ads:
Universidade Estadual do Ceará
Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS
ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO
FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS,
CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS
Fortaleza-Ceará
2005
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Universidade Estadual do Ceará
Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS
ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO
FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS,
CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade
Animal
Orientador: Dra. Selene Maia de Morais
Co-orientador: Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Fortaleza - Ceará
2005
2
ads:
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS
DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO FRENTE A DIFERENTES
CEPAS DE Microsporum canis, Candida spp E Malassezia
pachidermatis
Autora: Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle
Defesa em _____/____/________ Conceito:
Nota:
Banca Examinadora
___________________________________________
3
Selene Maia de Morais, Profa. Dra.
Orientadora (UECE)
Nilberto R. F. do Nascimento, Prof. Dr.
Examinador (UECE)
Marcos Fábio Gadelha Rocha, Prof. Dr.
Co-Orientador/Examinador (UECE)
______________________________________
______________________________________
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, Dra.
Examinadora (UFC)
4
F677a Fontenelle, Raquel Oliveira dos Santos
Avaliação do potencial antifúngico de óleos essenciais
de plantas do nordeste brasileiro frente a diferentes cepas de
dermatófitos e leveduras / Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle –
Fortaleza, 2005.
102 p.; il.
Orientadora: Profa. Dra. Selene Maia de Morais.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Óleos essenciais 2. Atividade antifúngica 3.
Toxicidade 4. Croton 5. Lippia I. Universidade Estadual do Ceará,
Faculdade de Veterinária. II. Título.
CDD: 815.53
DEDICO,
A Deus, razão do meu existir e ao meu marido Joffre Fontenelle
Filho, por estar ao meu lado em todos os momentos.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a todos aqueles que tanto me ajudaram, durante todo o
curso.
À professora Dra. Selene Maia de Morais, por sua orientação e dedicação na
realização deste trabalho.
Ao professor Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pela dedicação, compreensão e
amizade oferecida neste trabalho, e pela co-orientação.
Ao Professor Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento, pela paciência,
orientação e principalmente pela sua simplicidade como ser humano.
A minha banca examinadora composta pela Dra. Selene Maia de Morais, pelos
Dr(s) Marcos Fábio Gadelha Rocha, Nilberto Robson Falcão do Nascimento e pela Dra.
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante.
Aos professores do PPGCV, pela paciência e dedicação.
As Dra. Marta Regina Kerntopf e Adriana Rocha Tomé, pela contribuição à
realização deste trabalho.
A todos os alunos dos laboratórios de Química em Produtos Naturais, em
especial à aluna Cristiane Maria Souza de Castro que muito me ajudou nos
experimentos.
6
A todos os amigos do Centro Especializado em Micologia Médica, que me
ajudaram na realização desse projeto e estiveram ao meu lado durante este período
(Carolina Sidrim de Paula Cavalcante, Rossana Aguiar Cordeiro e Francisco Atualpa
Soares Júnior) em especial, a Érika Helena Salles de Brito por todos os ensinamentos e
amizade.
A todos os colegas do mestrado em Ciência Veterinárias do PPGCV, que
fizeram parte da minha vida durante estes dois anos. E aqueles que fazem parte do
PPGCV.
A Alzenira e Adriana Albuquerque, secretárias do PPGCV, que em muito me
ajudaram durante todo o tempo de mestrado.
A CAPES, pelo financiamento da bolsa durante o período de dois anos.
A meu marido, Joffre Fontenelle Filho, pelo grande incentivo e força.
Aos meus pais, Luís Gonzaga Rodrigues dos Santos e Edvirgens Moreira
Oliveira dos Santos, pelo apoio, carinho e incentivo.
A meus irmãos, Rute Oliveira dos Santos e Moisês Oliveira dos Santos por todo
o apoio.
7
RESUMO
Produtos naturais à base de plantas medicinais vêm sendo estudados ao longo dos anos e a
constatação de sua eficácia tem sido demonstrada por pesquisadores de todo mundo. As micoses
constituem um sério problema, especialmente em lugares de clima tropical e subtropical, os
dermatófitos e as Candida spp são os patógenos mais freqüentes destas enfermidades. O
objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antifúngica de óleos essenciais de plantas do
nordeste brasileiro frente a diferentes cepas de dermatófitos (Microsporum canis) e leveduras
(Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis) que acometem animais;
determinar o grupo de fungos mais sensíveis às plantas utilizadas; averiguar os componentes
químicos que se encontram em maior quantidade nas diversas plantas que apresentaram
atividade antifúngica e avaliar a toxicidade através da dose letal média (DL
50
) por via
intraperitoneal e oral em camundongos
.
Para tanto as plantas foram coletadas e identificadas,
posteriormente os óleos essenciais foram obtidos e seus constituintes analisados por
cromatografia de gás e espectrometria de massa. Os fungos foram recuperados da micoteca do
Centro Especializado em Micologia Médica e a viabilidade dos mesmos foi avaliada através de
testes laboratoriais. A atividade antifúngica foi averiguada através do método de difusão em
ágar. Os óleos essenciais obtidos do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides
demonstraram atividade apenas contra o M. canis enquanto que os óleos essenciais do Croton
zehntneri e da Lippia sidoides foram efetivos contra todos os fungos testados apresentando dose-
dependência. O óleo essencial da Lippia sidoides foi mais potente que os óleos essenciais das
espécies de Croton. Nas maiores concentrações o óleo essencial da L. sidoides inibiu
completamente o crescimento dos fungos. Este óleo essencial apresentou o timol (59,65%) e o
cariofileno (10,60%) como maiores constituintes. A toxicidade aguda de todos os óleos
essenciais até 3 g/Kg por via oral foi desprovida de qualquer toxicidade. A administração oral de
100 mg/Kg durante 30 dias não induziu nenhuma alteração histopatológica, hematológica ou
bioquímica significativa. Desta forma, devido à alta eficácia e a baixa toxicidade, os óleos
essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides constituem fontes importantes de compostos
antifúngicos que podem ser úteis no tratamento de micoses em animais.
8
ABSTRACT
Mycoses are serious public health concern specially in subtropical and tropical regions with
dermatophytes and yeast infections being the most common pathogens. This work was
undertaken in order to test whether essential oils extracted from the leaves of Croton species
(Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri) or from Lippia sidoides
would represent a potential therapeutic alternative for this infectious threats. Thase plants are
used in the folk medicine to treat dermatological problems and in the present study were tested
them in vitro against several strains of Microsporum canis, Candida albicans, Candida tropicalis
e Malassezia pachydermatis and also evaluated for its acute and sub-chronic toxicological
effects. The chemical constituents of the essential oils were determined by GL-Chromatography
coupled to mass espectroscopy. The essential oils obtained from Croton nepetaefolius and
Croton argyrophylloides were effective only against M. canis while the essential oils of Croton
zehntneri and Lippia sidoides were effective against all tested strains in a dose-related way.
Lippia sidoides was the most efficient being at the higher doses used (i.e. 75 and 100 mg/mL) as
effective as the positive controls used griseofulvin for M. canis, itraconazol for M.
pachydermatis and amphotericin B. Lippia sidoides essential oil at these doses sometimes
completely inhibited fungi growth. This essential oil has thymol (59.6%) and caryophyllene
(10.6%) as major constituents. The acute administration of all essential oils up to 3 g/Kg by the
oral route to mice was devoided of overt toxicity. The oral administration of 100 mg/Kg to rats
during 30 days did not induce histopathological, haemathological or serum biochemical
alterations. Therefore, due to its high efficacy and low toxicity the essential oils of Croton
zehntneri and Lippia sidoides are promising drugs in the search of new antifungal drugs.
9
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Colônia de Microsporum canis................................................................................. 11
Figura 2: Colônias de Candida spp. ..........................................................................................12
Figura 3: Blastoconídios de levedura. .......................................................................................12
Figura 4: Colônia típica de Malassezia spp...............................................................................14
Figura 5: Esquema de uma extração do óleo essencial............................................................. 33
Figura 6: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100 mg/mL) de OECa testada,
perante cepa de Microsporum canis........................................................................................... 47
Figura 7: Halo de inibição produzido pela menor concentração (25 mg/mL) do OELs perante
cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 47
Figura 8: Halo de inibição produzido pela maior concentração do OECn (100mg/mL) perante
cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 47
Figura 9: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100mg/mL) do OECn perante
cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 48
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classes de toxicidade aguda de substâncias administradas a ratos por diferentes vias e
extrapolação para toxicidade humana ........................................................................................... 17
Tabela 2: Análise química das três espécies de Croton e da Lippia sidoides.............................. 43
Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides
contra M. canis ............................................................................................................................. 45
Tabela 4: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides
contra Candida spp ...................................................................................................................... 46
Tabela 5: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides
contra M. pachydermatis .............................................................................................................. 46
Tabela 6: Peso dos ratos após tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia
sidoides durante 30 dias................................................................................................................. 49
Tabela 7: Parâmetros Bioquímicos de ratos Wistar antes do tratamento, após 15 dias e 30 dias do
tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30
dias................................................................................................................................................ 49
Tabela 8: Parâmetros hematológicos de ratos Wistar antes e depois de tratamento oral com
117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30 dias.......................... 50
12
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média
DL
50
Dose letal média
DMSO Dimetil-sulfóxido
HCM Hemoglobina corpuscular média
K.I. Índice de retenção na coluna do cromatógrafo
IT Inibição total
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
OELs Óleo Essencial da Lippia sidoides
OECn Óleo Essencial do Croton nepetaefolius
OECa Óleo Essencial do Croton argyrophylloides
OECz Óleo Essencial do Croton zehntneri
OE Óleo Essencial
TGO Transaminase glutâmica oxalacética
TGP Transaminase glutâmica pirúvica
TW Tween
UFC/mL Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
VCM Volume corpuscular médio
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 2
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................ 4
2.1 Plantas medicinais......................................................................................................... 4
2.1.1 Importância das plantas medicinais.............................................................................. 4
2.1.2 Óleo essencial............................................................................................................... 6
2.2 Plantas medicinais estudadas nesta dissertação......................................................... 7
2.2.1 Croton spp. .................................................................................................................. 7
2.2.2 Lippia sidoides.............................................................................................................. 8
2.3 Fungos: aspectos gerais ................................................................................................. 9
2.3.1 Dermatófitos................................................................................................................ 10
2.3.2 Leveduras..................................................................................................................... 11
2.4 Estudos de toxicidade................................................................................................... 15
2.4.1 Toxicidade aguda......................................................................................................... 16
2.4.2 Toxicidade sub-crônica ............................................................................................... 18
2.4.2.1 Avaliação Bioquímica.............................................................................................. 18
14
2.4.2.2 Avaliação Hematológica.......................................................................................... 21
3 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 25
4 HIPÓTESE...................................................................................................................... 27
5 OBJETIVOS.................................................................................................................... 29
5.1 Objetivo Geral.............................................................................................................. 29
5.2 Objetivos Específicos................................................................................................... 29
6 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 32
6.1 Coleta das plantas........................................................................................................ 32
6.2 Obtenção dos óleos essenciais..................................................................................... 32
6.3 Análise da composição química dos compostos vegetais......................................... 33
6.4 Determinação da dose letal média (DL
50
) ................................................................ 34
6.5 Toxicidade sub-crônica............................................................................................... 34
6.6 Microrganismos.......................................................................................................... 35
6.6.1 Recuperação das cepas.............................................................................................. 35
15
6.6.2 Identificação laboratorial........................................................................................... 36
6.6.2.1 Candida spp............................................................................................................ 36
6.6.2.2 Malassezia pachydermatis...................................................................................... 37
6.6.2.3 Dermatófitos........................................................................................................... 38
6.7 Atividade antifúngica................................................................................................. 40
6.7.1 Método de difusão em ágar....................................................................................... 40
7 RESULTADOS.............................................................................................................. 42
7.1 Análise dos óleos essenciais........................................................................................ 42
7.2 Atividade antimicrobiana .......................................................................................... 44
7.3 Toxicidade.................................................................................................................... 48
8 DISCUSSÃO................................................................................................................... 52
9 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 56
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 57
16
ANEXO.............................................................................................................................. 67
Artigo: Antifungal and Toxicologial evaluation of essential oils from Northeast Brazil.. 68
17
Introdução
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais, seus óleos essenciais e demais compostos, constituem
fonte viável de medicamentos para enfermidades das mais variadas possíveis. Essas plantas
surgem como alternativa em locais onde a falta de medicamentos é uma constante e o seu
custo é elevado. Aliados a esses fatores, a resistência a antibióticos e a toxicidade durante
tratamentos prolongados com várias drogas antifúngicas têm sido a razão para uma
extensiva procura de novas drogas para a terapêutica de infecções causadas por fungos.
