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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Departamento de Fisiologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA EM RATAS SUBMETIDAS AO
CLAMPEAMENTO DA ARTÉRIA RENAL ESQUERDA
MODELO 2 RINS/ 1 CLIPE
Dissertação de Mestrado
Rosane Aparecida Ribeiro
PORTO ALEGRE – RS
2006
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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Departamento de Fisiologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA EM RATAS SUBMETIDAS AO
CLAMPEAMENTO DA ARTÉRIA RENAL ESQUERDA
MODELO 2 RINS/ 1 CLIPE
Rosane Aparecida Ribeiro
ORIENTADOR: Prof. Dr. Gilberto Luiz Sanvitto
Dissertação apresentada ao
curso de Pós-graduação em
Ciências biológicas: Fisiologia,
ICBS da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, como
requisito parcial para obtenção
do título de mestre em Fisiologia.
PORTO ALEGRE – RS
2006
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II
Aos meus pais.
III
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por sempre me indicar a direção melhor que devo
seguir, a Ele os meus mais nobres e sinceros agradecimentos.
Aos meus pais, que mesmo distante sempre estiveram presentes me incentivando
nas dificuldades ou nos momentos em que pensei em desistir.
Ao professor Dr. Gilberto Luiz Sanvitto, pela orientação, incentivo e
compreensão.
Ao professor Dr. Aldo Bolten Lucion, pelo auxílio e contribuições durante o
desenvolvimento deste trabalho.
À Cármen Gomes, Charlis Raineki e Márcia Breigeiron pelo auxílio teórico e
prático.
À Tatiane S. Cagol Camozzato, Ana Raquel Karkow, Caroline P. Veiga,
Rosana Frey por estarem presentes nas horas difíceis, me incentivando a continuar.
À Elisa C. Winkelmann-Duarte e Adriano B. Duarte por me receberem em sua
casa, pela convivência harmoniosa, e pelo apoio durante o mestrado.
Ao aluno de iniciação científica Osni Gonçalves, pela eficiência com que
colaborou com o desenvolvimento deste trabalho.
Aos colegas de laboratório: Camila Padilha, Fabiana de Sousa, Natália Uriarte,
Gabriela Severino, Ana Lúcia Cecconello que contribuíram com coleguismo nas mais
diversas situações.
À bioterista Ângela, pelos cuidados com os animais.
IV
Ao Laboratório de Fisiologia Cardiovascular por permitir o uso do aparelho para
verificação da pressão arterial.
Ao professor Dr. Celso R. Franci e à Sônia A. Zanon e Anelise Todeschini,
pelas dosagens hormonais, de importância para a complementação dos resultados
obtidos neste estudo.
Às professoras Sara C. Sagae, Sandra Lucinei Balbo, Maria Lúcia Bonfleur,
por acreditarem em mim, me direcionarem à pós-graduação e pelos conselhos
importantes nos momentos difíceis.
Aos professores membros da banca examinadora Profª. Drª. Ilma S. Brum, Profª.
Drª. Maria Cláudia Irigoyen e Prof. Dr. Celso Rodrigues Franci pela atenção e
sugestões.
Ao CNPq, órgão que contribuiu com apoio financeiro.
À instituição: UFRGS, pela oportunidade de crescimento intelectual, profissional e
também pessoal.
V
SUMÁRIO
LISTAS DE FIGURAS _______________________________________________ IX
LISTA DE ABREVIATURAS_________________________________________XIII
RESUMO _________________________________________________________XIV
INTRODUÇÃO ______________________________________________________ 1
1.
HIPERTENSÃO___________________________________________________ 2
2.
A
NGIOTENSINA
____________________________________________________ 3
2.1 Angiotensina II e pressão arterial___________________________________ 4
2.2 Modelo de Hipertensão Renovascular _______________________________ 6
3.
FISIOLOGIA
REPRODUTIVA_______________________________________ 7
3.1 O Ciclo Estral da Rata ___________________________________________ 8
3.2 Comportamento Sexual da rata____________________________________ 12
3.3 Angiotensina e Função Reprodutiva________________________________ 15
JUSTIFICATIVA____________________________________________________ 18
OBJETIVO _________________________________________________________ 20
EXPERIMENTO
I __________________________________________________ 21
1. Objetivos específicos ____________________________________________ 21
E
XPERIMENTO
II ____________________________________________________ 21
2. Objetivos específicos ____________________________________________ 21
VI
MATERIAIS E MÉTODOS ___________________________________________ 22
1.
ANIMAIS_______________________________________________________ 23
2.
GRUPOS
EXPERIMENTAIS _______________________________________ 23
3.
PROCEDIMENTOS
CIRÚRGICOS __________________________________ 24
3.1 Hipertensão Renovascular - modelo de Goldblatt tipo I: 2 Rins/1 Clipe (2R/1C)
_______________________________________________________________ 24
4.
REGISTRO
DA
PRESSÃO
ARTERIAL
E
FREQÜÊNCIA
CARDÍACA______ 25
4.1 Pletismografia Caudal___________________________________________ 25
EXPERIMENTO I___________________________________________________ 26
1.
ANÁLISE
DO
CICLO
ESTRAL _____________________________________ 26
2.
COMPORTAMENTO
SEXUAL _____________________________________ 29
2.1 Seleção de ratos machos sexualmente ativos _________________________ 29
2.2 Seleção de fêmeas em Proestro e Registro Comportamental _____________ 30
3.
CONTAGEM
DO
NÚMERO
DE
ÓVULOS ____________________________ 31
4.
ANÁLISE
ESTATÍSTICA__________________________________________ 32
EXPERIMENTO II __________________________________________________ 32
1.
CANULAÇÃO
DA
VEIA
JUGULAR _________________________________ 33
2.
D
OSAGEM
H
ORMONAL
_____________________________________________ 33
3.
PESO
DOS
OVÁRIOS
E
CONTAGEM
DO
NÚMERO
DE
ÓVULOS ________ 34
4.
ANÁLISE
ESTATÍSTICA__________________________________________ 34
RESULTADOS______________________________________________________ 36
VII
1.
CIRURGIA
E
CLAMPEAMENTO
RENAL ____________________________ 37
1.1 Peso Corporal _________________________________________________ 37
1.2 Pressão Arterial Sistólica e Frequência Cardíaca ______________________ 37
1.3 Peso Renal ___________________________________________________ 37
1.4 Índice Renal __________________________________________________ 38
EXPERIMENTO I___________________________________________________ 38
1.
CICLO
ESTRAL _________________________________________________ 38
2.
COMPORTAMENTO
SEXUAL _____________________________________ 39
2.1 Freqüência de Lordoses _________________________________________ 39
2.2 Freqüência de Montas___________________________________________ 39
2.3 Quociente de lordose (número de lordose/número de montas)____________ 39
2.4 Freqüência e Duração da Locomoção_______________________________ 39
3.
CONTAGEM
DO
NÚMERO
DE
ÓVULOS ____________________________ 40
EXPERIMENTO II __________________________________________________ 40
1.
PERFIL
HORMONAL_____________________________________________ 40
1.1Estradiol______________________________________________________ 40
1.2 LH__________________________________________________________ 41
1.3 FSH_________________________________________________________ 41
2.
PESO
DOS
OVÁRIOS
E
CONTAGEM
DO
NÚMERO
DE
ÓVULOS ________ 42
DISCUSSÃO________________________________________________________ 60
1.
H
IPERTENSÃO RENOVASCULAR
_______________________________________ 61
VIII
2.
C
ICLO
E
STRAL
____________________________________________________ 63
3.
C
OMPORTAMENTO
S
EXUAL
__________________________________________ 66
4.
O
VULAÇÃO
______________________________________________________ 70
CONCLUSÕES _____________________________________________________ 75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ___________________________________ 78
IX
LISTAS DE FIGURAS
Figura 01: Variações hormonais nas diferentes fases do ciclo estral da rata (SMITH;
FREEMAN; NEILL, 1975) .............................................................................................11
Figura 02: Coleta do esfregaço vaginal para análise do ciclo estral ..............................27
Figura 03: Células coletadas por meio de esfregaço vaginal nas diferentes fases do ciclo
estral da rata .................................................................................................................... 28
Figura 04: Peso corporal de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H. As barras indicam a
média±EPM. p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls)........................43
Figura 05: (A) Pressão Arterial Sistólica (mmHg); e (B) Freqüência Cardíaca (bm
-1
), de
ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H. As barras indicam a média±EPM. Letras diferentes
indicam diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-
Keuls)...............................................................................................................................44
Figura 06: (A) Peso renal direito; e (B) Peso renal esquerdo, de ratas FICT, 2R/1C,
2R/1C-H. As barras indicam a média±EPM. Letras diferentes indicam diferenças
significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).......................45
X
Figura 07: (A) Índice renal direito; e (B) Índice renal esquerdo, de ratas FICT, 2R/1C,
2R/1C-H. As barras indicam a média±EPM. Letras diferentes indicam diferenças
significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).......................46
Figura 08: (A) Tempo em dias (média±EPM) para o retorno a mudanças nas fases do
ciclo estral, após cirurgia, em ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H; e (B) Percentual de ratas
FICT, 2R/1C, 2R/1C-H que retornaram ao ciclo estral regular após 15 dias da
intervenção cirúrgica. Letras diferentes se referem à diferenças significativas, p<0,05
(ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls) .........................................................47
Figura 09: (A) Número de lordoses em 15 minutos (média±EPM), apresentado por ratas
FICT, 2R/1C e 2R/1C-H, em proestro, quando testadas com machos sexualmente ativos.
(B) Número de montas do macho em 15 minutos (média±EPM) quando testados com
fêmeas FICT, 2R/1C e 2R/1C-H, em proestro. As barras indicam a média±EPM. Letras
diferentes indicam diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de
Newman-Keuls)................................................................................................................48
Figura 10: Quociente de lordose (média±EPM) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, em
proestro, quando testadas com machos sexualmente ativos. Letras diferentes indicam
diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).....49
XI
Figura 11: (A) Média ± EPM da freqüência de locomoção; e (B) Média ± EPM do
percentual da duração de locomoção durante 15 minutos, apresentado por ratas FICT,
2R/1C, 2R/1C-H, em proestro, durante o registro do comportamento sexual (ANOVA de
uma via seguida de Newman-Keuls)................................................................................50
Figura 12: Número de óvulos (média±EPM) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, na fase
estro. Letras diferentes se referem a diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma
via seguida de Newman-Keuls)........................................................................................51
Figura 13: Concentração plasmática de estradiol (pg/mL) na tarde do proestro (das
13:00 às 20:00h) em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. p<0,05 (ANOVA de duas vias de
medidas repetidas, seguida de Newman-Keuls)...............................................................52
Figura 14: Média ± EPM da área abaixo da curva das concentrações plasmáticas de
estradiol durante a tarde do proestro (das 13:00 às 20:00h) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-
H. p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).........................................53
Figura 15: Concentração plasmática de LH (ng/mL) na tarde do proestro (das 13:00 às
20:00h) em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. * indica diferenças significativas, p<0,05
(ANOVA de duas vias de medidas repetidas, seguida de Newman-Keuls).....................54
XII
Figura 16: Média ± EPM da área abaixo da curva das concentrações plasmáticas de LH
durante a tarde do proestro (das 13:00 às 20:00h) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H.
p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls)..............................................55
Figura 17: Concentração plasmática de FSH (ng/mL) na tarde do proestro (das 13:00 às
20:00h) em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. p<0,05 (ANOVA de duas vias de medidas
repetidas, seguida de Newman-Keuls)...............................................................56
Figura 18: Média ± EPM da área abaixo da curva das concentrações plasmáticas de
FSH durante a tarde do proestro (das 13:00 às 20:00h) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H.
p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls)..............................................57
Figura 19: (A) Peso do ovário direito; e (B) Peso do ovário esquerdo (média±EPM), de
ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, na fase estro. p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de
Newman-Keuls)................................................................................................................58
Figura 20: Número de óvulos (média±EPM) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, na fase
estro. Letras diferentes se referem a diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma
via seguida de Newman-Keuls)........................................................................................59
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS
Ang II - angiotensina II
APOM - área pré-óptica medial
ASO - sistema olfatório acessório
FC – freqüência cardíaca
FSH – hormônio folículo estimulante
icv – intracerebroventricular
LH – hormônio luteinizante
LHRH – hormônio liberador do hormônio luteinizante
MeA – núcleo medial da amígdala
MnPO – núcleo pré-óptico mediano
NTS – núcleo trato solitário
OCVs - órgãos circunventriculares
PAG – substância cinzenta periaqueductal
PAS – pressão arterial sistólica
PRL – prolactina
PVN – núcleo paraventricular
RNAm – RNA mensageiro
SNC – sistema nervoso central
SFO – órgão subfornicial
SRA - sistema renina-angiotensina
VMH – núcleo ventromedial do hipotálamo
XIV
RESUMO
No modelo de hipertensão renovascular, a redução do fluxo sangüíneo para o rim
causada pela aplicação de um clipe na artéria renal, modelo 2 Rins/ 1 Clipe (2R/1C),
leva à secreção de renina e um aumento secundário na concentração de angiotensina II
(Ang II) periférica, que tem papel na elevação da pressão arterial. Além de seu efeito
vasopressor a Ang II tem envolvimento na fisiologia reprodutiva. A Ang II está
envolvida na regulação da secreção do hormônio liberador do hormônio luteinizante
(LHRH), ovulação, e comportamento sexual em ratos machos e fêmeas.
