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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Departamento de Fisiologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia
Papel da MRP1/Bomba GS-X na regulação do
potencial redox celular, e a influência do
estado redox celular na expressão e atividade
da MRP1/bomba GS-X
Angela Kolberg
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas: Fisiologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
como requisito parcial para a obtenção do
título de Doutor.
Orientador:
Prof. Dr. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr
Porto Alegre
2005
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ii
Obrigado meu Deus, que na
sua infinita bondade me
impede de esmorecer
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iii
AGRADECIMENTOS
Não existem palavras que expressem suficiente agradecimento à minha
família... meu marido Carlos, e meus filhos Carolina e Wagner, que
estiveram sempre ao meu lado, compartilhando vitórias e derrotas,
rindo com minhas alegrias, amparando-me nas dificuldades, e, acima
de tudo demonstrando paciência inesgotável, ao longo destes tantos
anos.
Um agradecimento especial ao Professor Doutor Paulo Ivo Homem de
Bittencourt Junior, meu orientador.
Gostaria de agradecer ainda as Professoras Roselis Silveira Martins da
Silva, Maria Flávia Marques Ribeiro e Ilma Simoni Brum da Silva, pelo
apoio e orientação, bem como pelo empréstimo de material.
Em particular meus agradecimentos a duas pessoas especiais, minhas
alunas de iniciação científica Juliane Rossato e Bibiana Sgorla de
Almeida, que dividiram angústias e multiplicaram alegrias, além das
noites em claro.
Obrigada, também, Thiago Gomes Heck, pela ajuda na manutenção de
várias linhagens celulares que mantivemos em cultura
iv
Em especial, também, agradecer a Daiane da Rocha Janner, pelas
eletroforeses, protocolo de incorporação de Timidina e sua infindável
disponibilidade de ajudar a todos e a qualquer hora, mesmo, muitas
vezes, em detrimento de seu próprio trabalho.
E vale citar todo o grupo atuante no nosso laboratório, que, de uma
forma ou outra, trabalha em conjunto, oferecendo, aqui e ali, sua
colaboração: Maurício da Silva Krause, Elza Maria Santos da Silveira,
Mariana Ferraz Rodrigues, Daniela Mariano da Rocha Bandeira de Mello,
Damiana da Rocha Vianna, Lino Pinto de Oliveira Junior, João Antônio
Bonatto Costa, Alexandre Ramos Lazzarotto, Alexandre Maslinkiewicz,
Denise Jacques Lagranha.
Meus agradecimentos se estendem também à Dona Ritinha, nossa
incansável colaboradora.
Nossos agradecimentos à Coordenação da Pós-Graduação e, em
particular à Secretaria da mesma.
Este trabalho foi financiado pela FAPERGS (Porto Alegre, RS, Brasil,
Proc. 96/1120-1, 97/0285-2, 98/1653-6, 98/1062-6), FAPESP (São
Paulo, SP, Brasil, Proc. 93/3498-4), PROPESQ-UFRGS (Editais 01/98,
02/98, 2000 e Editais emergenciais) e Ministério de Ciência e
Tecnologia/Ministério de Educação PRONEX (168/97) porquanto gostaria
também de prestar meus agradecimentos pelo apoio.
“Somente em Deus, ó minha alma, espera silenciosa: dele
vem minha salvação. Só ele é minha rocha... o meu alto
refúgio...” (Salmo 62:1) ..... Obrigada Mãe.
v
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS_______________________________________________ iii
LISTA DE ABREVIATURAS _______________________________________ vi
RESUMO __________________________________________________________ ix
INTRODUÇÃO __________________________________________________01
OBJETIVOS _____________________________________________________28
MATERIAIS E MÉTODOS_____________________________________30
RESULTADOS___________________________________________________60
DISCUSSÃO ____________________________________________________92
CONCLUSÃO___________________________________________________107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_________________________111
APÊNDICE FINAL__________________________________________________x
ABSTRACT ____________________________________________________xxxxvii
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
AA ............................................ Ácido araquidônico
AINES ....................................... Antiinflamatórios não-esteróides
ATPase .................................... adenosina trifosfatase
BCG ......................................... Bacillus Calmette-Guérin
βME ………………………………………………. Beta-mercaptoetanol
BSA .......................................... albumina sérica bovina
BSO .......................................... butionina-sulfoximina
CDNB ....................................... 1-Cl-2,4-dinitrobenzeno
Con A ....................................... concanavalina A
COX ......................................... ciclooxigenase
CP-PG ...................................... prostaglandina ciclopentenônica
DAG ......................................... diacilglicerol
DEM ........................................ maleato de dietila
DHETE ..................................... ácido diidróxi-eicosatraenóico
DMSO ...................................... sulfóxido de dimetila
DNP-SG................................... (2,4-dinitrofenil)-S-glutationa
DTNB ......................... ............ ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
DTT.......................................... ditiotreitol
EET ......................................... ácido epoxieicosatrienóico
EGF .......................................... fator de crescimento epidérmico
EPA .......................................... ácido eicosapentenóico
EPOX ....................................... epoxigenase
ETYA ....................................... ácido eicosatetraenóico
FCS ........................................... soro fetal bovino
gadd ......................................... growth arrest DNA damage
GC............................................. glicocorticóides
GS-conjugado............................ S-conjugados de glutationa
GSH.......................................... glutationa (forma reduzida)
GSPx......................................... glutationa peroxidase
GSRd (GSSG).............................. redutase de dissulfeto de glutationa
GSSG........................................ dissulfeto de glutationa
GST........................................... glutationa S-transferase
GS-X......................................... bomba de glutationa
γ-GCS........................................ γ-glutamilcisteína sintetase
HEp-2........................................ carcinoma de laringe humano
vii
HETE........................................ ácido hidróxi-eicosatetraenóico
HPETE...................................... ácido hidroperóxi-eicosatetraenóico
HPLC........................................ High Performance Liquid Cromatography
HSE........................................... elemento de ligação dos HSF ao DNA
HSF........................................... fator de transcrição para HSP
HSP........................................... proteína de choque térmico
HSP70....................................... proteína de choque térmico de 70 kDa
HSP90....................................... proteína de choque térmico de 90 kDa
IL.............................................. interleucina
KETE........................................ ácido ceto-eicosatetraenóico
LDL.......................................... lipoproteína de baixa densidade
LOX .......................................... lipoxigenase
LPS........................................... lipolissacarídeo
LT............................................. leucotrieno
LX............................................. lipoxina
MAPK quinase.............................. quinase ativada por mitógenos
MAPKK...................................... MAP quinase quinase
MDR.......................................... resistência múltipla a drogas
MRP ......................................... proteína de multiresistência a drogas
MOPS........................................ ácido morfolinopropanossulfônico
MPA.......................................... ácido meta-fosfórico
MRP.......................................... proteína associada à MDR
NDGA....................................... ácido nor-diidroguaiarético
NEM.......................................... N-etil-maleimida
NK............................................. matadoras naturais
P-170........................................ glicoproteína MDR de 170 kDa
P-glicoproteína........................... glicoproteína MDR de 170 kDa
PBS........................................... salina tamponada com fosfato
PDGF........................................
fator de crescimento derivado de plaquetas
PG............................................. prostaglandina
PGA.......................................... prostaglandina A
PGD......................................... prostaglandina D
PGE.......................................... prostaglandina E
PGH ........................................ prostaglandina H
PGI........................................... prostaciclina
PGJ
2
.......................................... prostaglandina J
2
PGs........................................... prostaglandinas
PIPES....................................... ácido
piperazina N-N’-bis-(etanossulfônico)
PKA.......................................... proteína quinase A
PKC.......................................... proteína quinase C
PLA
1
......................................... fosfolipase A
1
PLA
2
......................................... fosfolipase A
2
PLase........................................ fosfolipase
PLC........................................... fosfolipase C
PLD........................................... fosfolipase D
viii
PMSF......................................... fluoreto de fenil-metil-sulfonila
PPAR-γ....................................... receptor -γ, ativado por peroxissomos
PUFA........................................ ácidos graxos poliinsaturados
ROS ........................................ Espécies reativas do oxigênio
SFB........................................... soro fetal bovino
TAG.......................................... triacilgliceróis
TBA.......................................... ácido 2-tiobarbitúrico
TBHP........................................ hidroperóxido de t-butila
TCA.......................................... ácido tricloroacético
TE ........................................... tampão de ensaio
TEM.......................................... tampão tris-EDTA-NaCl
TGF........................................... fator de crescimento transformante
TNF........................................... fator de necrose tumoral
TXA ........................................... tromboxana A
U............................................... unidades de atividade enzimática
UI.............................................. unidades internacionais
ix
RESUMO
Uma das complicações que levam o paciente terminal de
câncer à morte é a imunossupressão. Por sua vez, a superprodução de
prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) no plasma desses
indivíduos é um fator de risco para depressão imunológica já que as
CP-PGs bloqueiam inúmeras interações entre células imunológicas.
Estudos de nosso grupo revelaram que células tumorais apresentam
alta atividade da ATPase bomba GS-X/MRP que exporta conjugados
sulfidrila, inclusive CP-PG na forma de S-conjugados de glutationa. A
glutationa é uma das, ou a mais importante substância para
manutenção do estado redox celular. Como o acúmulo de proteínas de
choque térmico (HSP) induzidas pelas CP-PGs em células imunológicas é
indicativo do grau de estresse ao qual cada célula está sendo
submetida, neste trabalho, buscamos determinar qual a influência da
MRP1/bomba GS-X na presença de estresse celular causado por
desbalanço redox e os parâmetros de estresse celular necessários para
influenciar a expressão e/ou a atividade da MRP1/bomba GS-X. Nossos
resultados sugerem que linfócitos respondem bem a transfecção por
eletroporação com o gene da MRP1/bomba GS-X e que a presença
desta proteína possa conferir resistência ao tratamento com substâncias
eletrofílicas de maneira a ajustar o estado redox celular mais
rapidamente, o que impede o efeito citotóxico destas substâncias.
x
APÊNDICE FINAL
Reagentes e Soluções
PBS - Phosphate-buffered saline, NaCl 136,8 mM, KCl 2,7 mM, KH
2
PO
4
0,9 mM e Na
2
HPO
4
6,4 mM em água milliQ, pH 7,4.
Solução Hanks I - NaCl 136,8 mM, KCl 5,4 mM, MgSO
4
0,8 mM,
Na
2
HPO
4
0,3 mM, KH
2
PO
4
0,5 mM, NaHCO
3
12 mM, HEPES 1 mM,
EGTA 1 mM e albumina bovina (BSA, fração V, Sigma) 2 g/l em água
destilada. Antes da adição do BSA, a solução foi gaseificada por 10 min
em corrente de carbogênio (5% CO
2
/95%O
2
) tendo tido o pH ajustado
para 7,4 com NaOH 10 M.
Solução Hanks II - NaCl 136,8 mM, KCl 5,4 mM, MgSO
4
0,8 mM,
Na
2
HPO
4
0,3 mM, KH
2
PO
4
0,5 mM, NaHCO
3
12 mM, HEPES 1 mM,
CaCl
2
1 mM, BSA 2 g/l e colagenase (de Clostridium histolyticum, tipo
V, Sigma) 1 g/l em água destilada. Antes da adição do BSA e da
colagenase, a solução foi gaseificada por 10 min em corrente de
carbogênio tendo tido o pH ajustado para 7,4 com NaOH 10 M.
Solução Krebs-Henseleit - NaCl 115,0 mM, KCl 5,0 mM, NaHCO
3
24 mM, HEPES 1 mM, CaCl
2
1 mM, MgCl
2
1 mM, glicose 5,6 mM e BSA
4 g/l. Antes da adição do BSA, a solução foi gaseificada por 10 min em
xi
corrente de carbogênio tendo tido o pH ajustado para 7,4 com NaOH
10 M.
Outros materiais e reagentes analíticos - Os demais reagentes
analíticos utilizados foram de procedência da Sigma Chemical Co. (P.O
BOX 14508 St. Louis, MI, 63178 USA), Merck (Darmstadt, DR),
Boehringer (Mannheim, DR), GIBCO (Scotland, UK), Ecibra Ind. e Com.
de Produtos Químicos Ltda. (São Paulo) e Reagen (Rio de Janeiro)
conforme indicado em cada caso. Todas as enzimas utilizadas foram
obtidas junto à Sigma ou Boehringer. Solventes grau cromatográfico
para HPLC e TLC foram fornecidos pela Merck (Darmstadt, DR).
Materiais para transfecção e crescimento de bactérias
Tampão Tris – Lubrol :
Tris................................................................10,0mM
EDTA..............................................................2,0mM
βME................................................................1,4mM
Lubrol.............................................................0,5 %
Água Milli- Q(q.s.p)......................................... q.s.p.
Tampão Tris –EDTA(TE):
Tris..............................................................10,0mM
EDTA.............................................................1,0mM
Água Milli-Q(q.s.p)...........................................100ml
Tampão ácido acético/acetato (Tampão de lise):
xii
Ácido acético glacial.........................................0,89ml
Acetato de sódio................................................2,89g
Água Milli-Q(q.s.p)..........................................1000ml
Tampão TBE (pH 8,3 a 8,6):
Ácido bórico....................................................5,3g
Tris..............................................................10,8g
EDTA (5M pH8,0)..........................................4,0ml
Gel de Agarose (0,8%):
Agar..............................................................0.8g
TBE (q.s.p)..................................................100ml
Brometo de etídio................2μl de solução 10 mg/ml
Tampão de amostra para DNA:
Glicerol ........................................................ 50%
EDTA (pH8,0)............................................... 1mM
Azul de bromofenol..................................... 0,25%
Xilenocianol FF............................................. 25%
Meio líquido LB, pH 7,4:
Triptona.......................................................10,0g
Extrato de levedura........................................5,0g
NaCl.............................................................5,0g
xiii
NaOH 1N.....................................................1,0ml
Água Milli-Q(q.s.p).....................................1000ml
Meio Sólido LB pH 7,4:
Triptona....................................................10,0g
Extrato de levedura.....................................5,0g
NaCl..........................................................5,0g
NaOH 1N..................................................1,0ml
Ágar........................................................15,0g
Solução de ampicilina 4mg/ml:
Ampicilina...................................................0,2g
PBS (q.s.p).............................................50,0ml
Substrato para peroxidase (para revelação de
segundos-anticorpos):
DAB (diaminobenzidina)...............................6mg
TRIS (50mM, pH 7,6)..................................10ml
H2O2 30%..................................................10μl
CDNB (1-Cl-2,4-dinitrobenzeno) 100mM:
CDNB....................................................202,6mg
Etanol.......................................................10ml
xiv
Meio SOC:
Extrato de levedura...............................5g/100ml
Triptona...............................................2g/100ml
NaCl........................................................10mM
KCl..........................................................2,5mM
MgCl
2
. 6 H
2
O............................................10mM
MgSO
4
. 7 H
2
O.............................................10mM
C
6
H
12
O
6
.......................................................20mM
OUTROS REAGENTES ESPECÍFICOS UTILIZADOS
TEN 10x (1 litro)
• TRIS 0,5 M 60,55 g acertado o pH para 7,4 com HCl
conc.
• EDTA 50 mM 18,61 g
• NaCl 1,5 M 87,66 g
• Água MilliQ q.s.p 1 litro
TEN-Tween 1x (1 litro)
• Foi diluido o TEN 10x com água MilliQ a 1:10 (100 ml de TEN + 900
ml de água)
• Foi adicionado 450 μl de Tween 20 (ρ
Tween20
=1,1 g/ml) por litro de
TEN diluído
xv
• As concentrações finais foram:
Tris 50 mM
EDTA 5 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0,05% (w/v)
Transfer Buffer (1 litro)
• Glicina (grau eletroforese) 39 mM 2,9 g
• Tris (grau eletroforese) 48 mM 5,8 g
• SDS (grau eletroforese) 0,037% (w/v) 370 mg
• Metanol 20% (v/v) 200 ml
• Os reagentes sólidos foram dissolvidos em cerca de 700 ml de água
MilliQ sob agitação e acertado o pH para 8,3 com HCl concentrado
• O metanol foi adicionado e o volume completado para 1 litro.
xvi
“Sample Buffer"
• Água MilliQ 19,0 ml
• Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 5,0 ml final 62,5 mM
• Glicerol (grau Biol. Mol.) 4,0 ml final 10% (v/v)
• SDS 10% (w/v) 8,0 ml final 2% (w/v)
• β-Mercaptoetanol 2,0 ml final 5% (v/v)
• Azul de Bromofenol 1% (w/v) 2,0 ml final 0,05%
(w/v)
Commassie Blue (1 litro)
• Água MilliQ 500 ml
• Ácido acético glacial 100 ml (final 10% v/v)
• Metanol 400 ml (final 40% v/v)
• Commassie R250 1 g (0,1% w/v)
Solução de Lise para Eletroforese (10 ml)
• SDS 100 μl da solução a 10% (final 0,1% w/v)
• Leupeptina 4 μl da solução 5 mg/ml em água (final
2 μg/ml)
xvii
• Água MilliQ ...9 ml
• Agitado e conservado no freezer (-20
º
C)
• Foi adicionado 1 μl de solução de isopropanólica de PMSF 100 mM
(concentração final 100 μM) por ml de solução de lise apenas no
momento da homogeneização porque o PMSF é muito instável em
meio aquoso.
• Foi quantificado o número de células e estimada a quantidade de
proteínas (10
7
células ~1 mg de proteína) de forma a ser obtido um
homogenato a cerca de 2 mg de proteína por ml, que, quando diluído
com Sample Buffer a 1:1 forneceu solução a 1 mg/ml (50 μg/50 μl
nos wells).
• Células: foi homogeneizado o pellet celular e adicionada a
quantidade adequada de Solução de Lise. As células foram
homogeneizadas com seringa de insulina (cerca de 10x) e sonicadas.
Foram, então, centrifugaddas por 2 min a 15.000 x g e a proteína,
no sobrenadante, dosada em triplicata na leitora de ELISA. Foi
transferida quantidade conhecida de sobrenadante para um outro
tubo (Eppendorf) e adicionada a mesma quantidade de Sample
Buffer. Fervidas as amostras por 5 min.
xviii
Tampão de Eletrodo para Eletroforese
(Running Buffer 5x – suficiente para 12 corridas)
• Tris (grau eletroforese) 15 g
• Glicina (grau eletroforese) 72 g
• SDS (grau eletroforese) 5 g
• Os reagentes foram dissolvidos sob agitação em 1 litro de água MilliQ
(o pH final deve ser 8,3). Conservado na geladeira. No momento da
corrida aguardou-se que a temperatura ambiente fosse atingida
antes de diluir 1:5 (80 ml + 320 de água).
Procedimentos
1) As proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose;
2) As bandas foram visualizada com vermelho Ponceau e
posteriormente fotografadas e digitalizadas para registro);
3) A membrana foi lavada com TEN-Tween até o desaparecimento das
bandas;
4) AS membranas foram então incubadas com solução de bloqueio
(Leite Molico desnatado a 5% ou BSA a 1% em TEN-Tween) 2 horas
à temperatura ambiente com agitação vigorosa;
5) A solução de bloqueio foi removida e o primeiro anticorpo foi
adicionado em solução de bloqueio (0,1 ml por cm
2
de membrana =
xix
aprox. 5 ml para minigéis em placas de petri, potes de plástico ou
sacos plástico selados);
6) Os anticorpos para HSP70 foram incubados por 2 horas e para MRP1
foram incubados overnight, à temperatura ambiente sob agitação
vigorosa;
7) Após o devido tempo a membrana foi lavada 3 vezes com solução de
bloqueio (5 ml), 10 minutos cada;
8) Foi adicionado o segundo anticorpo em solução de bloqueio e
incubado por 2 horas sob agitação;
9) As membranas foram lavadas 3 vezes com 10 ml de TEN-Tween por
10 minutos cada;
10) Foi preparada a revelação por ECL;
11) Após a revelação as membranas foram digitalizadas para registro
permanente
12) A aquisição de dados foi feita no sistema VDS-Image Master
Preparação dos Anticorpos Utilizados
Veículo:
Incubações de 2 h: apenas tampão de bloqueio
Overnights: tampão de bloqueio com azida sódica (APENAS P/ O
PRIMÁRIO)
Anticorpos secundários foram ser incubados em NaN3-free sols.
Policlonais: 1:100 a 1:5000
Monoclonais SOBRENADANTES DE HIBRIDOMAS: sem diluir até
1:100
Monoclonais ASCITE DE CAMUNDONGOS: 1:1000 a 1:10.000
xx
- mouse anti-human HSP70 (Sigma H5147; ascite) 1:1000 (5 μl em 5 ml
solução de bloqueio)
- mouse anti-human MDR (Sigma P7965; ascite) 1:1000 (5 μl em 5 ml
solução de bloqueio)
- mouse anti-human MRP (QCRL-1, sobrenadante de hibridoma)
recomendado: 1:1000
- anticorpo secundário rabbit anti-mouse Ig (Sigma A9044) 1:100 a
1:1000
SDS-PAGE E WESTERN BLOTTING
Para cada amostra preparada, quantidades iguais de proteína
(cerca de 30 μg, determinada pelo método Bradford, (a seguir) foram
separadas durante 4 h (a 15 mA/gel) à temperatura ambiente (25ºC)
por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-
PAGE). Foi utilizado sistema vertical Slab Gel BIO-RAD Mini-Protean II
(BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) e tampão de corrida
constituído de Tris a 25 mM, glicina a 192 mM e SDS a 1% (m/v),
pH 8,3, usando-se 1 cm de gel de empilhamento (entrada) a 4% (m/v)
e gel de separação a 10% (m/v) em termos de monômero de
acrilamida, para corridas em géis de 10 cm em tampão de amostra
redutor constituído de Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, glicerol a 10% (v/v),
SDS a 2% (v/v) e β-mercaptoetanol a 5%, conforme descrito em
KOLBERG e cols. (2005) adaptado de SANTORO e cols. (1989). Como
marcador de peso molecular foi utilizada a mistura de padrões de pesos
moleculares previamente coloridos (BIO-RAD Kaleidoscope Polypeptide
Standards) com as seguintes proteínas: miosina (200 kDa), fosforilase
xxi
b (92,5 kDa), BSA (69 kDa), ovalbumina (46 kDa), anidrase carbônica
(30 kDa) e lisozima (14 kDa). Depois das corridas, os géis foram
destacados das placas de suporte, tendo os géis de separação sido
removidos.
Após as corridas os géis foram corados e fixados sob
agitação contínua com solução de Azul Comassie Brilhante 0,1% (m/v),
metanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v) durante 20 min e
submetidos a descoloração com agitação por cerca de 2 h em solução
de ácido acético glacial a 5% (v/v) até que fossem evidenciados os
padrões de peso molecular (ainda fortemente corados contra o fundo já
parcialmente descorado dos géis). Os géis foram, então, transferidos
para película de PVC (Whatman 3MM) e secos a 80°C por 2 h em
secador de géis BIO-RAD Gel Driyer a vácuo programável. Depois de
secos, os géis corados foram submetidos a densitometria no
equipamento (Amersham Pharmacia Biotech) Video Documentation
System de aquisição digital e processamento de imagens.
As amostras contidas em géis destinados a processamento
por Western blotting, como descrito em KOLBERG e cols. (2005),
adaptado de ELIA & SANTORO (1994), foram transferidas diretamente
para membranas de nitrocelulose (Millipore) em sistema refrigerado
BIO-RAD Blot Cell a 70 V até um total de 150 V x h. Após a
transferência, as bandas, contendo proteínas, foram evidenciadas pela
coloração com Vermelho Ponceau, foram então lavadas três vezes com
água destilada até a visualização das bandas. A membrana foi então
fotografada e submetidas a densitometria no equipamento (Amersham
xxii
Pharmacia Biotech) Video Documentation System de aquisição digital e
processamento de imagens.
Após a aquisição da imagem, a membrana foi cuidadosamente
lavada, para eliminar qualquer resíduo do Vermelho Ponceau, e mantida
em 10 ml de tampão de bloqueio (blotto), sob agitação durante 2 horas.
IMMUNOBLOTTING COM SEGUNDO-ANTICORPO CONJUGADO A
PEROXIDASE
TAMPÃO DE BLOQUEIO (BLOTTO)
- Leite Molico Desnatado a 5% (w/v): 500 mg de Leite Molico
desnatado em 10 ml de TEN-Tween 20 ou BSA a 1% em TEN-Tween
20 (100 mg de BSA/10 ml de TEN-Tween)
- NaN3-free/Phosphate-free
TAMPÃO DE BLOQUEIO para OVERNIGHTS à temperatura ambiente
- Leite Molico desnatado a 5% ou BSA 1%
- NaN
3
0,02% (20 mg/100 mL)
- Veículo: TEN-Tween 20
SUBSTRATO PARA REVELAÇÃO DA PEROXIDASE (DAB 1,67 mM)
- 3,3’,4,4’-tetraaminobifenila (= 3,3’-diaminobenzidina, DAB)
- Sigma D8001 (free base, MW 214,3) ou Sigma D5637 (tetra-HCl, FW
360,1)
- PREPARADO A FRESCO no momento da revelação!
xxiii
- Dissolvido 6,01 mg de DAB-4HCl em 10 ml de Tris pH 7,6.