Poucos desses produtos, no entanto, foram estudados de acordo com protocolos científicos
modernos e adequados. Portanto, a validação científica é essencial ao seu uso na espécie
humana e animal como medicamentos alternativos. Muitas dessas plantas são
popularmente usadas no tratamento de micoses.
Doenças infecciosas causadas por fungos representam um problema crítico
para a saúde pública. Nos últimos anos, ocorreu uma incidência crescente de infecções
fúngicas em virtude do aumento de indivíduos com o sistema imunológico comprometido
tais como: pacientes transplantados, acometidos por câncer ou infetados com o HIV.
Com o aumento na freqüência das micoses e do reduzido número de drogas
para o tratamento destas enfermidades, a realização de testes de sensibilidade se faz mais
necessária, o que torna a escolha da terapêutica, baseada na droga, mais eficaz, cada vez
mais adequada e eficiente.
Várias drogas já foram e continuam sendo testadas contra diferentes espécies
fúngicas pertencentes aos gêneros Candida e Malassezia, assim como para fungos
filamentosos, dentre elas, terbinafina, itraconazol, fluconazol e cetoconazol. Ademais, bons
resultados são obtidos a partir de estudos desenvolvidos com novas drogas antifúngicas,
como: voriconazol, albaconazol, ravuconazol, posaconazol e caspofungina.
Nos últimos anos, o interesse pela fitoterapia tem crescido acentuadamente em
todo o mundo. Além dos sucessos quase que “miraculosos” e dos aspectos históricos
19
fascinantes da medicina tradicional, notícias sobre descobertas de produtos naturais que
beneficiam a sociedade, de uma forma ou de outra, se tornaram cada vez mais freqüentes.
Os inúmeros problemas associados à terapia convencional foram os responsáveis pelo
crescimento nas pesquisas sobre plantas medicinais e seu conseqüente aumento na
produção e venda desses remédios.
Dessa forma, para uma eficiente investigação da atividade de compostos de
plantas usadas na medicina popular do Nordeste, contra espécies de dermatófitos e
leveduras, faz-se necessário a realização de testes de sensibilidade in vitro, correlacionando
com resultados in vivo. Nesta dissertação, foram avaliados a atividade antifúngica dos
óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides e da
Lippia sidoides contra o dermatófito (Microsporum canis) e as leveduras (Candida
albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis) que acometem animais.
20
Revisão
Bibliográfica
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plantas medicinais
2.1.1 Importância das plantas medicinais
A fitoterapia pode ser historicamente definida como a ciência que trata dos
problemas de saúde, utilizando os vegetais (fitocomplexos), sendo contemporânea ao início
da civilização. As plantas são tradicionalmente usadas por populações de todos os
continentes no controle de doenças e pragas. Os egípcios já faziam uso medicinal dos
vegetais. Algumas das espécies que eles utilizavam continuam empregadas até os dias de
hoje, tais como: Papaver somniferum (papoula), Scilla maritima (scila), Aloe Vera
(babosa) e Ricinus communis (óleo de rícino) (Lavabre, 1993).
No Brasil, o comércio de ervas medicinais começou com os índios e,
atualmente, em qualquer cidade, é possível comprar plantas, pós e ungüentos em mercados
e também nas ruas. Essa alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na
medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos, pelo fato de essas plantas serem fontes
importantes de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais constituem
modelos para a síntese de um grande número de fármacos, revelando nestes produtos alta
diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-química e biológica (Wall &
Wani, 1996).
Para enfatizar o benefício de certas plantas com propriedades medicinais, basta
recordar que o princípio ativo do comprimido símbolo da alopatia, a aspirina, ácido acetil-
salicílico (AAS) foi sintetizada, por Gilm, em 1859, baseado na salicina, substância ativa
de Salix alba L. (Calixto et al., 2000).
21
Apesar do aumento dos estudos sobre plantas medicinais, somente de 15 a 17%
destas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (Soejarto, 1996). Considerando a
grande biodiversidade do Nordeste brasileiro, esse número poderia ser bem maior (Rabelo,
2003).
A automedicação “milagrosa” com plantas medicinais, chegando ao extremo
de substituir terapias tradicionais em doenças graves, é prática bastante utilizada tanto em
populações de baixa renda, como único lenitivo para seus males, bem como nas camadas
mais privilegiadas que gozam de facilidade sanitária e pronto atendimento médico,
somente por puro modismo ou sob influência de grande exploração comercial. Assim, é
necessária extrema atenção ao uso não controlado das plantas medicinais e seus devidos
estudos de toxicidade para garantir o perfeito uso na espécie humana (Rabelo, 2003).
O Brasil possui sérios problemas de saúde pública, principalmente na região
Nordeste em razão do baixo poder aquisitivo de grande parte da população local, o alto
custo dos remédios torna-os inacessíveis até mesmo nos mais simples casos, como dores
agudas e/ou crônicas, febres e gripes (Rabelo, 2003). Portanto, o uso popular das plantas
medicinais foi o primeiro passo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos de
baixo custo para uma região tão carente de recursos financeiros e, por outro lado, tão rica
em flora, reunindo milhares de espécies vegetais distintas (Rabelo, 2003). É válido
ressaltar, contudo, que a planta dita medicinal, muitas vezes, chega às mãos do usuário
despojada de qualquer informação fidedigna: há desconhecimento total da época da coleta,
do especialista (se foi um especialista) que a colheu, dos cuidados tomados durante os
processos de armazenamento, secagem e moagem, da ausência de contaminação por
fungos e outros microrganismos, se é tóxica ou não. Tudo isso torna impossível à previsão
de eventuais efeitos colaterais que a planta possa provocar, porém, nada haveria a objetar
ao receituário de plantas integrais ou de seus extratos brutos, desde que se tratasse de
produtos obtidos sob rigoroso controle (Ribeiro, 1993).
22
2.1.2 Óleo Essencial
Os óleos essenciais (OE) são produtos de composição complexa extraídos de
plantas por vários processos, sendo o mais utilizado a destilação por arraste em vapor
d’água (Craveiro et al., 1976; Bruneton, 1995). Essas plantas têm um conteúdo de óleo
essencial em torno de 0,1 a 0,5% e, raramente, de 1 a 5% do peso verde (Bruneton, 1995).
Embora sua maior utilização ocorra nas áreas de alimentos (condimentos
aromatizantes de alimentos e bebidas), cosméticos (perfumes e produtos de higiene) e
também em farmácias, drogas vegetais ricas em óleos essenciais são empregadas in natura
para a preparação de infusões e/ou sob a forma de outras preparações simples (Lavabre,
1993).
De forma geral, os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias
voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Também podem ser chamados de
óleos voláteis, óleos etéreos ou essências. Essas denominações derivam de algumas de suas
características físico-químicas, como, por exemplo, a de serem geralmente líquidos de
aparência oleosa a temperatura ambiente, advindo daí a designação de óleo. Sua principal
característica, entretanto, é a volatilidade, diferindo dos óleos fixos, misturas de
substâncias lipídicas, obtidos geralmente de sementes. Outra característica importante é o
aroma agradável e intenso, sendo por isso chamados de essências (Bruneton, 1995; Simões
et al., 1999).
Os constituintes químicos desses óleos aromáticos variam desde
hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, fenóis, aldeídos, éteres, ácidos orgânicos,
ésteres, cetonas, lactonas, cumarinas, até compostos contendo nitrogênio e enxofre. Podem
ser utilizados para a síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e antissépticos (1978;
Lavabre, 1993; Bruneton, 1995).
23
2.2 Plantas medicinais estudadas nesta dissertação
2.2.1 Croton spp
Uma das famílias mais estudadas no Brasil é a das Euforbiaceas (Brito &
Brito, 1993). Essa família é composta de aproximadamente 290 gêneros, entre eles o
Croton, e cerca de 7.500 espécies, distribuídas em todas as regiões tropicais e subtropicais
do mundo (Barroso, 1991).
Amplamente distribuído na flora do Nordeste brasileiro, principalmente nas
caatingas, o gênero Croton é muito importante pela sua utilidade ao indivíduo que vive
afastado dos grandes centros populacionais (Lorenzi & Matos, 2002). As espécies de
Croton podem ser agrupadas, de acordo com as denominações populares, em canelas
silvestres, marmeleiros, velames, dentre outras (Fernandes et al., 1971). Várias espécies de
Croton têm sido estudadas nesses últimos anos, dentre as quais se destacam o C. zenhtneri,
C. nepetaefolius e C. argyrophylloides.
O Croton nepetaefolius Baill., marmeleiro vermelho ou marmeleiro sabiá é
usado para aliviar distúrbios gastrintestinais, na forma de chás e infusões. Seu óleo
essencial tem o efeito antiespasmódico comprovado sobre a musculatura lisa intestinal
(Coelho de Souza et al., 1997), assim como efeito anti-hipertensivo, que é mais potente em
animais com hipertensão genética ou experimental, o qual se deve a um componente
direto, um relaxamento miogênico do músculo liso vascular, e a um efeito indireto, via
atuação no sistema nervoso autônomo. Ademais, o óleo essencial tem atividade
antiinflamatória, também relatada, sugerindo que o mesmo tenha também atuação sobre as
funções imunológicas do organismo. Essa hipótese é reforçada por dados da literatura,
mostrando que o metil eugenol, um importante constituinte deste óleo, tem propriedade
imunomoduladora e antiinflamatória (Franchomme & Penoel, 1995).
24
O Croton argyrophylloides Muell. Arg. conhecido como marmeleiro prateado,
é um arbusto de ramos delgados, cilíndricos, cinerescentes e escabros. O fracionamento
dos extratos hexânicos e alcoólicos do lenho do caule e do estrato hexânico da casca do
caule levaram ao isolamento de um ácido carboxílico diterpênico e seu éter metílico
(Monte, 1980). O estudo químico do seu óleo essencial mostrou a presença de α-pineno e
β-guaieno (Craveiro, 1976).
O Croton zehntneri Pax et Hoffm., conhecido popularmente como canela de
cunhã, é uma planta subarbustiva e caducifólia do Nordeste brasileiro, pertencente à
família Euphorbiaceae. A medicina popular emprega esta planta para diversos fins, sendo
alguns desses já validados farmacologicamente. Por exemplo: o tipo químico anetol é
antidispéptico e estomáquico; o tipo metil-eugenol é usado popularmente, em forma de
chás e infusões, contra a insônia e como sedativo, embora seu uso ainda não esteja
validado cientificamente, mesmo estando comprovado que estas propriedades podem ser
atribuídas ao metil-eugenol; o tipo eugenol é utilizado como anti-séptico (Craveiro et al.,
1976).
