( PDF ) A expressão e a atividade da bomba MRP1/GS-X e de proteínas de choque térmico (HSP70) no miocárdio e gastrocnêmio de ratos adaptados a uma semana de natação

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Departamento de Fisiologia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia

A Expressão e a Atividade da Bomba MRP1/GS-X e de Proteínas de Choque

Térmico (HSP70) no Miocárdio e Gastrocnêmio de Ratos Adaptados a Uma

Semana de Natação: Possível Mecanismo de Citoproteção Induzido pelo

Exercício

Contra os Efeitos do Estresse Oxidativo

Dissertação de Mestrado

Mauricio da Silva Krause

Porto Alegre, 2005

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Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Instituto de Ciências Básicas da Saúde

Departamento de Fisiologia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia

A Expressão e a Atividade da Bomba MRP1/GS-X e de Proteínas de Choque Térmico

(HSP70) no Miocárdio e Gastrocnêmio de Ratos Adaptados a Uma Semana de Natação:

Possível Mecanismo de Citoproteção Induzido pelo Exercício

Contra os Efeitos do Estresse Oxidativo

Mauricio da Silva Krause

Orientador: Dr. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Júnior

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia, do

Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito

parcial para a obtenção do título de mestre.

Porto Alegre, 2005

A Expressão e a Atividade da Bomba MRP1/GS-X e de Proteínas de Choque

Térmico (HSP70) no Miocárdio e Gastrocnêmio de Ratos Adaptados a Uma

Semana de Natação: Possível Mecanismo de Citoproteção Induzido pelo

Exercício

Contra os Efeitos do Estresse Oxidativo

Mauricio da Silva Krause

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas –

Fisiologia, do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, como requisito parcial para a obtenção do título de mestre.

Orientador: ________________________________________________

Dr. Paulo Ivo Homem de Bittencourt Júnior

Comissão Examinadora: __________________________________________

Profa. Dra. Tânia Cristina Pithon Curi (USP/Unimep/Unicastelo)

__________________________________________

Profa. Dra. Maria Cláudia Costa Irigoyen (Fisiologia-UFRGS)

__________________________________________

Profa. Dr. Álvaro ReischaK de Oliveira (ESEF-UFRGS)

“Com efeito, é possível que nenhum de nós saiba nada

de importante; só que ele pensa que sabe, embora não

saiba; ao passo que eu, se nada sei, também não

considero que sei. Em suma, parece-me que sou um

pouco mais sábio do que ele, quanto mais não seja pelo

fato de não considerar saber aquilo que não sei”.

Sócrates

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, pela formação do meu caráter, amizade, amor e apoio

incondicional, sem o qual não teria sido possível a realização dos meus projetos de

vida.

A minha namorada, Josianne, pela paciência em tolerar minhas obsessões

profissionais, amor e companheirismo.

Aos meus irmãos pelos momentos de alegria e bom humor.

Ao meu orientador e amigo Paulo Ivo, pela oportunidade, atenção, apoio e

confiança, bem como pelas calorosas discussões sobre fisiologia e bioquímica.

Aos meus colegas de laboratório, dos quais sempre pude contar com a boa

vontade e paciência. Pelas eternas, mas sempre divertidas, madrugadas no

laboratório de fisiologia celular.

Aos professores e funcionários do departamento de fisiologia e ao pessoal da

segurança do ICBS.

Ao CNPq pelo apoio financeiro, sem o qual não seria possível a realização

deste projeto.

Aos colegas de pós-graduação pelas prazerosas horas de estudos e

discussões.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS....................................................................................................9

LISTA DE TABELAS..................................................................................................10

LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................11

RESUMO....................................................................................................................12

ABSTRACT................................................................................................................13

INTRODUÇÃO............................................................................................................14

1.1Objetivos................................................................................................................15

1.2 Objetivo Principal..................................................................................................15

1.3 Objetivos Específicos............................................................................................16

1.4 Estratégia Experimental........................................................................................16

1.5 Justificativa e Impacto Social ...............................................................................16

REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................16

2.1 Estresse, proteínas de choque térmico e citoproteção.........................................18

2.2 Heat shock factors e a regulação da resposta do choque térmico......................21

2.3 Papel citoprotetor das HSP...................................................................................24

2.4 Outras Chaperonas...............................................................................................25

2.4.1 Pequenas...........................................................................................................25

2.4.2 HSP60................................................................................................................26

2.4.3 HSP90................................................................................................................27

2.5 Radicais Livres, estresse oxidativo e exercício.....................................................27

2.6 NO, HSP e proteção contra injúria tecidual..........................................................34

2.7 HSP e Citoproteção no Miocárdio......... ..............................................................38

2.8 Regulação da expressão de HSP70 no miocárdio durante o exercício...............40

2.9 Músculo esquelético, exercício e expressão de HSP..........................................46

2.10 Músculo esquelético, treinamento físico e expressão de HSP...........................52

2.11 Bomba GS-X......................................................................................................53

2.12 Metabolismo da Glutationa e a Bomba GS-X....................................................54

2.13 Proteínas Multidroga resistentes........................................................................58

2.14 A Famílias das MRP`s.......................................................................................60

2.15 Substratos e Propriedades Cinéticas.................................................................64

2.16 Liberação de Glutationa por diferentes isoformas de MRP................................65

2.17 Função da MRP na defesa contra o Estresse Oxidativo....................................66

2.18 Regulação dos Genes da MRP..........................................................................67

METODOLOGIA........................................................................................................70

3.1 Animais................................................................................................................70

3.2 Exercício..............................................................................................................70

3.3 Treinamento.........................................................................................................71

3.4 Grupos experimentais..........................................................................................71

3.5 Preparações e determinações bioquímicas realizadas.......................................71

3.6 Determinação do conteúdo intracelular de GSH (glutationa reduzida) e GSSG

(dissulfeto de glutationa ou glutationa oxidada).........................................................72

3.7 Expressão de proteínas de choque térmico (HSP) e análises por SDS-PAGE....75

3.8 Expressão de MRP1 e análises por SDS-PAGE.................................................77

3.9 Cálculo das concentrações de proteínas nas amostras analisadas.....................78

3.10 Medida da atividade da ATPase de GSH (Bomba GS-X) em membranas de

músculo cardíaco e gastrocnêmio..............................................................................79

3.11 Análise estatística..............................................................................................84

4. RESULTADOS.......................................................................................................85

4.1 Metabolismo da glutationa no miocárdio de ratos submetidos ao exercício agudo

de natação..................................................................................................................85

4.2 Metabolismo da glutationa no miocárdio de ratos submetidos ao exercício agudo

após treinamento de natação.....................................................................................89

4.3 Variações no metabolismo da glutationa no miocárdio entre animais submetidos

ao exercício agudo e treinados por uma semana......................................................93

4.4 Metabolismo da glutationa no gastrocnêmio de ratos submetidos ao exercício

agudo de natação.......................................................................................................97

4.5 Metabolismo da glutationa no gastrocnêmio de ratos submetidos ao exercício

agudo após treinamento de natação.........................................................................101

4.6 Variações no metabolismo da glutationa no gastrocnêmio entre animais

submetidos ao exercício agudo e treinados por uma semana..................................105

4.7 Atividade da Bomba MRP1/GS-X no gastrocnêmio e miocárdio de ratos treinados

submetidos a exercício agudo de natação................................................................109

4.8 Expressão de Proteínas de Choque Térmico (HSP70) e da bomba MRP1/GS-X

no miocárdio e gastrocnêmio de ratos sedentários e treinados submetidos a exercício

físico agudo ..............................................................................................................112

6. DISCUSSÃO.........................................................................................................120

5. CONCLUSÕES.....................................................................................................135

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................137

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Revisão dos nomes alternativos para a família das MRP`s........................57

Figura 2. Modelo topológico da estrutura da MRP1 e 5.............................................60

Figura 3. MRP1 e 2 mediando o transporte de GSSG...............................................65

Figura 4. Conteúdo de dissulfeto de glutationa no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação...............................................................................84

Figura 5. Conteúdo de glutationa reduzida no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação...............................................................................85

Figura 6. Relação média de GSSG/GSH no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação...............................................................................86

Figura 7. Conteúdo de dissulfeto de glutationa no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação após treinamento..................................................88

Figura 8. Conteúdo de glutationa reduzida no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação após treinamento..................................................89

Figura 9. Relação média de GSSG/GSH no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação após treinamento..................................................90

Figura 10. Conteúdo médio de glutationa reduzida no miocárdio. Os valores são

expressos como média ± desvio padrão da média. ...................................................92

Figura 11. Conteúdo médio de dissulfeto de glutationa no miocárdio. Os valores são

expressos como média ± desvio padrão da média. ...................................................93

Figura 12. Relação média de GSSG/GSH no miocárdio. Os valores são expressos

como média ± desvio padrão da média......................................................................94

Figura 13. Conteúdo médio de GSSG no gastrocnêmio de ratos submetidos a

exercício agudo de natação. ......................................................................................96

Figura 14. Conteúdo médio de glutationa reduzida no gastrocnêmio de animais

sedentários submetidos ao exercício agudo de natação............................................97

Figura 15. Relação GSSG/GSH média no gastrocnêmio de ratos submetidos ao

exercício agudo de natação........................................................................................98

Figura 16. Conteúdo médio de glutationa reduzida no gastrocnêmio de animais

treinados submetidos ao exercício agudo de natação..............................................100

Figura 17. Conteúdo médio de glutationa oxidada no gastrocnêmio de animais

treinados submetidos ao exercício agudo de natação..............................................101

Figura 18. . Relação GSSG/GSH média no gastrocnêmio de ratos treinados

submetidos ao exercício agudo de natação..............................................................102

Figura 19. Conteúdo médio de dissulfeto de glutationa no gastrocnêmio................104

Figura 20. Conteúdo médio de glutationa reduzida no gastrocnêmio.......................105

Figura 21. Relação média de GSSG/GSH no gastrocnêmio....................................106

Figura 22. Atividade GS-X no miocárdio de ratos treinados.....................................108

Figura 23. Atividade GS-X no gastrocnêmio de ratos treinados...............................109

Figura 24. Expressão de HSP70 em animais sedentários submetidos ao exercício

físico e seus respectivos controles...........................................................................111

Figura 25. Expressão de HSP70 e MRP1 em ratos treinados..................................112

Figura 26. Expressão média de HSP70 no miocárdio de ratos................................114

Tabela 27. Expressão de MRP1 em miocárdio de ratos...........................................115

Figura 28. Expressão de HSP70 em gastrocnêmio de ratos treinados....................116

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Isoformas de MRP. Atividade GS-X, transportadora de drogas e localização

no corpo......................................................................................................................62

Tabela 2. Metabolismo da Glutationa no miocárdio de ratos submetidos a exercício

físico agudo. ...............................................................................................................83

Tabela 3. Metabolismo da Glutationa no miocárdio de ratos submetidos a exercício

físico agudo após treinamento de natação. ...............................................................87

Tabela 4. Metabolismo da Glutationa no gastrocnêmio de ratos submetidos a

exercício físico agudo.................................................................................................95

Tabela 5. Metabolismo da Glutationa no gastrocnêmio de ratos submetidos a

exercício físico agudo após treinamento de natação.................................................99

Tabela 6. Atividade da bomba MRP1/GS-X no gastrocnêmio e miocárdio de ratos

treinados submetidos a exercício agudo de natação................................................107

Tabela 7. Expressão de HSP70 e MRP1 no miocárdio e gastrocnêmio de ratos

treinados...................................................................................................................114

LISTA DE ABREVIATURAS

ROS- Espécies reativas do oxigênio

GPx- Glutationa peroxidase

GSH- Glutationa Reduzida

GSSG- Dissulfeto de Glutationa

GST- Glutationa S-transferase

HSP – Heat shock protein (proteína de choque térmico)

LPO- Lipoperoxidação

MRP – Multi drug resistence protein (Proteína de multirresistência a drogas)

NO- Óxido nítrico

PMSF – Fluoreto de fenil metil sulfonila

Ql- Quimiluminescência

SOD – Superóxido Dismutase

TBA-RS – Substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico

RNS- Espécies reativas do nitrogênio

ROI – Intermediários reativos do oxigênio

RESUMO

A relação entre as concentrações intracelulares de glutationa (GSH) e dissulfeto de

glutationa (GSSG), dita o estado redox celular que, por sua vez, modula a atividade de

muitos genes e proteínas sensíveis às alterações de potencial redox. As proteínas de

choque térmico (HSP) são fundamentais na defesa contra o estresse oxidativo e em

processos de reparo celular. Já a bomba GS-X codificada pelo gene MRP1 pode regular o

estado redox celular exportando dissulfeto de glutationa (GSSG), prevenindo o estresse

oxidativo. Nosso objetivo foi verificar a expressão de HSP70, da bomba MRP1 e sua

atividade, bem como o metabolismo da glutationa (GSH) no miocárdio e gastrocnêmio de

ratos submetidos ao exercício agudo e ao treinamento físico de natação. Ratos machos

Wistar, separados em controle e exercício (n=6; treinamento de uma semana, com carga de

5% do peso corporal na cauda, temperatura da água ± 30°C). Após o exercício os ratos

foram sacrificados e o músculo cardíaco e gastrocnêmio retirados. Para análise do estado

redox, foram utilizadas técnicas bioquímicas de análise do conteúdo intracelular de GSH e

GSSG; para análise da expressão de HSP70 e MRP1 foram utilizadas técnicas de SDS-

PAGE e Western blotting. A atividade da bomba MRP1 foi medida por técnicas

espectrofotométricas em membranas isoladas dos músculos em estudo. Os resultados foram

expressos como média ± desvio padrão da média. Foi utilizado o teste de análise de

variância complementado com o teste de comparações múltiplas de Student-Newmann-

Keus, para p <

0,05. Na análise do estado redox celular ([GSSG]/[GSH]), o miocárdio não

apresentou mudanças significativas, enquanto que o gastrocnêmio do grupo exercício

demonstrou aumento nesta modalidade indicando estresse (controle: 0,424± 0,056 e

exercício: 3,775 ± 0,466). Com relação à expressão de HSP70 (unidades arbitrárias), o

miocárdio não apresentou diferença, enquanto o gastrocnêmio do grupo exercício obteve um

aumento significativo (controle 0,602± 0,047 e exercício 0,807 ± 0,224). Na expressão da

MRP1, o coração apresentou diferença significativa (controle: 0,360± 0,028 e exercício:

0,800 ± 0,094), enquanto o gastrocnêmio não. A atividade da bomba MRP1 foi 21,4% maior

no coração, e essa atividade foi diminuída pelo treinamento em 27,76% em relação ao

controle. Os dados obtidos indicam que o miocárdio parece estar mais protegido do que o

gastrocnêmio contra o estresse oxidativo induzido pelo exercício por apresentar maior

expressão e atividade da bomba MRP1, uma vez que esta previne o acúmulo de GSSG

intracelular bombeando o mesmo para o exterior da célula.

ABSTRACT

The relation enters the intracellular concentrations of glutathione (GSH) and

gluthatione dissulfide (GSSG), said the cellular redox state that, in turn, it modulates

the activity of many genes and sensible proteins to the potential alterations redox.

The HSPs is basic in the defense against oxidative stress and in processes of cellular

repair. Already the MRP1 can regulate the cellular state redox exporting glutathione

disulfide (GSSG), preventing oxidative stress. Our objective was to verify the

expression of HSP70, MRP1 pump and its activity, as well as the metabolism of

glutathione (GSH) in the myocardium and gastrocnemium of rats submitted to the

acute exercise and the physical training of swimming. Male rats (Wistar), separate in

control and exercise (n=6; training of one week, whith load of 5% of the corporal

weight in the tail, temperature water ± 30°C). After the exercise the removed rats had

been sacrificed and cardiac muscle and gastrocnemium muscle. For analysis of the

redox state, had been used biochemical techniques of analysis of the intracellular

content of GSH and GSSG; for analysis of the expression of HSP70 and MRP1

techniques of SDS-PAGE and Western blotting had been used. The activity of MRP1

pump was measured by spectrophotometric techniques. The results had been

express as average ± shunting line standard of the average. The test of analysis of

variance was used complemented with the test of multiple comparisons of Student-

Newmann-Keus. In the analysis of the cellular redox state ([GSSG]/[GSH ]), the

myocardium did not present significant changes, while that the gastrocnemium of the

group exercise demonstrated increase in this modality indicating stress (control:

0,424± 0,056 and exercise: 3,775 ± 0,466). With relation to the HSP70 expression

(Unit. arbit.), the myocardium did not present difference, while the gastrocnemium of

the exercise group got a significant increase (0,047 control 0,602± and 0,807 exercise

± 0,224). In the expression of the MRP1, the heart control presented significant

difference (: 0,360± 0,028 and exercise: 0,800 ± 0,094), while the gastrocnêmio not.

The activity of MRP1 pump was 21.4% greater in the heart, and this activity was

diminished by the training in 27,76% in relation to the control. The gotten data

indicate that the myocardium seems to be more protecting than gastrocnêmio against

oxidative stress induced for the exercise for presenting greater expression and

activity of bomb MRP1, a time that this prevents the intracellular accumulation of

GSSG the same pumping for the exterior of the cell.

1. INTRODUÇÃO

O termo proteína de choque térmico (HSP, do Inglês, heat shock protein) tem

sido usado para um grupo de proteínas de expressão induzida por calor ou por outros

desafios metabólicos. A indução dessas proteínas é fundamental nos processos de

reparo que seguem diferentes tipos de danos e na prevenção da agregação de

proteínas não nativas, principal mecanismo através do qual as HSP conferem

citoproteção. A exposição prévia das células a condições estressantes, não-letais,

pode suscitar a síntese de HSP e proteger contra os efeitos lesivos de novas

exposições. Uma vez que o exercício físico é capaz de proporcionar condições

bastante semelhantes àquelas indutoras da síntese de HSP, é provável que a

expressão de HSP esteja relacionada com a prevenção de desnaturação protéica por

radicais livres, sendo qual se constitui em uma e das principais alterações

moleculares que levam a cardioproteção induzida pelo exercício.

O estresse oxidativo induzido por situações estressantes, como por exemplo,

de isquemia-reperfusão, levam ao aumento do conteúdo intracelular de glutationa

oxidada (GSSG) e a depleção de glutationa reduzida (GSH), alterando o estado redox

e logo a homeostase celular. Sabe-se que o aumento de GSSG e depleção de GSH

afetam a função de inúmeras proteínas por um processo conhecido como

glutatiolação (formação de pontes dissulfeto mistas), como, por exemplo, à bomba de

cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA) inativando-a e, com isso, aumentando o

conteúdo intracelular de cálcio, podendo ser então maléfica para a função cardíaca.

A bomba MRP1/GS-X (multidrug resistence protein 1), encontrada em diversas

células, inclusive no miocárdio e músculo esquelético, tem a capacidade de bombear

o conteúdo de glutationa oxidada para o meio extracelular, impedindo seu acúmulo e

com isso a manutenção do estado redox celular e com isso pode estar envolvida no

processo de cardioproteção.

Por estas razões, foi proposta a investigação do comportamento destas

variáveis (HSP70, MRP1 e metabolismo da glutationa) no miocárdio e músculo

esquelético de ratos em uma situação estressante de exercício físico agudo.

1.1 OBJETIVOS

Conforme discutido acima, HSP são induzidas pelo exercício e fazem

citoproteção. Entretanto o mecanismo de indução pelo exercício não está esclarecido.

Alterações de expressão e atividade da bomba MRP1 nunca foram investigadas em

exercício tampouco sua relação com a cardioproteção. Por esta razão, neste trabalho

propusemos investigar os aspectos da indução de HSP70 e MRP1 relacionada ao

exercício físico no miocárdio.

1.2 Objetivo principal

Caracterizar a correlação entre a indução da síntese de HSP e MRP1 no

músculo cardíaco e estresse oxidativo; sua comparação com o músculo

esquelético em resposta ao exercício agudo e treinamento e seu significado

fisiológico.

1.3 Objetivos específicos:

• Avaliar a existência de expressão de HSP70, em resposta às alterações

cardiovasculares induzidas pelo exercício agudo e ao treinamento físico.

• Avaliar a expressão e atividade da bomba MRP1/GS-x em resposta às

alterações cardiovasculares induzidas pelo exercício agudo e ao

treinamento físico.

• Avaliar o estado redox através do metabolismo da glutationa.

• Comparar as alterações destas variáveis no músculo cardíaco e no

gastrocnêmio.

1.4 Estratégia Experimental:

Avaliar em ratos sedentários (controles) e treinados (em natação) no miocárdio e

gastrocnêmio:

• Expressão de HSP70;

• Expressão e atividade da bomba MRP1/GS-X;

• Determinação das concentrações intramusculares de GSH (glutationa reduzida),

GSSG (dissulfeto de glutationa ou glutationa oxidada) - (relação GSSG/GSH,

índice de estresse oxidativo).

1.5 JUSTIFICATIVA E IMPACTO SOCIAL

O exercício físico também é capaz de promover a síntese de proteínas de

estresse. Entretanto, o mecanismo exato de indução de HSP e seu papel na resposta

à injúria resultante do exercício ainda não estão totalmente esclarecidos. Sabe-se

que a HSP70 é uma provável candidata à cardioproteção induzida pelo exercício,

enquanto a MRP1, que jamais foi relacionada a esta função, pode ser uma das

proteínas mais importante em situações de estresse cardiovascular.

Como foi discutido anteriormente, o acúmulo de GSSG no interior da célula,

está diretamente relacionado com a perda da função de diversas proteínas essenciais

para a homeostase cardíaca. Por esta razão, qualquer fator que altere o conteúdo de

GSSG para menos, pode ser um mecanismo de cardioproteção.

Dado que a prática de atividades físicas é um fenômeno social indiscutível e

contribui para a promoção da qualidade de vida, a pesquisa e produção científica e/ou

acadêmica mostra-se plenamente justificável. Por isso, a relevância social do projeto

é óbvia, uma vez que o mesmo virá a contribuir para produção de conhecimento na

área de Fisiologia Humana e do Exercício. Além disso, a geração desse

conhecimento permitirá que o acompanhamento das adaptações orgânicas às

atividades físicas direcionadas ao tratamento de doenças crônico-degenerativas seja

feito de forma mais eficiente e racional.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Estresse, proteínas de choque térmico e citoproteção

Diversas estratégias foram desenvolvidas pelas células para lidar com

mudanças adversas no ambiente. Entre essas, a resposta de choque térmico,

também referida como resposta ao estresse (WELCH, 1992), é a mais conservada

(LOCKE and NOBLE, 1995; FEHRENBACH and NIESS, 1999). Ela consiste na

rápida expressão de uma classe de proteínas conhecidas como proteínas de choque

térmico (LOCKE and NOBLE, 1995; FEHRENBACH and NIESS, 1999), que são

essenciais para a sobrevivência de células confrontadas com um agente ambiental

estressante (WELCH, 1992).