WESTERN BLOT PARA HSP70 E MRP COM REVELAÇÃO POR
ECL
Reagentes
Foram os mesmos utilizados para Western blot para HSP70 ou MRP1 e
outras proteínas de alta expressão: blotto com leite desnatado, TEN-
Tween 20 e anticorpos secundários marcados com HRP (peroxidase)
Princípio
A proteína foi separada por SDS-PAGE (10% funciona muito bem) e
transferida para membrana de nitrocelulose. Depois, a membrana foi
incubada com o primeiro anticorpo e em seguida com o segundo
anticorpo marcado com peroxidase. Adicionou-se Lumigen PS-3
(Acridan, Amersham) e peróxido de hidrogênio que desenvolve
quimiluminescência é quantificada por exposição da membrana tratada
a um filme de raios X ou outro específico para quimiluminescência.
Procedimento
• Células (linfócitos) foram obtidas e purificadas conforme as técnicas
indicadas.
• As células (cerca de 0,5-1,0 mg de proteína) foram, então, lisadas
em 100-200 μl de SDS 0,1% contendo PMSF 100 μM (1 μl da solução
xxiv
100 mM/ml de SDS) e leupeptina 2,0 μg/ml final (4 μl da solução
5 mg/ml em água).
• O homogenato foi misturado à razão de 1:1 com Tampão de Amostra
para SDS-PAGE e as amostras fervidas por 5 min a 100
o
C.
• Para SDS-PAGE, cerca de 20 μg de proteínas foram separadas em
gel de 8,5% e transferidas para membranas de nitrocelulose para
blotting durante 4 h a 150 mA ou a voltagem constante.
• As membranas foram incubadas por 2 h em BLOTTO (TEN-Tween 20
contendo leite desnatado a 5%, m/v) e, depois, incubadas overnight
a 4
o
C com o anticorpo primário anti-MRP1 (clone QCRL-4 – SIGMA
M9192) (1:1000) em BLOTTO.
• Depois das lavagens convencionais em TEN-Tween, as membranas
foram incubadas com o segundo anticorpo (SIGMA A9044) (1:1000)
por 2 h à temperatura ambiente.
• Utilizando o kit ECL Plus (Amersham Biosciences, RPN2132),
retirados da geladeira os frascos dos reagentes A (ECL Plus substrate
em Tris) e B (Solução estoque de Acridan em dioxano e etanol) e
esperou-se que a temperatura dos frascos equilibre-se com a
temperatura ambiente. Obs.: Os procedimentos seguintes foram
realizados na câmara escura com um mínimo de iluminação através
de filtro Kodak vermelho.
• Na câmara escura, com a luz apagada, sob a lanterna vermelha
conservando uma certa distância da bancada de trabalho foi cortado
um pedaço de filme de raios X (Hyperfilm, Amersham ou equivalente
sensível a quimiluminescência) e colocado sobre um cassete de
exposição aberto (sobre a superfície branca do Enhancing Screen).
xxv
Marcado um dos lados do filme para ser ajustado à marca ou corte
feito na membrana.
• Foi aberto um pedaço de filme de PVC (Magipac ou semelhante)
esticado sobre o filme de raios X contra a superfície lisa do cassete
de exposição de maneira a que não se formassem bolhas de ar e que
não existissem imperfeições entre o filme de raios X e o filme de PVC
onde a membrana foi depositada para exposição.
• Foram misturados os reagentes A e B num pequeno béquer à razão
de 40:1 de forma que o volume final de mistura de detecção foi de
0,1 ml/cm
2
(100 μl do reagente B em 4 ml do tampão A, são o
suficiente para membranas de 40 cm
2
como as utilizadas em nossos
experimentos com cubas Mini Protean II da BioRad).
• Foi removido o excesso de TEN-Tween utilizado nas lavagens finais
após o segundo anticorpo com o auxílio de um papel filtro
encostando-o nas bordas da membrana.
• Foi cortado outro pedaço de filme de PVC grande o suficiente para
servir como recipiente de ensaio contendo a membrana e colocada a
membrana sobre este filme de PVC com a face contendo as proteínas
voltada para cima.
• Foi adicionada a mistura de detecção (A+B) sobre a membrana
agitando levemente na palma da mão, por cerca de 5 min, de
maneira que o reagente de ECL espalhou-se homogeneamente sobre
a mesma. Neste ponto, a visualização das bandas foi feita apagando-
se a lanterna de segurança e observando-se a produção de intensa
luminosidade verde brilhante (tipo fluoresceína).
xxvi
• Quando a quantidade de luz emitida pelas bandas foi considerada
suficiente (3-5 min), retornou-se o reagente para o béquer de
origem e foi drenado o excesso com o auxílio de um papel filtro
aplicado às bordas da membrana.
• Deitou-se a membrana contra o filme de PVC que recobre o filme de
raios X de maneira a fazer coincidir as marcações da membrana e do
filme fotográfico e com a face contendo as proteínas a serem
detectadas voltada para o filme.
• O cassete foi fechado e aguardou-se cerca de 20 segundos.
• Revelação e fixação: o filme foi passado, inicialmente, pelo revelador
(2 a 3 min, cessando-se o banho quando foi observada a formação
das manchas correspondentes às bandas de interesse de maneira a
não ter-se grandes backgrounds), lavado em água corrente, passado
em banho de ácido acético a 10%, lavado em água corrente e
colocado no banho com o fixador (3-5 min). Após1-2 min no fixador,
quando a luz da câmara foi acesa novamente.
• Após a revelação do filme, foi feita uma estimativa do tempo de
exposição, o mesmo foi suficiente para obtenção de boas manchas.
• As bandas detectadas registradas em VDS.
• Revelação por ECL – Luminol e ácido p-coumárico. Ácido p-
coumárico, p-Iodofenol, fenol e anilina são enhancers do sistema de
quimiluminescência (QL) luminol-H
2
O
2
-horseradish peroxidase (HRP).
Enquanto esses enhancers podem ser utilizados para a dosagem
peróxido de hidrogênio em minutas quantidades, os sistemas
completos (com H
2
O
2
) promovem enhanced chemiluminescence
xxvii
(ECL) podendo ser utilizados na detecção de anticorpos marcados
com peroxidase (HRP), tanto em ELISA quanto em Western blots.
Luminol Ácido p-coumárico
REAGENTES:
Tris 1,5 M pH 8,8
DMSO em quantidade suficiente para preparar estoques de luminol e
p-coumárico
Ácido p-coumárico (Fluka, cód. 28200)
Luminol (3-aminophthalhydrazide = 3-aminoftalidrazida) grau QL
(Fluka, cód. 09253)
Peróxido de hidrogênio 30% (Merck ou Sigma); tem que ser um grau
analítico bom porque metais interferem na reação de QL
xxviii
PREPARAÇÃO:
Soluções-Estoque:
Ácido p-coumárico (MW 164,16): 150 mg em 10 mL de DMSO = 91,4
mM = congelado em pequenas alíquotas (250 ou 440 μL); durante os
experimentos, usado e recongelado (-20°C)
Luminol (MW177,16): 440 mg em 10 mL de DMSO = 248,4 mM =
congelado em pequenas alíquotas (250 ou 440 μL); durante os
experimentos, usado e recongelado (-20°C)
Reação (preparada apenas no momento das REVELAÇÕES:
Solução 1: 5 mL de Tris 1,5 M pH 8,8
50 μL de luminol (2,484 mM nesta solução; final 1,242 mM)
22 μL de ac. p-coumárico (402,2 μM nesta solução; final 201,1 μM)
Solução 2: 5 mL de Tris 1,5 M pH 8,8
6 μL de H2O2 30% (0,036% nesta solução; final 0,018%)
Reagente de Trabalho: 5 mL da Sol. 1 + 5 mL da Sol. 2; revelado
imediatamente.
Biology, Section III DETECTION OF PROTEINS, Chapters 10.7
(Detection of Proteins on Blot Transfer Membranes) and 10.8
(Immunoblotting and Immunodetection), John Wiley & Sons, Inc.,
2003.
xxix
“STRIPPING” E RESSONDAGEM DE MEMBRANAS
Em muitos experimentos, a reutilização das membranas de
nitrocelulose para ressondagem com outro anticorpo é importante para
efeito de controle. A completa remoção do primeiro e do segundo
anticorpos após a detecção pode ser realizada pela técnica a seguir. As
membranas, quando necessário, foram ressondadas, sempre mantidas
em refrigerador e úmidas (TEN-Tween) entre as sondagens.
Solução de strip:
β-mercaptoetanol 100 mM (puro = 14,3 M, d=1,11 g/ml)
SDS 2%
Em Tris-HCl 62,5 mM pH 6,7
Foi dissolvido 1,082 g de Tris em 130 ml de água MilliQ e acertado o
pH para 6,7 com HCl. Dissolver 2,86 g de SDS (grau Eletroforese) na
solução de Tris e adicionado 1 ml de β-ME sob agitação. Completado o
volume para 143 ml com água.
Procedimento
• A membrana foi submersa na solução de strip e incubada por 30 min
a 50
o
C.
• Lavada a membrana 2x com TEN-Tween, por 10 min cada, à
temperatura ambiente, utilizando-se de grandes volumes da solução
de lavagem (exemplo: 10-20 ml para membranas de 40 cm
2
).
• Incubada em BLOTTO e procedido como de costume para o restante
das operações de Western blot.
xxx
Purificação de DNA plasmideal a partir de 50ml cultura
de Escherichia coli (“midiprep”)
1. Foram transferidos 50ml da cultura “overnight” de E.Coli para um
falcon de 50ml, e centrifugado a 7700 g, por 10 minutos para peletar as
células.
2. O SN foi aspirado sem perturbar o pellet celular, ficando o mais seco
possível.
3. O pellet foi ressuspenso em 5ml da Solução I, sob agitação
vigorosa.
4. Foram adicionados 5ml da Solução II e misturado por inversão
repetida do tubo. Incubado a temperatura ambiente por 5 minutos.
Nota: A suspensão bacteriana deve estar clara por ação da lise celular.
5. Foram adicionadoa 5ml da Solução III e misturado por inversão
repetida do tubo. Incubado em gelo por 10min.
6. Foi centrifugado a 12000 G por 15min a temperatura ambiente.
7. O SN foi transferido para um tubo de centrífuga limpo. (O DNA
cromossomal desnaturado fixou-se ao tubo durante a remoção do SN).
8. Foram adicionados 10,5ml (0,7 volume) de isopropanol, à
temperatura ambiente, ao SN e agitado para misturar. Foi incubado por
10 minutos a temperatura ambiente.
9. Segui-se nova centrifugação a 12000 g por 20minutos para peletar o
DNA plasmideal. O SN descartado e o tubo invertido para secar.
xxxi
PURIFICAÇÃO DO DNA
1. O Sephaglass FP foi suspenso agitando a garrafa. Foram
adicionados 5ml da suspensão ao pellet de DNA, e agitado gentilmente
por 1 minuto para dissolver o pellet.
2. Seguiu-se incubação à temperatura ambiente por 10minutos.
Agitando gentilmente a amostra, à cada 2 minutos, para manter o
sephaglass em suspensão.
3. Centrifugado a 1000 x g por 2 minutos, em uma centrifuga de
bancada. Cuidadosamente removido o SN sem perturbar o pellet de
sephaglass.
4. O pellet de sephaglass foi lavado adicionando 5ml de Tampão de
Lavagem (“Wash Buffer”), e agitando gentilmente para ressuspendê-lo.
Foi centrifugado a 1000 x g por 2 minutos em uma centrifuga de
bancada. O SN removido sem perturbar o pellet.
5. Foram adicionados 5ml de etanol 70% ao pellet de sephaglass, e
agitado gentilmente para ressuspendê-lo. Seguiu-se nova centrifugação
a 1000 x g por 2 minutos em uma centrifuga de bancada. Foi removido
o sobrenadante sem perturbar o pellet.
6. Seguindo-se ao enxágüe com etanol, foi centrifugado a 1000 x g por
um minuto, sem a tampa. E, cuidadosamente, coletado com uma pipeta
todo resíduo de etanol.
xxxii
7. Fechado o tubo e dispersado parcialmente o pellet de sephaglass.
Deixado ao ar para secagem por 20-30minutos a temperatura
ambiente.
Nota: Não foi seco com vácuo. Secagem extensa iria dificultar a eluição do DNA do
sephaglass.
8. Para eluir o DNA ligado do sephaglass, foram adicionados 500μl de
TE e agitou-se para ressuspender o pellet. Foi incubado por 10minutos
a temperatura ambiente. Agitando ocasionalmente para manter o
sephaglass em suspensão.
9. Foi centrifugado a 1000 x g por 5 minutos em uma centrífuga de
bancada. Transferido o SN para um tubo de microcentrífuga limpo,
evitando o pellet de sephaglass no fundo do tubo.
Protocolo para extração de DNA plasmideal por
Isopropanol-Fenol-Clorofórmio
REAGENTES
Tampão GTE pH 8,0 (para 10 ml)
50 mM Tris-HCl
10 mM EDTA
50 mM glicose
Dissolvido 60,55 mg de Tris em cerca de 9 ml água MilliQ e
adicionado 3,722 mg de EDTA (sal dissódico). Acertado o pH para 8,0
xxxiii
com HCl concentrado e adicionado 9,010 mg de glicose. Completado o
volume para 10 ml com água MilliQ.
Solução de Lise (NaOH 0,2 M e SDS 1%)
Preparada solução-estoque de NaOH 5M (2 g/10 ml de água MilliQ) e
SDS 5% (w/w) (pode ser preparada diluindo-se das soluções
concentradas de SDS a 10 ou 20% ou pesando-se SDS Grau Biologia
Molecular, 500 mg/10 ml de água MilliQ).
Num tubo de ensaio, pipetada 1,9 ml de água destilada.
Adicionados 100 μl de NaOH 5M.
Adicionados 500 μl de SDS 5%.
Agitado.
Solução de Acetato de Potássio 5 M
Dissolvidos 28,06 g de hidróxido de potássio (KOH, FW 56,11) em 60
ml de água MilliQ.
Adicionado 11,5 ml (0,2011 mol) de ácido acético glacial (MW 60,05; d
= 1,05 g/ml) e acertar o pH entre 4,8 – 5,0. Completado com água
destilada para 100 ml.
PROCEDIMENTO
1. A cultura de bactérias competentes foi colocada para crescer (5 ml
de meio LB, 50 μl de bactérias). Foram adicionados 62,5 μl de
ampicilina à cultura = CULTURA OVERNIGHT (9-16 h crescido em
xxxiv
placa de Petri com antibiótico para selecionar as colônias; selecionada
uma colônia única e preparados os OVERNIGHT por 9-16 h).
2. 1 ml da cultura overnight foi transferido para um balão de 250 ml,
contendo 50 ml de meio LB e 625 μl de ampicilina e foi, novamente ,
crescido overnight com agitação vigorosa a 37
o
C.
3. Foi lida a absorbância a 600 nm, em torno de 4/ml para a amostra
concentrada (para ler no espectrofotômetro, a amostra foi diluida a
1:10 com água tomando 100 μl de suspensão e dispersando em
900 μl de água; a absorbância da amostra diluída girou em torno de
0,4 nm).
4. As bactérias foram precipitadas em tubos de centrífuga estéreis
tipo Falcon (50 ml) a 6.000 x g por 10 min, a 4
o
C. Desprezado o
sobrenadante.
5. O pellet foi ressuspenso em 1 ml de solução salina (ou PBS) e
transferido para um tubo de microcentrífuga de 2 ml (Eppendeorf).
6. Foi lavado o tubo onde estavam as bactérias centrifugadas
(Falcon) com mais 1 ml de salina (ou PBS) e adicionado ao tubo
Eppendeorf.
7. Foi centrifugado rapidamente (cerca de 2 min) em microcentrífuga
para precipitar as bactérias.
8. O sobrenadante foi aspirado cuidadosamente,
9. O pellet foi ressuspenso em 400 μl de Tampão GTE, contendo 2 μl
de RNAse (EC 3.1.27.5; de pâncreas bovino – US Biological R2011 ou
xxxv
de E. coli Y01220 Invitrogen) a 10 mg/ml para uma concentração
final de 50 μg/ml. Agitado vigorosamente no vórtex por 30 s e
deixado o tubo por 2 min à temperatura ambiente para permitir a
ação da RNAse sobre os fragmentos de RNA evitando que os mesmos
co-purifiquem com o DNA plasmideal.
10. Foi adicionado 1 ml de Solução de Lise (NaOH 0,2M e SDS 1%)
preparada a fresco.
11. Foi agitado gentilmente pelo método de inversão (10 a 20 vezes)
e incubado por 5 min em gelo.
Obs.: A suspensão não permaneceu nesta solução por mais que 5
min porque poderia haver rompimento do DNA genômico que iria co-
purificar com o plasmídeo.
12. As amostras foram neutralizadas com 600 μl de Acetato de
Potássio 5 M pH 4,8 gelado e agitado gentilmente pelo método de
inversão (10 – 15 vezes) até diminuir a viscosidade.
Obs.: O precipitado celular neutralizado precisa ser quebrado
efetivamente para garantir uma eficiente recuperação do DNA
plasmideal. No entanto, não se pode agitar (em vórtex ou com a pipeta)
vigorosamente já que isso ocasionaria a co-purificação do DNA
genômico ao plasmideal.
13. Foi incubado por 5 minutos em gelo.
14. Seguiu-se centrifugação a 12.000 x g por 5 min a 4
o
C em
microcentrífuga refrigerada com adaptador para tubos Eppendorf (rotor
SS-34).
xxxvi
15. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de
microcentrífuga. Cuidou-se para não aspirar o precipitado que
contém o DNA cromossomal que é indesejado.
16. Para determinação da concentração de DNA final foram utilizadas
cubetas de quartzo, em espectrofotômetro da seguinte maneira:
aliquotados 2 μl da solução de plasmídeo preparada e dissolvida em
498 μl de TE. Determinada a absorbância nos seguintes comprimentos
de onda utilizando o espectrofotômetro Amersham Bioscences
Ultrospec 2000, e o seguinte protocolo:
MODE → ABSORBANCE →
CONCENTRATION → NUCLEIC ACIDS
↓
DNA (ENTER)
BACKGROUND = YES (ENTER)
na posição 1) foi colocada a cubeta com TE
(blank) SET REFERENCE
(na posição 2) foi colocada a cubeta com 2 μl
da solução de plasmídeo preparada e
dissolvida em 498 μl de TE → RUN
O RESULTADO É DADO EM μg de DNA /ml
A RAZÃO 260/280 (PUREZA ≈ 2.0)
Para os cálculos:
1 UAbs
260 nm
= 50 μg/ml de DNA ou 40 μg/ml de RNA ou 33 μg/ml de
oligonucleotídeos
Referências Bibliográficas:
• Protocolo Unit. 1.7.1 Current Protocols in Molecular Biology
• Kit GFX
TM
Microplasmid prep kit (Amersham Biosciences)
xxxvii
ABSTRACT
A very common complication among lat-stage cancer patients
is immunossupression and or caquexy. Overproduction of
cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) in the blood is an important
risk factor for the development of immune system blocking. Results
from this group have revealed that tumor cells, present a high
expression of an ATPase, the GS-X pump, coded by MRP genes, which is
responsible for exportation of S-conjugates, including de CP-PGs
conjugated with glutathione (GSH). Glutathione is one of the most
important substances involved on redox balance maintenance. Since the
accumulation of heat shock proteins (HSP) induced by CP-PGs in
immune cells is an indicative of the degree of cellular stress to which a
cell may be submitted, in this work we searched for the influences of
MRP1/GS-X pump in presence of cellular stress caused by unbalanced
redox state and cellular stress parameters needed to enhance the
expression or activity of MRP1/GS-X pump. Our results showed that
lynphocites have a good response to transfection with the MRP1/GS-X
gene, by electroporation, and a suggested correlation between presence
of GS-X pump (MRP-1 expression) and also could play a role on
regulate intracellular redox status and that lymphocytes transfected
with human MRP1 gene presented a higher resistance to redox changes.
1
INTRODUÇÃO
1 Considerações Gerais
A relação oxidação-redução, ou estado "redox" celular é fator
significativo para a manutenção e defesa das células. SINDHU e cols.
(2005) demonstraram que o sistema de defesa antioxidante debilitado
tem papel significativo na patogênese do estresse oxidativo verificado
na insuficiência renal crônica. Evidências implicam o estresse oxidativo
na doença de Alzheimer, como a presença do aldeído 4-hidróxi-2-trans-
nonenal (HNE), produto da peroxidação lipídica da membrana. A classe
alfa das glutationa-S-transferases (GST) podem destoxificar o HNE e
têm importante papel na proteção celular contra o estresse oxidativo
(SULTANA e BUTTERFIELD, 2004). A manutenção do estado redox
intracelular é uma estratégia precisa que permite às células uma
eficiente habilidade de contra-atacar o meio extracelular altamente
oxidante.
Moléculas contendo grupos tiol, como a glutationa e
tiorredoxina contribuem para a homeostase do estado redox
intracelular. Funções celulares essenciais, como a expressão de genes,
são influenciadas pelo equilíbrio entre condições pró e anti-oxidantes. O
mecanismo pelo qual a transcrição de genes específicos é regulada pelo
estado redox em células eucarióticas é bastante complexo, porém,
pesquisas da última década sugerem que fatores de transcrição
2
sensíveis ao estado redox têm papel importante neste processo
(ARRIGO, 1999).
LE BRAS e cols. (2005) descreve o envolvimento das espécies
reativas de oxigênio (ERO), nas diferentes fases da via apoptótica, tal
como a indução de permeabilidade mitocondrial, liberação de fatores
de amplificação da morte mitocondrial, ativação das caspases
intracelulares e injúria ao DNA. Por exemplo, a alteração das proteínas
constitutivas mitocondriais induzidas pelas ERO, tais como canal
aniônico dependente de voltagem (VDAC – do inglês voltage-dependent
anion channel) e/ou o nucleotídeo adenina translocase (ANT – do inglês
adenine nucleotide translocase) pode induzir a pró-apoptótica
permeabilização da membrana mitocondrial.
Cascatas de sinalização ativadas por estresse oxidativo são
afetadas por alterações no potencial redox intracelular. As espécies
reativas de oxigênio, formadas, na maioria dos casos, por agentes
genotóxicos exógenos (irradiação, citocinas inflamatórias e
carcinógenos), são elementos desencadeadores das alterações do
potencial redox. As ERO e o potencial redox alterado podem ser
considerados como as mudanças intracelulares primárias que regulam
proteínas quinase, servindo, deste modo, como importantes
componentes celulares de ligação entre o estímulo externo e o sinal de
transdução na resposta ao estresse (ADLER e cols., 1999). Em
contraste à noção convencional de que as ERO sejam primordialmente
um gatilho para o dano oxidativo das estruturas biológicas, está o fato
de que, em baixas concentrações (fisiológicas), estas possam regular
uma série de mecanismos moleculares que podem estar ligados a
importantes funções celulares (SEN, 2000).
O potencial redox, sustentado pela relação entre a glutationa
(GSH) e o dissulfeto de glutationa (GSSG), tem a função de regular a
expressão de genes detoxificantes, sendo finamente regulado nas
3
células sob condições normais. Nestas condições, a extrusão de GSH e
conjugados de GSH (GS-conjugados), para fora das células é parte do
sistema GSH de defesa celular contra ERO. A redução de hidroperóxidos
pela enzima GSH peroxidase (GSPx) produz GSSG, o qual é
transportado através da membrana celular por intermédio de uma
ATPase específica para GS-conjugados (AKERBOOM & SIES, 1994, ANYA
& NAITO, 1993, BOARD, 1981, GODWIN e cols., 1992). A magnitude da
resposta a estímulos fisiológicos, suficientemente intensos para disparar
a sinalização redox sob condições não tóxicas, no entanto, ainda não é
conhecida.
TOYOKUNI e cols. (1995) sugeriram que diversas linhagens
tumorais parecem apresentar um persistente estado de estresse
oxidativo, o qual poderia ocasionar, entre outros eventos, a ativação
intermitente de fatores de transcrição, tais como NF-κB (do Inglês,
nuclear factor-kappaB), através de sistema intracelular para transdução
de sinal, e induzir a expressão de proto-oncogenes, tais como c-fos, c-
jun e c-myc. O estresse oxidativo, também induz a danos ao DNA, tais
como produtos modificados das bases e quebra da fita que podem levar
à mutação e aberração mutacional (instabilidade genômica). Apesar de
estar sob constante microambiente oxidativo, aparentemente as células
tumorais são resistentes à citólise oxidante, e adenocarcinomas, em
geral, são altamente resistentes à quimioterapia, particularmente, ao
tratamento com agentes eletrofílicos. Portanto, estes resultados
sugerem que células tumorais devem apresentar um mecanismo para
resistir ao estresse oxidativo gerado por ERO e agentes eletrofílicos,
como a produção aumentada de fatores derivados da células T da
leucemia adulta (ADF, do Inglês adult T-cell-leukemia-derived factor),
GSH e da enzima glutationa S-transferase (GST) (TOYOKUNI e cols.,
1995).
