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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA - UNICAMP
Moura, Cláudia de
M865c Caracterização de amostras de Escherichia coli
isoladas de bezerros com e sem diarréia: pesquisa de
fatores de colonização e toxinas / Cláudia de Moura.—
Campinas, SP: [s.n.], 2005.
Orientador: Domingos da Silva Leite.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de
Campinas, Instituto de Biologia.
1. Escherichia coli. 2. Diarréia. 3. Bovino.
4. Reação de cadeia da polimerase. 5. Virulência
(Microbiologia). I. Domingos da Silva Leite.
II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de
Biologia. III. Título.
Título em inglês: Characterization of Escherichia coli strains isolated of diarrheic and
healthy calves: a colonization factors and toxins study.
Palavras-chave em inglês (Keywords): Escherichia coli, diarrhea, calves, PCR,
virulence factors.
Área de Concentração: Microbiologia.
Banca Examinadora: Domingos da Silva Leite, Tomomasa Yano, Sérgio Mendonça.
Data da defesa: 11/04/2005.
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“Nunca se vence uma guerra lutando sozinho...”.
(Raul Seixas)
4
Dedico este trabalho a meu
pai Mario Roberto Camargo
de Moura, em homenagem
póstuma, pois a sua garra
ainda reina em mim.
5
Reconhecimento
À minha mãe, Dusolina Romancini de Moura por tudo que fez por mim, pela
paciência, tolerância e apoio incondicional, mesmo quando eu “chutava o balde” (com
certeza você terá um lugarzinho reservado no céu, ao lado de todos os anjos
bondosos...);
Ao Henrique R. de Oliveira, meu candeeiro, por dizer que me ama todos os dias;
6
Agradecimentos
Agradeço:
Ao Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, pela orientação, preocupação, paciência, consideração e
acima de tudo por acreditar na minha capacidade. A ele, toda minha admiração;
Ao Prof. Dr. Tomomasa Yano, chefe do Depto. Microbiologia e Imunologia, pela grande ajuda
em pré-banca e banca examinadora;
A Profa. Dra. Maria Silvia Viccari Gatti, não apenas como exemplo de profissional que é, mas
por tudo que me ensinou, em todos os sentidos, pela orientação nos momentos de necessidade (e
que não foram poucos...), incentivo no PED, pela grande ajuda em pré-banca e por me dar o
prazer de desfrutar de sua amizade;
Ao Prof. Dr. Sérgio Mendonça, pelo aceite de convite de banca examinadora;
Ao Prof. Dr. Marcelo Brocchi, pela orientação em pré-banca;
Aos funcionários Erivaldo Silva, Ana Lucia Soledade, Sandra Martins, Mirtis Ferraz e Evandro,
pelos ensinamentos, pois sem eles eu não conseguiria seguir meu caminho, e pela grande
amizade que construímos;
Aos colegas de Departamento: Cris, Monique, Patrícia, Jaqueline, Mario Paulo, pela amizade e
por todas as horas agradáveis que passamos juntos;
Ao amigo Geórgio F. Valadares, pela ajuda e principalmente pela nossa amizade, que espero
durar para sempre;
A minha amiga Daniela Ceratti pelo apoio moral e sempre me incentivando quando achei que
nada iria dar certo;
Aos meus familiares, por se orgulharem de mim;
Aos meus amigos, Cristina, Claudemir, Éder, Erick e todos da turma da Ponte São João, pois
tudo seria mais difícil sem grandes pessoas a minha volta;
As amigas Edilaine e Andréia, pelas longas conversas e pela força que me deram sempre, foi
como uma luz no fim do túnel;
A Universidade Estadual de Campinas, por promover o crescimento, a maturidade e o
conhecimento a todos os alunos;
A Pontifícia Universidade Católica de Campinas, por me apresentar ao fascinante mundo da
Biologia;
7
A Profa. Dra. Rosemary, por me incentivar ao estudo em Microbiologia;
Ao CNPq, pelo apoio financeiro;
E a todos que, direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
8
Índice Geral
Índice de Quadros e tabelas...........................................................................................................11
Lista de Abreviaturas.....................................................................................................................12
Resumo..........................................................................................................................................13
Abstract..........................................................................................................................................14
1. Introdução..................................................................................................................................15
1.1. Diarréia e Disenteria em bezerros...............................................................................15
1.2. Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC).................................................................17
1.3. Escherichia coli produtoras de lesão “attaching and effacing” (AEEC)....................21
1.4. Escherichia coli produtoras de toxinas.......................................................................25
1.4.1. Escherichia coli produtoras de verotoxigênica (VTEC e EHEC)................25
1.4.2. Escherichia coli produtoras de Fator Necrosante Citotóxico (NTEC)........27
1.5. Escherichia coli Enteroagregativas (EAEC)...............................................................32
2. Objetivos....................................................................................................................................35
3. Material e Métodos....................................................................................................................36
3.1. Amostras de Campo....................................................................................................36
3.2. Amostras Padrão.........................................................................................................36
3.3. Obtenção do DNA bacteriano.....................................................................................37
3.4. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)....................................................................37
9
3.5. Ensaios para a detecção de Hemolisina e Enterohemolisina em amostras de E.
coli .....................................................................................................................................40
3.6. Detecção da atividade da Verotoxina em ensaios de citotoxicidade celular...............40
3.6.1. Preparo das amostras....................................................................................40
3.6.2. Preparo da linhagem celular.........................................................................40
3.7. Determinação dos Sorogrupos....................................................................................41
3.8. Análise Estatística.......................................................................................................42
4. Resultados..................................................................................................................................43
4.1. Detecção de Fatores de Colonização (FC)..................................................................43
4.2. Detecção de Toxinas...................................................................................................44
4.3. Determinação dos Sorogrupos....................................................................................44
4.4. Associação de Fatores de Virulência e Sorogrupos....................................................45
5. Discussão...................................................................................................................................54
6. Conclusões.................................................................................................................................65
7. Referências Bibliográficas.........................................................................................................67
10
Índice de Quadros e Tabelas
Quadro 1. Seqüências de oligonucleotídeos utilizadas por iniciadores para ensaios de PCR e
tamanho (pb) expressados por amplificados..................................................................................38
Quadro 2. Temperaturas de anelamento para iniciadores dos fatores de virulência pesquisados
por PCR..........................................................................................................................................39
Tabela 1. Número de amostras totais e fatores de colonização em amostras de Escherichia coli
isoladas de bezerros com e sem diarréia........................................................................................47
Tabela 2. Toxinas em amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com e sem
diarréia...........................................................................................................................................48
Tabela 3. Sorogrupos de amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com e sem
diarréia...........................................................................................................................................49
Tabela 4. Distribuição de sorogrupos em amostras de Escherichia coli com e sem
diarréia...........................................................................................................................................49
Tabela 5. Associação de fatores de colonização e toxinas em amostras de Escherichia coli eae+
isoladas de bezerros com e sem diarréia........................................................................................50
Tabela 6. Associação dos fatores de colonização e toxinas em amostras de Escherichia coli eae-
isoladas de bezerros com e sem diarréia........................................................................................51
Tabela 7. Associação de sorogrupos com fatores de virulência em amostras de Escherichia coli
eae+ isoladas de bezerros com e sem diarréia...............................................................................52
Tabela 8. Amostras de Escherichia coli eae- : Associação de sorogrupos com fatores de
virulência ......................................................................................................................................53
11
Lista de Abreviaturas
AAF: Fímbria de aderência agregativa
AEEC: E. coli causadora de lesão Attaching and Effacing
BFP: Bundle-forming pillus
CDT: Toxina Citoletal Distensora
CNF: Fator Necrosante Citotóxico
EAEC: E. coli Enteroagregativa
EAF: E. coli Aderence Factor
EAST1: Toxina Termo-estável de E. coli Enteroagregativa
EHEC: E. coli Enterohemorrágica
EPEC: E. coli Enteropatogênica
ETEC: E. coli Enterotoxigênica
Ehly: Enterohemolisina
FC: Fator de Colonização
FV: Fator de Virulência
GC-C: Guanilato ciclase C
HC: Colite Hemorrágica
Hly: Hemolisina
HUS: Síndrome Urêmica Hemolítica
LEE: Lócus of Enterocyte Effacement
LT: Toxina Termo-lábil
Lesão A/E: Lesão Attaching and Effacing
NTEC: E. coli produtora de Fator Necrosante Citotóxico
STa: Toxina Termo-estável tipo a
STb: Toxina Termo-estável tipo b
VT: Verotoxina
VTEC: E. coli produtora de Verotoxina
12
Resumo
Infecções por Escherichia coli são uma das maiores causas de diarréia em animais, entre
eles os bezerros, sendo assim responsáveis por importantes danos econômicos na pecuária. Em
nosso trabalho 58 E. coli originárias de bezerros com diarréia e 43 E. coli isoladas de bezerros
sem diarréia, foram analisadas por ensaios de PCR (reação da polimerase em cadeia) quanto à
presença dos genes para fatores de virulência eae, EAF, K99, F41, CS31A, F17, STa, LT-II,
VT1, VT2, Hly, Ehly, CDT, CNF1, CNF2 e EAST1. Foram também realizados ensaios de
citotoxicidade em células Vero para a expressão da Verotoxina (VT) e testes sorológicos para
determinação dos sorogrupos. Os fatores de colonização (FC) foram detectados em 31 amostras,
sendo 28 originárias de bezerros com diarréia e três amostras de bezerros sadios, onde 26 foram
CS31A e onze F17, com seis delas apresentando CS31A/F17 associados. O gene eae esteve
presente em 43 E. coli, sendo 35 isolados de animais com diarréia. Os FC K99, F41 e EAF não
foram detectados. Quanto às toxinas pesquisadas, a mais freqüente foi a toxina VT1 presente em
43 E. coli, sendo 24 de origem de animais diarréico e 19 de bezerros sadios. Quarenta amostras
foram EAST1, com 17 amostras foram isoladas de bezerros com diarréia, dez amostras foram
VT2+ com seis delas isoladas de bezerros saudáveis. Oito amostras foram Ehly, seis CDT,
quatro CNF2 e apenas duas LT-II. Nenhuma amostra foi positiva para Hly, STa e CNF1. A
expressão fenotípica de VT e Ehly foram confirmadas em ensaios in vitro. Onze amostras foram
negativas para todos os fatores de virulência pesquisados. Vinte amostras mostraram associação
eae/VT1 e 13 foram CS31A/VT1. Foram detectados 35 sorogrupos entre as E. coli estudadas. A
associação entre CS31A e VT1 não tinha sido descrita na literatura até o presente momento e a
grande associação entre o gene eae e a toxina VT1 mostram que bezerros podem ser
considerados como reservatórios de VTEC.
13
Abstract
Infections caused by Escherichia coli are the most cause of diarrhea in animals, bovines
and cattle, being thus responsible for important economic losses in farms. In this work, 58 strains
isolated from calves with diarrhea and 43 strains isolated from healthy calves were studied for
PCR analysis about the virulence factors eae, EAF, K99, F41, CS31A, F17, STa, LT-II, VT1,
VT2, Hly, Ehly, CDT, CNF1, CNF2 and EAST1. We utilized techniques in vitro for the VT and
Ehly production and serological assays for detecting serogroups. Of the studied strains, 31 of
them were positive for colonization factors, being 28 isolated from diarrheic calves and five
isolated from healthy calves, where 26 were CS31A+, eleven F17 and an association between
CS31A/F17 was found in six strains from diarrheic calves. The eae gene was present in 43
strains, where 35 were isolated from calves with diarrhea and no E. coli were positive for the FC
K99, F41 and EAF. About the toxin genes, the most frequent was VT1 in 43 strains, being 24 of
diarrheic origin and 19 from healthy calves. Forty strains were EAST1, with of them 17 isolated
from diarrheic calves, ten strains were VT2, being six isolated from healthy calves. Eight strains
were Ehly, six CDT, four CNF2 and only two strains LT-II. Twenty E. coli showed association
of eae/VT1 and 13 are CS31A/VT1 positive. No strains were positive for STa, Hly and CNF1.
The production of VT and Ehly were positive in in vitro assays. Eleven strains were negative for
all the genes probes. We detected 35 serogroups between E. coli studied. To our knowledge, this
is the first description of an association between CS31A and VT1. The association between eae
gene and VT1 toxin show that calves should be considered VTEC reservoir in Brazil for human
infection.
14
1. Introdução
1.1. Diarréia e disenteria em bezerros
A diarréia em bezerros jovens (primeiras três semanas após o nascimento) é um sintoma
clínico muito comum, envolvendo a interação de um ou mais microrganismos patogênicos
(agentes bacterianos, virais ou protozoários), o sistema imune do animal e um ou mais fatores
ambientais, como o tipo de alojamento dos animais, a alimentação e as condições de higiene a
que são submeticos. Estudos realizados pelo Departamento de Agricultura nos Estados Unidos
no final da década de 70 estimaram que patógenos entéricos matavam a cada ano cerca de 25%
dos bezerros nascidos no país. Estimativas mais recentes consideram que a taxa de mortalidade
total de bezerros durante o período neonatal oscila, de um ano para outro, entre 5 e 10% e em
uma fazenda individual a taxa pode variar de 3 a 30% (Garcia et al., 1999). As diarréias agudas
são a principal causa da mortalidade neonatal em bezerros, estimando-se que sejam responsáveis
por aproximadamente 75% das mortes de bezerros menores de três semanas de idade (Garcia et
al., 1999).
