( PDF ) Estudos funcionais e estruturais da proteína reguladora humana Ki-1/57

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA – UNICAMP

Título em inglês: Functional and structural studies of human regulatory protein Ki-/57.

Palavras-chave em inglês (Keywords): Signaling, phosphorylation, Ki-1/57, RACK-1,

protein kinase C.

Área de concentração: Genética humana e médica.

Titulação: Doutorado.

Banca examinadora: Jörg Kobarg, Mônica Bucciarelli Rodriguez, Débora Foguel, Maria

Isabel Cano, Marcelo Menossi.

Data da defesa: 02/05/2005.

Nery, Flávia Cristina

N359e Estudos funcionais e estruturais da proteína

reguladora humana Ki-1/57 / Flávia Cristina Nery. --

Campinas, SP: [s.n.], 2005.

Orientador: Jörg Kobarg.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de

Campinas, Instituto de Biologia.

1. Ki-1/57. 2. RACK-1. 3. Proteína quinase C.

I. Jörg Kobarg. II. Universidade Estadual de Campinas.

Instituto de Biologia. III. Título.

(rcdet/ib)

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iii

AGRADECIMENTOS:

Foi há 4 anos que comecei algo... Algo que agora apresento a vocês, e ao

apresentá-lo sinto um sentimento de alívio como há muito não sentia!

Senti que brinquei com minha imaginação, meu conhecimento, minha

capacidade... Uma pessoa impaciente como eu sou (demasiada mesmo), que não

consegue ver o significado da palavra "esperar", pode se dizer que tive muitos

momentos difíceis até alcançar meu objetivo final: a tese.

Nesses 4 anos arrisquei-me em uma nova cidade, em um novo trabalho, em

novos amigos. Não sei se o que sinto hoje é diferente de antes... Continuo

assombrada pelo medo do novo, mas gostei e muito!

Gostei até de aprender que existem pessoas que se identificam, ou não, que a

pesquisa é difícil, mas surpreendente, mas com certeza o que eu mais gostei foi

aprender que o esforço vale a pena! Sim, hoje eu sei!

Hoje eu sei que o mais importante para mim é a aprendizagem. Aprender o

que ainda não sei ainda. Ah! E como existem coisas a serem aprendidas! E por isso

serei sempre uma aprendiz.

Eu creio que esta parte de agradecimentos é uma tarefa difícil, pois muitas

vezes cometemos injustiças e por esquecimento não mencionamos nomes de

pessoas que também contribuíram para o trabalho.

Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras pessoas

para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto pode mudar a

nossa vida e contribuir para o nosso sucesso.

Primeiramente, devo agradecer a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado

de São Paulo- FAPESP- pelo apoio financeiro, o que possibilitou que eu me

deslocasse de Belo Horizonte para a Cidade de Campinas e desenvolver um novo

trabalho. Ao laboratório Nacional de Luz Síncrotron-LNLS- por fornecer uma

excelente infra-estrutura que nos possibilita realizar diversos experimentos.

Meus agradecimentos ao meu orientador, professor Dr. Jörg Kobarg, que

sempre demonstrou acreditar no meu potencial, pela oportunidade oferecida, pela

orientação e principalmente pelo bom convívio neste quatro anos de trabalho. Com

ele tive a oportunidade de enriquecer meu conhecimento, com suas argumentações

científicas e sugestões nos meus relatórios, artigos, entre outros;

Aos membros da pré-banca: Profa. Dra. Anete P. de Souza, Prof. Dr,

Marcelo Menossi e Prof. Dr. Carlos H.I. Ramos; e banca (pág. iii) por terem

aceitado a participar da avaliação deste trabalho;

Ao Dr. Giani Del Sal por ter fornecido o plasmídeo pGEX-p53;

À todos do Centro de Biologia Molecular e Estrutural:

Aos pesquisadores: Dr. Carlos H. I. Ramos, Dra. Beatriz G. Guimaraes, Dr.

João A.R. G. Barbosa, Dr. Francisco Javier M. Martin, Dr. Celso E. Benedetti,

Dra. Thelma A. Pertinhez, Dr. Fabio C. Gozzo e Dr. Nilson I.T. Zanchin pelas

valiosas conversas e sugestões.

Em especial aos colegas do meu grupo: Alexandre Quaresma, Dario Passos,

Eliana Assmann, Edmilson Rui, Kaliandra Gonçalves, Patrícia Moura, e aos

novatos Daniel Trindade e Gustavo Bressan pela alegre convivência e sugestões e

alguns destes foram essenciais no desenvolvimento deste trabalho. À vocês muito

obrigada!

Um agradecimento especial deve ser feito à Maria Eugênia R. Camargo, a

qual por ser uma excelente técnica, sempre nos auxiliou nos experimentos e na

obtenção dos mais variados materiais.

Às demais técnicas que forneceram condições adequadas para o

desenvolvimento dos trabalhos: Luciana Camillo, Zildene Correa, Veruska Soares,

Tereza Silva, Andreia Meza, Sílvia Silva, Adriana Alves, e a Givanil Garrido por

sempre se preocupar com a ordem do laboratório e pelo seu ótimo humor.