4
Estudos recentes de nosso grupo (KOLBERG e cols.., 2005)
demonstraram que, em associação às condições referidas por estes
autores (TOYOKUNI e cols., 1995), a presença da ATPase de membrana
MRP1/bomba GS-X, que exporta GS-conjugados para o espaço
extracelular, possa estar envolvida na resistência de células tumorais à
atividade antiproliferativa ocasionada pela presença de prostaglandinas
ciclopentenônicas (CP-PGs). As CP-PGs (eletrofílicas) conjugam-se com
GSH através das GST, produzindo um GS-conjugado. Tendo em vista
que a reação da GST encontra-se próxima do equilíbrio químico sob as
condições fisiológicas do meio intracelular, a MRP1/bomba GS-X desloca
o equilíbrio para a direita, no sentido da formação de mais
GS-conjugados, o que impede o acúmulo de eletrófilos, como as
CP-PGs. Logo, a ausência, ou baixa atividade da MRP1/bomba GSX
favorece o acúmulo destas CP-PGs as quais têm reconhecida atividade
antiproliferativa, situação que se observa nos linfócitos em presença de
câncer (HOMEM DE BITTENCOURT & CURI, 2001). No entanto, em
células tumorais, com a alta atividade da MRP1/bomba GS-X, estes
conjugados são exportados para o meio extracelular, permitindo nova
conjugação, o que impede o acúmulo das CP-PGs. A expressão da GST
(que é induzida pela ativação do fator de transcrição AP-1, dependente
do NF-κB, e, portanto, de um certo nível de estresse oxidativo) também
se apresenta aumentada no câncer e no soro de pacientes com câncer,
é induzida por estresse oxidativo e está associada com a resistência das
células tumorais a agentes quimioterápicos (TOYOKUNI e cols. 1995).
A presença do câncer é uma situação de estresse que leva a
um desbalanço redox intracelular. Este desequilíbrio dá-se tanto pelo
aumento de espécies oxidantes, com conseqüente aumento das
concentrações intracelulares de GSSG, quanto pela depleção
não-oxidativa da GSH, através da formação de GS-conjugados. Nestas
situações verifica-se a expressão de proteínas de choque térmico (HSP,
do Inglês, Heat Shock Proteins), associadas ao estado redox alterado
5
(HOMEM de BITTENCOURT e cols., 1998a,b,c). Proteínas de choque
térmico (HSP) são um grupo de proteínas cuja expressão é aumentada
quando as células são expostas a temperaturas elevadas. Este aumento
na expressão é regulado transcripcionalmente, e é uma parte
importante da resposta ao choque térmico. A produção de altos níveis
de proteínas de choque térmico pode também ser disparada por
diferentes tipos de condições ambientais de estresse, tais como
infecção, inflamação, exposição celular a toxinas (etanol, arsenico,
metais e luz ultravioleta, entre outras), desnutrição e/ou hipóxia.
Consequentemente, as proteínas de choque térmico são também
conhecidas como proteínas de estresse, e sua regulação à maior é,
algumas vezes, descrita como parte da resposta ao estresse.
A homeostase do redox intracelular de GSH é finamente
regulada para comandar o metabolismo celular e proteger as células
contra o estresse oxidativo. As HSPs são fundamentais para a proteção
das células contra estresse e na recuperação das mesmas do efeito
deletério do calor e outros estresses (RIABOWOL e cols. 1988). KONDO
e cols. (1993) sugeriram que a síntese de GSH, através da
γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GCS, enzima-chave de regulação da
síntese GSH) e o transporte de metabólitos de GSH são responsíveis ao
choque térmico, verificando aumento da expressão de ambos os
mRNAs, da γ-GCS e de proteínas de uma classe especial de proteínas de
resposta ao estresse, as proteínas de choque térmico (HSPs). Outras
evidências mostraram existir uma íntima relação entre a resposta
celular ao estresse oxidativo e a atividade das HSPs. Por exemplo, o
efeito citotóxico da ativação do NF-κB (fator de transcrição nuclear κB)
pelo TNFα (fator de necrose tumoral alfa) em hepatócitos pode ser
completamente revertido pela ativação da via das HSPs, enquanto que
o bloqueio da expressão das mesmas pela utilização de mRNA anti-
sense para a HSP reverte completamente o efeito citoprotetor do
choque térmico. (KIM e cols., 1997). O tratamento de células com
6
doadores de óxido nítrico (NO) leva à formação de GS-conjugados e
conseqüente depleção dos conteúdos de GSH intracelular. Isto por sua
vez, induz a ativação da via das HSPs (FEINSTEIN e cols., 1996;
HUANG e cols., 1994) o que leva à citoproteção.
Resultados recentes sugerem que os processos oxidativos
celulares têm papel fundamental na resposta inflamatória, através da
ativação de quinases de estresse (JNK, MAPK, p38) e fatores de
transcrição sensíveis ao estado redox, como NF-κB e AP-1, os quais
diferencialmente regulam os genes mediadores pró-inflamatórios e
genes protetores antioxidantes tais como a γ-GCS, enzima-chave de
regulação da síntese de GSH (RAHMAN, 2000). O fator de transcrição
nuclear NF-κB tem papel proeminente na regulação gênica das
respostas imunológica e inflamatória, apoptose e proliferação celular
(GALTER e cols., 1994). Já é sabido, há quase uma década, que o
NF-κB é um fator de transcrição sensível ao estado redox. Estudos
identificaram que uma certa quantidade de GSSG é necessária para a
indução da ativação do NF-κB e da translocação nuclear, enquanto o
excesso de GSSG inibe a função do NF-κB em nível da ligação ao DNA
(GALTER e cols. 1994). As etapas sensíveis ao estado redox são
comumente dependentes da natureza do ativador do NF-κB (JANSSEN-
HEININGER e cols., 2000). Hiperóxia ou elevações das ERO causam a
ubiquitinação e destruição das proteínas inibitórias (I-κB), liberando o
NF-κB e permitindo que se ligue aos promotores dos genes-alvo. Em
células, modelos animais e injúria aguda em pulmões de humanos,
também a hiperóxia induz a expressão de múltiplas citocinas pró-
inflamatórias através de mecanismos dependentes de NF-κB (D'ANGIO
& FINKELSTEIN, 2000). Por outro lado, a atividade do NF-κB como
ligante do DNA e fator de transcrição, é inibida por agentes oxidantes e
potenciada por tióis (MIHM e cols. 1995). Assim, percebe-se
nitidamente que existe um "ótimo" de estado redox abaixo do qual, a
7
ativação do NF-κB diminui e acima do mesmo, a ativação aumenta mas
sua capacidade de ligação ao DNA diminui (GALTER, e cols. 1994).
Verifica-se que em células que apresentam resistência múltipla
a drogas, a baixa expressão de MRP está associada à baixa expressão
da γ-GCS, o que poderia sugerir participação da MRP na regulação da
GSH. Porém apesar de o mRNA da γ-GCS apresentar co-expressão com
as MRP-1 e MRP-2, a expressão dos dois genes parece ser controlada
independentemente (KUO e cols. 1998). Estudos de vários grupos de
pesquisa (JEDLITSHKI e cols., 1994; HOMEM DE BITTENCOURT & CURI,
2001), sugerem que a MRP1, mais do que qualquer outra proteína, é
mediadora do transporte ATP-dependente de S-conjugados de GSH.
Uma oxidação aumentada de GSH, catalisada pela GSPx leva à
formação aumentada de GSSG, que é um GS-conjugado e, portanto,
substrato para a ATP-dependente MRP/bomba GS-X, podendo ser
exportado pela mesma.. Estes resultados sugerem que a MRP/bomba
GS-X possa atuar como moduladora do potencial redox celular ao
exportar os GS-conjugados e regular o balanço entre GSSG e GSH.
2 Proteínas de múltipla resistência a drogas
No corpo humano, os transportadores desempenham papel
importante na distribuição e eliminação de muitos agentes terapêuticos,
clinicamente importantes. É sabido, por exemplo, que a glicoproteina P,
um transportador de membrana ATP-dependente de 170 kDa, oferece
resistência a uma variedade de agentes antineoplásicos clinicamente
importantes, fenômeno conhecido como multirresistência a drogas
(CHING e cols. 1994; FARDEL e cols. 1996; SHAROM e cols. 1997, DE
BRUIJN, 1990). A superexpressão de produtos do gene mdr1 pode estar
implicada como mecanismo primário na resistência tumoral a drogas
(SUKHAI & MILLER, 2000, GAO e cols., 1998).
8
As glicoproteinas P (PGP, do inglês P-glycoprotein) também
desempenham papel na proteção celular contra metabólitos e
substâncias químicas, é possível que sejam importantes na resposta
celular ao estresse. Além disso, é sabido que muitos estímulos
estressantes podem alterar a expressão do gene mdr-1. Vários fatores
de transcrição por estresse, tais como AP-1, Sp-1, AP-2, NF-Y e C/EBPβ
(também conhecido como NF-IL6), podem ligar-se em diferentes sítios
de ligação na seqüência dos genes mdr1 já identificadas Fig. 1 (COHEN
e cols., 1994; COMBATES e cols., 1994; RAYMOND e cols. 1990;
SUNDSETH e cols.; 1997, HIPFNER, e cols. 1994 e 1996).
9
10
A expressão e atividade da PGP pode ser controlada pré ou
pós transcripcionalmente por uma grande variedade de influencias
ambientais, tais como ativadores da proteína quinase C (PKC) que
aumentam a atividade da PGP e resistência a drogas e podem aumentar
a expressão do gene mdr1 via transcrição ou tradução (CHAUDHARY &
ROBINSON, 1992) Fig. 2.
Alterações na expressão de PGP que ocorrem em nível dos
RNA mensageiros (mRNA) são as mais freqüentemente observadas, e
ocorrem como resultado de aumento das taxas de gene de transcrição
(GERMANN, 1996). Exposição celular prolongada a drogas citotóxicas
também podem induzir superexpressão do gene mdr1 por amplificação
genética aumento da estabilidade do mRNA (LEE e cols. 1998). É
possível que a estabilidade do mRNA possa estar amarrada à
integridade celular (LEE e cols., 1995).
É possível que o efluxo de PGP, proteína responsável pela
remoção de metabólitos, possa estar ativamente envolvida no
mecanismo de proteção estabilização e reparo do dano celular, assim
como as proteínas de choque térmico (HSP, do inglês heat shock
protein). A presença de dois elementos de consenso para HSP, dentro
do promotor do gene, bem como aumento do mRNA da MDR1, que se
segue á exposição a alta temperatura sugerem que a MDR1 possa
funcionar como um gene de choque térmico.
A atividade basal do promotor de MDR1 requer transativação
mediada por fator de choque térmico (HSF, do Inglês, heat shock
factor)(KIM, e cols., 1997). A inibição da formação do complexo de
proteína de DNA, entre o HSF e seu elemento de resposta bloqueia a
transcrição basal de MDR1, sensibilizando células resistentes a drogas
anti-câncer (KIM, e cols. 1998).
11
12
Uma proteína quinase A (PKA, do Inglês, protein kinase A)
suprime a atividade de ligação do DNA do HSF, bem como reduz a
expressão de proteínas de choque térmico hsp90 e hsp70 (KIM, e cols.
1997). Acredita-se que a hsp90, que pode ser co-precipitada ou co-
induzida com a PGP, possa, de alguma forma, estar envolvida na
manutenção da atividade funcional e meia-vida da proteína PGP. Assim
sendo, a supressão da hsp90 iria possivelmente resultar na diminuição
da meia-vida e atividade da PGP (BERTRAM, e cols. 1996). Foi
demonstrado, também, que elementos de choque térmico podem estar
envolvidos nas alterações da taxa de transcrição da MDR através de
padrões que dependem da PKA e dos oncogenes raf.(KIM e cols. 1996).
As células podem ser resistentes ao choque térmico (um
fenômeno conhecido como termo tolerância) da mesma maneira que
podem ser resistentes às drogas (SUKHAI & PIQUETE-MILLER, 2000).
Várias evidências existem detalhando a modulação da expressão de
mdr1 por choque térmico.
As proteínas de multirresistência à drogas MRP compreendem
uma família. Pouco se sabe sobre os padrões de sinalização celular que
regulam a MRP, contudo, vários padrões de regulação do gene MRP
parecem ocorrer através de fatores ambientais (SUKHAI, 2000, KOOL e
cols. 1999). A expressão do gene da MDR1 pode, por exemplo, ser
afetada por resposta celular à irradiação ionizante, geralmente
apresentando aumento de expressão do gene, tal como observado na
irradiação por ultra violeta, onde ocorre aumento das taxas de
transcrição do gene MDR1 (OHGA, e cols. 1996). É possível que a
sinalização destes eventos ocorra através do sítio de ligação
CCAATbox/NF-Y. Na presença de irradiação, a transcrição aumentada,
13
que requer seqüências de –82 até –73, a qual contém um elemento
invertido CCAAT box, podendo abolir a resposta do promotor ao inibidor
de desacetilação das histonas, que modulam o empacotamento do DNA
(JIN & SCOTTO, 1998). Estes autores postulam, também, que as taxas
de acetiltransferase para atividade deacetilase poderiam ser
importantes na regulação da MDR1, com a hiperacetilação levando à
ativação do gene. A seqüência CCAATbox está, também, implicada na
indução imposta por vários outros estímulos(MORROW e cols. 1994),
que incluem diferenciação (MICKLEY e cols. 1989), choque térmico
(MYAZAKI e cols. 1992) e drogas citotóxicas (OHGA e cols., 1996)
Considera-se que esta seqüência participe da manutenção da atividade
do promotor MDR1, isto implica na possibilidade de que a MDR1 seja
induzida pela radiação através de uma resposta geral e inespecífica ao
estresse.
Outras evidências demonstraram que existe uma correlação
entre a atividade da proteína quinase e expressão de mdr1, sugerindo
que a ativação de proteína quinases dependentes de AMP cíclico pode
estar envolvida na indução do fenótipo multirresistência a drogas, em
células tumorais. A proteína quinase c-Jun NH
2
-terminal (JNK), é
ativada em resposta a muitos estímulos de estresse, incluindo fator de
crescimento (GF, do inglês growth factor), choque térmico, irradiação
UV, inibidores de síntese protéica, e citocinas inflamatórias (YAN e
cols.1994; DAVIS, 1993; COBB & Goldsmith, 1995; KYRIAKIS e cols.
1994; RAIGEAUD e cols. 1995; HIBI e cols. 1993).
É sabido que a maioria dos efeitos encontrados durante uma
resposta inflamatória aguda estão associados com a liberação de
algumas citocinas pró-inflamatórias, em particular IL-1β e IL-6, e,
posteriormente, fator de necrose tumoral TNF-α (TNF, do Inglês, tumor
necrosis factor). Estas citocinas são os mediadores principais envolvidos
na expressão hepática de várias glicoproteinas, bem como, citocromo
14
P450, enzima envolvida no metabolismo de drogas durante inflamação.
É possível que estes mediadores estejam, também, envolvidos com a
regulação da PGP e o controle da expressão do gene mdr durante a
inflamação, e que, particularmente a IL-6, possa ser a responsável
primária pela “down-regulation” (regulação a menor ou regulação para
baixo) da expressão e atividade da PGP, durante resposta inflamatória
aguda. (SUKHAI e cols., 1999; SUKHAI, e cols., 2000).
A superexpressão de outros transportadores de membrana,
tais como as proteínas de multi-resistência a drogas (MRP, do inglês
multidrug resistance-associated protein) tem papel importante no
desenvolvimento de resistência à drogas em tumores (HOMEM DE
BITTENCOURT, e cols. 1998a,b,c; 2001; KOLBERG e cols., 2005). Pouco
se sabe sobre a sinalização envolvida na regulação da MRP, no entanto,
alguns fatores ambientais já foram identificados como reguladores do
gene de MRP, e.g. irradiação (OOSTHUIZEN e cols., 2000; HARVIE e
cols., 1997. A proteína p53 (identificada por sua massa molecular = 53
kDa) e reconhecida como supressora tumoral, por ligar-se ao DNA
celular tumoral e impedir que a divisão celular siga para a fase “S”
ocorrendo a replicação, era sabida como supressora da transcrição de
mrp1 (WANG & BECK, 1998), e que na sua ausência ou inativação seria
possível observar aumento no RNA mensageiro da mrp (SULIVAN e
cols., 2000). No entanto, em estudos recentes desenvolvidos por ODA e
cols. (2005), em sarcomas de tecido mole, revelaram estreita relação
entre a expressão nuclear de p53 e altos níveis de MDR1/mRNA,
sugerindo a p53 possa ser um dos reguladores ativos da transcrição de
MDR1.
3 Proteínas de choque térmico (HSP)
Para uma molécula funcional ativa, durante o processo de
replicação, a cadeia polipeptídica adquire sua conformação
15
tridimensional típica. Replicação do material genômico é um processo
que requer não somente alta fidelidade na duplicação das seqüências do
DNA, mas, também, a herança do estado da cromatina. Nos últimos
anos, enormes esforços têm sido feitos no sentido de elucidar os
mecanismos envolvidos na correta propagação do estado da cromatina.
Destes estudos emerge uma rede epigenética que é a base deste
processo. Um jogo coordenado entre as modificações e das variantes
das histonas, metilação do DNA, componentes do RNA, remodelação da
cromatina ATP-dependente, e fatores de montagem específicos das
histonas, regulam o estabelecimento da programação temporal da
replicação, início da replicação e propagação dos domínios da cromatina
(SANTORO e LUCIA, 2005). Nas células, porém, onde há presença de
alta concentração de moléculas diversas, as cadeias de aminoácidos
com regiões hidrofóbicas livres tendem a formar aglomerados caóticos e
disfuncionais, porque a cadeia polipetídica é gradualmente sintetizada
nos ribossomas em pequenos fragmentos. Na ausência de determinados
co-fatores as emergentes cadeias replicam co-transacionalmente,
perdendo a informação do domínio completo da estrutura.
Os co-fatores celulares envolvidos na replicação da cadeia
polipeptídica estabelecem, também, o mecanismo de reparo de
moléculas protéicas deficientes que ocorrem sob condições de estresse.
As chaperonas, proteínas que têm sua expressão aumentada durante
situações de estresse, não podem ser consideradas como catalisadoras
da replicação protéica, pois não são capazes de acelerar o processo,
bem como, não têm a informação necessária para a aquisição da
conformação apropriada. Contudo, as chaperonas são um grupo de
proteínas mediadoras da correta replicação, montagem, reparo,
translocação através das membranas, e degradação de outras proteínas
(HARTL, 1996, BENJAMIN e cols., 1992, HUNT & MORIMOTO, 1995).
Estas chaperonas são chamadas de proteínas de choque térmico, HSP
(do Inglês, heat shock proteins) por serem sintetizadas em grandes
16
quantidades quando as células são expostas a temperaturas elevadas
(42°C). Células eucarióticas apresentam várias famílias de proteínas de
choque térmico que são classificadas conforme a região de massa
molecular. É o caso das famílias de 60 e 70 kDa, hsp60 e hsp70, que
apresentam diferentes membros e funções nas organelas. As
mitocôndrias, por exemplo, têm suas próprias moléculas de hsp60 e
hsp70, distintas daquelas que funcionam no citossol, e ainda uma
hsp70 especial, chamada BIP, que auxilia a replicação das proteínas no
retículo endoplasmático (BUKAU & HORWICH, 1998). As HSP têm uma
importância tão capital para a sobrevida das células que foi uma das
primeiras proteínas produzidas pela natureza durante a evolução das
espécies, a ponto de que a homologia entre certas HSP humanas e de
bactérias pode chegar a 50%.
Várias proteínas de choque térmico funcionam como
chaperonas moleculares, isto é, proteínas que “acompanham” outras
proteínas de um compartimento celular a outro ou até que cheguem a
seus destinos fisiológicos (núcleo, membranas, mitocôndrias etc.). A
função chaperona das HSP está relacionada a sua propriedade de
impedir dobramentos indesejáveis e a desnaturação das proteínas
celulares, motivo pelo qual, estas HSP apresentam efeito citoprotetor
(FEHRENBACH, 1999 e 2000) .
Tabela 1. Classificação das chaperonas
HSP70 ATPases
Proteínas com
domínio J
Fator de permutação de
Nucleotídeos
Eucarióticas:
HSP72, HSC70,
mHsp70, BiP
Procarióticas:
DnaK
Eucarióticas:
HSP40, HDJ1,
YDJ1p, MDJ1p
Procarióticas:
DnaJ, CBPA
Eucarióticas:
HIP, SSC1
Procarióticas:
GrpE=Hsp24
17
O nome HSP70 descreve, de fato, uma família de chaperonas
de multi-genes, mas, todos os membros têm em comum quatro
características: seqüência altamente conservada, massa molecular em
torno de 70 kDa, atividade ATPase e habilidade para ligar e liberar
segmentos hidrofóbicos de cadeias polipeptídicas simples (PETRONINI,
e cols. 1995).
O grupo de proteínas com domínio-J pode ser caracterizado
por dois aspectos: a habilidade de modular o ciclo de ligação-liberação
peptídica hsp70, e a presença de domínio-J extremamente conservado,
o qual é responsável pela interação com a respectiva proteína hsp70.
As proteínas domínio-J são, também, capazes de ligar proteínas simples
(FEIGE & POLLA, 1994, KELLEY e cols. 1993).
Os fatores de permutação de nucleotídeos são achados
somente em bactérias e leveduras. A função principal destas pequenas
proteinas (20 kDa) é a promoção de liberação de adenina difosfato
(ADP) pelas HSP70s.
As Hsp70s contêm dois domínios principais: domínio N-
terminal ATPase, o mais conservado (cerca de 64 % identidade residual
entre as Hsp70s eucarióticas) e a parte C-terminal ocupada por um
domínio ligante-peptídico mais variável. Ambas as regiões são
acompanhadas por sítio protease-sensitivo Fig 3.
18
Os estudos realizados no sistema HSP70 de Escherichia coli
(E. coli), demonstraram que o domínio ATPase de Dnak (um homólogo
da HSP70 da E. coli) transmite mudanças conformacionais dependentes
da presença de ATP no domínio ligante-peptídico, e é, também,
responsável pela interação como domínio-J, proteína DnaJ e com GrpE
(um fator de permutação nucleotídeo das E. coli) o qual promove a
liberação de ADP. A despeito da ausência do homólogo GrpE em células
eucarióticas, as mesmas também apresentam um fator envolvido na
regulação da liberação de ADP, chamado HIP (do inglês, hsp70
interacting protein), porém com função diversa da GrpE, pois a ligação
da HIP ao domínio ATPase da HSP70 inibe a dissociação da ADP
estabilizando a HSP70 no estado ligante-peptídico (AMIN e cols. 1988).
O domínio ligante-peptídico, formado por duas lâminas β
antiparalelas de quatro seqüências, tem um conjunto de terminações
fazendo contato direto com peptídeo limítrofe, enquanto a extremidade
da hélice não toca o peptídeo limítrofe, servindo mais como fator
limitante da taxa de ligação/liberação do peptídeo, de acordo com o
estado de domínio ATPase. Quando este último domínio forma um
complexo com ATP a hélice adota uma conformação aberta, permitindo
fácil ligação/liberação dos peptídeos. Quando a ADP ocupa a fenda ATP,
a extremidade da hélice fecha, ancorando o peptídeo limítrofe,
diminuindo, significativamente sua taxa de dissociação. Infelizmente,
pouco se sabe sobre a estrutura de todas as moléculas HSP70 e a cerca
das interações estéricas dos dois domínios funcionais descritos.
Particularmente, não está claro o mecanismo molecular de transferência
de energia entre a o domínio ATPase e a terminação ligante-peptídica
Fig 4.
19
O mecanismo de ação do ciclo ligação/liberação das HSP70 é
significativamente distinto entre células procarióticas e eucarióticas. Por
exemplo, nas E.Coli, o mecanismo inicia com a interação da DnaJ com o
peptídeo não replicado e a molécula-alvo DnaK. Como anteriormente
mencionado, a molécula DnaK, neste momento, está no estado “aberto”
e pode, efetivamente, ligar-se ao peptídeo limítrofe. Na seqüência a
DnaJ promove a ação hidrolítica do domínio DnaK ATPase, enquanto a
molécula GrpE facilita a liberação da ADP resultante. O restante do
complexo DnaK + peptídeo torna-se instável e rapidamente se dissocia,
liberando e.g. fragmentos de uma cadeia polipetídica longa,mais
estável.
A principal diferença no mecanismo de ação das HSP70 das
células eucarióticas está na presença da Hip e nos estágios iniciais da
reação. O peptídeo não replicado reage diretamente com a HSP70, mas
20
a presença da HSP40 (domínio-J) facilita significativamente o processo
de ligação. Neste ponto a HSP40 liga-se ao complexo peptídeo/HSP70,
estimula a atividade ATPase, e o complexo HSP70 adota um estado
ADP-ligante mais estável, e a ligação da molécula Hip estabiliza este
estado. O ciclo termina com a lenta dissociação da ADP, aquisição da
próxima molécula de ATP, e dissociação do peptídeo (Kelley, 1998).
4 Prostaglandinas
As prostaglandinas (PGs) são substâncias naturais dos
organismos vivos (BERGSTRÖM, CARLSON & WEEKS, 1968, IRVINE,
1982), que desempenham papel regulatório significativo em várias
funções, entre elas, ação citoprotetora, promoção ou inibição de
proliferação celular (BERGELSON, PINKUS & DANIEL, 1979; OHNO, e
cols., 1986) , atividade contrátil, e outras. As mesmas são ácidos
graxos insaturados derivados de ácidos graxos de vinte carbonos
contendo três, quatro ou cinco insaturações: ácido 8,11,14-
eicosatrienóico ou di-homo-γ-linoleico (precursor das PGs do tipo 1),
ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóico ou ácido araquidônico (AA, precursor
das PGs do tipo 2) e ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenóico (EPA,
precursor das PGs do tipo 3). No homem, o AA é o precursor mais
abundante e pode ser sintetizado a partir do ácido linoleico (9,12-
octadecadienóico) da dieta ou ingerido como tal.