Observações de campo sugerem que as enfermidades que afetam os bezerros durante os
três primeiros meses de vida podem acarretar seqüelas para longo prazo. Assim, há sugestão de
que bezerros que sobreviveram a episódios clínicos de diarréia podem estar afetados por alguns
efetores residuais mais prolongados sobre o crescimento, a eficácia produtiva e a produção de
leite. Um exemplo é um estudo realizado por Waltner-Toews e colaboradores em 1986 em 34
granjas de produção de leite, verificando a probabilidade de atraso no primeiro parto de novilhas
tratadas contra diarréia. O primeiro parto normal de uma novilha se dá entre os 22 e 24 meses de
15
vida. Quando tratadas contra diarréia, verificou-se que a chance de nascimento dos bezerros
depois dos trinta meses de vida triplicou.
É estimado que Escherichia coli, rotavírus, coronavírus e Criptosporidium spp juntos
sejam responsáveis por 75 a 95% de todos os casos de diarréia em bezerros, em todo o mundo.
Nos últimos anos, E. coli Verotoxigênica (VTEC) tem sido associada à diarréia e disenteria em
bezerros de duas a oito semanas de idade (Butler & Clarke, 1994).
O reconhecimento de E. coli como um patógeno gastrointestinal é recente. Contudo, E.
coli é encontrada como membro integrante da microbiota de mamíferos e eventos de
transferência gênica horizontal têm mostrado que amostras de E. coli comensais se tornaram
patogênicas, geralmente pela aquisição de ilhas de patogenicidade (Clarke, 2001).
A colibacilose entérica representa uma das mais comuns síndromes e muito raros são os
casos de colapso e morte de animais. A primeira descrição de Escherichia coli como agente
causador de diarréia foi feita por Smith & Halls em 1967 envolvendo E. coli enterotoxigênica
(ETEC) como a causa de diarréia em bezerros. Este fato mostra que ETEC tem um envolvimento
etiológico na colibacilose entérica (Butler & Clarke, 1994). Há também uma ação sinérgica entre
infecções por ETEC e rotavírus em bezerros. Experimentalmente, a maioria dos estudos
comprovam a existência deste sinergismo. Hess e colaboradores em 1984, em estudo mais
detalhado realizado sobre a ação sinérgica entre ETEC e rotavírus, comprovaram que, bezerros
livres de patógenos quando infectados com ETEC não apresentaram sintomas clínicos e a
infecção única com rotavírus ocasionava uma ligeira diarréia. A infecção simultânea com ambos
os agentes levava a uma diarréia grave.
No início dos anos 80 uma nova classe de E. coli causadoras de diarréia em bezerros foi
identificada como E. coli produtoras de verotoxina (VTEC).
16
A evolução no estudo do envolvimento de E. coli em doenças entéricas de bezerros tem
sido paralela a pesquisas similares feitas com outros animais, incluindo seres humanos (Butler &
Clarke, 1994) e vários grupos de E. coli vêm sendo associados também à diarréia em bezerros.
Os principais grupos são: Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), Escherichia coli
enteropatogênica (EPEC), Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), Escherichia coli
verotoxigênica (VTEC), Escherichia coli necrotoxigênica (NTEC), Escherichia coli causadora
de lesão Attaching and Effacing e Escherichia coli enteroagregativa (EAEC).
1.2. Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC)
Doenças entéricas causadas por ETEC são a forma mais comum de colibacilose que
ocorre em bovinos e em suínos, podendo também ocorrer em humanos, com menor intensidade
em cães e gatos e pouco se sabe sobre a ocorrência de diarréia causadas por ETEC em pássaros
ou répteis. A colibacilose que acomete animais de interesse comercial, principalmente na
pecuária, é de muito interesse, pois E. coli enterotoxigênica a elas associadas podem estar
intimamente relacionadas com doenças em seres humanos (Nagy & Fekete, 1999).
Segundo Blanco & Blanco (1993) em animais domésticos a colibacilose causada por
ETEC é muito freqüente, representando um grande problema em rebanhos de suínos, bovinos e
ovinos. Dois atributos caracterizam ETEC: a colonização da porção inferior do intestino e a
produção de enterotoxinas, dentre elas a toxina termo-lábil (LT) e a toxina termo-estável (ST)
(Nataro & Kaper, 1998). ETEC são comumente encontradas colonizando o intestino delgado de
animais recém-nascidos ou muito jovens. Dentre os fatores de colonização relatados como
associados à colibacilose bovina destacam-se K99, F41, F17, CS31A, entre outros (Bertin et al.,
1998; Frank et al., 1998; Orden et al., 1999).
17
Os de fatores de colonização (fímbrias ou pili) podem variar morfologicamente,
biologicamente e antigenicamente entre as linhagens de Escherichia coli (Nagy & Fekete, 1999)
e um fato interessante é que a resistência à infecção por este grupo de bactérias está relacionada,
entre outros fatores, a idade do animal, ou seja, com o avanço da idade a resistência à infecção
aumenta (Butler & Clarke, 1994).
A grande maioria das ETEC que podem causar diarréia em bezerros expressa
fímbrias K99 (F5) e F41, onde K99 ocupa a posição principal entre os fatores de colonização,
mediando a adesão da bactéria na microvilosidade intestinal, sendo que K99 e F41 algumas
vezes são produzidos simultaneamente por ETEC. Os receptores para K99 e F41 e mesmo os
genes de regulação da expressão são diferentes, sendo que genes de regulação de K99 são
encontrados em plasmídios, enquanto que para F41 estão presentes no cromossomo bacteriano
(Butler & Clarke, 1994).
A fímbria K99 tem natureza fibrilar, onde a estrutura principal apresenta um sítio ligante
de receptor exposto no topo da fímbria. Análise genética mostra que K99 é expresso por um
único operon fan inserido num plasmídio que apresenta tanto genes de expressão como
regulatórios e subunidades menores são necessárias para a montagem da estrutura fímbrial. Seu
receptor no enterócito é o Neu 5Gc-α(2-3)Galp-β(1-4)Glcp-β(1-1)-ceramida enquanto que o
receptor para a fímbria F41 é o N-acetilgalactosamina (Butler & Clarke, 1994).
Outra adesina menos freqüente encontrada em ETEC isoladas de bezerros é a fímbria F17
(anteriormente conhecida como FY ou Att25), que pode ou não estar associada à presença de
enterotoxinas. A adesão mediada por esta proteína de superfície é dependente da presença de
receptores glicoprotéicos, facilmente encontrados em bezerros e carneiros, que como no caso de
K99, vão diminuindo com o avanço da idade. F17 apresentam formas heterogêneas, formando
assim uma família de fímbrias F17, baseada na especificidade de receptores, sendo o operon
18
codificante inserido em plasmídio (Nagy & Fekete, 1999). A família de fímbrias F17 inclui
quatro variantes antigênicas (F17a, F17b, F17c e F17d), cuja proteína componente da subunidade
principal é codificada por f17A, e a adesina responsável em promover a ligação com o receptor
nos enterócitos (N-acetil-glucosamina) é codificada por f17G, cujas diferenças a afinidade de
receptores têm sido observadas em todas as variantes (Contrepois et al., 1998; Mainil et al.,
2000).
Outro fator de colonização que poderia estar relacionado a quadro diarréico em bezerros é
a adesina afimbrial CS31A. Esta adesina foi descrita pela primeira vez em amostras isoladas de
bezerros com septicemia e diarréia e vem sendo associada a estes quadros, diferentemente de
K99 e F41. CS31A é geneticamente associada à fímbria K88, expressa por ETEC de suínos, e
promove a adesão através do receptor N-acetilneuramínico (Bertin et al., 1998). Sua estrutura
antigênica é muito diferenciada de fímbrias típicas e aparenta ter um material capsular ao redor
da bactéria. O operon codificante de CS31A clp está inserido no cromossomo bacteriano, sendo
que clpG codifica a subunidade principal da fibrila. Este operon apresenta grande similaridade
com o operon codificante de K88 e menor similaridade ao operon de F41. Em estudos realizados
anteriormente, antígenos relacionados a CS31A estão sendo encontrados em amostras de
Escherichia coli isolados de pacientes hospitalizados com casos graves de diarréia e infecções
nosocomiais causados por Klebisiella pneumoniae, mostrando a possibilidade de transferência
horizontal de genes (Bertin et al., 1998). Bertin et al. (2000) relatam ainda que uma proteína de
17,5 kDa produzida por uma linhagem referência de CS31A seria uma subunidade estrutural
muito semelhante à fímbria F165 presente em E. coli isoladas de porcos com septicemia e à
fímbria P encontrada em E. coli isoladas de humanas com infecções do trato urinário. Este
trabalho demonstra que o operon pap (codificante da fímbria P) pode estar distribuído entre
algumas amostras diarreogênicas, sendo o responsável pela colonização da bactéria em sítios
19
extraintestinais. Além deste fato, o operon pap está altamente associado a amostras isoladas de
bovinos que produzem CS31A e F17, daí o entendimento de amostras produtoras de CS31A
serem também isoladas de septicemia em bezerros.
Além de fatores de colonização, a enterotoxinas têm sido associada a quadros
diarréicos causados por ETEC (Blanco & Blanco, 1993; Franck, et al., 1998). Neste sentido, a
principal enterotoxina associada a colibacilose causada por ETEC é a toxina termo-estável (ST),
principalmente a do tipo I (STa), também associada a ETEC produtoras das fímbrias K99 e F41.
A toxina termo-lábil (LT), da variante tipo II (LT-II), vem sendo encontrada também em
bezerros com diarréia, mas a sua capacidade de causar diarréia não está comprovada (Nagy &
Fekete, 1999).
As ST são pequenas, monoméricas e cujos genes estão inseridos em plasmídios,
compreendendo duas classes: toxina termo-estável tipo I (STa) e toxina termo-estável tipo II
(STb). O receptor de STa é o guanilato ciclase C (GC-C) e a ligação da toxina no receptor
específico induz em aumento dos níveis de monofosfato guanilato cíclico (cGMP), levando à
estimulação na secreção de cloro ou à inibição da absorção de sódio com subseqüente secreção
de fluidos intestinais (Clarke, 2001). STa é uma peptídeo de 18 aminoácidos, com massa
molecular de 2kDa e não imunogênico. Seu gene estrutural estA está localizado em um plasmídio
e está associado a um transposon (Nataro & Kaper, 1998).
Já a toxina STb também é codificada por um gene inserido em plasmídio (estB) e este
gene expressa um peptídeo de 48 aminoácidos. O receptor de STb não é conhecido, mas ela
causa mudanças morfológicas nas vilosidades celulares intestinais(Nataro & Kaper, 1998).
As LT são toxinas oligoméricas e consistem em dois grupos denominados LT-I e LT-II
(Nataro & Kaper, 1998). LT-I é relacionada à toxina colérica produzida por Vibrio cholerae e é
composta por uma subunidade A e cinco subunidades B idênticas que se ligam ao gangliosídeo
20
GM
1
. A subunidade A é responsável pela atividade enzimática da toxina, ativando adenilato
ciclase que resulta num aumento de cAMP cíclico intracelular, diminuindo a absorção de sódio e
levando a uma diarréia osmótica (Clarke, 2001).
A toxina termo-lábil tipo II (LT-II) apresenta aproximadamente 57% de similaridade com
LT-I em relação a subunidade A, mas não apresenta homologia aparente entre as subunidades B.
LT-II aumenta o nível de cAMP cíclico intracelular por mecanismos similares ao de LT-I, mas
LT-II usa GD1 como receptor ao contrário, de LT-I que utiliza GM1. Não existe evidência que
LT-II esteja associada a doenças em humanos ou em animais, mas uma grande porcentagem de
ETEC isolada de animais apresenta genes para expressão desta toxina. LT-I está associada a
ETEC isoladas de humanos e de alguns animais, não estando por outro lado associada com
bovinos (Nataro & Kaper, 1998). Além de adesão e produção de enterotoxinas a patogênese de
ETEC também envolve fatores do hospedeiro, sendo o mais importante deles o tipo de receptor
para tais fatores de virulência bacterianos.
Muitos outros fatores de virulência ligados a ETEC são conhecidos, porém não é
possível dizer o mesmo sobre seus receptores (Nagy & Fekete, 1999).
Em relação aos sorogrupos ligados a ETEC, um número muito limitado pode estar
relacionado a ETEC. Segundo Blanco & Blanco (1993) os sorogrupos característicos de ETEC
em bezerros são O8, O9, O20 e O101.
