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2
Avaliação do potencial das leveduras isoladas da fermentação da cachaça e
de nichos ecológicos regionais para bioremediação de cádmio em condições
laboratoriais
Kezia Pereira de Oliveira
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais,
como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre em
Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais
Área de concentração: Aplicação de Técnicas Nucleares
Orientadora: Dra. Maria José Neves
Belo Horizonte
2005
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Comissão Nacional de Energia Nuclear
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR
Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e
Materiais
Avaliação do potencial das leveduras isoladas da fermentação da cachaça e
de nichos ecológicos regionais para bioremediação de cádmio em condições
laboratoriais
Kezia Pereira de Oliveira
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais,
como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre em
Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais
Área de concentração: Aplicação de Técnicas Nucleares
Orientadora: Dra. Maria José Neves
Belo Horizonte
2005
4
5
Aos meus pais que acima de tudo acreditaram em mim, depositando toda sua confiança e
esperança para que eu conquistasse mais esta vitória, a vocês que acompanharam o meu
crescimento pessoal e profissional, a vocês meus amados, que me deram carinho,
segurança e uma base sólida para que eu continuasse a trilhar muitas das vezes o caminho
escuro da vida, onde a minha única luz é vocês, apesar de sempre distantes, mas próximo
em pensamentos, mantiveram-se ao meu lado, ao meu papai pelas palavras de grande
sabedorias e as orações de minha mamãe que se tornaram inegáveis aos olhos de Deus, me
fortalecendo a cada desafio enfrentado. A vocês entrego o meu amor incondicional com
todo carinho e respeito.
Dedico-lhes
6
AGRADECIMENTOS
A Dra. Maria José Neves agradeço pelos enriquecedores ensinamentos, pela
orientação e oportunidade de desenvolver este trabalho.
Ao professor Dr. Carlos Augusto Rosa do departamento de Microbiologia ICB/UFMG
por ter cedido às linhagens de leveduras que foram utilizadas neste trabalho.
Aos meus colegas de laboratório de Radiobiologia, no qual com o passar do tempo foi
criado um grande afeto que nos uniu, fazendo com que o respeito e a admiração se
fortalecessem com o decorrer da nossa convivência. A eles que nos momentos difícil
conseguiram me fazer sorrir, me apoiando e estando ao meu lado todo o tempo em que
necessitei. A Ariane, Bruno, Marcella, Priscilla, Edson e Marina pela amizade, apoio e
carinho.
Ao Flaviano pelas instruções preciosas que me foram de grande valor.
Ao Zacarias que com os seus cuidados me atendeu prontamente sempre com o largo
sorriso no rosto.
Ao professor Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade, que acompanhou o meu trabalho,
sempre prestativo, me auxiliando nos momentos em que eu o procurava sempre disposto e
atencioso, a ele que tem o dom não apenas de ensinar, mas o de compartilhar o seu
conhecimento.
A professora Dra. Maria Ângela de Barros Correia Menezes pelo incentivo,
conhecimento e por acreditar no potencial de seus alunos, a qual sempre me acolheu com
muito carinho, sempre atenta e prestativa.
A Ângela Maria Amaral e Geraldo Frederico Kastner da Radioquímica pelas
determinações das concentrações de cádmio incorporado pelas células e, a toda equipe do
7
reator (Fausto Maretti Junior, Amir Zacarias Mesquita, Paulo Fernandes de Oliveira, Luiz
Otávio I. Sette Câmara, Wagner de Souza) pela irradiação das amostras.
A nossa secretária e amiga Roseli, sempre pronta a nos atender, pela sua simpatia,
tranqüilidade e cuidados.
As bibliotecárias Virgínia, Nívea e Lenira por terem me recebido sempre com muita
simpatia e atenção.
Agradeço o imenso carinho e amizade, ao meu padrinho José Machado, sempre
presente e prestativo, obrigada pelo seu incentivo e otimismo.
As minhas colegas e amigas de moradia Tallita e Viviane, que me deram tranqüilidade
e paz para que nosso lar a cada dia tornasse mais harmonioso.
Em especial ao meu melhor amigo e conselheiro de todas as horas, que sempre me
incentivou, e esteve ao meu lado todos os momentos, a pessoa que foi fundamental para que
eu chegasse ate o fim, ao meu namorado Rhaine Matos Gonçalves, que com seu carinho e
amor fez com que as dificuldades se tornassem pequenas e meus dias mais radiantes,
“obrigada meu amor, por tanto carinho e apoio, ter você ao meu lado foi sem dúvida minha
maior conquista”.
Ao meu amado irmão Jetro Pereira de Oliveira, que por varias vezes foi mais que um
pai, me apoiando financeiramente mesmo diante de tantas dificuldades, e com palavras de
grande sabedoria, pois trilhou este mesmo caminho e conhece os espinhos que neles se
encontram, a ele que certamente foi à peça chave para o alcance desta vitória.
A minha irmã Sara e meu cunhado Ricardo, que estiveram sempre dispostos a me
ouvir e me dar carinho, onde a distância não foi fronteira para o grande afeto que nos une.
Ao CDTN por ter disponibilizado instalações e equipamentos para a realização dos
trabalhos. A todos os funcionários e membros do CDTN, que muitas vezes me ajudaram,
muito obrigada.
8
Em fim agradeço a Deus, por essa vitória, por ter sempre me mostrado o melhor
caminho a trilhar, a ele que atendeu minhas orações onde meu único pedido era que eu
pudesse ter a cada dia mais humildade e sabedoria, pela minha fé, e confiança, pois se não
fosse pelo seu poder divino certamente tanta felicidade e conquistas seriam impossíveis.
9
Os que confiam no Senhor serão como monte de Sião, que não se abala, mas permanece
para sempre.
(Salmo 125 : 1)
10
RESUMO
Avaliação do potencial das leveduras isoladas da fermentação da cachaça e de
nichos ecológicos regionais para bioremediação de cádmio em condições laboratoriais
Kezia Pereira de Oliveira
RESUMO
Os metais pesados, diferentemente, dos poluentes orgânicos, não podem ser
quimicamente degradados. Assim, são usados processos de remediação químicos e físicos
para a sua remoção, antes do lançamento em corpos d’água. Em sua maioria, estes processos
são eficazes, mas, podem ser inviáveis economicamente ou, agravam o problema, pois,
grandes quantidades de reagentes químicos podem ser necessários. A adição dos reagentes
químicos pode remover o metal, mas, cria um novo problema, com o descarte dos químicos.
A bioremediação, usando microorganismos como material bioabsorvente, tem sido aplicada
com sucesso em vários casos.
Células de leveduras podem acumular íons metálicos na superfície celular através do
processo de adsorção, que é o processo passivo ou então, absorver o metal ativamente, que é
acumulado no interior da célula.
Neste trabalho foram estudados vários parâmetros, biológicos, fisiológicos e químicos,
sendo estes parâmetros importantes para seleção de leveduras que possam ser usadas na
captação do cádmio de meio aquoso.
Fungos, Leveduras e bactérias quando expostos a situações adversas, apresentam uma
resposta adaptativa que capacita a célula a sobreviver frente a tal estresse. Normalmente,
nestas situações, o carboidrato trealose é sintetizado. Observamos que a presença de cloreto
de cádmio induz a síntese de trealose, entretanto, o acúmulo deste carboidrato não
desempenha papel protetor fundamental, nas condições estudadas.
A levedura tem capacidade para incorporar o cádmio sob diferentes formas químicas.
O uso de diferentes compostos químicos de cádmio, tais como, cloreto, óxido, acetato, nitrato
e, sulfato não proporcionam incorporação diferenciada do metal pelas leveduras.
As linhagens de leveduras isoladas da fermentação da cachaça e, da região, apresentou
uma maior tolerância a altas concentrações de cádmio, quando comparadas a linhagens de
laboratório. Todas as Saccharomyces cerevisiae (com exceção das de laboratório) toleram
11
para o seu crescimento, uma concentração de 50 ppm de cloreto de cádmio, enquanto, a
levedura Starmerela meliponinorum cresce a 100 ppm. A linhagem de laboratório
Saccharomyces cerevisiae tolera apenas 10 ppm de cloreto de cádmio para seu crescimento.
Altas concentrações de cloreto de cádmio inibem o crescimento das células de todas as
linhagens de leveduras estudadas.
A incorporação de cádmio pelas células de leveduras é dependente da concentração
inicial do metal no meio e, do tempo que as células ficam expostas ao metal. Comparando-se,
períodos curtos de exposição ao cádmio, 3 horas, com períodos longos, 24 horas, a
incorporação de cádmio pelas células é maior quando as células permaneceram mais tempo
em contato com o metal.
Para células vivas, a incorporação do cádmio é dependente da fase de crescimento em
que a célula se encontra. Células em fase estacionária captam menor quantidade de cádmio
quando comparadas com células em fase logarítmica do crescimento.
O aumento da massa não favorece a incorporação do metal. Por outro lado, leveduras
mortas por autoclavação captam mais cádmio quando comparadas com leveduras vivas.
Foram utilizadas neste trabalho diversas linhagens de leveduras. Usamos nove
linhagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas da fermentação da cachaça, provenientes de
alambiques do estado de Minas Gerais e, seis linhagens de leveduras, representando gêneros
e, espécies diferentes, do gênero Saccharomyces, isoladas de nichos ecológicos regionais. Não
verificamos que uma linhagem especifica tenha incorporação de cádmio muito superior à
outra. Os resultados são similares, indicando que a capacidade de incorporar cádmio, pelas
leveduras vivas, não está muito ligada ao gênero ou, espécie empregada.
Nossos estudos mostraram que as leveduras isoladas da fermentação da cachaça e,
aquelas selecionadas na região, apresentaram maior incorporação de cádmio quando,
comparadas com as linhagens de Saccharomyces cerevisiae de laboratório.
Este trabalho indica que é possível usar a biomassa de levedura de alambique, para
incorporar cádmio de efluentes contaminados, sem a necessidade de isolamento das linhagens
que a compõe, usando apenas as propriedades biosorventes e bioacumuladoras da biomassa
total de leveduras.
12
ABSTRACT
Avaliação do potencial das leveduras isoladas da fermentação da cachaça e de
nichos ecológicos regionais para bioremediação de cádmio em condições laboratoriais
Kezia Pereira de Oliveira
ABSTRACT
The heavy metals, differently of the organic pollutants, cannot be degraded
chemically. Owing to that characteristic, processes of chemical and physical remediation are
used before the release in water. In the majority of the cases, these processes are effective,
but, they can be unviable economically or, they can worsen the problem, because, great
amounts of chemical reagents can be necessary. The addition of the chemical reagents can
remove the metal, but it creates a new problem, with the discard of the chemist. The
bioremediation, using microorganisms as bioabsorvent material, has been applied with
success in several cases.
Cells of yeasts can accumulate metallic ions in the cellular surface through the process
of adsorption, that is the passive process, or to absorb the metal, that is accumulated inside the
cell.
In this work we studied several parameters, biological, physiological and chemical,
that are important for selection of yeasts that can be used in the incorporation of the cadmium
of water polluted.
Fungus, yeast and bacteria when exposed to adverse situations, presents an adaptable
answer that qualifies the cell to survive to such stress. Usually, in these situations the
carbohydrate trehalose is synthesized. We have observed that the presence of chloride of
cadmium induces the trehalose synthesis, however, the accumulation of this carbohydrate
doesn't play a fundamental protecting role, in the studied conditions.
The yeast has the capacity to incorporate the cadmium under different chemistries
forms. The use of different chemical compositions of cadmium, such as, chloride, oxide,
acetate, nitrate and sulfate, doesn't provide differentiated incorporation of the metal by the
yeast.
The strains of yeasts isolated of the “cachaça” fermentation and, region area, presented
a larger tolerance to high concentrations of cadmium, when compared to laboratory strains.
13
These yeasts tolerate, for his growth, a concentration of 50 ppm of chloride of cadmium,
while, the yeast Starmerela meliponinorum grows at 100 ppm. The laboratory strain of
Saccharomyces cerevisiae tolerates only 10 ppm of chloride of cadmium for his growth. High
concentrations of chloride of cadmium inhibit the growth of the cells in all the studied strains
of yeasts.
The incorporation of cadmium by yeasts cells is dependent of the initial concentration
of the metal in the medium and, of the period of time that the cells are exposed to the metal.
When short periods, 3 hours, of exposition to the cadmium are compared with long periods,
24 hours, we verified that the incorporation of cadmium by the cells is better in the long ones.
For living cells, the incorporation of the cadmium is dependent of the growth phase.
Cells in stationary phase has smaller incorporation of cadmium when compared with cells in
logarithmic phase.
The incorporation of cadmium by viable cells is dependent of the cellular mass used,
however an increase in the mass doesn't increase the metal incorporation. On the other hand,
cells killed by autoclaving incorporated more cadmium when compared with living cells.
In this work several strains of yeasts were used. We have used nine strains of
Saccharomyces cerevisiae isolated of the “cachaça” fermentation, coming of alambics of the
Minas Gerais state and, six strains of yeasts, representing different genders and species,
isolated from regional ecological niches. We haven’t verified that a specific strain has a very
superior incorporation of cadmium. The results are similar, indicating that the capacity to
incorporate cadmium, by living cells, is not very linked to the gender or species used.
Our studies showed that both, the yeasts isolated of the “cachaça” fermentation and the
regional ones, present larger incorporation of cadmium, when compared with the laboratory
strains of Saccharomyces cerevisiae.
This work indicates that it is possible to use the biomass of yeast from alambics, to
incorporate cadmium of polluted effluents, without the need of isolation of the strains that
composes the biomass, just using the biosorbents and bioaccumulative properties of the total
yeast biomass.
14
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ...........................................................................................6
RESUMO..............................................................................................................10
ABSTRACT..........................................................................................................12
SUMÁRIO ............................................................................................................14
LISTA DE TABELAS ..........................................................................................16
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................17
1 INTRODUÇÃO...........................................................................................18
1.1 C
ÁDMIO
........................................................................................................19
1.2 A
CÚMULO DE METAIS PELAS LEVEDURAS
.......................................................24
1.3 T
REALOSE
.....................................................................................................26
1.4 B
IOREMEDIAÇÃO
...........................................................................................29
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA .........................................................35
3 OBJETIVOS ...............................................................................................37
3.1 O
BJETIVO GERAL
...........................................................................................37
3.2 O
BJETIVO ESPECÍFICO
....................................................................................37
4 METODOLOGIA .......................................................................................38
4.1 L
INHAGENS
E
STUDADAS
................................................................................38
4.2 M
EIOS DE
C
ULTURA
.......................................................................................40
4.3 M
ANUTENÇÃO DAS LINHAGENS DE LEVEDURA NO LABORATÓRIO
....................40
4.4 P
ROTOCOLO
E
XPERIMENTAL
..........................................................................40
4.5 C
URVA DE CRESCIMENTO DAS LEVEDURAS
.....................................................41
4.6 T
ESTE DE TOLERÂNCIA AO CÁDMIO
. ...............................................................41
4.7 T
ESTES DE
I
NDUÇÃO DA
R
ESISTÊNCIA
............................................................42
4.8 D
OSAGEM DE TREALOSE
.................................................................................42
4.9 E
XTRAÇÃO DA TREALASE DO
H
UMICOLA GRISEA
.............................................43
15
4.10 D
ETERMINAÇÃO DE CÁDMIO INCORPORADO PELA CÉLULA
.............................43
5 RESULTADOS ...........................................................................................46
6 DISCUSSÃO ...............................................................................................72
7 CONCLUSÃO.............................................................................................84
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................86
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Linhagens utilizadas nesse estudo ........................................................................39
Tabela 2 - Teste de tolerância das leveduras ao cádmio ........................................................50
Tabela 3 - Influência de massas celulares crescentes na incorporação de cádmio..................61
Tabela 4 – Incorporação de cádmio pela biomassa não viável em diversas linhagens de
leveduras..............................................................................................................................65
Tabela 5 – Influência da exposição a concentrações crescentes de cádmio na incorporação do
metal por diversas linhagens.................................................................................................68
Tabela 6 – Influência do tempo de incubação das diversas linhagens em presença de 100 ppm
de cádmio.............................................................................................................................69
Tabela 7 – Influência do tempo de incubação e, diferentes condições, na incorporação de
cádmio por leveduras expostas a de 50 ppm de cloreto de cádmio. .......................................70
Tabela 8 – Influência do tempo de incubação e diferentes condições, na incorporação de
cádmio, por diferentes linhagens de leveduras, em presença de 50 ppm e 100 ppm de cloreto
de cádmio.............................................................................................................................71
Tabela 9 - Remoção de metais do efluente da
Companhia Paraibuna de Metais usando
diversas resinas absorventes. ................................................................................................83
17
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Influência de diferentes concentrações de cloreto de cádmio no crescimento da
levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT (linhagem de laboratório). ...........................47
Figura 2 - Influência das concentrações crescentes de cloreto de cádmio sobre os níveis de
trealose.................................................................................................................................48
Figura 3 - Determinação da quantidade de trealose acumulada na levedura Saccharomyces
cerevisiae W303-WT após exposição a diferentes compostos
de cádmio..............................51
Figura 4 - Determinação da quantidade de cádmio incorporado na linhagem Saccharomyces
cerevisiae W303-WT ...........................................................................................................52
Figura 6 - Influência de 500 ppm de cádmio no crescimento de diferentes leveduras. ...........57
Figura 7 - Influência de 500ppm de cloreto de cádmio nos níveis de trealose de diferentes
linhagens de leveduras..........................................................................................................58
Figura 8 - Quantidade de cádmio incorporado pelas células da linhagem Saccharomyces
cerevisiae W303-WT (linhagem de laboratório) ...................................................................60
Figura 9 – Influência do tempo de incubação com cádmio na incorporação do metal............62
Figura 10 - Incorporação de cádmio em diferentes linhagens de leveduras coletadas em fase
estacionária. .........................................................................................................................64
18
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, o desenvolvimento e, a rápida industrialização trouxe graves
problemas ambientais. Os resíduos industriais contendo metais pesados são despejados
desordenadamente e, constitui num grande risco à saúde e, ao meio ambiente.
Os metais pesados são elementos químicos que possuem peso especifico superior a 5
g.cm
-3
, sendo considerados “elementos traço” por serem naturalmente encontrados em poucas
partes por milhão (ppm) (MATTIAZZO-PREZOTTO, 1994). Diferem de outros agentes
tóxicos porque não são sintetizados nem degradados pelo homem. A atividade industrial,
visando a produção de novos compostos, diminuiu significativamente a permanência desses
metais nos minérios, alterando a distribuição desses elementos no planeta.
A ação dos metais pesados na saúde humana é muito diversificada. Entre os metais
mais perigosos estão o mercúrio, o cádmio (encontrado em baterias de celulares), cromo e o
chumbo.
A expressão “metal pesado” é comumente utilizada para designar metais classificados
como poluentes, englobando um grupo muito heterogêneo de metais, semimetais e mesmo
não metais como o selênio. Na lista de metais pesados estão, com maior freqüência, os
seguintes elementos: cobre, ferro, manganês, molibdênio, zinco, cobalto, níquel, vanádio,
alumínio, prata, cádmio, cromo, mercúrio e chumbo (CETESB, 2001).
As atividades industriais têm introduzido metais pesados nas águas numa quantidade
muito maior do que aquela que seria natural, causando poluição. Para se ter uma idéia disso,
basta lembrar que os metais pesados fazem parte dos despejos de grandes indústrias, em todos
os países do mundo.
No Brasil, estima-se que, das 2,9 milhões de toneladas de resíduos industriais
perigosos gerados anualmente, somente 600 mil toneladas recebam tratamento adequado,
conforme estimativa da Associação Brasileira de Empresas de Tratamento Recuperação e
Disposição de Resíduos Especiais - ABETRE (WHO, 1992). Os 78% restantes são
depositados indevidamente em lixões, sem qualquer tipo de tratamento (WHO, 1992).
A crescente industrialização nas últimas décadas expôs animais e, vegetais a muitas
espécies químicas potencialmente tóxicas. Os metais pesados ou, metais traço, destacam-se
como os mais perigosos, pois, mesmo em níveis traço, podem causar danos eco-biológico
irreversíveis (MIRANDA, 1993).
19
Todas as formas de vida são afetadas pela presença de metais dependendo da dose e,
da forma química. Muitos metais são essenciais para o crescimento dos organismos
biológicos, das bactérias ao ser humano, mas, eles são requeridos em concentrações traços,
acima destes níveis, podem danificar sistemas biológicos. Como resultado do fenômeno de
bioacumulação, quantidades sub-tóxicas presentes no ambiente podem atingir níveis de risco,
nos elos finais, da cadeia trófica (VOLESKY, 1990a).
1.1 Cádmio
O metal cádmio pertence, junto com o cobre e zinco, ao grupo IIb da Tabela
Periódica. É um elemento relativamente raro e, não é encontrado na natureza em estado puro.
Está associado principalmente a sulfitos em minérios de zinco, chumbo e cobre. Sua primeira
purificação ocorreu em 1817, sendo que, sua produção comercial somente se tornou
importante no início do século passado. Quando aquecido a altas temperaturas emite fumos de
cádmio altamente tóxicos. O cádmio é, vagarosamente oxidado pela umidade do ar, a óxido
de cádmio (ILO, 1998) e também é um grande absorvedor de nêutrons (HSDB, 2000).
Em 2001, o cádmio foi o 7
0
classificado na lista “de Substancias mais Perigosas” da
CERCLA (Comprehensive Environmental Response, Compensation, and Liability Act),
juntamente com a EPA (Environmental Protection Agency) e ATSDR (Agency for Toxic
Substances and Disease Registry), onde as substancias são classificadas de acordo com sua
toxicidade, potencial de risco à saúde e, exposição destes aos organismos vivos.
A principal fonte natural de lançamento de cádmio na atmosfera é a atividade
vulcânica. As emissões de cádmio ocorrem tanto durante os episódios de erupção como,
durante os períodos de baixa atividade vulcânica. Esta fonte, apesar de muito difícil de ser
quantificada, foi estimada como sendo responsável pela emissão de 820 toneladas do metal
por ano. A atividade vulcânica em mar profundo também é parte importante do ciclo do
cádmio, porém sua quantificação não foi ainda possível obter (WHO, 1992).
A utilização do cádmio nas indústrias tem sido crescente, pois, é usado para a
produção de pigmentos para tintas, plásticos, baterias e depósitos eletrolíticos. No mundo
inteiro sua produção anual é de 20.000 toneladas, sendo que a maior parte é destinada à
indústria de depósito eletro-químico. Interessante ressaltar que 50% do cádmio anual são
consumidos nos EUA, e que o meio ambiente pode ser afetado a uma distância de 100 km na
ordem de magnitude (U.S. GEOLOGICAL SERVEY, 2005).
20
O Brasil tem uma produção mineral bastante diversificada e destaca-se, no contexto
mundial, como grande exportador de minérios. A auto-suficiência do país estende-se à
maioria dos produtos minerais. A dependência externa reside, particularmente no carvão
metalúrgico, potássio e matérias-primas para a metalurgia de metais não ferrosos como, cobre,
zinco e, por conseqüência, o cádmio. O cádmio não aparece entre as principais reservas de
minerais brasileiros, porém, o zinco aparece em pequena proporção (U.S. GEOLOGICAL
SERVEY, 2005).
O cádmio tem utilização limitada. Suas principais aplicações recaem sobre cinco
categorias principais (WHO, 1992):
• Em recobrimento do aço e do ferro;
• Como estabilizador para cloreto de polivinila (PVC);
• Em pigmentos para plástico e vidro;
• Baterias de níquel-cádmio;
• Ligas.
Além desses usos, outros são citados na literatura:
• Fungicida (cloreto de cádmio) (ILO, 1998);
• Aditivo em indústria têxtil (ILO, 1998);
• Produção de filmes fotográficos (ILO, 1998);
• Manufatura de espelhos especiais (ILO, 1998);
• Coberturas de tubos eletrônicos a vácuo (em eletrodos e lâmpadas de vapor de
cádmio) (HSDB, 2000; ILO, 1998);
• Semicondutores (ILO, 1998);
• Vidro e cerâmicas esmaltadas (ILO, 1998);
• Solda para alumínio (MEDITEXT, 2000);
• Sistema de proteção contra incêndio (MEDITEXT, 2000);
• Televisão (HSDB, 2000);
• Absorvedor de nêutrons em reatores nucleares (HSDB, 2000);
• Amálgama em tratamento dentário (1Cd: 4Hg) (HSDB, 2000);
• Fios de transmissão de energia (MEDITEXT, 2000).