As PGs, têm ação sobre eventos importantes, como sinalização
transmembrana, diferenciação celular, proliferação (BOOYENS, e cols.,
1984), ativação para divisão celular (COWLEN & ELING, 1992) , ou
paralisação da mesma (D’ONOFRIO, e cols., 1986, 1992) como já
citado. Além disso, estão presentes na resposta ao estresse, resposta
imunológica, inativação da proliferação viral, ativação de proteínas de
choque térmico (HSP) (AMICI e cols., 1992, 1992b; AMICI & SANTORO,
1991), e produção de radicais livres (HEMPEL, e cols. 1993). As PGs
21
interferem no processo de proliferação celular de tumores e também em
células do sistema imunológico. A presença das mesmas no plasma dos
indivíduos com tumor, é um sinalizador que parece modular a resposta
imunológica negativamente no câncer (HOMEM de BITTENCOURT &
CURI, 1992).
A síntese de PGs pode ser mediada por eventos fisiológicos
tais como resposta inflamatória, crescimento tumoral, estresse celular,
e ser inibida por ação dos antiinflamatórios não-esteróides (AINES), do
tipo aspirina (THUN e cols.1991; HOMEM de BITTENCOURT, e cols.,
1989), e ocorre quando o AA é liberado para o citoplasma. A liberação
de AA ocorre diretamente através da fosfolipase A
2
(PLA
2
), ou
indiretamente pelas fosfolipases A
1
, C e D (BILLAH, e cols., 1990,
CHANG e cols. 1987). A regulação dos níveis celulares de AA e o
aumento da síntese de prostaglandinas pode se dar através da
expressão de LDL ou atividade de seus receptores.
O AA pode fornecer uma grande variedade de eicosanóides
(PARKER, 1986) por, pelo menos, três vias metabólicas conhecidas: a
da ciclooxigenase (COX), das lipoxigenases (LOX) e a via do citocromo
P450 ou epoxigenase (EPOX). A COX (PG endoperóxido sintase ou PGH
sintase, E.C. 1.14.99.1), existe em, pelo menos, três isoformas
altamente glicosiladas pós-traducionalmente, COX-1, COX-2 (OTTO e
cols., 1993) e COX-3 (ARITA e cols. 1990, BURGOYNE, 1990, WARNER
& MITCHELL, 2002; CHANDRASEKHARAN e cols., 2002; DING e cols.,
2003). A COX-1 localiza-se nas membranas do retículo endoplasmático
e envelope nuclear e é, então, responsável pela produção dos
prostanóides, terminologia usada para designar os produtos lipídicos
contendo anel ciclopentano e derivados da PGH sintase, como as PGs.
A outra atividade enzimática importante ligada ao
metabolismo do AA é a lipoxigenase. Através da atividade LOX
(E.C. 1.13.11.12) o AA pode ser metabolizado nos mamíferos por, pelo
22
menos, três enzimas distintas. A 12-LOX converte o AA no ácido 12-S-
hidroperóxi-eicosa-5,8,10,14-tetraenóico (12-HPETE), que, pela ação da
glutationa peroxidase (GSPx) é reduzido ao análogo hidroxilado, 12-
HETE. O precursor hidroperóxido (12-HPETE) pode ainda ser
enzimaticamente convertido no derivado 12-ceto-eicosatetraenóico (12-
KETE) ou nas hepoxilinas (derivados hidróxi-epóxi-eicosatrienóicos) A e
B, que, pela ação da hepoxilina hidrolase, são convertidas, em vários
tecidos, nos derivados trienóicos triidroxilados, as trioxilinas (PACE-
ASCIAK & LEE, 1989; PIOMELLI & GREENGARD, 1990). Da combinação
da atividade conjunta e ordenada das três LOX, surgem outros
eicosanóides com importantes atividades biológicas nas interações
célula-célula, como os ácidos diidróxi-eicosatetraenóicos (DHETE) e as
lipoxinas (LX) - derivados triidroxilados (SERHAN, 2002).
Prostaglandinas
ciclopentenonicas
23
Uma terceira via de metabolização do AA, a EPOX,
transformação pela atividade monooxigenase do complexo P450, pode
oxigenar o substrato graxo para fornecer vários derivados
monooxigenados (HETE) e uma série de quatro epóxidos, os ácidos
epoxieicosatrienóicos (EET) [5,6-; 8,9-; 11,12-; 14,15-EET] em vários
tecidos de mamíferos; estes podem ainda ser hidrolisados aos dióis
vicinais correspondentes (McGIFF & QUILLEY, 1999).
Entre as prostaglandinas, é de especial interesse, de nosso
grupo de trabalho, aquelas chamadas de ciclopentenônicas, ou CP-PGs.
As prostaglandinas ciclopentenônicas têm sido motivo de estudo nas
últimas três décadas (SANTORO e cols. 1976, 1977), por demonstrarem
efeito sobre o crescimento de células tumorais, tendo sido inclusive
eletivas como potenciais agentes terapêuticos antimetastáticos e
anticâncer (FITZPATRICK & STRINGFELLOW, 1979; FUKUSHIMA e cols.,
1982; NARUMIYA, 1986; IKAI e cols., 1987). Nessa época, também,
surgiram as primeiras evidências de modulação da proliferação e
diferenciação em células tumorais e do sistema imunológico e outros
estudos, revelando que o efeito antiproliferativo destas PGs
ciclopentenônicas é, na verdade, exercido apenas pelos derivados das
PGE2 (OHNO e cols., 1986, PETRINI e cols. 1998, PHIPS, e cols. 1989,
1991) e PGD2 (NARUMIYA & FUKUSHIMA, 1985).
Apenas as prostaglandinas com anel ciclopentenônico
(CP-PGs), que são produzidas pela desidratação das PGE2 e PGD2,
apresentam atividade antiproliferativa devido ao grupo cetona α ,β -
insaturado (HONN & MARNETT, 1985; ITO e cols., 1989, ATSMON e
cols., 1990). As CP-PGs produzidas como principais produtos de
desidratação das PGs parentais são a PGA2, PGA1, PGJ2 e Δ12-PGJ2.
AS CP-PGs são formadas quando se expõe a PGE2 ou PGD2 ao plasma
ou soluções contendo soro (KIKAWA e cols., 1984). Isto explica
24
também a o rápido desaparecimento da PGE2 e da PGD2 em meios de
cultura contendo soro (FITZPATRICK & WYNALDA, 1983; KIKAWA e
cols., 1984; ITO e cols., 1989). Uma vez internalizadas, as CP-PGs
localizam-se no núcleo celular mas de maneiras diferentes: a PGA2
permanece na forma livre, enquanto que a Δ 12-PGJ2 liga-se
covalentemente a proteínas da cromatina e da matriz nuclear
(NARUMIYA e cols., 1987). Isto se reflete no poder inibitório de cada
uma destas CP-PGs sobre a proliferação celular. Assim, o efeito
antiproliferativo da Δ 12-PGJ2 é muito mais potente e irreversível,
enquanto que o da PGA2 ou PGA1 é mais brando e pode ser revertido
pela lavagem das células (OHNO e cols., 1988a). Entretanto as CP-PGs
têm em comum a característica de induzir inibição da proliferação
celular por impedir a progressão das células além da fase G1 do ciclo
celular num processo que é sensível à cicloeximida (OHNO e cols.,
1988a; NARUMIYA e cols., 1989).
O efeito inibitório das CP-PGs sobre a proliferação de todas as
linhagens de células eucarióticas já testadas resultou numa grande
quantidade de trabalhos onde foi avaliado o potencial anticâncer destas
substâncias. Paralelamente a sua atividade antiproliferativa celular,
entretanto, as CP-PGs exibem um notável efeito antiproliferatico,
associado ao efeito antiviral. Assim como no efeito antiproliferativo
exercido sobre células eucarióticas, a ação antiviral das CP-PGs
depende da presença do anel ciclopentano contendo o grupamento
cetônico α,β-insaturado; assim outras PGs como as das séries B, E, F,
ou a prostaciclina (PGI2), 6-ceto-PGF1α ou tromboxana (TXA2) não
apresentam atividade antiviral (SANTORO e cols., 1990; AMICI &
SANTORO, 1991).
25
26
O estudo dos mecanismos envolvidos na atividade antiproliferativa das
CP-PGs sobre células eucarióticas ou vírus levou ao entendimento de
alguns mecanismos básicos da ação destas PGs e que podem estar
relacionados com um possível papel fisiológico das CP-PGs na regulação
da proliferação e diferenciação celulares. Por exemplo, o efeito inibitório
das CP-PGs sobre a replicação viral é dependente da célula hospedeira,
uma vez que a adição de actinomicina D (que suprime a transcrição do
DNA nas células hospedeiras mas não nos vírus testados) abole
completamente o efeito antiviral destas PGs (SANTORO e cols., 1989;
SANTORO e cols., 1989a; 1989b; AMICI & SANTORO, 1990). De fato, o
efeito antiproliferativo das CP-PGs parece depender da síntese de um
polipeptídeo de 74 kDa (nas células-alvo), identificado como uma
proteína de choque térmico (HSP) e pertencente à família das HSP70
(OHNO e cols., 1988b; SANTORO, 2000; D'ONOFRIO e cols., 1994).
Como as HSP70 são uma classe de proteínas induzida pelas
CP-PGs e sua síntese (pela célula tratada) está invariavelmente
associada ao efeito antitumoral e antiviral destas PGs, é possível que as
HSP70 possam mediar o efeito antiproliferativo das CP-PGs ou ainda
que as CP-PGs possam ser os mediadores fisiológicos da ação das
HSP70, cujo papel fisiológico preciso ainda não é conhecido (OHNO e
cols., 1988b; SANTORO e cols., 1989; AMICI & SANTORO, 1990). Na
verdade, em todos os modelos de células tumorais ou de células
infectadas (ou não) com vírus, o tratamento com CP-PGs ativa os HSFs
(fatores de transcrição para as HSP).
Outro fenômeno da maior importância que se observa após o
tratamento de células humanas com doses não-tóxicas de CP-PGs é a
termotolerância, a aquisição de resistência à exposição ao calor por
curtos períodos de tempo (AMICI e cols., 1993; MAGER & MORADAS
FERREIRA, 1993). De fato, as PGAs induzem resistência aos efeitos do
choque térmico, avaliados pelo atraso de 24-48 h na expressão de
27
HSPs. Além disso, o estabelecimento do estado de termotolerância não
é devido a um efeito direto da PGA, uma vez que, para que o mesmo se
estabeleça, é necessária a síntese de novo de HSPs (AMICI e cols.,
1993).
É interessante que existe uma nítida relação entre os
mecanismos fisiológicos envolvidos nas alterações de temperatura e o
metabolismo do AA. Como se sabe, as PGs do tipo E (precursoras das
PGAs) induzem o estado febril por alteração no set-point hipotalâmico
de controle da temperatura (CAMPBELL, 1990). Por outro lado, as PGAs
medeiam a expressão de HSP induzidas por choque térmico e outros
agentes estressantes ou têm sua síntese induzida pelas HSPs
(SANTORO e cols., 1990). O próprio AA é um potente modulador da
transcrição dos genes para HSPs humanos em doses fisiológicas
(JURVICH e cols., 1994).
O estudo da indução de HSPs constitui-se, pelo que foi
apresentado acima, numa ferramenta importante para a investigação
da participação das CP-PGs em eventos fisiológicos, já que são uma
classe de polipeptídeos induzidos por essas PGs. O tratamento de
células de mamífero com PGA1, PGA2, PGJ2 ou Δ12-PGJ2 resulta em
expressiva síntese de HSP70, a mais importante proteína de choque
térmico e de resposta ao estresse celular (OHNO e cols., 1988b;
SANTORO e cols., 1989; SCHLESINGER, 1990; AMICI & SANTORO,
1991; AMICI e cols., 1992). Como a expressão de HSP70 é regulada
pelo crescimento celular (SCHLESINGER, 1990; AMICI e cols., 1992), é
razoável supor-se que a indução de HSP70 por CP-PGs poderia ser parte
de um conjunto de efeitos fisiológicos relacionados ao crescimento
celular e envolvendo PGs. É possível que as HSP70 estejam envolvidas
no bloqueio do ciclo celular na fase G1 promovido pelas CP-PGs e,
portanto, poderiam ser proteínas reguladoras fisiológicas da progressão
do ciclo celular (OHNO e cols., 1988; MAGER & MORADAS FERREIRA,
28
1993). As HSP e, em particular as HSP70, são marcadores universais do
estresse celular induzido por uma série de fatores como choque
térmico, metais pesados, análogos de aminoácidos, agentes oxidantes e
substâncias teratogênicas (OHNO e cols., 1988b; SANTORO e cols.,
1989; SCHLESINGER, 1990; AMICI & SANTORO, 1991).
Em resumo, é fato sabido que pacientes na fase final de
câncer apresentam caquexia associada à imunossupressão, e que,
considerando resultados anteriormente por nosso laboratório (KOLBERG
e cols., 2005) é possível que uma das explicações para esta condição
seja o acúmulo de CP-PGs nos linfócitos que, por outro lado não
acumulam nas células tumorais. As CP-PGs, ainda, são sabidamente
causadoras de estresse oxidativo por proporcionarem o acúmulo de
GSSG, alterando o balanço redox, e ainda que as mesmas expressam
proteínas de choque térmico uma vez internalizadas. O acúmulo, ou
não, das CP-PGs pode ser devido a baixa expressão e/ou ineficiente
atividade da MRP-1/bomba GSx. Considerados em conjunto os dados
aqui apresentados nos propusemos a pesquisar os efeitos da bomba
MRP-G sobre o balanço redox celular e a influência do balanço redox
celular sobre a expressão e atividade da bomba MRP-GSx, e para tanto
estabelecemos os objetivos como segue.
28
OBJETIVOS
Considerando-se que estudos de nosso grupo e de outros
laboratórios demostram que a MRP1/bomba GS-X é capaz de extrudar
GS-conjugados, como GSSG, é possível que a mesma participe da
regulação do estado redox intracelular, em condições em que as células
estejam sob a ação de promotores de estresse celular. Assim sendo,
nosso objetivo foi avaliar:
O papel da MRP1/bomba GS-X para a manutenção do estado
redox de linfócitos, através do desafio com diversos agentes
estressantes: xantina/xantina oxidase, prostaglandinas
ciclopentenônicas (CP-PGs), em particular a PGA
2
, β-mercaptoetanol
(βME) e choque térmico, comparando-se com a atividade da bomba em
células controle e células transfectadas com o gene MRP-1,
(superexpressando a bomba). Além disso, foi avaliada a expressão de
HSP70, a concentração de glutationa GSH, glutationa oxidada (GSSG) e
a relação [GSSG/GSH], a viabilidade celular (como índice de
citotoxicidade) e incorporação de Timidina [2-
14
C] (como estimativa de
capacidade proliferativa).
Os objetivos específicos do trabalho foram investigar:
1. A viabilidade de se transfectar linfócitos com o gene
codificando para a bomba MRP1/GS-X e as condições
experimentais para tanto;
29
2. A expressão e atividade da bomba MRP1/GS-X em
linfócitos transfectados submetidos a diferentes fontes de
estresse celular (como oxidativo e térmico);
3. A relação entre a expressão de proteínas de choque
térmico e a resistência ao estresse celular em linfócitos
transfectados com o gene da bomba MRP1/GS-X;
4. A resistência de linfócitos transfectados aos efeitos
citostáticos e citotóxicos do tratamento com CP-PGs;
5. A resistência ao estresse oxidativo em células
transfectadas.
Desta forma, pretendeu-se identificar como e em que
magnitude a expressão da MRP1/bomba GS-X influencia o estado redox
celular de linfócitos, e se o próprio estado redox intracelular poderia
modular a expressão e/ou atividade da bomba.
30
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Reagentes e Soluções
A Seção de Reagentes e Soluções encontra-se no
Apêndice Final.
2. Animais
Ratos Wistar (Rattus norvegicus, var. albinus) adultos (3-4
meses) machos, obtidos biotério do Instituto de Ciências Básicas da
Saúde da UFRGS, pesando 250 ± 50 g e mantidos a 23 ± 2°C sob um
ciclo de claro/escuro de 12/12 h (lâmpadas fluorescentes acendendo
às 07 h 00 min), foram utilizados. Os animais receberam, ad libitum,
dieta comercial-padrão para ratos de laboratório contendo
aproximadamente 52% de carboidratos, 21% de proteínas e 4% de
lípides, tendo tido livre acesso a água.
3. Preparações celulares de linfócitos de linfonodos
mesentéricos de ratos
Para realização dos experimentos com linfócitos, foram
ortotanasiados de 3 a 4 animais e, então, os linfonodos mesentéricos
foram removidos cirurgicamente, retirada a gordura circundante, e os
mesmos foram conservados em PBS, em banho de gelo, como
descrito em HOMEM DE BITTENCOURT e cols. (1993) e KOLBERG e
cols. (2005). Primeiramente os ratos foram sacrificados através de
31
deslocamento cervical, mergulhados em copo de béquer contendo
álcool 70% e levados para a capela de fluxo laminar para extração
dos linfócitos. Com auxílio de uma tesoura e bisturi foi feito um corte
na região abdominal retirados os linfonodos (tendo o cuidado para
retirar a camada de gordura evitando-se assim a coagulação) os
quais foram colocados em um béquer contendo PBS com antibiótico
(em torno de 20ml).
A seguir, os linfócitos foram separados do tecido linfóide por
esmagamento (em obtentor gradeado de tecidos), (VIEIRA e cols.,
1992), filtrados em filtro de Whatmann, e centrifugados a 1000 x g
por 5min. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado, após
quebra, submetido à solução de hemólise por 5 min, em banho de
gelo a 4°C por 5 min para a remoção de eritrócitos conforme descrito
em GADD & HANSBROUGH (1990).
Depois de terem sido preparadas, as células foram pré-
incubadas a 37ºC, 5% CO
2
em meio RPMI 1640 contendo 10% (v/v)
SFB por 2 h em placas de poliestireno (Corning) a fim de se
eliminarem as células contaminantes aderentes. Este tipo de
preparação garante uma suspensão altamente pura em linfócitos
(mais de 99,5%) conforme avaliado previamente por exame de
preparações histológicas coradas pela técnica da hematoxilina/eosina
(HOMEM de BITTENCOURT e cols., 1993). A determinação da
viabilidade celular, foi feita pelo método da exclusão do azul Trypan,
indicou sempre uma proporção maior que 98% de células viáveis.
Quando submetidos a cultura celular, os linfócitos assim obtidos
foram mantidos em meio RPMI 1640 adicionado de 10% (v/v) de
SFB. Testes de viabilidade celular indicaram uma proporção sempre
maior que 97% de linfócitos viáveis após 48 h de cultivo nestas
condições.
32
3.1. Hemólise de eritrócitos contaminantes
Para a remoção de eritrócitos contaminantes de preparações de
linfócitos, as suspensões celulares brutas foram centrifugadas
(1000 x g por 5 min a 4°C) e os precipitados celulares ressuspensos
em 10 ml (por 10
7
-10
8
células) do tampão Tris 17 mM/NH
4
Cl
144 mM pH 7,4 e mantidos em banho de gelo no referido tampão por
5 min. Em seguida, as suspensões foram diluídas a 1:5 com 40 ml de
PBS a 4°C e centrifugadas novamente. Este tipo de protocolo garante
preparações celulares virtualmente isentas de eritrócitos, prestando-
se, portanto, ao estudo acurado do metabolismo da glutationa,
quando hemácias contaminantes representariam fonte considerável
de erro.
4. Produção de bactérias competentes:
Os plasmídeos pRc-RSV (que contêm os genes da MRP 1),
foram mantidos em bactérias Eschericha coli em temperaturas abaixo
de -70°C ou N
2
líquido, sendo reproduzidos quando necessário. Para
a produção de bactérias competentes para serem transfectadas com
o gene da bomba MRP/GS-X por eletroporação, foi feito o seguinte:
1. Foi selecionado um grupo de células crescidas e esgotada em LB
ágar com ampicilina. Após crescimento overnight à 37 °C com a
placa invertida.
2. Foi selecionada uma colônia isolada da placa e colocada para
crescer em 150ml de LB líquido (com ampicilina) em um
Erlenmeyer de 250ml, à 37°C com agitação vigorosa (>250 ciclos
por minuto); sendo monitorado o crescimento pela determinação
da O .D
600nm
(densidade óptica).
33
# Para uma transformação eficiente, é essencial
que o número de células viáveis não exceda 2 x 10
8
células/ml
3. Quando O . D + 0,5 (mais ou menos 6 horas), a cultura foi
resfriada em 0°C deixando os tubos em gelo por 10minutos.
4. Assepticamente e em gelo as células foram transferidas para um
tudo Falcon de 50 ml (estéril).
#Importante: todos os outros passos deste
procedimento foram feitos assepticamente.
5. Foram centrifugadas a 4000rpm por 10min a 4°C
6. O sobrenadante foi descartado, deixando o pellet o mais seco
possível e mantendo os tubos invertidos por 1min permitindo com
que os últimos traços de meio fossem escorridos.
7. O pellet foi ressuspenso cuidadosamente (com a pipeta) em 5ml
de 50 mM CaCl
2
gelado.
8. Manteve-se em gelo por 30min
9. Foi centrifugada a solução de células tratadas com CaCl
2
, a 4000
rpm por 5min a 4°C. Foi retirado o sobrenadante e mantidos os
tubos invertidos por 1 min permitindo com que os últimos traços
de meio fossem escorridos.
10. As células foram ressuspensas em 2ml de 50mM de CaCl
2
gelado. Após esta etapa juntou-se em um único tubo todas as
alíquotas de células.
11. Na solução obtida adicionou-se 70μl de DMSO, misturando
gentilmente, e as células foram mantidas no gelo por 15min,
adicionados mais 70μl de DMSO e misturado gentilmente.
34
12. Dividiu-se a solução de células (300μl em tubos Eppendorf,
sendo as células mantidas a -70°C ou N
2
líquido.
5. Purificação de DNA plasmideal a partir de 50ml
cultura de Escherichia coli
A) PROCEDIMENTO
1. A cultura de bactérias competentes foi colocada para
crescer (5 ml de meio LB, 50 μl de bactérias), adicionado 62,5 μl de
ampicilina à cultura = CULTURA OVERNIGHT (9-16 h crescido em
placa de Petri com antibiótico para selecionar as colônias; selecionada
uma colônia única e preparado em meio líquido LB + ampicilina,
overnight por 9-16 h).
2. Transferido 1 ml da cultura overnight para um balão de
250 ml, contendo 50 ml de meio LB e 625 μl de ampicilina e crescido
novamente overnight com agitação vigorosa a 37
o
C.
3. Lida a absorbância a 600 nm, a qual deve estar em torno
de 4/ml para a amostra concentrada (para ler no espectrofotômetro,
a amostra foi diluida a 1:10 com água tomando 100 μl de suspensão
e dispersando em 900 μl de água; a absorbância da amostra diluída
apresentou-se em torno de 0,4).
LISE CELULAR
São transferidos 50ml da cultura “overnight” de E.Coli para
um falcon de 50ml, e centrifugado a 7700 x g, por 10 minutos para
peletar as células.
Nota: A velocidade apropriada de centrifugação pode ser calculada
usando-se a seguinte formula: RCF=(1.12)(r)(rpm/1000)² , onde RCF=força
centrífuga relativa; r= radio medido do centro do eixo até o fundo do "“bucket"” e
35
rpm= revoluções por minuto. Para uma força de 7700 x g, onde r= 108mm, a
velocidade apropriada seria de 8000 rpm.
À partir deste momento foram utilizados dois diferentes
métodos de extração e purificação plasmideal: método de extração
isopropanol-fenol-clorofórmio e kit de extração “middi-prep” (veja
extração com kit de extração no Apêndice Final).
B) PRECIPITAÇÃO DO DNA PLASMIDEAL COM ISOPROPANOL-
FENOL-CLOROFÓRMIO
16. Foi adicionado 1 volume de isopropanol ao lisado (sobrenadante),
ou seja, 1 ml para cada ml de sobrenadante.
17. Foi misturado e mantido à temperatura ambiente por 15 min para
permitir a precipitação do DNA plasmideal, o que deixa a solução
turva.
18. O plasmídeo foi precipitado e centrifugando a 12.000 x g por 15
min ou 15.000 x g por 10 min à temperatura ambiente (20 –
25
o
C).
19 O sobrenadante foi aspirado e descartado.
20. Foi ressuspenso o precipitado plasmideal em 500 μl de TE pH 8,0.
21. Foram adicionado 500 μl de Fenol-Clorofórmio pH 7,5-8,0
Obs.: o pH alcalino é essencial para evitar-se o seqüestro do DNA
plasmideal na fase orgânica – clorofórmio, que está na parte inferior
do tubo.
22. Foi agitado em vórtex por 30 s.
23. Seguiu-se centrifugação a 15.000 x g por 2 min à temperatura
ambiente (20 – 25
o
C).
36
24. Foi coletada a fase aquosa (que contém o plasmídeo) e
transferido para outro Eppendorf.
25. Foram adicionados 500 μl de clorofórmio e a suspensão agitada
em vórtex por 30 s
Obs.: o clorofórmio serve para remover o excesso de fenol.
26. Foi centrifugado a 15.000 x g por 2 min à temperatura ambiente
(20 – 25
o
C).
27. Foi coletada a fase aquosa (que contém o plasmídeo) e
transferida para outro Eppendorf.
28. Foram adicionados 2 volumes (cerca de 1 ml nesta preparação)
de Etanol 95% gelado.
29. Foi agitado em vórtex por 5 s e deixado precipitando o plasmídeo
no etanol por 10 min a –20
o
C (no freezer).
30. Foi centrifugado a 12.000 x g por 15 min ou 15.000 x g por 10
min a 4
o
C.
31. Foi desprezado o sobrenadante.
32. Foi ressuspenso o precipitado em 1 ml de Etanol 70% (v/v) e
agitado em vórtex.
