( PDF ) Avaliação dos mecanismos envolvidos na indução dos receptorees B1 para as cininas em ratos tratados localmente com LPS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA

AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA INDUÇÃO DOS

RECEPTORES B

PARA AS CININAS EM RATOS TRATADOS

LOCALMENTE COM LPS

GISELLE FAZZIONI PASSOS

Dissertação apresentada ao Curso de

Pós-graduação em Farmacologia do

Centro de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Santa Catarina,

como requisito parcial à obtenção do título

de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. João Batista Calixto

Co-orientador: Dra. Maria Martha Campos

Florianópolis - SC

2005

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PASSOS, Giselle Fazzioni. Avaliação dos mecanismos envolvidos na indução

dos receptores B

para as cininas em ratos tratados localmente com LPS.

Florianópolis, 2005, 113 p. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Curso de

Pós-graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa Catarina.

Orientador: Prof. Dr. João Batista Calixto

Co-orientadora: Dra. Maria Martha Campos

Defesa: 17/02/2005.

O [receptor B

] para as [cininas] está normalmente ausente em condições

fisiológicas, sendo expresso em processos inflamatórios ou infecciosos. Este

estudo avaliou alguns dos mecanismos envolvidos na indução do receptor B

após o tratamento com o [lipopolissacarídeo] de E. Coli (LPS) na pata de rato. A

injeção do agonista seletivo dos receptores B

, a [des-Arg

-bradicinina] (DABK),

produziu [edema] de baixa intensidade na pata de ratos normais, enquanto o pré-

tratamento local com LPS causou aumento tempo-dependente do edema à

DABK, da ativação do [fator nuclear-κB] (NF-κB) e da expressão do RNAm para o

receptor B

. Os inibidores de síntese protéica, cicloheximida ou dexametasona, ou

da ativação do NF-κB, PDTC ou TLCK, reduziram significativamente a resposta

edematogênica à DABK nos animais tratados com LPS. O edema à DABK

também foi inibido de forma significativa pelos anticorpos anti-IL-1β ou anti-TNF-

α, pela IL-10 ou pelo antagonista do receptor de IL-1, IRA. A indução dos

receptores B

pelo LPS foi acompanhada por um aumento marcante dos níveis de

IL-1β e TNF-α, da expressão da sintase do óxido nítrico induzida (iNOS) e da

migração de [neutrófilos]. Os inibidores da migração celular, fucoidina ou

anticorpo anti-CD18, o antagonista de PAF WEB 2086 ou o anticorpo anti-PMN

também reduziram significativamente o edema mediado pelos receptores B

. Por

fim, os inibidores de NOS, L-NOARG, aminoguanidina e 1400W também inibiram

marcadamente o edema à DABK. Estes dados sugerem que a produção de

[citocinas] e de óxido nítrico, a ativação do NF-κB e o influxo de neutrófilos são

eventos importantes para a indução dos receptores B

após o tratamento com

LPS.

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AGRADECIMENTOS

Ao professor Dr. João Batista Calixto, meu especial agradecimento por ter

me dado a oportunidade de iniciar minha carreira científica, pela orientação na

realização deste trabalho, pelo constante incentivo, apoio, confiança e pelo

exemplo de competência e dedicação, que guardarei por toda a vida.

À Dra. Maria Martha Campos, pela inestimável co-orientação e pela

segurança, amizade e conhecimentos transmitidos durante toda a realização

deste trabalho. Seus ensinamentos têm sido de fundamental importância para

minha formação como farmacologista.

À minha mãe, Terezinha, e ao meu irmão, Raphael, por compartilhar os

momentos de dificuldades e alegrias e, principalmente, por todo o incentivo, amor

e paciência dedicados durante toda minha vida. Obrigada por sempre acreditarem

em minha capacidade.

Ao meu namorado, Rodrigo, em quem sempre encontrei incentivo,

companheirismo e amor incondicionais. Obrigada pelas inúmeras idéias e pelo

apoio no desenvolvimento de alguns experimentos.

À grande amiga Elizabeth Soares Fernandes, pelo carinho, paciência e

atenção dispensados a mim, desde o início desta jornada. Seus ensinamentos e

seu auxílio em grande parte dos experimentos foram fundamentais na conquista

de meus objetivos.

Aos amigos Carlos Eduardo, Dani Balz, Dani Duma, Júlio, Mariem e Nara,

pelo apoio e companheirismo em todas as horas. Aprendi muito com todos vocês.

Valeu mesmo!

À Adenir, Aline, Patrícia, Rafael e Rosana, pela colaboração, ajuda, carinho

e amizade.

Ao Prof. Dr. Jamil Assreuy, que me recebeu em seu laboratório em 1998

para um estágio voluntário, permitindo que eu tivesse meu primeiro contato com o

mundo da pesquisa científica. E lhe agradeço ainda pelo exemplo e ensinamentos

que dele recebi durante o curso de Pós-graduação.

A todos os professores do Curso de Pós-graduação em Farmacologia pelo

constante companheirismo e por terem compartilhado seus conhecimentos. Aos

funcionários da Pós-graduação e do Biotério que, indiretamente, auxiliaram-me no

desenvolvimento deste trabalho.

Aos colegas de turma de mestrado Cláudia, Elisângela, Fabrício, Geison,

Marcelo, Maria e Rafael Varaschin, pela amizade e pelas informações trocadas

durante os últimos dois anos.

Aos colegas de pesquisa Ana Carolina, Ana Flávia, Cândida, Daniela Leite,

Edinéia, Eunice, Juliano, Marina, Martina, Michel, Octávio, Rafaela, Robson,

Valfredo e Wilian, e demais colegas de outros laboratórios pela amizade, apoio e

colaboração, que tornaram nossa convivência a melhor possível.

Ao Prof. Dr. Mauro M. Teixeira (UFMG), pelo auxílio, dicas e sugestões,

que foram de grande importância na realização do presente trabalho.

Aos professores Maria Christina W. de Avellar (UNIFESP) e Jorge L.

Pesquero (UFMG), por permitir a realização de alguns experimentos em seus

respectivos laboratórios.

Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo apoio financeiro.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIAÇÕES.................................................................................. i

LISTA DE FIGURAS............................................................................................ iv

RESUMO............................................................................................................. vi

ABSTRACT.......................................................................................................... viii

INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1

OBJETIVOS………………………………………………………………………….... 22

1. Objetivo geral……………………………………………………………………..... 22

2. Objetos específicos………………………………………………………………... 22

MATERIAIS E MÉTODOS………………………………………………………….... 24

1. Animais…………………………………………………………………………….... 24

2. Procedimentos experimentais……………………………………………………. 24

2.1. Medida do edema de pata…….…………………………................................ 24

2.2. Tratamento com o lipopolissacarídeo de Escherichia coli….…...................

2.3. Análise dos mecanismos envolvidos no edema de pata causado pela

des-Arg

-BK em animais pré-tratados com LPS ............................................... 26

2.3.1. Efeito da co-injeção de antagonistas seletivos para o receptor B

…....... 26

2.3.2. Influência do tratamento com inibidores de síntese protéica ................... 26

2.3.3. Participação do fator de transcrição NF-κB…....………………………......

2.3.4. Efeito da associação de anticorpos para citocinas pró-inflamatórias....... 27

2.3.5. Influência da co-injeção de citocinas antiinflamatórias............................. 27

2.3.6. Efeito do tratamento com inibidores de migração celular................…...... 28

2.3.7. Efeito do tratamento com inibidores da óxido nítrico sintase.................... 29

2.4. Detecção do RNA mensageiro para o receptor B

…………..….......……..... 29

2.5. Ativação do fator de transcrição NF-κB....................………………………...

2.6. Medida dos níveis de IL-1β e de TNF-α..........................……….………......

2.7. Medida da atividade da mieloperoxidase (MPO).............................……..... 33

2.8. Expressão da iNOS ...............................................................……….……... 34

3. Drogas e reagentes.................................……………………………………..... 36

4. Análise estatística..……………………………………………………..…………. 37

RESULTADOS………………………………………………………………………... 38

1. Caracterização da resposta edematogênica causada por agonistas

seletivos para os receptores B

e B

para as cininas em animais pré-tratados

com LPS……………………………………………………………………................

2. Efeito do tratamento com LPS sobre o aumento do RNAm para o receptor

na pata de rato...............................................................................................

3. Análise dos mecanismos envolvidos no edema de pata causado pela des-

Arg

-BK em animais pré-tratados com LPS........................................................

4. Efeito da injeção intraplantar de LPS sobre a ativação do fator de

transcrição NF-κB na pata de rato .....................................................................

5. Medida dos níveis de IL-1β e de TNF-α após o tratamento com LPS na

pata de rato.........................................................................................................

6. Medida da atividade da mieloperoxidase após o tratamento com LPS.......... 55

7. Efeito do tratamento local com LPS sobre a indução da iNOS na pata de

rato......................................................................................................................

DISCUSSÃO....................................................................................................... 58

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 80

ANEXO................................................................................................................ 113

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AMPc Adenosina 3,5-monofosfato cíclico

AP-1 Proteína de ativação-1

BCG Bacilo de Calmette-Guérin

BK Bradicinina

C Controle

CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

CINC Fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas

CREB Elemento responsivo ao AMPc

COX Ciclooxigenase

DNA Ácido desoxiribonucléico

DNAc Ácido desoxiribonucléico complementar

DO Densidade óptica

ECA Enzima conversora de angiotensina

EGF Fator de crescimento epidermal

ELISA Enzima imuno-ensaio

EMSA Ensaio de deslocamento em gel

eNOS Sintase do óxido nítrico endotelial

E.P.M. Erro padrão da média

GR Receptor de glicocorticóide

GRE Elemento responsivo a glicocorticóide

HMWK Cininogênio de alto peso molecular

IκB Proteína inibitória do NF-κB

IKK

Proteína IκB quinase

IL Interleucina

iNOS Sintase do óxido nítrico induzida

i.p. Intraperitoneal

IRA Antagonista do receptor de IL-1

IRAK Proteína quinase associada ao receptor de IL-1

JAK Janus quinase

LBP Proteína de ligação ao LPS

LMWK Cininogênio de baixo peso molecular

LPS Lipolissacarídeo

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno

MPO Mieloperoxidase

MyD88 Proteína de diferenciação mielóide 88

NF-κB Fator nuclear-κB

nNOS Sintase do óxido nítrico neuronal

NO Óxido nítrico

NOS Sintase do óxido nítrico

PAF Fator de ativação plaquetária

PAMP Padrão molecular associado à patógeno

PBS Salina tampão fosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PDTC Pirrolidina-ditiocarbamato

PMN Polimorfonuclear

PRR Receptor de reconhecimento de padrão

RHD Domínio de homologia Rel

RNA Ácido ribonucléico

RNAm Ácido ribonucléico mensageiro

RT Transcrição reversa

s.c. Subcutâneo

TGF-β Fator de crescimento transformador-β

TLCK

Nα-tosil-clorometilcetona

TLR

Receptor toll-like

TNF Fator de necrose tumoral

TRAF Fator relacionado ao receptor de TNF

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Efeito do pré-tratamento com LPS na resposta edematogênica

mediada pelos receptores B

e B

na pata de rato ........…………………………

Figura 2 - Efeito do tratamento com LPS na expressão do RNAm para o

receptor B

na pata de rato …………………………………………………..........

Figura 3 - Efeito de antagonistas seletivos para os receptores B

sobre o

edema induzido pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS .....

Figura 4 - Efeito do tratamento sistêmico com inibidores de síntese protéica

sobre o edema causado pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com

LPS ……………………......................................................................................

Figura 5 - Efeito do tratamento sistêmico com inibidores da ativação do fator

de transcrição NF-κB sobre o edema mediado pelos receptores B

na pata de

ratos pré-tratados com LPS …………..............…………………………………..

Figura 6 - Efeito do tratamento com os anticorpos anti-IL-1β, anti-TNF-α, ou

com citocinas antiinflamatórias sobre o edema induzido pela des-Arg

-BK na

pata de ratos pré-tratados com LPS ....…………………………....................….

Figura 7 - Efeito da administração de inibidores de migração sobre o edema

causado pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS..................

Figura 8 - Efeito da administração de inibidores da NOS sobre o edema

induzido pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS .…........….

Figura 9 - Efeito da administração de inibidores da NOS sobre o edema

induzido pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS .…........….

Figura 10 - Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS sobre a

ativação do fator de transcrição NF-κB .......…...……………………………….…

Figura 11 - Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS sobre os níveis

de TNF-α e IL-1β na pata de rato........................................... ………………….

Figura 12 - Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS (1 µg/pata, 1 -

48 h) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) na pata de rato...………....

Figura 13 - Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS sobre a

expressão da iNOS na pata de rato...……...........................…...........................

Figura 14 - Mecanismo proposto para a regulação da indução dos receptores

para as cininas após a administração local de LPS in vivo .……..................

RESUMO

O receptor B

para as cininas está normalmente ausente durante condições

fisiológicas, sendo rapidamente expresso em resposta a processos inflamatórios,

infecciosos ou após o trauma tecidual. O objetivo do presente estudo foi analisar

os mecanismos envolvidos no processo de indução do receptor B

após o

tratamento local com o lipopolissacarídeo de Escherichia Coli (LPS) na pata de

rato. A injeção intraplantar do agonista seletivo para os receptores B

, a des-Arg

bradicinina (des-Arg

-BK), produziu uma resposta edematogênica de baixa

intensidade na pata de ratos normais, enquanto o pré-tratamento local dos

animais com LPS causou um aumento tempo-dependente do edema à des-Arg

BK, bem como, da ativação do fator nuclear-κB (NF-κB) e da expressão do RNAm

para o receptor B

. A resposta funcional mediada pelos receptores B

na pata de

ratos tratados com LPS foi inibida significativamente pela co-injeção dos

antagonistas seletivos para os receptores B

, a des-Arg

-[Leu

]-BK ou o R715, em

conjunto com a des-Arg

-BK. Além disso, o pré-tratamento sistêmico dos animais

com os inibidores de síntese protéica, cicloheximida ou dexametasona, ou com os

inibidores da ativação do NF-κB, PDTC ou TLCK, também foi capaz de inibir

significativamente a resposta edematogênica causada pela des-Arg

-BK nos

animais tratados com LPS. O envolvimento de citocinas pró-inflamatórias foi

avaliado através do uso de anticorpos anti-IL-1β ou anti-TNF-α. Ambos os

tratamentos foram capazes de reduzir marcadamente o edema de pata induzido

pelo agonista B

. Além disso, a resposta edematogênica causada pela des-Arg

BK foi inibida de maneira significativa pelo tratamento dos animais com a citocina

antiinflamatória IL-10 ou com o antagonista natural do receptor de IL-1, IRA. O

aumento dos receptores B

na pata de rato após a administração intraplantar de

LPS foi acompanhado por um aumento marcante dos níveis de IL-1β e TNF-α,

bem como um aumento da expressão da isoforma induzida da sintase do óxido

nítrico (iNOS) e da migração de neutrófilos para o sítio inflamatório. O tratamento

dos animais com inibidores da migração celular, como a fucoidina ou o anticorpo

anti-CD18, bem como o tratamento com o antagonista do receptor do fator de

ativação plaquetária (PAF), o WEB 2086, ou a depleção dos neutrófilos através da

administração do anticorpo anti-PMN também foram capazes de reduzir

significativamente o edema mediado pelos receptores B

, confirmando a

importância do influxo celular no processo de indução deste receptor. Por fim, o

pré-tratamento dos animais com o inibidor não seletivo de NOS, L-NOARG, ou

com os inibidores seletivos de iNOS, a aminoguanidina ou o 1400W também foi

capaz de inibir marcadamente a resposta edematogênica causada pela des-Arg

BK nos animais tratados localmente com LPS. Contudo, a administração dos

inibidores de NOS em conjunto com o agonista do receptor B

não produziu

inibição da resposta edematogânica. Analisados em conjunto, estes dados

demonstram que a produção de citocinas pró-inflamatórias, a ativação do NF-κB,

a produção de óxido nítrico e o influxo de neutrófilos são eventos importantes no

processo de indução dos receptores B

após o tratamento com LPS in vivo.

ABSTRACT

The kinin B

receptors are normally absent under physiological situations,

but they are highly inducible during inflammatory and/or infectious conditions or

following tissue damage. The present study attempted to analyze some of the

mechanisms involved in kinin B

receptor upregulation following the local injection

of Escherichia Coli lipopolysaccharide (LPS) into the rat paw. The intraplantar

injection of the selective kinin B

receptor agonist des-Arg

-bradykinin (des-Arg

BK) in naive animals produced a very weak increase in rat paw oedema. In

contrast, the intraplantar injection of des-Arg

-BK in rats treated locally with LPS

induced a time-dependent increase in oedematogenic response, preceeded by the

activation of nuclear factor-κB (NF-κB) and the increase in kinin B

receptor mRNA

expression. The functional response mediated by kinin B

receptors in the rat paw

was significantly inhibited by the co-injection of the selective B

receptor

antagonists des-Arg

-[Leu

]-BK or R715 with des-Arg

-BK. Moreover, systemic

pretreatment of animals with the protein synthesis inhibitors cycloheximide or

dexamethasone, or with the NF-κB inhibitors PDTC or TLCK, were also able to

prevent des-Arg

-BK-induced increase in paw volume in LPS-treated animals. The

possible contribution of pro-inflammatory cytokines was assessed by means of

treatment with anti-IL-1β or anti-TNF-α antibodies. Both treatments markedly

reduced the oedema formation induced by the selective kinin B

receptor agonist

in LPS-treated rats. Likewise, the oedematogenic response mediated by des-Arg

BK in LPS-treated animals was significantly inhibited by the injection of the anti-

inflammatory cytokine IL-10 or the natural IL-1 receptor antagonist, IRA. The

upregulation of kinin B

receptors in the rat paw following local LPS treatment was

accompanied by a marked increase in IL-1β and TNF-α levels, as well as an

increase in the inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and a marked

influx of neutrophils to the rat paw. The treatment of animals with cellular migration

inhibitors, such as fucoidan or the anti-CD18 antibody, as well as the treatment

with the platelet-activating factor (PAF) receptor antagonist WEB 2086 or the

neutrophil depletion with anti-PMN antibody were also capable of reducing in a

significant manner the oedematogenic response mediated by kinin B

receptors,

thus confirming the pivotal role of the neutrophil influx to the functional up-

regulation of kinin B

receptors. Finally, treatment of animals with the nonselective

NOS inhibitor L-NOARG, or with the selective iNOS inhibitors aminoguanidine or

1400W, also significantly prevented the paw oedema caused by des-Arg

-BK in

LPS-treated animals. However, co-administration of the NOS inhibitors with the B

agonist failed to produce inhibition of the oedematogenic response mediated by

des-Arg

-BK. Taken together, the present results indicate that the production of

pro-inflammatory cytokines, the activation of NF-κB, the production of nitric oxide

and the neutrophil influx represent events necessary to kinin B

receptor

upregulation following local LPS administration in vivo.