Da totalidade do cádmio usado pode-se considerar que 75% é empregado em baterias
de Ni-Cd, e os 25% restantes estão assim distribuídos: pigmentos 13%; recobrimento e
deposição 7%; estabilizadores para plásticos 4%, ligas não ferrosas e, outros usos 1%. O
consumo de cádmio varia, de país para país, dependendo das restrições ambientais, do
21
desenvolvimento industrial, das fontes naturais e, dos níveis comerciais (U.S. GEOLOGICAL
SURVEY, 2005).
A toxicidade do cádmio foi descoberta há mais de um século e, seu uso tem
significativamente se expandido (LASKEY & REHNBERG, 1984). O cádmio é considerado
um provável elemento carcinogênico ou, indutor de carcinogênese, em humanos (VOLESKY,
1990c; ADAMIS et al, 2003).
O principal problema do cádmio em humanos, é que o corpo humano raramente
excreta tanto cádmio quanto absorve. O cádmio tende a acumular no corpo humano (30 mg
em média no homem americano), com 33% nos rins e 14% no fígado (LÓPEZ-ALONSO et
al, 2000). O cádmio absorvido pelo homem (e por outros animais) tem efeito cumulativo.
Concentra-se na urina e no sangue (ROELS et al, 1999; ARANHA et al, 1994), com acúmulo
no fígado e rins (FRIBERG et al, 1974; IKEDA et al, 2000; ROELS et al, 1999; ARANHA et
al, 1994). Clinicamente os casos agudos e, crônicos de toxicidade de cádmio têm aumentado
em humanos (RAGAN & MAST, 1990). O contato ocorre primariamente por vias inalatórias
e digestivas. A inalação da poeira de cádmio e fumaças advém de indústrias. Está presente
também no tabaco e, assim, fumantes estão submetidos a uma exposição maior. Sua inalação
aguda resulta em edema pulmonar e, irritação do trato respiratório, enquanto a inalação
crônica causa mudanças enfisematosas e fibróticas no tecido pulmonar, assim como prejuízos
aos túbulos renais (ZAVON & MEADOW, 1970; FRIBERG et al, 1974).
O caso mais conhecido de intoxicação por cádmio, via alimentos, ocorreu nas margens
do rio Jintsu, na região de Funchu-Machi, no Japão, após a II Guerra Mundial, quando um
grande número de pessoas, plantadores de arroz e, pescadores, foram acometidos de dores
reumáticas, acompanhadas de deformidades ósseas e, distúrbios renais. Posteriormente,
determinou-se que esta epidemia ocorreu devido à intoxicação por cádmio, que se deu pelo
consumo de arroz contaminado por água de irrigação proveniente de efluentes de uma
indústria processadora de zinco-chumbo. A doença ficou conhecida na ciência médica como
Itai-Itai (ATSDR, 1997; MEDITEXT, 2000; WHO, 1992).
A alimentação é, portanto a principal fonte de contaminação, cerca de 70% da
exposição ocorre via oral (GROTEN & BLADEREN, 1994). Esta contaminação pode ocorrer
durante o uso de águas contaminadas na irrigação ou, pelo solo contaminado (MIDIO &
MARTINS, 2000; JARUP et al, 1998; PRASAD, 1995; TYLER, 1990).
O cádmio quando assimilado se distribui em todo o organismo, sendo encontrado em
células sanguíneas ou, ligado a proteínas do soro plasmático como albumina e outras
22
glicoproteínas ou, ligado a metaloproteínas (metalotioneínas) produzidas pelo fígado
(MATTIAZZO-PREZOTTO, 1994).
Em geral o cloreto de cádmio e o acetato de cádmio são os mais absorvidos e, mais
tóxico que outros compostos (MASON, 2005). Como medida de segurança, nos EUA o nível
seguro de cádmio na água para consumo humano é de 10 ppb (parte por bilhão). No Brasil a
concentração permitida pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) varia de 40
ppb a 1 ppb, dependendo da classe da água. Por exemplo: para a água classe 1 o limite
permitido de cádmio é de 1 ppb. Água classe 1 é aquela que, após desinfecção, pode ser
destinada ao abastecimento doméstico, recreação de contato, irrigação de frutas, hortaliças e,
criação de espécies destinadas á alimentação humana. Para água da classe 3, ou seja, água
que, após tratamento convencional, pode ser destinadas ao abastecimento doméstico, o limite
permitido é 10 ppb - Resolução N
o
357-CONAMA (CONAMA, 2005).
Com relação à incorporação de cádmio por leveduras, sabe-se que, os microrganismos
desenvolveram vários mecanismos para se livrarem dos efeitos tóxicos dos metais pesados ou,
compostos orgânicos. A detoxificação de metais em microrganismos é realizada por diversos
mecanismos que incluem: regulação da captação, transformação em espécies menos tóxicas e,
imobilização no interior das células. No interior das células as maiores moléculas que
participam do seqüestro de metais são o tripeptídeo glutationa (GSH; L- -Glu-Cis-Gli), e as
fitoquelatinas ou cadistinas ( -Glu-Cis)n Gli), e as proteínas de baixo peso molecular ricas
em cisteínas chamadas de metalotioneínas. A concentração de GSH em Saccharomyces
cerevisiae pode chegar a 1% do peso seco da célula. GSH funciona como uma espécie de
estoque endógeno de nitrogênio e enxofre e possui um papel importante na proteção contra
metais. A ação defensiva da GSH contra a toxicidade a metais pesados se baseia na
observação do seu acúmulo em resposta à presença de íons metálicos (GADD & GHARIEB,
2004).
Células de leveduras desenvolveram uma variedade de mecanismos de detoxificação
para eliminar compostos tóxicos. Os quatro principais mecanismos descritos, para a
resistência a metais na levedura Saccharomyces cerevisiae, são os seguintes (ERASO et al,
2004):
1- Leveduras possuem um mecanismo que diminui o influxo de metais para a célula. Este
mecanismo depende da repressão do gene do transportador do metal ou, da indução da
proteólise deste transportador.
23
2- Ligação dos metais e formação de complexos como as metalotioneínas (MT). Essas
moléculas neutralizam os efeitos tóxicos dos metais livres graças a ligação dos metais com
as células. A levedura Saccharomyces cerevisiae produz metalotioneínas capaz de ligar
cobre e cádmio. Estas MTs são codificadas pelo mesmo gene CUP1, cuja transcrição é
regulada diferentemente por cobre ou cádmio.
3- Compartimentalização em vacúolos. A proteína Ycf1 (yeast cadmium factor) da
membrana vacuolar tem um importante papel na tolerância ao cádmio em Saccharomyces
cerevisiae. Esta proteína é um membro da superfamília de transportadores ABC (ATP
Binding Cassette) e possui alta homologia com a proteína humana Mrp1 (human
multidrug resistance-associated protein). Ycf1 é uma proteína vacuolar, uma bomba que
conjuga glutationa e Enxofre e realiza o transporte do complexo Cd-GSH para o vacúolo.
Células com superexpressão do gene YCF1 mostram resistência ao cádmio.
4- Sistema de exportação ativo que limita a concentração intracelular do metal tal como o
sistema de efluxo descrito para bactérias. Este mecanismo não é muito descrito para
Saccharomyces cerevisiae ou, outros fungos (SHIEAISHI et al, 2000).
Aparentemente, o mecanismo mais comum na levedura é os “conjugados S glutationa”
(GS-X) parte da família de transportadores ATP-binding cassete (ABC). Bombas GS-X
catalisam o transporte dos conjugados de glutationa para o vacúolo. Através desse
transportador o cádmio é complexado a glutationa, removido do citoplasma e, transportado
para o vacúolo (ERASO et al, 2004).
Estes transportadores GS-X estão envolvidos na retirada do citoplasma de uma gama
de compostos conjugados com S (Enxofre). Até o momento dois transportadores GS-X foram
identificados molecularmente: MRP1, proteína associada com a resistência multidrogas em
humanos (MRP1 - human multidrug resistance associated protein) e YCF, fator transportador
de cádmio em levedura (YCF1 - yeast cadmium factor). Estas 2 proteínas possuem 43% de
identidade e 63% de homologia
(LI et al, 1997).
Em Saccharomyces cerevisiae a regulação da resposta adaptativa a metais pesados e
oxidantes ocorre principalmente a nível transcricional. A resposta da levedura Saccharomyces
cerevisiae ao cádmio é típica isto é, existe uma sobreposição entre a resposta aos vários
estresses, este fato pode refletir a produção de sinais comuns a estes estresses ou,
componentes regulatórios comuns ou, ambos. Por exemplo, várias proteínas de choque
térmico são transcritas em resposta ao cádmio. O tripeptídeo glutationa tem papel central na
proteção contra o estresse oxidativo e a toxicidade ao cádmio. A abordagem proteômica
24
revela que até 54 proteínas tem expressão aumentada em presença de cádmio, muitas dessas
proteínas tem papel fundamental no estresse oxidativo, corroborando a hipótese de que a
exposição à metais pesados resulta em estresse oxidativo. Ao mesmo tempo, durante a
exposição das células da levedura Saccharomyces cerevisiae ao cádmio, existe redução
substancial do nível de 43 outras proteínas
(JAMIESON, 2002).
A regulação pós-transcricional também participa da resposta à presença de metais
pesados. Exemplo típico é a síntese de peptídeos chamados de fitoquelatinas (phytochelatins
ou PCs) após a exposição aos metais pesados. PCs são sintetizadas a partir de GSH em uma
reação catalisada pelas PC sintases, PCs tem uma estrutura geral (Glu-Cys)n-Xaa, contendo
2–11 Glu-Cis repetidos. PCs quelam metais pesados com alta afinidade e facilitam o
seqüestro vacuolar desses metais (OLENA et al, 2001).
1.2 Acúmulo de metais pelas leveduras
Fungos e leveduras são capazes de remover metais pesados do meio ambiente externo
por meio de mecanismos que podem ser físico-químicos, como a adsorção ou, dependente da
atividade metabólica, como o transporte. Algumas interações físico-químicas podem ser
indiretamente dependente do metabolismo via síntese de constituintes particulares da célula
ou, metabólitos que possam agir como eficientes quelantes ou, ainda a criação de um
microambiente particular próximo à célula que facilite a deposição ou, precipitação. Assim, a
biomassa microbiana, viva ou morta, é capaz de acumular metal (GADD, 1990).
As leveduras podem atuar como acumuladoras de substâncias tóxicas, entre as quais
os metais pesados, para o qual tenham capacidade para captarem (BRADY et al, 1994;
VOLESKY, 1990a).
A célula de levedura, com sua complexa parede celular representa um sítio adicional
de adsorção em relação às células desprovidas de parede. Considera-se a parede celular uma
entidade protetora da membrana plasmática e, da célula como um todo (GADD, 1990).
Numerosos parâmetros químicos devem ser considerados para que um íon metálico
possa ser adsorvido por uma célula viva. Esses incluem: carga do metal, raio iônico, a
preferência do metal por ligantes orgânicos e, a disponibilidade e, concentração do metal
(WOOD & WANG, 1983).
A capacidade que os microrganismos apresentam de acumular metais pesados
geralmente envolve duas fases: uma ligação rápida com a superfície celular, independente do
25
metabolismo, seguida de um acúmulo intracelular dependente do metabolismo, com gasto de
energia. No acúmulo independente do metabolismo, os cátions podem se depositar por
processo de adsorção, precipitação inorgânica ou, ficarem adsorvidos a grupos aniônicos
presentes na parede celular (BRADY & DUNCAN, 1994; VOLESKY, 1990b; VOLESKY &
MAY-PHILLIPS, 1995). Assim, a biosorção é a capacidade que a célula apresenta em
seqüestrar passivamente o metal por diferentes mecanismos físico-químicos. Esta capacidade
é dependente de fatores externos ao microrganismo, bem como do metal, sua forma iônica em
solução, do sítio ativo de retenção responsável pelo seqüestro do metal. Uma característica
importante da biosorção é que ela pode ocorrer mesmo quando a célula não é mais
metabolicamente ativa, ou seja, quando morta (VOLESKY, 1990a). A biosorção de metais
pesados, por biomassa morta, vem sendo empregada como alternativa para as tecnologias
existentes de remoção que, são aplicadas em tratamento de águas residuais. A utilização de
biomassa morta contorna o problema de toxicidade dos íons metálicos para as células
(MATIS & ZOUBOULIS, 1994).
No acúmulo dependente do metabolismo, o metal é transportado pelas proteínas de
transporte através da membrana celular, ficando acumulado no citosol ligado a metalotioneina
(BRADY & DUNCAN, 1994). A metalotioneina está envolvida no armazenamento de metais,
destoxificação, desenvolvimento, diferenciação, controle do metabolismo celular, proteção
contra radicais livres e, resposta à radiação ultravioleta (BRADY & DUNCAN, 1994;
VOLESKY, 1990c).
Há diferentes mecanismos de ação de agentes complexantes nos sistemas biológicos.
Os microrganismos podem complexar metais em soluções, em polímeros extracelulares na
superfície das células ou, em compartimentos intracelulares (WOOD & WANG, 1983).
Os tipos de complexação que as células podem estabelecer com os metais são:
complexação e efluxo, biosorção na superfície celular, complexação via mecanismos
específicos, liberação extracelular de agentes complexantes, complexação e estocagem em
compartimentos intracelulares (BIRCH & BACHOFEN, 1990).
A biosorção e a bioacumulação são processos que resultam na redução de toxicidade.
De acordo com o seu tamanho ou, carga, os complexos formados não podem passar através da
membrana celular e, por serem insolúveis, precipitam. Por outro lado, complexos de baixo
peso molecular podem ser formados e, entram na célula por difusão, podendo então, ser
exportado de volta ao meio ou, estocado em compartimentos intracelulares (MACASKIE et
al, 1987; PETTERSON et al, 1985; TYNECKA et al, 1981).
26
Estes diferentes mecanismos são hipóteses encontradas na literatura para explicar as
diferenças de toxicidade observadas em certos metais e, podem ter um papel significativo nos
impactos ambientais (BABICH & STOTZKY, 1980).
Um metal complexado com um organismo apresenta-se, em geral, com diferente nível
de toxidez que o apresentado na forma livre (BABICH & STOTZKY, 1983; SPOSITO,
1983).
Há consideráveis diferenças na produção de compostos complexantes, dependendo da
fase de crescimento do organismo; células em fase exponencial do crescimento produzem
materiais complexantes diferentes daqueles formados na fase estacionária (GADD, 1990).
Os agentes quelantes microbiológicos não precisam, necessariamente, ser liberados
dentro do meio, mas, podem permanecer em compartimentos intracelulares, e na superfície
externa da célula, por exemplo, na forma, de polissacarídeos ou, polímeros. Eles podem fazer
parte da parede celular ou, apresentar-se na forma de cápsula, agindo como eficientes
compostos biosorventes (BEVERIDGE, 1989; KAPLAN et al, 1987; MACASKIE et al,
1987).
Em alguns casos, a adsorção é seguida de internalização de um outro complexo, via
processo ativo como é o caso de metais essenciais e, alguns metais tóxicos ou, por processo
de difusão passiva o qual se acredita ser a rota de adsorção para a maioria dos metais tóxicos
(GADD, 1990).
1.3 Trealose
A exposição de leveduras a ambientes poluídos com metais pesados é um forte
estímulo nocivo. Para sobreviver nesta nova situação à célula deverá se adaptar e, sobreviver.
Caso a adaptação não seja eficaz, a célula morrerá. Um dos mecanismos pelos quais leveduras
se tornam mais resistentes e, se adaptam a uma situação nociva, é o acúmulo de trealose
intracelular. Assim, optamos pela determinação de trealose como sendo um dos marcadores
de estresse. A trealose é um dissacarídeo não redutor constituído de duas unidades de glicose.
Originalmente, a trealose, juntamente com o glicogênio, eram considerados carboidratos
de
reserva para os microorganismos, porém, nas últimas duas décadas, vários autores
demonstram que a trealose possui, além da função de reserva, a função de proteção das
células durante processos de estresse, tais como altas temperaturas, choque osmótico,
exposição ao etanol e desidratação
(VAN LAERE, 1989). A trealose é o carboidrato menos
27
reativo e mais estável da natureza (PANEK, 1995). Este açúcar tem sido implicado na
sobrevivência sob varias condições estressantes, agindo como um protetor das membranas
(CROWE et al, 1984; LESLIE et al, 1995), assim como um soluto compatível ou, como
carboidrato de reserva. As células em fase estacionaria e, aquelas crescendo em fontes de
carbono não fermentáveis são naturalmente mais resistentes aos estresses e, possuem maior
nível de trealose (VAN DIJCK et al, 1995). Na levedura Saccharomyces cerevisiae, a trealose
pode constituir mais de 23% do peso seco da célula, dependendo das condições de
crescimento e, do estagio do ciclo celular (THEVELEIN, 1984). O acúmulo de trealose que
ocorre com a presença de um agente estressante, às vezes, é dependente do tempo de
exposição.
O papel protetor da trealose pode ser demonstrado quando aumenta a temperatura do
meio de incubação de 30ºC para 40ºC, este aumento de temperatura promove o acúmulo de
trealose em leveduras. Posteriormente, se essas leveduras, com alto teor de trealose, forem
transferidas para uma temperatura de 55
0
C (temperatura letal) observa-se que, uma grande
proporção das células sobrevive ao que antes era uma temperatura letal (NEVES et al, 1991).
Existe uma forte associação entre elevados teores de trealose e à resistência das
leveduras ao congelamento, fato de grande importância no fermento da indústria de
panificação que é comercializado congelado (HINO et al, 1990).
A sobrevivência das células depende de sua capacidade em monitorar o meio
ambiente extracelular e, rapidamente, responder com modificações que permitam uma melhor
sobrevida na nova situação. Normalmente, alterações nas condições físicas ou, químicas do
meio ambiente das células, levam ao imediato bloqueio no crescimento celular e,
desencadeiam uma série de respostas celulares que são essenciais para a sobrevivência. Estas
respostas compreendem a imediata produção de compostos chamados de solutos compatíveis
como a trealose. O termo soluto compatível se deve ao fato que mesmo acumulando em altas
concentrações o soluto não interfere no metabolismo normal da célula.
A síntese de trealose é o resultado da ação de vias que detectam o estresse e,
sinalizam vias metabólicas que induzirão a expressão de genes, cujos produtos podem conferir
proteção às células.
Nas leveduras, a trealose é formada no citosol por uma reação em duas etapas (CABIB
& LELOIR, 1958). Essa reação é conduzida por um complexo de três subunidades: uma
subunidade catalítica que é a trealose-6-fosfato sintase codificada pelo gene TPS1 (BELL et
al, 1998), uma subunidade que é a trealose-6-fosfato fosfatase codificada pelo gene TPS2 (DE
28
VIRGILIO et al, 1993), a maior subunidade codificada redundantemente por 2 genes, TSL1
(trealose sintase de cadeia longa) e TPS3 com atividade regulatória (VUORIO et al, 1993). As
duas enzimas envolvidas neste processo são dependentes de Mg
2+
(ELLIOT et al, 1996). As
subunidades TPS3 e TSL1 sintetizam proteínas responsáveis pela estabilização do complexo
(BELL et al, 1998). A trealose-6-fosfato sintase pode funcionar independentemente do
complexo (BELL et al, 1998). Os genes que codificam os componentes do complexo são
induzidos por estresse (DE VIRGILIO et al, 1993; WINDERICKX et al, 1996).
O complexo trealose sintase/fosfatase também está envolvido com a regulação do
influxo de glicose para a célula. A deleção do gene TPS1 causa uma série de problemas
regulatórios tais como: ativação da frutose-1,6-bifosfatase, inativação da H
+
-ATPase da
membrana plasmática, inativação do sistema de captação de potássio, perda da atividade da
piruvato descarboxilase, diminuição do conteúdo de trealose em fontes de carbono não
fermentáveis, hiperacúmulo de açúcares bifosfatados, diminuição gradual do pool de
polifosfatos, acidificação intracelular, etc (VAN AELST et al, 1993).
A quebra da trealose em 2 moléculas de glicose é realizada pela trealase ácida ou,
vacuolar, codificada pelo gene ATH1 e, pela trealase neutra ou, citosólica codificada pelo
gene NTH1. Atualmente, com a nova classificação proposta a denominação seria: trealase
neutra ou citosólica e trealase ácida ou extra celular (PARROU et al, 2005). A trealase ácida
possui atividade ótima em pH 4,0 e 5,0 (LONDESBOROUGH & VUORINO, 1984) e, sua
atividade é detectada apenas quando a célula entra nas fases respiratória e estacionária ou,
quando a célula cresce em um substrato não fermentável, como o etanol e o glicerol (SAN
MIGUEL & ARGUELLES, 1994). A atividade da trealase neutra ocorre em pH 6,7 e 7,0
(LONDESBOROUGH & VUORINO, 1984) e sua atividade é regulada por mecanismos de
fosforilação dependentes de cAMP (COUTINHO et al, 1992). A atividade desta enzima é alta
na fase exponencial, quando os níveis de trealose são baixos e, em presença de açúcares
fermentáveis, por exemplo, a glicose (NEVES & FRANÇOIS, 1992).
O acúmulo de trealose esta relacionado com o jejum de glicose, nitrogênio e fosfato
(LILLIE & PRINGLE, 1980) assim como na proteção contra estresse de desidratação e
dessecação (D’AMORE et al, 1991; GADD et al, 1987), congelamento (LEWIS et al, 1995),
estresse térmico (DE VIRGILLO et al, 1994; LEWS et al, 1995; NEVES et al, 1991; NEVES
& FRANÇOIS, 1992), osmóticos (HOUNSA et al, 1998) e, produtos químicos como etanol
(LUCERO et al, 2000; MANSURE et al, 1994; RIBEIRO et al, 1999), metais pesados
(ATTFIELD, 1987), radicais de oxigênio (BENAROUDJ et al, 2001) e, pressão hidrostática
29
(FERNANDES et al, 2001). O conteúdo de trealose em uma levedura é provavelmente um
dos mais importantes fatores que afetam a resistência das leveduras durante a liofilização e,
subseqüente reidratação. Nestes casos, o aumento dos níveis de trealose está intimamente
relacionado com o aumento da viabilidade, apesar de em alguns casos, como o estresse
osmótico, tolerância ao etanol e, pH extremos, o glicerol parece estar mais intimamente
envolvido (HOUNSA et al, 1998; SIDERIUS et al, 2000).
De maneira geral, células com alto conteúdo de trealose são mais resistentes a várias
situações nocivas. A presença de metais pesados é um desses fatores que, quando presentes no
ambiente, a célula deve monitorar e, desencadear mecanismos de proteção (ATTFIELD,
1987).
1.4 Bioremediação
As atividades antropogênicas resultam na poluição do meio ambiente urbano e rural
criando vastas áreas que não são seguras ou, não podem ser habitadas, isto sem considerar os
grandes desastres ambientais como Chernobyl e o vazamento de óleo do cargueiro Exxon
Valdez. Assim, a remediação é um grande negócio no mundo todo. Os EUA possuem cerca
de 12.000 sítios listados como contaminados e, a Europa possui cerca de 400.000 destes
sítios. Estima-se que devam existir ainda milhares de sítios não oficiais (WATANABA,
2001). O mercado da remedição em 1998 movimentou cerca de 15-18 bilhões de dólares
(WATANABA, 2001). A maior parte da remediação é de água subterrânea e de solo. Muitas
áreas são contaminadas com uma combinação de metais pesados e compostos orgânicos,
muitos destes sítios também apresentam a presença de radionuclídeos. A remediação
convencional envolve a remoção do contaminante do local e, disposição do mesmo em outro
local. Por exemplo, solo contaminado é escavado e, posteriormente, substituído por outro.
Água contaminada é bombeada, o poluente removido por métodos tais como filtração.
Claramente estas tecnologias não fazem a remediação da contaminação, elas simplesmente
removem a mesma de um local para outro ou, o transformam de um estado para outro (por
exemplo de líquido para gás). Desta forma, os projetos de remedição podem levar décadas
para se completarem, são muito difíceis, podem deixar contaminação residual
(WATANABA,
2001).