2.2.2 Lippia sidoides
Lippia sidoides, conhecida popularmente como alecrim-pimenta, é um
arbusto de folhas caducas, bastante aromático e próprio da vegetação nordestina,
pertencente à família Verbenaceae. Seu óleo essencial rico em timol é responsável pelo
alto poder antiséptico de suas folhas. Possui inúmeras aplicações na medicina popular,
sendo muitas delas comprovadas cientificamente. É usada para combater infecções da
garganta e da boca, para o tratamento de ferimentos na pele e no couro cabeludo, para o
tratamento de acne, sarna infectada, panos-brancos, impigens, caspa do mau cheiro nos
pés, nas axilas e virilha (Matos, 2000). Botelho & Soares (1994) testaram extratos de
25
Lippia sidoides contra bactérias causadoras de cárie, encontrando eficácia por parte
desses extratos.
2.3 Fungos: aspectos gerais
O estudo dos fungos tem aproximadamente 150 anos, porém as manifestações
clínicas ocasionadas por esses microrganismos são conhecidas desde a antigüidade
(Mendes-Giannini & Melhem, 1996). O desenvolvimento do conhecimento das espécies de
fungos brasileiros é relatado por Fidalgo (1968).
Nos últimos anos, a Micologia Médica evoluiu muito como ciência básica.
Diversos fungos foram reclassificados e as infecções fúngicas foram alvo de sensíveis
alterações. Essas mudanças taxonômicas não tiveram bases e/ou razões apenas teóricas e
especulativas, já que encerram conotações práticas nos setores clínico, laboratorial e
terapêutico (Paula, 1998).
Além da capacidade de produzir doença em seres humanos, os fungos também
causam doenças em animais e vegetais, destroem a madeira e materiais sintéticos e
compartilham com as bactérias um importante papel na decomposição de restos orgânicos
do solo (Mendes-Giannini & Melhem, 1996).
Doenças fúngicas ocorrem com relativa freqüência em clínicas de pequenos
animais, sendo que, nos casos crônicos, o tratamento se torna mais difícil e, às vezes,
frustrante. A problemática do tratamento pode ser justificada pelo limitado arsenal de
drogas antifúngicas comparadas com as drogas antibacterianas, pelo aparecimento de
vários efeitos colaterais à terapia com medicamentos convencionais e pela seleção de cepas
resistentes aos fármacos utilizados (Sidrim & Rocha, 2004).
26
2.3.1 Dermatófitos
O estudo das dermatofitoses teve início juntamente com a história da
Micologia Médica. Em 1839, Robert Remak elucidou a etiologia do favus. Quase um
século depois, os dermatófitos foram classificados por um brilhante dermatologista francês
de nome Raymond Jacques Andrien Sabouraud. Hoje existem muitos fungos pertencentes
aos gêneros Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum; entretanto, a denominação
dermatófito é utilizada somente para os fungos pertencentes a esses gêneros e que são
queratinofílicos e capazes de causar doenças em humanos e animais (Sidrim & Rocha,
2004).
Dentre as infecções fúngicas, as micoses superficiais são consideradas
preocupantes para os veterinários. Nos animais domésticos, as dermatofitoses,
consideradas como micoses superficiais, possuem grande interesse pelo seu potencial
zoonótico (Garcia et al., 2000; Crespo et al., 2000).
Os dermatófitos são um grupo de fungos taxonomicamente relacionados que
têm capacidade de invadir tecido queratinizado (pele, pêlos e unhas, do homem e dos
animais), produzindo dermatofitose, que também é conhecida como tínea. A infecção pode
ocorrer em qualquer idade, embora os jovens sejam mais comumente afetados do que os
idosos, assim como pacientes com imunossupressão ou debilitados (Muller et al., 1985;).
O Microsporum canis (Figura 1) é o responsável pela maioria de casos de
micoses em animais de estimação e o mais freqüente dermatófito zoofílico de humanos, em
27
diversas áreas urbanas (Cabañes, 2000; Brilhante et al., 2002). As enfermidades micóticas
têm importância distinta dentro das enfermidades veterinárias em virtude do seu potencial
zoonótico (Hay, 1995; Nakamura et al., 1999). Vários pesquisadores demonstraram a
importância epidemiológica dos animais nas dermatofitoses. Dentre os animais
domésticos, o gato é o principal disseminador do Microsporum canis (Nakamura et al.,
1999). As dermatofitoses em felinos são clinicamente caracterizadas por áreas de alopecia
e quebra de pêlos e em raros casos o M. canis é associado com o desenvolvimento de
grânulos e nódulos teciduais. O M. canis é cosmopolita, endêmico em criações de felinos, e
todos os animais jovens podem estar clinicamente afetados e, em contraste, os adultos
portadores podem não apresentar lesões (Nakamura et al., 1999).
2.3.2 Leveduras
A história natural das doenças causadas por leveduras é mais bem
compreendida à luz da susceptibilidade do hospedeiro. O indivíduo normal apresenta
mecanismos de defesa inespecíficos e específicos, tais como barreiras anatômicas e
fisiológicas, resposta inflamatória e resposta imunológica, que, juntos, representam
obstáculo ao estabelecimento da infecção fúngica (Sidrim & Rocha, 2004).
28
Figura 1: Colônia de Microsporum canis.
(Fonte: CEMM, 2005)
O gênero Candida é composto por fungos leveduriformes hialinos, que
apresentam duas formas de reprodução: assexuada ou anamorfa e sexuada ou teleomorfa.
Taxonomicamente, são enquadradas no grupo dos ascomicetos, visto que a reprodução
sexuada é caracterizada pela produção de ascos (Sidrim & Rocha, 2004).
Todas Candida spp apresentam colônias de coloração branca, superfície lisa e
textura glabrosa úmida (Raposo et al., 1996; Moretti et al., 2004) (Figura 2), que crescem
bem dentro de 48 horas, entre temperaturas de 25 e 37°C (Sidrim & Rocha, 2004). Com
relação à microscopia, se lâminas forem preparadas diretamente a partir de um fragmento
da colônia ou de uma amostra clínica positiva, apenas estruturas unicelulares, denominadas
blastoconídeos, que podem estar isoladas ou apresentando brotamento, vão ser visualizadas
(Figura 3). Desta forma, torna-se necessário a realização de microcultivo em placa de Petri,
para melhor visualização da disposição das estruturas fúngicas típicas de cada espécie,
sendo este, na maioria das vezes, suficiente para identificar o microrganismo (Moretti et
al., 2004).
A Candida albicans, apesar de fazer parte da microbiota normal do trato
intestinal, pode ser patógeno oportunista das regiões mucocutâneas, trato digestivo e
genital de mamíferos e aves, além de envolver pele, unhas e trato respiratório com riscos
29
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 3: Blastoconídios de levedura.
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 2: Colônias de Candida spp.
de desencadear fungemias. A candidíase como doença primária é extremamente rara, e, via
de regra, está associada a neoplasias, doenças imunomediadas e ao uso prolongado de
corticosteróides, antimicrobianos ou drogas citostáticas (Rippon, 1988; Kwon-Chung &
Bennet, 1992).
As leveduras do gênero Malassezia são associadas ao homem e aos animais,
causando diferentes enfermidades, ou como parte da microbiota de pele e mucosas (Bond
et al., 2000; Midgley, 2000).
Em animais, a primeira descrição de malasseziose, no caso, produzido por M.
pachydermatis data de 1925, quando Weidman isolou leveduras em forma de garrafa, não
lipodependentes, de lesões de pele de rinoceronte indiano, as quais denominou de
Pityrosporum pachydermatis. Desde então, é isolada de grande variedade de animais
homeotermos, particularmente mamíferos domésticos e selvagens (Guillot et al., 1994;
Guillot & Bond, 1999).
As leveduras do gênero Malassezia têm habilidade de utilizar lipídios como
fonte de carbono, sendo lipofílicas, e exigem a presença de ácidos graxos de cadeias longas
para seu desenvolvimento, sendo, portanto, lipodependentes, sendo a M. pachydermatis a
única exceção, pois, embora lipofílica, não é lipodependente, tendo a capacidade de se
desenvolver mesmo em meios sem adição de lipídeos (Midgley, 2000; Sidrim & Rocha,
2004).
As espécies de Malassezia, em geral, apresentam colônias com textura
cremosa, coloração de creme a marron-clara (Figura 4) e propriedades micromorfológicas
semelhantes, caracterizadas pela presença de blastoconídios globosos, ovais e com
presença de uma constrição denominada colarete, que podem ser visualizados em lâminas
confeccionadas a partir de um fragmento da própria colônia ou desde o exame direto de
amostra clínica positiva. Na microscopia, podem também ser visualizados filamentos
30
curtos de parede grossa, com um ou dois septos (Sidrim & Rocha, 2004; Chen & Hill,
2005).
Embora M. pachydermatis seja microrganismo comensal, algumas condições
podem propiciar seu desenvolvimento exacerbado, levando à subseqüente doença clínica.
O estado de doença, presumivelmente, reflete alterações nos mecanismos físicos, químicos
e/ou imunológicos do animal, que normalmente restringem a colonização da levedura.
Assim, fatores como terapia antibacteriana, emprego de corticóides, alergias, dermatites
seborréicas, distúrbios nutricionais ou hormonais e doenças intercorrentes, como
neoplasias, são considerados fatores predisponentes a malasseziose (Guillot & Bond,
1999).
31
Figura 4: Colônia típica de Malassezia spp.
(Fonte: CEMM, 2005)
2.4 Estudos de toxicidade
A Farmacologia, como ciência experimental que trata das propriedades das
drogas e seus efeitos em sistemas vivos, envolve o estudo das fontes das drogas
(farmacognosia), a ação das drogas no organismo (farmacodinâmica), o uso de drogas no
tratamento das doenças (terapêutica), e os efeitos tóxicos das drogas ou xenobióticos
(toxicologia) (Brown e Davis, 2001).
A toxicologia é o ramo científico que estuda as propriedades de químicos e
seus efeitos em organismos vivos, com objetivo de assegurar seus potenciais efeitos
adversos, a fim de ajudar a assegurar e proteger a saúde humana ou animal (Roberfroid,
1995).
Um efeito adverso é definido como uma alteração anormal, indesejável ou
nociva após exposição a substâncias potencialmente tóxicas. A morte é o efeito adverso
mais drástico que pode ocorrer, porém, efeitos adversos de menor gravidade incluem
alteração de consumo de alimentos ou água, variação no peso corpóreo ou de órgãos,
alterações anatomopatológicas ou simplesmente de níveis enzimáticos (Barros e Davino,
1996).
Os testes toxicológicos, aplicados em animais de laboratório e sob condições
previamente estabelecidas, permitem determinar os possíveis efeitos das substâncias em
humanos ou animais expostos a estas (Barros e Davino, 1996).
32
No Brasil, a resolução 1/78 (D.O. 17/10/78) do Conselho Nacional de Saúde,
estabelece como tipos de ensaios de toxicidade: aguda, subaguda (subcrônica), crônica,
teratogenia e embriotoxicidade e estudos especiais (Vasconcelos, 2002).
2.4.1 Toxicidade aguda
A toxicidade aguda de um composto químico é definida como os efeitos
adversos que ocorrem dentro de um período curto após administração de dose única ou
doses múltiplas administradas dentro de 24 horas (Barros e Davino, 1996). A toxicidade
aguda é expressa pela quantidade necessária, em mg/kg de peso corpóreo, para provocar a
morte em 50% de um lote de animais submetidos a experiência, sendo representada pela
dose letal 50 (Eaton e Klaasson, 1995; Barros e Davino, 1996; Repetto, 1997; Larini,
1997). Os valores de dose letal 50 (DL
50)
são obtidos a partir de índices de mortalidade
observados, empregando-se diversos métodos estatísticos. Entre estes métodos, destaca-se
o método de PROBITOS (termo derivado de PROBITS = probability units) que, além de
determinar o valor de toxicidade aguda e seus limites fiduciais, possibilita a obtenção de
uma reta “dose-resposta” (Larine, 1997).