INTRODUÇÃO

A inflamação pode ser definida como um conjunto de interações complexas

entre fatores solúveis e células, que ocorre nos tecidos em resposta a danos

traumáticos, infecciosos, pós-isquêmicos, tóxicos ou auto-imunes (Nathan, 2002).

O processo inflamatório é caracterizado por três eventos principais que incluem o

aumento substancial do suprimento de sangue para o local afetado, o aumento da

permeabilidade vascular e a migração de leucócitos para o sítio inflamatório. O

influxo celular é regulado por moléculas solúveis e difusíveis, produzidas

principalmente por células inflamatórias, plaquetas, células endoteliais e

mastócitos (Sharma e Buchanan, 1994; Levy, 1996). As moléculas solúveis

envolvidas na inflamação, ou mediadores inflamatórios, compreendem produtos

da degranulação de mastócitos (histamina e serotonina), mediadores lipídicos

(leucotrienos, prostaglandinas e fator de ativação plaquetária), citocinas,

quimiocinas, componentes do sistema complemento, e o óxido nítrico (NO). Além

destes, mediadores peptídicos como as cininas, neurocininas e o peptídeo

relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), entre outros, também exercem um

papel relevante no processo inflamatório.

As cininas constituem uma importante família de peptídeos biologicamente

ativos, com ações confirmadas em uma série de reações inflamatórias, presentes

em condições como sepse, dano pós-isquêmico, asma, pancreatite, diabetes,

artrite reumatóide, cistite, gastrite e câncer, além de dor e hiperalgesia (Bhoola et

al., 1997; Marceau e Bachvarov, 1998; Proud, 1998; Blais et al., 2000; Bhoola et

al., 2001; Calixto et al., 2000; 2004; Marceau e Regoli, 2004). Além disso, as

cininas possuem diversos papéis fisiológicos descritos, que abrangem a

participação no controle da pressão arterial, contração e relaxamento da

musculatura lisa e natriurese (Marceau e Bachvarov, 1998; Bascands et al.,

2003).

O estudo do sistema cininérgico teve início em 1909 quando Abelous e

Bardier observaram que a injeção de uma fração da urina humana insolúvel em

álcool produzia uma queda transitória na pressão sangüínea, quando

administrada por via endovenosa em cães anestesiados. Estas observações

foram confirmadas por Pribram e Hernheiser (1920) e por Frey (1926), que

observaram efeito semelhante após a injeção endovenosa de urina humana em

animais de diferentes espécies. O efeito hipotensor foi atribuído a uma substância

termolábil e não-dialisável presente na urina, denominada substância F (Frey e

Kraut, 1928). Posteriormente, Kraut e colaboradores (1930) encontraram

quantidades elevadas da substância F no pâncreas, sendo o órgão considerado o

sítio principal de síntese. Após essa descoberta, a substância F passou a se

chamar calicreína (do grego: kallikreas para pâncreas). Em 1937, Werle e

colaboradores demonstraram que a calicreína, quando incubada no plasma,

liberava uma potente substância contrátil a partir de um precursor inativo,

denominada calidina.

Em 1949, Rocha e Silva e colaboradores observaram que a incubação do

veneno da serpente Bothrops jararaca, ou de tripsina, com a fração

pseudoglobulina do plasma era capaz de liberar um potente agente hipotensor e

contracturante. Esta substância produzia resposta contrátil lenta em relação à

histamina e à acetilcolina, quando avaliada em preparações de íleo isolado de

cobaia. Baseados nesses resultados, os autores sugeriram o nome bradicinina

(BK) para definir a nova molécula (do grego: bradys para lento; kinesia para

movimento). Andrade e Rocha e Silva (1956) purificaram a BK, mas a seqüência

correta de aminoácidos só foi determinada em 1960 quando Boissonnas e

colaboradores sintetizaram o nonapeptídeo: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-

Arg. O advento da BK sintética permitiu o início dos estudos para a caracterização

das ações biológicas das cininas. Em 1964, Lewis demonstrou pela primeira vez a

capacidade da BK em evocar os sinais clássicos da inflamação: aumento da

permeabilidade vascular, formação de edema e dor. Mais tarde, em 1980, Regoli

e Barabé descreveram as ações fisiológicas da BK e análogos em diferentes

tecidos, relacionando as respostas observadas à ativação de dois receptores

específicos presentes na membrana celular, denominados pelos autores de

receptores B

e B

. Atualmente, a BK e cininas relacionadas têm sido implicadas

em uma série de condições patofisiológicas (Regoli e Barabé, 1980; Marceau et

al., 1998; Calixto et al., 2000; 2004; Marceau e Regoli, 2004).

A cascata de formação das cininas compreende mecanismos já bem

caracterizados (Regoli e Barabé, 1980; Proud e Kaplan, 1988; Bhoola et al., 1992;

Blais et al., 2000; Kaplan et al., 2002). O substrato para a síntese das cininas são

α-globulinas com múltiplos domínios, conhecidas como cininogênios. Em

mamíferos, foram descritos três tipos de cininogênios, que diferem em tamanho,

estrutura e função. O cininogênio de alto peso molecular (HMWK) é uma proteína

plasmática que apresenta massa molecular de 120 kDa e origina a BK. Já o

cininogênio de baixo peso molecular (LMWK) apresenta massa molecular de 66

kDa e origina a Lys-BK (calidina), embora funcione também como precursor da

BK. O LMWK está amplamente distribuído em tecidos, fibroblastos e outras

estruturas celulares do tecido conectivo. O terceiro tipo de cininogênio, o tipo T, é

encontrado unicamente em ratos e corresponde ao HMWK (Bhoola et al., 1992;

McLean et al., 2000a).

Os cininogênios são clivados por um grupo de proteases, genericamente

denominadas calicreínas, que podem ser encontradas no sangue (calicreína

plasmática) ou na maioria das glândulas exócrinas (calicreína tecidual). A

calicreína plasmática é produzida por hepatócitos e circula na corrente sangüínea

na forma inativa, chamada pré-calicreína (fator de Fletcher). A enzima ativa é

formada como conseqüência da clivagem da pré-calicreína em um processo

dependente da ativação do fator XII da coagulação sangüínea (fator de Hageman)

(Proud e Kaplan, 1988; Blais et al., 2000; Kaplan et al., 2002). A calicreína

plasmática libera BK a partir do HMWK, um processo que se encontra aumentado

em respostas inflamatórias (McLean et al., 2000a). Por outro lado, a calicreína

tecidual utiliza como substrato o LMWK, liberando Lys-BK (Werle et al., 1961;

MacDonald et al., 1988). Estudos demonstraram a secreção da calicreína tecidual

por diversos tipos celulares, sendo que em alguns tecidos a produção da enzima

ocorre em quantidades particularmente elevadas. Estes tecidos incluem os

glandulares (glândulas salivares, sudoríparas e pâncreas), além de pulmões, rins,

intestino e cérebro (McLean et al., 2000a; Kaplan et al., 2002). Ao contrário da

calicreína plasmática, a calicreína tecidual é sintetizada como um precursor, a

pró-calicreína e processada intracelularmente. Contudo, a enzima responsável

pela clivagem intracelular da pró-calicreína ainda não foi identificada (Kaplan et

al., 2002). Finalmente, uma terceira via através da qual as cininas podem ser

formadas envolve a ação de proteases celulares, liberadas em processos

inflamatórios agudos por mastócitos, basófilos e neutrófilos (Proud et al., 1985;

Proud e Kaplan, 1988; Kozik et al., 1998; Proud, 1998).

A BK possui uma meia-vida plasmática muito curta, podendo variar entre

10 e 50 segundos, conforme a espécie estudada (Décarie et al., 1996). A grande

susceptibilidade deste peptídeo à hidrólise é responsável por sua curta meia-vida.

O metabolismo e a degradação das cininas são mediados por um grupo de

enzimas denominadas cininases. A cininase II, também conhecida como enzima

conversora da angiotensina (ECA) (Erdös, 1990), é encontrada principalmente na

membrana de células endoteliais, sendo o principal mecanismo através do qual a

BK e a Lys-BK são inativadas. As ações da cininase II são exercidas através da

remoção do dipeptídeo da porção C-terminal de ambas as cininas, ocasionando

sua completa inativação. Outras peptidases, como a endopeptidase neutra e a

aminopeptidase plasmática, também exercem um importante papel no

metabolismo das cininas in vivo. A endopeptidase neutra, uma metalopeptidase

presente em células epiteliais, é responsável por cerca de 20 % da inativação da

BK, utilizando um mecanismo semelhante ao da cininase II (Gafford et al., 1983;

Bhoola et al., 1992). A aminopeptidase plasmática, por sua vez, é capaz de

converter a Lys-BK em BK por meio da clivagem de sua porção N-terminal

(Guimarães et al., 1973).

O grupo da cininase I (também conhecida como arginina carboxipeptidase)

é representado pelas enzimas carboxipeptidase N (plasma) e carboxipeptidase M

(membrana) e possui um papel menor na degradação da BK, sendo responsável

por menos de 10 % do metabolismo total do peptídeo. No entanto, a atividade da

cininase I é de importância particular, uma vez que essa enzima é responsável

pela geração dos metabólitos ativos des-Arg

-BK e Lys-des-Arg

-BK, através da

remoção do aminoácido arginina da porção C-terminal da BK e da Lys-BK,

respectivamente (Bhoola et al., 1992; Marceau et al., 1998). O metabolismo das

cininas des-Arg apresenta algumas diferenças em relação à BK e à Lys-BK. As

cininas des-Arg não reagem com arginina carboxipeptidases, uma vez que não

possuem o resíduo C-terminal correspondente. Além disso, a cininase II é capaz

de clivar o tripeptídeo C-terminal da des-Arg

-BK, embora de forma muito mais

lenta do que em relação à BK e à Lys-BK (Drapeau et al., 1991a). Estudos

demonstram ainda que a meia-vida da des-Arg

-BK exógena, no plasma ou em

preparações de tecido cardíaco, é cerca de 4 a 12 vezes maior do que a meia-

vida da BK sob as mesmas condições experimentais (Décarie et al., 1996; Blais et

al., 1997). A cininase II possui maior afinidade pela BK e pela Lys-BK do que a

cininase I. Este fato sugere que a formação dos metabólitos ativos des-Arg não

ocorre in vivo sob condições fisiológicas (Marceau, 1995). A formação destes

metabólitos pode ser observada especialmente em exsudatos inflamatórios, onde

a formação de fibrina é capaz de aumentar expressivamente a atividade das

cininases I em relação à cininase II (Campbell et al., 1990; Heindriks et al., 1990).

Uma vez liberadas, a BK, a Lys-BK e seus fragmentos, exercem uma série

de efeitos biológicos que incluem alterações na circulação periférica, como

vasodilatação, aumento do fluxo sangüíneo e da permeabilidade vascular, além

de redução da pressão sangüínea, contração ou relaxamento da musculatura lisa

e sensibilização de fibras aferentes sensoriais. As cininas são capazes ainda de

promover a liberação de diferentes mediadores pelo endotélio, induzir a

proliferação celular, regular o transporte de glicose e estimular a reabsorção

óssea (Regoli e Barabé, 1980; Bhoola et al., 1992; Regoli et al., 1998). Estes

numerosos efeitos resultam da ativação de dois receptores de membrana

específicos, denominados B

e B

. A classificação dos dois subtipos de

receptores teve origem em estudos farmacológicos conduzidos no final da década

de 70, que determinaram a ordem de potência dos agonistas cininérgicos em

preparações de órgão isolado (Regoli e Barabé, 1980). Posteriormente, esta

classificação foi confirmada através do uso de agonistas e antagonistas seletivos,

obtidos por modificações ou substituições dos aminoácidos que compõem a

estrutura das cininas (Vavrek e Stewart, 1985; Regoli et al., 1994; 1998; Stewart

et al., 1999; 2004). Assim, os receptores do tipo B

são ativados

preferencialmente pela des-Arg

-BK e pela Lys-des-Arg

-BK, enquanto que os

receptores B

são praticamente insensíveis a estes metabólitos. Por outro lado, os

receptores B

apresentam alta afinidade pela BK e pela Lys-BK, ao passo que os

peptídeos produzidos pela ação da cininase I são praticamente inativos neste

receptor.

Nas primeiras décadas após o descobrimento da BK diversas evidências

apontavam o envolvimento deste peptídeo na inflamação. Uma vez que não havia

ferramenta farmacológica capaz de bloquear as ações das cininas, estas

evidências eram obtidas através da avaliação da depleção do cininogênio nos

processos inflamatórios em larga escala. O desenvolvimento de antagonistas

seletivos para os receptores cininérgicos permitiu grandes avanços nos estudos

acerca do papel das cininas em situações fisiológicas e patológicas. Os primeiros

antagonistas seletivos para o receptor B

foram descobertos quase 10 anos antes

do desenvolvimento dos antagonistas seletivos para o receptor B

. O

desenvolvimento de antagonistas seletivos com o protótipo [Leu

]-des-Arg

-BK foi

um critério decisivo para definir a existência dos receptores B

(Regoli et al., 1977;

Regoli e Barabé, 1980). Já os primeiros antagonistas seletivos e competitivos

para os receptores B

tiveram sua estrutura baseada no protótipo [D-Phe

]-BK

(Vavrek e Stewart, 1985). Em 1991, surgiu a segunda geração de antagonistas

, com o desenvolvimento do HOE 140 (icatibante), sintetizado através da

introdução de dois aminoácidos sintéticos (Tic e Oic) nas posições 7 e 8 do

antagonista [D-Phe

]-BK (Hock et al., 1991; Wirth et al., 1991). Outros

antagonistas desta classe incluem o NPC 17731 e o NPC 17761, que apresentam

um resíduo alifático (D-cis-4-propoxiprolina) inserido na posição 7 (Kyle et al.,

1991). Em ambos os casos, as substituições realizadas produziram aumento

significativo da potência e meia-vida dos antagonistas, permitindo importantes

avanços no estudo das cininas em modelos in vivo e in vitro (Marceau et al., 1998;

Stewart, 2004). Mais tarde, a remoção da arginina C-terminal destes antagonistas

originou 2 potentes antagonistas seletivos para o receptor B

, o des-Arg

-HOE

140 e o des-Arg

-NPC 17731 (Stewart et al., 1999). A busca por antagonistas

não-peptídicos, ativos por via oral, levou ao desenvolvimento de uma terceira

geração de antagonistas seletivos para o receptor B

, que inclui o WIN 64338, o

FR 173657, o FR 167344, o NPC18884 e o bradizide. Todos estes antagonistas

foram efetivos, quando administrados por via oral, em modelos de dor e

inflamação (Sawutz et al., 1994; Griesbacher et al., 1998; De Campos et al., 1999;

Watanabe et al., 1999; Burgess et al., 2000; Griesbacher e Legat, 2000). Outros

avanços na área do desenvolvimento de bloqueadores dos receptores

cininérgicos são representados por antagonistas seletivos para o receptor B

como o R-715 e o B9958, que apresentam maior resistência à degradação por

peptidases, além de antagonistas mistos para os receptores B

e B

, como o

B9430 (Regoli et al., 1998; Marceau e Regoli, 2004; Stewart, 2004).

Recentemente, os esforços para o desenvolvimento de antagonistas não-

peptídicos seletivos para o receptor B

têm sido bem sucedidos. Antagonistas

seletivos para os receptores B

com a estrutura relacionada aos

benzodiazepínicos, diaminopiridina e dihidroquinoxalinona apresentaram ação

antinociceptiva em diferentes modelos animais (Su et al., 2003; Wood et al., 2003;

Kuduk et al., 2004). Além disso, o SSR 240612 foi o primeiro antagonista seletivo

para o receptor B

que se apresentou efetivo em diversos modelos de dor e

inflamação, quando administrado por via oral (Gougat et al., 2004).

Outra ferramenta farmacológica fundamental na caracterização dos

receptores cininérgicos como moléculas distintas foram os estudos com o uso de

radioligantes (Marceau, 1995; Hall, 1997; Marceau e Bachvarov, 1998; Blais et al.,

2000). Os primeiros estudos foram realizados em 1981 por Innis e colaboradores

com o uso de [

H]-BK, que constitui o ligante mais utilizado para a caracterização

dos receptores B

. Nos estudos que envolvem os receptores B

, o ligante mais

utilizado é a [

H]-Lys-des-Arg

-BK (Marceau et al., 1998). Até o momento, foram

realizados estudos de união específica (binding) para o receptor B

preparações teciduais ou culturas celulares específicas, tais como miométrio

uterino de rata (Liebmann et al., 1987), íleo, pulmão, traquéia, cérebro, bexiga

urinária de cobaia (Manning e Snyder, 1986; Farmer et al., 1989; 1991; Privitera et

al., 1992; Falcone et al., 1993) e fibroblastos de pulmão humano (Roscher et al.,

1983; 1990). Entretanto, para os receptores B

, a maior parte dos estudos com

radioligantes é realizada em culturas celulares, provavelmente em decorrência da

baixa densidade destes receptores nos tecidos (Hall e Morton, 1997). Os estudos

mais relevantes foram realizados em cultura de células musculares lisas da aorta

de coelhos (Schneck et al., 1994; Levesque et al., 1995), em células mesangiais

de rato (Bascands et al., 1993) e na linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7

(Burch e Kyle, 1992).