É neste contexto problemático que desponta a tecnologia da remediação com materiais
biológicos (microrganismos como bactérias, fungos, leveduras, algas ou, plantas) ou seja, a
bioremediação. A bioremediação pode ser feita in situ ou, ex situ. A bioremediação de
30
compostos orgânicos pode ser mais rápida que as técnicas convencionais e, principalmente,
pode não deixar contaminação residual. Microrganismos e plantas podem ser usados para
retirada de metais pesados da água ou, do solo mas, eles devem ser dispostos usualmente por
incinerados ou, cimentados (no caso de radionuclídeos). A EPA (Environmetal Protection
Agency dos EUA) estima que a fitoremediação pode economizar de 50 a 80% do gasto com
tecnologias convencionais (WATANABA, 2001).
A bioremediação é uma tecnologia para remoção e, recuperação de metais pesados,
de áreas contaminadas. COSSICH et al 2000 definiram bioremediação como sendo “um
processo onde se utiliza sólidos de origem vegetal ou, microrganismos, na retenção, remoção
ou recuperação de metais pesados de um ambiente líquido”. A bioremediação tem recebido
grande atenção, tanto como novidade científica, como também pela possível aplicação na
indústria. Entretanto, como tecnologia, a bioremediação não é nova. Por exemplo, o uso de
compostagem na agricultura e, os tratamentos do esgoto residenciais são técnicas que tem por
base o uso de microrganismos para catalisarem transformações químicas. Estas técnicas de
manejo do meio ambiente vem sendo aplicada pela humanidade desde os primórdios da
civilização, seu uso é anterior à descoberta da existência dos microrganismos. Os romanos
usavam a biolixiviação para recuperação de cobre nas minas da Espanha, na época em que seu
império se estendia a esta região. O cientista Paracelsus (1493-1541) descreveu em sua época
a biolixiviação, ou seja, a recuperação de cobre de minas (OLSON et al, 2003).
O mais
‘moderno” uso da bioremediação vem de 100 anos atrás , com a abertura da primeira planta
para tratamento biológico do esgoto em Sussex, em 1891, na Inglaterra.
Atualmente, a bioremediação é usada comercialmente para retirar uma limitada gama
de contaminantes, principalmente os hidrocarbonos encontrados na gasolina. Entretanto, os
microrganismos têm a capacidade de biodegradar praticamente todos os contaminantes
orgânicos e muitos inorgânicos
(NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1993).
Nos dias atuais, o Departamento de Estado dos EUA possui um programa específico
denominado NABIR (Natural and Accelerated Bioremediation Research) que explora o
potencial bioremediador com o intuito de encontrar solução para meio ambiente contaminado
por metais ou radionuclídeos.
Novo mesmo é o termo bioremediação que apareceu na literatura científica em 1987
(PALMISANO & HAZEN, 2003).
A bioremediação é o uso de microrganismos para diminuir, eliminar ou conter
compostos nocivos e/ou radioativos à níveis seguros no meio ambiente. Enquanto a
31
bioremediação de compostos orgânicos envolve sua transformação em produtos menos
tóxicos ou, não tóxicos, como CO
2
. A bioremediação de metais e radionuclídeos envolve sua
remoção da fase aquosa para reduzir o risco para os seres humanos e para o meio ambiente.
Microrganismos podem diretamente transformar os metais ou, radionuclídeos, pela mudança
do seu estado de oxidação para uma forma reduzida que permita sua imobilização. Os
microrganismos também podem indiretamente imobilizar metais e radionuclídeos através da
redução para íons inorgânicos que, por sua vez, reduz quimicamente os contaminantes para
formas menos móveis. A estabilidade a longo termo destes contaminantes é desconhecida.
Outros mecanismos pelos quais os microrganismos podem influenciar a mobilidade incluem:
alteração de pH, oxidação, e complexação (PALMISANO & HAZEN, 2003).
Os microrganismos incluindo bactérias, algas, fungos filamentosos e leveduras são
bioremediadores eficientes.
A capacidade de concentração de metais apresentada por certos fungos e leveduras
vem sendo utilizadas na extração de espécies metálicas, em meio aquoso. Dessa maneira, há
grande interesse na utilização de biomassa para a biosorção e, detoxificação de efluentes
industriais, removendo componentes metálicos deles.
A relação entre vários microrganismos e os metais pesados é bem documentada. O
estudo das interações entre as leveduras e, os metais pesados têm um alto interesse científico.
Entre os fungos, as leveduras, principalmente a levedura Saccharomyces cerevisiae, são as
mais exploradas cientificamente, devido ao fato de serem organismo de fácil manipulação
genética, rápido ciclo de vida e, crescimento em meios de custo relativamente baixo, e assim
servir de excelente modelo para o estudo de muitos problemas importantes na biologia dos
eucariotos (BROCK et al, 1984). As leveduras são também conhecidas por acumular grandes
quantidades de metais pesados de meio aquoso (GADD, 1986).
As técnicas convencionais empregadas para a remoção de metais de efluentes
industriais são compostas pelo uso de técnicas de precipitação química, trocas iônicas,
(KEFALA et al, 1999; KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995), processo de osmose reversa
(KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995), oxidação e redução química, filtragem, tratamento
eletroquímico, evaporação ou, extração por solventes (WAIHUNG et al, 1999), no entanto, o
custo destes processos é muito elevado (VEGLIO & BEOLCHINI, 1997). Métodos como
precipitação química e, extração por solventes, empregam uma grande quantidade de
reagentes químicos que, às vezes resolvem o problema do metal, mas, criam o problema do
rejeito destes químicos usados nestes métodos.
32
A bioremediação, ou seja, a remoção de metais pesados do meio ambiente por
microrganismos, é realizada por meio de mecanismos físico-químicos, como adsorção, ou
dependentes de atividade metabólica, como transporte. Algumas interações físico-químicas
podem estar indiretamente ligadas ao metabolismo, especialmente via síntese de constituintes
celulares ou, metabólitos que podem atuar como eficientes quelantes de metais, tais como:
glutationa, fitoquelatinas e metalotioneínas (VOLESKY & MAY-PHILLIPS, 1995).
Outros processos de acúmulo de metais por microrganismos são seqüestro e,
transporte, precipitação e reações de óxido-redução. O acúmulo de metais por via passiva,
adsorção e/ou complexação é denominado de biosorção. Entretanto, se esse acúmulo depender
da atividade metabólica do microrganismo, trata-se, então, de bioacumulação.
Para as leveduras, a toxicidade dos metais pesados, modifica a atividade biológica de
componentes celulares como ácidos nucléicos, enzimas, aminoácidos e lipídeos (BRENNAN
& SCHIESTL, 1996; ROMANDINI et al, 1992). Íons metálicos podem ter efeitos tóxicos
quando se acumulam em níveis extremamente altos. Excesso de Fe e Cu podem gerar espécies
reativas de oxigênio que degradam macromoléculas como DNA, proteínas e lipídeos. Os
metais podem também inibir processos bioquímicos competindo com outros íons pelo sítio
ativo das enzimas, transportadores intracelulares e, outros ligantes de importância biológica
(ALBERTINI, 1999; ASSMANN et al, 1996; SILVA, 2001), entre outros. Assim, a
bioacumulação é a retenção e concentração de uma substância dentro do organismo. Na
bioacumulação o soluto é transportado do lado de fora da célula através da membrana celular
e, no citoplasma é seqüestrado. Biosorção é associação da substância com a superfície celular.
Sorção não requer o metabolismo celular ativo (PALMISANO & HAZEN, 2003).
Na biosorção os microrganismos seqüestram o metal através de ligações de superfície,
entretanto, no processo de bioacumulação, os metais são concentrados através de uma
combinação de reações de superfície como precipitação e formação de complexo intra e
extracelulares (VOLESKY, 1990c). Porém, existem limitações práticas significativas para
sistemas que empregam a bioacumulação, tais como: a inibição do crescimento celular
quando a concentração dos íons dos metais torna-se muito elevado ou, a elevada toxicidade
das águas como, extremos de pH e, altas concentrações de sais. O processo ativo de
bioacumulação também requer fornecimento de nutrientes adequados, aeração e temperatura
para o crescimento dos microrganismos (VOLESKY, 1990c). No entanto, o fato que muitos
locais onde se realizam tratamentos convencionais de esgoto, acabem se tornando habitat de
33
microrganismos, sugere que tais limitações não impossibilitam sua aplicação em sistemas
envolvendo a bioacumulação de metais pesados (DÖNMEZ & AKSU, 1999).
Microrganismos exibem a propriedade de adsorver, em sua superfície celular, metais
pesados e, entre eles, fungos e leveduras apresentam maior tolerância para metais tóxicos
podendo desenvolver-se em meios com altas concentrações desses elementos. Além disso, o
pequeno tamanho das células microbianas fornece uma razão alta entre área da superfície e
volume, isto implica em uma grande superfície de contato com o ambiente, portanto,
possibilidade maior em adsorver ou, incorporar o metal (KURODA & UEDA, 2003).
Uma outra característica importante de muitas leveduras é a sua capacidade de se
desenvolver em condições adversas como pH extremos e, altas temperaturas, tolerando
condições ambientais extremas.
A somatória dessas características, alta tolerância a metais pesados e, desenvolvimento
sob condições adversas, faz das leveduras importantes adsorventes na remoção de metais
tóxicos. È importante ressaltar que a biomassa microbiana é capaz de acumular metais
estando vivas ou mortas (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995).
A abundante biomassa de fungos produzida como sub-produto, em processos
industriais, em larga escala, pode ser uma fonte economicamente viável de biosorventes de
metais. A transformação da biomassa residual em biosorvente de metais, não apenas reduz
drasticamente o custo de produção do biosorvente, mas, também, reduz o custo da disposição
do resíduo de biomassa proveniente de indústrias, como por exemplo, para os fungos
utilizados na produção de ácidos orgânicos (WAIHUNG et al, 1999; KAPOOR &
VIRARAGHAVAN, 1995), ou para as leveduras produzidas pela indústria sucro-alcooleira
brasileira, veja abaixo.
O Programa Nacional do Álcool (PROÁLCOOL) iniciou-se no Brasil em 1975 e,
estimulou o desenvolvimento da agroindústria sucro-alcooleira. Como conseqüência, muitos
produtos advindos desta agroindústria passaram a ser produzidos. Dentre esses produtos
destaca-se a grande produção da levedura Saccharomyces cerevisiae usada para fermentar o
caldo da cana de açúcar. A levedura Saccharomyces cerevisiae pode ser obtida nas destilarias
depois de ter sido usada como fermento para a produção de álcool. De cada litro de álcool
produzido sobram cerca de 30 gramas de peso seco de levedura. A produção anual de álcool
brasileiro é de cerca de 15 bilhões de litros, assim, o resíduo de leveduras pode ser estimado
em cerca de 450 mil toneladas. Estima-se que em 1996/1997 foram comercializadas cerca de
34
25.000 toneladas de leveduras a um preço médio de aproximadamente R$ 300,00 por tonelada
de levedura. (DEL RIO, 2004).
Especificamente, no estado de Minas Gerais, o agronegócio da cachaça desempenha
um importante papel para milhares de propriedades rurais do interior do estado. Em termos
econômicos, os 8.466 alambiques mineiros, apontados pelo SEBRAE, geram cerca de
240.000 empregos, diretos e indiretos. De acordo com as informações do SEBRAE, o estado
de Minas Gerais, produz anualmente cerca de 180 milhões de litros de cachaça. Acredita-se
que este dado esteja subestimado, em função da elevada taxa de clandestinidade do setor
(SEBRAE, 2004). Grande parte dos alambiques mineiros concentram-se nas regiões Norte,
Jequitinhonha e Rio Doce, regiões economicamente carentes, onde qualquer nova fonte de
renda tem grande impacto social (SEBRAE, 2004). Estes dados dão a dimensão da quantidade
de leveduras que são produzidas no estado de Minas Gerais e, que a biomassa residual pode
vir a ter outra destinação.
O interesse, por parte das indústrias, na utilização da biomassa, só será possível se
forem comprovados o baixo custo, e a eficácia do processo. O baixo custo dependerá de uma
produção em larga escala, razão pela qual este trabalho optou por verificar o potencial da
biomassa produzida pelos alambiques de cachaça. A eficácia da metodologia dependerá de
trabalhos que comprovem que a biomassa de leveduras remove quantidades razoáveis de
metal, razão pela qual foi realizado o presente trabalho.
35
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O elevado desenvolvimento industrial ocorrido nas últimas décadas tem sido um dos
principais responsáveis pela contaminação de nossas águas, solos e ar, seja pela negligência
no seu tratamento antes de despejá-las nos rios ou, por acidentes e, descuidos cada vez mais
freqüentes, que propiciam o lançamento de muitos poluentes em todos os ambientes.
Dentre estes poluentes podemos citar os metais pesados como causador de grande
problema para a saúde humana. Metais pesados são elementos químicos, de peso atômico
relativamente alto que, em concentrações elevadas, são muito tóxicos a vida. As atividades
industriais têm introduzido metais pesados nas águas, numa quantidade muito maior do que
aquela que seria natural, causando poluição. Basta lembrar que os metais pesados fazem parte
dos despejos de grandes indústrias, em todos os países do mundo. Dentre os metais
considerados mais perigosos para a saúde humana, estão o mercúrio, o cádmio, cromo e o
chumbo. Todas as formas de vida são afetadas pela presença de metais dependendo da dose e,
da forma química. Muitos metais são essenciais para o crescimento de todos os tipos de
organismos, desde as bactérias até o ser humano, mas, eles são requeridos em concentrações
traços acima das quais podem danificar sistemas biológicos.
O cádmio é um metal pesado, extremamente tóxico, tanto para o homem quanto, para
o meio ambiente. Sua utilização tem sido crescente para a produção de pigmentos para tintas,
plásticos, baterias e depósitos eletrolíticos. Em função desse fato, o tratamento do rejeito
metálico deve ser feito antes do descarte em efluentes líquidos. Normalmente, este tratamento
é feito por métodos químicos, que podem ser eficazes, mas, a um custo elevado, que muitas
vezes inviabiliza seu uso. Na procura de novas alternativas a bioremediação, ou seja, o uso de
materiais biológicos ou, organismos como bactérias, fungos, leveduras, algas e plantas têm
sido muito estudadas.
A detoxificação de efluentes industriais usando biomassa só será possível se forem
comprovados o baixo custo e, a eficácia do processo. O baixo custo do material bioabsorvente
dependerá de sua produção em larga escala. Assim, este trabalho optou por verificar o
potencial da biomassa de leveduras produzida pelos alambiques de cachaça, uma vez que,
regionalmente, esta é uma atividade economicamente importante no estado de Minas Gerais e,
no âmbito do país, existe uma grande produção de leveduras pela industria sucro-alcooleira.
Da mesma forma que, usamos leveduras isoladas da fermentação da cachaça, avaliamos
36
também, a capacidade de leveduras isoladas de diversos nichos ecológicos regionais em
incorporarem o cádmio.
A eficácia da metodologia usando leveduras como material bioabsorvente dependerá
de trabalhos que comprovem que estes microrganismos removem quantidades razoáveis de
metal, razão pela qual, o presente trabalho mediu vários parâmetros nas células e parâmetros
da captação do metal. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial bioremediador
de leveduras isoladas da fermentação da cachaça e, de ambientes regionais, para uso como
material absorvente de cádmio de efluentes líquidos.
37
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar o potencial das leveduras isoladas da fermentação da cachaça e, de nichos
ecológicos regionais, para captação de cádmio, em condições laboratoriais.
3.2 Objetivo específico
- Usar diversas linhagens de leveduras isoladas da fermentação da cachaça e,
leveduras de gêneros e espécies diversos, isolados de nichos ecológicos da
região, que possam ser capazes de captar maior quantidade de cádmio.
- Verificar a influência da exposição a concentrações crescentes do cloreto de
cádmio sobre crescimento, tolerância das leveduras, e os níveis de trealose das
células.
- Verificar a influência de diferentes composto de cádmio na incorporação do
metal pelas células.
- Verificar a influência do tempo de exposição das leveduras, ao cádmio, na
incorporação do metal.
- Determinar a influência da massa celular na captação de cádmio.
- Determinar a influência do ciclo de vida das leveduras (fase exponencial ou
estacionária) sobre a captação de cádmio.
- Determinar o mecanismo mais eficaz usado pela levedura para captação do
cádmio: mecanismo passivo ou ativo, usando células viáveis e, não viáveis.
- Comparar as linhagens isoladas da fermentação da cachaça e, de nichos
regionais, com linhagens de leveduras de laboratório: Saccharomyces cerevisiae
W303-WT e Saccharomyces cerevisiae S288C sob vários aspectos acima
mencionados.
38
4 METODOLOGIA
4.1 Linhagens Estudadas
Neste trabalho foram usadas 17 linhagens diferentes de leveduras, sendo que, 11
linhagens foram de Saccharomyces cerevisiae, nove isoladas de destilarias produtoras de
cachaça, do Estado de Minas Gerais. Duas linhagens são linhagens de laboratório:
Saccharomyces cerevisiae W303-WT e Saccharomyces cerevisiae S288C.
As leveduras foram obtidas da coleção do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia
do Departamento de Microbiologia do ICB/UFMG do professor Carlos Augusto Rosa. Toda
metodologia de coleta, isolamento e identificação das leveduras estão descritas em MORAIS
et al, 1997 e, PATARO et al, 2000. As leveduras foram isoladas e caracterizadas por métodos
convencionais (YARROW, 1998)
e, as identidades foram verificadas usando as chaves para
classificação taxonômica de KURTZMAN & FELL 1998.
39
Tabela 1: Linhagens utilizadas nesse estudo
Células
Destilaria/Origem
Cidade/Local
Região
Saccharomyces cerevisiae
W303-WT
Linhagem de laboratório
(MAT
α
ade2-1 can1-100
trp1-1 his3-11, 15 leu2-3,
112 ura3-1).
-
-
Saccharomyces cerevisiae S288C
Linhagem de laboratório
(MATa
his3
∆
1 leu2
∆
0
ura3
∆
0 met15
∆
0).
-
-
Saccharomyces cerevisiae 1011
Destilaria Seleta Boazinha
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 1978
Destilaria Galo Bravo
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2041
Destilaria José Cruz
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2049
Destilaria Sebastião
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2057
Destilaria Derci
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2062
Destilaria Déia
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2089
Destilaria Preciosa
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2097
Destilaria Seleta Boazinha
Salinas
Jequitinhonha
Saccharomyces cerevisiae 2464
Destilaria Seleta Boazinha
Salinas
Jequitinhonha
Starmerela meliponinorum
UFMG-J26.1
Isolada de pólen da abelha
Tetragonisca angustula em
uma colméia
Betim
Pq. Est. do Rio Doce
Pichia guilliermondii DC123.1
Isolada de Drosophila spp
Estação ecológica UFMG
Pq. Est. do Rio Doce
Pichia membranaefaciens DC 63.3
Isolada de Drosophila spp
Estação ecológica UFMG
Pq. Est. do Rio Doce
Pichia kluyvera DC 44.3
Isolada de Drosophila spp
Estação ecológica UFMG
Pq. Est. do Rio Doce
Candida cylindracea DC 44.2
Isolada de Drosophila spp
Estação ecológica UFMG
Pq. Est. do Rio Doce
Candida sorboxylosa DC 64.1
Isolada de Drosophila spp
Estação ecológica UFMG
Pq. Est. do Rio Doce
40
4.2 Meios de Cultura
Todos os experimentos foram realizados em meio de cultura líquido YPG (glicose
2%, extrato de levedura 1%, peptona 2%) quando era necessário usar placas com meio sólido,
adicionava-se 2% de ágar, ao meio YPG.
4.3 Manutenção das linhagens de levedura no laboratório
Usamos três técnicas diferentes para armazenagem das leveduras no laboratório:
-Armazenamento das células em óleo mineral na geladeira:
Uma alça contendo células foram inoculadas em tubos contendo meio YPG sólido,
previamente inclinado. Após 48 horas a 30
0
C, acrescentava-se, à superfície das leveduras,
óleo mineral esterilizado. Os tubos eram estocados a 4
0
C.
-Manutenção em placas de petri:
As leveduras foram mantidas em placas de petri contendo meio sólido YPG e, repicadas
periodicamente, a partir do original mantido em tubo inclinado com óleo mineral. As placas
também foram mantidas na geladeira.
-Manutenção em meio glicerol:
As linhagens foram pré-crescidas em meio YPG, sob agitação, a 30
0
C, coletadas em fase
estacionárias, por centrifugação e, resuspensas em meio contendo 1% extrato de levedura, 2%
peptona, 25% de glicerol. 1 ml deste meio contendo as células, foi transferido para tubos
criogênicos e, estocados em freezer a -70
0
C.
4.4 Protocolo Experimental
As células foram pré-incubadas a uma temperatura de 30
0
C, agitadas a 160 rpm
(rotação por minuto) por um período de aproximadamente 15 horas em meio líquido YPG.
Em seguida, o meio foi centrifugado (5 min,1000 g), o sobrenadante descartado e, as células
transferidas para um novo meio líquido YPG, por um período de 3 horas. Usávamos este
período de 3 horas para que as células entrassem em fase exponencial de crescimento. A fase
exponencial do crescimento era verificada pela presença de glicose no meio. A presença de
glicose foi verificada com o uso de fitas indicadoras de glicose na urina. De acordo com a
necessidade experimental, as células eram incubadas em meio YPG acrescido de
concentrações pré-estabelecidas de cloreto de cádmio. O cloreto de cádmio foi autoclavado
41
isoladamente, em solução aquosa concentrada e, depois adicionado ao meio YPG.
Posteriormente, as células foram incubadas em meio YPG a 30
0
C, sob agitação a 160 rpm,
durante períodos de tempo preestabelecidos. O tempo de incubação e, a concentração de
cloreto de cádmio foi variável, de acordo com a necessidade de cada experimento. Após o
tempo estabelecido, as células foram coletadas por filtração a vácuo usando filtros de
nitrocelulose de 0,45
µ
m de porosidade, 47 mm de diâmetro. As células foram lavadas duas
vezes com água destilada fria. A massa celular foi removida do filtro com espátula,
transferida para pedaços de papel alumínio, congeladas em nitrogênio líquido e, estocadas em
freezer –20
0
C. Posteriormente, esta massa celular congelada foi utilizada para as dosagens
desejadas.
4.5 Curva de crescimento das leveduras
Para a curva de crescimento das leveduras, um pré-inóculo de cada linhagem foi
crescido por cerca de 15 horas a 30
0
C, a 160 rpm, em meio YPG. Após este período,
verificava-se a densidade óptica da cultura em espectrofotômetro, a 660 nm. Uma amostra foi
inoculada em novo meio YPG, incubada sob agitação, a 30
0
C. Nos tempos pré estabelecidos,
uma alíquota, usualmente, 100
µ
l, foi retirada e, colocada em 900
µ
l de água. O crescimento
foi seguido pela medida da turbidez da suspensão, a 660 nm, em espectrofotômetro. Caso
necessário, eram feitas diluições em água para registro da turbidez.
4.6 Teste de tolerância ao cádmio.
As células foram pré-incubadas a uma temperatura de 30
0
C, a 160 rpm, por um
período de aproximadamente 15 horas, em meio YPG líquido. Em seguida, o meio foi
centrifugado (5 min, 1000g), o sobrenadante descartado e, as células transferidas para novo
meio líquido YPG durante 3 horas. Posteriormente, foi feita a contagem das células utilizando
a câmara de Neubauer. Após
a contagem, 300
µ
l meio YPG, contendo 1 x 10
6
células/ml,
foram colocados em poços de uma placa de metal. Em seguida, adaptou-se a parte superior da
placa de metal que, consistia em uma peça com hastes metálicas, encaixando em cada poços.
Após 3 minutos, a temperatura ambiente, a parte superior da placa foi retirada e, colocada
sobre meio sólido YPG contendo concentrações crescentes de cloreto de cádmio. As placas de
petri com meio sólido YPG e, cloreto de cádmio, permaneceu a temperatura ambiente, por
quatro dias. Após este tempo, foram comparados o crescimento das células nas placas com
42
cádmio e, na ausência de cádmio (controle). A comparação foi realizada com base na
inspeção visual para determinação das linhagens que formaram colônias nas placas.