A natureza universal dessa resposta tem sido continuamente confirmada desde

sua descrição inicial por Ritosa em (1962), em células de glândula salivar de

Drosophila busckii. Segundo este autor, a sujeição das larvas deste inseto a um

choque térmico

, por 30 min, determinava uma alteração do padrão de espessamento

cromossomal

. Como esses espessamentos são locais de intensa atividade

transcricional, a mudança de padrão evidenciava que o choque térmico havia ativado

um conjunto de genes que determinavam a expressão de um grupo específico de

proteínas. Ritosa também demonstrou que a variação no padrão de espessamento

cromossomal ocorria quando a temperatura atingia rapidamente um valor limiar

Correspondendo ao aumento de 25 para 30

C na temperatura do ambiente em que

se desenvolvia a larva

Esta elevação de temperatura determinava, no cromossoma 2L, o surgimento de

espessamentos nas regiões 2L 14, 2L15 e 2L20, além da regressão do

espessamento normalmente existente em 2L 8.

determinado, e não em resposta a qualquer variação brusca de temperatura de

amplitude entre 5 a 6 °C (RITOSA, 1962).

O termo proteína de choque térmico (HSP

), ou simplesmente proteína de

estresse (SP

), tem sido usado para as proteínas induzidas por calor (LOCKE and

NOBLE, 1995), assim como por outros desafios metabólicos, incluindo análogos de

aminoácidos, vários metais pesados, agentes que atacam os grupos sulfidrila das

proteínas (como o arsenito de sódio), diversos ionóforos

e venenos metabólicos que

afetam a produção de ATP (Welch, 1992). A expressão de HSP também pode ser

induzida por estresse oxidativo, mecânico e por citocinas (FEHRENBACH and

NIESS, 1999). Muitos destes agentes estressantes têm em comum a capacidade de

afetarem de modo adverso à conformação correta e, conseqüentemente, a função

das proteínas (MINOWADA, 1995).

A importância das HSP para a manutenção da homeostase celular pode ser

avaliada pelo fato de estas proteínas constituírem uma classe altamente conservada,

desde procariotos até o homem (MEYER e DA SILVA, 1999). Elas podem ser

agrupadas por suas massas moleculares, em famílias, sendo as mais comuns:

HSP110, HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 e HSP30 (27,28 e 30 e p

-heme-

oxigenase). Muitas destas famílias de proteínas têm sido identificadas em células de

mamíferos (FEHRENBACH and NIESS, 1999), sendo que o principal grupo de HSP

apresenta peso molecular de aproximadamente 70 kDa e ponto isoelétrico entre os

pH 5,2 e 6,3 (LOCKE, NOBLE and ATKINSON, 1991). Incluído neste grupo estão as

heat shock/stress proteins

stress proteins

proteína que funciona como canal iônico

proteínas conhecidas como reguladas pela glicose (GRP

) (LOCKE, NOBLE and

ATKINSON, 1991) que são induzidas por privação de glicose, influxo de cálcio,

exposição prolongada a hipóxia ou agentes que perturbam a N-glicosilação

(FEHRENBACH and NIESS, 1999).

As HSP não são induzidas apenas em condições de estresse. Há

componentes desta classe de proteínas que são expressos constitutivamente (HSC

ou seja, em células não submetidas a condições de estresse. As formas induzíveis,

quando expressas, se somam às constitutivas (MEYER e DA SILVA, 1999). Em

células eucarióticas, a família das proteínas de 70 kDa é composta primariamente

pela HSP70, que é uma proteína induzível de 72 kDa e da HSC70 que é uma

proteína constitutiva de 73 kDa. Os membros desta família possuem um domínio

capaz de ligar ATP e outro de ligar peptídeos, e se localizam tanto no compartimento

nuclear, como no citoplasmático (WELCH, 1992). Quando estas proteínas atacam

uma proteína desnaturada (dobrada de forma inadequada

) ou nascente (ainda não

dobrada

), estabelecem com estas uma ligação através do domínio ligante de

peptídeo com o objetivo de impedir agregação proteína-proteína. Como documentado

para a RNA-polimerase, a HSP70 desagrega e reativa as proteínas termicamente

danificadas. A energia liberada pela hidrólise do ATP é utilizada para separar a

proteína da HSP. A família HSP70 também auxilia no correto dobramento e

estabilização de polipeptídeos recém-formados, antes de estes assumirem seus

estados nativos. Em função destas características, as HSP70 são conhecidas como

glucose regulated proteins.

Heat Shock Cognates

misfolded

chaperonas moleculares

(WELCH, 1992; ESSIG and NOSEK,1997). As HSC70 são

encontradas em níveis relativamente altos na maioria das células. Em presença de

estresse e da desnaturação de proteínas, as HSC70 migram para o núcleo e

nucléolo, onde ligam a pré-ribossomas desnaturados ou que ainda não tenham

adquirido a conformação nativa. Acredita-se que HSC70 e HSP70 auxiliem na

estabilização de proteínas, sendo que a primeira agiria regularmente, em condições

não-estressantes, enquanto a segunda seria sintetizada para atender demandas

extras impostas à célula sob estresse (ESSIG and NOSEK,1997).

2.2 Heat shock factors e a regulação da resposta ao choque térmico.

Em células eucarióticas, a regulação dos genes HSP pelo calor requer a

ativação e translocação, para o núcleo, de uma proteína transregulatória, o HSF

(“heat shock factor”), que reconhece e liga-se a uma seqüência de elementos

localizada no promotor do gene HSP, denominada HSE (“heat shock element”)

deflagrando o processo de transcrição (SANTORO, 2000 e MEYER,1999). Uma

característica-chave do HSE é a presença de segmentos GAA/TCC arranjados

periodicamente, a intervalos de dois nucleotídeos. Os blocos GAA provavelmente

representam pontos de contato para o HSF, sendo que um HSE funcional inclui um

mínimo de três segmentos GAA, não-consecutivos. É possível que interações HSF-

DNA produtivas impliquem no dobramento dos sítios de ligação e que a presença de

múltiplos pontos de contato seja pré-requisito para que o fator induza tal dobramento

unfolded

do Inglês, chaperone = acompanhante

(AMIN et al. 1988). Em mamíferos, nos promotores dos genes das HSP70 e HSP90,

o HSE é composto por cinco e seis unidades pentaméricas, respectivamente, em

estreita proximidade com os elementos basais dos promotores (SANTORO, 2000).

Enquanto um único tipo de HSF foi descrito em fungos e em Drosophila, uma família

multigênica de HSF foi identificada em plantas e vertebrados. A presença de

diferentes HSFs na maioria dos eucariotos sugere que a interação entre eles deva ser

importante para proteger organismos complexos das diversas formas de alterações

ambientais (SANTORO, 2000).

Em um grande número de eucariotos, o HSF1 está presente tanto em células

submetidas, como não submetidas a diferentes tipos de estresse. Entretanto, na

ausência de estresse, o HSF1 é expresso na forma de um monômero inerte ligado à

HSP70 e a outras chaperonas. Na presença de um agente estressante capaz de

provocar um súbito aumento na presença de proteínas não-nativas, se estabelece

maior necessidade de chaperonas (HSP70, HSP90) para prevenir o surgimento de

agregados de proteínas desnaturadas. Conseqüentemente, as chaperonas

dissociam-se dos monômeros de HSF1, permitindo que estes assumam um estado

trimérico, sejam fosforilados nos resíduos de serina e translocados para o núcleo. A

partir deste momento, ligam-se aos HSEs, localizados a montante dos genes HSP,

resultando na transcrição induzida por estresse. Com o aumento da síntese de HSP,

é restabelecido equilíbrio inicial entre chaperonas livres e ligadas à proteínas não-

nativas. As HSP deslocam-se para o núcleo, ligam-se ao domínio ativador de

transcrição dos HSF1, reprimindo novamente o processo de transcrição de genes

HSP (SANTORO, 2000, FEHRENBACH and NIESS, 1999).

Além do HSF1, considerado o fator estresse-responsivo rapidamente ativado,

existem ainda o HSF2, 3 e 4. O HSF2 (co-expresso) é ativado em resposta a distintos

estímulos de desenvolvimento ou diferenciação; O HSF3, que mostra muitas

características semelhantes aos HSF1, é ativado principalmente por exposição a

temperaturas extremas e sob condições severas de estresse e parece ser importante

co-regulador do HSF1, aumentando a habilidade celular de regular com precisão a

resposta ao choque térmico; e finalmente, o HSF4, que parece ser regulador negativo

da resposta ao choque térmico, reprimindo a expressão dos genes HSP (SANTORO,

2000).

A ativação do HSF induzida por exercício observada em coração de ratos é

similar à ativação observada em coração de animais submetidos a choque térmico,

sugerindo que o exercício e o choque térmico induzem a expressão de HSP pelo

mesmo mecanismo geral. Em alguns casos, a temperatura interna do animal era

menor que a necessária para ativação por choque térmico, indicando que outros

fatores, além do calor, devem contribuir para a ativação do HSF pelo exercício

(FEHRENBACH and NIESS, 1999).

Embora a expressão de HSP seja regulada primariamente em nível

transcricional, mecanismos pós-transcricionais também devem ser importantes. O

mRNA de HSP70 é relativamente instável sob condições fisiológicas normais e é

quase indetectável através de Northern blot em músculos não submetidos a estresse.

Assim, quando o status fisiológico volta ao normal, a quantidade de mRNA de HSP70

viável é diminuída, determinando baixos níveis de transcrição (FEHRENBACH and

NIESS, 1999).

2.3 Papel citoprotetor das HSP

Apesar de a indução destas proteínas ter sido inicialmente interpretada como

um sinal para a detecção de estresse fisiológico, está bem estabelecido agora que a

indução é fundamental nos processos de reparo que seguem diferentes tipos de

danos e na prevenção contra a agregação e coagulação de proteínas não-nativas

(SANTORO, 2000), que é o principal mecanismo através do qual as HSP conferem

citoproteção, evitando dobraduras e interações incorretas entre as proteínas. Em

condições fisiológicas, os segmentos predominantemente hidrofóbicos das cadeias

polipeptídicas que formam as proteínas corretamente dobradas localizam-se no

interior da molécula, enquanto os segmentos hidrofílicos voltam-se para o exterior.

Esta disposição possibilita a solubilidade das proteínas em meio aquoso e impede a

formação de agregados que ocorreriam pela interação das partes hidrofóbicas de

diferentes moléculas (MEYER e DA SILVA, 1999).

O papel citoprotetor das HSP e, em particular, das HSP70, tem sido

extensivamente documentado tanto in vitro como in vivo, em uma variedade de

doenças humanas incluindo: distúrbios metabólicos, inflamação, infecção e isquemia.

No tecido cardíaco, diferentes tipos de agressões, incluindo isquemia miocárdica,

trauma e hipertermia, resultam na síntese de HSP, as quais desempenham um papel

central no restabelecimento da função cardíaca após injúria, tanto in vitro como em

modelos animais. No caso da inflamação, as HSP protegem as células de mamíferos

da citotoxicidade mediada pelos TNF

α e β. Também foi demonstrado que a

Tumor necrosis factor

expressão destas suprime a expressão de iNOS

(geradora de NO, um gás pró-

inflamatório) em células da astroglia. Em modelos da síndrome da angústia

respiratória do adulto (SARA) em roedores, o acúmulo induzido de HSP70 nos

pulmões está associado com uma diminuição da resposta inflamatória e prevenção

da letalidade desta doença. A expressão aumentada de HSP também está associada

com a inibição da replicação viral durante infecções agudas (SANTORO, 2000).

2.4 Outras Chaperonas

2.4.1 HSPs Pequenas

A ubiquitina provavelmente é a menor HSP (peso molecular de

aproximadamente 8kDa) sendo expressa em praticamente todas as células dos

mamíferos. É uma proteína altamente conservada que apresenta função na estrutura

da cromatina bem como na degradação de proteínas. Muitas proteínas intracelulares

são, antes de serem degradadas, ligadas covalentemente (em resíduos de lisina) e

modificadas pela adição de ubiquitina. O aumento de ubiquitina após o estresse

presumivelmente, facilita o endereçamento e remoção de proteínas desnaturadas

como conseqüência do evento estressante.

A HSP20 foi encontrada em tecido muscular esquelético de ratos constituindo

mais de 1,3% da proteína celular total do músculo e sua expressão é relacionada

com a contração muscular, especialmente em fibras de contração lenta.

Tem sido demonstrado, que a HSP27 é expressa tanto em tecido muscular

humano quanto de ratos. Ela se localiza no citossol em condições normais e é

inducible nitric oxide synthase

translocada ao núcleo em condições de estresse. Esta proteína é expressa em

concentrações relativamente baixas, porém em adição do estresse ela exibe uma

indução de sua expressão de 10 a 20 vezes maior que em repouso. As principais

funções relacionadas às HSP27 incluem a estabilização de microfilamentos e a

transdução de sinal das citocinas.

Outra importante HSP encontrada nos músculos estriados é a alfa-cristalina.

Esta se divide em duas isoformas: alfa A e alfa B. A primeira é expressa

principalmente no cristalino enquanto a segunda é expressa constitutivamente em

muitos tecidos diferentes e pode ser induzida pelo estresse fisiológico. Ambas

dividem o mesmo gene de origem; o tipo B atua como chaperona molecular tanto

para prevenir agregação de proteínas desnaturadas como para facilitar a renaturação

da mesma. Por esta razão, a tipo B pode desempenhar um papel fundamental no

desenvolvimento das células musculares.

2.4.2 HSP60

O músculo esquelético é capaz de expressar HSP60 sob condições de

estresse. Esta chaperona é encontrada no interior da mitocôndria, porem existem

evidências de que ela é sintetizada no citoplasma e então translocada à mitocôndria

onde é processada na sua forma madura. A HSP60 facilita o dobramento correto e a

montagem de proteínas endereçadas a entrar na mitocôndria. Também é capaz de

estabilizar proteínas sob situações de estresse. Essa proteína é expressa

constitutivamente em tecido muscular estriado e outras células em proporção ao

conteúdo mitocôndrial e é aumentada após estimulação elétrica crônica.

Recentemente tem se demonstrado que o treinamento de resistência aumenta sua

expressão de forma correspondente com a atividade enzimática mitocondrial

apresentada.

2.4.3 HSP90

As HSP90, são uma família de proteínas compostas por três subtipos: duas

intimamente relacionadas com isoformas citoplasmáticas (α e β) e uma proteína

reguladora da glicose (GRP94). A HSP90 é encontrada no citosol, núcleo e retículo

endoplasmático, e é relatada existindo em muitos tipos de células. Outra importante

atividade da HSP90 é a sua ligação com receptores de hormônios esteroidais não

ligados, incluindo receptores de estrógeno, progesterona, glicocorticóides e

andrógenos. A HSP90 apresenta um importante papel na regulação da atividade

destes receptores onde, na ausência do hormônio, ela se fixa e os inativa; após a

ligação do hormônio, ela se desliga dos receptores e permite que este seja

translocado ao sítio específico no DNA.

2.5 Radicais livres, estresse oxidativo e exercício

A prática diária de exercícios físicos de intensidade moderada é benéfica para a

saúde, reduzindo os riscos de diversas desordens relacionadas ao envelhecimento.

Por outro lado, exercícios intensos e prolongados têm efeitos adversos sobre a

saúde, provavelmente em função da excessiva geração de espécies reativas do

oxigênio (RADAK et al. 1999). De fato, o músculo esquelético gera consideráveis

quantidades de radicais livres durante contração muscular intensa (CLANTON e

KLAWITTER, 1999), assim como neutrófilos, eosinófilos e monócitos, em resposta ao

exercício vigoroso (NIESS et al. 1999).

Radicais livres são átomos ou moléculas que possuem um ou mais elétrons

desemparelhados e, em função disso, apresentam acentuada reatividade química.

Esta característica dá origem ao potente efeito oxidante desses radicais (que

facilmente subtraem elétrons de substâncias aceptoras), que é a base para seu efeito

destrutivo contra lipídios, proteínas, ácidos nucléicos e a matriz extracelular. Os

radicais livres de maior importância biológica são os radicais superóxido (O

2•

hidroxila (OH

) e óxido nítrico (NO). Vários mecanismos enzimáticos envolvendo a

catálise por cobre ou ferro, são responsáveis pela geração destes radicais nos

sistemas biológicos. Derivados oxidantes secundários podem resultar da reação de

um radical livre com outro, como por exemplo, o peróxido de hidrogênio (H

), o

peroxinitrito (ONOO

) e o ácido hipocloroso (HOCl). Eles também contribuem para o

estresse oxidativo devido ao fato de apresentarem ainda maior toxicidade do que os

radicais livres originais. Uma distinção terminológica é feita entre as espécies reativas

do oxigênio (ROS

), que incluem os radicais de oxigênio (O

, OH

) e seus derivados

e o átomo de oxigênio), e as espécies reativas do nitrogênio (RNS

), tais como

o NO e o ONOO

(NIESS et al., 1999).

O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre a produção de oxidantes e as

defesas antioxidantes, o que pode ser conseqüência de condições como: isquemia-

reperfusão, hipóxia severa, estresse térmico severo, choque séptico e lesão induzida

Reactive Oxygen Species

Reactive Nitrogen Species

por distensão muscular. Essas condições podem levar a injúria e disfunção mecânica

(CLANTON e KLAWITTER, 1999).

Diversos mecanismos são apontados como responsáveis pela produção de

radicais livres durante a atividade física. No processo de fosforilação oxidativa

mitocondrial, a enzima citocromo oxidase catalisa a redução do oxigênio molecular, o

que corresponde a 90 a 98% do consumo de O

. O oxigênio restante (2 a 10%) sofre

redução incompleta, um processo que conduz à geração de superóxido (O

). Assim,

a quantidade absoluta de O

tende a aumentar como resultado do aumento do

consumo de oxigênio pelo músculo em contração (NIESS, et al. 1999).

Outro importante mecanismo de geração de O

é a atividade da xantina

oxidase

, que catalisa a conversão da hipoxantina em xantina, e esta em ácido úrico.

Esta enzima age normalmente como desidrogenase, utilizando nicotinamida adenina

dinucleotídeo (NAD

) como aceptor de elétrons. Entretanto, condições de proteólise

causada por distúrbios na homeostase do cálcio intracelular, estresse térmico e

oxidação de grupos tióis determinam sua conversão para a forma oxidase, a qual

forma O

durante sua ação catalítica. Tanto em condições de isquemia-reperfusão,

como de exercício de alta intensidade, ocorre acúmulo de adenosina monofosfato

(AMP) como resultado da ação da adenilato quinase, a fim de compensar a

ressíntese inadequada de adenosina trifosfato (ATP). A metabolização subseqüente

do AMP para inosina monofosfato (IMP) leva a um aumento dos níveis de

hipoxantina, a qual é o principal substrato da xantina oxidase. Além disso, a

perturbação da homeostase do cálcio celular permite a conversão da xantina

Enzima localizada predominantemente no endotélio vascular

desidrogenase para sua forma oxidase e, portanto, aumenta a quantidade de O

produzido durante e após o exercício (NIESS, et al. 1999).

Finalmente, um mecanismo adicional de formação de ROS é a conversão de H

para o radical muito mais agressivo OH

, via reação de Fenton, na presença de ferro.

A extensão da geração de OH

depende principalmente da disponibilidade de ferro

livre. O exercício exaustivo parece estar associado a uma liberação aumentada de

ferro das hemo e mioglobinas, ou de seus produtos de degradação, como resultado

de danos ao tecido muscular. O cobre, catalisador na reação Haber-Weiss, também

pode contribuir para a formação aumentada de OH

(NIESS et al, 1999).

Os radicais livres podem agir como sinalizadores em diversos tipos de células

(JACKSON, 1999; CLANTON, ZUO e KLAWITTER, 1999) e o conhecimento dos

mecanismos através dos quais eles influenciam a expressão gênica é de importância

particular nos tecidos que, como o músculo esquelético, são sistematicamente

expostos a uma quantidade variável de estresse oxidativo (JACKSON, 1999).

Especula-se que os radicais livres, através da indução de fatores de transcrição

sensíveis ao estado redox da célula, como o NF-κB e a AP-1

, tenham importante

papel na efetivação das adaptações ao treinamento físico. Corrobora com esta idéia o

fato de que a geração intracelular de ROS, por estímulos patogênicos ou

inflamatórios, resulta na degradação da subunidade inibitória I-κB do NF-κB,

permitindo que este ligue às seqüências reguladoras da expressão de genes-alvo. No

entanto, o papel, no exercício, da ativação do NF-κB e do AP-1, pelas ROS, é pouco

conhecido (NIESS et al. 1999).

Antagonizando os efeitos das ROS, os sistemas de proteção antioxidantes do

corpo, assim como os antioxidantes alimentares, modulam diversos processos de

sinalização sensíveis ao estado redox da célula. Esses sistemas, que incluem as

enzimas superóxido dismutase (SOD – que dismuta o O

em H

), catalase (CAT-

que transforma H

em H2O), glutationa peroxidase (GSPx- que reduz peróxidos

orgânicos na presença de GSH), heme oxigenase-1 (HO-1) e outras proteínas de

choque térmico (HSP), podem ser influenciados tanto pelo esforço físico agudo como

pelo treinamento (NIESS et al. 1999).

Os antioxidantes dietéticos, como o α-tocoferol e o ácido ascórbico, podem

exercer efeitos moduladores sobre o sistema imune, suprimindo a produção de várias

citocinas inflamatórias e também inibindo a expressão de iNOS nos macrófagos. No

entanto, o efeito protetor destas manipulações sobre os danos musculares induzidos

pelo exercício não é claro. Outro aspecto que também merece consideração no que

diz respeito ao uso de antioxidantes dietéticos é que não se pode excluir a

possibilidade de que, em grandes doses, eles possam ser contra-produtivos para o

processo de regeneração do músculo, que parece depender de um certo nível de

estresse oxidativo. Desta forma, é preciso considerar a necessidade de manutenção

de níveis ótimos de α-tocoferol e ácido ascórbico (NIESS et al. 1999).