A utilização da biologia molecular como ferramenta no estudo dos

receptores cininérgicos teve início em 1991 quando McEachern e colaboradores

clonaram o receptor B

a partir do útero de ratas. Este estudo demonstrou que o

receptor B

pertence à superfamília de receptores acoplados à proteína G e

apresenta uma seqüência de 366 aminoácidos. Posteriormente, o receptor B

foi

clonado e seqüenciado a partir do DNA genômico humano e do DNA

complementar (DNAc) obtido de fibroblastos de pulmão humano, sendo que a

proteína codificada possui 364 aminoácidos, com 81% de homologia em relação

ao receptor B

de rato (Eggerickx et al., 1992; Hess et al., 1992). O gene do

receptor B

humano consiste em 3 éxons separados por dois íntrons, e está

localizado no cromossomo 14q32 (Powell et al., 1993; Ma et al., 1994a;

Kammerer et al., 1995). Mais tarde, o gene que codifica o receptor B

foi também

clonado em outras espécies animais, como camundongos (Ma et al., 1994b),

coelhos (Bachvarov et al., 1995), galinhas (Schroeder et al., 1997), cobaias

(Farmer et al., 1998), cães (Hess et al., 2001) e trutas (Duner et al., 2002). A

análise comparativa das seqüências de aminoácidos obtidas a partir de cada

espécie demonstrou uma homologia de aproximadamente 80 % (Prado et al.,

2002). A clonagem do receptor B

permitiu ainda observar diversos sítios de

importância funcional em todas as espécies de mamíferos estudadas. Estes

pontos incluem 3 sítios de N-glicosilação, 1 sítio de palmitoilação e diversos sítios

de fosforilação (Blais et al., 2000).

O receptor B

de origem humana foi clonado apenas em 1994 por Menke e

colaboradores. O receptor clonado apresentava os sete domínios transmembrana

típicos de receptores acoplados à proteína G, mas a homologia em relação ao

receptor B

mostrou-se muito baixa, de apenas 36 %. O estudo da estrutura e da

organização genômica do receptor B

de humanos demonstrou a presença de 3

éxons, separados por 2 íntrons, e uma localização muito próxima à do receptor

, no cromossomo 14q32 (Bachvarov et al., 1996; Yang e Polgar, 1996). Em

seguida, o receptor foi clonado também a partir de coelhos (MacNeil et al., 1995),

camundongos (Pesquero et al., 1996), ratos (Ni et al., 1998a), cães (Hess et al.,

2001) e macacos (Hess et al., 2002), sendo que a homologia entre os receptores

das diferentes espécies varia entre 68 e 97 %. Os maiores graus de homologia

são observados entre os receptores do camundongo e do rato (88 %) e os

receptores do homem e do macaco (97 %) (Hess et al., 2002; Prado et al., 2002).

Os avanços nos estudos de clonagem e seqüenciamento dos receptores B

e B

permitiram a utilização de técnicas de manipulação gênica. A deleção do

gene responsável pela expressão do receptor B

permitiu a avaliação do papel

deste receptor em fenômenos biológicos como o controle da pressão arterial,

inflamação, dor e hiperalgesia, assim como contração e relaxamento da

musculatura lisa (Borkowski et al., 1995; Alfie et al., 1996; Boyce et al., 1996;

Madeddu et al., 1997; Pesquero e Bader, 1998). A geração de animais com

deleção do gene para o receptor B

demonstrou que este receptor não participa

do controle da pressão sangüínea em condições normais (Pesquero et al., 2000).

Contudo, os receptores B

são fundamentais para o desenvolvimento da

hipotensão induzida por lipopolissacarídeo (LPS), no acúmulo e apoptose de

neutrófilos em respostas inflamatórias, na sensibilização central dolorosa e ainda

na nocicepção induzida por diferentes estímulos (Pesquero et al., 2000; Araújo et

al., 2001; Ferreira et al., 2001; 2002).

Apesar das diferenças observadas entre os receptores B

e B

, muitas

vezes as vias de sinalização celular ativadas pelos dois tipos de receptores são

semelhantes (Liebmann e Böhmer, 2000; Liebmann, 2001; Prado et al., 2002).

Ambos são acoplados a proteínas G do tipo Gαq, Gαi2 e Gαi3 (Yanaga et al.,

1991; Liao e Homcy, 1993; Austin et al., 1997; Xie et al., 2000) e sua ativação

pode estar envolvida, direta ou indiretamente, com diferentes vias de transdução

de sinal. Estas vias incluem fosfolipase C, D e A

, ativação da adenilato ciclase,

com a liberação subseqüente de prostaglandinas, NO, fosfatos de inositol e

diacilglicerol a partir de fosfolipídeos de membrana, levando à mobilização de

cálcio intracelular e ativação de isoformas específicas da proteína quinase C

(Schanstra et al., 1999; Liebmann e Böhmer, 2000; Prado et al., 2002; Blaukat,

2003). Além das vias consideradas clássicas, os receptores cininérgicos também

estão ligados à ativação de outras proteínas quinases, incluindo proteínas

quinases ativadas por mitógeno (MAPKs), Janus quinases (JAK), tirosina-

quinases, fosfatidilinositol-3-quinases, esfingosina-6-quinases, além de proteínas

como tirosina-fosfatases e pequenas proteínas G (small G proteins) (Ju et al.,

2000; Blaukat e Dikic, 2001; Liebmann, 2001; Prado et al., 2002; Blaukat, 2003).

A baixa homologia (36 %) existente entre os receptores B

e B

sugere que

estas proteínas são componentes de diferentes sistemas regulatórios (Marceau et

al., 1997). Esta afirmação é reforçada pelas diferenças observadas no padrão de

expressão destes dois receptores. Diversas evidências demonstram que os

receptores B

apresentam um caráter constitutivo, sendo expressos em diferentes

órgãos, tecidos e tipos celulares, incluindo células endoteliais, fibroblastos,

epitélio glandular, rins, coração, musculatura esquelética, sistema nervoso central,

musculatura lisa de vasos sangüíneos, ducto deferente, traquéia, intestino, útero e

bexiga (Dendorfer et al., 1999). Contudo, existem evidências de que a expressão

dos receptores B

pode ser regulada transcricionalmente em culturas celulares.

Assim, moléculas como o AMPc, fator de crescimento derivado de plaquetas

(PDGF) e interleucina-1 (IL-1) podem exercer uma regulação positiva sobre o

receptor B

(Bathon et al., 1992; Dixon, 1994; Dixon et al., 1996; Schmidlin et al.,

1998). Por outro lado, a supressão da expressão do receptor B

pode ser

observada na presença do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (Sawutz et al.,

1992). Além disso, a presença do receptor na superfície da célula pode ser

regulada através de mecanismos como a internalização e a dessensibilização

(Marceau et al., 2002). Os receptores B

, por sua vez, estão normalmente

ausentes nos órgãos e tecidos em condições normais, com algumas exceções,

como no sistema nervoso central (Raidoo e Bhoola, 1997; Wotherspoon e Winter,

2000; Ma et al., 2000; Shughrue et al., 2003; Calixto et al., 2004), sendo

rapidamente induzidos e modulados em diversos tipos celulares após traumas

teciduais ou durante alterações patológicas (Marceau et al., 1998; Ahluwalia e

Perretti, 1999; Calixto et al., 2000; 2004). Desta forma, grande parte das ações

fisiológicas das cininas são mediadas pela ativação dos receptores B

, enquanto

que os receptores B

parecem estar envolvidos na amplificação e perpetuação da

sinalização iniciada pelos receptores B

(Marceau et al., 1998; Calixto et al., 2000;

2004; Couture et al., 2001).

O caráter indutível dos receptores B

foi demonstrado primeiramente por

Regoli e colaboradores (1977) que observaram o desenvolvimento de uma

resposta contrátil à des-Arg

-BK em preparações isoladas de aorta de coelho, de

caráter tempo-dependente. Além de tecidos isolados de coelhos, o mesmo

fenômeno foi descrito em diversas preparações in vitro, obtidas de ratos, suínos,

bovinos e humanos (Couture et al., 1981; Campos e Calixto, 1994; Drummond e

Cocks, 1995; Pruneau et al, 1996; Zuzack et al., 1996; Teater e Cuthbert, 1997;

Marceau et al., 1998). Nestas preparações, os agonistas do receptor B

não

promovem resposta na primeira hora de incubação, mas induzem uma reação,

geralmente contrátil, cuja magnitude aumenta em função do tempo de incubação

in vitro. A indução do receptor B

nestes modelos parece ser dependente da

síntese de novo de proteínas, uma vez que a resposta é ausente nos tecidos

tratados com inibidores de transcrição e translação de RNA e de maturação

protéica (Regoli et al., 1978; Marceau et al., 1980; Whalley et al., 1983; DeBlois et

al., 1988; 1991; Audet et al., 1994; Campos e Calixto, 1994; Sardi et al., 2000).

Estudos demonstram ainda que citocinas e fatores de crescimento, incluindo IL-

1β, IL-2, interferon-γ e fator de crescimento epidermal (EGF), além da oncostatina,

são capazes de acelerar o desenvolvimento de respostas mediadas pelos

receptores B

in vitro (McLean et al., 2000a).

A indução do receptor B

in vivo tem sido amplamente demonstrada em

uma série de modelos animais. Este fenômeno pode ser observado na hipotensão

induzida por LPS em coelhos e ratos (Regoli et al., 1981; Marceau et al., 1984;

Bouthillier et al., 1987; Tokumasu et al., 1995; Nicolau et al., 1996), na

hiperalgesia inflamatória induzida em ratos após a irradiação de raios ultravioleta,

após a injeção intra-articular de adjuvante completo de Freund ou de citocinas

pró-inflamatórias (Perkins e Kelly, 1993; Davis e Perkins, 1994, Davis et al.,

1994), ou ainda após a indução de estresse térmico (Lagneux e Ribout, 1997) ou

de cistite química em ratos (Belichard et al., 1999). Além disso, o aumento dos

receptores B

também foi descrito após a indução de diabetes do tipo I por

streptozotocina (Cloutier e Couture, 2000; Campos et al., 2001; Gabra e Sirois,

2002; Vianna et al., 2003), em modelos de inflamação pulmonar e

broncoconstrição alérgicas (Huang et al., 1999; Christiansen et al., 2002; Eric et

al., 2003; Landgraf et al., 2003), no dano após isquemia seguida por reperfusão

(Mazenot et al., 2001; Kuebler et al., 2003; Souza et al., 2004), no modelo de

infarto do miocárdio em ratos (Tschöpe et al., 2000) ou após o tratamento crônico

de ratos e camundongos com inibidores da ECA (Marin-Castaño et al., 2002).

Finalmente, o tratamento com agentes flogísticos como carragenina, caolin ou

zimozan, além de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1β (Belichard et al., 2000;

McLean et al., 2000b; Seegers et al., 2004), ou estímulos infecciosos, como

formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (Todorov et al., 2003), também

pode resultar na indução dos receptores B

in vivo.

Diversos trabalhos apontam o envolvimento dos receptores B

e B

resposta edematogênica mediada pelas cininas na pata de rato. Neste modelo, os

receptores B

parecem ser constitutivos, enquanto os receptores B

apresentam

um caráter induzido. A administração local de uma única dose do agonista de

receptores B

é capaz de induzir edema, enquanto que a administração do

agonista de receptores B

não é capaz de produzir o mesmo efeito. Contudo, a

administração repetida do agonista de receptores B

resulta em dessensibilização

do receptor, associada ao aparecimento da resposta edematogênica ao agonista

(Campos e Calixto, 1995; Campos et al., 1995). A administração sistêmica de

LPS, do bacilo de Calmette-Guérin (BCG), bem como a adrenalectomia e a

indução de diabetes do tipo I por estreptozotocina são estímulos capazes de

induzir os receptores B

neste modelo (Campos et al., 1996; 1997; 2001; Cabrini

et al., 2001). Além disso, o aparecimento dos receptores B

no edema de pata de

rato também foi verificado após o tratamento local com citocinas, como a IL-1β ou

o TNF-α, ou com o fator de ativação plaquetária (PAF) (Campos et al., 1998;

1999; 2002; Fernandes et al., 2003).

O padrão de expressão apresentado pelos receptores B

é uma de suas

características mais peculiares. Seu caráter induzido não é observado na maioria

dos receptores acoplados à proteína G e seu padrão de expressão complexo se

assemelha ao de receptores ligados à tirosina-quinase (Calixto et al., 2004).

Evidências sugerem que a expressão destes receptores é um processo altamente

regulado, e compreende tanto mecanismos transcricionais, quanto pós-

transcricionais. A participação de fatores transcricionais no fenômeno de indução

dos receptores B

tem sido demonstrada em diferentes trabalhos, como descrito a

seguir. Dados recentes revelaram a presença de numerosas seqüências

candidatas à ligação de fatores de transcrição na região promotora do gene do

receptor B

, incluindo a proteína de ativação-1 (AP-1), o elemento responsivo ao

AMPc (CREB) e o fator nuclear-κB (NF-κB), dentre outros (Ni et al., 1998b; Yang

et al., 1998). Ni e colaboradores (1998b) demonstraram que mutações do sítio

para a ligação do NF-κB na região promotora do gene do receptor B

são capazes

de abolir a indução do receptor em resposta a estímulos como o LPS, IL-1β ou

TNF-α em células da musculatura vascular humana. Além disso, estudos

mostram que a expressão dos receptores B

induzida por IL-1β em fibroblastos

humanos é modulada a nível transcricional pelo NF-κB (Schanstra et al., 1998). A

participação do NF-κB no aumento das respostas mediadas pelos receptores B

foi confirmada também na aorta e no rim de coelhos (Marceau et al., 1998;

Marceau et al., 1999; Medeiros et al., 2001; Sabourin et al., 2002), em diferentes

tecidos de ratos adrenalectomizados (Cabrini et al., 2001), na pata de ratos

tratados localmente com IL-1β, TNF-α ou PAF (Campos et al., 1999; Fernandes et

al., 2003), ou ainda na veia umbilical humana (Sardi et al., 2002) e na veia porta

de rato (Medeiros et al., 2004). Além disso, o controle da expressão dos

receptores B

parece ocorrer em nível pós-transcricional, através da modulação

da estabilidade do seu RNAm (Zhou et al., 1999). A regulação de processos como

a homo-oligomerização e a maturação do receptor também parece contribuir para

a expressão de receptores funcionais na superfície celular (Kang et al., 2005).

Contudo, os mecanismos envolvidos na regulação pós-transcricional dos

receptores B

ainda são pouco caracterizados, sendo necessária a realização de

estudos adicionais.

Diversos estudos mostram que a expressão dos receptores B

é controlada

principalmente pela produção de citocinas específicas após trauma ou estresse

tecidual, em especial a IL-1β (Marceau et al., 1998). Dessa forma, muitos dos

estímulos capazes de aumentar as respostas mediadas pelos receptores B

parecem estar relacionados ao aumento na produção de IL-1β (McLean et al.,

2000a). Diferentes estímulos inflamatórios são capazes de estimular a produção

de IL-1β, incluindo a própria citocina, outras citocinas pró-inflamatórias como o

TNF-α, além de produtos bacterianos, como o LPS (Dinarello, 1998). De fato, a

indução do receptor B

após o tratamento com LPS tem sido demonstrada em

uma série de estudos in vitro e in vivo. Este fenômeno foi observado em

diferentes espécies de animais, incluindo coelhos (Regoli et al., 1981; Marceau et

al., 1984; Bouthillier et al., 1987; Medeiros et al., 2001), ratos (Tokumasu et al.,

1995; Nicolau et al., 1996; Marin-Castaño et al., 1998; McLean et al., 1999;

Schanstra et al., 2000; Yayama et al., 2000; Wille et al., 2001), suínos

(Schremmer-Danninger et al., 1996; 1998; Siebeck et al., 1998), camundongos

(Busser et al., 1998; Pesquero et al., 2000) e macacos (DeBlois e Horlick, 2001).

Outros estudos demonstraram ainda que o tratamento sistêmico com LPS é

capaz de promover um aumento das respostas mediadas pelos receptores B

modelo do edema de pata de rato (Campos et al., 1996; Ferreira et al., 2000).

O LPS é um polímero presente na superfície externa da parede celular de

bactérias Gram-negativas, sendo capaz de recrutar uma série de sistemas

efetores e modificar a expressão gênica em diferentes tipos celulares (Medzhitov

e Janeway, 2000; Raetz e Whitfield, 2002; Triantafilou e Triantafilou, 2002). A

molécula de LPS possui uma massa que varia entre 2.000 e 20.000 kDa e é

composta por um domínio hidrofóbico altamente conservado, conhecido como

lipídeo A (ou endotoxina) e um domínio hidrofílico de caráter variável, de

constituição polissacarídica. A porção polissacarídica do LPS é formada por duas

regiões distintas, um centro oligossacarídico, contendo entre 10 e 12 açúcares, e

uma cadeia polissacarídica distal, com unidades repetidas (antígeno “O”). O

lipídeo A foi identificado com sendo o responsável pela patogenicidade da

bactéria e antigenicidade do LPS, enquanto que o antígeno “O” auxilia a bactéria

na resistência a antibióticos, ao sistema complemento e a outros fatores

ambientais de estresse (Caroff et al., 2002; Raetz e Whitfield, 2002; Whitfield et

al., 2003).

