( PDF ) Criopreservação do sêmen canino diluído em Tris: avaliação morfológica, funcional e de suas interações com oócitos homólogos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Alexandre Rodrigues Silva

Criopreservação Do Sêmen Canino Diluído Em Tris:

Avaliação Morfológica, Funcional E De Suas Interações Com

Oócitos Homólogos

Fortaleza-Ceará

Dezembro de 2005

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Alexandre Rodrigues Silva

Criopreservação Do Sêmen Canino Diluído Em Tris:

Avaliação Morfológica, Funcional E De Suas Interações Com

Oócitos Homólogos

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial para a

obtenção de grau de Doutor em Ciências

Veterinárias.

Área: Reprodução e Sanidade Animal.

Orientadora: Dra. Lúcia Daniel Machado da

Silva.

Fortaleza-Ceará

Dezembro de 2005

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S586C

Silva, Alexandre Rodrigues.

Criopreservação do sêmen canino diluído em Tris:

Avaliação morfológica, funcional e de suas interações

com oócitos homólogos/Alexandre Rodrigues Silva.

Fortaleza, 2005.

165p.; il.

Orientadora: Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva

Tese: Doutorado em Ciências Veterinárias –

Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de

Veterinária.

1. Sêmen,2. Cão, 3. Criopreservação. I. Universidade

Estadual do Ceará, aculdade de Veterinária

CDD 636.08926

Universidade Estadual do Ceará

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Título do Trabalho: Criopreservação do sêmen canino diluído em Tris: Avaliação

morfológica, funcional e de suas interações com oócitos

homólogos

Autor (a): Alexandre Rodrigues Silva

Defesa em: 16/12/2005 Conceito obtido: Satisfatório “Com Louvor”

Nota obtida: 10 (Dez)

Banca Examinadora

__________________________________

Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva

Orientadora

_________________________________ ________________________________

Profa. Dra. Maria Denise Lopes Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza

Co-Orientadora/Examinadora Examinadora

_________________________________ ________________________________

Prof. Dr. Airton Alencar Araújo Profa. Dra. Ana Cláudia Nascimento Campos

Examinador Examinadora

“Ando devagar, porque já´tive pressa,

E levo esse sorriso porque já chorei demais.

Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe,

E só tenho a certeza de que muito pouco eu sei,

Eu nada sei.

Conhecer as manhas e as manhãs, o calor das matas e das maçãs.

É preciso amor pra poder pulsar, é preciso paz pra poder sorrir,

É preciso chuva para sorrir.

Penso que cumprir a vida seja simplesmente

Compreender a marcha e ir tocando em frente.

Como um velho boiadeiro levando a boiada,

Eu vou levando os dias pela longa estrada eu vou,

Da estrada eu sou.

Todo mundo ama um dia, todo mundo chora.

Um dia a gente chega e no outro vai embora.

Cada um de nós compõe a sua história,

E cada ser em si carrega o dom de ser capaz,

E ser feliz.”

Almir Sater

DEDICATÓRIA

“Aos cães, e em especial aos meus cães

Priscila, Guriá e Tê (in memorian), que são a razão

porque eu sigo essa estrada.”

Dedico

AGRADECIMENTOS

É incrível como escrever uma tese é difícil, porém mais incrível é perceber que escrever os

agradecimentos é simplesmente uma tarefa ainda mais difícil. O receio de escrever bobagem, de

exagerar no sentimento, ou de esquecer alguém importante, acaba por travar a nossa mente e

simplesmente dá um branco. Seria mais fácil então generalizar e dizer que quero agradecer a todos

que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho. Isso não deixa de ser uma grande

verdade, mas existem alguns agradecimentos especiais que não posso deixar de fazer:

A Deus ou qualquer que seja Seu nome, em qualquer língua ou religião, por cada uma das

“pequenas coisas que valem mais” e que fazem parte de um todo maravilhoso.

Aos meus pais, Antonio Magomante Silva e Erenice Rodrigues Silva, e aos meus irmãos,

Marcus Henrique, Herlon Victor e Janice Rodrigues Silva, por terem me dado uma base familiar

estável para poder encarar essa jornada de peito aberto. A vocês, o meu sincero obrigado! Eu os amo

muito!

À minha amiga, professora, orientadora e amiga, Dra. Lúcia Daniel M da Silva, que vem

dividindo comigo essa trajetória acadêmica, desde a inciciação científica em 1996 até o dia de hoje.

Acho que essa tese, mais do que um trabalho científico, representa a conclusão de uma grande

parceria, pela qual eu vou ser eternamente grato. Desse modo, seriam poucas as palavras que

representassem meu real agradecimento, mas eu tento aqui expressar, acima de tudo, o meu grande

obrigado pelo exemplo de ser humano maravilhoso que ela demonstrou ser durante esse tempo.

À Dra. Maria Denise Lopes, que sempre bem disposta a ajudar, tão bem me acolheu em

Botucatu-SP, onde possibilitou a realização de grande parte dos experimentos relatados nesta tese. O

meu muito obrigado por ter sido naquele momento não apenas a minha orientadora, mas também

uma amiga. Obrigado ainda por estar presente na minha defesa de tese, e por continuar sendo desde

então uma amiga com a qual eu tenho a certeza de poder contar.

À Dra. Fabiana Ferreira de Souza, que tanto me ajudou em minha estada em Botucatu-SP para

a realização de parte dos experimentos que compõem essa tese e por ter-se tornado uma grande

amiga, com quem eu tenho a certeza de sempre poder contar.

Ao Dr. Airton Alencar de Araújo, pelo incentivo e pela ajuda em diversos momentos no

decorrer da elaboração desta tese.

À Dra. Ana Cláudia Nascimento Campos, pela ajuda no decorrer dessa caminhada e também

por ter aceitado o convite para participar de minha banca de defesa de tese.

Ao Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas que tantas vezes me auxiliou com relação ao

delineamento estatístico dos experimentos e também por ter-me permitido o uso de diversos

equipamentos do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução-UECE.

Ao Dr. Ricardo Toniolli, pelo auxílio na elaboração do projeto que originou essa tese.

Ao Dr. José Ricardo de Figueiredo, por ter me representado o exemplo de como um

profissional da área acadêmica deve ser.

À minha grande amiga Rita de Cássia Soares Cardoso, com quem desde a iniciação científica

eu tenho o prazer de trabalhar e que muito me ajudou a superar alguns obstáculos e limitações que

encontramos no decorrer desta jornada.

A Marcos Renato Franzosi Mattos e sua esposa Lucilene Simões-Mattos, meus colegas de

mestrado e doutorado, e meus amigos do dia a dia, o meu muito obrigado por sua amizade de sempre,

e por terem me ensinado que o mundo não se resume àquilo que se observa, que existe uma

interdisciplinaridade entre as coisas, e que nada acontece sozinho ou por acaso.

Ao amigo Daniel Couto Uchoa, que mais que um amigo, mostrou-se ser um irmão nas horas

alegres e nas horas difíceis, e particularmente com relação a essa tese, por ter disponibilizado os

animais de seu canil,o Canil Grande Canafístula, para uso nos experimentos.

Às amigas Ana Kelen Felipe Lima e Ticiana Franco Pereira da Silva, cuja amizade e a certeza

de estarem aí do lado significam muito pra mim.

Aos colegas do Laboratório de Reprodução de Carnívoros – UECE: Janaína de Fátima

Saraiva Cardoso, Iran Águila Aguiar, Carlos Gabriel Dias, Victor Leão Hitzschsky Madeira,

Leonardo Tavernezzi, Raimunndo Diones Carneiro, Daniel Falcão Menezes Brilhante, Camila Louise

Ackerman, dentre outros que passaram pelo laboratório e aqueles que chegaram agora no finalzinho

do trabalho.

Às colegas do Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e Silvestres – UNESP: Maria

Isabel Melo Martins, Viviane Helena Chirinéia e Christiane Barreto, e aos demais membros do

Departamento de Reprodução Animal e Radiologia da UNESP-Botucatu, pela grande acolhida e por

ter-nos feito sentir como verdadeiros membros da casa.

À Dra. Berenice de Ávila Rodrigues, a quem tantas vezes eu pedi auxílio por e-mail e que

tantas vezes me incentivou e me serviu de exemplo.

Ao Instituto de Biociências da UNESP-Botucatu, por ter possibilitado a realização dos

procedimentos de microscopia eletrônica.

À organização não-governamental Pró-Carnívoros, na pessoa do Dr. Ronaldo Gonçalves

Morato, por ter nos cedido equipamentos essenciais para uso nos experimentos.

À CAPES, pelo fornecimento da bolsa de estudos durante o doutorado.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro à realização desse trabalho.

Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da

UECE e a todos os seus professores e funcionários, pela acolhida e ensinamentos passados.

E, finalmente, àqueles que nos são fiéis em todas as horas, e que se doam para trabalhos como

este, mesmo sem saber, e por isso e por tantas outras qualidades fazem jus ao título de “melhor amigo

do homem”, a eles mesmos, aos Cães.

O meu muito obrigado e FORÇA SEMPRE!!!

RESUMO

A presente tese objetivou aprimorar uma metodologia de congelação

de sêmen canino, utilizando o diluente Tris. Foi inicialmente avaliado

o efeito da diluição espermática, no qual foram comparados o método

de diluição baseado em uma concentração fixa de 200 x 10

espermatozóides/mL versus a diluição baseada no volume fixo a uma

proporção de uma parte de sêmen para uma parte de diluente. Foi

também testado o efeito da temperatura de adição do glicerol ao

diluente, comparando-se 27ºC com 4ºC, bem como foi avaliada a

adição de diluente ao sêmen após a descongelação. Foram ainda

aplicados diferentes testes de avaliação seminal, no sentido de

observar a relação entre eles e as interações entre espermatozóides e

oócitos homólogos, sendo ao final também realizada uma análise

conjunta de diferentes parâmetros morfológicos do sêmen. Para atingir

os objetivos, o sêmen foi colhido por manipulação digital peniana,

avaliado macro e microscopicamente, diluído conforme o tratamento

proposto, congelado e armazenado em nitrogênio líquido. A

descongelação se deu em banho-maria a 38ºC. A partir das análises do

sêmen descongelado, verificou-se que não existem diferenças entre os

dois métodos de diluição testados, nem entre as temperaturas de

adição de glicerol. Observou-se também que a adição de diluente ao

sêmen após a descongelação não traz prejuízos e nem benefícios ao

mesmo. No tocante às relações entre os testes, verificou-se que alguns

parâmetros de motilidade espermática avaliados pela análise

computadorizada de sêmen apresentam valor preditivo quanto às

interações entre espermatozóides caninos descongelados e oócitos

homólogos. Finalmente, a avaliação combinada de diversos

parâmetros morfológicos mostrou que o procedimento de

criopreservação induz diversas alterações à célula espermática, mas

algumas destas são apenas detectadas através da microscopia

eletrônica.

ABSTRACT

This thesis aimed to improve a canine semen freezing procedure

using a Tris-based extender. First, the effect of the sperm dilution

was evaluated by comparing the dilution method based on a fixed

concentration of 200 x 10

spermatozoa/mL versus the dilution

based in the fixed volume on a proportion of one part semen to

one part extender. The effect of the temperature of glycerol

addition to the extender was also tested, being compared 27ºC

with 4ºC, as well as the addition of extender after thaw. Different

semen evaluations were also applied in the sense of observing the

relations among semen parameters and sperm-oocyte interaction

in vitro. Finally, a combined evaluation of different morphologic

parameters of semen was conducted. In order to reach the

objectives, the semen was collected by digital manipulation,

appraised grossly and microscopically, diluted according to the

proposed treatment, frozen and stored in liquid nitrogen. The

thawing was conducted at water-bath at 38ºC. From the thawed

semen analyses, it was verified that there are no differences

between the two dilution methods tested, neither between the

temperatures of glycerol addition. It was also observed that the

addition of extender to the semen after thaw does not cause any

damages or benefits to the semen. Concerning the relationships

among the tests, it was verified that some sperm motility patterns

evaluated by computerized analysis of semen present prognostic

value on the interactions between thawed canine spermatozoa and

homologue oocytes. Finally, the combined evaluation of several

morphologic parameters showed that the cryopreservation

procedure induces several alterations to the sperm cell, but some

of these are just detected through the electronic microscopy.

SUMÁRIO

Pág.

1. Introdução 01

2. Revisão de literatura

a) Anatomo-fisiologia reprodutiva do macho canino 03

b) O espermatozóide canino 04

c) Histórico da criopreservação de sêmen canino 05

d) O diluidor Tris 06

e) A gema de ovo 08

f) O glicerol 10

g) Métodos de congelação e descongelação de sêmen canino 12

h) Métodos de avaliação seminal 14

Artigo de revisão: Principais aspectos ligados à

aplicação da inseminação

artificial na espécie canina

3. Justificativa 34

4. Hipóteses científicas 36

5. Objetivos 37

6. Capítulo 01: Comparison between differente dilution rates

on canine semen

freezing using Tris-buffer with the addition of egg-yolk and glycerol

7. Capítulo 02: Influence of temperature for glycerol addition and post-

thaw dilution

on the quality of canine frozen semen

8. Capítulo 03: Prognostic value of canine frozen semen parameters on in vitro

sperm oocyte interactions

9. Capítulo 04: Combined evaluation of multiple morphological

parameters and fine

structural appearance of caninef-frozen thawed semen

10. Discussão geral

a) Sobre os animais utilizados no experimento 84

b) Efeito da diluição espermática 85

c) Temperatura de adição de glicerol 86

d) Motilidade espermática 87

e) Teste de termorresistência e efeito da adição de diluidor após a descongelação 90

f) Múltiplos parâmetros morfológicos do sêmen canino 91

g) Teste hipo-osmótico 93

h) Aparência ultra-estrutural espermática 94

i) Interação entre espermatozóides caninos congelados e oócitos homólogos 94

j) Efeito individual do cão 96

k) Considerações finais 97

11. Conclusões 99

12. Perspectivas 100

13. Referências bibliográficas 101

Anexos

Anexo 01: Procedimento para teste de interação entre espermatozóides e oócitos 123

Anexo 02:

Preparo das soluções utilizadas no teste de interação entre

espermatozóides e oócitos

125

Anexo 03: Preparo das soluções utilizadas na avaliaç

ão de integridade de

membrana espermática por microscopia de fluorescência

128

Anexo 04:

Convite para participar do prêmio concedido pelo Instituto Royan em

Tehran, Iran

129

Anexo 05: The potential for gramete recovery from non-

domestic canids and

felids

130

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% Porcentagem

ALH Amplitude lateral head

Ave. Avenue

BCF Beat cross frequency

BHT Hidroxi-tolueno butilado

BSA Bovine serum albumine (Albumina sérica bovina)

C1 Concentração inicial

C2 Concentração final

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CASA Computer Aidded Semen Analysis

C-FDA Diacetato de carboxi-fluoresceína

CLONE Cryogenics Laboratory of New England

cm Centímetros

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Cool Cooled semen

DMSO Dimetil-sulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

Ext Extended semen

FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Fr Fresh semen

Glyc Glycerolized semen

HOST Teste hipo-osmótico

HTR Hamilton Thorn Researcher

IA Inseminação artificial

IAIU Inseminação Artificial Intra-Uterina

IAIV Inseminação Artificial Intra-Vaginal

Km Kilometer

L Litro

LDL Low density lipoproteins (Lipoproteínas de baixa densidade)

LH Hormônio luteinizante

Lin Linearity

LRC Laboratório de Reprodução de Carnívoros

min Minutos

mL Mililitros

mm Milímetros

mOsm Miliosmol

ng Nanogramas

ºC Graus Celsius

P Probabilidade

PBS Phosphate buffer saline

pH Potencial hidrogeniônico

PI Iodeto de propídio

R Coeficiente de relação

REPAS Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e Silvestres

RIA Radio-imuno ensaio

s Segundos

SAS Statistical Analysis System

SD Standard deviation

SQA Semen quality analyzer

St. Standardized

STR Straightness

TEM Transmission Electronic Microscopy

THAM Trometamol

Thaw Frozen/thawed semen

TTR Teste de termorresistência

UECE Universidade Estadual do Ceará

UNESP Universidade Estadual Paulista

USA United States of America

V/V Volume / Volume

V:V Volume:Volume

V1 Volume inicial

V2 Volume final

VAP Velocity average pathway

VCL Velocity curvilinear

VSL Velocity straight line

µm Micrômetros

LISTA DE FIGURAS

Figuras

Pág.

Capítulo 01:

Fig. 1. Sperm motility of fresh (F), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-

supplemented (Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen, submitted to standardized

sperm concentration (St. concentration) or volume:volume extension (V:V

extension – P>0.05; Student’s t test). 43

Fig. 2. Sperm vigor of fresh (F), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-

supplemented (Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen, submitted to standardized

sperm concentration (St. concentration) or volume:volume extension (V:V

extension – P>0.05; Mann-Whitney’s test). 43

Capítulo 02:

Fig. 1. Progressive sperm motility of fresh (Fr), cooled (Cool) and frozen-thawed

(Thaw) semen submitted to glycerol addition at 27 or 4ºC (p > 0.05; Student’s t

test).

Capítulo 03:

Fig. 1: Oócito canino corado em Hoeschst 33258, apresentando espermatozóides

(seta branca) ligados à sua zona pelúcida.

Figura 2: Espermatozóides caninos corados com carboxifluoresceína/iodeto de

propídio, apresentando membrana plasmática intacta (corados em verde – seta

branca) e não-intacta (corados em vermelho ou parcialmente corados – seta preta),

visualizados por microscopia de fluorescência. 70

Capítulo 04:

Fig. 1: Fine-structural appearance of the head region of: A - slightly swollen

plasmalemma (p) above the acrosomal region in a fresh canine spermatozoon; and

the most common alterations observed in the head region of frozen canine

spermatozoa: B – swollen plasmalemma (p) and undulant outer acrosomal

membrane (am) and areas of vesiculation (arrow heads) in the acrosomal

membrane; C - swollen plasmalemma (p) and loss of electro-dense acrosomal

contents (arrows), 11500x; D – swollen (p) and ballooning (arrow heads)

plasmalemma and vesiculation (arrows) in the acrosomal membranes. 78

Fig. 2: Transmission electron micrographs of the midpiece region in canine

spermatozoa showing: A - longitudinal section illustrating intact plasmalemma (p),

mitochondrial sheath (ms) and axonem (ax) in fresh semen; B - sagital section

illustrating swollen plasmalemma (p) and normal mitochondrial sheath (ms) and

axonem (ax) in fresh semen; C- longitudinal section, and D -sagital section

demonstrating swollen plasmalemma (p) and abnormal appearance of

mitochondrial sheath (am), but intact axonem (ax), in frozen-thawed semen.

LISTA DE TABELAS

Tabelas

Pág.

Capítulo 01:

Table 1. Means and standard deviation of the characteristics of two ejaculates

obtained from donor stud dogs. 43

Table 2. Sperm motility of thawed canine semen submitted to standardized sperm

concentration or volume:volume extension and maintained at 38ºC for 30 minutes.

Table 3. Sperm vigor of thawed canine semen submitted to standardized sperm

concentration or volume:volume extension and maintained at 38ºC for 30 minutes.

Table 4. Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed semen

submitted to standardized sperm concentration or volume:volume extension.

Capítulo 02:

Table 1. Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine semen after

glycerol addition at 27 or 4ºC evaluated immediately after semen collection or

thawing and after 60 min, under dilution of one part semen to four parts extender

(1:4). 52

Table 2. Acrosomal status (%) of fresh and frozen-thawed canine semen after

glycerol addition at 27 or 4ºC evaluated immediately after semen collection or

thawing and after 60 min, under dilution of one part semen to four parts extender

(1:4). 52

Table 3. Progressive sperm motility (%) of fresh and frozen-thawed canine semen

after glycerol addition at 27 or 4ºC in the undiluted (1:0) and diluted one part

semen to four parts extender (1:4) samples, kept at 38ºC for 120 min. 53

Capítulo 03:

Table 1. Sperm motility patterns observed in canine frozen/thawed semen (n=10)

by Computer Aided Semen Analysis – CASA.

Table 2: Interactions among frozen-thawed canine sperm and homologue oocytes

after 18h incubation – Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted to

spermatozoa and number of spermatozoa bound, penetrated or interacted to

oocytes (n=10 canine frozen-thawed semen samples).

Capítulo 04:

Table 1. Sperm morphology analysis in fresh and frozen canine semen.

Table 2. Acrosomal integrity on canine fresh and frozen semen.

1. INTRODUÇÃO

Os canídeos são mamíferos caracterizados por dentes caninos pontiagudos, uma

dentição para o regime onívoro e um esqueleto dimensionado para a locomoção digitígrada. Os

canídeos do gênero Canis apareceram ao final da era terciária e adaptaram-se a diversos

ecossistemas. Estudos arqueológicos recentes têm mostrado que o cão foi a primeira companhia

não-humana dos homens (Morey, 1994), sendo um descendente direto do lobo cinzento (Wayne

e Vila, 2001). Os mais antigos esqueletos de cães foram descobertos cerca de 30.000 anos depois

do aparecimento do Homo sapiens sapiens, e foram encontrados sempre próximos aos

acampamentos humanos, recebendo por isso a denominação Canis familiaris (Grandjean e

Vaissaire, 2001). Desde então, o cão doméstico, universalmente conhecido como “o melhor

amigo do homem”, tem sido criado com diversos propósitos que incluem a caça, o pastoreio, a

companhia como animal de estimação, dentre outros.

A domesticação do cão pelo homem e sua manutenção como animal de estimação

determinaram, nessa espécie, um processo de seleção gradativo e contínuo. A valorização desse

processo ajudou a definir os diferentes padrões raciais hoje conhecidos (Rodrigues, 1997). Cada

raça canina possui um padrão específico, constituído por um conjunto de características físicas e

comportamentais que permitem ao animal desempenhar a função para qual a sua raça foi

desenvolvida. Neste sentido, o homem tem, constantemente, tentado promover o melhoramento

genético na criação de cães, para o qual faz uso de inúmeras ferramentas melhoradoras, dentre as

quais podem ser destacadas as biotécnicas reprodutivas.

Dentre todas as biotécnicas, aquela que, atualmente, oferece os maiores subsídios para

difusão de material genético na criação de cães é, sem dúvidas, a inseminação artificial em

intrínseca associação à tecnologia de sêmen (Silva, 2001). A possibilidade de utilização do

sêmen canino criopreservado abriu diversas fronteiras para a criação de cães, pois permite a troca

de material genético de alto valor zootécnico entre localidades distantes, bem como o

armazenamento desse material por períodos indefinidos (Linde-Forsberg e Forsberg, 1989).

Apesar de os primeiros estudos relacionados à inseminação artificial e conservação de

sêmen terem sido desenvolvidos, na espécie canina, por Lázaro Spallanzani ao final do século

XVIII (England, 1993), os estudos posteriores se concentraram, principalmente, na reprodução

daqueles animais que tinham um interesse produtivo para o homem, como bovinos, pequenos

ruminantes e suínos. Assim, após um longo vazio científico, em 1969, Seager obteve a primeira

gestação canina, utilizando o sêmen criopreservado. Desde então, inúmeros estudos relacionados

à reprodução canina têm sido conduzidos e, particularmente, nas últimas duas décadas, tem

crescido o interesse nessa espécie. Esse maior interesse atual é atribuído, principalmente, a uma

mudança conceitual dentro da medicina veterinária, onde a necessidade de especialização em

determinadas áreas tem aumentado a cada dia, haja vista uma maior requisição dos criadores

quanto a serviços especializados direcionados para seus animais de alto valor zootécnico ou

afetivo.

Diversas metodologias têm sido preconizadas para a criopreservação do sêmen canino.

Uma metodologia inicialmente desenvolvida para a conservação do sêmen caprino utilizando o

diluente à base de água de coco (Nunes et al., 1997) foi adaptada para a espécie canina

utilizando-se o diluente Tris em trabalhos anteriores (Silva et al., 1998; 2000; 2002cd; 2003).

Entretanto, são ainda necessários alguns ajustes que proporcionem uma maior praticidade ao uso

dessa metodologia, tais como a definição da temperatura de adição de glicerol e o estudo da

diluição do sêmen. Além disso, esses trabalhos anteriores se baseavam em resultados avaliados

apenas pela análise clássica da motilidade e morfologia espermática, sendo então aqui proposta a

aplicação de testes mais avançados, como a microscopia eletrônica, análise computadorizada e

teste de interação espermatozóides-oócitos.

No decorrer dos anos, diversos testes foram desenvolvidos para avaliar a qualidade das

amostras seminais nas diferentes espécies. Porém, apenas recentemente as relações entre os

mesmos estão sendo aos poucos desvendadas (Herrera et al., 2004; Quintero-Moreno et al.,

2004). Em cães, existe ainda uma carência de estudos acerca dessas relações, uma vez que seria

importante o conhecimento de um teste capaz de predizer a fertilidade in vitro e/ou in vivo de

uma amostra de sêmen.

A partir das informações apresentadas, segue-se uma revisão de literatura abordando

diversos temas ligados à criopreservação de sêmen canino e oferecendo embasamento para os

experimentos realizados nesta tese.

2. REVISÃO DE LITERATURA

a) Anátomo-fisiologia reprodutiva no macho canino

O sistema reprodutivo masculino é formado pelos testículos, epidídimos, vasos deferentes,

glândulas acessórias e o pênis. Os testículos produzem espermatozóides e testosterona, assim

como inibina, estrógeno e diversas proteínas. Os epidídimos proporcionam o ambiente para a

maturação final dos espermatozóides e servem como um órgão de armazenamento para essas

células. As glândulas acessórias produzem o plasma seminal e, no caso do cão, a única glândula

presente é a próstata. O pênis, que se encontra protegido pelo prepúcio, consiste no órgão

copulatório. Nos cães, o pênis possui algumas características peculiares como a presença de um

osso peniano em seu interior e de um bulbo de tecido esponjoso erétil, que proporciona o

“engate” com a fêmea durante a cópula (Getty, 1981, Johnston et al., 2001).

O desenvolvimento das gônadas e da espermatogênese no cão é similar ao que ocorre em

outros mamíferos. A diferenciação sexual ocorre entre os 27 e 34 dias após a concepção

(Johnston et al., 2001). A descida dos testículos ocorre entre duas e oito semanas após o

nascimento e, por volta das 16 semanas, as células de Sertoli e as espermatogônias, que se

multiplicam durante toda a vida, já estão presentes nos túbulos seminíferos (Kawakami et al.,

1991). Os espermatócitos e as espermátides são apenas observados após 20 e 22 semanas,

respectivamente. Já os espermatozóides, podem estar presentes nos túbulos seminíferos após 26

semanas e, nos epidídimos, após 32 semanas (Mialot et al., 1985a).

A espermatogênese é o processo pelo qual uma espermatogônia diplóide origina quatro

células espermáticas haplóides. Esse processo é desencadeado nos túbulos seminíferos do

testículo, a partir do início da puberdade no macho. No cão, a espermatogênese tem duração de

oito a nove semanas, podendo ser observados 4,5 ciclos epiteliais nos túbulos seminíferos. A

duração do ciclo do epitélio seminífero no cão é de 13,8 dias, sendo dividido em oito estágios.

Já o trânsito espermático ao longo do epidídimo é de 14 dias (Foote et al., 1972).

A puberdade no cão ocorre entre os nove e doze meses de idade, sendo marcada pelo

aparecimento dos primeiros espermatozóides no ejaculado. Entretanto, alguns cães podem ser

férteis mesmo aos seis meses (Christhiansen, 1988). A qualidade do sêmen melhora à medida

que a maturidade sexual é atingida. O macho canino parece não apresentar influência da

estacionalidade e é capaz de manter sua espermatogênese e a função testicular ao longo de todo

o ano (Taha et al., 1981; Martins, 2005).

Segundo Olar et al. (1983), a produção diária de espermatozóides no cão está entre 11,7 e

16,7 milhões de espermatozóides por grama de parênquima testicular. Esses mesmos autores

sugeriram que a freqüência de ejaculação não afeta a produção diária de espermatozóides, mas

pode reduzir as reservas localizadas na cauda do epidídimo e ducto deferente em até 26% após

seis a oito coletas de sêmen semanais. Em adição, Johnston et al. (2001) consideram que a

concentração espermática normal para a espécie canina deva ser superior a 200 x 10

espermatozóides/mL.

b) O espermatozóide canino

O espermatozóide ou gameta masculino é uma célula altamente diferenciada e polarizada

(Rodriguez-Martinez et al., 1993). Sua função na propagação genética é estabelecida através da

penetração e conseqüente fecundação do gameta feminino (Rodrigues, 1997).

Foi Leeuwenhoek, em 1679, quem primeiro descreveu o espermatozóide canino (Oetttlé,

1993). Mais tarde, com o desenvolvimento da microscopia, no século XIX, foi possível

identificar as diferenças morfológicas específicas dos espermatozóides entre as diferentes

espécies animais (Rodrigues, 1997). Segundo Bedford e Hoskins (1990), a diversificação

morfológica espermática nas diferentes espécies animais poderia estar relacionada às suas

respectivas formas de fecundação.

A célula espermática canina tem um comprimento total de 61,4 ± 0,3 µm, comprimento de

cabeça 6,1 ± 0,04 µm, com largura de 3,8 ± 0,2 µm. A peça intermediária mede 10,1 ± 0,7 µm e

a cauda em torno de 50 µm. A cabeça espermática é primariamente formada pelo DNA que

compõe o núcleo e é recoberta, anteriormente, pelo acrossoma e posteriormente pelo envoltório

pós-nuclear (Bartlett, 1962; Woodall and Johnstone, 1988). Segundo Dahlbon et al. (1997),

existem marcadas diferenças entre indivíduos, com relação à morfometria da cabeça

espermática na espécie canina.

O modelo básico da estrutura da membrana plasmática das células espermáticas segue a

organização estrutural de uma bicamada de duplo folheto com fosfolipídios e proteínas

associadas (Watson, 1995). Nos espermatozóides, o duplo folheto não é simplesmente uma

bicamada passiva de membrana lipídica em que receptores recebem seus sinais moleculares

específicos. Ele atua também como uma estrutura altamente especializada, assumindo um papel

ativo na capacidade fertilizante, recebendo sinais e modificando-se ao longo do processo da

espermatogênese, trânsito e armazenagem no epidídimo, ejaculação, depósito no trato genital

feminino e, finalmente, capacitação e penetração do oócito (Watson, 1995; Cunha, 2002).

Segundo Bouchard et al. (1990), a membrana plasmática do espermatozóide canino

apresenta uma baixa proporção de ácidos graxos poli-insaturados em relação aos saturados.

Essa particularidade seria o fator responsável pelo espermatozóide canino exibir uma

resistência própria contra o choque térmico, uma vez que as células espermáticas do cão

apresentam baixa sensibilidade às oscilações de temperatura.

c) Histórico da criopreservação de sêmen canino

Em 1776, Spallanzani observou que uma redução na temperatura diminuía reversivelmente

a atividade metabólica do espermatozóide, possibilitando assim a sua armazenagem (England,

1993). Com a descoberta acidental da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al. (1949),

iniciou-se uma era de extenso desenvolvimento de metodologias de criopreservação de células

espermáticas em diversas espécies, com o primeiro sucesso na congelação do sêmen canino

notificado por Rowson em 1954 (England, 1993). Em 1969, Seager obteve a primeira gestação

canina, utilizando o sêmen criopreservado. Atualmente, na maioria das notificações científicas

(Rota et al., 1999; Tsutsui et al., 2000), a gestação tem sido alcançada utilizando-se um diluente

à base de Tris-gema-glicerol.

No Brasil, a primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen

canino congelado foi realizada a pouco mais de 20 anos, tendo sido obtida uma ninhada de seis

cães normais da raça Boxer (Vaske et al., 1981). Desde então, inúmeros trabalhos vêm sendo

realizados a respeito do processamento de sêmen canino. Uma segunda gestação oriunda de IA

com sêmen canino congelado veio a ser confirmada por ultrassonografia em 2000 através de um

trabalho realizado pelo Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC) da Universidade

Estadual do Ceará (UECE - Silva et al., 2001), porém a cadela abortou devido à infecção por

Erlichia canis e Leishmania chagasi. Recentemente, Santos (2004) apresentou resultados de

70% de nascimentos após inseminação artificial com sêmen congelado e diluído em Tris.

d) O diluente Tris

O sêmen apropriadamente diluído pode ser congelado por tempo indeterminado,

permanecendo potencialmente fecundante quando reaquecido e utilizado em uma IA. Desse

modo, faz-se necessário o uso de um bom diluente, o qual deve conter nutrientes como uma

reserva de energia, servir como tampão ajustando as alterações do pH; promover uma pressão

osmótica e concentração de eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos; proteger as células contra

o choque térmico durante o processo de resfriamento e possuir crioprotetores que reduzam os

danos às células espermáticas durante a congelação e posterior descongelação (Concannon e

Battista, 1989).

Os primeiros experimentos para a preservação do sêmen canino por períodos curtos ou

longos iniciaram-se com uma adaptação empírica de diluentes usados para o resfriamento e

congelação do sêmen bovino com o uso dos tampões à base de citrato (Harrop, 1962), leite

desnatado (Martin, 1963); cloreto de fosfato (Wales e White, 1963), Tris (Foote, 1964; Gill et

al., 1970) e lactose (Seager, 1969). A maioria dos grupos de pesquisa da atualidade tem utilizado

o diluente Tris, o qual tem se mostrado superior a outros diluentes (Farstad, 1996; Silva et al.,

2000).

O Tris (Tris-hidroximetil-aminometano - H

NC(CH

OH)

) é uma substância facilmente

solúvel em água, e disponível comercialmente em um alto grau de pureza na forma de cristais.

Ele permanece estável em temperatura ambiente por diversos meses e é conhecido por não inibir

diversos sistemas enzimáticos (Bates, 1962). Ele atua como tampão iônico bipolar em pH entre

7,0 e 9,0 (McPhail e Goodman, 1984).

O tampão Tris tem sido utilizado em medicina recebendo a denominação de Trometamol

(THAM), tanto como uma alternativa ao bicarbonato de sódio como em associação com o

mesmo, para combater a acidose metabólica, uma vez que o Tris se difunde facilmente através de

espaços intracelulares (Sirieix et al., 1997; Kallet et al., 2000). Em pesquisas de biologia

molecular, foi demonstrado que o Tris pode ser utilizado como estabilizador de pH de diversas

reações (Bates, 1962), bem como na realização da eletroforese (Sendroy Jr et al., 1962).

Sabe-se que a atividade metabólica do espermatozóide resulta na formação de íons H+,

que poderiam levar à acidificação do meio. Desse modo, é necessário um mecanismo para a

remoção desses íons, visto que a diminuição de pH poderia levar a uma redução da longevidade

e da capacidade fertilizante da célula espermática (England, 1985). Nesse sentido, Davis et al.

(1963) foram os primeiros a descrever a utilização do tampão Tris para a conservação do sêmen

de um mamífero, no caso, da espécie bovina. No ano seguinte, Foote (1964) adaptou o uso do

diluente à base de tampão Tris associado ao citrato para a preservação do sêmen na espécie

canina. Desde então, o Tris tornou-se o diluente mais utilizado para a congelação do sêmen

canino. De fato, Kober (1985 - apud Rodrigues, 1997) reportou que o Tris não apenas apresenta

atividade tamponante, mas que também atua na redução do metabolismo da frutose pela célula

espermática, contribuindo assim para a preservação de sua energia.

Para o preparo do diluente Tris, usualmente, realiza-se a adição de uma hexose

(C6H12O6), como uma fonte exógena de substrato energético para o espermatozóide (England,

1993). A célula espermática dos mamíferos é capaz de obter a energia necessária para a

manutenção de sua motilidade através da via glicolítica ou do ciclo de Krebs (Rigau et al., 2002).

Sabe-se que o plasma seminal da espécie canina, normalmente, não possui grandes quantidades

dos açúcares frutose e glicose (Rigau et al., 2001). Entretanto, estes são os açúcares mais

comumente utilizados para o preparo do diluente Tris (Silva et al., 2002c; Martins, 2005). Rigau

et al. (2001) demonstraram que esses açúcares atuam em mecanismos diferentes na célula

espermática, sendo que a frutose lhe confere uma motilidade mais rápida e linear.