4.7 Testes de Indução da Resistência
Para a realização deste experimento as células foram pré-incubadas a 30
0
C, 160 rpm,
por um período de aproximadamente 15 horas em meio líquido YPG, sendo transferidas por
centrifugação, para um novo meio líquido YPG, por um período de 3 horas. Em seguida, as
células foram transferidas para meio YPG contendo 2,5 ppm de cloreto de cádmio. Após 8
horas nestas condições, foram acrescentados mais 50 ppm cloreto de cádmio ao meio que já
continha 2,5 ppm de cloreto de cádmio. As incubações prosseguiram por mais 7 horas, a
30
0
C, sob agitação. Em paralelo, foram mantidas incubações controles (ausência de cloreto de
cádmio e, incubações com 2,5 e, 50 ppm de cloreto de cádmio). Posteriormente, foi
determinada a turbidez a 660 nm, para verificação do crescimento e, as células foram
coletadas para determinação dos níveis de trealose.
4.8 Dosagem de trealose
Após realização do protocolo experimental desejado, as células congeladas em
nitrogênio líquido foram transferidas para tubos cônicos, mantidos em gelo, e pesadas. Em
seguida, foram resuspensas em 1 ml de Na
2
CO
3
0,25 M homogeneizadas em vórtex, fervidas
durante 20 minutos e, centrifugadas durante 5 minutos a 1000 g. Após esta etapa, 200
µ
l do
sobrenadante foi acidificado com ácido acético 1,2N (concentração final de 0,30N) até pH
5,0-5,5 (verificado com fita indicadora de pH) e, tamponado com 300mM de acetato de sódio
contendo 30 mM de CaCl
2
(concentração final 75mM acetato sódio + 7,5 mM CaCl
2
)
.
A
solução foi misturada em vórtex e, 100
µ
l da mistura foi usada para a determinação da
trealose. A trealose foi determinada enzimaticamente com uma preparação de trealase
extraída do fungo Humícola grisea var. thermoidea. A reação foi realizada durante 2 horas a
40°C. Após este período, usou-se 50
µ
l desta solução para dosagem da glicose formada. A
glicose formada foi determinada com auxílio de um Kit comercial da Bioclin (Glicose GOD –
Clin). A reação desenvolveu-se a 37
0
C, durante 15 minutos. O produto colorido formado foi
determinado em espectrofotômetro a 505nm. Todos as dosagens foram realizadas em
duplicatas. Para cada amostra foram realizadas incubações paralelas, na presença de trealase
desnaturada, para verificação de possível contaminação por glicose do meio. Uma unidade de
43
trealase foi definida como a quantidade de enzima que liberou 1
µ
mole de glicose/g de peso
úmido.
A quantificação de trealose acumulada foi realizada utilizando metodologia descrita
por NEVES et al (1994).
4.9 Extração da trealase do
Humicola grisea
A trealase foi extraída do fungo Humicola grisea var. thermoidea, cultivado em ágar
aveia (farinha de aveia 4%, ágar 1,8%, em de água de torneira), durante 20 dias a 40
0
C. Após
esse período, os frascos foram deixadas durante 5 dias a temperatura de 4
0
C, procedimento
que aumenta a quantidade de trealase a ser extraída. Adicionou-se aos erlemeyers, 10 ml de
água destilada e, raspou-se a superfície do ágar com bastão de vidro. A suspensão formada foi
filtrada em funil contendo gaze em seu interior. Posteriormente, a suspensão foi centrifugada
a 1000 g por 40 min. Adicionou-se ao sobrenadante 1% de Kaolin (silicato de alumínio
hidratado/Sigma) e a mistura foi deixada à temperatura ambiente durante 20 minutos com
agitação esporádica. A solução foi centrifugada por 20 minutos a 1000 g, o sobrenadante foi
dialisado toda noite contra H
2
O à 4
0
C. A suspensão foi distribuída em tubos e, congelada.
Para cada lote de enzima preparada, foram realizados testes da atividade, utilizando como
padrão a trealose comercial (Sigma) nas concentrações de 2, 5, 10 mM.
4.10 Determinação de cádmio incorporado pela célula
Usamos a análise por ativação neutrônica para determinação do cádmio incorporado
pelas células. A análise por ativação neutrônica tem sido reconhecida como uma das mais
importantes ferramentas analíticas na determinação da composição química elementar em
teores de traços. A técnica tem como princípio à indução de radioatividade artificial, em uma
amostra, através da irradiação com nêutrons e, posterior medida da atividade induzida
mediante a detecção da radiação gama. Os fenômenos físicos, na qual está fundamentada esta
análise são, as propriedades do núcleo, radioatividade e, a interação da radiação com a
matéria, via reação neutrons-gama (n,
γ
). Os raios gama emitidos, denominados de raios gama
de decaimento, possuem energias que são características de cada radionuclídeo. Assim,
quando detectados por espectroscopia gama, podem ser utilizados para identificar e,
quantificar os elementos químicos presentes em uma amostra. Cerca de 70% dos elementos
químicos naturais tem propriedades nucleares adequadas para a ativação neutrônica. A análise
44
por ativação neutrônica é multielementar isto é, a irradiação da amostra e, a espectroscopia
gama é um processo inerentemente multisotópicos, sendo possível determinar grande número
de elementos simultaneamente (cerca de 30 elementos). A técnica apresenta baixa ocorrência
de interferências, pois, diversas combinações de tempo de irradiação, decaimento e,
contagem, bem como seleção de diferentes energias gama para contagem após a irradiação,
podem ser empregadas. A técnica da ativação neutrônica é muito seletiva, elementos difíceis
de serem analisados por técnicas analíticas convencionais, são relativamente fáceis de serem
analisados, por ativação neutrônica. Entre esses elementos destacam-se as terras raras, os
metais preciosos e alguns tóxicos, como o antimônio e arsênio. A seletividade é devida
principalmente às propriedades nucleares diferentes para elementos com propriedades
químicas semelhantes. A sensibilidade da técnica é grande e depende de muitos parâmetros
experimentais que podem ser ajustados, bem como, de parâmetros nucleares e, do fluxo de
nêutrons no reator. Devido a grande sensibilidade, pequenas quantidades de amostra são
necessárias, em alguns casos são suficientes poucos miligramas. Isto é uma grande vantagem
em análises de pequenas quantidades de amostras ou, de amostras preciosas.
A técnica tem capacidade de análise de matrizes no estado sólido, líquido e gasoso: a
reação nuclear (n,
γ
) independe do estado físico da matriz. O método é não destrutivo, a
amostra não é visualmente ou, quimicamente, alterada.
A análise por ativação neutrônica, quando adequadamente executada, é um dos
métodos analíticos mais precisos e exatos. Isto a torna uma importante ferramenta analítica
para certificação, calibração e intercomparação de amostras em teores traços e ultratraços.
No decorrer dos anos, esta técnica vem apresentando notáveis progressos devido aos
avanços computacionais, manuseio automático de amostras, desenvolvimento de detectores de
Germânio intrínseco e, de instrumentos eletrônicos apropriados (IAEA-TECDOC 435, 1987;
IAEA-TECDOC 564, 1990; EHMANN & VANCE, 1991; KRUGER, 1971; DE SOETE et al,
1972).
A ativação neutrônica é realizada em reatores de pesquisas. No Brasil, apenas dois
Centros de Pesquisas utilizam a ativação neutrônica, o Centro de Desenvolvimento da
Tecnologia Nuclear (CDTN), em Belo Horizonte e o Instituto de Pesquisas Energéticas e
Nucleares (IPEN), em São Paulo, ambos pertencentes à Comissão Nacional de Energia
Nuclear (CNEN).
O Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear possui o reator TRIGA IPR-1,
dotado de mesa giratória e, dispositivo de irradiação especialmente apropriado para esta
45
técnica analítica. Durante a irradiação, a mesa gira em torno do núcleo do reator a uma
velocidade constante, de modo a garantir um fluxo de nêutrons uniforme nas amostras.
Atualmente, a potência do reator é de 100 kW e nesta potência o fluxo de nêutrons atinge um
valor em torno 6,6
×
10
11
n/cm
-2
s
-1
. A meia-vida do
115
Cd é de 2,2 dias (MENEZES et al,
2003).
46
5 RESULTADOS
Nossa primeira abordagem foi verificar qual influência teria a presença de cádmio na
curva de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT, linhagem de
laboratório.
As células da linhagem Saccharomyces cerevisiae W303-WT em condição controle
(ausência de cádmio) apresentou o perfil de crescimento esperado: aumento do número de
células,
a medida em que o tempo progride, o aumento progressivo da concentração de
cádmio utilizada (2 ppm a 50 ppm) diminuiu o crescimento das leveduras (Figura 1). Após 2
horas as células controle cresceram, permanecendo em fase exponencial por um período de 20
horas. Células expostas à concentração de 2 ppm de cloreto de cádmio tiveram seu
crescimento reduzido em comparação com as células controle porém, em comparação com as
demais concentrações (5 ppm a 50 ppm), as células expostas a 2 ppm de cloreto de cádmio,
cresceram mais rapidamente. Na presença de 50 ppm de cloreto de cádmio o crescimento foi
lento, e após 22 horas as células tinham crescido cerca de 25% do obtido pelas células
incubadas na ausência de cloreto de cádmio (controle).
Após verificar que a linhagem Saccharomyces cerevisiae W303-WT responde à
presença de cloreto de cádmio com reflexo pronunciado no crescimento, decidiu-se, verificar
se a presença de cádmio teria influência sobre o acumulo de trealose (Figura 2).
Observou-se na Figura 2 que os níveis de trealose nas células aumentaram em
presença de cloreto de cádmio, quando comparados com as células em condições controle
(ausência de cloreto de cádmio). Observou-se (Figura 2) que à medida que aumenta a
concentração de cádmio aumentaram os níveis de trealose.
As células em condição controle foram coletadas em fase exponencial de
crescimento, portanto, não apresentaram níveis de trealose elevados. Pode-se constatar, no
entanto, que a presença de cloreto de cádmio fez com que ocorresse uma elevação nos níveis
de trealose quando concentrações crescentes deste composto químico foram adicionadas.
Durante a exposição das células a concentrações de 50 ppm a 850 ppm de cloreto de
cádmio, os níveis de trealose aumentaram progressivamente à medida que aumentou-se as
concentrações de cloreto de cádmio. Na concentração de 1000 ppm os níveis de trealose
foram inferiores aos obtidos das concentrações de 850 ppm, 750 ppm e 500 ppm. Tal
47
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Tempo (Horas)
Crescimento (D.O 660nm)
Controle
2 ppm
5 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
50 ppm
Figura 1 - Influência de diferentes concentrações de cloreto de cádmio no crescimento da
levedura
Saccharomyces cerevisiae
W303-WT (linhagem de laboratório).
As células da linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT foram incubadas a
30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca de 15 horas em meio YPG. Posteriormente, foram
transferidas, por centrifugação, para um novo meio YPG, permanecendo por 3 horas nas
mesmas condições acima especificadas. Após este período, o meio foi dividido e, a cada
parte, acrescentou-se a concentração de cádmio discriminada. A condição controle foi
realizada em ausência de cloreto de cádmio. As células permaneceram incubadas em presença
de cloreto de cádmio nos tempos discriminados, quando uma amostra foi retirada para análise
da turbidez. As determinações foram realizadas no espectrofotômetro a 660nm.
48
0
10
20
30
40
50
0
2
4
6
8
Tempo (Horas)
Trealose ( moles de glicose liberada/g
de peso úmido)
Controle
50 ppm
100 ppm
175 ppm
350 ppm
500 ppm
750 ppm
850 ppm
1000 ppm
Figura 2 - Influência das concentrações crescentes de cloreto de cádmio sobre os níveis
de trealose.
As células da linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT foram incubadas a
30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca de 15 horas, em meio YPG. Posteriormente, as células
foram coletadas por centrifugação e transferidas para um novo meio YPG permanecendo por
3 horas nas mesmas condições acima especificadas. Após este período, o meio foi dividido e,
a cada parte, acrescentou-se as concentrações de cloreto de cádmio discriminadas. A condição
controle foi realizada em ausência de cloreto de cádmio. As células permaneceram nestas
condições por um período de 8 horas. Nos tempos determinados, amostras foram coletadas
por filtração, congeladas em nitrogênio líquido e, estocadas em freezer. Posteriormente, a
massa celular foi submetida à extração para dosagem de trealose, segundo metodologia
previamente descrita. Os valores de trealose foram expressos em
µ
moles de glicose liberada
por grama de peso úmido.
49
resultado demonstrou que quanto maiores as concentrações do cloreto de cádmio utilizadas,
maiores foram os níveis de trealose acumulados. A exposição das células à concentração de
1000 ppm de cloreto de cádmio foi muito tóxica para as células, não sendo possível sintetizar
trealose.
O próximo passo foi verificar qual concentração de cádmio permitia o crescimento e
a reprodução das células. Observando a
Tabela 2, verificou-se que todas as leveduras usadas
foram capazes de formar colônias em concentrações de até 15 ppm de cloreto de cádmio, com
exceção da linhagem de laboratório Saccharomyces cerevisiae W303-WT.
As linhagens Pichia kluyvera e Pichia guilliermondii, não cresceu a uma
concentração de 50 ppm
de cloreto de cádmio.
As linhagens que cresceram na concentração de ate 50 ppm de cloreto de cádmio
foram: Starmerela meliponinorum, Candida cylindracea, Pichia membranaefaciens, e todas
as linhagens de leveduras Saccharomyces cerevisiae isoladas da fermentação da cachaça:
Saccharomyces cerevisiae 1011, Saccharomyces cerevisiae 1978, Saccharomyces cerevisiae
2041, Saccharomyces cerevisiae 2049, Saccharomyces cerevisiae 2057, Saccharomyces
cerevisiae 2062, Saccharomyces cerevisiae 2089, Saccharomyces cerevisiae 2097,
Saccharomyces cerevisiae 2464 (Tabela 2).
A única linhagem que cresceu e, reproduziu em presença de até 100 ppm de cloreto
de cádmio foi a da levedura Starmerela meliponinorum.
Nenhuma das linhagens testadas cresceu nas concentrações de 500 ppm 1000 ppm e
2000 ppm de cloreto de cádmio (resultados não mostrados).
Após constatarmos que o cloreto de cádmio provocou diminuição no crescimento da
cultura de células (Figura 1), estimulou a síntese de trealose (Figura 2) e interferiu na divisão
e reprodução das diversas linhagens de leveduras (Tabela 2), foram realizados experimentos
para verificar se a forma química, sob a qual o cádmio era apresentado às células, teria
influência nos níveis de trealose (Figura 3) e na sua incorporação (Figura 4). Para tanto,
adicionou-se ao meio de incubação contendo células da linhagem Saccharomyces cerevisiae
W303–WT, 300 ppm de cada um dos seguintes compostos químicos: cloreto de cádmio,
óxido de cádmio, acetato de cádmio, nitrato de cádmio e sulfato de cádmio.
Observa-se, na Figura 3, que os níveis de trealose aumentaram nas células expostas a
300 ppm dos cinco tipos de sais de cádmio, se comparado com os dados obtidos nas células
controle (ausência de sais de cádmio).
50
Tabela 2 - Teste de tolerância das leveduras ao cádmio
Linhagens / ppm CdCl
2
0
5
10
15
20
50
100
250
Saccharomyces cerevisiae W303-WT
C
C
C
N
N
N
N
N
Saccharomyces cerevisiae 1011
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 1978
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2041
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2049
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2057
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2062
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2089
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2097
C
C
C
C
C
C
N
N
Saccharomyces cerevisiae 2464
C
C
C
C
C
C
N
N
Starmerela meliponinorum
C
C
C
C
C
C
C
N
Candida cylindracea
C
C
C
C
C
C
N
N
Candida sorboxylosa
C
C
C
C
C
C
N
N
Pichia guilliermondii
C
C
C
C
C
N
N
N
Pichia kluyvera
C
C
C
C
C
N
N
N
Pichia membranaefaciens
C
C
C
C
C
C
N
N
Legenda: C= crescimento, N= não crescimento.
As células de leveduras das diferentes linhagens foram incubadas a 30
0
C, sob agitação (160
rpm), por cerca de 15 horas em meio YPG. Após este período foram centrifugadas e,
transferidas para um novo meio (YPG) permanecendo nas mesmas condições acima
especificadas por 3 horas. Após este período 1 x 10
6
células/ml foram colocada na placa de
poços e, plaqueadas em meio sólido YPG contendo concentrações crescentes de cloreto de
cádmio (5 ppm á 250 ppm). As placas foram deixadas á temperatura ambiente por quatro dias.
O crescimento das colônias nas placas foram analisados por inspeção visual, comparando o
crescimento das colônias da placa controle com o crescimento das colônias expostas a
diferentes concentrações de cloreto de cádmio.
51
0
5
10
15
20
0
2
4
Tempo (horas)
Trealose ( moles de glicose liberada/g
de peso úmido)
Controle
cdcl2
oxido Cd
acetato Cd
Nitrato Cd
Sulfato Cd
Figura 3 -
Determinação da quantidade de trealose acumulada na levedura
Saccharomyces cerevisiae
W303-WT após exposição a diferentes compostos
de cádmio
As células da linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT foram incubadas a
30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca de 15 horas em meio YPG. Após este período, o meio
foi dividido e, a cada parte acrescentou-se 300 ppm dos seguintes reagentes químicos: cloreto
de cádmio, óxido de cádmio, acetato de cádmio, nitrato de cádmio e sulfato de cádmio. A
condição controle foi realizada em ausência de cádmio. As células permaneceram nestas
condições por um período de 4 horas. Nos tempos determinados, amostras foram coletadas
por filtração, congeladas em nitrogênio líquido e, estocadas em freezer. Posteriormente, a
massa celular foi submetida à extração para dosagem de trealose, segundo metodologia
previamente descrita. Os valores de trealose foram expressos em
µ
moles de glicose liberada
por grama de peso úmido.
52
0
500
1000
1500
2000
2500
0
2
4
Tempo (horas)
µµ
g Cádmio incorporado /g de peso
úmido de célula
Controle
cdcl2
oxido Cd
acetato Cd
Nitrato Cd
Sulfato Cd
Figura 4 - Determinação da quantidade de cádmio incorporado na linhagem
Saccharomyces cerevisiae
W303-WT
As células da linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT foram incubadas a
30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca de 15 horas em meio YPG. Posteriormente, as células
foram coletadas por centrifugação e, transferidas para um novo meio YPG, permanecendo por
3 horas nas mesmas condições acima especificadas. Após este período, o meio foi dividido e,
a cada parte foram acrescentados 300 ppm dos seguintes reagentes químicos: cloreto de
cádmio, óxido de cádmio, acetato de cádmio, nitrato de cádmio e sulfato de cádmio. A
condição controle foi realizada em ausência de cádmio. As células permaneceram nestas
condições por um período de 4 horas. Nos tempos determinados, amostras foram coletadas
por filtração, lavadas por três vezes com água destilada, congeladas em nitrogênio líquido e,
estocadas em freezer. Posteriormente, a massa celular foi pesada e enviada ao Reator Triga
para irradiação e, subseqüente determinação da quantidade de cádmio incorporado pelas
células. Os valores foram expressos em
µ
grama de cádmio incorporado por grama de peso
úmido de células.
53
Em seguida, foram determinadas as quantidades de cádmio incorporadas pelas
células quando o metal era apresentado sob diferentes formulas química (Figura 4). Houve
incorporação dos cinco diferentes sais de cádmio pela linhagem de células de leveduras
Saccharomyces cerevisiae W303-WT.
O cloreto de cádmio e o óxido de cádmio proporcionaram, relativamente, uma maior
incorporação do metal, pelo tempo estudado. O cloreto de cádmio também possui uma
vantagem na indução da síntese de trealose, em relação aos demais sais de cádmio estudados.
Decidiu-se, no entanto em usar o cloreto de cádmio em todos os experimentos que serão
descritos a seguir.
Para verificar se era possível induzir a resistência ao cloreto de cádmio foram usadas
células da linhagem Saccharomyces cerevisiae W303-WT. As células foram incubadas em
ausência de cloreto de cádmio e, em presença de 2,5 ppm e 50 ppm de cloreto de cádmio
durante 15 horas (Figura 5A e Figura 5B).
Verificou-se, no período de 8 horas, que as células em condição controle cresceram
sem qualquer problema (Figura 5A). Na presença de 2,5 ppm de cloreto de cádmio o
crescimento foi inibido cerca de 27%. Na presença de 50 ppm de cloreto de cádmio o
crescimento foi inibido em cerca de 55% em relação ao crescimento das células em condições
controle. Após este período de 8 horas, a incubação realizada na presença de 2,5 ppm de
cloreto de cádmio foi dividida ao meio. Parte continuou na mesma condição (2,5 ppm) e, à
outra parte, foram adicionados 50 ppm de cloreto de cádmio. As células que receberam mais
50 ppm de cloreto de cádmio tiveram o crescimento reduzido em relação às que
permaneceram em 2,5 ppm de cloreto de cádmio porem, esta redução do crescimento não
chegou aos patamares determinados para o crescimento das células que permaneceram
durante todo do experimento com 50 ppm de cloreto de cádmio.
Este resultado mostrou que o pré-tratamento com baixas concentrações de cloreto de
cádmio proporcionou uma vantagem para as células quando estas foram expostas a
concentrações mais elevadas deste metal. Comparando-se com o controle observou que a
presença de 2,5 ppm de cloreto de cádmio fez com que os níveis de trealose fossem mais
altos.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0
3
6
9
12
15
Tempo (Horas)
Crescimento (D.O 660nm)
Controle
2,5ppm
50ppm
2,5+50ppm
A linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT foi incubada a 30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca de 15 horas, em
meio YPG. Posteriormente, foi transferida por centrifugação para um novo meio YPG permanecendo por 3 horas nas mesmas condições
acima especificadas. Após este tempo, o meio foi dividido em 3 partes; uma parte continuou em YPG (controle), uma parte adicionou-se 2,5
ppm de cloreto de cádmio e, a outra parte, adicionou-se 50 ppm de cloreto de cádmio. Após 8 horas nestas condições, a incubação com 2,5
ppm de cloreto de cádmio foi subdividida. Parte continuou na mesma situação, ou seja, com 2,5 ppm de cloreto de cádmio e, à outra parte,
adicionou-se mais 50 ppm de cloreto de cádmio. As células permaneceram incubadas nas condições acima descritas e, nos tempos
discriminados, amostras foram retiradas para análise da turbidez. As determinações foram realizadas no espectrofotômetro a 660nm (parte A)
e para determinação dos níveis de trealose acumulados (parte B). Os valores de trealose foram expressos em
µ
moles de glicose liberada por
grama de peso úmido.
0
10
20
30
40
50
0
3
6
9
12
15
Tempo (Horas)
Trealose (
µµ
moles de glicose
liberada/g de peso úmido)
Controle
2,5ppm
2,5+50ppm
50ppm
Figura 5B
Figura 5B - Níveis de trealose acumulados por células incubadas em
presença de cádmio.
Figura 5 A- Pré-adaptação das células de leveduras em
presença de cloreto de cádmio.
55
Neste mesmo experimento, em que se verificou o crescimento das células adaptadas
a baixas concentrações de cloreto de cádmio, houve coleta de amostras para determinar os
níveis de trealose nestas mesmas células (Figura 5A e Figura 5B). Como era previsto as
células controle (ausência de cloreto de cádmio) não sintetizaram trealose, pois, durante este
tempo não foram submetidas a nenhuma situação de estresse, estavam em presença de glicose
e, em fase exponencial de crescimento. A elevação dos níveis de trealose foi baixa quando as
células da linhagem Saccharomyces cerevisiae W303 -WT foram incubadas em presença de
baixas concentrações de cloreto de cádmio (2,5 ppm), porém, as células expostas a uma
concentração mais elevada de cloreto de cádmio (50 ppm), quando comparadas as que
estavam incubadas diretamente com 2,5 ppm de cloreto de cádmio, tiveram um aumento
acentuado nos níveis de trealose.
As células que ficaram expostas por um período de 8 horas a 2,5 ppm de cloreto de
cádmio e, posteriormente, adicionou-se mais 50 ppm do metal, apresentaram um acentuado
aumento nos níveis de trealose, em relação às células que permaneceram com 2,5 ppm de
cloreto de cádmio por 15 horas, porém, em relação às células que ficaram incubadas com 50
ppm de cloreto de cádmio, pelo mesmo período de tempo, o aumento nos níveis de trealose
foram irrelevantes.