Os resultados obtidos a partir dos estudos de toxicidade aguda servem também
para conhecimento do mecanismo de ação da substância, identificar possíveis órgãos ou
sistemas sensíveis e determinar se os efeitos são reversíveis ou não. Ainda mais, os
resultados obtidos dos estudos de toxicidade aguda são empregados para o delineamento
dos estudos de toxicidade subcrônica e crônica, particularmente no que se refere à escolha
de doses (Barros e Davino, 1996).
Hadge e Sterner (1949) apresentam uma tabela de toxicidade oral, inalatória e
por contato (pele) para ratos e fazem uma extrapolação para humanos (tab. 2).
33
Tabela 1: Classes de toxicidade aguda de substâncias administradas a ratos por diferentes
vias e extrapolação para toxicidade humana.
Classe Termo usual DL
50
Oral
[ 1 ]
Inalação
[ 2 ]
DL
50
Pele
[ 3 ]
DL
50
Huma
na
[ 4 ]
1 Toxicidade Elevada
≤ 1 mg
<10 ≤ 5 mg 15 mg
2 Toxicidade Alta 1–50 mg 10 – 10
2
5 – 43 mg 5 ml
3 Toxicidade Média 50–500 mg 10
2
– 10
3
44 – 340 mg 30 g
4 Toxicidade Baixa 0.5–5 g 10
3
– 10
4
0,35 – 2,81 mg 250 g
5 Praticamente atóxico 5–15 g 10
4
– 10
6
2,82 – 22,59 mg 1000 g
6 Relativ. Inofensivo > 15 g >10
6
> 22,6 g > 1 Kg
Segundo Repetto (1997), o estudo de toxicidade aguda permite determinar o
grau de toxicidade aproximada de uma substância em quatro categorias conforme a DL
50
aproximada por via oral. Estas categorias são:
I. Muito tóxica: DL
50
inferior ou igual a 25 mg/kg.
II. Tóxica: DL
50
inferior ou igual a 250 mg/kg.
III. Nociva: DL
50
inferior ou igual a 2000 mg/kg.
IV Sem toxicidade aguda: DL
50
superior a 5000 mg/kg.
34
2.4.2 Toxicidade subcrônica
Os estudos de toxicidade subcrônica são realizados para obter informações sobre a toxicidade de substâncias
químicas, em humanos ou animais, após exposições repetidas a estas (Barros e Davino, 1996).
Os estudos de toxicidade subcrônica e crônica, que objetivam determinar o
efeito tóxico após exposição prolongada a doses cumulativas da substância em teste, não
se diferenciam na sua essência, mas, sim, em sua extensão (Repetto, 1997). Parâmetros
hematológicos e bioquímicos devem ser avaliados no início e final do estudo. Exames
histopatológicos, também, devem ser realizados no final do experimento (Barros e Davino,
1996).
Os estudos de toxicidade subcrônica e crônica são feitos após a administração cumulativa de uma substância e
envolvem análise hematológica, análise bioquímica e histopatológica dos animais. Além destes parâmetros, devem ser feitas
observações diárias para verificar o comportamento dos animais tratados (Vasconcelos, 2002).
2.4.2.1 Avaliação Bioquímica
A avaliação de alguns parâmetros bioquímicos fornece indicações de alterações fisiológicas que podem estar
envolvidas com a ocorrência de efeitos provocados por uma substância e ajudam no diagnóstico de algumas patologias, entre elas
podendo-se citar as intoxicações (Vasconcelos, 2002).
O fígado tem papel essencial no metabolismo dos nutrientes, incluindo o
controle e a manutenção do nível de glicose sangüínea, na desintoxicação e excreção de
metabólitos, na síntese de muitas proteínas plasmáticas e na digestão mediante a síntese,
secreção biliar e conservação de ácidos biliares, que são essenciais para uma ótima
hidrólise da gordura da dieta e para absorção intestinal de ácidos gordurosos e outros
lipídios, incluindo vitaminas lipossolúveis (Tennant, 1997).
35
Muitas toxinas induzem danos hepáticos. A suscetibilidade do fígado ao
insulto tóxico é em parte uma conseqüência de sua localização entre o trato digestivo e o
resto do organismo e o papel central que ele desempenha na biotransformação e disposição
de xenobióticos (Turk e Casteel, 1997).
As manifestações clínicas da disfunção hepática são diretamente atribuíveis a
alterações nas funções metabólicas, de excreção, de síntese e digestivas do fígado. O
fígado tem a maior reserva funcional, e sinais de falência hepática freqüentemente não se
desenvolvem até que 70% ou mais da capacidade funcional do fígado esteja perdida. É
importante salientar que, até quando uma fração maior da massa hepatocelular for perdida
em uma injúria aguda, por exemplo, hepatite aguda ou necrótica, a recuperação é possível
em virtude da capacidade única de recuperação do fígado (Tennant, 1997). As enzimas
hepáticas, por ocasião de uma injúria hepática, são liberadas para o plasma e o aumento da
quantidade destas enzimas plasmáticas torna-se de utilidade diagnóstica.
Em todas as espécies domésticas, a atividade da aspartato aminotransferase ou
transaminase glutâmica oxalacética (AST/TGO) é alta no fígado e, na injúria aguda ou
crônica do fígado, a atividade da TGO do plasma é aumentada. Atividade da alanina
aminotransferase ou transaminase glutâmica pirúvica (ALT/TGP) sérica é considerada
específica para injúrias hepáticas em cães e gatos, e em pequenos animais com injúrias
hepatocelulares, um aumento fracional na atividade da TGP é de 4 a 8 vezes maior do que
o aumento correspondente em TGO (Center, 1996).
A albumina é sinterizada pelo fígado como todas as proteínas plasmáticas,
exceto as imunoglobulinas. É a proteína plasmática mais osmoticamente ativa em razão da
sua abundância e tamanho, contribuindo com cerca de 75% da atividade osmótica do
plasma (Kaneko, 1997).
Hipoalbuminemias podem ter origem hepática, no caso da hepatite crônica
difusa especialmente em cirroses, ou podem ter origem não hepática, como no caso das
36
dietas inadequadas, má absorção, gastroenteropatias com perda de proteínas, diarréias
crônicas etc. (Hagiware, 1983).
Outro parâmetro de avaliação bioquímica é a dosagem das bilirrubinas séricas.
A bilirrubina resulta da degradação da hemoglobina no sistema retículo endotelial, e é
excretada pelo sistema hepatobiliar para a luz intestinal. A determinação do nível sérico
das bilirrubinas tem importância fundamental no diagnóstico das três formas de icterícia:
hemolítica, hepática e pós-hepática ou obstrutiva (Hagiware, 1983). A bilirrubina é
derivada da destruição de eritrócitos danificados ou senescentes por macrófagos do baço,
fígado e medula óssea. Colestase resulta em hiperbilirubinemia conjugada. A bilirrubinúria
pode ocorrer em virtude de regurgitação da bilirrubina conjugada. Hemólise pode resultar
em hiperbilirrubinemia não conjugada (Turk e Casteel, 1997).
Em mamíferos, os rins funcionam como o maior órgão de excreção para
eliminação de resíduos metabólicos do corpo. Perda parcial da função renal resulta em
desvios variáveis do normal, dependendo da quantidade de tecido funcional remanescente.
O termo azotemia refere-se ao acúmulo de resíduos de nitrogênio no sangue. Concentração
sangüínea de uréia e creatinina são medidas como índices de azotemia, embora nenhum
dos dois provoque toxicidade significante em razão do seu acúmulo (Finco, 1997).
A creatinina é formada no metabolismo da creatina e fosfocreatina muscular. O seu nível sangüíneo não é afetado
pela dieta, idade ou sexo do animal. É excretada totalmente pelos glomérulos, não ocorrendo reabsorção tubular. Serve, portanto,
como índice de filtração glomerular e, por ser facilmente eliminada, o seu aumento na circulação sangüínea ocorre mais tardiamente
nos estados de insuficiência renal, quando comparada
à uréia sangüínea (Hagiware, 1983). Em muitas espécies domésticas, as concentrações séricas de uréia e creatinina são estimativas
grosseiras da taxa de filtração glomerular. Com base no mecanismo de excreção renal destes dois compostos, a creatinina é o melhor
indicador (Finco, 1997).
2.4.2.2 Avaliação hematológica
37
A Hematologia é a ciência que estuda o sangue sob aspecto morfológico,
fisiológico e patológico, e, conseqüentemente, Hematologia clínica veterinária representa o
emprego dos conhecimentos da citada especialidade na interpretação e resolução de
problemas clínicos de âmbito veterinário (Birgel, 1983).
A presença de alterações hematológicas em animais de laboratório expostos a
novos agentes farmacêuticos é um importante elemento na avaliação total de riscos e
perigos de potencial exposição pelo animal (Vasconcelos, 2002).
O sangue e a medula óssea apresentam uma mistura complexa de células que
respondem de maneiras diferentes aos vários insultos tóxicos. Os efeitos de substâncias
nas células sangüíneas não são restritos à destruição celular ou inibição de hematopoiese.
Alguns agentes estimulam a hematopoiese, enquanto outros afetam a função das células do
sangue, resultando em diminuição ou aumento da função (Lund, 2000).
O sangue é constituído por elementos sólidos, ou seja, os corpúsculos celulares
(hemácias, leucócitos e plaquetas), pelo plasma que é composto de 90% de água e dilui as
proteínas e minerais, e, finalmente, pelos elementos gasosos (O
2
e CO
2
) (Birgel, 1983).
O hemograma expressa as condições do sangue periférico num certo momento
da vida de um animal, nele aparecendo registrados os valores quantitativos e qualitativos
das células do sangue. Está dividido em eritrograma e leucograma (Souza, 1998).
O eritrograma é o estudo dos glóbulos vermelhos e compreende os seguintes
parâmetros:
⇒ contagem de hemácias/mm
3
;
⇒ hemoglobina (g/dL);
38
⇒ hematócrito (%);
⇒ índice hematimétrico - VCM (volume corpuscular médio), HCM
(hemoglobina corpuscular média) e CHCM (concentração de hemoglobina
corpuscular média).
O leucograma é o estudo dos glóbulos brancos e compreende a contagem
global e diferencial dos leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e
monócitos). A contagem diferencial é expressa em valores relativos, que representam a
percentagem de cada leucócito em relação à contagem total, ou em valores absolutos que
significam a quantidade de cada leucócitos por mm
3
de sangue. O leucograma, também, faz
referências à morfologia dos leucócitos, como, por exemplo, a presença de granulações
tóxicas nos neutrófilos, linfócitos atípicos ou alguma anomalia leucocitária (Souza, 1998).
Também faz parte do hemograma a avaliação das plaquetas, que consiste da
contagem do número de plaquetas por mm
3
de sangue e a análise da morfologia das
plaquetas, verificando se existe alguma anomalia quanto a coloração, tamanho ou
agregação (Vasconcelos, 2002).
Pequenas diferenças nos valores médios nos grupos dos animais tratados
comparados com os valores do grupo-controle são, com freqüência estatisticamente
significantes, e nem todas as pequenas diferenças detectáveis nesta situação estão
diretamente relacionadas aos efeitos tóxicos do composto que está sendo estudado (Lund,
2000).
39
40
Justificativa
3 JUSTIFICATIVA
Com o aumento na freqüência das micoses e do reduzido número de drogas
para o tratamento destas enfermidades, os óleos essenciais de plantas constituem fontes
importantes de compostos antifúngicos. No Nordeste do Brasil, várias plantas são
utilizadas pelo povo, principalmente em locais onde a falta de medicamentos é uma
constante e o custo é elevado. Para o seu uso em larga escala, no entanto, estudos que
comprovem estas atividades, associados à determinação da toxicidade, fazem-se
necessários. Um estudo detalhado, abordando os aspectos químicos, micológicos e
farmacológicos dos óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton
argyrophylloides e da Lippia sidoiedes é importante para a sua validação como prováveis
substâncias com atividade antifúngica contra dermatófitos (Microsporum canis) e
leveduras (Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis).