De acordo com a dose, a via de administração e a sensibilidade individual,

a administração de LPS pode induzir desde um aumento da resistência imune

contra infecções microbiais e virais até o aparecimento de sintomas patológicos

severos, característicos do choque séptico (Alexander e Rietschel, 2001). As

respostas à administração de doses elevadas de LPS incluem neutropenia,

hipotensão, coagulação intravascular disseminada, produção de diversas

citocinas pró-inflamatórias e proteínas de fase aguda (Calandra, 2001; Hotchkiss

e Karl, 2003; Marshall, 2003; Pinsky, 2004). Esta resposta inflamatória

descontrolada, observada nos quadros de sepse, é responsável pela letalidade

elevada da mesma, que é apontada como a causa de cerca de 210.000 mortes

anuais somente nos Estados Unidos (Angus et al., 2001; Martin et al., 2003). Por

outro lado, a injeção de pequenas quantidades de LPS nos tecidos é capaz de

induzir a expressão de diferentes moléculas envolvidas no processo inflamatório

como quimiocinas, citocinas, e moléculas de adesão, levando ao recrutamento

celular e formação de edema (Ulevitch e Tobias, 1995; Saban et al., 2001; Caroff

et al., 2002; Savard et al., 2002).

A existência do LPS foi relatada pela primeira vez no final do século 19,

quando Richard Pfeiffer identificou, em lisados de Vibrio cholerae, uma toxina

resistente ao calor capaz de causar choque tóxico em animais (Alexander e

Rietschel, 2001; Caroff et al., 2002). Contudo, o entendimento dos mecanismos

celulares responsáveis por esta e outras respostas imunes mediadas por produtos

bacterianos sofreu um avanço significativo a partir de 1996 quando Lemaitre e

colaboradores demonstraram que a proteína toll, presente em moscas da espécie

Drosophila melanogaster e envolvida no desenvolvimento embrionário, era

necessária também na geração de uma resposta imune contra fungos. Em 1997,

uma proteína homóloga à toll da drosófila foi clonada e caracterizada em

humanos, sendo denominada de receptor toll-like (TLR) (Medzhitov et al., 1997;

Rock et al., 1998; Akira et al., 2001). Existem 13 TLR identificados até o

momento, sendo 10 em humanos e 12 em camundongos, responsáveis pela

identificação de uma série de microorganismos, incluindo bactérias, fungos, vírus

e protozoários (Beutler et al., 2004; Tabeta et al., 2004). Dentre estes receptores,

o TLR do tipo 4 foi apontado como sendo responsável pelo reconhecimento do

LPS (Poltorak et al., 1998). No entanto, o reconhecimento do LPS por estes

receptores envolve também a ligação do produto bacteriano com a proteína de

ligação ao LPS (LBP), presente no soro e, subseqüentemente, com a molécula

CD14 presente na superfície celular, que permitem a interação com o TLR4.

Outra proteína necessária para a ativação do TLR4 pelo LPS é a MD-2, associada

constitutivamente ao receptor TLR4 (Shimazu et al., 1999). Existem evidências de

que, além do TLR4, outros receptores podem estar envolvidos nas respostas

mediadas pelo LPS, incluindo as integrinas CD11c ou CD18, e CD55, dentre

outros (Triantafilou e Triantafilou, 2002).

Assim como o receptor toll presente na drosófila, o TLR de mamíferos é

uma proteína transmembrana do tipo I, com um domínio extracelular composto

por regiões ricas em leucina e um domínio citoplasmático similar ao do receptor

de IL-1. As vias de sinalização intracelular, comuns aos dois receptores, estão

relacionadas ao recrutamento da proteína de diferenciação mielóide 88 (MyD88),

à ativação da proteína quinase associada ao receptor de IL-1 (IRAK) e à

associação de fatores relacionados ao receptor de TNF (TRAF6). A ativação

destes receptores pode resultar ainda na estimulação de proteínas da família das

MAPKs, envolvidas na regulação de fatores transcricionais responsáveis pelo

controle da expressão gênica, como o NF-κB (Medzhitov e Janeway, 2000;

Suzuki et al., 2002).

O processo de indução do receptor B

parece ser complexo e existem

inúmeros trabalhos desenvolvidos na tentativa de melhor entender os

mecanismos envolvidos na sua regulação, bem como, a função exercida por

estes receptores, principalmente no desenvolvimento de processos inflamatórios.

Na presente dissertação, foi utilizado um modelo in vivo, onde o LPS foi

administrado localmente na pata de ratos. Neste modelo, procuramos avaliar

alguns dos mecanismos envolvidos no processo de indução do receptor B

. Em

especial foram analisados a participação de citocinas pró-inflamatórias, a ativação

do NF-κB, o influxo de neutrófilos e a produção de NO.

OBJETIVOS

1. Objetivo geral

O objetivo do presente trabalho foi analisar, através de estudos

farmacológicos, bioquímicos e de biologia molecular, os mecanismos envolvidos

na ação modulatória do lipopolissacarídeo de Escherichia Coli (LPS) sobre o

processo de indução do receptor B

para as cininas in vivo.

2. Objetivos específicos

2.1. Analisar a influência do pré-tratamento local com LPS sobre o edema de pata

de rato induzido pelo agonista seletivo de receptores B

, a des-Arg

-BK, ou pelo

agonista seletivo de receptores B

, a Tyr

-BK.

2.2. Confirmar a expressão do receptor B

para as cininas após a injeção de LPS

na pata de rato, através da técnica de RT-PCR.

2.3. Investigar alguns dos mecanismos envolvidos no aumento da resposta

edematogênica mediada pelos receptores B

após o tratamento com LPS,

incluindo a participação de síntese protéica, da ativação do fator de transcrição

NF-κB e da produção de óxido nítrico.

2.4. Avaliar a participação da produção secundária de citocinas no edema de pata

causado pela des-Arg

-BK em ratos pré-tratados com LPS.

2.5. Analisar o efeito de inibidores da migração celular e a participação de

moléculas de adesão e de fatores quimiotáticos no aumento funcional dos

receptores B

na pata de ratos tratados localmente com LPS.

2.6. Determinar o perfil temporal da ativação do fator de transcrição NF-κB na

pata de ratos tratados localmente com LPS.

2.7. Relacionar o perfil temporal da produção de IL-1β e de TNF-α, da migração

de neutrófilos e da indução da sintase do óxido nítrico induzida (iNOS) com a

indução dos receptores B

na pata de rato após a injeção intraplantar de LPS.

MATERIAL E MÉTODOS

1. Animais

Para a realização dos experimentos, foram utilizados ratos machos

Wistar (140 - 180 g), fornecidos pelo Biotério Central da UFSC ou pela

TECPAR (Curitiba, PR). Os animais foram alojados em grupos de 5 por gaiola,

mantidos em câmaras ventiladas (ALESCO), com temperatura e umidade

controladas (22 ± 2 ºC e 60 - 80 %, respectivamente), em ciclo claro/escuro de

12 h e com livre acesso à água e ração até a hora dos experimentos. Os

animais foram aclimatizados no laboratório durante um período de, pelo menos,

1 h e os experimentos realizados entre 7:00 e 19:00 h. Todos os experimentos

foram conduzidos de acordo com as indicações para o cuidado com animais de

laboratório e recomendações éticas para experimentos com animais

conscientes (Zimmerman, 1983) e foram aprovados pela Comissão de Ética no

Uso de Animais da UFSC (protocolo número 262/CEUA e 23080.035334/2003-

16/UFSC).

2. Procedimentos experimentais

2.1. Medida do edema de pata

O procedimento utilizado para a avaliação do edema de pata foi similar

àquele descrito por Campos e Calixto (1995), com pequenas modificações. Os

animais foram levemente anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (0,125 g/kg,

intraperitoneal (i.p.) e receberam, por via intraplantar, na pata direita, 0,1 ml de

salina tamponada (PBS; composição em mM: NaCl 137, KCl 2,7 e tampão

fosfato 10) contendo des-Arg

-BK (100 nmol/pata; agonista seletivo de

receptores B

) ou tirosina

-BK (Tyr

-BK) (3 nmol/pata; agonista seletivo de

receptores B

) (Campos et al., 1995; 1996). A pata esquerda recebeu o mesmo

volume (0,1 ml) de PBS e foi utilizada como controle. O aumento de volume foi

medido pletismometricamente (Pletismômetro, Ugo Basile) em diversos

intervalos de tempo (10, 20, 30, 60 e 120 min) após a injeção das cininas ou

apenas no pico do edema (20 min). A diferença entre o volume das patas direita

e esquerda foi quantificada (em ml) e tomada com índice de edema. Nos

experimentos onde foi administrada a Tyr

-BK, os animais foram pré-tratados

com um inibidor da cininase II, o captopril (5 mg/kg, 1 h, s.c.), a fim de evitar a

degradação deste peptídeo (Corrêa e Calixto, 1993).

2.2. Tratamento com o lipopolissacarídeo de Escherichia coli

Na maior parte dos experimentos, os animais foram levemente

anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (0,125 g/kg, i.p.) e tratados por via

intraplantar com o lipopolissacarídeo de Escherichia Coli (LPS) (1 µg/pata)

(Safieh-Garabedian et al., 1997), em vários intervalos de tempo (1, 6, 12, 24, 36,

48 ou 72 h) antes da injeção das cininas. Em alguns experimentos, com o

objetivo de determinar o possível efeito sistêmico da injeção intraplantar de LPS,

os animais receberam LPS (1 µg/pata, 12 h) na pata direita, e des-Arg

-BK (100

nmol/pata) na pata contralateral. O edema foi avaliado como descrito

anteriormente, comparando-se as respostas obtidas nos animais tratados com

PBS, com aquelas obtidas nos animais tratados com LPS.

2.3. Análise dos mecanismos envolvidos no edema de pata causado pela

des-Arg

-BK em animais pré-tratados com LPS

2.3.1. Efeito da co-injeção de antagonistas seletivos para o receptor B

Com o objetivo de confirmar o envolvimento dos receptores B

para as

cininas na resposta edematogênica induzida pela des-Arg

-BK na pata de ratos

pré-tratados com LPS (1 µg/pata, 12 h), os animais receberam uma injeção

intraplantar contendo os antagonistas seletivos para o receptor B

, a des-Arg

[Leu

]-BK (100 nmol/pata) ou o R-715 (60 nmol/pata), em conjunto com a des-

Arg

-BK (100 nmol/pata) (Campos e Calixto, 1995; Pinheiro et al., 2001). As

respostas obtidas foram analisadas comparando-se o edema produzido pela des-

Arg

-BK, após tratamento com o LPS, na presença ou ausência dos antagonistas.

2.3.2. Influência do tratamento com inibidores de síntese protéica

A fim de verificar a possível participação de síntese protéica no edema de

pata causado pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata) em ratos tratados com LPS,

outros grupos de animais foram tratados previamente com o glicocorticóide,

dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.) ou com o inibidor de síntese protéica, a

cicloheximida (1,5 mg/kg, s.c.) (Campos et al., 1998), ambos administrados 6 h

antes da injeção de LPS (1 µg/pata, 12 h). O edema de pata foi avaliado conforme

descrito anteriormente, e as respostas obtidas na presença dos inibidores foram

comparadas àquelas observadas nos animais tratados com PBS.

2.3.3. Participação do fator de transcrição NF-κB

Para analisar o envolvimento do fator de transcrição NF-κB no aumento da

resposta edematogênica mediada pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata) após o

tratamento com LPS (1 µg/pata, 12 h), outros grupos de animais foram tratados

com os inibidores da ativação do fator de transcrição NF-κB, TLCK (2 mg/kg, i.p.)

ou PDTC (100 mg/kg, i.p.) (Campos et al., 1999), ambos administrados 30 min

antes da injeção de LPS. As respostas edematogênicas observadas na presença

dos inibidores foram comparadas àquelas observadas nos animais controle

(tratados com PBS).

2.3.4. Efeito da associação de anticorpos para citocinas pró-inflamatórias

Com a finalidade de avaliar a contribuição da produção secundária de

citocinas sobre o edema de pata induzido pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata) em

animais pré-tratados com LPS (1 µg/pata, 12 h), os animais receberam os

anticorpos anti-IL-1β ou anti-TNF-α (50 ng/pata), administrados em conjunto com

o LPS (Campos et al., 1999). Os animais controle receberam PBS e a resposta

inibitória foi analisada comparando-se o aumento de volume produzido pela des-

Arg

-BK, na presença ou ausência dos anticorpos.

2.3.5. Influência da co-injeção de citocinas antiinflamatórias

Para investigar a participação de citocinas antiinflamatórias no aumento da

resposta edematogênica causada pela des-Arg

-BK após o tratamento com LPS,

outros grupos de animais receberam as citocinas antiinflamatórias, IRA

(antagonista natural dos receptores da IL-1; 100 µg/pata) ou IL-10 (10 ng/pata),

em associação com o LPS (1 µg/pata), 12 h antes da injeção da des-Arg

-BK (100

nmol/pata) (Campos et al., 1999). As respostas obtidas foram comparadas

àquelas observadas nos animais controle (tratados com PBS).

2.3.6. Efeito do tratamento com inibidores de migração celular

Visando analisar a participação de moléculas de adesão no aumento da

resposta edematogênica mediada pela ativação dos receptores B

em ratos

tratados com LPS, os animais receberam o inibidor não-seletivo de selectinas, a

fucoidina (10 mg/kg), ou o anticorpo monoclonal para β2-integrina, o anti-CD18

(β2-integrina) (1 mg/kg), ambos administrados por via endovenosa 15 min antes

da injeção de LPS (1 µg/pata, 12 h) (Teixeira e Hellewell, 1997; Campos et al.,

2002). A participação da migração de neutrófilos foi avaliada pelo uso do

anticorpo anti-PMN (34 µg/kg, i.p.), administrado 30 minutos antes da injeção de

LPS (Adams e Tepperman, 2001; Fernandes et al., 2003). Em outra de série de

experimentos, para investigar o envolvimento de fatores quimiotáticos no

desenvolvimento do edema de pata à des-Arg

-BK (100 nmol/pata) em animais

pré-tratados com LPS, os animais receberam o antagonista seletivo do receptor

para o fator de agregação plaquetária (PAF), o WEB 2086 (15 µg/pata) (Campos

et al., 2002), co-administrado com o LPS. O edema de pata foi avaliado conforme

descrito anteriormente, e as respostas obtidas na presença dos inibidores foram

comparadas àquelas observadas nos animais tratados com PBS.

2.3.7. Efeito do tratamento com inibidores da óxido nítrico sintase

Para avaliar o envolvimento da produção do óxido nítrico (NO) no edema

de pata causado pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata) em ratos que receberam LPS

(1 µg/pata, 12 h), os animais foram tratados com o inibidor não seletivo da óxido

nítrico sintase (NOS), L-NOARG (10 mg/kg, i.p.), 30 min antes do LPS. Outros

grupos de animais receberam os inibidores seletivos da NOS induzida (iNOS), a

aminoguanidina (30 mg/kg, i.p.), 30 min antes da injeção de LPS e com reforço a

cada 4 h, ou o 1400W (1 mg/kg, s.c., 1 h antes do LPS) (Garvey et al., 1997; da S.

Rocha et al., 2002). Com o objetivo de excluir a participação do NO sobre a

resposta funcional dos receptores B

, outros grupos de animais receberam os

inibidores da NOS, nas doses descritas acima, 30 min antes da des-Arg

-BK. Os

animais controle foram tratados com PBS e o edema de pata foi avaliado como

descrito anteriormente.

2.4. Detecção do RNA mensageiro para o receptor B

Com o objetivo de confirmar o efeito do LPS sobre a indução dos

receptores B

para as cininas, foram medidos os níveis do RNAm para o receptor

após o tratamento com o produto bacteriano em diferentes intervalos de tempo,

através da técnica da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da

polimerase (RT-PCR), conforme metodologia descrita por Campos et al. (2002).

Os animais foram levemente anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (0,125 g/kg,

i.p.) e tratados por via intraplantar com LPS (1 µg/pata) ou PBS e foram

sacrificados em vários intervalos de tempo (1 - 48 h). O tecido subcutâneo das

patas foi removido em condições livres de RNAse, congelado em nitrogênio

líquido e estocado a - 70 ºC. Posteriormente, as amostras foram homogeneizadas

e o RNA total foi extraído utilizando reagente TRIzol (Gibco BRL), conforme as

recomendações do fabricante. A transcrição reversa (RT) foi realizada com 1 µg

de RNA total, utilizando oligo dT como primer (25 µg/ml) e 200 U de transcriptase

reversa (Life Technologies), em 20 µl de tampão de PCR contendo dNTP 0,5 mM,

DTT 10 mM, MgCl

2,5 mM, KCl 50 mM e Tris-HCl 20 mM (pH 8,4). As amostras

foram incubadas por 50 min a 42 ºC, aquecidas por 15 min a 70 ºC e, finalmente,

resfriadas em gelo. Após o tratamento com 2 U de Rnase H (20 min, 37 ºC), a

amplificação do DNAc de seqüências específicas para o receptor B

de rato e

para a β-actina foi obtida por PCR, utilizando os seguintes primers: sense

TGAAGCTGTGAGCTCTTTG e antisense GCCAGTTGAAACGGTTCCC, para o

receptor B

; e sense GTTCCGATGCCCCGAGGATCT e antisense

GCATTTGCGGTGCACGATGGA, para a β-actina. O DNAc da β-actina foi

utilizado para a padronização da quantidade de RNA. Alíquotas de 5 µl do RT

foram adicionadas a um tampão contendo: Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), MgCl

1,5

mM, dNTP 300 µM, 2 µg/ml de cada primer e 50 U/ml de Taq polimerase (Life

Technologies), em um volume final de 100 µl. O ciclo do PCR foi o seguinte: 4 min

a 94 ºC, 36 ciclos de 35 s a 94 ºC, 45 s a 60 ºC, 45 s a 72 ºC e, finalmente, 7 min

a 72 ºC. Alíquotas de 25 µl de cada amostra foram analisadas em gel

Tris/borato/EDTA (TBE)-poliacrilamida 20% e coradas com brometo de etídio. A

análise quantitativa foi realizada pela medida da intensidade da banda do receptor

, normalizada pela intensidade da banda da β-actina. O tamanho das bandas foi

de 450 pb para o receptor B

e 600 pb para a β-actina.