A influência de exercícios agudos e crônicos sobre a atividade da SOD, CAT e

GSPx foi investigada em vários tecidos. A SOD, uma metaloproteína localizada

primariamente no citoplasma e mitocôndrias de células de mamíferos, catalisa a

conversão (dismutação) de superóxido (O

) em peróxido de hidrogênio (H

) e

Activator protein-1= dímero de fos+jun

oxigênio. A CAT remove o H

pela conversão deste em água e oxigênio. A GSPx é

uma enzima que catalisa a redução de H

e peróxidos de ácidos graxos em água e

dissulfeto de glutationa (também conhecida como glutationa oxidada, GSSG),

utilizando GSH como doador de elétrons. A GSSG é regenerada a GSH numa reação

em que o NADPH é o agente redutor. Resumidamente, o exercício vigoroso agudo

aumenta a atividade da SOD no músculo esquelético, coração, pulmão, fígado e

células sangüíneas vermelhas. Embora tenham sido detectados efeitos estimulantes

do exercício sobre a GSPx, a influência do exercício agudo sobre a esta enzima ainda

é inconsistente. O treinamento físico, por sua vez, parece induzir a atividade da GSPx

e da SOD, embora não tenham sido demonstrados efeitos deste tipo de intervenção,

sobre a atividade da CAT. Em leucócitos humanos, até o presente, não há dados

disponíveis sobre mudanças na atividade de SOD, CAT ou GSPx, relativas ao

exercício (NIESS et al. 1999).

A heme-oxigenase possui duas isoformas: a HO-1 (32 kDa), que é induzível, e a

HO-2, que é constitutiva. A elevação da expressão de HO-1 protege a célula contra o

estresse oxidativo reduzindo o polo intracelular de ferro livre, via indução da síntese

de ferritina, se opondo à geração de ROS através da reação de Fenton. Além disso, a

HO-1 catalisa a etapa inicial na degradação de heme a bilirrubina, um potente

antioxidante hidrossolúvel. Aumentos na expressão de HO-1, em função de exercício,

foram demonstrados em músculos de camundongos e em monócitos, linfócitos e

granulócitos humanos. Além disso também foi observado que a expressão basal de

HO-1 em leucócitos foi menor em indivíduos treinados do que em não treinados,

sugerindo um estado pró-oxidante mais baixo nas células, devido a adaptações ao

treinamento físico (NIESS et al. 1999).

A HSP70 também parece proteger contra o estresse oxidativo. No entanto,

apenas a geração intracelular, e não a exposição extracelular às ROS, aumentam as

HSP70 citoplasmáticas. Com relação aos efeitos protetores da HO-1 e da HSP70, a

expressão aumentada dessas proteínas de estresse deve ajudar a manter a

viabilidade, função e capacidade proliferativa de células imuno-competentes, durante

e após o exercício vigoroso (NIESS et al. 1999). Como a ativação de vias das HSP

bloqueia a ativação do NF-κB, é possível que a expressão de HSP esteja relacionada

à modulação da atividade de citocinas inflamatórias.

O envolvimento do NF-κB na expressão de citocinas inflamatórias e,

conseqüentemente, de seus efeitos moduladores sobre os processos inflamatórios

agudos e crônicos, é importante do ponto de vista fisiopatológico. Discute-se o papel

dos antioxidantes como opção terapêutica, devido a um efeito inibitório sobre o NF-

κB, o qual têm sido observado, quando se administra ácido ascórbico e outros

antioxidantes (NIESS et al. 1999).

O aprimoramento das defesas antioxidantes em resposta ao condicionamento

muscular também sugere uma estreita relação entre as espécies reativas de oxigênio

e a atividade contrátil (NIESS et al. 1999).

2.6 NO, HSP e proteção contra injúria tecidual

O óxido nítrico é um radical livre gasoso, pequeno e relativamente estável que

prontamente se difunde nas células, onde reage com alvos moleculares. Apesar de

servir como uma molécula sinalizadora-chave em diversos processos fisiológicos (e.g.

defesa imunológica, comunicação neuronal e regulação vascular), pode causar ou

contribuir para condições fisiopatológicas (e.g. choque vascular, diabetes,

neurodegeneração, artrite e inflamação crônica) quando sua síntese é desregulada e

excessiva (GROSS et al. 1995).

Em mamíferos, como resultado de seus efeitos antimicrobianos, o NO e outros

RNS estão envolvidos na defesa do organismo (“host defense”). A enzima

responsável pela síntese de NO, nestas situações, é a NO sintase induzível (iNOS

que é expressa em monócitos, macrófagos, linfócitos T, neutrófilos, eosinófilos e

células mesangiais, do sistema imunológico humano. Níveis normais de NO também

são necessários para vários outros mecanismos fisiológicos, incluindo as funções de

sinalização, mas sua produção excessiva pode ter efeitos prejudiciais para as células.

No metabolismo energético, os complexos efeitos do NO incluem a inibição da

NADH-ubiquinona e da succinato-ubiquinona-oxirredutase, na cadeia respiratória

mitocondrial, e da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, na glicólise (NIESS et al.

1999).

Uma ampla variedade de fatores, ativadores e inibidores, foram identificados como

moduladores da expressão de iNOS, através dos quais, várias citocinas

desempenham seu papel. A expressão de iNOS, in vitro, pode ser estimulada pela

combinação de IFN-γ, TNF-α e IL-β. IL-8 e IL-6 têm um efeito mais inibitório, o qual

pode ser entendido como um importante mecanismo de feedback na regulação da

iNOS (NIESS et al. 1999) e dos efeitos do NO.

A influência do exercício físico sobre a expressão de iNOS e produção de NO em

células imunocompetentes ainda é pouco conhecido. Foi demonstrado que a corrida

exaustiva em esteira em uma intensidade de 110% do limiar anaeróbio individual

(IAT), em homens não-treinados, resultou em aumento na expressão de iNOS em

neutrófilos e linfócitos, o qual persistiu por 48 h após o exercício. Uma expressão

aumentada de iNOS também foi observada imediatamente após uma corrida de meia-

maratona. Uma vez que o NO não foi determinado nesses estudos, não se sabe se a

expressão aumentada de iNOS se traduz em um aumento relevante na geração de

NO pelos leucócitos. Além disso, o exato mecanismo levando a um aumento na

expressão de iNOS, em função do exercício, não está claro. Fatores que produzem

uma liberação aumentada de citocinas, como IFN-γ, TNF-α ou IL-1β, sob estresse

físico, podem estar envolvidos na produção aumentada de NO (NIESS et al. 1999) e

precisam, portanto, ser investigados.

Segundo Veseley et al. (1998), no tecido muscular esquelético, a HO-1 parece ser

induzida apenas por exercício ou estimulação elétrica in vivo. Estes autores,

estudando os efeitos da hemina e do nitroprussiato de sódio em células da linhagem

de mioblastos esqueléticos de rato L6G8, observaram um aumento tempo e dose-

dependente na atividade de HO-1. O efeito do nitroprussiato de sódio, por sua vez,

inducible NO-synthase

era reduzido pela co-incubação com hidróxi-cobalamina, sugerindo que o NO deve

estar envolvido na ativação do gene que codifica para HO-1.

A adenosina e o óxido nítrico, substâncias vasoativas candidatas para a regulação

local do fluxo de sangue no músculo esquelético, aumentam nas células musculares

e no fluido intersticial durante o exercício. Além disso, as enzimas responsáveis pela

formação destas duas substâncias, AMP 5’-nucleotidase e a NOS, também estão

ativas durante a contração muscular. Evidências in vivo, como in vitro, sugerem que o

aumento na concentração intersticial de adenosina, induzido por contração, resulta da

síntese extracelular mediada pela AMP 5’-nucleotidase extracelular ligada à

membrana. Ainda não está claro se a indução da formação de óxido nítrico no

músculo se origina da NOS endotelial, localizada no endotélio microvascular, ou da

NOS neuronal (nNOS) das células nervosas e fibras musculares. Evidências

funcionais do papel da adenosina no controle do fluxo sangüíneo muscular se apóiam

em estudos utilizando agonistas e antagonistas do receptor de adenosina, adenosina

desaminase ou inibidores da captação de adenosina. A maioria destes estudos foi

realizada em animais de laboratório e, ainda que estes resultados mostrem alguma

discrepância, a maioria indica que a adenosina participa na regulação do fluxo

sangüíneo muscular. Em humanos, ainda faltam evidências que confirmem este papel

da adenosina. O papel do NO para a fisiologia do músculo esquelético tem sido

estudado com inibidores de NOS. A despeito do grande número de estudos nesta

área, o papel do NO no aumento do fluxo de sangue muscular induzido por contração

ainda é incerto. A maioria dos estudos, mas não todos, em humanos e animais

mostraram que, embora o bloqueio da NOS reduza o fluxo muscular de sangue no

repouso, e durante a recuperação do exercício, não há nenhum efeito deste bloqueio

sobre o aumento da perfusão muscular durante o exercício. Ainda não existem

evidências conclusivas sobre os mecanismos subjacentes ao aumento multi-fase do

fluxo sangüíneo muscular durante o exercício, assim como sobre o papel e potência

das diversas substâncias vasoativas (RADEGRAN & HELLSTEN, 2000).

O exercício também provoca estresse oxidativo através da geração aumentada de

intermediários reativos do oxigênio (ROI

) no músculo, assim como no sistema

hematopoiético. A elevação de temperatura induzida pelo exercício também pode

provocar o estresse oxidativo, uma vez que Salo et al. observaram que, com o

aumento da temperatura, as mitocôndrias musculares sofriam um progressivo

desacoplamento com geração aumentada de ROI.

Um papel para os intermediários reativos do oxigênio, produzidos primariamente

como conseqüência do elevado ritmo de respiração mitocondrial é postulado na

fadiga muscular. Considerando a capacidade potencial dos intermediários reativos do

oxigênio de danificarem as proteínas intracelulares durante séries consecutivas de

contrações musculares, a capacidade de rotas antioxidantes preexistentes pode ser

complementada pela síntese de HSP. Aumentos no mRNA de HO-1, em particular,

devem fazer parte de uma rota antioxidante induzível no músculo esquelético que é

responsiva ao estresse metabólico associado com contrações musculares repetidas

(FEHRENBACH and NIESS, 1999).

A ativação de neutrófilos descritas após exercício e um aumento dos produtos de

peroxidação lipídica sugerem que o estresse oxidativo desempenha um papel

importante nas mudanças induzidas pelo exercício nas células hematopoiéticas. Em

particular, a proteína HO-1 antioxidante é induzida por hipóxia e estresse oxidativo.

Uma rota redox-sensível faz a mediação de pelo menos parte da indução do gene de

HO-1 por hipóxia em miócitos cardíacos. Foi observado que a indução de HO-1 em

leucócitos após exercício de endurance extenuante de longa duração se correlaciona

com a concentração plasmática aumentada de interleucina-8, um indicador da

ocorrência de intermediários reativos de oxigênio in vivo. Estes resultados permitem

considerar o estresse oxidativo como um estímulo potencial para a expressão de HSP

associada ao exercício (FEHRENBACH and NIESS, 1999).

Segundo Salo et al. (1991) a hipertermia do exercício provocaria o

desacoplamento mitocondrial, elevando a concentração de ubisemiquinona e

aumentando a concentração de superóxido (O

). Este ânion e o peróxido de

hidrogênio (H

), subseqüentemente formado, podem ser responsáveis pela

expressão aumentada de HSP70 e de outras HSP.

2.7. Proteínas de Choque Térmico e Citoproteção no Miocárdio

Diversos mecanismos de citoproteção cardíaca estão associados à expressão de

HSP, a maior parte da atenção é voltada para os processos que envolvem a morte

celular programada – apoptose. A maior via da apoptose envolve a liberação da

citocromo C da mitocôndria. Esta se liga a uma proteína conhecida como Apaf-1 e

desencadeia a sua oligomerização. O complexo formado, então atrai a pro-forma da

Reactive oxygen intermediates

enzima proteolítica caspase-9 que é clivada e passa a sua forma ativa, e por meio

disso inicia-se o processo apoptótico. Interessantemente, diferentes tipos de HSP têm

demonstrado inibir este processo em diferentes pontos. Foi demonstrado que a

HSP27 é capaz de ligar-se a citocromo-c e prevenir sua ligação a Apaf-1 (GARRIDO

et al, 1999; BRUEY et al, 2000). Inversamente, a HSP90 se liga a Apaf-1 e previne

sua ligação a citocromo-c (PANDEY et al, 2000), enquanto a HSP70 previne a já

oligomerizada Apaf-1 de recrutar a pro-caspase-9 (BEERE et al, 2000; SALEH et al,

2000).

Além de seu efeito anti-apoptótico mediado por caspases, a HSP70 parece

apresentar mecanismos independentes de caspases (JÃÃTTELÃ et al, 1998). A

capacidade da HSP70 de inibir a quinase C-Jun N-terminal (Jnk kinase), indutora de

apoptose, parece ser a maneira independente de caspase pela qual a HSP70 inibe a

morte celular programada (GABAI et al, 2000; PARK et al, 2001). Já foi demonstrado

que o aumento da expressão de HSP70 em células cardíacas protege a célula da

apoptose em decorrência de estímulos estressores como calor e isquemia (BRAR et

al, 1999).

Além deste efeito inibidor de apoptose, as HSP`s apresentam outros efeitos de

proteção como, por exemplo, já foi demonstrado que a HSP27 pode proteger a

integridade dos microtúbulos e do citoesqueleto de actina em miócitos e células

endoteliais expostas à isquemia (BLUHM et al, 1998; LOKTIONOVA et al, 1998).

Além disso, a HSP90 tem demonstrado ligar-se a óxido nítrico sintase endotelial

(eNOS) e estimular sua atividade (GARCIA et al, 1998), enquanto o aumento da

expressão da HSP70 aumenta a produção e NO em resposta à estimulação de

citocinas (BELLMAN et al, 2000). Essas observações são particularmente

interessantes em vista das observações de que angina instável ativa ambas HSP72 e

eNOS no coração humano (VALEN et al, 2000), enquanto o NO protege as células

em cultura da morte induzida pelo TNF-α por induzir a expressão de HSP70 (KIM et

al, 1997).

Pelo fato de as HSP, em particular a HSP70, protegerem a célula via múltiplos

mecanismos regulatórios, é possível que estes efeitos possam ser utilizados

terapeuticamente.

2.8 Regulação da Expressão de HSP70 no Miocárdio durante o Exercício

Com relação à sinalização e ativação do HSF1, ativador da expressão de

HSP70, Russo et al (1984) foram os primeiros a observarem que a depleção do

conteúdo de glutationa resultava em concomitante aumento da expressão de HSP70.

A partir deste momento, muitos outros trabalhos utilizando diversos modelos

diferentes de manipulação do conteúdo intracelular de GSH (logo do estado redox da

célula cardíaca) demonstraram que a oxidação e depleção de grupos tiols não

protéicos levavam a ativação do HSF1 (Freeman et al, 1995; Hatayama et al, 1999;

Huang et al, 1994; Jacquier et al, 1996; Liu et al, 1996; Zou at al, 1998) e levaram a

hipótese de que a oxidação de grupos tiols levaria a ativação de HSF1. No entanto,

em um estudo realizado por PAROO (2002), foi verificado que em ratos exercitados

durante uma hora a 30m/min por 60 minutos, não havia correlação entre o conteúdo

de glutationa e a ligação do HSF ao HSE, uma vez que neste exercício não houver

alterações no estado redox celular do coração, mas ainda assim ocorreram ativação e

ligação do HSF. Aparentemente, esta relação entre depleção de grupos tiols e HSF1

ocorre apenas em situações farmacológicas e não em fisiológicas.

Sessões de exercício agudo são associadas com um aumento da recuperação

funcional, melhora da contratilidade e preservação da função metabólica durante a

injúria causada por isquemia-reperfusão (PAROO, NOBLE et al, 2002; LOCKE,

1995). Entre os mecanismos moleculares envolvidos nesta citoproteção está a

expressão de HSP70, uma proteína intracelular chave na restauração dos danos

causados pelo estresse isquêmico, facilitando a recuperação do coração ao seu

estado funcional normal (BENJAMIN et al, 1998).

Diversos trabalhos têm indicado que a simples ligação HSF1-HSE no DNA não é

suficiente para induzir a ativação transcripcional do HSF1, sugerindo um evento

adicional na regulação deste fator de transcrição (JURIVICH et al, 1992). Acredita-se

que a hiperfosforilação do HSF1 em seus resíduos de serina seguida de sua ligação

ao HSE inicie sua atividade (XIA et al, 1997).

A proteína quinase C ou PKC (quinase dependente de cálcio-fosfolipídeo) e a

proteína quinas A ou PKA (quinase dependente de AMPcíclico), medeiam muitos

processos de fosforilação em células cardíacas. Durante o exercício, níveis elevados

de catecolaminas no plasma e coração levam ao aumento da atividade da PKC E

PKA, e estas participam na regulação de processos de mobilização de substratos

energéticos, mudanças de fluxo iônico, desenvolvimento de força contrátil bem como

da expressão gênica (SUGDEN et al, 1995; FRANCIS et al, 1982). Já foi

demonstrado que a administração de agonistas β-adrenérgicos que aumentam a

atividade da PKA, potencializam a expressão de HSP70 durante uma sessão aguda

de exercício (PAROO et al, 1999), enquanto que autores demonstraram que o

tratamento com inibidores de PKC diminuía a cardioproteção induzida pelo exercício

(YAMASHITA et al, 2001).

A administração do inibidor de PKA (H-89), atenuou a elevação do RNAm da

HSP70 e subseqüente expressão de HSP70 induzida pelo exercício. Em contraste, a

administração do inibidor de PKC (CHEL) não afetou a formação de RNAm da HSP70

bem como seu acumulo intracelular. Isso sugere que, ao contrário do que ocorre em

cultura de células e com o uso de outros agentes estressores, a regulação do gene

da HSP70 no exercício agudo depende apenas da PKA, e não de ambas (MELLING

& NOBLE, 2004).

É sabido que a ativação do HSF1 envolve uma série complexa de eventos

regulatórios, que incluem a localização nuclear, oligomerização, ligação ao HSE e

finalmente à transcrição do gene (SARGE et al, 1993; WESTWOOD et al, 1991). No

entanto, em adição a estes eventos, muitos estudos têm sugerido outro mecanismo

de controle: a regulação da atividade de transcrição do HSF1 (JURIVICH et al, 1992;

BRUCE et al, 1993).

Numerosos estudos demonstraram que a hiperfosforilação induzida do HSF1,

seguida de sua ligação ao HSE dá inicio a sua atividade. As evidencias deste

mecanismo baseiam-se em estudos que demonstram a redução da eletromobilidade

reduzida do HSF1, após um tratamento com fosfatases (SARGE et al, 1993). Estas

observações sugerem que a fosforilação seja um mecanismo importante para a

translocação do HSF1 ao núcleo, e não a sua ativação efetiva.

Em estudos com cultura de células, o inibidor da PKC atenuou a fosforilação do

HSF1 e a subseqüente transcrição do gene da HSP70 (OHNISHI et al, 1999). A

importância da fosforilação como mecanismo regulatório da ativação do HSF1ainda

não é esclarecida, mas estudos recentes demonstraram que a ativação do HSF1

ocorre mesmo na ausência da fosforilação. Provavelmente, o exercício induz

mecanismos regulatórios intracelulares diferentes dos que controlam a ativação do

HSF1 na resposta ao choque térmico. Recentemente foi sugerido que a fosforilação

do HSF1 só seria necessária para a máxima ativação transcripcional (HOLMBERG et

al, 1998).

Foi demonstrado que a fosforilação dos resíduos de serina 303, 307 e 363

diminuem a ativação do HSF1 ao invés de ativá-lo (KNAUF et al, 1996; KLINE et al,

1997). A via repressiva da fosforilação da ser303 e 307 na regulação da atividade do

HSF1 é um potencial alvo para a proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) por

sua capacidade de fosforilar estes resíduos (XAVIER et al, 2000; CHU et al, 1998).

Foi demonstrado que a ativação de MAPK e ERK1/2, diminuem a atividade

transcripcional do HSF1, mas não alteram a sua localização, oligomerização nem a

sua ligação ao DNA (CHU et al, 1996). Estudos com a PKA demonstraram que ela

participa de inúmeras vias de sinalização das MAPK`s, incluindo ERK ½ (HAFNER et

al, 1994; DUMAZ et al, 2003).

Outras modificações pós-translacionais além da fosforilação podem participar na

regulação da atividade do HSF1. KIANG et al (1994, 1998), demonstrou a

participação dos níveis de cálcio intracelular na regulação da expressão do gene da

HSP70. Estes estudos demonstraram que o uso de quelantes de cálcio (BAPTA-AM)

atenua a elevação de RNAm de HSP70 bem como sua síntese em células cardíacas.

No coração, a PKA é o principal regulador de cálcio intracelular através da

fosforilação dos canais de cálcio tipo-L (PELZER et al, 1990; KEEF et al, 2001).

A maioria dos trabalhos que examinaram a regulação da cardioproteção mediada

por HSP70, eram focadas na PKC. Estes estudos demonstraram que a OKC é

essencial para os processos de cardioproteção, mas as evidencias da sua relação

com a expressão de HSP70 não eram conclusivas (YAMASHITA et al, 1997;

KUKREJA et al, 1999; JOYEUX et al, 1997). Em um estudo de MELLING & NOBLE

(2004), foi sugerido que a PKC não estaria envolvida nos eventos iniciais da ativação

do gene da HSP70, mas 24 horas após o exercício se faria importante, levando a um

mecanismo de proteção posterior à célula cardíaca.

Outro fator indutor da síntese de HSP70 no miocárdio e esquelético são as

mudanças bruscas de temperatura. Com o objetivo de verificar a influência da

temperatura na expressão de HSP70 em uma sessão aguda de exercício, KIM et al

(2004), realizaram um experimento com ratos Sprague-Dawley divididos em três

grupos de exercício (esteira, 17m/min, 0% de inclinação) em diferentes condições

ambientais: frio (11°C), controle (23°C) e quente (41°C). Após o exercício, a

temperatura retal dos animais foi aumentada nos grupos exercício controle e quente,

mas apresentou uma pequena queda no grupo frio. O tempo de exaustão dos animais

variou em 44±18 min (calor), 55.4±11min (frio) e 102±39min (controle). A expressão

de HSP70 foi aumentada nos grupos exercício controle e exercício calor,

permanecendo inalterada no frio. Estes dados sugerem que as temperaturas internas

aumentadas levam a expressão aumentada de HSP70.