Nosso objetivo nesse trabalho foi analisar a regularidade do ciclo estral após a
implantação do clipe, o comportamento sexual, peso ovariano, ovulação, como também,
verificar as concentrações plasmáticas de estradiol, hormônio luteinizante (LH) e
hormônio folículo estimulante (FSH) durante a tarde do proestro em ratas submetidas ao
modelo 2R/1C.
Dos animais clipados, em torno de 55% apresentaram pressão arterial sistólica
(PAS) maior que 150 mmHg, dessa forma os animais neste estudo foram divididos em
três grupos: grupo de ratas FICT (submetidas à cirurgia fictícia), grupo 2R/1C (fêmeas
submetidas à laparotomia, com dissecação da artéria renal esquerda, para a implantação
de um clipe de prata de 0,15mm de diâmetro, e que apresentavam PAS <125 mmHg), e
2R/1C-H (fêmeas submetidas ao modelo 2R/1C e que apresentavam PAS >150 mmHg).
No experimento I foi realizada análise do ciclo estral que iniciou-se no dia seguinte após
a cirurgia, na noite do segundo proestro após o registro da PAS, o comportamento sexual
foi registrado, e na manhã seguinte (estro), o número de óvulos foi contado. No
XV
experimento II ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H, no segundo ou terceiro proestro, após
registro dos parâmetros cardiovasculares, tiveram a veia jugular externa canulada às
11:00h da manhã. Amostras de 600µL de sangue foram coletadas às 13:00, 14:00, 15:00,
16:00, 17:00, 18:00, 19:00, e 20:00h. O sangue foi centrifugado, o plasma coletado foi
destinado ao radioimunoensaio para estradiol, LH, e FSH. Ao final das coletas as ratas
retornaram ao biotério, e na manhã seguinte (fase estro), tiveram os ovários coletados,
pesados separadamente, e em seguida foi realizada a contagem do número de óvulos.
Os resultados mostraram que ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentam um maior tempo,
em dias, para o retorno às mudanças de fases do ciclo estral, após a cirurgia. Ratas
2R/1C-H apresentaram redução na freqüência de lordose e um menor quociente de
lordose (Freqüência de lordose/Freqüência de monta). Foi verificada redução no número
de óvulos nos animais 2R/1C-H e 2R/1C quando comparado ao grupo FICT. As
concentrações plasmáticas de estradiol e FSH na tarde do proestro não foram diferentes
entre os grupos, porém a concentração plasmática de LH no grupo hipertenso foi menor
às 16:00h em relação ao demais grupos. A redução no número de óvulos em ratas
2R/1C-H e 2R/1C, na fase estro, foi confirmada no experimento II, porém esta não foi
acompanhada por alteração no peso do ovário direito e esquerdo. Em conjunto nossos
resultados demonstraram que ratas 2R/1C-H apresentam redução na capacidade
reprodutiva, que não foi associada a alterações nas concentrações plasmáticas de
estradiol e FSH, mas sim a uma modificação do perfil da curva de secreção de LH na
tarde do proestro. Sugere-se que a redução na função reprodutiva verificada seja devido
ao aumento de Ang II e/ou elevação da pressão arterial.
INTRODUÇÃO
Introdução
2
1. HIPERTENSÃO
A hipertensão é a elevação sustentada da pressão arterial sistêmica (sistólica e/ou
diastólica), é considerada uma síndrome heterogênea na qual vários fatores contribuem
para o seu aparecimento (CARRETERO & OPARIL, 2000; GIORGI, 2005). Pode ser ou
não acompanhada por lesão em órgãos como: rins, vasos sangüíneos, retina, coração
(GIORGI, 2005).
A hipertensão é um dos fatores que contribuem para o desenvolvimento de doença
cardiovascular e acidente vascular cerebral (GIORGI, 2005). Além disso, estudos
epidemiológicos sugerem uma associação entre a doença hipertensiva e a patogênese de
disfunções sexuais, onde os homens apresentam prejuízo da função erétil e ejaculação
(MOREIRA et al., 2001; FERRARIO & LEVY, 2002; SASAYAMA et al., 2003), e as
mulheres apresentam diminuição do orgasmo, libido, redução na lubrificação vaginal, ou
infertilidade (DUNCAN & BATEMAN, 1993), associadas à hipertensão e ao tratamento
anti-hipertensivo (LEWIS et al., 1998; DUNCAN et al., 2000; FOGARI et al., 2004).
Devido aos vários problemas decorrentes da hipertensão, como já citado acima,
foram desenvolvidos modelos experimentais em animais para o seu estudo. Estes em sua
maior parte envolvem a manipulação dos rins, do sistema nervoso ou das supra-renais,
além da inibição de substâncias que participam e que integram o processo vasoativo da
doença hipertensiva (RUZICKA & LEENEN, 1994; PINTO, PAUL, GANTEN, 1998).
O estudo com animais possibilita a compreensão dos mecanismos fisiopatológicos que
Introdução
3
provocam esta ruptura na homeostase, contribuindo para o controle clínico, bem como
melhora na qualidade de vida dos pacientes com esta doença.
2. Angiotensina
A angiotensina II (Ang II) é o produto final da clivagem do angiotensinogênio que
se inicia a partir da ativação da enzima renina (FITZSIMONS, 1980; BOTTARI et al.,
1993; MORGAN; PIPKIN; KALSHEKER, 1996; SAAVEDRA, 2005). Vários trabalhos
focalizam as ações da Ang II sobre a regulação da pressão arterial, balanço hídrico e
controle da função reprodutiva (STEELE; NEGRO-VILAR; McCANN, 1981; STEELE;
McCANN; NEGRO-VILAR, 1982; STEELE & GANONG, 1986; SAAVEDRA, 1992;
GANONG, 1995; SANVITTO et al., 1997; PHILLIPS & SUMMER, 1998).
Nas últimas décadas foi demonstrada a existência de sistemas renina-
angiotensina (SRA) locais presentes em diversos tecidos como: na parede arterial,
pulmão, rins, adrenal, hipófise e gônadas (SAAVEDRA, 1992). No entanto, uma das
descobertas mais importantes foi a descrição de um SRA cerebral (SAAVEDRA, 2005),
atuando, inicialmente sobre o aumento da pressão sangüínea (BICKERTON &
BUCKLEY, 1961).
A descoberta de receptores para a Ang II localizados em neurônios dentro da
barreira hematoencefálica confirmaram a existência da produção de Ang II endógena,
respondendo a Ang II gerada no cérebro, ou transportada através da barreira
hematoencefálica. A presença de receptores para Ang II nos órgãos circunventriculares
(OCVs) e em células endoteliais cerebrovasculares permitem que a Ang II periférica
Introdução
4
tenha ações sobre o sistema nervoso central (SNC). Assim, o cérebro responde tanto a
Ang II central e periférica, e os dois sistemas estão integrados (SAAVEDRA, 2005).
Os receptores de Ang II foram classificados, farmacologicamente, em dois
subtipos: AT
1
e AT
2
(SAAVEDRA et al., 1993; TIMMERMANS et al., 1995;
GASPARO et al., 2000). O receptor AT
1
é subdividido em duas isoformas distintas,
AT
1A
e AT
1B
, é o predominante em cérebros de ratos adultos (TSUTSUMI &
SAAVEDRA, 1991) e está localizado no plexo coróide, nas estruturas que correspondem
aos OCVs e nas envolvidas na regulação cardiovascular e homeostase dos líquidos, na
formação hipocampal, em áreas do sistema límbico relacionadas com o controle da
função hipofisária, e na hipófise (JÖHREN & SAAVEDRA, 1996). Entretanto, o
receptor
AT
2
é mais encontrado no SNC de humanos, predominando em tecidos fetais
(McGREGOR et al., 1995; TIMMERMANS et al., 1995), mostrando-se concentrado em
áreas relacionadas ao controle e ao aprendizado da atividade motora, visual, sensorial e
estruturas límbicas (TSUTSUMI & SAAVEDRA, 1991; SONG et al., 1992;
TIMMERMANS et al., 1995).
2.1 Angiotensina II e pressão arterial
A Ang II é reconhecida como um fator importante na patogênese da hipertensão
clínica e experimental (DeFORREST et al., 1982; MARTINEZ-MALDONADO, 1991;
NISHIMURA et al., 1992; KAGIYAMA et al., 2001). Perifericamente, a Ang II modula
a pressão arterial através de uma potente ação vasoconstritora e por ativação dos
receptores pré-sinápticos excitatórios nas terminações nervosas simpáticas pós-
Introdução
5
ganglionares (FITZSIMONS, 1998; FERNANDEZ et al., 2003). Centralmente, a Ang II
pode regular a pressão arterial por meio da liberação do peptídeo arginina-vasopressina,
inibição sináptica baroreflexa para o núcleo trato solitário (NTS), e, ainda, por aumento
da atividade do sistema nervoso simpático (LENKEI et al., 1997; ZHU et al., 2002).
O envolvimento da Ang II nas respostas cardiovasculares tem sido amplamente
estudado. As rotas aferentes que levam a informação do sistema cardiovascular ao SNC
iniciam nos receptores periféricos como os baroceptores (receptores de pressão)
localizados nas paredes do seio carotídeo e arco aórtico, e atriais (receptores de
estiramento) na parede dos átrios direito e esquerdo. A despolarização das fibras
sensoriais destas regiões codifica informações relacionadas com a pressão do sangue
contra a parede das artérias (receptores do seio carotídeo e arco aórtico) e com o volume
sangüíneo total ou retorno venoso (receptores atriais) (SPYER, 1994; BUCCAFUSCO,
1996).
Pesquisas que relacionam a ação da Ang II com a manutenção da hipertensão em
ratos adultos têm demonstrado que microinjeções de Ang II dentro do NTS produz
aumento dose-dependente da pressão arterial sistêmica, o mesmo ocorrendo quando as
injeções de Ang II são via intracerebroventricular (icv) (PLUNKETT & SAAVEDRA,
1985). Pesquisas realizadas em camundongos mutantes, com ausência do gene que
codifica o receptor AT
2
, demonstraram um significante aumento da pressão em resposta
à administração intravenosa de Ang II (ICHIKI et al., 1995). Dados mais específicos
mostraram o envolvimento do receptor AT
1A
na fase aguda da hipertensão renovascular,
onde a administração intravenosa de um antisense para o receptor AT
1A
promoveu uma
Introdução
6
diminuição do número total do respectivo receptor em tecidos periféricos de ratos
machos 2R/1C (GALLI & PHILLIPS, 2001).
2.2 Modelo de Hipertensão Renovascular
O modelo de hipertensão renovascular descrito por Goldblatt e colaboradores
(1934) é caracterizado por apresentar um esquema fisiopatológico no qual há estágios
temporais no desenvolvimento e manutenção da hipertensão renovascular, sendo sua
regulação determinada pelo envolvimento de uma inter-relação neural e hormonal
(MARTINEZ-MALDONADO, 1991).
Neste modelo experimental a elevação da pressão arterial é mediada pela ativação
do SRA, a qual ocorre após ser realizada a restrição do suprimento de sangue para um
dos rins, por clampeamento da artéria renal, sendo que o rim contralateral é mantido
intacto: modelo 2 Rins/ 1 Clipe (2R/1C), ou o rim contralateral é retirado: modelo 1
Rim/ 1 Clipe (1R/1C) (MARTINEZ-MALDONADO, 1991; RUZICKA & LEENEN,
1994; NAVAR et al., 1998).