Os resultados obtidos usando as células da linhagem de Saccharomyces cerevisiae
W303-WT (linhagem de laboratório) foram claros: a presença de cádmio na concentração de
2,5 ppm diminuiu o crescimento em cerca de 40%, em 15 horas (Figura 5A) e, a presença de
cádmio, em qualquer das concentrações usadas, elevou a síntese de trealose (Figura 2). Nos
interessamos em saber qual seria o comportamento de outras leveduras isoladas da
fermentação da cachaça e, da nossa região, frente ao cádmio, pois, é bem conhecido, que
microrganismos usados em processos de fermentação estão sujeitos a uma grande flutuação
de parâmetros químicos, físicos e biológicos e, são muito resistentes a todos os estresses. Por
exemplo, durante a fermentação do caldo de cana para a produção da cachaça, as leveduras
têm contato com a grande quantidade de açúcar presente no mosto, estes altos níveis de
sacarose promovem um forte estresse osmótico nestas células. Outros exemplos de estresses
que ocorrem durante o desenvolvimento da fermentação da cachaça são os estresses térmicos,
quando a temperatura nas dornas de fermentação pode atingir 41
0
C durante o verão e, o
estresse alcoólico, quando, à medida que, se desenvolve a fermentação, o teor alcoólico vai
aumentando. As leveduras apesar de estarem sujeitas a este conjunto de estresses
desenvolvem muito bem a fermentação, pois, estão adaptadas a desenvolverem tal tarefa. A
56
partir desta observação a idéia foi a seguinte: o uso de leveduras isoladas da fermentação de
cachaça ou, isoladas diretamente do meio ambiente, poderia ser mais resistentes à presença de
cádmio? Para tanto foi realizado o experimento apresentado na Figura 6, onde verificamos a
influência de 500 ppm de cloreto de cádmio, durante 3 horas, sobre o crescimento de
diferentes gêneros e espécies de leveduras.
A Figura 6 mostrou que 500 ppm de cloreto de cádmio reduziu o crescimento em
todas as linhagens, porém não inibiu completamente. Algumas linhagens como
Saccharomyces cerevisiae 1011 Saccharomyces cerevisiae 2041 foram mais sensíveis a
presença desta concentração de cloreto de cádmio, enquanto outras do mesmo gênero e
espécie foram mais resistentes (Ex. Saccharomyces cerevisiae 1978). A linhagem Pichia
guilliermondii mostrou um discreto crescimento a 500 ppm de cloreto de cádmio, mas a
linhagem Pichia kluyvera teve seu crescimento afetado por esta concentração de cloreto de
cádmio. As linhagens Candida cylindracea e Candida sorboxylosa apresentaram crescimento
superior ao das linhagens do gênero Pichia, permanecendo mais próximas ao crescimento das
linhagens do gênero Saccharomyces.
A habilidade em crescer nesta concentração de cloreto de cádmio não tem qualquer
relação com o gênero e, espécie utilizada, aparentando ser um fenômeno acidental referente à
linhagem em questão.
O experimento apresentado na Figura 7 foi realizado para verificar se as leveduras
isoladas do meio ambiente também respondem à presença de cádmio aumentando os níveis de
trealose, tal como a linhagem de laboratório (Figura 2).
Nas linhagens Saccharomyces cerevisiae, praticamente não houve síntese de trealose
nas células incubadas em presença de 500 ppm de cloreto de cádmio em relação às células
controle (ausência de cloreto de cádmio), mas, as linhagens Starmerela meliponinorum,
Pichia guilliermondii, Pichia membranaefaciens, Pichia kluyvera, Candida sorboxylosa e
Candida cylindracea apresentaram níveis de trealose elevados em relação às células controles
e, as demais linhagens do gênero Saccharomyces (Figura 7).
Concluímos com este resultado que a concentração elevada de cloreto de cádmio
(500 ppm) fez com que algumas linhagens tivessem dificuldade de acumular altos níveis de
trealose. Porém, foi possível aumentar experimentalmente os níveis de trealose em algumas
das linhagens utilizando 500 ppm de cloreto de cádmio, durante as 3 horas de exposição a este
composto químico.
57
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
S. cerevisiae W303-WT
S. cerevisiae 1011
S. cerevisiae 1978
S. cerevisiae 2041
S. cerevisiae 2049
S. cerevisiae 2057
S. cerevisiae 2062
S. cerevisiae 2089
S. cerevisiae 2097
S. cerevisiae 2464
S. meliponinorum
C. cylindracea
C. sorboxylosa
P. guilliermondii
P. kluyvera
Crescimento (D.O 660nm)
Controle
Ausência de Cd 3 hs
500 ppm de Cd 3 hs
Figura 6 - Influência de 500 ppm de cádmio no crescimento de diferentes leveduras.
As células das diferentes leveduras foram incubadas a 30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca
de 15 horas em meio YPG. Após este período, as células foram transferidas por centrifugação,
para um novo meio YPG permanecendo por 3 horas nas condições acima citadas. Ao término
deste período amostras foram coletadas para determinação da D.O. (controle), e os meios
foram divididos. Parte da incubação recebeu 500 ppm de cloreto de cádmio e parte seguiu
sem adição de cloreto de cádmio (Ausência de cloreto de cádmio 3 horas). As células
permaneceram nestas condições por 3 horas quando amostras foram retiradas para análise da
turbidez. As determinações foram realizadas no espectrofotômetro a 660nm.
58
0
5
10
15
20
25
30
35
40
S. cerevisiae 1011
S. cerevisiae 1978
S. cerevisiae 2041
S .cerevisiae 2049
S. cerevisiae 2057
S. cerevisiae 2062
S. cerevisiae 2089
S. cerevisiae 2097
S. cerevisiae 2464
S. meliponinorum
C. cylindracea
C. sorboxylosa
P. guilliermondii
P. kluyvera
P. membranaefaciens
trealose (
µµ
moles de glicose
liberada/g de peso úmido)
cont 0 hs
Ausência de Cd 3 hs
500 ppm deCd 3 hs
Figura 7 - Influência de 500ppm de cloreto de cádmio nos níveis de trealose de diferentes
linhagens de leveduras
.
As células das diferentes leveduras foram incubadas a 30
0
C, sob agitação (160 rpm) por cerca
de 15 horas em meio YPG. Após este período, as células foram transferidas por centrifugação,
para um novo meio YPG permanecendo por 3 horas nas condições acima citadas. Ao término
deste período, amostras foram coletadas para dosagem de trealose (controle), e os meios
foram divididos. Parte da incubação recebeu 500 ppm de cloreto de cádmio e, parte seguiu
sem adição de cloreto de cádmio (Ausência de cloreto de cádmio 3 horas). As células
permaneceram nestas condições por 3 horas quando amostras foram coletadas por filtração,
congeladas em nitrogênio líquido e, estocadas em freezer. Posteriormente, a massa celular foi
submetida à extração para dosagem de trealose, segundo metodologia previamente descrita.
Os valores de trealose foram expressos em
µ
moles de glicose liberada por grama de peso
úmido.
59
Após verificarmos que as leveduras isoladas da fermentação da cachaça e, do meio
ambiente, em linhas gerais, são mais resistentes à presença de cádmio, pois, conseguem
crescer e, se dividirem, em concentrações mais elevadas deste metal, quando comparadas com
a linhagem de levedura de laboratório Saccharomyces cerevisiae W303-WT (Tabela 2),
realizamos uma série de experimentos para conhecermos a capacidade das células, de
diferentes linhagens em levedura, em captarem o cádmio do meio extracelular e, acumularem
o metal no interior da célula.
Primeiramente, foi verificada qual quantidade de cádmio as células da linhagem
Saccharomyces cerevisiae W303-WT consegue captar do meio extracelular e, se está
incorporação era dependente do tempo e, da concentração de cádmio presente no meio. O
resultado está apresentado na Figura 8. As células em condições controle não acumularam
cádmio, pois não foram expostas a este metal. Ao serem expostas a concentrações que
variaram de 100 ppm á 1500 ppm de cádmio, verificamos que, o aumento da concentração de
cádmio, em relação ao aumento do tempo, fez com que houvesse maior incorporação de
cádmio (Figura 8). O que se concluiu, é que o aumento da captação de cádmio foi dependente
da concentração do metal e do tempo em que as células de leveduras permaneceram em
contato com este metal.
Para verificarmos se a proporção de massa celular é fator importante para que as
células incorporem cádmio, foram feitos experimentos com as células da linhagem de
levedura Saccharomyces cerevisiae S288C (linhagem de laboratório) utilizando massa
celulares crescentes, este experimento pode ser observado na Tabela 3. As diferentes
quantidades de células foram incubadas com uma mesma concentração de cádmio (300 ppm)
em um mesmo volume (50 ml) por um período de 24 horas. Observou-se que, apesar da
grande diferença entre as massas de células, os níveis de cádmio incorporados foram
similares, tendo poucas variações. Aparentemente, a quantidade de células não parece ser um
fator decisivo para a incorporação do metal.
Após a realização de experimentos avaliando a incorporação de cádmio em linhagem
de leveduras de laboratório (Figura 8 e Tabela 3), foram realizados experimentos para
verificar a incorporação de cádmio em diversas linhagens de leveduras. Verificamos
se, as
células das leveduras isoladas da fermentação de cachaça ou, do meio ambiente (Figura 9)
foram capazes de captarem mais cádmio que a linhagem de levedura de laboratório (Figura 9).
As células que permaneceram 3 horas em contato com o cádmio incorporaram menos
cádmio que as células que ficaram por 24 horas em contato com o metal.
60
0
2000
4000
6000
8000
10000
0
4
8
12
16
20
Tempo (horas)
g de cádmio acumulado/g
de peso úmido
Controle
100 ppm
500 ppm
750 ppm
1000 ppm
1500 ppm
Figura 8 -
Quantidade de cádmio incorporado pelas células da linhagem
Saccharomyces
cerevisiae
W303-WT (linhagem de laboratório)
A linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae W303-WT foi incubada a 30
0
C, sob
agitação (160 rpm) por cerca de 15 horas em meio YPG. Posteriormente, as células foram
coletadas por centrifugação e, transferidas para um novo meio YPG, permanecendo por 3
horas nas mesmas condições acima especificadas. Após este período, o meio foi dividido e, a
cada parte, acrescentou-se as concentrações especificadas de cloreto de cádmio. A condição
controle foi realizada em ausência de cádmio. As células permaneceram nestas condições
pelos seguintes tempos: 4, 8, 12, 16 e 20 horas quando as amostras foram coletadas por
filtração, lavadas três vezes com água destilada , congeladas em nitrogênio líquido e,
estocadas em freezer. Posteriormente, a massa celular foi pesada e, enviada ao Reator Triga
para irradiação e, subseqüente determinação da quantidade de cádmio incorporado pelas
células. Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio incorporado por grama de peso
úmido de células.
61
Tabela 3 - Influência de massas celulares crescentes na incorporação de cádmio.
Tempo (24horas)
Controle
0,77 gramas
de células
1,5 gramas
de células
2,8 gramas
de células
5 gramas
de células
Cd acumulado
ND
200
180
200
200
Legenda: ND = não detectado cádmio.
A linhagem de levedura Saccharomyces cerevisiae S288C foi incubada a 30
0
C, sob agitação
(160 rpm) cerca de 15 horas, em meio YPG. Posteriormente, foram transferidas para 50 ml de
meio YPG permanecendo por 3 horas. Após este período acrescentou-se uma concentração de
300 ppm de cádmio. As células permaneceram nestas condições por 24 horas quando as
amostras foram coletadas por filtração, lavadas três vezes com água destilada, congelada em
nitrogênio líquido e, estocadas em freezer. Posteriormente, a massa celular foi pesada e
enviada ao Reator Triga para irradiação e, subseqüente determinação da quantidade de cádmio
incorporado pelas células. Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio incorporado
por grama de peso úmido de células.
62
0
3000
6000
9000
S. cerevisiae S288C
S. cerevisiae 1978
S. cerevisiae 2041
S. cerevisiae 2464
S. meliponinorum
C. cylindracea
P. membranaefaciens
g de Cd
acumulado/g de peso úmido célula
50 ppm/Cd 3 hs
50 ppm/Cd 24 hs
100 ppm/Cd 3 hs
100 ppm/Cd 24 hs
Figura 9 – Influência do tempo de incubação com cádmio na incorporação do metal.
Células de diferentes linhagens de leveduras foram pré-incubadas cerca de 15 horas
em meio líquido YPG, sob agitação (160 rpm), a 30
0
C. Foram transferidas, por centrifugação,
para um novo meio YPG, permanecendo nestas condições por 3 horas. Após este período as
incubações foram divididas em três, uma parte seguiu na mesma condição (controle), uma
parte acrescentou-se 50 ppm, a na outra 100 ppm de cloreto de cádmio. Após 3 horas e, 24
horas foram coletadas amostras por filtração, lavadas por três vezes com água destilada,
congelada em nitrogênio líquido e, guardadas no freezer. Posteriormente, a massa celular foi
pesada e enviada ao Reator Triga para irradiação e, subseqüente determinação da quantidade
de cádmio incorporado pelas células. Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio
incorporado por grama de peso úmido de células. Na condição controle (ausência de cádmio)
não foi detectado cádmio.
63
Neste experimento as linhagens de leveduras que apresentaram maior incorporação
de cádmio foram: Saccharomyces cerevisiae 2041, em seguida, Saccharomyces cerevisiae
1978 e, Saccharomyces cerevisiae 2064. Comparando-se todas as linhagens verifica-se que as
linhagens que
apresentaram a menor incorporação, nas condições usadas, foram o
Saccharomyces cerevisiae S288C (linhagem de laboratório) e Starmerela meliponinorum
(Figura 9).
Na Figura 9, sete linhagens diferentes de leveduras, foram incubadas com
concentrações de 50 ppm e, 100 ppm cádmio, observou-se que a concentração de cádmio
presente no meio extracelular tem influência na capacidade de incorporação do metal, pelas
diferentes linhagens de leveduras usadas. Também foi possível verificar que esta captação foi
dependente do tempo, quanto maior o tempo, maior a incorporação.
Os resultados apresentados na Figura 9 mostraram variações da incorporação de
cádmio que talvez pudessem ser dependentes da fase de crescimento, para observarmos o
fenômeno com maiores detalhes realizamos o experimento mostrado na Figura 10 onde, as
células de leveduras foram coletadas na fase estacionaria, e só depois entraram em contato
com o cádmio. Podemos observar que, quando as células foram inoculadas na fase
estacionária, em presença de cádmio, a incorporação de cádmio, pela maioria das leveduras,
foi menor que, quando as células cresceram na presença deste metal (Figura 9). Com exceção
da linhagem Saccharomyces cerevisiae 2041 que incorporou uma quantidade de cádmio
considerável, em relação a demais linhagens, nestas condições.
A incorporação de cádmio parece ser dependente da fase de crescimento em que se
encontram as células (Figura 9 e Figura 10).
Para compararmos o tipo de mecanismo de incorporação que estava sendo utilizado
pelas células das leveduras (passivo ou ativo), foram realizados experimentos contendo
células mortas após autoclavação. As biomassas não viáveis foram incubadas em meio
contendo 50 ppm de cádmio por um período de 48 horas (Tabela 4).
Como pode ser visto na Tabela 4, as células das diferentes linhagens de leveduras
não viáveis foram incubadas em presença de 50 ppm de cádmio, o objetivo foi analisar o tipo
de incorporação processada por estas linhagens: se foi incorporação passiva (método
independente do ciclo metabólico do microrganismo, o que caracteriza a biossorção –
VOLESKY 1990a) ou, incorporação ativa (depende do metabolismo da célula, transporte do
metal para o interior do citoplasma e organelas, o que caracteriza a bioacumulação –
VOLESKY 1990a). Comparando com os resultados da Figura 10 (célula em fase estacionária)
64
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
S. cerevisiae W303-WT
S. cerevisiae S.288C
S. cerevisiae 1978
S. cerevisiae 2041
S. cerevisiae 2464
S. meliponinorum
C. cylindracea
C. sorboxylosa
P. guilliermondii
P. kluyvera
P. membranaefaciens
µµ
g de Cd acumulada/g
de peso úmido
Figura 10 - Incorporação de cádmio em diferentes linhagens de leveduras coletadas em
fase estacionária.
As células das diversas linhagens de leveduras foram incubadas por cerca de 48
horas em meio YPG, sob agitação (160 rpm) a 30
0
C. Após este período, as culturas foram
divididas: parte continuou na mesma condição (controle) e, na outra parte foram adicionados
50 ppm de cloreto de cádmio. As células permaneceram nestas condições por mais 12 horas
sendo então coletadas por filtração, lavadas por três vezes com água destilada, congelada em
nitrogênio líquido e guardadas no freezer. Posteriormente, a massa celular foi pesada, enviada
ao Reator Triga para irradiação e, subseqüente determinação da quantidade de cádmio
incorporado pelas células de leveduras. Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio
incorporado por grama de peso úmido células. Na condição controle (ausência de cádmio) não
foi detectado cádmio.
65
Tabela 4 – Incorporação de cádmio pela biomassa não viável em diversas linhagens de
leveduras
Células
Controle
50 ppm de CdCl
2
Saccharomyces cerevisiae W303-WT
ND
3400
Saccharomyces cerevisiae 1011
ND
6900
Saccharomyces cerevisiae 1978
ND
5600
Saccharomyces cerevisiae 2041
ND
4000
Saccharomyces cerevisiae 2049
ND
4600
Saccharomyces cerevisiae 2057
ND
5500
Saccharomyces cerevisiae 2062
ND
5000
Saccharomyces cerevisiae 2089
ND
6100
Saccharomyces cerevisiae 2097
ND
4700
Saccharomyces cerevisiae 2464
ND
5500
Starmerela meliponinorum
ND
6200
Candida cylindracea
ND
3800
Candida sorboxylosa
ND
4200
Pichia guilliermondii
ND
5100
Pichia kluyvera
ND
2400
Pichia membranaefaciens
ND
3000
Legenda: ND = não detectado cádmio
As diversas linhagens de leveduras foram pré-incubadas em meio líquido YPG por cerca de
15 horas, sob agitação 160 rpm a 30
0
C. Foram transferidas para um novo meio YPG,
permanecendo nestas condições por 3 horas. Posteriormente, foram autoclavadas,
centrifugadas e incubadas em novo meio YPG com 50 ppm de cádmio. As células foram
incubadas por um período de 48 horas, coletadas por filtração, lavadas três vezes com água
destilada, congelada em nitrogênio líquido e, estocadas em freezer. Posteriormente, a massa
celular foi pesada e enviada ao Reator Triga para irradiação e, subseqüente determinação da
quantidade de cádmio incorporado pelas células. Os valores foram expressos em
µ
gramas de
cádmio incorporado por grama de peso úmido de células.
66
e os da Figura 9 (células em fase exponencial e estacionaria) podemos verificar que, a
incorporação de cádmio pelas células mortas foi maior, em relação às células vivas, dos
experimentos anteriores, quando foi utilizada a concentração de 50 ppm de cádmio.
Para facilitar a compreensão dos resultados e, as discussões, serão comparados
alguns resultados apresentados a seguir.
Na tabela 5 observou-se a incorporação de cádmio por diversas linhagens coletadas em
fase exponencial de crescimento e incubadas com três concentrações diferentes de cádmio (50
ppm, 100 ppm e 500 ppm). Observou-se (Tabela 5) que o aumento da concentração de cádmio
fez com que ocorresse um aumento na incorporação do metal para todas as linhagens, quando
colocadas na presença de concentrações crescentes de cádmio (50 ppm e 100 ppm). Quando
as células foram incubadas por seis horas na presença de 500 ppm de cádmio observou-se que
o mesmo fenômeno não se repetiu para a linhagem de leveduras Saccharomyces cerevisiae
1978 e Saccharomyces cerevisiae 2464, mostrando uma baixa incorporação de cádmio se
comparada com os dados obtidos após a exposição das células a 50 ppm e 100 ppm de
cádmio.
Comparando o tempo de incubação em que as células permaneceram em contato com
o cádmio (Tabela 6), observa-se que quanto maior o tempo que as células permaneceram em
contato com o cádmio, maior a incorporação do metal em todas as linhagens. As linhagens de
levedura Saccharomyces cerevisiae foram as que mais incorporaram cádmio nesta situação,
em seguida a linhagem de levedura Pichia membranaefaciens e por último a linhagem de
laboratório Saccharomyces cerevisiae S288C.
Observa-se na tabela 7 que, quanto maior o tempo de exposição das células ao cádmio,
maior a incorporação do metal por estas células. Com exceção da linhagem Saccharomyces
cerevisiae 2041 que, em 12 horas de incubação, incorporou mais que quando incubadas por
24 horas. As células não viáveis parecem ter, de fato, uma maior capacidade de incorporar o
metal, pois, o tempo de exposição ao cádmio, nestas condições foi de 12 horas, porém todas
as linhagens incorporaram muito mais cádmio nesta situação que, quando foram expostas
vivas, por um período de 24 horas. Verificamos na Tabela 7 a influência de 50 ppm de cádmio
em diferentes linhagens de leveduras, quando as células foram coletadas em três situações
diferentes. O que se conclui é que quando as diversas linhagens de leveduras foram expostas a
uma mesma concentração de cádmio (50 ppm), porém situações diferentes, a condição em que
as células mais incorporaram cádmio foi quando elas foram expostas ao metal após estarem
67
mortas. Observa-se na Tabela 7, que a situação em que as células menos incorporaram
cádmio foi quando expostas a este metal por um período de 3 horas.
A capacidade de captação de metais pesados por células mortas tem sido
extensivamente estudada. Já se sabe que a capacidade de incorporação de metais por células
mortas é maior que em células vivas (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995). O uso de
biomassa morta é mais viável para as industrias, pois oferecem maiores vantagens em relação
ao uso de biomassa viva. As células vivas são mais sensíveis quando expostas ao metal,
diversos fatores interferem para que ela se mantém viável, a toxidade do metal, o pH do meio
e a temperatura, são fatores que interferem na eficiência das células vivas em captarem mais
metal que as mortas. A biossorção de metais com células vivas, no entanto é mais
complicado.
Na tabela 8 observa-se que a incubação de células não viáveis, em presença de
cádmio, parece ser uma situação favorável para as células incorporarem o metal, pois, se
compararmos com um tempo maior de exposição ao metal (24 horas) e, maior concentração
de cádmio (100 ppm) a biomassa composta de células mortas incorpora mais cádmio que em
outra situação.
68
Tabela 5 – Influência da exposição a concentrações crescentes de cádmio na
incorporação do metal por diversas linhagens.
ND = Não Determinado cádmio.
Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio incorporado por grama de peso úmido de
células.
Os dados e as condições experimentais para 50 ppm 3 horas e 100 ppm 3 horas foram
retirados da Figura 9 e os de 500 ppm da Figura 7.
Células
50 ppm 3 hs
100 ppm 3hs
500 ppm 6 hs
Saccharomyces cerevisiae S288C
210
350
ND
Saccharomyces cerevisiae 1978
440
1200
250
Saccharomyces cerevisiae 2041
530
4900
12000
Saccharomyces cerevisiae 2464
910
1600
110
Starmerela meliponinorum
160
410
6000
Pichia membranaefaciens
190
350
ND
Candida cylindracea
440
730
4600
69
Tabela 6 – Influência do tempo de incubação das diversas linhagens em presença de 100
ppm de cádmio.
ND = Não Determinado cádmio.
Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio incorporado por grama de peso úmido de
células.
Os dados e as condições experimentais foram retirados da Figura 9.
Células/ Condições
100 ppm 3hs
100 ppm 24hs
Saccharomyces cerevisiae S288C
350
880
Saccharomyces cerevisiae 1978
1200
5600
Saccharomyces cerevisiae 2041
4900
8100
Saccharomyces cerevisiae 2464
1600
5400
Starmerela meliponinorum
410
1200
Pichia membranaefaciens
350
4300
Candida cylindracea
730
2800
70
Tabela 7 – Influência do tempo de incubação e, diferentes condições, na incorporação de
cádmio por leveduras expostas a de 50 ppm de cloreto de cádmio.