A indução de HSP70, pelo exercício, segundo Locke et al. (1995), confere ao

miocárdio uma melhor recuperação pós-isquêmica e deve ser responsável, pelo

menos em parte, pela proteção miocárdica associada ao exercício. Em concordância

com estes autores, Powers et al. (1998) sustentam que, em ratos, a melhora da

contratilidade e a redução da peroxidação lipídica no miocárdio submetido a

condições de isquemia/reperfusão, in vivo, parece estar relacionada com aumentos

na concentração de HSP70 e na atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD)

e fosfofrutoquinase (PFK), induzidos pelo treinamento de resistência

. Locke et al.

(1995), examinando a ativação do HSF no coração de ratos Sprague-Dawley

submetidos a corrida em esteira (24 m/min) por períodos de 0, 20, 40 ou 60 min ou

até a exaustão (102 ± 7 min), observaram que esta ocorria em 80% dos animais que

corriam pelo menos 40 min. Em contraposição, Taylor et al. (1999) observaram que

sessões agudas de exercício podem ter efeitos cardioprotetores sem elevação

concomitante de HSP70.

A intensidade do exercício parece ser um fator crítico na evocação da resposta

cardioprotetora da HSP70, conforme demonstrado por Noble et al. (1999). Estes

autores examinaram a possibilidade da corrida espontânea de ratos em uma roda,

conferirem uma resposta similar àquela observada em resposta ao exercício forçado

em esteira. Eles relataram que os níveis de HSP70 eram quatro vezes maiores, em

ambos os ventrículos dos animais forçados a correr na esteira, em comparação com

o ventrículo direito dos ratos que se exercitavam espontaneamente, mesmo que

endurance

ambos tenham corrido uma distância similar. A expressão de HSP73 e HSP75, por

outro lado, não eram diferentes entre os grupos.

Para determinar os efeitos do exercício sobre a expressão de HSP70 em corações

submetidos à isquemia-reperfusão, TAYLOR et al (1999) utilizou ratas Sprague-

Dawley divididas em 1 dia de corrida (1DR), três dias (3DR), 1 dia no frio de 8°C

(1CR), sedentárias e sedentários com choque térmico (HS). O exercício era composto

de 100min a uma velocidade de 20m/min com 6° de inclinação. Os corações eram

isolados e a isquemia induzida; após esta, eram recuperados por 30 min e os dados

eram coletados. Em todos os parâmetros, o coração dos animais exercitados se

encontravam recuperados do estresse da isquemia-reperfusão, no entanto, os valores

de HSP72 nos grupos sedentários, HS, 1DR e 3DR, mas não em CR. A partir destes

dados, os autores concluíram que o exercício produz cardioproteção sem a elevação

dos níveis de HSP72.

2.9 Músculo esquelético, exercício e expressão de HSP

Células submetidas a estresse podem sobreviver ou morrer dependendo do tipo

de célula, do tipo e intensidade do estresse e de outros fatores. A exposição prévia

das células a condições estressantes não-letais pode suscitar a síntese de HSP e

proteger contra os efeitos lesivos de novas exposições (MEYER e DA SILVA, 1999).

O exercício físico de duração e intensidade adequadas é um estresse capaz de

perturbar a homeostasia celular e proporcionar estímulos como elevação de

temperatura, diminuição de pH, aumento da concentração de íons cálcio e diminuição

da disponibilidade de oxigênio (COYLE et al., 2000), assim como a redução das

reservas de glicogênio (FEHRENBACH and NIESS, 1999). Essas condições são

bastante semelhantes àquelas capazes de ativar o HSF e promover a síntese de HSP

(LOCKE and NOBLE, 1995; FEHRENBACH and NIESS, 1999). Na verdade, vários

autores afirmam que o exercício é um estímulo adequado para promover aumentos

na expressão de proteínas de estresse (LOCKE and NOBLE, 1995; ESSIG and

NOSEK, 1997; FEHRENBACH and NIESS, 1999). Em consonância com esta

afirmação está a observação de que o ritmo de síntese de HSP70 aumenta, tanto no

sóleo como no extensor longo dos dedos, após uma única sessão de exercício

(HERNANDO e MANSO, 1997). Também foram observados níveis aumentados de

mRNA codificando para HSP70, em função do exercício, choque térmico e estresse

oxidativo, em músculo cardíaco e esquelético (FEHRENBACH and NIESS, 1999).

Algumas HSP são sintetizadas com o aumento da duração do exercício, enquanto

outras são sintetizadas apenas em condições de exaustão ou próximo a ela (LOCKE

and NOBLE, 1995). Febbraio e Koukoulas (2000) examinaram o efeito do exercício

até a exaustão sobre a expressão do mRNA codificando para HSP70 em cinco

homens saudáveis que pedalaram até a exaustão numa intensidade de 63% da

captação máxima de oxigênio. Foram obtidas amostras do músculo vasto lateral e

medida a temperatura muscular em repouso, aos 10 min de exercício,

aproximadamente 40 min antes da fadiga (144 ± 7 min) e no momento em que

ocorreu a fadiga (186 ± 15 min). A temperatura muscular aumentou inicialmente (10

min) e então se manteve estável até o final do exercício. A concentração de lactato

também aumentou inicialmente (10 min), mas não era diferente dos valores de

repouso 40 min antes e no momento em que ocorreu a fadiga. O conteúdo de

glicogênio muscular, por sua vez, diminuiu progressivamente ao longo do exercício,

passando de 486 ± 74 mmol/kg de peso seco no repouso para 25 ± 7 mmol/kg de

peso seco no momento da fadiga. A concentração de mRNA HSP70 aumentou

2,2 ± 0,5 vezes 40 min antes do momento de fadiga e 2,6 ± 0,9 vezes no momento da

fadiga, mas não era diferente dos valores de repouso aos 10 min de exercício. Assim,

os dados sugerem um aumento progressivo no conteúdo de mRNA codificando para

HSP70, indicando que o exercício agudo é capaz de desencadear a resposta de

estresse.

O exercício físico é capaz de elevar a temperatura central até 44

C e a muscular

acima de 45

C (Salo et al. 1991). Esse aumento de temperatura parece ser

fundamental na expressão das HSP, uma vez que Hammond et al. (apud

FEHRENBACH and NIESS, 1999) não conseguiram demonstrar aumento na

concentração de HSP70 após uma hora de natação. Segundo Fehrenbach and Niess,

a submersão em água, neste experimento, poderia ter amenizado a elevação da

temperatura corporal. No entanto, outros fatores como a proporção de fibras do tipo I

nos grupos musculares envolvidos nesse estudo (LOCKE e NOBLE, 1995), ou que a

intensidade de exercício utilizada (NOBLE et al., 1999) também podem ter

influenciado os resultados.

O aumento coincidente na concentração de catecolaminas e na síntese de

HSP70, levou Paroo e Noble (1999) a estudarem o papel dos receptores beta-

adrenérgicos na expressão dessas proteínas. Os resultados obtidos levaram os

autores a concluir que o receptor beta-adrenérgico não induz a síntese de HSP70, per

se, mas deve estar envolvido na complexa regulação da resposta de estresse ao

exercício.

Uma das teorias para explicar a fadiga de baixa freqüência (LFF

) aponta a

interrupção de algum estágio no processo de acoplamento excitação-contração em

decorrência da desnaturação, por espécies reativas do oxigênio (ROS

), de uma ou

mais proteínas associadas com o mecanismo de liberação do Ca

do retículo

sarcoplasmático. Dado o potencial das ROS danificarem proteínas intracelulares

durante séries subseqüentes de contrações musculares, a capacidade dos sistemas

antioxidantes preexistentes deve ser complementada pela síntese de HSP induzíveis

(ESSIG and NOSEK, 1997). A quantidade de mRNA para HO-1, importante proteína

de estresse oxidativo, aumenta no músculo após repetidas contrações. A ocorrência

deste aumento depende da geração ativa de tensão, não ocorrendo no caso da

geração de tensão por processos passivos. Aumentos na expressão de mRNA

codificando para HO-1 deve fazer parte de um sistema antioxidante induzível pelo

estresse metabólico resultante de contrações musculares repetidas. A análise por

Northern blot mostrou também que o mRNA codificando para HSP70 estava 3,5 a

15,5 vezes maior do que os valores de controle (ESSIG et al. 1997).

A possibilidade das mitocôndrias de músculo cardíaco serem fonte de estresse

oxidativo, in vivo, foi confirmada por Leeuwenburgh et al. (1999) pela observação de

que o exercício determina um aumento de 50% na ocorrência de orto-tirosina, meta-

tirosina e o,o’-ditirosina nas proteínas mitocondriais. Segundo os autores, estes

marcadores aumentam em proteínas oxidadas por radical hidroxila, de modo que os

low-frequency fatigue

resultados obtidos proporcionam evidência direta de que as mitocôndrias do músculo

cardíaco produzem um intermediário semelhante ao radical hidroxila

(LEEUWENBURGH et al. 1999).

Exercícios de intensidades não habituais e extenuantes podem causar dano ao

músculo esquelético, especialmente se envolverem contrações excêntricas.

, o que

pode ser constatado, segundo Clarkson e Sayers (1999), diretamente em nível celular

(diminuição da quantidade e da atividade de proteínas transportadoras de glicose e

lactato/H

), ou indiretamente a partir de vários índices da função muscular (menor

capacidade de alongamento e de gerar tensão). O estresse fisiológico associado com

dano muscular resulta em resistência sistêmica à ação da insulina. Os mecanismos

moleculares associados a esta resistência, segundo Del Aguila, et al.(2000),

envolvem a menor ativação do IRS-1

, da fosfatidilinositol 3-quinase e da proteína

quinase B, o que leva, presumivelmente, a uma menor captação de glicose mediada

pela insulina. Uma vez que a produção de TNFα se correlaciona (r = 0,77, P < 0,05)

com a menor ação da insulina sobre a PI 3-quinase, é possível que este fator seja

responsável pela diminuição da transdução do sinal da insulina (Del AGUILA et al.

2000). Esta maior resistência à insulina poderia levar a expressão aumentada de

GRP75 e GRP78.

A atividade física prolongada também pode determinar maior expressão de

GRP75 e GRP78, na medida em que leva à progressiva depleção de glicose e das

reactive oxygen species

Contrações em que o músculo se alonga apesar de estar desenvolvendo tensão.

insulin receptor substrate-1

reservas de glicogênio muscular, fenômeno que se correlaciona fortemente com

fadiga (ESSIG and NOSEK, 1997).

Em síntese, o exercício promove a síntese de HSP por diversos mecanismos,

porém é mais provável que exista um mecanismo comum entre os vários agentes

estressores relacionados ao exercício. Além disso, deve ocorrer regulação diferencial

tanto em nível de mRNA como em nível de proteínas (FEHRENBACH and NIESS,

1999).

2.10 Músculo esquelético, treinamento físico e expressão de HSP

Considerando os benefícios da expressão de HSP pelas células ou tecidos, é

importante perguntar que efeito teria o exercício físico sistemático sobre a expressão

de HSP?

Embora existam informações limitadas sobre o assunto, o exercício físico regular

(treinamento) parece aumentar o conteúdo de HSP70 no músculo esquelético de

ratos. A extensão dos efeitos obtidos parece depender dos grupos musculares

envolvidos e do tipo de exercício empregado (LOCKE and NOBLE, 1995).

O conteúdo muscular de HSP70, em ratos, está relacionado com a proporção de

fibras que contém meromiosina pesada (MHC

) do tipo I, uma vez que a HSP70 é

expressa constitutivamente neste tipo de fibra muscular. Assim, músculos como o

sóleo, composto primariamente por fibras do tipo I, apresentam um elevado conteúdo

de HSP70, parecendo estar em um estado de choque térmico contínuo. Em

myosin heavy chain

contraste, músculos como o gastrocnêmio, composto primariamente por fibras do tipo

IIb, apresentam um baixo conteúdo de HSP70 (LOCKE and NOBLE, 1995). O

extensor longo dos dedos também apresenta uma expressão constitutiva de HSP70

menor que o sóleo, enquanto a expressão de HSP73 é semelhante (HERNANDO e

MANSO, 1997). O aumento proporcional de MHC do tipo I e de HSP que acompanha

a hipertrofia muscular compensatória do músculo plantar está de acordo com a idéia

de que este tipo de MHC está associado à expressão de proteínas de choque térmico

(LOCKE and NOBLE, 1995).

O treinamento de endurance, em ratos, aumenta a expressão basal de HSP70,

HSP73 e HSP60 nos ventrículos e no músculo sóleo, mas não nos átrios e na porção

lateral do gastrocnêmio (SAMELMAN, 2000). No entanto, Gonzalez et al. (2000)

afirma que a “up-regulation” de HSP70 em resposta ao exercício regular depende da

manutenção deste e que uma alça de retroalimentação deve restabelecer o limiar,

característico das fibras não submetidas a estresse, quando o treinamento é

interrompido.

2.11 Bombas GS-X

Plantas e animais eliminam uma vasta gama de toxinas lipofílicas do citosol

após sua conjugação com glutationa (ISHIKAWA et al, 1992; MARTINOIA et al,

1993; LI et al, 1995). Esse processo de transporte é mediado pelas bombas GS-X,

uma grande família de ATPases transportadoras de ânions dependentes de

magnésio. O termo “bomba GS-X” foi originalmente proposto, baseado na sua

atividade transportadora de conjugados de xenobióticos com alta afinidade por S-

conjugados de glutationa, dissulfeto de glutationa e cisteinil leucotrienos. As

propriedades cinéticas e a especificidade por substratos da bomba GS-X tem sido

intensamente estudados usando vesículas de membrana plasmática de diferentes

fontes biológicas. Evidencias acumulativas, sugerem que a bomba GS-X apresenta

uma larga especificidade de substratos orgânicos e que por meio disso, medeia

importantes funções fisiológicas na inflamação, estresse oxidativo, metabolismo de

xenobióticos e resistência a drogas anti-tumor.

Nos últimos anos, ocorreu um notável progresso na compreensão da natureza

molecular das bombas GS-X. A superexpressão do gene das proteínas multidroga

resistentes – MRP1 (COLE et al, 1992; ZAMAN et al, 1994) em células de câncer

humano foram primeiramente reportadas em aumentar o transporte de GS-

conjugados ATP dependente, demonstrando que o gene da MRP1 codifica a bomba

GS-X humana (MULLER et al, 1994; LEIER et al, 1994). Uma bomba GS-X

específica do fígado, chamada de cMOAT, já foi clonada de fígado de ratos e exibe

uma extensa homologia com a MRP1 humana (PAULUSMA et al, 1996; BUCHLER

et al, 1996; ITO et al, 1996). Pelo fato desta bomba ter importante papel na

eliminação de anions orgânicos nos hepatócitos, mutações no gene da cMOAT

implica em hiperbilirrubinemia associada.

2.12 Metabolismo da glutationa e a bomba GS-X

Uma das maiores funções da bomba GS-X é a excreção e/ou seqüestro de

compostos tóxicos, atuando como um sistema de proteção. O metabolismo e a

detoxificação de xenobióticos é realizado em três estágios: Na fase 1, os

xenobióticos e substancias endógenas são oxidados, reduzidos ou hidrolisados para

expor ou introduzir um grupo funcional de reatividade apropriada. A citocromo P450

outras oxidases de função mista são exemplos de enzimas da fase 1 que conferem a

eletrofilicidade requerida sobre componentes não reativos para subseqüente

metabolismo pelas enzimas da fase 2. Na fase 2, os derivados ativados são

conjugados com GSH, ácido glucurônico ou sulfato, pela ação das GSH transferases,

UDP-glucuronil transferases e sulfotransferases. Na fase 3, os conjugados são

transportados do citosol para o meio extracelular ou para compartimentos

intracelulares. O principio destas reações é que a conjugação confere a carga

negativa e aumenta a hidrossolubilidade necessária para promover a extrusão pela

bomba GS-X ou outros transportadores ainda não identificados.

A função da bomba GS-X é diretamente ligada com o metabolismo celular da

GSH. A glutatiolação do composto a ser exportado, promove a carga negativa que

permite o seu reconhecimento pela bomba GS-X. GSH apresenta duas importantes

características na sua estrutura, conhecidas como ligação γ-glutamato e grupo SH,

ambos intimamente ligados a sua estabilidade intracelular e suas funções biológicas.

O conteúdo intracelular de GSH em células de mamíferos é na ordem de 1-10mM

(MEISTER et al, 1989), que é mais elevada que a concentração de ATP. Em muitas

células, o conteúdo de GSH representa mais de 90% do total de enxofre não

protéico. Esta alta concentração intracelular de GSH é possível, pela ação da

estrutura da ligação γ-glutamato, que protege a molécula de GSH da clivagem

protéica. O grupo SH da GSH é fortemente nucleofílico e confere à molécula a

habilidade de reagir com uma grande variedade de agentes, incluindo radicais livres,

espécies reativas de oxigênio, metais pesados e componentes tóxicos eletrofílicos,

atuando na detoxificação de células vivas, bem como, possivelmente, reagindo com

diversas proteínas e enzimas e com isso alterando sua função normal.

A biossíntese de glutationa é realizada no citosol. A reação consiste de dois

passos catalisados pela γ-glutamillcisteína sintetase e pela GSH sintetase, onde cada

etapa requer uma molécula de ATP. A γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GCS) catalisa o

primeiro passo onde uma ligação amida é formada entre o grupo amino da cisteína e

o γ-carboxil do glutamato. No segundo passo, a GSH sitetase catalisa a reação entre

a glicina e o grupo carboxil da cisteína da γ-glutamilcisteína. A reação catalisada pela

γ-GCS é a etapa limite para a síntese de GSH e é controlada por feedback negativo a

partir de seu produto, GSH via inibição competitiva não alostérica (MEISTER et al,

1983).

A via de inativação de drogas mediada pela GSH é biologicamente um

mecanismo “caro”. A síntese de GSH e o transporte de S-conjugados do citosol,

requer pelo menos três moléculas de ATP em ordem de metabolizar 1 mol de

moléculas de droga. Isso parece desfavorável quando se compara com a produção

de apenas duas moléculas de ATP produzidas na glicólise a partir de uma molécula

de glicose. No entanto, como este mecanismo é encontrado nos reinos animal e

vegetal sendo ubíquo e muito bem conservado, sugere que esta via é fundamental

para a sobrevivência das células.

De fato, a GSH aparece como fundamental via de proteção de células vivas

sobre condições de estresse oxidativo (SIES et al, 1985). O conteúdo intracelular de

GSSG é mantido a níveis baixos (menos de 3% do conteúdo total de GSH) pela ação

da GSSG redutase e é aumentado pela reação da GSH peroxidase, levando a um

aumento do conteúdo intracelular de GSSG e seu efluxo da célula. O efluxo de

GSSG já foi observado em diversos tipos celulares, incluindo eritrócitos, fígado,

pulmão e coração. É importante notar que os estudos da bomba GS-X começaram

com a descoberta do efluxo de GSSG de eritrócitos humanos.

Em 1969, um trabalho feito por Srivastava e Beutler, demonstrou que o

transporte de GSSG em eritrócitos humanos era unidirecional e dependente de

energia. O transporte de GSSG ocorria mesmo contra um gradiente de concentração

e que levava quase a exaustão de ATP quando eram incubados com drogas

citotóxicas.

Em 1984, foi demonstrada pela primeira vez, a liberação de GSSG e de

conjugados de GSH a partir de corações isolados e perfundidos (ISHIKAWA et al,

1984). O coração é órgão continuamente exposto a altas concentrações de sangue

oxigenado vindo dos pulmões. As cardiomiopatias resultam de danos oriundos de

estresse oxidativo imposto por hiperoxia ou administração de certas drogas, bem

como situações de isquemia-reperfusão. O efluxo de GSSG foi sugerido como

importante mecanismo de defesa contra o estresse oxidativo (ISHIKAWA et al,

1986). A relação entre efluxo de GSSG versus a razão citosólica de ATP/ADP = 10,

sugerindo um processo de transporte ATP dependente. O efluxo de GSSG do

coração não é afetado por epinefrina, norepinefrina ou dibutiril AMP cíclico,

sugerindo que o transporte é independente de regelações hormonais α e β-

adrenérgicas (ISHIKAWA et al, 1986). A bomba GS-X cardíaca mostrou ter alta

afinidade por conjugados de glutationa com longa cadeia alifática de carbonos.

No fígado, GSSG e GS-conjugados são predominantemente excretados

na bile. Akerboom et al (1982) demonstraram que o transporte hepatobiliar de GSSG

era inibido por GS-conjugados, sugerindo a existência de um transportador comum

para GSSG e GS-conjugados. Contudo, o potencial de membrana ter sido

especulado como força de direção para o transporte de GSSG e GS-conjugados

(INOUE et al, 1984). Kobaiashi e colaboradores evidenciaram, ao utilizar vesículas

de membranas de canalículos biliares, que o transporte de S-(2,4-dinitrofenil-

glucuronídeo)-glutationa (GS-DNP) era ATP dependente. A inibição do transporte de

glucuronídeos conjugados pela GS-DNP sugeriu que a eliminação hepatobiliar

destes compostos era mediada pela bomba GS-X hepática (KOBAIASHI et al, 1991).

A descoberta de dois tipos de icterícia em ratos, mutantes para bomba GS-X,

Wistar e Sprague-Dawley levou ao aumento dos estudos sobre a bomba GS-X dos

hepatócitos. O efeito predominante era a hiperbilirrubinemia conjugada e a secreção

falha de GSH, GSSG, GS-conjugados (OUDE et al, 1989; 1990; TAKIKAWA et al,

1990), complexos GSH-metais (HOUVEN et al, 1990), conjugados de bilirrubina-

glucuronídeos (JANSEN et al, 1987) e cisteinil-leucotrienos (HUBER et al, 1987;

ISHIKAWA et al, 1990), assim como anions orgânicos (JANSEN et al, 1987;

SATHIRAKUL et al, 1993). Estes achados estimulam a idéia de que a bomba GS-X

hepatobiliar apresenta especificidade para diferentes anions orgânicos. A bomba GS-

X hepática também é conhecida como “Transportador canalicular de diferentes

anions orgânicos (cMOAT)”.