Posteriormente, os mesmos autores (Rigau et al., 2002) demonstraram que a frutose parece ser

mais sensível à atividade da enzima hexoquinase, apresentando assim um efeito mais

significativo sobre o metabolismo da célula espermática, quando comparada à glicose.

Silva et al. (2002c) congelaram o sêmen de cães na ausência de glicerol ou gema de ovo,

utilizando um diluente formado apenas por Tris-frutose-ácido cítrico, e demonstraram que 11%

dos espermatozóides foram capazes de apresentar motilidade após a descongelação. Esses

autores atribuíram a sobrevivência desses espermatozóides a uma ação crioprotetora da frutose,

sugerindo que o aumento de sua concentração no meio poderia possivelmente levar a melhores

resultados pós-descongelação. Finalmente, vale salientar que todos os derivados de açúcares

que participam da via glicolítica são isômeros D (Nelson e Cox, 2000). Desse modo, na

composição do diluente à base de Tris, sugere-se o uso da D-frutose (Silva et al., 2002c).

O ácido cítrico (ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxílico - C

) é outra substância

que entra na composição do diluente Tris (Silva et al., 2002c). Ele é um ácido fraco inorgânico,

facilmente encontrado nos citrinos, ou seja, nos frutos cítricos. Em temperatura ambiente, ele

apresenta-se como um pó cristalino branco, podendo existir na forma anidra ou na

monohidratada, a qual apresenta uma molécula de água para cada molécula de ácido cítrico

(Wikipedia, 2005). No caso do diluente Tris, a forma utilizada é a monohidratada (Silva et al.,

2002c). Por sua conhecida ação anti-oxidante, o ácido cítrico tem sido utilizado como um

conservante natural. Em bioquímica, é marcada a sua atuação no ciclo de Krebs, importante via

da respiração celular que ocorre nas mitocôndrias. Além disso, em algumas soluções, o ácido

cítrico é capaz de servir como doador de prótons, produzindo o citrato, que é largamente

conhecido por atuar na estabilização de pH (Wikipedia, 2005). Assim, é provável que o ácido

cítrico contribua para a preservação da célula espermática auxiliando na manutenção do pH do

diluente e atuando como anti-oxidante, bem como no mecanismo de respiração celular.

e) A gema de ovo

A gema de ovo de galinha tem sido adicionada ao tampão Tris por proteger a membrana

plasmática, restaurando os fosfolipídios perdidos durante o choque térmico oriundo da mudança

de temperatura que ocorre durante o resfriamento inicial do sêmen (Watson e Plummer, 1985;

Hammerstedt et al., 1990). Acredita-se que essa proteção possa ser devido à presença de uma

lipoproteína chamada fosfatidilcolina. Durante o choque térmico, as lipoproteínas interagem com

a estrutura lipídica da membrana plasmática das células espermáticas e propiciam a proteção.

(Bouchard et al., 1990). Segundo Foulkes (1977), a gema de ovo previne também a liberação da

enzima hialuronidase pela célula espermática.

Para a preservação do sêmen canino, uma variedade de concentrações de gema de ovo

tem sido utilizada. Visto que a mesma também tem uma capacidade de tampão, sua quantidade

no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do diluente

(Farstad, 1996). Nesse contexto, a maioria dos autores utiliza concentrações de gema em torno

de 20% no diluente (Farstad e Andersen-Berg, 1989; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Silva,

2001; Martins, 2005).

Moura (2000) comparou as gemas de ovo de galinha e codorna como protetores de

resfriamento na congelação do sêmen de cães e observou não existirem diferenças entre as

mesmas quanto à conservação da motilidade, vigor e morfologia espermática após a

descongelação. Assim, é sugestivo que a gema de ovo de codorna, que é bastante rica em ácido

ascórbico e outras vitaminas, possa também ser utilizada na congelação do sêmen canino.

Apesar de seus efeitos benéficos, a gema apresenta alguns inconvenientes, como a

possibilidade de transmissão de doenças (Silva et al, 2002c). Além disso, ela facilita o processo

de oxidação sobre os espermatozóides caninos, podendo promover a peroxidação dos lipídios

insaturados, à qual o espermatozóide canino é bastante sensível (Davies, 1982 apud Rodrigues,

1997). Por essas razões, pesquisas visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e

purificados foram conduzidas e observaram que os análogos do hidroxitolueno butilado (BHT)

são interessantes substitutos para a gema, por também protegerem a membrana plasmática da

injúria do choque térmico (Farstad, 1996). Além disso, foram também conduzidas pesquisas na

ausência da gema de ovo, onde se utilizando um diluente composto pelo tampão Tris acrescido

apenas de glicerol, foi verificada uma motilidade espermática pós-descongelação de 35% (Silva

et al., 2002c).

Diversos autores propuseram que a fração de baixa densidade da gema de ovo,

principalmente composta por lipoproteínas de baixa densidade (LDL), seria a principal

responsável pela proteção que a gema de ovo confere às células espermáticas (Folkes, 1977;

Graham e Foote, 1987). Esses autores sugerem que as LDL aderem às membranas celulares

durante os procedimentos de congelação e descongelação e conferem proteção a essas

membranas. Entretanto, a maneira como isso ocorre permanece por ser elucidada. Estudos

recentes mostraram ser possível a purificação das LDL, permitindo sua utilização em

substituição à gema de ovo integral (Moussa et al., 2002). Varela Jr. et al. (2004) avaliaram o

efeito de diferentes concentrações de LDL purificada adicionada ao diluente Tris para a

refrigeração do sêmen do cão a 5ºC e observaram que concentrações entre 6 e 10% de LDL são

tão eficientes quanto o uso de 20% de gema de ovo integral. Entretanto, a literatura ainda é

escassa de informações quanto ao uso das LDL na tecnologia de sêmen de cães.

Além de sua ação em proteger a membrana espermática, a gema de ovo é também

conhecida por servir como uma fonte protéica para o diluente (Santos, 2004). Outras substâncias

têm sido também utilizadas com este mesmo propósito, tais como o leite desnatado (Rota et al.,

2001) e a albumina sérica bovina – BSA (Rodrigues, 1997; Sirivaidiapong et al., 2000; Santos,

2004).

Já foi também descrita a incorporação de detergentes derivados do dodecil sulfato de

sódio (SDS) ao diluente Tris, tais como o Equex STM (Peña, 2000) e o Orvus ES (Tsutsui et al.,

2000). Segundo Peña (2000), o SDS é um detergente aniônico do grupo alquil, cujo efeito

protetor sobre a célula espermática não está ainda totalmente compreendido. Porém, acredita-se

que ele solubilize as lipoproteínas da gema de ovo e aumente deste modo seu potencial de

proteção à célula espermática. Esse mesmo autor alertou ainda para o fato de que uma exposição

prolongada dos espermatozóides ao SDS poderia conferir um excesso de fluidez à sua membrana

plasmática.

f) O glicerol

Para se obter sucesso com a criopreservação de sêmen, faz-se necessária a adição de

substâncias denominadas crioprotetores, cuja presença é capaz de melhorar a sobrevivência

celular após os processos de congelação e descongelação. Os agentes crioprotetores pertencem a

dois grupos: 1) aqueles que penetram nas células, como o glicerol, o dimetilsulfóxido (DMSO), o

etileno-glicol e o metanol; 2) aqueles que permanecem no meio extracelular, como as proteínas,

os açúcares e o polivinil-pirrolidona (England, 1993).

O glicerol (CH

), um álcool polihídrico altamente permeável, é o crioprotetor mais

empregado na congelação de sêmen nas diferentes espécies (Silva et al., 2003). Esta substância

possui a capacidade de penetrar através das membranas celulares. Parks e Graham (1992)

sugeriram que o glicerol penetra a célula através da difusão passiva, permanecendo tanto na

membrana quanto no citoplasma. Graham (1996) verificou que a difusão do glicerol é de 30 a 60

vezes mais lenta que a da água. Nas espermátides de ratos foi identificada a presença de um

canal protéico específico para a penetração do glicerol, denominado Aquaporina 7 (Ishibashi et

al., 1997), o qual se acredita existir também em células espermáticas das demais espécies, haja

vista a grande similaridade entre as mesmas.

Apesar da larga utilização, o mecanismo de ação do glicerol no interior da célula não está

ainda totalmente elucidado (Curry, 2000). Sabe-se que o mesmo inicialmente ocasiona um

estresse osmótico à célula espermática, impedindo a formação de grandes cristais de gelo

intracelulares (Watson, 2000). Os efeitos protetores do glicerol são representados por suas

propriedades coligativas, pela diminuição do ponto de congelamento e pela conseqüente redução

das concentrações de eletrólitos na fração não-congelada da amostra (Lovelock e Polge, 1954).

McLaughin et al. (1992), Curry (2000) e Holt (2000) reportaram que o glicerol exerce

efeitos tóxicos sobre os espermatozóides, como alterações físico-químicas que podem levar à

ruptura da membrana plasmática, à remoção de importantes proteínas membranárias, ou originar

danos acrossomais. O glicerol pode ainda contribuir para a alteração das propriedades da

membrana celular através da indução de modificações na estabilidade da sua estrutura lipídica e

de alterações na sua permeabilidade à água. A fusogenicidade da membrana e sua resposta ao

sinal de transdução poderiam ser também afetadas, contribuindo para a redução da longevidade e

aceleração da capacitação espermática (Watson, 1995).

Para Watson (1979), a concentração ideal de glicerol no diluente seria aquela em que há

uma predominância de seus efeitos protetores sobre os efeitos tóxicos. Essa concentração pode

ser influenciada por outros componentes do diluente, pelo padrão de resfriamento e pelos

métodos de congelação e descongelação. No entanto, os principais fatores determinantes seriam

ainda as características seminais de cada espécie.

Vários pesquisadores sugerem o uso de concentrações finais de glicerol entre 2 e 16%

para a criopreservação do sêmen canino, dependendo da composição do diluente utilizado.

Ravaszova et al. (1996) testaram o efeito de 4, 6 e 8% de glicerol no diluente à base de Tris e

observaram que as concentrações de 4 e 6 % de glicerol são as mais apropriadas em preservar a

motilidade e o vigor espermático. Do mesmo modo, Silva et al. (2002d) testaram as

concentrações de 4, 6 e 8% de glicerol para a congelação do sêmen canino e verificaram que a

morfologia espermática era melhor preservada, quando utilizada a concentração de 6%.

O efeito da temperatura de adição de glicerol tem sido investigado em estudos de

criopreservação do sêmen canino. Os agentes crioprotetores penetrantes, particularmente o

glicerol, protegem a célula da crioinjúria durante a fase de cristalização que ocorre entre -6

e -

C. Dessa forma, não pareceria ser lógico adicionar o glicerol a temperaturas superiores a

C (Colas, 1975). No entanto, Andersen (1975) realizou a adição de um diluente glicerolizado

ao sêmen a 37

C e obteve bons resultados após inseminação artificial. Já Peña et al. (1998) não

encontraram diferenças entre a adição de glicerol ao sêmen a 37° ou a 4°C. Em todo caso, existe

ainda uma carência de estudos conclusivos com relação à temperatura ideal para a adição do

glicerol ao sêmen do cão.

No tocante à forma de adição, Fontbonne e Badinand (1993b) não verificaram diferenças

na qualidade do sêmen canino após a descongelação entre a adição do glicerol de uma única vez

em relação à adição fracionada, tanto à temperatura ambiente (25

C) quanto a 5°C. Ademais,

Silva et al. (2003) compararam a adição única e fracionada do glicerol ao sêmen, na temperatura

de 4ºC e não observaram diferenças entre as mesmas.

Tal qual em outras espécies, a ausência de glicerol durante a criopreservação do sêmen

canino resulta em uma significativa redução na sobrevivência após a descongelação. Olar et al.

(1989) verificaram que a motilidade estimada do espermatozóide após a descongelação em

diferentes diluentes na ausência de glicerol fica em torno de 11%. Já Silva et al. (2002c)

obtiveram motilidade de 20% no uso do diluente Tris acrescido apenas de gema de ovo, o que

comprova a necessidade da adição do glicerol.

g) Métodos de congelação e descongelação de sêmen canino

Diversas metodologias têm sido descritas para a congelação do sêmen de cães e variam

de acordo com o diluente, protetores de resfriamento e agentes crioprotetores empregados,

preconizando o uso de diferentes velocidades de congelação. Em todas elas, busca-se minimizar

o dano causado ao espermatozóide pelo processamento, visando recuperar um máximo possível

de espermatozóides viáveis (Strom et al., 1997).

Dentre os diversos métodos existentes, o mais usual é o descrito por Andersen (1975).

Neste método, foi realizada a diluição do sêmen a 37ºC em Tris acrescido de gema de ovo e

glicerol. Em seguida, foi procedido um período de equilíbrio de três horas, seguido do envase

em palhetas plásticas e a exposição aos vapores de nitrogênio para congelação. Atualmente, esse

método tem servido como base para inúmeros trabalhos onde têm sido realizadas pequenas

modificações, alcançado excelentes resultados in vitro (Strom et al., 1997) e in vivo (Fergunson

et al., 1989; Linde-Forsberg et al., 1999; Rota et al., 1999; Tsutsui et al., 2000).

O método CLONE foi desenvolvido para aplicação comercial pelo Cryogenic

Laboratories of New England, Inc. (CLONE) e tem sido utilizado desde 1983. Ele consiste na

diluição do sêmen à temperatura ambiente em um diluente denominado Clone A. Procede-se

então o período de equilíbrio de uma hora, a adição do diluente Clone B, o envase e a exposição

aos vapores de nitrogênio. Esse método tem também proporcionado motilidade pós-

descongelação em torno de 70% (Strom et al., 1997) e taxas de concepção em torno de 86,4%

após inseminação (Govette et al., 1996).

Em 2000, Silva et al. adaptaram a metodologia de congelação do sêmen de caprinos

com o diluente à base de água de coco (Nunes et al., 1997) para a congelação do sêmen de cães

com o diluente Tris. Estes autores observaram que este método é de grande praticidade e é mais

rápido que o método de Andersen, por não requerer um tempo de equilíbrio após a adição de

glicerol. No decorrer dos anos, diversos ajustes foram realizados nessa metodologia, tais como a

determinação da concentração ideal de glicerol no diluente (Silva et al., 2002d) e da forma ideal

para a adição do glicerol ao diluente (Silva et al., 2003). Entretanto, o ajuste final de alguns

detalhes, tais como a temperatura ideal para adição do glicerol, bem como a taxa de diluição

mais adequada, poderia conferir maior praticidade a esse método. Além disso, os testes

realizados com o sêmen descongelado após aplicação desse método até então se concentraram na

avaliação clássica do sêmen, sendo sugestiva a realização de análises mais sofisticadas.

De maneira análoga ao processo de congelação espermática, existem vários protocolos

preconizando diferentes temperaturas e velocidades de descongelação para o sêmen canino.

Badinand et al. (1993) descongelaram amostras de sêmen a 37

C por 45s e consideraram esse

método mais seguro, pois o tempo de permanência em temperaturas altas poderia ser crítico e de

influência letal sobre a viabilidade dos espermatozóides. Do mesmo modo, Silva et al. (1998)

sugerem que a temperatura de 37ºC por 60s promove uma menor porcentagem de alterações

morfológicas espermáticas do que a de 50ºC por 30s.

Por outro lado, Ivanova-Kicheva et al. (1995), comparando os processos de

descongelação a 37

C por 8s e 55

C por 5s, observaram que a motilidade espermática foi

melhor preservada a 55

C e sugeriram que a elevação da temperatura de descongelação reduz o

dano osmótico nas células, além de prevenir a formação de cristais. Além disso, Chirinéa (2004)

e Martins (2005) utilizaram um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e

obtiveram excelente qualidade espermática pós-descongelação. Usualmente, este processo é

realizado sob imersão em banho-maria a temperaturas que variam de 37

C (Linde-Forsberg,

1991) a 75

C (Olar et al., 1989).

h) Métodos de avaliação seminal

i) Análise da motilidade espermática: Segundo Derivaux (1980), a avaliação da

motilidade espermática é definida como o percentual de espermatozóides móveis em uma

amostra e sua intensidade de movimento. Embora a relação entre a motilidade e a capacidade

fecundante do espermatozóide canino não esteja totalmente elucidada, atualmente, a maioria dos

pesquisadores ainda utiliza a motilidade como o principal parâmetro para a avaliação de

diluentes, crioprotetores e técnicas de criopreservação de sêmen canino (Ivanova-Kicheva et al.,

1997; Silva et al., 2003). Seager e Fletcher (1972) ressaltam que a avaliação da motilidade

espermática deve ser avaliada imediatamente após a coleta ou descongelação do sêmen, com o

auxílio da microscopia óptica. Em seguida, deve-se avaliar o status da motilidade ou vigor

espermático, que é a qualidade da motilidade exibida pelos espermatozóides móveis. Para tanto,

faz-se uso de escalas que vão de 0 a 5, cujas classificações variam conforme o autor (Herman e

Swanson, 1941; Platz e Seager, 1977; Christhiansen, 1988).

Nothling et. al. (1997) observaram que a taxa de implantação em cadelas inseminadas

com sêmen congelado estaria correlacionada positivamente com o número de espermatozóides

móveis após a descongelação, sendo que a motilidade apresentaria então um melhor indicativo

de fertilidade do que a verificação da morfologia e da integridade do acrossoma. No entanto,

esses autores ressaltam que, além da qualidade seminal, fatores como a detecção do momento

ideal para a realização da inseminação, podem também influenciar nos resultados de fertilidade.

Apesar da larga utilização, a motilidade espermática não é um parâmetro totalmente

confiável para se predizer a capacidade fecundante de uma amostra de sêmen. A presença de

espermatozóides imóveis não implica que os mesmos estejam mortos. Em outras espécies já

foi comprovada a presença de espermatozóides estruturalmente intactos, porém imóveis, após a

descongelação (Janukauskas et al., 1995), sendo que os mesmos poderiam voltar a apresentar

movimento através da adição de substâncias estimulantes, tais como a cafeína (Larsson e

Einarsson, 1976). Por outro lado, espermatozóides que apresentem uma motilidade de boa

qualidade após a descongelação podem ser incapazes de fertilizar um oócito caso apresentem

danos acrossomais (Strom et al., 1997).

Apesar da avaliação da motilidade espermática não poder ser usada como uma

mensuração dos espermatozóides vivos e mortos na amostra, ela fornece a informação de um

fator que é necessário para a capacidade fertilizante do espermatozóide, pois a motilidade é a

manifestação da sua competência estrutural e funcional (Peña Martinez, 2004). Embora na

espécie canina já tenham sido realizados estudos que mostrem que a motilidade está geralmente

relacionada à integridade de membrana plasmática (Kumi-Diaka, 1993) e à morfologia

(Ellington et al., 1993), a existência de correlações entre motilidade espermática e fertilidade in

vitro ou in vivo permanece por ser melhor esclarecida. E, mesmo em outras espécies, essas

relações entre motilidade e fertilidade são ainda bastante conflitantes (Sanchez-Partida et al.,

1999; Tardif et al., 1999).

ii) Análise computadorizada: A análise computadorizada (CASA) foi proposta pra

suplantar o obstáculo de subjetividade nas análises de sêmen e vem sendo utilizada em diversas

espécies animais, incluindo o cão (Iguer-Ouada and Verstegen, 2001). Segundo Rijsselaere et al.

(2005), os resultados de motilidade verificados através da CASA estariam correlacionados aos

avaliados subjetivamente pela microscopia óptica.

Para a aplicação da CASA, já foi descrito o uso de diversos aparelhos. Dentre estes,

podem ser destacados o Hamilton Thorn (HTR analyzer, Hamilton Thorn Research, Berverly,

EUA – Iguer-Ouada, 2001), o Cell Soft Computer Videomicrography System (Cryo Resources

Ltd, Nova York, EUA – Gunzel-Apel et al., 1993), o SM-Cell Motion Analysis (Stroemberg-

Mika, Bad Feilnbach, Alemanha – Gunzel Apel t al., 1993) e o Sperm Quality Analyser (SQA II,

Medical Electronic Systems LTD. Tirat Carmel, Israel – Rijsselaere et al., 2002).

Günzel-Apel et al. (1993) foram os primeiros a descrever a análise do sêmen canino com

a CASA. Essa análise permite uma avaliação objetiva e precisa não somente sobre a proporção

de células móveis em uma amostra de sêmen, mas também sobre a qualidade do movimento

das mesmas. As trajetórias do espermatozóide, individualmente, são determinadas pela função

flagelar, onde características como velocidade, freqüência de batimento flagelar e amplitude irão

corretamente refletir a condição fisiológica de cada célula (Peña, 2000). Os dados obtidos através

desse método correspondem a centenas de mensurações espermáticas individuais, fornecendo

informações sobre a qualidade média da motilidade em uma amostra de sêmen (Günzel-apel et

al., 1993) e também sobre diferentes subpopulações espermáticas coexistindo na amostra (Peña

Martínez, 2004).

A CASA permite ainda uma análise morfométrica dos espermatozóides,

proporcionando análises das dimensões da célula espermática e avaliação de sua morfologia.

Rijsselaere et al. (2004) adaptou o Metrix Oval Head Morphology Software (Metrix) para uso no

Hamilton Thorn, e validou os parâmetros de dimensão e morfologia espermática para o cão.

Entretanto, esses mesmos autores citam que esses dados morfométricos são ainda de difícil

interpretação, uma vez que Dahlbon et al. (1997) comprovaram que existem marcadas diferenças

individuais entre os cães com relação à morfometria de suas células espermáticas.

iii) Teste de termorresistência: Esse teste corresponde à verificação in vitro da

longevidade espermática através de repetidas observações da motilidade pós-descongelação em

tempos variados durante a incubação em temperaturas similares à uterina. Acredita-se que o

mesmo possa ser considerado um indicador razoável da fertilidade, visto que parcialmente

mimetizaria uma situação in vivo (Peña et al., 1998). Strom et al. (1997) reportam que o teste de

termorresistência (TTR) tem sido mostrado como um teste laboratorial seguro para predizer o

potencial fertilizante do sêmen humano e que, tal qual na espécie suína, poderia dar uma melhor

indicação da capacidade fertilizante do espermatozóide canino do que a simples estimação da

motilidade espermática imediatamente após a descongelação. Associado a esses fatos, na espécie

bovina, o teste de termorresistência confere uma melhor estimativa da fertilidade do que a

simples estimação imediata da motilidade após a descongelação (Larsson e Einarsson, 1976).

Entretanto, Concannon e Battista (1989) sugerem que a termorresistência espermática após

a descongelação na espécie canina seja inferior à das outras espécies e que o teste de

termorresistência deve ser utilizado apenas para a avaliação de técnicas de congelação. Em

adição, Olar (1984) sugere que a avaliação da motilidade imediatamente após a descongelação

pode ser mais importante do que a sobrevivência espermática após um longo período de

incubação.

Silva (2001) afirma ser necessário um rigoroso controle da temperatura de incubação para

a realização desse teste, uma vez que estes autores incubaram o sêmen canino descongelado em

temperaturas que oscilavam entre 37 e 39 °C e verificaram uma motilidade espermática de

apenas 2,5% após 120 minutos. Já Strom et al. (1997) reportaram uma motilidade de 22% para o

sêmen descongelado após 180 minutos, no uso do mesmo diluente, sendo, porém mantido a uma

temperatura fixa de 37 °C. Por outro lado, mesmo no uso de uma temperatura fixa de 39 °C,

Peña et al. (1998) obtiveram apenas 6,8% de motilidade após 4 horas de incubação no uso do

mesmo diluente. Em adição, Peña e Linde-Forsberg (2000b) observaram que a adição da pasta

Equex STM ao diluente Tris melhorava consideravelmente os resultados de termorresistência,

sendo verificados 20% de espermatozóides móveis decorridas 7 horas da descongelação.

Strom et al. (1997) afirmam que uma baixa termorresistência não estaria necessariamente

associada com baixa fertilidade na espécie canina. Esses autores encontraram alta porcentagem

de motilidade espermática após a descongelação (74%), mas obtiveram baixa termorresistência

(20% após uma hora de incubação a 37 °C) ao utilizar um método comercial para a congelação

do sêmen de cães. Entretanto, após inseminação artificial por via intra-uterina, foi obtida uma

taxa de 85% de fertilidade. Assim, a existência de uma correlação entre longevidade espermática

após a descongelação e as taxas de fertilidade in vivo em cães merece ainda maiores estudos.

iv) Avaliação da morfologia espermática: Um outro parâmetro importante a ser avaliado

é a morfologia espermática. Até o momento, ainda não foi descrita a evidência de uma relação

entre a morfologia espermática e a fertilidade no cão. Os poucos trabalhos que evidenciam uma

possível relação ainda são conflitantes (Oettlé e Soley, 1985; Renton et al., 1986; Plummer et al.,

1987). Oettlé (1993) relata que à medida que o percentual de espermatozóides anormais

aumenta, a fertilidade é reduzida, sendo observado que quando a proporção de espermatozóides

morfologicamente normais está abaixo de 60%, a fertilidade é adversamente afetada.

Para possibilitar a avaliação da morfologia espermática, pode-se fazer uso de diversos

corantes, tais como: Eosina-Nigrosina (Dott e Foster, 1972), Spermac (Oettlé, 1993), Rosa de

Bengala (Rodrigues, 1997), Giemsa (Cardoso et al., 2003), Hematoxilina-Eosina (Silva et al.,

2003). Segundo Dott e Foster (1972), a coloração de Eosina-Nigrosina permitiria a distinção de

espermatozóides vivos e mortos, uma vez que a Nigrosina ofereceria um plano de fundo para a

distinção entre células eosinofílicas e não-eosinofílicas, que representariam os espermatozóides

mortos e vivos, respectivamente.

O corante Rosa de Bengala (Rodrigues, 1997) permite não apenas a visualização da

morfologia espermática, mas também a avaliação da integridade do acrossoma. O acrossoma é

uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas incluindo pró-acrosina, hialuronidase,

esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de fecundação (Hafez, 1995),

desempenhando um papel crucial na função espermática. Sirivaidyapong et al. (2000) relataram

que além da observação da motilidade, deve também ser avaliada a integridade do acrossoma,

uma vez que a composição de diversos diluentes para o sêmen do cão, incluindo aqueles

baseados em Tris, promoveriam um aumento na incidência de reação acrossômica ao final dos

processos de congelação e descongelação.

Diversas classificações foram propostas para a morfologia espermática. Seager (1986)

sugere a classificação das alterações morfológicas espermáticas como: primárias, quando

relacionadas a problemas oriundos da produção espermática no testículo; ou secundárias, quando

relacionadas aos problemas causados durante a maturação espermática no epidídimo, ou

oriundas dos processos de manipulação do sêmen, como diluição, resfriamento, congelação ou

descongelação. Oettlé (1993) sugere a classificação de acordo com os danos que as alterações

causam à função espermática, nomeando tais alterações como defeitos maiores ou menores. Já

outros autores preferem classificar as alterações de acordo com a região espermática afetada,

sendo eles defeitos de cabeça, peça intermediária ou cauda (Silva et al., 2003).

v) Uso de sondas fluorescentes: A integridade de membrana plasmática não é importante

apenas para o metabolismo espermático, mas também para o sucesso da fertilização do oócito. A

coloração com sondas fluorescentes tem como objetivo avaliar a integridade estrutural da

membrana plasmática da célula espermática (Souza, 2003).

Em 1986, Garner et al descreveram o uso de duas substâncias fluorescentes: o diacetato de

carboxifluoresceína e o iodeto de propídio, para verificar a integridade de membrana de

espermatozóides de bovinos, através de um citômetro de fluxo. Posteriormente, Harrisson e

Vickers (1990) modificaram essa técnica e mostraram ser possível a observação da integridade

da membrana através da microscopia de fluorescência.

O diacetato de carboxifluorosceína (CFDA) é uma solução não fluorescente que penetra o

ambiente celular e é, rapidamente, convertida em carboxifluorosceína pelas esterases

intracelulares. A carboxifluorosceína é uma solução altamente fluorescente não permeável que é

mantida no meio intracelular na presença de uma membrana plasmática intacta, apresentando a

coloração verde. Por outro lado, o iodeto de propídio (PI) tem a capacidade de corar o DNA de

células que estão mortas ou têm sua membrana danificada, produzindo uma coloração vermelho

fluorescente quando excitada (Peña et al., 1998).

Existem diversos outros corantes fluorescentes utilizados para avaliar não apenas a

integridade da membrana plasmática, mas também os diversos estágios da reação acrossômica.

Dentre os mesmos, podem ser citados: o SYBR-14, o carboxi-SNARF, a calceína-AM associada

ao homodímero etídio, e o Hoeschst 33258 (Rijsselaere et al., 2005).

As colorações fluorescentes permitem a avaliação espermática tanto através da

microscopia de fluorescência, quanto da citometria de fluxo. A vantagem da citometria é a

possibilidade de contagem de um maior número de células e uma avaliação mais objetiva dos

parâmetros seminais. Em todo caso, Peña (2000) demonstrou haver uma alta correlação entre os

resultados avaliados por ambas as técnicas.

vi) Teste hiposmótico: A habilidade do espermatozóide bovino e humano em se alterar

na presença de meios hipotônicos foi demonstrada por Drevius e Eriksson (1966). Esses autores

observaram que esta resposta osmótica estava associada com o encurvamento e o enrolamento da

cauda dos espermatozóides e que o desenrolamento ocorria quando o espermatozóide retornava a

um meio isosmótico. Essas modificações foram largamente confirmadas por outros

pesquisadores (Foote e Bredderman, 1969; Mahi-Yanagimachi, 1976). Van Der Vem et al.

(1986) demonstraram que a resposta espermática às alterações osmóticas está relacionada à

presença de uma membrana celular funcional. Segundo Drevius e Eriksson (1966), o aumento no

volume sofrido pelo espermatozóide exposto a condições hiposmóticas ocorre com um mínimo

de aumento na sua área superficial. Assim, após a expansão da membrana plasmática da sua

cauda, os filamentos axiais flexíveis iniciam um processo de encurvamento ou enrolamento,

conferindo uma aparência mais esférica à célula espermática. Segundo Souza (2003), acredita-se

que a membrana plasmática da região da cabeça do espermatozóide tenha o mesmo

comportamento que a da cauda, porém não é possível essa observação pelo teste hipo-

osmótico (HOST).

O teste de incubação de espermatozóides em meios hipo-osmóticos tem sido

rotineiramente utilizado como uma análise laboratorial da integridade da membrana espermática

no sêmen humano, uma vez que existe uma correlação positiva entre a turgidez e o enrolamento

das caudas espermáticas como uma resposta às baixas pressões osmóticas e uma alta habilidade

fertilizante do sêmen correspondente (Jeyedran et al., 1992). Da mesma forma que na espécie

humana, em bovinos (Revell e Mrode, 1994) e em suínos (Perez-Llano et al.,2001) foi

demonstrado existir uma correlação positiva entre a porcentagem de células espermáticas que se

alteram em condições hiposmóticas e a fertilidade in vivo após inseminação artificial.

No espermatozóide canino, o choque hipo-osmótico induz um progressivo destacamento

de acrossomas, cuja membrana é uma estrutura muito lábil que pode ser alterada por processos

tais como a congelação, descongelação, resfriamento e diluição para inseminação artificial

(Oettlé, 1986). England e Plummer (1993) verificaram existir uma correlação negativa entre a

osmolaridade e a porcentagem de espermatozóides caninos edemaciados em soluções aquosas

hiposmóticas à base de sacarose, frutose e citrato de sódio. Além disso, esses pesquisadores

demonstraram não existir correlação entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados e

outros parâmetros seminais, tais como a motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e

mortos. Em 1999, Inamassu et al. observaram existir no sêmen canino fresco uma correlação

positiva entre a turgidez espermática em resposta ao HOST e a morfologia espermática.

Entretanto, a avaliação da existência de correlação dos resultados do HOST com a capacidade

fertilizante in vitro ou in vivo dos espermatozóides caninos frescos ou congelados permanece por

ser verificada.

vii) Avaliação da aparência ultra-estrutural espermática: Essa análise consiste em

uma avaliação morfológica profunda das estruturas que compõem a célula espermática, uma vez

que segundo Hammersted et al. (1990), é extremamente difícil detectar os danos celulares

associados à criopreservação. Assim, microanálises radiográficas possibilitam uma quantitativa

localização de elementos no ambiente intracelular, através da utilização da microscopia

eletrônica (Rodriguez-Martinez e Enkwall, 1989).

Burgos et al. (1970) realizaram um trabalho pioneiro ao avaliar, através da microscopia

eletrônica, as células espermáticas de gatos, porquinhos da índia, hamsters e ratos. Em humanos,

a integridade da membrana plasmática e acrossoma do espermatozóide congelado, avaliada

através da microscopia eletrônica, mostrou-se positivamente correlacionadas com a fertilidade

obtida após inseminação artificial (Mahadevan e Trounson, 1984).

Apesar dos avanços na microscopia eletrônica, existem poucos trabalhos apresentando

uma descrição sistemática da aparência estrutural fina do espermatozóide canino (Oettlé, 1993),

principalmente após os procedimentos de congelação e descongelação. Utilizando esse método,

Rodriguez-Martinez et al. (1993) observaram que o espermatozóide descongelado apresenta um

alto grau de danos acrossômicos, incluindo perda do conteúdo. Porém, eles verificaram que o

plasmalema aparentemente permanecia intacto na maioria dos casos. Esses autores sugeriram

que tal fato poderia ser a razão para a baixa porcentagem de anormalidades acrossômicas

normalmente notificadas quando se utilizava a microscopia de contraste de fase.

viii) Testes de incubação com oócitos: A ligação do espermatozóide à zona pelúcida é

um evento crítico inicial para que ocorra a interação entre os gametas que deverá culminar com a

fertilização do oócito. Assim, a interação entre os gametas visualizada in vitro reflete a

habilidade do espermatozóide em interagir com o oócito, o que indiretamente possibilita a

avaliação de danos no sistema complexo de proteínas, glicoproteínas e carbohidratos, sistema

esse conhecido por permitir a ligação entre o espermatozóide e o oócito (Oehninger et al., 1993).

Desse modo, são descritas três formas de se avaliar a funcionalidade espermática: a fertilização

in vitro, a penetração de oócitos e os testes de ligação à zona pelúcida (Mayenco-Aguirre e

Perez-Cortes, 1998).

Na espécie bovina, o teste de penetração espermática em oócitos homólogos desnudos é

um forte indicativo de fertilidade in vivo. Esse teste vem sendo utilizado com sucesso para a

avaliação do sêmen congelado de touros, tornando-se um instrumento de grande utilidade para os

núcleos de seleção, uma vez que reduz o tempo dos testes de fertilidade obtidos a campo

(Henault e Killian, 1995; Vila et al., 2001). Choldhry et al. (1995) sugerem que testes de

penetração espermática em oócitos de hamster são eficientes para se avaliar a capacidade

fecundante do sêmen ovino após o processo de criopreservação, visto haver uma forte correlação

entre a fertilidade in vitro e in vivo nessa espécie. Segundo Larsson e Rodriguez-Martinez

(2000), os testes de penetração e ligação à zona pelúcida e os testes de incubação do sêmen em

hemi-zona (HZT) podem ser utilizados para avaliar o efeito dos diferentes métodos de

tratamento espermático, tais como o resfriamento e a congelação, sobre a habilidade fertilizante

do espermatozóide canino.

Segundo Olar (1984), a avaliação da capacidade fecundante do espermatozóide canino

imediatamente após a descongelação seria um parâmetro mais importante do que a simples

observação da manutenção da motilidade após um período de incubação. Em um trabalho

pioneiro, Froman et al. (1984) verificaram a capacidade fecundante in vitro de espermatozóides

caninos frescos e congelados e observaram que o processo de congelação afeta bastante a taxa de

penetração em oócitos de camundongas, sendo este talvez o motivo para as baixas taxas de

fertilidade in vivo obtidas com o sêmen congelado.