33. Foi centrifugado a 12.000 x g por 5 min ou 15.000 x g por 2 min a
4
o
C.
34. O sobrenadante foi desprezado.
35. Centrifugado por 10 s em microcentrífuga à temperatura
ambiente para retirar qualquer líquido residual que pode ser
removido por aspiração.
36. O precipitado foi secado à temperatura ambiente.
37. O plasmídeo dissolvido em 150 μl de TE pH 8,0.
37
Rendimento com as técnicas utilizadas:
Ambos os protocolos fornecem de 100 a 500 μg de DNA
plasmideal para cada 50 ml iniciais de cultura de bactérias. A
determinação da concentração de DNA foi feita em espectofotômetro
Amersham Bioscences Ultrospec 2000 (veja no Apêndice final).
Para transfecção transientes de células eucarióticas por
eletroporação, usamos de 10–40 μg de DNA por seção (1 cubeta de
eletroporação contendo volume de 800 μl) (Potter e cols., 1984).
O rendimento de 100-500 μg de DNA plasmideal por frasco de
50 ml de cultura, em 250 ml de cultura obtido foi de 500-2500 μg de
DNA. Em 500 μl de tampão de ensaio (TE) (1–5 mg de DNA/ml).
6. Produção de células competentes
PADRONIZAÇÃO DO MÉTODO DE ELETROPORAÇÃO
Partiu-se de uma cultura de linfócitos (obtida dos linfonodos
mesentéricos de um pool de 4 ratos), mantida em frasco de 25 cm
2,
de poliestireno (FALCON, Becton Dickinson, UK ou Corning, NY, USA)
até a confluência (1 a 4 x 10
7
células), descartado o sobrenadante
(SN).
Adicionado 2 ml de Tripsina (0,05%) , incubado em atmosfera
umidificada de 5% (v/v) de CO
2
em ar, numa estufa-incubadora
(Harris, USA) estufa de CO
2
, a 37°C, por 5 minutos, as células foram
desprendidas do frasco por agitação , adicionados 15 ml de meio
RPMI, e as células contadas em câmara de Newbauer (diluição de
1:100 com PBS e 1:1 com TripanBlue). Para uma eletroporação e
transfecção eficiente a quantidade de células inicial deveria ser de 1 x
10
7
células).
38
1. Padronizada a voltagem ideal:
• Utilizada cubeta de 800 μl.
• Pipetados 800 μl da suspensão celular nas cubetas e
incubado em gelo por 10 minutos.
• Eletropulsadas as células em diferentes voltagens
nominais: 500 volts, 1000 volts, 1500 volts, 2000 volts e
2500 volts.
• Para cada voltagem nominal utilizada, realizados 1, 2 e 3
pulsos.
2. Verificada a viabilidade celular tempo-pulso-dependente
• Após a identificação das voltagens ideais, eletropulsadas
as células, e aliquotadas 1ml da suspensão celular em
cada poço de uma placa de 24 poços.
• Verificada a viabilidade celular em 24 horas, 48 horas, 72
horas, uma semana e duas semanas
7. Medida da capacidade de exportação de
conjugados de GSH em células intactas incubadas
No sentido de se avaliar a capacidade de produção e
exportação de S-conjugados de glutationa, as células (linfócitos
transfectados ou não) foram incubadas por diferentes períodos de
tempo (15, 30, 45 e 60 min) na presença de 1-Cl-2,4-dinitrobenzeno
50 μM (CDNB, Sigma) em tampão PBS (GIBCO). O corante CDNB é
substância de escolha para este tipo de determinação bioquímica uma
vez que é substrato universal para todas as isoformas conhecidas das
glutationa S-transferases (GST, E.C. 2.5.1.18) (HABIG & JAKOBY,
1981; AKERBOON & SIES, 1989, AWASTHI e cols., 1981 e 1991,
39
HENDERSON, e cols., 1994) que medeia a conjugação de moléculas
de GSH com substâncias eletrofílicas.
O CDNB é uma substância altamente eletrofílica reagindo
prontamente com GSH para produzir o conjugado (2,4-dinitrofenil)-S-
glutationa (DNP-SG) que, por sua vez, é bastante estável e apresenta
um espectro UV (com absorção máxima a 340 nm) que difere
claramente daquele do precursor CDNB (λ
máx
a 252 nm). Estas
características permitem, então, a medida espectrofotométrica do
conjugado em formação (veja figura abaixo com o esquema da
reação intracelular, por favor). Pelo menos numa faixa de
concentração de até 100 μM, o CDNB mostrou-se ser não-tóxico para
as células estudadas conforme avaliado pela viabilidade celular que,
após 120 min de incubação, apresentou-se inalterada (dados não
mostrados).
Cl
NO
2
NO
2
+
GSH
SG
NO
2
NO
2
GST
+
HCl
CDNB
CDNB
DNP
DNP
-
-
SG
SG
ε
252
= 13,8 mM
-1
.cm
-1
ε
340
= 9,6 mM
-1
.cm
-1
Cl
NO
2
NO
2
+
GSH
SG
NO
2
NO
2
GST
+
HCl
CDNB
CDNB
DNP
DNP
-
-
SG
SG
ε
252
= 13,8 mM
-1
.cm
-1
ε
340
= 9,6 mM
-1
.cm
-1
Figura 7. Esquema representativo da exportação de DNP-SG,
mostrando a conjugação do grupo tiol (-SH), via GST. GSH:
glutationa; CDNB: clorodinitrobenzeno GST: Glutationa S-
transferase
;;
DNP-SG:
(
2
,
4-dinitrofenil
)
-S-
g
lutationa
Para as incubações, foram preparados linfócitos de
linfonodos mesentéricos i.p. conforme descrito anteriormente. Na
preparação de linfócitos, os linfonodos mesentéricos foram retirados e
40
limpos, como anteriormente descrito, e as células conservadas em
solução de Hank’s Balanced salt solution – (HBSS), sem adição de
penicilina, até o momento das dosagens. O período entre a obtenção
das suspensões celulares e as dosagens estiveram entre 2-3 horas.
Após as preparações, as células foram ressuspensas em 21
ml de solução HBSS e separadas em 20 tubos de microcentrífuga
(Eppendorf 2 ml), na razão de 1 ml em cada (o restante da
suspensão foi utilizado posteriormente para contagem de células). Em
seguida, as alíquotas foram centrifugadas em microcentrífuga de
mesa, por 30 s à velocidade máxima (15.000 x g) e os sobrenadantes
descartados para que fossem iniciados os experimentos de captação-
exportação, pela ressuspensão das células (1-2 x 10
6
por preparação)
em solução de CDNB (50 μM) ou no veículo (PBS). Soluções-estoque
de CNDB foram preparadas em etanol absoluto na concentração de
100 mM tendo sido utilizado 1 μl desta solução para cada 2 ml de
solução final em PBS. Os tubos foram mantidos em banho-maria,
com agitação, e as medições foram realizadas em espectrofotômetro
(340 nm) em intervalos de 15 min, a partir do tempo zero.
Experimentos preliminares mostraram que a atividade máxima de
exportação do conjugado nas células estudadas deu-se 15 min após a
adição do CDNB, nas condições empregadas.
Os "brancos" espectrofotométricos foram conduzidos em
PBS igualmente. No tempo zero, as células receberam CDNB (ou
PBS) em gelo e foram imediatamente submetidas a incubação a 37ºC
ou banho de gelo. Os valores obtidos para as amostras conservadas
em gelo durante todo o período de incubação foram, então,
subtraídos dos demais pontos. Sob as condições experimentais
descritas, as absorbâncias das preparações-controle entre 250 e
400 nm permaneceram sempre constantes durante os períodos de
incubação, de maneira que o aumento detectado na absorbância a
41
340 nm refletiu sempre incremento na concentração do conjugado
DNP-SG. Embora as células tenham sido tratadas com CDNB e o
conjugado DNP-SG tenha sido analisado sem prévia lavagem das
células para a remoção do CDNB não importado (i.e., um na presença
do outro), experimentos preliminares mostraram que a lavagem das
células após incubação com CDNB não afeta as taxas de exportação
do conjugado. Além disso, experimentos onde os estoques
intracelulares de glutationa foram marcados com [2-
3
H]-glicina
indicaram que as células estudadas sintetizam DNP-SG ([2-
3
H]-
glicina) quando incubadas com CDNB (HOMEM DE BITTENCOURT e
cols., 1998a). Também não foi observada alteração na absorbância a
340 nm na análise dos sobrenadantes de meios de incubação de
CDNB com as células em gelo (quando não ocorre exportação do
conjugado para o espaço extracelular). Isso indica que a conjugação
do CDNB com moléculas de GSH deva ocorrer intracelularmente. As
taxas de produção de DNP-SG foram expressas em termos das
médias ± EPM das amostras em duplicatas e foram calculadas com
base no coeficiente de absorção milimolar do DNP-SG a 340 nm
(9,6 mM
-1
.cm
-1
) em pmol/min/10
6
.
8. Determinação do conteúdo intracelular de GSH e
GSSG e relação [GSSG/GSH]
Para a determinação dos conteúdos intracelulares de glutationa
(GSH) e dissulfeto de glutationa (glutationa "oxidada", GSSG), as
células (cerca 1 a 4 x 10
7)
foram lavadas duas vezes em PBS (4°C) e
imediatamente rompidas em 200 μl de ácido metafosfórico 5% (m/v)
com homogeneização por micropipeta para análise cinético-
espectrofotométrica pelo método de reciclagem com o ácido 5,5'-
ditiobis-[2-nitrobenzóico] (=DTNB) e GSSG redutase (GSRd) de
ANDERSON (1985). A rápida homogeneização das células em meio
42
ácido é um passo de extrema importância para a inativação das tiol-
transferases e γ-glutamiltranspeptidases responsáveis pela
transformação da GSH em outros derivados peptídicos, levando a
subestimativas das concentrações reais do tripeptídeo. Além disso, a
acidificação previne a auto-oxidação da GSH que ocorre rapidamente
em pH superior a 7,0 (ANDERSON, 1985; AKERBOOM & SIES, 1981,
CARLBERG, 1985).
Por outro lado, apesar de a auto-oxidação da GSH em GSSG em
meio ácido ocorrer numa taxa mínima (0,1 a 0,2% por hora), pelo
fato de as concentrações intracelulares de GSSG serem naturalmente
muito baixas (menos de 1% da concentração de GSH), o
processamento das amostras para dosagem de GSSG deve ser
efetuado o mais rapidamente possível, a fim de evitar-se resultados
falsamente superiores aos valores reais (AKERBOOM & SIES, 1981).
Em preparações celulares frescas (linfócitos), as células foram
submetidas a incubação com tampão de hemólise para a retirada de
eritrócitos contaminantes, como descrito anteriormente (item 3),
uma vez que eritrócitos, por apresentarem significativa atividade de
enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH, podem interferir nos
resultados, mesmo quando em baixa densidade celular.
A primeira parte do ensaio consistiu na determinação do
conteúdo de glutationa "total" (GSH+ GSSG) medido em equivalentes
de GSH pelo método da reciclagem com DTNB que leva à oxidação
estequiométrica da GSH em GSSG com formação do ácido 5-tio-2-
nitrobenzóico (TNB) e posterior restituição da GSH pela redução
altamente específica com GSSG redutase (GSRd, EC 1.6.4.2) na
presença de NADPH. A taxa de formação de TNB, proporcional à
soma inicial de GSH e GSSG, foi, então, monitorada a 412 nm (ε
TNB
= 13,6 mM
-1
.cm
-1
). Alternativamente, poderia ter sido
monitorada a taxa de consumo de NADPH a 340 nm (ε
NADPH
= 6,22
43
mM
-1
.cm
-1
) ou fluorimetricamente (excitação a 366 nm/emissão de
400-3000 nm). O método empregado é bastante sensível, específico
e reprodutível. Contudo, como a velocidade da reação depende não
somente da concentração inicial de GSH+GSSG, mas, também, da
atividade da GSRd, fatores que interfiram na atividade enzimática,
levarão invariavelmente a falsos resultados. Por isso, além de ter sido
utilizada sempre uma curva de calibração (0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0
nmol) com padrão de GSH precisamente preparado a cada ensaio,
foram efetuadas leituras de amostras com adição de padrão, sendo
os resultados obtidos idênticos aos observados para as amostras
separadamente. A incubação foi iniciada pela adição de 700 μl de
NADPH (concentração final 0,17 mM) e 100 μl de DTNB (final
1,26 mM), ambos em tampão fosfato de sódio 143 mM (pH 7,5), a
cerca de 25 μl de amostra (em MPA 5%) num volume final 990 μl
em cubeta de 1 cm de caminho óptico a 37°C, tendo sido registrada
a absorbância a 412 nm em jaqueta termostatizada com aquisição
direta e processamento cinético automático (em espectrofotômetro
Gilford-Response I, Chicago 60609, USA) até a estabilização das
leituras (12 min). Em seguida, foram adicionados 10 μl de GSRd
(atividade final na cubeta de 0,5 U/ml) sob agitação e as amostras
foram analisadas espectrofotometricamente a 412 nm por cerca de
20 min adicionais.
Antes da determinação do conteúdo de GSSG, alíquotas de
100 μl das mesmas amostras ensaiadas para GSH "total" foram
retiradas para conjugação da GSH presente com N-etil-maleimida
(NEM, Fluka) segundo metodologia descrita em AKERBOOM & SIES
(1981). Foram adicionados, então, 35 μl de NEM 200 mM
(concentração final 50 mM) diretamente às amostras dissolvidas em
MPA 5%. Depois, a mistura foi neutralizada, cuidadosamente sob
agitação, até pH 5,5 pela adição de 20 μl de KOH 2 M em tampão de
ácido piperazina-N,N'-bis-(etanossulfônico) (=PIPES, Boehringer,
44
pKa= 6,8 a 25°C, faixa de trabalho de 6,1 a 7,5) 0,3 M. A inclusão de
PIPES, ou outros agentes tamponantes como MOPS (ácido
morfolinopropanossulfônico), previne alcalinização local, durante a
neutralização, o que levaria a auto-oxidação da GSH, favorecida em
pHs maiores que 7,0. O excesso de NEM, que, em concentrações tão
baixas quanto 10 μM inibe o processo de dosagem da GSSG por
reciclagem em até 30% foi efetuado por extração com 500 μl de
acetato de etila 3 vezes, tendo o excesso de solvente sido evaporado
em concentrador SpeedVac e por passagem em corrente de
nitrogênio. Posteriormente, cerca de 25 μl de amostra foram
ensaiados pelo método da reciclagem, como descrito para a GSH,
exceto que as amostras foram inicialmente incubadas com a GSRd
por 5 min a 37°C, tendo sido monitorada a absorbância a 340 nm
(consumo de NADPH) até a estabilização. Depois, foi adicionado o
DTNB e as leituras a 412 nm (produção de TNB) foram
acompanhadas espectrofotometricamente conforme descrito acima. A
diferença entre os valores obtidos para glutationa "total" e GSSG
forneceu os valores dos conteúdos de GSH procurados.
9. Expressão de proteínas de choque térmico (HSP)
por Western Blot
A expressão de proteínas de choque térmico (HSP), pode
ser tomada como um indicativo de estresse celular induzido pelo
acúmulo de CP-PGs nas células. Particularmente, em células humanas
e de ratos, a HSPs de maior expressão são o polipeptídeo de 72 kDa
(induzida por situações de estresse celular) e o de 74 kDa (forma
constitutiva) coletivamente chamadas de HSP da família de 70 kDa
(HSP70). No intuito de avaliarmos a correlação entre o acúmulo de
CP-PGs em linfócitos e a expressão de HSP70, quantidades iguais de
proteína foram, então, carregadas em gel de poliacrilamida (10%)
para eletroforese. Depois das corridas, foi analisada a indução de
45
expressão de HSP por Western blotting com identificação das HSP70
através do uso de anticorpos monoclonais de camundongo contra
HSP70 humana (SIGMA HS1470) (hibridoma BRM-22) contra HSP70
humana (SIGMA - Amersham) que dá reação cruzada contra a
proteína de rato, permitindo, assim, sua identificação (veja a seguir).
Para a separação destas proteínas, foi aplicado o método de
eletroforese em poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE,
Laemmli e cols., 1970), utilizando-se como amostras suspensões
contendo linfócitos normais, e linfócitos transfectados com o gene
MRP-1, contido no vetor pRc/RSV. As células foram, inicialmente,
precipitadas em tubos para microcentrífuga (Eppendorf), agitadas
(vórtex), lisadas em solução de SDS a 0,1% e passadas em seringa
de insulina (1 ml) para serem homogeneizadas e a quantidade total
de proteína pudesse ser medida (BRADFORD, 1974). A seguir as
preparações foram diluídas em tampão de amostra e quantidades
iguais de proteína foram carregadas e submetidas a corridas
eletroforéticas em cuba Mini-Protean II (Bio-Rad) conforme método
SDS-PAGE descrito no apêndice.
A seqüência dos experimentos compreende a obtenção das
amostras da mesma maneira que para o experimento utilizado na
medição de conjugação e exportação de DNP-SG.
Para o Western blotting das HSP70, as membranas foram
incubadas à temperatura ambiente durante 2 h sob agitação enérgica
em tampão de bloqueio a 0,05% (v/v) na presença de anticorpo
monoclonal BRM-22 de ascite de camundongo, diluído a 1:1000, que
reage especificamente com o polipeptídeo de 73 kDa, HSP73 (ou
HSC70, proteína constitutiva) e com o de 72 kDa, HSP72 (ou HSP70
induzível). Depois disso, as membranas foram lavadas três vezes sob
agitação por 10 min com 5 ml de TEN-Tween e incubada por 1 h com
5 ml de solução contendo o segundo anticorpo, de coelho contra IgG
46
de camundongo conjugado a peroxidase de rabanete (Sigma A 9044)
sob agitação por 1 h adicional. Após nova lavagem, as membranas
foram submetidas a reação com o revelador 4-Cl-Naftol (BIO-RAD)
em tampão contendo NaCl 83 mM, Tris-HCl 17 mM, pH 7,4 e H
2
O
2
a
0,15%, ou reveladas pela técnica de ECL (veja no apêndice).
Imediatamente após o aparecimento das manchas de interesse com
boa resolução, os filtros foram retirados do revelador, lavados com
água a fim de evitar-se superexposição e submetidos a secagem em
estufa por 30 min a 37ºC. Conforme a necessidade em cada caso, as
manchas foram registradas digitalmente (VDS, Amersham Pharmacia
Biotech) e as imagens analisadas para os cálculos posteriores.
10. Expressão de HSP70 e MRP1 em linfócitos
transfectados com o gene MRP1 na presença de PGA
2
A TRANSFECÇÃO DOS LINFÓCITOS FOI EFETUADA EM
ALÍQUOTAS DE 10
7
CÉLULAS (em 500 μl) POR VEZ;
As cubetas de eletroporação estéreis foram colocadas em
gelo na câmara de fluxo laminar, por 10min;
Foram pipetados cerca de 500 μl de suspensão celular,
contendo aproximadamente 1,0 x 10
7
linfócitos (o volume exato
dependeu de cada preparação), nas cubetas de eletroporação, ainda
em gelo, na câmara de fluxo laminar;
Foram pipetados de 50 a 100 μl de DNA plasmideal
(contendo os 10 μg de DNA necessários por transfecção), sobre as
células nas cubetas, isto é, um volume calculado a partir de uma
solução de DNA com concentração girando em torno de 100 a 200 μg
de DNA plasmideal purificado por ml = 01-0,2 mg/ml). As células
47
controle (que não receberam o DNA) foram eletropulsadas com
volume equivalente de TE estéril ou meio de cultura;
Secadas as cubetas externamente com papel-toalha e
eletropulsadas as células a 1500 V nominais (400 V reais);
Anotada a voltagem, real e o tempo de eletroporação que
são determinados automaticamente pelo aparelho Eppendorf;
As células eletroporadas foram diluidas imediatamente(na
câmara de Fluxo Laminar) com um volume de 20 x (10 ml no
presente caso) de meio de cultura RPMI 1640, utilizando-se dos tubos
Falcon de 50 ml previamente preparados = para as placas de 24
poços, sendo 12 controles (sem DNA; só chocadas) e 12
efetivamente transfectadas, foram preparados 2 tubos Falcon de 50
ml contendo previamente 40 ml de meio RPMI sem soro, cada. A
cada eletropulso as células (controles ou transfectadas) foram
transferidas para os respectivos tubos e dispersadas no meio de
cultura com o auxílio de uma pipeta automática com ponteira cortada
(estéril).
Deixadas as células repousando por 10 min à temperatura
ambiente; os dois Falcon de 50 ml (contendo cerca de 47 ml cada) a
1.000 x g por 5 min à temperatura ambiente;
Descartado o sobrenadante na câmara de fluxo laminar e
ressuspensas as células em 13,0 ml (por tubo) de meio RPMI 1640
contendo 10% SFB e 3 μg/ml de Con A (a mistura contendo Con A e
SFB em meio de cultura foi preparada durante a centrifugação das
células). A mistura de meio continha 26 ml para os dois tubos: 2,6 ml
de SFB inativado pelo calor, 156 μl Con A à 500 μg/ml estéril e 23,24
ml de meio RPMI 1640;
48
À medida em que as células foram sendo transfectadas, as
células foram transferidas para Tubo Falcon de 50 ml contendo
apenas meio de cultura RPMI 1640 (GIBCO BRL Life Technologies Ltd.
USA) contendo L-glutamina 2 mM;
Depois que todas as alíquotas foram transfectadas e
repousarem por 10 min à temperatura ambiente, as mesmas foram
somadas na mesma placa de 25 cm
2
onde foram pré-incubadas (por
2 h) para serem cultivadas por 24 h na presença de Con A;
Cultivados os linfócitos na mesma garrafa (contendo os
macrófagos) onde as células foram pré-incubadas para a adesão de
dos mesmos.
Após o cultivo, as células foram ressuspensas (POR
INVERSÃO, NAS PRÓPRIAS GARRAFAS) e transferido o conteúdo de
cada garrafa para um Falcon de 15 ml para centrifugação;
Centrifugadas as células por 10 min a 1000 x g à
temperatura ambiente;
Ressuspenso o conteúdo de cada tubo DELICADAMENTE
com a mão com 13 ml de meio (sem soro nem nada) = 13 alíquotas
de 1,0 ml de células a serem semeadas nas placas de 24 poços por
grupo (controle/DNA);
Avaliada a contagem total e viabilidade celular na alíquota
restante dos 13 ml;
Foram semeadas cuidadosamente (AGITANDO POR
INVERSÃO O TUBO A CADA PIPETADA) as alíquotas de 1,0 ml
(contendo cerca de 10
7
linfócitos cada) em cada poço;
Adicionados 10μl da solução de SBF+ConA (226μl SFB +
24μlConA) a cada poço e a prostaglandina A
2
nas concentrações de
0μM, 10μM e 40μM, tanto para as células controle quanto para as
49
transfectadas, e tanto para cultivo por 6 horas (Fig. 8) quanto por 24
horas (Fig. 9).
Após 6 horas, foi coletada a suspensão dos 6 primeiros
poços agitando com pipeta, e foi transferido para tubo de centrífuga
(eppendorf) de 2ml, os poços foram lavados 1 x com PBS o qual foi
transferido para o mesmo tubo. Os tubos foram centrifugados a
16000G 2min, e homogeneizado o pellet em 100μl SDS 0,1% +
leupeptina + 1μl PMSF.
Foi medida a concentração de proteínas na leitora de Elisa,
adicionado sample buffer e as amostras foram fervidas 5 min para
posterior western blott (Apêndice Final) .
Após 24 horas, foi verificada a viabilidade celular, que
esteve em 1 a 2 x 10
7
células, e foi adicionada Timidina [2-
14
C]
(código Amersham CFA 219
), 0,1μCi/ml para um pool de 1 a 2 x 10
7
WB
Viabilidade
.
1 2
3
4
5
6
PLACA 1
A
B
C
D
Figura 8. Desenho esquemático da distribuição experimental. 1-Linfócito controle;
2-Linfócito controle mais PGA
2
10 µM;3-Linfócito controle mais PGA
2
40 µM;4-
Linfócito Transfectado Controle;5-Linfócito Transfectado mais PGA
2
10 µM;6-
Linfócito transfectado mais PGA
2
40 µM. A-Amostras para medida de expressão de
HSP70 por Western Blot;B-Amostras para medida de expressão de MRP1 por
Western blot;C-Amostras para medida de incorporação de Timidina [2-
14
C];D-
Amostras para medida de captação e incorporação de Timidina [2-
14
C], para Placa
1, coletada após 6 horas de incubação.
50
células, aguardou-se 12 horas (ou mais) e foi adicionado TCA
(método descrito a seguir) para medida da incorporação.
Para a Placa 2 (Fig 9.) aquardou-se 24 horas, e foram
repetidos todos os passos necessários para preparação das amostras,
tanto para western blot (medida de expressão de HSP70 e MRP1),
quanto para viabilidade (medida da incorporação da Timidina).
WB
Viabilidade
.
1 2
3
4
5
6
PLACA 2
A
B
C
D
Figura 9. Desenho esquemático da distribuição experimental. 1-Linfócito controle;
2-Linfócito controle mais PGA
2
10 µM;3-Linfócito controle mais PGA
2
40 µM;4-
Linfócito Transfectado Controle;5-Linfócito Transfectado mais PGA
2
10 µM;6-
Linfócito transfectado mais PGA
2
40 µM. A-Amostras para medida de expressão de
HSP70 por Western blot;B-Amostras para medida de expressão de MRP1 por
Western blot;C-Amostras para medida de incorporação de Timidina [2-
14
C];D-
Amostras para medida de captação e incorporação de Timidina [2-
14
C], para Placa
2, coletada após 24 horas de incubação.