2.13 Proteínas Multidrogas Resistentes

A família das MRP`s foi introduzida na temática sobre resistência múltipla a

drogas em 1992 quando Susan Cole e Roger Deeley clonaram a proteína associada

ao gene multidroga resistente, conhecido atualmente como MRP1 (COLE et al,

1992); logo em seguida, foi clonada a MRP2 em 1996 (FLENS et al, 1996;

BUCHLER et al, 1996; TANIGUCHI et al, 1996). Posteriormente, ficou conhecido e

existência de cinco membros desta família de proteínas (KOOL et al, 1997). A MRP6

foi adicionada a este grupo em 1998 (KOOL et al, 1998 e 1999) e já foi observada a

presença de um sétimo membro desta família.

Por serem proteínas transportadoras ligadoras de ATP, são chamadas

também, de “ATP-binding cassette transporters” ou ABC transporters. Atualmente,

pelo menos 21 novos transportadores ABC diferentes já foram identificados com

base em suas seqüências conservadas de aminoácidos (ALLIKMETS et al, 1996).

Algumas destas MRP`s são conhecidas por outros nomes, como demonstrado na

figura abaixo (fig.1). MRP2, como já anteriormente dito, é conhecida como cMOAT

(JANSEN et al, 1985).

ABCC

nomenclatura

MRP

nomenclatura

Outros nomes

adotados

Interações Fisiológicas

ABCC1 MRP1 GS-X Bomba,

LTC4 ATPase, and

A mais expressa bomba carreadora MRP/GS-X.

Carreador fisiológico de LTC

and GSSG das células

DNP-SG ATPase para o espaço extracelular; co-transportadora de

componentes anfifílicos conjugados com GSH das

células.

ABCC2 MRP2 cMOAT-1 Transporte de anions inorgânicos, como bilirrubina e

compostos sulfatados e glucuronídeos, sulfatos e

glutationa conjugados na bile; co-transporte de

componentes anfifílicos conjugados com GSH sua

deficiência hereditária resulta em hiperbilirrubinemia

conjugada II/síndrome de Dubin-Johnson.

ABCC3 MRP3 cMOAT-2 or MOAT-D Transportador hepático de anions orgânicos.

ABCC4 MRP4 MOAT-B Transportador de nucleotídeos cíclicos, componentes

anti-retrovirais, e ácidos sulfatados da bile. É o

transportador de antiinflamatórios não esteróides

sensível a prostaglandinas.

ABCC5 MRP5 MOAT-C Confere resistência a drogas anti-retrovirais e

anticâncer.

ABCC6 MRP6 - Confere resistência a drogas anticâncer. Sua deficiênci

hereditária resulta em pseudoxanthoma elasticum, uma

desordem multisistêmica que afeta a pele, olhos e os

vasos sanguíneos.

ABCC7 - CFTR Medeia o transporte de GSH. É o regulador da

condutância transmembrânica na fibrose cística..

ABCC8 - SUR-1 Um receptor de sulfoniruléia não apresenta função

intrínseca de transporte, nem ativo nem passivo, mas

esta associada com a proteína do canal de potássio

Kir6.1 ou Kir6.2 que forma o canal de potássio sensível

ao ATP (K

ATP

). Implicado na persistência da

hipoglicemia hiperinsulinêmica na infância.

ABCC9 - SUR-2 Outro receptor de sulfoniruléia que não apresenta

função intrínseca de transporte . Mutações neste,

provoca ativação Na-ATP-dependente de canais de

potássio ATP-sensíveis,

com implicações que induzem

a abertura deste.

ABCC10 MRP7 -

Carreador de anions anfipáticos, para transporte17-β-

estradiol 17-(β-glucoronideo resistência a drogas

anticâncer).

ABCC11 MRP8 - Transporta purinas e pirimidinas cíclicas bem como

seus análogos.

ABCC12 MRP9 - Altamente expresso em câncer de mama.

ABCC13 - - Não é uma ABC funcional.

Figura 1. Revisão dos nomes alternativos para a família das MRP`s.

A homologia entre os membros da família das MRP`s é alta entre MRP1, 2, 3

e 6. Estes transportadores, dividem uma característica comum de apresentarem um

segmento TMDoLo (uma extensão N-terminal com cinco domínios transmembrana

conectados com um núcleo do tipo glicoproteína P – Pgp-like) (BAKOS et al, 1996;

TUSNÁDY et al, 1997). Este segmento é ausente na MRP 4 e 5, e esta estrutura

básica é essencial para a atividade transportadora na MRP1 (BAKOS et al, 1998).

2.14 A família das bombas MRP`s

Como citado anteriormente, a família das MRP`s humanas consiste de pelo

menos treze membros (ver fig.1). A estrutura das MRP`s, prevista por inúmeros

métodos computacionais, mostra notáveis semelhanças de pelo menos quatro dos

seis membros da família. Em contraste com a organização dos típicos seis

segmentos transmembrana descritos para a família da P-glicoproteína (LOO et al,

1999; AMBUDKAR et al, 1999), a MRP exibe um domínio amino-terminal adicional

representado pela extensão de aproximadamente 200 aminoácidos. Esta topologia

distingue a MRP dos outros transportadores ABC (TUSNADY et al, 1997). Os

melhores membros caracterizados são a MRP1 (COLE et al, 1992) e o membro

apicalmente localizado MRP2 (BUCHLER et al, 1996; TANIGUCHI et al, 1996). A

MRP1 consiste em uma proteína de 1531 aminoácidos, e seu gene está localizado

no cromossomo 16p13.12-13 pesando aproximadamente 200kb; contém 31 éxons e

nenhum íntron (GRANT et al, 1997). A elucidação da seqüência e da função da

MRP1 (JEDLITSCHKY et al, 1994; LEIER et al, 1994) sugere a presença funcional

de proteínas semelhantes em diversos tecidos. Por exemplo, a comparação de

transportadores obtidos a partir das membranas de vesículas dos canalículos

hepáticos de rato, resultaram na caracterização e identificação da MRP2, uma

isoforma apical da MRP1 (MAYER et al, 1995; PAULUSMA et al, 1996). Esta

proteína, além de ser encontrada na membrana dos hepatócitos, se faz presente em

outros domínios apicais como no epitélio do túbulo proximal dos glomérulos renais

(SCHAUB et al, 1997 e 1999).

A íntima relação entre MRP1 e 2 é também evidente na tipologia destes

transportadores. Diversos métodos foram utilizados para predizer a organização

transmembrana da MRP1 e 2 humana. Entre estes métodos, incluem a análise

computacional, análises mutacionais e experimentos limitados por proteólise

(BAKOS at al, 1996), assim como estudos de inserção de epítopos (KAST et al, 1998

e 1999; HIPFNER at al, 1996). A maioria dos estudos se focou na predição

topológica da MRP1, mas outros se focaram na eletrofilicidade e em programas de

predição transmembrana, demonstrando a próxima relação entre MRP1 e 2. Ambos

transportadores apresentam um núcleo estrutural para interação multidroga (MDR-

like), duas regiões transmembrana com dois domínios de ligação para ATP e uma

terceira região transmembrana amino-proximal, como se observa na figura 2.

Figura 2. Modelo topológico da estrutura da MRP1 e 5. Núcleo glicoproteína-

like (Pgp-like); Extensão N-terminal extra com cinco domínios transmembrana

(TMDo); Domínio de ligação citoplasmática (Lo).

Uma notável semelhança topológica entre ambas as proteínas foi encontrada

na região amino-terminal. A terminação amino parece ser extracitosólica na maioria

das predições; isto foi descrito primeiramente em MRP2 e depois em MRP1 (CUI et

al, 1999). Estes estudos demonstraram experimentalmente a localização extracelular

do domínio amino-terminal.

A MRP3, 4 e 5 são codificadas por diferentes genes localizados em diferentes

cromossomos. A MRP3 no cromossomo 17q21.3, a MRP4 no cromossomo 13q31-32

e a MRP5 no cromossomo 3q27 (KOOL et al, 1995). Além disso, a MRP3 é mais

bem caracterizada em respeito a sua localização e em parte a respeito de sua função

transportadora (HIROHASHI et al, 1999; KONIG et al, 1999; KOOL et al, 1999). A

distribuição tecidual da MRP3 é semelhante a MRP2, ambas expressas

abundantemente no fígado, cólon e rim (KONIG et al 1999). MRP3 é localizada

basolateralmente na membrana de hepatócitos como já estudado por microscopia de

fluorescência (KOOL et al, 1999).

Pouco se sabe a respeito da localização precisa de MRP4, 5 e 6. Sabe-se que

a MRP4 tem função de bomba de efluxo drogas contra o vírus da imunodeficiência

(SCHUCTZ et al, 1999) e que ela apresenta preferência por conjugados fosfatados,

não se sabe a respeito de sua função no transporte de GSH, glucuronídeo ou

conjugados com sulfatos. Com relação a MRP5, esta se apresenta como um

transportador de anions orgânicos conjugados com GSH. A função da MRP6

permanece desconhecida, mas recentemente foi associada à resistência ligada a

antraciclina; é altamente expressa nos rins e fígado, sendo pouco encontrada em

outros tecidos (KOOL et al, 1999). A tabela 1 resume a localização das MRP`s nos

diversos tecidos.

Atividade GS-X Transporte de

Drogas

Localização no

corpo

MRP1

SIM SIM Geral, mas pouco

no Fígado

MRP2 SIM SIM Fígado, Rim e

Intestino

MRP3 SIM SIM Fígado, Adrenais,

Pâncreas, Rim e

Intestino

MRP4 Não Sabe Não Sabe Próstata, Pulmão,

Músculo,

Pâncreas,Testículo

e ovário

MRP5 SIM Não Sabe Geral

MRP6 Não Sabe Não Sabe Fígado e Rim

Tabela 1. Isoformas de MRP. Atividade GS-X, transportadora de drogas e

localização no corpo.

2.15 Substratos e Propriedades cinéticas

Conforme discutido anteriormente, a MRP1 funciona como uma bomba ATP

dependente unidirecional para S-conjugados de glutationa-leucotrieno C4 (LEIER et

al, 1994), a especificidade pelo substrato desta proteína transportadora, foi estudada

intensamente usando vesículas de membrana de células que expressavam a

proteína recombinante em altos níveis (LEIRE et al, 1998; JEDLITSCHKY et al, 1997;

RENES et al, 1999). A faixa de substratos inclui anions anfifílicos, principalmente

compostos lipofílícos conjugados com glutationa, glucuronato ou sulfato, incluindo

cisteinil-leucotrienos, bilirrubina glucorinizada e 17β-glucuronil estradiol, assim como

componentes endógenos. Os Leucotrienos conjugados com GSH é o substrato com

maior afinidade (Km=0,1μM). O dissulfeto de glutationa também é exportado pela

MRP1, no entanto, apresenta baixa afinidade (Km=100μM) (LEIER et al, 1996),

indicando que a seu transporte no processo de estresse oxidativo á associado com a

elevação de sua concentração. O transporte de glutationa reduzida não foi detectado

nestes estudos com vesículas (LEIER et al, 1996). No entanto, a glutationa reduzida

pode servir como co-substrato neutro ou substancia catiônica. O transporte de

algumas drogas, como a vincristina e daunorubicina, só é realizado pela MRP1,

quando em presença de GSH (LOE et al, 1998). Ambas as drogas, também são

substratos para a MDR1 P-glicoproteína que, em contraste com a MRP1, transporta

estes componentes independentemente da presença de GSH (AMBUDKAR et al,

1999). Para algumas drogas citostáticas, sua conjugação com GSH ou glucuronatos

é necessária para que sejam identificadas pela proteína, sendo, por tanto, substratos

para MRP1.

A especificidade da MRP2 é, apesar de sua semelhança com a MRP1, menor

para leucotrienos C4 (cerca de 4 vezes maior) e por 17β-estradiol cerca de 5 vezes

maior (CUI et al, 1999), enquanto bilirrubina glucuronada é preferencialmente

transportada por MRP2.

A MRP3, exibe, conforme citado anteriormente, similaridade na distribuição

tecidual, mas é localizada na membrana basolateral (KONIG et al, 1999; KOOL et al,

1999), e também apresenta função de transportar conjugados, tendo alta afinidade

por glucuronisídeos e baixa afinidade por leucotrienos C4 (JEDLITSCHKY et al,

1996).

2.16 Liberação de Glutationa pelas Isoformas de MRP

O transporte de GSH de diversas células envolve os membros da família da

MRP (LOE et al, 1996 e 1998; ZAMAN et al, 1995; RAPPA et al, 1997; PAULUSMA

et al, 1999; REBBEOR et al, 1998). Isso é demonstrado pelo co-transporte, GSH

dependente, a partir da MRP1, de toxinas como a vincristina. Além disso, a MRP2 é

capaz de exportar GSH do interior de células transfectadas para o espaço

extracelular (bile) de ratos (PAULUSMA et al, 1999). Outros estudos demonstraram

que a MRP2 possui baixa afinidade pelo transporte de GSH, no entanto, como a

concentração de GSH no fígado é muito alta (5-10mM), a MRP2 pode servir como

importante mecanismo de manutenção do fluxo de substancias dependes de GSH

para a bile, bem como para o turnover hepático de GSH (PAULUSMA et al, 1999).

Interessantemente, o transporte de GSH catalisado pela MRP3 não foi identificado

(KOOL et al, 1999).

2.17 Função da MRP na Defesa contra o Estresse Oxidativo

Uma grande variedade de células e tecidos são capazes de liberar GSSG sob

condições de adição de hidriperóxidos ou outros agentes causadores de estresse

oxidativo indicando que as vias que envolvem a GSSG redutase podem ser

insuficientes para prevenir os danos oxidativos (SIES et al, 1975 e 1988;

AKERBOON et al, 1988; HOMOLYA et al, 2003). A identificação de proteínas

liberadoras de GSSG das células, como a MRP1 e 2 (LEIR et al, 1996), sugerem que

os membros da família das MRP`s sejam uma rota essencial para o controle

intracelular dos níveis de GSSG e que as MRP`s medeiem o transporte de GSSG

como um mecanismo adaptativo para compensar o estresse oxidativo quando a

GSSG redutase torna-se a etapa limitante (ver figura 3). A liberação do conteúdo de

GSSG é considerada um importante mecanismo de manutenção do potencial redox

induzido pelos grupos tiols reduzidos. É consistente com esta visão que o estresse

oxidativo aumente a expressão de MRP1 em cultura de células (YAMANE et al,

1998). Em astrócitos de ratos submetidos a estresse oxidativo, já foi verificado que a

bomba MRP1 medeia à liberação de GSSG em uma tentativa de defender-se contra

os efeitos do estresse oxidativo, mantendo o estado redox inalterado (HIRRLINGER

et al, 2001).

Figura 3. MRP1 e 2 mediando o transporte de GSSG quando este, causado pela

saturação das vias da GSSG redutase, começa a acumular-se intracelularmente.

Provável mecanismo de defesa contra os danos do estresse oxidativo. (SIES et al,

1988 e HOMOLYA et al, 2003).

2.18 Regulação dos genes de MRP por sinais de estresse

Atualmente sabe-se muito pouco a respeito das vias de sinalização que

controlam a função e expressão das MRP`s, tanto que as seqüências do promotor de

seu gene ainda não foram identificadas. No entanto, as vias de regulação do gene da

MRP parece ocorrer através de estímulos de fatores externos. Sabe-se, por exemplo,

que a irradiação gama em linhagens de células T humana causa aumento de até seis

vezes os níveis do RNAm de mrp1 (OOSTHUIZEN et al, 2000; HARVIE et al, 1997).

Estudos recentes apontaram diversas ligações entre a atividade da p53 e a

expressão de mrp1. A p53, aparentemente reduz a transcrição de mrp1 (VOLM et al,

1993) e em células mutantes com a p53 inativadas, os níveis de RNAm de mrp1

apresentam-se elevadas. A regulação negativa a partir da p53 parece ocorrer através

de seus efeitos na transcrição de um ativador Sp-1 (WANG et al, 2000).

Contrariamente, um estudo recente indicou que a expressão de mrp1 em

células cancerígenas de esôfago não é controlada por choque térmico (STEIN et al,

1997). No entanto, esta evidencia é limitada e novos estudos em diferentes linhas de

células devem ser realizados.

Fatores inflamatórios demonstraram reduzir a atividade e a expressão de mrp2

ao nível do RNAm . Esta regulação a menor (“dowregulation”) parece ocorrer durante

a liberação de citocinas infllamatórias, como já demonstrado em camundongos

tratados com IL-6, IL-8β e TNF-α. Além disso, agentes antiinflamatórios como a

dexametasona previnem grandes mudanças na expressão de MRP2 induzidas pela

inflamação (KUBITZ et al, 1999). Recentemente foi demonstrado que alterações no

estado redox celular podem induzir o aumento da expressão de MRP1 e 2

(KAUFFMANN et al, 2002).

A resistência a drogas anticâncer em pacientes com câncer de próstata, é

associada a mutações no gene da PTEN, uma fosfatase que participa na inativação

da via fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K). Aparentemente, o aumento da atividade da

PI3K leva a aumento da resistência a drogas anticâncer. Interessantemente, a

expressão de MRP1 mas não de MDR1 é observada. Juntos, estes dados sugerem

uma via de comunicação cruzada entre a PI3K e o controle gênico das MRP`s (LEE

et al, 2002).

Como mostrado acima, os mecanismos de regulação da expressão da MRP

ainda são carentes de estudos e, até o momento sua relação com as perturbações do

estado redox em exercício nunca foi abordada.

3. METODOLOGIA

3.1 Animais

Foram utilizados 36 ratos Wistar (Rattus norvegicus, var. albinus) adultos (3-4

meses) machos. A opção por animais machos se deve ao fato de que o estrogênio,

segundo Paroo et al. (1999), determina uma menor expressão de HSP70 em resposta

ao exercício. Os animais, obtidos junto ao Biotério do Instituto de Ciências Básicas da

Saúde – UFRGS, foram mantidos sob um ciclo de claro/escuro de 12/12 h e

temperatura ambiente de 23

C. Receberam, ad libitum, dieta comercial-padrão para

ratos de laboratório contendo aproximadamente 52% de carboidratos, 21% de

proteínas e 4% de lípides, e livre acesso à água de torneira.

3.2 Exercício

O protocolo de exercício compreendeu natação (60 minutos) em tanque contendo

água a uma temperatura entre 29-30

C, a fim de evitar que a imersão em água fria

amenize a elevação da temperatura que acompanha o exercício (FEHRENBACH and

NIESS, 1999). Para evitar que o animal flutuasse foi fixado, à cauda, um peso

correspondendo a 5% do peso corporal deste. A escolha desta carga é baseada no

estudo de GOBATTO (2001) onde foi demonstrado que ratos Wistar sedentários

submetidos a uma sessão de natação aguda, conseguem manter constantes os

níveis de lactato sangüíneo sem causar o acúmulo deste (5,5mmol/l).

3.3 Treinamento

O treinamento foi composto de sessões diárias de natação (60 minutos),

durante sete dias sem intervalos. Após a última sessão de treinamento, os animais

foram sacrificados e os tecidos extraídos para análise.

3.4 Grupos experimentais:

Os animais, divididos em pares, foram aleatoriamente distribuídos em quatro

grupos: Grupo exercício Agudo (nada 60min, sem treinamento); Grupo Controle

agudo (mantido na água, sem nadar, pelo mesmo tempo do par que nada até o

término da sessão). Grupo exercício treinado (uma semana) e controle treinado

(mantido na água, sem nadar enquanto o grupo de treinamento nada). Após a última

sessão de exercício os animais foram sacrificados e os músculos gastrocnêmio e

coração serão cirurgicamente removidos e processados para análises.

3.5 Preparações e determinações bioquímicas realizadas:

• Obtenção e Preparação dos músculos (gastrocnêmio e coração)

• Determinação do Conteúdo Intracelular de GSH e GSSG

• SDS-PAGE e Western blotting para HSP70 e MRP1

• Cálculo das Concentrações de Proteínas nas Amostras Analisadas

• Medida da atividade da ATPase de GSH (Bomba GS-X) em membranas de

músculo cardíaco e gastrocnêmio.

3.6 Determinação do conteúdo intracelular de GSH e GSSG

Para a determinação dos conteúdos intracelulares de glutationa (GSH) e

dissulfeto de glutationa (glutationa oxidada, GSSG), os tecidos (cerca de 10 mg)

foram lavados duas vezes em PBS (4°C) e imediatamente rompidos e

homogeneizados em 200 μl de ácido metafosfórico 5% (m/v) para análise cinético-

espectrofotométrica pelo método de reciclagem com o ácido 5,5'-ditiobis-[2-

nitrobenzóico] (DTNB) e GSSG redutase (GSRd) de ANDERSON (1985). A rápida

homogeneização das células e tecidos em meio ácido é um passo de extrema

importância para a inativação das tiol-transferases e γ-glutamiltranspeptidases

reponsáveis pela transformação da GSH em outros derivados peptídicos, levando a

subestimativas das concentrações reais do tripeptídeo. Além disso, a acidificação

previne a auto-oxidação da GSH que ocorre rapidamente em pH superior a 7,0

(ANDERSON, 1985; AKERBOOM & SIES, 1981). Por outro lado, apesar de a auto-

oxidação da GSH em GSSG em meio ácido ocorrer numa taxa mínima (0,1 a 0,2%

por hora), pelo fato de as concentrações intracelulares de GSSG serem naturalmente

muito baixas (menos de 1% da concentração de GSH), o processamento das

amostras para dosagem de GSSG deve ser efetuado o mais rapidamente possível, a

fim de evitar-se resultados falsamente superiores aos valores reais (AKERBOOM &

SIES, 1981). Em preparações celulares frescas (macrófagos, linfócitos e hepatócitos),

as células normalmente são submetidas à incubação com tampão de hemólise para a

retirada de eritrócitos contaminantes, uma vez que eritrócitos, por apresentarem

significativa atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH, podem

interferir nos resultados, mesmo quando em baixa densidade celular. Por isso, serão

eliminados os eritrócitos das preparações musculares a serem ensaiadas.