41
42
Hipótese
4 HIPÓTESE
Os óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton
argyrophylloides e da Lippia sidoides constituem fontes de compostos antifúngicos para
combater micoses em humanos e animais.
43
44
Objetivos
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antifúngica ‘in vitro’ dos
óleos essenciais de Croton spp. e Lippia sidoides contra dermatófitos (Microsporum canis)
e leveduras (Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis).
5.2 Objetivos Específicos
1 Estabelecer a sensibilidade dos microrganismos testados frente aos óleos essenciais
utilizados;
2 averiguar os componentes químicos que se encontram em maior quantidade nas diversas
plantas que apresentam atividade antifúngica;
3 avaliar a toxicidade aguda e subcrônica dos óleos essenciais das plantas.
.
45
46
47
Material e
Métodos
6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Coleta das plantas
As plantas foram coletadas no Município de Viçosa do Ceará. As exsicatas
foram depositadas no Herbário Prisco Bezerra, no Departamento de Biologia da UFC, onde
foram identificadas taxonomicamente.
6.2 Obtenção dos óleos essenciais
Os óleos essenciais do C. zenhtneri, C. nepetaefolius, C. argyrophylloides e da
Lippia sidoides foram extraídos no Laboratório de Produtos Naturais da Universidade
Estadual do Ceará.
A obtenção dos óleos essenciais foi realizada por destilação a vapor d’água ou
hidrodestilação, de acordo com o método descrito por Craveiro et al. (1976). Esse processo
consistiu na propriedade que as essências possuem de serem miscíveis com água no estado
de vapor. As folhas da planta foram picadas e colocadas em um recipiente, conectado em
uma extremidade a um vaso contendo água em ebulição, e a outra extremidade a um
condensador. O vapor de água arrastou as substâncias voláteis contidas no material,
formando uma mistura de vapores. Após a passagem pelo condensador, ocorreu a
separação das fases hidrofílica e hidrofóbica por decantação que foram coletadas em
erlenmeyer. A fase hidrofóbica constitui o óleo essencial (Figura 5).
48
Figura 5:. Esquema de uma extração do óleo essencial.
6.3 Análise da composição química dos compostos vegetais
Os óleos essenciais foram analisados por cromatografia de gás acoplada a
espectrometria de massa.
A cromatografia gasosa separa componentes a partir de misturas complexas de
compostos voláteis. Nas aplicações analíticas, é possível o acoplamento com um sistema
de espectrometria de massa que é extremamente útil na separação e identificação de
estruturas, como, por exemplo, de componentes de óleos essenciais (óleos voláteis)
(Craveiro, 1976; Simões, et al., 1999).
49
6.4 Determinação da dose letal média (DL
50
)
A dose letal média foi estimada segundo o método de Miller e Tainter, (1944).
Para tanto, foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) pesando entre 20-30 g
que foram divididos (n = 10/grupo). Os camundongos foram tratados por via
intraperitoneal e oral através de cânula de gavagem, com salina (0,01 mL/kg) ou com os
compostos vegetais (100; 300; 500; 750; 1000; 2000 e 3000 mg/kg). Os animais foram
observados por 1 hora para verificação de efeitos hipocráticos, sendo anotados em tabelas
modificadas de Malone. Após 24 horas, o número de mortos foi registrado.
6.5 Toxicidade subcrônica
Para averiguar a toxicidade subcrônica, ratos Wistar de ambos os sexos
divididos em dois grupos (n=10/grupo) tratados pela via oral durante 30 dias com OELs na
concentração determinada pela dose letal média obtidas em estudos prévios em
camundongos com administração intraperitoneal e 1 mL/kg/dia de veículo (salina). Estes
animais foram pesados no início, durante e após os trinta dias para avaliação de ganho de
peso. Amostras de sangue foram coletadas antes, 15 e 30 dias após o tratamento, e a
concentração sérica de uréia, creatinina, transaminase glutâmica oxalacética (TGO) e
transaminase glutâmica pirúvica (TGP) foram comparadas entre e dentro dos grupos. As
amostras de sangue foram coletadas do plexo infraorbital em tubos com gel separador para
soro (Vacuette, São Paulo, Brasil) e centrifugadas a 3000 g e as análises bioquímicas foram
realizadas com o uso de kits disponíveis comercialmente (Labtest, Lagoa Santa, Minas
Gerais, Brasil). No final do período experimental, coração, pulmão, fígado, rins e baço
foram coletados de todos os grupos, fixados em formol, processados e corados para análise
50
histopatológica. Os valores de contagem total e diferencial de células sangüíneas obtidos
antes e após o tratamento foram comparados.
6.6 Microrganismos
Foram utilizadas 07 cepas de Candida albicans, 05 de Candida tropicalis, 10
de Microsporum canis, provenientes do estoque em ágar batata à -20ºC com DMSO 10%;
e 10 cepas de Malassezia pachydermatis, estocadas em ágar Dixon modificado, também a
temperatura de -20ºC. As cepas utilizadas foram provenientes do CEMM (Centro
Especializado em Micologia Médica), do Departamento de Patologia e Medicina Legal da
Universidade Federal do Ceará.
6.6.1 Recuperação das cepas
As cepas de Candida albicans, Candida tropicalis e Microsporum canis
estocadas em ágar batata acrescido de DMSO (10%) à –20 ºC foram descongeladas e
repicadas para um tubo contendo ágar batata. Estas foram incubadas a 28 ºC e observadas
diariamente por 04 dias, no caso das Candidas e 10 dias para os dermatófitos, com o
objetivo de verificar a presença de crescimento das colônias e, assim, confirmar a
viabilidade das cepas.
Da mesma forma, as cepas de Malassezia pachydermatis foram descongeladas
e um fragmento da colônia repicado para dois tubos de ensaio, um contendo, ágar Dixon
modificado e outro ágar batata. Os tubos contendo os inóculos foram incubados a 37 ºC e
51
observados diariamente por um período de até 10 dias, a fim de verificar o crescimento e a
manutenção da viabilidade das cepas.
6.6.2 Identificação laboratorial
6.6.2.1. Candida spp
A identificação laboratorial das espécies de Candida foi feito com o objetivo
de avaliar a viabilidade das cepas após a estocagem, mediante a união de uma série de
testes:
A. Prova do Tubo Germinativo - é um método simples que permite a distinção
entre a C. albicans ou C. dubliniensis, que são positivas para este teste, de
outras espécies de leveduras, consideradas tubo germinativo negativo.
B. Microscopia - o estudo micromorfológico das espécies de Candida é
possível através da prova do microcultivo. Esta é realizada em meio corn-
meal-tween 80, onde, sob baixa tensão de oxigênio, ocorre produção de
conídeos e filamentação, sendo possível sugerir a espécie, isso pela
presença e disposição de blastoconídeos, hifas verdadeiras e pseudo-hifas,
que se distinguem de acordo com a espécie.
C. Assimilação de carboidratos - esta representa a habilidade que uma
levedura tem de crescer aerobicamente na presença de determinado
carboidrato, fornecido como única fonte de energia. A positividade é
52
avaliada por meio da observação de halo de crescimento da levedura em
presença do carboidrato fornecido. Os açúcares utilizados são: dextrose,
maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose, melobiose, L-arabinose,
celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina, manitol, inositol,
entre outros.
D. Assimilação de nitrogênio - determina a capacidade que uma levedura tem
de crescer aerobiamente na presença de um composto nitrogenado
fornecido como fonte de energia. Em meio ágar sólido, desprovido de
qualquer fonte de nitrogênio e adicionado da suspensão de levedura, são
colocadas alíquotas de compostos nitrogenados. A positividade será
avaliada mediante o crescimento da levedura em presença do composto
nitrogenado fornecido. Geralmente, as fontes utilizadas são: a peptona, que
será utilizada como controle positivo, e o nitrato de potássio.
E. Fermentação de carboidratos - por esta prova, será avaliada a capacidade
que cada espécie de Candida tem de crescer, anaerobiamente, na presença
de determinado açúcar fornecido como única fonte de energia. A
positividade será avaliada por intermédio da produção de gás carbônico e
alteração do pH. Os carboidratos geralmente utilizados são: dextrose,
maltose, sacarose, galactose, lactose e trealose.
6.6.2.2. Malassezia pachydermatis
Para a avaliação da viabilidade das cepas de Malassezia foram levados em
consideração os seguintes aspectos:
53
A. Características macroscópicas - as colônias de Malassezia spp., de uma
forma geral, apresentam textura glabrosa seca com coloração no tom de
amarelo-creme.
B. Características microscópicas - a microscopia foi analisada por intermédio
da coloração de Gram. O que se observa são blastoconídeos com
morfologia oval e apresentando brotamento em colarete, podendo estar ou
não associados a hifas curtas e tortuosas.
C. Prova da urease - nesta prova, foi analisada a capacidade de o fungo
produzir a enzima urease, apresentado por algumas espécies deste gênero.
D. Assimilação do tween (20, 40, 60 e 80) - frente a este teste, a espécie
poderá ou não assimilar os diversos tween testados.
E. Repique para meios não ricos em lipídio - com o intuito de observar o
crescimento que definirá a espécie.
A capacidade do microrganismo produzir a enzima urease, assimilar o tween
40 e 80, e de crescer em meio pobre em lipídio, dentre todas as espécies do gênero, só é
observada na espécie que será estudada, a Malassezia pachydermatis.
6.6.2.3. Dermatófitos
54
Para avaliar a viabilidade das cepas fúngicas dermatofíticas, após terem sido
retiradas da micoteca, foram realizados alguns testes, dentre eles:
A. Macromorfologia - na análise das características macromorfológicas, foram
levados em consideração o relevo e a textura, bem como a presença ou
ausência de pigmento (Sidrim & Rocha, 2004).
B. Micromorfologia - o estudo micromorfológico foi feito a partir do
isolamento primário, sendo uma pequena alíquota da colônia retirada do
ágar e montada entre lâmina e lamínula com corante lactofenol azul-
algodão. A montagem foi observada em microscopia óptica em objetiva de
40X. Nestas preparações, podem ser visualizadas estruturas de reprodução
(macroconídios e microconídios), bem como estruturas de ornamentação
(hifas nodulares, pectinadas, entre outras).
C. Perfuração de pêlo - esta prova tem como objetivo visualizar se o fungo
perfura ou não o pêlo, in vitro. Este teste baseia-se em manter cabelos de
crianças pré-púberes esterilizados em ágar - gel, sendo alíquotas de fungos
repicadas sobre o pêlo. O teste foi considerado positivo quando foram
observadas perfurações perpendiculares ao longo do pêlo. Alguns fungos
possuem enzimas capazes de degradar a queratina, in vitro, como fonte de
energia (Sidrim & Rocha, 2004).
D. Prova da urease - esta prova bioquímica é processada em meio de
Christensen e detecta a presença ou ausência de enzima urease produzida
pelo fungo. O resultado é considerado positivo quando houver a mudança
do meio de amarelo para róseo e será negativo quando o meio se mantiver
amarelo (Sidrim & Rocha, 2004).
55
E. Prova de requerimento vitamínico - utilizada para diferenciação de cepas
baseadas em exigências nutricionais. Os meios de cultura utilizados foram
enriquecidos com ácido nicotínico, tiamina, histidina e inositol, sendo a
base do ágar T1 ao T5 a caseína e do ágar T6 e T7 o nitrato de amônia
(Sidrim & Rocha, 2004).