2.5. Ativação do fator de transcrição NF-κB

A ativação do fator de transcrição NF-κB após o tratamento com LPS foi

determinada pelo ensaio de deslocamento em gel (EMSA). Os animais foram

levemente anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (0,125 g/kg, i.p.) e receberam,

por via intraplantar, 0,1 ml de PBS contendo LPS (1 µg/pata). Após diferentes

intervalos de tempo (1 - 48 h), os animais foram sacrificados e o tecido

subcutâneo das patas injetadas foi removido e rapidamente congelado em

nitrogênio líquido. Patas tratadas com PBS foram utilizadas como controle. Em

alguns experimentos, os animais foram tratados com o inibidor do fator de

transcrição NF-κB, o PDTC (100 mg/kg), conforme descrito no item 2.2.3. Os

extratos nucleares foram preparados de acordo com a metodologia descrita por

D’Acquisto et al. (1999), com algumas modificações. Os tecidos foram suspensos

em 3 ml de tampão hipotônico de lise gelado (HEPES 10 mM (pH 7,9), MgCl

1,5

mM, KCl 10 mM, fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) 0,5 mM, inibidor de tripsina 1,5

µg/ml, pepstatina A 5 µg/ml, leupeptina 5 µg/ml, benzamidina 0,1 mM e ditiotreitol

(DTT) 0,5 mM) e homogeneizados durante 1 min, com o auxílio de um Ultra-

Turrax (Biospec Products Inc.). O homogenato foi mantido em gelo por 15

minutos, sob agitação vigorosa, na presença de 25 µl de polydet P-40 10 %. A

fração nuclear foi precipitada por centrifugação a 1.500 x g por 5 minutos. O

extrato nuclear foi ressuspenso em 600 µl de um tampão de extração com alta

concentração de sal (HEPES 20 mM (pH 7,9), NaCl 420 mM, MgCl

1,5 mM,

EDTA 0,2 mM, glicerol 25 % (v/v), PMSF 0,5 mM, inibidor de tripsina 1,5 µg/ml,

pepstatina A 7 µg/ml, leupeptina 5 µg/ml, benzamidina 0,1 mM e DTT 0,5 mM),

incubado sob agitação contínua a 4 ºC por 30 min e centrifugado a 13.000 x g por

15 min. O sobrenadante foi aliquotado e estocado à -70 ºC até a utilização. A

concentração de proteína das amostras foi determinada utilizando-se o kit para

dosagem de proteína da BioRad (BioRad Protein Assay kit).

O EMSA foi realizado com o kit Shift Assay System (Promega), de acordo

com as instruções do fabricante. O oligonucleotídeo de fita-dupla com consenso

para o NF-κB (5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’) foi marcado nas

extremidades com [γ

P] ATP (DuPont), na presença da T4 polinucleotídeo

quinase (10 U), por 10 minutos a 37 ºC. Os nucleotídeos não incorporados foram

removidos pela passagem da mistura em uma coluna de Sephadex G-25

(Pharmacia). Um volume de 20 µl (10 µg) dos extratos nucleares foi incubado em

tampão de ligação (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl

1 mM, NaCl 50 mM, DTT 0,5

mM, EDTA 0,5 mM, glicerol 4%, e 1 µg de poli (dI-dC)), por 20 min, em

temperatura ambiente. Posteriormente, cada amostra foi incubada por 30 minutos

em temperatura ambiente com cerca de 25.000 cpm do oligonucleotídeo [

P] NF-

κB. Os complexos proteína-DNA foram avaliados em gel não-desnaturante de

acrilamida: bisacrilamida 6 % (37,5: 1) em 0,25 x de tampão Tris-borato/EDTA

(TBE), a 150 V por 2 h. O gel foi seco por vácuo e analisado utilizando-se o

sistema FUJIX BAS 2000 (Düsseldorf). Para os estudos de competição, os

oligonucleotídeos consenso para o NF-κB ou para o TFIID (5’-

GCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGA-3’; fator não relacionado à família NF-κB,

responsável pelo recrutamento da RNA polimerase II) não marcados foram

adicionados à mistura em excesso com relação à quantidade de sonda marcada,

com a função de detectar interações DNA/proteína específicas e inespecíficas,

respectivamente.

2.6. Medida dos níveis de IL-1β e de TNF-α

Para a medida dos níveis de IL-1β e TNF-α após a injeção intraplantar de

LPS, foi utilizada a metodologia previamente descrita por Francischi et al. (2000),

com pequenas modificações. Os animais foram levemente anestesiados com

2,2,2 tribromoetanol (0,125 g/kg, i.p.) e receberam LPS (1 µg/pata), sendo

sacrificados após vários intervalos de tempo (1 – 48 h). Os animais controle

receberam PBS pela mesma via. O tecido subcutâneo das patas injetadas foi

removido e colocado em tampão fosfato, contendo Tween 20 0,05 %, cloreto de

benzametônio 0,1 mM, EDTA 10 mM, NaCl 0,4 mM, aprotinina A 2 µg/ml, PMSF

0,1 mM e albumina sérica bovina (BSA) 0,5 %. Os tecidos foram homogeneizados

e centrifugados a 3000 g, por 10 min, a 4 ºC, sendo o sobrenadante obtido

utilizado para o ensaio. Os níveis de IL-1β e TNF-α foram medidos através de kit

de ELISA, de acordo com as recomendações do fabricante (R & D Systems). As

respostas foram expressas em pg/ 100 mg de tecido.

2.7. Medida da atividade da mieloperoxidase (MPO)

O recrutamento de neutrófilos foi quantificado indiretamente através da

determinação da atividade da MPO, segundo o método descrito por Souza et al.

(2000), com pequenas modificações. Os animais foram levemente anestesiados

com 2,2,2 tribromoetanol (0,125 g/kg, i.p.) e receberam na pata direita LPS (1

µg/pata). Após vários intervalos de tempo (1 - 48 h), os animais foram sacrificados

e tiveram o tecido subcutâneo das patas injetadas removido, congelado em

nitrogênio líquido e armazenado à - 70 ºC. Patas tratadas com PBS foram

utilizadas como controle. Os tecidos foram homogeneizados a 5 % (peso/volume)

em tampão EDTA/NaCl (pH 4,7), e centrifugados a 10.000 rpm, por 15 min a 4 ºC.

O precipitado resultante foi ressuspenso em tampão 1 gelado (pH 7,4; NaCl 0,1

M, NaPO

0,02 M e NaEDTA 0,015 M). Adicionou-se então NaCl 0,2 % gelado e,

após 30 s, NaCl 1,6 % contendo glicose 5 % (gelado). A solução foi centrifugada a

10.000 rpm, por 15 min a 4 ºC. O precipitado formado foi ressuspenso em tampão

2 gelado (pH 5,4; NaPO

0,5 M e hexadecil-trimetilamônio – H-TAB 0,5 %) e as

amostras obtidas foram congeladas e descongeladas 3 vezes em nitrogênio

líquido. Após o último descongelamento, as amostras foram centrifugadas

novamente a 10.000 rpm, por 15 min a 4 ºC, e 25 µl do sobrenadante foram

utilizados para o ensaio de MPO. A reação enzimática foi realizada na presença

de tetrametilbenzidina (TMB; 1,6 mM), NaPO

(80 mM) e peróxido de hidrogênio

; 0,3 mM). A absorbância foi medida em 650 nm e os resultados foram

expressos em densidade óptica (DO) por mg de tecido.

2.8. Expressão da iNOS

Para avaliar o efeito do tratamento com LPS sobre o aumento da

expressão da iNOS na pata de rato foi utilizada a técnica de Western blot. Para

tal, os animais foram levemente anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (0,125

g/kg, i.p.), receberam LPS (1 µg/pata) na pata direita e o tecido subcutâneo das

patas injetadas foi removido em diferentes intervalos de tempo (de 30 min a 12 h).

Os animais tratados com PBS pela mesma via foram utilizados como controle. A

preparação das amostras para o ensaio foi realizada segundo metodologia

descrita por Miralles et al. (2000), com pequenas modificações. As amostras de

tecido coletadas foram homogeneizadas em tampão de lise gelado (Tris-HCl 40

mM (pH 7,5), NaCl 5 mM, MgCl

1 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, leupeptina 40

µg/ml, Triton X-100 1 %) (1:10 p/v) e mantidas sob agitação constante, a 4 ºC

durante 15 min. As amostras foram centrifugadas a 12.000 x g, por 10 min a 4 ºC,

sendo o sobrenadante coletado como a fração citosólica das preparações. A

determinação da concentração de proteínas das amostras foi realizada utilizando

o kit Bio-Rad, segundo recomendações do fabricante. As amostras foram

armazenadas em freezer - 70 ºC até o momento do uso.

Cerca de 200 µg da fração citosólica das amostras foram adicionados ao

tampão Tris-HCl 65,5 mM (pH 6,8, contendo: dodecil sulfato de sódio (SDS) 3 %,

glicerol 20 %, azul de bromofenol 0,005 %), fervidas durante 5 min e separadas

por eletroforese em gel de poliacrilamida 10 %. As proteínas foram transferidas

para uma membrana de nitrocelulose (BioRad) por eletroforese, utilizando-se

corrente constante de 300 mA por 4 h. A membrana foi bloqueada em solução

TBS-T (Tris-buffered saline tween 20) contendo leite em pó desnatado (5 %) por

60 min, em temperatura ambiente, sob agitação. Posteriormente, a membrana foi

incubada na presença do anticorpo primário anti-iNOS (1:150) (Santa Cruz

Biotech.) overnight, a 4 ºC, sob agitação. O anticorpo secundário, anti-IgG de

coelho conjugado à peroxidase (Santa Cruz) foi diluído em tampão de bloqueio

(1:4000), adicionado e mantido por 2 h em temperatura ambiente, sob agitação. O

anticorpo secundário foi removido por lavagem e as bandas foram visualizadas

por aumento da quimioluminescência (ECL, Amersham).

3. Drogas e reagentes

Os seguintes reagentes e drogas foram utilizados: LPS de Escherichia coli

(sorotipo 0111:B4), 2,2,2 tribromoetanol, tirosina

-BK, captopril, dexametasona,

cicloheximida, fucoidina, TLCK (Nα-tosil-clorometilcetona), PDTC (pirrolidina-

ditiocarbamato), L-NOARG (Nω-nitro-L-Arginina), aminoguanidina, EDTA, tween

20, Triton X-100, H-TAB (brometo de hexadeciltrimetil amônio), TMB

(tetrametilbenzidina), PMSF (fenilmetilsulfonilfluoreto), aprotinina A, leupeptina,

pepstatina A, benzamidina, inibidor de tripsina, BSA (albumina sérica bovina),

cloreto de benzametônio, HEPES, DTT (ditiotreitol), brometo de etídio, pastilhas

de PBS (todos obtidos da Sigma Chemical Company, St. Louis, EUA); des-Arg

BK e des-Arg

-[Leu

]-BK (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, PA, EUA);

glicerol, Tris-HCl, acrilamida e SDS (dodecil sulfato de sódio) (Invitrogen,

Carlsbad, CA, EUA); polydet P-40 (Polyscience, Warrington, PA, EUA); glicose,

NaPO

, MgCl

, KCl, H

e NaCl (Merck, São Paulo, Brasil); 1400W (N-(3-

(aminometil)benzil)acetamidina) (Tocris, MO, EUA). O anticorpo anti-PMN de rato

foi obtido da Accurate Chemicals, San Diego, CA, EUA. A citocina recombinante

humana IL-10 (lote BC110), o antagonista do receptor de IL-1 recombinante

humano (IRA) e os anticorpos anti-IL-1β (lote B01D3) e anti-TNF-α (lote CT101)

foram obtidos da R&D Systems Inc. (Minneapolis, EUA). O WEB2086 foi

gentimente doado pela Boehringer-Mannheim Corp. (Mannheim, Alemanha). O

anticorpo anti-CD18 foi cedido gentilmente pelo Dr. Paul Hellewell (University of

Sheffield, UK) e o R-715 (AcLys[D-βNal

, Ile

]des-Arg

-BK) pelo Dr. Domenico

Regoli (University of Sherbrooke, CA). As soluções-estoque para os peptídeos

foram preparadas em PBS (10 mM) em tubos siliconizados, mantidas a -18 °C e

diluídas na concentração desejada no dia dos experimentos. As outras drogas

foram diluídas em PBS, com exceção da dexametasona, que foi diluída em 5% de

etanol.

4. Análise estatística

Os resultados foram expressos pela média ± erro padrão da média. As

percentagens de inibição representam a média das inibições obtidas para cada

experimento individual no pico do edema (20 min após a injeção da des-Arg

-BK).

A avaliação estatística dos resultados foi realizada por meio do teste “t” de

Student ou por análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Dunnett ou

Newman-Keuls, quando apropriado. Valores de P menores do que 0,05 (P < 0,05)

foram considerados como indicativos de significância.

RESULTADOS

1. Caracterização da resposta edematogênica causada por agonistas

seletivos para os receptores B

e B

para as cininas em animais pré-tratados

com LPS

Como demonstrado anteriormente (Campos e Calixto, 1995; Campos et al.,

1996; 1997; 1998), a injeção intraplantar do agonista seletivo para os receptores

, a des-Arg

-BK (100 nmol/pata) produziu apenas uma discreta alteração no

volume das patas de animais controle (0,134 ± 0.016 ml). Por outro lado, a injeção

de des-Arg

-BK em animais que foram pré-tratados localmente com LPS

(1µg/pata) resultou em um aumento marcante no volume das patas. A resposta

máxima foi observada 12 h após a adminstração do LPS (0,41 ± 0,03 ml),

permanecendo significativa por até 72 h (Figura 1 A). A resposta edematogênica à

des-Arg

-BK (100 nmol/pata) não apresentou aumento significativo naqueles

animais que receberam LPS (1µg/pata, 12 h) na pata contralateral (Figura 1 B).

Os resultados da Figura 1 C demonstram que o tratamento prévio dos

animais com LPS (1 µg/pata, 12 h) não foi capaz de produzir alteração

significativa do edema de pata induzido pelo agonista seletivo para os receptores

, a Tyr

-BK (3 nmol/pata).

Figura 1 – Efeito do pré-tratamento com LPS na resposta edematogênica

mediada pelos receptores B

e B

na pata de rato. (A) Edema de pata induzido pelo

agonista seletivo para os receptores B

, a des-Arg

-BK (100 nmol/pata) em animais

controle ou pré-tratados com LPS (1 µg/pata, 1 - 72 h). (B) Efeito do pré-tratamento

com LPS (1 µg/pata, 12 h) sobre o edema induzido pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata)

na pata contralateral. (C) Efeito do pré-tratamento com LPS (1 µg/pata, 12 h) sobre o

edema de pata induzido pelo agonista seletivo para os receptores B

, a Tyr

-BK (3

nmol/pata). Os valores representam a diferença de volume (em ml) das patas tratadas

com veículo (PBS) ou com as cininas 20 min após a administração. Cada coluna

representa a média de 4-6 animais e as barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P <

0,01 em relação ao grupo controle (PBS). (teste “t” de Student para amostras não

pareadas).

Aumento no volume da pata (ml)

0.25

0.00

0.50

PBS

61224

Pré-tratamento com LPS (h)

36 48 72

0.00

0.25

0.50

PBS LPS 12 h

0.00

0.25

0.50

PBS LPS 12 h

Aumento no volume da pata (ml)

2. Efeito do tratamento com LPS sobre o aumento do RNAm para o receptor

na pata de rato

Com o objetivo de avaliar o efeito do tratamento com LPS sobre a indução

dos receptores B

para as cininas na pata de rato, foram quantificados os níveis

de RNAm para esse receptor em diferentes intervalos de tempo após a

administração do produto bacteriano. A Figura 2 demonstra que o tratamento local

com LPS (1 µg/pata, 1 - 48 h) foi capaz de produzir um aumento tempo-

dependente dos níveis de RNAm para o receptor B

. Os níveis máximos do

RNAm para o receptor B

foram observados entre 1 e 6 h, retornando à condição

basal 12 h após o tratamento com LPS .

Figura 2 – Efeito do tratamento com LPS na expressão do RNAm para o receptor

na pata de rato. (A) Expressão tempo-dependente do mRNA para receptor B

pata de ratos pré-tratados com LPS (1 µg/pata, 1 - 48 h). 1. PBS; 2. LPS 1 h; 3. LPS 6

h; 4. LPS 12 h; 5. LPS 24 h; 6. LPS 36 h; 7. LPS 48 h. (B) Análise semi-quantitativa do

mRNA para o receptor B

; os valores representam a relação entre o sinal para o

receptor B

e o sinal para a β-actina. Cada coluna representa a média de 4

experimentos e as barras verticais, os e.p.m. **P < 0,01 em relação ao grupo controle

(PBS). (ANOVA de duas vias seguida do teste de Dunnett).

0.0

0.4

0.8

PBS 1 6 12 24

Pré-tratamento com LPS (h)

36 48

Razão do sinal B

-actina

(unidades relativas)

234567

β-actina

3. Análise dos mecanismos envolvidos no edema de pata causado pela des-

Arg

-BK em animais pré-tratados com LPS

O aumento na resposta edematogênica induzido pela des-Arg

-BK (100

nmol/pata) nos animais pré-tratados com LPS (1 µg/pata, 12 h) foi inibido de

forma significativa pela co-injeção dos antagonistas seletivos para o receptor B

, a

des-Arg

-[Leu

]-BK (100 nmol/pata) ou o R-715 (60 nmol/pata). As taxas de

inibição observadas foram de 43 ± 6 e 50 ± 1 %, respectivamente (Figura 3 A e

B).

Os resultados da Figura 4 mostram que o tratamento sistêmico dos animais

com o glicocorticóide dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.), ou com o inibidor de

síntese protéica cicloheximida (1,5 mg/kg, s.c.), 6 h antes da administração do

LPS (1 µg/pata, 12 h), foi capaz de bloquear significativamente o edema de pata

causado pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata), com inibições de 46 ± 8 e 58 ± 8 %,

respectivamente.

O edema de pata mediado pelos receptores B

em ratos que receberam

LPS (1 µg/pata, 12 h) também foi significativamente inibido pelo pré-tratamento

sistêmico dos animais com os inibidores da ativação do fator de transcrição NF-

κB, PDTC (100 mg/kg, i.p.) ou TLCK (2 mg/kg, i.p.), ambos administrados 30

minutos antes da injeção de LPS. As inibições obtidas foram de 74 ± 1 e 50 ± 3

%, respectivamente (Figura 5 A e B).