A constrição de uma das artérias renais, e a preservação do rim contralateral
resultam numa elevação progressiva da pressão arterial, cujos níveis pressórios são
dependentes do grau de constrição da artéria renal imposta pelo diâmetro do clipe e da
extensão desta constrição (RUZICKA & LEENEN, 1994). O clampeamento da artéria
renal esquerda produz pequena elevação da pressão arterial já no primeiro dia após
estenose (SCHRIKER et al., 1994), e em seguida ocorre gradual elevação na pressão que
é independe do grau de estenose imposto pelo clipe, porém os valores de pressão arterial
Introdução
7
atingidos variam conforme este grau, podendo resultar em hipertensão de moderada a
severa (RUZICKA & LEENEN, 1994).
A elevação da pressão arterial sistêmica devido ao aumento da concentração de
Ang II circulante é promovida por meio de ações rápidas (agudas) e a longo prazo
(crônicas). A curto prazo ocorre o aumento da resistência periférica total mediada pela
Ang II circulante. A longo prazo o que se verifica é o aumento no volume sangüíneo
mediado por ações renais da Ang II e aldosterona, efeitos tróficos da Ang II nos
músculos cardíaco e liso dos vasos, e aumento da atividade simpática, que parecem
participar na manutenção da hipertensão nas fases crônicas (MARTINEZ-
MALDONADO, 1991; RUZICKA & LEENEN, 1994; KAGIYAMA et al., 2001).
Estudos que investigam a fisiopatologia molecular do modelo 2R/1C demonstram
que quatro semanas depois de aplicado o clipe na artéria renal a concentração de Ang II
cerebral apresenta-se elevada (MORISHITA et al., 1993). Em seis semanas é verificado
que a responsividade do sistema adrenérgico central em áreas relacionadas com o
controle cardiovascular encontra-se aumentada (JUNG; LEE; KIM, 2004).
Este modelo se demonstra próprio para o estudo de disfunções sexuais que
ocorrem em situações de hipertensão, principalmente por estar esta hipertensão
associada a um aumento das concentrações de Ang II, tanto periférica quanto central.
3. FISIOLOGIA REPRODUTIVA
A reprodução compreende todos os eventos fisiológicos, somáticos e
comportamentais, que asseguram a perpetuação da espécie. Em mamíferos a reprodução
Introdução
8
encontra-se sob o controle dos sistemas nervoso e endócrino que atuam de forma
coordenada na promoção, desenvolvimento e na maturação dos caracteres sexuais e dos
comportamentos relacionados a cada sexo (LIBERTUN, 2004).
A função reprodutiva fica prejudicada quando alterações no eixo hipotálamo-
hipófise, ou na própria gônada, comprometem tanto a parte comportamental quanto a
gametogênica. Vários fatores podem promover alterações na função reprodutiva, dentre
estes encontramos a hipertensão (CLARK, 1995).
3.1 O Ciclo Estral da Rata
Grande parte do conhecimento que possuímos sobre o controle do ciclo ovariano
de vários mamíferos, é baseado em estudos sobre o ciclo estral de ratas (FREEMAN,
1994). O ciclo ovariano da rata apresenta fase folicular curta, e é composto basicamente
de quatro fases: o estro, metaestro, diestro, e o proestro, estas fases podem ser
verificadas por meio das mudanças na mucosa vaginal, a qual apresenta padrão distinto
de distribuição de células epiteliais, leucócitos e células queratinizadas em cada fase do
ciclo (MATTHEWS & KENYON, 1984; FREEMAN, 1994).
Na fase de estro, que possui duração de 25 a 27 horas, a mucosa vaginal apresenta
células queratinizadas. A seguinte fase: metaestro, com duração de 6 à 8 horas, pode ser
identificada pela presença de células epiteliais, leucócitos e células queratinizadas. Essa
fase precede o diestro, que tem duração de 55 a 57 horas e apresenta mucosa com
predomínio de leucócitos e presença de muco, podendo aparecer algumas células
Introdução
9
epiteliais. Após, ocorre o proestro com duração de 12 a 14 horas, fase que a mucosa
vaginal caracteriza-se por células epiteliais (FREEMAN, 1994).
Em cada fase do ciclo estral verifica-se variações nas concentrações hormonais de
esteróides gonadais, de gonadotrofinas (Figura 01) (BUTCHER; COLLINS; FUGO et
al., 1974; SMITH; FREEMAN; NEILL, 1975; FREEMANN, 1994), e observam-se
alterações comportamentais.
A concentração plasmática de estradiol varia durante as fases do ciclo,
apresentando-se baixa no estro e começando a elevar-se na tarde do metaestro, até
atingir concentrações mais altas no meio dia do proestro, sendo fundamental para o pico
pré-ovulatório de gonadotrofinas, após diminui sua concentração, atingindo níveis basais
no início da madrugada do estro (SMITH; FREEMAN; NEILL, 1975; FREEMAN,
1994). O aumento de estrógeno no diestro induz a um aumento na secreção de
gonadotrofinas na tarde do proestro (FREEMAN, 1994). O mecanismo pelo qual o
estrógeno estimula a secreção de LHRH (hormônio liberador do hormônio luteinizante)
ainda não está claro. Dados indicam que o sistema noradrenérgico central pode ser o
principal mediador do mecanismo de retroalimentação positivo dos esteróides gonadais,
pois lesão eletrolítica no locus coeruleus na manhã do proestro, em ratas ciclando
regularmente, diminui o conteúdo de noradrenalina na área pré-óptica medial (APOM) e
hipotálamo médio basal bloqueando a onda pré-ovulatória de gonadotrofinas, e com isso
ovulação (ANSELMO-FRANCI et al., 1997), não tendo o estrógeno ação direta sobre os
neurônios LHRH (SHIVERS et al., 1983; JENNES et al., 1992; HERBINSON et al.,
1995).
Introdução
10
O padrão de secreção de prolactina (PRL), LH e FSH apresenta-se baixo até à
tarde da fase proestro, onde fazem pico. O pico plasmático para o LH, importante para o
processo ovulatório, ocorre entre as 15:00 e 18:00h da fase proestro. Para o FSH, o que
se verifica é uma elevação na secreção a partir das 15:00h do proestro, com a presença
de um pico na madrugada desta fase. A concentração plasmática de PRL sobe na fase
proestro, com pico às 15:00h retornado aos níveis basais por volta das 06:00h do estro
(SMITH; FREEMAN; NEILL, 1975). A PRL é o maior hormônio luteotrófico que inicia
e mantém a secreção de progesterona pelo corpo lúteo (SMITH; FREEMAN; NEILL,
1975), e é importante para o comportamento de receptividade ao macho, na rata (MANI,
2003). O FSH liga-se a seus receptores nas células da granulosa dos folículos primários
e estimula a produção de estradiol a partir dos andrógenos, além disso, tem o papel de
recrutar novos folículos que possam depois responderem a FSH e LH e crescer para o
próximo ciclo (SCHWARTZ, 2000).
O padrão de secreção de progesterona durante o ciclo consiste de dois picos, sendo
verificado concentrações elevadas entre a tarde do metaestro e manhã do diestro, onde
os valores começam a cair permanecendo baixos até à tarde do proestro onde faz pico
(SMITH; FREEMAN; NEILL, 1975). A rápida elevação de progesterona facilita o
comportamento reprodutivo na fêmea e liberação de LH para o processo ovulatório
(PFAFF; VASUDEVAN; ATTARDI, 2000), além disso, progesterona é essencial para a
reprodução porque induz no endométrio a transcrição de genes específicos envolvidos
com a implantação do blastocisto (CHABBERT-BUFFET et al., 2000).
Introdução
11
Figura 01: Variações hormonais nas diferentes fases do ciclo estral da rata (SMITH;
FREEMAN; NEILL, 1975).
Introdução
12
3.2 Comportamento Sexual da rata
Como já mencionado, uma inter-relação entre mecanismos neurais e endócrinos é
necessária para a ocorrência dos eventos fisiológicos e comportamentais reprodutivos
(FREEMAN, 1994). A coordenação dos eventos fisiológicos com comportamento é um
pré-requisito para sucesso na reprodução (SIMERLY, 2002). A ação dos hormônios
gonadais promove a diferenciação do sistema nervoso revelando condutas distintas entre
machos e fêmeas no que se refere ao comportamento sexual e a atitudes relacionadas à
reprodução (PILGRIM & REISERT, 1992; SIMERLY, 2002).
O conceito de “diferenciação sexual do sistema nervoso” pode ser constituído pela
fase “organizacional” e “ativacional” dos hormônios sexuais: a primeira é o período
crítico, logo após o nascimento, durante o qual circuitos neurais específicos de cada sexo
são consolidados, e a segunda é quando, no adulto, os hormônios sexuais são requeridos
para ativar aqueles circuitos e propiciar o desencadeamento dos aspectos fisiológicos da
função reprodutiva (KELLY, 1991; PILGRIM & REISERT, 1992; McCORMICK et al.,
1998). Assim, os hormônios sexuais exercem alterações estruturais e neuroquímicas em
áreas e circuitos sexualmente dimórficos (NAFTOLIN, 1981).
O estrógeno é importante na coordenação e regulação de vários aspectos da
reprodução (SHUGHRUE et al., 1992). Neurônios sensíveis ao estrógeno foram
encontrados predominantemente na APOM, no hipotálamo tuberal, em regiões límbicas
como amígdala e parte do mesencéfalo e córtex cerebral (KATO & VILLEE, 1967).
SHUGHRUE et al. (1992) verificaram que a concentração do RNA mensageiro (RNAm)
para o receptor de estrógeno altera-se durante o ciclo estral, e existe expressão
Introdução
13
diferencial no sistema nervoso, estes aspectos verificados podem ser os determinantes da
instalação do comportamento reprodutivo e o período da ovulação.
O período em que a rata está pronta para o coito denomina-se estro
comportamental, nesta fase o comportamento proeminente verificado é a postura para a
cópula, ou seja, a curvatura espinhal, assumida pela fêmea que é denominada lordose.
Quando a rata em proestro é estimulada sobre ou perto dos flancos, arqueia o dorso e
fica completamente imóvel, para auxiliar a inserção peniana do macho (BEHBEHANI,
1995). Na ausência da lordose a intromissão e ejaculação não são possíveis. Há
receptores sensoriais nos flancos e no períneo da fêmea que, quando estimulados, suas
aferências sensoriais ascendem pela coluna anterolateral da medula espinhal. As fibras
ascendentes atingem a formação reticular e o núcleo vestibular lateral. Terminações
sensoriais ascendentes no tronco cerebral não controlam imediatamente os neurônios
descendentes de uma maneira simples. A facilitação da resposta eferente descendente do
tronco cerebral para o comportamento de lordose possui uma natureza tônica, o que
reflete em parte as influências estrogênicas no hipotálamo. A circuitaría que facilita o
comportamento de lordose é formada por células nervosas próximas e no núcleo
ventromedial do hipotálamo (VMH). Do VMH as eferências seguem através de uma
trajetória periventricular medial ou lateral para a formação reticular e substância
cinzenta periaqueductal (PAG). Neurônios na substância central enviam axônios
descendentes para a formação reticular do bulbo. O sinal eferente descendente ativa
neurônios reticuloespinhais e eles atuam em conjunto com neurônios vestibuloespinhais
lateral que controlam os músculos dorsais que executam o comportamento de lordose
(PFAFF; VASUDEVAN; ATTARDI, 2000).
Introdução
14
Os efeitos facilitatórios sobre o comportamento sexual na rata ocorrem por ação da
progesterona e pela ação de seu receptor, e isto está relacionado com a distribuição
dinâmica de seus receptores no hipotálamo (MANI; BLAUSTEIN; O’MALLEY, 1997;
AUGER, 2001; MANI, 2001), por exemplo a ovariectomia abole a lordose, que é
praticamente restaurada pelo tratamento com estradiol, no entanto o tratamento adicional
com progesterona amplifica drasticamente o efeito estimulatório do estradiol sobre o
comportamento sexual da rata (FLANAGAN-CATO, 2000; LEVINE et al., 2001).
Está bem estabelecido a existência de uma via dependente de estrógeno e
progesterona, a qual exerce um efeito estimulatório para o reflexo de lordose e inclui o
sistema olfatório acessório (ASO), núcleo medial da amígdala (MeA) e VMH (ROWE &
ERSKINE, 1993; DUDLEY; RAJENDREN; MOSS, 1996; FLANAGAN-CATO;
CALIZO; DANIELS, 2001). O ASO é composto pelo órgão vomeronasal (região
quimicamente sensível aos feromônios localizada dentro da cavidade nasal), pelo bulbo
olfatório acessório e projeções do bulbo olfatório acessório, as quais são enviadas para o
núcleo MeA (KRETTEK & PRICE, 1978). Durante a execução do comportamento
sexual estas regiões apresentam aumento no número de células imunorreativas para Fos,
indicando aumento da atividade neuronal (RAJENDREN & MOSS, 1993). Por outro
lado, a remoção de qualquer um dos componentes desta via não permite que ocorra o
reflexo de lordose, induzido pelo macho, mesmo em presença de concentrações
adequadas de estrógeno e progesterona (RAJENDREN; DUDLEY; MOSS, 1990;
RAJENDREN & MOSS, 1993).