6.7 Atividade antifúngica
6.7.1 Método de difusão em ágar
A atividade contra dermatófitos e leveduras dos extratos das plantas foi
qualitativamente medida pelo método de difusão em ágar (Camm et al., 1975; Cole, 1994),
onde, o inóculo dos dermatófitos e das leveduras foram adicionados às placas de Petri com
ágar batata com o auxílio de um swab. Um pequeno poço foi feito no centro da placa
usando uma pipeta Pasteur e 100 µL do óleo essencial das plantas juntamente com seu
diluente (óleo mineral) e os controles negativos com água destilada foram adicionados aos
poços nas concentrações de 5%, 10% e 20%; os controles positivos para as leveduras
foram a anfotericina B e o itraconazol enquanto que para as cepas de M. canis, foi utilizada
a griseofulvina. As placas foram guardadas a temperatura ambiente e a leitura foi feita após
07 dias. O diâmetro da zona de inibição ao redor do poço foi medido e registrado nas
quatro direções diferentes.
56
57
Resultados
7 RESULTADOS
7.1 Análise dos óleos essenciais
A análise química do óleo essencial das três espécies de Croton e da Lippia
sidoides está mostrada na tabela 1. No óleo essencial do Croton nepetaefolius, observou-se
em maior quantidade a presença de metil-eugenol (15,73%) e biciclogermacreno (14,08%).
O Croton argyrophylloides apresentou o spathulenol (20,33%) e biciclogermacreno
(11,72%) em maiores proporções, enquanto que o Croton zehntneri mostrou o estragol
(72,85%) e o anetol (14,32%) em maiores quantidades. A Lippia sidoides apresentou o
timol (59,65%) e o cariofileno (10,60%) em maiores proporções.
58
Tabela 2: Análise química das três espécies de Croton e da Lippia sidoides
K.I. Componentes Composição (%)
C. a. C. n. C. z. L. s.
931 α-Thujene - - - 1.48
939 α-Pinene 5.55 - - 0.51
976 Sabineno 4.68 - - -
991 Myrceno - - 0.43 5.43
1018 α-Terpinene - - - 1.43
1026 Para Cymene - - - 9.08
1031 Limonene - - - 1.01
1033 1,8-Cineole 11.22 8.00 0.59 -
1050 E-β-Ocimene - - 0.38 0.27
1062 G-Terpinene - - - 3.83
1098 Linalool - - - 0.28
1171 Umbellulone - - - 0.46
1189 α-Terpineol - 3.54 - -
1196 Methyl chavicol - - 72.85 -
1235 Methyl Thymylether - - - 1.79
1285 Anethole - - 14.32 -
1290 Thymol - - - 59.65
1298 Ortho-Vanillin - 5.04 - -
1339 δ-Elemene - - 0.16 -
1376 α-Copaene - - - 0.66
1391 β-Elemene 6.24 3.72 0.32 -
1404 Methyl-Eugenol - 15.73 - -
1413 E- α-Bergamotene - 4.56 - -
1419 E-Caryophyllene 5.67 11.38 1.63 10.60
1435 E- α-Bergamotene - 9.09 0.22 -
1439 Aromadendrene - 3.35 - 0.53
1455 α-Humulene - 5.90 0.16 0.56
1459 Dehidroaromadendrane - - - 0.91
1461 Alloaromadendreno - - 0.27 -
1480 Germacrene-D - - 0.93 -
1485 β-Selinene 3.16 - - -
1500 Bicyclogermacrene 11.72 14.08 5.12 -
1505 Cupareno - - 0.17 -
1506 β-Bisabolene - 2.95 0.24 -
1524 δ -Cadinene - - 0.20 0.35
1578 Spathulenol 20.33 4.28 0.64 -
1581 Caryophyllene Oxide - 4.37 - 0.72
1593 Veridiflorol - - 0.32 -
KI – índice de retenção na coluna do cromatógrafo.
Ca = Croton argyrophylloides, Cn = Croton nepetafolius, Cz = Croton zenhtneri, Ls =
Lippia sidoides.
59
7.2 Atividade antimicrobiana
Os óleos essenciais do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides
demonstraram atividade apenas contra o M. canis (figuras 6 e 8). No entanto, os óleos
essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides apresentaram atividade contra todos os
fungos testados (tabelas 3, 4 e 5). O óleo essencial do Croton nepetaefolius foi o menos
efetivo, apresentando atividade antifúngica apartir da concentração de 50 mg/ml, enquanto
que o Croton argyrophylloides e o Croton zehntneri (figura 9) inibiram o crescimento do
fungo em todas as doses testadas. As zonas de inibição de crescimento foram relativamente
grandes e com o aumento das concentrações mostraram dose-dependência. Por outro lado,
o óleo essencial da L. sidoides (figura 7) foi claramente mais potente que os óleos
essenciais das espécies de Croton, apresentando grande zona de inibição de crescimento na
menor concentração quando comparado com a máxima resposta obtida com os óleos dos
Croton. Na concentração ≥ 50 mg/ml o óleo essencial da L. sidoides inibiu totalmente o
crescimento do Microsporum canis (tabela 3). Quando comparado com a griseofulvina (1
mg/ml), droga usada como controle positivo, todas as espécies de Croton mostraram baixo
crescimento da zona de inibição. Os valores das médias do crescimento das zonas de
inibição nas maiores concentrações do C. nepetaefolius, C. argyrophylloides e C. zehntneri
e da griseofulvina foram 19,8 ± 7,2; 31,2 ± 9,9; 22 ± 7,3 e 51,6 ± 6,7, respectivamente
(tabela 3).
O óleo essencial do C. nepetaefolius e do C. argyrophylloides foram
inofensivos contra Candida spp mesmo nas mais altas concentrações. A adição destes
óleos nas concentrações de 100 mg/mL não induziu nenhuma inibição no crescimento do
fungo (tabela 4). Por outro lado o C. zehntneri e L. sidoides foram efetivos contra a
Candida spp, sendo a L. sidoides mais potente, e em concentrações superiores a 25 mg/ml
ela apresentou maiores zonas que o controle positivo, anfotericina B (tabela 4). A máxima
inibição da zona de crescimento medido em milímetros para C. zehntneri, L. sidoides e
anfotericina B foi 12,6 ± 1.1; 23,2 ± 1,8 (p<0,05 C. zehntneri e anfotericina B) e 10,8 ±
1,5, respectivamente.
60
Similarmente, os óleos essenciais do C. nepetaefolius e do C. argyrophylloides
foram inofensivos contra Malassezia pachydermatis. A incubação destes óleos na
concentração de 100 mg/ml novamente foi inofensivo e não demonstrou nenhum efeito no
crescimento do fungo. Contudo, a incubação do C. zehntneri e mais eficientemente da L.
sidoides induziram zonas de inibição de crescimento do fungo de forma dose-dependente.
Na concentração de 100 mg/ml a L. sidoides induziu uma inibição total do crescimento do
fungo com maiores zonas de inibição que do itraconazol (controle positivo) em
concentração acima de 25 mg/ml (tabela 5). As zonas máximas de inibição do C. zehntneri
e do itraconazol foram 22,6 ± 6,7 e 29,7 ± 9,0, enquanto a L. sidoides tem similar zona na
concentração de 25mg/ml e 41,2 ± 9,5 (p<0,05 vs. C. zehntneri e itraconazol) a 50 mg/ml
(tabela 5).
Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de
Croton e da Lippia sidoides contra M. canis
Drogas
Zona de inibição de crescimento (mm)
Espécie de fungo dermatofítico - Microsporum canis
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (1 mg/ml)
Croton nepetaefolius 10.2±1.7 18.6±4.6
a
18.7±4.2
a
19.8±7.2
a
-
Croton argyrophylloides 14.8±4.0 21.1±4.2
a
26.2±5.5
a
31.2±9.9
b
-
Croton zehntneri 11.8 ±3.0 16.8±5.8 18.7±4.4 22±7.3
a
-
Lippia sidoides 33.4±12.4
c
IT IT IT -
Griseofulvina - - - - 51.6 ± 6.7
d
IT= Inibição total do crescimento do fungo
a
p<0.05 vs. 25mg/ml
b
p<0.05 vs. 50 mg/ml
c
p<0.05 vs. Croton species tested at 25 mg/ml
d
p<0.05 vs. Todas as concentrações das espécies de Croton testadas e L. sidoides em 25 mg/ml
Tabela 4: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de
61
Croton e da Lippia sidoides contra Candida spp.
Drogas
Zona de inibição de crescimento (mm)
Espécie de fungo leveduriforme – Candida spp.
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (5 μg/ml)
Croton nepetaefolius NI NI NI NI -
Croton argyrophylloides NI NI NI NI -
Croton zehntneri 7.4±1.1 9.0±1.4 10.0±1.5 12.6±1.1 -
Lippia sidoides 9.8±0.9 16.4±2.1
a
21.5±4.2
a,b
23.2±1.8
a,b
-
Anfotericina B - - - - 10.75 ± 1.5
NI= Não ocorreu inibição do crescimento do fungo
a
p<0.05 vs. 25mg/mL
b
p<0.05 vs. Anfotericina B
Tabela 5: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de
Croton e da Lippia sidoides contra M. pachydermatis
Plants
Zona de inibição de crescimento (mm)
Espécie de fungo leveduriforme – Malassezia
pachydermatis
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (8 μg/ml)
Croton nepetaefolius NI NI NI NI -
Croton argyrophylloides NI NI NI NI -
Croton zehntneri 11.6 ± 2.9 13.2 ± 2.7 17.2 ± 3.9
a
22.6 ± 6.7
a
-
Lippia sidoides 30.0 ± 10.0 41.2 ± 9.5
b
50.0 ± 8.3
a,b
IT -
Itraconazol - - - - 29.7 ± 9.0
IT= Inibição total do crescimento do fungo
NI= Não ocorreu inibição no crescimento do fungo
a
p< 0.05 vs. 25 mg/mL
b
p< 0.05 vs. Itraconazol
62
63
Figura 6: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100
mg/mL) de OECa testada, perante cepa de Microsporum canis.
(Fonte: Fontenelle, 2005)
(Fonte: Fontenelle, 2005)
Figura 7: Halo de inibição produzido pela menor concentração (25
mg/mL) do OELs perante cepa de Microsporum canis.
(Fonte: Fontenelle, 2005)
Figura 8: Halo de inibição produzido pela maior concentração do
OECn (100mg/mL) perante cepa de Microsporum canis.
7.3 Toxicidade
A administração dos óleos essenciais nas doses de 100 a 3000 mg/kg não
induziu uma notável alteração no comportamento padrão dos ratos. Todos os óleos
essenciais induziram miotonia, taquipnéia e dispnéia. A DL
50
calculada foi de 168,6 (160,5-
176,7) mg/kg para o Croton argyrophylloides de 163.8 (155.3-172.3) mg/kg para o Croton
nepetaefolius e de 117,95 (110,61-125,29) mg/kg para a Lippia sidoides. O Croton
zehntneri não apresentou toxicidade nas concentrações testadas for i.p. administração e
depois da administração oral nenhum óleo essencial demostrou toxicidade até 3 g/kg.
Além disso a avaliação toxicológica do óleo essencial, mais eficiente, com
atividade antifúngica, que também foi o mais abundante, foi administrado durante 30 dias
por gavagem, oralmente, nas doses correspondente a DL
50
estimado pela rota
intraperitoneal. A administração subcrônica do óleo essencial da L. sidoides foi destituído
de toxicidade. O peso corporal não foi afetado pelo tratamento, estando com 322,9 ± 18,96
g no primeiro dia e 328,3 ± 22,67 g no 30
o
. dia quando comparado com o veículo de
tratamento dos animais 331,1 ± 24.0 g vs. 357,2 ± 21,2 (p>0,05) (tabela 6).
64
(Fonte: Fontenelle, 2005)
Figura 9: Halo de inibição produzido pela maior concentração
(100mg/mL) do OECn perante cepa de Microsporum canis.
Tabela 6: Peso dos ratos após tratamento com 117,95 mg/kg de óleo essencial da Lippia
sidoides durante 30 dias.