A primeira parte do ensaio consiste na determinação do conteúdo de glutationa "total"

(GSH + 2 GSSG), medido em equivalentes de GSH pelo método da reciclagem com

DTNB que leva à oxidação estequiométrica da GSH em GSSG com formação do

ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB) e posterior restituição da GSH pela redução

altamente específica com GSSG redutase (GSRd, EC 1.6.4.2) na presença de

NADPH. A taxa de formação de TNB, proporcional à soma inicial de GSH e GSSG, é,

então, monitorada a 412 nm (ε

TNB

= 13,6 mM

-1

.cm

-1

). Alternativamente, pode ser

monitorada a taxa de consumo de NADPH a 340 nm (ε

NADPH

= 6,22 mM

-1

.cm

-1

) ou

fluorimetricamente (excitação a 366 nm/emissão de 400-3000 nm). O método

empregado é bastante sensível, específico e reprodutível. Contudo, como a

velocidade da reação depende não somente da concentração inicial de GSH +

GSSG, mas, também, da atividade da GSRd, fatores que interfiram na atividade

enzimática, levarão invariavelmente a falsos resultados. Por isso, além de ser

utilizada sempre uma curva de calibração (0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 nmol) com padrão

de GSH precisamente preparado a cada ensaio, são efetuadas leituras de amostras

com adição de padrão, sendo, normalmente, os resultados obtidos idênticos aos

observados para as amostras separadamente. A incubação é iniciada pela adição de

700 μl de NADPH (concentração final 0,17 mM) e 100 μl de DTNB (final 1,26 mM),

ambos em tampão fosfato de sódio 143 mM (pH 7,5), a cerca de 25 μl de amostra

(em MPA 5%) num volume final 990 μl em cubeta de 1 cm de caminho óptico a 37°C,

sendo registrada a absorbância a 412 nm em jaqueta termostatizada com aquisição

direta e processamento cinético automático (em espectrofotômetro Amersham-

Pharmacia Ultrospec 2000, UK) até a estabilização das leituras (12 min). Em seguida,

são adicionados 10 μl de GSRd (atividade final na cubeta de 0,5 U/ml) sob agitação e

as amostras são analisadas espectrofotometricamente a 412 nm por cerca de 20 min

adicionais.

Antes da determinação do conteúdo de GSSG, alíquotas de 100 μl das mesmas

amostras ensaiadas para GSH "total" são retiradas para conjugação da GSH

presente com N-etilmaleimida (NEM, Fluka) segundo metodologia descrita em

AKERBOOM & SIES (1981). São adicionados, então, 35 μl de NEM 200 mM

(concentração final 50 mM) diretamente às amostras dissolvidas em MPA 5%.

Depois, a mistura é neutralizada, cuidadosamente sob agitação, até pH 5,5 pela

adição de 20 μl de KOH 2 M em tampão de ácido piperazina-N,N'-bis-

(etanossulfônico) (PIPES, Boehringer, pKa= 6,8 a 25°C, faixa de trabalho de 6,1 a

7,5) 0,3 M. A inclusão de PIPES, ou outros agentes tamponantes como MOPS (ácido

morfolinopropanossulfônico), previne alcalinização local, durante a neutralização, o

que levaria a auto-oxidação da GSH, favorecida em pHs maiores que 7,0. O excesso

de NEM, que, em concentrações tão baixas quanto 10 μM inibe o processo de

dosagem da GSSG por reciclagem em até 30% é efetuado por extração com 500 μl

de acetato de etila 3 vezes, sendo o excesso de solvente evaporado em concentrador

SpeedVac e por passagem em corrente de nitrogênio. Posteriormente, cerca de 25 μl

de amostra são ensaiados pelo método da reciclagem, como descrito para a GSH,

exceto que as amostras são inicialmente incubadas com a GSRd por 5 min a 37°C,

tendo sido monitorada a absorbância a 340 nm (consumo de NADPH) até a

estabilização. Depois, é adicionado o DTNB e as leituras a 412 nm (produção de

TNB) são acompanhadas espectrofotometricamente conforme descrito acima. A

diferença entre os valores obtidos para glutationa "total" e 2 x GSSG fornece os

valores dos conteúdos de GSH procurados (GSH = GSHtotal - 2 x GSSG).

3.7 Expressão de proteínas de choque térmico (HSP) e análises por SDS-PAGE.

Para a avaliação da indução da síntese de HSP nos modelos experimentais

apresentados, quantidades iguais de proteínas foram carregadas em gel de

poliacrilamida (a 10%) para eletroforese. Depois das corridas, foi analisada a indução

de expressão de HSP por densitometria (VDS, Amersham) ou as amostras foram

submetidas à transferência e Western blotting com identificação das HSP70 (72 e 74

kDa, componentes da principal subfamília de HSP), através do uso de anticorpos

monoclonais de camundongo contra HSP70 humana.

Para cada amostra preparada, quantidades iguais de (cerca de 20 a 100 μg,

dependendo do tamanho do gel preparado) são separadas durante 18h (16h a

9mA/gel; 2h a 18mA/gel) à temperatura ambiente (25°C) por eletroforese em gel de

poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Utiliza-se o sistema vertical Slab Gel BIO-RAD

(BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) e tampão de eletrodo constituído de Tris

a 25 mM, glicina a 192 mM e SDS a 1% (v/v), pH 8,3, usando-se 1 cm de gel de

entrada (empilhamento) a 4% (m/v) e gel de separação a 10% (m/v) em termos de

acrilamida, para corridas em géis de 20 cm em tampão de amostra redutor constituído

de Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, glicerol a 10% (v/v), SDS a 2% (v/v) e β-mercaptoetanol

a 5%, conforme descrito em SANTORO et al (1989). Como marcador de peso

molecular, utiliza-se a mistura de padrões de proteínas frias (BIO-RAD), contendo

miosina (200 kDa), fosforilase b (92,5 kDa), BSA (69 kDa), ovalbumina (46 kDa),

anidrase carbônica (30 kDa) e lisozima (14 kDa). Depois das corridas, os géis são

destacados das placas de suporte, sendo os géis de entrada removidos.

Os géis contendo amostras não destinadas a immunoblot são corados sob

agitação contínua com solução de Azul Comassie Brilhante (BIO-RAD) durante

20 min e submetidos à descoloração com agitação por cerca de 2 h em solução de

ácido acético glacial a 5% até que sejam evidenciados os padrões de peso molecular

(ainda fortemente corados contra o fundo já parcialmente descorado dos géis). Os

géis são, então, transferidos para filtro de papel Whatman 3MM, envoltos em película

de PVC e secos a 80°C por 2 h em um BIO-RAD Gel Dryer a vácuo programável.

As amostras contidas em géis destinados a processamento por Western

blotting, como descrito em ELIA & SANTORO (1994), são transferidas diretamente

para membranas de nitrocelulose (Millipore) em sistema refrigerado BIO-RAD Blot

Cell a 70 V até um total de 150 V x h. Após a transferência, as bandas, contendo

proteínas, são evidenciadas pela coloração com Vermelho Ponceaus, sal de sódio

(Sigma) a 0,3% (m/v) em solução de TCA a 3%. Após a verificação, as membranas

são descoradas em tampão TEN (Tris 50 mM pH 7,4, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM).

Antes do "immunoblotting", os filtros de nitrocelulose são hibridizados com BSA a 1%

(m/v) em água a fim de recobrirem-se as porções da membrana onde não houve

transferência de proteínas, promovendo-se, então, bloqueio de ligação inespecífica

dos anticorpos ao filtro. Para o Western blotting das HSP70, as membranas são

incubadas à temperatura ambiente durante 18 h sob agitação enérgica em tampão

TEN-Tween 20 a 0,05% (v/v) na presença de anticorpo monoclonal 3A3 de

camundongo contra HSP70 humana (Amersham), diluído a 1:1000, que reage

especificamente com o polipeptídeo de 74 kDa, HSP74 (ou HSC70, proteína

constitutiva) e com o de 72 kDa, HSP70 (ou HSP70 induzível). Depois disso, os filtros

são lavados três vezes sob agitação por 10 min com 5 ml de TEN-Tween e incubados

por 1 h com 5 ml de solução contendo o segundo anticorpo, IgG RPN 1177 (de cabra,

contra imunoglobulinas de camundongo, biotinilado, Amersham) em TEN-Tween sob

agitação. Depois disso, repete-se a lavagem dos filtros, como descrito acima e os

filtros são submetidos à reação com o conjugado streptavidin-horseradish peroxidase

(Amersham) sob agitação por 1 h adicional. Após nova lavagem, as membranas são

submetidas à reação com o revelador 4-Cl-Naftol (BIO-RAD) em tampão contendo

NaCl 83 mM, Tris-HCl 17 mM, pH 7,4 e H

a 0,15%. Imediatamente após o

aparecimento das manchas de interesse com boa resolução, os filtros são retirados

do revelador, lavados com água a fim de evitar-se superexposição e submetidos à

secagem em estufa por 30 min a 37°C. Conforme a necessidade em cada caso, as

manchas são fotografadas e levadas ao VDS Amersham Pharmacia para a aquisição

de dados e armazenamento para tratamento e análises estatísticas posteriores.

3.8 Expressão de MRP1 e análises por SDS-PAGE.

Foi utilizada a mesma técnica da análise de HSP70 por SDS-PAGE, utilizando-

se apenas de diferentes anticorpos (moclonais anti-MRP1 humana)

3.9 Cálculo das concentrações de proteínas nas amostras analisadas

Na determinação das concentrações de proteínas nas amostras, quando

demandado em cada caso, são utilizados os métodos de BRADFORD (1976) e de

LOWRY et al (1951), conforme indicado. Em ambas as determinações, são utilizadas

como padrão de referência, soluções de albumina sérica bovina (BSA) fração V

(Sigma). A razão para a escolha de um ou outro método é a sensibilidade e

interferência de certos componentes das preparações a serem analisadas. O método

de BRADFORD, baseado na ligação do Azul Comassie Brilhante G-250 0,01% (m/v)

em meio de ácido fosfórico 8,5% (m/v)-etanol 4,7% (m/v) a proteínas das amostras,

com formação de complexo que absorve intensamente a 595 nm (BIO-RAD Protein

Assay kit, Bio-Rad Laboratories, GmbH, DR), apresenta, na faixa de algumas

dezenas de microgramas de proteína ensaiada, sensibilidade um pouco maior que o

método de LOWRY et al. Este, por sua vez, baseia-se na ligação do reagente de

Folin-Ciocalteau a hidroxilas fenólicas presentes em amostras protéicas hidrolisadas

previamente em meio alcalino, com formação de complexo cromogênico que pode ser

monitorado espectrofotometricamente a 750 nm. Por outro lado, em amostras

contendo dodecilsulfato de sódio (SDS), EDTA, EGTA, sacarose, Triton X-100 e Tris,

devido à razoável interferência apresentada, optou-se pela utilização do método de

LOWRY et al.

3.10 Medida da atividade da ATPase de GSH (Bomba GS-X) em membranas de

músculo cardíaco e gastrocnêmio

Este protocolo foi desenvolvido em nosso laboratório (Kolberg et al, 2005)

para avaliarmos a capacidade de exportação de S-conjugados de GSH, pelas

membranas das células estudas, independentemente de outros fatores intracelulares

como concentração de GSH e atividade GST. Neste ensaio foi acoplada a hidrólise

de ATP, estimulada por conjugados de GSH (DNPSG sintetizado, como descrito

acima, e GSSG), ao consumo de nicotinamida adenina dinuclotídeo (NADH), em

presença de fosfoenolpiruvato (PEP), piruvato quinase (PK) e lactato desidrogenase

(LDH).

Os tecidos foram homogeneizados manualmente com tampão de extração

em uma proporção de 5ml/g de tecido. Foi utilizado um homogeneizador manual de

vidro (tipo Potter-Elvehjem), adicionada solução de fluoreto de fenil-metil-sulfonila

(PMSF, inibidor de serino-proteases do tipo quimotripsina, tripsina e trombina, bem

como de cisteíno-proteases como papaína) 100 μM, e leupeptina (inibidor de serino-

proteases e tiol-proteases, como tripsina, plasmina, proteinase K, calicreína,

papaína, trombina e catepsina A e B) a 2 μg/ml, e homogeneizado.

Seguiu centrifugação a 1000 x g por 10 min para a separação de restos

celulares, núcleos e células inteiras. O sobrenadante foi reservado e o precipitado

ressuspenso em presença de PMSF 100μM e leupeptina a 2 μg/ml. Em seguida, foi

adicionado tampão de extração, e somados os sobrenadantes que, a seguir, foram

centrifugados a 15.000 x g por 20 min para a remoção da fração mitocondrial.

Descartado o precipitado, o sobrenadante foi novamente centrifugado a 15.000 x g

por 10 min para a exclusão eventuais mitocôndrias remanescentes. Novamente, foi

descartado o precipitado e o sobrenadante centrifugado a 100.000 x g por 1 hora

para a obtenção da fração microssomal (de membranas). Descartado o

sobrenadante (fração solúvel), o precipitado (microssomos) foi homogeneizado em

homogeneizador manual de vidro (tipo Potter-Elvehjem) em 5 volumes de tampão de

extração, e centrifugado a 15.000 x g por 20 min para uma nova lavagem das

mitocôndrias contaminantes. Descartado o precipitado, o sobrenadante foi

centrifugado novamente a 100.000 x g por 1 hora para a purificação da fração

microssomal. Depois, o sobrenadante foi desprezado e o precipitado novamente

homogeneizado em homogeneizador manual de vidro (tipo Potter-Elvehjem) em

tampão Tris-Lubrol (veja a seguir, por favor) e centrifugado a 100.000 x g por 1 hora.

Esta etapa foi realizada porque a bomba GS-X pode ser solubilizada em lubrol PX

(um detergente composto de condensados de óxido de etileno com álcoois graxos

normalmente utilizado para a remoção e solubilização de certas proteínas de

membrana , como adenilil ciclase). Após a centrifugação, o precipitado do Tris-lubrol

foi descartado e o sobrenadante (contendo a atividade enzimática a ser testada) foi

reservado para ser ensaiado.

Optou-se por utilizar o detergente lubrol e não Triton-X100, pois, em

experimentos prévios, observamos que o Triton interfere muito na determinação

espectrofotométrica da enzima, provavelmente por inativar a lactato desidrogenase

e/ou a piruvato quinase utlilizadas.

O princípio da técnica desenvolvida em nosso laboratório baseia-se na

monitoração espectrofotométrica da hidrólise de ATP acoplada ao consumo de

NADH na presença de amostras de membranas, e do sistema fosfoenolpiruvato,

piruvato quinase e lactato desidrogenase (veja esquema abaixo).

onde

DNP-SG = 2,4-dinitrofenil-S-glutationa

ATP = adenosina, trifosfato

ADP= adenosina, difosfato

Pi = fosfato inorgânico

PK = piruvato quinase

LDH = lactato desidrogenase

PEP = fosfoenolpiruvato

NAD

/NADH = nicotinamida adenina dinucleotídeo forma oxidada/reduzida

PRINC

PIO

Bomba GS-X/MRP

DNP-SG

intracelular

DNP-SG

intracelular

ATP ADP+Pi

PEP Piruvato Lactato

NADH + H

NAD

máx

=340 nm

340

=6,22 mM

-1

.cm

-1

LDH

Descrição do ensaio: O ADP formado pela hidrólise do ATP na presença da

ATPase e dos substratos (GSSG ou DNP-SG) é fosforilado pela piruvato quinase

(PK, Boehringer) na presença de fosfoenolpiruvato (PEP, Sigma, que funciona como

doador do grupo fosfato), que também é adicionado à cubeta de reação.

Desfosforilado, o PEP transforma-se em piruvato que, por sua vez, é reduzido a

lactato na presença de NADH (Sigma, adicionado à cubeta) e da enzima lactato

desidrogenase (LDH, Sigma). Como o consumo de NADH é estequiométrico com a

hidrólise de ATP pela ATPase/Bomba GS-X, esta técnica permite avaliar a atividade

de bomba, monitorando o consumo de NADH a 340 nm na presença de

GS-conjugados.

Escolha do substrato: DNP-SG é um substrato mais sensível às várias isoformas

das bombas GS-X/MRP (K

< 100 μM). No entanto, o referido substrato é colorido e

absorve fortemente a 340 nm, inviabilizando qualquer determinação

espectrofotométrica nesta faixa de comprimento de onda. A alternativa mais comum

é a utilização de DNP-SG triciado. Entretanto, além de o uso de radioativos ser

sempre motivo de atenção redobrada e, sempre que possível, substituído por outra

técnica, à contagem do substrato captado por transporte ativo pelas vesículas só

pode ser feito a posteriori. A presente técnica tem o diferencial de permitir a

determinação de atividade da bomba GS-X online. No entanto, outro substrato

“incolor” deve ser utilizado. No caso presente, foi utilizado o próprio GSSG, substrato

fisiológico da ATPase e que não absorve a 340 nm. Apesar de a sensibilidade das

ATPase ao GSSG ser menor (K

> 1 mM) o dissulfeto de glutationa apresentou

perfis cinéticos idênticos aos observados quando o substrato era o DNP-SG. A única

restrição com relação do GSSG é que, por tratar-se de substância fortemente

oxidante (em termos bioquímicos) com E

= + 1,26 V, não pode ser adicionado ao

meio de incubação em concentrações superiores a 4 mM, para evitar-se a oxidação

instantânea do NADH (E

= - 0,3 V) .

ENSAIO ESPECTROFOTOMÉTRICO

• 700 μl de tampão de ensaio Tris-Sacarose (TrisHCl 10 mM, pH 7,4, sacarose 250

mM)

• 50 μl de NADH 4 mM (final 200 μM)

• 50 μl de MgCl

200 mM (final 10 mM)

• 50 μl de PEP 40 mM (final 2 mM)

• 50 μl de ATP 20 mM (final 1 mM)

• 50 μl de mistura de enzimas PK/LDH (20 U/ml de cada = final 1 U/ml de cada)

• até 30 μl de membranas solubilizadas

• 10 μl de inibidores (ouabaína, EGTA etc.)

• 10 μl de DNP-SG 10 mM (final 100 μM) para o início da corrida

monitora-se o consumo de NADH a 340 nm e 37

CÁLCULOS:

NADH/340 nm

= 6,22 mM

-1

.cm

-1

logo, 6,22 (μmol/ml)

-1

.cm

-1

. Sendo as cubetas de 1 cm

de caminho óptico, e o volume final sempre mantido em 1 ml, podemos dizer que

NADH/340 nm

= 6,22 por μmol de ATP hidrolisado na unidade de tempo. Sendo os

valores obtidos por volta de três ordens de grandeza menores que μmols, podemos

escrever:

nmols de ATP = variação da absorbância/0,00622

ou em termos cinéticos:

nmols de ATP/min/mg proteína = (variação da absorbância/min) /0,00622 x mg

proteína.

3.11 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média

± desvio padrão da média. Os

resultados de cada grupo foram avaliados através de teste "t" de Student

pareado.Foi utilizado o teste de análise de variância complementado com o teste de

comparações múltiplas de Student-Newmann-Keus. As diferenças foram

consideradas significativas para um nível de significância de, pelo menos, 5%.

RESULTADOS

4.1 Metabolismo da glutationa no miocárdio de ratos submetidos ao

exercício agudo de natação

Os resultados a seguir são apresentados em nmols/g de tecido nas variantes

de dissulfeto de glutationa (GSSG), glutationa reduzida (GSH) e glutationa total,

enquanto a relação GSSG/GSH é representada em unidades arbitrárias.

As variações no conteúdo de GSSG, GSH e a relação GSSG/GSH no

miocárdio entre os grupos controle e exercício agudo não apresentaram diferença

significativa (p≥0,05) como se pode observar nas tabela 2 e nas figuras 4, 5 e 6.

GRUPOS AMOSTRA

GSH

TOTAL GSSG GSH GSSG/GSH

EXERCÍCIO X1 4986.47

471.08 4044.31 0.1165

X2 4766.92

504.34 3758.24 0.1342

X3 3680.68

314.54 3051.60 0.1031

X4 4664.37

762.37 3139.63 0.2428

CTRL X5 3895.03

405.20 3084.63 0.1314

X6 3815.25

701.86 2411.53 0.2910

X7 5382.80

439.74 4503.32 0.0976

X8 3850.04

466.90 2916.24 0.1601

GSH GSSG GSSG/GSH

GSH

TOTAL

GRUPOS

média

Desvio

Pa média

Desvio

Pa média

Desvio

Pa média

Desvio

EXERCÍCIO 3498.45 340.07 513.08 131.28 0.149 0.045 4524.610 409.019

CTRL 3228.93 633.88 503.43 95.23 0.170 0.060 4214.695 541.203

Tabela 2. Metabolismo da Glutationa no miocárdio de ratos submetidos a exercício

físico agudo. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%.

GSSG média Coração Exercício Agudo

0.00

100.00

200.00

300.00

400.00

500.00

600.00

nmols/g tecido

Controle Agudo

Exercício Agudo

Figura 4. Conteúdo de dissulfeto de glutationa no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação. Os valores são expressos como média

± desvio

padrão da média, p

<0,05. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e

tecidos homogeneizados em MPA a 5%.

GSH média Coração Agudo

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

3500.00

4000.00

4500.00

nmols/g tecido

Coração Controle

Coração Exercício

Figura 5. Conteúdo de glutationa reduzida no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação. Os valores são expressos como média

± desvio

padrão da média, p<0,05. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e

tecidos homogeneizados em MPA a 5%.

Relação GSSG/GSH Coração

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

Unidades Arbitrárias

Coração Controle

Coração Exercício

Figura 6. Relação média de GSSG/GSH no miocárdio de ratos submetidos a

exercício físico agudo de natação. Os valores são expressos como média ± desvio

padrão da média, p

<0,05. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e

tecidos homogeneizados em MPA a 5%.

4.2 Metabolismo da glutationa no miocárdio de ratos submetidos ao exercício

agudo após treinamento de natação

Os resultados a seguir são apresentados em nmols/g de tecido nas variantes

de dissulfeto de glutationa (GSSG), glutationa reduzida (GSH) e glutationa total,

enquanto a relação GSSG/GSH é representada em unidades arbitrárias.

Não foram encontradas diferenças significativas entre os conteúdos de GSH

no miocárdio dos grupos estudados. No entanto, o grupo exercício treinado

apresentou uma redução significativa de 29% no conteúdo de dissulfeto de glutationa

com relação ao seu grupo controle. O estado redox, verificado pela relação

GSSG/GSH permaneceu inalterado entre os grupos.

GRUPOS AMOSTRA

GSH

TOTAL

GSSG GSH GSSG/GSH

EXERCÍCIO X1 8,908 680

7547.54 0.0902

X2 5,756 845

4065.08 0.2079

X3 4,707 1,057

2593.23 0.4075

CTRL X4 7,490 1,231

5027.40 0.2449

X5 5,608 1,089

4423.20 0.1941

X6 6,601 1,334

3933.00 0.3391

GSH GSSG GSSG/GSH

GSH

TOTAL

GRUPOS

média

Desvio

Pa média

Desvio

Pa média

Desvio

Pa média

Desvio

EXERCÍCIO 4735.28 1799.05 860.81 133.37 0.235 0.113 6456.910 1546.355

CTRL 4461.20 387.63 1217.90 87.04 0.259 0.052 6566.267 665.508

Tabela 3. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Metabolismo da Glutationa no miocárdio de ratos

submetidos a exercício físico agudo após treinamento de natação.