1.3. Escherichia coli produtoras de lesão “Attaching and Effacing” (AEEC)
Escherichia coli produtoras de lesão “Attaching and Effacing” (A/E) (AEEC) têm sido
implicadas em diarréia e disenteria no homem e vários outros animais, incluindo bezerros de
duas a oito semanas de idade. “Attaching and Effacing” é um termo usado para descrever uma
21
lesão intestinal produzida por este tipo de patógeno: “attaching” indica a adesão íntima da
bactéria no enterócito; “effacing” está relacionado com a adesão localizada na microvilosidade
intestinal.
O mecanismo geral da lesão A/E é caracterizado pela destruição da microvilosidade
intestinal, aderência íntima da bactéria ao epitélio intestinal, formação de pedestal e agregação da
actina polimerizada e outros elementos no sítio da adesão bacteriana (Nataro & Kaper, 1998).
Os principais genes responsáveis por esta lesão estão inseridos no cromossomo
bacteriano, formando uma ilha de patogenicidade denominada “Lócus of enterocyte effacement”
(LEE). Neste fragmento estão incluídos genes que codificam um sistema de secreção do tipo III
e o gene eae, que é responsável pela produção da proteína intimina (Nataro & Kaper, 1998).
Tir, uma proteína translocada pelo canal formado pelas moléculas Esp, é inserida na
membrana da célula alvo para funcionar como receptor para intimina (Trabulsi et al., 2002). Já a
intimina, uma proteína de membrana externa de 94 KDa, é responsável pela adesão íntima entre
a bactéria e a membrana do enterócito. As moléculas Esp (EspA, EspB e EspD), produto da
secreção do tipo III, estão envolvidas na formação de um canal de ligação entre a bactéria e a
célula alvo para transporte de moléculas efetoras e o rearranjo do citoesqueleto de actina do
enterócito, formando portanto, um pedestal (China et al., 1999).
Escherichia coli produtoras de lesão A/E abrange dois grupos de E. coli diarreogênicas:
E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enterohemorrágica (EHEC) (China et al., 1999).
Infecções humanas por EPEC podem ser de origem bovina, que é considerado o maior
foco de infecção. EPEC foi o primeiro grupo de E. coli patogênico a ser descrito nos EUA
associado à diarréia infantil, sendo hoje considerado uma das principais causas de diarréia e
morte infantil nos países desenvolvidos (Nataro & Kaper, 1998).
22
As EPEC, além da ilha de patogenicidade LEE, podem apresentar ainda um plasmídio
entre 50-70 MDa chamado “EPEC aderence factor” (EAF). Neste plasmídio está inserida uma
sequência de treze genes envolvidos na expressão e montagem de um pili do tipo IV,
denominado “bundle-forming pillus” (BFP), (que é responsável pela aderência localizada da
bactéria na membrana do enterócito). A expressão e montagem de BFP requerem elementos
regulatórios, como a proteína Per e um gene cromossomal dsbA, que codificam uma enzima
periplasmática que medeia a formação de pontes de dissulfeto (Nataro & Kaper, 1998).
O plasmídio EAF não é essencial para a formação da lesão attaching and effacing,
contudo sua presença aumenta a eficiência da lesão, provavelmente pela influência dos genes
regulatórios (per A, B C) que aumenta a expressão dos genes presentes no locus LEE (Frankel et
al., 1998).
Existem amostras de EPEC que não apresentam o plasmídio EAF, as quais são
denominadas EPEC atípicas. Deste modo, a diferença básica entre uma EPEC típica e uma
atípica é a presença ou não do plasmídio EAF (Trabulsi et al., 2002).
Segundo Albert et al., (1996), algumas linhagens de E. coli que apresentam fatores de
virulência ligados a EPEC podem produzir uma toxina denominada Toxina Citoletal Distensora
(CDT). Contudo, a associação de CDT com o quadro de diarréia não está ainda muito clara
(Clarke, 2001).
Os sorogrupos de EPEC relacionados com quadro de infecção humana são bem
caracterizados. Doze deles são reconhecidos pela Organização Mundial de Saúde: O26, O55,
O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142 e O158. Nestes sorogrupos estão
incluídas tanto EPEC típicas como EPEC atípicas, bem como outras categorias de E. coli
diarreogênicas, como E. coli enteroagregativa (EAEC) (Trabulsi et al., 2002). Tais sorogrupos
também podem ser encontrados em amostras bovinas.
23
Um outro grupo de Escherichia coli causadoras de diarréia, as E. coli enterohemorrágicas
(EHEC), como dito anteriormente, apresentam em seu cromossomo a ilha de patogenicidade
LEE, onde está inserido o gene eae responsável pela produção de intimina e conseqüentemente,
da lesão A/E, porém, EHEC não apresentam o plasmídio EAF, mas possuem genes para
produção de verotoxinas, o que as exclui totalmente do grupo das EPEC (Paton & Paton, 1998).
O mecanismo de aderência de EHEC não está muito bem descrito, mas algumas possíveis
adesinas têm sido a elas relacionadas. Uma região cromossomal de seis seqüências gênicas
(lpfABC´CDE), muito semelhante a um operon que codifica uma fímbria de Salmonella sorotipo
typhimurium foi identificado em EHEC do sorotipo O157:H7, bem como genes cromossomais
que codificam uma proteína muito semelhante a IrgA de Vibrio cholerae que pode conferir poder
de adesão em células em cultura (Szalo et al., 2002).
Análises sorológicas deste grupo bacteriano mostram o sorotipo O157:H7 considerado
como o mais virulento e também o mais comum envolvido em quadros de Colite Hemorrágica
(HC) e Síndrome Urêmica Hemolítica (HUS) em humanos. Blanco et al. (2001) ressaltam os
sorogrupos O103, O118 e O145 como patógenos emergentes causadores de HUS. No Brasil,
infecções humanas por O157:H7 têm sido restritas a diarréias não sanguinolentas,
particularmente em crianças muito jovens. Contudo, O157:H7 tem sido identificada em animais,
inclusive no rebanho bovino. Cerqueira et al. (1999) foram os primeiros a verificar O157:H7 em
E. coli isoladas de bovinos no Rio de Janeiro, Brasil. Moreira et al. (2003) encontraram 67% das
amostras de E. coli isoladas no Sul do Brasil como O91 e O157. Recentemente, Irino et al.
(2005) encontraram O157:H7 estudando amostras de E. coli isoladas de bovinos em São Paulo.
24
1.4. Escherichia coli produtoras de toxinas
1.4.1. Escherichia coli produtoras de verotoxinas (VTEC e EHEC)
E. coli verotoxigênica se refere a todas as amostras capazes de produzir toxinas que
apresentam efeito citotóxico em células Vero em cultura: Escherichia coli produtoras de
Verotoxina (VTEC) e E. coli Enterohemorrágica (EHEC). Podem produzir dois tipos de
verotoxinas, VT1 e/ou VT2. A Verotoxina tipo 1 (VT1) é funcional e estruturalmente
relacionada com a Toxina de Shiga sintetizada por Shigella dysenteriae tipo I. VT1 e VT2
também são conhecidas como Toxina Shiga-like (Stx) (Orden, 2002). VT1 e VT2 apresentam
aproximadamente 60% de homologia de DNA e são imunologicamente distintas (Agbodage,
1999).
Kaper et al. (2004) relatam que amostras produtoras de VT são consideradas como VTEC
e, se além de apresentarem genes para esta toxina apresentarem LEE em seu cromossomo, são
consideradas então EHEC.
A Verotoxina foi descoberta pela primeira vez em E. coli em 1977 por Konowalchuk et
al. (1977), observando filtrados de sobrenadantes bacterianos em ensaios de citotoxicidade em
células Vero (células de rim de macaco verde africano).
As VTs são holotoxinas de aproximadamente 70 KDa, onde a subunidade A (32 kDa) é
catalítica e uma subunidade B pentamérica (aproximadamente 7,7 kDa por monômero) se liga ao
receptor dos enterócitos. Uma vez ligada, a toxina é internalizada por processo de endocitose e
vesículas contendo a toxina são formadas. Em algumas células há a fusão das vesículas com o
lisossoma e a toxina é degradada. Em outras, a toxina é processada via complexo de Golgi e
retículo endoplasmático, onde a subunidade A é quebrada por uma protease gerando dois
fragmentos, A1 e A2, de 27 e 4 kDa, respectivamente. A subunidade A1 tem atividade RNA N-
25
glicosidase, que cliva a porção 28S ribossomal da célula alvo. Esta clivagem inibe a ligação de
amino acil-tRNA na porção 60s ribossomal, inibindo a síntese protéica da célula (Paton & Paton,
1998; Law, 2000). VT1 e VT2 ligam-se ao receptor globotriosilceramida (Gb3) da célula
eucariótica, resultando em efeito citotóxico. Portanto, a diarréia sanguinolenta se dá não por
alteração osmótica dos enterócitos, e sim pela destruição da camada de células absortivas
presentes no epitélio intestinal (Agbodaze, 1999).
Os genes que codificam VT estão inseridos no cromossomo bacteriano através de fagos
temperados, sendo um único operon que apresenta estruturas comuns, constituindo de apenas
uma unidade transcricional, codificando primeiro a subunidade A e depois as subunidades B
(Paton & Paton, 1998).
Em diversos países, quando analisados os sorogrupos prevalentes ligados a VTEC,
observa-se uma grande diversidade de sorotipos. Mais de 125 diferentes sorogrupos têm sido
observados, porém com um número limitado frequentemente relacionados a amostras de VTEC
(O2, O5, O8, O20, O22, O26, O45, O82, O91, O103, O116, O153, O156, O171, O172, O174)
comumente encontrados em bezerros em diferentes países (Blanco et al., 2001).
Um outro fator que pode também aumentar a virulência de VTEC, além da expressão de
VT, é a produção de uma hemolisina denominada Enterohemolisina (hemolisina de E. coli
enterohemorrágica, Ehly), codificada por genes inseridos em um plasmídio de aproximadamente
60 MDa (Blanco et al., 2001). Enterohemolisina caracteriza-se por produzir pequenas zonas de
hemólise (hemólise tipo α ou parcial) após 24-48 hs de incubação quando inoculadas em ágar
contendo hemácias previamente lavadas, diferentemente da α-hemolisina de E. coli, que
apresenta hemólise total (do tipo β ou completa) após 4 horas de incubação, e ainda, sem a
necessidade de serem inoculadas em meios de cultura com hemácias previamente lavadas (Law,
2000).
26
O envolvimento da Ehly com doenças intestinais ainda não está muito bem determinado e
também é desconhecido seu papel em infecções humanas, pois não há relatos sobre o
envolvimento de Ehly com casos de HUS e HC. Porém existem indícios de que a relevância
desta toxina na infecção animal seja importante. Contudo, o operon ehx é altamente conservado,
levando a crer de que a toxina tenha papel fundamental no poder infeccioso de VTEC (Law,
2000).
Há uma sugestão de que a Ehly poderia aumentar o potencial citotóxico da Verotoxina e
poderia ser considerado também um marcador de diagnóstico de VTEC numa infecção intestinal
(Nataro & Kaper, 1998; Leomil, et al., 2003). Investigações em vários países na Europa, Ásia e
América do Norte mostram que 10 a 80% dos bezerros estão infectados por VTEC, mas no
Brasil esta porcentagem ainda é desconhecida. E ainda, amostras produtoras apenas de VT1, e
que possuem o gene eae necessário para causar a lesão A/E, são atributos suficientes para causar
diarréia em bezerros (Leomil et al., 2003).
Nas EHEC, além da produção de VTs e de Ehly, outros fatores de virulência estão
associados, como a presença de LEE (Blanco et al., 2001). EHEC não carregam o plasmídio
EAF (E. coli aderence factor), não codificando, portanto, o pilus tipo IV BFP (bundle forming
pillus) (Paton & Paton, 1998).
O mecanismo exato de adesão destes patógenos (EHEC) ainda é incerto e estudos mais
aprofundados seriam necessários para se avaliar o envolvimento da intimina neste processo de
adesão, e de possíveis outros mecanismos ainda não conhecidos por parte do grupo das EHEC
(Law, 2000). Estão sendo descritas algumas adesinas que podem ter papel importante na adesão
desta bactéria. A adesina ToxB, codificada por um plasmídio de 93kb, está presente em EHEC
O157:H7 e em outros sorotipos. Esta proteína apresenta seqüência muito semelhante à família de
toxinas de Clostridium, proteína LifA de EPEC e proteína Efa-1, que estão sendo consideradas
27
adesinas expressadas por EHEC (Kaper et al., 2004). Este plasmídio também codifica toxinas
RTX, que são similares à hemolisina de E. coli Uropatogênica, EspP protease e proteína StcE.
Esta última cliva o inibidor de protease C1 da via do complemento e pode contribuir
potencialmente para o dano no tecido alvo, edema e anormalidades características de infecções
por EHEC (Kaper et al., 2004).
Porém, EHEC também apresenta outros fatores de virulência que podem ser considerados
marcadores para a distinção entre EHEC e VTEC, como a produção da proteína EspB e da
proteína autoaglutinante (Saa) (Paton et al., 2001).
