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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
Instituto de Ciências Exatas – Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química Orgânica
Grazielle Lopes
2005
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA
BIOMONITORAMENTO DOS EXTRATOS BRUTOS E DAS
FRAÇÕES GLICOALCALÓIDAIS DE SEIS ESPÉCIES DO
GÊNERO Solanum, FRENTE À Artemia Salina E AO CARAMUJO
Biomphalaria glabrata E REAÇÕES COM O ALCALÓIDE
SOLASODINA DE solanum crinitum
Grazielle Lopes
Sob orientação da Professora
Dra. Áurea Echevarria Aznar N. Lima
Sob co - orientação da Professora
Dra. Tânia Maria Sarmento da Silva
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Magister Scientiae em Química, Área
de concentração Química Orgânica.
Seropédica
Maio de 2005
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Lopes, Grazielle
Biomonitoramento dos extratos brutos e das frações glicoacaloidais de seis espécies do gênero Solanum
frente á Artemia salina e ao caramujo Biomphalaria glabrata. E as reações com o alcalóide solasodina
de Solanum crinitum. / Dissertação. Seropédica. Rio de Janeiro. UFRuralRJ. ICE-DeQuim. 2005.
Orientador: Aurea Echevarria Aznar de Lima
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA
Grazielle Lopes
Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduaçào em Químca Orgânica, área
de concentração em Síntese Orgânica, como requisito parcial para obtenção do grau de
Magister Scientiae, em Química Orgânica.
Aprovada em:...../...../......
_______________________________________________________________
Profa. Dra. Áurea Echevarria Aznar N. Lima (Orientadora)
DEQUIM, ICE – UFRRJ
________________________________________________________________
Profa. Dra. Luciana Vignólio Alves
Química Orgânica – Vota Redonda
Departamento de Biologia – Maria Teresa
________________________________________________________________
Profa. Dra.Helena Regina Pinto Lima
Instituto de Biologia - Departamento de Botânica
________________________________________________________________
Profa. Dra. Márcia Cristina Campos de Oliveira (Suplente)
DEQUIM ICE – UFRRJ.
“Agradeço e dedico esse trabalho a minha
mãe, Vera Lucia Pedrosa Lopes, que
sempre se mostrou amiga, companheira e
presença certa em todos os momentos,
apesar da distância geográfica. Que sempre
demonstrou a força de uma guerreira sem
perder a doçura e o respeito pelas pessoas”.
“Ao meu pai, Amauri Lopes, que
possibilitou a minha formação e me
ensinou a encarar sem medo todas as
situações. E que do seu jeito, eu sei que me
ama muito, também te amo por isso
agradeço e reconheço o que fez por mim”.
De tudo, ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto, devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...
Fernando Pessoa
Agradecimentos
A Deus que sempre esteve comigo e me permitiu encerrar mais esta
etapa e me anima para as próximas;
A minha família, pela compreensão das ausências e o incessante
incentivo;
A Dra Tânia Maria Sarmento da Silva, pela co-orientação e por todo
aprendizado que me proporcionou, além de ter me recebido em sua casa;
A Universidade Federal da Paraíba por ter me acolhido e proporcionado
um grande crescimento profissional;
A prof
a
Dra Maria de Fátima Agra, pela identificação das espécie de
Solanum;
Aos queridos amigos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica – LTF-
UFPB;
A UFRJ e ao aluno de doutorado Flávio por permitir a utilização do
RMN;
Aos amigos Cláudio, Myrtes, Alice, Andressa, Kenia, Ari e Silavana que
tanto me ajudaram e me ensinaram durante este tempo;
A mais nova amiga Amanda, por quem eu tenho uma grande admiração;
Os estagiários Dílson, Camila, Ana Paula Amorim, Ana Paula e Marcio
que sempre colaboraram como podiam;
As amigas Andréa Rosane da Silva (Rose) e Tatiana Santana Ribeiro
(Taty), por toda a nossa história que já vem lá da graduação, e que continuará por
muitos anos;
As queridas amigas Regina Lucia Pelachin Lianda (Rrê) e Ana Paula
Rosa Lopes (Aninha) por todos os nossos cafés da manhã, jantares e agradáveis
conversas (sempre muito construtivas);
A todos os amigos da pós-graduação, Janaína, Cristina, Marli, Juliana,
Cássia, Virgínia, Luciano, Mario Sergio, Ildomar, Luiz (Pilha), Cleber, Bauer, pela
excelente convivência;
Ao Professor Mario Geraldo de Carvalho, pelas inúmeras ajudas;
A Professora Rosane Nora Castro pela ajuda com o CG-EM;
Aos amigos da V.L.S. A, Matheus, Thiago, Luís e Yuri pelos
maravilhosos momentos de descontração;
Aos amigos, Mery, Alessandra, Rodrigo e Marcio pelo incentivo e
carinho;
Aos funcionários, Áurea (in memorian), Eli, Frances, Fábio, Maurício,
Aldir, André (Choque), Eugênio, Rui, Carlos, Renato, Conceição e Neli, pela atenção
dispensada comigo e pela convivência cordial;
À Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, por todos estes
incríveis anos que dela tenho feita minha casa;
Ao corpo docente do PPGQO, por sua valiosa contribuição em minha
formação;
À CAPES, pelo financiamento deste trabalho.
E a Mario Limeira de Andrade, meu namorado, amigo e companheiro,
por toda a sua compreensão e amor, te Amo.
À Professora Áurea Echevarria, pela
amizade, carinho e é claro pela
competência indiscutível e a ética.
Muito Obrigada!!
Sumário
Lista de Abreviaturas.....................................................................................................xiv
Índice de Figuras............................................................................................................xvi
Índice de Tabelas...........................................................................................................xvii
Resumo...........................................................................................................................xix
Abstract............................................................................................................................xx
1.0 Introdução..................................................................................................................1
1.1 Histórico e importância das plantas...............................................................1
1.2 Família Solanácea: Gênero Solanum.............................................................4
1.3 Atividade biológica do gênero Solanum........................................................8
1.4 Os Esteróides.................................................................................................10
1.4.1 Importância econômica e farmacológica.............................................10
2.0 Objetivos...................................................................................................................16
3.0 Parte experimental.....................................................................................................17
3.1 Equipamentos...............................................................................................17
3.2 Reagentes e solventes...................................................................................18
3.3 Metodologia..................................................................................................19
3.3.1 Coleta e identificação do material vegetal..........................................19
3.3.1.a Solanum crinitum.......................................................................19
3.3.1.b Solanum capsicoide...................................................................19
3.3.1.c Solanum variable.......................................................................20
3.3.1.d Solanum lycocarpum.................................................................20
3.3.1.e Solanum americanum................................................................21
3.3.1.f Solanum seaforthianum .............................................................21
3.4 Preparação dos extratos e obtenção das frações...........................................22
3.4.1 Obtenção e purificação da solasodina.................................................22
3.5 Detecção dos glicoalcalóides de solanum crinitum
utilizando CLAE-EM..................................................................................23
3.6 Reação de esterificação utilizando MW.......................................................24
3.6.1 Reação catalisada por imidazol...........................................................24
3.6.2 Reação catalisada por ZnCl
2
................................................................24
3.6.3 Reação catalisada por gel de sílica......................................................25
3.6.4 Reação catalisada por Na
2
CO
3
............................................................25
3.7 Reação de esterificação com a solasodina.....................................................26
3.7.1 Reação com suporte de gel de sílica.....................................................26
3.7.2 Reação com suporte de gel de sílica e H
2
SO
4
......................................26
3.7.3 Reação sólido-sólido.............................................................................27
3.7.4 Reação da solasodina com catalisador imidazol...................................27
3.7.5 Reação da solasodina com cloreto de cinmoíla....................................28
3.7.5.a Preparação do cloreto de cinamoíla................................................28
3.7.5.b Reação de esterificação..................................................................28
3.7.6 Reação da solasodina com cloreto de benzoíla....................................29
3.7.7 Reação da solasodina com anidrido acético.........................................29
3.8 Reações de oxidação da solasodina...............................................................30
3.8.1 Reação de oxidação utilizando MnO
2
..................................................30
3.8.1.a Preparação do MnO
2
.......................................................................30
3.8.1.b Reação de oxidação........................................................................30
3.8.2 Reação de oxidação utilizando PDC....................................................31
3.8.2.a Preparação do PDC.........................................................................31
3.8.2.b Reação de oxidação........................................................................31
3.8.3 Reação de oxidação utilizando PCC.....................................................32
3.8.3.a Preparação do PCC.........................................................................32
3.8.3.b Reação de oxidação........................................................................32
3.9 Ensaios Biológicos........................................................................................32
3.9.1 Ensaio de toxidez frente a Artemia salina............................................33
3.9.1.a Procedimentos para o ensaio de toxidez.........................................33
3.9.2 Ensaio moluscicida frente ao caramujo Biomphalaria glabrataI.........37
3.9.2.a Procedimentos para o ensaio moluscicida......................................37
4.0 Resultados e Discussão..................................................................................39
4.1 Obtenção dos extratos, frações glicoalcaloidais e da solasodina de
Solanum crinitum.............................................................................................................39
4.2 Monitoramento dos glicoalcalóides de Solanum crinitum
por CLAE-EM.........................................................................................44
4.3 Reações utilizando solasodina.................................................................47
4.3.1 Estudo da metodologia para as reações de esterificação...................48
4.3.2 Reações de esterificação da solasodina.............................................50
4.3.3 Reações de oxidação da solasodina...................................................52
4.4 Atividade Biológica.................................................................................56
4.4.1 Atividade frente a Artemia salina......................................................56
4.4.2 Atividade moluscicida frente ao caramujo Biomphalario glabrata..64
5.0 Conclusão ...............................................................................................67
6.0 Resultados e Discussão............................................................................68
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AcOH – ácido acético
Ac
2
O – anidrido acético
o
C – grau Celsius
CCD – cromatografia em camada delgada
CDCl
3
– clorofórmio deuterado
CG-EM – cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas
CLAE-EM – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de
massas
conc. – concentração
DL
50
– dose letal para 50%
DMSO – dimetilsulfóxido
dp – desvio padrão
EM – espectrometria de massas
EtOH – etanol
g – gramas
h - horas
Hex. - hexano
IV – infra-vermelho
JBP – Jardim Botânico da Paraíba
M
+
- pico de íon molecular
MeOH – metanol
MHz – mega hertz
Min. – minutos
mL – mililitros
MW – microondas
m/z – relação carga massa
n.t. – não testado
P.A – padrão analítico
P - probabilidade
PCC – pyridinum chlorochromate
PDC – pyridinum dichromate
R – coeficiente se correlação
RMN
13
C – Ressonância Magnética de Carbono- 13
S – segundos
T AS – toxidez em Artemia salina
THF – tetrahidro furano
TMS – tetra metil silano
RMN
1
H – Ressonância Magnética de Hidrogênio
µg – microgramas
µL – microlitros
Índice de Figuras
Figura 1. Estrutura da efedrina e da policarpina...............................................................1
Figura 3. Estrutura da hiosciamina e da hioscina.............................................................4
Figura 4. Estrutura da nicotina.........................................................................................5
Figura 5. Estrutura do flavonóide tilirosídeo....................................................................5
Figura 6. Hormônios sexuais progesterona e testosterona...............................................9
Figura 7. Estrutura da diosgenina..................................................................................10
Figura 8. Estrutura da ecogenina...................................................................................11
Figura 9. Estrutura do colesterol....................................................................................13
Figura 10. Estrutura da tomatidina.................................................................................14
Figura 11. Estrutura do glicoalcalóide solasonina..........................................................15
Figura 12. Estrutura da solasodina.................................................................................23
Figura 13. Esquema para o ensaio de toxidez frente à Artemia salina...........................34
Figura 14. Esquema para o ensaio moluscicida frente ao caramujo Biomphalaria
glabrata...........................................................................................................................37
Figura 15. Estrutura da solasodina.................................................................................40
Figura 16. Espectro de RMN de
1
H da solasodina.........................................................41
Figura 17. Espectro de RMN de
13
C para a solasodina..................................................42
Figura 18. Espectro de massas da fração glicoalcaloidal...............................................45
Figura 19. Cromatogramas e espectros de massas das plantas coletadas no Rio de
Janeiro e em João Pessoa.................................................................................................46
Figura 20. Equações das reações da solasodina com o ácido cinâmico.........................47
Figura 21. Estrutura do cinamato de ciclo pentila..........................................................49
Figura 22. Espectro de massas do cinamato de ciclo pentila.........................................49
Figura 23. Principais fragmentos para o éster cinamato de ciclo pentila.......................49
Figura 24. Fragmento do éster cinâmico da solasodina................................................51
Figura 25. Estrutura da solasodina acetilada..................................................................51
Figura 26. Espéctro de RMN
13
C da solasodina acetilada..............................................52
Figura 27. Espectro de infra - vermelho e estrutura da solasodinona............................53
Figura 28. Deslocamentos químicos para a cetona β,γ-insaturada e deslocamentos
obtidos no trabalho..........................................................................................................55
Figura 29. Rearranjo alílico para a solasodinona...........................................................55
Figura 30. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log da dose ensaiada para o
extrato bruto e fração glicoalcaloidal de S. seaforthianum.............................................55
Figura 31. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log da dose ensaiada para o
extrato bruto e fração glicoalcaloidal S. lincocarpum.....................................................57
Figura 32. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log da dose ensaiada para o
extrato bruto e fração glicoalcaloidal S. crinitum............................................................58
Figura 33. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log da dose ensaiada para o
extrato bruto e fração glicoalcaloidal S. americanum.....................................................59
Figura 34. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log da dose ensaiada para o
extrato bruto S. capsicoides.............................................................................................60
Figura 35. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log da dose ensaiada para o e
fração glicoalcaloidal S.variable.....................................................................................61
Figura 36. Gráfico comparativo dos valores de DL
50
para as espécies de Solanum frente
à Artemia salina...............................................................................................................62
Índice de Tabelas
Tabela 1. Grazdiente de eluição da coluna no equipamento de CLAE-EM _________23
Tabela 2. Espécies de Solanum utilizadas nos ensaios_________________________33
Tabela 3. Dose da % de larvas mortas para S. seaforthianum____________________35
Tabela 4. Dose da % de larvas mortas para S. lycocarpum______________________35
Tabela 5. Dose da % de larvas mortas para S. capsicóides______________________35
Tabela 6. Dose da % de larvas mortas para S. variable ________________________36
Tabela 7. Dose da % de larvas mortas para S. crinitum ________________________36
Tabela 8. Dose da % de larvas mortas para S. americanum _____________________36
Tabela 9. Peso dos frutos, extratos e frações glicoalcaloidais das espécies de
Solanum e respectivos rendimentos________________________________________40
Tabela 10. Atribuições para os deslocamentos químicos de RMN
13
C
para a solasodina_______________________________________________________43
Tabela 11. Rendimento das reações do ciclopentanol om
ácido benzóico com diferentes catalisadores_________________________________50
Tabela 12. Rendimento das reações de oxidação da solasodina __________________54
Tabela 13. Valores de DL
50
frente à Artemia salina para os extratos brutos e frações
glicoalcaloidais das espécies de Solanum____________________________________63
Tabela 14. Triagem da ação moluscicida ds extratos brutos e frações glicoalcaloidais
das seis espécies do gênero Solanum _______________________________________65
Tabela 15. Valores de DL
50
para as frações glicoalcaloidais de S. crinitum e S.
seaforthianum_________________________________________________________66
RESUMO
Este trabalho relata o estudo da atividade biológica dos extratos brutos e das
frações glicoalcaloidais de seis espécies do gênero Solanum, S. crinitum, S.
seforthianum, S.capsicoides, S. variable, S. americanum, S. lycocarpum frente ao
microcrustáceo Artemia salina e ao caramujo Biomphalaria glabrata.