Evidências têm demonstrado aumento da atividade de neurônios produtores de
LHRH, predominantemente no septo medial, órgão vasculoso da lâmina terminal,
Introdução
15
APOM e área hipotalâmica anterior, durante a ativação de regiões envolvidas no
comportamento sexual. Além disso, a atividade desses neurônios se mostra diminuída
nos casos de destruição de áreas envolvidas no reflexo de lordose, sugerindo a
participação deste hormônio neste comportamento (RAJENDREN & MOSS, 1993).
3.3 Angiotensina e Função Reprodutiva
Tem sido demonstrado que a Ang II afeta a secreção dos hormônios da hipófise
anterior (GANONG, 1993). Por meio de uma série de trabalhos STEELE et al. (1982;
1983; 1985; 1986 e 1992) verificaram que Ang II está envolvida na regulação da
secreção de LHRH e ovulação. A Ang II age de forma a aumentar a secreção de LHRH
na fase proestro, o que contribui para o pico de LH registrado na tarde desta fase, e,
portanto ovulação.
Corroborando com os resultados obtidos por STEELE et al., trabalhos de
PHILLIPS et al. (1993) verificaram que há mudanças nas concentrações hipotalâmicas
de Ang II e secreção de Ang II em ratas ovariectomizadas e repostas com estradiol e
progesterona, sendo evidenciado um pico na concentração hipotalâmica de Ang II uma
hora antes do pico de LH plasmático. Em ratas na fase proestro verifica-se padrão
semelhante, as concentrações de Ang II no líquido cefalorraquidiano alcançam valores
de pico entre 12:30 e 13:30h retornando a valores semelhantes a de fêmeas em diestro
após este horário (GHAZI et al., 1994).
Os efeitos facilitatórios da Ang II sobre a secreção de LHRH podem ocorrer por
meio da ação direta ou indireta na APOM ou por combinação de ambas as ações. A ação
Introdução
16
indireta da Ang II sobre a APOM ocorre pela facilitação da liberação de noradrenalina
(STEELE & GANONG, 1986; STEELE, 1992) para a APOM. Esta ação ocorreria via
locus coeruleus
: a Ang II promove a secreção de noradrenalina do
locus coeruleus
que
por sua vez atua sobre receptores alfa-adrenérgicos da APOM. O
locus coeruleus
tem
participação na secreção de LHRH, pois lesão eletrolítica deste núcleo bloqueia o pico
plasmático de LH na tarde do proestro (ANSELMO-FRANCI et al., 1997; MARTINS-
AFFÉRRI et al., 2003). Diretamente a Ang II estimula a secreção de LHRH (STEELE,
1987; STEELE, 1992) da APOM via receptor AT
1
(DORNELLES & FRANCI, 1998).
Portanto, os estudos evidenciam que a Ang II eleva-se no cérebro mais ou menos uma
hora antes das concentrações de LH no plasma fazerem pico, e direta e indiretamente a
Ang II estimula a secreção de LHRH, o que eleva o LH plasmático na fase proestro, e
também favorece ovulação.
Além do SRA central, a existência de um SRA ovariano está bem estabelecida, e
este tem demonstrado importância no desenvolvimento folicular, esteroidogênese,
maturação do ovócito, e ovulação, assim considera-se o SRA ovariano como um sistema
autócrino, parácrino e endócrino (BUMPUS et al., 1988; YOSHIMURA, 1997; SPETH;
DAUBERT; GROVE, 1999).
Estudos evidenciaram que além de seu importante efeito dipsinogênico, a Ang II
central também modula outros comportamentos, como por exemplo o comportamento
sexual em ratos machos e fêmeas. Microinjeções icv de Ang II diminuem o
comportamento sexual em ratos machos (CLARK, 1989) e estudos complementares
verificaram que este efeito modulador seria mediado pelo receptor AT1 (KEATON &
CLARK, 1998). A administração de microinjeções de Ang II no MeA aumenta a
Introdução
17
latência para o comportamento ejaculatório em ratos machos (BREIGEIRON et al.,
2002), e inibe o comportamento de lordose em ratas (CECCONELLO, 2005). Assim,
conforme as evidências experimentais citadas que mencionam a importância da Ang II
na fisiologia reprodutiva, a investigação das alterações das concentrações de Ang II in
vivo como as que ocorrem no modelo de hipertensão renovascular constituem uma
importante linha de pesquisa para verificação das implicações Ang II elevada in vivo na
fisiologia reprodutiva.
JUSTIFICATIVA
Justificativa
19
O ovário da rata possui todos os componentes do SRA.
A Ang II central tem importância na facilitação da elevação da concentração
plasmática de LH na fase proestro.
Considerando-se que no modelo de hipertensão renovascular ocorre um aumento
da Ang II central, além do aumento da Ang II plasmática, acreditamos que situações de
Ang II elevada, como as produzidas no modelo de hipertensão renovascular, poderiam
ser prejudiciais a esteroidogênese, comportamento sexual e ovulação.
O modelo de hipertensão renovascular, portanto, compõe uma importante
ferramenta para o esclarecimento das associações/interações entre Ang II elevada em um
modelo
in vivo
, hipertensão arterial. E como a maioria dos estudos com animais
experimentais são realizados em machos devido à complexidade inerente às variações
hormonais em fêmeas, as possíveis alterações reprodutivas em fêmeas, por aumento da
Ang II merecem ser avaliadas.
OBJETIVO
Objetivo
21
Este trabalho teve por objetivo verificar aspectos da função reprodutiva em ratas
submetidas ao clampeamento da artéria renal esquerda, modelo: 2 Rins/1 Clipe (2R/1C).
EXPERIMENTO I
1. Objetivos específicos
Verificar a regularidade do ciclo estral, o comportamento sexual, e a ovulação em
ratas submetidas ao modelo 2R/1C.
Experimento II
2. Objetivos específicos
Verificar as concentrações plasmáticas de estradiol, LH e FSH durante a tarde do
proestro, bem como o peso ovariano e ovulação em ratas submetidas ao modelo 2R/1C.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
23
1. ANIMAIS
Foram utilizados ratos machos e fêmeas adultos, da variedade
Wistar
provenientes do biotério do Instituto de Ciências Básicas da Saúde (ICBS) da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Os animais foram mantidos sob
condições de temperatura (22+
2°C) e luz (6:00 as 18:00) controlados, e tiveram livre
acesso à água e ração padrão.
2. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Neste trabalho 110 ratas que apresentavam ciclo estral regular foram utilizadas
para o experimento. Os grupos experimentais que compuseram este trabalho foram:
•
Cirurgia fictícia (
FICT
): ratas que foram submetidas a laparotomia com
dissecação da artéria renal esquerda, porém sem a colocação do clipe de prata.
•
2 Rins / 1 Clipe (
2R/1C
): ratas que foram submetidas à cirurgia de
clampeamento da artéria renal (modelo de hipertensão renovascular) com
colocação de um clipe de prata de 0,15mm de diâmetro na artéria renal esquerda,
e que apresentavam PAS <125 mmHg.
Materiais e Métodos
24
•
2 Rins / 1 Clipe hipertensas (
2R/1C-H
): ratas que foram submetidas à
cirurgia de clampeamento da artéria renal (modelo de hipertensão renovascular)
com colocação de um clipe de prata de 0,15mm de diâmetro na artéria renal
esquerda, e que apresentavam valores de PAS >150 mmHg.
3. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
3.1 Hipertensão Renovascular - modelo de Goldblatt tipo I: 2 Rins/1 Clipe (2R/1C)
Ratas que apresentavam no mínimo três ciclos regulares consecutivos, estando na
fase de diestro, foram submetidas à cirurgia de clampeamento da artéria renal esquerda,
modelo experimental de hipertensão renovascular tipo I descrito por GOLDBLATT et
al. (1934).
Os animais foram anestesiados com o relaxante muscular xilazina (Ronpum
100mg/mL - Profarb, MG) e o anestésico cloridrato de ketamina (Ketalar 50mg/mL -
Parke-Davis, SP) na dose de 100 mg/kg peso corporal, via intraperitonial.
Em seguida os animais foram posicionados em decúbito dorsal, para a realização
de uma incisão mediana na região abdominal com tamanho aproximado de 3cm logo
abaixo do apêndice xifóide. Esta abertura foi realizada por planos até a cavidade
peritonial. Com o auxílio de cotonetes (embebidos em solução fisiológica aquecida)
ocorreu o afastamento de vísceras abdominais. O rim esquerdo foi isolado em campo
cirúrgico por tiras de algodão, também embebidas em soro fisiológico aquecido. Com o
hilo renal esquerdo identificado foi iniciado o isolamento da artéria renal esquerda que
teve seu diâmetro diminuído com a colocação de um clipe de prata de tamanho 2 x 8mm,
Materiais e Métodos
25
dobrado em "V" e abertura interna de 0,15mm. Os animais permaneceram com este clipe
renal até apresentarem o segundo ou terceiro proestro após o registro dos parâmetros
cardiovasculares verificados por pletismografia caudal.
No grupo FICT (controle), foi realizada a mesma cirurgia, no entanto não houve a
colocação do clipe.
4. REGISTRO DA PRESSÃO ARTERIAL E FREQÜÊNCIA CARDÍACA
4.1 Pletismografia Caudal
O registro da PAS e freqüência cardíaca (FC) foi realizado pelo método não
invasivo da pletismografia caudal, utilizando o sistema da KENT SCIENTIFIC (RTBP
1001 Rat Tail Blood Pressure System for rats and mice, Litchfield, USA). Para a
realização do registro dos parâmetros cardiovasculares os animais foram colocados
durante 1 hora na sala, para a adaptação ao novo ambiente. Passado este intervalo, a
PAS e a FC foram determinadas.
O registro da PAS e FC foi feito na fase clara do ciclo claro-escuro, no décimo dia
após a intervenção cirúrgica. Durante o mesmo, os animais foram colocados em um tubo
de acrílico, no qual, em uma das extremidades se tinha acesso à cauda do animal. O tubo
de acrílico foi coberto por um pano o que permitiu uma menor exposição do animal ao
ambiente. Foram realizados no mínimo dois pré-testes para adaptação do animal, ou
seja, somente a partir do terceiro dia do registro foi considerado os valores de PAS e FC.
À cauda do animal era colocado um transdutor pneumático acoplado a um
esfingmomanômetro, e na presença de sinal adequado eram realizadas consecutivamente
Materiais e Métodos
26
determinações da PAS durante 4 minutos e 30 segundos. A PAS obtida consistiu da
média de 5 a 8 registros obtidos neste período.
Nesta etapa do experimento é que o grupo 2R/1C, conforme PAS foi subdividido
em 2R/1C-H (PAS >150 mmHg) e 2R/1C (PAS <125 mmHg).
EXPERIMENTO I
1. ANÁLISE DO CICLO ESTRAL
No dia seguinte à cirurgia iniciou-se diariamente a coleta do esfregaço vaginal às 9
horas da manhã (Figura 02), segundo técnica de LONG & EVANS (1922). Após a
coleta, o esfregaço era analisado a fresco em um microscópio (Figura 03). No final do
período experimental, a análise do ciclo estral consistiu em verificar quanto tempo, em
dias, ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H, demoravam a apresentar mudanças nas fases do
ciclo estral após a intervenção cirúrgica, e qual o percentual de animais que retornavam
a ciclar regularmente após 15 dias a contar da cirurgia.
Materiais e Métodos
27
Figura 02:
Coleta do esfregaço vaginal para análise do ciclo estral.
Materiais e Métodos
28
Figura 03:
Células coletadas por meio de esfregaço vaginal nas diferentes fases do ciclo
estral da rata.
Materiais e Métodos
29
2. COMPORTAMENTO SEXUAL
Este experimento teve como objetivo verificar o comportamento sexual pela
medida do quociente de lordose (índice de lordose/monta) exibido pela fêmea em
proestro quando colocada com um macho sexualmente ativo.
2.1 Seleção de ratos machos sexualmente ativos
Ratos machos foram colocados em caixas de ambientação com 20 x 50cm, com
fêmeas receptivas (uma fêmea para cada dois machos), e permaneceram assim durante
quinze dias a fim de adquirirem experiência sexual (treino). Após este período, as
fêmeas foram retiradas das caixas, e os ratos permaneceram sozinhos por mais sete dias
(período de abstinência sexual). Passado este período de três semanas, estes ratos foram
testados em seu desempenho sexual.