Grupo Peso inicial Peso final
Tratado com Lippia sidoides 322,9 ± 18,96 g 328,3 ± 22,67 g
Controle 333,1 ± 24,.02 g 357,2 ± 21,19 g
Os parâmetros bioquímicos analisados, creatinina, uréia e TGO e TGP, não
foram significativamente afetados (tabela 7). Os perfis séricos dos vários marcadores não
foram alterados quando comparados com o controle interno, i.e., os valores obtidos antes
dos tratamentos ou com os grupos tratados com salina (tabela 8). Adicionalmente a
avaliação histopatológica do fígado, rins, pulmões, coração e baço não revelou alterações
na estrutura padrão dos tecidos estudados. Por isso, a administração da DL
50
do óleo
essencial da Lippia sidoides a ratos durante 30 dias não induziu manifestações significantes
sistêmicas de toxicidade. Similarmente, os perfis hematológicos de ratos Wistar não foram
significativamente afetados.
Tabela 7: Parâmetros Bioquímicos de ratos Wistar antes do tratamento, após 15 dias e 30
dias do tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo.
Parâmetros Bioquímicos/Toxicidade Sub Crônica
Grupo Uréia Creatinina TGO TGP
Antes de
OELs
88,71 ± 19,85
(n=10)
0,87 ± 0,09
(n=10)
100,2 ± 15,89
(n=10)
52,1 ± 9,98
(n=10)
OELs
(15 dias)
55,96 ± 4,87
(n=09)
0,87 ± 0,16
(n=08)
125,7 ± 10,33
(n=09)
55,54 ± 9,15
(n=09)
OELs
(30 dias)
46,56 ± 8,65
(n=09)
0,84 ± 0,06
(n=09)
135,3 ± 12,94
(n=09)
41,86 ± 10,52
(n=09)
Antes do
veículo
51,8 ± 18,65
(n=10)
1,04 ± 0,05
(n=10)
138,3 ± 15,89
(n=10)
37,02 ± 13,68
(n=10)
Veículo
(15 dias)
64,4 ± 9,53
(n=10)
0,89 ± 0,13
(n=10)
120,3 ± 10,33
(n=10)
66,36 ± 13,77
(n=10)
Veículo
(30 dias)
48,4 ± 7,68
(n=10)
0,97 ± 0,15
(n=10)
122,2 ± 12,94
(n=10)
50,25 ± 14,25
(n=10)
65
Tabela 8: Parâmetros hematológicos de ratos Wistar antes e depois de tratamento oral com
117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30 dias.
Dia zero 30 dias após tratamento com OELs
Parâmetros Média ± EP IC (95%) Média ± EP IC (95%)
Hemáceas MM
3
3,6 ± 1,75 3,5 – 3,7 3,5 ± 178000 3,3 - 3.,6
Hemoglobina g/dL 8, 9 ± 1,3 8,08 – 9,69 8,4 ± 1,28 7,47 – 9,32
Hematócrito % 28,7 ± 1,2 27,84 – 29,62 28,45 ± 1,17 27,61 – 29,29
Leucócitos totais 6820 ± 877 6121 - 7519 6590 ± 967,8 5898 - 7282
66
67
Discussão
8 DISCUSSÃO
Os óleos essenciais são fontes potenciais de componentes antimicrobianos
(Lemos et al., 1990; Souza et al., 2003; Gurgel et al., 2005; Phongpaichit et al., 2005;
Yayli et al., 2005). Os resultados de pesquisas anteriores, contudo, dificilmente podem ser
correlacionados com estudos atuais, visto que os métodos empregados para testar a
atividade destes compostos não são padronizados. A composição dos óleos essenciais varia
grandemente na dependência da região geográfica, devido a variedade e idade da planta,
bem como pelo método de secagem e de extração empregados (Jerkovic et al., 2001).
Nosso estudo mostrou que o óleo essencial do Croton zehntneri e da Lippia
sidoides foram efetivos contra Microsporum canis, uma das mais comuns espécies de
dermatófito causador de infecções fúngicas superficiais em humanos, gatos e cachorros
(Brilhante et al., 2005; Sidrim & Rocha, 2004; Brilhante et al., 2005a,b).. Eles também
foram ativos contra foram ativos contra Candida spp. e Malassezia pachydermatis, que são
leveduras importantes, envolvidas em micoses de humanos e animais (Sidrim & Rocha,
2004). Os óleos essenciais do C. argyrophylloides e C. nepetafolius foram pouco efetivos
e não mostraram um perfil de concentração-relação.
Os maiores componentes dos óleos essenciais que foram mais eficientes com
relação à atividade antifúngica foram identificadas como o estragol e o anetol para o C.
zehntneri e o timol para a L. sidoides.
A ausência de atividade contra leveduras pelos óleos essenciais do C.
argyrophylloides e C. nepetafolius contrastando com a eficácia do C. zehntneri e da L.
sidoides pode ser explicada pela presença do estragol e do anetol em altas quantidades no
C. zehntneri e do timol na L. sidoides. Estes componentes não estão presentes no óleo
essencial do C. argyrophylloides e do C. nepetafolius e tais compostos foram previamente
registrados por serem efetivos como antifúngico incluindo leveduras (?).
68
Lopes Júnior et al. (2005) determinaram que o óleo essencial do Croton
zehntneri tinha ação antibacteriana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli e
Klebisiella pneumoniae, bem como ação antifúngica contra Cryptococcus neoformas e
Candida albicans. No presente estudo, o estudo fitoquímico feito com o óleo essencial do
Croton zehntneri usado, demonstrou a presença de estragol e anetol, sendo este último uma
substância que previamente mostrou atividade antifúngica (Lopes Júnior et al., 2005).
Lacoste et al., 1996 registraram o potencial antimicrobiano da L. sidoides contra
microrganismo da microflora da pele, bem como seus principais componentes, timol e
carvacrol (Lacoste et al., 1996)
O presente estudo revelou que a administração por até 30 dias de uma dose
correspondente a DL
50
não afetou qualquer parâmetro bioquímico, hematológico ou
histopatológico estudado. Uma vez que o OELs está sendo testado quanto a sua eficácia
antifúngica e quanto a sua segurança com relação ao tratamento, o período de
administração é suficiente para comprovar que este óleo essencial é seguro para
administração oral em protocolos com dosagens simples ou repetidas como proposta
terapêutica até o limite da DL
50.
A contagem de células vermelhas do sangue também foi normal após
tratamento durante 30 dias com OELs e nenhuma alteração foi observada no hematócrito
ou valores de hemoglobina. As plaquetas também permaneceram inalteradas em número e
forma. Por isso, é improvável que a administração por longo prazo de OELs cause danos
diretos nas células sangüíneas, na medula óssea ou anormalidades na absorção ou
incorporação de nutrientes necessários para a eritropoiese, pelo menos em grau suficiente
para causar anemia. Similarmente, a administração durante 30 dias de OELs não causou
efeitos significantes na contagem total ou diferencial das células sangüíneas da linhagem
branca. Assim, estes efeitos dão suporte à falta de efeitos tóxicos induzidos por OELs
diretamente nas células sangüíneas e nenhum dano direto à medula óssea. Além do mais,
uma atividade imunodepressora deste extrato é também improvável.
69
Os resultados sugerem a importância e a necessidade de pesquisas do potencial
no uso dos os óleos essenciais no tratamento de infecções fúngicas. O pequeno número de
antifúngicos disponíveis para o tratamento de micoses, a maioria fungistáticos, juntamente
com a resistência emergente induz a pesquisa de terapêuticos alternativos combinado com
o baixo custo e baixa toxicidade, como os óleos essenciais.
Os resultados deste estudo explicam e justificam, em parte, o uso popular
destas plantas para o tratamento de micoses e destacam o potencial antifúngico que podem
ser explorados para propósitos terapêuticos como uma alternativa para o tratamento de
micoses superficiais.
Os óleos essenciais do C. zehntneri e da L. sidoides podem ter uma eficiente
aplicação como medicamento tópico para a pele no o tratamento de infecções fúngicas e
bacterianas superficiais, particularmente em micoses cutâneas.
70
71
Conclusões
9 CONCLUSÕES
1 Os óleos essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides apresentaram
atividade contra cepas de M. canis, Candida spp e Malassezia pachydermatis;
2 os óleos essenciais do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides
demonstraram atividade apenas contra o M. canis;
3 a administração, por longo prazo, de OELs é relativamente segura e,
provavelmente, desprovida de toxicidade significativa;
4 os óleos essenciais das plantas estudadas constituem fontes importantes de
compostos antifúngicos que podem ser úteis no tratamento de micoses em
animais.
72
Referências
Bibliográficas
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BARROS, S. B. M; DAVINO, S. C. Em: OGA, S. Fundamentos de Toxicologia, p. 61-
70. Editora Atheneu, São Paulo, 1996.
BARROSO, G. M. Sistemática de Angiospermas do Brasil. Viçosa: Imprensa
Universitária, 1991. v. 2.
BIRGEL, E. H. Hematologia Clínica Veterinária. Em: Patologia Clínica Veterinária.
Birgel, E. H. Benesi, F. J. 2 ed. p 2-69. Sociedade Paulista de Medicina Veterinária, São
Paulo, 1983.
BOND, R.; LAMPORT, A. I.; LLOYD, D. H. Colonisation status of Malassezia
pachydermatis on the hair and in the hair follicle of healthy beagle dogs. Rev. Veterinary
Science, v. 68, p. 291-293, 2000.
BOTELHO, M. A. & SOARES, J.B. O óleo essencial do Alecrim-pimenta (Lippia
sidoides Cham.) na prevenção da cárie dental. In: XIII Simpósio de Plantas Medicinais
do Brasil, p.20, Fortaleza, 1994.
BRILHANTE, R. S. N.; CORDEIRO, R. A.; MEDRANO, D. J. A.; SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Antifungal susceptibility
and genotypical pattern of Microsporum canis strains. Canadian Journal of Microbiology, v. 51, p. 1480-3275, 2005.
BRILHANTE, R. S. N.; ROCHA, M. F. G.; CORDEIRO, R. A.; RABENHORST, S. H.; GRANJEIRO, T. B.; MONTEIRO, A. J.;
SIDRIM, J. J. C. Phenotypical and molecular characterization of Microsporum canis strains in north-east Brazil. Journal of
Microbiology, v. 99, p. 776-782, 2005.
73
BRILHANTE, R. S. N.; CAVALCANTE, C. S. P.; SOARES-JÚNIOR, F. A.; CORDEIRO, R. A.; SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M.
F. G. High rate of Microsporum canis feline and canine dermatophytoses in Northeast Brazil: epidemiological and diagnostic
features. Mycopathology, v. 156, p. 303-308, 2003.
BRILHANTE, R. S. N. Estudo das dermatofitoses canina e felina: Aspectos
epidemiológicos e comportamentais do Microsporum canis frente a diferentes métodos de
estocagem. Fortaleza, 2002. 85p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) -
Universidade Estadual do Ceará.
BRITO, A. R. M. S.; BRITO, A. A. S. Forty years of brasilian medicinal plant research.
Journal of Ethnopharmacology, v. 39, p. 53-67, 1993.
BROWN, S. A.; DAVIS, L. E. Principles of Pharmacology. Em: Veterinary
Pharmacology and therapeutics. Adams, H. R. p 3-8. Eighth ed. Iowa State University
Press, USA, 2001.
BRUNETON, J. Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal. In: BRUNETON, J.
Terpenoids and steroids essential oils. 2 ed., Inglaterra: Lavoisier Publishing, 1995. 405-
426.
CABAÑES, F.J. Dermatofotosis animales. Recientes avances. Rev. Iberoam Micology. v.
17, p. 8-12, 2000.
CALIXTO, J. B.; BEIRITH, A.; FERREIRA, J. Naturally ocurring antinociceptive
substances from plants. Rev. Phytotherapy, v. 14, p. 401-418, 2000.
CAMM, E. L.; TOWERS, G. H. N.; MITCHELL, J. C. UV-mediated antibiotic activity of
some Compositae species. Phytochemistry, v. 14, p. 2007-2011, 1975.