A fração glicoalcaloidal de Solanum crinitum, foi monitorada por CLAE-EM
sendo verificada a presença de três diferentes glicoalcaloides, bem como foi realizada a
comparação química das frações de plantas coletadas em João Pessoa-PB e Seropédica-
RJ observando-se o mesmo perfil. Desta espécie, isolou-se o alcalóide esteroidal
solasodina, com o qual foram realizadas reações de oxidação e esterificação, sendo que
na segunda utilizou-se a metodologia clássica e também irradiação em forno de
microondas, na presença de diferentes catalisadores.
As técnicas espectroscópicas de IV, RMN de
1
H e
13
C e também CG-EM, foram
utilizadas para identificar e caracterizar os produtos obtidos nas reações.
Os ensaios frente a Artemia salina mostraram que, tanto os extratos brutos como
as frações glicoalcaloiais apresentaram toxidez significativa, sendo as frações de S.
seaforthianum e de S. crinitum, as mais tóxicas.
Diante do ensaio moluscicida, todos os extratos brutos e algumas das frações
glicoalcaloidais não apresentaram atividade significativa. Porém, as frações de S.
seaforthianum e S. crinitum, mostraram bastante ativas, podendo este efeito ser
correlacionado aos resultados do ensaio de toxidez geral.
ABSTRACT
The biological activity of crude extracts and glycoalkaloidal fractions of six
Solanum species, S. crinitum, S. seafothianum, S. variable, S. capsicoide, S.
americanum and S. lincocarpum, was related in this work against Artemia salina
microcrustace and Biomphalaria glabrata snail.
The S. crinitum glycoalkaloidal fraction was HPLC-MS monitored and three
different glycoalkaloids were verified. The S. crinitum collected plants, from João
Pessoa (PB) and Seropédica (RJ), were compared and a similar chemical profile was
observed.
The steroidal alkaloid solasodine was isolated from S. crinitum and utilized on
oxidation and sterification reactions. In the last reactions the microwave irradiation was
also utilized in the presence of several catalysts. The NMR
1
H,
13
C and IR spectroscopic
techniques and the GC-MS were used to characterize the products.
The crude extracts and fractions of Solanum species were assayed against
Artemia salina and the result had showed a significant toxicity. The S. seaforthianum
and S. crinitum glycoalkaloidal fractions were the most actives.
All crude extracts of Solanum species and four glycoalkaloidal fractions haven’t
presented significant activity against Biomphalaria glabrata snails. However, the S.
seafothianum and the S. crinitum fractions showed effective moluscicidal activities and
these results have led us a good correlation ship with Artemia salina assays.
INTRODUÇÃO
1.0 INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS MEDICINAIS
O uso de plantas medicinais é uma das práticas mais antigas e universais da
espécie humana. Não importa que cultura ou sociedade se considere, até hoje é possível
encontrar plantas sendo usadas no tratamento de enfermidades.
Muitos medicamentos usados pela população até hoje têm sua origem nas
plantas medicinais, cujos princípios ativos são usados como protótipo pela indústria
farmacêutica, tais como a aspirina, efedrina, pilocarpina, apresentadas na Figura 1
(BOTSARIS, 1997).
Figura 1. Estruturas da Efedrina e da Policarpina
Retornando a história, sabe-se que os egípcios usavam além das plantas
aromáticas, muitas outras cujos efeitos bem conheciam, como por exemplo, a papoula
(sonífera), a babosa e o óleo de rícino (cartático). Os assírios também incluíam, no seu
receituário, nada menos que 250 plantas terapêuticas, entre elas: o açafrão, a assa-fétida,
o cadamomo, a papoula, o tremoço, dentre outras. Na Grécia antiga, Hipócrates (460-
361 a.C.) considerado o pai da medicina, empregava centenas de drogas de origem
vegetal. Teofrastos (372- 285 a.C.), em História das Plantas, catalogou nada menos que
500 espécies. Crateús, que viveu no século I a.C. publicou a primeira obra de que se tem
conhecimento na história – Orhizo Tomikom- sobre plantas medicinais com ilustrações
(BOTSARIS, 1997).
A palavra fitoterapia foi criada para designar tradições populares de tratamento,
nas quais as plantas medicinais são usadas. O uso terapêutico dessas espécies ficou
restrito à abordagem leiga desde o salto tecnológico da indústria farmacêutica, ocorrido
nas décadas de 50 e 60. A fitoterapia consiste em um tratamento das doenças e de
O
O
N
N
OH
CH
3
H
alterações orgânicas, por meio de espécies vegetais secas ou recém colhidas e seus
extratos (GONÇALVES, 1994).
As espécies vegetais para uso medicinal têm recebido atenção especial, pelos
diferentes significados que as plantas medicinais assumem em nossa sociedade como
um recurso biológico e cultural, destacando-se seu potencial genético para o
desenvolvimento de novos fármacos. Além disso, as plantas medicinais representam
possíveis fontes de recursos financeiras através de sua comercialização resgatando o
fortalecimento da identidade cultural (SILVA, 2000).
As plantas medicinais representam a principal matéria médica utilizada pelas
chamadas medicinas tradicionais, ou não ocidentais, em suas práticas terapêuticas,
sendo a medicina popular a que utiliza o maior número de espécies diferentes.
Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população
dos países em desenvolvimento utilizam-se da medicina popular na atenção primaria à
saúde. Essas populações dependem, em grande parte, dos chamados profissionais
tradicionais para a cura de seus problemas de saúde, seja pelas dificuldades impostas ao
acesso à biomedicina, especialmente alopática , seja por questões de entendimento sobre
a realidade social e aspectos culturais deste tipo de população, ou pela questão
financeira (DA SILVA, 2000).
O conhecimento das propriedades medicinais das plantas, dos minerais e de
certos produtos de origem animal é uma das maiores riquezas da cultura indígena, uma
sabedoria tradicional que passa de geração em geração. Vivendo em permanente contato
com a natureza, os índios e outros povos da floresta estão habituados a estabelecer
relações de semelhança entre as características de certas substâncias naturais e seu
próprio corpo (GONÇALVES, 1994).
É impossível estabelecer precisamente quantas das 250.000-300.000 espécies de
plantas do mundo são utilizadas medicinalmente, mas sabe-se que pelo menos de 10-
20% de todas as espécies de uma determinada região tem seu uso na medicina
tradicional. Entretanto, menos que 1000 são amplamente utilizadas, sendo estas também
de importância comercial.
No Brasil, o uso de plantas medicinais pela população é bastante difundido, até
mesmo por ser muitas vezes o único recurso terapêutico de algumas comunidades
(MACIEL et al., 2002). Nesse contexto inserem-se várias comunidades da região do
norte e nordeste brasileiro. Apesar de considerada um centro mundial de biodiversidade,
os indicadores de desenvolvimento sustentável destas regiões, elaborados mostram que
em relação à equidade, saúde e educação, elas apresentam-se com menores índices do
país em todos os indicadores analisados. Portanto, essa riqueza de biodiversidade não
têm sido traduzida como qualidade de vida para a sua população, apesar de apresentar
comunidades detentoras do saber tradicional sobre o ambiente natural e que têm um
papel fundamental na manutenção de espécies e variedades nativas e seus sistemas de
manejo (SILVA, 2000).
Estima-se que pelo menos a metade das espécies nativas do Brasil possui alguma
propriedade medicinal, entretanto nem 1% foi estudada adequadamente. Na região
Amazônica foram catalogadas em duas comunidades que vivem as margens da Baía de
Marajó-PA, 260 plantas entre nativas e cultivadas; 1200 são comercializadas no
mercado Ver-o-Peso, em Belém-PA; outras 242 espécies são cultivadas em quintais
residenciais, também em Belém. As observações populares sobre o uso e a eficácia de
plantas medicinais contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes
terapêuticas dos vegetais, prescritos com freqüência, pelos efeitos medicinais que
produzem, apesar de não terem ainda seus constituintes químicos conhecidos (MACIEL
et al., 2002).
Os altos custos de produção dos medicamentos sintéticos, a existência de
estudos científicos para alguns produtos fitoterápicos comprovam sua eficácia clínica e
segurança, e a grande porcentagem da população mundial que não tem acesso aos
medicamentos resultantes de síntese estão dentre as razões do crescente interesse por
terapias alternativas e o uso terapêutico de produtos naturais, especialmente os
derivados de plantas (SILVA, 2000).
Estes fatores somados ao limitado efeito dos medicamentos sintéticos em
doenças crônicas têm estimulado à pesquisa de plantas medicinais como alternativa
terapêutica, com resultados bastante satisfatórios (HIRUMA-LIMA, 1999).
Dados recentes na literatura demonstram a grande variedade de substâncias
químicas isoladas de plantas que apresentam atividade farmacológica. Isto pode levar à
descoberta de novos compostos úteis para o desenvolvimento de novos fármacos, e a
preços mais acessíveis para a maioria da população (DA SILVA, 2000).
1.2 FAMÍLIA SOLANACEAE: O GÊNERO SOLANUM L.
A família Solanaceae descrita por Antoine Laurent de Jussieu compreende 94
gêneros, com 2.950 espécies subcosmopolitas, sendo 56 gêneros espontâneos na
América do Sul, dos quais 25 são endêmicos. Entre estes, encontram-se árvores,
arbustos, lianas e ervas, muitos desses com grande ocorrência no Brasil
(MABBERLEY, 1997). Os principais gêneros estão distribuídos em duas subfamílias:
a) Solanoideae, na qual se encontram os gêneros:
● Capsicum, uma das inúmeras pimentas vermelhas e amarelas usadas
como condimento, de onde se isolou, entre outros diversos compostos, a
capsaicina, apresentada na Figura 2.
Figura 2. Estrutura da Capsaicina
● Datura, como a Datura stramonium, e outras relevantes espécies de
importância farmacológica pela presença de inúmeros alcalóides como a hioscinamina e
hioscina que são mostradas na Figura 3 (DI STASI et al, 2002).
Figura 3. Estruturas da hiossiamina e da hioscina
● Solanum, com inúmeros representantes no Brasil, como o juá-bravo, fumo-
bravo, cuvitinga e outras espécies, amplamente usadas como alimento e que possuem
H
3
CO
HO
N
H
O
O
OH
O
N
C
H
3
O
OH
O
N
CH
3
O
elevado valor econômico, como é o caso da batata-doce e das mais variadas batatas;
Lycopersicum, do famoso tomate.
b) Cestroideae, na qual se destacam os gêneros:
● Nicotiana, da famosa espécie Nicotiana tabacum, fonte de nicotina,
usada como ferramenta farmacológica e, ainda do ponto de vista comercial e
social, uma importante espécie cuja indústria do fumo movimenta milhões de
dólares anualmente, mas que causa problemas de saúde extremamente sérios e
graves. A Figura 4 apresenta a estrutura da nicotina. (DI STASI et al., 2002).
Figura 4. Estrutura da Nicotina
Estes dados mostram a enorme importância dessa família botânica tanto do
ponto de vista farmacológico, visto que inclui inúmeras espécies fontes de compostos
químicos de grande relevância na farmacologia e na medicina moderna, como por
compreender espécies vegetais de amplo valor econômico e de grande utilização na
alimentação humana. Em estudos realizados muitas das espécies da família Solanaceae
foram referidas como medicinais, sendo algumas delas:
● Brunfelsia grandiflora D. Don – Conhecida popularmente na região
amazônica como maliaca. E, em outras regiões, pelos nomes de manacá-da-
serra, managá-caa, gambá, manacá-açu e jerataca.
Na região amazônica, a infusão das folhas é considerada excelente para diminuir
a febre. Mabberley (1997) refere que as folhas e cascas da espécie são usadas na
Amazônia como alucinógenas.
● Physalis angulata L. – Chamada, na região amazônica, de camapu. Em
outras regiões também é conhecida como bucho-de-rã, joá, juá-de-capote, mata-
fome, tomate silvestre e cereja-de-inverno.