No Brasil, poucos são os relatos e não se sabe ao certo sobre a ocorrência de EHEC
isoladas de bezerros com ou sem diarréia. E ainda, a prevalência de VTEC e EHEC entre as E.
coli isoladas de quadro diarréico no rebanho bovino brasileiro também não está totalmente
descrita.
Há indícios de que VTEC e EHEC são amplamente distribuídas no intestino de bezerros,
porcos, carneiros, búfalos e seus produtos derivados, como leite e carne (Agbodaze, 1999).
Animais domésticos, principalmente bezerros, são considerados como o principal reservatório de
VTEC potencialmente infecciosa para seres humanos. A transmissão ocorre no consumo de
derivados destes animais (leite e carne) ou através da água contaminada por fezes destes
carreadores, uma vez que VTEC são encontrados como parte da sua microbiota (Blanco et al.,
2001). O reconhecimento de VTEC e EHEC como agente etiológico de doença representa um
dos mais importantes avanços no estudo de patógenos entéricos. Vale salientar o fato de que E.
coli verotoxigênicas (VTEC e EHEC) não são apenas agentes casuais de diarréia em algumas
áreas geográficas, mas também agentes significantes de duas enfermidades importantes para
animais e seres humanos, como a Colite Hemorrágica (HC) e Síndrome Urêmica Hemolítica
(HUS) (Agbodaze, 1999).
28
1.4.2. Escherichia coli produtoras de Fator Necrosante Citotóxico (NTEC)
Escherichia coli necrotoxigênica (NTEC) é uma categoria emergente de bactérias
potencialmente patogênicas. Estão definidas tendo como base a produção de uma ou mais
toxinas denominadas CNF (fator necrosante citotóxico), tipo 1 ou tipo 2 (CNF1 e CNF2) (Van
Bost et al., 2001). Estas toxinas foram assim denominadas por possuirem a capacidade de causar
necrose em pele de coelhos, serem letais a ratos e induzirem a multinucleação de células Vero e
HeLa em cultura (De Rycke & Plassiart, 1990; Van Bost et al., 2001). Dois tipos diferentes de
CNF têm sido relatados: CNF1 e CNF2. Linhagens produtoras de CNF1 vêm sendo encontradas
causando enterites em ruminantes, porcos, cães, coelhos e cavalos e infecções extra-intestinais
em porcos, cães, gatos e em humanos (De Rycke et al., 1999). Linhagens produtoras de CNF2
são isoladas freqüentemente de ruminantes com infecções intestinais e septicemias (Van Bost et
al., 2001).
Amostras NTEC produtoras de CNF1 têm sido associadas com infecções extraintestinais
humanas. Amostras NTEC produtoras de CNF2 podem ser isoladas de fezes de uma
porcentagem representativa de bezerros saudáveis. Portanto, a associação de NTEC com o
quadro diarréico de bezerros jovens é muito questionada (Orden et al., 1999).
CNF1 e CNF2 são proteínas monoméricas, de 110 a 115KDa, tendo seu mecanismo de
ação recentemente elucidado. Induzem a desamidação da glutamina 63 da proteína alvo RhoA da
célula eucariótica, produzindo um resíduo glutamato, aumentando o stress da célula alvo e
resultando em aumento de tamanho e geralmente, morte celular (Nataro & Kaper, 1998). O
modo de ação na geração da diarréia ainda não está esclarecido (Nataro & Kaper, 1998).
Os genes de CNF1 estão localizados no cromossomo bacteriano, no mesmo operon que
estão inseridos os genes de expressão de alfa-hemolisina (α-Hly) que, com outros genes de
29
virulência caracterizam a ilha de patogenicidade denominada Pai 5 (De Rycke et al., 1999; Van
Bost et al., 2001). Muitas são as hemolisinas produzidas por E. coli. As hemolisinas clássicas (do
tipo alfa ou beta) são ativas quando testadas em meios de cultura contendo sangue (Agar Sangue)
(Mainil et al., 1999).
CNF2 foi identificada como uma toxina Vir de E. coli, pois os genes responsáveis pela
produção da toxina estão inseridos no plasmídio Vir. Contudo, os genes responsáveis pela
produção de CNF1 estão inseridos no cromossomo bacteriano (Van Bost et al., 2001). Outros
genes para fatores de virulência estão inseridos no plasmídio Vir, como os genes que expressam
a fímbria F17, bem como seus subtipos que compõem a família F17, mas nem todas as amostras
que apresentam tal plasmídio e produzem CNF2, podem produzir a adesina.
Amostras NTEC podem apresentar ainda outros fatores de virulência. A toxina termo-
lábil tipo 2 (LT-II) e a Toxina termo-estável de E. coli Enteroagregativa 1 (EAST1) estão
associadas a NTEC. NTEC produtora de CNF1 pode expressar fímbria P e S e ainda adesina
AFA e CS31A. NTEC produtoras de CNF2 podem expressar além de F17, adesina AFA (Bertin
et al., 1998; Mainil et al., 1999).
Genes responsáveis pela expressão de um subtipo de CDT (toxina citoletal distensora),
denominado CDT-III, estão também inseridos dentro do plasmídio Vir, que pode, portanto ser
produzida tanto por amostras caracterizadas como NTEC como por amostras EPEC descritas há
pouco (Orden et al., 1999; Van Bost et al., 2001).
CDT foi descrita pela primeira vez em E. coli em 1987 por Johnson e Lior como uma
nova toxina entérica. Mais tarde, mostrou-se que a atividade de CDT era similar a toxina
produzida por alguns patógenos como Shigella, Campylobacter, Helicobacter, Actiobacillus,
entre outros (De Rycke & Oswald, 2001; Pickett & Whitehouse, 1999).
30
A estrutura genética de CDT está organizada em um único operon que inclui três genes
adjacentes denominados cdtA, cdtB e cdtC, que codificam proteínas com massa molecular
deduzida de 27, 29, e 20 KDa, respectivamente.
A expressão dos três genes é necessária para a atividade de CDT (De Rycke & Oswald,
2001). Estudo recente mostra que os genes de CDT são carreados por bacteriófagos, que podem
ser inseridos tanto no cromossomo bacteriano como em plasmídios (Janka et al., 2003). Em
modelo animal (camundongo) a CDT foi associada a uma rápida secreção intestinal e a diarréia
observada após 4 horas da inoculação (Okuda et al., 1997). A relação do efeito no modelo
animal com doença no homem e animais ainda é desconhecido, sendo os principais efeitos desta
toxina a capacidade de bloquear o ciclo celular entre a fase G2 e M da célula hospedeira,
causando posteriormente distensão celular e lise. Este evento pode sugerir que CDT seja capaz
de induzir alguma alteração genômica, pois CDT-B apresenta alguma homologia com enzimas
fosfodiesterases (De Rycke & Oswald, 2001). As proteínas CDT-A e CDT-C são consideradas
proteínas acessórias, mediando a ligação de CDT no receptor da célula alvo e são considerados
como fatores importantes na intoxicação, mas esta propriedade ainda não está muito bem
elucidado (Pickett et al., 2004).
Quatro variantes genéticas CDTI, CDTII, CDTIII e CDTIV, têm sido identificadas em E.
coli. Recentemente, Bielaszewska et al. (2004) identificaram uma nova variante genética de
CDT em amostra VTEC O157:H-, denominada então de CDTV. Estudos mostram que existe
uma incidência maior das variantes I e II em amostras isoladas de humanos e CDTIII mais
prevalente em amostras isoladas de bezerros. Não existe ainda uma clareza na prevalência ou
incidência de CDTIV em amostras isoladas de origem animal ou de seres humanos, o mesmo
pode ser dito no que diz respeito ao quadro diarréico causado por tal variante protéica (Clark et
31
al., 2002; Van Bost et al., 2001). O papel de CDTV e também sua incidência em E. coli isoladas
de bovino ainda não está esclarecida.
NTEC 1 também pode produzir CDT, mas não a variante tipo III. Há indícios de que uma
nova variante de CDT (CDTIV) poderia estar sendo produzidas por amostras CNF1 positivas
(Mainil et al., 2003).
A ação e interação de CNF e CDT têm sido descritas (Pickett & Whitehouse, 1999). CNF
causa a reativação da síntese de DNA e do ciclo celular e a ocorrência do stress das fibras de
actina. CDT é responsável pelo bloqueio da mitose na fase G2/M. Contudo, CDT só exerce sua
função novamente se a célula alvo entrar na fase S do ciclo celular. Então é necessária a ativação
de CNF para o efeito acontecer. O sinergismo entre CNF e CDT causa alterações funcionais na
vilosidade intestinal, inibindo a renovação celular, induzindo a fagocitose e facilitando a invasão
do microrganismo no tecido alvo podendo causar diarréia (Mainil et al., 2003).
1.5. Escherichia coli Enteroagregativas (EAEC)
E. coli Enteroagregativa (EAEC) são membros das E. coli diarreogênicas, reconhecidas
como patógenos emergentes de diarréia, atingindo principalmente crianças dos países
subdesenvolvidos como Índia, Brasil, México, Chile e Irã (Nataro & Kaper, 1998).
Muitos são os fatores de virulência ligados a EAEC, como a fímbria de aderência
agregativa tipos I e II (AAF/I e AAF/II, respectivamente), plasmídio codificante de toxina (Pet),
várias hemolisinas (Hly), proteínas de membrana externa e uma enterotoxina designada Toxina
termo-estável de EAEC tipo 1 (EAST1). Estudos sugerem existir maior número de adesinas
envolvidas no fenótipo agregativo das amostras (Law & Chart, 1998; Navarro-Garcia et al.,
1998).
32
EAST1 é um peptídeo enterotóxico termo-estável de baixo peso molecular que foi
primeiramente descrito por Savarino et al., (1991). EAST1 é codificado pelo gene astA, uma
seqüência de 117 pares de base encontrada tanto em plasmídio como inserido no cromossomo
bacteriano, algumas vezes em ambos, com uma ou mais cópias numa mesma bactéria (Ménard et
al., 2004). Este gene codifica um peptídeo de 38 aminoácidos com peso molecular de
aproximadamente 4.1KDa. Por se tratar de uma toxina de peso molecular muito baixo, que
também ativa o cGMP na célula intestinal alvo, EAST1 é comparada à toxina STa produzida por
E. coli Enterotoxingênicas (ETEC). Contudo, EAST1 apresenta apenas 50% de homologia
quando comparada a STa e não é neutralizada por antissoros produzidos contra a toxina termo-
estável (Ménard et al., 2004).
Muitos são os sorogrupos e sorotipos associados a EAEC, apesar de muitas amostras não
apresentarem antígenos O tipáveis e serem imóveis. Mais de 90 sorotipos diferentes são
encontrados em EAEC, sendo muitos deles característicos de EPEC e ETEC como O44, O86,
O111, O126 e O128 (Law & Chart, 1998).
Estudos epidemiológicos demonstraram que EAST1 não está apenas associada a EAEC,
mas também está presente em quase todos os grupos de E. coli causadoras de diarréia e alguns
outros patógenos entéricos. Foram encontradas amostras que não possuíam outro fator de
virulência a não ser EAST1 em fezes de humanos, bezerros e porcos, inclusive em animais
saudáveis, estudos tentam mostrar, no entanto, que EAST 1 sozinha não é capaz de causar
doença em seres humanos (Law & Chart, 1998, Ménard et al., 2004).
Existem vários estudos mostrando a evolução da Escherichia coli como um grande
patógeno gastrointestinal, no que diz respeito à transferência horizontal de genes, que traz como
consequência diversidade biológica quanto aos seus fatores de virulência. Estudos comprovam
que amostras isoladas de animais saudáveis podem ser potencialmente patogênicas para seres
33
humanos, por possuírem fatores de virulência característicos para tal hospedeiro, mostrando ser
um grande risco para a saúde pública.
No Brasil, o rebanho de bovinos cresce a cada dia e a necessidade de estudos mais
aprofundados no que diz respeito a colibacilose bovina é cada vez mais importante, pois bezerros
são considerados por muitos autores como reservatórios para patógenos humanos e o consumo
de derivados destes animais podem se tornar um risco a população.
Por estes motivos, este trabalho tem por objetivo caracterizar as amostras de Escherichia
coli isoladas de bovinos com e sem diarréia quanto a seus fatores de virulência e sorogrupos,
tentando mostrar se o rebanho brasileiro em uma determinada região do país pode ser
considerado de risco para o consumo da população.
34
Objetivos
O presente trabalho teve por objetivo caracterizar 101 amostras de Escherichia coli isoladas
de bezerros com e sem diarréia quanto à:
• Presença dos genes de fatores de colonização K99, F41, CS31A e F17;
• Presença dos genes de toxinas STa, LT-II, CNF1, CNF-2, VT1 e VT2, EAST1, CDT III e
Ehly;
• Presença do gene eae e do plasmídio EAF;
• Determinação dos sorogrupos (antígenos O);
• Expressão de Hemolisina e Enterohemolisina;
• Detecção da atividade da Verotoxina e,
• Detectar uma possível associação entre os fatores de colonização e toxinas entre as amostras
estudadas.