Para a realização deste teste, Hay et al. (1997) relatam que podem ser utilizados oócitos

caninos coletados através de ovariosalpingohisterectomias, os quais podem ser utilizados, tanto

imediatamente após a cirurgia, quanto após conservação, para a avaliação do sêmen congelado

de cães domésticos, lobos cinzentos (Canis lupus) e lobos vermelhos (Canis rufus). Esses autores

sugerem ainda que as amostras de sêmen que retêm a motilidade após a descongelação também

retêm o movimento progressivo, indicando que se elas sobreviverem a congelação serão capazes

de progredir, e verificaram que baixa motilidade e aumento nos danos acrossômicos nas células

espermáticas caninas após a descongelação estão correlacionadas com penetração reduzida em

oócitos homólogos. Mastromonaco et al. (2002) demonstraram que o armazenamento de oócitos

caninos em solução salina hipertônica promove danos à zona pelúcida, reduzindo as taxas de

penetração espermática durante o teste de incubação. Além disso, esses autores observaram que a

integridade das células do Cumulus Ooforus é necessária para que ocorra uma boa interação

entre os oócitos e os espermatozóides caninos.

Mayenco-Aguirre e Perez-Cortez (1998) citam que na espécie canina a ligação à zona

pelúcida de oócitos homólogos é significativamente afetada pela concentração espermática,

sendo sugestivo o uso de concentrações superiores a 1 x10

espermatozóides capacitados e

móveis/mL. Segundo esses autores, a partir dessa concentração espermática sugerida, foi obtida

uma taxa de ligação de 86%. Ivanova et al. (1999) observaram que diferentes cães apresentam

uma variação individual quanto à possibilidade de terem seu sêmen congelado, com conseqüente

variação na porcentagem de espermatozóides ligados à zona pelúcida. Strom-Holst et al. (2000)

mostraram que a adição da pasta Equex STM ao diluente tem um efeito benéfico sobre a

capacidade de espermatozóides caninos descongelados em se ligarem à zona pelúcida de

oócitos homólogos.

A fertilização in vitro na espécie canina não apresentou ainda um sucesso expressivo.

Mahi e Yanagimachi (1976) obtiveram uma taxa de fertilização de oócitos caninos in vitro de

27% após 72 horas de incubação. Entretanto, esses autores não verificaram a presença de

clivagem nesse experimento. Yamada et al. (1992) conseguiram obter embriões caninos de 8

células, 96 horas após a fertilização in vitro, ao utilizarem sêmen canino in natura. Entretanto, a

taxa de clivagem obtida foi de apenas 2% do total de oócitos fertilizados. Metcalf (1999)

suplementou o meio de cultivo com gonadotrofinas e observou seu efeito benéfico sobre a

maturação nuclear de oócitos caninos in vitro. Além disso, foi obtida após 96 horas de

fertilização e cultivo in vitro a formação de embriões caninos de 8 células, representando 2,4%

do total de oócitos fertilizados in vitro. Otoi et al. (2000) obtiveram uma taxa de 13% de oócitos

caninos fertilizados in vitro, mas apenas 0,5% do total de oócitos utilizados no experimento

atingiu a fase de blastocisto inicial. Segundo esses autores, os oócitos caninos poderiam

desenvolver-se ao estágio de blastocisto após maturação, fertilização e cultivo in vitro, embora a

competência do oócito em desenvolver-se esteja significativamente reduzida após esses

procedimentos. Recentemente, Rodrigues (2004) avaliaram o efeito do estágio reprodutivo das

cadelas doadoras de oócitos sobre o desenvolvimento embrionário in vitro, e observaram que

esse desenvolvimento estaria mais dependente de condições intrínsecas dos oócitos, do que

propriamente do estágio reprodutivo das cadelas.

O teste de penetração oocitária consome menos tempo do que a fertilização in vitro visto

que não há a necessidade de maturar o oócito e somente a penetração é avaliada e não o seu

desenvolvimento (Hewitt e England, 1997). A penetração do espermatozóide na zona e/ou

ooplasma mostrou-se intimamente associada à motilidade espermática (Hay et al., 1997), mas

não apresentou correlações com a integridade do acrossoma (Rodrigues et al., 2004). De um

modo geral, são escassas as informações a respeito das relações entre os resultados do teste de

penetração e os diferentes parâmetros avaliados no sêmen canino após descongelação.

ix) Teste de fertilidade in vivo: Uma vez que muitos dos parâmetros avaliados in vitro

não são correlacionados com a fertilidade, a inseminação artificial de um grande número de

fêmeas é ainda o teste mais confiável ao se comparar os métodos de preservação de sêmen

(Amann e Hammerstedt, 1993). Em cães, testes de fertilidade são difíceis de serem realizados

devido ao número limitado de cadelas disponíveis e a longa duração do seu ciclo estral

(Souza, 2003), bem como devido à baixa eficiência dos protocolos de indução e sincronização de

estro reportados para uso nessa espécie (Eilts, 2005). Além disso, deve-se ter em mente que os

resultados de fertilidade in vivo são dependentes não apenas da qualidade seminal, mas também

de fatores inerentes à fertilidade da fêmea (Eilts, 2005).

Devido existirem diversos fatores ligados ao sucesso da inseminação artificial, os dados

referentes a esse tópico originaram um artigo publicado na Revista Portuguesa de Ciências

Veterinárias, o qual se encontra a seguir.

ARTIGO DE REVISÃO

Principais aspectos ligados à aplicação da

inseminação artificial na espécie canina

Main aspects for the accomplishment of artificial insemination in canine species

Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias

98 (546): 53-60, 2003

Principais aspectos ligados à aplicação da inseminação artificial

na espécie canina

Main aspects for the accomplishment of artificial insemination

in canine species

Alexandre R. Silva, Rita de Cássia S. Cardoso, Lúcia D. M. Silva

Laboratório de Reprodução de Carnívoros / PPGCV / UECE. Av. Paranjana, 1700, Itaperi, 60740-000, Fortaleza - Ceará, Brasil

Resumo: A inseminação artificial pode ser utilizada

como um meio alternativo na impossibilidade de

realização de monta natural ou na utilização de sémen

refrigerado ou congelado. Assim, o presente trabalho

tem por objetivo apresentar uma revisão geral acerca

dos principais aspectos ligados à aplicação dessa

biotécnica na espécie canina. Dentre esses aspectos,

pode-se destacar a utilização de sémen fresco,

refrigerado e congelado; os diversos métodos descritos

para o monitoramento do ciclo éstrico, como a citologia

vaginal, vaginoscopia, dosagens hormonais,

ultrassonografia e mensuração de resistência elétrica do

muco cervical; bem como as vias de inseminação

intravaginal e intrauterina. Finalmente, são traçadas

considerações sobre a eficiência da inseminação

artificial nessa espécie de fisiologia tão particular.

Summary: The artificial insemination can be used as an

alternative way when the natural mating cannot be

performed or when chilled or frozen semen is used.

Thus, the aim of this study is to present a general review

about the main aspects for the accomplishment of this

biotechnique in canine species. Concerning those

aspects, it can stand out the use of fresh, chilled and

frozen semen; the several methods described for the

estral cycle monitoring, as the vaginal cytology,

vaginoscopy, hormone assay, ultrasound and electric

resistance measurement of the cervical mucus; as well

as the routes of insemination intravaginal and

intrauterine. Finally, considerations are made on the

efficiency of the artificial insemination in that species of

such a peculiar physiology.

_____________________________________________

Introdução

A inseminação artificial (IA) consiste em, após a

obtenção do sémen, depositá-lo no trato genital da

fêmea a ser inseminada. Essa técnica pode ser utilizada

como um meio alternativo quando da impossibilidade de

realização de monta natural, devido a problemas

anatômicos, comportamentais e sanitários, ou ainda,

quando da utilização de sémen refrigerado ou

congelado. Sendo de principal relevância este último,

que possibilita a manutenção da capacidade fecundante

em animais de alto interesse zootécnico por um espaço

indeterminado de tempo, além de resguardar tais

animais do estresse causado pelo seu transporte para fins

de acasalamento (Guérin, 1998).

A primeira IA notificada cientificamente foi realizada

no final do século XVIII por Spallazani, que utilizou

sémen fresco obtido da vagina de uma cadela

naturalmente acasalada e depositou-o na vagina de uma

outra cadela utilizando uma seringa. Esse procedimento

resultou no nascimento de três filhotes após 62 dias

(Johnston et al., 2001).

Somente em 1954 foi descrita por Harrop a primeira

IA com sémen canino refrigerado a 4°C. Após 15 anos,

Seager (1969) obteve a primeira gestação utilizando

sémen canino congelado, resultando no nascimento de

dois filhotes. Nos anos 80, estabeleceu-se a utilização do

sémen canino fresco ou refrigerado e os resultados têm

se aproximado aos obtidos por monta natural. Porém, os

resultados obtidos através da IA com sémen canino

congelado são ainda bastante heterogêneos (Linde-

Forsberg e Forsberg, 1989; Silva, 1995). Nesse sentido,

o presente estudo apresenta uma revisão geral acerca

dos principais aspectos ligados à aplicação da IA na

espécie canina.

Coleta e análise seminal

De um modo geral, utiliza-se para a inseminação

artificial um macho de escolha do proprietário da cadela

a ser inseminada. Entretanto, com o surgimento dos

bancos de sémen canino, preconiza-se a realização de

uma seleção dos animais doadores. Assim, observa-se

que esta seleção pode exercer um marcado efeito sobre a

fertilidade, tal qual é descrito para outras espécies, visto

que existe uma grande variação individual entre os cães

(England, 1993). Por essa razão, a seleção de

reprodutores deve ser feita através de uma detalhada

anamnese, verificando-se o desempenho reprodutivo

anterior do macho e problemas de saúde atuais ou

prévios. Deve também ser procedido um cuidadoso

exame clínico geral e andrológico, que deve incluir a

inspeção e palpação dos órgãos reprodutivos,

observando-se principalmente o tamanho e a

consistência testicular, visto que cães com

espermatogênese anormal freqüentemente têm testículos

de consistência inferior à normal. Em seguida, deve-se

proceder à coleta e avaliação do sémen e inspeção do

comportamento de monta (libido), podendo ter

continuidade com testes hormonais e análises

cromossômicas (Christiansen, 1988, Feldman e Nelson,

1996).

O ejaculado canino é naturalmente dividido em três

frações distintas (Harrop, 1955). A primeira fração

consiste em um fluido claro originado na próstata e

supõe-se ser responsável pela limpeza do canal uretral

(England e Allen, 1992). A segunda fração, rica em

espermatozóides, é de origem testicular e apresenta

volume variável conforme o tamanho testicular e a

variação individual, possuindo aspecto turvo, leitoso e

opalescente (Christiansen, 1988). A terceira fração é o

fluido prostático que deve ser claro e facilmente

distinguível da fração espermática. Apresenta um grande

volume e serve como um meio diluidor natural

proporcionando o transporte dos espermatozóides no

trato genital da cadela (England e Allen, 1992).

O sémen é facilmente colhido de cães, em especial

daqueles com experiência prévia de acasalamento. A

presença de uma cadela em estro pode melhorar a

qualidade do ejaculado, particularmente no caso de cães

inexperientes ou tímidos. Pode-se ainda congelar

zaragatoas impregnadas de secreções vaginais de

cadelas em estro (Silva, 2001) ou impregnadas com o

feromônio sintético metil-?-benzoato (Goodwing et al.,

1979), que podem ser passados na região perianal de

uma cadela no momento da coleta do sémen. Assim, o

cão irá reagir como se estivesse diante de uma cadela

em cio.

Diversos métodos foram descritos para a coleta de

sémen nesta espécie, tais como: massagem digital, uso

de vagina artificial, vibrador elétrico e eletroejaculação

(Harrop, 1955; Christiansen, 1988). Segundo Boucher et

al. (1958), a massagem digital permite a obtenção de um

sémen de qualidade superior ao obtido por vagina

artificial, sendo que o primeiro método é especialmente

confiável mesmo para cães não condicionados. Althouse

et al. (1991) observaram que a exposição do sémen

fresco às luvas de látex e/ou vinil causa um imediato

decréscimo na motilidade espermática, devendo-se

evitar tal contato durante a massagem digital, que é hoje

o método de eleição para a coleta do sémen nesta

espécie.

A massagem digital consiste em massagear o

prepúcio do cão na altura do bulbo cavernoso peniano,

até que o animal atinja a ereção parcial. O prepúcio é

então retraído para trás do bulbo e o pênis é apertado

com moderada pressão, posteriormente ao bulbo (Seager

e Fletcher, 1972; Christiansen, 1988). O ejaculado é

coletado fracionadamente com o auxílio de um funil de

vidro ou plástico que desemboca em tubos graduados

(Gill et al., 1970), devendo-se evitar o contato direto

entre o pênis e o material de coleta (Seager e Fletcher,

1972).

A análise padrão da fração espermática do ejaculado

é rotineiramente utilizada para avaliar a qualidade do

sémen canino, incluindo a observação do volume,

coloração, viscosidade, pH e osmolaridade. A avaliação

microscópica do sémen inclui a observação da

concentração e morfologia espermática, bem como a

avaliação subjetiva da porcentagem de espermatozóides

móveis na amostra (motilidade) e a qualidade dessa

motilidade, denominada de vigor (Christiansen, 1988;

Feldman e Nelson, 1996; Johnston et al., 2001). Vale

salientar que diversos métodos de análise seminal

computadorizada (CASA) já foram validados para a

espécie canina, entre eles destacam-se o Analisador de

Qualidade Espermática (SQA) e o Hamilton Thorn

(HTR), os quais permitem uma avaliação objetiva e

precisa dos parâmetros microscópicos seminais

(Iguer-Ouada, 2001).

Embora a relação entre a motilidade e a capacidade

fecundante do espermatozóide canino não esteja

totalmente elucidada, a maioria dos pesquisadores ainda

utiliza a motilidade como o principal parâmetro para a

avaliação do sémen canino (Ivanova-Kicheva et al.,

1997). Assim, uma amostra normal de sémen deve

exibir uma motilidade mínima de 70% (Christiansen,

1988). Em seguida, deve-se avaliar o vigor espermático,

que é a qualidade da motilidade exibida pelos

espermatozóides móveis, observada em escala que varia

de 0 a 5 (Platz e Seager, 1977). Em 1993, Oettlé

demonstrou que a morfologia espermática normal em

cães estaria melhor correlacionada com a fertilidade

após IA, do que a simples observação da motilidade

espermática, sendo que haveria um decréscimo nessa

fertilidade caso fossem utilizadas amostras de sémen

apresentando morfologia espermática normal inferior a

60%.

Diversos outros métodos foram descritos para a

avaliação da qualidade seminal. Dentre estes, podem ser

destacados o teste de termorresistência (Ström et al.,

1997), o teste hipo-osmótico (England e Plummer,

1993), o teste de capacitação e reação acrossômica in

vitro (Hewitt e England, 1998), a análise ultra-estrutural

(Rodrigues-Martinez et al., 1993) e os testes de

incubação com oócitos homólogos ou heterólogos

(Mayenco-Aguirre e Perez-Cortéz, 1998; Metcalf, 1999;

Larsson e Rodrigues-Martinez, 2000, Mastromonaco et

al., 2002).

Processamento de sémen

A IA com sémen fresco oferece taxas de gestação

similares às obtidas com a monta natural (Pereira et al.,

2001). Entretanto, o sémen fresco apresenta pouca

flexibilidade, devendo ser utilizado em um curto período

após sua coleta. Segundo England (1999), caso o

volume ou a concentração espermática não seja

suficiente para a IA, deve-se realizar uma nova coleta

para incrementar a amostra. Por ocasião da IA, é

necessário realizar a expansão da fração espermática, a

qual é geralmente realizada adicionando-se o líquido

prostático autólogo até ser atingido o volume mínimo

desejado (Nothling e Volkmann, 1993; Uchoa et al.,

2001; Silva et al., 2002a). Entretanto, pode-se também

fazer uso de diluidores, como o Tris (Uchoa et al.,

2001), água de coco (Pereira et al., 2001), solução salina

fisiológica (Silva et al., 2002a) e o leite desnatado

(Betini et al., 2001).

Quando não é necessário o emprego imediato do

sémen, sua viabilidade é prolongada através da

refrigeração e da adição de diluidores, como o leite

desnatado e a glicina-gema (Cunha e Lopes, 1997), o

Tris-gema (Stornelli et al., 2001) e a água de coco

(Fontenele et al., 2002). O sémen refrigerado apresenta

maior flexibilidade que o fresco, podendo ser

transportado em garrafas térmicas e manter-se viável por

um a cinco dias, desde que a temperatura seja mantida

em torno de 4 e 5 °C (Province et al., 1984; England e

Ponzio, 1996). Recentemente, Iguer-Ouada (2001)

obteve êxito ao prolongar a viabilidade do sémen canino

por mais de 20 dias, através troca do meio diluidor Tris,

conferindo uma renovação de substrato energético para

as células espermáticas.

O sémen canino pode ser ainda congelado e

armazenado por tempo indeterminado, permanecendo

potencialmente fecundante quando reaquecido e

utilizado em IA. Desse modo, o sémen congelado é o

que oferece maior flexibilidade de uso, porém é o que

sofre as mudanças mais drásticas quanto à sua qualidade

pós-descongelação (Concannon e Battista, 1989).

Diversos diluidores são utilizados para a congelação do

sémen canino, dentre eles podemos destacar a lactose

(Seager, 1969), o Tris (Andersen, 1975), o Triladyl

(Nothling et al., 1995), o Biociphos W482 e o Laiciphos

478 (Silva, 1995), o diluidor comercializado pelo

Cryogenetics Laboratory of New England - CLONE

(Ström et al., 1997) e, mais recentemente, um diluidor à

base de água de coco (Cardoso et al, 2003). Entretanto,

em diversas publicações, o tampão Tris tem-se mostrado

superior a outros diluidores, tanto para a refrigeração,

quanto para a congelação, sendo este o diluidor mais

utilizado pela maioria dos grupos de pesquisa da

atualidade (Farstad, 1996

; Silva et al., 2000).

A gema de ovo de galinha é adicionada ao Tris,

geralmente na proporção de 20% (Linde-Forsberg e

Forsberg, 1989; Silva et al., 2003), por promover a

proteção da célula espermática contra o choque térmico

(Watson e Plummer, 1985; Hammerstedt et al., 1990).

Dentre os agentes crioprotetores que podem ser

utilizados destacam-se o glicerol (Polge et al., 1949), o

dimetilsulfóxido (Olar et al., 1989), o metanol (Kim et

al., 1994) e o etileno-glicol (Santos et al., 2001).

Entretanto, o glicerol (CH

) é o crioprotetor mais

empregado na congelação de sémen canino em

concentrações variando entre 2 e 8%, dependendo da

composição do diluidor utilizado (Ravaszova et al.,

1996; Silva et al., 2003). Finalmente, pode-se ainda

adicionar ao diluidor a pasta Equex, que é um aditivo

comercial para sémen, contendo o dodecil-sulfato, o

qual possibilita um aumento na resistência aos danos

oriundos da congelação (Rota et al., 1999).

Diversas metodologias têm sido descritas para a

congelação do sémen canino e variam de acordo com o

diluidor e agentes crioprotetores empregados,

preconizando o uso de diferentes velocidades de

congelação. Em todas elas, busca-se minimizar o dano

causado ao espermatozóide pelo processamento, visando

recuperar um máximo possível de espermatozóides

viáveis (Ström et al., 1997). Dentre os diversos métodos

existentes, o mais usual é o descrito por Andersen

(1975), que serve como base para inúmeros estudos

onde têm sido realizadas pequenas modificações nesse

método, alcançando excelentes resultados in vitro

(Ström et al., 1997) e in vivo (Rota et al., 1999; Tsutsui

et al., 2000). Existem também vários protocolos

preconizando diferentes temperaturas e velocidades de

descongelação para o sémen canino. Usualmente, este

processo é realizado sob imersão em banho-maria a

temperaturas que variam de 37

C (Linde-Forsberg,

1991) a 75

C (Olar et al., 1989). Ademais, a

armazenagem do sémen canino pode ser realizada em

pastilhas (Battista et al., 1988), tubos de alumínio de 5

mL (Ivanova-Kicheva et al., 1997) ou,

preferencialmente, em palhetas (Cardoso et al., 2003;

Silva et al., 2003).

Monitoramento do ciclo éstrico da cadela

A problemática da obtenção de sucesso através da

IA na espécie canina está diretamente ligada às

dificuldades concernentes à determinação do momento

ideal para inseminação nessa espécie de fisiologia

reprodutiva particular. Segundo Concannon et al.

(1977), a ovulação ocorreria de maneira sincrônica entre

36 e 50 horas após o pique de hormônio luteinizante

(LH). Os ovócitos emitidos não estariam ainda maduros,

encontrando-se no estado de vesícula germinativa. A

maturação seria então concluída dois a três dias mais

tarde com a emissão do segundo corpúsculo polar (Holst

e Phemister, 1971; Tsutsui, 1989). A partir desse

momento, o ovócito seria fecundável, mas a sua

sobrevivência parece ser muito curta, de apenas 24 a 48

horas (Concannon e Battista, 1989). O limite máximo de

fecundação se encontraria em torno de 6,5 dias depois

do pique de LH (Tsutsui, 1989), sendo o período ideal

de fecundação entre três e quatro dias depois do pique.

No entanto, esses estudos não nos permitem determinar

precisamente o momento e o caráter sincrônico da

ovulação (Silva, 1995). Devido a essa problemática,

segue-se uma abordagem dos diversos métodos

descritos para o monitoramento do ciclo éstrico da

cadela, visando a determinação do momento ideal para a

realização da IA.

Inicialmente, sugere-se a observação das mudanças

anatômicas e comportamentais da cadela que ocorrem

principalmente durante o proestro, que dura em torno de

9 dias, caracterizando-se por edemaciação vulvar,

associada a uma descarga serosanguinolenta vaginal, em

resposta às altas concentrações de estrógeno.

Usualmente, nesse momento, a cadela atrai os machos,

mas não permite ser acasalada, mantendo a cauda sobre

a vulva e demonstrando um comportamento agressivo

(Johnston et al., 2001). A fase subseqüente é

denominada de estro e caracteriza-se pela vulva

aumentada e amolecida, diminuição das descargas

vaginais e aceitação do acasalamento pelo macho

(Allen, 1992), com exibição da vulva através do

afastamento da cauda (Uchoa et al., 2001). No início

dessa fase, o estrógeno atinge seu pique máximo, a

partir do qual inicia seu declínio. Esse pique de

estrógeno promove o pique de LH, que por sua vez é

responsável pelo desencadear da ovulação, que irá

culminar na elevação dos níveis de progesterona

(Concannon et al., 1989).

Outro método prático sugerido para o

acompanhamento do ciclo éstrico da cadela é a

associação da observação de suas mudanças

comportamentais e anatômicas com a citologia vaginal.

Porém, como este método não é muito preciso, ele fica

reservado à inseminação artificial com o sémen fresco.

Assim, tal método se baseia na observação do perfil

citológico da cadela, o qual sofrerá mudanças bem

características de acordo com as fases do ciclo éstrico

(Schutte, 1967). A inseminação deve ser realizada

quando a fêmea estiver receptiva ao macho e apresentar

uma citologia com pelo menos 70% de células epiteliais

superficiais. No entanto, uma grande parcela de cadelas

candidatas a IA com sémen fresco são justamente

aquelas que têm desvio de comportamento, não

aceitando a cópula e não manifestando comportamento

sexual normal. Nesses casos, o comportamento não pode

ser utilizado como guia, ficando a citologia vaginal

como método isolado. Essa última é excelente para guiar

o veterinário dentro do ciclo éstrico da cadela, mas nem

sempre é eficaz quando utilizada isoladamente (Silva et

al., 2002b). Segundo England e Allen (1989), além da

morfologia celular observada através da citologia

vaginal convencional, o padrão de cristalização do muco

vaginal das cadelas em estro deve também ser

observado, uma vez que o mesmo apresentaria

alterações de acordo com o aparecimento do pique

estrogênico no decorrer do ciclo éstrico.

Uma alternativa para aumentar a eficiência na

determinação do momento ótimo para IA é o

acompanhamento da cadela por vaginoscopia (Lindsay,

1983). Baseando-se nesse método, o momento ideal para

a realização da IA seria quando a mucosa vaginal

apresentar pregas fortemente angulosas e de coloração

pálida (Johnston et al., 2001). Tanto os endoscópios

fibro-ópticos, quanto proctoscópios pediátricos, com

diâmetro inferior a 12 mm, podem ser utilizados na

maioria das cadelas a fim de se visualizar as mudanças

na região cranial da vagina. O uso de ambos os

instrumentos requer prática e atenção, no intuito de não

causar danos à estrutura anatômica da cadela (Burke,

1996).

O método mais eficiente para se determinar o

momento ótimo para a IA é através da dosagem de

progesterona plasmática, uma vez que a cadela é a única

dentre as fêmeas domésticas que apresenta uma

evolução da progesteronemia dois a três dias antes da

ovulação (Johnston et al., 2001). Os valores de

progesterona sérica são inferiores a 1,0 ng/mL durante o

anestro e a maior parte do proestro e rapidamente

começam a aumentar nas proximidades do pique de LH

(Concannon et al., 1989). A dosagem da

progesteronemia é hoje uma prática rotineira que pode

ser feita com auxílio de kits semiquantitativos

comerciais do Enzime linked Imunosorbent Assay

(ELISA) ou por laboratórios especializados que

fornecem valores quantitativos obtidos por

radioimunoensaio (RIA). O RIA é geralmente o mais

acurado das duas técnicas, sendo, entretanto, mais caro e

requerendo maior tempo de execução (Johnston et al.,

2001). Segundo Johnston et al. (2001), o momento ideal

para a realização da IA seria dois dias após a

progesterona ter atingido concentrações entre 4 e 10

ng/mL. Dosagens paralelas de progesterona e hormônio

luteinizante (LH) mostraram que o início da elevação

significativa da progesteronemia corresponde ao pique

do LH, o qual pode ser uma referência importante para

definir-se as datas da inseminação, uma vez que a

ovulação costuma ocorrer 48 horas após o pique desse

hormônio (GUÉRIN, 1998). Atualmente, testes de RIA

ELISA encontram-se comercialmente disponíveis para a

dosagem do LH sérico. No entanto, a mensuração desse

hormônio apresenta o inconveniente da necessidade de

diversas coletas sanguíneas diárias (Johnston et al.,

2001).

Hase et al. (2000) investigaram o uso da ultra-

sonografia como método para predizer a ovulação na

cadela. Entretanto, a ocorrência da ovulação só foi

observada em 54,5% das cadelas estudadas. Por outro

lado, Silva et al. (1996) já haviam verificado a

dificuldade de se determinar a ovulação na cadela por

ultra-sonografia, em virtude da presença de uma bolsa

de tecido conjuntivo circundando o ovário.

Mudanças na resistência elétrica dos fluidos

vaginais têm sido utilizadas com sucesso na

determinação do momento ideal para a inseminação em

Raposas Azuis e Prateadas (Fougner, 1989). Esse

método foi também descrito para a espécie canina, tendo

sido constatado sucesso, desde que o detector de

resistência elétrica seja sempre colocado na mesma

posição da vagina da cadela. No entanto, a extensa

variação no tamanho da vagina das cadelas nas diversas

raças dificulta o procedimento nessa espécie (Johnston

et al., 2001).

Vias de inseminação artificial

A IA intravaginal (IAIV) consiste na deposição do

sémen na vagina da cadela e apresenta-se como a via de

escolha na maioria dos casos, por ser de fácil execução e

por oferecer bons resultados de um modo geral. Para a

IAIV pode-se utilizar uma pipeta rígida de vidro ou

plástica, geralmente utilizada para a inseminação de

bovinos (Seager e Fletcher, 1972; Seager e Platz, 1977);

um pênis artificial, que consiste em um dispositivo

plástico preenchido por ar, imitando as dimensões do

pênis do cão (Kojima et al., 1996ab) ou a sonda de

Osíris (Mialot et al., 1985).

A sonda de Osíris é uma pipeta plástica flexível

munida de um pequeno balão inflável na sua

extremidade distal, imitando o enchimento dos bulbos

erécteis do pênis do cão durante o coito e impedindo o

refluxo do sémen. O balonete evita também o recuo da

sonda e estimula o peristaltismo vaginal, tal qual ocorre

no coito. Essa sonda realiza a aspersão do sémen

diretamente na porção cranial da vagina (Mialot et al.,

1985).

No protocolo clássico de IAIV, recomenda-se a

elevação do trem posterior da cadela por 5 a 20 minutos,

visando-se evitar o refluxo do sémen (Seager, 1986).

Porém, Pinto et al. (1998) observaram que a redução no

tempo de elevação do trem posterior de 10 para 1

minuto não compromete a fertilidade, nem a

prolificidade das cadelas. Além disso, Tsutsui et al.

(1989) citam que os espermatozóides caninos

conseguem atingir o corno uterino um a dois minutos

após a deposição vaginal do sémen.

A IA por via intrauterina (IAIU), que consiste na

deposição do sémen diretamente dentro do útero, fica

reservada para casos particulares, onde a via vaginal

poderia comprometer os resultados da IA, como, por

exemplo, na utilização de um sémen congelado com

baixa qualidade pós-descongelação (Silva, 1995).

Segundo Johnston et al. (2001), a IAIU pode ainda ser

utilizada como uma alternativa para melhorar as taxas

de fertilidade de machos oligospérmicos, ou seja, com

um baixo número de espermatozóides no ejaculado.

Várias abordagens têm sido realizadas com o intuito

de se desenvolver técnicas para a IAIU, na qual a

deposição do sémen é realizada diretamente dentro do

útero da fêmea por via transcervical ou através de

procedimentos cirúrgicos transabdominais como a

laparotomia e laparoscopia.

A IAIU via transcervical não é uma técnica fácil de

ser executada e, em alguns casos, a tranqüilização do

animal pode ser necessária. O cateterismo cervical foi

adaptado para a espécie canina a partir de experimentos

prévios realizados na raposa azul (Fougner et al., 1973).

Na cadela, esta técnica exige destreza do operador

devido à anatomia particular do cérvix e à presença da

prega médio-dorsal da vagina (Pineda et al., 1973;

Linde, 1978; Lindsay, 1983). Assim, para sua execução

são utilizados uma bainha plástica e o catéter

escandinavo, o qual é transpassado através do cérvix ,

sendo este palpado por via abdominal, permitindo a

deposição do sémen diretamente no corpo uterino. O

catéter escandinavo consiste em um catéter metálico

com 0,75 a 1,0 mm de diâmetro, sendo comercializado

em três diferentes tamanhos: 20, 30 ou 40 cm

(Andersen, 1975).

A IAIU por laparotomia foi desenvolvida no intuito

de transpor as dificuldades do cateterismo cervical. No

entanto, essa técnica comporta uma intervenção

cirúrgica com todos os riscos implícitos. Além disso,

uma anestesia profunda poderia interferir na motilidade

uterina e na migração oocitária (Tsutsui et al., 1989).

A IAIU por laparoscopia, apesar considerada uma

técnica semicirúrgica, tem caráter pouco invasivo e é de

rápida execução, uma vez que o sémen pode ser

depositado em apenas um corno uterino, haja vista que

os espermatozóides rapidamente migram para o outro

corno (Tsutsui et al., 1989). Os resultados obtidos após

IAIU por laparoscopia, tanto com sémen fresco, como

com sémen congelado, têm sido satisfatórios (Silva,

1995).

Em alguns países europeus, a realização de

inseminações por métodos cirúrgicos, existindo a

possibilidade do procedimento não-cirúrgico, é

considerada antiética (Farstad,2000). Assim, a

endoscopia vaginal parece ser o método do futuro para a

sondagem do colo uterino, uma vez que ela possui a

grande vantagem de possibilitar a visualização da

abertura do cérvix sem a necessidade de sedação do

animal (Wilson, 1993; Shin et al., 1997). Segundo

Wilson (1993), esse método proporcionaria taxas de

concepção em torno de 80%, mesmo com a utilização

do sémen congelado. Para sua execução, é utilizado um

endoscópio fibro-óptico rígido conectado a uma fonte

luminosa e um cateter urinário, sendo necessária a

palpação abdominal para auxiliar a guiar tais

instrumentos.

Eficiência da inseminação artificial

A IA com sémen canino fresco, contendo um número

adequado de espermatozóides, proporciona resultados

de fertilidade similares àqueles obtidos pela monta

natural (Pereira et al., 2001; Uchoa et al., 2001; Silva et

al., 2002a), a qual, segundo Daurio et al. (1987),

apresenta eficiência em torno de 85% nesta espécie.

No uso do sémen refrigerado, Pinto et al. (1999)

obtiveram 90% e 100% de fertilidade em cadelas

submetidas a IAIV com sémen refrigerado por 24 e 48

horas, respectivamente. Mas, segundo Guérin (1998), os

resultados são geralmente inferiores àqueles obtidos

com o sémen fresco, sendo obtida uma taxa de

fertilidade em torno de 70%. Além disso, o sucesso

desse método estaria dependente de uma boa

coordenação entre o envio do sémen e o momento de

realização da inseminação.

As taxas de concepção observadas após IA com

sémen congelado são sensivelmente inferiores às obtidas

com sémen fresco (Linde-Forsberg e Forsberg, 1989).

Esse fato é provavelmente devido à viabilidade e

fecundidade reduzida dos espermatozóides congelados.

Isso pode ser devido ao processo de congelação e

descongelação, à qualidade do sémen após congelação,

aos tipos de meios utilizados, dentre outros fatores. De

fato, segundo Concannon e Battista (1989) e Fontbonne

e Badinand (1993b), a viabilidade do espermatozóide

após descongelação pode variar de 12 a 24 horas.

Ademais, no uso de sémen congelado, as taxas de

concepção são geralmente mais altas quando o sémen é

depositado no útero, comparado à deposição vaginal

(Olar et al., 1989; Concannon e Battista, 1989).

Entretanto, Silva (1995) descreve 100% de gestação

para a IAIU por laparotomia e a IAIV utilizando-se a

sonda de Osíris com o sémen congelado, o que implica

que a própria metodologia de inseminação pode

influenciar os resultados. Resultados semelhantes foram

também descritos por Fontbonne e Badinand (1993a), os

quais encontraram taxa de fertilidade de 52,6% a partir

de IAIV com a sonda de Osíris, e 73,6% em IAIU

transcervical por cateterismo, não sendo evidenciadas

diferenças estatísticas entre os dois métodos.

Com relação ao número de IA, Uchoa et al. (2001) e

Silva et al. (2002a) sugerem a realização de duas

inseminações, geralmente, com intervalos de 48 horas,

utilizando o sémen a fresco. Esse mesmo número de

inseminações é sugerido por Silva (1995) para a

utilização de sémen congelado. Ademais, no uso de

sémen refrigerado por até 11 dias, Iguer-Ouada (2001)

obteve 50% de fertilidade após a realização de uma

única IA.

O número mínimo de espermatozóides requerido para

a IA não está bem estabelecido. Taxas de fertilidade

satisfatórias já foram obtidas com doses inseminantes de

35 x 10

espermatozóides móveis após IAIU e de 50 x

espermatozóides móveis após IAIV (Wilson, 1993).

De um modo geral, a IAIU requer uma menor

concentração de espermatozóides por IA do que a

técnica de IAIV.

Segundo Guérin (1998), a fertilidade entre as raças é

bastante variável, sendo ainda constatado que o número

de espermatozóides por ejaculado varia

proporcionalmente de acordo com o tamanho do cão.

Assim, talvez seja necessário aumentar a dose

inseminante para as raças de grande porte, uma vez que

esse maior número de espermatozóides poderia estar

correlacionado a um maior comprimento do aparelho

genital da cadela.

Considerações finais

Apesar da difundida utilização da IA na espécie

canina na atualidade, são necessários ainda um maior

conhecimento e controle dos fatores que podem

influenciar seu sucesso. Assim, diversos estudos

continuam a ser conduzidos visando encontrar

metodologias de preservação de gametas que permitam

uma perda mínima da qualidade seminal, uma maior

eficácia na determinação do momento ideal para a

inseminação e utilização de uma via eficiente que não

traga riscos ao animal.

Entende-se, desse modo, que a IA em cães seria

apenas o começo de uma nova era para a reprodução e

otimização do material genético de canídeos domésticos

e selvagens, uma vez que as biotecnologias

estabelecidas para a espécie canina poderiam servir

como base para estudos visando a preservação e difusão

do material genético oriundo de canídeos selvagens

ameaçados ou em extinção, haja vista a similaridade

filogenética entre tais espécies (Wayne e Vila, 2001).

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3. JUSTIFICATIVA

A partir da revisão de literatura apresentada, pode-se perceber que nas últimas duas

décadas, um grande avanço foi alcançado no que diz respeito ao desenvolvimento de biotécnicas

da reprodução aplicadas a cães e, em particular, no que se refere à tecnologia de sêmen canino.