N
H
Na região amazônica, o chá de sua raiz é utilizada para o tratamento de
problemas do fígado e contra malária. O chá preparado com raiz de camapu misturada
com raiz de açaí, jurubeba e pega-pinto é utilizada contra doença nervosa. A seiva dessa
espécie é calmante e depurativa, útil contra reumatismo; os frutos são desobstruintes,
diuréticos e resolutivos (CORRÊA, 1984); em Minas Gerais, são utilizados para os
mesmos fins (GAVILLANES et al., 1982); no Pará, o chá da raiz é considerado útil
contra problemas do fígado, contra inflamações, tosse e dores no corpo (AMOROZO &
GÉLY, 1988); na Paraíba, o uso interno da planta toda é tido como útil contra
problemas renais (AGRA, 1980).
● Solanum tuberosum L. – Na região do Vale do Ribeira, a espécie é conhecida
como batata e comumente denominada batata-inglesa ou batatinha. Na mata atlântica, a
infusão das folhas é usada contra distúrbios do estômago (DI STASI & HIRUMA-
LIMA, 2002).
O gênero Solanum é considerado um dos maiores e mais complexos entre as
angiospermas. Este é compreendido por 1000 espécies (Darcy, 1991) e
aproximadamente 3000 variedades são descritas na literatura (NEE, 1991). O gênero é
bem representado no Brasil e está amplamente distribuído no norte e sul e em diversas
regiões fitogeográficas, sendo muitas das espécies endêmicas destas regiões (AGRA,
1999).
No nordeste do Brasil, muitas espécies de Solanum são usadas na medicina
popular e são comumente chamadas de jurubeba, sendo está palavra originária do tupi-
guarani, yu`beba, que se refere à presença de espinhos em algumas delas (AGRA,
1999).
As primeiras descrições para o gênero foram realizadas por Linnaeus, no Species
Plantarum (1753), onde foram descritas 23 espécies, entre Europa e África sendo
algumas exóticas e outras cultivadas. Em 1813, Michel-Felix Dunal`s descreveu 235
espécies, e em 1816 em uma 2° edição, foram incluídas 321 espécies (KNAPP, 2002).
George Don (1837) enumerou e descreveu 406 espécies de Solanum, sendo que
G.G. Walpers (1844) seguiu o sistema de Don`s e listou 435 espécies e mais 72 das
quais se tinham informações incompletas. A maior descrição para o gênero Solanum foi
feita por Dunal em 1852, onde foram listadas 900 espécies.
Desde 1852 muitas novas espécies têm sido descobertas e descritas, elevando o
número de nomes entre 3000 e 5000, tornando a classificação do gênero um pouco
problemática, e fazendo com que o tratamento taxonômico seja feito distribuindo o
gênero em pequenos grupos.
Linneaus (1753) dividiu o gênero em dois grupos o Inermia, ou espécie
desarmada, e Spinosa, ou espécie armada. Dunal (1813,1816) dividiu o gênero
similarmente. Suas categorias foram Inermia, ou Solanums desarmada, e Aculeata, ou
Solanums armada. No Prodromus (1852) ele dividiu o gênero Solanum dentro de duas
seções (“sectio”) que foram basicamente as mesmas. Ele nomeou Pachystemonum,
espécies fortes com espinhos cilíndricos e que não furam, e Leptostemonum, espécies
com espinhos atenuados, tricomas e que freqüentemente furam. Novos tratamentos para
a taxonomia e classificação do gênero Solanum, desde o trabalho de Dunal em 1852,
tem sido relativamente poucos e limitados (KNAPP, 2002).
1.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA DO GÊNERO SOLANUM L.
O gênero Solanum apresenta grande importância econômica. Espécies de
Solanum produzem uma grande variedade de saponinas esteroidais e alcalóides
responsáveis pela resistência contra alguns agentes patogênicos. Cerca de 200 alcalóides
com bases esteroidais diferentes (esqueletos colestano com 27 átomos de carbono
divididos em 5 tipos de estruturas) já foram isolados e se apresentam na planta na forma
livre e como glicoalcalóide (ATTA-UR-RAHMAN & CHOUDHARY, 1998).
Dos muitos compostos que compõem o perfil dos metabólitos especiais das
plantas, os glicoalcalóides estão entre os mais interessantes não somente por razões
químicas e biológicas, mas também por exercerem uma importante influência em vários
aspectos da atividade e comportamento humano. Cerca de 75 estruturas do tipo aglicona
que ocorrem naturalmente (alcaminas) são conhecidas e apresentam esqueleto colestano
C
27
com um anel adicional contendo nitrogênio ou grupos que dão basicidade e algumas
das atividades biológicas.
Esteroides alcaloidais e outros glicosídeos ocorrem em numerosas espécies do
gênero Solanum que demonstram possuir diversas atividades biológicas, incluindo
antifúngica, antiviral, moluscicida, teratogênica e embriotóxica. Preparações contendo o
glicosideo solasodina são atualmente utilizadas para certos tipos de câncer (CHAM et
al, 1980). Espécies deste gênero também possuem flavonóides, como o tilirosídeo
(representado na Figura 5) extraído dos tricomas de Solanum crinitum Lam,
(ESTEVES-SOUZA et al, 2002) e são muito interessantes devido às suas atividades
farmacológicas como antimicrobiana e antivirais (ESTEVES-SOUZA, 2003). Em
adição, uma porção significante das atividades biológicas dos glicoalcaloides originam-
se da porção oligo sacarídica, incluindo cinco unidades monossacarídicas e usualmente
ligadas no carbono 3 (SILVA, 2002).
Figura 5. Estrutura do flavonóide Tilirosídeo
Embora sejam chamados glicoalcaló ides, alguns destes compostos também
apresentam características de saponinas. Muitos glicoalcloides exibem dois principais
tipos de atividades biológicas que refletem a natureza química “dual”: Atividade
antiacetilcolinesterase remanescente de alguns alcalóides e a propriedade de lise da
membrana, similar as saponinas (DA SILVA, 2000).
Os glicoalcalóides causam efeitos tóxicos, como por exemplo, em
microorganismos e plantas, a toxidez é geralmente manifestada prejudicando o
crescimento, desenvolvimento, permeabilidade ou metabolismo. Em animais inferiores
a atividade alimentar, crescimento, desenvolvimento e mortalidade são os parâmetros
mais comumente quantificados enquanto que, em mamíferos de laboratório uma grande
variedade de parâmetros fisiológicos/farmacológicos são registrados os quais variam em
natureza e intensidade. Informações de toxidez em humanos aparecem principalmente
como casos de envenenamento acidental (somente poucos casos experimentais foram
registrados).
O
O
O
OH
HO
OH
O
O
O
OH
HO
OH
OH
Embora uma variedade de efeitos seja produzida pelos glicoalcaloides, muitos
resultam de um limitado número de ações bioquímicas. Um dos mais conhecidos destes
é a capacidade para romper a membrana celular e causar a perda dos solutos vitais, os
glicoalcaloides podem também inibir a ação da enzima acetilcolinesterase, um efeito
que é obviamente limitado a animais em que o sistema nervoso central é bem
desenvolvido. Em organismos mais complexos é difícil saber o exato modo da toxidez
devido a variedade de células diferentes e tipos de organismo que podem ser afetados,
tais como a presença de sistemas de transportes, absorção diferente, metabolismo,
características excretoras, etc (RODDICK, 1996).
Sobre o rompimento das membranas, a primeira opinião favorece as
propriedades surfactantes dos glicosídeos anfipáticos como a base de atividades. Porém,
a demonstração de que o glicoalcaloide do tomate, α-tomatidina, forma in vitro um
complexo molecular estável 1:1 com 3β-hidroxi esteroides, como o colesterol, veio
contribuir para resolver esta questão. Os esteroides livres ajudam a estabilizar a camada
de lipídeos de membranas eucarióticas, mas acredita-se que a ligação com os
glicoalcaloides comprometa este papel levando a perda de permeabilidade (RODDICK,
1996).
1.4 OS ESTERÓIDES
1.4.1 Importância Econômica e Farmacológica
Os esteróides produzidos no mundo podem ser agrupados convenientemente do
seguinte modo: andrógenos (hormônios sexuais masculinos), estrógenos e progesteronas
(hormônios sexuais femininos) e corticosteróides. Drogas esteroidais possuem uma
vasta gama de aplicações e são usadas como antiinflamatórios e agentes
anticancerígenos, tratamento de desordens por deficiência hormonal, como
contraceptivos orais e agentes anabólicos. A indústria de hormônios esteroidais
empregou no passado substâncias de origem animal como o colesterol e os ácidos
biliares, como material de partida para a síntese de hormônios sexuais (progesterona e
testosterona, representados pela Figura 6, etc). e adrenocorticais (cortisona,
aldosterona, etc). A preemente busca por fontes alternativas de matéria-prima para a
síntese de hormônios esteroidais resultou, no final da década de 40, no desenvolvimento
das sapogeninas esteroidais obtidas de plantas com possibilidades inusitadas (OASHI,
1999).
Figura 6. Hormônios sexuais Progesterona e Testosterona.
As sapogeninas esteroidais são de considerável importância econômica como
precursoras de muitos esteróides farmacologicamente ativos, inclusive
anticoncepcionais de via oral, de corticosteróides e de hormônios sexuais. A sapogenina
de maior importância econômica é a diosgenina, cuja extração é feita quase que
inteiramente das espécies dioscóreas. Entretanto, a indústria baseia-se na coleta de
plantas, que estão se tornando raras em algumas áreas e a cada dia torna-se mais difícil e
mais dispendioso explorar as fontes selvagens inexploradas anteriormente.
Figura 7. Estrutura da Diosgenina
Outra sapogenina esteroidal obtida comercialmente é a hecogenina, a qual é
extraída do suco do sisal, o produto descartado durante o processo de desfibramento das
folhas da Agave sisalana Perrine. Devido ao grupo cetônico no C-12 a hecogenina não é
apropriada para a manufatura de anticoncepcionais de uso oral, mas é ideal para a
síntese de corticosteróides. O consumo mundial de esteróides assume na época atual
grandes proporções. O movimento mundial de venda de hormônios sexuais, drogas
antiinflamatórias, anovulatórios e outros medicamentos de natureza esteroidal é da
ordem de bilhões de dólares por ano (OASHI, 1999).
O
O
H
H
H
O
H
HO
O
O
H
O
O
Figura 8. Estrutura da Hecogenina
Por volta de 1940, com o trabalho pioneiro de Marker, surgiu o primeiro
processo industrial para a síntese de hormônios esteroidais, a partir da diosgenina
isolada de tubérculos do gênero Dioscorea (espécie de inhame), notadamente D.
composita e D. floribunda, espécies selvagens encontradas no México. Apesar da
crescente demanda por diosgenina ocorrida nos anos seguintes, um impasse começou a
surgir: o extrativismo predatório da produção mexicana fez com que o país não
acompanhasse o crescimento da demanda mundial de hormônios e isso concorreu para
que a produção de diosgenina perdesse seu lugar de destaque na economia mexicana
(OASHI, 1999).
Nesse sentido, a dificuldade no cultivo intensivo das dioscórias selvagens e as
restrições do México à exportação dos tubérculos e de diosgenina pura levaram os
grandes laboratórios a procurar novas fontes de matérias-primas. A Companhia Syntex,
de origem mexicana, foi a primeira indústria de hormônios esteroidais. Com a redução
de exploração das dioscóreas pelo México, os laboratórios começaram a partir para a
busca de outras matérias-primas que pudessem oferecer esteróides, tanto a partir de
processos biotecnológicos (oxidações biológicas em posições estratégicas da molécula
de partida), como através do uso de outras fontes renováveis e abundantes (OASHI,
1999)..
A Glaxo, de origem britânica, partiu para explorar a sua tecnologia química de
síntese parcial de hormônios esteroidais a partir de substâncias isoladas do suco do
sisal. Foi assim que se deu início a utilização de sapogeninas encontradas nas plantas,
como uma matéria-prima para a fabricação de fármacos tão importantes (OASHI,
1999).
O
O
H
H
H
O
H
HO
H
Entre as sapogeninas, a hecogenina é a mais importante para a síntese de
corticóides. Ela é matéria-prima na produção de hormônios corticais, como cortisona,
cortisol, predinisolone, dexametasona, betametasona e outros (OASHI, 1999).
O aproveitamento da hecogenina a partir do sisal como alternativa de
diversificação do setor agrícola brasileiro foi feito pelo professor Carl Djerassi, da
Universidade de Stanford, em 1966. A partir daí, nasceu a primeira tentativa nacional de
uma indústria de hormônios esteroidais.
Os trabalhos sobre as sapogeninas existentes em plantas da família das
Liliáceas, Amarilidáceas e Discoriáceas proporcionaram a descoberta de novas
substâncias mais abundantes e mais adequadas para a síntese de hormônios esteroidais.
Os hormônios hoje consumidos são produtos de transformação de síntese parcial
cuja matéria-prima é de origem vegetal ou animal. A matéria-prima que até
recentemente predominava no panorama mundial era a diosgenina (Figura 7), o
estigmasterol e o colesterol (representado na Figura 9). A hecogenina ainda não ocupa
um lugar relevante como matéria-prima para a síntese de esteróides, pois, como ponto
de partida, apresenta o inconveniente de ter sua molécula totalmente saturada. Esta
característica obriga a incluir diversas etapas de transformações químicas que levam aos
hormônios (OASHI, 1999).
Figura 9. Estrutura do Colesterol
Dentre as substâncias naturais, já isoladas, destacam-se os glicoalcalóides
esteroidais e as saponinas esteroidais encontradas na maioria das plantas do gênero
Solanum. Estes são compostos de grande interesse na medicina tradicional, pois são
matérias-primas para a produção de vários fármacos com diferentes aplicações
(BENTO).
HO
Muitas das plantas da família Solanaceae acumulam alcalóides esteroidais com
esqueleto básico colestânico (C
27
), como encontrado na solasodina (Figura 12) e na
tomatidina (Figura 10), epímeros no átomo de carbono (C
22
). Estes alcalóides são
essencialmente análogos nitrogenados das saponinas esteroidais, e estão presentes como
glicosídeos (SIMÕES et al, 1986).