35
3. Material e Métodos
3.1. Amostras de campo
Neste trabalho foram analisadas amostras de Escherichia coli originárias de bezerros,
sendo 58 delas isoladas de 29 bezerros com diarréia e outras 43 isoladas de 21 bezerros sem
diarréia em fazendas de gado leiteiro. As amostras já identificadas foram gentilmente cedidas
pela Profa. Dra. Halha O. Saridakis, da Universidade Estadual de Londrina (UEL), PR. Os
bezerros apresentavam de três dias a quatro meses de idade em período pré desmame da região
norte do estado do Paraná, Brasil. As amostras foram semeadas em Agar MacConckey e as
colônias características de E. coli foram então semeadas em Meio de Estoque (Agar Nutriente e
Caldo Nutriente) para preservação.
3.2. Amostras padrão
Utilizou-se como controle positivo para as reações de PCR as amostras padrão de E. coli
a seguir:
- F41, K99, STa: B41 (O101:K-)
- F17: B62
- CS31A: 31A
- LT-II: Pc/c LT-II
- CNF1: MR 48 (O75:K95)
- CNF 2: B26a (O123:H16)
- CDT: CDT III (O128:H-)
- EAF: FV176 (O114:H2)
- Hly: FVL 16 (O6:K13:H1)
36
- VT1 / VT2: 152–2(5)(O157:H7)
- EAST1: FV171: (O44)
- Ehly: C3888: Ehly+
- eae: 2348/69
- DH5α: controle negativo.
3.3. Obtenção do DNA bacteriano
As amostras padrão e de campo foram cultivadas em caldo Brain Hearth Infusion (BHI -
Difco) a 37ºC por 18 horas e, em seguida, semeadas em ágar triptona soja (TSA – Difco) e
novamente incubadas a 37ºC por 18 horas. Do crescimento bacteriano em placa, foi retirado um
raspado que foi ressuspenso em 100µL de água Milli-Q previamente esterilizada. O produto foi
homogeneizado em vórtex e submetido à lise térmica (fervura) durante 10 minutos e, em
seguida, centrifugado a 10.000 rpm por 5 minutos (Centrífuga Sorvall MC 12). Os sobrenadantes
com o DNA bacteriano foram utilizados nos ensaios da PCR (Blanco et al., 1997b).
3.4. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
Para a detecção e amplificação dos genes de interesse foram utilizados para cada reação:
Componentes Volume (µL) Concentração Final
10x “PCR Buffer” (Gibco-BRL) 3 µL 1x
10mM “dNTP mixture” (Gigco – BRL) 0,6 µL 0,2mM
Par de Iniciadores - 50 pmol
50 mM MgCl
2 (Gibco – BRL) 1,5 µL 1,5 mM
DNA bacteriano 7 µL -
Taq – DNA polymerase (5U)(Gibco-BRL) 0,2 µL 1U
Água Milli-Q esterilizada qsp (30 µL) -
Total 30 µL -
37
As sequências dos pares de iniciadores estão descritas no Quadro 1. As reações de
amplificação foram realizadas no Termociclador (Applied Biosystems – GeneAmp – PCR
System 9700), onde foram submetidas a 94
o
C por cinco minutos, 35 ciclos de 94
o
C por um
minuto, temperatura de anelamento específicas descritas no Quadro 2 por um minuto e a 72
o
C
por dois minutos.
Quadro 1. Sequências de oligonucleotídeos utilizadas como iniciadores para ensaios da PCR e
tamanhos (pb) expressados por amplificados.
Gene Sequência (5’ – 3’)
Produto
amplificado (pb)
Referência
bibliográfica
K99
TGG GAC TAC CAA TGC TTC TG
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CS31A
GGG CGC TCT CTC CTT CAA C
CGC CCT AAT TGC TGG CGA C
402
Bertin et al.,
1998.
F17
GCA GAA AAT TCA ATT TAT CCT TGG
CTG ATA AGC GAT GGT GTA ATT AAC
537
Bertin et al.,
1996.
STa
TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG
ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG
244
So & McCarty,
1980.
LT-II
AGA TAT AAT GAT GGA TAT GTA TC
TAA CCC TCG AAA TAA ATC TC
300
Schultsz et al.,
1994.
CDT III
GAG TTA TTC CTT CCC CAG GC
CAA AGG CAT CAA CAG CAG AA
108
Silva & Leite,
2002.
VT1
AAG TTG CAG CTC TCT TTG AAT A
TGC AAA CAA ATT ATC CCC TGA G
364
Ojeniyi et al.,
1994.
VT2
GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA
GTA TCT GCC TGA AGC GTA A
386
Ojeniyi et al.,
1994.
Ehly
GCA TCA TCA AGC GTA CGT TCC
AAT GAG CCA AGC TGG TTA AGC T
534
Paton & Paton,
1998.
EAF
CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA A
TAT GGG GAC CAT GTA TTA TCA
397
Gunzburg et al.,
1995.
CNF1
GAA CTT ATT AAG GAT AGT
CAT TAT TTA TAA CGC TG
543
Blanco et al.,
1996.
CNF2
AAT CTA ATT AAA GAG AAC
CAT GCT TTG TAT ATC TA
543
Blanco et al.,
1996.
EAST1
CCA TCA ACA CAG TAT ATC CGA
GGT CGC GAG TGA CGG CTT TGT
111
Yamamoto &
Echeverria, 1996.
Eae
GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC
CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG
384
Yu & Kaper,
1992.
38
Quadro 2. Temperaturas de anelamento para iniciadores dos fatores de virulência pesquisados
por PCR.
Fator de Virulência Temperatura de Anelamento (
o
C)
CDT, LT-II, CS31A, K99, F41, STa
48
F17
62
CNF1 e CNF2 43
VT1 e VT2 54
EAST1
50
eae
51
Enthlhy e EAF 50
Após os ciclos, as reações foram submetidas a 72
º
C por sete minutos para extensão final.
Para a visualização dos resultados, 10µL do produto da PCR foram misturados com 4µL do
tampão de amostra para corrida de eletroforese (tampão TAE acrescido de 25% Ficoll ou
sacarose, 0,25% azul de bromofenol, 0,25% Xileno cianol) que foram aplicados em gel de
agarose horizontal a 2%, preparados com tampão TAE (Tris 1,6M, EDTA 0,025M, ácido
acético, 0,8M pH 7,9).
A corrida eletroforética foi realizada por 45 minutos a 100 volts. Em seguida, o gel foi
submerso em solução de brometo de etídeo (1,5µg/ml) por 10 minutos. As bandas foram
visualizadas em transluminador de luz ultravioleta e fotografadas no sistema Image Máster
VDS (Pharmacia Biotech Inc. USA).
39
3.5. Ensaios para a detecção de Hemolisina e Enterohemolisina em amostras de E.
coli
Para a detecção da produção de hemolisina as amostras padrão e as de campo foram
semeadas em caldo BHI e incubadas a 37
o
C/18 hs e, em seguida, semeadas em Ágar Sangue
contendo 5% de hemácia bovina não lavadas e incubadas por 24h a 37
o
C. Foram consideradas
hemolisina positivas quando observado um halo transparente ao redor do crescimento bacteriano,
com hemólise do tipo α (ou parcial) ou do tipo β (ou total).
Para a detecção da Enterohemolisina, as amostras também foram cultivadas em Ágar
Sangue preparado com 5% de hemácias previamente lavadas com PBS (sangue bovino) (Beutin
et al., 1988) e incubadas a 37
o
C por 24hs. Neste caso as amostras capazes de efetuar hemólise
tipo α foram consideradas positivas.
3.6. Detecção da atividade da Verotoxina em ensaios de citotoxicidade celular
3.6.1. Preparo das amostras
As amostras de E. coli padrão e de campo foram cultivadas em 2 ml de meio líquido TSB
(Tryptic Soy Broth – Difco) a 37
o
C com agitação a 250 rpm por 18 horas. O crescimento
bacteriano obtido foi centrifugado a 12.000 rpm por 10 min. em centrífuga refrigerada com rotor
para microtubos de 1,5ml. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi armazenado a 4
o
C
até o momento do experimento.
3.6.2. Preparo da linhagem celular
As células Vero (Células de Rim de Macaco Verde Africano) foram descongeladas e
cultivadas em garrafas com Meio Mínimo Essencial Eagle (MEM) contendo 10 % de soro fetal
40
bovino (SFB), 100 UI de penicilina/ml e 10 mg/ml de estreptomicina, e incubadas a 37ºC em
estufa a 5% de CO
2
para a formação de uma monocamada celular.
Para o teste de citotoxicidade, as células foram submetidas à ação da tripsina para o
desprendimento da monocamada e, em seguida, foram preparadas microplacas de fundo chato
com 96 poços contendo 100µL de MEM Eagle com 10% de SFB, 100 UI de penicilina/ml e 10
mg/ml de estreptomicina com aproximadamente 2,5x10
5
células/ml.
Após 24 horas a 37ºC em estufa a 5% de CO
2
, o meio de cultura foi substituído por
100µL de MEM Eagle com 2% de soro fetal bovino contendo diluições a 1:4 e 1:8 dos
sobrenadantes das amostras em estudo. As placas foram então incubadas a 37
o
C em estufa a 5%
CO
2
e as alterações morfológicas das células foram observadas em microscópio invertido após
24 e 48 hs de incubação.
3.7. Determinação dos Sorogrupos
Para a determinação dos antígenos O (sorogrupagem), a metodologia utilizada foi
baseada em Guinée et al. (1972) e modificado por Blanco et al. (1992). As amostras de campo
foram semeadas em ágar triptona soja (TSA) e incubadas a 37
o
C por 24 hs. Do crescimento
bacteriano em placa foi obtido um raspado bacteriano que foi suspenso em dois tubos contendo 2
ml de NaCl 0,15M até a concentração de 1,8x10
9
baseando-se na Escala 6 de MacFarland. Após
um tubo ser submetido à lise térmica (fervura) por uma hora e o outro autoclavado por 2,5 horas,
para as amostras que continuaram em suspensão foram acrescidos 2 ml de NaCl 0,15M
formalizada 0,5%, adicionado de solução de Violeta Genciana 0,005%.
41
Para determinação dos sorogrupos, cada suspensão bacteriana foi testada frente aos
antissoros O específico (O1 até O175) por reação de aglutinação em microplaca de poliestireno
de fundo V.
Cada poço da microplaca recebeu 50µL da amostra em teste e 50 µL de antissoro diluído
(1:80). A placa foi incubada a 37
o
C/18h em câmara úmida. Para padrão negativo de leitura,
utilizou-se um poço com 50µL de amostra e 50µL de NaCl 0,15M. As amostras que não
apresentaram um depósito (botão) no fundo do poço foram consideradas como positivas.
3.8. Análise Estatística
Para a análise estatística dos resultados obtidos no trabalho foi utilizado o teste de
proporções entre os dois universos estudados (amostras isoladas de bezerros com diarréia e
amostras isoladas de bezerros sadios). Considerando Ho como hipótese nula e H
1
como hipótese
não nula, foi considerado o resultado obtido na fórmula a seguir:
_________________
Z = (p1 – p2) / √ p(1-p) / (1/n
1
+ 1/n
2
) , sendo
p: no. total de amostras positivas/ no. total de amostras estudadas;
p1: no. total de amostras positivas/ no. de amostras isoladas de bezerros com diarréia;
p2: no. total de amostras positivas/ no. de amostras isoladas de bezerros sem diarréia;
n
1
: universo de amostras isoladas de bezerros com diarréia;
n
2
: universo de amostras isoladas de bezerros sadios;
considerando α
0,005/2
= 1,96, rejeitar Ho quando Z ≥ 1,96.
42
4. Resultados
4.1. Detecção de Fatores de Colonização (FC)
Foram analisadas 101 amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com e sem
diarréia, sendo detectados Fatores de Colonização (FC) estudados em 31 amostras. O gene eae
foi encontrado em 43 amostras, sendo que 35 amostras eram provenientes de animais com
diarréia e oito amostras de animais sadios. Para os demais FC, os resultados foram os seguintes:
26 CS31A+, sendo 24 em animais com diarréia e duas em animais sadios, onze F17+, sendo dez
isoladas de bezerros com diarréia e uma isolada de um animal sadio. Destas, seis amostras
apresentaram associação CS31A+/F17+, todas de animais de quadros diarréicos (Tabela 1).
Em relação a E. coli eae+ observou-se as seguintes associações: 11 amostras foram
CS31A+, todas de origem diarréica, sendo que três estavam associados a F17 e F17 sem
associação a outro FC foi detectado em quatro amostras, todas de origem diarréica. Apenas três
amostras apresentaram a associação entre CS31A e F17 entre as amostras eae+, todas isoladas de
quadro diarréico (Tabela 5).
Vinte e oito amostras não apresentaram outros fatores de colonização a não ser o eae
(Tabela 5).