O teste de desempenho sexual consistiu em avaliar durante dez minutos o
comportamento do macho perante uma fêmea receptiva. As fêmeas utilizadas tanto para
o teste como para o treino foram submetidas a ovariectomia. Dez dias após a
ovariectomia, foram induzidas à receptividade sexual por injeções subcutâneas de
benzoato de estradiol (benzo-ginoestril ap 5mg - SARSA, RJ) na dose de 2 µg/rata, 48
horas antes do teste, e progesterona-Sigma na dose de 500µg/rata, mais benzoato de
estradiol na dose de 2 µg/rata, 6 horas antes do teste (MAS et al., 1987). Os machos que,
ao serem colocados com as fêmeas, apresentavam mais de seis intromissões penianas no
período de dez minutos, foram considerados como sexualmente ativos e separados para
Materiais e Métodos
30
serem submetidos ao experimento de verificação do quociente de lordose exibido por
ratas, na noite da fase proestro.
2.2 Seleção de fêmeas em Proestro e Registro Comportamental
Fêmeas dos grupos FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H, quando apresentaram o segundo ou
terceiro proestro após o registro da PAS e FC, foram submetidas ao registro do
comportamento sexual.
Para o registro do comportamento sexual, os ratos foram colocados em caixas de
observação com dimensões de 70 x 70 x 35cm cujas paredes eram de aço com exceção
da parede frontal que era de vidro, o que permitiu a ampla visualização dos animais. O
chão das caixas de observação, assim como o das caixas de ambientação, foi coberto
com maravalha.
Em todo o experimento, o registro foi realizado de uma a seis horas após início da
fase escura. Inicialmente, o macho foi retirado da caixa onde estava ambientado para ser
colocado na caixa de observação por um período de dez minutos para adaptação ao novo
ambiente. Após este intervalo, a fêmea foi colocada com o macho na caixa de
observação iniciando-se, imediatamente a seguir, a sessão de registro do comportamento
sexual que teve duração de quinze minutos para os comportamentos de monta exibidos
pelo macho, e de lordose pela fêmea. O registro consistiu em filmar os animais com uma
filmadora de vídeo.
Ao término do registro, este foi visualizado com o auxílio de um aparelho de vídeo
por um observador treinado que digitou, num microcomputador com programa
Materiais e Métodos
31
especialmente elaborado, uma tecla selecionada para cada comportamento à medida que
este ocorria. O programa computou a freqüência de cada comportamento. A freqüência é
o número de vezes que cada comportamento ocorre durante o registro. A duração foi
caracterizada como o tempo total de ocorrência de um comportamento específico.
Os parâmetros comportamentais avaliados foram:
• Locomoção:
movimentos de exploração do ambiente realizados pela fêmea como
parâmetro de resposta a estímulos recebidos.
• Freqüência de lordose
(toda vez que a fêmea eleva a parte traseira do dorso para o
macho montar),
e monta
(toda vez que o macho usa as patas dianteiras para agarrar a
fêmea pelos flancos).
• Quociente de lordose:
número de lordose divididos pelo número de montas.
3. CONTAGEM DO NÚMERO DE ÓVULOS
Ratas FICT, 2R/1C e 2R/1C-H submetidas ao registro do comportamento sexual
na noite do proestro, e que na manhã seguinte às 9:00h estavam na fase estro, foram
primeiramente pesadas, em seguida decapitadas, e por meio de uma laparotomia tiveram
os ovários removidos. Os ovidutos foram dissecados, lavados em solução salina 0,9%, e
colocados entre duas lâminas, entre as quais foram comprimidos para posterior
contagem do número de óvulos por meio de um microscópio óptico (Zeiss, Goettingen,
Germany) com lentes de aumento de 2,5x (GOMES et al., 1999).
Materiais e Métodos
32
Além disso, o rim esquerdo e o rim direito também foram retirados e pesados, para
posterior cálculo do índice renal. O índice renal foi obtido pela divisão do peso renal do
rim (mg) sobre o peso corporal (g).
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram comparados entre os três grupos (FICT, 2R/1C, 2R/1C-H)
pela análise de variância (ANOVA) de uma via seguida de Newman-Keuls e expressos
como média
±
erro padrão da média (EPM). p<0,05 foi adotado como critério de
significância.
EXPERIMENTO II
Ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H no segundo ou terceiro proestro após registro dos
parâmetros cardiovasculares, tiveram a veia jugular externa canulada às 11:00h da
manhã. Amostras de 600
µ
L de sangue foram coletadas em seringas heparinizadas de
hora em hora, iniciando às 13:00h do mesmo dia (horário das coletas: 13:00, 14:00,
15:00, 16:00, 17:00, 18:00, 19:00, e 20:00 horas) perfazendo um total de 8 coletas. Após
a remoção de cada amostra sangüínea um volume igual de NaCl 0,9% estéril foi reposto.
O sangue coletado foi centrifugado por 30 minutos à 3.000 rpm e estocado (-80ºC) para
posterior dosagem de estradiol, LH, e FSH por radioimunoensaio.
Materiais e Métodos
33
1. CANULAÇÃO DA VEIA JUGULAR
Os animais foram anestesiados com injeção intraperitonial de solução de
tribromoetanol (Aldrich Chem. Comp. Inc.) 2,5% em salina. A dose utilizada foi de
1mL/100g de peso corporal (POLETINI et al., 2003).
Após a anestesia uma cânula de silicone foi introduzida na veia jugular externa,
com o auxílio de uma agulha de implantação, a cânula foi suturada no músculo peitoral
maior e a parte livre da cânula foi externalizada no pescoço, um pouco abaixo das
orelhas, conforme técnica descrita por HARMS & OJEDA (1974). A cânula foi mantida
cheia de solução fisiológica até o momento da coleta de sangue.
2. Dosagem Hormonal
A concentração plasmática de estradiol foi determinada por radioimunoensaio
utilizando-se
kits
MAIA
®
da BioChem. ImmunoSystems (Bologna, Itália). O limite
mínimo para detecção para o estradiol foi de 7,5 pg/mL. Para as dosagens de LH e FSH
foram utilizados
kits
específicos fornecidos pela National Institute of Arthritis, Diabetes,
Digestive and Kidney Diseases (NIADDK, Baltimore – USA), e o anticorpo para
precipitação foi produzido pelo laboratório do Prof. Dr. Celso R. Franci (FMRP – USP),
o limite mínimo para a detecção do LH foi de 0,04ng/mL, e para o FSH 0,39ng/mL.
Além disso, os erros intra-ensaios para o estradiol foi 3,2%, para o LH 4% e FSH 3,2%.
Materiais e Métodos
34
3. PESO DOS OVÁRIOS E CONTAGEM DO NÚMERO DE ÓVULOS
Ratas FICT, 2R/1C e 2R/1C-H submetidas a coleta de sangue na tarde do proestro,
e que na manhã seguinte às 9:00h estavam na fase estro, foram primeiramente pesadas,
em seguida decapitadas, e por meio de uma laparotomia tiveram os ovários (direito e
esquerdo) removidos, e pesados separadamente. Os ovidutos foram dissecados, lavados
em solução salina 0,9%, e colocados entre duas lâminas, entre as quais foram
comprimidos para posterior contagem do número de óvulos por meio de um microscópio
óptico (Zeiss, Goettingen, Germany) com lentes de 2,5x (GOMES et al., 1999).
Além disso, o rim esquerdo e o rim direito também foram retirados e pesados, para
posterior cálculo do índice renal. O índice renal foi obtido pela divisão do peso renal
(mg) sobre o peso corporal (g). É importante ressaltar que os resultados referentes ao
peso corporal, PAS, FC, peso renal direito e esquerdo, índice renal direito e esquerdo
dos animais utilizados no experimento II foram analisados juntamente com os
respectivos resultados do experimento I.
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados referentes à concentração plasmática de estradiol, LH e FSH dos três
grupos experimentais foram comparados pela análise de variância (ANOVA) de duas
vias (grupo e horário) e de medidas repetidas, seguida de Newman-Keuls. Foi realizado
o cálculo da área abaixo da curva da concentração plasmática de estradiol, LH e FSH
das 13:00 às 20:00 da tarde do proestro. Os resultados obtidos da área abaixo da curva
Materiais e Métodos
35
da concentração plasmática de estradiol, LH e FSH, bem como do peso do ovário direito
e esquerdo e número total de óvulos foram analisados por meio de ANOVA de uma via
seguida de Newman-Keuls. Os resultados foram expressos pela média
±
EPM, e p<0,05
foi adotado como critério de significância.
RESULTADOS
Resultados
37
1. CIRURGIA E CLAMPEAMENTO RENAL
O sucesso de desenvolvimento de hipertensão, observado neste estudo, ao utilizar
o modelo de hipertensão renovascular descrito por GOLDBLATT et al. (1934), foi de
55%.
1.1 Peso Corporal
O peso corporal, verificado ao final do experimento, foi semelhante [F(2,69)=2,06,
p=0,135] entre os grupos estudados (Figura: 04).
1.2 Pressão Arterial Sistólica e Freqüência Cardíaca
A PAS foi maior [F(2,69)=197,0, p<0,0001] no grupo de ratas 2R/1C-H quando
comparado aos grupos 2R/1C e FICT, e ratas 2R/1C apresentaram PAS maior que ratas
FICT (Figura: 05A). A FC foi maior [F(2,69)=20,28, p<0,0001] em ratas 2R/1C-H
quando comparado aos demais grupos (Figura: 05B).
1.3 Peso Renal
Ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentaram um aumento [F(2,69)=21,93, p<0,0001] no
peso renal direito (Figura: 06A) e uma redução [F(2,69)=73,83, p<0,0001] no peso renal
esquerdo (Figura: 06B) quando comparado ao grupo FICT. Foi verificado também, que
o peso renal esquerdo foi menor no grupo 2R/1C-H em relação ao grupo 2R/1C.
Resultados
38
1.4 Índice Renal
O grupo de ratas 2R/1C-H e 2R/1C tiveram aumento [F(2,69)=31,43, p<0,0001] no
índice renal direito (Figura: 07A), e uma redução [F(2,69)=61,27, p<0,0001] no índice
renal esquerdo (Figura: 07B) quando comparado ao grupo FICT. O índice renal
esquerdo foi menor no grupo 2R/1C-H em relação ao grupo 2R/1C.
EXPERIMENTO I
1. CICLO ESTRAL
O tempo médio em dias para retornar a mudanças nas fases do ciclo estral foi
maior [F(2,69)=20,29, p<0,0001] em ratas 2R/1C-H e 2R/1C quando comparado ao
grupo FICT, e ratas hipertensas quando comparadas às 2R/1C apresentaram um tempo
maior para voltar a mudanças nas fases do ciclo estral (Figura: 08A). Além disso, foi
verificado que depois de 15 dias, após realizado os procedimentos cirúrgicos, o
percentual de animais que retornaram ao ciclo regular foi menor no grupo de ratas
2R/1C-H, contudo, todos os animais FICT retornaram a ciclar regularmente (Figura:
08B).
Resultados
39
2. COMPORTAMENTO SEXUAL
2.1 Freqüência de Lordoses
Ratas 2R/1C-H apresentaram uma diminuição [F(2,37)=4,85, p<0,02], quando
comparadas ao grupo FICT, na média de freqüência de lordoses em 15 minutos, quando
testadas na noite do proestro com machos sexualmente ativos (Figura: 09A).
2.2 Freqüência de Montas
Machos sexualmente ativos colocados com fêmeas 2R/1C e FICT, na noite do
proestro não apresentaram diferença na média da freqüência de montas [F(2,37)=0,46,
p=0,63], em 15 minutos sobre as fêmeas 2R/1C quando comparados ao grupo FICT
(Figura: 09B).
2.3 Quociente de lordose (número de lordose/número de montas)
O quociente de lordose apresentado por ratas 2R/1C-H na noite do proestro,
quando testadas com ratos machos sexualmente ativos, apresentou uma diminuição
[F(2,37)=6,35 p<0,005] quando comparado ao grupo de ratas FICT, contudo não foi
diferente do grupo 2R/1C (Figura: 10).
2.4 Freqüência e Duração da Locomoção
Ratas 2R/1C-H e 2R/1C, quando comparadas ao grupo FICT, durante o registro do
comportamento sexual, não apresentaram alteração quanto ao tempo de exploração do
Resultados
40
ambiente, ou seja, freqüência de locomoção [F(2,37)=0,90, p=0,42] (Figura: 11A) e
duração total de locomoção [F(2,37)=0,26, p=0,77] na arena (Figuras: 11B).