Figura 3 – Efeito de antagonistas seletivos para os receptores B

sobre o edema

induzido pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS. Os

antagonistas seletivos para os receptores B

, a des-Arg

-[Leu

]-BK (100 nmol/pata; A)

ou o R-715 (60 nmol/pata; B) foram co-administrados com a des-Arg

-BK (100

nmol/pata) nos animais tratados previamente com LPS (1 µg/pata, 12 h). Os valores

representam a diferença de volume (em ml) das patas tratadas com veículo (PBS) ou

com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a média de 4-6 animais e as barras

verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P < 0,01 em relação ao grupo controle (PBS, círculos

fechados). (ANOVA de duas vias para medidas repetidas seguida do teste de Newman-

Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

10 20 30 60 120

0.25

0.0

0.50

Controle

+ de s-Arg

-Leu

-BK

10 20 30 60 120

0.25

0.0

0.50

Controle

+ R715

** **

Figura 4 – Efeito do tratamento sistêmico com inibidores de síntese protéica

sobre o edema causado pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS.

Os animais receberam dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.; A) ou cicloheximida (1,5 mg/kg,

s.c.; B) 6 h antes do LPS (1 µg/pata), e após 12 h foi administrada a des-Arg

-BK (100

nmol/pata). Os valores representam a diferença de volume (em ml) das patas tratadas

com veículo (PBS) ou com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a média de 4-6

animais e as barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P < 0,01 em relação ao grupo

controle (PBS, círculos fechados). (ANOVA de duas vias para medidas repetidas

seguida do teste de Newman-Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

10 20 30 60 120

0.00

0.25

0.50

Controle

+ Dexametasona

10 20 30 60 120

0.00

0.25

0.50

Controle

+ Cicloheximida

Figura 5 – Efeito do tratamento sistêmico com inibidores da ativação do fator de

transcrição NF-κB sobre o edema mediado pelos receptores B

na pata de ratos

pré-tratados com LPS. Os animais receberam os inibidores PDTC (100 mg/kg, i.p; A)

ou TLCK (2 mg/kg; B) 30 min antes do LPS (1 µg/pata), e após 12 h foi administrada a

des-Arg

-BK (100 nmol/pata). Os valores representam a diferença de volume (em ml)

das patas tratadas com veículo (PBS) ou com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a

média de 4-6 animais e as barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P < 0,01 em relação

ao grupo controle (PBS, círculos fechados). (ANOVA de duas vias para medidas

repetidas seguida do teste de Newman-Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ PDTC

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ TLCK

A co-injeção dos anticorpos anti-IL-1β ou anti-TNF-α (50 ng/pata) (Figura 6

A e B) reduziu de maneira significativa a formação do edema induzida pela des-

Arg

-BK (100 nmol/pata) em animais tratados com LPS (1 µg/pata, 12 h), com

inibições de 62 ± 8 e 36 ± 5 %, respectivamente. De maneira semelhante, a

administração conjunta do antagonista natural do receptor de IL-1, IRA (100

µg/pata), ou da citocina antiinflamatória, IL-10 (10 ng/pata) reduziu de forma

significativa a resposta à des-Arg

-BK nos animais tratados com LPS. As inibições

observadas foram de 55 ± 6 e 37 ± 4 %, respectivamente (Figura 6 C e D).

O papel do recrutamento de células foi avaliado pelo uso de inibidores de

migração celular. Os dados da figura 7 mostram que o pré-tratamento dos animais

com os inibidores de moléculas de adesão, fucoidina (inibidor não-seletivo de

selectinas; 10 mg/kg, e.v., 15 min), ou anti-CD18 (anticorpo monoclonal para β2-

integrina, 1 mg/kg, e.v., 15 min), produziu inibição significativa do edema causado

pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata) em animais tratados com LPS (1 µg/pata, 12 h),

com inibições de 60 ± 5 e 41 ± 4 %, respectivamente. De maneira similar, a

administração do antagonista de receptores para o PAF, WEB 2086 (15 µg/pata),

em conjunto com o LPS (1µg/pata, 12 h), ou o pré-tratamento dos animais com o

anticorpo anti-PMN (34 µg/kg, i.p., 30 min), causou uma redução marcante da

resposta mediada pelos receptores B

nos animais tratados com LPS. As

percentagens de inibição foram de, respectivamente, 54 ± 6 e 49 ± 6 %.

Figura 6 – Efeito do tratamento com os anticorpos anti-IL-1ß, anti-TNF-a, ou com

citocinas antiinflamatórias sobre o edema induzido pela des-Arg

-BK na pata de

ratos pré-tratados com LPS. Os anticorpos anti-IL-1ß (50 ng/pata; A) e anti-TNF-a (50

ng/pata; B), o antagonista de receptores para IL-1 (IRA; 100 µg/pata; C), ou a IL-10 (10

ng/pata; D) foram co-administrados com o LPS (1 µg/pata), 12 h antes da des-Arg

-BK

(100 nmol/pata). Os valores representam a diferença de volume (em ml) das patas

tratadas com veículo (PBS) ou com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a média de

4-6 animais e as barras verticais, os e.p.m. **P < 0,01 em relação ao grupo controle

(PBS, círculos fechados). (ANOVA de duas vias para medidas repetidas seguida do

teste de Newman-Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ Anti-IL-1β

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ Anti-TNF-α

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ IRA

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ IL-10

Figura 7 – Efeito da administração de inibidores de migração sobre o edema

causado pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS. Os animais

foram tratados com fucoidina (10 mg/kg, e.v., 15 min; A), anticorpo anti-CD18 (1 mg/kg,

e.v., 15 min; B), WEB 2086 (15 µg/pata; C) ou anticorpo anti-PMN (34 µg/kg, i.p., 30

min; D), e receberam a des-Arg

-BK (100 nmol/pata) 12 h após a administração de LPS

(1 µg/pata). Os valores representam a diferença de volume (em ml) das patas tratadas

com veículo (PBS) ou com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a média de 4-6

animais e as barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P < 0,01 em relação ao grupo

controle (PBS, círculos fechados). (ANOVA de duas vias para medidas repetidas

seguida do teste de Newman-Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

10 20 30 60 120

0.25

0.0

0.50

Controle

+ Fucoidina

10 20 30 60 120

0.25

0.0

0.50

Controle

+ Anti-CD18

10 20 30 60 120

0.25

0.0

0.50

Controle

+ WEB 2086

10 20 30 60 120

0.00

0.25

0.50

Controle

+ Anti-PMN

Em outro grupo experimental, foi avaliado o possível envolvimento do NO

no aumento da resposta edematogênica mediada pelos receptores B

em ratos

que receberam LPS (1µg/pata, 12 h). Nestes animais, o edema de pata induzido

pela des-Arg

-BK (100 nmol/pata) foi significativamente bloqueado pelo pré-

tratamento com o inibidor não seletivo da NOS, L-NOARG (10 mg/kg, i.p.),

administrado 30 min antes do LPS (39 ± 8 %) (Figura 8 A). O tratamento com os

inibidores seletivos da iNOS, aminoguanidina (30 mg/kg, i.p., 30 min antes LPS e

com reforço a cada 4 h), ou com o 1400W (1 mg/kg, s.c., 1 h) também foi capaz

de inibir o edema à des-Arg

-BK nos animais que receberam LPS (Figura 8 B e

C). As percentagens de inibição observadas após o tratamento com esses

inibidores foram: 50 ± 5 % e 45 ± 8 %, respectivamente. Todavia, o tratamento

dos animais com os inibidores da NOS, nas mesmas doses descritas acima, 30

min antes da administração da des-Arg

-BK em animais pré-tratados com LPS (1

µg/pata, 12 h), não foi capaz de inibir a resposta edematogênica causada pelos

receptores B

(Figura 9).

Figura 8 – Efeito da administração de inibidores da NOS sobre o edema induzido

pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS. Os animais foram

tratados com o inibidor não seletivo para a NOS, L-NOARG (10 mg/kg, i.p., 30 min; A),

ou com os inibidores seletivos para a iNOS, aminoguanidina (30 mg/kg, i.p., 30 min

antes LPS e com reforço a cada 4 h; B), ou 1400W (1 mg/kg, s.c., 1 h; C), e receberam

a des-Arg

-BK (100 nmol/pata) 12 h após a administração de LPS (1 µg/pata). Os

valores representam a diferença de volume (em ml) das patas tratadas com veículo

(PBS) ou com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a média de 4-6 animais e as

barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P < 0,01 em relação ao grupo controle (PBS,

círculos fechados). (ANOVA de duas vias para medidas repetidas seguida do teste de

Newman-Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ L-NOARG

102030 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ Aminoguanidina

10 20 30 60 120

0.0

0.2

0.4

Controle

+ 1400 W

** **

Tempo após a injeção (min)

Aumento no volume da pata (ml)

Figura 9 – Efeito da administração de inibidores da NOS sobre o edema induzido

pela des-Arg

-BK na pata de ratos pré-tratados com LPS. Os animais foram

tratados com LPS (1 µg/pata, 12 h) e receberam, 30 min antes da des-Arg9-BK (100

nmol/pata), o inibidor não seletivo para a NOS, L-NOARG (10 mg/kg, i.p.; A), ou os

inibidores seletivos para a iNOS, aminoguanidina (30 mg/kg, i.p.; B), ou 1400W (1

mg/kg, s.c.; C). Os valores representam a diferença de volume (em ml) das patas

tratadas com veículo (PBS) ou com a des-Arg

-BK. Cada ponto representa a média de

4-6 animais e as barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05 em relação ao grupo controle

(PBS, círculos fechados). (ANOVA de duas vias para medidas repetidas seguida do

teste de Newman-Keuls) .

Aumento no volume da pata (ml)

Tempo após a injeção (min)

102030 60 120

0.00

0.25

0.50

Controle

+ L-NOARG

102030 60 120

0.00

0.25

0.50

Controle

+ Aminoguanidina

102030 60 120

0.00

0.25

0.50

Controle

+ 1400 W

Tempo após a injeção (min)

Aumento no volume da pata (ml)

4. Efeito da injeção intraplantar de LPS sobre a ativação do fator de

transcrição NF-κB na pata de rato

O ensaio de deslocamento em gel (EMSA) demonstrou que a injeção

intraplantar de LPS (1 µg/pata) promoveu uma ativação marcante do fator de

transcrição NF-κB na pata de rato (Figura 10). A ativação do NF-κB após o

tratamento com LPS apresentou um perfil bifásico, com um primeiro aumento

observado entre 1 e 12 h e um segundo aumento entre 36 e 48 h. Os resultados

também demonstram que o tratamento dos animais com o PDTC (nas mesmas

doses capazes de inibir o aumento do edema induzido pela des-Arg

-BK) aboliu

completamente a ativação do NF-κB observada após a administração de LPS na

pata de rato.

5. Medida dos níveis de IL-1β e TNF-α após o tratamento com LPS na pata de

rato

Os resultados da Figura 11 mostram que o tratamento com LPS (1 µg/pata)

foi capaz de induzir um aumento significativo dos níveis de IL-1β e TNF-α no

tecido subcutâneo da pata de rato (1,6 e 50 vezes, respectivamente). O aumento

da produção de TNF-α foi significativo 1 h após o tratamento com LPS, retornando

a níveis indetectáveis após esse período (Figura 11 A). Em relação à IL-1β, os

níveis máximos foram observados 12 h após o tratamento com LPS (Figura 11 B),

retornando a níveis basais 24 h após o tratamento.

Figura 10 – Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS sobre a ativação do

fator de transcrição NF-κB. (A) Ativação do NF-κB induzida pelo LPS (1 µg/pata, 1 -

48 h) na pata de rato. 1. PBS; 2. LPS 1 h; 3. LPS 6 h; 4. LPS 12 h; 5. LPS 24 h; 6. LPS

36 h; 7. LPS 48 h; 8. LPS 12 h + PDTC; 9. competição específica; 10. competição

inespecífica; 11. LPS 12 h. (B) Representação gráfica da razão do sinal expresso em

unidades relativas. Cada coluna representa a média de 3 experimentos e as barras

verticais, os e.p.m. Difere significativamente do controle PBS** ou LPS

(P < 0,01).

(ANOVA de duas vias seguida do teste de Dunnett).

PBS 6 12 24 36 48112

Pré-tratamento com LPS (h)

PDTC

1 2 3 4 5 6 7 8

Ativação do NF-

Razão do sinal (unidades relativ as)

9 10 11

Figura 11 – Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS sobre os níveis de

TNF-α e IL-1β na pata de rato. Aumento dos níveis de TNF-α (A) ou IL-1β (B) induzido

pelo LPS (1 µg/pata, 1 - 48 h) na pata de rato. Cada coluna representa a média de 4

experimentos e as barras verticais, os e.p.m. **P < 0,01 em relação ao grupo controle

(PBS). (ANOVA de duas vias seguida do teste de Dunnett).

140

PBS 1 6 12 24

Pré-tratame nto com LPS (h)

36 48

TNF-

(pg/ 100 mg tecido)

250

500

PBS 1 6 12 24

Pré-tratamento com LPS (h)

36 48

IL-1

(pg/ 100 mg tecido)

6. Medida da atividade da mieloperoxidase após o tratamento com LPS

Visando avaliar a migração celular para a pata dos animais tratados com

LPS, foram quantificados os níveis da enzima MPO em diferentes intervalos de

tempo após a administração do produto bacteriano. A figura 12 mostra que a

injeção intraplantar de LPS (1 µg/pata) foi capaz de promover um aumento

marcante e tempo-dependente da migração de neutrófilos, conforme indicado

pelo aumento de aproximadamente 7 vezes na atividade da MPO. O aumento

máximo da migração de neutrófilos foi observado em 12 h, permanecendo

significativo por até 36 h e retornando à condição basal após esse período.

7. Efeito do tratamento local com LPS sobre a indução da iNOS na pata de

rato

O ensaio de Western blot demonstrou que o tratamento local com LPS (1

µg/pata) promoveu o aumento da expressão da enzima iNOS na pata de rato

(Figura 13). Os resultados indicam que em condições basais não é possível

observar a expressão da enzima. No entanto, o tratamento com LPS levou a um

aumento marcante e tempo-dependente da indução da iNOS, observado entre 1 e

12 h após a administração do produto bacteriano. O efeito máximo foi verificado 6

h após o tratamento com LPS, apresentando uma redução após esse período.

Figura 12 – Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS (1 µg/pata, 1 - 48 h)

sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) na pata de rato. Cada coluna

representa a média de 3 experimentos e as barras verticais, os e.p.m. **P < 0,01 em

relação ao grupo controle (PBS). (ANOVA de duas vias seguida do teste de Dunnett).

0. 25

0. 0

0. 50

PBS 1 6 12 24

Pré-tratamento com LPS (h)

36 48

Atividade da MPO (DO/mg tecido)

0. 25

0. 0

0. 50

PBS 1 6 12 24

Pré-tratamento com LPS (h)

36 48

Atividade da MPO (DO/mg tecido)

Atividade da MPO (DO/mg tecido)Atividade da MPO (DO/mg tecido)

Figura 13 – Efeito tempo-dependente do tratamento com LPS sobre a expressão

da iNOS na pata de rato. (A) Expressão tempo-dependente da iNOS na pata de ratos

pré-tratados com LPS (1 µg/pata, 1 - 12 h). (B) Representação gráfica da expressão da

iNOS em unidades relativas. Cada coluna representa a média de 3 experimentos e as

barras verticais, os e.p.m. *P < 0,05; **P < 0,01 em relação ao grupo controle. (ANOVA

de duas vias seguida do teste de Dunnett).

13 612

Pré-tratamento com LPS (h)

iNOS 

13 612

Pré-tratamento com LPS (h)

iNOS 

C1612

Pré-tratamento com LPS (h)

1/2

Expressão da iNOS

(unidades relativas)

DISCUSSÃO

Os organismos vivos são constantemente expostos a diferentes tipos de

patógenos. A primeira linha de defesa do organismo contra patógenos

microbianos, fúngicos e virais é o sistema imune inato, formado pelos

mecanismos de defesa desprovidos de memória imunológica. Desta forma, a

resposta imune inata ocorre sempre na mesma extensão, não importando o

número de exposições ao agente infeccioso, utilizando componentes celulares,

como macrófagos, neutrófilos, basófilos, mastócitos e eosinófilos, bem como

componentes moleculares, como o sistema complemento, proteínas de fase

aguda e citocinas (Delves e Roitt, 2000). O sucesso deste tipo de resposta imune

depende do reconhecimento pelo organismo de domínios conservados presentes

nos patógenos, chamados padrões moleculares associados a patógenos

(PAMPs) (Janeway e Medzhitov, 1998). O reconhecimento dos PAMPs é

realizado por diferentes receptores chamados receptores de reconhecimento de

padrão (PRR), expressos por muitos tipos celulares, em especial por células do

sistema imune. O exemplo de PAMP melhor estudado é o LPS, um componente

da membrana de bactérias Gram-negativas considerado um potente ativador do

sistema imune. A resposta inflamatória ao LPS está tão intimamente relacionada

ao sistema imune inato que mesmo quantidades pequenas do produto bacteriano

são capazes de causar respostas inflamatórias severas in vivo, incluindo o

choque endotóxico. De fato, experimentos demonstram que, em culturas

celulares, o LPS é capaz de gerar resposta em concentrações muito baixas, de

até 1 pg/ml (Brown et al., 1994; Blease et al., 1998).

Grande parte dos efeitos atribuídos ao LPS parece ser mediada por uma

cascata de eventos celulares relacionada à ativação dos TLR4, que resulta na

ativação de fatores transcricionais, como o NF-κB, e na indução de uma série de

genes envolvidos na inflamação, como IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, a isoforma

induzida da sintase do óxido nítrico (iNOS), e a ciclooxigenase do tipo 2 (COX-2),

dentre outros (Guha e Mackman, 2001; Hawiger, 2001, Saban et al., 2001; Beg,

2002; Dobrovolskaia e Vogel, 2002; Zuany-Amorin et al., 2002; Akira e Hemmi,

2003). Além destas moléculas inflamatórias, diversas evidências apontam um

aumento dos receptores B

para as cininas após o tratamento com LPS in vitro ou

in vivo (Marceau et al., 1998; Calixto et al., 2001; 2004; Couture et al., 2001).