Foram detectadas 16 amostras FC+ mas negativas para o gene eae, sendo 15 amostras
CS31A+, treze delas isoladas de bezerros com diarréia, sendo três delas associadas a F17 e
apenas uma F17+ isolada de bezerro sadio (Tabela 6).
Em setenta E. coli não foram detectados FC e não foram encontradas amostras positivas
para os genes de K99, F41 e EAF. Os resultados obtidos quanto aos fatores de colonização estão
descritos na tabela 1.
43
4.2. Detecção de Toxinas
Nas 101 E. coli estudadas, 69 delas apresentaram reação positiva para pelo menos um dos
genes de toxinas pesquisados (Tabela 2), sendo 43 amostras VT1+, sendo 24 em animais com
diarréia e 19 em animais sadios. Ainda, 40 amostras foram EAST1+, sendo 17 provenientes de
animais com diarréia e 23 de animais saudáveis; 10 VT2+, sendo quatro de amostras diarréicas e
seis de amostras isoladas de bezerros saudáveis; oito Enthly+, com quatro isoladas de quadro
diarréico, seis amostras foram CDT+, quatro CNF2+ e apenas duas LT-II+. Não foram
detectadas amostras positivas para os genes das toxinas Hly, CNF1 e STa. As amostras positivas
para os genes de toxinas podem ser visualizadas na Tabela 2.
A expressão de VT foi confirmada em ensaios com células Vero para todas as E. coli VT
positivas, enquanto que a expressão da Ehly também foi confirmada quando semeadas em Ágar
contendo hemácias previamente lavadas.
4.3. Determinação dos Sorogrupos
Foram detectados 35 sorogrupos diferentes nas amostras, sendo alguns em maior
freqüência, como O7 em sete amostras, O23 em cinco amostras, O4, O8, O153 e O156 em
quatro amostras cada, O103, O123 e O146 em três amostras cada, O1, O3, O15, O26, O49, O55,
O128, O144, O148 e O175 em duas amostras cada. Os demais sorogrupos não houve prevalência
entre as amostras estudadas, mostrando a diversidade biológica dos isolados bovinos. Os
resultados dos testes de sorogrupos podem ser visualizados na Tabela 3. Os resultados dos
sorogrupos, bem como sua distribuição entre as amostras isoladas de bezerros com ou sem
44
diarréia podem ser visualizados na Tabela 4. Sete amostras apresentaram-se rugosas nos ensaios
de sorologia e vinte e uma amostras mostraram-se não-tipáveis (NT).
4.4 Associação entre Fatores de Virulência e Sorogrupos
Das 43 E. coli eae+, 35 foram isoladas de bezerros com diarréia e oito isoladas de
bezerros sadios. Nestas amostras foram identificados 24 sorogrupos, sendo os sorogrupos mais
comuns O123 e O156 (tabela 7). Além disto, a maioria destas amostras associaram-se também
com a produção de toxinas, visto que das 43 E. coli eae+ encontradas, 34 apresentaram um ou
mais genes responsáveis pela expressão de toxinas. Vinte amostras foram VT1+, sendo 15 delas
isoladas de quadros diarréicos. Entre as amostras eae+/CS31A+, observou-se a seginte
distribuição das toxinas: duas amostras VT1+, uma EAST1+, uma VT2+, duas amostras
VT1+/EAST1+ e uma VT1+/Enthly+. Quatro amostras foram eae+/F17+, sendo que uma estava
associada a VT2+, uma associada a CDT+ e CNF2+ e uma associada a EAST1+ e CNF2+.
Das amostras eae+/CS31A+/F17+, uma estava associada a VT1 e outra associada a VT1
e EAST1. As amostras de E. coli apenas eae+, cinco amostras foram VT1+, três amostras
EAST1+, quatro VT1+/EAST1+, três VT1+/Enthly+, duas Enthly+, duas CDT+, uma CNF2+,
uma EAST1+/Enthly e outra VT1+/CDT+. Seis amostras não apresentaram toxinas. As
asssociações entre fatores de colonização e toxinas entre as amostras eae+ estão demonstradas
nas tabelas 5 e 7.
Entre as E. coli eae negativas, verificou-se 25 sorogrupos identificados, sendo mais
encontrados os sorogrupos O7 e O4.
Em relação às toxinas estudadas, foram encontradas 40 amostras dentre as 58 amostras
eae negativas potencialmente capazes de produzir uma ou mais toxinas, sendo que 29 delas
45
foram isoladas de bezerros sadios. Vinte e três amostras foram VT1 positivas, sendo 14 isoladas
de bezerros sem diarréia. Vinte e três amostras foram EAST1+, onde 16 eram provenientes de
bezerros sadios. Dentre as amostras CS31A+, observamos cinco amostras VT1+, sendo uma
associada a CDT, uma associada a VT2/EAST1 e duas associadas a EAST1. Três amostras
apresentaram a associação entre CS31A/F17, sendo que apenas uma amostra produziu toxina
VT1. Apenas uma amostra apresentou FC F17+, sendo que também apresentou resultado
positivo para EAST1.
Nove amostras deste grupo foram EAST1+, oito amostras VT1+/EAST1+, quatro VT1+
e três amostras VT2+. As demais associações estão descritas na tabela 6. As associações entre
fatores de colonização e toxinas estão descritas nas Tabelas 7 e 8.
Quarenta e duas amostras não apresentaram FC nem eae, sendo que destas, onze também
não apresentaram produção de toxina.
Onze amostras foram negativas para todos os fatores de virulência pesquisados neste
trabalho, sendo cinco delas isoladas de bezerros com diarréia e seis delas isoladas de bezerros
sadios. As associações dos fatores de virulência, bem como dos sorogrupos e sorotipos podem
ser visualizados nas tabelas que se seguem.
46
Tabela 1. Número de amostras totais e fatores de colonização em amostras de Escherichia coli
isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Número total de
animais
No. de bezerros com
diarréia e sem
diarréia
No. de amostras
isoladas de bezerros
com e sem diarréia
Análise de
Proporção (Z)*
50
29 D
(a)
21 S
(b)
58 D
43 S
Z= 0,14**
Fatores de
colonização*
No. total de
amostras (%)
Bezerros com e sem
diarréia
Análise de
Proporção (Z)**
CS31A 20 (19,8%) 18 D
02 S
Z= 3,5
F17 05 (4,9%) 04 D
01 S
Z= 0,34
CS31A/F17 06 (5,9%) 06 D Z= 2,39
eae
43 (42,5%) 35 D
8 S
Z= 4,24
(a) = diarréia
(b) = sadio
*Não foi encontrado resultado positivo para os FC K99, F41 e EAF.
** Z= resultado da análise proporcionais entre bezerros com diarréia e sadios.
α
0,05/2
= 1,96, portanto, se Z≥ 1,96 = rejeitar hipótese nula (H
0
), resultado proporcionalmente
significante
Z≤ 1,96 = aceitar H
0
, resultado proporcionalmente insignificante.
47
Tabela 2. Toxinas em amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Toxinas*
No. total de
amostras (%)
Bezerros com e sem
diarréia
Análise de
Proporção (Z)**
VT1 43 (42,6%) 24 D
(a)
19 S
(b)
Z= 0,3
VT2 10 (9,9%) 04 D
06 S
Z= 1,42
Ehly 08 (7,9%) 04 D
04 S
Z= 0,62
EAST1 40 (39,6%) 17 D
23 S
Z= 2,6***
CDT 06 (5,9%) 04 D
02 S
Z= 0,16
CNF2 04 (3,9%) 03 D
01 S
Z= 1
LT-II 02 (1,9%) 02 D Z= 1,5
(a) = diarréia
(b) = sadio
*Não foram encontrados resultados positivos para as toxinas STa, CNF1 e Hly.
**Z= resultado da análise proporcionais entre bezerros com diarréia e sadios.
***
α
0,05/2
= 1,96, portanto, se Z≥ 1,96 = rejeitar hipótese nula (H
0
), resultado proporcionalmente
significante
Z≤ 1,96 = aceitar H
0
, resultado proporcionalmente insignificante.
48
Tabela 3. Sorogrupos de amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Sorogrupo
No. Amostras
O7 7
O23 5
O4, O8, O153, O156 4
O103, O123, O146 3
O1, O3, O15, O26, O49, O55, O128, O144, O148, O175 2
O5, O6, O9, O10, O17, O76, O78, O85, O91, O113, O117,
O119, O124, O126, O138, O169
1
NT* 21
Rugosas 7
Total de amostras
101
* NT: Não Tipável.
Tabela 4. Distribuição de sorogrupos de amostras de Escherichia coli com e sem diarréia.
Sorogrupo
Bezerros
com
diarréia
Bezerros
sadios
Sorogrupo
Bezerros
com
diarréia
Bezerros
sadios
O1 2 O103 3
O3 1 O113 1
O4 4 O117 1
O5 1 O119 1
O6 1 O123 2 1
O7 3 4 O124 1
O8 4 O126 1
O9 1 O128 2
O10 1 O138 1
O15 2 O144 1 1
O17 1 O146 3
O23 4 1 O148 2
O26 2 O153 3 1
O49 1 1 O156 4
O55 2 O169 1
O76 1 O175 2
O78 1 NT* 11 10
O85 1 Rugosa 5 2
O91 1
Total de amostras
58 43
* NT: Não Tipável.
49
Tabela 5. Associação dos fatores de colonização e toxinas em amostras de Escherichia coli eae+
isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Fatores de Colonização Toxinas No. de amostras
VT1+ 2*
EAST1+ 1
VT2+ 1
VT1+/EAST1+ 2
VT1+/Ehly+ 1
CS31A+
Sem toxina 1
VT2+ 1
CDT+/CNF2+ 1
EAST1/CNF2+ 1
F17+
Sem toxina 1
VT1+ 1
VT1+/EAST1+ 1
CS31A+/F17+
Sem toxina 1
VT1+ 5
EAST1+ 3
CDT+ 2 (1D/1S)**
Ehly+ 2 (1D/1S)
VT1+/CDT+ 1
VT1+/EAST1+ 4 (1D/3S)
VT1+/Ehly+ 3 (1D/2S)
CNF2+ 1
EAST1+/Ehly+ 1
Sem FC pesquisados
Sem toxina 6 (5D/1S)
*Todas as amostras foram isoladas de bezerros com diarréia
** D: diarréia / S: sem diarréia
50
Tabela 6. Associação dos fatores de colonização e toxinas em amostras de Escherichia coli eae-
isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Fatores de Colonização Toxinas No. de Amostras
VT1+ 1*
EAST1+ 2(1D/1S)**
VT1+/CDT+ 1
VT1+/VT2+/EAST1+ 1
VT1+/EAST1+ 2 (1D/1S)
CS31A+
Sem toxina 5
F17+ EAST1+ 1 (S)
VT1+ 1 CS31A+/F17+
Sem toxina 2
VT1+ 4(1D/3S)**
VT2+ 3 (S)
EAST1+ 9 (S)
VT1+/VT2+ 1(S)
VT2+/EAST1+ 1(S)
VT1+/VT2+/EAST1+ 1
VT1+/VT2+/Ehly+ 1(S)
VT1+/EAST1+ 8(1D/7S)
EAST1/LT-II 1
VT1+/EAST1+/LT-II 1
VT1+/CDT+/CNF2+ 1 (S)
Sem FC pesquisados
Sem toxina 11(5D/6S)**
* Todas as amostras foram isoladas de bezerros com diarréia
** D: diarréia / S: sem diarréia
51
Tabela 7. Associação de sorogrupos com fatores de virulência em amostras de Escherichia coli
eae+ isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Sorotipo/Sorogrupo Bezerros com diarréia/
Sadios
FC** Toxinas
O1 D* - -
O3 D - EAST1
O4 S - VT1/EAST1
O7 D - EAST1
O8 D F17 VT2
D CS31A VT2
D - -
D - CDT
O17 D F17 CNF2/EAST1
O23 D CS31A VT1/EAST1
D CS31A EAST1
D - -
D F17 -
O26 D CS31A VT1
D - Ehly
O55 D - VT1/CDT
D - VT1
O78 D F17 CNF2/CDT
O103 D - VT1
O117 D CS31A VT1/EAST1
O123 D - VT1/Ehly
S* (2 amostras) - VT1/EAST1
O124 D - VT1
O144 D CS31A/F17 VT1
D CS31A/F17 -
O146 D CS31A/F17 VT1/EAST1
D - VT1/EAST1
D - -
O153 D - -
D - CNF2
O156 S - Ehly
S (2 amostras) - VT1/Ehly
S - -
O175 S - CDT
Não-Tipável (NT) D CS31A VT1/Ehly
D - EAST1
D (2 amostras) - VT1
D CS31A -
Rugosa D - EAST1/Ehly
D CS31A VT1
Total de amostras: 43
*D: diarréia/S: sadio
**FC: Fator de Colonização
52
Tabela 8. Associação de sorogrupos com fatores de virulência de amostras de Escherichia coli
eae- isoladas de bezerros com e sem diarréia.