Células
1
50 ppm
3 hs
2
50 ppm
24 hs
3
50 ppm
12 hs
4
50 ppm 48 horas
Biomassa não viável
Saccharomyces cerevisiae W303-
WT
ND
ND
450
3400
Saccharomyces cerevisiae S288C
210
1500
720
ND
Saccharomyces cerevisiae 1978
440
1700
440
5600
Saccharomyces cerevisiae 2041
530
1400
2900
4000
Saccharomyces cerevisiae 2464
910
4300
600
5500
Starmerela meliponinorum
160
460
470
6200
Candida cylindracea
440
480
ND
3800
Pichia membranaefaciens
190
1700
ND
3000
ND = Não Determinado cádmio.
Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio incorporado por grama de peso úmido de
células.
Os dados e, as condições experimentais para 50 ppm (3 horas e 24 horas) foram retirados da
Figura 9. Dados e, as condições experimentais de 50 ppm,12 horas, foram retirados da Figura
10. Dados e, as condições experimentais 50 ppm, 48 horas (Biomassa não viável) foram
retirados da Tabela 4.
As células foram coletadas em diversas situações:
1- Células em fase exponencial de crescimento, incubadas por 3 horas em presença de 50
ppm de cádmio, após este período as células foram coletadas;
2- Células em fase exponencial de crescimento, incubadas por 24 horas em presença de
50 ppm de cádmio, e após este período as células foram coletadas;
3- Células em fase estacionaria (após 48 horas), em seguida acrescentaram-se 50 ppm de
cádmio. As células permaneceram em contato com o metal por 12 horas, sendo então
posteriormente coletadas;
4- Células incubadas durante 12 horas em meio YPG, em seguida foram autoclavadas,
após este procedimento, acrescentou se 50 ppm de cádmio. As células permaneceram
nesta situação por 48 horas, quando foram coletadas.
71
Tabela 8 – Influência do tempo de incubação e diferentes condições, na incorporação de
cádmio, por diferentes linhagens de leveduras, em presença de 50 ppm e 100 ppm de
cloreto de cádmio.
ND = Não Determinado cádmio.
Os valores foram expressos em
µ
gramas de cádmio incorporado por grama de peso úmido de
células.
Os dados e, as condições experimentais para 100 ppm (24 horas) foram retirados da Figura 9.
Dados e, as condições experimentais para 50 ppm 48 horas (Biomassa não viável) foram
retirados da Tabela 4.
Células
100 ppm 24 hs
50 ppm 48 hs
Saccharomyces cerevisiae S288C
880
ND
Saccharomyces cerevisiae 1978
5600
5600
Saccharomyces cerevisiae 2041
8100
4000
Saccharomyces cerevisiae 2464
5400
5500
Starmerela meliponinorum
1200
6200
Candida cylindracea
4300
3800
Pichia membranaefaciens
2800
3000
72
6 DISCUSSÃO
Neste trabalho estudamos vários parâmetros biológicos, fisiológicos e químicos para
seleção de leveduras que possam vir a ser eficientes na captação do cádmio de meios aquosos.
Os parâmetros biológicos estudados na levedura foram: crescimento das células em
cultura líquida, formação de colônias em meio sólido, tolerância ao cádmio, níveis de trealose
após exposição ao cádmio, indução da resistência ao metal, captação de cádmio pelas células.
Os parâmetros fisiológicos estudados na levedura foram: diferentes fases de crescimento das
células, densidade celular do inóculo, capacidade de captação do metal por células vivas e
mortas. Os parâmetros químicos estudados foram: diferentes concentrações de cádmio, forma
química do cádmio, tempo de exposição ao metal.
O estudo, primeiramente, foi realizado em linhagem de levedura de laboratório. O
objetivo foi possuir valores de referência capazes de nortear a busca por uma levedura
eficiente na captação do metal. Posteriormente, usamos leveduras empregadas na fermentação
da cachaça produzida na região de Minas Gerais e, leveduras isoladas de nichos ecológicos
regionais.
O cádmio foi o metal escolhido, pois, é um metal tóxico que está associado a vários
problemas de saúde (ATSDR, 1997; WHO, 1992). O cádmio está presente nas águas naturais
devido às descargas de efluentes industriais, principalmente nas galvanoplastias, produção de
pigmentos, soldas, equipamentos eletrônicos, lubrificantes e acessórios fotográficos. A
queima de combustíveis fósseis também é uma fonte de liberação de cádmio para o ambiente
(ILO, 1998; MEDITEXT, 2000).
Nos seres humanos, o cádmio pode apresentar efeito crônico, pois concentra nos rins,
fígado, pâncreas e na tireóide, e tem efeito agudo, sendo que uma única dose de 9,0 gramas
pode levar à morte (LÓPEZ-ALONSO et al, 2000).
O cádmio é um elemento com nenhuma função biológica, com a única exceção
conhecida da anidrase carbônica da alga Thalassiosira weissflogi (LANE et al, 2005) que é
dependente do metal. É tóxico mesmo em baixas concentrações. Todas as linhagens
estudadas, tanto de laboratório, como as linhagens isoladas da fermentação da cachaça ou, da
região, foram susceptíveis à presença de cádmio. Observamos na Figura 1 que a presença de
2,0 ppm de cloreto cádmio, interferiu no crescimento da linhagem de laboratório da levedura
Saccharomyces cerevisiae. Em todas concentrações usadas, superiores a 2,0 ppm de cloreto
73
de cádmio, houve uma grande inibição do crescimento no período de 28 horas em que foi
realizado o estudo. O mesmo efeito inibitório sobre o crescimento também foi verificado para
leveduras isoladas da fermentação de cachaça e da região (Figura 6).
GHARIEB (2001) trabalhando com o fungo Fusarium sp mostrou que a inibição do
crescimento aumenta com o aumento da concentração de cádmio no meio. De acordo com a
literatura, o efeito inibitório do cádmio sobre o crescimento celular se deve a vários fatores,
todos eles ligados ao bloqueio de grupos funcionais de moléculas importantes tais como:
enzimas, polinucleotideos, sistema de transportes de íons ou, nutrientes e, substituição de íons
essenciais em sítios ativos (GHARIEB, 2001).
O cádmio induz a formação de radicais livres, não pela reação de Fenton, mas, como
resultado de sua reação com grupos tiois. Estudos proteômicos realizados na levedura
Saccharomyces cerevisiae mostram que a expressão de muitas proteínas é alterada em
resposta ao cádmio, particularmente, enzimas responsáveis pela assimilação de sulfato,
proteínas de choque térmico, enzimas do estresse oxidativo, proteases e enzimas do
metabolismo de carboidratos. As modificações mais evidentes nas proteases e, enzimas do
metabolismo de carboidrato são o aparecimento de isoformas com baixo conteúdo de enxofre
que, são sintetizadas para ocuparem o lugar das enzimas pré-existentes. Na ausência de
cádmio, a quantidade de sulfato incorporado nestas proteínas é de 79% mas, na presença de
cádmio, diminui para 19%. Assim, os aminoácidos que possuem sulfato são direcionados para
a via de síntese de glutationa (GSH). O fato que estas novas enzimas terem menos
aminoácidos com sulfato, as deixa menos susceptíveis ao efeito deletério do cádmio, pois,
este agora se ligará com menos afinidade a elas, ficando livre (MENDOZA-CÓZATL et al,
2004). Linhagens Cd-resistentes de Saccharomyces cerevisiae ficam protegidas da toxicidade
do cádmio pela produção de grandes quantidades de metalotioneina e fitoquelatinas que ligam
o metal (GHARIEB, 2001).
Acredita-se que o efeito tóxico do cádmio seja também conseqüência de lesões
estruturais na membrana plasmática, possivelmente pela ligação a componentes orgânicos
como grupamentos sulfidrilas e, pela alteração na permeabilidade de íons essenciais como
Na
+
, K
+
, Mg
+2
e Ca
+2
. Estes íons estão presentes em relativamente altas concentrações nos
sistemas biológicos, são essenciais para diversas funções celulares incluindo formação de
cargas e, gradiente de concentração através de membranas que, são usados em processos de
transporte, respostas osmóticas, manutenção do pH citoplasmático, estabilização de
ribossomas, ácidos nucléicos e ativando enzimas que sintetizam DNA, RNA e proteínas
74
(GHARIEB, 2001). O transporte do cádmio do meio extracelular para o interior da célula
pode ser realizado em Saccharomyces cerevisiae através do transportador de zinco, isto graças
à semelhança de coordenação química entre os dois metais (GOMES et al, 2002).
Finalmente, podemos considerar que a toxicidade dos metais, nos organismos vivos,
envolve mecanismos oxidativos ou genotóxicos. Estes mecanismos oxidativos ou genotóxicos
se baseiam nas propriedades físicas e, químicas dos metais. Dependendo do metal existe um
mecanismo molecular. Na prática, até três mecanismos moleculares de toxicidade de metais
pesados são propostos: produção de espécies reativas por autooxidação e reação de Fenton
(Fe, Cu), bloqueio de grupos funcionais essenciais em biomoléculas (Cd, Hg), e deslocamento
de íons metálicos de biomoléculas (por exemplo, Cd substituindo Ca
+2
ou, Zn
+2
) (GOMES et
al, 2002; ALKORTA et al, 2004). Trabalhos indicam que a ação genotóxica do cádmio está
ligada a inativação dos sistemas de reparo, induzindo assim a hipermutabilidade
(MCMURARY & TAINER, 2003). De maneira geral, os sistemas de reparo do DNA
envolvem: reversão dos danos diretos, excisão de bases, excisão de nucleotídeos, reparo em
quebras de duplas fitas, e reparo “mismatch” (ou reparo de pareamento incorreto). Nos seres
humanos e, na levedura Saccharomyces cerevisiae, a ação do cádmio ocorre porque o metal,
especificamente inativa o sistema de reparo “mismatch”, não se tratando, portanto de uma
ação direta do metal sobre o DNA mas, e sim inibindo um tipo específico de reparo do DNA
(MCMURARY & TAINER, 2003).
O cádmio como um metal tóxico (ATSDR, 1997; WHO, 1992) e, não essencial, é um
forte agente causador de estresse (BRENNAN & SCHIESTL, 1996). As células respondem
aos estresses, os mais variados possíveis, de algumas poucas maneiras: inibindo todos os
genes não essenciais para a nova situação e, estimulando fortemente os genes que, de alguma
forma, estão envolvidos no estresse em questão ou, que possam proteger a célula de alguma
maneira. (LINDQUIST & CRAIG, 1988). Assim, nosso objetivo foi verificar se as células
respondem à presença de cádmio com a síntese de trealose. A opção pela determinação dos
níveis de trealose se deveu ao fato que, este carboidrato é um marcador inespecífico de
estresse e, geralmente, se verifica que seus níveis estão aumentados nas mais diferentes
situações percebidas como nocivas para as células de levedura (VAN LAERE, 1989).
Verificamos na Figura 2 que, o aumento crescente das concentrações de cádmio leva a um
aumento nos níveis de trealose acumulados pela linhagem de levedura de laboratório. A
mesma resposta de síntese de trealose pode ser verificada nas linhagens isoladas da
fermentação da cachaça e linhagens isoladas da região (Figura 7), entretanto, os resultados
75
neste protocolo não são tão claros como os observados na linhagem de laboratório (Figura 2),
dado o nosso interesse em realizar o experimento em situação de alta concentração de cádmio
(500 ppm), pois, nosso objetivo, é o de selecionar uma levedura que possa captar cádmio em
efluentes industriais altamente poluídos.
As linhagens Saccharomyces cerevisiae 1011, Saccharomyces cerevisiae 2057,
Saccharomyces cerevisiae 2464, Starmerela meliponinorum, Candida cylindracea, Candida
sorboxylosa, Pichia guilliermondii, Pichia kluyvera e Pichia membranaefaciens, conseguiram
acumular mais trealose, comparadas com o controle, quando incubadas na presença de 500
ppm de CdCl
2
. Evidentemente, esta é uma concentração letal (Tabela 2), entretanto, nas 3
horas em que estas células permaneceram em contato com esta alta concentração do metal,
conseguiram acumular altos níveis de trealose. Células com altos níveis de trealose, em geral,
são mais resistentes (LILLIE & PRINGLE, 1980).
A primeira função atribuída a trealose foi como carboidrato de reserva (ELBEIN,
1974), posteriormente, foram feitas correlações entre o conteúdo de trealose e, a resistência a
diversas condições de estresses. Assim, o dissacarídeo trealose protege contra o estresse de
dessecação (D’AMORE et al, 1991; GADD et al, 1987; HOTTINGER et al, 1987), altas
temperaturas (HOTTINGER et al, 1987; NEVES & FRANÇOIS, 1992), congelamento
(LEWIS et al, 1995), aumento da pressão hidrostática (FERNANDES et al, 2001), agente
oxidantes tais como etanol, sulfato de cobre, peróxido de hidrogênio (LUCERO et al, 2000;
MANSURE et al, 1994; RIBEIRO et al, 1999), estresse osmótico (HOUNSA et al, 1998) e
metais pesados (ATTFIELD, 1987).
A função protetora da trealose parece estar clara apenas nos casos de dessecação e,
no choque térmico. Durante o processo de dessecação ou, desidratação, as membranas
biológicas perdem sua integridade estrutural e funcional. Acredita-se que a trealose faça
interações com os fosfolípideos da membrana, formando pontes de hidrogênio com seus
grupos OH e, grupos fosfatos. Estas pontes de hidrogênio poderiam ocupar o lugar da água
em torno dos fosfolípideos estabilizando desta forma as membranas desidratadas (CROWE et
al, 1991; DE ARAUJO et al, 1991; ELEUTHERIO et al, 1993). No caso da elevação de
temperatura (choque térmico) a presença da trealose impede a agregação das proteínas
desnaturadas pelo efeito térmico, mantendo assim, o estado conformacional ativo das
proteínas (SINGER & LINDQUIST, 1998). Em todos os outros estresses em que a trealose se
acumula, não se conhece qual seria sua função.
76
Apesar de todas as considerações acima realizadas, devemos ressaltar que em nossos
experimentos não verificamos um acentuado papel protetor da trealose (figuras 5A e 5B).
Nestes experimentos (figuras 5A e 5B), induzimos a síntese de trealose com a concentração
de 2,5 ppm de cloreto de cádmio e, posteriormente, adicionamos às células que apresentavam
níveis aumentados de trealose, mais 50 ppm de cloreto de cádmio. Não verificamos que a
presença de altos níveis de trealose tenha sido uma vantagem adicional para que as células
continuassem o seu crescimento nesta condição tóxica. Esta ausência de correlação entre
níveis aumentados de trealose e, proteção, já foi verificada por outros autores (ALEXANDRE
et al, 1998), entretanto, até o momento, não existe uma compreensão clara do porque da célula
sintetizar tanta trealose se, esta não irá protege-la. Evidentemente, devemos sempre considerar
que vários circuitos gênicos de detecção dos estresses e, ativações dos genes são interligadas
e, superpostas, portanto, não são altamente específicos (BANUETT, 1998). Outra
consideração cabível é que períodos de redução do crescimento estão associados com altos
níveis de trealose. Assim, células em fase estacionária, ou células incapacitadas de crescerem
por deficiência em nutrientes essenciais como carbono, nitrogênio, enxofre e fosfato (LILLIE
& PRINGLE, 1980)
ou, células dormentes como esporos (INOUE & SHIMODA, 1981),
conídios (HANKS & SUSSMAN, 1969) e ascósporos (SUSSMAN & LINGAPPA, 1959),
possuem altos níveis de trealose. Neste caso, é evidente que existe uma redução do
crescimento (Figura 1 e Figura 6) e, talvez, seja possível especular que esta dificuldade em
prosseguir o ciclo celular normal é que sinalize para a síntese de trealose mais do que a
presença de uma agente estressante. Tal possibilidade já foi proposta por THEVELEIN
(1996), evidentemente, o autor não tratava do caso específico do cádmio, mas, do papel global
que pode desempenhar a trealose no ciclo de vida da levedura Saccharomyces cerevisiae.
A presença de metais pesados afeta a atividade metabólica de culturas de fungos e
leveduras e, pode afetar o processo comercial de fermentação. O efeito da presença de metais
pesados nos processos fermentativos comerciais gerou todo o interesse em correlacionar o
comportamento dos fungos na presença destes. Resultados destes estudos levaram à
concepção que se poderia usar fungos e leveduras para remoção de metais pesados de
efluentes industriais.
Devido a sua natureza imutável, os metais são um grupo de poluentes que recebem
muita atenção. Na realidade, muitos metais são essenciais para os sistemas biológicos e,
devem estar presentes em determinadas concentrações. Caso a concentração do metal
aumente além de determinados parâmetros, os metais podem agir de maneira deletéria,
77
bloqueando grupos funcionais essenciais, deslocando outros metais ou, modificando a
conformação de moléculas biológicas.
Como resultado da atividade humana como mineração, galvanoplastia, produção de
combustíveis, energia, fertilizantes e, aplicação de pesticidas, a poluição oriunda de metais é
um dos grandes problemas ambientais e, de saúde, dos dias atuais. Grandes proporções de
metais pesados têm sido liberados no ambiente como resíduos industriais ou, efluentes
industriais que alcançam corpos d’água, contribuindo assim para o aumento da poluição em
sistemas aquáticos (BABICH & STOTZKY, 1980). As legislações ambientais mais
restritivas, os problemas ecológicos e, o alto custo das tecnologias convencionais no
tratamento de efluentes contendo metais pesados, tem resultado na busca por tecnologias não
convencionais. Muitas leveduras, microrganismos e, algas, são conhecidos pela capacidade de
concentrarem metais pesados de soluções aquosas, acumulando-os no seu interior ou, na
superfície de suas estruturas celulares (BRADY & DUNCAN, 1994; VOLESKY & MAY-
PHILLIPS, 1995; GOMES, et al, 2002;
GADD, 1986;
HUANG et al, 1988a; KAPOOR &
VIRARAGHAVAN, 1995; GAVRILESCU, 2004; VOLESKY, 1990a). O presente trabalho
se insere no contexto de busca de novas alternativas para diminuir a concentração de metais
que possam poluir o meio ambiente.
Fungos e leveduras são fáceis de crescer e produzem muita biomassa. São
largamente usados em uma variedade de processos fermentativos industriais. Esta biomassa
tem um custo baixo, pois, é o produto final de um processo de fermentação e, teria de ser
descartada. A possibilidade de outra destinação para a biomassa, que não o descarte, pode
gerar novos dividendos para a indústria. Nosso interesse em usar leveduras selecionadas da
fermentação da cachaça se deve ao fato do estado de Minas Gerais possuir grande quantidade
de alambiques produtores da bebida. Em 1995, segundo levantamento do SEBRAE o número
de alambiques, em situação regular no estado, era de 8,466. Sabe-se que o setor possui uma
alta informalidade assim, é possível considerar que este número que aparece na pesquisa do
SEBRAE tenha sido subestimado (SEBRAE, 2004).
Por outro lado, foi também nosso interesse usar leveduras isoladas da região, pois,
caso haja interesse em cultivá-las para a produção de biomassa, seu cultivo normalmente é
simples, feito com tecnologia de baixo custo e, com uso de meios de cultura pouco
dispendiosos (KAPPOR & VIRARAGHAVAN, 1995). É importante ressaltar que
microrganismos isolados de uma região são altamente adaptados a esta região por isso,
variações decorrentes da sazionalidade tais como: temperatura, quantidade de água
78
disponível, luminosidade, não têm qualquer influência sobre o microrganismo, uma vez que,
este está plenamente adaptado às condições vigentes na região (ZUZUARREGUI
&
DEL
OLMO, 2004).
Verificamos que as células da linhagem de Saccharomyces cerevisiae de laboratório
W303-WT são capazes de retirar cádmio do meio extracelular e, acumular o metal (Figura 8).
A captação de cádmio é dependente da concentração do metal presente no meio e, do tempo
que as células ficam em contato com este meio. Aumentando-se a concentração e, o tempo de
exposição ao cádmio, aumenta-se à quantidade de cádmio incorporado pelas células. O
mesmo resultado foi verificado em células isoladas da fermentação da cachaça e, da região,
(Figura 9). Comparando-se os resultados apresentados na Figura 9 com o resultado da
incorporação de cádmio pelas células da linhagem de laboratório da Figura 8, observa-se que,
as células isoladas da fermentação da cachaça e, da região, incorporam muito mais cádmio
que a linhagem de laboratório. A título de ilustração desta afirmação, a linhagem de levedura
Saccharomyces cerevisiae W303-WT (linhagem de laboratório) incorporou 820
µ
g de cádmio
quando exposta a 100 ppm de metal por 20 horas (Figura 8) e, as células da linhagem de
levedura Saccharomyces cerevisiae 2041 incorporaram 8100
µ
g de cádmio quando expostas
a 100 ppm de metal por 24 horas (Figura 9).
Observa-se que a linhagem de levedura Starmerela meliponinorum foi a que
apresentou a menor incorporação de cádmio (Figura 9, 100 ppm de cádmio 24 horas e
compare com as outras linhagens no mesmo gráfico), entretanto, está linhagem foi a única que
cresceu na presença de uma concentração de 100 ppm de cloreto de cádmio (Tabela 2).
Possivelmente, este fenômeno se deva ao fato que, nem sempre a linhagem que é mais
resistente a um metal, seja aquela que tenha a maior captação do metal. As células podem
estar usando um mecanismo extrusor do metal, que permite que elas cresçam em alta
concentração do metal, mas, não o incorporem em grandes quantidades (SHIEAISHI et al,
2000). Resultados de outros autores (GHARIEB, 2001) sugerem que o efluxo de cádmio é um
mecanismo indutível que se inicia na presença de um gradiente de cádmio através da
membrana celular. Este mecanismo pode ser a indução de um sistema exportador ativo que
limita a concentração intracelular do metal. Este mecanismo ocorre em mutantes de
Saccharomyces cerevisiae resistentes ao cádmio (SHIEAISHI et al, 2000). É parte de um dos
quatro mecanismos propostos para uma célula ser resistente a um metal (SHIEAISHI et al,
2000). Os outros três mecanismos são: repressão do gene de um transportador específico para
o metal, indução de proteínas específicas que podem ligar o metal, tais como as fitoquelatinas,
79
glutationas e metalotioneínas e, compartimentalização em vacúolos, limitando a concentração
citoplasmática do íon (SHIEAISHI et al, 2000).
Ainda na Figura 9 é possível observar que a linhagem de laboratório Saccharomyces
cerevisiae S288C também incorporou menor quantidade de cádmio quando comparada às
leveduras isoladas da natureza (compare 50 ppm ou 100 ppm de cádmio durante 24 horas em
todas as linhagens apresentadas). Este resultado é extremamente favorável à hipótese inicial
que, as linhagens de leveduras isoladas diretamente da natureza teriam um desempenho
melhor na captação do metal que, as linhagens de leveduras ditas de laboratório. Uma vez
que, as linhagens isoladas diretamente da natureza devem ser mais adaptadas as flutuações e
estresses do meio ambiente.
De fato, os resultados obtidos por VIANNA, em várias linhagens de leveduras
isoladas da fermentação da cachaça (VIANNA, 2003), corroboram com a afirmativa que a
resistência é maior em microrganismos isolados diretamente da natureza. Neste trabalho,
VIANNA (2003), determinou a síntese de proteínas de choque térmico, em diversas
simulações de estresses que ocorrem durante a fermentação para a produção da cachaça. Estas
linhagens apresentaram síntese constitutiva, isto é, na ausência de estresse, das proteínas de
choque térmico hsp 70 e hsp 104. Entre as várias linhagens que o autor usou, estavam também
as leveduras Saccharomyces cerevisiae 1011 e 2464, usadas no presente trabalho. A resposta
celular aos estresses é evolutivamente conservada em todos os organismos vivos e, o maior
papel é atribuído a proteínas de choque térmico (Hsps) e, outras moléculas que conferem
proteção aos estresses, como a trealose. A resposta molecular induzida pela célula determina
se o organismo se adapta, sobrevive ou, se a injúria será reparada ou, levará a morte
(ALOYSIUS, 1999). Normalmente, a expressão de proteínas de choque térmico ocorre em
todos os estresses e, parece estar ligada à manutenção das funções celulares vitais frente a um
estímulo nocivo (ALOYSIUS, 1999). A expressão constitutiva das hsp 70 e hsp 104, em
várias linhagens de leveduras, poderia indicar que as leveduras isoladas da fermentação da
cachaça e, talvez de nosso habitat, poderiam ser mais resistentes aos estresses de maneira
geral. Além da síntese constitutiva de hsp, as linhagens de Saccharomyces cerevisiae, isoladas
da fermentação da cachaça, utilizadas por VIANA, apresentam altos níveis de trealose, na
ausência de estresse, quando comparadas às linhagens de laboratório (VIANNA, 2003).