Entretanto, os resultados obtidos com as técnicas de criopreservação de sêmen canino ainda são

deveras heterogêneos.

O interesse de companhias comerciais como a International Canine Genetics

(Philadelphia, USA), aliado aos recursos humanos aperfeiçoados nas universidades, possibilitam

hoje a implantação de bancos de sêmen canino congelado em alguns países, os quais tentam

constantemente aprimorar as técnicas de congelação já existentes ou mesmo desenvolver novas

técnicas visando obter uma perda mínima da qualidade espermática durante o processamento.

Esses estudos acerca da criopreservação de sêmen, além de serem importantes para a

própria espécie canina, têm servido como base para as pesquisas relacionadas à indústria de

curtume européia. Esta indústria é proprietária de fazendas onde se criam canídeos outros, como

a Raposa Azul (Alopex lagopogus) e a Raposa Prateada (Vulpes vulpes), visando a preservação e

multiplicação do material genético de animais portadores de genes mutantes de alto valor

comercial (Farstad, 1996). Conforme esse ponto de vista, as pesquisas em tecnologia do sêmen

canino abrem a perspectiva de serem adaptadas à preservação de espécies canídeas ameaçadas de

extinção, como o Lobo Guará (Chrysocyon brachyurus), a Raposinha do Campo (Pseudalopex

sp.) e o Cachorro Vinagre (Spheotos venaticus).

Nesse sentido, em trabalhos anteriores (Silva et al., 1998;2000;2002cd; 2003), foi

adaptada para a espécie canina, no uso do diluente Tris, uma metodologia inicialmente

desenvolvida para a conservação do sêmen caprino utilizando o diluente à base de água de coco

(Nunes et al., 1997). Entretanto, são ainda necessários alguns ajustes que proporcionem uma

maior praticidade ao uso dessa metodologia, tais como a definição da temperatura de adição de

glicerol e o estudo da diluição de sêmen. Além disso, esses trabalhos anteriores se baseavam em

resultados avaliados apenas pela análise clássica da motilidade e morfologia espermática, sendo

então aqui proposta a aplicação de testes mais avançados, como a microscopia eletrônica,

análise computadorizada e teste de interação espermatozóides-oócitos, com o intuito de avaliar a

eficiência dessa metodologia.

Apesar de diversos testes que avaliam diferentes parâmetros relacionados à qualidade das

amostras de sêmen já terem sido desenvolvidos, existe ainda uma carência de estudos acerca das

relações entre os mesmos, no que se refere ao sêmen canino. O estabelecimento dessas relações

seria importante não apenas por permitir a padronização de um teste in vitro capaz de predizer a

fertilidade in vitro e/ou in vivo de uma amostra de sêmen, mas também por proporcionar uma

maior compreensão das relações entre os diferentes parâmetros avaliados nas amostras de sêmen.

Diante do exposto, justifica-se a realização dos experimentos reportados na presente tese.

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

? O sêmen canino destinado à criopreservação poderia ser eficientemente diluído segundo

o método de concentração pré-fixada ou aquele baseado em um volume fixo.

? A adição do diluente glicerolizado ao sêmen à temperatura ambiente (27ºC) não traria

prejuízos à célula espermática e poderia conferir maior praticidade ao procedimento de

criopreservação.

? Poderiam existir relações entre as análises de diferentes parâmetros do sêmen canino

congelado e suas interações com oócitos homólogos.

5. OBJETIVOS

5.1. Geral

? Aprimorar uma metodologia de congelação de sêmen canino utilizando o diluente

Tris e avaliar seus efeitos sobre diferentes parâmetros seminais.

5.2. Específicos

? Verificar o efeito da diluição espermática sobre a qualidade seminal após

descongelação;

? Observar a influência da temperatura de adição de glicerol durante o procedimento

de criopreservação sobre a qualidade seminal após descongelação;

? Determinar o efeito da adição de diluente após a descongelação sobre a qualidade e

longevidade espermática;

? Verificar a existência de relações entre os parâmetros seminais com as interações in

vitro dos espermatozóides caninos congelados e oócitos homólogos;

? Avaliar os efeitos da criopreservação sobre diferentes parâmetros morfológicos e

sobre a aparência ultra-estrutural de células espermáticas caninas.

6. CAPÍTULO 01

Comparison between different dilution rates on canine semen freezing

using Tris-buffer with the addition of egg-yolk and glycerol

Comparação entre diferentes diluições na congelação do sêmen canino utilizando o tampão

Tris acrescido de gema de ovo e glicerol

Brazilian Journal of Veterinary Medicine and Animal Science

In Press, Ref. 1095/04

(Aceito para publicação em 23 de Junho de 2005)

RESUMO

Compararam-se a concentração espermática padronizada e a expansão volume:volume na

diluição do sêmen canino para congelação. O sêmen de seis cães, submetidos a duas coletas por

estimulação manual, foi avaliado e diluído em tris acrescido de gema de ovo e glicerol, de

acordo com duas diferentes diluições. A primeira baseou-se na concentração espermática

padronizada de 200x10

espermatozóides/ml, e a segunda mediante diluição volume:volume, na

proporção de uma parte de sêmen para uma de diluente. O sêmen foi congelado, armazenado em

nitrogênio líquido e descongelado após uma semana. A motilidade e o vigor espermáticos foram

avaliados a cada etapa do processo e aos 15 e 30 min após descongelação. A morfologia

espermática foi avaliada após coleta e descongelação. Nenhuma diferença foi observada entre os

tratamentos após a descongelação quanto à motilidade, vigor, porcentagem de espermatozóides

morfologicamente normais e longevidade. Ambas as taxas de diluição podem ser eficientemente

utilizadas na congelação do sêmen canino.

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec.,

Comparison between different dilution rates on canine semen freezing using

Tris-buffer with the addition of egg-yolk and glycerol

[Comparação entre diferentes diluições na congelação do sêmen canino utilizando o tampão

tris acrescido de gema de ovo e glicerol]

A.R. Silva, R.C.S. Cardoso, L.D.M. Silva

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária

Universidade Estadual do Ceará

Avenida Paranjana, 1700 - Itaperi

60740-000 – Fortaleza, CE

ABSTRACT

Standardized sperm concentration and volume:volume extension were compared as dilution rates for canine semen

freezing. Six proven stud dogs were submitted to two seminal collections by manual stimulation. Semen was

evaluated and extended in tris plus egg-yolk and glycerol according to two different dilution rates. The first one was

based on a standardized sperm concentration of 200x10

spermatozoa/ml and the second was a volume:volume

extension at a proportion of one part semen to one part extender. Semen was frozen, stored in liquid nitrogen and

thawed after one week. Sperm motility and vigor were appraised after each stage of the process and at 15 and 30

min post-thawing. Sperm morphology was analyzed after collection and thawing. No differences were observed

between treatments after thawing regarding sperm motility and vigor, normal sperm morphology rate or longevity.

Both dilution rates can be efficiently used for canine semen freezing.

Keywords: dog, semen, extender, freezing, dilution

RESUMO

Compararam-se a concentração espermática padronizada e a expansão volume:volume na diluição do sêmen

canino para congelação. O sêmen de seis cães, submetidos a duas coletas por estimulação manual, foi avaliado e

diluído em tris acrescido de gema de ovo e glicerol, de acordo com duas diferentes diluições. A primeira baseou-se

na concentração espermática padronizada de 200x10

espermatozóides/ml, e a segunda mediante diluição

volume:volume, na proporção de uma parte de sêmen para uma de diluidor. O sêmen foi congelado, armazenado

em nitrogênio líquido e descongelado após uma semana. A motilidade e o vigor espermáticos foram avaliados a

cada etapa do processo e aos 15 e 30 min após descongelação. A morfologia espermática foi avaliada após coleta e

descongelação. Nenhuma diferença foi observada entre os tratamentos após a descongelação quanto à motilidade,

vigor, porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais e longevidade. Ambas as taxas de diluição

podem ser eficientemente utilizadas na congelação do sêmen canino.

Palavras-chave: cão, sêmen, diluidor, congelação, diluição

Recebido para publicação em 17 de março de 2004

Recebido para publicação, após modificações, em 19 de outubro de 2004

E-mail: [email protected]

INTRODUCTION

Nowadays, some chilling methods have been

yielding expressive results in conserving canine

semen for several days (Iguer-Ouada, 2001),

allowing semen exchange between countries.

However, cryopreservation continues to be an

important tool for the conservation of genetic

material from valuable stud dogs for an

indefinite time. Moreover, due to philogenetic

similarities between the domestic and non-

domestic canids, the former are used as an

experimental model for the latter, mainly

because of the lack of availability of non-

domestic canids for use in experiments

(Goodrowe et al., 1998; Silva et al., 2004). For

this reason, scientific research has been carried

out in an attempt to improve different protocols

for this procedure by using different

cryoprotective agents (Soares et al., 2002; Silva

et al., 2003), extenders (Bueno et al., 2001;

Cardoso et al., 2003), freezing/thawing

processes, and several dilution rates (England,

1993).

In general, investigations on canine semen

technology use a dilution rate based on a

standardized sperm concentration. The advantage

of this method is that it is simpler to calculate the

number of spermatozoa per straw, allowing the

preparation of semen doses for artificial

insemination. Furthermore, standardized

concentration allows the researcher to determine

the exact proportion between the extender and

the sperm cells. Several authors have reported

the use of sperm concentrations ranging from

100 (Tsutsui et al., 2000; Bueno et al., 2001),

200 (Sirivaidyapong et al., 2001), 400 and

800x10

spermatozoa/ml (Peña and Linde-

Forsberg , 2000) for canine semen freezing.

On the other hand, other investigators have been

conducting their work based on a volume:volume

extension. By this method, there is no need to

count spermatozoa using counting chambers or

expensive methods such as spectrophotometry or

computer assisted semen analysis. The absence

of this step on the methodology renders it more

practical, reducing the time and the costs

involved in canine semen freezing. Thus, some

authors have been using dilutions consisting of

one part semen to: one part extender (Cardoso et

al., 2003; Silva et al., 2003), two parts extender

(Silva and Verstegen, 1995), three parts extender

(Yildiz et al., 2000) and four parts extender

(England and Ponzio, 1996).

According to England (1993), the standardized

sperm concentration method neglects the effect

of dilution upon sample viability and the

variation in extender constituent concentration.

Indeed, the studies that use variable dilution rates

do not make accurate comparisons between

extenders, as final concentrations are often

unknown. There is no evidence that the

relationship between chemical concentration and

sperm concentration is important; thus, if the

final concentration of the chemical is relevant,

studies should utilize volume:volume dilutions of

semen with an extender.

In view of the controversial information

concerning the ideal dilution rate for canine

semen, the objective of the present study was to

compare standardized sperm concentration and

volume:volume extension as dilution rates for

canine semen freezing using a tris-buffer

extender containing egg-yolk and glycerol.

MATERIAL AND METHODS

Six proven stud dogs from private kennels were

selected for this experiment: one Dobermann,

one American Staffordshire Terrier, one

Rottweiler, one Brazilian Mastiff and two

Boxers. The dogs were aged from one to six

years. The animals were maintained in individual

boxes and fed dry food once daily, with free

access to water.

Each dog was submitted to two seminal

collections by manual stimulation. Ejaculates

were collected into a funnel coupled to a

graduated tube and fractions were separated by

color modification (Johnston et al., 2001). The

sperm-rich fraction was evaluated and later

individually frozen. Semen volume, color and

viscosity were grossly evaluated. Sperm motility

(percentage of mobile spermatozoa) and vigor

(sperm motility status), scored on a scale from 0

(without movement) to 5 (fast progressive

movement), were evaluated by light microscopy

(100x). Sperm morphology was evaluated by

microscopic analysis (1000x) of a slide stained

with eosin-nigrosin, counting 200 cells per slide.

Morphologic sperm abnormalities were classified

according to Johnston et al. (2001). Sperm

concentration was determined with a Neubauer

counting chamber.

Only samples that presented a volume =0.6ml,

concentration >200x10

spermatozoa/ml, sperm

motility =80% and vigor =4 were used in the

experiment. Samples were divided in two

aliquots. The first was submitted to dilution

according to standard sperm concentration. After

determination of sperm concentration in fresh

semen, the needed extender volume was

calculated by the formula: V

, where V

is the initial volume, C

the initial concentration

in fresh semen, V

the final volume after

extension, and C

, the final sperm concentration,

which was standardized as 200x10

spermatozoa/ml. The second aliquot was

submitted to volume:volume extension based on

a proportion of one part semen to one part

extender (1:1).

An extender consisting of 3.028g tris-hydroxy-

methyl-aminomethane, 1.78g monohydrated

citric acid and 1.25g D-fructose, dissolved in

100ml distilled water (Silva et al., 2002) was

used. The osmosis of this solution was

305mOsm/l and the pH 6.6. Twenty percent of

this solution was then replaced with egg-yolk

and the extender was divided into two equal

portions. The first portion did not contain the

cryoprotector and was added to semen at 27ºC.

The second contained 12% glycerol and was

added to semen when both reached 4ºC. After

addition, the final glycerol concentration was

6%.

Semen was frozen by adding the first portion of

the extender to the semen at 27ºC immediately

after the initial analysis. A cooling period was

then allowed when the semen was maintained in

a thermal box at 15ºC for 40min, at a cooling rate

of 0,30°C/min. The semen was then transferred

to a refrigerator for a further 30 min, where it

reached 4ºC at 0.37°C/min. At the end of this

time, a second portion of extender containing

glycerol was added to the sample and sperm was

packed into 0.25ml plastic straws. Finally, all

straws were horizontally placed in a thermal box

for 5min, 5cm above the liquid nitrogen (N

)

level, reaching a temperature close to -70ºC in

vapor and then plunged into liquid N

. After one

week, the semen was thawed in a water bath at

38ºC/1min and kept there for 30min for a

thermoresistance test (Silva et al., 2003).

Sperm motility and vigor were appraised after

collection, first dilution, cooling, glycerol

addition, immediately after thawing and at 15

and 30min post-thawing on a glass slide over a

warmed plate coupled to a light microscope.

Sperm morphology was analyzed after semen

collection and thawing.

The results were expressed as mean and standard

deviation and were analyzed by the Statview 5.0

software (Statview, 1998). Percentage data

concerning to sperm motility and morphology

were subjected to arcsine transformation.

Differences among the seminal parameters of

dogs were analyzed by the Kruskal-Wallis test.

The effects of the dilution rates on sperm

motility and morphology, as well as the effects

of the incubation period on motility were

evaluated by the Student t-test. The effects of

dilution rates and incubation period on vigor

were analyzed by the Mann-Whitney- test. The

results were considered significant when P<0.05.

RESULTS AND DISCUSSION

Fresh dog semen was white in color with milky

viscosity. Values for sperm motility, vigor,

concentration and morphology, as well as second

fraction volume are shown in Table 1. Statistical

analysis showed that dogs were a homogeneous

population, since no differences were detected

among them (P>0.05). Furthermore, seminal

parameters were in the normal range for canine

species (Oettlé, 1993; Johnston et al., 2001).

Fig. 1 and 2 show similar patterns of sperm

motility and vigor for both dilution rates

throughout extension, cooling, glycerol addition

and thawing. After thawing, a reduction in

motility and vigor was observed in both

treatments, which showed no difference from

each other (P>0.05). It is possible that the

reduction of seminal quality after thawing was

due to a sum of factors, such as the

crystallization phase that occurs between –6 and

–10

C, whose effect is reduced by the addition of

the cryoprotector (Colas, 1975); the toxic action

of glycerol, which can cause physical-chemical

alterations that lead to the rupture of the sperm

membrane or the removal of important

membrane proteins in spite of having protective

effects on the sperm cell; the osmotic alterations

originating from the addition of the cryoprotector

and the ionic rearrangement that occurs during

freezing; the alterations in the lipid-protein bi-

layer and modifications in the membrane

enzymes of the sperm cell (Holt, 2000); and the

thermal shock due to the several temperature

changes to which sperm are subjected (Farstad,

1996). Many researchers have used sperm

motility as the main parameter for the evaluation

of freezing/thawing techniques applied to canine

semen (Ivanova-Kicheva et al., 1997; Bueno et

al., 2001). In this study, the percentage of mobile

spermatozoa obtained after thawing using both

dilution rates (60%) was within the ideal range

for the performance of artificial insemination

using frozen semen (Concannon and Battista,

1989).

Table 1. Means and standard deviation of the characteristics of two ejaculates obtained from donor stud dogs

Dog

Sperm motility

(%)

Sperm vigor

(0-5)

Concentration

(x10

spermatozoa/ml)

Normal sperm

(%)

fraction

volume (ml)

95.0 ? 0.0 5.0 ? 0.0 1250.0 ? 70.7 77.5 ? 8.5 0.9 ? 0.1

2 97.5 ? 3.5 5.0 ? 0.0 520.0 ? 113.1 76.0 ? 0.0 0.5 ? 0.1

3 92.5 ? 3.5 5.0 ? 0.0 885.0 ? 502.1 78.3 ? 6.7 1.6 ? 0.8

4 95.0 ? 0.0 5.0 ? 0.0 1370.0 ? 650.5 80.3 ? 3.2 2.4 ? 2.1

5 99.0 ? 1.4 5.0 ? 0.0 2760.0 ? 28.3 79.8 ? 1.1 1.9 ? 0.1

6 100.0 ? 0.0 5.0 ? 0.0 1740.0 ? 367.7 81.3 ? 5.3 1.1 ? 0.2

Total 96.5 ? 0.9 5.0 ? 0.0 1420.8 ? 228.3 79.2 ? 1.4 1.4 ? 0.3

No statistical differences were observed among dogs (P>0.05; Kruskal-Wallis test).

100

Fr Ext Cool Glyc Thaw

Evaluation stages

Sperm motility (%)

St. concentration

V:V extension

Figure 1. Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented (Glyc) and

frozen/thawed (Thaw) semen, submitted to standardized sperm concentration (St. concentration) or

volume:volume extension (V:V extension - P>0.05; Student’s t test).

3,5

4,5

Fr Ext Cool Glyc Thaw

Evaluation stages

Sperm vigor (0-5)

St. concentration

V:V extension

Figure 2. Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented (Glyc) and

frozen/thawed (thaw) semen, submitted to standardized sperm concentration (St. concentration) or

volume:volume extension (V:V extension - P>0.05; Mann-Whitney test).

The effects of semen incubation at 38ºC for

30min are shown in Tables 2 and 3. During the

thermoresistance test, sperm motility declined

significantly 15min after thawing in both

treatments, but vigor only declined at 30min

(P<0.05). However, at 15min, both parameters

were still within the acceptable range (30 – 50%)

for the use of frozen semen for insemination

(Concannon and Battista, 1989). Furthermore,

15min is more than enough time for the semen to

reach the fertilization site, since Tsutsui et al.

(1989) showed that canine spermatozoa can

reach the uterine horn 2min after vaginal

deposition. On the other hand, post-thawing

dilution could improve sperm longevity, as

shown by other authors (Ström et al., 1997; Peña

and Linde-Forsberg, 2000).

Table 2. Sperm motility of thawed canine semen

submitted to standardized sperm concentration or

volume:volume extension and maintained at

38°C for 30 minutes

Sperm motility (%)

Evaluations post

thawing (min)

Standardized

concentration

V:V extension

0 54.6 ± 11.2a 61.3 ± 9.1a

15 41.3 ± 10.9b 44.6 ± 13.1b

30 26.3 ± 16.5c 31.3 ± 15.4c

Values followed by different lower case letters differ between

rows (P<0.05; Student’s t test); no differences between

columns were observed (P>0.05; Student’s t test).

Table 3. Sperm vigor of thawed canine semen

submitted to standardized sperm concentration or

volume:volume extension and maintained at

38°C for 30 minutes

Sperm vigor (0-5)

Evaluations post

thawing (min)

Standardized

concentration

V:V extension

0 4.0 ± 0.3a 4.1 ± 0.2a

15 3.8 ± 0.4a 3.8 ± 0.7a

30 2.6 ± 1.2b 3.0 ± 1.1b

Values followed by different lower case letters differ between

rows (P<0.05; Man-Whitney test); no differences between

columns were observed (P>0.05; Man-Whitney test).

In human species (Alvarez et al., 1996), the

thermoresistance test has been shown to be a safe

clinical test to predict the fertilizing potential of

semen. However, in the dog, Ström et al. (1997)

stated that low sperm longevity is not necessarily

associated with low fertility. These authors found

a high sperm motility after thawing (74%), but

semen showed low longevity (20% after 1h at

37°C). However, a fertility rate of 85% was

obtained in intra-uterine artificial insemination.

Thus, the existence of a correlation between

post-thawing sperm longevity and in vivo fertility

rate needs to be confirmed.

Even if the dogs used in this experiment initially

constituted a homogeneous population (Table 1),

wide individual variability was observed in

response to the freezing procedure and in the

thermoresistance test, with 30-70% variation in

sperm motility immediately after thawing, and a

0-50% variation at 30min. According to Yu et al.

(2002), one aspect of sperm cryobiology that is

different from other types of cells is the fact that

spermatozoa from different individuals may

exhibit significantly different responses to the

same freezing treatment, which has also been

observed among dogs (Silva et al., 2003).

Oettlé (1993) described the relationship between

the percentage of morphologically normal

spermatozoa and fertility in dogs. This author

verified that samples with less than 60%

morphologically normal sperm population rate

would cause a significant reduction in fertility.

Concerning this parameter, in the present study

no differences were observed between fresh and

thawed semen for either treatment (P>0.05)

regarding normal sperm morphology rate, which

was higher than 70% (Table 4). This shows that

the freezing protocols were efficient in

preserving sperm morphology, regardless of the

dilution rate. Detached sperm heads were the

most frequent abnormality found both in fresh

and in frozen semen. However, by analyzing

separately each sperm abnormality, a higher

incidence of kinked and coiled tails was verified

in both treatments compared to fresh semen

(P<0.05). This finding was probably due to the

cold shock effect or to glycerol exposure, as

reported for red wolves (Goodrowe et al., 1998).

Moreover, a freezing procedure using

volume:volume extension showed a low

incidence of proximal droplets (P<0.05).

Possibly, freezing/thawing procedures damaged

the droplet membrane releasing its enzymes,

which could have adverse effects on semen

viability. Even if no acrosome abnormality was

seen in fresh semen, no differences were found

between fresh and frozen semen (P>0.05). The

staining method used in this experiment was not

efficient in showing internal acrosome details,

and only acrosome detachment was verified in

frozen semen. Finally, a higher rate of bent

midpieces was verified in fresh than in frozen

semen using a standardized concentration

(P<0.05). This is an uncommon fact that is

difficult to explain since this abnormality was

not verified in three ejaculates after freezing,

which randomly reduces the normal distribution

of bent midpieces.

Table 4. Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed semen submitted to standardized

sperm concentration or volume:volume extension

Sperm morphology (%)

Fresh

Standardized

concentration

V:V extension

Normal sperm

79.2 ? 1.4 76.5 ? 4.8 74.3 ? 6.9

Head abnormalities

Detached head 11.6 ? 3.2 10.8 ? 2.2 12.2 ? 3.3

Double head 0.4 ? 0.2 0.0 ? 0.0 0.4 ? 0.2

Macrocephalic 0.1 ? 0.2 0.3 ? 0.6 0.1 ? 0.2

Microcephalic 0.1 ? 0.3 0.1 ? 0.2 0.0 ? 0.0

Pyriform head 0.3 ? 0.4 0.2 ? 0.5 0.2 ? 0.4

Detached acrosome 0.0 ? 0.0 0.3 ? 0.5 0.1 ? 0.2

Midpiece abnormalities

Thickened midpiece 0.0 ? 0.0 0.0 ? 0.0 0.1 ? 0.2

Bent midpiece 2.3 ? 1.7A 0.9 ? 0.9B 1.3 ? 0.9AB

Proximal droplet 0.2 ? 0.3A 0.1 ? 0.2AB 0.0 ? 0.0B

Distal droplet 0.1 ? 0.2 0.0 ? 0.0 0.0 ? 0.0

Abaxial insertion 0.3 ? 0.4A 0.0 ? 0.0B 0.1 ? 0.2B

Tail abnormalities

Kinked tail 1.7 ? 1.1A 4.3 ? 1.7B 4.3 ? 2.4B

Coiled tail 4.0 ? 1.5A 6.0 ? 2.9B 6.8 ? 2.9B

Strongly coiled tail 0.5 ? 1.1 0.6 ? 1.2 0.6 ? 1.0

Double 0.0 ? 0.0 0.1 ? 0.2 0.1 ? 0.1

Values followed by different capital letters differ among columns (P<0.05; Student’s t test).

According the dilution rates, no differences were

verified in the seminal characteristics, except for

some morphological abnormalities. In addition,

while the standard sperm concentration was

always 200x10

spermatozoa/ml, the final sperm

concentration in volume:volume extension

ranged from 220 to 1390x10

spermatozoa/ml,

with an average of 684.1?403.6x10

spermatozoa/ml. In general, special attention

should be given to dilution rate, which seems to

be an important factor influencing semen

viability after the freezing/thawing process.

Mann (1964) suggested that excessive dilution

leads to permanent loss of motility, metabolic

activity and fertilizing capacity in vivo. The

mechanism of sperm inactivation by excessive

dilution resembled senescence of spermatozoa

during storage as a result of cold shock, because

there is evidence that such treatments do indeed

result in the destabilization of sperm membranes

and impairment of their function. Furthermore,

recent reports have shown that seminal plasma

proteins are important for the maintenance of

semen viability in rams, preventing cold-shock

damage to the spermatozoal membrane (Barrios

et al., 2000; Pérez-Pé et al., 2001). In dogs, an

excessive dilution could minimize the beneficial

effects of proteins from testicular and epidydimal

fluids present in sperm fraction. In fact, very

high dilution rates, such as one part of semen to

16 or 32 parts extender, cause a significant

decrease in sperm progressive motility (Wales

and White, 1963; England, 1993). Otherwise, for

stallion semen, Varner et al (1987) reported that

dilution rates based in a lower standardized

concentration of 25x10

spermatozoa/ml

improved the longevity of spermatozoa motility

and showed better results than dilutions in

greater sperm concentrations such as 50 and

100x10

spermatozoa/ml. Thus, further studies

must to be conducted in order to determine the

efficiency of other dilution rates using other

extenders and freezing/thawing procedures for

canine semen.

In conclusion, a sperm concentration

standardized at 200x10

spermatozoa/ml and

volume:volume extension at one part semen to

one part extender are efficient dilution rates for

canine semen freezing.

ACKNOLEDGEMENTS

The authors thank Capes and CNPq for financial

support and DVM Daniel C. Uchoa (Grande

Canafístula Kennel) for providing the animals

used in the experiment.

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7. CAPÍTULO 02

Influence of temperature for glycerol addition and post thaw dilution on

the quality of canine frozen semen

Influência da temperatura de adição de glicerol e diluição pós-descongelação

na qualidade do sêmen canino congelado

Reproduction in Domestic Animals

In Press, Ref. RDA 630

(Aceito para publicação em 29 de julho de 2005)

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi comparar a temperatura ambiente (27ºC) e a de 4ºC para a

adição de glicerol na criopreservação de sêmen canino e verificar o efeito de diferentes diluições

pós-descongelação sobre o sêmen canino. Dez ejaculados oriundos de cinco cães foram coletados

por manipulação digital. As amostras de sêmen foram avaliadas e posteriormente divididas em duas

alíquotas. A primeira alíquota foi diluída em Tris-gema-glicerol a 27ºC e a segunda recebeu o

glicerol a 4ºC. As amostras foram congeladas e estocadas em nitrogênio líquido. Após uma semana,

as amostras foram descongeladas e submetidas à avaliação de motilidade espermática progressiva,

morfologia, integridade acrossomal, teste hipo-osmótico (HOST) e teste de termorresistência. Para

o teste de termorresistência, as alíquotas foram divididas em duas porções: uma porção foi mantida

sem diluição e a outra foi diluída na proporção de uma parte de sêmen para quarto partes de diluente

(1:4). Nenhuma diferença foi observada entre as temperaturas de adição de glicerol no que se refere

aos parâmetros seminais avaliados. Além disso, as diluições pós-descongelação demonstraram

efeitos similares sobre a longevidade espermática canina. Correlações entre a motilidade

espermática pós-descongelação e os resultados do HOST e do teste de termorresistência foram

observadas em ambas as temperaturas de adição de glicerol. Em conclusão, o glicerol pode ser

adicionado ao sêmen canino à temperatura ambiente (27ºC) ou a 4ºC. Ademais, não existe

necessidade de diluir o sêmen após a descongelação para realização do teste de termorresistência,

mas se for necessário aumentar o volume para inseminações artificiais, a adição do diluente não vai

prejudicar o sêmen.

Influence of Temperature during Glycerol Addition and Post-Thaw Dilution on the

Quality of Canine Frozen Semen

AR Silva, RCS Cardoso and LDM Silva

Laboratory of Carnivore Reproduction – State University of Ceará, Fortaleza, Brazil

Contents

The aim of the present study was to compare room

temperature (27ºC) and 4ºC for glycerol addition on

canine semen cryopreservation and verify the effect of

different post thawing dilutions on canine semen. Ten

ejaculates from five stud dogs were collected by digital

manipulation. Semen samples were evaluated and further

divided into two aliquots. The first aliquot was extended

in Tris-egg yolk-glycerol at 27ºC and the second one

received glycerol at 4ºC. Samples were frozen and stored

in liquid nitrogen. After one week, samples were thawed

and submitted to evaluations of progressive sperm

motility, morphology, acrosomal integrity, hypo-osmotic

swelling (HOST) and thermoresistance tests. For

thermoresistance test, aliquots were divided in two

portions: one portion was kept undiluted (1:0) and the

other one was diluted in a one part semen to four parts

extender (1:4) ratio. No differences were observed

between temperatures for glycerol addition regarding

seminal parameters evaluated. Furthermore, post-thawing

dilutions demonstrated similar effect on canine semen

longevity. Correlations among post-thaw sperm motility

and HOST and results from thermoresistance test were

observed for both temperatures for glycerol addition. In

conclusion, glycerol could be added to canine semen at

room temperature (27ºC) or at 4ºC. Moreover, there is no

need to extend canine semen after thawing for the

thermoresistance test, but if we need to increase the

inseminating volume for artificial inseminations, the

addition of extender will not damage the semen.

Introduction

Glycerol (Polge et al., 1949) is the cryoprotectant most

frequently used for semen cryopreservation in several

species (Vidament et al., 2000; Gil et al., 2003), including

the dog (Silva et al., 2002, 2003). However, some factors

such as the concentration (Peña et al., 1998) and the form

of glycerol addition (Silva et al., 2003) could influence

semen cryopreservation. Moreover, temperature for

glycerol addition remains as a controversial factor that has

been revised in several species such as ovine (Vidament et

al., 2000) and equine (Gil et al., 2003).

For canine species, there is scarce and controversial

information concerning this subject. Some authors used

glycerol addition at different temperatures, such as: at

37ºC (Peña et al., 1998), at 35 ºC (Nothling and

Shuttleworth, 2005), at 32ºC (Yildtz et al., 2000) or at

room temperature (Rota, 1998). However, Foote (1982)

reported that glycerol could be toxic to mammalian

sperms when added at high temperatures in some media

but not in others. According to Silva et al. (2003) and

Rota et al. (2005), the addition of glycerol could be

performed after cooling at 4ºC. This procedure would

reduce the exposure of sperm cell to cryoprotectant,

decreasing its damage on spermatozoa. Anyway, there is a

lack of studies comparing different temperatures for

glycerol addition to canine semen.

The analysis of multiple parameters related to the

functional and morphologic characteristics of spermatozoa

increases the predictability of the fertilizing potential of a

semen sample (Peña-Martinez, 2004). In this way,

evaluation of practical and cheap tests such as acrosomal

status (Rodrigues, 1997), hypo-osmotic swelling (England

and Plummer, 1993) and thermoresistance (Strom et al.,

1997) can also be used for this purpose. Peña and Linde-

Forsberg (2000) evaluated methodologies for canine

semen cryopreservation by thermoresistance test and

suggested that sperm longevity is increased when post

thaw dilutions are conducted. In addition, studies about

post-thaw dilution are important also for understanding

the behavior of thawed sperm when expansion is needed

to increase inseminating volume for intra-vaginal artificial

inseminations.

The aim of present study was to compare room

temperature (27ºC) and 4ºC for glycerol addition on

canine semen cryopreservation by correlating immediate

post-thaw sperm motility and results from sperm

morphology, acrosomal status, hypo-osmotic swelling and

thermoresistance tests. Moreover, this work intends to

verify the effect of different dilutions used for the

thermoresistance test on frozen-thawed canine semen.

Material and Methods

Animals

Five proven stud Boxer dogs from a private kennel

were selected for this experiment. The dogs were aged

from one to six years. The animals were maintained in

individual boxes and fed dry food once daily, with free

access to water.

Semen collection and initial evaluation

Each dog was submitted to two seminal collections by

manual stimulation in a one week interval. Ejaculates

were collected into a funnel coupled to a graduated tube

and semen fractions were separated by color modification.

The sperm-rich fraction was evaluated and later

individually frozen. Semen volume and color were grossly

evaluated. Progressive sperm motility was evaluated by

light microscopy (100x). Sperm cell morphology and

acrosomal status were evaluated by phase-contrast

microscopy (1000x) analyzing a slide stained with Bengal

Rose (Rodrigues, 1997), counting 200 cells per slide.

Sperm morphologic abnormalities were classified as

primary and secondary (Silva et al., 2003). Sperm

concentration was determined using a Neubauer counting

chamber. Hypo-osmotic swelling and thermoresistance

tests were performed after sperm collection and both are

described later. Only the samples presenting a volume >

0.6mL, concentration > 200 x 10

spermatozoa/mL, sperm

motility > 80% and vigor > 4 were used in the experiment.

Semen processing

An extender consisting of 3.028g Tris-hydroxymethyl-

aminomethane, 1.78g monohydrated citric acid and 1.25g

D-fructose, dissolved in 100mL distilled water (Silva et

al., 2002) was used. The osmosis of this solution was

295mOsm/L and the pH 6.6. Twenty percent of this

solution was then replaced by egg-yolk (V/V). During

initial analysis, the semen remained at room temperature

(27°C) for approximately 10 min and was divided into

two aliquots. At 27ºC, the first aliquot was extended in a

ratio of one part semen to one part Tris-egg yolk plus 6%

glycerol (Group 27ºC); the second aliquot was initially

extended at one part semen to a half part Tris-egg yolk,

without glycerol (Group 4ºC). Semen was kept in a

thermal box for 40 min aiming to reach 15ºC, at a cooling

rate of -0.30°C/min. Samples were then transferred to a

refrigerator for a further 30 min, where they reached 4ºC

at -0.37°C/min rate. After cooling, the second aliquot

(Group 4ºC) was added to the other half part Tris -egg yolk

plus 12% glycerol also at 4ºC, which provided a final

concentration of 6% glycerol in the extender. Final

dilution rate for both aliquots was one part semen to one

part extender (1:1). Progressive sperm motility was

reevaluated by light microscopy (100x) at this time.

Samples were packed into 0.25mL plastic straws, which

were placed horizontally in a thermal box for 5 min, 5cm

above the liquid nitrogen (N

) level, reaching a

temperature close to -70ºC in the vapor. Finally, straws

were plunged into liquid N

for storage. One week later,

samples were thawed in a water bath at 38ºC/1 min and

reevaluated.

Hypo-osmotic swelling test (HOST)

For the evaluation of sperm membrane function, a

HOST (England and Plummer, 1993) was performed for

fresh and frozen-thawed semen. A hypo-osmotic solution

(150 mOsm/L), constituted by 7.35g sodium citrate plus

13.51g fructose dissolved in 1000mL distilled water, was

used. After collection and immediately after thawing

(Groups 4ºC and 27ºC), 0.01mL semen was diluted in

0.09mL hypo-osmotic solution and kept in a water bath at

38ºC. After 45 min, a sperm aliquot was placed on a glass

slide, covered by a coverslip and evaluated by microscopy

under 400x magnification, counting 200 cells.

Spermatozoa presenting swollen coiled tails were

considered as presenting a functional sperm membrane.