3. CONTAGEM DO NÚMERO DE ÓVULOS
Ratas 2R/1C-H e 2R/1C, na fase estro, mostraram uma redução [F(2,37)=13,53,
p<0,0001] do número de óvulos em relação ao grupo FICT, como pode ser verificado na
Figura: 12.
EXPERIMENTO II
1. PERFIL HORMONAL
1.1 Estradiol
A Figura: 13 apresenta a concentração plasmática de estradiol (pg/mL) na tarde do
proestro (avaliada das 13:00 às 20:00h), em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. A ANOVA
de duas vias de medidas repetidas demonstrou efeito grupo [F(2,30)=3,39, p<0,05] e
horário [F(7,210)=19,95, p<0,0001], porém não ocorreu interação grupo-horário
[F(14,210)=1,09, p=0,37]. O
post hoc
demonstrou que às 17:00, 18:00, 19:00 e 20:00h
as concentrações plasmáticas de estradiol foram diferentes em relação aos demais
horários estudados, independentemente do grupo, o que caracteriza uma curva normal
para o estradiol na tarde do proestro, e que o grupo de ratas 2R/1C apresenta maior
Resultados
41
secreção de estradiol quando comparado ao grupo FICT. A área abaixo da curva do
estradiol foi semelhante entre os grupos [F(2,30)=3,00, p=0,07] (Figura: 14).
1.2 LH
A concentração plasmática de LH (ng/mL) das 13:00 às 20:00h da tarde do
proestro em ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, pode ser observada na Figura: 15. A ANOVA
de duas vias de medidas repetidas demonstrou efeito para horário [F(7,210)=41,04,
p<0,0001], porém não ocorreu efeito grupo [F(2,30)=1,36, p=0,27]. Houve interação
entre grupos e horários estudados [F(14,210)=20,30, p<0,0001]. O
post hoc
revelou que
a concentração plasmática de LH no grupo hipertenso foi menor às 16:00h em relação ao
demais grupos. E que das 16:00 até às 19:00h a secreção de LH foi maior nos grupos
FICT e 2R/1C quando comparado aos primeiros horários estudados. Já para o grupo
2R/1C-H a concentração plasmática de LH foi maior das 16:00 até às 20:00 quando
comparado às 13:00, 14:00, e 15:00h. Na Figura: 16 pode ser visualizada a área abaixo
da curva para o LH, a qual apresentou-se semelhante entre os grupos [F(2,30)=2,04,
p=0,15].
1.3 FSH
A Figura: 17 apresenta a concentração plasmática de FSH (ng/mL) na tarde do
proestro, em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. A ANOVA mostrou que não ocorreu efeito
grupo [F(2,30)=2,91, p=0,07, e interação [F(14,210)=1,44, p=0,14. Porém, ocorreu
efeito horário [F(7,210)=33,30, p<0,0001], o teste de Newman-Keuls demonstrou que o
FSH plasmático na tarde do proestro apresenta maior concentração das 16:00 até às
Resultados
42
20:00 em relação aos primeiros horários estudados, o que caracteriza uma curva normal
de secreção de FSH na tarde do proestro, independente do grupo estudado. A área
abaixo da curva do FSH foi semelhante para os grupos estudados [F(2,30)=1,00, p=0,38]
(Figura: 18).
2. PESO DOS OVÁRIOS E CONTAGEM DO NÚMERO DE ÓVULOS
Ratas 2R/1C-H e 2R/1C, na fase estro, mostraram uma redução [F(2,29)=7,41,
p<0,003] do número de óvulos em relação ao grupo FICT (Figura: 20), a redução do
número de óvulos não foi acompanhada por alteração no peso do ovário direito
[F(2,29)=0,25, p=0,78] (Figura: 19A), e esquerdo [F(2,29)=1,10, p=0,35] (Figura: 19B).
Resultados
43
Figura 04
: Peso corporal de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H. As barras indicam a
média
±
EPM. p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
0
100
200
300
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(26)
(28)
(18)
Peso (g)
Resultados
44
Figura 05
:
(A)
Pressão Arterial Sistólica (mmHg); e
(B)
Freqüência Cardíaca (bm
-1
), de
ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H. As barras indicam a média
±
EPM. Letras diferentes
indicam diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-
Keuls).
(A)
(B)
0
50
100
150
200
a
b
c
(26)
(28)
(18)
PAS (mm Hg)
0
100
200
300
400
500
FICT
2R/1C
2R/1C-H
a
b
a
(26)
(28)
(18)
FC (bm
-1
)
Resultados
45
Figura 06: (A) Peso renal direito; e (B) Peso renal esquerdo, de ratas FICT, 2R/1C,
2R/1C-H. As barras indicam a média±EPM. Letras diferentes indicam diferenças
significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
(A) (B)
0
500
1000
1500
a
b
b
(26)
(28)
(18)
Peso renal direito
(mg)
0
250
500
750
1000
FICT
2R/1C-H
2R/1C
a
b
c
(26)
(28)
(18)
Peso renal esquerdo
(mg)
Resultados
46
Figura 07
:
(A)
Índice renal direito; e
(B)
Índice renal esquerdo, de ratas FICT, 2R/1C,
2R/1C-H. As barras indicam a média
±
EPM. Letras diferentes indicam diferenças
significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
(A)
(B)
0
1
2
3
4
5
a
b
b
(26)
(28)
(18)
Índice renal direito
(mg/g peso corporal)
0
1
2
3
4
FICT
2R/1C
2R/1C-H
a
b
c
(26)
(28)
(18)
Índice renal esquerdo
(mg/g peso corporal)
Resultados
47
EXPERIMENTO I
Figura 08
:
(A)
Tempo em dias (média
±
EPM) para o retorno a mudanças consecutivas
nas fases do ciclo estral, após cirurgia, em ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H; e
(B)
Percentual de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H que retornaram ao ciclo estral regular após
15 dias da intervenção cirúrgica. Letras diferentes se referem à diferenças significativas,
p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
(A) (B)
0
5
10
15
a
b
c
(26)
(28)
(18)
Tempo em dias para retornar
à mudanças nas fases do ciclo
estral
0
25
50
75
100
(26)
(28)
(18)
2R/1C
FICT
2R/1C-H
Percentual de ratas que
apresentavam ciclo regular
(15 dias após cirurgia)
Resultados
48
Figura 09
:
(A)
Número de lordoses em 15 minutos (média
±
EPM), apresentado por ratas
FICT, 2R/1C e 2R/1C-H, em proestro, quando testadas com machos sexualmente ativos.
(B)
Número de montas do macho em 15 minutos (média
±
EPM) quando testados com
fêmeas FICT, 2R/1C e 2R/1C-H, em proestro. As barras indicam a média
±
EPM. Letras
diferentes indicam diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de
Newman-Keuls).
(A) (B)
0
10
20
30
a
a,b
b
(16)
(16)
(08)
Freqüência de Lordose
0
10
20
30
40
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(16)
(16)
(08)
Freqüência de monta
Resultados
49
Figura 10
: Quociente de lordose (média
±
EPM) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, em
proestro, quando testadas com machos sexualmente ativos. Letras diferentes indicam
diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
FICT
2R/1C
2R/1C-H
a
b
a,b
(16)
(16)
(08)
Quociente de lordose
Resultados
50
Figura 11
:
(A)
Média
±
EPM da freqüência de locomoção; e
(B)
Média
±
EPM do
percentual da duração de locomoção durante 15 minutos, apresentado por ratas FICT,
2R/1C, 2R/1C-H, em proestro, durante o registro do comportamento sexual (ANOVA de
uma via seguida de Newman-Keuls).
(A) (B)
0
100
200
(16)
(16)
(08)
Freqüência de locomoção
0
10
20
30
40
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(16)
(16)
(08)
Percentual de Locomoção
Resultados
51
Figura 12
: Número de óvulos (média
±
EPM) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, na fase
estro. Letras diferentes se referem a diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma
via seguida de Newman-Keuls).
0
5
10
15
FICT
2R/1C
2R/1C-H
a
b
(16)
(16)
(08)
b
Número de óvulos
Resultados
52
EXPERIMENTO II
0
5
10
15
20
25
30
35
40
13 14 15 16 17 18 19 20
Tempo (horas)
Estradiol (pg/mL
)
FICT 2R/1C 2R/1C-H
Figura 13
: Concentração plasmática de estradiol (pg/mL) na tarde do proestro (das
13:00 às 20:00h) em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. p<0,05 (ANOVA de duas vias de
medidas repetidas, seguida de Newman-Keuls).
Resultados
53
Figura 14
: Média
±
EPM da área abaixo da curva das concentrações plasmáticas de
estradiol durante a tarde do proestro (das 13:00 às 20:00h) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-
H. p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
0
100
200
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(10)
(12)
(10)
Área abaixo da curva
Estradiol (pg/mL x h)
Resultados
54
0
5
10
15
20
13 14 15 16 17 18 19 20
Tempo (horas)
LH (ng/mL
)
FICT 2R/1C 2R/1C-H
*
Figura 15
:
(A)
Concentração plasmática de LH (ng/mL) na tarde do proestro (das 13:00
às 20:00h) em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. * indica diferenças significativas, p<0,05
(ANOVA de duas vias de medidas repetidas, seguida de Newman-Keuls).
Resultados
55
Figura 16
: Média
±
EPM da área abaixo da curva das concentrações plasmáticas de LH
durante a tarde do proestro (das 13:00 às 20:00h) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H.
p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
0
25
50
75
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(10)
(12)
(10)
Área abaixo da curva
LH (ng/mL x h)
Resultados
56
0
2
4
6
8
10
12
14
13 14 15 16 17 18 19 20
Tempo (horas)
FSH (ng/mL
)
FICT 2R/1C 2R/1C-H
Figura 17: (A) Concentração plasmática de FSH (ng/mL) na tarde do proestro (das
13:00 às 20:00h) em ratas FICT, 2R/1C, e 2R/1C-H. p<0,05 (ANOVA de duas vias de
medidas repetidas, seguida de Newman-Keuls).
Resultados
57
Figura 18: Média
±
EPM da área abaixo da curva das concentrações plasmáticas de
FSH durante a tarde do proestro (13:00 às 20:00h) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H.
p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls).
0
10
20
30
40
50
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(10)
(12)
(10)
Área abaixo da curva
FSH (ng/mL x h)
Resultados
58
Figura 19: (A) Peso do ovário direito; e (B) Peso do ovário esquerdo (média
±
EPM), de
ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, na fase estro. p<0,05 (ANOVA de uma via seguida de
Newman-Keuls).
(A)
(B)
0
25
50
75
(10)
(12)
(10)
Peso ovário direito
(mg)
0
25
50
75
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(10)
(12)
(10)
Peso ovário esquerdo
(mg)
Resultados
59
Figura 20: Número de óvulos (média
±
EPM) de ratas FICT, 2R/1C, 2R/1C-H, na fase
estro. Letras diferentes se referem a diferenças significativas, p<0,05 (ANOVA de uma
via seguida de Newman-Keuls).
0
5
10
15
FICT
2R/1C
2R/1C-H
(10)
(12)
(10)
a
b
b
Número de óvulos
DISCUSSÃO
Discussão
61
O presente estudo teve por objetivo verificar a função reprodutiva em ratas
submetidas ao clampeamento da artéria renal esquerda modelo 2R/1C. Nossos resultados
mostraram que o clampeamento da artéria renal e a elevação da pressão arterial em
fêmeas é acompanhada por redução na receptividade sexual, menor número de óvulos,
alterações na regularidade das mudanças de fases do ciclo estral e menor percentual de
animais que retornam ao ciclo estral regular após a cirurgia. As alterações sobre a função
reprodutiva na rata hipertensa, não são acompanhadas por modificações na secreção de
estradiol, bem como de FSH na tarde do proestro. É necessário ressaltar que na ovulação
ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentaram prejuízos semelhantes, conforme pode ser
verificado no experimento I (Figura: 12) e confirmado no experimento II (Figura: 20).
Para melhor abordagem dos parâmetros avaliados em nosso estudo dividimos a
discussão em tópicos.
1. Hipertensão renovascular
A aplicação do clipe na artéria renal esquerda, em nosso estudo, levou à
hipertensão, em parte dos animais, como comprovado por meio do aumento da PAS, FC,
redução do peso e índice renal esquerdo e aumento do peso e índice renal direito.
Discussão
62
A redução no índice renal esquerdo indica hipotrofia devido à redução do fluxo
sanguíneo para o rim esquerdo, em contraposição o aumento no índice renal direito
indica hipertrofia deste rim devido à compensação nos processos de filtração renal
(OKUNIEWSKI et al., 1998).