Figura 10. Estrutura da Tomatidina
Os alcalóides esteroidais são uma importante classe de metabólitos secundários
que ocorrem em plantas e também em certos animais superiores e invertebrados
marinhos. Diferentemente de muitas outras classes de alcalóides, as bases esteroidais
não são derivadas de aminoácidos. Biogeneticamente, eles são freqüentemente
chamados de “aminas esteroidais” ao invés de alcalóides propriamente.
Devido à similaridade estrutural com anabolizantes, hormônios esteroidais e
corticosteróides, os alcalóides esteroidais têm sido alvo de investigações
farmacológicas. O interesse recente deve-se a demanda mundial de busca de material de
partida como os esteróides, devido à escassez de diosgenina. Muitos alcalóides
esteroidais podem ser convertidos em valiosos hormônios bioativos por reações
químicas e microbianas. Muitos corticosteróides utilizados para o tratamento de doenças
de pele podem ser obtidos por conversão química de alcalóides esteroidais
estruturalmente parecidos (ATTA-UR-RAHMAN & CHOUDHARY, 1998).
Os alcalóides esteroidais são principalmente encontrados nas famílias
Apocynaceae, Bruxaceae, Liliaceae e Solanaceae. A maioria dos alcalóides são tóxicos
para mamíferos quando na forma glicosilada. Alguns glicoalcalóides encontrados no
gênero Solanum, freqüentemente presentes em quantidades relativamente pequenas,
podem provocar intoxicações alimentares quando em concentrações maiores na dieta
humana normal, provocando problemas gastrointestinais e neurológicos. Esta toxidez
O
HO
N
H
H
permitiu sugerir que os alcalóides participam do processo defensivo dos vegetais.
Várias atividades biológicas são atribuídas a tais produtos naturais.
São conhecidos aproximadamente 1400 alcalóides esteroidais, que geralmente
ocorrem nas partes aéreas de muitas espécies do gênero
Solanum. Os tipos mais comuns
são os espirolosanos, solanidanos, sendo que em muitos casos estes alcalóides são
glicosilados, como a solasonina, apresentada na
Figura 11 (ATTA-UR-RAHMAN &
CHOUDHARY, 1996).
Figura 11. Estrutura do glicoalcalóide Solasonina
Figura 11. Estrutura do glicoalcaloide Solasonina
Nosso interesse no estudo de plantas medicinais na busca de novos princípios
ativos, particularmente da família Solanaceae, levou-nos a investigar as atividades
biológicas de diferentes espécies do gênero
Solanum, bem como de suas frações ricas
em glicoalcalóides.
O
O
N
H
O
OR
O
O
O
OR
OR
OR
OR
O
OR
OR
RO
RO
2.0 OBJETIVOS
Este trabalho tem como principais objetivos específicos:
• Coletar e enviar para identificação diversas espécies do gênero Solanum (Solanaceae),
visando às extrações das frações ricas em glicoalcalóides de seus frutos verdes.
• Isolar e caracterizar a presença de solasodina da espécie com maior rendimento de
fração glicoalcaloidal.
• Monitorar a fração glicoalcaloidal de Solanum crinitum Lam proveniente do Rio de
Janeiro e Paraíba utilizando a técnica de CLAE-EM.
• Realizar reações de esterificação e oxidação com a solasodina
• Analisar a toxidez frente Artemia salina dos extratos brutos e frações glicoalcaloidais
das diferentes espécies de
Solanum.
• Avaliar a ação moluscicida frente ao Biomphalaria glabrata.
3.0 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 EQUIPAMENTOS
• Espectros de Ressonância Magnética Nuclear de
1
H,
13
C e correlações
Homonuclear e foram realizados em espectrômetro Bruker modelo AC 200 (200
MHz,
1
H e 50,3 MHz,
13
C). Como referência interna foi usado tetrametilsilano
(TMS) e o solvente utilizado em todos os espectros foi CDCl
3
;
• Os espectros na região do infravermelho (IV) foram obtidos em espectrofotômetro
Perkin-Elmer modelo 1605, série FTIR-1600, os valores das bandas de absorção
foram medidos em número de números de onda (cm
-1
);
• Os espectros de massas (EM) acoplados aos correspondentes cromatogramas
foram obtidos através (CG-EM), aparelhos Hewlett-Packard, modelo HP-5890 e
HP-6890, operados a 70 eV (impacto de elétrons);
• Na cromatografia em camada fina (CCD) utilizou-se placas de alumínio com sílica
Kieselgel 60 F 254, com 0,2 mm de espessura, com indicador de fluorescência
(Merck), reveladas com lâmpada ultravioleta de comprimento de onda 254 nm. Na
cromatografia em coluna utilizou-se como adsorvente sílica gel 60, com partículas de
35-70 mesh (Merck);
• A remoção dos solventes foi feita em evaporador rotatório, marca BÜCHI;
• Os pontos de fusão foram determinados utilizando-se aparelho Quimis Q-340s e
não foram corrigidos;
• Utilizou-se balança de precisão com quatro casas decimais da OHAUS para a
pesagem do material;
• Foi utilizado aparelho de microondas Cônsul com 4500wats de potência.
•Para as análises de por CLAE, utilizou-se um Cromatógrafo da Shimadzu, Coluna
Slim-pack CLC-ODS (250 x 4.6 mm d.i.; tamanho de partícula 5
µm), acoplado a
um espectrômetro de massas triplo quadrupolo Quattro LC (Micromass,
Manchester, UK).
3.2 REAGENTES E SOLVENTES
Os solventes usados nas sínteses, recristalizações, extrações, preparação de
extratos, cromatografia em coluna e camada fina, foram todos de grau P.A. da Vetec,
Aldrich e MercK, sendo eles:
y Etanol y Éter etílico y DMSO
y Metanol y THF y Hexano
y Clorofórmio yPiridina
y Diclorometano yAcetonitrila
Os reagentes utilizados nas sínteses foram das marcas Vetec e Aldrich:
yÁcido acético
y Cloreto de zinco
y Ácido cinâmico y Dióxido de manganês
y Àcido sulfúrico y Hidróxido de amônio
y Anidrido acético y Hidróxido de sódio
y Ácido clorídrico y Imidazol
y Celite y Óxido de Crômio (VI)
y Cloreto de benzoíla y Permanganato de potássio
y Carbonato de sódio
y Solasodina
y Ciclo pentanol y Sulfato de manganês
y Cloreto de sulforila y Trietilamina
Os solventes e as outras substâncias utilizadas para os ensaios biológicos estão
descritas abaixo:
y Água destilada y Gel de Sílica y Cloreto de magnésio
y Água mineral y Tween 80
y Cloreto de sódio y Cloreto de potássio
y Cloreto de cálcio y Sulfato de sódio
y Brometo de Potássio y Carbonato de sódio
3.3 METODOLOGIA
3.3.1 Coleta e Identificação do Material Vegetal
3.3.1.a Solanum crinitum Lam
O extrato foi preparado a partir dos frutos verdes coletados no dia 31 de julho de
2003 em Seropédica, RJ. Depois de triturados obteve-se uma massa igual a 1,310Kg.
A planta foi identificada por comparação com escicata depositada no herbário do
Departamento de Botânica da UFRRJ.
3.3.1.b Solanum capsicóide
Os frutos foram coletados no dia 17 de maio de 2004 em Caieiras, SP. Depois de
triturados obteve-se uma massa igual a 86,59g utilizada na preparação do extrato.
A planta foi identificada pela professora Maria de Fátima Agra, LTF-Setor de
Botânica da UFPB, e a escicata depositada no Herbário Prof
or
Lauro Pires Xavier
Jardim Botânico da Paraíba (JBP) UFPB.
3.3.1.c Solanum variable
Os frutos foram coletados no dia 17 de junho de 2004 em Seropédica, RJ.
Depois de triturados obteve-se uma massa igual a 35,27g que foi utilizada na preparação
do extrato.
A planta foi identificada pela professora Maria de Fátima Agra, LTF-Setor de
botânica da UFPB, e a excicata depositada no Herbário Prof
or
Lauro Pires Xavier
Jardim Botânico da Paraíba (JBP) UFPB.
3.3.1.d Solanum lincocarpum ·
Os frutos foram coletados no dia 17 de junho de 2004 em Seropédica, RJ.
Depois de triturados obteve-se uma massa igual a 4,55g que foi utilizada na preparação
do extrato.
A planta foi identificada pela professora Maria de Fátima Agra, LTF-Setor de Botânica
da UFPB, e a excicata depositada no Herbário Prof
or
Lauro Pires Xavier Jardim
Botânico da Paraíba (JBP) UFPB.
3.3.1.e
Solanum americanum
Os frutos foram coletados no dia 12 de fevereiro de 2004 em Seropédica, RJ.
Depois de triturados obteve-se uma massa igual a 341,29g que foi utilizada na
preparação do extrato.
A planta foi identificada pela professora Maria de Fátima Agra, LTF-Setor de
Botânica da UFPB, e a escicata depositada no Herbário Prof
or
Lauro Pires Xavier
Jardim Botânico da Paraíba (JBP) UFPB.
3.3.1.f Solanum seaforthianum
Os frutos foram coletados no dia 07 de Julho de 2004 na UFRRJ - Seropédica,
RJ. Depois de triturados obteve-se uma massa igual a 154,29g que foi utilizadas para
preparação do extrato.
A planta foi identificada pela professora Maria de Fátima Agra, LTF-Setor de
botânica da UFPB, e a excicata depositada no Herbário Prof
or
Lauro Pires Xavier Jardim
Botânico da Paraíba (JBP) UFPB.
3.4 Preparação dos Extratos e Obtenção das Frações Glicoalcaloidais
Os frutos verdes foram triturados e adicionou-se EtOH (90%) contendo 2% de
AcOH, sendo a mistura mantida em repouso por no mínimo dois dias. Após este
período o
extrato foi filtrado e concentrado em rota-evaporador. Este procedimento foi
realizado 3 vezes para exaustão do extrato.
Ao extrato bruto, já concentrado, foi adicionado o mesmo volume de AcOH 10% e
deixou-se pernoitar em resfriamento. Filtrou-se em celite a vácuo, e à solução foi
adicionado NH
4
OH (em banho de gelo) em quantidade suficiente para obter pH 10.
Após pernoitar, filtrou-se a vácuo, sendo o filtrado descartado e o precipitado já
constituia a fração rica em glicoalcaloides. O procedimento acima descrito foi o mesmo
para a preparação de todos os outros extratos e obtenção de suas respectivas frações
glicoalcaloidais.
Foi efetuado um teste simples, em bancada, para confirmar a presença de
glicoalcalóides nas frações. Este teste consistia em solubilizar uma pequena quantidade
da fração em ácido acético e logo após adicionar 2 gotas de reagente de Dragendorff,
sendo para o resultado positivo observado a formação de precipitado.
Para verificar a presença de solasonina nas frações, foram realizadas CCD,
comparando as frações glicoalcaloidais das outras plantas, com a fração glicoalcaloidal
da
Solanum crinitum.
3.4.1 Obtenção e Purificação de Solasodina
Apenas a fração contendo o glicoalcalóide solasonina da
S. crinitum foi
hidrolisada para obtenção do alcalóide esteroidal. A fração foi solubilizada em EtOH /
HCl
(conc
.
)
(8:2) e mantida em refluxo por 2 horas, logo após filtrou-se, e deixou-se em
repouso por uma noite. No dia seguinte filtrou-se, e com o filtrado preparou-se uma
suspensão em água ao qual se adicionou NH
4
OH (conc.) e mantendo-se em banho-
maria por 30 minutos, após resfriamento, obteve-se o extrato bruto da solasodina.
A solasodina foi solubilizada em MeOH a quente sendo adicionado
posteriormente carvão ativo. Aqueceu-se novamente e filtrou-se a vácuo utilizando terra
de infusória. A solasodina (
Figura 12) foi recristalizada em MeOH.
Figura 12. Estrutura da Solasodina
Figura 12.
Estrutura da Solasodina
3.5 Detecção dos Glicoalcalóides de Solanum crinitum utilizando CLAE-EM
A separação dos glicoalcalóides presentes na fração glicoalcaloidal de
S. crinitum
foi realizada utilizando-se uma coluna Slim-pack CLC-ODS (250 x 4.6 mm d.i.
tamanho de partícula 5
µm).
Como fase móvel foi utilizada a mistura H
2
O: acetonitrila segundo o gradiente
mostrado na Tabela 1, com fluxo de 1,0 mL/min.
N
H
HO
O
H
TABELA 1 – Gradiente de eluição da coluna no equipamento de CLAE-EM
3.6 Reações de Esterificação Utilizando MW
3.6.1 Reação Catalisada por Imidazol
Pesaram-se 100 mg de imidazol e 635 mg de ácido cinâmico, sendo
posteriormente homogeneizados em almofariz. Transferiu-se para uma placa de Petri
e adicionou-se 0,133 mL de ciclopentanol.
A reação foi exposta a irradiação em forno de microondas por 3 minutos
divididos em 6 exposições de 30 s, com intervalos de mesmo valor entre cada uma.
Posteriormente extraiu-se com éter etílico, adicionou-se a solução sulfato de magnésio,
filtrou-se e deixou-se evaporar o solvente. (HIROSE
et al, 2002).
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
3.6.2 Reação Catalisada por ZnCl
2
Tempo (min.) Água (%) Acetonitrila (%)
0
20
21
25
80
10
80
80
20
90
20
20
OH
O
HO
3 MIN.
MW
O
O
imidazol
OH
O
HO
3 MIN.
MW
O
O
ZnCl
2
Pesaram-se 50 mg de ácido cinâmico e 35,8 mg de Na
2
CO
3
bem misturados e
transferiu-se para uma placa de Petri e adicionando-se 0,214 mL de ciclopentanol. O
meio reacional foi levado ao aquecimento de maneira similar ao item 3.6.1 (LIAO
et al,
2003).