Os receptores B

para as cininas estão normalmente ausentes nos tecidos

em condições fisiológicas, podendo ser rapidamente induzidos após estímulos

inflamatórios, traumáticos ou infecciosos (Marceau et al., 1998; Calixto et al.,

2004). As primeiras evidências funcionais demonstrando a indução dos

receptores B

pelo LPS surgiram em 1981, quando Regoli e colaboradores

observaram que o pré-tratamento de coelhos com o produto bacteriano era capaz

de induzir o aparecimento de uma resposta hipotensora à des-Arg

-BK. As

observações acerca do efeito do LPS sobre as respostas hipotensoras mediadas

pelos receptores B

foram confirmadas através de estudos posteriores em coelhos

(Marceau et al., 1984; Bouthillier et al., 1987; Drapeau et al., 1991b), ratos

(Tokumasu et al., 1995; Nicolau et al., 1996; McLean et al., 1999), porcos

(Siebeck et al., 1998; Schmid et al., 1998) e macacos (DeBlois e Horlick, 2001).

Além disso, o aumento dos receptores B

após a administração de LPS também

foi observado na aorta e outras preparações vasculares de coelhos (Regoli et al.,

1981; Bouthillier et al., 1987; Medeiros et al., 2001; Sabourin et al., 2001) e porcos

(Schremmer-Danninger et al., 1996; 1998), em tecidos cardíacos e renais de ratos

(Marin-Castanõ et al., 1998; McLean et al., 1999; Schanstra et al., 1999; 2000;

Yayama et al., 2000) e na bexiga isolada de camundongo (Busser et al., 1998),

dentre outros. Wille e colaboradores (2001) demonstraram ainda que, em ratos, o

tratamento com LPS é capaz de promover um aumento no extravasamento

plasmático mediado pelos receptores B

em diversos tecidos, incluindo duodeno,

traquéia, íleo e brônquios.

Diversas evidências sugerem que o bloqueio dos receptores B

pode ser

benéfico durante o choque séptico (Schmid et al., 1998; Pesquero et al., 2000;

DeBlois e Horlick, 2001; Calixto et al., 2004; Marceau e Regoli, 2004). De fato, a

hipotensão inicial observada no choque endotóxico induzido por LPS é

marcadamente reduzida em animais com deleção gênica do receptor B

(Pesquero et al., 2000). Por outro lado, animais transgênicos que superexpressam

o receptor B

apresentam maior susceptibilidade à morte provocada pelo choque

endotóxico (Ni et al., 2003). Desta forma, é de grande importância o melhor

entendimento dos mecanismos através dos quais o LPS é capaz de induzir o

aumento dos receptores B

in vivo.

As cininas, agindo sobre os receptores B

e B

, podem evocar diretamente

vários sinais inflamatórios, incluindo aumento na permeabilidade vascular,

vasodilatação arteriolar, formação de edema, migração celular, dor e hiperalgesia

(Hall e Morton, 1997; Calixto et al., 2000; Calixto et al., 2001; Calixto et al., 2004;

Marceau e Regoli, 2004). Em ratos normais, a administração intradérmica ou

intraplantar de des-Arg

-BK produz uma resposta edematogênica de pequena

intensidade (Campos e Calixto, 1995). Por outro lado, o edema de pata causado

pela administração intraplantar de des-Arg

-BK em ratos sofre um aumento

marcante quando os animais são previamente submetidos a diferentes estímulos

inflamatórios. Estudos anteriores mostraram que o tratamento sistêmico com LPS

é um estímulo capaz de produzir um aumento expressivo das respostas

edematogênicas mediadas pelos agonistas dos receptores B

na pata de rato

(Campos et al., 1996; Ferreira et al., 2000).

Os resultados obtidos neste estudo confirmam e estendem dados da

literatura, demonstrando que o tratamento por via intraplantar com LPS resulta em

um aumento funcional tempo-dependente e sustentado dos receptores B

na pata

de rato, como avaliado através do edema de pata. O aumento da resposta

edematogênica causada pela injeção de des-Arg

-BK nos animais previamente

tratados com LPS teve seu pico em 12 h e se manteve significativamente elevado

por até 72 h. Com base nos dados do RT-PCR, é possível sugerir que esta

resposta é dependente de síntese protéica, uma vez que os níveis de RNAm para

os receptores B

se apresentaram elevados entre 1 e 6 h após a administração de

LPS. Esta idéia é reforçada por resultados demonstrando que a cicloheximida e o

glicocorticóide dexametasona, dois agentes capazes de interferir na síntese de

novo de proteínas, foram capazes de reduzir de maneira significativa o aumento

na resposta edematogênica mediada por receptores B

nos animais pré-tratados

localmente com LPS.

A cicloheximida é um antibiótico produzido por uma bactéria da espécie

Streptomyces griseus, cuja principal atividade biológica é a inibição do processo

de translação em células eucarióticas, que resulta na inibição da síntese protéica

(Ennis e Lubin, 1964). Por sua vez, o glicocorticóide dexametasona tem seus

principais efeitos associados com sua capacidade de influenciar a expressão

gênica em todos os níveis de regulação conhecidos. Devido ao seu caráter

lipofílico, os glicocorticóides se difundem através da membrana plasmática e se

ligam a receptores nucleares específicos (GR). Os GRs localizam-se no

citoplasma, onde formam complexos com várias proteínas regulatórias, incluindo

as heat shock proteins. Depois da ligação do agonista, os receptores sofrem

alterações conformacionais que resultam na exposição do sinal de localização

nuclear do receptor. Após sua ativação, o GR é translocado para o núcleo, onde

ocorrem interações proteína-proteína, ou a interação direta com seqüências

específicas do DNA, chamadas de elementos responsivos a glicocorticóides

(GRE). Estes processos podem resultar tanto na estimulação, quanto na inibição

da transcrição de uma série de genes, particularmente daqueles envolvidos no

processo inflamatório. As interações proteína-proteína que ocorrem entre o GR e

fatores de transcrição específicos, particularmente o AP-1 e o NF-κB, respondem

pelo principal efeito antiinflamatório dos glicocorticóides. Além de suas ações

transcricionais, os glicocórticoides podem agir também pós-transcricionalmente,

aumentando ou reduzindo a estabilidade do RNAm, bem como alterando

processos translacionais, através da ligação com proteínas regulatórias

específicas (Sternberg, 2001; Pelaia et al., 2003; Smoak e Cidlowski, 2004).

Desta forma, os efeitos dos glicocorticóides sobre a expressão dos receptores B

podem estar relacionados com a redução de sua síntese ou da síntese de

citocinas pró-inflamatórias, através da inibição do NF-κB (Donaldson et al., 1997;

Marceau et al., 1998; Blais et al., 2000). Além disso, dados recentes (Haddad et

al., 2000) sugerem que as ações da dexametasona sobre o aumento dos

receptores B

causado por IL-1β ou TNF-α, em fibroblastos de pulmão humano,

podem envolver alterações na taxa de transcrição do gene para o receptor B

decréscimo da degradação do RNAm, ou ainda aumento da estabilidade do

RNAm do receptor, provavelmente através da inibição da MAPK p38 (Kassel et

al., 2001; Lasa et al., 2001; 2002; De Bosscher et al., 2003). É possível sugerir

que um ou mais destes processos estejam associados com os efeitos inibitórios

da dexametasona sobre o aumento da resposta edematogênica mediada pelos

receptores B

na pata de rato.

Os resultados do presente estudo também indicam que o edema de pata

causado pela des-Arg

-BK em ratos previamente tratados com LPS é mediado

exclusivamente por receptores B

, já que o aumento no volume da pata induzido

pelo agonista B

foi significativamente bloqueado pela co-injeção dos

antagonistas seletivos para o receptor B

, des-Arg

[Leu

]-BK e R-715. Além disso,

o LPS, quando administrado no mesmo intervalo de tempo em que foi observada

a resposta máxima à des-Arg

-BK, não foi capaz de modificar a resposta mediada

pelos receptores B

, quando avaliado no edema de pata induzido pelo agonista de

receptores B

, a Tyr

-BK. Resultados semelhantes foram observados em animais

adrenalectomizados ou tratados com BCG, PAF, IL-1β ou TNF-α (Campos et al.,

1997; 1998; Cabrini et al., 2001; Fernandes et al., 2003). Contudo, estes dados

diferem daqueles observados após o tratamento sistêmico com LPS. Neste

modelo, Campos e colaboradores (1996) observaram uma redução significativa

do edema de pata causado pela Tyr

-BK, acompanhado pelo aumento da

resposta edematogênica mediada pelo agonista de receptores B

. Esta evidência

permite sugerir que mecanismos regulatórios distintos participam da modulação

dos receptores cininérgicos, de acordo com a via de administração do LPS. Os

resultados obtidos no presente estudo demonstram ainda, que o efeito do

tratamento intraplantar com LPS sobre o aumento na resposta edematogênica

mediada pelos receptores B

não parece envolver alterações sistêmicas, uma vez

que a injeção prévia do produto bacteriano na pata contralateral não foi capaz de

alterar o edema à des-Arg

-BK.

Diversos estudos apontam uma importante participação do NF-κB nas

ações mediadas pelo LPS (Guha e Mackman, 2001; Yi et al., 2001; Cook et al.,

2004). Nos últimos anos, a via do NF-κB tem sido amplamente descrita por

diferentes grupos de pesquisa que demonstraram o envolvimento deste fator de

transcrição em uma variedade de patologias, incluindo asma, artrite reumatóide,

sepse, aterosclerose, esclerose múltipla, câncer e doença intestinal inflamatória,

dentre outras (Barnes e Adcock, 1997; Barnes e Karin, 1997; Perkins, 2000; Tak e

Firestein, 2001; Yamamoto e Gaynor, 2001; Sun e Andersson, 2002; Li e Verma,

2002; Santoro et al., 2003; Shishodia e Aggarwal, 2004). O envolvimento do NF-

κB em condições patofisiológicas está diretamente associado ao controle da

expressão de uma série de genes, muitos deles envolvidos no processo

inflamatório, como fatores de crescimento, citocinas pró-inflamatórias,

quimiocinas, moléculas de adesão, metaloproteinases, COX-2 e iNOS, dentre

outros (Baichwal e Baeuerle, 1997; Tak e Firestein, 2001). NF-κB é a designação

para membros de uma família de fatores de transcrição diméricos estruturalmente

relacionados, denominada de Rel. Cada membro desta família contém uma região

N-terminal conservada chamada domínio de homologia Rel (RHD), necessária à

dimerização, à localização nuclear e à ligação ao DNA (Kopp e Gosh, 1995;

Baldwin, 1996; May e Gosh, 1998). Até o momento, 5 proteínas pertencentes à

família Rel foram identificadas em mamíferos: NF-κB1 (p50; p105), NF-κB2 (p52;

p100), RelA (p65), RelB e c-Rel (Gosh et al., 1998). A maior parte dos membros

desta família forma homo ou heterodímeros entre si, sendo que o heterodímero

formado pelas subunidades p50 ou p52 com p65 é a forma mais ativa.

Com exceção dos linfócitos B e algumas áreas do sistema nervoso central,

onde o NF-κB é encontrado constitutivamente no núcleo, nas demais células não

estimuladas, o fator de transcrição permanece no citoplasma na forma inativa,

associado a proteínas regulatórias chamadas de inibidores de κB (IκB) (May e

Gosh, 1998). Esta associação mantém o sinal de localização nuclear do NF-κB

mascarado, evitando a migração do fator de transcrição para o núcleo (May e

Gosh, 1998; Li e Verma, 2002; Vermeulen et al., 2002). Estímulos inflamatórios

induzem a ativação do complexo de proteínas IκB quinases (IKKs), composto por

duas subunidades catalíticas (IKKα e IKKβ) e uma subunidade regulatória

(IKKγ/NEMO) (Karin, 1999; Karin e Bem-Neriah, 2000; Israel, 2000). Uma vez

ativado, o complexo IKK promove a fosforilação do IκB e, conseqüentemente, a

ubiquitinação e a degradação da proteína por proteasomas. Isso permite a

translocação do NF-κB livre do citoplasma para o núcleo e sua associação com

regiões promotoras de uma série de genes, regulando sua transcrição (Bauerle e

Baltimore, 1996; Barnes e Karin, 1997; Sun e Andersson, 2002; Karin et al.,

2004).

A participação do NF-κB na regulação da expressão do receptor B

tem

sido demonstrada em diferentes modelos experimentais in vitro e in vivo.

Schanstra e colaboradores (1998) observaram que a expressão do receptor B

por fibroblastos de pulmão humano tratados com IL-1β era acompanhada pela

ativação deste fator de transcrição, e que este evento era necessário para a

indução do receptor B

. Estudos posteriores demonstraram que mecanismos

semelhantes parecem estar envolvidos na indução do receptor B

na aorta de

coelhos (Medeiros et al., 2001; Sabourin et al., 2002), na veia umbilical humana

(Sardi et al., 2000; 2002), na veia porta de rato (Medeiros et al., 2004) e na

musculatura lisa traqueal de camundongos (Bachar et al., 2004). Além disso, a

participação do NF-κB na regulação da expressão do receptor B

in vivo foi

observada no modelo do edema de pata após o tratamento local com PAF, IL-1β

ou TNF-α (Campos et al., 1999, Fernandes et al., 2003) ou em animais

adrenalectomizados (Cabrini et al., 2001).

No presente estudo, demonstramos que o LPS, quando administrado por

via intraplantar, é capaz de induzir uma rápida ativação do NF-κB, de caráter

bifásico, apresentando um primeiro aumento entre 1 e 12 h e um segundo

aumento entre 36 e 48 h, como indicado pelo ensaio de deslocamento em gel .

Estudos recentes têm descrito um padrão de ativação semelhante em resposta a

estímulos inflamatórios (Thompson et al., 1995; Gukovsky et al., 1998; Schmidt et

al., 2003) e infecciosos (Yurochko et al., 1995; Hauf et al., 1997; Sporn et al.,

1997; Conelly et al., 2001; Han et al., 2002). Lawrence e colaboradores (2001)

observaram que a fase tardia de ativação do fator de transcrição está associada à

produção de prostaglandinas antiinflamatórias provenientes da COX-2, bem como

de citocinas antiinflamatórias como o fator de crescimento transformador-β1

(TGF-β1). Desta forma, a inibição da fase tardia de ativação do NF-κB prolonga

as respostas inflamatórias, o que sugere a participação deste fator de transcrição

na resolução do processo inflamatório (Conelly et al., 2001; Zou et al., 2003).

Contudo, o papel biológico exercido pela ativação bifásica do NF-κB em

processos inflamatórios ainda é pouco entendido e, muitos autores, associam

este perfil de ativação à amplificação e perpetuação das respostas inflamatórias.

O papel da ativação do fator nuclear NF-κB no processo de indução dos

receptores B

após o tratamento local com LPS foi confirmado através do uso de

dois inibidores deste processo, o PDTC, um inibidor da fosforilação da IκB, e o

TLCK, um inibidor de proteassomas. Ambos os tratamentos foram capazes de

inibir de maneira marcante a resposta edematogênica causada pela des-Arg

-BK

em ratos tratados com LPS, demonstrando pela primeira vez que a ativação do

NF-κB pelo LPS é um evento necessário ao aumento dos receptores B

in vivo.

Vários dados da literatura têm demonstrado que a indução dos receptores

parece envolver a produção de citocinas pró-inflamatórias em diferentes

modelos experimentais in vitro e in vivo (DeBlois et al., 1991; Ahluwalia e Perretti,

1996; Larrivée et al., 1998; Sardi et al., 1998; Campos et al., 1998; 1999; 2002;

Marceau et al., 1998; Phagoo et al., 1999; Calixto et al., 2000; 2004; Haddad et

al., 2000; Zhang et al., 2004). Diversas evidências suportam a hipótese de que

citocinas pró-inflamatórias produzidas em resposta ao LPS são capazes de levar

ao aumento dos receptores B

através do aumento da ativação do NF-κB.

Estudos recentes mostram que a IL-1β e o TNF-α são capazes de ativar este fator

de transcrição em diferentes situações in vivo, em especial após a administração

de LPS (Han et al., 2002; Koay et al., 2002). Desta forma, estas citocinas pró-

inflamatórias são capazes de induzir a expressão de moléculas de adesão e de

fatores quimiotáticos como o PAF, regulando assim o recrutamento de neutrófilos

in vivo (Sun e Hsueh, 1991; Camussi et al., 1995; Tan et al., 1996; Wyble et al.,

1997; De Plaen et al., 2002; Jersmann et al., 2001; Han et al., 2002). Além disso,

Campos e colaboradores (1998; 1999; 2002) demonstraram que a IL-1β e o TNF-

α, agindo conjuntamente, são capazes de induzir o aumento dos receptores B

pata de rato, através de um processo dependente da ativação do NF-κB e do

acúmulo de neutrófilos na pata de rato. Os dados do presente estudo confirmam e

estendem estas evidências, demonstrando que a resposta edematogênica

causada pelo agonista seletivo para os receptores B

, a des-Arg

-BK, em animais

tratados por via intraplantar com LPS, parece ser dependente da produção de

citocinas pró-inflamatórias, mais especificamente de IL-1β e de TNF-α. Esta

conclusão é baseada nos resultados que indicam que o bloqueio das ações do

TNF-α, através da associação de anticorpos específicos, ou da IL-1β através da

associação do antagonista natural do receptor de IL-1 (IRA) ou de anticorpos

específicos, reduziu significativamente o edema de pata mediado pelos

receptores B

. Estas evidências funcionais foram reforçadas pelos dados que

indicam que o tratamento local com LPS é capaz de promover um aumento

tempo-dependente dos níveis de TNF-α e IL-1β na pata de rato, que foi máximo

em 1 h e 12 h, respectivamente.