Thermoresistance test

For the evaluation of sperm longevity, a

thermoresistance test (Strom et al., 1997) was conducted

for both fresh and frozen-thawed semen. After collection,

one part fresh semen was diluted in four parts Tris-

extender (1:4) and kept at 38 °C in water bath. Progressive

sperm motility was evaluated at 30, 60, 90 and 120

minutes after dilution. Sperm morphology and acrosomal

status were also evaluated immediately after semen

collection and after 60 min.

Immediately after thawing, semen samples from both

groups (27ºC or 4ºC) were divided into two aliquots that

were kept at 38 ºC in water bath. The first aliquot was

kept undiluted (1:0) and the second was diluted in a one

part thawed semen to four parts Tris -extender (1:4) ratio.

Progressive sperm motility was evaluated immediately

after and at 30, 60, 90 and 120 min after thawing. Sperm

morphology and acrosomal status were evaluated

immediately after thawing and after 60 min only in 1:4

diluted samples.

Statistical analysis

The results were expressed as mean and standard

deviation and analyzed by the Statview 5.0 software (SAS

Institute Inc., 1998). Percentage data were arcsine

transformed. The effects of the temperature for glycerol

addition on progressive sperm motility, morphology,

acrosome integrity and HOST as well as the effects of

post thawing dilutions and incubation period on sperm

motility and morphology were evaluated by the Student’s

t test (P < 0.05). To evaluate dog effect and its interactions

with effects of temperature for glycerol addition, post

thawing dilutions and incubation period on the variables

studied, data were subjected to analysis of variance

followed by Fisher’s PSLD test (P < 0.05).

Presence of correlations among post thaw sperm

motility and morphologically normal spermatozoa, normal

acrosomes, HOST and sperm motility at 60 and 120 min

were analyzed by Spearman’s Correlation Test (P < 0.05)

only for 1:4 diluted sample using both temperatures for

glycerol addition (Groups 4ºC and 27ºC).

Results

Fresh dog semen was white-milky in color. The volume of

sperm rich fraction was 0.71 ± 0.17 mL, with a sperm

concentration of 1.07 ± 0.37 x 10

spermatozoa/mL.

Progressive sperm motility was 96.5 ± 3.3% spermatozoa.

Sperm with normal morphology was 90.7 ± 3.9%, with

98.0 ± 1.5% of acrosomal integrity.

100

Fr Cool Thaw

Evaluation stages

Sperm motility (%)

27ºC

4ºC

Fig. 1: Progressive sperm motility of fresh (Fr), cooled

(Cool) and frozen/thawed (Thaw) semen submitted to

glycerol addition at 27ºC or 5ºC (P > 0.05 - Student’s t

test)

No differences regarding progressive sperm motility

(Figure 01) were observed between temperatures for

glycerol addition after cooling period or after thawing (P

> 0.05).

There was a significant decline (P < 0.05) in the

normal spermatozoa percentage after thawing (Table 1),

maybe due to a high incidence of secondary

abnormalities, such as acrosomal defect and coiled tails,

for both treatments. However, no difference was observed

between the temperatures for glycerol addition (P > 0.05)

regarding sperm morphology after thawing. Concerning

acrosomal status (Table 2), a decline in the number of

spermatozoa with normal acrosome was observed after

thawing, when a high number of swelling acrosome was

verified (P < 0.05), but no differences were observed

between temperatures for glycerol addition (P > 0.05).

Regarding HOST, 96.7 ± 1.0% sperm with

functional membrane were observed in fresh semen. A

significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane

functionality was found after thawing for both treatments,

although no differences were shown between temperatures

for glycerol addition. Values of 33.5 ± 9.1% and 39.6 ±

13.7% reacting spermatozoa were observed after thawing

for glycerol addition at 27º and 4ºC, respectively.

Table 1: Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine semen after glycerol addition at 27ºC or 4ºC

evaluated immediately after semen collection or thawing and after 60min, under dilution of one part semen to four

parts extender (1:4).

Frozen-thawed semen

Fresh semen

Glycerol addition at 27ºC Glycerol addition at 4ºC

0’ 60’ 0’ 60’ 0’ 60’

Normal sperm 90.7 ± 4.0

88.4 ± 4.2

86.3 ± 3.8

87.7 ± 4.2

86.9 ± 3.1

87.8 ± 5.1

Abnormalities

Primary 1.9 ± 31.3 1.3 ± 0.6 1.3 ± 1.0 0.9 ± 1.0 1.2 ± 1.3 1.2 ± 1.2

Secondary 7.4 ± 4.1

10.3 ± 4.4

12.1 ± 4.1

11.4 ± 4.1

11.6 ± 3.7

11.0 ± 4.8

Total 9.3 ± 4.0

11.6 ± 4.2

14.3 ± 4.0

12.3 ± 4.2

13.1 ± 3.2

12.2 ± 5.1

A,B

Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test)

Table 2: Acrosomal status (%) of fresh and frozen-thawed canine semen after glycerol addition at 27ºC or 4ºC

evaluated immediately after semen collection or thawing and after 60min, under dilution of one part semen to four

parts extender (1:4).

Frozen-thawed semen

Fresh semen

Glycerol addition at 27ºC Glycerol addition at 4ºC

Acrosome 0’ 60’ 0’ 60’ 0’ 60’

Normal 98.7 + 1.5

98.5 + 1.6

94.7 + 2.2

96.0 ± 2.6

97.0 ± 1.0

97.2 + 2.0

Absent 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ± 0.2 0.2 ± 0.6 0.1 ± 0.2 0.0 ± 0.0

Swollen 0.6 ± 0.7

0.2 ± 0.5

3.4 ± 2.3

2.2 ± 1.9

1.8 ± 1.3

1.8 ± 1.4

Ruptured 0.1 ± 0.3 0.1 ± 0.2 0.4 ± 0.5 0.4 ± 0.6 0.1 ± 0.2 0.5 ± 1.0

Deformed 0.4 ± 0.7 0.5 ± 0.8 1.0 ± 1.1 0.3 ± 0.5 0.4 ± 0.5 0.2 ± 0.4

Cystic 0.3 ± 0.4 0.7 ± 0.9 0.5 ± 0.7 1.1 ± 1.1 0.6 ± 0.9 0.4 ± 0.3

A,B,C

Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 – Student’s test)

Table 3: Progressive sperm motility (%) of fresh and frozen-thawed canine semen after glycerol addition at 27ºC or

4ºC in the undiluted (1:0) and diluted one part semen to four parts extender (1:4) samples, kept at 38 °C for 120 min

Frozen-thawed semen

Glycerol addition at 27ºC Glycerol addition at 4ºC

Evaluations

Fresh semen

1:0 1:4 1:0 1:4

0 96.5 ± 3.4

65.5 ± 10.9

57.5 ± 15.0

65.0 ± 8.5

61.0 ± 14.1

30 85.0 ± 8.8

41.5 ± 22.6

42.0 ± 18.9

45.0 ± 17.16

46.0 ± 15.1

60 79.0 ± 9.9

30.0 ± 14.7

30.5 ± 16.3

30.0 ± 14.7

33.5 ± 15.1

90 72.0 ± 9.5

9.8 ± 14.5

13.8 ± 14.3

19.0 ± 16.8

21.0 ± 17.6

120 68.0 ± 10.6

4.5 ± 8.7

10.3 ± 12.0

9.0 ± 11.1

16.0 ± 16.8

A,B,

Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test);

a,b,c,d,e

Values followed by different lower case letters differ between rows (P < 0.05 - Student’s t test);

During the thermoresistance test, no differences were

observed between the temperatures for glycerol addition

and neither among the different post-thaw dilutions (P >

0.05) regarding progressive sperm motility (Table 3). A

negative effect of incubation time was observed, since that

in each evaluation, there was a significant decline in

sperm motility in all the groups (P < 0.05). In all

evaluations, values for fresh semen were always higher

than post thawing values for all the groups (P < 0.05).

The effect of the dog was significant on all the

parameters studied (P < 0.05), except on HOST results (P

> 0.05). However, interactions were only observed

between dog and incubation period during

thermoresistance test at 90 and 120 min evaluations (P <

0.05).

Using glycerol addition at 27ºC, there were

statistically significant correlations (P<0.05) between

immediate post-thaw sperm motility and HOST (r=75.9%)

and motility at 60 min (r=77.5%) and at 120 min

(r=42.2%). No significant correlations between post-thaw

sperm motility and morphologically normal spermatozoa

or normal acrosomes were found (P>0.05). In the use of

4ºC, statistically significant correlations (P<0.05) were

verified between immediate post-thaw sperm motility and

HOST (r=74.6%), motility at 60 min (r=88.5%) and at

120 min (50.6%). There was no significant correlation

between post thaw sperm motility and morphologically

normal spermatozoa or normal acrosomes (P>0.05).

Discussion

Despite its protective effects, glycerol might induce

changes in lipid packing structure of the sperm membrane

and hence the stability and water permeability of the cell

would be altered. Such changes can contribute to reduce

sperm longevity and accelerate its capacitation (Watson,

1995). The possibility of reducing these toxic effects by

lowering the temperature was reported for ram semen,

since the membrane intactness was higher and the

proportion of acrosome-reacted spermatozoa was lower

when glycerol was added at 5ºC instead of 15ºC (Gil et

al., 2003). On the other hand, Vidament et al. (2000)

showed that stallion sperm motility and fertility are

improved when glycerol is added at 22ºC instead of 4ºC.

For canine species, this is the first report to compare

room temperature (27ºC) and 4ºC for glycerol addition,

and no differences between them were observed regarding

post-thaw sperm motility, morphology, acrosomal

integrity, membrane functionality or longevity. These

results agree with those found by Peña et al. (1998), who

reported no differences on post-thaw sperm motility, live

spermatozoa percentage and acrosomal integrity after

glycerol addition at 37ºC or 4º. Our results also showed

that is unnecessary to keep the semen samples and the

extender in water bath at 37ºC prior to freezing procedure.

Moreover, a cooling time before glycerol addition is not

necessary, suggesting that a glycerol-added extender

could be combined with canine semen at room

temperature in a one-step method. These results disagree

from those reported by Okano et al. (2004), who

suggested that sufficient time for cooling before glycerol

addition may be essential for the preservation of sperm

quality after freezing/thawing procedure.

It has previously been shown that canine spermatozoa

tolerate exposure to hypertonic solutions of permeating

cryoprotectants, especially glycerol (Songsassen et al.,

2002), which could be one hypothetic explanation for

canine spermatozoa to be low sensitive to different

temperatures for glycerol addition. Furthermore, the

constitution of plasmatic membrane gives to canine sperm

cell an inherent resistance to thermal stress since it has a

low ratio of polyunsaturated : saturated phospholipid fatty

acids (Bouchard et al., 1990).

Sperm motility remains as the main parameter used to

evaluate cryopreservation techniques. In our study, 65%

progressive motile spermatozoa were found immediately

after thaw with both treatments. This value is within the

range currently reported for frozen-thawed canine semen

(Peña and Linde-Forsberg, 2000; Silva et al, 2003).

However, Rota et al. (2005) reported that the subjective

evaluation of immediate post-thaw motility alone might

not be a sensitive enough parameter to pick differences

that can be better evaluated by other methods.

Oettlé (1993) reported that normal sperm morphology

would be better correlated with in vivo fertility than sperm

motility, since a decrease in fertility would be observed

should semen samples with less than 60% normal

spermatozoa be used for inseminations. The present study

showed a reduction in normal sperm morphology after

freeze-thaw at both treatments. The freeze-thaw process

inducing a high incidence of tail and acrosomal defects

may explain it. Despite of this, morphological

abnormalities are not higher than 20% and thawed semen

could still be used for artificial insemination. In addition,

post-thaw acrosomal integrity may also be a useful

indicator of semen quality (Ferguson et al., 1989). In our

study, the decline in acrosomal integrity after thawing was

less than 5%.

Concerning to HOST, 33.5% and 39.6% reacted

spermatozoa were found after thawing for glycerol

addition at 27º or 4ºC, respectively, in the use of a

150mOsm solution. Better results (56%) for canine

thawed semen were reported by Kumi-Diaka (1993) that

tested different hyposmotic solutions and found that

60mOsm/L solution promoted a maximal number or

reacted spermatozoa. In our study, it was also observed a

decrease in percentage of reacted spermatozoa after

thawing when comparing to fresh semen. Kumi-Diaka

(1993) suggested that freezing procedure could disrupt

sperm cytoplasmatic membrane, leading to loss of

intracellular solute and decreasing the percentage of

reacted spermatozoa. Significant correlations (75%) were

verified between HOST and immediate post-thaw sperm

motility in our study. Similar correlations were reported

by Rota et al. (2005) for canine thawed semen, but a

relationship between HOST response and fertilizing

capacity of dog spermatozoa has not yet been established

(Peña-Martinez, 2004), as reported for humans (Jeyedran

et al., 1992).

This study showed that there is no need to extend

canine semen after thawing for the thermoresistance test.

These results disagree with those reported by Peña and

Linde-Forsberg (2000) who suggested that a 1:4 post

thawing dilution could improve canine sperm longevity.

However, these authors incorporated Equex (Nova

Chemical Sales Inc., Sicuate, MA, USA) to the extender,

which was previously reported to increase longevity of

canine spermatozoa (Rota et al., 1997). Anyway, our

results demonstrate that the post-thawing dilution

provokes no damage to spermatozoa and canine semen

could be normally extended to increase the inseminating

volume. Furthermore, the present study found 30%

progressive motile sperm after one hour at 38ºC after thaw

and this value was correlated with immediate post-thaw

sperm motility. However, the existence of a correlation

between post-thawing sperm longevity and in vivo fertility

rate needs to be confirmed for the dog.

Excepting results from HOST, all parameters

were affected by the dog factor, indicating that different

dogs may have different sensitivities to the freezing

procedure, as previously reported by Rota et al. (2005).

In conclusion, glycerol could be added to canine

semen at room temperature (27ºC) or at 4ºC. Moreover,

there is no need to extend canine semen after thawing for

the thermoresistance test, but if it is necessary to increase

the inseminating volume for artificial inseminations, the

addition of extender will not damage the semen.

Acknowledgments

The authors thank Capes by grants and CNPq for

financial support, and DVM Daniel C. Uchoa (Grande

Canafístula Kennel) for providing the animals used in the

experiment.

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Submitted: 19.05.2005

Author’s address (for correspondence): Alexandre R. Silva,

Rua Aracati, 69, Benfica, 60020-240, Fortaleza - Ceará,

Brazil. E-mail: [email protected]

8. CAPÍTULO 03

Prognostic value of canine frozen-thawed semen parameters

on in vitro sperm-oocyte interactions

Valor preditivo dos parâmetros do sêmen canino congelado-descongelado sobre

as interações espermatozóides-oócitos in vitro

Theriogenology

Ref: THERIO-D-05-0034

Aceito para publicação em 19 de dezembro de 2005

RESUMO

A combinação dos dados obtidos a partir da análise convencional de sêmen com os

resultados de testes de penetração oocitária poderia melhorar a avaliação da habilidade fertilizante

de uma amostra de sêmen. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o valor preditivo de

diferentes parâmetros seminais sobre as interações in-vitro entre o sêmen canino

congelado/descongelado e oócitos homólogos. Dez ejaculados oriundos de cinco cães foram

coletados por manipulação digital. As amostras de sêmen foram avaliadas, diluídas em Tris-gema-

glicerol, congeladas e estocadas em nitrogênio líquido, e descongeladas após algumas semanas. As

amostras foram então avaliadas quanto aos padrões de motilidade e populações espermáticas pela

análise computadorizada (CASA), quanto à integridade da membrana plasmática pela coloração de

diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio, e quanto à morfologia espermática pela

coloração de Rosa de Bengala. O sêmen descongelado foi também incubado com oócitos

homólogos por 18 h em atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar a 38ºC e as interações

espermatozóides-oócitos foram avaliadas. Um modelo de regressão linear simples foi aplicado para

obter as relações entre as interações espermatozóides-oócitos e os parâmetros seminais. Relações

significativas foram verificadas entre: porcentagem de oócitos ligados a espermatozóides e

freqüência de batimento de cauda - BCF (R

=63%), porcentagem de oócitos interagidos com

espermatozóides e BCF (R

=73%); número de espermatozóides penetrados e velocidade média na

trajetória -VAP (R

=64%) e velocidade linear - VSL (R

=64%). As análises de integridade de

membrana plasmática e morfologia espermática apresentaram baixo valor preditivo para as

interações in vitro entre espermatozóides caninos congelados/descongelados e oócitos homólogos.

Por outro lado, alguns padrões da motilidade espermática avaliados pela CASA apresentaram valor

preditivo para as interações espermatozóides-oócitos in vitro na espécie canina.

Prognostic value of canine frozen-thawed semen parameters

on in vitro sperm-oocyte interactions

Alexandre R. Silva

, Rita de Cássia S. Cardoso

, Lúcia D. M. Silva

, Viviane H. Chirinéa

, Maria

D. Lopes

, Fabiana F. Souza

Laboratory of Carnivore Reproduction – FAVET, UECE, Paranjana Ave. 1700, Itaperi, 60740-000,

Fortaleza, Ceará, Brazil

Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals – Department of Animal Reproduction

and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, s/nº, 18618-000, Botucatu,

São Paulo, Brazil.

Laboratory of Animal Reproduction - UNIRP, Rod. BR 153, Km 69, São José do Rio Preto, São

Paulo, Brazil

Running Title: Prognostic values of canine semen parameters

Abstract

Combining the data from conventional semen analysis with oocyte penetration assays should

improve the assessment of the fertilizing ability of a semen sample. Thus, the objective of the

present study was to evaluate the prognostic value of various semen parameters on the in vitro

interactions between frozen-thawed canine sperm and homologous oocytes. Ten ejaculates from

five stud dogs (2 ejaculates/dog) were collected by digital manipulation. Semen samples were

evaluated, extended in Tris-egg yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen, and thawed

several weeks later. Samples were evaluated for motility and sperm populations by computer-aided

semen analysis (CASA), plasma membrane integrity (carboxy-fluorescein diacetate and propidium

iodide), and sperm morphology (Bengal Rose). Thawed spermatozoa were also incubated with

homologous oocytes for 18 h in an atmosphere of 5% CO

and 95% air at 38 ºC and sperm-oocyte

interactions were evaluated. Simple linear regression models were calculated with sperm parameters

as independent variables and sperm-oocyte interactions as the dependent variable. There were

significant associations between: percentage of oocytes bound to spermatozoa and beat cross

frequency (BCF; R

=63%); percentage of oocytes that interacted with spermatozoa and BCF

=73%); and number of penetrated spermatozoa and velocity average pathway (VAP; R

=64%)

and velocity straight line (VSL; R

=64%). Although plasma membrane integrity and sperm

Corresponding author: Rua Aracati 69, Benfica, 60020-240, Fortaleza – Ceará, Brazil.

morphology had little prognostic value for in vitro interactions between canine frozen-thawed

sperm and homologous oocytes, some motility patterns (evaluated by CASA) were predictive of in

vitro sperm-oocyte interactions.

Keywords: Dog; Semen; Freezing; Oocyte; CASA

1. Introduction

Cryopreservation induces a series of osmotic, chemical, and mechanical stresses to sperm,

causing death of some sperm and severe post-thaw damage in surviving cells, reducing fertilizing

ability [1]. Thus, frozen-thawed sperm should be evaluated to assess cell integrity [2].

The ultimate goal of frozen semen evaluation is to predict the fertility of a sample when

inseminated into a bitch of normal fertility [3]. Historically, researchers analyzed semen samples by

subjectively assessing sperm motility and morphology [4,5]. More recently, evaluations have

included the integrity of the plasma membrane [6] and computer-aided semen analysis (CASA) [7].

The development of tests that assess the functional status of sperm cells, such as the sperm-oocyte

interaction test [8], have greatly improved semen analysis. Therefore, combining conventional

semen analysis with the results of oocyte penetration assays should provide a reliable method to

assess the fertilizing ability of semen samples [9], as recently reported for humans [10] and cattle

[11]. Since these tests are currently not used in dogs, there is a lack of information concerning

associations between standard tests of semen quality and the sperm-oocyte interaction test in dogs.

The aim of the present study was to evaluate the prognostic value of semen measurements

e.g. sperm motility patterns and sperm populations identified by CASA, plasma membrane

integrity, and sperm morphology, on the in vitro interaction between frozen-thawed canine sperm

and homologous oocytes.

2. Materials and methods

2.1. Animals

Five privately-owned, proven stud dogs (one Brazilian Mastiff and four Boxers) were

selected for this experiment. The dogs, aged from 1 to 6 y, were maintained in individual pens and

fed dry food once daily, with free access to water.

Tel. + 55 85 32511964; E-mail address: [email protected]

2.2. Semen collection and initial evaluation

Semen was collected by manual stimulation twice from each dog and the sperm-rich fraction

was analyzed. Semen volume and color were grossly evaluated and sperm concentration was

determined using a Neubauer counting chamber. Sperm motility was evaluated by light microscopy

under 100 x magnification. Sperm cell morphology was evaluated as cited below for frozen-thawed

semen.

2.3. Semen processing

An extender consisting of 3.028 g Tris-hydroxymethyl-aminomethane, 1.78 g monohydrated

citric acid and 1.25 g D-fructose, dissolved in 100 mL of distilled water, was used [12]. The

osmosis of this solution was 295 mOsm/L and the pH 6.6. Twenty percent (vol:vol) of this solution

was subsequently replaced by egg-yolk.

Semen was initially extended in Tris-egg yolk at room temperature (27 ºC). Samples were

kept in an insulated box for 40 min, with an objective to reach 15 ºC, at a cooling rate of -0.30

°C/min, and transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 ºC at -0.37 °C/min

rate. After cooling, semen was added (1:1) to Tris-egg yolk plus 12% glycerol also at 4 ºC, resulting

in a final concentration of 6% glycerol in the extender. Final dilution resulted in a sperm

concentration of 200 x 10

sperm/mL. Samples were packed into 0.25 mL plastic straws, which

were placed horizontally in an insulated box for 5 min, 5 cm above the liquid nitrogen (N

) level,

reaching a temperature of approximately -70 ºC in the vapor. Finally, the straws were plunged into

liquid N

for storage [13]. After 15 d, samples were transferred to a dry-shipper and transported to

another laboratory for further analyses. Immediately before evaluations, samples were thawed for 1

min in a water bath at 38 ºC.

2.4. Computer aided semen analysis (CASA)

The CASA was conducted according to Iguer-Ouada and Verstegen [14]. After thawing,

semen samples (10 µL) were placed in a Makler chamber, allowed to settle for 1 min, maintained at

38 ºC, and examined by a phase-contrast microcopy system with stroboscopic illumination, which

was a compound of the Hamilton-Thorne Computer-Aided Semen Analyzer, Version 10 Ivos

(HTR-IVOS 10 Analyzer; Hamilton Thorne Research, Beverly, MA, USA). Three different, non-

consecutive, randomly selected microscopic fields were scanned. The data were computerized and

mean ± SD determined.

The following parameters were measured for each sample: the number of counted cells; the

percentage of total motile sperm; the percentage of progressive motile sperm; velocity average

pathway (VAP) - the average velocity of smoothed cell path (µm/sec); the velocity straight line

(VSL) - the average velocity measured in a straight line from the beginning to the end of track

(µm/sec); the curvilinear velocity (VCL) – the average velocity measured over the actual point-to-

point track followed by the cell (µm/sec); the amplitude lateral head (ALH) – amplitude of lateral

head displacement (µm); the beat cross frequency (BCF) – frequency of sperm head crossing the

sperm average path (Hertz); the straightness (STR) – the average value of the ratio VSL/VAP in

percentage (straightness estimates the proximity of the cell path to a straight line, with 100%

corresponding to the optimal straightness); and the linearity (LIN) – the average value of the ratio

VSL/VCL in percentage (linearity estimates the proximity of the cell track to a straight line).

According to low VAP cut-off (LVV) and medium VAP cut-off (MVV), the overall sperm

population was subdivided in four categories: Rapid, with VAP > MVV; Medium, with (LVV <

VAP < MVV); Slow, with VAP < LVV; and Static, the proportion of cells that were not moving.

2.5. Plasma membrane integrity

Plasma membrane integrity was assessed with a fluorescent solution containing the

fluorophores 6-carboxy-fluorescein diacetate (C-FDA) and propidium iodide (PI), as described by

Cunha et al. [6]. An aliquot (10 µL) of thawed semen was extended in 40 µL fluorescent solution.

After 10 min, slides of the stained samples were evaluated by epifluorescence microscopy (LEICA

– Episcopic Fluorescent Attachment “EFA” Halogen Lamp Set, Leica Microsystems Inc.,

Bannockburn, IL, USA). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm were counted and

classified as having or lacking an intact plasmalemma, according to the color; sperm stained green

(C-FDA) were considered to have an intact plasmalemma, whereas those stained red (PI) or

partially stained red, were considered non-intact.

2.6. Sperm-oocyte interactions

2.6.1. Collection and selection of oocytes

Reproductive tracts from bitches of unknown age or cycle stage were collected after

ovariohysterectomy (n = 22) and transported to the laboratory in warm saline solution (38 °C)

within 2 h after surgery. Ovaries (n = 44) were dissected from the tracts in sterile saline plus

gentamycin (0.025 mg/mL), washed and placed in sterile 35 mm-grid dishes with 10 mL Phosphate

Buffered Saline (PBS), containing 0.4% w/v bovine serum albumin (BSA). Ovaries were finely

sliced with a scalpel (#22 blade) to release oocytes from the ovarian cortex. After removal of debris,

the dish was analyzed by stereo-microcopy in order to identify Grade-1 oocytes, containing an even

dark ooplasm surrounded by a well-formed, multilayered cumulus cell mass. Selected oocytes were

washed five times in PBS and transferred to 95 µL droplets (10 ova/droplet) of Tyrode’s Albumin

Lactate-Piruvate – TALP [15] containing 0.3% w/v BSA. Droplets were overlaid with mineral oil

equilibrated with sterile saline, and maintained at 38 ºC for 30 min under humidified atmosphere

containing 5% CO

and 95% air before co-incubation with sperm [8].

2.6.2. Sperm-oocyte co-incubation

After thawing and sperm evaluation, sperm samples were washed by extending them in

Sperm-TALP (1:1) [15] and centrifuged (700 x g for 5 min) at room temperature. After washing,

the supernatant was discarded and the concentration of sperm pellet was adjusted at 40 x 10

motile

cells/mL by dilution in Sperm-TALP. Next, 5 µL of the sperm cell suspension was added to the

oocytes in each droplet of TALP to create a final volume of 100 µL, with a concentration of 2 x 10

motile sperm/mL. A minimum of 30 oocytes (three droplets) was used per replicate. After

incubation for 18 h at 38 ºC under a humidified atmosphere containing 5% CO

and 95% air, the

oocytes were removed, washed in PBS plus BSA, and transferred to a tube containing 1% aqueous

sodium citrate for 10 min to expand the cumulus cells. Samples were then vortexed for 3 min to

detach cumulus cells. Finally, oocytes were incubated for 20 min in Hoechst 33258 in 2.3% sodium

citrate (100 µL/mL) to stain bound and penetrated sperm heads. Stained oocytes were placed on a

clean slide and sandwiched with a coverslip, supported by silicon, to prevent damage to the oocytes

[8]. These oocytes were examined at 400 x under fluorescent illumination (LEICA – Episcopic

Fluorescent Attachment “EFA” Halogen Lamp Set; Leica Microsystems Inc.) to identify the

percentage of oocytes bound to sperm, oocytes with sperm penetrated into the perivitelline space or

ooplasm, and the number of sperm that had bound and penetrated the oocytes. From these data, the

percentage of oocytes interacting with sperm was calculated, representing the total percentage of all

forms of interaction between oocytes and sperm, such as only bound, only penetrated, or bound plus

penetrated oocytes. Similarly, the number of sperm interacting with oocytes was also calculated, i.e.

the number of sperm only bound, only penetrated, or bound plus penetrated.

2.7. Sperm morphology

Sperm morphology was evaluated by phase-contrast microscopic (1000 x) examination of a

slide stained with Bengal Rose (total of 200 sperm/slide). Sperm morphologic abnormalities were

classified as primary and secondary [12,13].

2.8. Statistical analysis

Ten replicates were used. The results were expressed as means (±SD) and analyzed by

Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). A simple linear regression model was

used to identify associations between sperm-oocyte interactions (dependent variables) and sperm

parameters (independent variables). Probabilities < 0.05 were considered significant. The existence

of an individual effect of a dog on all parameters studied was determined by analysis of variance,

followed by Fisher’s PLSD test (P<0.05).

3. Results

Fresh dog semen was milky-white in color. The mean (± SD) volume of the sperm-rich

fraction was 0.9 ± 0.4 mL, with a concentration of 1030.3 ± 600.2 x 10

sperm/mL. Sperm motility

(subjective assessment of fresh semen) was 97.5 ± 3.5% and 92.5 ± 3.4% of sperm had normal

morphology.

Sperm motility patterns (CASA data) of the frozen-thawed semen are shown in Table 1. The

proportion of sperm in the four populations were as follows: rapid, 63.9 ± 9.4%; medium, 4.3 ±

1.2%; slow, 26.4 ± 7.2%; and static, 5.6 ± 2.5%. Using epifluorescence microscopy of frozen-

thawed semen, 39.4 ± 11.7 and 60.6 ± 11.7% of sperm had intact and non-intact sperm membranes,

respectively.

Table 1: Sperm motility patterns observed in canine frozen/thawed semen (n=10) by Computer

Aided Semen Analysis (CASA).

Sperm motility patterns Mean ± SD

No. sperm evaluated 1209.2 ± 235.1

Total motile sperm (%) 68.7 ± 9.3

Progressively motile (%) 57.3 ± 8.1

Velocity average pathway (µm/sec) 100.9 ± 7.4

Velocity straight line (µm/sec) 89.0 ± 7.2

Curvilinear velocity (µm/sec) 136.8 ± 9.7

Amplitude lateral head (µm) 5.2 ± 0.3

Beat cross frequency (Hz) 22.8 ± 2.9

Straightness (%) 87.5 ± 2.2

Linearity (%) 66.3 ± 3.4

Due to the reduced volume in semen samples, post-thaw sperm morphology was evaluated

in only six replicates. There were 87.2 ± 4.8% normal sperm, with 1.4 ±1.6% primary and 11.2 ±

3.5% secondary abnormal sperm, including: decapitated sperm, 1.4 ± 1.6%; acrosomal defects, 2.1

± 1.2%; broken midpieces, 1.4 ± 2.1%; and coiled tails, 5.7 ± 3.9%.

For the sperm-oocyte interaction test, 5.5 ± 2.1 ovaries were used for each semen sample

tested. The number of oocytes obtained from each ovary ranged from 0 to 222. The total number of

oocytes collected to be used in this study was 1346 oocytes; from that number, 322 Grade-1 oocytes

were selected for use in this trial. It was noteworthy that 30 Grade-1 oocytes were used for each

frozen-thawed semen sample. Results of sperm-oocyte interactions are expressed in Table 2.

Table 2: Interactions among frozen-thawed canine sperm (n=10 samples) and homologous oocytes

after 18 h of incubation.

Sperm-oocyte interactions Mean ± SD Range

Oocytes bound to spermatozoa (%) 57.5 ± 21.0 26.3 - 89.4

Oocytes penetrated by spermatozoa (%) 36.6 ± 14.8 18.8 - 60.0

Oocytes interacted* with spermatozoa (%) 72.7 ± 19.8 36.8 – 100.0

No. bound spermatozoa 1.9 ± 1.1 1 - 9

No. penetrated spermatozoa 1.2 ± 0.3 1 - 3

No. interacted* spermatozoa 2.3 ± 1.4 1 – 11

* Interacted means only bound, only penetrated or bound plus penetrated.

Based on linear regression analyses, there were relationships between: percentage of oocytes

bound to sperm and BCF (R

=63%; P=0.04); percentage of oocytes interacting with sperm and BCF

=73%; P=0.01); number of penetrated sperm and VAP (R

=64%; P=0.04) and VSL (R

=64%;

P=0.04). There were no significant associations (P>0.05) among sperm-oocyte interactions and the

other motility patterns, sperm populations, plasma membrane integrity, or sperm morphology.

There was an effect of individual dog (P < 0.05) for VAP, VCL, STR, LIN, sperm

populations, number of bound sperm, and number of sperm interacting with oocytes. Since sperm

morphology was not done on some replicates, the dog effect could not be determined for this

parameter.

4. Discussion

Although the multiparameter evaluation of semen has been extensively reviewed [2,3,16], it

is clear that further studies are needed to identify one or more tests to accurately predict fertility of

cryopreserved semen. It was proposed that CASA could overcome subjectivity in semen analysis; it

has been used in several species, including the dog [14]. The HTR-IVOS 10 analyzer yielded

measures of various motility patterns that were essential for fertilization in boars [17]. In the present

work, total and progressive sperm motility, VAP and VCL values were similar to those found by

Peña and Linde-Forsberg [18]. Values for ALH and BCF found in our study seemed high, an

indication of sperm hyperactivation [18]. It was noteworthy that a low ALH value was related to

failure of in vitro fertilization in human sperm [19].

BCF had significant associations to bound and interacted oocytes rates in the present study,

suggesting that a hyperactive motion pattern is needed for initial stages of in vitro fertilization, as

previously reported by Verstegen et al. [20]. Sperm velocity patterns of VAP and VSL were

significantly related to the number of penetrated sperm. VAP is known as a significant predictor of

in vitro fertility (IVF); its enhancement is an indication of capacitation, which is essential for

fertilization [20]. In addition, as VSL indicates sperm forward progression [20], these associations

suggested that progressive sperm motion directly affects in vitro sperm-oocyte interactions in the

canine.

According to our results, some motility patterns evaluated by CASA were predictive of in

vitro sperm-oocyte interactions in dogs. Similarly, Herrera et al. [11] demonstrated that CASA

could be used as an efficient predictor for IVF in cattle; in that species, IVF was significantly

related to progressive sperm motility after thawing, but not to VAP, LIN and BCF. Furthermore,

Donelly et al. [21] found significant relationships between IVF rates and progressive sperm

motility, VAP, VCL and VSL in humans; they inferred that some CASA measurements provided

reliable estimation of the fertilizing ability of human sperm. Coefficients of relation (R

) found in

the present study ranged from 63 to 73%; these were within the range reported by other authors,

who reported relations between CASA parameters and IVF that ranged from 27% [10] to 85% [11]

in various species.

Our findings confirmed that sperm motility in a dog semen sample is not uniform, but rather

can be categorized in separate subpopulations [22]. Although significant relationships between

rapid sperm population and IVF rates were previously described for humans [10], we did not

identify significant relationships among a single sperm subpopulation and sperm-oocyte

interactions for dogs. Perhaps in vitro fertilizing ability in dogs is not necessarily associated to a

sperm population with rapid motion, but rather is distributed among various sperm populations.

Using the CFDA/PI staining, Rota et al. [23] reported 56% of canine sperm had intact sperm

membranes, compared to 39% in the present study. That there was a high incidence of sperm with a

non-intact plasma membrane could represent various stages of sperm activation [24]. In fact,

capacitation-like changes in dog semen seem to be both initiated and accelerated by

cryopreservation procedures [25]. No significant relationship between plasma membrane integrity

and sperm-oocyte interactions in dogs was found in this study; however, it has been reported that

both acrosome-intact and acrosome-reacted sperm are capable of binding to the zona pellucida in

dogs [26]. In contrast, Hay and Goodrowe [27] reported that acrosomal integrity is a critical factor

in determining the fertilizing ability of feline sperm cells. Further studies regarding relationships

among sperm-oocyte interactions and various analyses of the functional integrity of sperm should

be conducted in dogs.

It is known that fertility in dogs is only adversely affected when the proportion of

morphologically normal sperm is < 60% [28]. In the present study, the cryopreservation procedure

used resulted in 87% morphologically normal frozen-thawed sperm. However, since not all damage

would be apparent with phase-contrast microscopy, ideally other techniques (e.g. electron

microscopy) should be used for sperm analysis. Moreover, no significant relations between sperm

morphology and sperm-oocyte interactions were found. These results were consistent with those

reported by Tartaglione and Ritta [29] that sperm motility and morphology were not good

predictors of in vitro fertility in bulls. However, Jedrzejczak et al [30] observed that normal sperm

morphology in human fresh semen was significantly related to IVF and demonstrated that an

increase in sperm tail structural defects corresponded to a lower proportion of fertilized oocytes.