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
3.6.3 Reação Catalisada por Gel de Sílica
Pesou-se 50 mg de ácido cinâmico e misturou-se com uma pequena porção de
sílica, previamente ativada, adicionando-se gotas de diclomentano, para obter uma
melhor homogeneização.
Após evaporar o solvente, a reação foi exposta à irradiação em forno de
microondas realizando-se os procedimentos já citados anteriormente.
Tentando obter melhores rendimentos, repetiram-se as reações utilizando
imidazol e ZnCl
2
, aumentando a exposição à irradiação de microondas para 6 min.
divididos em 12 tempos de 30s com intervalos de mesmo valor.
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
3.6.4 Reação Utilizando Na
2
CO
3
SÍLICA
O
O
HO
MW
3min.
OH
O
O
O
HO
MW
3min.
OH
O
Na
2
CO
3
Pesaram-se 50 mg de ácido cinâmico e 35,8 mg de Na
2
CO
3
bem misturados,
transferiu-se para uma placa de Petri e adicionou-se 0,214 mL de ciclopentanol. O meio
reacional foi levado ao aquecimento de maneira similar ao item 3.6.1 (HIEH
et al,
2002).
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
3.7 Reações de Esterificação com a Solasodina
3.7.1 Reação com Suporte de Gel de Sílica
Misturou-se 50 mg de solasodina com 21 mg de ácido cinâmico e uma pequena
porção de gel de sílica, previamente seca em estufa a uma temperatura de 150
o
C por
aproximadamente 2 horas. Adicionou-se gotas de diclorometano para melhor
homogeneização dos reagentes. Após evaporar o solvente, transferiu-se os reagentes
para uma placa de Petri que foi exposta a irradiação em forno de microondas por 3 min.
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
3.7.2 Reação com Suporte de Gel de Sílica e H
2
SO
4
OH
O
O
N
H
HO
O
O
N
H
O
MW
SÍLICA
3 MIN.
OH
O
O
N
H
HO
O
O
N
H
O
H
2
SO
4
/
SÍLICA
MW
3 MIN.
Os procedimentos experimentais e estequiométricos foram similares aos já
citados no item 3.7.1, a única diferença foi a adição de gotas de ácido sulfúrico
concentrado ao meio reacional.
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
3.7.3 Reação Sólido-Sólido
A reação foi realizada de forma similar as já citadas, porém não ocorreu a
adição de catalisador ácido e não foi utilizado suporte de gel de sílica.
3.7.4 Reação da Solasodina com Imidazol como Catalisador
Misturaram-se 50 mg de solasodina, 55,3 mg de ácido cinâmico, 8,5mg de
imidazol, e transferiu-se a mistura sólida para uma placa de Petri, onde foram
adicionadas gotas de diclorometano para melhor homogeneizar o meio reacional.
A placa de Petri foi levada para a exposição à irradiação em forno de
microondas por 3 min. Divididos em 6 tempos de 30 s, com intervalos de mesmo
valor. Após o término deixou-se esfriar, lavou-se com éter etílico para extrair o
produto, filtrou-se e deixou-se evaporar.
O produto da reação foi identificado, utilizando a técnica de CG – EM e o
rendimento calculado em percentual de área relativa dos picos.
OH
O
O
N
H
HO
O
O
N
H
O
3 MIN.
Silica
MW
OH
O
O
N
H
HO
O
O
N
H
O
3 MIN.
MW
imidazol
3.7.5 Reação da Solasodina com Cloreto de Cinamoíla
3.7.5.a Preparação do Cloreto de Cinamoíla
Pesou-se 300mg de ácido cinâmico, transferiu-se para um balão de 50mL onde
foi adicionado 0,60mL de SOCl
2
. A reação foi mantida em refluxo por 8 horas. Após,
fez-se à destilação do meio reacional para a retirada do excesso de SOCl
2.
3.7.5.b Reação de Esterificação
Pesaram-se 100mg de solasodina e 40mg de do cloreto de ácido recém
preparado, transferiu-se para um balão de 50mL, adicionou-se 30mL CHCl
3,
previamente seco, e trietilamina. A reação permaneceu em refluxo por 11 horas,
havendo um acompanhamento por CCD.
Após esse período, deixou-se esfriar, evaporou-se o solvente e preparou-se uma
coluna filtrante para purificar o produto. Utilizou-se como eluente, Hexano e CHCl
3
,
nos seguintes gradientes: Hexano puro, Hex./CHCl
3
(9:1), Hex./CHCl
3
(8:2),
Hex./CHCl
3
(7:3), Hex./CHCl
3
(1:1).
3.7.6 Reação da Solasodina com Cloreto de Benzoíla
O
N
H
HO
O
Cl
O
O
N
H
O
REFLUXO
trietilamina
11 horas
O
Cl
REFLUXO
8 HORAS
trietiamina
O
N
H
HO
O
O
O
N
H
Pesou-se 100mg de solasodina, transferiu-se para um balão de 50mL, onde
foram dicionados 0,028mL de cloreto de benzoíla, 30mL de CHCl
3
e 5 gotas de
trietilamina. A reação foi mantida em refluxo por 8 horas.
Para a purificação do produto da reação, preparou-se uma coluna filtrante
utilizando como eluentes Hexano e CHCl
3
, nos seguintes gradientes: Hexano puro,
Hex./CHCl
3
(8:2), Hex./ CHCl
3
(7:3), Hex./ CHCl
3
(1:1), Hex./ CHCl
3
(2:8).
3.7.7 Reação da Solasodina com Anidrido Acético
Foram adicionados em um balão de fundo redondo 230mg de solasodina, 2mL de
piridina e 5mL de anidrido acético. Está mistura foi mantida sob agitação a temperatura
ambiente, por 24h. Após o tempo de reação, adicionou-se 10mL de água destilada,
extraindo-se o produto com CHCl
3
. O excesso de piridina foi eliminado pela adição de
1mL de H
2
SO
4
10%. O produto foi então novamente extraído com CHCl
3
e, a solução
seca com Na
2
SO
4
anidro (SHIRINER, 1979). A fase orgânica foi evaporada e o
derivado acetilado foi obtido com 40% de rendimento (92mg). A obtenção do produto
foi confirmada por RMN
13
C e
1
H.
3.8 REAÇÕES DE OXIDAÇÃO DA SOLASODINA
3.8.1 Reação de Oxidação Utilizando MnO
2
3.8.1.a Preparação do MnO
2
3
Mn
+2
MnO
4
OH
-
H
2
O
MnO
2
H
2
O
2
5
2
+
+
+
2 hora
temp. amb.
O
N
H
H
O
Ac
2
O/PY
24h / Tamb
O
o
o
N
H
Adicionou-se simultaneamente, durante uma hora, uma solução de 2,8g de
sulfato de manganês em 3mL de água e 2g de NaOH em 5mL de água em uma solução
40% (p/v) de KMnO
4
, previamente aquecida. Este meio reacional ficou sob agitação
por mais uma hora. O precipitado fino foi isolado por filtração a vácuo, sendo lavado
várias vezes com água. O produto foi seco em estufa (100-200
°) por duas horas antes
de ser utilizado.
3.8.1.b Reação de Oxidação
Em um balão de 50mL de capacidade, equipado com agitador magnético, e
septo de borracha, foi preparada uma solução de solasodina 0,49g (0,0012mol) em 5mL
de THF (seco) agitado sob atmosfera inerte (N
2
) e em seguida adicionou-se 103g (1,2
moles) de MnO
2
. Após 3 horas sob agitação, fez-se análise por CCF. A reação foi
mantida 4 dias, e o produto foi isolada por filtração, lavando com CH
2
Cl
2
.
3.8.2 Reação de Oxidação Utilizando PDC
3.8.2.a. Preparação do PDC
Primeiro preparou-se o complexo adicionando 6,2x10
-2
moles de óxido de
crômio (VI) em um balão de 100mL e em seguida 50mL de piridina anidra
(previamente destilada). A solução foi mantida sob agitação vigorosa por um período
de 10 a 15 minutos.
3.8.2.b. Reação de Oxidação
O
N
H
HO
MnO
2
(S)
O
O
N
H
EtOH
TEMP. AMB.
4 DIAS
O
N
H
HO
O
O
N
H
15-22 HORAS
TEMP. AMB.
PDC
No próprio meio reacional em que foi preparado o PDC, em seguida adicionou-
se de uma só vez 0,3 mg (0,00073 moles) de solasodina diluída em 10mL de piridina
anidra. A mistura foi mantida em agitação por aproximadamente 30 minutos, e esta
permaneceu em repouso à temperatura ambiente por 15-22 horas.
A mistura foi despejada em 300mL de água destilada e extraída com 250mL de
éter divididos em três porções. A extração com éter foi lavada sucessivamente com
ácido hidroclorídrico 10% (em 3 partições) e 25mL de carbonato de sódio 10% e 25mL
de água (HOLUM, 1961). Repetiu-se o mesmo procedimento, porém substituindo a
extração com éter por CHCl
3
na mesma quantidade.
3.8.3 Reação de Oxidação Utilizando PCC
3.8.3.a Preparação do PCC
Em um Becher contendo 61mL de HCl 6N, foram rapidamente adicionados 33g de
CrO
3
, sob agitação intensa. Após 5 minutos, a solução homogênea foi resfriada a 0
o
C e
foram cuidadosamente adicionados 26,4mL de piridina. Quando se resfriou a mistura a
0
o
C, obteve-se um sólido alaranjado (PCC) que foi filtrado e seco a vácuo durante 2
horas (CAREY, 1975).
3.8.3.b Oxidação da Solasodina
Em um balão de fundo redondo de 250mL foram suspensos 40mg de PCC em
30 ml de CH
2
Cl
2
anidro. Dissolveu-se 870mg de solasodina em 40mL de CH
2
Cl
2
e
adicionou-se à solução de PCC com agitação magnética, e manteve-se em refluxo
durante 3 horas.
O
O
N
H
Refluxo
3 Horas
O
HO
N
H
PCC
3.9 ENSAIOS BIOLÓGICOS
Foram avaliadas a toxidez frente a Artemia salina Leach e a atividade moluscicida
frente ao caramujo
Biomphalaria glabrata, dos extratos etanólico e das frações
glicoalcaloidais de 6 espécies do gênero
Solanum, descritas na Tabela 2.
Tabela 2. Espécies de Solanum utilizadas nos ensaios biológicos
3.9.1 Ensaio de Toxidez Frente a Artemia salina Leach
Para realizar o ensaio de toxidez, preparou-se uma solução salina artificial,
composta por (48g de NaCl, 3g de CaCl
2
.2H
2
O, 0,20g de KBr, 1,40g de KCL, 8g de
Na
2
SO
4
, 0,4g de NaHCO
3
e 22g de MgCl
3
.6H
2
O para 2L de solução), que foi utilizada
como meio de cultura das ovas. Depois da solução pronta, colocou-se as ovas no
criadouro e a solução até cobrí-las totalmente. Tampou-se a parte contendo as ovas e
direcionou-se a luz para a parte descoberta, onde após a eclosão, as larvas passam por
fototropismo. As Artemias foram utilizadas após 48 horas da eclosão.
3.9.1.a Procedimento para o Ensaio de Toxidez
Foram pesados 0,05g dos extratos e das frações glicoalcaloidais e solubilizados
em 2ml de DMSO, transferiu-se para um balão de 5mL e completou-se o volume com
3mL de solução salina. Desta solução, chamada de solução mãe, retiraram-se 5
Solanum variable
Solanum capsicoide
Solanum lycocarpum
Solanum crinitum
Solanum americanum
Solanum seaforthianum
alíquotas de volumes diferentes que variaram de 38µL a 500µL. Transferiu-se à cinco
tubos de ensaio, sendo que cada dose foi preparada em quadruplicata.
A cada tubo, com a suas devidas doses, foram adicionados 5mL de solução
salina medidos em uma bureta. Para comparação dos resultados, utilizou-se uma
solução controle, com os mesmos volumes que os ensaios com os extratos (500-38
µL),
a partir de uma solução estoque que continha 2mL de DMSO e 3mL de solução salina,
também preparada em quadruplicata.
Utilizando-se uma pipeta Pasteur, pegou-se de 10-15 larvas que foram
colocadas nos tubos de ensaio. Elas ficaram expostas às amostras e ao controle por 24
horas, e após este período realizou-se a contagem dos microcrustáceos vivos e mortos.
A
Figura 13 ilustra o procedimento do ensaio.
Figura 13. Esquema para ensaio de toxidez geral frente à Artemia salina
Para o calculo da dose letal que mata 50% das larvas (DL
50
), utilizou-se o log da
concentração em função da percentagem de microcrustáceos mortos (método
acumulativo) sendo obtidas curvas com perfil sigmoidal, fazendo-se necessário utilizar
a técnica estatística de probitos (BIER, 1965).
As
Tabelas de 3-8 apresentam os valores dos log das doses e dos
correspondentes probitos que foram utilizados para a confecção dos gráficos e
posteriores cálculos das DL
50
.
Solução estoque
1mg/mL
alíquotas
Tabela 3. Doses e porcentagens de larvas mortas para S. seaforthianum
Extrato Bruto Fração Glicoalcaloidal
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
125 84,00 5,99 50 54,00 5,10
120 63,00 5,33 47 25,00 4,33
115 39,00 4,72 45 6,00 3,36
110 15,00 3,96 40 2,00 2,67
100 2.00 2,95 38 0 0
Tabela 4. Doses e porcentagens de larvas mortas para S. lycocarpum
Extrato Bruto Fração Glicoalcaloidal
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
500 100,00 7,33 500 81,00 5,88
300 91,00 6,34 300 34,00 4,59
200 70,00 5,52 200 11,00 3,77
100 45,00 4,87 100 3,00 3,12
50 9,00 3,66 50 2,00 2,95
Tabela 5.