Com base nos resultados do presente estudo, é possível sugerir que a

indução dos receptores B

in vivo, através de estímulos capazes de promover a

liberação de citocinas pró-inflamatórias, pode ser regulada pela produção

secundária de citocinas antiinflamatórias, uma vez que a associação da citocina

IL-10 foi capaz de prevenir a indução funcional dos receptores B

mediada pelo

tratamento com LPS. A IL-10 é uma citocina antiinflamatória produzida durante

processos inflamatórios, geralmente pelas mesmas células que produzem

mediadores pró-inflamatórios, incluindo monócitos, macrófagos e linfócitos T. As

ações antiinflamatórias da IL-10 estão relacionadas à sua capacidade de suprimir

a expressão de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão

(Moore et al., 2001), além de possuir um papel relevante em diversas doenças

inflamatórias como a sepse, artrite e doença intestinal inflamatória (Fiorentino et

al., 1991; Dokka et al., 2000; Yoshimura et al., 2003).

O recrutamento de leucócitos para o sítio inflamatório é um componente

crítico da imunidade inata. A migração de leucócitos a partir da circulação

sangüínea é um processo composto por uma série de etapas, orquestradas pela

ativação seqüencial de moléculas de adesão e seus ligantes nos leucócitos e

células endoteliais. As moléculas de adesão envolvidas na migração de leucócitos

compreendem selectinas, integrinas e imunoglobulinas (Walzog e Gaehtgens,

2000). O processo de migração tem início com a captura dos leucócitos

circulantes pela parede vascular, seguida por seu rolamento ao longo da parede.

Este processo de marginação é um comportamento normal dos leucócitos

circulantes, e somente na presença do estímulo apropriado ocorre a ativação

destas células e sua aderência firme às células endoteliais da parede vascular,

com a subseqüente diapedese dos leucócitos para o parênquima tecidual

(Wagner e Roth, 2000). O rolamento é um processo mediado por selectinas,

enquanto que as integrinas são responsáveis pela aderência firme do leucócito

ativados à célula endotelial (Allcock et al., 2001). A ativação dos leucócitos ocorre

em resposta à ação de diferentes moléculas, como a anafilotoxina C5a e a

quimiocina IL-8 (Yoshimura et al., 1987; Collins et al., 1991). Os neutrófilos estão

entre as primeiras células a chegar ao sítio inflamatório e são importantes

ferramentas em respostas agudas, sendo responsáveis pela eliminação partículas

estranhas, como bactérias (Delves e Roitt, 2000). De fato, a administração de

produtos bacterianos, como o LPS, é capaz de produzir uma migração aguda de

neutrófilos para o local da injeção, através da liberação de vários mediadores

inflamatórios, incluindo fatores quimiotáticos como a C5a e o PAF, além de

quimiocinas como a IL-8 e o fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas

(CINC), entre outros (Smedegard et al., 1989; Martich et al., 1991; Ohira et al.,

1995; Davenpeck et al., 1998; Han et al., 2002). Além disso, o LPS provoca

alterações em moléculas de adesão, como o shedding de L-selectinas e a

indução da expressão de integrinas (Harris et al., 1994; Chakravortty e Kumar

1999;

Wagner e Roth, 1999). Os dados obtidos no presente estudo estão de

acordo com aqueles da literatura, que demonstram a capacidade do LPS em

induzir o influxo celular para o local de inflamação (

Chakravortty e Kumar 1999;

Zentay et al., 1999; Fan e Malik, 2003; Serikov et al., 2004). Assim, o tratamento

local com LPS produziu uma migração marcante e tempo-dependente de

neutrófilos para a pata de rato, conforme avaliado através do ensaio da MPO. A

enzima MPO, presente principalmente no interior dos grânulos azurófilos dos

neutrófilos catalisa a reação entre peróxido de hidrogênio e cloreto, formando

ácido hipocloroso, um importante componente da resposta de defesa contra

infecções bacterianas. Desta forma, o aumento na atividade da enzima é um

indicativo indireto da migração de neutrófilos para o local da inflamação

(Winterbourn et al., 2000; Faurschou e Borregaard, 2003). O influxo de neutrófilos

observado após a administração de LPS teve um aumento significativo em 6 h,

apresentando a resposta máxima em 12 h e declinando após este período. O

perfil temporal apresentado por este fenômeno foi similar àquele observado na

ativação do NF-κB e no aumento da resposta funcional dos receptores B

sugerindo uma possível relação entre estes eventos.

O papel da migração celular no aumento das respostas mediadas pelos

receptores B

foi avaliado através de diferentes ferramentas. O edema causado

pela des-Arg

-BK nos animais tratados com LPS foi significativamente inibido pelo

tratamento sistêmico com o inibidor não seletivo de selectinas, fucoidina, ou com

o anticorpo monoclonal para β2-integrina, o anti-CD18. Estes resultados permitem

sugerir que a indução dos receptores B

em resposta ao LPS é um processo

dependente da produção e ativação de moléculas de adesão. Além disso,

estratégias como a indução de neutropenia com o anticorpo anti-PMN, ou o

bloqueio dos receptores de PAF com o WEB 2086, também foram capazes de

reduzir de maneira significativa a resposta edematogênica mediada pelos

receptores B

. Estes resultados demonstram que a indução dos receptores B

vivo após a administração local de LPS é um evento dependente do influxo de

neutrófilos para a o sítio inflamatório. Estudos anteriores também demonstraram o

envolvimento da migração celular na modulação dos receptores B

in vivo. A

migração de neutrófilos parece ser importante na indução dos receptores B

após

a administração local de IL-1β ou PAF em ratos (Campos et al., 2002; Fernandes

et al., 2003). Contudo, a depleção de neutrófilos não é capaz de prevenir o efeito

hipotensor da des-Arg

-BK em coelhos tratados sistemicamente com LPS

(Bouthillier et al., 1987). As diferenças para estas respostas podem estar

relacionadas à espécie animal utilizada, ou ainda ao caráter local ou sistêmico da

resposta inflamatória.

Outros estudos também demonstraram que a migração de neutrófilos para

o sítio inflamatório é um evento dependente de receptores B

. Ahluwalia e Perretti

(1996) mostraram que a administração local de antagonistas seletivos para os

receptores B

é capaz de reduzir de forma marcante o acúmulo de neutrófilos

induzido pela IL-1β no modelo da bolha de ar em camundongos. Resultados

semelhantes foram observados na pata de ratos tratados localmente com IL-1β

(Campos et al., 2002), na inflamação pulmonar induzida por sefadex em cobaias

(Perron et al., 1999), na cavidade pleural de ratos tratados com estreptozotocina

(Vianna et al., 2003), ou no leito mesentérico de camundongos tratados com IL-1β

(McLean et al., 2000b). Além disso, animais com supressão gênica do receptor B

apresentaram redução na migração de neutrófilos em condições inflamatórias,

bem como redução na apoptose destas células, demonstrando que estes

receptores são importantes no controle de ambos os processos (Pesquero et al.,

2000; Araújo et al., 2001). Em conjunto, estes dados demonstram que as cininas

têm um importante papel na migração de neutrófilos durante respostas

inflamatórias, ao mesmo tempo em que a migração destas células é um evento

importante na indução dos receptores B

O PAF é um importante fator quimiotático para neutrófilos, conhecido por

causar diversas alterações nesta célula, incluindo a elevação do cálcio

intracelular, aumento do burst respiratório, degranulação, adesão ao endotélio,

dentre outras (Evangelou, 1994; Zhou et al., 1994; Franciose et al., 1996; Ishii e

Shimizu, 2000). Este fator quimiotático é responsável por muitos dos efeitos

patofisiológicos do LPS e outros produtos bacterianos in vivo (Rylander et al.,

1988; Sun e Hsueh, 1991; Camussi et al., 1995; Tan et al., 1996; Lo et al., 1997;

Shen et al., 1998; Tsuji e Shirasawa, 1998; Bulger et al., 2002). Han e

colaboradores (2002) demonstraram recentemente que o PAF é o mediador

responsável pela ativação do NF-κB e pela produção de citocinas após a

administração de LPS in vivo. Além disso, o bloqueio das ações deste mediador

lipídico é capaz de inibir a indução dos receptores B

após a administração local

de IL-1β na pata de rato (Campos et al., 2002). Ademais, a administração local do

próprio PAF é capaz de induzir o aumento dos receptores B

neste modelo

experimental (Fernandes et al., 2003). Desta forma, é possível sugerir que o PAF

produzido pelo tratamento com LPS pode modular a indução dos receptores B

através de seu efeito quimiotático ou da ativação direta do NF-κB através de seu

receptor. Os resultados do presente estudo confirmam esta hipótese e

demonstram que a indução funcional dos receptores B

, avaliada através do

aumento da resposta edematogênica causada pela des-Arg

-BK em ratos pré-

tratados localmente com LPS, foi prevenida de forma significativa pelo

antagonista dos receptores de PAF, o WEB 2086.

Outra importante molécula integrante do processo inflamatório, produzida

em resposta à administração de LPS é a iNOS, uma enzima envolvida na

produção do NO (Xie et al., 1993; 1994; Kleinert et al., 2003). O NO é uma

importante molécula sinalizadora inter e intracelular, envolvida na regulação de

uma variedade de funções celulares em situações fisiológicas ou patológicas.

Nos tecidos animais, o NO é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina, em

uma reação de oxidação catalisada por uma família de enzimas denominadas

sintases do NO (NOS). As NOS são identificadas de acordo com o tipo celular ou

as condições em que foram primeiramente descritas. Dessa maneira, existem três

isoformas distintas de NOS: as constitutivas NOS endotelial (eNOS) e NOS

neuronal (nNOS), e a NOS induzida (iNOS) (Hanafy et al., 2001). As isoformas

constitutivas da NOS são responsáveis pela produção de pequenas quantidades

de NO, relacionada a eventos fisiológicos como neurotransmissão, regulação do

tônus vascular, inibição da agregação plaquetária e da adesão celular, além do

efeito antioxidante (Guzik et al., 2003). Por outro lado, a isoforma induzida da

enzima tem sua expressão modulada em processos inflamatórios ou

fisiopatológicos, com algumas exceções. Uma vez expressa, a iNOS libera NO de

maneira contínua e em grande quantidade. O NO proveniente da iNOS responde

por efeitos protetores contra patógenos virais ou bacterianos (Bogdan, 2001), ou

por efeitos citotóxicos, que incluem dano ao DNA, oxidação de lipoproteínas de

baixa densidade (LDL), nitração de resíduos de tirosina e inibição da respiração

mitocondrial, dentre outros (Ischiropoulos e Al-Mehdi, 1995; Guzik et al., 2003;

Gow et al., 2004). Os efeitos deletérios do NO estão implicados na patologia de

doenças inflamatórias como aterosclerose, artrite reumatóide, asma, diabetes,

choque séptico, rejeição de transplantes, esclerose múltipla e doença inflamatória

intestinal, dentre outras (Vallance e Leiper, 2002; Aktan, 2004).

Lagneux e colaboradores (2000) demonstraram o envolvimento do NO no

processo de indução dos receptores B

após o estresse térmico. Neste trabalho,

os autores observaram que a resposta hipotensora mediada pelo agonista dos

receptores B

em animais submetidos ao estresse térmico era reduzida nos

grupos pré-tratados com um inibidor não seletivo de NOS. Por outro lado, os

animais pré-tratados com um inibidor seletivo da iNOS apresentavam uma

resposta hipotensora aumentada, o que sugere a existência de uma interação

entre as diferentes isoformas da enzima, capaz de modular as respostas

mediadas pelos receptores B

neste modelo.

Os resultados do presente estudo permitem sugerir a participação do NO

no processo de indução dos receptores B

na pata de animais tratados com LPS.

O pré-tratamento dos animais com o inibidor não seletivo da NOS, L-NOARG, ou

com os inibidores seletivos para a iNOS, 1400W ou aminoguanidina, foi capaz de

reduzir de maneira significativa a resposta edematogênica causada pela des-Arg

BK nos animais tratados localmente com LPS. Por outro lado, a administração

dos mesmos inibidores pouco antes da injeção do agonista de receptores B

não

apresentou o mesmo efeito. Estes resultados estão de acordo com estudos

anteriores (Ferreira et al., 2000), que demonstram que a co-administração de

inibidores de NOS com a des-Arg

-BK em animais pré-tratados sistemicamente

com LPS não é capaz de alterar a resposta edematogênica mediada pelos

receptores B

. A partir destes resultados, é possível sugerir que o NO

desempenha um papel importante no processo de indução dos receptores B

sem, no entanto participar da resposta edematogênica observada após a

administração de des-Arg

-BK. Além disso, o aumento dos receptores B

na pata

de rato após a administração intraplantar de LPS foi acompanhado por um

aumento tempo-dependente da expressão da iNOS, como indicado pelo ensaio

de Western blot. Este aumento foi observado 1 h após a administração do LPS,

teve seu pico em 6 h e permaneceu elevado por até 12 h.

Estudos recentes demonstram que a administração de doadores de NO é

capaz de promover um aumento nos níveis de IL-8 em células do epitélio

brônquico e monócitos humanos, através de mecanismos que envolvem a

ativação de fatores transcricionais, como o NF-κB e o AP-1, bem como a

estabilização do mRNA desta quimiocina (Ma et al., 2004; Sparkman e Boggaram,

2004). A ativação do NF-κB pelo NO proveniente de doadores parece ser um

mecanismo importante também no aumento da expressão da COX-2 na pele de

camundongos (Chun et al., 2004). Neste trabalho, os autores observaram ainda,

que o tratamento tópico dos animais com inibidores seletivos para a iNOS foi

capaz de inibir a expressão da COX-2 induzida pelo tetradecanoilforbol acetato

(TPA). Além disso, Jacobs e Ignarro (2003) demonstraram que, na presença de

um doador de NO, ocorre um aumento concentração-dependente da ativação do

NF-κB em macrófagos estimulados com LPS. A participação do NO na ativação

do NF-κB mediada pelo tratamento sistêmico com LPS foi confirmada também no

sistema nervoso central de ratos. Glezer e colaboradores (2003) observaram que

o pré-tratamento com um inibidor de NOS reduziu parcialmente os efeitos do LPS

sobre a ativação do fator de transcrição. Estes dados permitem sugerir que o NO

exerce um importante papel na indução dos receptores B

após o tratamento com

LPS na pata de rato, através da modulação direta da ativação do NF-κB, ou ainda

através do aumento da produção de fatores quimiotáticos, regulando assim o

influxo celular para o sítio inflamatório. Contudo, as ações exercidas pelo NO em

processos patofisiológicos são controversas, e diferentes estudos apontam que

este mediador é capaz de modular negativamente a ativação do NF-κB,

principalmente através da inibição da IKK e da regulação dos níveis de IκBα

(Mendes et al., 2002; Mohan et al., 2003; Marshall et al., 2004; Reynaert et al.,

2004). Os diferentes efeitos exercidos pelo NO sobre este fator de transcrição

podem estar relacionados a suas ações pró ou antiinflamatórias e fatores como a

concentração do mediador no local da inflamação, uso de diferentes doadores e o

caráter agudo ou crônico da resposta inflamatória podem ser responsáveis por

seu efeito dual (Feelish, 1998; Connelly et al., 2001).

Os receptores B

para as cininas representam uma classe atípica de

receptores acoplados à proteína G, normalmente ausentes nos tecidos, mas que

podem aumentar rapidamente após certos estímulos inflamatórios, infecciosos ou

trauma tecidual. Vários estudos têm demonstrado que o aumento da expressão

dos receptores B

é altamente dependente da ativação de fatores transcricionais,

síntese de novas proteínas e produção de citocinas pró-inflamatórias (Marceau,

1995; Marceau et al., 1998; McLean et al., 2000a; Calixto et al., 2001; 2004;

Couture et al., 2001). Embora os mecanismos envolvidos na expressão do

receptor B

em condições inflamatórias tenham sido avaliados em diversos

estudos, a seqüência exata de eventos envolvidos neste processo ainda não é

totalmente compreendida.

O presente trabalho procurou avaliar a sequência de eventos que leva ao

aumento dos receptores B

após a administração in vivo de LPS, através de

estudos moleculares e funcionais (Figura 14). Com base nos resultados

apresentados neste trabalho, pode-se sugerir que o tratamento local com LPS

promove uma rápida ativação do NF-κB, que parece estar relacionada à liberação

de TNF-α e IL-1β. Estas citocinas promovem o influxo de neutrófilos através da

indução da expressão de moléculas de adesão e fatores quimiotáticos, como o

PAF, que também pode contribuir para a ativação do NF-κB. A ativação do NF-κB

pode induzir a expressão de iNOS, e os níveis elevados de NO podem contribuir

para a amplificação da ativação deste fator de transcrição e para o aumento do

influxo celular. A migração de neutrófilos é um evento importante para o aumento

dos receptores B

, embora os mecanismos envolvidos neste processo ainda não

sejam totalmente conhecidos. Os resultados obtidos no presente estudo não

permitem apontar quais células expressam o receptor B

, porém os dados

funcionais sugerem que as células endoteliais são o principal alvo para a

seqüência de eventos descrita acima. Desta forma, é possível sugerir que a ação

conjunta de TNF-α, IL-1β, dos neutrófilos e do fator de transcrição NF-κB parece

ser fundamental para a indução dos receptores B

pelo LPS in vivo.

Figura 14 – Mecanismo proposto para a regulação da indução dos

receptores B

para as cininas após a administração local de LPS in vivo.

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ANEXO

Parte dos resultados da presente dissertação está publicada em:

PASSOS, G.F., FERNANDES, E.S., CAMPOS, M.M., ARAÚJO, J.G.,

PESQUERO, J.L., SOUZA, G.E., AVELLAR, M.C., TEIXEIRA, M.M.,

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receptor up-regulation after lipopolysaccharide

administration: role of proinflammatory cytokines and neutrophil influx. J.

Immunol., 172: 1839-1847, 2004.

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