SELA de

1mg/mL a partir de 10L para 4,5mg/mL a partir de 3L de cultura bacteriana. Um

aumento de 15 vezes quando comparado aos resultados descritos na literatura.

Com a purificação da proteína SELA anticorpos policlonais utilizando

camundongo Mus musculus foram obtidos na tentativa de encontrar proteínas

homólogas em organismos como Leishmania major, Trypanosoma cruzi e

Homo sapiens, visto que ainda não foi caracterizada uma proteína ou mais de

uma proteína responsável pela conversão de serina em selenocisteína em

organismos eucarióticos. Entretanto, os ensaios de “Imunobloting” não

detectaram proteína homóloga nesses organismos.

Nesse trabalho uma combinação de técnicas como DLS e CD foram

utilizada na determinação de alguns parâmetros da proteína SELA e posterior

determinação da estrutura global desta foi conseguida pela técnica de SAXS.

O ensaio de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi capaz de

determinar a massa aproximada da molécula em 442 kDa e a homogeneidade

da solução protéica, um requisito fundamental para a realização dos demais

experimentos.

Com ensaios de Dicroísmo Circular (CD) foi possível a predição das

estruturas secundárias encontradas na proteínas SELA, como sendo

predominantemente de hélices α. Foram encontrados também pequenas

porcentagens de folhas β e estruturas não periódicas, mas devido ao grande

erro associado a essas medidas esses dados foram reduzidos.

Com concentrações próximas a 6mg/mL experimentos de Espalhamento

de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) foram possíveis de serem realizados. A

vantagem dessa abordagem é a obtenção de dados estruturais a baixas

resoluções de proteínas em soluções, o que em muitos casos é a única

alternativa visto das dificuldades na obtenção de cristais bons para a

metodologia de Difração de Raios-X

Os dados gerados por SAXS, apesar das coletas terem sido realizadas

em modo “Single Bunch” com uma corrente muito menor do que a rotina do

Laboratório Nacional de Luz Síncrotron disponibiliza a seus usuários, foram

muito bons. Isto é devido ao grande tamanho da proteína homodecamérica

SELA e a simetria nela encontrada.

Desta forma as análises de SAXS foram capaz de determinar o diâmetro

máximo da proteína em 185Å, sua massa molecular em 527 +/- 28 kDa e o raio

de giro de 67,3 +/- 0,3Å, além da estrutura global da proteína SELA com uma

resolução próxima a 20Å.

Essa metodologia de SAXS é muito eficaz quando utilizada em conjunto

com resultados obtidos na difração em cristais, pois permite a sobreposição

das imagens obtidas e comparação da forma protéica em solução e em cristais,

ilustrando uma maior dinâmica das proteínas em estudos, bem com ensaio

entre proteínas e ligantes específicos dessas proteínas (Fisher et. al., 2003).

Experimentos de transcrição in vitro para a síntese do tRNA

sec

uca

Escherichia coli, foram realizados e confirmados pela técnica de transcrição

reversa (RT-PCR), para posteriores ensaios de interação com a proteína SELA

através de experimento simples como “Gel Shift” e para posteriores medidas de

DLS, CD e SAXS, variando-se as concentrações do tRNA ligante.

VII. PERSPECTIVAS FUTURAS

É objetivo a continuidade deste trabalho através:

• Tentativas de aumentar a quantidade obtida de proteína SELA purificada

para posteriores ensaios de cristalização;

• Ensaios de interação Proteína-tRNA

sec

uca

, através da técnica de

retardamento da migração em gel (Gel Shift);

• Ensaios estruturais em solução do complexo Proteína-tRNA

sec

uca

utilizando-se das metodologias de DLS, CD e SAXS;

• Tentativa de cristalização do complexo Proteína-tRNA

sec

uca

;

• Caso seja possível a cristalização do complexo Proteína-tRNA

sec

uca

comparação dos dados obtidos em solução (SAXS) e por cristais.

VIII. REFERÊNCIAS

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