Sorotipo/Sorogrupo Bezerros com
diarréia/ Sadios
FC** Toxinas
O1 D* CS31A VT1
O3 D CS31A -
O4 S (3 amostras)* - EAST1
O5 S - EAST1
O6 D CS31A EAST1
O7 D CS31A VT1/VT2/EAST1
S (3 amostras) - VT1/EAST1
S CS31A VT1/EAST1
O10 D CS31A VT1/CDT
O15 S (2 amostras) - VT1/EAST1
O23 S - VT2
O49 D CS31A -
S - EAST1
O85 S CS31A EAST1
O103 D - VT1
D - VT1/EAST1
O113 S - VT1/VT2/Ehly
O119 S - VT2/EAST1
O126 D CS31A/F17 -
O128 S - VT1/EAST1
O138 S - EAST1
O148 S F17 EAST1
O153 D - VT1/EAST1/VT2
S - VT1/EAST1
O169 S - EAST1
O175 S - VT1/CDT/CNF2
Não-Tipável (NT) D CS31A/F17 -
D CS31A/F17 VT1
D (3 amostras) CS31A -
S (2 amostras) - EAST1
S (3 amostras) - VT1
S - VT2
Rugosa D - LT-II/EAST1
D - VT1/LT-II/EAST1
S - VT1/VT2
S - VT2
D CS31A VT1/EAST1
Total de amostras: 47
*D: diarréia/S: sadio
Obs.: Onze amostras foram negativas para todos os fatores de virulência pesquisados.
53
5. Discussão
A colibacilose bovina é um dos maiores problemas da pecuária mundial. Infecções
intestinais podem acometer bezerros de uma a oito semanas de idade, sendo causadas quase
sempre por Escherichia coli patogênicas. Bezerros saudáveis eventualmente albergam subtipos
com tal potencial, mas não necessariamente causando doenças. Levando em consideração estes
fatos é possível, portanto, reconhecer tais animais como reservatórios de amostras com poder de
causar infecção em humanos (Urdahl et al., 2003).
Uma vez que a colibacilose bovina vem sendo considerada uma das principais causas de
perdas econômicas da pecuária mundial, e levando em consideração que o estudo da
epidemiologia desta doença no Brasil ainda não está totalmente fechado e bem descrito, faz-se
necessário verificar quais os fatores de virulência importantes no desenvolvimento da diarréia
bovina e identificar os sorogrupos prevalentes. Estes estudos dão suporte para melhor
compreensão da colibacilose que acomete bovinos no Brasil, principalmente bezerros, podendo
até surgir novas perspectivas para o desenvolvimento de vacinas.
A infecção por E. coli está muito relacionada a fatores ligados à integridade física do
animal e seu manejo. Entre os fatores mais considerados então: a idade do animal, a vitalidade
do bezerro ao nascer e a sua imunidade. A sensibilidade do bezerro aos agentes infecciosos está
diretamente ligada à idade do animal. É considerado como o período de maior risco dos bezerros
adquirirem infecções entre as três primeiras semanas de vida e dentro deste período, a maior
incidência de casos de diarréia está na segunda semana de vida (Garcia et al., 1999).
Para a realização deste estudo utilizaram-se métodos moleculares e alguns métodos
fenotípicos para traçar o perfil de amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com e sem
diarréia. Uma vez que a técnica de PCR se mostra como um método bastante específico e rápido
54
na literatura, os testes moleculares foram realizados para caracterizar as amostras de Escherichia
coli quanto a presença de genes de fatores de colonização e toxinas mais relevantes na
colibacilose bovina, indicados na literatura nacional e internacional. Foram realizados também
ensaios para a detecção da produção de Verotoxina e determinação dos sorogrupos prevalentes,
tentando assim, traçar um perfil completo das amostras.
Ao comparar a incidência de fatores de colonização em amostras de E. coli a literatura
mostra uma variedade de resultados. Contrepois et al. (1989) estudando amostras bovinas
isoladas na França, Canadá e Índia observaram que 41,7% apresentaram CS31A. No Brasil,
Valadares et al. (1999), estudando amostras de E.coli isoladas de bezerros com diarréia na região
de Campo Grande, MS, relataram que entre 255 amostras, 47 (18,4%) foram positivas para
CS31A e, dentre estas, 13 apresentaram associação com F17. Bertin et al. (2000) estudando 118
amostras de E. coli isoladas de bezerros com diarréia e/ou septicemia na França observaram a
presença da associação de CS31A/F17 em 34% das amostras, de F17 em 27,1% e CS31A em
17,8% das amostras. Mais recentemente, Mercado et al. (2003) encontraram o FC CS31A em
21% dos isolados obtidos de bezerros na Argentina e entre estas, 14,3% apresentaram F17
associados. Nesse estudo, das 58 amostras de E. coli de origem diarréica, 24 (41,3%) foram
positivas para CS31A, dez amostras (17,2%) foram F17+ e dentre estas se observou a associação
de CS31A com F17 em seis amostras (10,3%). Por outro lado, das 43 amostras isoladas de
animais sadios, apenas três E. coli (7,0%) apresentaram FC, sendo duas amostras CS31A e uma
F17. Pode-se então observar uma grande diferença no que diz respeito aos fatores de colonização
detectados na França e os detectados na América do Sul, mostrando a diversidade da prevalência
desses fatores nas diferentes regiões. Vale ressaltar que 90% das amostras CS31A+ foram
isoladas de quadro diarréico e analisando as proporções dos resultados obtidos (Z= 3,5, ou seja,
proporcionalmente significante) e ainda, que todas as amostras CS31A+/F17+ foram isoladas de
55
bezerros com diarréia (Z=2,39, proporcionalmente significativo), isso mostra que tais fatores de
virulência estariam envolvidos no quadro diarréico desses bezerros, visto que tais FC estão
relacionados com quadro diarréico e septicemico. Em compensação, das cinco amostras F17+
sem associação com CS31A, quatro foram isoladas de bezerros com diarréia, mas este resultado
não mostrou significância para o quadro diarréico (Z=0,34, menor que Z=1,96).
Wieler et al. (1996) estudando 174 amostras de E. coli isoladas de bezerros com diarréia
na Alemanha verificaram que 122 (70,1%) apresentaram o gene eae. Osek & Winiarczyk (2001)
estudando amostras de bezerros saudáveis na Europa observaram que o gene eae foi detectado
em 84 (21,5%) de um total de 390 amostras estudadas. Mais recentemente, Salvadori et al.
(2003), trabalhando com 205 amostras isoladas de bezerros com diarréia do Estado do Mato
Grosso do Sul, Brasil, verificaram que apenas 3,4% das amostras apresentavam o gene eae.
Nesse mesmo ano, Leomil et al. (2003) observaram que dentre as 24 VTEC isoladas de bezerros,
10 apresentaram o gene eae, sendo sete isoladas de animais com diarréia e 3 de animais sadios.
Ugrinovich (2004) estudando E. coli isoladas de bezerros com e sem diarréia no Estado de São
Paulo, mostrou que dentre as 98 amostras isoladas 48 (49%) apresentaram o gene eae. Porém,
quando comparada à prevalência deste gene entre as amostras isoladas de bezerros com diarréia
e sadios, foi observado que 50% eram de origem diarréica e 50% de amostras controle. No
recente artigo publicado por Irino et al. (2005), estudando amostras VTEC isoladas de gado
leiteiro adulto, detectaram a presença do gene eae em 1% das amostras de Escherichia coli.
Foram encontrados 43 amostras de E. coli (42,6%) com resultado positivo para o gene
eae, sendo 35 amostras (34,6%) de origem diarréica e oito (7,9%) isoladas de bezerros sadios.
Ou seja, das amostras de E. coli eae positivas encontradas, 81,3% foram isoladas de bezerros
com diarréia e 34,4% das amostras de E. coli diarréicas só apresentaram o gene eae como fator
de colonização. Concordando com Leomil et al. (2003) e diferente do observando por
56
Ugrinovich (2004), esses resultados indicam que o gene eae está associado ao quadro diarréico
de bezerros, visto que a análise proporcional das amostras reforça esta afirmação (Z=4,24, maior
que Z=1,96).
Vale ressaltar que foram observadas diferenças relevantes quanto à presença ou não do
gene eae entre as amostras isoladas em localidades de diferentes estados do nosso país, e, mesmo
entre as amostras isoladas na Europa. Deste modo, os resultados obtidos suscitam que novos e
mais amplos estudos sejam realizados visando determinar a prevalência do gene eae no rebanho
brasileiro, considerando a extensão do país, manejo, raças, tamanho do rebanho e sua finalidade
(corte ou leite).
Menge et al. (1999) mostraram em seu estudo que VT1 tem contribuído para a
patogênese de VTEC associada à diarréia em bezerros, suprimindo a resposta imune associada à
mucosa do organismo hospedeiro. Urdahl et al. (2003), estudando amostras de E. coli isoladas de
bezerros sadios em fazendas de gado leiteiro na Alemanha, encontraram 64,6% das amostras
positivas para VT e, dessas, a grande maioria foi VT1. Moreira et al. (2003) utilizando ensaios
com células Vero para verificação da produção de VT, mostraram que 49% dos bezerros
estudados de fazendas de gado leiteiro no sul do Brasil apresentaram VTEC em sua flora
intestinal. Leomil et al. (2003) relataram entre as amostras VTEC isoladas de bezerros que 50%
eram VT1, 33,3% VT1/VT2 e 16,7% VT2. Um estudo recente feito por Mercado et al. (2004) na
Argentina, mostrou que 80% das VTEC isoladas de bezerros com diarréia apresentaram gene
para VT1. Ugrinovich (2004) observou que dentre as 98 amostras estudadas, 76 foram positivas
para o gene stx, sendo VT1 a mais freqüente (59,2%). Um recente estudo realizado por Irino et
al. (2005) relata que 97% das VTEC isoladas de gado leiteiro adulto apresentaram VT2 ou
VT1/VT2. Um outro estudo desenvolvido por Zweifel et al. (2005) com amostras de E. coli
57
isoladas de gado de corte na Suécia detectaram 43% VT1+, 20% VT2+ e 9% VT1/VT2+. Neste
trabalho ainda foram observados os genes eae em 21% das amostras.
Os resultados obtidos no presente estudo se mostram muito semelhante aos trabalhos
anteriores quando evidencia que a toxina mais freqüente foi a Verotoxina, detectada em 52,5%
das amostras. Por outro lado, observamos a VT1 como a de maior prevalência (81,1%). Dados
esses que confirmam que VTEC produtora de VT1 está muito mais associada a bezerros que
VTEC produtora de VT2 (Wieler et al., 1996; Orden et al., 2002) e são contrários ao citado por
Irino et al. (2005). Além disto, este trabalho mostra que bezerros podem sim, ser reservatórios de
VTEC, pois entre as 43 E. coli VT1+, 24 foram isoladas de bezerros com diarréia e 19 amostras
isoladas de bezerros sadios, mas proporcionalmente não existe significância com o quadro
diarréico (Z=0,3, menor que Z=1,96).
Neste trabalho, entre as amostras de E. coli VT1+ isoladas de bezerros com diarréia,
62,5% apresentaram associação com o gene eae. Entre as 19 amostras VT1+ isoladas de bezerros
sem diarréia, 26,3% estavam associadas ao eae. Blanco et al. (1997a), estudando bezerros
saudáveis de fazendas leiteiras e de corte em Lugo, Espanha, encontraram 27% das amostras
positivas para VT1, mas apenas 0,8% de amostras eae positivas. Cobbold & Desmarchelier
(2001) estudando amostras isoladas de bovinos saudáveis de diferentes idades na Austrália,
observaram que 29% das amostras VTEC isoladas apresentavam o gene eae. Na Espanha, Orden
et al. (2002) encontraram 24,3% de VTEC isoladas de bezerros saudáveis portadoras do gene
eae, sendo muitas delas associadas a VT1.
Boerlin et al. (1999) mostraram em seu estudo uma associação significativa entre a
presença do gene eae e VT2 em amostras de origem humana. Esta associação raramente é
encontrada em amostras isoladas de bovinos. Nesse trabalho foram detectadas 9,9% das amostras
58
de E. coli VT2+ e destas, 20% estavam associadas ao gene eae. 80% das amostras VT2+ (oito
amostras) não apresentaram o gene eae e seis amostras foram isoladas de bezerros sadios.
Irino et al. (2003), estudando amostras de E. coli isoladas de bezerros do estado de São
Paulo, observaram que 94% das VTEC encontradas eram produtoras de VT2 e apenas 6% eram
produtoras de VT1, fato que não se assemelha aos resultados aqui detectados. Um recente estudo
realizado por Irino et al. (2005) relata que só foi possível verificar a presença do gene eae em 1%
de amostras VTEC, restritos aos sotoripos O157:H7 e O111:HNM, sorotipos esses
característicos de EHEC. Esses estudos ratificam nossa afirmação anterior quando em se tratando
da grande variedade de sorogrupos e sorotipos VTEC existentes no rebanho bovino brasileiro e
mundial.