In the present study, there was a high rate of interactions among canine frozen-thawed sperm

and homologous oocytes (72%). These results were in agreement with a previous report of 70%

frozen-thawed sperm-oocyte interactions in canine species [8]. We found 36% penetrated oocytes

and 57% with sperm bound to the zona. Similar results were observed by De los Reyes et al [31]

who reported a penetration rate of 34% using canine frozen-thawed semen. Our results seemed

lower than the 60% penetration rate for fresh canine semen, reported by Hewitt and England [9].

Although both acrosome-intact and acrosome-reacted sperm are capable of binding to the zona

pellucida in dogs [26], cryopreservation adversely affects the fertilizing capacity of sperm, mainly

due to modifications in the sperm cell membrane [1]. Fertilizing capacity could be interpreted as the

ability of sperm to bind to the zona, penetrate the oocyte, and promote embryo development.

Between one and three sperm penetrated the oocytes in this study, indicating the presence of

polyspermy, in agreement with previous reports [8,9]. Moreover, we observed from one to 11

sperm bound to the zona (average 1.9 sperm/oocyte), similar to that previously reported in a study

of a zona pellucida binding assay in dogs [32].

Although the reproductive status of oocytes-donor bitches used in this study was unknown,

Rodrigues et al. [33] showed that viable oocytes could be obtained from bitches at various stages of

the reproductive cycle, since dog embryos depend more on the intrinsic development of the oocyte,

rather than the reproductive stage of the bitch at the time of oocyte retrieval. Although the oocytes

did not undergo any maturation procedure in this study, Hewitt et al. [34] showed that the assay can

be performed quickly and easily using either mature or immature oocytes. In contrast, Fontbonne et

al. [35] recently reported that no sperm penetration occurred in vivo in immature canine oocytes.

Thus, the relationship between in vitro sperm-oocyte interactions and in vivo fertility in dogs needs

further study.

There was a significant effect of the individual dog on some post-thaw seminal parameters,

suggesting that individual dogs may have different susceptibility to sperm cryopreservation, as

previously reported [15]. In swine, differences among individuals for susceptibility to

cryopreservation and in vitro fertility have been reported [17]. Furthermore, individual stallions

have been designated as “poor” or “good” regarding the susceptibility of their sperm to

cryopreservation [36].

To our knowledge, the present study is the first to evaluate the prognostic value of various

parameters of frozen semen on in vitro sperm-oocyte interactions in dogs. Although various tests

[2,15,23,25] have been used to evaluate canine frozen semen samples, no significant relationships

were reported between the results and in vitro or in vivo fertility. Therefore, it is important to be

cautious in estimating the potential fertility of a specific semen sample based exclusively on sperm

characteristics.

In conclusion, some motility patterns evaluated by CASA were predictive for the interaction

of frozen-thawed canine sperm and homologous oocytes in vitro. However, analysis of plasma

membrane integrity and sperm morphology had little prognostic value.

Acknowledgments

The authors thank Capes for grants and CNPq for financial support, and Daniel C. Uchoa

DVM (Grande Canafístula Kennel) for providing the animals used in the experiment.

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Figuras relacionadas ao Capítulo 03

Figura 1: Oócitos caninos corados em Hoeschst 33258, apresentando espermatozóides (seta branca)

ligados à sua zona pelúcida (zp).

Figura 2: Espermatozóides caninos corados com carboxifluoresceína/iodeto de propídio,

apresentando membrana plasmática intacta (corados em verde - seta branca) e não-intacta (corados

em vermelho – seta vermelha; ou parcialmente corados – seta preta), visualizados por microscopia

de fluorescência.

9. CAPÍTULO 04

Combined evaluation of multiple morphological parameters and fine structural

appearance of canine frozen-thawed semen

Avaliação combinada de múltiplos parâmetros morfológicos e aparência ultra-estrutural

do sêmen canino congelado-descongelado

RESUMO

Existe uma carência de informações concernentes à avaliação combinada de múltiplos

parâmetros morfológicos e da aparência ultra-estrutural do sêmen canino congelado. O presente

estudo objetivou descrever e discutir acerca das alterações em alguns parâmetros morfológicos e na

aparência ultra-estrutural de espermatozóides caninos provocados por um procedimento padrão de

criopreservação. Ejaculados de quarto cães foram coletados por manipulação digital. As amostras

de sêmen foram avaliadas, diluídas em Tris-gema-glicerol, congeladas e estocadas em nitrogênio

líquido, e posteriormente descongeladas e submetidas à avaliação da motilidade espermática pela

análise computadorizada (CASA), morfologia espermática, integridade acrossomal, integridade da

membrana plasmática e aparência ultra-estrutural pela da microscopia eletrônica de transmissão

(TEM). As principais alterações morfológicas observadas no sêmen descongelado foram cabeças

destacadas, defeitos de acrossoma, peça intermediária curvada, caudas quebradas e enroladas.

Houve um declínio na integridade acrossomal após a descongelação. Uma alta proporção de

membranas plasmáticas não-intactas foi verificada após a descongelação. No que diz respeito aos

resultados de TEM, as alterações mais comumente observadas após a descongelação incluíam

plasmalema da cabeça edemaciado e com balonamento, membrana acrossomal externa com

ondulações, membrana acrossomal vesiculada e perda de conteúdo acrossomal, bem como

plasmalema edemaciado e região bainha mitocondrial de aspecto anormal na região da peça

intermediária. Pode-se concluir que a criopreservação induz uma série de alterações morfológicas

no espermatozóide canino, mas algumas destas alterações são apenas percebidas através de uma

avaliação profunda da aparência ultra-estrutural da célula espermática. Além disso, sugere-se o uso

da avaliação combinada de múltiplos parâmetros morfológicos e da aparência ultra-estrutural para a

análise do sêmen canino congelado-descongelado.

Combined evaluation of multiple morphological parameters and fine structural appearance of

canine frozen-thawed semen

Alexandre R. Silva

, Rita de Cássia S. Cardoso

, Lúcia D. M. Silva

, Viviane H. Chirinéa

, Maria

D. Lopes

Laboratory of Reproduction of Carnivores – State University of Ceará, Paranjana Ave. 1700,

Itaperi, 60740-000, Fortaleza, Ceará, Brazil

Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals – State University of São Paulo, Rubião

Junior District, s/n, 18618-000, Botucatu, São Paulo, Brazil.

Abstract

There is a lack of information concerning combined evaluation of multiple morphological

parameters and the fine-structural appearance of canine frozen spermatozoa. The present study

aimed to describe and discuss about the alterations in some morphological parameters and fine-

structural appearance of the canine spermatozoa provoked by a standardized cryopreservative

procedure. Ejaculates from four stud dogs were collected by digital manipulation. Semen samples

were evaluated, extended in Tris-egg yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen, and further

thawed and submitted to evaluation of progressive sperm motility by computer-aided semen

analysis (CASA), sperm morphology, acrosomal integrity, plasma membrane integrity and sperm

fine-structural appearance by transmission electronic microscopy (TEM). The main morphological

abnormalities observed in frozen semen were detached heads, acrosomal defects, bent midpiece,

kinked and coiled tails. There was a decline in acrosomal integrity after thaw. A high rate of non-

intact plasma membrane was verified after thaw. Concerning to TEM results, most common post-

thaw sperm alterations included swollen and ballooning head plasmalemma, undulant outer

acrosomal membrane, vesiculated acrosomal membrane and lost of acrosomal contents, as well as

swollen plasmalemma and abnormal mitochondrial sheath in midpiece region. We can conclude

that cryopreservation induces a series of morphologic alterations in canine sperm, but some of these

alterations can only be realized through a deep analysis of the fine-structural appearance of the

sperm cell. Furthermore, we suggest the use of combined evaluation of multiple morphological

parameters and fine structural appearance for the canine frozen-thawed semen analysis.

Keywords: Dog, Semen, Freezing, Electronic Microscopy, Sperm Morphology

1. Introduction

Cryopreservation procedures can provoke physical-chemical alterations that lead to rupture

of the sperm membrane, removal of important membrane proteins, ionic rearrangement, alterations

in the lipid-protein bi-layer and modifications in the membrane enzymes of the sperm cell (Holt,

2000). Frozen spermatozoa should be assessed to determine the degree of cell injury caused by

cryopreservation (Peña-Martinez, 2004). Most studies on canine semen cryopreservation are

focused mainly on post thaw sperm motility analysis (Ivanova-Kicheva et al., 1997). The combined

evaluation of multiple morphological parameters and fine-structural appearance of canine frozen-

thawed semen is not currently performed.

Several staining techniques are used for sperm morphology assessment. Among them,

Bengal Rose allows us to evaluate not only the morphology, but also the acrosomal integrity of the

sperm cell (Rodrigues, 1997). Furthermore, some authors demonstrated the use of fluorescent stains

to evaluate plasma membrane integrity in sperm cells (Rota et al, 1997).

The fine-structural analysis involves a thorough morphological evaluation of the sperm cell

contents (Rodriguez-Martinez and Enkwall, 1989). Transmission electronic microscopy (TEM) was

reported as an efficient method for the evaluation of the sperm fine structure (England and

Plummer, 1993; Rodriguez-Martinez et al., 1993). However, TEM is not currently used for canines,

which results in a lack of studies regarding the fine-structural appearance of canine spermatozoa

before and after cryopreservation.

The objective of the present study was to describe and discuss the alterations in some

morphological parameters, such as sperm morphology, acrosomal status, plasma membrane

integrity and fine-structural appearance of the canine spermatozoa caused by a standardized

cryopreservation procedure.

2. Material and Methods

2.1 Animals

Four proven stud dogs of different breeds, one Brazilian Mastiff and three Boxers, from a

private kennel were selected for this experiment. The dogs were aged from one to six years. The

animals were maintained in individual boxes and fed dry food once daily, with free access to water.

2.2 Semen collection and initial evaluation

Each dog was submitted to one semen collection by manual stimulation, and the sperm-rich

fraction was evaluated. Semen volume and color were grossly evaluated. Sperm motility was

analyzed by light microscopy (100x). Sperm concentration was determined using a Neubauer

counting chamber. Sperm morphology, acrosomal status and fine-structural appearance were

evaluated as described below.

2.3 Semen cryopreservation

An extender consisting of 3.028g Tris-hydroxymethyl-aminomethane, 1.78g monohydrated

citric acid and 1.25g D-fructose, dissolved in 100mL distilled water (Silva et al., 2002) was used.

The osmosis of this solution was 295mOsm/L and the pH 6.6. Twenty percent of this solution was

then replaced by egg-yolk (vol:vol).

Cryopreservation procedure adopted was that reported by Silva et al. (2003). During initial

analysis, semen remained at room temperature (27°C) for 10 min and further extended in Tris-egg

yolk. Semen was kept in a thermal box for 40 min aiming to reach 15ºC, at a cooling rate of -

0.30°C/min. Samples were then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where they

reached 4ºC at -0.37°C/min rate. After cooling, semen was added to Tris-egg yolk plus 12%

glycerol also at 4ºC, which provided a final concentration of 6% glycerol in the extender. Final

sperm concentration was 200 x 106 spermatozoa/mL. Samples were packed into 0.25mL plastic

straws, which were placed horizontally in a thermal box for 5 min, 5cm above the liquid nitrogen

) level, reaching a temperature close to -70ºC in the vapor. Finally, straws were plunged into

liquid N

for storage. After 15 days, samples were transferred to a dry-shipper and transported to

another laboratory for further analyses. Immediately before evaluations, samples were thawed in a

water bath at 38ºC/1 min. Progressive sperm motility was assessed by a computer-aided semen

analysis (CASA - Hamilton Thorn Analyzer Ivos 10, Hamilton Thorne Research, Beverly, USA),

which also measured two sperm morphological parameters: elongation and area.

2.4 Sperm morphology and acrosomal integrity

After semen collection and thaw, sperm morphology was evaluated by phase-contrast

microscopy, under 1000x magnification, analyzing a slide stained with Bengal Rose (Rodrigues,

1997), counting 200 cells per slide. Sperm morphologic alterations were classified according to

their origin as primary and secondary (Seager, 1986), and according to the sperm region affected as

head, midpiece or tail defects (Silva et al., 2003). Acrosomal integrity was also evaluated, and

acrosomal defects were classified as absent, swollen, detached, cystic and abnormal distributed

(Rodrigues, 1997).

2.5 Sperm fine structure

After collection and thawing, semen aliquots from only three dogs were individually

centrifuged at 720G / 5 min. Pellets were fixed using 3% glutaraldehyde in phosphate buffer and

kept at 5ºC prior to the procedure. For transmission electronic microscopy, fixed samples were

pooled, post-fixed in phosphate buffer plus osmium tetroxide (1%), dehydrated by acetone solutions

and embedded in Araldite. Ultra fine sections (50nm) were obtained and stained with uranyl acetate

and lead citrate before examination by a transmission electronic microscope (Philips CM 100,

Germany). Spermatozoa were documented by micrographs and results were subjectively described

(Chirinéa, 2004).

2.6 Plasma membrane integrity

Plasma membrane integrity was assessed with a fluorescent solution containing fluorophores

6-carboxy-fluorescein diacetate (C-FDA) and propidium iodide (PI), as described by Rota et al. [6].

One aliquot of 10µL thawed semen was extended in 40µL fluorescent solution. After ten minutes,

slides of the stained samples were evaluated by epifluorescence microscopy (LEICA – Episcopic

Fluorescent Attachment “EFA” Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-

FDA/PI, 200 sperm cells were counted and classified as having or not an intact plasmalemma,

according to the color. Cell membranes stained in green (C-FDA) were considered intact, while

those stained in red (PI) or partially stained were considered as non-intact.

2.7 Statistical analysis

Four replicates were used in this experiment, except for TEM that used three replicates. Data

were expressed as mean and standard deviation and analyzed by the Statview 5.0 software (SAS

Institute Inc., Cary, USA). Differences regarding plasma membrane integrity, sperm morphology

and acrosomal status, were verified by Mann-Whiney test (P < 0.05).

3. Results

Fresh dog semen was white-milky in color. The volume of sperm rich fraction was 1.01 ±

0.15mL, with a sperm concentration of 777.67 ± 266.70 x 10

spermatozoa/mL. Sperm motility of

fresh semen was 96.2 ± 4.8 % spermatozoa. After thaw, it was verified 60.0 ± .3% motile

spermatozoa by CASA, which also showed values of 64.0 ± 0.82% and 3.05 ± 0.10 µm

for

elongation and area, respectively.

Evaluation of the sperm morphology according to the sperm region affected is shown in

Table 01. There was a significant higher incidence of coiled tails and acrosomal defects in frozen

semen, but no differences regarding normal sperms were observed. Concerning the origin of the

alteration, 0.89 ± 0.77% and 1.55 ± 1.76% primary alterations were observed in fresh and frozen

semen, respectively. Regarding the secondary alterations, a 6.0 ± 3.88% and 11.12 ± 4.46%

incidence was found in fresh and frozen semen, respectively. There were no differences between

fresh and frozen semen regarding the origin of the morphologic alterations. Furthermore, the

acrosomal integrity is presented in Table 02. A decrease in the percentage of spermatozoa with

normal acrosome was observed after thawing.

Table 01: Sperm morphology analysis in fresh and frozen canine semen

Sperm morphology Fresh Semen Frozen Semen

Normal sperm (%) 93.21 ± 3.48 87.08 ± 5.88

Head alterations (%)

Detached head 3.10 ± 03.53 1.67 ± 1.87

Macrocephalic 0.0 ± 0.0 0.13 ± 0.26

Abnormal morphology 0.37 ± 0.45 1.42 ± 1.88

Acrosomal defect 0.79 ± 0.61

2.30 ± 0.90

Midpiece alterations (%)

Thickened midpiece 0.28 ± 0.57 0.13 ± 0.26

Bent midpiece 0.74 ± 0.97 1.38 ± 2.75

Abaxial insertion 0.14 ± 0.28 0.25 ± 0.50

Tail alterations (%)

Kinked tail 0.25 ± 0.49 1.17 ± 2.01

Coiled tail 0.86 ± 0.84

4.23 ±1.73

Double tail 0.38 ± 0.26 0.0 ± 0.0

Values followed by different letters differs between columns (P<0.05).

Table 02: Acrosomal integrity on canine fresh and frozen semen.

Acrosomal Status (%) Fresh Semen Frozen Semen

Normal 99.17 ± 0.64

97.14 ± 1.04

Absent 0.14 ± 0.28 0.28 ± 0.33

Swollen 0.0 ± 0.0 1.69 ± 1.48

Cystic 0.40 ± 0.27 0.90 ± 1.10

Abnormal distribution 0.15 ± 0.30 0.0 ± 0.0

Detached 0.15 ± 0.30 0.0 ± 0.0

Values followed by different letters differs between columns (P<0.05).

For plasma membrane integrity, 46.75 ± 13.15% intact and 53.25 ± 13.15% non-intact

sperm membrane were observed in frozen semen. No differences were observed among intact and

non-intact membrane sperms.

Concerning the fine structure of canine semen, several fresh spermatozoa showed a slightly

swollen but intact plasmalemma above the acrosomal region (Fig. 01A). The most common

alterations observed in the head region of frozen canine spermatozoa (Fig. 01B-D) included swollen

and ballooning plasmalemma, undulating outer acrosomal membrane, vesiculation of the acrosomal

membrane and loss of electro-dense acrosomal contents. The midpiece region was intact in fresh

spermatozoa (Fig. 02A), but some cells presented swollen plasmalema in this region (Fig. 02B).

Regarding to frozen-thawed semen, the midpiece region presented the plasmalemma usually

swollen and the mitochondrial sheath unorganized, although the axoneme seemed to remain intact

(Fig. 02C-D).

Figure 1: Fine-structural appearance of the head region of: A - slightly swollen plasmalemma (p)

above the acrosomal region in a fresh canine spermatozoon; and the most common alterations

observed in the head region of frozen canine spermatozoa: B – swollen plasmalemma (p) and

undulant outer acrosomal membrane (am) and areas of vesiculation (arrow heads) in the acrosomal

membrane; C - swollen plasmalemma (p) and loss of electro-dense acrosomal contents (arrows),

11500x; D – swollen (p) and ballooning (arrow heads) plasmalemma and vesiculation (arrows) in

the acrosomal membranes.

Figure 2: Transmission electron micrographs of the midpiece region in canine spermatozoa

showing: A - longitudinal section illustrating intact plasmalemma (p), mitochondrial sheath (ms)

and axoneme (ax) in fresh semen; B - sagital section illustrating swollen plasmalemma (p) and

normal mitochondrial sheath (ms) and axoneme (ax) in fresh semen; C- longitudinal section, and D

-sagital section demonstrating swollen plasmalemma (p) and abnormal appearance of mitochondrial

sheath (am), but intact axoneme (ax), in frozen-thawed semen.

4. Discussion

Fertility in dogs is only adversely affected when the rate of morphologically normal

spermatozoa falls bellow 60% (Oettlé, 1993). The cryopreservation procedure adopted in the

present study was able to maintain more than 85% normal sperms after thawing. The main

morphological abnormalities observed in frozen semen were secondary defects (Seager, 1986),

probably originated from the thermal shock and osmotic stress caused by the freezing-thawing

procedures (Farstad, 1996). It is known that the addition or removal of the cryoprotectant causes a

transient osmotic stress that affects the sperm plasmalemma (Gao et al., 1993), which could lead to

the membrane fragility and cause sperm tail detachment (Silva et al., 2003).

Post-thaw acrosomal integrity may also be a useful indicator of semen quality (Ferguson et

al., 1989). In the present study, sperm morphology evaluation showed an increase of acrosomal

defects after thawing, represented mainly by swollen spermatozoa. In bovine sperm, post-thaw

acrosomal defects seem to be caused by the activation of proteases, as their previous inhibition was

providing a protective effect on sperm membranes (Sanchez et al., 1995). Decline in post-thaw

acrosomal integrity was less than 5% in the present study. However, Rodrigues (1997) previously

reported that not all stages of acrosomal damage could be identified by phase contrast microscopy.

Plasma membrane integrity is essential for cell viability, as its selective permeability of the

plasma membrane maintains intracellular metabolic activities, pH and ionic composition (Rota et

al., 1997). Using the CFDA/PI staining, Rota et al. (1997) found 56% intact sperm membrane for

canine frozen-thawed semen and we verified 46% intact sperm membrane in the present study.

These results represent a high rate of non-intact plasma membrane, which could indicate different

stages of sperm activation (Colenbrander et al., 2003). In fact, capacitation-like changes in dog

semen seem to be both initiated and accelerated by cryopreservation (Rota et al., 1999). Although

the changes caused by freezing and thawing most likely represent acrosomal degradation, Strom et

al. (1997) do not exclude the possibility that spermatozoa might still retain their fertilizing ability if

these changes are only minor. Moreover, there are indications that in the canine species, both

acrosome-intact and acrosome-reacted spermatozoa are capable of binding to the zona pellucida

(Kawakami et al., 1993).

In spite of the advances in TEM, there are few studies presenting a systematic description of

the canine spermatozoa. The occurrence of slightly swollen plasmalemma above the acrosomal

region observed in fresh canine spermatozoa in the present study was previously reported by

Chirinéa et al. (2005). These authors considered this to be a consequence of the semen sample

being exposed to glutaraldehyde during the fixation procedure for TEM. Moreover, canine

spermatozoa undergo several alterations in the head region after cryopreservation, but the

plasmalemma seems to remain intact. Similar results were reported by Rodriguez-Martinez et al.

(1993) and they suggested that the plasmalemma remaining intact after cryopreservation might

account for the low percentage of acrosomal defects usually reported when using phase contrast

microscopy.

Our results showed that the undulating acrosomal membrane seems to be a common

consequence of cryopreservation in dog spermatozoa, as reported by Burgess et al. (2001).

Vesiculation in acrosomal membranes and loss of acrosomal contents observed in our study with

frozen semen could be a result of acrosomal reaction by the fusion of the plasma membrane with

the outer acrosomal membrane (Eilts, 2005). In fact, Rodriguez-Martinez et al. (1993) suggested

that the alterations found in the fine structural appearance of canine frozen semen could be

interpreted as a false acrosomal reaction.

We demonstrated that the plasmalemma of the midpiece region of canine spermatozoa

undergoes the same swelling effects as the head region, as previously reported by Burgess et al.

(2001). To our knowledge, the present study is the first report describing the consequences of

cryoinjury on the fine structural appearance of the mitochondrial sheath in the midpiece region of

the canine frozen spermatozoa by TEM. The mitochondrial sheath was unorganized, but the

axoneme seemed to remain intact in frozen samples. In humans, it is known that abnormalities in

the mitochondrial sheath can directly affect the sperm motility (Rao et al., 1989). Alterations in the

mitochondrial sheath resulting from freezing-thawing procedures could also possibly damage the

post-thaw sperm motility in canine semen.

Although sperm motility analysis was not the main objective of this study, it is necessary to

emphasize that the values after thawing (60%) were within the acceptable range for use in artificial

insemination (Morton and Bruce, 1989). The CASA system also analyzed elongation, a sperm

morphometric parameter expressing the average value of the ratio of minor to major axis of the

sperm head. Values found in present work (54%) were within the normal range for canine sperm,

reported as being between 47.6 and 67% (Rijsselaere et al., 2004). The other sperm morphometric

parameter was the area, i.e., the average size of all sperm heads in square microns, and they were

similar to those reported by Iguer-Ouada and Verstegen (2001), but smaller than those reported by

Rijsselaere et al (2004). According to Dahlbon et al. (1997), sperm head morphometry was

significantly variable among individuals and the limits for sperm head dimensions still have to be

established in dogs.

The number of replicates used in this study was enough for the analysis of several sperm

cells. Moreover, it was also enough to reach our intent of describing and discussing the main effects

of cryoinjury in frozen-thawed canine spermatozoa, using different methods to evaluate sperm

morphology. From all these data, we can conclude that cryopreservation induces a series of

morphological alterations in canine sperm, but some of these alterations can only be determined by

a profound analysis of the fine structural appearance of the sperm cell. Furthermore, we suggest the

combined evaluation of multiple morphological parameters and fine structural appearance for the

canine semen analysis.

Acknowledgments

The authors thank Capes by grants and CNPq for financial support, DVM Daniel C. Uchoa

(Grande Canafístula Kennel) for providing the animals used in the experiment and Institute of

Biosciences (IB-Unesp/Botucatu) for technical assistance regarding to transmission electronic

microscopy.

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10. DISCUSSÃO GERAL

a) Sobre os animais utilizados nos experimentos

Os cães machos doadores de sêmen utilizados em todos os experimentos foram provenientes

do canil Grande Canafístula, localizado na região metropolitana de Fortaleza, Ceará. Procurou-se

utilizar sempre cães de uma mesma raça, no caso a raça Boxer. Entretanto, devido à falta de um

animal dessa raça nos experimentos referentes aos Capítulos 01, 03 e 04, fez-se uso também de um

cão da raça Fila Brasileiro. Cada animal passou previamente por uma seleção que consistiu de uma

avaliação clínica e andrológica. Além disso, por ocasião de cada coleta, o estado geral do animal foi

novamente observado e os parâmetros macroscópicos de cor, volume e viscosidade, bem como os

microscópicos de motilidade, vigor, morfologia e concentração espermática foram avaliados. Para

todos os experimentos, foi estabelecido um limite mínimo de qualidade para uso das amostras de

sêmen, onde essas deveriam apresentar um volume mínimo que permitisse sua divisão em alíquotas

de igual volume a serem utilizadas em todos os tratamentos para cada experimento, motilidade

espermática sempre superior a 80% e concentração espermática superior a 200 x 10

espermatozóides/mL. De acordo com os valores observados nos resultados de todos os

experimentos, os parâmetros avaliados no sêmen fresco encontravam-se dentro da faixa normal

descrita para a espécie canina (Oettlé, 1993; Johnston et al., 2001).

As cadelas doadoras de oócitos utilizadas no Capítulo 03 pertenciam à comunidade da

cidade de Botucatu, estado de São Paulo, e eram pacientes de uma campanha de castração em massa

realizada pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista

(FMVZ-UNESP), naquela mesma cidade, onde o experimento foi realizado entre os meses de

agosto e outubro de 2004. Previamente a cada castração, que acontecia mensalmente, as pacientes

eram submetidas a uma avaliação geral do estado clínico e sanitário, para então serem preparadas

para a cirurgia. A equipe responsável pelo procedimento cirúrgico era composta por alunos e

professores do Hospital Veterinário daquela universidade. Antes do início das cirurgias, era deixado

um recipiente contendo solução salina aquecida a 38ºC dentro de uma caixa térmica, com um dos

membros da equipe para a coleta dos tratos reprodutivos das cadelas. À retirada dos tratos

reprodutivos, estes eram encaminhados para o Laboratório de Fertilização In Vitro daquela

universidade, onde se dava início ao seu processamento. O intervalo entre a retirada do trato

reprodutivo e o início do experimento nunca foi superior a duas horas. Vale salientar aqui, que nós

não tivemos acesso aos dados referentes à idade, peso, raça, ou estágio reprodutivo das cadelas. Em

todo caso, Rodrigues et al. (2004) já haviam demonstrado que oócitos viáveis poderiam ser obtidos

de cadelas em diferentes estágios reprodutivos, visto que os embriões caninos produzidos a partir de

fertilização in vitro são mais dependentes do programa de desenvolvimento intrínseco do oócito do

que das condições da cadela no momento da coleta desses oócitos.

b) Efeito da diluição espermática

De um modo geral, as pesquisas em tecnologia de sêmen canino utilizam uma taxa de

diluição baseada em uma concentração espermática pré-fixada (Peña and Linde-Forsberg , 2000;

Tsutsui et al., 2000; Bueno et al., 2001; Sirivaidyapong et al., 2001), que possibilita calcular o

número de espermatozóides por palheta e determinar a exata proporção entre o diluente e as células

espermáticas. Por outro lado, outras pesquisas têm se baseado em uma proporção de volume fixo,

entre diluente e sêmen (Silva & Verstegen, 1995; England & Ponzio, 1996; Yildiz et al., 2000;

Cardoso et al., 2003; Silva et al., 2003), onde não existe necessidade de se contar os

espermatozóides, rendendo mais praticidade ao procedimento e reduzindo o tempo e os custos

envolvidos com a congelação do sêmen canino.

Em trabalhos anteriores (Silva et al., 2000, 2002cd, 2003), foi feito uso da diluição

volume:volume devido à praticidade, uma vez que realizávamos a coleta de sêmen em canis

distantes de nosso laboratório. Entretanto, sempre permanecia a dúvida a respeito da utilização de

uma concentração espermática pré-fixada. Por isso, no Capítulo 01 desta tese, foram comparadas

essas duas diferentes formas de diluição de sêmen canino destinado à criopreservação. Segundo os

resultados encontrados, não existem diferenças entre as duas formas de diluição do sêmen canino.

Isso mostra que a proporção entre diluente e sêmen em ambas as situações não traz danos à

qualidade seminal. Segundo Mann (1964), uma diluição excessiva poderia levar a uma perda

permanente da motilidade, da atividade metabólica e da capacidade fertilizante da célula

espermática. Além disso, pesquisas recentes têm demonstrado que as proteínas do plasma seminal

são importantes para a manutenção da viabilidade seminal de ovinos, prevenindo os danos oriundos

do choque térmico sobre a membrana espermática (Barrios et al., 2000; Pérez-Pé et al., 2001). A

partir desse conhecimento, poderíamos hipotetizar que uma diluição excessiva minimizaria os

efeitos benéficos de substâncias presentes dos fluidos testiculares e epididimários que compõem a

fração espermática em cães. De fato, sabe-se que altas taxas de diluição, tais como de uma parte de

sêmen para 16 ou 32 partes de diluente, causam um decréscimo significativo na motilidade

progressiva no sêmen de cães (Wales and White, 1963; England, 1993).

Em suma, dentro das condições descritas no experimento, o sêmen canino pode ser

eficientemente diluído a uma concentração fixa de 200 x 106 espermatozóides/mL, ou a uma

diluição baseada em um volume fixo, na proporção de uma parte de sêmen para uma parte de

diluente. A partir desses resultados, no experimento referente ao Capítulo 02, foi utilizada a diluição

baseada em volume fixo. Entretanto, como no teste de interação entre espermatozóides e oócitos,

era necessário o conhecimento do número de espermatozóides na palheta de sêmen, foi feito uso da

concentração espermática pré-fixada nos experimentos referentes aos Capítulos 03 e 04, visto que

os mesmos foram desenvolvidos em conjunto.

c) Temperatura de adição de glicerol

Existem escassas e controversas informações a respeito da temperatura de adição de glicerol

ao sêmen de cães. As diferentes pesquisas preconizam o uso de temperaturas que vão desde

próximas à corpórea (Peña et al., 1998; Nothling and Shuttleworth, 2005) ou à ambiente (Yildtz et

al., 2000; Rota, 1998) até temperaturas de resfriamento (Silva et al., 2003; Rota et al. 2005).

Em trabalhos anteriores (Silva et al. 2000, 2002cd, 2003), foi utilizada a temperatura de 4ºC,

uma vez que a metodologia utilizada era baseada naquela primariamente desenvolvida para o uso do

diluente à base de água de coco em caprinos (Nunes et al., 1997) e posteriormente adaptada para

uso no cão (Silva et al., 2000; Cardoso et al., 2001). Entretanto, acreditava-se que a adição do

crioprotetor ao sêmen em uma temperatura mais elevada, no caso a temperatura ambiente (27ºC),

poderia além de não trazer prejuízos ao sêmen canino, também conferir maior praticidade ao

procedimento de criopreservação. Desse modo, o experimento reportado no Capítulo 02 desta tese

consistiu no primeiro trabalho a comparar a temperatura ambiente (27ºC) e aquela após a etapa de

resfriamento (4ºC) para a adição do glicerol durante o procedimento de criopreservação de sêmen

canino. Esse experimento demonstrou que não existem diferenças entre as mesmas no tocante à

motilidade, morfologia, integridade acrossomal, função de membrana e longevidade espermáticas

após a descongelação. Esses resultados são similares àqueles reportados por Peña et al. (1998), os

quais não encontraram diferenças entre uma temperatura próxima à corpórea (37ºC) e 4ºC para

adição do glicerol, com relação à motilidade espermática, porcentagem de espermatozóides vivos e

integridade acrossomal.

Os resultados aqui obtidos são ainda importantes por mostrarem ser desnecessária a

manutenção das amostras de sêmen e do diluente em banho-maria a temperaturas controladas,

normalmente de 37ºC, antes do início da congelação. Além disso, verifica-se também ser

desnecessário o abaixamento da temperatura antes da adição do glicerol, denotando que um diluente

já adicionado de glicerol poderia ser adicionado ao sêmen canino à temperatura ambiente. Esses

achados podem ser explicados pelo fato de ter sido previamente demonstrado que o espermatozóide

canino tolera a exposição a soluções hipertônicas à base de crioprotetores permeáveis, em especial o

glicerol (Songsassen et al., 2001). De fato, Hammersted et al. (1990) sugeriram que o glicerol

penetra muito rapidamente nas células espermáticas e que um tempo de equilíbrio seria

desnecessário.

A possibilidade de adição do diluente contendo glicerol ao sêmen canino à temperatura

ambiente de 27ºC, bem como a não necessidade de manutenção dos mesmos em banho-maria antes

do início do processamento, conferem uma maior praticidade ao procedimento de criopreservação.

Entretanto, apesar de ser sugerido o uso da temperatura de 27ºC para adição do diluente

glicerolizado ao sêmen canino, nos experimentos posteriores, referentes aos Capítulos 03 e 04,

optou-se por fazer uso ainda da adição de glicerol à temperatura de 4ºC. Isto se deve ao fato de que

estava sendo desenvolvido um trabalho em paralelo com o diluente à base de água de coco, que

preconiza o uso dessa temperatura.

d) Motilidade espermática

Na maioria das pesquisas realizadas na área de tecnologia de sêmen canino, a avaliação da

motilidade espermática continua sendo o principal parâmetro avaliado após a descongelação por

diversos pesquisadores. Essa avaliação se baseia na mensuração da porcentagem de

espermatozóides móveis na amostra através da microscopia óptica (Seager and Fletcher, 1972) e é

eventualmente acompanhada da avaliação do vigor (Hermann & Swanson, 1941; Platz and Seager,

1977; Christhiansen, 1986, Jonhston et al, 2001), que representa a intensidade de movimento dos

espermatozóides em escalas que variam desde zero (sem movimentos) a cinco (movimento

progressivo contínuo). Entretanto a avaliação desses parâmetros através da microscopia óptica

oferece limitações primárias como a subjetividade e a variabilidade (Rijsselaere et al., 2005). A

determinação subjetiva da motilidade espermática pode ser influenciada pela temperatura de

avaliação e pela habilidade do avaliador, levando a uma alta variabilidade entre os laboratórios

(Iguer-Ouada and Verstegen, 2001).

Nos Capítulos 01 e 02 do presente trabalho, a motilidade espermática nas amostras de sêmen

foi avaliada apenas subjetivamente através da microscopia óptica. Foi então verificado um declínio

significativo da motilidade a cada etapa do processamento do sêmen e, principalmente, após a

descongelação, bem como no decorrer do teste de termorresistência. Esse declínio é provavelmente

decorrente de uma soma de fatores, como a formação de cristais de gelo que ocorre entre -6 e -10 ºC

(Colas, 1975); a ação tóxica do glicerol que pode causar alterações físico-químicas e osmóticas que

levam à ruptura da membrana espermática, à remoção de importantes proteínas da membrana, ao

rearranjo de íons e a alterações na bi-camada lipídio protéica (Holt, 2000); bem como o choque

térmico, oriundo das diversas modificações na temperatura ao qual o espermatozóide é submetido

durante a congelação e descongelação (Farstad, 1996). É necessário ainda relatar que a partir do

experimento referente ao Capítulo 02, abolimos o uso da avaliação do vigor espermático, uma vez

que as publicações internacionais atualmente têm se concentrado apenas na análise da motilidade,

sem levar em conta esse parâmetro.