11. Efeito da Xantina/Xantina Oxidase sobre a
expressão de HSP70 e MRP1
À partir de cultura de linfócitos, transfectados e controle (veja
método 6), e após 24 horas em concanavalina A (ConA), a suspensão
foi centrifugada, 1000g x 10 min, descartado o sobrenadante e as
células ressuspensas em 13ml de meio RPMI 1640 (GIBCO BRL Life
51
Technologies Ltd. USA) contendo L-glutamina 2 mM, e distribuídas
como mostrado na Fig. 10:
1. Primeiramente foi adicionada a superóxido dismutase (SOD),
40μl da solução (15000U/ml) aos 2ml de cada poço, exceto os
controle;
2. A seguir, foram adicionados 20μl de Xantina 0,004 V/ml final
(SIGMA -69-89-6) (2,25mM em NaOH 1mM);
3. Por fim , foram adicionados 20μl de Xantina Oxidase 0,004
v/ml final (SIGMA 9002-17-9), para dar o start na reação;
4. Após 30 min, aspirados os poços reservados para MPA, e
transferidos para tubos de centrífuga (eppendorf), lavado uma vez o
poço com PBS e transferido para o tubo, centrifugar 1600G 2min,
quebrado o pellet e ressuspenso em 200μl MPA 5%, para medida de
concentração de GSH, GSSG e[GSSG/GSH].
5. Foi utilizado o mesmo procedimento com os poços
reservados para western blot, aspirados os poços, lavados 2x com
C
1
2
3
5
6
4
B
A
Figura 10. Desenho esquemático da distribuição experimental. 1-Linfócito
controle; 2-Linfócito controle mais xantina/xantina oxidase;3-Linfócito controle
mais xantina/xantina oxidase/SOD;4- Linfócito Transfectado Controle;5-Linfócito
Transfectado mais xantina/xantina oxidase;6- Linfócito transfectado mais
xantina/xantina oxidase/SOD. A-Amostras para medida de expressão de HSP70 por
Western blot;B-Amostras para medida de expressão de MRP1 por Western blot;C-
Amostras para medida de concentração de GSH, GSSG e da relação [GSSG/GSH].
52
PBS, centrifugados a 16000G por 2 min e ressuspensos em meio
RPMI + SFB 10% em placa nova, incubado por 6horas.
6. Após as seis horas, aspirado o conteúdo dos poços, lavado
uma vez com PBS, transferindo para eppendorf de 2ml, centrifugada
a 16000G por 2 min, homogeneizado o pellet e ressuspenso em 100μl
de SDS + Leupeptina + 1μl PMSF.
7. Foi medida concentração de proteínas na leitora de Elisa,
adicionado sample buffer e fervido 5 min, para posterior western blott
(veja no Apêndice Final) .
12. Efeito da Xantina/Xantina Oxidase + βME na
expressão de HSP70
A partir de cultura de linfócitos transfectados e controle (veja
método 6), e após 24 horas em concanavalina A (ConA), a suspensão
foi centrifugada a 1000g por 10min, o sobrenadante foi descartado e
as células foram ressuspensas em 13ml de meio RPMI 1640 (GIBCO
BRL Life Technologies Ltd. USA) contendo L-glutamina 2 mM, e
distribuídas como mostrado na Fig. 11:
Objetivo: Verificar a resposta celular ao agente redutor βME
Soluções e preparações:
βME = Peso Molecular (MW) 78,13 g/mol
ϕ (densid.) = 1,12g/ml
volume final 0,5 ml → usando 10μl → 50X → 1mM final
preparar 50mM e 25mM e 10mM
50mM = 50μmol/ml x 78,13μg/μmol = 3,907mg/ml
53
ρ (densid.) = 1,12g/ml → 1,12mg ⎯ 1μl
3,907mg ⎯ x = 3,49μl
Preparação = 996,5μl Meio RPMI e 3,49μl βME = 50mM
→ 1:1 meio → 25mM → 1:5 → 10mM
C
1
2
3
5
6
4
B
A
Figura 11. Desenho esquemático da distribuição experimental. 1-Linfócito controle
mais xantina/xantina oxidase/βME 10mM; 2-Linfócito controle mais xantina/xantina
oxidase/βME 25mM;3-Linfócito controle mais xantina/xantina oxidase/βME
50mM;4-Linfócito Transfectado mais xantina/xantina oxidase/βME 10mM;5-
Linfócito Transfectado mais xantina/xantina oxidase/βME 25mM;6- Linfócito
transfectado mais xantina/xantina oxidase//βME 50mM. A-Amostras para medida
de expressão de HSP70 por Western blot;B-Amostras para medida de expressão de
MRP1 por Western blot;C-Amostras para medida de concentração de GSH, GSSG e
da relação [GSSG/GSH].
1. Primeiramente, foi adicionado o βME para cada poço, nas
concentrações indicadas, após foi adicionada a xantina, e por último
foi dado o start na reação com xantina oxidase.
3. Após 30 min o conteúdo dos poços foi aspirado, os poços
lavados duas vezes com PBS, sendo o lavado transferido para tubo de
2ml (eppendorf), foi centrifugado a 16000G por 2 min, o pellet foi
homogeneizado e ressuspenso em 100μl de SDS + Leupeptina + 1μl
PMSF.
54
4. Foi medida concentração de proteínas na leitora de Elisa, as
amostras foram padronizadas, adicionou-se sample buffer e, as
mesmas foram fervidas 5 min, para posterior western blott (ver
Apêndice Final) .
13. Efeito do choque térmico na expressão de HSP70
e MRP1
A partir de uma cultura de linfócitos, transfectados e controle
(veja método 6), e após 24 horas em concanavalina A (ConA), a
suspensão foi centrifugada, 1000g x10min, descartado o
sobrenadante e as células ressuspensas em 13ml de meio RPMI e
distribuídas como mostrado na Fig. 12:
1. As placas 1 e 2 foram submetidas, a choque térmico de 42°C
por duas horas;
2. Seguiu-se incubação por 6 horas em estufa de CO
2
5%, a
37°C.
PLACA 1
PLACA 2
2
2
1
1
A
B
A
B
Figura 12. Desenho esquemático da distribuição experimental. 1-Linfócito controle
2-Linfócito transfectado A-Amostras para medida de expressão de HSP70 por
Western blot;B-Amostras para medida de expressão de MRP1 por Western blot;
Placa 1-um choque térmico de 42°C, por duas horas; Placa 2-um choque térmico
de 42°C, por duas horas, e outro choque térmico 24 horas após o primeiro;
55
3. Após 6 horas a suspensão da placa 1 foi coletada, sendo
agitada com pipeta, o poço foi lavado 1 x com PBS e transferido tudo
para tubo de 2ml (eppendorf);
4. Seguiu-se centrifugação a 16000G por 2min;
5. O pellet foi homogeneizado em 100μl de SDS 0,1% +
Leupeptina + 1μl de PMSF;
6. A concentração de proteínas foi medida na leitora de Elisa, as
amostras foram padronizadas, adicionou-se sample buffer e, as
mesmas foram fervidas por 5 min, para posterior western blott (ver
Apêndice final) .
7. Após 24 horas, a viabilidade foi medida (em torno de 1 a 2 x
10
7
células);
8 . Foi adicionada Timidina 0,1 μCi/ml para um pool de 1 a 2 x
10
7
células ;
9. Foi adicionado o TCA (método a seguir) e realizada a leitura
da incorporação.
10. 24 horas após o primeiro choque, foi realizado o segundo
choque na placa 2, de 42°C por duas horas, e incubado em estufa de
CO
2
5%, a 37C, após 6 horas de incubação procedido da mesma
forma como os passos 3 a 9 realizados com a placa 1.
14. Preparações celulares para avaliação da taxa de
captação e incorporação de Timidina [2-
14
C]
Princípio: Tendo em vista que, dos 5 nucleotídeos componentes de
ácidos nucleicos (A, C, G, T e U), somente a timidina (T) é
incorporada apenas em DNA, a incorporação da mesma em células
fornece pistas sobre a atividade de síntese de DNA.
Linfócitos obtidos de linfonodos mesentéricos de um pool de 4
ratos (crescendo aderidos às placas), foram cultivados em meio
56
RPMI, adicionado de 10% (v/v) de soro fetal bovino em placas de
cultura estéreis de 24 poços (para experimentos com PGA) ou 4
poços (para experimentos com choque térmico).
A Timidina [2-
14
C] foi diluída em PBS ou meio de cultura a 10
μCi/ml (para utilizar 50 μL/500 μL finais em placas de 24 poços, ou
200 μL/2 mL finais em placas de 6 poços, concentração final
0,1 μCi/mL ou 0,02 μCi/well
Para os experimentos com concanavalina A (con A) a mesma foi
preparada em meio estéril (em meio de cultura); solução-mãe a
500 μg/ml. Como a concentração final da lectina (con A) deve ser
5 μg/ml (acima do que ocorre perda de viabilidade de linfócitos), a
diluição da solução-mãe foi realizada diretamente no meio de cultura
a 1:100 (100 μL de con A para 10 ml finais de meio com SFB);
posteriormente a solução-mãe foi diluida 1:5 com meio de cultura
(por exemplo, 200 μL de con A concentrada + 800 μL de meio) e, em
seguida 1:20 já nas placas (por exemplo, 25 μL da solução diluída a
1:5 + 475 μL de meio contendo os demais aditivos, ou, ainda, 100 μL
da solução diluída 1:5 + 1900 μL de meio contendo os demais
aditivos)
Os linfócitos ativados com Con A foram obtidos pela adição da
lectina como descrito acima, enquanto que as células controle
(quiescentes) receberam quantidades idênticas de meio. Excetuando-
se o pulso de timidina [2-
14
C], todas as adições celulares foram
realizadas no início das culturas. Depois dos períodos de
incubação/cultura prévios, as células receberam um pulso de timidina
(timidina [2-
14
C] 0,02 μCi/poços e foram cultivadas por 15 h
adicionais. Depois deste período, as células foram coletadas para a
avaliação da incorporação de timidina[2-
14
C].
Neste caso, a coleta de células foi feita automaticamente em
um coletor múltiplo (Skatron Combi Multiple Cell Harvester, Suffolk,
UK) e papéis-de-filtro cat. Nº 1731 (Skatron Combi, Suffolk, UK), não
57
havendo necessidade de processos extrativos preparatórios para a
obtenção do DNA celular. Os discos de papel contendo a
radioatividade incorporada no DNA das células (apenas a fração
insolúvel em TCA) foram levados para contagem em 5 ml de coquetel
de cintilação hidrossolúvel.
Filtração em sistema Manifold Millipore®.
Após a incubação em TCA a 10% por 1 h, o material foi
centrifugado (15.000 x g por 5 min) e foi efetuada a coleta de
alíquotas de volume conhecido do sobrenadante (por exemplo 450 μL
de 500 mL) para a determinação da radioatividade incorporada ao
material solúvel em TCA (timidina captada mas não incorporada ao
DNA) como na preparação anterior. Neste caso, entretanto, a
suspensão foi agitada em vórtex e o precipitado (os tubos Eppendorf
foram lavados com TCA 5% para retirar qualquer resíduo de material)
foi transferida para o sistema Millipore equipada com membranas
(0,45 μm) de nitrocelulose. Em seguida, as amostras foram lavadas
por três vezes com volumes de 5 mL TCA 5% e deixadas secar na
linha de vácuo do sistema até o final. Após, as membranas (filtros)
foram transferidas diretamente para os viais para contagem da
radioatividade incorporada em 1,5 mL de líquido de cintilação.
Cálculo da taxa de captação/incorporação de timidina em DNA
A estimativa das alterações na incorporação de timidina
marcada no DNA das células foi feita diretamente a partir das
contagens em cpm ou dpm e expressas pelo número de células
estudadas por well. Exemplo: 3.450 cpm/10
5
células. Embora a
incorporação de timidina em DNA seja o resultado pretendido, não se
pode deixar de compará-la com a CAPTAÇÃO TOTAL = (TIMIDINA
CAPTADA + TIMIDINA INCORPORADA EM DNA) uma vez que as
58
células como um todo podem apresentar uma falsa incorporação alta
(alta captação e baixa incorporação em DNA) caso as células como
um todo sejam medidas. Ao contrário, baixas incorporações podem,
na verdade constituir-se baixa captação e não baixa incorporação em
DNA.
Valores de referência (n=12):
Linfócitos quiescentes: 389 ± 56
Linfócitos estimulados com Con A: 4105 ± 531 (10,55 x em relação
aos controles)
15. Cálculo das concentrações de proteínas nas
amostras analisadas
Na determinação das concentrações de proteínas nas amostras,
quando demandado em cada caso, foram utilizados os métodos de
BRADFORD (1976) e de LOWRY e cols. (1951), conforme indicado.
Em ambas as determinações, foram utilizadas como padrão de
referência, soluções de albumina sérica bovina (BSA) fração V
(Sigma). A razão para a escolha de um ou outro método foi a
sensibilidade e interferência de certos componentes das preparações
a serem analisadas. O método de BRADFORD, baseado na ligação do
Azul Comassie Brilhante G-250 0,01% (m/v) em meio de ácido
fosfórico 8,5% (m/v)-etanol 4,7% (m/v) a proteínas das amostras,
com formação de complexo que absorve intensamente a 595 nm
(BIO-RAD Protein Assay kit, Bio-Rad Laboratories, GmbH, DR),
apresenta, na faixa de algumas dezenas de microgramas de proteína
ensaiada, sensibilidade um pouco maior que o método de LOWRY e
cols.. Este, por sua vez, baseia-se na ligação do reagente de Folin-
Ciocalteau a hidroxilas fenólicas presentes em amostras protéicas
hidrolisadas previamente em meio alcalino, com formação de
59
complexo cromogênico que pode ser monitorado
espectrofotometricamente a 750 nm. Por outro lado, em amostras
contendo dodecilsulfato de sódio (SDS), EDTA, EGTA, sacarose, Triton
X-100 e Tris, devido à razoável interferência apresentada, optou-se
pela utilização do método de LOWRY e cols..
16. Análise estatística
Conforme necessário em cada experimento, as diferenças entre
os grupos controle e os tratados foram comparadas com o teste "t"
de Student bicaudado para dados não-pareados tendo sido
considerado para nível de significância mínimo um risco α com
p<0,05 para erros do tipo I, Tukey-Kramer ou Bonferroni para análise
de variância.
60
RESULTADOS
1. Transfecção
Determinação da voltagem e número de pulsos
Um fator crítico na transfecção de células eucarióticas é a
escolha do procedimento de transfecção celular. O procedimento deve
apresentar eficiência e não deixar resíduos, já que as células devem ser
preparadas e posteriormente submetidas à presença de substâncias
oxidantes e redutoras, com a finalidade de determinar a resposta de
manutenção do estado redox celular.
Das várias técnicas disponíveis, escolhemos a eletroporação
por ser limpa, rápida e apresentar um rendimento razoável em termos
de μg de DNA/número de células expostas. A eletroporação consiste
num pulso elétrico rápido (8 ms, constante determinado pelo aparelho,
Eppendorf) aplicado às células em suspensão de sorte que as células
ficam altamente despolarizadas com abertura de todos os canais iônicos
e com exposição do intracelular ao meio externo durante este período
de tempo. Como o DNA é negativo, migra rapidamente pela diferença
de potencial eletroquímico estabelecido. Contudo, uma limitação da
técnica é a voltagem a ser aplicada: quanto maior, melhor a eficiência.
No entanto, quanto maior, maior a taxa de mortalidade celular.
Para testar qual a melhor voltagem para transfecção de
linfócitos foram utilizadas entre 1,0 à 3,5 X 10
7
células, obtidas de
61
linfonodos mesentéricos e ressuspensos em 4ml de meio RPMI1640
(sem soro). Esta suspensão era fracionada em 500 μl, as células
contadas e, depois, eletroporadas com diferentes voltagens. Iniciamos
com 40 V até 1500 V. Após, dividíamos as células vivas pelo somatório
entre vivas e as mortas, obtendo a porcentagem de células vivas
(Fig. 7). Desta forma ficou determinado que 400 V de diferença de
potencial real (não a nominal aplicada no aparelho) representava o
máximo de voltagem a ser aplicado sem comprometimento da
viabilidade celular.
Figura 7. Viabilidade celular de linfócitos (10
7
em 0,5 ml de meio de
cultura RPMI1640) transfectados por eletroporação com o gene MRP-1
contido no vetor pRc/RSV a várias voltagens diferentes, conforme
descrito em Materiais e Métodos, imediatamente após a transfecção.
62
Além da voltagem, o número de pulsos também foi testado.
Para tanto foi repetido o procedimento descrito anteriormente,
utilizando-se voltagem programada de 250 a 1200 V, aplicando-se um,
dois e três pulsos, verificando-se o percentual de células vivas, usando
o mesmo critério já descrito. Os resultados obtidos demonstraram que a
melhor viabilidade é obtida quando aplicamos apenas um pulso elétrico
com voltagem de 400V (voltagem real). Podemos observar que quando
aplicamos dois pulsos o percentual de células viáveis tende a aumentar,
porém não ultrapassa 40%. Quando foram aplicados três pulsos a
viabilidade diminui aproximando-se de zero (Fig. 8).
Figura 8 - Viabilidade celular de linfócitos (10
7
em 0,5 ml de meio de
cultura RPMI1640) transfectados com o gene MRP-1 contido no vetor
pRc/RSV, por eletroporação, com - 1 eletropulso; - 2 eletropulsos;
e 3 eletropulsos de 250, 400, 600 e 800 volts de voltagem real :,
sendo da diferente número de pulsos, conforme descrito em Materiais
e Métodos, imediatamente após a transfecção. (gráfico representativo
de 4 ex
p
erimentos
)
0
20
40
60
80
100
120
250 volts 400 volts 600 volts 800 volts
Voltagem Real
Células viáveis (%)
63
Determinação da efetividade da transfecção
Segundo a literatura, transfecções eficientes são obtidas
utilizando-se, para transfecção transiente, uma relação de 10 a 40 μg
de plasmídio para 1 a 2 X 10
7
células (POTTER et all,1984) . Para
verificação da eficiência da transfecção, foram tomadas entre 1,0 à 3,5
X 10
7
células, obtidas de linfonodos mesentéricos e ressuspensos em
4ml de meio RPMI1640 (sem soro). Esta suspensão dividida em 500 μl
separada em dois grupos, controle e transfectadas. O grupo controle foi
eletroporado a 400 V, em um dois e três pulsos (choques). O grupo
transfectado recebeu o plasmídeo pRc-RSV na proporção de 40 μg para
1,28 x 10
7
células, sendo eletroporado com 400 V em um dois e três
pulsos.
Os linfócitos foram então incubados por 24 horas na presença
de conA, conforme descrito no capítulo de métodos, e a determinação
da eficiência da transfecção foi realizada por Western Blot, utilizando-se
5 μl de anticorpo monoclonal Anti-MRP1 (M9192 SIGMA). O grupo
transfectado utilizando-se um pulso apresentou uma expressão de
MRP1 34%, maior que o grupo controle eletroporado com apenas um
pulso, e 21% maior, p<0,05, que o grupo transfectado com dois
pulsos.(Fig. 9).
64
65
2. Expressão de Proteínas de Choque Térmico
HSP70 em Linfócitos Controle e Transfectados,
na presença de Prostaglandina A
2
Prostaglandinas A
2
(PGA
2
) são substâncias sabidamente
eletrofílicas, e portanto, de fácil conjugação com substâncias doadoras
de elétrons (por exemplo glutationa). A presença destas
prostaglandinas pode causar dano celular, pois além de conjugar-se
com a glutationa depletando-a e, consequentemente, diminuir a
resposta ao estresse oxidativo celular, esta substância é também
antiproliferativa, agindo na fase G1 para S do ciclo celular, impedindo a
divisão. Quando ocorre a presença de PGA
2
intracelularmente, vários
fatores de resposta ao estresse são ativados, entre estes a produção de
proteínas de choque térmico (HSP).
A expressão de HSP70 (proteína de choque térmico de 70
kDa) foi analisada em linfócitos controle e transfectados, na presença
de PGA
2
nas concentrações de 10 μM e 40 μM, seis horas e vinte e
quatro horas após a incubação.
Foram utilizadas 2,65 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 44,5 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o
gene da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de
400 V. Ambos os grupos foram incubados em presença de
concanavalina A por 24 h. Após este período os grupos foram incubados
66
na presença de Prostaglandina A
2,
nas concentrações de 10 μM e 40 μM
(conforme descrito no capítulo de métodos), por 6 e 24 horas.
Nas incubações com 6 horas, as células não transfectadas,
incubadas com PGA
2
10μM, quando comparadas com seu respectivo
controle, tiveram um aumento na expressão de HSP70 (em torno de
11%). Já com 40 μM, houve queda da expressão (em torno de 30%; p=
0,0812), o que pode ser atribuído a morte celular, já que esta
concentração é extremamente tóxica para linfócitos (Homem de
Bittencourt e cols., 1998b,c).
Por outro lado, as células transfectadas, incubadas com PGA
2
10μM, quando comparadas com seu respectivo controle apresentam
uma ligeira queda da expressão de HSP70 enquanto que incubadas com
40 μM apresentaram um aumento da expressão de HSP70 da ordem de
25% (p=0,0806) (FIG 10).
Nas incubações por 24 h, as células não transfectadas quando
comparadas com seu próprio controle não apresentaram diferenças
significativas. Já as células transfectadas e incubadas com 10 μM de
PGA
2
apresentaram uma queda na expressão de HSP70 na ordem de
42% (p=0,0157), situação que se inverte com as células transfectadas
na presença de PGA
2
40 μM que apresentam uma expressão 48%
(p=0,0098) maior de HSP70, quando comparada com seu próprio
controle (FIG 11).
67
68
69
3. Expressão de Proteínas de Choque Térmico
HSP70 em Linfócitos Controle e Transfectados,
na presença Xantina/Xantina Oxidase, SOD e
βME
Espécies ativas do oxigênio (por exemplo superóxido) são
produzidas pelo oxigênio molecular em vários processos biológicos.
Dentre estes a reação da enzima Xantina oxidase quando catalisa a
oxidação da Xantina à ácido úrico. O aumento de espécies ativas do
oxigênio, intracelularmente, leva ao desbalanço do estado de
oxidação/redução, conhecido como estresse celular.
Com a finalidade de avaliar a expressão de proteínas de
choque térmico HSP70 em células transfectadas e não tranfectadas com
o gene da MRP1, contido no plasmídeo pRc-RSV, as mesmas foram
incubadas na presença de xantina/xantina e superóxido dismutase.
Foram utilizadas 2,58 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 44,5 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o
gene da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de
400 V. Ambos os grupos foram incubados em presença de
concanavalina A por 24 h. Após este período as células foram incubadas
na presença de Xantina (26,8 U/ml) e Xantina Oxidase (0,4 U/ml) e
superóxido dismutase (SOD – 15000 U/ml) (conforme descrito no
capítulo de métodos) por 30 min.
70
As células não transfectadas, quando comparadas com seu
controle, apresentaram uma queda de 70% na expressão de HSP70
quando incubadas com xantina e xantina oxidase. Quando se adicionou
superóxido dismutase (SOD), enzima de redução do superóxido, o
comportamento permaneceu semelhante. As células transfectadas e
incubadas com xantina/xantina oxidase, mostram uma expressão de
HSP70 quatro vezes menor, quando comparadas ao seu controle.
Situação totalmente revertida pela adição de SOD (FIG 12).
71
A expressão de HSP70 foi avaliada também nas células
transfectadas e não transfectadas, incubadas na presença de
xantina/xantina oxidase, porém com a adição do agente redutor beta
mercaptoetanol (βME).
Foram utilizadas 1,72 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 23 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o gene
da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de 400
V. Ambos os grupos foram incubados em presença de concanavalina A
por 24 h. Após este período os grupos foram incubados na presença de
Xantina (26,8 U/ml) e Xantina Oxidase (0,4 U/ml) e beta
mercaptoetanol (βME) nas concentrações de 10 µM, 25 µM e 50 µM, por
30 min.
Não houve diferença significativa na expressão de HSP70,
entre os grupos das células não transfectadas. As células transfectadas
apresentaram expressão de HSP70 duas vezes menor no grupo
incubado na presença de βME na concentração de 25 μM, em
comparação com o grupo incubado com 10 μM. A mesma redução de
expressão de HSP70 foi verificada no grupo tratado com 50 μM com
relação do grupo incubado com 10 μM (FIG 13).
72
73
4. Expressão da MRP1/bomba GS-X em
Linfócitos Controle e Transfectados, na
presença de Prostaglandina A
2
A MRP1/Bomba GS-X é uma proteína de membrana capaz de
reconhecer conjugados sulfidrila, tais como: dissulfetos de glutationa
(GSSG), CPPG-SG (conjugados –SG resultantes da conjugação de
prostaglandinas ciclopentenônicas e GSH), medicamentos, e exportá-los
para o espaço extracelular, e, neste processo depletar glutationa
reduzida (GSH), podendo afetar o balanço redox celular, alterando a
resposta ao estresse celular mediada pela ação da GSH.
A expressão da MRP/Bomba GS-X (proteína de múltipla
resistência à drogas) foi analisada em linfócitos controle e
transfectados, na presença de PGA
2
nas concentrações de 10 μM e 40
μM, seis horas e vinte e quatro horas após a incubação.