A identificação de amostras VTEC capazes de produzir verotoxina pode ser realizada em
ensaios celulares. A expressão de VT foi confirmada em ensaios de citotoxicidade em todas as
amostras VT positivas em testes de PCR. O mesmo foi observado com amostras Ehly positivas
em ensaios de PCR quando testadas em Ágar Sangue. Diferentemente do nosso trabalho, Irino et
al. (2005), relatam que 88% das amostras apresentaram o gene de Ehly, mas apenas uma amostra
mostrou atividade em Agar Sangue.
Ehly está fortemente associada a E. coli produtoras de Verotoxina (VTEC) isoladas de
bezerros (Beutin, et al., 1993; Holland et al., 1999; Cobbold & Desmarchelier, 2001). No Brasil,
Irino et al. (2003) observaram que 80% das amostras VTEC eram produtoras de Ehly. A baixa
frequência de Ehly observada entre as amostras estudadas no presente trabalho, apenas oito
amostras (7,9%) e ainda mostrando pouca significância no quadro diarréico (Z=0,62, menor que
Z=1,96) o que não era esperado, pois no Brasil Irino et al. (2003) e Ugrinovich (2004)
encontraram muitas amostras produtoras de Ehly.
59
Os resultados encontrados nos estudos realizados no rebanho bovino brasileiro no que
tange a prevalência de variedades de VT (VT1 e/ou VT2) e da sua associação com o gene eae
mostram-se controversos. Do mesmo modo, também controversos os estudos que dizem respeito
a VTEC isoladas de bezerros em diferentes continentes.
Segundo Osek et al. (2000) não foi encontrada nenhuma associação entre VT e F17, mas
46,7% das amostras estudadas pelos autores apresentaram resultado positivo para Ehly. Além
disso, estudo que difere totalmente do nosso trabalho e se assemelha aos demais vistos
anteriormente, mostrando que no Brasil o risco de contaminação humana por estes patógenos é
grande, representando um fator de risco a saúde humana.
Neste aspecto, o presente trabalho mostra-se compatível com a literatura publicada até o
momento, pois bezerros podem apresentar VTEC como parte de sua microbiota intestinal e esta
nem sempre está associada ao gene eae e, o fato desse microrganismo estar presente em seu trato
gastrointestinal, não necessariamente estaria associado a quadros de diarréia. É importante
salientar também a diversidade de amostras isoladas em diferentes estados brasileiros, que por
tratar-se de um país de grande área geográfica e com muitos rebanhos bovinos, a diversidade dos
fatores de virulência de VTEC pode ser um fato previsível.
Trinta e cinco amostras de E. coli (34,6%) foram positivas para a toxina EAST1, sendo
grande parte associadas a VT1 e ao fator de colonização CS31A. Até o momento este é o
primeiro relato de associação entre amostras CS31A/VT1. Não foi observada nenhuma
publicação a associação entre CS31A e VT1 em bovinos com e sem diarréia em outros países e
até mesmo em outros estados brasileiros.
Bertin et al. (1998) encontraram a associação entre CS31A e EAST1 em 87% das
amostras de E. coli CNF1 positivas estudadas e em 72% das amostras negativas para CNF1. Um
estudo realizado por Valadares (2000), com amostras de E. coli do Mato Grosso do Sul, Brasil,
60
revelou que entre as amostras CS31A positivas 29,8% estavam associadas a EAST1, 8,5% do
total das amostras apresentaram VT1 e nenhuma amostra apresentou VT2. Ugrinovich (2004)
encontrou apenas duas amostras de E. coli (2%) EAST1 positivas, sendo uma em amostra de
origem diarréica e outra em bezerro sadio, em bezerros do Estado de São Paulo. Irino et al.
(2005) encontraram em seu trabalho apenas 4,9% das amostras portadoras do gene para EAST1,
sendo que todas elas estavam associadas a VT1 e VT2. Este estudo indicou ainda que EAST1
não estava envolvido com o quadro diarréico, pois quando analisadas as proporções entre as E.
coli EAST1+ isoladas de bezerros com e sem diarréia, o resultado mostrou-se proporcionalmente
significante ao constatar que EAST1 foi mais prevalente entre os isolados de bezerros sadios aos
isolados de bezerros com diarréia (Z=2,6, maior que Z=1,96).
Quanto às demais toxinas detectadas entre as amostras pesquisadas neste trabalho, o
número de amostras positivas pode ser questionável e também pouco significante (Z< 1,96,
aceitando hipótese nula). A associação entre amostras NTEC com quadros diarréicos é
questionada, mas Orden et al. (1999) encontraram a maioria das amostras isoladas NTEC
associadas a quadros diarréicos. Orden et al. (2002), estudando amostras de E. coli isoladas de
bezerros de diferentes idades na Espanha, encontraram 10,9% de amostras positivas para CNF e
todas elas produtoras de CNF2.
Van Bost et al. (2001), estudando 430 amostras isoladas de bezerros com diarréia na
Bélgica, encontraram 8% de amostras produtoras de CNF. Nestas, verificou-se que 57%
apresentavam associação entre a produção de CNF2 e toxina CDTIII. Neste trabalho, foi
encontrado 3,9% das amostras produtoras de CNF2 e destas 50% (duas amostras) associadas a
CDT. Proporcionalmente, tal resultado não mostrou significância para o quadro diarréico das
amostras estudadas neste trabalho (Z=1, menor que Z= 1,96).
61
Um trabalho desenvolvido recentemente por Pickett et al. (2004) mostrou a associação,
em amostras de E. coli de origem humanas, de CDTIII com outros fatores de virulência ligados a
VTEC e NTEC. As amostras produtoras de CDT apresentaram-se positivas também para VT1 e
CNF2. Neste trabalho 66,6% das amostras CDTIII positivas apresentaram associação com o
gene eae. De fato, esses resultados estão condizentes com os resultados de Orden et al.(1999) e
Van Bost et al. (2001), sendo mais um indicativo da necessidade de maiores estudos com as
amostras E. coli isoladas de bezerros no Brasil.
Em 2002, Ugrinovich et al. relataram o isolamento de uma amostra de E. coli LT-II+ a
partir de fezes de bezerro com diarréia. Em um trabalho mais recente, Salvadori et al. (2003)
encontraram em amostras de E. coli isoladas de bezerros com diarréia 8,3% das amostras
positivas para LT-II. No presente trabalho verificamos a presença do gene de LT-II em apenas
1,9% das amostras isoladas de bezerros com diarréia. A baixa freqüência observada por
diferentes autores e neste trabalho, sugere que a LT-II não deva ter um papel importante na
colibacilose bovina.
Não foi encontrada nas amostras de E. coli estudadas reação positiva para o plasmídio
EAF. Esse trabalho está confirmando a literatura, pois já é conhecido que amostras VTEC e
EHEC não apresentam tal plasmídio (Nataro & Kaper, 1998; Paton & Paton, 1998; Szalo et al.,
2002). Amostras EHEC apresentam plasmídio muito similar ao EAF, mas neste não está inserido
o gene responsável pela expressão de BFP (Szalo et al., 2002). A associação de CNF1 e Hly tem
sido freqüentemente relatada em amostras isoladas de infecções extraintestinais (I.T.U. e
septicemia) de humanos (Blanco & Blanco, 1993; Orden et al., 1999). Concordando com a
literatura, os genes para as toxinas Hly e CNF1 não foram detectados nas amostras por nós
estudadas.
62
Vale a pena ressaltar a ausência do gene para STa nas amostras analisadas, indicando não
se tratar de amostras enterotoxigênicas (ETEC) pois, assim como K99 e F41, que não foram
encontrados nas amostras estudadas, estes fatores de virulência são característicos deste grupo de
E. coli diarreogênicas (Blanco & Blanco, 1993). Frank et al. (1998) estudando amostras de
bezerros para validação de reações de PCR multiplex não encontrou associação alguma entre os
fatores de virulência ligados a ETEC e VTEC. Apenas 4% das amostras apresentaram um perfil
VT2/STa, o que é um fato incomum. Mais tarde, Osek et al. (2000) não encontraram genes para
K99, F41, STa, STb, LT-I e LT-II em amostras VTEC. Estes trabalhos confirmam nosso estudo,
mostrando que fatores de virulência ligados a ETEC não são encontrados em amostras VTEC.
Nesse estudo foram identificados 35 sorogrupos. Todos os sorogrupos estão associados a
VTEC em bovinos (http://www.lugo.usc.es/ecoli/SEROTYPESBOV.htm
/SEROTYPESHUM.htm/ 28/10/2004; Vaz et al., 2004). Em relação às amostras eae+/VT1+,
oito sorogrupos estão associados a VTEC em bovinos: O4, O8, O23, O26, O55, O103 e O146,
O156. Das amostras VT1+, onze sorogrupos encontrados estão associados a VTEC em bovinos:
O1, O7, O10, O15, O23, O103, O113, O119, O128, O153 e O175. Ainda dentro do grupo de
amostras VTEC (eae+/VT1+), nove amostras estão associadas a isolados capazes de causar
doença em humanos, sendo eles: O4, O8, O23, O55, O117, O123, O124, O144 e O146. Apenas
dois sorogrupos estão associados fortemente a doença em humanos (O26 e O156). Nas amostras
VTEC portadoras de VT1, dez sorogrupos estão associadas a VTEC humana, como O1, O7,
O15, O23, O103, O113, O119, O128, O153 e O175, mas apenas os sorogrupos O103 e O113
estão associados com diarréia grave em humanos (http://www.lugo.usc.es/ecoli/
SEROTYPESBOV.htm/SEROTYPESHUM.htm/ 28/10/2004). Apesar de não ser verificado
nesse trabalho o sorogrupo O157, os sorogrupos O26 e O156 estão fortemente associados a
doenças tanto em bovinos como em humanos e alguns sorogrupos como O55, O91, O103, O111,
63
O113 estão sendo considerados atualmente por vários pesquisadores como patógenos
emergentes, causadores de diarréias em humanos e diarréia grave em bezerros em diferentes
países, inclusive o Brasil (Vaz et al., 2004; Pradel et al., 2000).
Estes resultados demonstram a importância de estudos mais aprofundados sobre
colibacilose em bovinos no Brasil, nas suas diferentes regiões geográficas, e para animais
submetidos os diferentes manejos e para diferentes finalidades, como gados de corte ou leiteiro,
por se tratar de um possível risco à Saúde Pública.
De acordo com os resultados obtidos, foi confirmado que bezerros são reservatórios de
amostras não O157 produtoras de VT do tipo 1, uma vez que sorogrupos de grande relevância
foram encontrados, O55, O91, O103, O111, além de sorogrupos já descritos como causadores de
doenças em humanos como O26, O103, O113, O153 e O156, o que pode ser considerado um
risco para saúde pública.
O papel do gene eae na colibacilose bovina deve ser melhor estudado e a confirmação da
associação entre o fator de colonização CS31A com a toxina VT1 em amostras isoladas do
rebanho brasileiro se faz necessária, por se tratar de um país de dimensões geográficas
consideráveis e a diversidade biológica quando se trata de fatores de virulência ligados a
colibacilose bovina.
64
6. Conclusões
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho chega-se as seguintes conclusões:
a) O gene eae foi encontrado em uma grande porcentagem em E. coli isoladas de bezerros
com diarréia e também associado à toxina VT1;
b) A toxina VT1 foi detectada com maior freqüência nas amostras (42,5%) em comparação
a VT2, confirmando os dados da literatura sobre a prevalência de VTEC1, sendo que
todas as amostras positivas mostraram atividade em células Vero;
c) A pouca diferença entre as amostras VT1+ isoladas de bovinos com e sem diarréia,
afirma que bezerros são reservatórios de VTEC, indicando grande risco a saúde pública;
d) A associação de CS31A com VT1 (42,3% das amostras CS31A+) ainda não havia sido
descrita até o presente momento, mostrando uma nova associação entre fatores de
colonização e toxinas em amostras isoladas no Brasil;
e) Os sorogrupos identificados nas amostras estão relacionados a sorogrupos de VTEC de
bovinos, sendo os sorogrupos O26, O103, O113 e O156 associados a doença em
humanos;
f) Cinqüenta por cento das amostras CNF2 positivas apresentaram associação com CDTIII;
65
g) A presença de LT-II nas amostras estudadas embora em uma porcentagem não
significativa sugere maiores estudos relacionados à colibacilose bovina;
h) Pode-se considerar que bezerros são reservatórios de amostras não O157 produtoras de
VT do tipo 1, uma vez que sorogrupos de grande relevância foram encontrado, alguns
deles ainda podendo ser causadores de doenças em humanos;
i) Não foram identificados os fatores de virulência F41, K99, STa, mostrando não se tratar
de E. coli enterotoxigênica (ETEC) e também não foi observado resultado positivo para
CNF1 e Hly e EAF;
j) Este trabalho reforça a necessidade de maiores estudos sobre a colibacilose no Brasil,
uma vez que os dados do trabalho são confrontantes com o da literatura e mostra ainda
uma grande diferença entre os fatores de virulência encontrados em amostras de
diferentes regiões do nosso país.
66
7. Referências Bibliográficas
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