Doses e Porcentagens de larvas mortas para S. capsicoide
Extrato Bruto
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
500 100 7,33
300 96 6,75
200 76 5,70
100 13 3,87
50 0 0
Tabela 6. Doses e porcentagem de larvas mortas para S. variable
Fração Glicoalcaloidal
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
500 66 5,4
300 30 4,5
200 14 3,9
100
2 2,9
50
0 0
Tabela 7. Doses e porcentagem de larvas mortas para S. crinitum
Extrato Bruto Fração Glicoalcaloidal
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
500 99 7,33 500 99 7,3
300 93 6,48 300
98 7,0
200 71 5,55 200
84 6,0
100 42 4,80 100
65 5,4
50 21 4,19 50
45 4,9
Tabela 8.
Doses e porcentagem de larvas mortas para S. americanum
Extrato Bruto Fração Glicoalcaloidal
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
Dose (µl)
% de Mortos Probitos
500 98 7,10 500 98 7,10
300 86 6,10 300 92 6,40
200 56 5,20 200 78 5,80
100 36 4,60 100 51 5,00
50 15 3,90 50 20 4,20
3.10 Ensaio Moluscicida Frente ao Caramujo Biomphalaria glabrata
Os ensaios para a avaliação moluscicida, consistiam basicamente na introdução
do extrato da planta ou fração glicoalcaloidal em um recipiente contendo os caramujos.
Após um determinado tempo, que para o ensaio preliminar foi de 24-48 horas, e para o
definitivo 24-72 horas, realizou-se a observação do número de caramujos vivos e
mortos.
Figura 14. Esquema para o ensaio moluscicida frente ao caramujo
Biomphalaria glabrata
3.10.1 Materiais e Procedimentos para o Teste Moluscicida
1- Utilizaram-se caramujos entre 8-10 mm de diâmetro (adultos)
2-
Água desclorada (mineral)
3-
Provetas
4-
Copos de 125mL e de 250mL para cinco concentrações, (n=5).
5-
Tween 80 (detergente para ajudar na solubilização da amostra)
6-
Cápsula de porcelana
7-
Balões volumétricos
Solução Estoque
1mg/mL
Alíquotas da Amostra
8- Solução estoque com concentração de 1mg/mL após pesar a amostra, eram
adicionados 1-2 gotas de tween 80 e posteriormente água ate completar o
volume para 125 mL.
9-
Para o ensaio preliminar foi transferida uma alíquota da solução estoque
(começando pelo volume referente a 100
µg/mL) e completado o volume para
125mL, em seguida mergulhou-se 5 caramujos, (a relação é sempre de 25ml de
solução por caramujo). Após 48 horas de exposição, foi verificado se a amostra
apresentou atividade, quando ativo, foram realizado ensaios nas concentrações
de 80
µg/mL, 70µg/mL, 50µg/mL e 10µg/mL.
10-
Para o ensaio definitivo as concentrações foram escolhidas de acordo com o
resultado do ensaio preliminar. Alíquotas da solução estoque (também de
1mg/mL) foram completadas com água mineral para dois copos de 250mL, em
seguida 10 caramujos foram mergulhados. Cada concentração foi avaliada em
duplicata utilizando 20 caramujos por concentração.
11-
Depois de 24 horas observou-se o comportamento dos caramujos, e após 48
horas os caramujos foram transferidos para um a placa de Petri e verificado se
havia reação aos estímulos provocados com uma espátula. Para confirmação da
mortandade, os caramujos foram transferidos para um copo limpo, contendo
apenas água e alimento. Depois de 24 horas, foi realizado um novo exame.
12-
O controle foi feito com uma gota de tween 80 e água, sendo os caramujos
transferidos para copos com 125mL ou 250mL (n=2).
13-
O cálculo da DL
50
foi realizado utilizando o log da concentração em função da
percentagem de caramujos mortos, sendo obtidas curvas com perfil sigmoidal,
fazendo-se necessário utilizar a técnica estatística de probitos (BIER,1965).
4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O estudo de diversas espécies da família Solanaceae foi motivado pela grande
diversidade de atividades biológicas apresentadas pelo gênero
Solanum. Assim, foram
estudadas seis espécies do gênero
Solanum sendo elas: S. crinitum, S. variable, S.
americanum, S. lycocarpum, S. capsicoides e S. seaforthianum.
4.1 Obtenção dos Extratos, Frações Glicoalcaloidais, e da Solasodina de
Solanum crinitum Lam
A partir dos frutos verdes moídos das seis espécies foram preparados os
respectivos extratos em etanol e ácido acético (8:2). Posteriormente, reservou-se uma
parte dos extratos brutos para a realização de ensaios biológicos, e a outra parte foi
utilizada para a obtenção das frações glicoalcaloidais, utilizando uma metodologia
específica já citada anteriormente na Parte Experimental.
A avaliação da presença de glicoalcalóides foi realizada utilizando ácido acético
e o reagente de Dragendorff que mostrou resultado positivo quando houve aparecimento
de precipitado, das seis espécies, a única que não apresentou resultado positivo foi a
S.
capsicoides. A presença de solasonina foi investigada nas frações glicoalcaloidais, por
CCD em comparação com a fração de
Solanum crinitum, cuja presença é majoritária.
Os rendimentos dos extratos brutos foram calculados em relação ao peso dos
frutos moídos, e os rendimentos das frações glicoalcaloidais em relação aos extratos
brutos obtidos. Os respectivos valores de pesos e rendimentos estão descritos na
Tabela
3, sendo que as espécies S. crinitum e S. seaforthianum apresentaram-se mais ricas nas
frações glicoalcaloidais.
Tabela 9. Peso (g) dos frutos, extratos e frações glicoalcaloidais das espécies de
Solanum e respectivos rendimentos.
Diante da maior disponibilidade dos frutos de
S. crinitum encontrados em
abundância no município de Seropédica, e em função do maior rendimento obtido para
sua fração glicoalcaloidal esta espécie foi escolhida para o isolamento do alcalóide
esteroidal solasodina.
Após a hidrólise da fração glicoalcaloidal de
S. crinitum, obteve-se 29,50g de
solasodina, em estado seco e não purificada. A purificação da solasodina bruta foi
realizada por recristalização em metanol e carvão ativo sendo obtidos 22,50g do
alcalóide puro, apresentando um rendimento de 3,73% em relação ao extrato bruto, a
estrutura da solasodina está representada na
Figura 15.
Figura 15. Estrutura da solasodina
Figura 15. Estrutura da solasodina
Extrato bruto Fração de glicoalcaloide
Espécies Peso frutos
(g)
Peso (g) Rendimento (%) Peso (g) Rendimento (%)
S.variable
4,55 0,4 8,1 0,10 25
S.capsicoide
86,59 25,0 29,0 ---- ----
S.lincocarpum
35,27 17,0 48,2 0,40 2,3
S.crinitum
1031 600 58,2 324,00 54
S.americanum
341,29 70,0 20,1 0,60 0,9
S.seaforthianum
154,29 30,0 19,4 13,00 43
N
H
HO
O
H
SOLASODINA
A solasodina obtida foi comparada com amostra padrão por CCD e, apresentou
ponto de fusão na faixa de 200-202
o
C (201-202
o
C, SIGMA, 2001). Além disso, sua
estrutura foi confirmada por técnicas espectrocópicas.
A análise do espectro de RMN de
1
H permitiu atribuir os seguintes sinais: dois
dubletos correspondentes a duas metilas secundárias (H-21 e H-27) em δ
H
0,81 e 0,91,
e dois singletos para duas metilas terciárias, H-19 e H-18, que apareceram em δ
H
0,99
e 0,78, respectivamente.
Os alcalóides do tipo espirosalanos têm dois anéis piperidínicos e tetra-
hidrofurano peculiares ligados em espiro, fornecendo perfil característico ao espectro
de RMN de
1
H. O multipleto com deslocamento químico em campo baixo, em δ
H
4,24
corresponde ao hidrogênio metínico geminal (H-16) ao oxigênio do anel tetrafurânico.
Os hidrogênios metilênicos geminais ao nitrogênio (H-26 e H-26’) têm deslocamentos
químicos em δ 2,61 (H-α) e 2,56 (H-β). A
Figura 16 mostra o espectro de RMN
1
H.
Figura 16. Espectro de RMN
1
H da solasodina
No espectro de RMN de
13
C foi observado a presença do C-22, um carbono
quaternário com deslocamento em δ 98,10 característico de todos os alcalóides do tipo
espirosolano (RADEGLIA, 1977). A
Tabela 10 mostra os valores dos deslocamentos
químicos encontrados na literatura em comparação com os valores obtidos para o
produto isolado neste trabalho. A
Figura 17mostra o espectro de
13
C.
Figura 17.
Espectro de RMN
13
C da solasodina
Tabela 10. Atribuições para os deslocamentos químicos de RMN
13
C para a solasodina
(RADEGLIA, 1977)
C
Literatura (
δ) Solasodina isolada (δ)
1 37,3 37,4
2 31,5 31,5
3 71,7 71,8
4 42,3 42,4
5 140,9 140,9
6 121,3 121,5
7 32,1 32,3
8 31,5 32,2
9 50,2 50,2
10 36,7 36,8
11 20,9 19,5
12 40,0 40,0
13 40,5 40,6
14 56,6 56,7
15 32,1 32,2
16 79,0 78,9
17 62,9 62,5
18 16,4 16,5
19 19,3 19,5
20 41,3 42,4
21 15,2 15,4
22 98,4 98,4
23 34,1 34,2
24 30,3 30,4
25 31,5 31,8
26 47,7 47,8
27 19,3 19,4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
27
26
23
24
25
O
N
H
HO
4.2. Monitoramento dos Glicoalcalóides de Solanum crinitum por CLAE-EM
A análise por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria
de massas (CLAE-EM) é uma poderosa técnica analítica para identificar e/ou
monitorar a presença de metabólitos especiais de plantas. O trabalho de
fracionamento de um extrato vegetal pode ser abreviado pela obtenção do perfil
cromatográfico do respectivo extrato ou fração. Assim, através do tempo de retenção
dos compostos eluídos no sistema cromatográfico, o qual é regido por parâmetros,
tais como: polaridade e peso molecular, é possível identificar ou monitorar suas
presenças.
Por outro lado, a obtenção dos espectros de massas dos picos presentes nos
respectivos cromatogramas permitem inferir sobre os metabólitos presentes na espécie
em estudo, e finalmente fazer a identificação dos mesmos (BRANCO e
PIZZOLATTI, 2002).
Diante disso, foram realizadas as análises por CLAE-EM da fração
glicoalcaloidal de
Solanum crinitum, que de acordo com as placas de CCD,
apresentava três diferentes glicoalcaloides. Após a hidrólise da fração glicoalcaloidal
observou-se apenas um alcalóide com estrutura esteroidal: a solasodina (aglicona),
indicando a provável diferença apenas nas unidades de açúcar.
O cromatograma referente a fração glicoalcaloidal de
Solanum crinitum,
apresentou 3 picos de abundâncias significativas com tempos de retenção em 13,04,
13,66 e 14,39 s, sendo obtido o espectro de massas que forneceu fragmentos
correspondentes aos possíveis íons moleculares (M
+.
) com m/z = 868,74, 884,73 e
900,72. Esses íons moleculares poderiam ser atribuídos a três diferentes estruturas
glicosiladas, sendo o pico m/z = 884,73 referente à solasonina (CHEN
et al, 1994).
Comparando-se os valores dos possíveis íons moleculares 868,74 e 900,72 com
a solasonina, pôde-se sugerir que as estruturas dos glicoalcaloides apresentavam
diferenças apenas na natureza das unidades de açúcar. Complementando, os fragmentos
m/z 394,09 e 396,28 caracterizam a presença do esqueleto esteroidal para os três
glicoalcaloides.
Assim, as estruturas sugeridas para os glicoalcalóides podem apresentar três
unidades de glicose (M
+.
= 868,74), duas de glicose e uma ramnose (solasonina, M
+.
=
884,73) e o outro glicoalcalóide com uma glicose e duas raminoses (M
+.
= 900,72). As
estruturas não foram propostas devido a dificuldade na separação dos glicoalcalóides e,
em função da pequena quantidade da mistura não foi possível a obtenção de espectros
de RMN para a provável elucidação. A
Figura 18 apresenta o espectro de massas da
fração glicoalcaloidal.
Espectro de Massas da Fração Glicoalcaloidal de Solanum crinitum
Figura 18. Espectro de massas da fração glicoalcaloidal de Solanum crinitum
Diante da possibilidade de coletar a espécie
S. crinitum na cidade de João Pessoa
(PB), tornou-se fato interessante realizar a comparação do perfil de metabólitos
especiais com a coletada em Seropédica (RJ), devido às diferenças morfológicas
observadas e também em função das variações de solo e clima. Através dos
cromatogramas e dos espectros de massas obtidos para as frações glicoalcaloidais dos
frutos das duas plantas foi possível verificar que estas apresentavam características
químicas semelhantes, apesar das visíveis diferenças como a maior presença de
espinhos e tricomas pela espécie do nordeste.
A comparação dos cromatogramas e espectros de massas (
Figura 19) permitiu
visualizar a semelhança dos metabólitos da classe dos glicoalcaloides.
Cromatograma de
Solanum crinitum do Rio de Janeiro (RJ)
Cromatograma de
Solanum crinitum de João Pessoa (Paraíba)
Figura 19. Cromatogramas e espectros de massas das plantas coletadas no
Rio de Janeiro e em João Pessoa
4.3 Reações Utilizando a Solasodina
O interesse em realizar modificações estruturais na solasodina, deveu-se a
estudos anteriores, onde se avaliou sua atividade citotóxica frente a células do
carcinoma de Ehrlich e da leucemia humana K562. Os ensaios também foram
realizados com o glicoalcalóide solasonina. Os resultados indicaram atividade
citotóxica significativa para a solasonina, e baixa atividade para a solasodina,
indicando assim, a importância da presença dos açúcares na estrutura do glicoalcaóide
(ESTEVES-SOUZA, 2002), justificando assim, o interesse na busca de novos
derivados da solasodina.