De acordo com a literatura, a captação de metais, por células vivas, depende do
tempo de contato (Figura 8 e Figura 9), pH da solução, condições da cultura, concentração
80
inicial do metal (Figura 8 e Figura 9) e concentrações de células (Tabela 3), (KAPPOR &
VIRARAGHAVAN, 1995).
Para estudar o efeito da densidade celular sobre a captação do metal, realizamos o
experimento apresentado na Tabela 3. A incubação de células da linhagem laboratório
(Saccharomyces cerevisiae S288C) foi realizada mantendo-se fixos, volume, tempo de
exposição e, concentração de cádmio, variou apenas a massa de células colocada no meio.
Verifica-se que, apesar da grande diferença da massa celular empregada, os níveis de cádmio
incorporados foram basicamente os mesmos. Tal fato indica que, quantidades maiores de
massa celular não favorecem a incorporação do cádmio pelas células. A baixa captação de
cádmio em biomassa com alta densidade celular já foi observada em diversas linhagens de
fungos, tais como: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Mucor racemosus, Penicillium
chrysogenum, Trichoderma viride (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995). KAPPOR &
VIRARAGHAVAN (1995) atribuíram este fenômeno às interações eletrostáticas na superfície
das células. A presença de um grande número de células implica que a distância entre elas
diminuiu, permitindo a agregação rápida e, a formação de grumos, diminuindo a área
superficial disponível para contato com o metal (KIFF & LITTLE, 1986).
Para verificar a influência da condição da cultura, na captação do metal, foi realizado
o experimento apresentado na Figura 10. Neste protocolo experimental as células foram
crescidas por 48 horas, em meio YPG, até atingirem a fase estacionária (verificado pelo
esgotamento de glicose com fita indicadora) quando foram adicionados 50 ppm de cloreto de
cádmio, durante 12 horas. Verifica-se que, a incorporação de cádmio foi menor quando
comparado às células crescidas na presença de 50 ppm de cloreto de cádmio (Figura 9, 50
ppm de cádmio durante 24 horas). O acúmulo de metais realizado por células em crescimento
varia com a idade das células. Uma possível explicação para o fato é que as modificações que
ocorrem na morfologia da célula levem a modificações químicas na superfície celular,
favorecendo uma maior captação do metal. A captação máxima de metal ocorre durante a fase
lag ou, nos primeiros estágios do crescimento e, declina quando a cultura atinge a fase
estacionária (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995). Quando se usa células em fase
estacionária do crescimento, geralmente, o acúmulo de metais nestas células é muito rápido e,
atinge o equilíbrio entre 60 a 120 minutos, entretanto, 90% desta captação ocorre em 10
minutos (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995). Biosorção de íons metálicos ocorre por
ligação à superfície incluindo troca iônica, e complexação com grupos funcionais presentes na
superfície celular. Acredita-se que vários grupos funcionais possam estar envolvidos na
81
ligação com os metais. Nesses grupos funcionais incluem-se os grupamentos carboxílicos,
sulfidrílicos, aminos e fosfatos (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995).
Leveduras, algas, fungos e bactérias apresentam parede celular que possuem ácidos
orgânicos e, grupamentos funcionais capazes de adsorver prótons e, cátions metálicos de uma
solução aquosa. A captação de metais pesados pela biomassa pode se processar por um
mecanismo ativo (dependente da atividade metabólica da célula), conhecido como
bioacumulação e, por um mecanismo passivo (sorção e/ou complexação) conhecido como
biosorção (VOLESKY & MAY-PHILLIPS, 1995; VOLESKY, 1990a). Biosorção é a
absorção passiva de íons metálicos na superfície celular e, bioacumulação é quando o íon
metálico é transportado através da célula para o seu interior (BLACKWELL & TOBIN,
1999). Para verificar se, o mecanismo de ação usado pelas células, para captação de metal,
tratava-se de bioacumulação ou, biosorção, foi realizado o experimento mostrado na Tabela 4.
Neste protocolo experimental as células foram crescidas até a fase logarítmica, em meio YPG.
Em seguida, essas culturas foram colocadas na autoclave (15 minutos à temperatura de 121
0
C,
sob alta pressão) para matar as células. Posteriormente, adicionou-se 50 ppm de cloreto de
cádmio a estas células. As células ficaram em contato com o metal por 48 horas, quando
foram coletadas para determinação da quantidade de cádmio incorporado. Observa-se, na
Tabela 4, que células mortas incorporam maior quantidade de metal quando, comparadas com
células vivas (Tabela 7). Nossos dados indicam que o mecanismo de biosorção (Tabela 4) é
eficiente, para a captação de cádmio. De acordo com a literatura, a biosorção de metais por
células não viáveis é possível graças, a presença de grupos funcionais na superfície externa
que permite a ligação do metal (KAPOOR & VIRARAGHAVAN, 1995).
A tabela 8 compara os resultados obtidos durante a bioacumulação com a biosorção.
A diferença entre o acúmulo por um ou, outro mecanismo não é tão diferente assim, embora
seja uma comparação difícil de realizar já que as concentrações usadas e, os tempos de
exposição, foram diferentes. Entretanto, o uso de células mortas implica em muitas vantagens
como, será visto abaixo.
A biomassa morta pode ser obtida de fontes industriais, que utilizam células de
leveduras para o processo de fermentação de alimentos e, bebidas. As células podem ser
mortas através da elevação da temperatura (SIEGEL et al, 1986; SIEGEL et al, 1987;
GALUN et al, 1983; TOWNSLEY et al, 1986), por autoclavação (HUANG et al, 1988a;
TOBIN et al, 1984) ou substâncias químicas como ácidos, álcalis, detergentes e (AZAB &
PETERSON, 1989; BRADY et al, 1994; RAO et al, 1993; HUANG et al, 1988a;
82
MUZZARELLI et al, 1980a; WALES & SAGAR, 1990; TSEZOS & VOLESKY, 1981;
ROSS & TOWNSLEY, 1986; GADD et al, 1988), outras substâncias químicas orgânicas
como formaldeído (HUANG et al, 1988b) ou, ainda, métodos mecânicos para ruptura das
células. Todos esses métodos podem, de alguma maneira, interferir com a capacidade de
ligação do metal aos grupos presentes na parede, favorecendo ou, dificultando esta ligação. O
método da autoclavação para matar as células foi escolhido para não gerar mais resíduos
químicos. Uma vez que, se tivesse optado por tratamentos químicos para matar as células,
introduziria o uso deste químico que depois, seria um rejeito que, de alguma forma, teria de
ser tratado para neutraliza-lo.
O uso de biomassa não viável para a captação de metais oferece algumas vantagens
sobre células vivas. Sistemas usando células vivas são mais sensíveis aos efeitos tóxicos da
concentração do metal e, condições como pH e temperatura. Células vivas necessitam de uma
constante oferta de nutrientes o que, certamente, tem influência sobre os custos da operação.
Leveduras, algas, fungos e, bactérias podem remover metais pesados e,
radionuclídeos de solução aquosa em quantidades substanciais (ADAMIS et al, 2003;
ALOYSIUS et al, 1999; GADD, 1986).
Os níveis de metais e, compostos orgânicos que podem estar presente na água
dependem do uso que a água terá. No Brasil, estes limites são fixados pela Portaria n
0
357, do
CONAMA (2005). Em geral, os efluentes industriais mostram níveis de metais acima dos
permitidos para descarte, como exemplo podemos citar o trabalho de BENEDETTO et al
(2005) que caracterizou o efluente industrial da Companhia Paraibuna de Metais, que
apresenta vazão superior a 100 m
3
/h, localizado no estado de Minas Gerais. Os autores
determinaram a seguinte composição: Zn=108mg/L, Ca=208mg/L, Mg=105mg/L,
Mn=193mg/L, Fe=2,7mg/L, Cd=36mg/L, Pb= 1,92mg/L. Todos os metais presentes estão
acima dos níveis permitidos pela resolução 357 do CONAMA. Assim, para o seu descarte,
são necessário tratamentos convencionais como, a precipitação com diferentes compostos
químicos ou, a remoção por resinas comerciais. Transcreve-se abaixo os resultados de
adsorção obtidos pelos autores, quando testaram várias resinas comerciais ou, absorventes,
usando 100 ml deste efluente e 0,5 grama de resina (BENEDETTO et al 2005):
83
Tabela 9 -
Remoção de metais do efluente da
Companhia Paraibuna de Metais usando
diversas resinas absorventes.
Adsorvente
Sintetizada
Tipo
Grupo
funcional
% de Adsorção
Zn Ca Mg Mn Fe Cd Pb
IR 748
ROHM &
HAAS
Quelante
Ácido
iminodiacético
26,5
<0.5
1,0
38,6
77,9
26,3
86,2
IRA-120
HOHM &
HAAS
Catiônica ácido
forte
Sulfônica
39,2
25,0
34,3
<0.5
18,9
35,5
70,5
S 950
PUROLITE
Quelante
Ácido
Aminofosfórico
35,9
<0.5
6,7
31,6
>99
22,9
83,8
TP 207
BAYER
Quelante
Ácido
Iminodiacético
13,0
<0.5
<0.5
39,4
>96
1,7
41,7
VPOC 1026
BAYER
Catiônica ácido
forte
DEHPA
53,7
9,1
9,5
56,0
55,2
7,5
27,6
C 249
SYBRON
CHEMICALS
Quelante
Ácido
iminodiacético
49,1
64,3
44,8
68,9
90,4
46,4
85,9
ZEOLITE
PETROBRÁS
-
-
1,9
15,4
<0.5
40,0
<0.5
<0.5
22,9
CARVÃO
BONECHAR -
BR
-
-
2,3
<0.5
0.5
7,2
>99
41,9
>99
Observa-se nesta tabela (BENEDETTO et al, 2005) que, para o cádmio, a melhor
remoção foi realizada com a resina C 249 que, nas condições empregadas pelos autores,
removeu 3,34 mg/grama de resina. Os valores obtidos usando leveduras estão próximos, ou
melhores, aos apresentados por esta resina, observe a tabela 4, onde foram usados 50 ppm de
cloreto de cádmio (valor que mais se aproxima da concentração inicial do efluente), que a
retenção de cádmio pelas leveduras, foram superiores ao desta resina, com exceção da
linhagem de Pichia kluyvera. Nossos resultados estão apresentados em peso úmido, o que
significa que quando expressos em peso seco, este valor será maior.
Este resultado mostra que as leveduras têm um potencial grande para realizar esta
remoção de cádmio. Evidentemente, devemos ressaltar que nossos resultados foram obtidos
usando um único metal enquanto, o efluente real apresenta sete metais. É provável que
interferências entre os vários metais diminua a incorporação de um dado metal pela levedura.
Avaliando os dados obtidos neste trabalho, parece ser viável o uso de leveduras como material
bioabsorvente.
84
7 CONCLUSÃO
- O cádmio, mesmo em baixas concentrações, interfere no crescimento das diversas
linhagens de células de leveduras, inclusive nas linhagens isoladas da fermentação de
cachaça e, do meio ambiente regional.
- A presença de cádmio induz a síntese de trealose.
- A presença de altos níveis de trealose, induzidos pelo cádmio, na linhagem de laboratório
(W303-WT), não proporcionou grande proteção às células desafiadas com o metal.
- A apresentação do cádmio sob diferentes formas químicas não teve influência na
quantidade de cádmio incorporado pelas células Saccharomyces cerevisiae W303-WT
(linhagem de laboratório).
- Todas as células da linhagem usadas neste trabalho (com exceção da linhagem
Saccharomyces cerevisiae de laboratório) toleraram concentrações de até 50 ppm de
cloreto de cádmio.
- A linhagem de levedura Starmerela meliponinorum cresceu em presença de 100 ppm de
cloreto de cádmio, mas, usando células viáveis, mostrou uma incorporação baixa de
cádmio, quando comparadas com as outras linhagens de levedura.
- A incorporação de cádmio pelas células viáveis é dependente do tempo de exposição ao
metal e, da concentração cádmio presente no meio. Tempo e, concentrações maiores
favorecem a incorporação de cádmio pelas leveduras.
- A incorporação de cádmio é dependente da fase de vida da levedura. Células em fase
logarítmica incorporam mais cádmio que células em fase estacionária.
- Massas crescentes não favorecem a incorporação de cádmio pelas células.
- As linhagens de leveduras isoladas da fermentação da cachaça e, da região, incorporam
maiores quantidades de cádmio quando comparadas com as linhagens de laboratório.
- Leveduras mortas incorporam cádmio do meio extracelular.
- Não foram observadas diferenças muito expressivas na incorporação de cádmio entre as
linhagens estudadas.
- Os resultados sugerem que o uso de uma linhagem isolada de levedura não proporcionará
uma maior incorporação de cádmio.
85
- Os resultados sugerem que o mais indicado, para incorporação de cádmio de efluentes
contaminados é, o uso de biomassa composta de gêneros e, espécies diferentes de
leveduras mortas.
86
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMIS, P. D. B.; PANEK, A. D.; LEITE, S. G. F.; ELEUTHERIO, E. C. A. Factors
involved with cadmium absorption by a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae.
Brazilian Journal of Microbiology
, v.34, p.55-60, 2003.
ALBERTINI, S.
Isotermas de adsorção de cádmio por
Saccharomyces cerevisiae. 54p.
Dissertação (mestrado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de
São Paulo. Piracicaba, 1999.
ALEXANDRE, H.; PLOURDE, L.; CHARPENTIER, C.; FRANCOIS, J.
Lack of correlation
between trehalose accumulation, cell viability and intracellular acidification as induced by
various stresses in Saccharomyces cerevisiae.
Microbiology,
v.144, n.4, p.1103-1111, 1998
ALKORTA, I.; HERNANDES-ALLICA, J.; BECERRRIL, J. M.; AMEZAGA, I.; ALBIZU,
I.; GARBISU, C. Recent findings on the phytoremediation of soils contaminated with
environmentally toxic heavy metals and metalloids such as zinc, cadmium, lead and arsenic.
Reviews in Environmental Sciences and Biotechnology,
v.3, p.71-90, 2004.
ALOYSIUS, R.; KARIM, M. I. A.; ARIFF, A. B. The mechanism of cadmium removal from
aqueous solutions by nonmetabolizing free and immobilized live biomass from Rhizopus
oligosporus.
World Journal of Microbiology & Biotechnology,
v.15, p.571-578, 1999.
ARANHA, S.; NISHIKAWWA, A. M.; TAKA, T.; SALIONE, E. M. C. Níveis de cádmio e
chumbo em fígado e rins de bovino.
Revista Instituto Adolfo Lutz,
v.54(1), p.16-20, 1994.
ASSMANN, S.; SIGLER, K.; HOFER, M. Cd
+2
induced damage to yeast plasma membrane
and its alleviation by Zn
+2
: studies on Schizosaccharomyces pombe and reconstituted plasma
membrane vesicles.
Archive of Microbiology
, v.165, n.4, p.279-282, 1996.
ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry
. Toxicological Profile for
Cadmium,
Atlanta: ATSDR, 1997. p.347
87
ATTFIELD, P. V. trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae during exposure to
agents that induce heat shock response.
FEBS Letters,
v.225 n.1-2, p.259-263,1987.
AZAB, M. S.; PETERSON, P. J. The removal of cadmium from water by the use of
biological sorbents.
Water Science Technology,
v.21, p.1705-1706, 1989.
BABICH, H.; STOTZKY, G. Environmental factors that influence the toxicity of heavy
metals and gaseous pollutants to microoganisms.
CRC Critical Reviews Microbiology
, v.8,
n.7, p.99-145, 1980.
BABICH, H.; STOTZKY, G. Influence of chemical speciation on the toxicity of heavy metals
to the microbiota. In: NRIAGU, J.O. (Ed.)
Aquatic Toxicology,
New York: Wiley & Sons,
p.1-46. 1983.
BELL, W.; SUN, W.; HOHMANN, S.; WERA, S.; REINDERS, A. DE VIRGILIO, C.;
WIEMKEN, A.; THEVELEIN, J. M. Composition and functional analysis of the
Saccharomyces cerevisiae trehalose synthase complex.
Journal of Biological Chemistry,
v.273, p.33311-33319, 1998.
BENAROUDJ, N.; LEE, D. H.; GOLDBERG, A. L. Trehalose accumulation during cellular
stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals.
Journal of
Biological Chemistry,
v. 276, n.26, p.24261-24267, 2001.
BENEDETTO, J. S.; MORAIS, C. A.; MELO, F. S. D. Zinc And Heavy Metals
Recovery/Removal From Industrial Effluent By Ion Exchange. In: ICHMET
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HEAVY METALS IN THE ENVIROMENT XIII,
2005, Rio de Janeiro, RJ.
Proceedings...
Rio de Janeiro: Centro de Tecnologia Mineral, 2005.
CD-ROM.
BANUETT, F. Signalling in the yeasts: an informational cascade with links to the filamentous
fungi.
Microbiology and Molecular Biology Reviews,
v.62, n.2, p.249-274, 1998.
88
BEVERIDGE, T. J. Role of cellular desing in bacterial metal accumulation and
mineralization.
Annual Review Microbiology
, v.43, n.3, p.147-171, 1989.
BIRCH, L.; BACHOFEN, R. Complexing agents from microorganisms.
Experientia
, v.46,
n.7, p.827-834, 1990.
BLACKWELL, K. J.; TOBIN, J. M. Cadmium accumulation and its effects on intracellular
ion pools in a brewing strain of Saccharomyces cerevisiae.
Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology,
v.23, p.204–208, 1999.
BRADY, D., STOLL, A.; DUCAN, J. R. Biosorption of heavy metal cations by non-viable
yeast biomass.
Environmental Technology
, v. 15, p
.
429-438, 1994.
BRADY, D.; DUNCAN, J. R. Bioacumulation of metal cation by Saccharomyces cerevisiae.
Applied Microbiology and Biotechnology
, v.41, p.149-159, 1994.
BRENNAN, R. J.; SCHIESTL, R. H. Cadmium is an induces of oxidative stress in yeast.
Mutation Research
, v.356, n.1, p.171-178, 1996.
BROCK, T. D.; SMITH, D.W.; MADIGAN, M. T.
Biology of Microorganisms,
4ed.
Prentice Hall: New Jersey, 1984. 909p.
CABIB, E.; LELOIR, L. F. The biosynthesis of trehalose phosphate.
Journal of Biological
Chemistry,
v.231, p. 259-275, 1958.
CETESB. Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental.
Relatório de
estabelecimento
de valores orientadores para solos e águas subterrâneas
. São Paulo:
CETESB
,
2001.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Committee on in Situ Bioremediation.
Situ
bioremediation
: when does it work? Washington: National Academies Press, 1993.
Disponível em: <http://www.nap.edu/catalog/2131.html>. Acesso em: 19 de agosto de 2005.
89
CONAMA. Conselho Nacional do Meio Ambiente.
Resolução CONAMA n
o
357
: estabelece
a classificação das águas e os níveis de qualidade exigidos. Disponível em:
<http://www.mma.gov/port/conama/res/res86/res2086.html>. Acesso em: 13 de junho 2005.
COSSICH, E. S.
Biossorção de Cromo (III) pela Biomassa da Alga Marinha
Sargassum
sp
. 147p. Campinas: Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas,
Tese (Doutorado), 2000.
COUTINHO, C. C.; SILVA, J. T.; PANEK, A. D. Trehalose activity and its regulation during
growth of Saccharomyces cerevisiae.
Biochemistry International,
v.26, p.521-530, 1992.
CROWE, J. H.; CROWE, L. M.; CHAPMAN, D. Preservation of membranes in
anhydrobiotic organisms: the role of trehalose.
Science,
v.223, p. 701-703, 1984.
CROWE, J. H.; PANEK, A. D.; CROWE, L. M.; PANEK, A. C.; DE ARAUJO, P. S.
Trehalose transport in yeast cells.
Biochemistry International,
v.24, p.721-730, 1991.
D’AMORE, T.; CRUMPLEN, R.; STEWART, G. G. The involvement of trehalose in stress
tolerance.
Journal Industrial Microbiology,
v.7, p.191-196, 1991.
DE ARAUJO, P. S.; PANEK, A. C.; CROWE, J. H.; CROWE, L. M.; PANEK, A. D.
Trehalose-transporting membrane vesicles from yeasts.
Biochemistry International
, v.24,
p.731-737, 1991.
DE SOETE, D.; GIJBELS, R.; HOSTE, J.
Neutron Activation Analysis,
New York: Jonh
Wiley, p.177, 1972.
DE VIRGILIO, C.; BURCKERT, N.; BELL, W.; JENO, P.; BOLLER, T.; WIEMKEN. A.
Disruption of TPS2, the gene encoding the 100kDa subunit of the trehalose-6-phosphate
synthase / phosphatase complex in Saccharomyces cerevisiae, causes accumulation of
trehalose-6-phosphate and loss of trehalose-6-phosphate phosphatase activity.
European
Journal of Biochemistry,
v.212, p.315-323, 1993.
90
DE VIRGILIO, C.; HOTTIGER, T.; BOLLER, T.; WIEMKEN. A. The role of trehalose
synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeasts. I. Genetic evidence that trehalose is
a thermoprotectant.
European Journal of Biochemistry,
v.219, p.179-186, 1994.
DEL RIO, D. T.
Biossorção de cádmio por leveduras
Saccharomyces cerevisiae. 66p.
Dissertação de mestrado – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da Universidade
de São Paulo. Piracicaba, 2004.
DÖNMEZ, G.; AKSU, Z. The effect of copper (ll) ions on the growth and bioaccumulation
properties of some yeasts.
Process Biochemistry
, v.35, p.135-142, 1999.
EHMANN, W. D.; VANCE, D. E.
Radiochemichemistry and Nuclear Method of Analysis,
New York: John Wiley, 1991, 531 p. (serie: Chemical Analysis).
ELEUTHERIO, E. C. A.; DE ARAÚJO, P. S.; PANEK, A. D. Role of the trehalose carrier in
dehydration resistence of Saccharomyces cerevisiae.
Biochimica et Biophysica
Acta,
v.1156,
p.263-266, 1993.
ELBEIN, A. D. The metabolism of alpha,alpha-trehalose.
Advances in
Carbohydrate
Chemistry and Biochemistry
, v.30, p.227-256, 1974.
ELLIOT, B.; HALTIWANGER, R. S.; FUTCHER, B. Synergy between trehalose and Hsp
104 for thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae.
Genetics,
v.144, p.923-933, 1996.
ERASO P; MARTÍNEZ-BURGOS M.; FALCÓN-PÉREZ. J. M.; PORTILLO F.; MAZÓN
M. J. Ycf1-dependent cadmiun detoxification by yeast requires phosphorylation of residues
Ser908 and Thr911.
FEBS Letters
, v.577, p.322–326, 2004.)
FERNANDES, P. M. B.; FARINA, M.; KURTENBACH, E. Effect of hydrostatic pressure on
the morphology and ultrastructure of wild-type and trehalose synthase mutant cells of
Saccharomyces cerevisiae.
Letters in Applied Microbiology
, v.32, n.1, p.42-6, 2001.
91
FRIBERG, L.; PISCATOR, M.; NORDBERG, G. F.; KJELLSTROM, T.
Cadmium in the
Environment,
2 ed. Cleveland, OH: CRC Press, 1974. 94p.
GADD, G. M. The uptake of heavy metals by fungi and yests: the chemistry and physiology
of the process and applications for biotechnology. In: ECCLES, H; HUNT, S.
Immobilization
of Ions by Bio-Sorption,
London: Ellis Horwood Limited Publishers, 1986.
Cap. 5.2, p.135-147.
GADD, G. M.; CHALMERS, K.; REED, R. H. The role of trehalose in dehydration resistance
of Saccharomyces cerevisiae.
FEMS Microbiology
Letters,
v.48, p.249-254, 1987.
GADD, G. M. Accumulation of metals by microorganisms and algae. In:
Biotechnology: A
Complete Treatise,
ed. REHM, H.; REED, G. v. 6b, p.401-433, 1988.
GADD, G. M. Biosorption.
Chemistry and Industry
, v.2, p.421-426, 1990.
GADD G. M; GHARIEB G. G. Role of glutathione in detoxification of metal by
Saccharomyces cerevisiae.