Média Dissulfeto de Glutationa Coração

0.00

200.00

400.00

600.00

800.00

1000.00

1200.00

1400.00

GSSG

nmols/g de tecido

Controle

Exercício

Figura 7. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo de dissulfeto de glutationa no miocárdio

de ratos submetidos a exercício físico agudo de natação após treinamento. Os

valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

Glutationa Reduzida Média Coração

0.00

1000.00

2000.00

3000.00

4000.00

5000.00

6000.00

7000.00

GSH

nmols/g de tecido

Controle

Exercício

Figura 8. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo de glutationa reduzida no miocárdio de

ratos submetidos a exercício físico agudo de natação após treinamento. Os valores

são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

Relação GSSG/GSH média Coração

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

GSSG/GSH

Unidades Arbitrárias

Controle

Exercício

Figura 9. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Relação média de GSSG/GSH no miocárdio de

ratos submetidos a exercício físico agudo de natação após treinamento. Os valores

são expressos como média

± desvio padrão da média., p<0,05.

4.3 Variações no metabolismo da glutationa no miocárdio entre animais

submetidos ao exercício agudo e treinados uma semana.

Repetindo os resultados anteriormente demonstrados, aqui comparamos o

comportamento das variáveis envolvidas no metabolismo da glutationa entre os

grupos controle do exercício agudo, exercício agudo não treinado, controle repouso

de uma semana e exercício agudo treinado por uma semana.

Os resultados a seguir são apresentados em nmols/g de tecido nas variantes

de dissulfeto de glutationa (GSSG), glutationa reduzida (GSH) e glutationa total,

enquanto a relação GSSG/GSH é representada em unidades arbitrárias.

Com relação ao conteúdo de glutationa reduzida no miocárdio, só foram

encontradas diferenças significativas entre os grupos controle agudo e controle

treinado (27%) e entre o grupo exercício agudo e controle treinado (21%) como se

observa na figura 10.

As concentrações de dissulfeto de glutationa médio no miocárdio foram

significativamente maiores no grupo controle treinado com relação aos grupos

controle agudo (58%), exercício agudo (57%) e exercício treinado (29%). O grupo

exercício treinado apresentou aumento de GSSG quando comparados aos grupos

controle agudo (41%) e exercício agudo (40%); como se observa na figura 11.

Quando o estado redox celular foi avaliado pela relação GSSG/GSH, verificou-

se que este permanecia inalterado, com exceção de uma diferença entre o estado

redox dos grupos exercício agudo e exercício treinado (42% maior no segundo).

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

GSH Coração

Figura 10. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de glutationa reduzida no

miocárdio. Os valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

200

400

600

800

1000

1200

1400

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

GSSG Coração

Figura 11. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de dissulfeto de glutationa no

miocárdio. Os valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

Relação GSSG/GSH Coração

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Unidades Arbitrárias

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Figura 12. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Relação média de GSSG/GSH no miocárdio. Os

valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

4.4 Metabolismo da glutationa no gastrocnêmio de ratos submetidos ao

exercício agudo de natação

Os resultados a seguir são apresentados em nmols/g de tecido nas variantes

de dissulfeto de glutationa (GSSG), glutationa reduzida (GSH) e glutationa total,

enquanto a relação GSSG/GSH é representada em unidades arbitrárias. Os

resultados obtidos nesta modalidade podem ser vistos na tabela 4.

GRUPOS AMOSTRA

GSH

TOTAL

GSSG GSH GSSG/GSH

EXERCÍCIO X1 10,746 2,723

5298.70 0.5140

X2 11,206 2,217

6771.18 0.3274

X3 9,002 2,540

3921.31 0.6478

CTRL X4 13,099 1,511 10077.38 0.1499

X5 13,858 905

14352.13 0.0653

X6 16,163 1,151

13860.85 0.0830

GSH GSSG GSSG/GSH

GSH

TOTAL

GRUPOS

média

Desvio

Pa média

Desvio

Pa média

Desvio

Pa média

Desvio

EXERCÍCIO 5330.40 1007.77 2493.58 181.23 0.496 0.114 10317.563 822.162

CTRL 12763.45 1654.02 1189.04 215.28 0.099 0.032 14373.107 1128.373

Tabela 4. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Metabolismo da Glutationa no gastrocnêmio de

ratos submetidos a exercício físico agudo, p

<0,05.

100

Com relação ao conteúdo intracelular de dissulfeto de glutationa, os animais

sedentários que foram submetidos ao exercício físico agudo apresentaram um

aumento significativo de 52% quando comparados com o seu respectivo grupo

controle, como é observado na figura 13.

Média Dissulfeto de Glutationa Gastrocnêmio

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

GSSG

nmols/g de tecido

Controle

Exercício

Figura 13. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de GSSG no gastrocnêmio de

ratos submetidos a exercício agudo de natação. Os valores são expressos como

média

± desvio padrão da média, p<0,05.

101

Como mostra a figura 14, a concentração de glutationa reduzida no

gastrocnêmio dos animais exercitados encontra-se diminuída em 58% em relação ao

grupo controle.

Glutationa Reduzida Média Gastrocnêmio

0.00

2000.00

4000.00

6000.00

8000.00

10000.00

12000.00

14000.00

16000.00

GSH

nmols/g de tecido

Controle

Exercício

Figura 14. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de glutationa reduzida no

gastrocnêmio de animais sedentários submetidos ao exercício agudo de natação. Os

valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

102

O estado redox, medido pela relação GSSG/GSH no gastrocnêmio do grupo

exercício foi 80% maior que no grupo controle, indicando a presença de estresse

oxidativo conforme a figura 15.

Relação GSSG/GSH média Gastrocnêmio

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

GSSG/GSH

Unidades Arbitrárias

Controle

Exercício

Figura 15. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Relação GSSG/GSH média no gastrocnêmio de

ratos submetidos ao exercício agudo de natação. Os valores são expressos como

média

± desvio padrão da média, p<0,05.

103

4.5 Metabolismo da glutationa no gastrocnêmio de ratos submetidos ao

exercício agudo após treinamento de natação

Os resultados a seguir são apresentados em nmols/g de tecido nas variantes

de dissulfeto de glutationa (GSSG), glutationa reduzida (GSH) e glutationa total,

enquanto a relação GSSG/GSH é representada em unidades arbitrárias. Os

resultados obtidos nesta modalidade podem ser vistos na tabela 5.

GRUPOS AMOSTRA

GSH

TOTAL

GSSG GSH GSSG/GSH

EXERCÍCIO X1 4,664 2,001

662.26 3.0210

X2 4,269 1,910

450.30 4.2405

X3 4,058 1,807

444.60 4.0641

CTRL X4 5,962 1,436

3089.40 0.4649

X5 3,876 1,841

1311.00 0.4750

X6 4,993 998

2998.20 0.3327

GSH GSSG GSSG/GSH

GSH

TOTAL

GRUPOS

média

Desv.

Pad média

Desv.

Pad média

Desv.

Pad média

Desv.

Pad

EXERCÍCIO 519.05 87.72 1905.70 68.56 3.775 0.466 4330.453 217.244

CTRL 2466.20 708.15 1425.00 298.34 0.424 0.056 4943.800 738.203

Tabela 5. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Metabolismo da Glutationa no gastrocnêmio de

ratos submetidos a exercício físico agudo após treinamento de natação, p

<0,05.

104

O conteúdo de GSH reduzida no gastrocnêmio do grupo treinado foi 78%

menor do que em seu respectivo controle. (figura 16), enquanto que a sua

concentração de dissulfeto de glutationa foi 29% maior que no grupo controle (figura

17).

Glutationa Reduzida Média Gastrocnêmio

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

3000.00

3500.00

GSH

nmols/g de tecido

Controle

Exercício

Figura 16. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de glutationa reduzida no

gastrocnêmio de animais treinados submetidos ao exercício agudo de natação. Os

valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

105

Média Dissulfeto de Glutationa Gastrocnêmio

0.00

500.00

1000.00

1500.00

2000.00

2500.00

GSSG

nmols/g de tecido

Controle

Exercício

Figura 17. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de glutationa oxidada no

gastrocnêmio de animais treinados submetidos ao exercício agudo de natação. Os

valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

106

A relação GSSG/GSH no gastrocnêmio do grupo exercício treinado, foi 88%

maior do que em seu respectivo controle. Como demonstrado na figura 18.

Relação GSSG/GSH média Gastrocnêmio

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

4.000

4.500

GSSG/GSH

Unidades Arbitrárias

Controle

Exercício

Figura 18. . Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Relação GSSG/GSH média no gastrocnêmio de

ratos treinados submetidos ao exercício agudo de natação. Os valores são

expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

107

4.6 Variações no metabolismo da glutationa no gastrocnêmio entre animais

submetidos ao exercício agudo e treinados uma semana.

Repetindo os resultados anteriormente demonstrados, aqui comparamos o

comportamento das variáveis envolvidas no metabolismo da glutationa entre os

grupos controle do exercício agudo, exercício agudo não treinado, controle repouso

de uma semana e exercício agudo treinado por uma semana.

Os resultados a seguir são apresentados em nmols/g de tecido nas variantes

de dissulfeto de glutationa (GSSG), glutationa reduzida (GSH) e glutationa total,

enquanto a relação GSSG/GSH é representada em unidades arbitrárias.

Com relação ao conteúdo de GSH reduzida foram encontradas diferenças

entre todos os grupos. O grupo controle agudo diferiu positivamente em 58% do

grupo exercício agudo, 80% do grupo controle treinado e 95% grupo exercício

treinado. O grupo agudo treinado obteve diferença significativa de 53% maior que no

grupo controle treinado e de 90% com o grupo exercício treinado. Como citado

anteriormente, ouve também diferença de 78% entre o controle treinado e o exercício

treinado.

O grupo controle agudo apresentou diferença estatística significante, em

relação ao seu conteúdo de glutationa oxidada, de 37% comparado com o grupo

exercício treinado e 52% com relação ao controle treinado. O grupo exercício

treinado apresentou seu conteúdo de GSSG 25% maior que seu controle e 23%

maior quando comparado com o grupo exercício agudo. Houve também diferença de

42% entre os grupos exercício agudo e controle treinado.

108

Na avaliação do estado redox (GSSG/GSH), o grupo controle agudo foi

diferente em 80% , 14% e 97% quando comparado respectivamente aos grupos

exercício agudo, treinado controle e exercício treinado. Entre os grupos treinado

controle e exercício treinado houve diferença de 88% e entre o exercício treinado e

exercício agudo de 49%. Estas diferenças tornam-se mais claras quando observadas

nas figuras 19, 20 e 21.

GSSG Gastrocnêmio

500

1000

1500

2000

2500

3000

nmol/g tecido

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Figura 19. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de dissulfeto de glutationa no

109

gastrocnêmio. Os valores são expressos como média ± desvio padrão da média,

<0,05.

GSH Gastrocnêmio

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

nmol/g tecido

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Figura 20. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Conteúdo médio de glutationa reduzida no

gastrocnêmio. Os valores são expressos como média

± desvio padrão da média,

<0,05.

110

Relação GSSG/GSH Gatrocnêmio

0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

Unidades Arbitrárias

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Figura 21. Animais imediatamente sacrificados após o exercício e tecidos

homogeneizados em MPA a 5%. Relação média de GSSG/GSH no gastrocnêmio.

Os valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

111

4.7 Atividade da Bomba MRP1/GS-x no gastrocnêmio e miocárdio de ratos

treinados submetidos a exercício agudo de natação.

A tabela 6 apresenta os dados obtidos a partir dos ensaios bioquímicos

realizados para identificar a atividade enzimática da bomba MRP1. O SLOPE indica

a velocidade de transporte em UI/min. O resultado final da velocide é expresso em

nmol/min/mg de proteína.

CORAÇÃO

ANIMAL SLOPE MÉDIO VELOCIDADE MÉDIA (VM) VALOR FINAL DA VM

(descontando GSSG)

MÉDIA DESVPAD EPM

R1 0,0122

144.70

145.23 8.85 5.11

R2 0,0128

154.34

R3 0,0117

136.66

R4 0,0165

213.02

201.04 10.39 6.00

R5 0,0154

195.56

R6 0,0153

194.54

GASTROCNÊMIO

ANIMAL SLOPE MÉDIO VELOCIDADE MÉDIA (VM) VALOR FINAL DA VM

(descontando GSSG)

R1 0,0134

163.99

164.52 2.45 1.42

R2 0,0133

162.38

R3 0,0136

167.20

R4 0,0136

167.20

165.60 7.37 4.25

R5 0,0139

172.03

R6 0,0130

157.56

Tabela 6. Atividade da bomba MRP1/GS-x no gastrocnêmio e miocárdio de ratos

treinados submetidos a exercício agudo de natação.

112

Os dados obtidos demonstraram que o miocárdio apresenta 21,4% mais

atividade GS-x quando comparado ao gastrocnêmio. Como pode ser observada nas

figuras 22 e 23, a atividade GS-x é alterada com o treinamento, porém a do

gastrocnêmio permanece inalterada.

Atividade Média da Bomba MRP1 no Miocárdio

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

250.00

Atividade Bomba

nmol/min/mg de proteína

Controle

Treinado

Figura 22. Atividade GS-x no miocárdio de ratos treinados. Os valores são expressos

como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

113

Atividade Média da Bomba MRP/GS-x no Gastrocnêmio

150.00

155.00

160.00

165.00

170.00

175.00

Atividade Bomba

nmol/min/mg de proteína

Controle

Treinamento

Figura 23. Atividade GS-x no gastrocnêmio de ratos treinados. Os valores são

expressos como média

± desvio padrão da média.

114

4.8 Expressão de Proteínas de Choque Térmico (HSP70) e da bomba MRP1/GS-

x no miocárdio e gastrocnêmio de ratos sedentários e treinados submetidos a

exercício físico agudo

Os resultados a seguir são apresentados como a relação da expressão de

HSP70 e MRP1 sobre a de

β-actina e os valores são demonstrados em unidades

arbitrárias.

Não houve expressão de HSP70 no miocárdio de ratos dos grupos controle

agudo tampouco do grupo submetido ao exercício agudo, por esta razão, estes

dados não foram demonstrados na tabela 6.

115

C C C G G G

Figura 24. Expressão de HSP70 em animais sedentários submetidos ao exercício

físico e seus respectivos controles sacrificados 6 horas após o exercício. A - Na

imagem superior é possível visualizar o conteúdo de

β-actina no gel de poliacrilamida

corado com commassie blue. Na imagem abaixo (B) observa-se, na membrana de

nitrocelulose, a ausência da expressão de HSP70 tanto no gastrocnêmio quanto no

miocárdio dos grupos controles. As primeiras três bandas representam o músculo

cardíaco (C) e as outras três o gastrocnêmio (G). C – Membrana de nitrocelulose dos

animais submetidos a exercício agudo.

116

G G G C C C

Figura 25. Expressão de HSP70 e MRP1 em ratos treinados sacrificados 6 horas

após o exercício. A- Bandas de actina em gel corado com commassie blue; B –

Membrana de nitrocelulose indicando a expressão de HSP70 e MRP1 no grupo

controle treinado; C - Membrana de nitrocelulose indicando a expressão de HSP70 e

MRP1 no exercício treinado. As três primeiras bandas são de amostras de

gastrocnêmio (G) e as três últimas de miocárdio (C).

MRP1

HSP70

MRP1

HSP70

117

RATO ACTINA MRP HSP70

Relação

MRP/Actina

Relação

HSP70/Actina

37287 13268 36860 0.355834 0.988548

48690 16329 37919 0.335367 0.778784

39549 15478 36373 0.391363 0.919695

Média relação 0.360855 0.895676

Desvio Padrão 0.028334 0.106925

GRUPO

TREINADO

RATO ACTINA MRP HSP70

Relação

MRP/Actina

Relação

HSP70/Actina

51587 44638 43625 0.865296 0.845659

72187 49938 50330 0.691787 0.697217

73992 62386 52172 0.843145 0.705103

Média relação 0.800076 0.749326

Desvio Padrão 0.094433 0.083519

GRUPO

CONTROLE

RATO ACTINA MRP HSP70

Relação

MRP/Actina

Relação

HSP70/Actina

49163 30820 0 0.626894

47197 25841 0 0.547514

52372 33166 0 0.633277

Média relação 0 0.602562

Desvio Padrão 0 0.04778

GRUPO

TREINADO

RATO ACTINA MRP HSP70

Relação

MRP/Actina

Relação

HSP70/Actina

52751 43567 0 0.825899

35732 38103 0 1.066355

53984 40256 0 0.745702

Média relação 0 0.879319

Desvio Padrão 0 0.166868

118

Tabela 7. Expressão de HSP70 e MRP1 no miocárdio e gastrocnêmio de ratos

treinados. Resultados em pixels e expressos sobre a relação HSP70/Actina e MRP1/

Actina em unidades arbitrárias.

Relação HSP70/Actina Coração

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Unidades Arbitrárias

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Figura 26. Expressão média de HSP70 no miocárdio de ratos sacrificados 6 horas

após o exercício. Os valores são expressos como média

± desvio padrão da média,

p<0,05.

119

Relação MRP1/Actina Coração

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Unidades Arbitrárias

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Tabela 27. Expressão de MRP1 em miocárdio de ratos sacrificados 6 horas após o

exercício. Os valores são expressos como média

± desvio padrão da média, p<0,05.

120

Relação média HSP/Actina Gastrocnêmio

0.5

1.5

2.5

Unidades Arbitrárias

Controle Agudo

Exercício Agudo

Controle Treinado

Exercício Treinado

Figura 28. Expressão de HSP70 em gastrocnêmio de ratos treinados sacrificados 6

horas após o exercício . Os valores são expressos como média

± desvio padrão da

média, p<0,05.

121

Os dados indicativos sobre a expressão de HSP70 no miocárdio demonstram

um aumento nos grupos controle treinado e exercício treinado em relação ao controle

e exercício agudo, porém não havia diferença entre eles. Por outro lado, o

gastrocnêmio apresenta um pico elevado de expressão após o exercício agudo dos

animais sedentários (61% maior que o controle treinado e 45% maior que no

exercício treinado); não apresentando expressão nos animais do grupo controle

agudo. O grupo exercício treinado expressou HSP70 28% mais que seu controle.

Com relação à expressão de MRP1, ficou claro que o gastrocnêmio de todos

os grupos não expressou a proteína em quantidade suficiente para detecção pelo

método utilizado. No miocárdio do grupo controle agudo e exercício agudo também

não ocorreram diferenças na expressão de MRP1, no entanto, está é aumentada no

grupo controle e aumentava ainda mais após o treinamento de natação de uma

semana (58%).

122

4. DISCUSSÃO

Os efeitos do estresse oxidativo, independente do tecido atingido, levam ao

dano de lípides de membrana, DNA e proteínas necessárias para a função normal

da célula. Com relação aos efeitos do estresse oxidativo e nitrosativo sobre as

proteínas , este, pode alterar a função das mesmas por um fenômeno conhecido

como glutatiolação (KLATT et al, 2000) . Este processo, se confere na adição

covalente de glutationa aos resíduos de cisteína de diversas proteínas (formando

um composto dissulfeto misto) e parece ser um candidato para explicar como as

mudanças no estado redox induzidas por estresse oxidativo e nitrosativo pode ser

transduzida a uma resposta celular funcional. Esta resposta de formação de

compostos mistos de dissulfeto parece atuar com um mecanismo tampão do

estresse oxidativo e de proteção de importantes proteínas contra a oxidação

irreversível dos resíduos críticos de cisteínas regulando a atividade enzimática

(ZIEGLER et al, 1985; THOMAS et al, 1995). A regulação da função de proteínas

ocorre principalmente pela oxidação reversível de resíduos de metionina e de

cisteína, ambos aminoácidos que apresentam enxofre em sua cadeia lateral. No

primeiro caso, a metionina pode sofrer oxidação reversível a sulfóxido (em

condições razoáveis de estresse oxidativo) ou irreversível a sulfonila (sob

condições de estresse oxidativo severo). Sob a forma de sulfóxido, a proteína

perde sua função temporariamente, mas pode, pela ação de redutases, recuperar

sua forma original. Sobre a forma de sulfonila, a proteína perde definitivamente

sua função (LEVINE et al, 1996). No segundo caso, os resíduos de cisteína

123

podem sofrer oxidação a ácidos sulfênicos (RSOH), sulfínico (RSO2H) e sulfônico

(RSO3H). Nas formas sulfínica e sulfônica, compostos de formas estáveis, a

redução não pode ser efetuada por enzimas redutases. Por outro lado sob a forma

de sulfênico, um composto instável, pode ser reduzido a sua forma original (sendo

assim um processo de oxidação reversível) ou ainda alternativamente oxidado a

sulfinato e sulfonato (processo irreversível) ou ainda formar compostos de

dissulfeto misto com GSH (CLAIBORNE et al, 1999). Conforme imaginado, o

processo de modificação oxidativa em resíduos de cisteína e a conseqüente

formação de dissulfetos mistos é totalmente dependente do estado redox celular,

e estas modificações podem ser reversíveis após o retorno ao estado redox

original (PRINZ et al, 1997). Aparentemente estas transformações sugerem uma

estratégia imediata no combate aos possíveis danos irreversíveis causados por

alterações no estado redox celular, que podem rapidamente alterar a homeostase

celular de forma extremamente prejudicial.

Em nossos resultados verificamos que as concentrações de GSH e de

GSSG, bem como o estado redox celular (razão de GSSG/GSH), encontraram-se

inalteradas no exercício agudo em relação ao controle no miocárdio. Estes

resultados se repetem ao avaliar as mesmas variáveis entre os grupos exercício

treinados e seu respectivo grupo controle. No entanto, entre os conjuntos: controle

agudo e exercício agudo versus controle treinado e exercício treinado, os valores

basais já se encontravam mais elevados no segundo conjunto. Uma vez que um

dos fatores de grande influencia no conteúdo de glutationa intracelular é a

disponibilidade de seus aminoácidos constituintes, seria possível ,para explicar

124

esse nível basal mais elevado,que a dieta tenha influenciado nos resultados dos

animais estudados. O interessante destes resultados obtidos do metabolismo da

glutationa no miocárdio dos ratos, é de que apesar da pequena diferença entre os

conjuntos estudados, o comportamento das concentrações dos componentes

estudados foi o mesmo, demonstrando que o miocárdio impede variações

significativas no estado redox, mesmo sobre influencia do estresse fisiológico

causado pelo exercício de natação.