As reações de esterificação clássica, envolvendo a solasodina e o cloreto do
ácido cinâmico não forneceram resultados positivos, como também, as
reações entre a
solasodina e o ácido cinâmico que foram realizadas com suporte sólido de gel de sílica,
com ou sem catalisador ácido (H
2
SO
4
) sob irradiação de microondas. Este fato foi
confirmado por CCD, em que se comparou o produto da reação com o padrão de
solasodina e ácido cinâmico, tendo como eluente CHCl
3
:MeOH (9,5:0,5). O resultado
negativo também foi verificado para a mesma reação sem suporte de gel de sílica
(reação sólido-sólido). A
Figura 20 ilustra as equações para as reações realizadas.
Figura 20. Equações das reações da solasodina com ácido cinâmico
Esses resultados negativos motivaram-nos a buscar novas alternativas para a
possível esterificação da solasodina sob irradiação em forno de microondas.
O
N
H
HO
SOLASODINA
OH
O
ÁCIDO CINÂMICO
H
2
SO
4
C/
S/ SÍLICA
SÍLICA
H
2
SO
4
S/ SÍLICA
/
/
MW
3 MIN.
NÃO REAGIU
NÃO REAGIU
NÃO REAGI
U
4.3.1 Estudo da Metodologia para as Reações de Esterificação
Inicialmente foram realizadas reações utilizando o sistema ciclopentanol e ácido
benzóico com diversos catalisadores como ZnCl
2
; imidazol; Na
2
CO
3
; gel de sílica e
H
2
SO
4
, expostas à irradiação em forno de microondas, como modelo para posterior
utilização com a solasodina.
As aplicações do aquecimento de irradiação sob microondas tem sido utilizadas
em pesquisas de diferentes áreas. Estas incluem a preparação de amostras para análise,
tecnologia em polímeros, cerâmica e decomposição de alcanos. A técnica tem também
uso estabelecido em processos de decomposição como na hidrólise de proteínas e
peptídeos. Aplicações em sínteses inorgânicas e orgânicas, em estado sólido, têm sido
também muito beneficiadas por esta tecnologia (CADDICK, 2001).
As reações com os cinco catalisadores (ZnCl
2
, imidazol, Na
2
CO
3
, gel de sílica e
H
2
SO
4
), foram realizadas em forno de microondas doméstico, mantendo-se sempre a
mesma potência e o tempo de exposição a irradiação. Dentre os cinco catalisadores
testados as reações que forneceram resultados satisfatórios foram aquelas em que se
utilizaram o ZnCl
2
, imidazol ou o H
2
SO
4
.
Estas reações foram monitoradas por cromatografia gasosa, e a formação dos
produtos foi confirmada por espectrometria de massas (CG-MS). Pôde-se confirmar a
formação do éster proveniente do ácido cinâmico e ciclopentanol, através da análise
dos espectros de massas que apresentaram pico de íon molecular M
+
216, e alguns
sinais correspondendo aos fragmentos: m/z = 103, 131, 149, comuns nas reações
utilizando-se os três catalisadores citados acima. A
Figura 21 apresenta a estrutura do
éster do cinamato de ciclopentila
e as Figura 22 e 23 mostram o espectro de massas e
os principais fragmentos sugeridos para o éster cinamato de ciclopentanila obtido na
reação de esterificação utilizando o ZnCl
2
, escolhido dentre os três catalisadores que
apresentaram o mesmo perfil.
Figura 21. Estrutura do cinamato de ciclopentila
Figura 22.
Espectro de massas do éster cinamato de ciclopentila
Figura 23. Principais fragmentos para o éster cinamato de ciclopentila
O
O
O
O
M
216
OH
O
H
OH
O
m/z 103
O
m/z 131
m/z 149
C
6
H
9
O
2
C
5
H
9
O
C
5
H
7
Os cálculos dos rendimentos dessas reações foram realizados através da área
relativa percentual para o pico do produto, em relação a área do pico do reagente com
estequiometria limitante, obtendo-se 77% para a reação catalisada por ZnCl
2
em área
relativa, 47% para a catalisada por imidazol e 62% para a reação com H
2
SO
4
como
catalisador, sendo que todas foram realizadas em potência máxima do forno de
microondas.
Tentando melhorar os rendimentos das reações utilizando o imidazol e o ZnCl
2
como catalisadores estas foram repetidas mantendo-se os meios reacionais expostos as
irradiações de microondas por mais tempo, porém diminuindo a potência do aparelho.
Os resultados observados não foram satisfatórios, pois, não houve um aumento nos
rendimentos, ocorrendo em alguns casos até uma diminuição da formação do produto.
Os rendimentos das reações do ciclopentanol e ácido benzóico frente aos
diversos catalisadores estão descritos na
Tabela 11.
Tabela 11. Rendimentos das reações do ciclopentanol com ácido benzóico com
diferentes catalisadores.
Catalisador Tempo
(min.)
Potência
(W)
Rend. em
área relativa
(%)
ZnCl
2
3 10 77
ZnCl
2
6 10 36
ZnCl
2
6 5 35
Imidazol 3 10 47
Imidazol 6 10 17
Imidazol 6 5 0,5
H
2
SO
4
6 5 62
Na
2
CO
3
3 10 Não reagiu
Gel de Sílica 3 10 Não reagiu
4.3.2. Reações de Esterificação da Solasodina
Assim, a reação da solasodina com o ácido cinâmico foi realizada sob irradiação
de microondas utilizando os catalisadores que apresentaram melhores resultados, ou
seja, na presença de imidazol e ZnCl
2
. Os produtos foram isolados através da extração
com CHCl
3,
e foram analisados por CG-EM, sendo que puderam ser observados
fragmentos importantes provenientes da fragmentação do éster formado entre a
solasodina e o ácido cinâmico.
O íon molecular não pôde ser observado nos espectros de massas. A Figura 24 mostra
os principais fragmentos sugeridos para o éster cinâmico da solasodina.
Figura 24. Principais fragmentos para o Ester cinâmico da solasodina
A solasodina também foi submetida à reação de esterificação frente ao anidrido
acético utilizando piridina como catalisador. A reação apresentou-se bem eficiente, após
48 horas de reação, foi possível extrair o produto com facilidade obtendo-se 92mg do
acetato, o que correspondeu a um rendimento de 40%. A estrutura do produto obtido
está representada pela
Figura 25.
Figura 25. Estrutura da solasodina acetilada.
A solasodina acetilada foi caracterizada através dos espectros de RMN
1
H e de
13
C. O espectro de RMN de
13
C mostrou deslocamento químico para o C-3 em δ 70, 12,
característico de álcool secundário acetilado em esqueleto esteroidal (BREITMAIER &
VOELTER, 1987), enquanto que o C-3 da solasodina em
δ 71,7 (RADEGLIA, 1977),
além de absorções em
δ 170,13 e 21, 7, referentes aos carbonos carbonílico e metílico
do grupo acetila, respectivamente. A
Figura 26 mostra o espectro obtido.
N
O
H
O
O
3
1
2
M
+
543
C
3
H
4
OH
O
O
N
H
m/z 503
O
N
H
O
O
Figura 26. Espectro de RMN
13
C da solasodina acetilada
4.3.3. Reações de Oxidação da Solasodina
Foram realizadas reações de oxidação da solasodina utilizando-se três reagentes
oxidantes diferentes o PDC, MnO
2
e o PCC, com o intuito de avaliar a técnica mais
eficiente tanto no rendimento quanto no isolamento.
A primeira reação de oxidação foi realizada utilizando PDC, sendo que a
mistura reacional foi analisada por CCD observando-se a formação do produto. Porém,
o processo de extração e de isolamento do produto foi muito dificultoso, fazendo-se
necessário a utilização de uma coluna filtrante, o que acarretou em um rendimento
muito baixo. A formação da solasodina oxidada, que foi chamada de solasodinona, foi
confirmada pela espectroscopia de infra-vermelho que apresentou uma banda de
absorção em 1729cm
-1
, característica do grupo carbonila em cetonas. No entanto, a
banda larga de absorção em 3200cm
-1
, indicou ainda a presença do grupamento OH,
evidenciando a reação parcial de oxidação.
A segunda técnica foi a oxidação utilizando MnO
2
onde, através de CCD pôde-
se verificar que esse oxidante não se apresentou muito eficiente devido a presença de
muitas impurezas no produto formado, e da grande quantidade de solasodina que não
havia reagido. Confirmou-se a formação do produto, através do espectro de infra-
vermelho que apresentou uma pequena banda de absorção em 1670cm
-1
, confirmando a
presença da carbonila.
A técnica em que se utilizou o PCC como agente oxidante foi a que forneceu
melhores resultados, tanto no rendimento como na pureza do produto. A formação do
produto foi confirmada por CCD, que apresentou uma mancha intensa atribuída a
solasodinona. O espectro de infra-vermelho também foi obtido, e apresentou uma
intensa banda de absorção em 1677cm
-1
, que confirmou a presença da carbonila. A
Figura 27 mostra o espectro de infra-vermelho e a estrutura da solasodinona.
Figura 27. Espectro de infra-vermelho e estrutura da solasodinona.
N
O
H
O
Os valores dos rendimentos obtidos nas reações de oxidação da solasodina estão
indicados na
Tabela 12.
Tabela 12. Rendimento das reações de oxidação da solasodina.
Os espectros de RMN
1
H e de
13
C foram obtidos para a solasodinona,
confirmando sua estrutura, através da comparação dos valores dos
deslocamentos químicos com os correspondentes descritos na literatura
(RADEGLIA, 1977). O deslocamento químico observado para o C-3 foi de
δ
199,40, e 125,7 para o C-4, valores típicos de cetona
α,β-insaturada
(BREITMAIER & VOELTER, 1987), indicando a ocorrência do rearranjo
alílico para o H em posição
γ à carbonila. A Figura 28 mostra os deslocamentos
químicos da literatura para os carbonos envolvidos, e a
Figura 29 o rearranjo
alílico
Figura 28. Deslocamentos químicos para a cetona β, γ (MAHATO &
KUNDU, 1994) e cetona
α,β-insaturadas (BREITMAIER & VOELTER, 1987) e os
valores, em vermelho e entre parênteses, obtidos neste trabalho.
Oxidante Rendimento (%)
PDC 7,5
MnO
2
25
PCC 30
O
O
N
H
δ 215
δ 121,3
δ 142,4
O
O
N
H
δ 197
δ 169
δ 124
(199,40)
(125,7)
A Figura 26 mostra o espectro de RMN de
13
C para a solasodinona
Figura 29. Rearranjo alílico sugerido para a solasodinona
4.4. Atividade Biológica
Foram realizados ensaios para a avaliação da toxidez geral frente a Artemia
salina
Leach e atividade moluscicida frente ao caramujo Biomphalaria glabrata, dos
extratos brutos e das frações glicoalcaloidais das seis espécies de plantas do gênero
Solanum estudadas nesse trabalho.
4.4.1. Atividade Frente a Artemia salina Leach
Os laboratórios de produtos naturais ou de síntese orgânica têm inserido dentro
de suas rotinas de isolamento ou monitoramento, diversos ensaios biológicos simples.
Geralmente, esses ensaios são pouco viáveis em laboratórios de química, pois estes não
estão devidamente equipados para a realização de bioensaios de rotina utilizando
animais tecidos ou órgãos isolados, fazendo-se necessário realizar ensaios com
procedimentos simples e rápidos (CAVALCANTE
et al, 2000).
A letalidade de organismos simples tem sido utilizada para um rápido e
relativamente simples monitoramento da resposta biológica, onde existe apenas um
O
O
N
H
O
HO
N
H
O
O
N
H
H
3
O
O
HO
HH
N
H
H
2
O
H
2
O
HH
2
O
..
..
parâmetro envolvido: morte ou vida, e os resultados podem ser facilmente tratados
estatisticamente. O ensaio de letalidade permite a avaliação da toxidez geral e, portanto
é considerado essencial como bioensaio preliminar no estudo de compostos com
potencial atividade biológica (SIQUEIRA
et al, 1998).
Dentre esses bioensaios, encontra-se a toxidez sobre
Artemia salina Leach
(TAS), que se caracteriza por ser de baixo custo e rápido. A
Artemia salina é um
microcrustáceo de água salgada que é utilizada como alimento vivo para peixes. O
primeiro trabalho relativo ao uso da TAS em bioensaios foi para avaliar resíduos de
pesticidas. E a partir daí, inúmeros artigos têm sido publicados na literatura em estudos
ambientais, utilizando produtos e toxinas naturais, além de extratos de plantas
(SIQUEIRA
et al, 1998).
Os extratos brutos e frações glicoalcaloidais dos frutos verdes de
S. crinitum, S.
americanum, S. lincocarpum e S. seaforthianum, como também o extrato bruto de S.
capsicoides, e a fração de glicoalcalóides de S. variable, foram submetidos ao ensaio
frente a
Artemia salina.
Foram preparadas soluções-mãe de 40% (v/v) de DMSO e solução salina.
Destas soluções foram retiradas alíquotas que variaram entre 500 – 38
µl que foram
adicionadas aos tubos de ensaio para a realização dos testes. Os ensaios foram
realizados em quadruplicata para cada concentração. Os valores dos log das doses
versus os percentuais de larvas mortas permitiram a obtenção de gráficos com perfil
sigmoidal, que foram tratados estatisticamente pelo método dos Probitos (BIER, 1965)
e posteriormente submetidos à regressão linear. As equações assim obtidas permitiram
a obtenção dos valores da dose letal que mata 50% (DL
50
). As Figuras 30 – 35
apresentam os gráficos dos probitos dos porcentuais de larvas mortas versus log doses
ensaiadas e as equações que permitiram a obtenção dos valores de DL
50
.