Foram utilizadas 1,76 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 46 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o gene
da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de 400
V.
Nas incubações de 6 h, as células não transfectadas, quando
incubadas com PGA
2
10μM, apresentaram uma expressão de MRP1 duas
vezes maior que o controle. Apesar da aparente queda de expressão
nas células incubadas com 40 μM, os valores obtidos não demonstram
diferença significativa. As células transfectadas apresentaram uma
74
expressão de MRP1 cinco vezes maior que as não tratadas,
demonstrando assim a efetividade da transfecção. E, quando
comparadas com seu controle mostram uma discreta queda progressiva
da expressão de MRP, para os grupos incubados com a PGA
2
nas
concentrações de 10 μM e 40 μM (FIG 14).
Nas incubações de 24 h, as células não transfectadas, e
incubadas com PGA
2
nas concentrações de 10 μM e 40 μM não
apresentaram diferenças significativas na expressão de MRP1. As
células transfectadas e incubadas com PGA
2
na concentração de 40 μM,
apresentaram um aumento da expressão de MRP1 33% quando
comparadas com seu controle (FIG 15).
75
76
5. Expressão de MRP1 na presença de
Xantina/Xantina Oxidase e SOD
Como anteriormente descrito a reação da enzima Xantina
oxidase, quando catalisa a oxidação da Xantina à ácido úrico, produz
superóxido causando estresse oxidativo. Analisamos a expressão de
MRP1 em células controle e transfectadas, sob o efeito do estresse
produzido pelo par xantina/xantina oxidase e com a adição de SOD.
Foram utilizadas 2,57 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 48 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o gene
da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de 400
V, 8s. Ambos os grupos foram incubados em presença de Xantina (26,8
U/ml) e Xantina Oxidase (0,4 U/ml) e superóxido dismutase (SOD –
15000 U/ml) (conforme descrito no capítulo de métodos) por 30 min.
As células não transfectadas, quando comparadas com seu
controle, não apresentam diferenças significativas na expressão de
MRP1 entre os grupos tratados. As células transfectadas com o gene da
MRP1, contido no plasmídeo pRc-RSV, comparadas ao seu controle,
apresentaram uma expressão 2 vezes maior, p<0,01, da MRP1, quando
incubadas com xantina e xantina oxidase. Quando se adicionou
superóxido dismutase (SOD), enzima de redução do superóxido, a
expressão de MRP1 foi ainda 1,5 vezes maior que o controle p<0,01,
sugerindo que o estresse oxidativo possa estar colaborando na
expressão da bomba (Fig. 16).
77
78
6. Medida das concentrações de GSH, GSSG e
relação [GSSG/GSH]
Com a finalidade de determinar a resposta ao estresse
oxidativo produzido pela reação xantina/xantina oxidase (aumento da
produção de superóxido) em linfócitos controle e transfectados com o
gene da MRP1 contido no plasmídeo pRc-RSV, foram determinadas as
concentrações de glutationa reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSG)
e a relação entre estas.
Foram utilizadas 2,58 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 44,5 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o
gene da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de
400 V. Ambos os grupos foram incubados em presença de
concanavalina A por 24 h. Após este período as células foram incubadas
na presença de Xantina (26,8 U/ml) e Xantina Oxidase (0,4 U/ml) e
superóxido dismutase (SOD – 15000 U/ml), por 30 min. As medidas das
concentrações de GSH, GSSG e a relação GSH/GSSG foi analisada por
espectrofotometria em leitora de Elisa (conforme descrito no capítulo de
métodos).
As células não transfectadas e incubadas na presença de
xantina/xantina oxidase (X/XO), apresentaram concentração de GSH
78% vezes menor, p<0,05, quando comparadas com seu controle.
Recuperando a expressão de GSH quando se adicionou SOD. Ao
contrário, as células transfectadas e incubadas na presença de X/XO,
79
apresentaram um aumento de 91%, p<0,05, na concentração de GSH,
quando comparadas com seu controle. Quando comparamos os dois
grupos celulares incubados na presença de X/XO, transfectados e não
transfectados, podemos observar que as células transfectadas
apresentaram uma concentração de GSH quase treze vezes maior que
as células não tranfectadas, p<0,05, (FIG 17).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
C
ONT
C
ONT
C
ONT
X
A
/
X
O
C
ONT
X
A
/
X
O
/
S
OD
T
R
A
NS
F
C
ONT
T
R
A
NS
F
X
A
/
X
O
T
R
A
NS
F
X
A
/
X
O/
S
OD
concetração de GSH
(nmol /10 células)
6
*
†
*
†
Figura 17 –Concentração de GSH em CONT CONT–linfócitos controle; CONT
XA/XO–linfócitos controle incubados na presença de Xantina/Xantina Oxidase; CONT
XA/XO/SOD linfócitos controle incubados na presença de Xantina/Xantina
Oxidase/SOD; TRANSF CONT–linfócitos transfectados; TRANSF XA/XO - linfócitos
transfectados incubados na presença de Xantina/Xantina Oxidase; TRANSF
XA/XO/SOD-linfócitos transfectados incubados na presença de Xantina/Xantina
Oxidase/SOD., p<0,005. Gráfico representativo da média de sete experimentos
independentes, cada um em duplicata.(Análise estatística por Tukey-Kramer/
Bonferroni e teste T de student).
80
Com relação às concentrações intracelulares de GSSG, tanto
as células transfectadas quanto as não-transfectadas não mostraram
diferença significativa. Quando incubadas com X/XO, ou com X/XO e
SOD, também não apresentaram diferenças significativas, conforme
avaliação pelos testes t de Student, por ANOVA, seguida de teste de
Bonferroni (FIG 18).
A relação [GSSG/GSH] é um importante indicador da resposta
celular ao estresse, pois o balanço redox celular, depende em grande
parte da manutenção do metabolismo da glutationa, em especial de sua
forma reduzida (GSH). Quando analisamos as células não-
transfectadas, pudemos observar que o grupo incubado na presença de
0
2
4
6
8
10
12
C
O
NT C
O
NT
CO
NT
XA/X
O
CO
N
T
XA/XO/SOD
TRANSF CONT
TRANS
F
XA/XO
TR
ANSF
X
A
/XO/SO
D
Concetração de GSSG
(nmol/ 10 células)
6
Figura 18 –Concentração de GSSG em CONT CONT–linfócitos controle; CONT
XA/XO–linfócitos controle incubados na presença de Xantina/Xantina Oxidase; CONT
XA/XO/SOD linfócitos controle incubados na presença de Xantina/Xantina
Oxidase/SOD;TRANSF CONT–linfócitos transfectados; TRANSF XA/XO–linfócitos
transfectados incubados na presença de Xantina/Xantina Oxidase; TRANSF
XA/XO/SOD-linfócitos transfectados incubados na presença de Xantina/Xantina
Oxidase/SOD. Não se observam diferenças significativas nas concentração de GSSG
nos grupos estudados. Gráfico representativo de sete experimentos intependentes,
cada um em duplicata.
81
X/XO apresenta uma relação [GSSG/GSH] 5,5 vezes (p<0,001) maior
que seu controle (FIG 19) sugerindo um intenso estresse oxidativo. No
entanto, as células transfectadas não apresentaram diferença
significativa entre os grupos tratados.
0
2
4
6
8
10
12
C
ONT
C
ONT
C
ONT XA/
X
O
C
ONT X
A
/
X
O/
S
O
D
TR
ANSF CO
N
T
TR
A
N
S
F XA
/
XO
TRANSF XA
/
XO/SOD
Relação [GSSG]/[GSH]
*
Figura 19 – Relação [GSSG/GSH] CONT CONT - linfócitos controle; CONT
XA/XO–linfócitos controle incubados na presença de Xantina/Xantina
Oxidase; CONT XA/XO/SOD linfócitos controle incubados na presença de
Xantina/Xantina Oxidase/SOD;TRANSF CONT–linfócitos transfectados;
TRANSF XA/XO–linfócitos transfectados incubados na presença de
Xantina/Xantina Oxidase; TRANSF XA/XO/SOD-linfócitos transfectados
incubados na presença de Xantina/Xantina Oxidase/SOD. (p<0,001). Gráfico
representativo de sete experimentos independentes, cada um em duplicata.
(
Análise estatística
p
or Bonferroni
)
.
7. Incorporação de Timidina [2-
14
C]
Como já comentado anteriormente, as células dependem da
sustentação do metabolismo da glutationa para manutenção do estado
redox celular e reposta ao estresse oxidativo. Em situações onde
aconteça a depleção da glutationa, sem a posterior recuperação, ocorre
o acúmulo de glutationa oxidada (GSSG) e substâncias citotóxicas, tais
como radicais livres. O acúmulo de radicais livres intracelularmente
causam a alteração do DNA, por peroxidação das bases e dano às
82
proteínas; atacam os ácidos graxos insaturados nos fosfolipedes e
outros componentes lipídicos das membranas celulares, resultando na
formação de hidroperóxidos lipídicos, alterando a estrutura das
membranas e perturbando sua função normal, o que pode ativar o
mecanismo de apoptose celular.
Primeiramente foi determinada a incorporação da Timidina [2-
14
C] em linfócitos controle e linfócitos incubados na presença de
concanavalina A (ConA), agente mitógeno. Observa-se uma
incorporação cinco vezes maior, p<0,001, nos linfócitos tratados com
ConA (FIG 20).
0
4000
8000
12000
16000
12
Incorporação de Timidina [2-
14
C]
(dpm)
Controle
Con A (5 μg/mL)
*
p<0,001
Para verificar a função imunológica apresentada pelas células,
transfectados não transfectados, incubadas na presença de PGA
2
nas
concentrações de 10 μM e 40 μM ou submetidas a choque térmico de
42ºC, as mesmas foram incubadas na presença de Timidina [2-
14
C],
com a finalidade de medir a captação e incorporação da mesma.
Figura 20 – Gráfico representativo incorporação de timidina [2-14C]
em células (linfócitos) controle e na presença de concanavalina A , onde
se observa uma incorporação 5 vezes maior nas células tratadas com
Con A, p<0,001. Gráfico representativo de dois experimentos
independentes, cada um em duplicata.(Análise estatística por teste t de
student).
83
Foram utilizadas 2,65 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletropulsadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 44,5 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o
gene da MRP1, e posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de
400 V. Ambos os grupos foram incubados em presença de
concanavalina A por 24 h. Após este período os grupos foram incubados
na presença de Prostaglandina A
2,
nas concentrações de 10 μM e 40 μM,
por 6 e 24 horas e adicionada Timidina[2-
14
C] (conforme descrito no
capítulo de métodos).
A capacidade de captação de Timidina [2-
14
C], pelos grupos
celulares estudados foi avaliada para excluir a possibilidade de que
alterações na captação pudessem refletir-se nos resultados de
incorporação obtidos.
As células não transfectadas, quando tratadas com PGA
2
10
μM, por 6 horas, apresentam leve tendência para aumentar a captação
quando comparadas ao controle. No entanto, as diferenças de captação
apresentadas pelos grupos de células transfectadas e não transfectadas,
entre si, ou entre grupos, não foram significativas (FIG 21). Resultado
semelhante foi obtido nos grupos tratados por 24 horas (FIG 22), ou
mesmo para os grupos tratados com choque térmico (FIG 23).
84
Figura 21 – Captação de timidina [2-14C] em X1–linfócitos controle;X2- linfócitos controle
incubados na presença de PGA
2
10μM; X3- linfócitos controle incubados na presença de PGA
2
40
μM; X4–linfócitos trnasfectados;X5- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
10μM; X6- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
40 μM; pelo período de 6 h.
Não se observam diferenças significativas entre os grupos estudados. Gráfico representativo de
dois experimentos independentes, cada um em duplicata. (Análise por ANOVA).
Figura 22 – Captação de timidina [2-14C] em X1–linfócitos controle;X2- linfócitos controle
incubados na presença de PGA
2
10 μM; X3- linfócitos controle incubados na presença de PGA
2
40 μM; X4–linfócitos transfectados;X5- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
10μM; X6- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
40 μM; pelo período de 24 h.
Não se observam diferenças significativas entre os grupos estudados. Gráfico representativo de
dois experimentos independentes, cada um em duplicata. (Análise por ANOVA)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
CO
N
T
CO
N
T
CO
NT
P
G
A
2
10
µ
M
CON
T
PGA2
40µM
T
R
ANSF C
O
N
T
T
R
N
AS
F
PGA2
10
µM
TRNASF PGA2 40µM
Captação de Timidina [2- C]
(pmol/10 células)
14
6
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
C
ONT CO
N
T
CO
N
T
PG
A2
10 µ
M
CONT
PG
A
2 4
0
µM
TRANS
F
CONT
T
RANSF PGA2 10 µm
T
R
A
N
SF
PG
A2 40 µm
Captação de Timidina [2- C]
(pmol/10 células)
14
6
85
Posteriormente foi avaliada a capacidade de incorporação de
Timidina [2-
14
C], no DNA das células tratadas (linfócitos controle e
transfectados). Não se observam diferenças significativas entre os
grupos controle e transfectados, na presença de prostaglandina A
2
,
após 6 horas de incubação (FIG 24). Resultado semelhante para
incubação durante 24 horas (FIG 25).
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
X
1
CON
T
C
O
NT
X
2
C
ONT
1 HS
X
3
C
ONT
2 HS
X4 T
R
A
NSF C
O
N
T
X5 TRANSF 1HS
X6 TRANSF 2HS
Captação de Timidina [2- C]
(pmol/10 células)
14
6
Figura 23 – Captação de timidina [2-14C] em X1-linfócitos controle; X2-linfócitos
controle submetidos a um choque térmico de 42°C por duas horas; X3-linfócitos
controle submetidos a dois choques térmicos de 42°C por duas horas; X4-linfócitos
transfectados; X5-linfócitos transfectados submetidos a um choque térmico de 42°C
por duas horas; X6-linfócitos transfectados submetidos a dois choques térmicos de
42°C por duas horas. Não se observam diferenças significativas entre os grupos
estudados. Gráfico representativo de dois experimentos independentes, cada um em
duplicata.Análise por ANOVA.
86
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
X1 CONT CONT
X2 CO
N
T PGA2
10
µM
X3
C
ONT P
G
A2 40µM
X4 T
RA
NSF
C
ONT
X5
TRA
NSF
P
GA2 10µ
M
X6T
R
ANSF
P
G
A2
40
µM
Incorporação de Timidina [2- C]
(pmol/10 células)
14
6
Figura 24 – Incorporação de timidina [2-14C] em X1–linfócitos controle;X2- linfócitos controle
incubados na presença de PGA
2
10 μM; X3- linfócitos controle incubados na presença de PGA
2
40 μM; X4–linfócitos trnasfectados;X5- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
10 μM; X6- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
40 μM; pelo período de 6 h.
Não se observam diferenças significativas entre os grupos estudados. (Análise por ANOVA)
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
X
1 CON
T
CONT
X2 CONT PGA2 10 µm
X
3 C
O
N
T
P
GA2 40 µM
X
4 TRANSF
CO
NT
X5
TRAN
SF
PGA2 10 µm
X
6
TRAN
SF
PGA2 40 µm
Incorporação de Timidina [2-
14
C]
(pmol/10
6
células)
Figura 25 – Incorporação de timidina [2-14C] em X1–linfócitos controle;X2- linfócitos
controle incubados na presença de PGA
2
10μμM; X3- linfócitos controle incubados na presença
de PGA
2
40 μM; X4–linfócitos trnasfectados;X5- linfócitos transfectados incubados na presença
de PGA
2
10μM; X6- linfócitos transfectados incubados na presença de PGA
2
40 μM; pelo
período de 24 h. Não se observam diferenças significativas entre os grupos estudados. Gráfico
representativo de dois experimentos independentes, cada um em duplicata. (Análise por
ANOVA).
87
As células (linfócitos controle e transfectados) foram, também,
tratadas com choque térmico e incubadas com Timidina [2-
14
C], não
sendo possível identificar diferenças significativas entre os grupos (FIG
26).
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1,4000
X1 CONT
C
O
NT
X2 CONT 1 HS
X3 CON
T
2
H
S
X
4
TRAN
SF
CO
N
T
X
5 TRANSF 1HS
X6 TRANSF
2
HS
Incorporação de Timidina [2-
14
C]
(pmol/10
6
células)
Figura 26 – Incorporação de timidina [2-14C] em X1-linfócitos controle; X2-
linfócitos controle submetidos a um choque térmico de 42°C por duas horas; X3-
linfócitos controle submetidos a dois choques térmicos de 42°C por duas horas; X4-
linfócitos transfectados; X5-linfócitos transfectados submetidos a um choque térmico
de 42°C por duas horas; X6-linfócitos transfectados submetidos a dois choques
térmicos de 42°C por duas horas. Não se observam diferenças significativas entre os
grupos estudados. Gráfico representativo de dois experimentos independentes, cada
um em duplicata. (Análise por ANOVA).
88
8. Exportação de DNP-SG
A bomba MRP1/GS-x, é sabidamente, responsável pela
exportação de conjugados sulfidrila para o espaço extracelular. Com a
finalidade de determinar a atividade desta bomba, os grupos celulares
(linfócitos controle e transfectados com o gene da MRP1/GS-x), foram
incubados na presença de clorodinitrobenzeno (CDNB), e a atividade da
bomba determinada pela taxa de exportação de DNP-SG, conforme
descrito no capítulo de Métodos.
É possível observar que os linfócitos transfectados com o gene
da bomba MRP1/GS-X mostram uma curva de atividade de exportação
mais eficiente do que os linfócitos controle (FIG 27).
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0 min 15 min 30 min 45 min 60 min
TEMPO (min)
ABSOrBÂNCIA (nm)
X1 CONT+PBS
X2 CONT+CDNB
X3 TRANSF+PBS
X4 TRANSF+CDNB
Figura 27 – Exportação de DNP-SG em X1-linfócitos controle; X2-linfócitos controle
incubados com clorodinitrobenzeno (CDNB); X3-linfócitos transfectados; X4-linfócitos
transfectados incubados com CDNB. Gráfico representativo de 3 experimentos
independentes, todos preparados em duplicata.
89
9. Efeitos da PGA
2
na Viabilidade de linfócitos
controle e transfectados
Com a finalidade de avaliar o possível efeito citotóxico e
citostático das PGA
2
(LEUNG & MIHING, 1980), linfócitos controle e
transfectados com o gene da MRP1, contido no plasmídeo pRc-RSV,
foram cultivados na presença de PGA
2
nas concentrações de 0, 1, 5, 10,
e 40 μΜ.
Foram tomadas 1,75 x 10
7
células de linfócitos obtidos dos
linfonodos mesentéricos, ressuspensas em 13ml de meio RPMI1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino, mantidas por duas horas em
estufa para adesão dos macrófagos. Após este período as células
controle foram eletroporadas com um pulso de 400 V, e as células
transfectadas receberam 46 μg de plasmídeo pRc-RSV, contendo o gene
da MRP1, e posteriormente foram eletroporadas com um pulso de 400
V, 8s. Ambos os grupos foram incubados em presença de 3 μg
concanavalina A por mais de 72 h. Após este período os grupos foram
incubados na presença de PGA
2
nas concentrações de 0, 1, 5, 10, e 40
μΜ. por 30 min (Fig. 28).
90
Figura 28. Resistência dos linfócitos não transfectados, e transfecção com gene MRP1/bombaGS-
X, aos efeitos citostáticos e citotóxicos da PGA
2
. (A) células transfectadas com o gene MRP1
contido no plasmídeo pRc-RSV (B) células controle. No tempo zero (logo após a eletropulsão e
tempo de recondicionamento), ambos os grupos foram tratados com a CP-PG PGA
2
em diferentes
concentrações: 0 (z), 1 ({), 5 (), 10 (□) , 20 (▲) ou 40 (Δ) μM. As células, então, foram
colhidas nos tempos indicados para avaliação da contagem celular e viabilidade pela técnica de
exclusão por Trypan Os dados, em termos de percentual de controles, foram expressados como
± S.E.M. das três diferentes preparações, cada uma preparada em dobro. (Figura já publicada em
KOLBERG e cols., 2005)
91
DISCUSSÃO
Como apresentado na seção de introdução, prostaglandinas
ciclopentenônicas (CP-PGs) podem ser produzidas em grandes
quantidades no plasma de indivíduos com câncer nos estágios finais.
Dado que estas substâncias possuem uma potente atividade
antiproliferativa e que são captadas por todas as células do organismo,
a fisiologia dos vários sistemas começa a entrar em colapso e os
pacientes tendem a evoluir ao óbito.
Um dos maiores desequilíbrios homeostáticos verificados
nesses estágios da doença é a imunossupressão. Considerando-se que o
sistema imunológico é fundamental para que o organismo se oponha ao
crescimento do tumor, a falência do sistema imunológico propicia o
agravamento do estado de caquexia e a morte. Estudos de nosso grupo
sugerem que o acúmulo de CP-PGs em linfócitos nesses estágios possa
ser responsável, pelo menos em parte, pela grave imunossupressão que
afeta esses doentes de câncer (KOLBERG e cols., 2005; HOMEM DE
BITTENCOURT & CURI, 2001).
As CP-PGs inibem a proliferação celular em uma variedade de
modelos experimentais de tumor, tanto in vitro quanto in vivo
(SANTORO & AMICI, 1989). Elas são ativa e seletivamente
transportadas para dentro das células, por um carreador de
membrana), e, então, transferidas para o núcleo, onde se ligam a
proteínas nucleares e atuam especificamente na interface G
1
/S do ciclo
92
celular (OHNO e cols., 1988; SANTORO & AMICI, 1989). Dependendo
das concentrações empregadas, as CP-PGs podem ser extremamente
tóxicas por bloquear a síntese de proteínas e causar dano aos
filamentos de actina do citoesqueleto (IKAI & FUKUSHIMA, 1990) e por
inibirem a expressão das DNA-polimerases β e γ (OHNO e cols., 1987).
O efeito antiproliferativo das CP-PGs depende de sua captação pelas
células, um fenômeno que pode ser tão efetivo que torna difícil a
detecção destas substâncias, in vivo, poucos minutos após sua adição
ao meio de cultura (NARUMIYA & FUKUSHIMA, 1986). Além disso, a
inibição da proliferação celular mediada por CP-PGs é dependente da
presença de, pelo menos, um grupo carbonila α,β-insaturado (podendo
apresentar múltiplas insaturações conjugadas, como α,β,γ e α,βγ,δ; veja
FIG. 6) e está associada com a indução de proteínas de choque térmico
de 72 kDa (HSP70), através da ativação (sensível à cicloeximida) dos
fatores de transcrição de choque térmico (HSF, do Inglês, heat shock
factors), que passam de uma forma monomérica não-ligante de DNA,
para uma forma trimérica, transcripcionalmente ativa, que se liga a seu
sítio de controle no promotor dos genes para o choque térmico (heat
shock genes) (OHNO e cols., 1988; SANTORO & AMICI, 1989). Além do
mais, existe o fato de que as CP-PGs inibem a ativação do fator de
transcrição nuclear κB (NF-κB), por inibição direta das IκB quinases,
através da reação das CP-PGs com resíduos cisteína destas quinases, os
quais são necessários para a ativação e atividade ligante do DNA do
NF-κB (ROSSI e cols., 2000); este efeito é, também, associado com a
ativação dos HSF (SANTORO, 2000; ROSSI & SANTORO, 1997). Uma
vez que, a ativação de NF-κB dispara a transcrição de inúmeros genes
envolvidos com a resposta imunológica, proliferação e diferenciação
celular, o bloqueio da ativação do NF-κB mediado pelas CP-PGs pode ter
papel significativo na inibição do crescimento celular e na
imunossupressão no câncer.
93
O efeito antiproliferativo das CP-PGs é tal que estas foram
propostas como potenciais agentes para tratamento alternativo no
câncer. A falta de especificidade e efeito inibitório sobre células
imunológicas, contudo, excluíram sua utilização.
Vários achados experimentais sugerem a ocorrência de
superprodução de PGs no plasma de indivíduos com câncer (WILLIAMS
& SIDDIQUI, 1987) e que essas possam transformar-se em CP-PGs
(HOMEM DE BITTENCOURT & CURI, 2001). Por outro lado, linfonodos de
animais portadores do tumor de Walker 256 acumulam grandes
quantidades de CP-PGs enquanto que o próprio tecido tumoral não
(HOMEM DE BITTENCOURT & CURI, 2001). Uma possível explicação
para este acúmulo de CP-PGs observado em células imunológicas seria
a baixa atividade da MRP1/bomba GS-X em comparação com aquela
encontrada em células tumorais. Estudos de nosso grupo de pesquisa
mostraram que várias linhagens de células tumorais (humanas e de
outras espécies de mamíferos) realmente apresentam altas atividades
da MRP/bomba GS-X, enquanto que linfócitos de rato e outras células
hematopoéticas da linhagem branca apresentam apenas uma atividade
irrisória desta ATPase (HOMEM DE BITTENCOURT e cols., 1998a,b).
Entretanto, apenas recentemente, ficou demonstrado que a enorme
diferença entre a alta resistência de células tumorais e a grande
sensibilidade de linfócitos ao tratamento com CP-PGs estavam
realmente associados a diferentes níveis de expressão da bomba
MRP1/GS-X (KOLBERG e cols., 2005). Por isso conduzimos vários
experimentos com linfócitos para testar sua sensibilidade ao tratamento
com CP-PGs. Entretanto, havia ainda um impedimento técnico. Para o
estudo dos efeitos de CP-PGs e outros agentes estressantes sobre a
fisiologia de linfócitos em termos da capacidade de exportação de
GS-conjugados através da bomba GS-X, eram necessários estudos com
linfócitos transfectados com o gene codificando para a bomba
GS-X/MRP1.