BioMetals
, v.
17, p.
183–188, 2004.
GALUN, M.; KELLER, P.; MALKI, D. Removal of uranium (VI) from solution by fungal
biomass and fun- gal wall related biopolymcrs.
Science
, v.219, p.285-286, 1983.
GAVRILESCU, M. Removal of heavy metals from the environment by biosorption.
Engineering in Life Sciences,
v.4, n.3, p.219-231, 2004.
GHARIEB, M. M. Pattern of cadmium accumulation and essential cations during growth of
cadmium-tolerant fungi.
Biometals,
v.14, p.143-151, 2001.
GOMES, D. S.; FRAGOSO, L. C.; RIGER, C. J.; PANEK, A. D.; ELEUTHERIO, E. C. S.
Regulation of cadmium uptake by Saccharomyces cerevisiae.
Biochimica et Biophysica
Acta,
v.1573, p.21-25, 2002.
92
GROTEN, J. P.; BLADEREN, P. J. Cadmium bioavailability and healt risk in food.
Trends
Food Sciences Techonogy,
v.5, p.50-55, 1994.
HANKS, D. L.; SUSSMAN, A. S. The relation between growth conidiation and trehalase
activity in Neurospora crassa.
Americam Journal of Botany,
v.56, p.1160-1166, 1969.
HINO, A.; MIHARA, K.; NAKASIMA, K.; TAKANO, H. Trehalose levels and survival ratio
of freeze-tolerant versus freeze-sensitive yeasts.
Applied and Environmental Microbiology,
v.56, p.1386-1391, 1990.
HOTTIGER, T.; BOLLER, T.; WIEMKEN, A. Rapid changes of heat and dessication
tolerance correlated with changes of trehalose content in Saccharomyces cerevisiae cells
subjected to temperature shifts.
FEBS Letters,
v.220, p.113-115, 1987.
HUANG, C. P.; WESTMAN, D.; QUIRK, K.; HUANG, J. P. The removal of cadmium (II)
from dilute aqueous solutions by fungal adsorbent.
Water Science Technology,
v.20, p.369
376, 1988a.
HUANG, C. P.; WESTMAN, D.; QUIRK, K.; HUANG, J. P.; MOREHART, A. L. Removal
of cadmium (II) from dilute solutions by fungal biomass.
Particulate Science and
Technology,
v.6, p.405- 419, 1988b.
HOUNSA, C. G.; BRANDT, E. V.; THEVELEIN, J.; HOHMANN, S.; PRIOR, B. A. Role of
trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress.
Microbiology,
v.144, p. 671-680, 1998.
HSDB HAZARDOUS SUBSTANCE DATA BANK. Cadmium. In: TOMES CPS
TM
SYSTEM.
Toxicology, Occupational Medicine and Environmental Series,
Englewood:
Micromedex, 2000. CD-ROM.
IKEDA, M.; ZHANG, Z. W.; MOON, C. S.; SHIMBO S.; WATANABE, N. H.; MATSUDA,
N. I. Possible effects of environmental cadmium exposure on cadmium function in the
93
Japanese general population.
International Archives of Occupational and Environmental
Health,
v.73, n.1, p.15-25, 2000.
ILO INTERNATIONAL LABOUR OFFICE
. Encyclopaedia of Occupational Health and
Safety,
Geneva, 1998. CD-ROM.
INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENGY. Vienna, 1987.
Comparison of Nuclear
Analytical Methods with Competitive Methods
. (IAES-TECDOC 435).
INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENGY. Vienna, 1990.
Pratical Aspects of
Operating a Neutron Activation Analysis Laboratory
. (IAES-TECDOC 564).
INOUE, H.; SHIMODA, C. Changes in trehalose content and trehalase activity during spore
germination in fission yeast Schizosaccharomyces pombe.
Archives of Microbiology,
v.129,
p.19-22, 1981.
JAMIESON D. Saving sulfur.
Nature Genetics
, v 31, p 228-230, 2002.
JARUP, L.; BERLUND, M., ELINDER, C. G.; NORDBERG, G.; VAHTER, M. Health
effects of cadmium exposure a review of literature and a risk estimate.
Scandinavian Journal
of Work, Environment & Health
, v.24, p.1-51, 1998.
KAPLAN, D.; CHRISTIAEN, D.; ARAD, S. M. Chelating properties of extracellular
polysaccharides from Chlorella app.
Applied Environmental Microbiology,
v.53, n.9,
p.2953-2956, 1987.
KAPOOR, A.; VIRARAGHAVAN, T.
Fungal biosorption - an alternative treatment. Option
for heavy metal bearing wastewaters: a Review.
Bioresource
Technology,
v.
53 p.195-206,
1995.
KEFALA, M. L.; ZOUBOULIS, A. L.; MATIS, K. A Biosorption of cadmium ions by
Actinomycetes and separation by flotation.
Environmental Pollution
, v.104, p.283-293,
1999.
94
KIFF, R. J.; LITTLE, D. R. Biosorpition of heavy metals by immobilized fungal biomass. In:
Immobilization of Ions by Biosorption,
Ed. H. H. Eccles; S. Hunt. Ellis Horwood,
Chichester, UK, p.71-80, 1986.
KURODA, K. & UEDA, M. Adsorption of cadmium ion by cell surface-engineered yeasts
displaying metallothionein and hexa-His.
Applied Environmental Microbiology, v.
63 n.2
p.182-186.
KRUGER, P.
Principles of Activation Analysis
. New York: Jonh Wiley, 1971.
KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. The yeasts: a taxonomic study. 4 ed.
Elsevier Science
Publishers
, Amsterdam. 1998.
LANE, W. T.; SAITO, A. M.; GEORGE, N, G.; PICKERING, J. I.; PRINCE, C. R.;
MOREL, M. M. F. Biochemistry: A cadmium enzyme from a marine diatom.
Nature
, v.435,
p.42-42, 2005.
LASKEY, J. W.; REHNBERG G. L. Reproductive effects of low acut doses of cadmium
chloride in adult male rats.
Toxicology and Applied Pharmacology
, v.73, p.250-255, 1984.
LESLIE, S. B.; ISRAELI, E.; LIGHTHART, B.; CROWE, J. H.; CROWE, L. M. Trehalose
and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying.
Applied
Environmental Microbiology,
v.61, p.3592-3597, 1995.
LEWIS, J. G.; LEARMONTH, R. P.; WATSON, K. Induction of heat, freezing and salt
tolerance by heat and salt shock in Saccharomyces cerevisiae.
Microbiology,
v.141, p.687-
694, 1995.
LI Z.; LU Y.; ZHEN R.; SZCZYPKA M.; DENNIS J. THIELE AND PHILIP A. R. A new
pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1-catalyzed
transport of bis (glutathionato) cadmium.
Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America,
v. 94, p. 42-47, 1997.
95
LILLIE, S. H.; PRINGLE, J. R. Reserve carbohydrate metabolism in Saccharomyces
cerevisiae: responses to nutrient limitation.
Journal Bacteriology,
v.143, p.1384-1394, 1980.
LINDQUIST, S. L.; CRAIG, E. A. The heat-shock proteins.
Annual Review of Genetics
,
v.221, p.631-677, 1988.
LONDESBOROUGH, J.; VARIMO, K. Characterization of two trehalose in baker’s yeast.
Biochemical
Journal,
v.219, p.511-518, 1984.
LÓPEZ ALONSO, M.; BENEDITO, J. L.; MIRANDA, M.; CASTILLO, C.; HERNÁNDEZ,
J.; SHORE, R. F. Arsenic, cadmium, lead, copper and zinc in cattle from Galicia, NW Spain.
Science of the Total Environment,
v.246, p.237-248, 2000.
LUCERO, P.; PENALVER, E.; MORENO, E.; LAGUNAS, R. Internal trehalose protects
endocytosis from inhibition by ethanol in Saccharomyces cerevisiae.
Applied
Environmental Microbiology,
v.66, n.10, p.4456-4461, 2000.
MACASKIE, L. E.; DEAN, A. C. R.; CHEETHAM, A. K. Cadmium accumulation by a
Citrobacter ssp.; the chemical nature of the accumulated metal precipitate and its location on
the bacterial cells.
Journal General Microbiology,
v.133, n.13, p.538-544, 1987.
MANSURE, J. J. C.; PANEK, A. D.; CROWE, L. M.; CROWE, J. H. Trehalose inhibits
ethanol effects on intact yeast cells and liposomes.
Biochimica et Biophysica
Acta,
v.1191,
p.309-316, 1994.
MASON, J. O.
Toxicological profiles
:
cadmiun.
Disponível em
http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles
/
IP-metals1/ip04-a.pdf
. Acesso em 13 de Junho,
2005.
MATIS, K. A.; ZOUBOULIS, A. I. Flotation of cadmium: loaded biomass.
Biotechnology &
Bioengineering
, v.44, n.3, p.354-360, 1994.
96
MATTIAZZO-PREZOTTO, M. M.
Comportamento de cobre, cádmio e zinco adicionados
a solos de clima tropical em diferentes valores de pH.
197p. Tese (Livre Docência) Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo. Piracicaba, 1994.
McMURRAY, C. T.; TAINER, J. A. Cancer, cadmium and genome integrity.
Nature
Genetics,
v.34, n.3, p.239-241, 2003.
MEDTEXT MEDICAL MANAGEMENT. Cadmium. In: TOMES CPS TM SYSTEM.
Toxicology, occupational medicine and environmental series.
Englewood: Micromedex
,
2000. CD-ROM.
MENDOZA-COZATL, D.; LOZA-TAVERA, H.; HÉRNÁNDEZ-NAVARRO, A.;
MORENO-SANCHEZ, R. Sulfur assimilation and glutathione metabolism under cadmium
stress in yeast, protists and plants.
FEMS Microbiology Review
, 2004.
MENEZES, M. A. B. C.; SABINO, C. V. S.; FRANCO, M. B.; KASTNER, G. F.;
MONTOYA, E. H. R. K
0
-instrumental neutron activation establishment at CDTN, Brazil: a
successful story.
Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry,
v. 257, n.3, p. 627-
632, 2003.
MIDIO, A. F.; MARTINS, D. I.
Agentes tóxicos contaminantes indiretos de alimentos.
In:
Toxicologia de alimentos. São Paulo: Varela, 2000. Cap. IV, p.163-252.
MIRANDA, C. E. S.
Determinação de cádmio por espectrofotometria de absorção
atômica com pré-concentração em resina de troca iônica empregando sistema FIA.
89p.
Dissertação (mestrado) – Instituto de Física e Química de São Carlos, Universidade de São
Paulo. São Carlos, 1993.
WATANABA M. Can bioremediation bounce back?
Nature Biotecnology, v.19, p.1111-
1115, 2001.
MORAIS, P. B.; ROSA, C. A.; LINARDI, V. R.; PATARO, C.; MAIA, A. B. R. A.
Characterization and succession of yeast populations associated with spontaneous
97
fermentation during the production for Brazilian sugarcane aguardente.
World Journal of
Microbiology & Biotechnology,
v.13, p.241-243, 1997.
MUZZARELLI, R. A. A., TANFANI, F.; SCARPINI, G. Chelating, film-forming, and
coagulating ability of the chitosan-glucan complex from Aspergillus niger industrial wastes.
Biotechnology & Bioengineering,
v.22 ,p.8858-96, 1980.
NEVES, M. J.; JORGE, J. A.; FRANÇOIS, J. M.; TERENZI, H. F. Effects of heat shock on
the level of trehalose and glycogen, and on the induction of thermotolerance in Neurospora
crassa.
FEBS Letters,
v.283, p.19-22, 1991.
NEVES, M. J.; FRANÇOIS, J. On the mechanism by which a heat shock induces trehalose
accumulation in Saccharomyces cerevisiae.
Biochemical
Journal,
v.288, p.859-864, 1992.
NEVES, M. J.; TERENZI, H. F.; LEONE, F. A.; JORGE, J. A. Quantification of trehalose in
biological sample with conidial trehalase from thermophilic fungus Humicola grisea var.
thermoidea.
World Journal of Microbiology & Biotechnology,
v.10, p.17-19. 1994.
OLENA K. VATAMANIUK, ELIZABETH A. BUCHER, JAMES T. WARD & PHILIP A.
R.
A New Pathway for Heavy Metal Detoxification in Animals.
THE JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY
Vol. 276, N. 24, v.15, p. 20817–20820, 2001
OLSON G.J.; BRIERLEY JA.; BRIERLEY C.L.
Bioleaching review part B: Progress in
bioleaching: applications of microbial process by the minerals industries.
Applied
Microbiology and Biotechnology
, v. 63, p. 249-257, 2003.
PALMISANO A. & HAZEN T. Bioremediation of Metals and Radionuclides: What It Is and
How It Works (2nd Edition).
Lawrence Berkeley National Laboratory,
2003.
<http://repositories.cdlib.org/lbnl/LBNL-42595_2003/ >Acesso em: 19 de agosto de 2005.
PANEK, A. D. Trehalose metabolism – new horizons in technological applications. Brazilian
Journal of Medical and Biological Research, v.28. p.169-181, 1995.
98
PARROU, J. L.; JULES, M.; BELTRAN, G.; FRANÇOIS, J.
Acid trehalase in yeasts and
filamentous fungi: localization, regulation and physiological function.
FEMS Yeast
Research,
v.5, n.6-7, p.503-511, 2005.
PATARO, C.; GUERRA, J. B.; PETRILLO-PEIXOTO, M. L.; MENDONÇA-HAGLER,
L.C.; LINARDI, V. R. ROSA, C. A. Yeast communities and genetic polymorphism of
Saccharomyces cerevisiae strain associated with artisanal fermentation in Brazil.
Journal of
Applied Microbiology,
v.89, p.24-31, 2000.
PETTERSON, A.; KUNST, L.; BERGMAN, B.; ROOMAM, G. Accumulation of aluminium
by Anabaena cylindrica into polyphosphate granules and cell walls and X-ray dispersive
microanalisis study.
Journal General Microbiology
, v.131, p.2545-2548, 1985.
PRASAD, M. N. V. Cadmium toxicity and tolerance in vascular plants.
Environmental and
Experimental Botany
, v.35, n.4, p.525-545, 1995.
RAGAN, H. A.; MAST, T. J. Cadmiun inhalation and male reproductive toxicity.
Reviews of
Environmental Contamination and Toxicology
, v.114, p.1-22, 1990.
RAO, C. R. N.; IYENGAR, L.; VENKOBACHAR, C. Sorption of copper (II) from aqueous
phase by waste biomass.
Journal Environmental Engineering Division,
Am. Soc. Civ.
Engrs, v.119, p.369-377, 1993.
RIBEIRO, M. J. S.; LEÃO, L. S. C.; MORAIS, P. B.; ROSA, C. A.; PANEK, A. D.
Trehalose accumulation by tropical yeast strains to stress conditions.
Antonie van
Leeuwenhoek
, v.75, p.245-251, 1999.
ROELS, H. A.; HOET, P; LISON, D. Usefuness of biomarkers of exposure to inorganic
mercury, lead, or cadmium in controlling occupational and environmental risks of
nephrotoxicity.
Renal Failure
, v.21, n.3-4, p.251-262, 1999.
ROMANDINI, P.; TALLANDINI, L.; BELTRAMINI, M.; SALVATO, B.; MANZANO, M.
DE BERTOLDI, M.; ROCCO, G. P. Effects of copper and cadmium on growth, superoxide
99
dismutase and catalase activities in different yeast strains.
Comparative Biochemistry and
Physiology
, v.103, n.2, p.255-262, 1992.
ROSS, I. S.; TOWNSLEY, C. C. The uptake of heavy metals by filamentous fungi. In:
Immobilization of Ions by Biosorption
. ECCLES, H ; HUNT, S. Chichester: Ellis
Horwood, 1986. p.49-57.
SAN MIGUEL, P. F.; ARGUELLES, J. C. Differential changes in the activity of cytosolic
and vacuolar trehalases along the growth cycle of Saccharomyces cerevisiae.
Biochimica et
Biophysica Acta,
v.1200 n.2 p.155-160, 1994.
SEBRAE.
Sistema agroindustrial da cachaça de alambique; Estudo técnico das
alternativas de aproveitamento da cana-de-açúcar.
BH: 2004. Disponível em:
<:http://www.sebraemg.com.br/Geral/ arquivo_get.aspx?cod_documento=15 -> Acesso em
15 junho. 2005.
SHIEAISHI, E.; INOUHE, M.; JOHO, M.; TOHOYAMA, H. The cadmium-resistant gene,
CAD2, which is a mutated putative copper-transporter gene (PCA1), controls the intracellular
cadmium level in the yeast S. cerevisiae.
Current Genetics,
v.37, p.79-86, 2000.
SIDERIUS, M.; VAN WUYTSWINKEL, O.; REIJENGA, K. A.; KELDERS, M.; MAGER,
W. H. The control of intracellular glycerol in Saccharomyces cerevisiae influences osmotic
stress response and resistence to increased temperature.
Molecular Microbiology
, v.36, n.6,
p.1381-1390, 2000.
SIEGEL, S.; KELLER, P.; GALUN, M..; LEHR, H.; SIEGEL, B.; GALUN, E. Biosorption of
lead and chromium by Penicillium preparations.
Water Air & Soil Pollution,
v.27, p.69-75,
1986.
SIEGEL, S. M..; GALUN, M.; KELLER, P., SIEGEL, B. Z.; GALUN, E. Fungal biosorption:
a comparative study of metal uptake by Penicillium and Cladosporium. In: PATTERSON, J.
W.; R. PASSINO.
Metal
Speciation, Separation and Recovery,
Chelsea, Michigan: Lewis
Publishers, 1987. p. 339-361.
100
SILVA, S. M. G.;
Efeito do cádmio sobre a fermentação alcoólica e o uso da vinhaça para
atenuar a sua ação tóxica.
142p. Tese (Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz
de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2001.
SINGER, M. A.; LINDQUIST, S. Multiple effects of trehalose on protein folding in vitro and
in vivo.
Molecular Cell,
v.1, p.639-648, 1998.
SPOSITO, G. The chemical forms of trace metals in soil. In: THORNTON, I
. Applied
Environmental Geochemistry,
London: Academic Press, 1983. cap 3, p.123-170.
SUSSMAN, A. S.; LINGAPPA, B. T. Role of trehalose in ascospores of Neurospora
tetrasperma.
Science,
v.130, p.1343. 1959.
THEVELEIN, J. M. Regulation of trehalose mobilization in fungi.
Microbiology
Review,
v.48, p.42-59, 1984.
THEVELEIN, J. M. Regulation of trehalose metabolism and its relevance to cell growth end
function.
The Mycota Biochemistry and Moleccular Biology
. v.3, p.395-420, 1996.
TOBIN, J. M.; COOPER, D. G.; NEUFELD, R. J. Uptake of metal ions by Rhizopus arrhizus
biomass.
Applied Environmental
Microbiology,
v.47, p.821-824, 1984.
TOWNSLCY, C. C.; ROSS, I. S.; ATKINS, A. S. Biorecovery of metallic residues from
various industrial effluents using filamentous fungi. In: LAWRENCE, R. W.; BRANION, R.
M. R.; ENNER, H. G.
Fundamental and Applied
Biohydrometallurgy,
Amsterdam:
Elsevier, 1986. p. 279-289.
TSEZOS, M.; VOLESKY, B. Biosorption of uranium and thorium.
Biotechnology &
Bioengineering
, v.23, p.583-604, 1981.
TYLER, G. Bryophites and heave metals: a literature review.
Botanic Journal of Linnean
Society
, v.10, p.221-235, 1990.
101
TYNECKA, Z.; GOS, Z.; ZAJIE, J. Energy: dependent efflux of cadmium coded by a
plasmid resistence determinant in Staphylococcus aureus.
Journal of Bacteriology
, v.147,
n.7, p.313-319, 1981.
U.S. GEOLOGICAL SURVEY.
Mineral commodity summaries
. Disponível em:
<http://geo-nsdi.er.usgs.gov/metadata/mineral/mcs/metadata.html>. Acesso em: 13 de junho
de 2005.
VAN AELST, L.; HOHMANN, S.; BULAYA, B.; DE KONING, W.; SIERKSTRA, L.;
NEVES, M. J.; LUYTEN, K.; ALIJO, R.; RAMOS, J.; COCCETTI, P.; MARTEGANI, E.;
MAGALHÃES-ROCHA, N. M.; BRANDÃO, R. L.; VAN DIJCK, P.; VANHALEWYN, M.;
DURNEZ, P.; JANS, A. W. H.; THEVELEIN, J. M. Molecular cloning of gene involved in
glucose sensing in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Molecular Microbiology,
v.8, n.5,
p.43-927, 1993.
VAN DIJCK, P.; COLAVIZZA, D.; SMET, P.; THEVELEIN, J. M. Differential importance
of trehalose in stress resistence in fermenting and nonfermenting Saccharomyces cerevisiae
cells.
Applied Environmental Microbiology,
v.61, p.109-115, 1995.
VAN LAERE, A. Trehalose, reserve and/or stress metabolite?
FEMS Microbiology Review,
v.63, p.201-210, 1989.
VEGLIO, F.; BEOLCHINI, F. Removal of metals by biosorption: a review.
Hydrometallurgy
, v.44, p.301-316, 1997.
VIANA, C. R.
Efeito dos estresses térmico e alcoólico no metabolismo da trealose e na
expressão das proteínas de choque térmico em linhagens de
Saccharomyces cerevisiae
isoladas durante a produção da cachaça mineira
. 91p. Dissertação (mestrado) –
Departamento de Microbiologia, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais, 2003.
VOLESKY, B. Biosorption and biosorbents. In:
Biosorption of Heavy Hetals,
Boca Raton:
CRC Press, cap.1.1, p.3-6, 1990a.
102
VOLESKY, B. Biosorption by fungal biomass. In:
Biosorption of Heavy Hetals,
Boca
Raton: CRC Press, cap.2.3, p.139-171, 1990b.
VOLESKY, B. Removal and Recovery of heavy metals biosorption. In:
Biosorption of
Heavy Hetals,
Boca Raton: CRC Press, cap.1.2, p.7-43, 1990c.
VOLESKY, B.; MAY-PHILLIPS, H. A. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces
cerevisiae.
Applied Microbiology and Biotechnology
, v.42, n.5, p.797-806, 1995.
VUORIO, O. E; KALKKINEN, N.; LONDESBOROUGH, J. Cloning of two related genes
encoding the 56-kDa and 123-kDa subunits of trehalose synthase from the yeast
Saccharomyces cerevisiae.
European Journal of Biochemistry,
v. 216, p.849-861, 1993.
WAIHUNG, L.; CHUA, H.; LAM, K. H.; BI, S. P. A comparative investigation on the
biosorption of lead by filamentous fungal biomass.
Chemosphere
, v.39, p.2723-2736, 1999.
WALES, D. S.; SAGAR, B. F. Recovery of metal ions by microfungal filters.
Journal of
Chemical Technology & Biotechnology,
v.49, p.345-355, 1990.
WINDERICKX, J.; DE WINDE, J. H.; CRAUNWELS, M.; HINO, A.; HOHMANN, S.;
VAN DIJCK, P.; THEVELEIN, J. M. Expression regulation of genes encodind subunits of
the trehalose synthase complex in Saccharomyces cerevisiae. Novel variations of STRE-
mediated transcriptional control?
Molecular Genetics and Genomics,
v.262, p.470-482,
1996.
WHO WORLD HEALTH ORGANIZATION.
Cadmium
. Geneva. (Environmental Healt
Criteria 134) 1992.
WOOD, J. M.; WANG, H. K. Microbial resistance to heavy metals.
Environmental Science
Technology
, v.17, n.12, p. 582-590, 1983.
103
YARROW, D. Methods for the isolation, maintenace, classification and identification of
yeasts. In The yeasts: a toxonomic study. 4 ed. Edited by C.P. Kurtzman and J.W. Fell.
Elsevier Science B.V.
Amsterdam. p.77-100, 1998.
ZAVON, M. R.; MEADOW, C. D. Vascular sequelae to cadmium fume exposure.
American
Industrial Hygiene Association Journal,
v.31, p.180-182, 1970.
ZUZUARREGUI, A.; DEL OLMO, M.
Analyses of stress resistance under laboratory
conditions constitute a suitable criterion for wine yeast selection.
Antonie Van
Leeuwenhoek,
v.85, n.4, p.271-280, 2004.
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