74
CAMURÇA-VASCONCELOS, A. L. F. Estudo farmacológico e toxicológico do extrato acetato de etila de Spigelia anthelmia
Linn em animais de laboratório. Fortaleza. (Mestrado em Ciências Veterinárias). Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual
do Ceará. 93p, 2002.
CENTER, S. A. Em: Strombeck’s Small Animal Gastroenterology. Guilford, W. G.,
Center, S. A.; Strombeck, D. R.; William, D. A; Meyer, D. J., eds., 553p. Philadelphia,
Pennsylvania, USA, 1996.
CHEN, T.; HILL, P. B. The biology of Malassezia organisms and their ability to induce
immune responses and skin disease. Veterinary Dermatology, v. 16, p. 4-26, 2005.
COELHO-DE-SOUZA, A. N.; CRIDDLE, D. N. e LEAL-CARDOSO, J. H. Selective
modulatory effect of the essential oil of Croton zehntneri on isolated smooth preparations
of the guinea-pig. Phytotherapy Research, v. 12, p. 189-194, 1997.
COLE, M. D. Key antifungal, antibacterial and anti-insect assays. A critical review.
Biochemical Systems and Ecology, v. 22, p. 837-856, 1994.
CRAVEIRO, A. A.; ALENCAR, J. W.; MATOS, F. J. A. Estudo de óleos essenciais de
plantas do Nordeste brasileiro. Ciência Cultural, v. 28, p. 180, 1976.
CRESPO, M. J.; ABARCA, M. L.; CABAÑES, F. J. Evaluation of different Preservation
and Store Methods for Malassezia spp. Journal Clinic Microbiology, v. 38 (10), p. 3872-
5, 2000.
EATON, D. L.; KLAASSEN, C. D. Principles of toxicology. Em: Casarett and Doull’s
toxicology: the basic science of poisons. 5ª ed. McGraw-hill, New York, 1995.
FERNANDES, A. G.; ALENCAR, J. W.; MATOS, F. J. A. Canelas silvestres nordestinas:
aspectos botânicos, químicos e farmacológicos. Ciencia Cultural, v. 32, p. 26-33, 1971.
75
FIDALGO, M. E. P. K. The genus hexagona. Memoirs of the New York. Botanical
Garden, v. 17, p. 35-108, 1968.
FINCO, D. R. Kindney function. Em: Clinical Biochemistry of Domestic Animals.
Kaneko, J. J.; Harvey, J. W.; Bruss, M. L. eds. Academic Press, USA, 1997.
FRANCHOME, P.; PENOEL, D. D. L’aromatherapie exactement – Encyclopedie de
I’utisation therapeutique des huiles essentielles. Limoges: Roger Jolois, 1995.
GARCIA, M. E.; BLANCO, J. L. Principales enfermedades fúngicas que afetam a los
animales domésticos. Rev. Iberoam Micology, v. 17, p. S2-S7, 2000.
GUILLOT, J.; CHERMETTE, R.; GUÉHO, E. Prévalence du genre
Mallassezia chez les mammifères. Journal Mycology Medical, v. 4, p. 1-15, 1994.
GUILLOT, J.; BOND, R. Malassezia pachydermatis: a review. Medical Mycology, v. 37,
p. 295-306, 1999.
GURGEL, L. A.; SIDRIM, J. J. C.; MARTINS, D. T.; CECHINEL-FILHO, V. S. In vitro
antifungal activity of dragon’s blood from Croton urucurana against dermatophytes.
Journal of Ethnopharmacology, v. 97, 409-412, 2005.
HAGIWARE, M. T. Bioquímica Clínica. Em: Patologia Clínica Veterinária. 2ª ed. p 89-
130. Sociedade Paulista de medicina Veterinária. São Paulo, 1983.
76
HAY R.J. Dermatophytosis and other superficial mycose. In: MANDELL, G.L.
BENNET, J.E., DOLIN, R. Principles and practice of infestious disease. 4a. Ed. London.
Churchill livingstone, 1995. 2375-2386.
JERKOVIC, L.; MASTELIC, J.; MILOS, M. The impact of both the season of collection and drying on the volatile constituents of
Origanum vulgare. L. spp. Hirtum grown wild in Croatia. Intitute Journal Food Science Technology, v. 36, p. 649-654, 2001.
KANECO, J. J. Serum proteins and the Dysproteinemias. Em: Clinica Biochemistry of
Domestic Animals. Kaneco, J. J.; Harvey, J. W.; Bruss, M. L. eds. Academic Press, USA,
1997.
KWON-CHUNG, K. J.; BENNETT, J. E. Epidemiology. In: Kwon-Chung, K. J. &
Bennett, J. E. (Eds). Medical Mycology, v. 30, p. 35-43, 1992.
LACOSTE, E., CHAUMONT, J. P., MANDIN, D., PLUMEL, M. M., MATOS, F. J.,
Antiseptic properties of essential oil of Lippia sidoides Cham. Application to the cutaneous
microflora. Ann. Pharm Fr. 54, 228, 1996.
LARINE, L. Toxicologia. p. 43-58. 3ª ed. Manole, São Paulo, 1997.
LAVABRE, M. Aromaterapia: a cura pelos óleos essenciais. 2 ed. Rio de Janeiro:
Record, 1993.
LEMOS, L. C.; TAINTER, M. L. The estimation of ED50 and its error by means of
logarithmic-probit graph paper. Proceedings of the Society of Experimental Biology &
Méd., v. 57, p. 261-264, 1944.
77
LEMOS, T. L. G.; MATOS, F. J. A.; ALENCAR, J. W.; CRAVEIRO, A. A.; CLARK, A.
M.; MCCHESNEY, J. D. Antimicrobial activity of essentials oils of brazilian plants.
Phytotherapy Research, v. 4, p. 82-83, 1990.
LOPES JÚNIOR, J. E. G. Avaliação da atividade citotóxica, antimicrobiana, larvicida e antiinflamatória de óleos essenciais
do Croton zehntneri PAX ET HOFFM., Anetol e análogos. Fortaleza. (Mestrado em Ciências Fisiológicas). Centro de Ciências
da Saúde, Universidade Estadual do Ceará. 96p, 2005.
LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas
Cultivadas. São Paulo: Instituto Plantarum, 2002.
LUND, J. E. Toxicologic effects on bloodand Bone Marrow. Em: Schalm’s Veterinary
Hematology. Feldman, B. V.; Zinki, J. G.; Jain, N. C. eds. 5ª ed. p 44-50, 2000.
MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais – Guia de seleção e emprego de plantas usadas em
fitoterapia no Nordeste do Brasil. 2 ed. Fortaleza: Imprensa Universitária – UFC, 2000.
MENDES-GIANNINI, M. J. S.; MELHEM, M. S. C. Infecções fúngicas. In: FERREIRA,
A. W.; ÁVILA, S. L. M. – Diagnóstico laboratorial. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan,
1996. 216-275.
MIDGLEY, G. The lipophilic yeasts: state of the art and prospects. Medical Mycology, v.
38(Supl. 1), p. 9-16, 2000.
MILLER, L. C.; TAINTER, M. L. The estimation of ED50 and its error by means of
logarithmic-probit graph paper. Proceedings of the Society of Experimental Biology &
Méd., v. 57, p. 261-264, 1944.
78
MONTE, F. J. Q. Contribuição ao conhecimento químico de plantas do Nordeste –
Croton argyrophylloides Muell. Arg. Fortaleza, 1980. 03-10p. Dissertação (Mestrado) –
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará.
MORETTI, A., POSTERARO, B., BONCIO, L., MECHELLI, L., GASPERIS, E.,
AGNETTI, F., RASPA, M. Diffuse cutaneous candidiasis in a dog. Diagnosis by PCR-
REA. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 21, p. 139-142, 2004.
MULLER, G. H.; KIRK, R. W.; SCOTT, D. W. Dermatologia dos pequenos animais.
São Paulo: Manole, 1985, 935p.
NAKAMURA, Y.; WATANABE, S.; HASEGAWA, A. Dermatomycosis in human and
animals. Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi, v. 40, n. 1, p. 9-14, 1999.
PAULA, C. R.; Candidíases. In: ZAITZ, C.; CAMPBELL, I.; MARQUES, S. A.; RUIZ,
L. R. B.; SOUZA, V. M. Compêndio de micologia médica. São Paulo: Medsi, p. 99-107,
1998.
PHONGPAICHIT, S.; SUBHADHIRASAKUL, S.; WATTANAPIROMSAKUL, C.
Antifungal activities of extracts from Thai medicinal plants against opportunistic fungal
pathogens associated with AIDS patients. Mycoses, v. 48, p. 333-338, 2005.
RAPOSO, B. R.; NOBRE, M. O.; FERNANDES, C. G.; PORTO, M. Candidíase cutânea
em um canino. Revista da Faculdade de Zootecnia, Veterinária e Agronomia, 2-3, 11-
14, 1996.
RABELO, Michelle. Avaliação do efeito antiedematogênico e antinociceptivo do óleo
essencial de Ocimum gratissimum (OEOG) Labiatae. Fortaleza, 2003. 116p. Dissertação
79
(Mestrado em Ciências Fisiológicas) – Centro de Ciências da Saúde, Universidade
Estadual do Ceará.
REPETTO, M. Toxicologia Experimental. Em: Toxicologia Fundamental. 3ª ed Editora
Diaz de Santos, Madrid, p. 291-300,1997.
RIBEIRO, B. Q. Plantas medicinais ameríndias. Ciência Hoje, v. 15, p. 52-54, 1993.
RIPPON, J.W. Medical micology: the pathogenic fungi and the pathopenic actinomicetes,
3a.. ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1988.
ROBERFROID, M. Toxicology: a Science and an Art. Toxicology in vitro, v.9, p. 839-
844, 1995.
SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica à luz de autores
contemporâneos. Rio de Janeiro: Guanabara, 2004.
SILVEIRA, R. E. Contribuição ao conhecimento químico de plantas nativas do
Nordeste Croton sonderianus Muell arg. Fortaleza, 1979. Dissertação de mestrado –
Universidade Estadual do Ceará.
SIMÕES, C. M. O.; SPITZER, V. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Ed.
Universidade/UFRGS. 3
a
ed., 1999.
SOEJARTO, D. D. Biodiversity prospecting and benefit sharing: perspectives from the
field. Journal of Ethnopharmacology, v. 51, p. 1-15, 1996.
80
SOUZA, I. P. Hematologia Clínica, v. 1, 1998.
SOUZA, L. K. H.; OLIVEIRA, C. M. A.; FERRI, P. H.; OLIVEIRA-JÚNIOR, J, G.;
SOUZA-JÚNIOR, A. H.; FERNANDES, O. F. L.; SILVA, M. R. Antimicrobial activity of
Hyptis ovalifolia towards dermatophytes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 98, p. 963-965,
2003.
TENNANT, B. C. Hepatic Function. Em: Clinical Biochemistry of Domestic Animals.
Kaneco, J. J.; Harvey, J. W.; Bruss, M. L. eds. Academic Press, USA, 1997.
TURK, R. J.; CASTEEL, S. W. Clinical Biochemistry in Toxicology. Em: Clinical
Biochemistry of Domestic Animals. Kaneco, J. J.; Harvey, J. W.; Bruss, M. L. eds.
Academic Press, USA, 1997.
WALL, M. E.; WANI, M. C. Camptothecin and taxol. From discovery to clinic. Journal
of Ethnopharmacology, v. 51, p. 239-254, 1996.
YAYLI, N.; YASAR, A.; GULEC, C.; USTA, A.; KOLAYLI, S.; COSKUNCELEBI, K.;
KARAOGLU, S. Composition antimicrobial activity of essential oils from Centaurea
sessilis and Centaurea armena. Phytochemistry, v. 66 p. 1741-1745, 2005.
81
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