Já nos Capítulos 03 e 04, trabalhou-se com a análise computadorizada de sêmen (CASA). A

CASA foi proposta pra suplantar o obstáculo de subjetividade nas análises de sêmen e vem sendo

utilizado em diversas espécies, incluindo o cão (Iguer-Ouada and Verstegen, 2001). No presente

trabalho, foi utilizado o Hamilton Thorn Analyzer Ivos 10, sendo possível a mensuração de

diferentes padrões da motilidade espermática, como velocidade média na trajetória (VAP),

velocidade curvilínea (VCL), velocidade linear progressiva (VSL), progressão (STR), linearidade

(LIN), deslocamento lateral de cabeça (ALH) e freqüência de batimento de cauda (BCF). Além

disso, foi possível identificar a presença de diferentes subpopulações que compõem as amostras de

sêmen canino após a descongelação, tal qual previamente observado por outros autores (Quintero-

Moreno et al., 2004). Isso evidencia que os espermatozóides oriundos de uma mesma amostra de

sêmen respondem de maneira diferenciada aos danos oriundos dos processos de congelação e

descongelação. Em suínos e gazelas, Abaigar et al. (1999) sugerem que a divisão dos

espermatozóides que compõem um ejaculado em diferentes subpopulações é originada na

espermatogênese, quando a heterogeneidade genotípica é ainda capaz de afetar a qualidade das

células espermáticas.

Um dos objetivos dessa tese foi estabelecer as relações entre os diferentes testes utilizados

para a avaliação da qualidade espermática após a descongelação. Nesse sentido, no Capítulo 02,

observou-se a existência de correlações entre a motilidade espermática avaliada imediatamente após

a descongelação e aquela avaliada aos 60 e 120 minutos, no decorrer do teste de termorresistência.

Esse resultado mostra que quanto maior a motilidade imediata do sêmen após a descongelação,

maior será a sua longevidade. Além disso, foram também verificadas correlações entre a motilidade

espermática e a função de membrana avaliada pelo teste hipo-osmótico (HOST), sugerindo que a

manutenção da função da membrana plasmática é essencial para a manutenção da motilidade

espermática após a descongelação. Resultados similares foram também descritos por Rota et al.

(2005), mas a existência de correlações entre o HOST e os testes de fertilidade in vivo ou in vitro na

espécie canina permanece por ser verificada (Peña-Martinez, 2004).

Já no Capítulo 03, observou-se que alguns padrões de motilidade espermática pós-

descongelação avaliada pela CASA apresentam relações significativas com os resultados do teste de

interação entre espermatozóides e oócitos. Esses padrões são: a freqüência de batimento de cauda

(BCF), velocidade média na trajetória (VAP) e velocidade progressiva linear (VSL). Esses

resultados concordam com aqueles descritos por Herrera et al. (2004), que demonstraram que a

porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva e total determinada pela CASA

apresenta uma relação linear significativa com a fertilidade in vitro em bovinos, mas os parâmetros

de VAP, LIN e BCF não apresentam tal relação. Esses autores sugerem que a CASA poderia então

ser utilizada para predizer a fertilidade na espécie bovina.

Por outro lado, a inexistência de relações entre a CASA e os testes de fertilidade in vivo já

foi descrita para a espécie suína (Quintero-Moreno et al., 2004) e eqüina (Kirk et al., 2005). Além

disso, Oehninger et al. (2000) sugeriram que é difícil expressar as reações entre os parâmetros

avaliados pela CASA com a fertilidade in vitro, uma vez que a CASA ou qualquer outro método de

análise espermática examina populações espermáticas (Suzuki e Nagai, 2003).

Paralelamente à realização da CASA, foi também realizada a análise subjetiva da motilidade

espermática nas amostras de sêmen descongelado, permitindo o estabelecimento de uma

comparação entre os dois métodos. Esses dados comparativos não se encontram apresentados na

presente tese e deverão ser publicados no futuro. No uso da CASA observou-se após a

descongelação uma motilidade progressiva de 57,3 ± 8,1% e total de 68,7 ± 9,3%. Já no uso da

microscopia óptica, a motilidade espermática observada foi de 63 ± 8,3%. Comparações entre os

métodos mostraram não existir diferenças significativas (teste t de Student, P>0,05) entre os

resultados da microscopia óptica e ambos os dados mostrados pela CASA. Essa proximidade de

resultados entre os dois métodos já havia sido previamente relatada por Iguer-Ouada e Verstegen

(2001). Esses resultados mostram que a subjetividade imposta à análise por microscopia óptica

permite variações na avaliação da amostra de sêmen, denotando valores que se situam entre a

motilidade total e a progressiva, verificadas pela CASA. O resultado dessa comparação é

importante porque permite uma validação das análises subjetivas realizadas nessa tese, certificando

os resultados verificados para esse parâmetro nos Capítulos 01 e 02.

e) Teste de termorresistência e efeito da adição de diluente após a descongelação

Nos capítulos 01 e 02 desta tese foram realizados testes de termorresistência no sentido de se

avaliar a longevidade espermática. Em ambos verificou-se um declínio gradual da motilidade

espermática no decorrer do período de incubação. Conforme visto no Capítulo 02, por volta de 60

minutos após a descongelação, havia ainda em torno de 30% de espermatozóides móveis nas

amostras, permitindo o uso das mesmas para a realização de inseminações (Concannon e Battista,

1989), sendo indicada a via intra-uterina nesse momento. Além disso, vale salientar que no caso da

realização de uma inseminação imediatamente após a descongelação do sêmen, estando a cadela no

momento ideal, os valores de motilidade imediata após a descongelação associados a essa

longevidade espermática seriam mais que suficientes para a ocorrência da fertilização, haja vista

que Tsutsui et al. (1989) mostraram que os espermatozóides caninos podem atingir o corno uterino

até dois minutos após a deposição vaginal. Vale ainda ressaltar que a presença de relações entre a

longevidade espermática e o potencial fertilizante do sêmen não foi ainda descrita para a espécie

canina, conforme já verificada, por exemplo, em humanos (Alvarez et al., 1996).

A partir dos resultados de termorresistência obtidos em um trabalho anterior (Silva et al.,

2003) e no Capítulo 01 desta tese, objetivou-se testar o efeito da adição de diluente ao sêmen após a

descongelação, pois se acreditava que a adição do diluente poderia diminuir a ação tóxica do

glicerol sobre a célula espermática durante a incubação, melhorando assim a longevidade

espermática. Além disso, Peña e Linde-Forsberg (2000) haviam sugerido que a diluição pós-

descongelação melhoraria a longevidade espermática. Desse modo, no Capítulo 02, foi demonstrado

que a adição do diluente ao sêmen descongelado, em uma proporção de uma parte do sêmen para

quatro partes do diluente, não trás benefício e nem prejuízo à longevidade ou à morfologia

espermáticas. Esses dados mostraram que é desnecessária a diluição pós-descongelação para a

realização do teste de termorresistência. Porém, havendo necessidade de expandir o volume seminal

para a realização de inseminação artificial intravaginal, a adição do diluente não iria trazer prejuízo

à qualidade espermática. Provavelmente, esses resultados foram diferentes daqueles encontrados

por Peña e Linde-Forsberg (2000) devido ao fato que esses autores adicionaram o Equex (Nova

Chemical Sales Inc., Sicuate, MA, USA) ao diluente, o qual previamente já tinha sido demonstrado

que tinha um efeito de prolongar a longevidade espermática em cães (Rota et al., 1997).

É necessário ressaltar que foi verificada, no Capítulo 02, a existência de interações entre o

efeito individual do cão doador de sêmen e o período de incubação. Provavelmente, do mesmo

modo que os diferentes cães apresentam uma diferente sensibilidade à congelação de sêmen, os

mesmos também devem apresentar uma diferente resistência à incubação por longo período em

temperaturas pré-determinadas, para a realização do teste de termorresistência. Entretanto, os

fatores que determinam essas diferenças permanecem por serem elucidados.

f) Múltiplos parâmetros morfológicos dos espermatozóides caninos

Segundo Oettlé (1993), a fertilidade em cães só seria afetada caso amostras de sêmen com

menos de 60% de espermatozóides normais fossem utilizadas em inseminações artificiais. Nos

quatro experimentos que compõem esta tese, observou-se que o procedimento de congelação

adotado foi eficiente em preservar a morfologia espermática. Entretanto, no primeiro trabalho a taxa

de morfologia espermática normal após a descongelação (74%) foi inferior àquela encontrada nos

demais experimentos (85%). Naquele trabalho foram utilizados esfregaços de sêmen corados com

Eosina-Nigrosina, o qual nós constatamos ter uma boa qualidade tintorial, porém permitindo a

presença de muitos debris e sujidades que dificultavam a leitura da lâmina. Além disso, o processo

de manufatura do esfregaço, que consistia no rolamento de um swab impregnado de sêmen por

sobre a lâmina, também aumentava a ocorrência de destacamento de cauda, tanto no sêmen fresco

quanto no descongelado. Segundo Dott e Foster (1972), a coloração de Eosina-Nigrosina permitiria

a distinção de espermatozóides vivos e mortos. No entanto, observamos que as diferenças tintoriais

entre os espermatozóides vivos e mortos são muito sutis e difíceis de serem avaliadas, e por isso

esse parâmetro não foi incluso no presente trabalho.

A partir do experimento 02, foi feito uso do corante Rosa de Bengala (Rodrigues, 1997), o

qual permite não apenas a visualização da morfologia espermática, mas também a avaliação da

integridade do acrossoma. O seu processo de manufatura consistia em diluir 0,5µL de sêmen em

75µL de Rosa de Bengala e em seguida colocar uma gota dessa solução sobre lâmina e recobrir com

lamínula fixada com esmalte. Esse procedimento pareceu não induzir o destacamento da cauda dos

espermatozóides e, além disso, mostrava uma excelente qualidade tintorial.

Em todos os trabalhos, as principais alterações morfológicas espermáticas observadas no

sêmen descongelado foram cabeças destacadas, peças intermediárias dobradas, caudas quebradas e

enroladas, e defeitos acrossomais. Esses defeitos consistiam em alterações secundárias (Seager,

1986), provavelmente originadas do choque térmico e do estresse osmótico provocado pelos

procedimentos de congelação e descongelação (Farstad, 1996), bem como da manipulação do

sêmen.

O corante Rosa de Bengala foi também eficiente em permitir a visualização do acrossoma e

a identificação de diferentes alterações morfológicas nessa estrutura. Dentre essas alterações, a mais

presente no sêmen descongelado foi a edemaciação dos acrossomas. Entretanto, é necessário

enfatizar que nem todos os estágios do dano acrossomal podem ser identificados através da

microscopia de contraste de fase (Rodrigues, 1997), sendo assim sugerido o emprego de outras

técnicas mais eficientes, como a epifluorescência e a microscopia eletrônica.

A integridade da membrana plasmática é essencial para a viabilidade celular, uma vez que a

permeabilidade seletiva da membrana é responsável pela manutenção da atividade metabólica

intracelular, do pH e da composição iônica da célula (Rota et al., 1997). Nos Capítulos 03 e 04 foi

utilizada a solução CFDA/PI para a avaliação da integridade da membrana plasmática e observou-se

que a porcentagem de espermatozóides com membrana não intacta após a descongelação

sobrepunha a de espermatozóides com membrana intacta. Colembrander et al. (2003) havia

previamente relatado que essa maior incidência de membranas plasmáticas não intactas poderia ser

um indicativo de diferentes estágios da ativação espermática. De fato, as modificações indicativas

de capacitação observadas no sêmen canino podem ser tanto iniciadas quanto aceleradas pelos

procedimentos de preservação (Rota et al., 1999). Vale ainda salientar que atualmente alguns

laboratórios têm feito uso da Citometria de Fluxo, que permite uma análise mais acurada que aquela

realizada pela microscopia convencional de fluorescência, visto que realiza a avaliação de diversos

parâmetros morfológicos através da análise sistemática de um grande número de células (Rota et

al., 1998).

O Capítulo 03 mostrou não existirem relações significativas entre morfologia espermática e

integridade acrossomal com os resultados do teste de interação entre espermatozóides e oócitos.

Esse fato é indicativo que a avaliação isolada de tais parâmetros não é suficiente para predizer a

fertilidade das amostras de sêmen canino.

Não foram também observadas relações entre as interações espermatozóides-oócitos e a

integridade de membrana plasmática. Uma possível justificativa para isto refere-se ao fato de que

fora previamente demonstrado que o espermatozóide canino portador de membrana intacta ou não-

intacta poderia ligar-se à zona pelúcida de oócitos (Kawakami et al., 1993). De fato, Strom et al.

(1997) sugerem que o espermatozóide canino poderia reter seu potencial fertilizante, caso as

alterações na membrana plasmática fossem mínimas. Assim, poderíamos inferir que pequenas

alterações permitiriam a entrada do iodeto de propídio, manifestando a fluorescência em vermelho,

e caracterizando a célula como portadora de uma membrana não-intacta, mas a sua capacidade

fertilizante poderia ainda estar preservada.

Finalmente, foram também avaliados os parâmetros morfológicos Área e Alongamento,

através da análise computadorizada (CASA). Entretanto, esses parâmetros são de difícil

interpretação (Rijsselaere et al., 2004). Além disso, Dahlbon et al. (1997) demonstraram haver uma

grande variação individual entre os cães com relação às dimensões da cabeça de seus

espermatozóides, dificultando ainda mais a interpretação desses parâmetros morfométricos.

g) Teste hipo-osmótico

O teste hipo-osmótico (HOST) avalia a integridade funcional da membrana espermática

(Spittaler e Tyler, 1985), sendo essa importante para o metabolismo espermático. Essa análise é um

teste de endosmose que determina as mudanças na membrana espermática, onde o transporte

através dessa é um processo bioquímico importante para a viabilidade espermática e capacidade

fertilizante (Jeyendran et al., 1992). Alguns autores demonstraram que a resposta osmótica do

sêmen fresco estaria correlacionada com a fertilidade em algumas espécies (Jeyedran et al., 1992;

Revell and Mrode, 1994; Perez-Llano et al., 2001). Na espécie canina, a presença de correlações

dos resultados do HOST no sêmen fresco ou descongelado, com a fertilidade in vivo ou in vitro

ainda não foi avaliada (Peña-Martinez, 2004).

No capítulo 02 desta tese, observou-se que o procedimento de criopreservação promove uma

redução da resposta osmótica dos espermatozóides caninos. Além disso, foi verificada a presença de

correlações significativas entre a resposta osmótica do sêmen canino descongelado e sua motilidade

imediata após a descongelação. Isso mostra que a manutenção da função da membrana plasmática é

de suma importância para a manifestação da motilidade espermática.

É necessário ainda enfatizar que a pressão osmótica do composto formado por 0,01 mL de

sêmen descongelado diluído em 0,09mL da solução hipo-osmótica (150mOsm/L), utilizado no

Capítulo 02, foi mensurada, tendo sido verificados 280mOsm/L. Possivelmente, o HOST para o

sêmen congelado/descongelado não costuma ser realizado sob as mesmas condições que aquele

para o sêmen fresco, onde os espermatozóides estavam realmente submetidos a uma solução com

150mOsm/L. Provavelmente, essa osmolaridade de 280mOsm/L deve-se à presença de gema de

ovo e glicerol no diluente do sêmen, uma vez que Hammerstedt et al. (1990) reportaram que a

adição dessas substâncias ao diluente Tris proporcionava uma alta osmolaridade de até

1300mOsm/L. Desse modo, a resposta de enrolamento de cauda espermática observada após a

descongelação deveu-se principalmente ao choque osmótico da passagem abrupta dos

espermatozóides de um meio contendo 1300mOsm/L para 280mOsm/L. Outros autores sugerem o

uso de soluções hipo-osmóticas de 55mOsm/L (Sanchez et al., 2002) ou até mesmo 0mOsm/L

(Quintela et al., 2004), no intuito de obter uma melhor resposta osmótica dos espermatozóides

descongelados. Entretanto, a aplicação do HOST para o sêmen canino descongelado deve ainda ser

melhor estudada.

h) Aparência ultra-estrutural espermática

Apesar dos avanços da microscopia eletrônica, existem pouquíssimos trabalhos aplicando

essa técnica para a avaliação de espermatozóides caninos (Oettlé, 1993; Rodriguez-Martinez et al.,

1993; Chirinéa et al., 2005). Esses trabalhos detinham-se principalmente à avaliação da cabeça dos

espermatozóides, e em apenas um deles foram observados os efeitos da crioinjúria sobre a

membrana plasmática da peça intermediária das células espermáticas (Burgess et al., 2001). Nesse

sentido, esta tese apresenta no Capítulo 04, a primeira descrição dos danos causados pela

criopreservação na estrutura interna da peça intermediária dos espermatozóides caninos. Foi

verificado que esta região espermática apresenta edemaciação da membrana plasmática similar

àquela observada na região da cabeça. Além disso, a bainha mitocondrial em alguns

espermatozóides apresenta uma desorganização estrutural, porém o axonema se mantém intacto.

Com relação à região da cabeça espermática, as alterações aqui encontradas foram similares àquelas

previamente descritas por outros autores (Rodriguez-Martinez et al., 1993; Chirinéa et al., 2005).

A partir desses resultados, é possível destacar que a microscopia eletrônica permite a

avaliação profunda da estrutura espermática e é capaz de evidenciar alterações ultra-estruturais que

não são possíveis de serem identificadas por outras técnicas. Sendo assim, apesar do custo elevado

desse procedimento, é recomendado que o mesmo passe a ser adotado em conjunto com outras

técnicas de avaliação morfológica espermática.

i) Interação entre espermatozóides caninos congelados e oócitos homólogos

A ligação do espermatozóide à zona pelúcida é um evento crítico na interação gametogênica

que culmina com a fertilização do oócito (Mayenco-Aguirre e Pérez-Cortes, 1998). Baseado neste

fato, Hewitt e England (1997) sugeriram que o teste de interação espermatozóides-oócitos in vitro

seria um forte indicativo para predizer a fertilidade de uma amostra de sêmen. Entretanto, até então,

as relações entre as interações gametogênicas inicias e os demais parâmetros seminais ainda não

tinham sido estudados na espécie canina.

No Capítulo 03 desta tese, observou-se uma alta taxa de interações (72%) entre

espermatozóides caninos descongelados e oócitos homólogos, representada por 36% de

espermatozóides penetrados nos oócitos e 57% apenas ligados à zona pelúcida. Esses resultados são

indicativos de que o espermatozóide canino, após os procedimentos de congelação e descongelação,

retêm sua capacidade fertilizante. Porém, uma vez que a viabilidade espermática encontra-se

reduzida após descongelação, os espermatozóides não conseguiriam expressar eficientemente essa

fertilidade após a realização de inseminações artificiais, conforme resultados mostrados na literatura

(Silva et al., 2003).

Os resultados de interações espermatozóides-oócitos encontrados nesse trabalho são

similares aos encontrados por outros autores para o sêmen descongelado (De los Reyes et al.,

2004), mas são inferiores aos reportados para o sêmen fresco (Hewitt e England, 1997). De fato,

sabe-se que os procedimentos de criopreservação e descongelação comprometem a capacidade

fertilizante do espermatozóide (Watson, 1995). Além disso, Hay et al. (1997) demonstraram que a

própria adição do glicerol ao diluente durante o processo de congelação do sêmen canino pode

influenciar negativamente a taxa de penetração, uma vez que promove alterações na morfologia

espermática e integridade de acrossoma e de membrana.

A metodologia utilizada para a realização do teste de interação entre espermatozóides e

oócitos (Hay et al., 1997) mostrou-se ser bastante prática e eficiente. No entanto, foi realizada uma

modificação nesta técnica ao se utilizar o vortex para o desnudamento dos oócitos. A partir dos

resultados obtidos, pode ser sugerida a não utilização deste equipamento, uma vez que esse

procedimento provocou a perda de diversos oócitos.

Apesar de ser conhecido que o espermatozóide deva apresentar integridade de membrana e

morfologia normal para que possa exibir sua capacidade fertilizante, o presente trabalho mostrou

não haverem relações lineares entre a avaliação de tais parâmetros seminais e o teste de interação

espermatozóides-oócitos na espécie canina. Por outro lado, alguns dos padrões de motilidade

espermática avaliados pela CASA apresentaram tal correlação.

A avaliação de múltiplos parâmetros de sêmen tem sido constantemente revisada em

diversas espécies (Peña-Martinez, 2004; Eilts, 2005; Rodriguez-Martinez, 2005). Os autores são

unânimes em afirmar que maiores estudos são necessários para se estabelecer um teste in vitro

capaz de predizer o potencial fertilizante de uma amostra de sêmen, qualquer que seja a espécie.

Inclusive, Oliveira (2003) sugere que apesar das técnicas utilizadas para a avaliação espermática

após descongelação apresentarem baixa ou nenhuma correlação entre si, elas permitem a análise de

propriedades individuais das células espermáticas, podendo ser então complementares e não

excludentes. Desse modo, mesmo tendo sido estabelecidas relações entre a CASA e as interações

espermatozóide-oócito in vitro no presente trabalho, sugere-se a avaliação de múltiplos parâmetros

seminais, no intuito de predizer a capacidade fertilizante in vitro do sêmen canino.

j) Efeito individual do cão

No Capítulo 01 desta tese, foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis para verificar se os animais

utilizados no experimento faziam parte de uma população homogênea, ou seja, suas características

seminais eram similares. Esse fato foi realmente constatado nesse trabalho. Entretanto, a partir do

Capítulo 02, observamos que seria mais interessante verificar não apenas se os animais partiam de

um mesmo ponto inicial, mas também se os mesmos exerciam algum tipo de influência sobre os

resultados após a descongelação. Sendo assim, a estatística foi reformulada e passamos a fazer uso

da análise de variância seguida do teste PSLD de Fisher para verificar a existência de um efeito

individual do cão, e de interações desse efeito com os demais tratamentos, sobre os diferentes

parâmetros avaliados no sêmen canino após a descongelação.

No decorrer da tese, observou-se que o efeito individual do cão incidia sobre diferentes

parâmetros seminais, como motilidade imediata após a descongelação, alguns padrões de

motilidade, populações espermáticas, longevidade, morfologia espermática, integridade acrossomal

e interações entre espermatozóides e oócitos. Além disso, foram também observadas interações

entre o efeito individual do cão e o período de incubação, durante a realização do teste de

termorresistência. Esses resultados mostram que diferentes cães podem apresentar uma diferente

sensibilidade aos procedimentos de congelação, tal qual previamente reportado para suínos (Gil et

al., 2005) e eqüinos (Kirk et al., 2005).

Algumas hipóteses podem ser levantadas para explicar a diferença de congelabilidade

seminal entre os cães. Thurston et al. (2002) identificaram a presença de marcadores moleculares

ligados a genes que controlariam a congelabilidade seminal em suínos, determinando variações

individuais e entre diferentes raças. Entretanto, pesquisas dessa ordem não foram ainda

desenvolvidas na espécie canina. Em adição, já foi identificado que os espermatozóides de

diferentes cães apresentam diferenças quanto à permeabilidade de sua membrana plasmática, que

pode se refletir em diferentes resultados após a descongelação (Yu et al., 2002), mas não se sabe

ainda qual fator determina essa diferença de permeabilidade na membrana celular, tal qual já

estudado em suínos (De Leeuw et al., 1990) e camundongos (Phelps et al., 1999). Isso seria então

um indicativo que novas pesquisas devam ser conduzidas no intuito de identificar o fator que

confere uma maior congelabilidade ao sêmen de determinados cães, possibilitando assim o

aprimoramento dos protocolos de congelação seminal.

k) Considerações finais

Um protocolo de preservação adequado deve manter o potencial fertilizante das células

espermáticas que deverão, ao final de todo o processo, apresentar a vitalidade necessária para

atingir o local da fertilização e estarem aptas a concluir a capacitação e a reação acrossômica, que

constituem o estágio final de maturação espermática e possibilitam a fecundação do oócito (Watson,

1995; Rota, 1998). Para se obter sucesso na congelação de sêmen é necessária a adição de um

diluente que ajude a estabilizar o metabolismo celular, previna a capacitação espermática e a reação

acrossômica precoces, e ofereça um ambiente favorável para a preservação da integridade e função

de todos os compartimentos espermáticos e ainda da membrana plasmática dos espermatozóides

(Watson, 1995; Watson, 2000). Nesse sentido, uma grande variedade de diluentes tem sido testada

para a preservação de sêmen nas diferentes espécies.

A equipe do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC-UECE) tem trabalhado com o

diluente Tris já há bastante tempo, seja ele o principal objeto de estudo (Silva et al., 1998, 2002cd,

2003), ou simplesmente como o grupo controle em testes de diluentes alternativos (Silva et al.,

2000, 2004). É necessário enfatizar a grande praticidade de uso desse diluente, o qual é constituído

por ingredientes de fácil aquisição comercial, a um custo relativamente baixo, e além disso, é de

fácil preparo. Nos trabalhos que compõem a presente tese, foi preparado um volume de 100 mL do

diluente Tris-frutose-ácido cítrico, divididos em alíquotas de 1,5 mL acondicionadas em tubos

plásticos com tampa e armazenadas em freezer por até seis meses. Por ocasião de cada congelação,

realizava-se então o descongelamento das amostras de Tris para uso no experimento, e fazia-se a

adição da gema de ovos frescos de galinha e de glicerol. Após seis meses do preparo do diluente,

era sempre preparado um novo volume do mesmo.

Em trabalhos anteriores, foi adaptada para a espécie canina, no uso do diluente Tris (Silva,

2001), uma metodologia de congelação previamente utilizada com o diluente à base de água de

coco em caprinos (Nunes et al., 1997), e no decorrer desse tempo, temos aperfeiçoado essa

metodologia. Assim, nossos principais propósitos com a presente tese foram aprimorar esta

metodologia e realizar diversas análises morfológicas e funcionais do sêmen descongelado, no

intuito de verificar se essa metodologia de congelação foi realmente eficiente para preservar a

qualidade espermática.

Com os resultados obtidos nesta tese, demonstramos que essa metodologia de congelação,

em associação com o diluente Tris, tem sido bastante eficiente em conservar a qualidade do sêmen

canino após a descongelação. Algumas descobertas conferiram uma maior praticidade ao método de

congelação, por exemplo, pela possibilidade de realização da diluição baseada em volume fixo, ou

mesmo, através da adição do glicerol a uma temperatura ambiente de 27ºC.

Além disso, essa tese tem um caráter inovador para a pesquisa científica por demonstrar a

realização conjunta de diferentes testes de avaliação seminal, inclusive, ao estudar a existência de

relações entre os mesmos. Além das convencionais análises de motilidade, morfologia, acrossoma,

termorresistência e resposta osmótica, nesta tese foram utilizadas técnicas mais avançadas, como a

análise computadorizada, microscopia de fluorescência, teste de interação entre espermatozóides e

oócitos e microscopia eletrônica de transmissão. Assim, sugerimos a utilização conjunta de

diferentes testes para a avaliação do sêmen canino, uma vez que os mesmos poderiam

complementar-se. Mas salientamos que alguns padrões de motilidade avaliados isoladamente

através da CASA apresentam relações significativas com os estágios iniciais da fertilização in vitro

na espécie canina.

11. CONCLUSÕES

1. A diluição baseada em uma concentração espermática pré-fixada de 200 x 10

espermatozóides/mL e aquela baseada em um volume fixo na proporção de uma parte de

sêmen para uma parte de diluente (1:1) são igualmente eficientes para a criopreservação do

sêmen canino.

2. O diluente contendo glicerol pode ser adicionado ao sêmen canino tanto à temperatura

ambiente (27ºC) quanto após o resfriamento (4ºC), durante o procedimento de

criopreservação.

3. Não existe necessidade de diluir o sêmen canino após a descongelação para a realização do

teste de termorresistência, mas a adição do diluente Tris ao sêmen canino descongelado não

promove danos à sua qualidade.

4. Alguns parâmetros de motilidade espermática avaliados pela análise computadorizada

(CASA) apresentam relações significativas com as interações in vitro entre espermatozóides

caninos congelados/descongelados e oócitos homólogos.

5. O procedimento de criopreservação induz uma série de alterações nas características

morfológicas dos espermatozóides caninos, mas algumas destas alterações apenas podem

ser verificadas através da avaliação da aparência ultra-estrutural da célula espermática.

100

12. PERSPECTIVAS

A cada dia, novas pesquisas vêm sendo realizadas no intuito de aprimorar as biotécnicas

reprodutivas já existentes. Assim, acreditamos que essa tese possa servir de base para pesquisas

futuras realizadas por outros autores, no intuito de atingir ainda um maior avanço na tecnologia de

sêmen canino. Os resultados obtidos neste trabalho também apontam a direção para futuras

investigações relacionadas ao aprimoramento ou desenvolvimento dos testes de avaliação seminal,

no intuito de se tentar predizer a fertilidade in vivo das amostras de sêmen. Além disso, devido ter

sido verificada a ocorrência de um efeito individual do cão doador de sêmen, é sugestiva a

realização de estudos no sentido de se determinar a razão de existirem cães com diferentes

sensibilidades à congelação de sêmen, e talvez assim aprimorar os protocolos existentes.

Durante a realização deste trabalho, nós nos deparamos com o obstáculo da impossibilidade

de manutenção de cadelas em um número adequado para a realização de inseminações artificiais,

para que pudéssemos então comprovar os resultados aqui obtidos através da fertilidade in vivo. No

entanto, haja vista a similaridade e, em alguns aspectos, a superioridade dos resultados aqui

apresentados em relação aos descritos na literatura, realmente acreditamos ser possível alcançar

resultados de fertilidade in vivo bastante aceitáveis. Sendo assim, sugerimos que a metodologia

apresentada nesse trabalho possa vir a ser utilizada em escala comercial, dentro da rotina de um

laboratório ou banco de sêmen canino, possibilitando a manutenção e posterior difusão do material

genético de reprodutores de alto interesse zootécnico ou afetivo, e permitindo a ocorrência de

gestação em diversas cadelas.

Não poderíamos ainda deixar de destacar a possibilidade de aplicação dessa metodologia de

congelação de sêmen em programas de conservação de espécies ameaçadas de extinção. O

armazenamento de material genético abre fronteiras para o estudo da preservação de espécies

canídeas silvestres, sendo uma das principais formas de se aumentar a variabilidade genética

(Johnston e Lacy, 1995). Nesse sentido, apresentamos um artigo em anexo que fala da possibilidade

de adaptação de algumas biotécnicas desenvolvidas em pequenos animais para os carnívoros

selvagens (Anexo 05).

101

13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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122

ANEXOS

123

ANEXO 01

Procedimento para Teste de Interação entre Espermatozóides e Oócitos

1. Ovários

a. Transportar os ovários em solução salina fisiológica (250 mL) a 38ºC para o

laboratório. Colocar Gentamicina (6,25mg) apenas se o início do procedimento for

demorar.

b. Dissecar os ovários, limpar toda a gordura circundante e lavá-los em solução

fisiológica.

c. Repassar os ovários para uma placa de Petri (60x10) e fatiá-los utilizando lâmina de

Bisturi, em uma solução de PBS + 0,4% BSA.

d. Examinar os oócitos em Lupa, contar o número de oócitos por ovário e selecionar os

oócitos Grau 1.

e. Repassar os oócitos selecionados para uma placa contendo Talp FIV (1h em estufa)

ou “PBS + BSA”.

f. Lavar em Talp FIV ou PBS.

g. Em uma placa pequena, colocar três gotas de 30?L de Talp FIV, tendo o cuidado pra

não colocar as gotas no canto da placa

h. Colocar aproximadamente 3mL de óleo mineral ao redor das gotas, vagarosamente.

Quando for retirar o óleo do seu recipiente, ter o cuidado de não introduzir a ponteira

até o final, para não pegar solução salina.

i. Completar cada uma das três gotas com mais 65?L de Talp FIV.

j. Colocar 10 oócitos por gota

k. Cobrir e deixar na estufa até a chegada do sêmen.

2. Sêmen

a. Descongelar o sêmen e avaliar a motilidade e vigor espermáticos

b. Centrifugar com Sperm Talp (1h em estufa) na proporção de 1:1 (3400 RPM / 5

min.)

c. Desprezar o sobrenadante

d. Calcular o número total de espermatozóides móveis e dividir por 400. O resultado

dessa divisão corresponde ao volume de Sperm Talp a ser acrescentado para se

atingir a concentração de 400 x 10

sptz móveis/mL.

124

e. Homogeneizar com sucessivas pipetagens.

f. Adicionar 5?L de sêmen a cada gota com os oócitos, atingindo a concentração final

de 2 x 10

sptz/mL.

g. Levar para a lupa para observar a presença dos espermatozóides móveis.

h. Cobrir a placa com sua tampa e levá-la para a estufa por 18 horas.

3. Avaliação

a. Retirar a placa da estufa

b. Avaliar o estado dos oócitos na lupa

c. Retirar os oócitos e lavá-los 2x em “PBS + BSA”

d. Retirar os oócitos e transferi-los para um ependorf com solução de citrato de sódio a

1% por dez minutos

e. Levar o ependorf para o Vortex por 3 minutos

f. Retirar todo o volume e colocá-lo em uma placa

g. Coletar os oócitos em um volume mínimo possível e repassá-los para uma lâmina,

tendo o cuidado de colocar a pipeta na posição vertical.

h. Adicionar o corante Hoechst 33258 no mesmo volume, também com a pipeta na

vertical, e em seguida, homogeneizar a solução.

i. Recobrir com uma lamínula, suspensa em vaselina ou silicone em seus cantos,

fazendo pressão sobre os mesmos com uma ponteira, para evitar que a gota deslize.

j. Avaliar em microscópio de epifluorescência.

125

ANEXO 02

Preparo das Soluções Utilizadas no Teste de Interação entre Espermatozóides e Oócitos

1. Soluções de estoque de íons

a. Cloreto de Sódio (NaCl) – 2,28 M

6,665g / 50mL

b. Cloreto de Potássio (KCl) – 158 mM

0,88g / 50mL

c. Bicarbonato de Sódio (NaHCO

) – 250 mM

1,05g / 50mL

d. Fosfato de Sódio (NaH

O) – 35 mM

0,235g / 50mL

e. Cloreto de Cálcio (CaCL

.2H

O) – 16,46 mM

1,47g / 50mL

f. Cloreto de Magnésio (MgC

.6H

O) – 10 mM

1,015g / 50mL

g. Hepes – 1M

1,19g / 5mL

OBS. Utilizar água MiliQ em todas as soluções.

126

2. Soluções de Estoque TL

a. Espermatozóide TL – Osmolaridade 295 mOsm/L

19,81 mL de H

1,085mL de NaCl

0,49mL de KCl

2,50mL de NaHCO

0,25mL de NaH

0,09mL de Lactato de sódio

0,25mL de Hepes

0,25mL de CaCL

.2H

0,275mL de MgCL

.6H

b. FIV TL – Osmolaridade 295 mOsm/L

44,125mL de H

1,25mL de NaCl

0,50mL de KCl

2,50mL de NaHCO

2,50mL de NaH

0,045mL de Lactato de sódio

0,25mL de CaCL

.2H

0,125mL de MgCL

.6H

127

3. Solução TALP

a. TALP SPERM (pH 7,4)

9,5mL Espermatozóide TL

60mg de BSA (Fração V)

100?L de Piruvato de Sódio (2,2 mg/mL)

83,5?L de Gentamicina (50mg/mL)

10?L de Vermelho Fenol (1mg/100mL)

b. TALP FIV (pH 7,4)

9,5mL de FIV TL

30,0mg de BSA (Fração V)

10?L de Piruvato de Sódio (2,2mg/mL)

83,5?L de Gentamicina (50mg/mL)

10?L de Heparina (2,0mg/mL)

10?L de Vermelho Fenol (1mg/100mL)

128

ANEXO 03

Preparo das Soluções Utilizadas na Avaliação de Integridade de Membrana Espermática

por Microscopia de Fluorescência

1 Solução-Estoque de Fluoresceína

a. 6-carboxifluoresceína diacetato 9,2 mg

b. DMSO 20 mL

2 Solução-Estoque de Iodeto de Propídio

a. Iodeto de propídio 10 mg

b. Solução fisiológica 20 mL

3 Solução de Formaldeído

a. Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica

4 Solução de Trabalho

a. Sol.-Estoque de Fluoresceína 20 µL

b. Sol. Estoque de Iodeto de Propídio 10 µL

c. So. de Formaldeído 10 µ

d. Citrato de Sódio 3% 0,96 mL

Obs. A solução de trabalho foi sempre preparada no momento da avaliação

microscópica, conforme citado por Cunha, 2002.