Neste estudo, foi observado que cerca de 55% dos animais selecionados para o
experimento apresentaram hipertensão, resultado que está de acordo com a literatura
(OKUNIEWSKI et al., 1998). Pelo fato de que 45% das ratas clipadas não
desenvolveram hipertensão, resolvemos avaliar a função reprodutiva nestes animais
também, já que há poucos estudos em ratas que foram submetidas ao modelo 2R/1C, e
foi demonstrado que o sucesso de desenvolvimento de hipertensão renovascular, em
fêmeas, é muito menor do que em machos (OKUNIEWSKI et al., 1998).
Apesar de obtermos um menor percentual de animais que desenvolveram
hipertensão, quando comparado a machos submetidos ao modelo 2R/1C
(OKUNIEWSKI et al., 1998), as ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentaram resposta renal
semelhante, como demonstrado pelo menor índice renal esquerdo (Figura: 07B), que não
foi decorrente da relação peso renal/ peso corporal, pois ambos grupos apresentaram
peso corporal semelhante entre si, e quando comparado ao grupo FICT (Figura: 04).
Sabe-se que a Ang II no rim produz vasoconstrição nas arteríolas aferente e eferente,
reduzindo a pressão capilar glomerular, e desta forma, diminuindo filtração glomerular e
fluxo sangüíneo renal, e que em paralelo pode ocorrer a estimulação da secreção de
contrarreguladores, como óxido nítrico e prostaglandinas (ARIMA, 2003). Portanto, no
caso das ratas 2R/1C a secreção de contrarreguladores pode ter sido mais acentuada que
nas ratas 2R/1C-H, impedindo que a elevação de Ang II expressasse ações renais como
Discussão
63
por exemplo, maior reabsorção de sódio e retenção de líquido (NAVAR et al., 1998) e
assim, contribuição para o aumento da pressão arterial sistêmica. É claro que a hipótese
de que uma completa oclusão da artéria renal possa ser o determinante do insucesso do
desenvolvimento da hipertensão nestes animais, também não pode ser descartado.
Porém, em nossos resultados, o peso renal esquerdo e índice renal esquerdo em ratas
2R/1C (Figuras: 06B e 07B) foram maiores em relação às 2R/1C-H, o que sugere
também, que nesses animais, a completa oclusão da artéria renal esquerda não tenha
ocorrido. Além disso, é importante ressaltar com base no resultado do maior peso renal
esquerdo dos animais 2R/1C em relação aos 2R/1C-H, que a redução no fluxo sangüíneo
para o rim esquerdo possa não ter sido a necessária ou suficiente por todo o
experimento, para que ocorresse secreção de renina, e conseqüente aumento da Ang II
circulante, e desta forma determinando o insucesso de desenvolvimento da hipertensão
nestes animais.
2. Ciclo Estral
Ratas clampeadas apresentaram um tempo maior em dias para retornar as
mudanças nas fases do ciclo estral, sendo que o grupo 2R/1C-H apresentou um tempo
maior para retomar as mudanças nas fases do ciclo quando comparado ao grupo 2R/1C,
e também um maior percentual de ratas que não retornaram a ciclar regular após a
cirurgia (Figuras: 08A e 08B).
Os estudos da função reprodutiva em ratas hipertensas são escassos.
OKUNIEWSKI et al. (1998), em seus experimentos, verificaram que o esfregaço
Discussão
64
vaginal de ratas submetidas ao modelo 2R/1C não se apresentava uniforme, e portanto
sugeriram que estes animais ciclavam regularmente. Mas, em nosso trabalho
demonstramos que, após a cirurgia, ratas clipadas apresentam um retardo para retornar a
mudanças nas fases do ciclo estral, e um menor percentual de ratas 2R/1C-H que
retornam a ciclar regularmente após a cirurgia (Figura: 08). Como ratas do grupo FICT
retornaram em poucos dias às mudanças nas fases do ciclo e ao ciclo regular, sugerimos
desta forma que distúrbios não relacionados ao estresse da cirurgia afetam o ciclo estral
em ratas clipadas. Possivelmente, a elevação gradual de Ang II e instalação da
hipertensão em ratas clipadas poderiam estar afetando a regularidade do ciclo nestes
animais.
O envolvimento do SNC em regular a secreção da hipófise anterior, estimulando a
expressão de comportamentos reprodutivos e monitorando as aferências sensoriais do
meio ambiente faz do ciclo um processo neuroendócrino (SCHWARTZ, 2000). Durante
o ciclo estral as secreções ovarianas variam (SMITH; FREEMAN; NEILL, 1975) e
preparam o trato reprodutivo para receber o óvulo (FREEMAN, 1994; SCHWARTZ,
2000). É possível que a elevação da concentração de Ang II circulante nas ratas
clampeadas possa estar promovendo uma alteração na relação receptores AT
1
/AT
2
no
ovário, e assim resultando em alterações no ciclo estral. GOOYER et al. (2004) ao
verificarem o desenvolvimento folicular em ratas hipertensas transgênicas (mRen-2)27,
as quais exibem elevadas concentrações séricas de pró-renina, e renina extra-renal e
angiotensina I em sítios que normalmente se caracterizam por expressar baixas
quantidades destes, e em ratas
Sprague-Dawley
que sofreram infusão de Ang II por 12-
14 dias, evidenciaram redução da expressão do RNAm para o receptor AT
1A
e nenhuma
Discussão
65
modificação para o receptor AT
2
nestes animais. Desta forma, a maior disponibilidade
de receptores AT
2
no ovário poderia ser a responsável pela menor secreção de estradiol,
já que o receptor AT
2
está envolvido na redução da secreção ovariana deste hormônio
(KOTANI et al., 1999), e portanto, faria com que as ratas 2R/1C-H e 2R/1C
permanecessem nos primeiros dias após a cirurgia, persistentemente em diestro, fase
onde verifica-se baixas concentrações de esteróides gonadais e de gonadotrofinas
(BUTCHER; COLLINS; FUGO et al., 1974; SMITH; FREEMAN; NEILL, 1975;
FREEMANN, 1994). Contrariamente, conforme verificado em nosso estudo, no perfil
hormonal obtido na tarde do proestro em ratas clipadas e FICT, distúrbios relativos ao
ciclo estral não se deve a alterações na esteroidogênese ovariana, já que os animais
2R/1C não apresentaram modificação no perfil de secreção para o estradiol na tarde do
proestro. Mas, estes resultados foram obtidos de ratas 2R/1C-H e 2R/1C que já
apresentavam mudanças nas fases do ciclo estral, e não de ratas que estavam sem ciclar,
portanto, estudos futuros analisando a concentração plasmática de estradiol num período
mais curto após a cirurgia, poderão confirmar a hipótese anteriormente citada.
Ao avaliarmos as concentrações de LH e FSH na tarde do proestro em ratas
2R/1C-H e 2R/1C, verificamos que a concentração plasmática de LH no grupo
hipertenso, às 16:00h, encontrava-se menor em relação aos demais grupos, porém, o
conteúdo total de LH na tarde do proestro (Figura; 16) não foi alterado.
Fisiologicamente, o pico de LH nos animais 2R/1C-H parece ter um atraso em relação
aos demais grupos, sendo verificado às 18:00h, enquanto nos animais FICT e 2R/1C é
observado às 17:00h. Já o padrão da concentração plasmática de FSH foi semelhante
entre os grupos estudados (Figura: 17).
Discussão
66
Sabe-se que a elevação plasmática de LH no proestro é fundamental para os
eventos que culminarão com a ovulação (SCHWARTZ, 2000). O pico pré-ovulatório de
LH depende da secreção de LHRH do hipotálamo, processo este, que por sua vez
depende da retroalimentação positiva do estradiol e sinais neurais que iniciam a elevação
plasmática de gonadotrofinas (LEVINE, 1997). A Ang II central está envolvida no
controle da secreção de LH (STEELE et al., 1981; STEELE & GANONG, 1986;
PHILLIPS et al., 1993; GHAZI et al., 1994). Evidências experimentais indicam que há
elevação nas concentrações de Ang II cerebrais já na quarta semana após colocação do
clipe na artéria renal (MORISHITA et al., 1993). Assim, mesmo sendo evidenciado que
nos horários estudados o conteúdo total de estradiol, FSH e LH na tarde do proestro não
encontram-se alterados, não podemos descartar que as mudanças nas concentrações de
Ang II, neste modelo experimental, podem estar levando a um distúrbio no eixo
hipotálamo-hipófise-gônadas, principalmente nos primeiros dias após a cirurgia
interferindo no perfil hormonal em ratas clipadas, e portanto no ciclo estral.
3. Comportamento Sexual
Na noite do proestro, as ratas apresentam receptividade sexual decorrente do
aumento de estradiol e progesterona que atuam em estruturas do SNC (PFAFF;
VASUDEVAN; ATTARDI, 2000). Em nosso trabalho, ratas hipertensas em proestro
apresentaram redução no quociente de lordose, efeito que não é decorrente de problemas
motores nestes animais, pois a freqüência e a duração de locomoção durante o registro
dos parâmetros comportamentais não foram alteradas (Figura: 11A e 11B). Além disso,
Discussão
67
a redução da lordose em ratas não se deve a problemas na esteroidogênese ovariana, já
que nossas ratas não apresentaram alteração no perfil de secreção para o estradiol na
tarde do proestro (Figura: 13).
BREIGEIRON (2005) verificou que em ratos com hipertensão renovascular há
uma redução da freqüência de monta com intromissão, prolongada latência para iniciar a
monta com intromissão, longos intervalos entre monta com intromissão e ejaculação e
aumento da duração do intervalo pós-ejaculatório, com diminuição do número de
animais que ejaculam e que retomam a atividade sexual após a ejaculação, quando
comparados aos ratos do grupo FICT.
Diversos estudos epidemiológicos com mulheres e homens demonstraram que
pacientes hipertensos apresentam disfunção sexual (LEWIS et al., 1998; DUNCAN et
al., 2000; MOREIRA et al., 2001; FERRARIO & LEVY, 2002; SASAYAMA et al.,
2003; FOGARI et al., 2004). No presente estudo, nas fêmeas com hipertensão
renovascular, um possível efeito inibitório direto e indireto da Ang II no MeA, APOM,
VMH, e PAG, regiões que são importantes para o comportamento de lordose em ratas
(RAJENDREN; DUDLEY; MOSS, 1991; RAJENDREN & MOSS, 1993;
BEHBEHANI, 1995; PFAFF; VASUDEVAN; ATTARDI, 2000), pode ser o fator que
esteja reduzindo a receptividade nestes animais.
A Ang II é reconhecida como um fator importante na patogênese da hipertensão
experimental e clínica (DeFORREST et al., 1982; MARTINEZ-MALDONADO, 1991;
NISHIMURA et al., 1992; KAGIYAMA et al., 2001). O modelo de hipertensão
renovascular é caracterizado por apresentar elevadas concentrações plasmáticas de Ang
II (RUCKIZA & LEENEN, 1994), e já na quarta semana após a estenose da artéria renal
Discussão
68
a Ang II central apresenta-se elevada (MORISHITA et al., 1993). Estudos evidenciaram
que microinjeções icv de Ang II inibem o comportamento sexual em machos (CLARK,
1989) sendo este efeito mediado pelo receptor AT
1
(CLARK & KEATON, 1998).
Também, microinjeções de Ang II no núcleo MeA diminuem o comportamento sexual
em ratos machos (BREIGEIRON et al., 2002) e fêmeas (CECCONELLO, 2005).