94
Por outro lado, um fator crítico na transfecção de células
eucarióticas é a escolha do procedimento de transfecção celular. O
procedimento deve apresentar eficiência e não deixar resíduos, já que
as células devem ser preparadas e posteriormente submetidas à
presença de substâncias oxidantes e redutoras, com a finalidade de
determinar a resposta de manutenção do estado redox celular.
Nosso estudo mostrou que 400 V de diferença de potencial
real (não a nominal aplicada no aparelho) representava o máximo de
voltagem a ser aplicado sem comprometimento da viabilidade celular
(Fig. 7). Além da voltagem, o número de pulsos também foi testado.
Os resultados obtidos demonstraram que a melhor viabilidade é obtida
quando aplicamos apenas um pulso elétrico com voltagem de 400V
(voltagem real). Podemos observar que quando aplicamos dois pulsos o
percentual de células viáveis tende a aumentar, porém não ultrapassa
40%. Quando foram aplicados três pulsos a viabilidade diminui
aproximando-se de zero (Fig.8). Assim, pela primeira vez, foi possível
efetuar estudos com linfócitos transfectados por eletroporação, uma
técnica que, apesar de limpa, apresenta maior mortalidade celular que
outras técnicas clássicas, como lipofecção, transfecção viral e cloreto de
cálcio. Os resultados apresentados nesse trabalho bem como outros que
já publicamos (KOLBERG e cols., 2005) permitiram, então, que
pudéssemos avançar com os estudos sobre os efeitos de CP-PGs e
outros agentes estressantes, como estresse oxidativo e térmico, sobre a
funcionalidade de linfócitos.
A eletrofilicidade de CP-PGs, como PGA
2
é bem conhecida,
conforme já avaliado na seção de Introdução. Assim, a presença destas
prostaglandinas pode causar dano celular, pois além de conjugar-se
com a glutationa depletando-a e, consequentemente, diminuir a
resposta ao estresse oxidativo celular, esta substância é também
antiproliferativa, agindo na fase G1 para S do ciclo celular, impedindo a
95
divisão. Quando ocorre a presença de PGA
2
intracelularmente, vários
fatores de resposta ao estresse são ativados, entre estes a produção de
proteínas de choque térmico (HS).
A expressão de HSP70 foi analisada em linfócitos controle e
transfectados, na presença de PGA
2
nas concentrações de 10 μM e
40 μM, seis horas e vinte e quatro horas após a incubação. Após este
período as células controle foram eletropulsadas com um pulso de 400
V, e as células transfectadas receberam 44,5 μg de plasmídeo pRc-RSV,
contendo o gene da MRP1 humana (seqüência completa), e
posteriormente foram eletropulsadas com um pulso de 400 V. Ambos os
grupos foram incubados em presença de concanavalina A por 24 h.
Após este período os grupos foram incubados na presença de PGA
2,
nas
concentrações de 10 μM e 40 μM (conforme descrito no capítulo de
métodos), por 6 e 24 horas.
Nas incubações com 6 horas, as células não transfectadas,
incubadas com PGA
2
10μM, quando comparadas com seu respectivo
controle, tiveram um aumento esperado na expressão de HSP70 (em
torno de 11%). Já com 40 μM, houve queda da expressão (em torno de
40%), o que pode ser atribuido a morte celular, já que esta
concentração é extremamente tóxica para linfócitos (HOMEM DE
BITTENCOURT e cols, 1998b,c). Por outro lado, as células
transfectadas, incubadas com PGA
2
10μM, quando comparadas com seu
respectivo controle apresentam uma ligeira queda da expressão de
HSP70 enquanto que incubadas com 40 μM apresentaram um aumento
da expressão de HSP70 da ordem de 25% (FIG. 10). Nas incubações
por 24 h, as células não transfectadas quando comparadas com seu
próprio controle não apresentaram diferenças significativas. Já as
células transfectadas e incubadas com 10 μM de PGA
2
apresentaram
uma queda na expressão de HSP70 na ordem de 70%, situação que se
inverte com as células transfectadas na presença de PGA
2
40 μM que
96
apresentam uma expressão 48% maior de HSP70, quando comparada
com seu próprio controle (FIG 11). Apesar de alguma discreta mas
não-significativa diferença entre os grupos, de maneira geral, os dados
sugerem que a transfecção com o gene da bomba MRP1/GS-X não
tenha tido um efeito acentuado sobre a expressão de HSP70. Isto não
significa dizer que as células não estejam protegidas contra o
tratamento com PGA
2
(ver a seguir). Significa apenas que, quando
tratadas com PGA
2
, a capacidade de resposta celular em termos de
expressão de HSP70 parece ser a mesma nos dois grupos.
Espécies ativas do oxigênio (por exemplo superóxido) são
produzidas pelo oxigênio molecular em vários processos biológicos.
Dentre estes a reação da enzima Xantina oxidase quando cataliza a
oxidação da Xantina a ácido úrico. O aumento de espécies ativas do
oxigênio, intracelularmente, leva ao desbalanço do estado de
oxidação/redução, conhecido como estresse celular.
Com a finalidade de avaliar a expressão de proteínas de
choque térmico HSP70 em células transfectadas e não tranfectadas com
o gene da MRP1, contido no plasmídeo pRc-RSV, as mesmas foram
incubadas na presença de xantina/xantina oxidase e superóxido
dismutase. Quando comparadas com seus respectivos controles, as
células não transfectadas apresentaram uma queda de 70% na
expressão de HSP70 quando incubadas com xantina e xantina oxidase.
Quando se adicionou superóxido dismutase (SOD), enzima de redução
do superóxido, o comportamento permaneceu semelhante. As células
transfectadas e incubadas com xantina/xantina oxidase, mostram uma
expressão de HSP70 quatro vezes menor, quando comparadas ao seu
controle. Situação totalmente revertida pela adição de SOD (FIG 12). A
expressão de HSP70 foi avaliada também nas células transfectas e não
transfectadas, incubadas na presença de xantina/xatina oxidase, porém
com a adição do agente redutor beta mercaptoetanol (βME). Neste
97
caso, não houve diferença significativa na expresão de HSP70, entre os
grupos das células não transfectadas (FIG 13). Esses resultados
sugerem que o estresse causado pela adição de agentes geradores de
ânions superóxido é menor em células transfectadas mas que o
tratamento com β-ME não atenua esses efeitos em nenhum dos grupos
(só a adição de SOD foi capaz de minimizar o estresse provocado pelo
par xantina/xantina oxidase). Note-se que a resposta ao tratamento
com substâncias que geram estresse oxidativo em linfócitos é bem
diferente daquela induzida pelo tratamento com PGA
2
. A resposta à
PGA
2
é muito mais acentuada, embora o estresse oxidativo gerado pela
adição do par xantina/xantina oxidase seja muito maior, o que sugere
que a PGA
2
ative outros mecanismos de estresse celular.
A expressão da MRP/bomba GS-X pode ser um importante
agente de modulação da atividade biológica das CP-PGs, através da
exportação das mesmas para o espaço extracelular. O papel fisiológico
destas proteínas pode variar de uma função protetora contra a
toxicidade química e estresse oxidativo (COLE & DEELEY, 1998) à
regulação do estado redox e de ativação celular (HOMEM de
BITTENCOURT e cols., 1998 a, b) bem como à supressão do
crescimento celular no câncer (ISHIKAWA e cols., 1998).
Quando comparadas com seus controles, linfócitos
transfectados mostraram uma discreta queda progressiva da expressão
de MRP, para os grupos incubados por 6 h com a PGA
2
nas
concentrações de 10 μM e 40 μM (FIG 14). Nas incubações de 24 h, as
células transfectadas e incubadas com PGA
2
na concentração de 40 μM,
apresentaram uma expressão de MRP1 49% maior quando comparadas
com seu controle (FIG 15). Esses achados sugerem que, ao contrário
do que se observou para a expressão da HSP70, a expressão da bomba
MRP1/GS-X parece estar afetada pelo tratamento com PGA
2
. Isto é, o
estresse celular causado pela adição de PGA
2
pode estar modulando a
98
expressão dessa proteína que regula o estado redox celular. Por outro
lado, quando os linfócitos foram desafiados com o grupo
xantina/xantina oxidase, é possível observar que, embora não
significativo, ocorre aumento na expressão da MRP1/GS-X, que se
mantém quando é adicionada a SOD, enquanto que nos linfócitos ocorre
um aumento significativo (p,0,05) na expressão da bomba, quando os
mesmos são desafiados com o grupo xantina/xantina oxidase, efeito
que se inverte ligeiramente quando a SOD é adicionada.
É possível observar ainda que os linfócitos transfectados com o
gene da bomba MRP1/GS-X mostram uma curva de atividade de
exportação de GS-conjugados mais eficiente do que os linfócitos
controle (FIG 27).
Ao longo da evolução os seres vivos tiveram que desenvolver
um mecanismo capaz de enfrentar as situações de estresse oxidativo,
desenvolvendo um sistema de defesa que permitisse recuperar o
balanço redução/oxidação, ou balanço redox celular (HAMMOND e cols.
1982, MONKS e cols., 1990). Várias são as substâncias que participam
ativamente deste sistema de defesa, por exemplo: a enzima
superoxidodismutase (SOD) - responsável pela destruição do radical
superóxido formando peróxido de hidrogênio; a catalase - enzima
responsável pela redução do peróxido de hidrogênio à água; a
glutationa peroxidase – enzima responsável pela conversão de peróxido
de hidrogênio à água, converter dissulfetos; vitaminas (E e C) e outras .
Dentre as defesas contra o estresse oxidativo, uma das mais
importantes é a glutationa (GSH).
A glutationa é um tripeptídeo composto por um glutamato,
uma glicina e uma cisteína. Está presente em todas as células dos
mamíferos, e se apresenta em altas concentrações (milimolares) nos
tecidos do rim, fígado, cérebro, músculo esquelético e eritrócitos. A
glutationa é um potente destoxificante, que permite ao organismo
99
livrar-se de radicais livres, toxinas e poluentes, formando compostos
solúveis (através da ligação com o grupo sulfidrila existente na cisteína)
que podem ser excretados (JAESCHKE, 1990).
A conjugação intracelular de PGAs com moléculas de GSH e
sua exportação pela bomba GS-X na forma de GS-conjugados pode ser
uma estratégia celular importante na manutenção da homeostase. O
primeiro passo na inativação de muitas substâncias endógenas e
exógenas dá-se pela conjugação com moléculas de GSH (MEISTER,
1983; MEISTER, 1985a; MEISTER, 1985b; HONN & MARNETT, 1985;
GOUIN e cols., 1986) e o papel desse processo pode ser inferido pela
importância das GST na destoxificação contra substâncias eletrofílicas
(PHILLIPS & MANTLE; 1993; GOTOH e cols., 1993; WANG & LEE, 1993;
HALES & HUANG, 1994; ZHANG & DAS, 1994). No caso da PGA
1
, que
reage avidamente com proteínas contendo grupos sulfidrila (HAM e
cols., 1975), a conjugação com moléculas de GSH é fundamental,
porque abole todo seu caráter eletrofílico e, portanto, seus efeitos
deletérios sobre a células. O segundo passo no processo de eliminação
de substâncias como as CP-PGs seria, então, a exportação destas na
forma de GS-conjugados, como sugerido anteriormente (ISHIKAWA,
1992). Esta etapa é capital no processo de defesa celular contra
eletrófilos porque desloca o equilíbrio da reação catalisada pelas GST
para a direita, no sentido da eliminação de mais moléculas do eletrófilo.
Com a finalidade de determinar a resposta ao estresse
oxidativo produzido pela reação xantina/xantina oxidase (aumento da
produção de superóxido) em linfócitos controle e transfectados com o
gene da MRP1 contido no plasmídeo pRc-RSV, foram determinadas as
concentrações de glutationa reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSG)
e a relação entre estas. Os resultados mostraram que as células não
transfectadas e incubadas na presença de xantina/xantina oxidase
(X/XO), apresentaram concentração de GSH 78% menor, p<0,05,
100
quando comparadas com seus controles. Nos controles tratados com
X/XO houve um aumento esperado quando da adição de SOD (que
dismuta os ânions superóxidos formados). Ao contrário, as células
transfectadas e incubadas na presença de X/XO, apresentaram um
aumento de 91%, p<0,05 (por ANOVA), na concentração de GSH,
quando comparadas com seu controle. Quando comparamos os dois
grupos celulares incubados na presença de X/XO, transfectados e não
transfectados, podemos observar que as células transfectadas
apresentaram uma concentração de GSH quase 13 vezes maior que as
células não tranfectadas, p<0,05, (FIG 17). Estes resultados sugerem
que, apesar de não existir diferença significativa para a expressão de
HSP70 (um marcador de estresse celular) as células transfectadas têm
uma capacidade de regeneração de GSH muito maior que suas
contrapartes não transfectadas. Essa noção é reforçada pelo fato de que
as concentrações de GSSG (forma oxidada da GSH) não se alteram
entre os grupos. Logo, é de se esperar que a diferença entre eles seja
devida a uma capacidade de regeneração maior de GSH, já que,
sabidamente o tratamento com X/XO gasta GSH oxidando-a.
Entretanto, como o tratamento com o par gerador de superóxido
também aumenta as concentrações de GSSG, o fato de as
concentrações de GSSG terem se mantido constantes sugere também
que este dissulfeto possa ter sido eliminado das células pela bomba
MRP1/GS-X. O estresse oxidativo (avaliado pela relação [GSSG]/[GSH])
foi muito menor nas células transfectadas que nas células controle não-
transfectadas, sugerindo que a superexpressão da bomba MRP1/GS-X
tenha um importante papel na manutenção do estado redox celular.
Um dos efeitos diretos das CP-PGs é a depleção dos
estoques intracelulares de GSH. Por outro lado, a redução nas
concentrações de GSH cria um ambiente "oxidativo" e interfere numa
série de processos celulares, como o favorecimento da síntese de certas
PGs e LTs (HUWYLER e cols., 1990; HEMPEL & WESSELS, 1994),
101
ativação de proteínas sensíveis ao estado redox, como as p56
lck
e
p59
fyn
, que são tirosina-quinases da família src (DRÖGE e cols., 1994),
ativação de fatores transcripcionais responsivos a substâncias
eletrofílicas, como HSFs (CHEN e cols., 1995) ou NFκB (DRÖGE e cols.,
1994; TOYOKUNI e cols., 1995) e iniciação da transcrição dos
oncogenes fos e jun (BERGELSON e cols., 1994). Somados, os efeitos
da depleção nos estoques de GSH influenciam na modulação da
resposta imunológica (GMÜNDER e cols., 1990; DRÖGE e cols., 1994) e
no desenvolvimento de certos tipos de cânceres humanos (SILBER e
cols., 1992; SCHWARTZ e cols., 1993; TOYOKUNI e cols., 1995). Na
verdade, a maioria das células tumorais já caracterizadas apresenta alta
taxa de geração de espécies ativas de oxigênio e/ou intenso estresse
oxidativo, que foi definido por TOYOKUNI e cols. (1995) como "estresse
oxidativo persistente". Este, por sua vez, como mencionado acima,
favorece a ativação de fatores de transcrição e proto-oncogenes, além
de estar relacionado com a instabilidade genômica, resistência múltipla
a agentes quimioterápicos, invasividade e metástase (TOYOKUNI e
cols., 1995). A razão pela qual se estabelece este estresse não é
conhecida atualmente. Entretanto, não se pode descartar a
possibilidade de que a alta atividade da COX presente nos tumores
possa ser um fator gerador desse estado, já que a síntese de PGs é
acompanhada de geração de hidroperóxidos, necessários para a
ativação da própria enzima (CAMPBELL, 1990; VANE, 1994).
Para verificar a resposta proliferativa, um indicativo da função
imunológica, apresentada pelos linfócitos em estudo, transfectados e
não-transfectados, incubados na presença de PGA
2
nas concentrações
de 10 μM e 40 μM ou submetidas a choque térmico de 42ºC, as células
foram incubadas na presença de Timidina [2-
14
C], com a finalidade de
medir a captação pelas células e incorporação da mesma em DNA. A
capacidade de captação de Timidina [2-
14
C], pelos grupos celulares
102
estudados foi avaliada para excluir a possbilidade de que alterações na
captação (que é mediada por transportadores específicos para
nucleotídeos) pudessem refletir-se nos resultados de incorporação
obtidos.
As células não-trasfectadas, quando tratadas com PGA
2
10 μM,
por 6 horas, apresentam tendência para aumentar a captação quando
comparadas ao controle. No entanto, as diferenças de captação
apresentadas pelos grupos de células transfectadas e não transfectadas,
entre si, ou entre grupos, não foram significativas (FIG 21). Resultado
semelhante foi obtido nos grupos tratados por 24 horas (FIG 22), ou
mesmo para os grupos tratados com choque térmico (FIG 23).
Posteriormente foi avaliada a capacidade de incorporação de Timidina
[2-
14
C], no DNA das células tratadas (linfócitos controle e
transfectados). Não se observam diferenças significativas entre os
grupos controle e transfectados, na presença de prostaglandina A
2
,
após 6 horas de incubação (FIG 24). Resultado semelhante para
incubação durante 24 horas (FIG 25). As células (linfócitos controle e
transfectados) foram, também, tratadas com choque térmico e
incubadas com Timidina [2-
14
C], não sendo possível identificar
diferenças significativas entre os grupos (FIG 26).
Conforme discutido acima, a presença da bomba MRP1/GS-X
parece conferir resistência ao choque oxidativo. Assim, resolvemos
testar a capacidade proliferativa de linfócitos transfectados com o gene
da bomba MRP1/GS-X humana quando as células foram desafiadas com
diferentes concentrações de PGA
2
. Os experimentos foram conduzidos
por até 3 dias. A Fig. 28 mostra os resultados obtidos. Apesar de os
testes com incorporação de timidina marcada em DNA terem sido
inconclusivos para 24 h de cultivo (Fig. 25), o que se reflete nas
contagens celulares 1 dia após o tratamento com a PGA
2
(Fig. 28A e
B), ao longo dos períodos de cultivo celular linfócitos transfectados
103
mostraram-se muito mais aptos a se proliferarem quando estimulados
pela Con A. Na verdade, enquanto a viabilidade e a contagem celulares
diminuíram significativamente nas células não-transfectadas tratadas
com PGA
2
(ação citostática e citotóxica combinadas), as células
superexpressando a bomba GS-X chegaram mesmo a apresentar um
aumento na capacidade proliferativa entre 48 e 72 h de cultura (Fig.
28 B).
CP-PGs sendo produzidas intracelularmente podem regular,
assim, uma série de processos vitais. De fato, como abordado
anteriormente, as possibilidades de um papel funcional para as CP-PGs
produzidas intracelularmente são muitas. Mas, mesmo que estes
eicosanóides sejam produzidos apenas extracelularmente, pela
interconversão a partir de PGs parentais, seu efeito sobre a
funcionalidade celular é potentíssimo depois de serem captados pelas
células. Logo, a exportação de CP-PGs conjugadas a moléculas de GSH
através da ATPase MRP1/bomba GS-X fornece a base para a regulação
das concentrações intracelulares de CP-PGs, modulando, portanto, o
nível de supressão promovido por estes possíveis sinalizadores
negativos.
O entendimento da regulação da expressão dos genes que
codificam para a MRP/bomba GS-X, será, portanto, um passo
importante na elucidação de novos padrões de MDR e controle de
proliferação celular já que poderá proporcionar informação significativa
acerca de estratégias a serem empregadas na prática quimioterápica no
câncer.
Paralelamente à manipulação da MRP/bomba GS-X em células
tumorais, contudo, este laboratório propõe o uso de linfócitos
transfectados com a MRP/bomba GS-X do sangue de pacientes com
câncer com a finalidade de transfusão autóloga [(KOLBERG e cols.,
2005 e HOMEM DE BITTENCOURT & CURI, 2001 para proposta de
104
terapia com linfócitos transfectados com a MRP/bomba GS-X (MTL)].
Esta possibilidade está, atualmente, sob investigação em nosso grupo
de pesquisa através do uso da transfecção do gene MRP1 em linfócitos
de ratos portadores do tumor de Walker 256 (KOLBERG e cols., 2005).
No entanto, a quantidade de linfócitos que pode ser obtida através
deste processo pode significar apenas uma pequena parcela do volume
total de linfócitos existentes no organismo. Além disso, o sucesso da
transfecção do gene MRP nestas células pode ocorrer somente em uma
minoria dos linfócitos coletados. Então sugerimos um método
alternativo de transfecção de linfócitos, o qual está baseado na
abordagem de um adeno-retrovírus quimérico (REYNOLDS e cols.,
1999). Esta técnica é utilizada para melhorar a incorporação de genes
heterólogos em genomas hospedeiros de forma estável (integração
gênica) de maneira a prolongar a expressão do gene.
Tomados como um todo os resultados apresentados neste
trabalho sugerem que a imunossupressão observada em portadores de
câncer em fase final possa estar relacionada ao acúmulo de CP-PGs em
linfócitos destes indivíduos. Através da eliminação de CP-PGs, que são
extremamente citotóxicas e citostáticas quando em altas concentrações
em linfócitos, por intermédio da MRP/bomba GS-X, espera-se que uma
nova abordagem clínica possa tornar-se acessível, na qual as armas
biológicas contra as células cancerosas serão o retorno da própria
função imunológica a sua normalidade.
Em resumo, a transfecção de linfócitos com o gene da bomba
MRP1/GS-X por eletroporação mostrou-se perfeitamente viável e sugere
que a expressão desta proteína possa conferir resistência ao tratamento
com substâncias eletrofílicas de maneira a ajustar o estado redox
celular mais rapidamente, o que impede o efeito citotóxico destas
substâncias. Os detalhes sobre o mecanismo pelo qual CP-PGs
interferem na expressão fisiológica desta proteína estão sendo
estudados atualmente em nosso laboratório.
105
Finalmente, o sucesso das técnicas transfecção e de avaliação
das mesmas testadas neste trabalho, garantem que possamos,
imediatamente, começar os estudos de autotransfusão de amostras
contendo linfócitos superexpressando a bomba GS-X/MRP, pelo menos
em ratos. Somados aos resultados do estresse oxidativo, metabolismo
da glutationa e expressão de proteínas de choque térmico, esses
resultados permitem que se possa estabelecer o nível de necessidade
de transfusão autóloga em animais experimentais e, possivelmente em
humanos no futuro, de linfócitos transfectados com os genes
codificando para as bombas GS-X a partir da “leitura” dos parâmetros
aqui estudados.
106
CONCLUSÃO
O oxigênio molecular é responsável pela rápida produção
de espécies ativas (radicais livres), mesmo durante processos
fisiológicos, podendo causar alterações no balanço redox, levando
ao estresse celular. Para enfrentar o desafio da presença destes e
outros radicais livres, desenvolveu-se, ao longo da evolução, um
sistema de defesa. A glutationa (GSH) é uma das substâncias
diretamente envolvida na recuperação do balanço redox celular,
facilitando a conversão das oxidações.
Resultados anteriores de nosso grupo de trabalho
sugerem que a imunossupressão e caquexia presentes nos
estágios avançados de câncer, possam estar relacionadas com a
atividade e expressão da MRP1/bomba GS-X, a qual tem papel
importante na exportação de metabólitos de medicamentos,
dissulfetos e prostaglandinas ciclopentenônicas, causando
acúmulo das mesmas em células do sistema imune (linfócitos) as
quais apresentam menor expressão da bomba (KOLBERG e cols,
2005). Esses achados corroboram resultados existentes na
literatura que sugerem um estado de estresse persistente no
câncer, relacionado a massiva presença de radicais livres e a
coincidente baixa expressão de enzimas antioxidantes, em células
tumorais agressivas, de rápida proliferação e metastáticas,
portanto, de alta malignidade (TOYOKUNI, e cols,1985).
107
Os resultados dos experimentos realizados para
identificar qual o envolvimento da MRP1 na resposta ao estresse
celular, e qual a interferência do estresse celular na expressão e
atividade da MRP1 permitiram concluir que:
1. Linfócitos, obtidos de linfonodos mesentéricos de rato,
podem ser transfectados com o gene MRP1, por eletroporação, e
serem, posteriormente cultivados por, pelo menos 72 horas, sob
diferentes condições de estresse celular;
2. Os dados obtidos sugerem que linfócitos transfectados
com o gene da MRP-1, que a expressão da MRP-bomba-GSx possa
estar aumentada quando os mesmos são submetidos ao estresse
celular, e, também, que a atividade da MRP-bomba GS-x possa
estar aumentada, porém dados mais significativos deverão ser
futuramente investigados.
3. Nossos resultados sugerem que a expressão de
proteínas de choque térmico HSPs, em linfócitos mesentéricos de
rato, transfectados com o gene da MRP-1 contido no plasmídio
pRc/RSV, está intimamente ligada à resposta ao estresse celular,
confirmando dados já existentes na literatura parta outros tipos
celulares.
4. Linfócitos transfectados com o gene da MRP-1,
contido no vetor pRc/RSV demonstraram ser mais resistentes aos
efeitos citotóxicos e citostáticos ao tratamento com
prostaglandinas PGA
2
, confirmando dados anteriores de nosso
laboratório (KOBERG e cols, 2005), o que sugere uma possível
razão para sua eficiência em ao enfrentar situações de estresse
celular.
108
5. Em conjunto nossos dados sugerem que linfócitos
transfectados com o gene da MRP-1 demonstram melhor
competência em enfrentar situações de estresse celular.
109
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