S. seafortheanum
Figura 30. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log dose ensaiada para
o extarto bruto e fração glicoalcaloidal de
S. seafortheanum.
Após a regressão linear foram obtidas as seguintes equações:
Extrato de
S. seafortheanum
Probitos do % de larvas mortas = -65,43 (±5,72) + 34,10 (±2,79) log dose
R = 0,9901 dp = 0,1908 p = 0,0012
Log DL
50
= 5-(-65,43) / 34,10 = -2,07 DL
50
= 23,6 µg/mL
Fração de
S. seafortheanum
Probitos do % de larvas mortas = -74,10 (±1,85) + 46,92 (±1,12)log dose
R = 0,9994 dp = 0,0929 p = 5,69. 10
-4
Log DL
50
= 5-(-74,10) / 46,92 = -1,69 DL
50
= 1 µg/mL
1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
Probitos do % das larvas mortas
log dose
extrato
fração
S. lycocarpum
Figura 31. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log dose ensaiada para
o extrato bruto e fração glicoalcaloidal de
S. lycocarpum.
Após a regressão linear foram obtidas as seguintes equações:
Extrato de
S. lycocarpum
Probitos do % de larvas mortas = -2,28 (±1,47) + 2,84 (±0,65)log dose
R = 0,9903 dp = 0,2193 p = 0,0012
Log DL
50
= 5-(-2,28) / 2,84 = 2,60
DL
50
= 80 µg/mL
Fração de
S. lycocarpum
Probitos do % de larvas mortas = -2,42 (±1,40) + 2,89 (±0,62)log dose
R = 0,9296 dp = 0,5123 p = 0,0222
Log DL
50
= 5-(-2,42) / 2,89 = 2,56
DL
50
= 70 µg/mL
1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
Probitos do % de larvas mortas
log dose
extrato
fração
S. crinitum
Figura 32. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log dose ensaiada para
o extarto bruto e fração glicoalcaloidal de
S. crinitum.
Após a regressão linear foram obtidas as seguintes equações:
Extrato de
S. crinitum
Probitos do % de larvas mortas = -1,21 (±0,68) + 3,07 (±0,30)log dose
R = 0,9861 dp = 0,2375 p = 0,0020
Log DL
50
= 5-(-1,21) / 3,07 = 2,02
DL
50
= 52,7 µg/mL
Fração de
S. crinitum
Probitos do % de larvas mortas = 0,46 (±0,65) + 2,53 (±0,29)log dose
R = 0,9810 dp = 0,5123 p = 0,0030
Log DL
50
= 5-(0,46) / 2,53 = 1,80
DL
50
= 13 µg/mL
1,61,82,02,22,42,62,8
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
Probitos do % de larvas mortas
log dose
extrato
fração
S. americanum
Figura 33. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log dose ensaiada para
o extarto bruto e fração glicoalcaloidal de
S. americanum.
Após a regressão linear foram obtidas as seguintes equações:
Extrato de
S. americanum
Probitos do % de larvas mortas = -1,55 (±0,85) + 3,09 (±0,38)log dose
R = 0,9786 dp = 0,2982 p = 0,0037
Log DL
50
= 5-(-1,55) / 3,09 = 2,09
DL
50
= 25,20 µg/mL
Fração de
S. americanum
Probitos do % de larvas mortas = -0,72 (±0,21) + 2,86 (±0,09)log dose
R = 0,9984 dp = 0,0737 p < 0,0001
Log DL
50
= 5-(0,72) / 2,86 = 1,97
DL
50
= 18,70 µg/mL
1,61,82,02,22,42,62,8
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
Probitos do % de larvas mortas
log dose
extrato
fração
S. capsicoide
Erro!
Figura 34. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log dose ensaiada para
o extrato bruto de
S. capsicoide.
Após a regressão linear foi obtida a seguinte equação:
Extrato de
S. capsicoide
Probitos do % de larvas mortas = -11,49 (±2,43) + 7,28 (±1,08)log dose
R = 0,9686 dp = 0,8481 p = 0,0067
Log DL
50
= 5-(-11,49) / 7,28 = -2,26
DL
50
= 40,00 µg/mL
1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Probitos do % de larvas mortas
log dose
extrato
S. variable
Figura 35. Gráfico do probitos do % de larvas mortas x log dose ensaiada para
a fração glicoalcaloidal de
S.variable.
Após a regressão linear foi obtida a seguinte equação:
Fração de
S. variable
Probitos do % de larvas mortas = -7,97 (±1,75) + 5,09 (±0,77)log dose
R = 0,9667 dp = 0,8473 p = 0,0073
Log DL
50
= 5-(-7,97) / 5,09 = -2,90
DL
50
= 160,00 µg/mL
Os valores de DL
50
(µg/mL) obtidos nos ensaios de toxidez frente a Artemia
salina para os extratos brutos e frações glicoalcaloidais das diversas espécies de
Solanum estudadas estão indicados na Tabela 13. Observou-se que todos os extratos
mostraram atividade significativa, sendo o de
S. seafortheanum o mais ativo (DL
50
=
23,6
µg/mL), enquanto que as frações alcaloidais foram mais ativas quando
comparadas aos respectivos extratos brutos. A fração de glicoalcalóides mais ativa
também foi de
S. seaforthianum que apresentou DL
50
= 1 µg/mL, e a menos ativa foi a
S. variable com DL
50
= 160 µg/mL.
1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8
0
1
2
3
4
5
6
Probitos do % de larvas mortas
log dose
fração
Tabela 13. Valores de DL
50
frente a Artemia salina para os extratos brutos e
frações glicoalcaloidais das espécies de
Solanum.
Espécie
Extrato
DL
50
µg/mL
Fração
DL
50
µg/mL
Atividade
a
S.seaforthianum
23,60 1,00 Ativa
S. lycocarpum
80,00 70,00 Ativa
S. capsicoide
40,00 n.t.
b
Ativa
S. variable
n.t. 160,00 Ativa
S. crinitum
57,70 13,00 Ativa
S. americanum
25,20 18,70 Ativa
a
Considera-se ativa DL
50
< 1000 µg/mL;
b
n. t.: não testada.
A
Figura 36 mostra o gráfico comparativo dos valores de DL
50
para a toxidez
frente a
Artemia salina das espécies de Solanum avaliadas.
Figura 36. Gráfico comparativo dos valores de DL
50
para as espécies de
Solanum frente a Artemia salina.
S
.
s
e
a
f
o
r
t
h
i
a
n
u
m
S
.
l
i
n
c
o
c
a
r
p
u
m
S
.
c
a
p
s
i
c
o
i
d
e
S
.
v
a
r
i
a
b
l
e
S
.
c
r
i
n
i
t
u
m
S
.
a
m
e
r
i
c
a
n
u
m
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
DL
50
(µg/mL)
Espécies de Solanum
extrato bruto
fração glicoalcaloidal
4.4.2 Atividade Moluscicida Frente ao Caramujo Biomphalaria Glabrata
A doença parasitária esquistossomose é o maior problema de saúde em muitos
países tropicais e mais de 300 milhões de pessoas estão infectadas. Os caramujos
aquáticos são os hospedeiros intermediários para o parasita e por causa disto, a infecção
é transmitida para os humanos através do contato com a água contaminada,
principalmente em áreas rurais com o fornecimento precário de água para o consumo
doméstico e pobres instalações sanitárias. A erradicação da doença é impossível com os
recursos disponíveis, entretanto o objetivo imediato é o controle da mortalidade. Apesar
do sucesso de alguns programas de controle, a prevalência da esquistossomose continua
constante, devido principalmente ao crescimento da população e ao aumento de áreas de
irrigação (WHO,1993).
No Brasil 8 milhões de pessoas são infectadas, com distribuição em vastas
regiões, desde Belém do Pará até o Norte do Paraná, com dois focos isolados em Santa
Catarina e um caso no Rio Grande do Sul ( CARVALHO
et al, 1998).
É uma doença provocada pelo
Schistossoma mansoni, caracteriza-se por uma
fase aguda, muitas vezes despercebida, e uma crônica, na qual podem surgir formas
graves, evidenciadas principalmente pela hipertensão porta ou pulmonar (PRATA,
1987).
Existe uma necessidade urgente de encontrar um moluscicida seletivo e eficiente
para o controle dos caramujos, especialmente porque os compostos utilizados ou as
formulações em geral são biocidas, afetando também muitos animais e plantas (ou
ambos) onde estes habitam. Por esta razão, tem-se aumentado a procura por substâncias
derivadas de plantas com atividade moluscicida, na esperança de que espécies
disponíveis localmente possam ser usadas para o controle da doença em áreas
endêmicas (KLOOS & MCCULLOUGH, 1982; MARSTON & HOSTETTMANN,
1985, MARSTON & HOSTETTMANN, 1991).
Os extratos dos frutos verdes e as frações glicoalcaloidais de S. crinitum,, S.
americanum, S. lincocarpum e S. seaforthianum, bem como o extrato bruto S.
capsicoides e a fração glicoalcaloidal de S. variable, foram submetidos ao ensaio
moluscicidada frente ao caramujo
Biomphalaria glabrata. Primeiramente foram
realizados ensaios preliminares (triagem, conforme Parte Experimental) para verificar a
existência ou não de atividade significativa. Os resultados dessa triagem estão
apresentados na
Tabela 14.
Tabela 14.
Triagem da ação moluscicida dos extratos brutos e frações
glicoalcaloidais das seis espécies do gênero
Solanum
Espécies de
Solanum
Amostras
testadas
Diâmetro dos
caramujos
(mm)
Concentrações
testadas (
µg/ml)
Mortalidade
(%)
Atividade
S. seaforthianum
Extrato 12-13 100
50
0
0
Inativo
S. seaforthianum
Fração 12-13 100
50
100
40
Ativo
Ativo
S. crinitum
Extrato 11-12 100
50
100
0
Ativo
Inativo
S. crinitum
Fração
11-12
100
80
70
5 0
100
Ativo
S. lincocarpum
Extrato 9-10 100 0 Inativo
S. lincocarpum
Fração 9-10 100 0 Inativo
S. americanum
Extrato 9-10 100 0 Inativo
S. americanum
Fração 9-10 100 0 Inativo
S. variable
Fração 9-10 100 0 Inativo
S. capsicoides
Extrato 9-10 100 0 Inativo
De acordo com os resultados observados na Tabela 14, verificou-se que apenas
as frações glicoalcaloidais de
S. seaforthianum e S. crinitum, apresentaram atividade
moluscicida significativa, o que nos levou a realização dos ensaios definitivos com
essas amostras.
Os ensaios definitivos foram realizados, segundo metodologia detalhada
descrita na Parte Experimental, utilizando concentrações que variaram entre 40 a 1
µg/mL, em duplicata para cada dose, sendo cada experiência realizada com 20
caramujos. A contagem dos caramujos mortos e vivos foi realizada após 48 horas,
mantendo-se os ensaios em observação por mais 24 horas. Os gráficos dos valores dos
log das doses versus os percentuais de caramujos mortos possibilitaram a obtenção dos
valores de DL
50
, após o tratamento estatístico pelo método dos Probitos (BIER, 1965),
sendo posteriormente submetidos à regressão linear. A
Tabela 15 mostra os valores de
DL
50
obtidos para as frações glicoalcaloidais de S. crinitum e S. seaforthianum frente
aos caramujos.
Tabela 15. Valores de DL
50
para as frações glicoalcaloidais de S. crinitum e S.
seaforthianum frente a Biomphalaria glabrata.
Espécie
DL
50
(µg/mL)
Coeficiente de
correlação
a
S. crinitum
34,70 0,9647
S. seaforthianum
4,90 0,9358
a
Coeficiente de correlação obtido, após regressão linear, na equação para determinar
o valor de DL
50
As frações glicoalcaloidais das espécies S. crinitum e S. seaforthianum
apresentaram atividade moluscicida significativa que pôde ser correlacionada com a
maior toxidez frente a
Artemia salina, uma vez que estas também foram as mais ativas
frente a esse microcrustáceo, indicando a importância do ensaio de toxidez geral.
5.0 CONCLUSÃO
De acordo com os objetivos desse trabalho, pôde-se concluir que:
1 – Das seis espécies de plantas do gênero
Solanum estudadas, apenas Solanum
capsicoides não apresentou fração de glicoalcalóides e Solanum crinitum forneceu o
maior rendimento da fração glicoalcaloidal.
2 - Através de CLAE-EM pôde-se verificar que a fração glicoalcaloidal de
S. crinitum é
constituída por três diferentes glicoalcalódes, que possuem o mesmo esqueleto
esteroidal, variando apenas nas suas unidades de açúcar. Esta técnica também permitiu
confirmar a semelhança química entre as frações de glicoalcalódes de
S. crinitum
coletada em Seropédica-RJ e em João Pessoa-PB, pois os cromatogramas apresentaram
o mesmo perfil.
3 - Nas reações de esterificação da solasodina realizadas pela técnica tradicional não foi
observado a formação do produto, o que nos levou a buscar novas metodologias. Das
metodologias sintéticas testadas, as reações em que foram utilizados ZnCl
2
, imidazol e
H
2
SO
4
sob irradiação em forno de microondas, respectivamente, forneceram o éster
cinâmico da solasodina, que foi confirmado através de CG-EM.
4 - Os ensaios frente à
Artemia salina Leach mostraram que, tanto os extratos brutos
como as frações glicoalcaloidais apresentaram toxidez significativa, sendo as frações de
S. seaforthianum e de S. crinitum, as mais tóxicas.
5 - Diante do ensaio moluscicida frente à
Biomphalaria glabrata, todos os extratos
brutos e algumas das frações glicoalcaloidais não apresentaram atividade significativa.
Porém, as frações de
S. seaforthianum e S. crinitum, mostraram-se bastante ativas,
podendo este efeito ser correlacionado aos resultados do ensaio de toxidez geral.
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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