Além do possível efeito inibitório da elevação da concentração da Ang II central
sobre o comportamento sexual na rata hipertensa, especulamos uma provável ação
inibitória da Ang II periférica sobre o reflexo de lordose na rata hipertensa, com base nas
seguintes evidências: a) o órgão subfornicial (SFO) - órgão circunventricular - possui
receptores para Ang II circulante (LENKEI et al., 1997); b) o SFO envia projeções para
o núcleo pré-óptico mediano (MnPO) (KOLAJ; BAI; RENAUD, 2004), que também é
ricamente inervado por terminações nervosas imunorreativas à Ang II, cujas aferências
provém do SFO (LIND; SWANSON; GANTEN, 1985). O MnPO está relacionado com
o controle da ingesta hídrica, cardiovascular (LENKEI et al., 1997), e função
reprodutiva (BHAT et al., 1995); c) o MnPO envia eferências para o núcleo
paraventricular (PVN) (TANAKA et al., 1993a; STOCKER & TONEY, 2005); d) além
disso, o SFO em resposta à Ang II também apresenta projeções diretas para o PVN
(TANAKA et al., 1985). Sugerimos portanto, que a Ang II periférica elevada, que
caracteriza o modelo de hipertensão renovascular usado em nosso trabalho, através das
duas vias citadas acima, não somente contribua para o controle da ingesta hídrica e
cardiovascular, como está bem estabelecido (TANAKA et al., 1993a; TANAKA &
NOMURA, 1993; TANAKA et al., 1993b; STOCKER & TONEY, 2005), mas que
possa estar envolvida na redução do comportamento de lordose, pelo fato de se saber
Discussão
69
que: a) existem projeções do PVN para o núcleo MeA (OLMOS; BELTRAMINO;
ALHEID, 2004); b) o núcleo MeA é importante no comportamento sexual da rata, por
enviar eferências tanto para a APOM quanto VMH (CANTERAS; SIMERLY;
SWANSON, 1995), e sua ativação não só estimula o VMH (SAKUMA & PFAFF,
1982), como também promove a lordose (MASCÓ & CARRER, 1980); c) e que
segundo SWANSON & PETROVICH (1998) o núcleo MeA possui neurônios
gabaérgicos, sugerindo que suas eferências são predominantemente gabaérgicas. Desta
forma, Ang II elevada ativando esta circuitaría, poderia estar aumentando as saídas
inibitórias do núcleo MeA para a APOM, reduzindo portanto, a lordose na rata
hipertensa, mesmo sob concentrações adequadas de estradiol como pode ser verificado
no perfil plasmático na tarde do proestro para este hormônio nos animais 2R/1C-H.
A APOM é uma região importante no comportamento sexual da rata (KATO &
SAKUMA, 2000), participa na inibição tônica da lordose (TAKEO; CHIBA; SAKUMA,
1993) quando há baixas concentrações de estrógeno, enviando projeções inibitórias para
a PAG e área tegmental ventral do mesencéfalo (ARENDASH & GORSKI, 1983;
HASEGAWA et al., 1991; SAKUMA, 1994). É possível que um efeito inibitório do
núcleo MeA sobre a resposta sexual, seja dado por neurônios gabaérgicos do núcleo
MeA, que fazem sinapse com neurônios da APOM, impedindo-os de responderem ao
estrógeno (SAKUMA, 1994).
Por outro lado, a redução do comportamento sexual em machos com hipertensão
renovascular tratados com nifedipina que normaliza a pressão arterial, mas não interfere
nas concentrações plasmáticas de Ang II, apresentam um padrão normal de
comportamento sexual (BREIGEIRON, 2005). Assim, efeitos da pressão arterial
Discussão
70
sistêmica sobre o comportamento sexual, e não do aumento da Ang II, não podem ser
descartados como os responsáveis pela redução do comportamento de receptividade na
rata submetida ao clampeamento da artéria renal. A PAG, região do mesencéfalo em
torno do aqueduto cerebral, cuja estimulação diretamente ativa neurônios que se
projetam para medula espinhal, ativando motoneurônios dos músculos dorsais
responsáveis pela lordose, também está envolvida no controle autonômico
(BEHBEHANI, 1995). Segundo BEHBEHANI (1995) existe uma integração das
funções da PAG, dentre elas interação das regiões envolvidas com o comportamento de
lordose e regulação autonômica. Portanto, a proximidade das áreas envolvidas no
controle cardiovascular e comportamento sexual na rata, pode na hipertensão levar à
ruptura na execução apropriada do comportamento sexual.
4. Ovulação
Nossos resultados demonstraram que ratas 2R/1C-H e 2R/1C apresentam uma
redução no número de óvulos. Apesar de haver poucos dados na literatura que
verificaram a ovulação em ratas hipertensas, nossos resultados corroboram com os de
HASHIMOTO & KIMURA (1989), os quais verificaram que ratas espontaneamente
hipertensas apresentam menor número de óvulos quando comparado a ratas
Wistar-
Kyoto.
Sabe-se que o aumento no LH plasmático no proestro é o evento chave para que
ocorra a ovulação. O LH promove retorno da meiose do ovócito e enfraquece a parede
de células em torno dos folículos permitindo expansão deste, e finalmente, a ovulação
Discussão
71
(SCHWARTZ, 2000). Em nosso trabalho a redução do número de óvulos em ratas
2R/1C-H não foi relacionada à alteração no conteúdo total de LH na tarde do proestro,
porém houve uma alteração no perfil de secreção para LH, sendo evidenciada uma
menor concentração plasmática de LH às 16:00h em relação aos demais grupos, e que
assim como verificado por HASHIMOTO E KIMURA (1989) em ratas
espontaneamente hipertensas, o pico plasmático de LH parece apresentar um atraso em
relação às ratas FICT e 2R/1C. Esta modificação do perfil plasmático de LH, associada
aos valores normais de estradiol, indica um possível efeito central da Ang II e/ou dos
mecanismos de regulação da pressão sobre a secreção de LH, que poderiam estar
contribuindo para a redução do número de óvulos em ratas 2R/1C-H.
A redução do número de óvulos em ratas 2R/1C-H, verificada neste estudo,
também pode ser associada à elevação da concentração de Ang II circulante que
caracteriza este modelo (RUZICKA & LEENEN, 1994; NAVAR et al., 1998), pois, em
ratas hipertensas transgênicas (mRen-2)27, e em ratas
Sprague-Dawley
que foram
submetidas à infusão com Ang II por 12-14 dias, ocorre uma redução no número de
folículos antrais grandes e folículos pré-ovulatórios (GOOYER et al., 2004), e além
disso como já mencionado, verifica-se redução da expressão do RNAm para o receptor
AT
1A
no ovário, sem alteração para o receptor AT
2
(GOOYER et al., 2004). O receptor
AT
1A
está envolvido com crescimento celular e propriedades angiogênicas da Ang II
(CHUNG et al., 1998). Pode ser que nestes sítios a Ang II influencie processos como
fluxo sangüíneo, vascularização, crescimento dos folículos via AT
1A
(GOOYER et al.,
2004). Por outro lado, o AT
2
está envolvido com apoptose, e formação de folículos
atrésicos (SPETH; DAUBERT; GROVE, 1999; KOTANI et al., 1999). Portanto, a
Discussão
72
elevação na concentração plasmática de Ang II no modelo de hipertensão utilizado em
nosso estudo, pode também estar resultando numa menor razão receptor AT
1
/AT
2
no
ovário, o que levaria a redução na maturação folicular, menor número de folículos pré-
ovulatórios, e conseqüentemente menor número de óvulos liberados. Assim, a redução
da ovulação em ratas 2R/1C-H, mesmo apresentando conteúdo total de LH e FSH
normal na tarde do proestro, quando comparado ao grupo FICT, pode ser devido a
problemas no ovário, possivelmente quanto à relação receptor AT
1
/AT
2
, que resultaria
em uma maior formação de folículos atrésicos.
É necessário ressaltar que um dos determinantes da redução do número de óvulos
nas ratas 2R/1C-H pode ser a possível ruptura na integridade do SRA ovariano nestes
animais, já que este sistema é importante para a ovulação (PELLICER et al., 1988;
YOSHIMURA et al., 1992; SAHIN et al., 1997) e esteroidogênese (BUMPUS et al.,
1988). Como verificado por GOOYER et al. (2004), a infusão de Ang II por 12-14 dias
em ratas promove redução da concentração de renina ovariana, o que se refere ao
clássico
feedback
negativo da Ang II sobre a secreção de renina, como por exemplo a
ação da Ang II via AT
1
reduzindo a secreção de renina renal (MATSUSAKA &
ICHIKAWA, 1997). Sugerimos que nos animais 2R/1C-H, este mecanismo de
feedback
negativo sobre a renina ovariana esteja acontecendo, e desta forma, menor produção de
Ang II no micromeio do ovário e conseqüentemente redução da ovulação.
Outro aspecto importante a considerar, quanto à redução do número de óvulos, é
que em nosso trabalho o perfil de secreção para o FSH na tarde do proestro para ratas
2R/1C-H não foi alterado (Figura: 17). Este resultado corrobora com a possibilidade de
que alterações quanto à ação do FSH e à ligação do LH a seus receptores no ovário,
Discussão
73
pode estar reduzindo a ovulação nas ratas hipertensas, pois o FSH induz a maturação
folicular elevando o conteúdo de receptores para LH (FINK, 2000; SCHWARTZ,
2000). Os folículos pré-ovulatórios apresentando aumento nos níveis de receptores para
LH estão aptos a ser liberados (KOTANI et al., 1999) em resposta ao pico de LH que
ocorre na tarde do proestro (BUTCHER; COLLINS; FUGO et al., 1974; SMITH;
FREEMAN; NEILL, 1975; FREEMANN, 1994). Como verificaram KOTANI et al.
(1999) a cultura de células da granulosa na presença de FSH (50 ng/mL) e Ang II
(100nM) de ratas tratadas com
diethylstilbestrol
, reduziu o aumento da ligação de
125
I-
gonadotrofina coriônica humana ao receptor de LH, e esta supressão do efeito do FSH,
foi revertida pelo antagonista do receptor AT
2
, PD-123319.
Outra ação possível que contribuiria para a redução do número de óvulos nos
animais 2R/1C-H, seria a diminuição do fluxo sangüíneo para o ovário. Nosso modelo
de hipertensão caracteriza-se pela elevação da Ang II, potente peptídeo vasoconstritor
(FITZSIMONS, 1998). Sabe-se que na hipertensão a elevação da pressão arterial é
sustentada por várias ações dentre elas vasoconstrição arteriolar (RUZICKA &
LEENEN, 1994; NAVAR et al., 1998). A vasoconstrição nas artérias do ovário pode
estar afetando o fluxo sangüíneo ovariano e assim em déficit do número de óvulos
liberados, pois como sugerido por ACOSTA & MIYAMOTO (2004), no ovário o
aumento do fluxo sangüíneo para a camada de células em torno dos folículos ovulatórios
pode participar no aumento do suprimento de gonadotrofinas, nutrientes, hormônios e
outros componentes sangüíneos importantes para a ovulação.
Com relação à redução do número de óvulos no grupo 2R/1C, sugerimos que a
redução do fluxo sangüíneo renal devido a colocação do clipe, e aumento da secreção de
Discussão
74
renina e conseqüente elevação da concentração plasmática de Ang II nos primeiros dias
após a cirurgia, pode ter resultados que se verificam a longo prazo, já que
fisiologicamente a redução do número de óvulos é mais acentuada nas 2R/1C-H,
enquanto as 2R/1C parecem estar num período de restabelecimento à valores normais.
Esta redução no número de óvulos nos animais 2R/1C possibilita especular que a
redução do fluxo sangüíneo, e nível sistêmico de pressão arterial podem não estar
diminuindo a ovulação nos animais hipertensos, e sim que este desfecho sobre a
ovulação possa ser dependente da concentração de Ang II.
Nossos resultados demonstram que a hipertensão renovascular está relacionada
com disfunção sexual em fêmeas, e que esta pode ser decorrente da concentração de Ang
II circulante e/ou da elevação da pressão arterial sistêmica. Cabe salientar a necessidade
de estudos complementares que verifique o desenvolvimento folicular em ratas que
foram submetidas ao clampeamento da artéria renal e que desenvolveram ou não
hipertensão. Além disso, avaliar as concentrações plasmáticas de FSH na madrugada do
estro, assim como a quantificação da concentração plasmática e central de Ang II, renina
plasmática e ovariana. Esses dados futuros contribuiriam para responder, em parte, o
porquê de ratas 2R/1C-H apresentarem redução na capacidade reprodutiva, e dos
animais 2R/1C-H e 2R/1C apresentarem semelhanças nos parâmetros: regularidade do
ciclo estral e ovulação.
CONCLUSÕES
Conclusões
76
A interpretação dos resultados deste trabalho encaminham para as seguintes
conclusões:
•
A implantação do clipe na artéria renal esquerda desenvolveu hipertensão
em 55% das ratas.
•
A hipertensão renovascular reduz a capacidade reprodutiva de fêmeas,
como verificado pela redução do número de ratas que ciclam regularmente,
diminuição do comportamento de lordose e ovulação.
•
Há prejuízos semelhantes com relação à regularidade do ciclo estral e
ovulação em ratas 2R/1C-H e 2R/1C, porém fisiologicamente os animais
2R/1C parecem estar retornando a regularidade dos parâmetros acima
citados.
•
Os prejuízos sobre a função reprodutiva nas ratas clipadas não se deve à
alteração na esteroidogênese ovariana e secreção de FSH na tarde do
proestro.
Conclusões
77
•
A Ang II e/ou o estado hipertensivo, pode estar mediando muitas das
alterações comportamentais, endócrinas e vasculares importantes no
processo reprodutivo.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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