Como proposto anteriormente, as variações no estado redox em células

cardíacas tem grande importância no que concerne a alterações na função de

proteínas. Como exemplo clássico de proteína que sofre influencia do estado

redox, está o fator de transcrição NF-

κB. Este fator apresenta uma dupla variação

de ativação ao estado redox, primeiramente, um estado pró-oxidativo é requerido

para sua ativação inicial e, a posteriori, necessita de condições reduzidas para a

sua ligação ao promotor no DNA. A primeira condição, é importante para ativar

uma enzima (IKK) responsável pela degradação da proteína regulatória negativa

do NF-

κB, a IκBα. No segundo momento, pelo fato de que condições pró-

oxidantes poderiam levar a oxidação e a conjugação com glutationa dos resíduos

essenciais de ligação deste fator de transcrição (que devem apresentar carga

positiva) junto à seqüência promotora no DNA (que apresenta carga

essencialmente negativa), e que está impediria o início da transcrição de proteínas

dependentes de sua ligação ao promotor e a sua conseqüente ativação, se faz

necessária à predominância de condições redutoras para dar inicio a transcrição

de proteínas dependentes do NF-

κB. Recentes evidências sugerem que a

125

resposta inflamatória participa no desenvolvimento da insuficiência cardíaca e que

o NF-

κB estaria diretamente ligado a esta condição (VALEN et al, 2001).

Miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca um aumento na ativação do

NF-

κB e como conseqüência uma elevação na expressão de citocinas

inflamatórias COX-2, TNF-

α iNOS e moléculas de adesão celular (CAM`s). Uma

vez que para a ativação e ligação do NF-κB se fazem necessárias condições

especificas de estado redox, é de se pensar nos benefícios de manter estável o

grau de ativação deste fator através da manutenção do estado redox celular no

miocárdio. Nossos dados sugerem que o miocárdio, mesmo durante o estresse do

exercício físico, bem como após uma semana de treinamento, é capaz de manter

constante o conteúdo de glutationa reduzida e oxidada e por conseguinte o estado

redox celular, evitando assim, possíveis ativações indesejáveis deste fator de

transcrição.

Dentre outras proteínas que podem ter sua função alterada como

conseqüência de variações redox está o canal de potássio transiente de efluxo. As

arritmias cardíacas são um dos problemas clínicos que mais contribuem com a

incidência de morte súbita, e sua causa é originada de remodelamentos dos

componentes elétricos do coração (NABAUER et al, 1995; NERBONNE et al,

2000). Apesar de os mecanismos da arritmogênese não serem completamente

conhecidos, diversos estudos sugerem que a regulação a menos (downregulation)

e a atividade dos canais de K transientes de efluxo possam estar envolvidos

(TOMASELLI et al, 1999). A perda da função deste canal, pode levar a

repolarização anormal e a possibilidade do inicio de mecanismo de reentrada da

126

corrente elétrica (PARK et al, 1997; QIN et al, 1996). Outra possível conseqüência

da alteração na funcionalidade deste canal seria o aumento do conteúdo de cálcio

intracelular a uma concentração na qual é possível o inicio de processos de

contratura e insuficiência cardíaca (KAPRIELIAN et al, 1999; WICKENDEN et al,

1998). Dentro desta perspectiva é interessante citar um trabalho de ROZANSKI et

al (2002), onde foi estudado a influencia do metabolismo positivo da glutationa (a

favor de um estado reduzido), induzido por alterações nas etapas limites da

síntese e da disponibilidade de seus aminoácidos precursores, no remodelamento

de canais de potássio em coração de ratos pós-infartados. Neste estudo foi

demonstrado que em miocárdio de ratos pós-infartados havia uma regulação a

menor dos canais de K transientes de efluxo, e que o conteúdo de GSH s

encontrava diminuído e que esta diminuição estava associada à redução das

enzimas glutationa redutase e

γ-glutamilcisteína sintetase. Após o tratamento com

N-acetilcisteína (precursor de glutationa) e de dicloroacetato (substancia que

aumenta a atividade das vias da pentose) esta alterações de regulação a menor

eram recuperadas, demonstrando que as alterações no estado redox induzidas

pelo estresse oxidativo modula esta variável.

Seguindo a mesma linha de raciocínio, os receptores de rianodina, que

medeiam a liberação de cálcio a partir do retículo sarcoplasmático, bem como a

bomba de cálcio (conhecida como SERCA), que bombeia os íons cálcio

citoplasmáticos de volta ao retículo sarcoplasmático, são ambos suscetíveis a

modificações redox. O mecanismo de ativação dos canais de rianodina do

miocárdio se difere das células musculares esqueléticas (LAMB et al, 2000). No

127

músculo esquelético este é ativado por alterações de voltagem (BERS et al,2000)

enquanto no miocárdio sua ativação ocorre estimulada por íons cálcio

citoplasmáticos aumentados, e por conseguinte aparece como um mecanismo de

amplificação onde um aumento inicial de cálcio citosólico induz um aumento ainda

maior por parte dos canais de rianodina (RIOS et al, 1991). Sendo o cálcio, um

íon que atua como segundo mensageiro ubíquo, participando de processos de

transdução dos mais variáveis, na regulação de numerosas enzimas incluindo

fosfatases, quinases, proteases fosfolipases e endonucleases, este deve ser

mantido em concentrações estreitamente controladas. A oxidação dos grupos tiol

dos canais de rianodina, induz a liberação do cálcio a partir do retículo

sarcoplasmático. Já é um fato comprovado, que mudanças na razão GSSG/GSH

(indicativo do estado redox celular) modificam a atividade do canal de rianodina

(FENG et al, 2000; XIA et al, 2000; OBA et al, 2002). Em outros estudos

realizados por ARACENA (2001) e HIDALGO (2002), foi demonstrado que

aumentos de GSSG intracelular, estimulam a liberação de cálcio a partir dos

canais de rianodina.

Com base nos comentários anteriores, fica perfeitamente claro que o

miocárdio, como órgão essencial e permanentemente ativo, deve encontrar

maneiras inteligentes de manter constantes o conteúdo de GSSG e seu estado

redox nos mais variados desafios fisiológicos, para que assim não sofra os efeitos

danosos do estresse oxidativo. Por conseguinte, nosso trabalho demonstrou que

mesmo com o estresse do exercício forçado, bem como durante o treinamento

físico, o miocárdio manteve constante seu estado redox.

128

Ao contrário do miocárdio, o gastrocnêmio sofreu grandes alterações no

estado redox celular. Analisando o conteúdo de glutationa oxidada nos grupos

estudados, é possível notar que estes apresentam um comportamento parecido,

onde o grupo exercício agudo apresenta maior conteúdo que seu controle. O

mesmo se repete entre os grupos exercício treinado e controle treinado, porém

aparentemente existe uma adaptação no que concerne a formação de GSSG ou a

sua eliminação. O conteúdo de glutationa reduzida nos grupos estudados também

apresentou comportamentos semelhantes quando comparados com seus

controles, no entanto, os níveis basais de GSH no grupo controle treinado já eram

inferiores ao controle dos animais do exercício agudo. Esta alteração pode ser

decorrente da dieta ou de possíveis alterações que o estresse da manipulação

realizado por uma semana pode ter influenciado nos dados obtidos. Quando são

observados os dados da razão GSSG/GSH verifica-se mais uma vez um

comportamento semelhante entre os grupos, onde os exercícios apresentam uma

forte alteração redox em suas células. Chama a atenção, a grande diferença

encontrada no grupo exercício treinado, onde os níveis de estado redox atingem

valores altíssimos. Para explicar este comportamento é possível especular que, o

fato dos animais em questão terem sido exercitados diariamente por apenas uma

semana possa ter ocasionado uma resposta inflamatória muscular e, como este

processo é sabidamente um fator produtor de radicais livres é possível que esta

alteração seja a causa dos resultados encontrados. Ainda na mesma linha de

raciocínio é possível pensar que as células do sistema imunológico ativadas no

processo de inflamatório, devido ao seu alto metabolismo, aumentaram o

consumo de glutamina bem como a sua produção, alterando a disponibilidade dos

129

aminoácidos necessários à síntese de glutationa no músculo. É possível também,

especular que a depleção contínua de glutationa e a não adaptação dos

transportadores bem como das enzimas relacionadas á síntese de glutationa em

apenas uma semana de treinamento, tenha levado a este estado redox

encontrado.

Para tentar explicar os resultados encontrados em ambos os tecidos no que

se referem ao metabolismo da glutationa e estado redox celular, podemos analisar

os dados obtidos na expressão e atividade da bomba MRP1/GS-X. Nossa

hipótese inicial, era de que o miocárdio poderia estar protegido dos danos

associados ao estresse oxidativo e nitrosativo por um mecanismo de transporte

ativo do conteúdo de glutationa oxidada do citosol para o meio extracelular e desta

maneira impedir alterações no estado redox celular.

Como citado na introdução, as GS-X são uma grande família de ATPases

transportadoras de ânions e dependentes de magnésio. O termo “bomba GS-X”

foi originalmente proposto, baseado na sua atividade transportadora com alta

afinidade por S-conjugados de glutationa, dissulfeto de glutationa e cisteinil

leucotrienos. Já em 1984, foi demonstrada pela primeira vez, a liberação de

GSSG e de conjugados de GSH a partir de corações isolados e perfundidos

(ISHIKAWA et al, 1984). Como as cardiomiopatias resultam de danos oriundos de

estresse oxidativo imposto por hiperoxia ou administração de certas drogas, bem

como situações de isquemia-reperfusão, o efluxo de GSSG foi sugerido como

importante mecanismo de defesa contra o estresse oxidativo (ISHIKAWA et al,

1986). A identificação de proteínas liberadoras de GSSG das células, como a

130

MRP1 e 2 (LEIR et al, 1996), sugere que os membros da família das MRP`s seja

uma rota essencial para o controle intracelular dos níveis de GSSG e que as

MRP`s medeiem o transporte de GSSG como um mecanismo adaptativo para

compensar o estresse oxidativo quando a GSSG redutase torna-se a etapa

limitante. A liberação do conteúdo de GSSG é considerada um importante

mecanismo de manutenção do potencial redox induzido pelos grupos tiols

reduzidos. Ë consistente a esta visão, que o estresse oxidativo aumente a

expressão de MRP1 em cultura de células (YAMANE et al, 1998). Em astrócitos

de ratos submetidos a estresse oxidativo, já foi verificado que a bomba MRP1

medeia à liberação de GSSG em uma tentativa de defender-se contra os efeitos

do estresse oxidativo, mantendo o estado redox inalterado (HIRRLINGER et al,

2001).

Os dados obtidos neste trabalho, demonstram que o miocárdio aumentou

significativamente sua expressão de MRP1 somente nos grupos treinado controle

e treinado exercício, sendo que a de maior significância foi neste último. Nos

outros grupos, o miocárdio não apresentou expressão suficiente para ser

identificada pelos métodos utilizados na revelação. O controle da expressão da

MRP1, bem como as vias de sinalização que a controlam são muito pouco

conhecidos. Como citado na introdução nem as seqüências do promotor de seu

gene foram identificadas. No entanto, as vias de regulação do gene da MRP

parece ocorrer através de estímulos de fatores externos, como por exemplo a

radiação (OOSTHUIZEN et al, 2000; HARVIE et al, 1997). Estudos recentes

apontaram diversas ligações entre a atividade da p53 e a expressão de mrp1. A

131

p53, aparentemente reduz a transcrição de mrp1 (VOLM et al, 1993) e em células

mutantes com a p53 inativadas, os níveis de RNAm de mrp1 apresentam-se

elevadas. A regulação negativa a partir da p53 parece ocorrer através de seus

efeitos na transcrição de um ativador Sp-1 (WANG et al, 2000). Um estudo

recente indicou que a expressão de mrp1 em células cancerígenas de esôfago

não é controlada por choque térmico (STEIN et al, 1997). No entanto, esta

evidência é limitada e novos estudos em diferentes linhagens de células devem

ser realizados. Interessantemente a resistência a drogas anticâncer em pacientes

com câncer de próstata, é associada a mutações no gene da PTEN, uma

fosfatase que participa na inativação da via fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K).

Aparentemente, o aumento da atividade da PI3K leva a aumento da resistência a

drogas anti-cancer. Interessantemente, a expressao de MRP1 mas não de MDR1

é observada. Juntos, estes dados sugerem uma via de comunicação cruzada

entre a PI3K e o controle gênico das MRP`s (LEE et al, 2002). Este último dado

cria a possibilidade de que a regulação da expressão de MRP pode ocorrer por

ativação da via PI3K ou por outros mecanismos de fosforilação. Como não

existem dados na literatura para explicar os possíveis mecanismos de expressão

da MRP1 em situaçoes de exercício físico podemos especular que tálvez,

mecanismos de fosforilação induzidos pela ação de catecolaminas (por exemplo)

podem estar involvidos no controle da expressão de MRP, a longo prazo, após o

treinamento físico. Nossos dados, de expressão de MRP1 no miocárdio sugerem

que esta bomba pode ser, pelo menos em parte, pelo controle do estado redox

celular em diversas situaçoes estressantes como o exercício físico, e que na

132

tentativa de manter contante a relação GSSG/GSH a expressão desta proteína é

aumentada.

Em contrapartida com a expressão aumentada de MRP1 no músculo

cardíaco, o gastrocnemio não apresentou expressão em decorrência do exercício

agudo de uma hora tampouco após o treinamento de uma semana. Levando-se

em consideração todas as alterações provocadas em células submetidas a

estresse oxidativo e a alterações no estado redox celular, pode-se sugerir que o

miocárdio encontra-se mais protegido que o gastrocnemio no que concerne aos

processos de mudança na função de proteínas.

Dada a importância do músculo cardíaco, era de se esperar também, uma

atividade de transporte da bomba GS-x maior em relação ao músculo esquelético.

Este fato foi confirmado em nosso trabalho onde foram encontrados, pela primeira

vez, valores nos animais controle (músculo cardíaco), maiores em relação aos

grupos controle do gastrocnêmio. A atividade da bomba GS-X no gastrocnêmio

permanece inalterada após o treinamento, porém, interessantemente o miocárdio

sofre uma significativa redução. A diminuição da atividade GS-x no miocárdio

poderia ser explicada em função de que uma expressão aumentada de MRP1 no

músculo cardíaco levaria a uma menor disponibilidade de substrato (GSSG) e por

conseguinte uma redução em sua atividade. Estas alterações, na expressão e na

atividade da MRP1 provavelmente têm importância na manutenção do estado

redox celular, impedindo alterações no conteúdo de GSSG intracelular e por

conseguinte impedindo alterações importantes na função de proteínas. A ausência

da expressão de MRP1 no gastrocnêmio, mas a demonstração de que esta

133

apresenta atividade GS-X, sugere que o método de revelação não foi sensível

para detectar alterações mínimas de expressão, ou ainda pela existencia de outra

MRP, por exemplo a MRP5, presente em diversos tecidos.

Entre as muitas estratégias desenvolvidas pelas células para lidar com

mudanças adversas no ambiente como o estresse oxidativo, a expressão de

HSP70 é uma das mais conservadas. Por esta razão, nossa hipótese era de que,

ao se realizar uma sessão aguda de exercício físico de natação, a expressão de

HSP70 encontrar-se-ia aumentada em ambos os tecidos, principalmente no

gastrocnêmio, uma vez que o miocárdio estaria mais protegido contra os efeitos

do estresse oxidativo e das variações redox, pela expressão aumentada de

MRP1.

No miocárdio, a expressão de HSP70 não foi demonstrada no grupo

controle agudo tampouco após uma sessão de exercício agudo. No entanto,

quando observamos o grupo controle treinado, a expressão de HSP70 já se

encontra aumentada e, após o exercício, não sofre alteração significativa. A

ausência da expressão desta proteína de estresse no miocárdio dos animais

submetidos ao exercício agudo poderia ser justificada pela ausência de estresse

oxidativo. Em teoria, se não há estresse oxidativo, não existira desnaturação de

proteínas e por conseguinte não se faria necessária à expressão de HSP70. No

entanto, ambos os grupos, controle treinado e exercício treinado expressaram a

proteína. Como se trata de uma proteína cuja função está associada à

cardioproteção através de inúmeros mecanismos, seria incoerente se pensar que

sua expressão não ocorresse após uma sessão de exercício agudo com animais

134

sedentários como foi demonstrado em nosso trabalho. Entretanto, cabe lembrar

que a ativação do HSF1, fator de transcrição necessário para a síntese de HSP70,

e sua fixação ao promotor no DNA é um mecanismo complexo, e que, como já

demonstrado, a simples ligação HSF1-HSE no DNA não é suficiente para induzir a

ativação transcripcional do HSF1, sugerindo um evento adicional na regulação

deste fator de transcrição (JURIVICH et al, 1992). Acredita-se que a

hiperfosforilação do HSF1 em seus resíduos de serina seguida de sua ligação ao

HSE inicie sua atividade (XIA et al, 1997). Entre os candidatos a ativadores do

HSF por fosforilação, estão a proteína quinase C ou PKC (quinase dependente de

cálcio-fosfolipídeo) e a proteína quinas A ou PKA (quinase dependente de

AMPcíclico). Durante o exercício, níveis elevados de catecolaminas no plasma e

coração levam ao aumento da atividade da PKC E PKA, e estas participam na

regulação de processos de mobilização de substratos energéticos, mudanças de

fluxo iônico, desenvolvimento de força contrátil bem como da expressão gênica

(SUGDEN et al, 1995; FRANCIS et al, 1982). Já foi demonstrado que a

administração de agonistas

β-adrenérgicos que aumentam a atividade da PKA,

potencializam a expressão de HSP70 durante uma sessão aguda de exercício

(PAROO et al, 1999), enquanto que autores demonstraram que o tratamento com

inibidores de PKC diminuía a cardioproteção induzida pelo exercício (YAMASHITA

et al, 2001). Em um estudo de MELLING & NOBLE (2004), foi sugerido que a PKC

não estaria envolvida nos eventos iniciais da ativação do gene da HSP70, mas 24

horas após o exercício se faria importante, levando a um mecanismo de proteção

posterior à célula cardíaca, abrindo a possibilidade de uma janela de controle da

135

expressão de HSP mais ampla. Este último dado, explicaria o fato da ausência da

expressão de HSP70 após o exercício agudo, uma vez que os animais foram

dissecados 6 horas após o exercício,e talvez, este tempo não foram suficientes

para induzir a expressão da proteína. Nesta mesma perspectiva, com relação à

expressão aumentada encontrada no miocárdio dos animais do grupo controle

treinado, poderia ser explicado pelo provável aumento da temperatura corporal

induzida pelo contato diário com a água aquecida (30

°C) do aquário, uma vez que

outro fator indutor da síntese de HSP70 no miocárdio e esquelético são as

mudanças bruscas de temperatura.

Com relação à expressão de HSP70 no gastrocnêmio, a ausência de sua

expressão no grupo controle agudo poderia ser explicada, em parte, assim como

no músculo cardíaco, pela provável resposta retardada ao estresse, muito após as

seis horas do exercício, e por conseguinte, essa resposta já seria visível no grupo

controle treinado, onde neste a expressão foi clara. Obviamente, por adaptações

decorridas do treinamento, a expressão de HSP70 nos animais treinados foi

menor que a dos animais sedentários submetidos ao exercício agudo, resposta

esta, já esperada.

Os nossos dados sugerem que, aparentemente, o músculo cardíaco

apresenta-se mais protegido contra os danos do estresse oxidativo bem como das

variações no estado redox induzidas pelo exercício físico, devido a sua intrínseca

capacidade aumentada de exportar, via MRP1, os excessos de GSSG formado

durante o estresse, evitando assim, importantes mudanças na função de suas

proteínas. Por sua vez, o gastrocnêmio, mais suscetível ao dano oxidativo, teria

136

como principal mecanismo de proteção à expressão de HSP70 aumentada. No

entanto, a expressão de HSP70 no miocárdio também se faz importante em

diversos mecanismos de cardioproteção.

Somados, os resultados sugerem que uma aumentada atividade GS-X

graças a um aumento na expressão da MRP1 possam ter sido uma adaptação

evolutiva importante para impedir o estresse oxidativo no miocárdio em relação ao

músculo esquelético. O significado fisiológico desses achados bem como suas

possíveis aplicações terapêuticas encontra-se em estudo em nosso laboratório.

137

5. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos no presente estudo, apresentamos as

conclusões abaixo:

1) O gastrocnêmio de animais sedentários submetidos a exercício agudo de

natação (60 min) apresenta mudanças no estado redox celular, induzidas pelo

estresse oxidativo, quando comparadas ao seu grupo controle. Apresenta

expressão aumentada de HSP70 em relação ao controle e não expressa

MRP1.

2) O gastrocnêmio de animais treinados submetidos a exercício agudo de

natação comporta-se de maneira semelhante ao músculo do animal

sedentário, porém de forma ainda mais acentuada. Expressa HSP70 de forma

significativa em relação ao seu controle, mas esta é inferior ao conteúdo

expresso no animal sedentário submetido ao exercício. . Não expressão

MRP1 e apresenta atividade GS-x baixa e inalterada com o treinamento.

3) Ao contrário do músculo gastrocnêmio, o miocárdio de animais sedentários

submetidos a exercício agudo de natação (60 min) não apresenta mudanças

no estado redox celular quando comparadas ao seu grupo controle. Não

138

apresenta expressão de HSP70 em relação ao controle seis horas após o

exercício tampouco de MRP1.

4) O miocárdio de animais treinados submetidos a exercício agudo de natação

não apresenta variações no estado redox celular quando comparados ao seu

controle. Expressa HSP70 de forma igual ao seu controle, mas esta é superior

ao conteúdo expresso no animal sedentário submetido ao exercício. Expressa

MRP1 de forma acentuada quando comparado ao seu controle e aos animais

sedentários submetidos ao exercício agudo e apresenta atividade GS-X mais

alta que o gastrocnêmio, porém esta é diminuída com o treinamento com o

treinamento.

5) Tomados num todo, nossos resultados sugerem que a expressão da MRP1 e

a conseqüente atividade das bombas GS-X no miocárdio sejam um fator

diferencial que o confere resistência ao estresse oxidativo por exportar GSSG

mais do que o músculo esquelético.

139

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