129

ANEXO 04

Convite para participar do prêmio concedido pelo Instituto Royan em Tehran, Iran

De:

"info" <[email protected]rg> Adicionar endereço

Para:

[email protected]

Assunto:

The 6th RIRA

Data:

Mon, 29 Nov 2004 10:48:41 +0330

Dear Dr. Silva,

Your research paper with the title "The potential for gamete recovery from non-domestic canids

and felids" in the Animal Reproduction Science Journal, was interesting for Scientific Board of

Royan International Research Award.

So, here by we would like to invite you to participate in the 6th Royan International Research

Award with the said paper. For participating, you should send us the followings:

1. Your full paper,

2. 2. Filled Application form (is attached)

3. Your CV

4. A color photo of yourself.

If you need more information about our award, please refer to our web site address:

www.RoyanInstitute.org

If the first author can not participate, any of the research colleagues can present the paper if all

others accept.

All of our ceremonies and congresses will be held on time if the situation in the middle east is

peaceful

Looking forward your early reply

Your Sincerely

S. Kazemi PhD / Award Chairman

Royan Institute

P.O.Box:19395-4644

Tehran - IRAN

Tel: +98 21 241 3790

Fax: +98 21 2409314

130

ANEXO 05

The potential for gamete recovery from non-domestic canids and felids

O potencial da recuperação de gametas de canídeos e felídeos não domésticos

Animal Reproduction Science,

81: 159-175, 2004

131

The potential for gamete recovery

from non-domestic canids and felids

Alexandre R. Silva

a,*

, Ronaldo G. Morato

, Lúcia D.M. Silva

Laboratory of Carnivore Reproduction, PPGCV - UECE, Paranjana Ave. 1700, Itaperi,

60740-000, Fortaleza, Ceará, Brazil

National Research and Conservation Center for Natural Predators (CENAP/IBAMA),

Pro-Carnivore Association, School of Veterinary Medicine – UNIBAN

Received 20 March 2003; received in revised form 25 September; accepted 2 October 2003

Abstract

Species are becoming extinct at a rate 100 times the natural background rates. Considering

all mammalian orders, 24% of all Carnivora species are threatened. The goal of carnivore

conservation is to reverse the decline in populations and to secure remaining populations in ways

that will assure enduring public support. In this context, biotechnology is a tool with tremendous

potential for assisting the conservation of endangered canid and felid species. As the first step for

biotechnology development is the gamete obtainment, this review will discuss the potential of

gamete recovery from non-domestic canids and felids, based on learning how to apply these

procedures in the domestic carnivores. Thus, electroejaculation and obtaining both epidydimal

spermatozoon and spermatogonial germ cells are indicated as techniques for male gametes

recovery. In the female gametes retrieval, different methods for oocyte recovery from both antral

and preantral follicles, and the possibility for ovarian tissue transplantation are discussed.

Furthermore, the study discusses the responsibilities involved in the use of assisted reproduction in

endangered species conservation.

Key-words: conservation, biotechniques, reproduction, canid, felid.

________________________________________________________________________________

1. Introduction

The constant search for widening territory has led to the destruction and fragmentation of

ecosystems. As a consequence, some species have disappeared while some forest islands have been

formed. These islands isolate populations and, consequently, prevent the interchange of genetic

information, which can lead to the decrease of genetic variability of the involved populations

(O’Brien et al., 1985; Roelke et al., 1993). Furthermore, a large number of animals are suffering due

to the transformation of their habitats into agricultural centers. It is then that humans systematically

eliminate species because they are causing economic damage to farmers. Another consequence is

Corresponding Author. Present address: Rua Aracati, 69, Benfica, Fortaleza, Ceará60020 – 240, Brazil.

Tel.: + 55-85-2214959; fax: + 55-85-2992740

E-mail address: [email protected]

132

that a large number of animals have been victims of traffic accidents on roads, increasing the

number of convalescent or dead animals (Rodrigues, 2002). Because a great part of these animals

belong to endangered species, the loss of a single individual could be deleterious for the

maintenance of a species.

Species are becoming extinct at a rate 100 times the natural background rates. With only

around 5% of the land surface of the planet protected in some way, continued habitat loss will

produce much greater extinction rates, with a potential disappearance of up to half of the world’s

species. Of all mammalian orders, 24% of all Carnivora species are threatened (Gittleman et al.,

2001). Carnivores represent extremes of problems in conservation biology. In one lineage, some

canid species such as the red fox (Vulpes vulpes) have virtually no risk of extinction – indeed,

many now consider them as pests in our largest cities – while other canids such as the Ethiopian

wolf (Canis siemensis) are rapidly proceeding toward inevitable extinction (Purvis et al., 2001).

Moreover, among the 37 felid species, only the domestic cat (Felis catus) is not in risk of extinction

(Pope et al., 1993).

Otherwise, there are many questions concerning the conservation of non-domestic

carnivores. Gittleman et al. (2001) classify carnivores as “umbrella species”, since they are

predators and require large areas to compound their territory. Thus, if carnivores are conserved, a

large number of species and ecosystems will be protected also. Carnivores are also classified as

indicator species – those that reflect critical environmental damage; keystone species – those that

play a pivotal role in ecosystems; flagship species – popular species that attract much attention; and

vulnerable species – species most likely to become extinct.

The goal of carnivore conservation is to reverse declines in populations and to secure

remaining populations in ways that will gain enduring public support. In this context, biotechnology

has a tremendous potential as a tool for assisting conservation of endangered canids and felids

(Wildt, 1997; Bainbridge and Jabbour, 1998; Howard, 1999). Goodrowe et al. (2000) suggest that

the Carnivora order has numerous representatives that are imperiled and could benefit from

reproductive biotechnology. Due to the phylogenetic similarities between the domestic and non-

domestic carnivorous species, the first are used as an experimental model for the others, mainly

because of the lack of availability of non-domestic carnivores for use in experiments (Pope et al.,

1993). Because the first step for biotechnology development is gamete obtainment, this review will

discuss the potential of gamete recovery from non-domestic canids and felids, based on learning

how to apply these procedures in the domestic carnivores.

2. Male gamete recovery

2.1 Semen characteristics and storage

Semen is a cellular suspension containing spermatozoa and secretions originating from

accessory organs of the masculine reproductive tract. In addition, semen technology refers to the

various forms of sperm quality maintenance, including expansion of the seminal volume for fresh

use and storage by cooling and cryopreservation. Cryopreservation is an important tool for the

formation of cryobanks, as it maintains the sperm viability for an indefinite time. Cryobanks can

serve as a source of genetic material to be used through utilizing the reproductive biotechniques in

conservation of the non-domestic carnivores. Thus, particular attention will be given to the methods

of gamete recovery from canids and felids.

2.2 Electroejaculation

Several methods are reported for semen collection in animals, as the use of an artificial

vagina (Jalkanen, 1993), digital masturbation of the penile bulb (Forsberg et al., 1989) and

electroejaculation (Watson, 1978; Wildt et al., 1983). With wild carnivores, electroejaculation is the

method of choice due to the difficulty and risks involved in handling these animals.

Electroejaculation would facilitate the gamete recovery particularly from convalescent animals,

133

allowing sperm preservation for an indefinite period of time followed by the application of several

other biotechniques such as artificial insemination and in vitro embryo production.

For its execution, anesthesia using the tiletamine-zolazepan or ketamine-xilazine in

proportions that vary with the species is needed. However, some drugs seem to interfere with the

sperm quality, such as promazine, which allows urine contamination (Morato and Barnabé, 1998).

Furthermore, it is important to be aware of the risks involved in the anesthetic procedure. According

to Osofsky et al. (1996), the factors that must be considered in selecting a drug include efficiency,

safeness, existence of an antagonist, and availability and cost of the drug.

Electroejaculation is based on the controlled electric stimulation of the ejaculatory reflex,

through the introduction of a trans-rectal probe with three electrodes, connected to an electric

stimulator. The probe is inserted 7-9 cm into the rectum with the electrodes directed ventrally. Care

should be taken to evacuate any feces from the rectum. A weak electric current stimulates the

nerves supplying the reproductive organs (Platz and Seager, 1978). Different EEJ protocols have

been reported but many researchers are using the Wildt et al. protocol (1983). The authors reported

a total of 80 electric stimulations divided in three series: 30 stimuli (10 stimuli at 2, 3 and 4 V –

series 01), 30 stimuli (10 stimuli at 3, 4 and 5 V – series 02) and 20 stimuli (10 stimuli at 5 and 6 V

– series 03) for the collection of semen from South African cheetahs (Acinonyx jubatus), with 5-

min intervals between the series. The animal responds to the stimuli with a rigid extension of the

hind legs. If this reaction is not seen in series 01 or if stronger stimulation is observed, the electrode

may not be in the proper position in the rectum, or there may be interference in the current

transmission due to the presence of feces. To collect semen, a gentle pressure applied at the penile

base should allow for penile extrusion, and the ejaculate is collected into a pre-warmed test tube

that has been placed over the glans penis.

Using electroejaculation, Howard et al. (1984) reported semen collection from more than 28

cat species. Moreover, some researchers have reported successful semen collection from wild felids

by using electroejaculation, such as tigers (Panthera tigris - Donoghue et al., 1992), snow leopards

(Panthera uncia - Roth et al., 1994), Indian leopards (Panthera pardus - Jayaprakash et al., 2001),

caracals (Caracal caracal - Pope et al., 2001), jaguars (Panthera onca - Morato et al., 2001; Silva et

al., 2003), ocelots (Leopardus pardalis – Queiroz et al., 2002), margays (L. wiedii) and tigrinas (L.

tigrinus - Morais et al., 2002).

Graham et al. (1978) reported the use of electroejaculation to collect semen from non-

domestic felids. The authors cryopreserved the samples and found that 25 to 50% sperm motility

was preserved after thawing in lions (Panthera leo), jaguars (Panthera onca), leopards (Neofelis

nebulosa), cheetahs (Acinonyx jubatus) and leopard cats (Felis bengalensis), and in the latter a 70%

sperm motility was maintained. The same authors reported finding lesser values of sperm motility,

between 1 and 20% post-thaw, for Indian tigers (Panthera tigris), Geoffroy’s cats (Felis geoffroy)

and ocelots (Felis pardalis), but the spermatozoa from gold cats (Felis aurata) did not survive

cryopreservation. Furthermore, using electroejaculation to collect the semen, Byers et al. (1989)

obtained 40% sperm motility post-thaw in Siberian tigers (Panthera tigris).

In canids, Goodrowe et al. (1998) collected semen by electroejaculation from the red wolves

(Canis rufus) and obtained semen of acceptable quality. They followed the cryopreservation

technique commonly used for the domestic dog (Canis familiaris), which results in significant

damages to wolf spermatozoa, suggesting that further studies on cryoinjury in these species must be

performed. Afterwards, Goodrowe et al. (2001) collected semen from 11 adult male red wolves by

the same method and used cryopreservation. After thawing, spermatozoa motility was 23.7% and

the fertilizing capacity was examined by using a penetration assay in domestic dogs oocytes, with a

18.1% penetration rate. Moreover, Leibo and Songsasen (2002) reported the collection of semen

from Mexican gray wolves (Canis lupus), followed by cryopreservation. It appeared as if the gray

wolf spermatozoa were also sensitive to freezing and thawing, as only a very low percentage of

spermatozoa survived the freezing process.

Hermes et al. (2001) collected semen from African wild dogs (Lycaon pictus) by

electroejaculation and performed cryopreservation. These authors found 40% of motile spermatozoa

post-thaw and suggested cryopreservation could be used in conservation efforts for gamete rescue

of genetically distinct populations threatened by extinction. Recently, successful semen collection

134

in maned wolves (Crysocyon brachyurus) has been performed by electroejaculation (Wildt,

unpublished; Songansen, personal communication). However, in some occasions, urine

contamination is a barrier to obtaining good sperm quality (Morato, personal communication).

The blue (Alopex lagopus) and silver (Vulpes vulpes) foxes are commercially valuable

canids and are both farmed for their pelts. In these species, semen collection is usually performed

by using an artificial vagina (Jalkanen, 1993) or digital masturbation (Forsberg et al., 1989).

However, Barta and Jacubicka (1989) reported semen collection from foxes by electroejaculation

under halothane anesthesia, which suggests the possibility of using this technique in those canids.

2.3 Collection of epidydimal spermatozoa

The epididymus is a component of the male reproductive tract and is attached to the testicle.

One of its main functions is the storage of spermatozoa for ejaculation. Present technologies allow

for semen collection directly from the epididymus and this seems to be a viable alternative method

for obtaining gametes from animals unable to ejaculate or from animals that have recently died.

Furthermore, Garde et al. (1998) suggested that viable epidydimal spermatozoa from Iberian deers

(Cervus elaphus) could be collected in the 10 to 20 h post mortem period. However, it must be

noted that this period would vary according to the weather and temperature conditions where the

procedure is being executed.

In studies accomplished with epididymal spermatozoa from domestic cats, it was verified

that these spermatozoa require less capacitating time as compared with ejaculated spermatozoa and

are able to penetrate feline oocytes 20 min after in vitro insemination (Niwa et al., 1985; Goodrowe

and Hay, 1993). Fresh feline epididymal spermatozoa were able to fertilize oocytes in vitro,

promoting 40.7% cleavage rate. After freezing, a 26% cleavage rate was obtained (Lengwinat and

Blottner, 1994). Bogliolo et al. (2001) reported that after intracytoplasmic sperm injection using

feline frozen epididymal spermatozoa, resulted in 34.9% embryos that developed to the morula

stage, indicating that spermatozoa with minimal motility could be used in reproductive

biotechniques. Moreover, Tsutsui et al. (2002) performed the unilateral intrauterine artificial

insemination with frozen-thawed epididymal semen from cats and obtained a 23% (3/11)

conception rate.

For non-domestic cats, Jewgenow et al. (1997) demonstrated that spermatozoa were

collected from the finely minced cauda epididymus of lions (Panthera leo), tigers (Panthera tigris),

leopards (Panthera pardus), pumas (Felis concolor) and jaguars (Panthera onca). The samples were

treated as described by Lengwinat and Blottner (1994), washing the spermatozoa in Hank’s

balanced salt solution and extended in medium M199 supplemented with 2.5 mMol/L sodium

lactate l

-1

and 0.4% bovine serum albumin. Progressively motile spermatozoa varied between 60%

and 85% for the various felids. In this same study, the epididymal semen was frozen and motility

between 25% and 65% for the different species that were utilized were obtained after thawing. The

frozen semen was then submitted to in vitro fertilization and 18.5% 8-cell embryos developed.

Similarly, Morato et al. (1999) provided evidence that frozen epididymal spermatozoa from jaguars

were able to penetrate heterologous zona-free oocytes.

Unfortunately, there is no information concerning epididymal semen collection from wild

canids. However, procedures developed for domestic dogs (Canis familiaris) could be adapted to

wild dogs. Thus, Yu and Leibo (2002) obtained canine testes by orchiectomy, followed by

dissection of the epididymus, which was kept under refrigeration before the isolation of epididymal

sperm. These authors found that epididymal spermatozoa could be stored at 4°C for 8 days, while

still maintaining motility, intact morphology and the ability to bind to oocytes. Sirivaidyapong

(2002) reported that the sperm collection technique could influence post-thaw results suggesting

that canine epididymal spermatozoa should be collected by inserting a fine needle in the vas

deferens, injecting bovine fetal serum, TCM 199 or Tris-buffer extender. This procedure facilitates

washing the epididymal tail with consequent collection of spermatozoa of improved quality. Hewitt

et al. (2001) observed that the conventional cryopreservation method for ejaculated canine semen

could be adopted for canine epididymal spermatozoa. In addition, Fahring (2003) reported

collection of canine epididymal semen 20 h after orchiechtomy if the testes were kept at 15 to 25°C.

135

Epididymal semen was cryopreserved in pellets and had 1% to 54% sperm motility following

thawing.

2.4 Obtaining spermatogonial stem cells

Spermatogenesis is a complex and very efficient process that starts with the division and

differentiation of spermatogonial stem cells located in the basal membrane of seminiferous tubules

sustained by Sertoli cells (Schlatt, 2002). Mammals have unique spermatogonial stem cells; because

they can maintain their proliferation in adults so genetic material can be passed to subsequent

generations. Consequently, these cells are a valuable source for biological experimentation, medical

research, agricultural biotechnology and genetic modification of the species (Brinster and Nagano,

1998). Recent studies on their recovery and cryopreservation showed the perspective of application

in the conservation of genetic material from endangered animal species.

Present methods described for spermatogonial isolation from fragments of recently collected

testis consists on elutriation (Bucci et al, 1986) or sedimentation rate in a gradient of bovine serum

albumin under gravity force action (Bellvé et al., 1977). Some other isolation techniques have been

proposed as immunological markers for posterior magnetic cellular separation (Shinohara et al.,

1999). After collection, germ cells can remain for several months in tissue culture media, only

resuming spermatogenesis after in an environment that provides favorable conditions for their

expansion and differentiation (Nagano et al., 1998). Such favorable conditions are generally

provided by transplant to other organisms (Brinster and Zimmerman, 1994).

Brinster and Zimmerman (1994) described the first success in the spermatogonial transplant.

They demonstrated that the microinjection of a mouse testis cell heterogeneous suspension into the

seminiferous tubules of a recipient mouse, previously confirmed to be sterile, could result in

spermatogenesis in the injected animal. After this finding, several other researchers began studies in

this area, showing possibilities such as the spermatogonial culture among different species, i.e., the

xenograft (Clouthier et al., 1996). Cryopreservation of testis cell suspensions seems to hold the

greatest promise for the storage of germ cells to be used later in transplants, as Avarbock et al.

(1996) showed that spermatogenesis can continue after cryopreservation.

In spite of the progress in this area, some factors remain to be controlled, such as the ideal

number of germ cells to be transplanted, formation of antibodies against spermatogonial cells by the

recipient (Ogawa et al., 1999), and poor quality of cells that have developed using these procedures

(Russell and Brinster, 1996). There is also a problem concerning xenograft related to the different

time of spermatogenesis in each species (França et al., 1998). However, Honaramooz et al. (2002)

recently observed complete spermatogenesis after transplantation of testicular tissue fragments from

species that are phylogenetically more distant, such as pigs and goats into castrated

immunodeficient mice.

As for carnivores, Dobrinsky et al. (1999) were the first to report spermatogonial

transplantation from domestic dogs to mice. These authors achieved the dissociation of

seminiferous tubules by enzyme digestion with collagenase, DNase and trypsin in pieces of testis

from mongrel dogs. Viable spermatogonial germ cells were selected through Trypam blue

exclusion. Some seminiferous tubules were cryopreserved using dimethylsulfoxide as

cryoprotectant. Fresh or frozen canine testicular tissue was transplanted to several immunodeficient

infertile mice and success was determined by immunohistochemistry, which detected the presence

of dividing canine germ cells in the recipient mice. Although countless divisions and cellular

transformations have been observed, the development of such cells to spermatozoa was not verified.

By using molecular biology techniques and genetics, testicular activity is better understood

and provides important data for the development of germ cell recovery methods. Phenomena

involved in spermatogenesis are studied by analyzing spermatozoa through flow cytometry

(Jewgenow et al., 1997). As relationships between spermatogenic activity and age, season or the

inbreeding among non-domestic carnivores are not known, the information obtained with the study

of the testicular activity will be very helpful in the future application of reproductive biotechniques

in programs of animal conservation.

136

3. Female gamete recovery

3.1 Ovarian follicles and oocytes

The follicle is the ovarian morphofunctional unit constituted by the oocyte surrounded by

somatic cells. When performing its gametogenic function, the follicle is an essential element for

maintenance of oocyte viability, seeking to assure growth and maturation of immature oocyte and,

finally, to release a mature oocyte by the ovulation process (Figueiredo et al., 2002). It is known

that the ovarian follicular population seems to be made up of thousands of follicles in different

mammalian females (Driancourt, 1991). Thus, oocyte retrieval represents a rich source of genetic

material to be used as a foundation for genetic banks, aiding in endangered species preservation,

mainly in relation to the possibility of collecting material originated from post mortem or

convalescent animals.

Donoghue et al. (1990), Wildt (1991) and Luvoni and Oliva (1993) suggested that the

development of efficient methods for in vitro maturation (IVM) or fertilization (IVF) of oocytes

collected post mortem or through ovariectomy is important to prevent the species extinction. Thus,

IVM and IVF techniques are adapted for several non-domestic animals (Johnston et al., 1991; Pope

et al., 1993), based on systematic studies in domestic animals (Wood et al., 1995; Wolfe and Wildt,

1996), including wild carnivores. Moreover, Rodrigues et al. (2001) suggest that application of

oocyte and ovary tissue cryopreservation will help in the conservation of several animal species,

with the objective of maintaining biodiversity.

3.2 Recovery of oocytes included in antral follicles

According to Hildebrandt et al. (2000), ultrasonographic images of the reproductive tract

offers new opportunities for induction of sexual cycles and ovulation, adoption of superovulating

regimens, contraception programs, semen collection and techniques of sperm extraction directly

from the testicle, as well as the ovum pick up application.

Pieterse et al. (1988) were the first to describe the ovum pick up technique, which consists

on the insertion of an ultrasonographic probe in the female vagina or rectum. Ovarian follicles are

then visualized on a monitor, allowing oocyte collection by puncturing the follicles with a fine

needle connected to a tube collector. The oocytes could be used in IVM and IVF (Nibart et al.,

1997). This technique is extensively used for oocyte collection in cattle and results indicate the

possibility of repeated collections in both pregnant and non-pregnant females (Lacaze et al.,

1997;Guyader-Joly et al., 1997).

Concerning carnivorous species, ovum pick up using ultrasonography has yet to be reported.

This may be due to the difficulty of ovarian visualization, because in bitches the ovary is

surrounded by a pouch rich in conjunctive tissue (Silva et al., 1996). Furthermore, there are no

commercial probes developed for intravaginal use in either canids or felids. However, in spite of

this difficulty, the presence of antral ovarian follicles can be detected by the fluid accumulation in

the antral cavity (Hayer et al., 1993). Hermes et al. (2001) were thus able to visualize the follicles

and corpora lutea in ovaries of female African wild dogs (Lycaon pictus) by transrectal

ultrasonography, suggesting the possibility of oocyte puncture in carnivores. Researchers could be

underestimating the potential of ultrasonography for assisted reproduction in endangered canids and

felids species. The adaptation of this technique would be an important alternative, because it is a

non-invasive procedure and it could allow oocyte collection without the risks involved with surgical

procedures.

Another possibility for oocytes retrieval is laparoscopy. According to Bush et al. (1978),

laparoscopy was effective in the evaluation of reproductive status, particularly ovarian anatomy and

function, direct visual biopsy of internal organs, and as a surgical means of fertility control.

Laparoscopy is a minimally invasive procedure commonly used for intrauterine deposition of

frozen-thawed semen in domestic dogs (Silva et al., 1995) and cats (Farstad, 2000).

For domestic cats, Goodrowe et al. (1988) reported the laparoscopic collection of oocytes,

which were inseminated in vitro with ejaculated semen. When the developing embryos reached the

4-cell stage, they were transferred to the oviduct of oocyte donors. Thus, five of the six cats

receiving embryos became pregnant. In wild felids, Swanson et al. (1996) reported the visualization

of changes in the reproductive tract during ovarian stimulation with exogenous gonadotropins in the

ocelot (F. pardalis) by laparoscopy. Moreover, Pope et al. (2001) reported that multiple

laparoscopic oocyte retrievals could be successfully performed in caracal (Caracal caracal) after

repeated ovarian stimulation with equine (eCG) and human (hCG) chorionic gonadotropin.

Embryos could also be reliably produced in vitro using cryopreserved spermatozoa and live

offspring could be produced after embryo transfer.

Unfortunately, in addition to the individual variability in ovarian response universally

observed following gonadotropic hormone administration, there are huge species-specific

differences in sensitivity and the optimal dosage determination is not simply a matter of

extrapolation (Pope, 2000). Moreover, repeated treatment of domestic cats with eCG and hCG may

cause an immune mediated refractoriness to ovarian stimulation, dictating that the suitability of

these hormonal combinations should be further investigated (Swanson et al., 1995). Similarly,

protocols using porcine FSH and LH resulted in reduced numbers of follicles at the second

treatment as compared with the first (Morato et al., in press), possibly due to a humoral immune

response. By considering the feasibility of fecal steroid analyses with radioimmunoassay (Brown et

al., 1994) combined with sexual behavior and ultrasonographic images it is possible to determine

the more ideal time for oocyte recovery by laparoscopy, without the use of exogenous

gonadotropins.

In addition, Jewgenow et al. (1997) suggested that the collection of ovaries from tigers

(Panthera tigris), lions (Panthera leo), pumas (Felis concolor), cheetahs (Acinonyx jubatus),

leopards (Panthera pardus) and jaguars (Panthera onca) could be accomplished by ovary dissection

8 h after the death of these animals, followed by mechanical follicle isolation. By performing this

procedure, the authors obtained 16 ± 2 cumulus-oocyte complexes with acceptable quality, which

were submitted to IVM and IVF using homologous semen or heterologous epididymal domestic cat

semen. The most desirable results were obtained with lion oocytes fertilized by lion sperm, with a

31.6% (18/44) conception rate. This research also provides evidence that leopard oocytes can be

fertilized by domestic cat sperm and used in in vitro fertilization procedures to produce 22% (2/9)

8-cell embryos. Otherwise, domestic cat oocytes can be fertilized by leopard spermatozoa,

producing 19.5% (8/41) 8-cell embryos.

Pope et al. (1993) performed oocyte collection from domestic and non-domestic cats by

laparotomy and posterior ovary dissection. These oocytes were submitted to IVF and then

transferred to receiving females. The main result obtained in this study was the interspecies embryo

transfer from an Indian desert cat (Felis silvestris ornata) embryo to a domestic cat (Felis catus),

which resulted in the birth of two kittens. Afterwards, Pope et al. (1997) recovered ovaries from

domestic cats by ovariectomy and demonstrated that morphology of the oocyte ooplasm can affect

in vitro maturation, as well as the gonadotropin supplementation. According to the morphological

aspect by stereomicroscopical exam, cumulus-oocyte complexes were classified as mature,

immature or degenerated. Besides the successful embryo production by IVF using this approach,

light and electron microscopic evaluations revealed that ovarian stimulation followed by follicular

aspiration resulted in a heterogenous oocyte population with respect to meiotic maturation. The

correct assessment of the oocyte maturation status is difficult to perform through

stereomicroscopical exam (Gjorret et al., 2002).

Domestic bitches have ovulations of an immature oocyte in a germinal vesicle stage and

they require around 2 days meiotic maturation to be complete (Silva et al., 2002). Hay et al. (1997)

reported that canine oocytes could be collected by ovarihysterectomy and be immediately used in

IVF, or after freezing at -18 °C. However, as for laparotomy, this collection technique is an invasive

procedure and should be considered as the last alternative for convalescent animals due to the risks

and stress it causes to the animals. Moreover, Rodrigues and Rodrigues (2003) reported that oocyte

quality is a more reliable indicator of its potential for meiotic maturation in vitro as compared with

the hormonal environment of the donor female at the time of oocytes retrieval, as the in vitro

nuclear maturation of dog oocytes is not influenced by the in vitro reproductive status of the female.

138

The use of IVF in canine species was not particularly successful in facilitating reproduction.

Metcalf (1999) supplemented the culture medium with gonadotropins and observed its beneficial

effect on the nuclear maturation of canine oocytes. Furthermore, the formation of canine 8-cell

embryos was obtained after 96 h of IVF and culture, representing 2.4% of the total oocytes

fertilized in vitro. Otoi et al. (2000) reported 13% in vitro fertilized canine oocytes, but only 0.5%

oocytes used in the experiment reached the phase of initial blastocyst. According to these authors,

canine oocytes could be developed to the blastocyst stage after IVM, IVF and culture, although the

competence of the oocyte developing is significantly reduced after these procedures.

Unfortunately, oocyte recovery studies for wild canids are rare. Farstad et al. (1993)

collected the ovaries from six blue foxes (Alopex lagopus) immediately after their death. They

performed oocyte isolation and selection by stereomicroscopy. This study provided evidence that

vulpine oocytes could be fertilized and reach the initial embryonic development stage, because five

of 13 ova had cleaved into the 2-cell stage at 24 h after insemination, but only one developed into a

morula by 144 h. Afterwards, Farstad et al. (2001) collected ovaries from seven blue foxes after

ovulation from the dominant follicles and obtained the oocytes by blind aspiration from subordinate

antral follicles. MIV and FIV were performed and 75 of 125 oocytes (60%) underwent germinal

vesicle breakdown within 48 h after insemination, suggesting that immature oocytes from

subordinate follicles are able to mature and be fertilized.

Oocytes can be preserved if they are not immediately submitted to IVF. However, Aman

and Parks (1994) observed that cooling could cause chromosomal anomalies in mature oocytes, as a

consequence of the temperature decrease on meiotic fusion. Rodrigues et al. (2002) performed the

IVM of domestic feline oocytes, previously kept under refrigeration at 4°C for 24 h, and they did

not observe deleterious effects of storage on oocyte meiotic progression. Moreover, Herrick and

Swanson (2003) demonstrated that even brief (2-3 weeks) salt storage significantly affects cat

oocyte penetration rate, and the penetration continues to decline as storage duration increases to 2-3

months. However, the authors hypothesized that the composition of the solution may have

contributed to reduced sperm penetration. For canine species, Mastromonaco et al. (2002) found

that oocyte storage in hypertonic salt solution damages the zona pellucidae, reducing the sperm

penetration rates. These authors also observed that the integrity of cumulus cells is necessary for an

enhanced interaction between the oocytes and the canine spermatozoa.

It has already been demonstrated that the cryopreservation of oocytes originating from antral

follicles is successful in mice (Carrol and Gosden, 1993), rabbits (Vicent et al., 1989) and bovine

(Fuku et al., 1992), followed by IVF after thaw, resulting in the birth of normal offspring in all of

these species. In domestic felines, Luvoni and Pellizzari (2000) demonstrated that the mature oocyte

could be cryopreserved and, soon after, fertilized in vitro with success.

3.3 Recovery of preantral follicles

Although the maturation of oocyte recovered from antral follicles is an efficient method for

the use of haploid female material, it may be possible to also increase the efficiency of the oocyte

utilization by activation in initial phases of development (Jewgenow et al., 1997). The preantral

ovarian follicles (PAF) represent 90% of the follicular population in mammals (Figueiredo et al.,

2002). Small PAF recovered from the ovaries collected from post mortem animals or through

ovariectomy, therefore, are a rich oocyte source, because they can mature in vitro.

In canids, PAF retrieval studies are extremely scarce. In 1987, Telfer and Gosden observed

that the domestic bitch present a great number of PAF containing several oocytes. Durrant et al.

(1998) accomplished canine PAF isolation and characterization, and suggested the use of the

enzymatic digestion associated to the mechanical isolation. Bolamba et al. (1998) verified that after

the enzyme method that uses collagenase and DNase for the isolation, PAF could be cultivated in

vitro and oocytes would be capable of reinitiate the meiotic divisions.

In 1993, Jewgenow and Pitra reported that feline PAF are capable of developing in vitro to

the antral phase. Moreover, Jewgenow and Goritz (1995) demonstrated the isolation of PAF from

domestic cats by mechanical ovary dissection. By adapting the methods described for domestic cats

to non-domestic felid species, Jewgenow and Stolt (1996) accomplished the isolation and the ultra-

139

structural characterization of PAF from cheetahs, jaguars, lions and Sumatran, Siberian and Bengal

tigers that had died at local zoos. These authors verified the similarity among domestic and non-

domestic felid PAF. Later on, Jewgenow et al. (1997) recovered 1,867 ± 1,144 PAF from each

ovary from several species of non-domestic felids, observing that the follicle growth is possible in

the culture medium for up to 14 days, with a 20% increase (40? m to 50? m) on the diameter of

preantral follicles from the puma.

These promising results suggest the possibility of future use of preantral follicles as a source

of oocytes to be used in other biotechniques, as the foundation for germoplasm banks, as Jewgenow

et al. (1998) reported that it is possible to maintain the viability of PAF from domestic cats after

cryopreservation procedures.

3.4 Ovarian tissue preservation and culture

Bert (1863) was the first to report an ovarian transplantation. A significant impact on the

vascular anastomosis techniques of several transplanted organs, including the ovary, was only

achieved in the twentieth century, with the studies by Carrel and Guthrie (1906). According to Salle

et al. (2002), both whole ovary and ovarian fragment transplantations could be used for ovarian

follicle cultures. Moreover, Shaw et al. (2000) reported that a great advantage for the preservation

and culture of ovarian tissue is due to the possibility of material collection not dependent upon the

age or reproductive status of the donor.

Bogliolo et al. (1993) suggested that the term alotransplantation refers to the transplantation

of an organ originating from one individual to another that is genetically different, but belonging to

the same species. McCone (1899) was the first to report a canine ovarian tissue alotransplant to the

broad ligament of another bitch, which resulted in pregnancy. In 2001, Metcalf et al. obtained a

canine ovarian tissue xenografting to the renal capsule of several immunodeficient infertile mice.

The mice necropsy was done after 56 days, when the follicular development was confirmed, but the

antral formation of follicles was not visualized.

Gosden et al. (1994) performed the transplant of ovarian cortex fragments from domestic

cats to the renal capsules of severely immunodeficient infertile mice. After 9 months, the necropsy

of the recipient mice was accomplished, when the presence of follicles was verified in the grafts.

These ovarian follicles reached a 3 mm diameter, had a normal antral cavity and appeared to be

cytologically normal. However, ovulation was not observed in any of the grafts. Furthermore,

Bosch et al. (2002) reported that freeze-thawed cat ovarian cortex not only survives

xenotransplantation into the kidney capsule from severe combined immunodefficient mice but also

contains follicles able to grow to antral stages containing gonadotropin responsive granulosa cells.

According to Ledda et al. (2001), oocytes and ovarian tissue cryopreservation is not yet fully

established. There are still several obstacles to overcome for this technology to be routinely used.

Even so, improvement in the cryopreservation techniques is seen as an important tool for the

formation of ovarian tissue banks, with the purpose of conserving endangered species (Paris, 2002).

4. Final Considerations

As reviewed, there are several methods available for recovering gametes from non-domestic

canids and felids, including healthy, convalescent animals or animals that recently died. However,

even if these gametes would be a valuable resource in the formation of cryobanks by contributing to

the preservation of genetic material essential for the maintenance of the species, there are many

obstacles to overcome, such as the improvement of the cryopreservation protocols for both male

and female gametes, hormone supplements in the medium for IVM and IVF, compatible recipients

for the embryos produced in laboratory, and suitable habitats to receive the animals that are

produced by assisted techniques.

According to Wildt et al. (2001a), effective techniques in domestic species are not

necessarily applicable to wild species. Reproductive mechanisms are highly varied among animal

groups. Without understanding the fundamentals of reproductive processes, assisted breeding can

never become consistently successful. There is no doubt that the reproductive sciences can

140

contribute to carnivore conservation, but the first priority must always be the production of new

basic knowledge that eventually may have applications in the management of these animals. Once

this information is known, wildlife can be propagated by using improved natural or assisted

breeding.

In addition, the use of stored gametes requires further studies. Sub-specific populations can

become independent from other populations through natural or historical events. The non-studied

introduction of gametes or new individuals into a population can produce undesirable hybrids,

which can accelerate the genetic extinction of the native population in just a few years (Wayne and

Brown, 2001).

Reproductive science is only one component of an abundantly complex conservation puzzle

and can contribute to wildlife conservation, but only in the context of problems being

simultaneously addressed by wildlife and habitat management, ecology, population biology,

behavior, nutrition, genetics, veterinary medicine, sociology and conflict resolution. Genuine

conservation is achieved only when the reproductive knowledge and technologies are integrated

into multidisciplinary programs that conserve species integrity ex situ and preferably in situ (Wildt

et al., 2001b).

Currently, several ecosystems are being destroyed by human actions, beginning the process

of extinction of several species. Scientific research, however, improves or develops new

reproductive biotechniques. Thus, the application of these techniques could minimize the effects of

the devastation. Even so, there is no sense in using them just to multiply animals in the laboratory.

It is necessary to have a habitat prepared to receive these animals after they are produced. There

needs to be an awareness of actions and their consequences by trying to develop ways of expanding

the land mass used by humans, but still allowing a peaceful coexistence with all of the ecosystems.

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