Aos meus pupilos, Taís Kuniyoshi e Marcos Alborghetti, com os quais creio

que contribuí com sua iniciação científica, que hoje são meu orgulho.

Às minhas queridas amigas biólogas: Flavia Carneiro (Loira ou Melo),

Sandra Scapin e Daniela Ierardi por todos momentos divertidos que passamos

juntas e pela nossa eterna amizade, ao amigo Dr. Júlio Borges por estar sempre

disposto a ajudar e ser um amigo para todas as horas.

À amiga Ana Paula Brandão pela amizade sólida e verdadeira e à amiga

Regiani Cury pela nossa alegre e tranqüila convivência, pela energia positiva e pelo

carinho.

Aos amigos de BH que sempre torcem por mim e se preocupam comigo:

Mônica, Luciana, Claudia, Rosângela, Daniela, Rubinho, Chris, Lú, Fábio, Lierge

e muitos... muitos outros.

Aos meus familiares que sempre me apoiaram. Aos meus pais, Ivanir Nery e

Enir Muniz, que me deram não somente a vida, mas principalmente a minha

educação e condições de estudo. Aos meus irmãos Fernanda L. Nery e Fúlvio K.

Nery por sempre torcerem por mim.

Eu fortemente agradeço ao Edson G. Ochi, por sua extensa paciência, pelo

seu amor, por sempre estar disposto a me ajudar em qualquer situação e

principalmente pelo seu apoio que me conforta e me deixa mais forte para superar

meus desafios.

E finalmente à Deus por sempre me iluminar e me guiar...

Um pouco de poesia:

Viver vale a pena!

Que a felicidade não dependa do tempo, nem da paisagem, nem da sorte, nem do

dinheiro.

Que ela possa vir com toda a simplicidade, de dentro para fora, de cada um para

todos.

Que as pessoas saibam falar, calar, e acima de tudo ouvir.

Que tenham amor ou então sintam falta de não tê-lo. Que tenham ideal e medo de

perdê-lo.

Que amem ao próximo e respeitem sua dor, para que tenhamos certeza de que viver

vale a pena.

Viver é colocar seu sonho à prova. Os brotos da esperança crescem alimentados pelo

sonho.

É preciso reviver o sonho e a certeza de que tudo vai mudar.

É necessário abrir os olhos e perceber que as coisas boas estão dentro de nós, onde

os sentimentos não precisam de motivos nem os desejos de razão.

Mas é preciso ver as coisas com o coração e nem sempre com a razão.

Não se esqueça de que o aprendizado dura a vida toda.

Eleve suas expectativas. Pessoas com sonhos grandes obtêm energia para crescer.

Os vencedores pensam em como realizar seu objetivo. Por isso ...

Tenha metas claras. Ter objetivos evita desperdícios de tempo, energia e dinheiro.

Amplie os seus relacionamentos profissionais.

Os amigos são a melhor referência em crises e a melhor fonte de oportunidades na

expansão. Ter bons contatos é essencial em momentos decisivos.

No mais o importante é aproveitar o momento e aprender sua duração, pois a vida

está nos olhos de quem sabe ver. Afinal a vida é uma arte, viver vale a pena!

(Flávia C. Nery)

vii

ÍNDICE

Capa

Ficha catalográfica

Componentes da banca

iii

Agradecimentos iv

Um pouco de poesia

vii

ÍNDICE

viii

Lista de figuras e tabelas

Lista de abreviações e siglas

RESUMO

xiii

ABSTRACT

xiv

1 INTRODUÇÃO

1.1 O linfoma de Hodgkin 1

1.2 O papel da molécula CD30 no linfoma de Hodgkin

1.3 O anticorpo Ki-1 detecta CD30 e uma proteína de 57 kDa : Ki-1/57

1.4 Características da proteína Ki-1/57

2 OBJETIVOS

3 RESULTADOS 15

3.1 Artigo I: Characterization of a family of proteins that interact with the

C-terminal region of the chromatin-remodeling factor CHD3

3.2 Artigo II: Ki-1/57 Interacts with RACK1 and Is a Substrate for the Phosphorylation

by Phorbol 12-Myristate 13-Acetate-activated activated Protein Kinase C

3.3 Artigo III: Ki-1/57 interacts with p53 and interferes negatively in its

transcriptional activation function 36

3.4- Artigo IV: A spectroscopic analysis of the interaction between the human

regulatory proteins RACK-1 and Ki-1/57

viii

4 RESULTADOS COMPLEMENTARES 74

4.1 Caracterização da proteína Ki-1/57 74

4.2 O sistema de duplo híbrido em levedura

4.2.1 Ensaio de duplo híbrido em levedura com a porção C-terminal de Ki-1/57

(122-413)

4.2.2 Ensaio de duplo híbrido em levedura com a porção N-terminal de Ki-1/57

(1-150)

4.3 A proteína Ki-1/57 possui um parálogo humano: CGI-55 e possíveis

ortólogos em outros organismos vertebrados

4.4 Ensaios de cristalização 83

4.4.1 Utilizando a proteína recombinante 6xHis-RACK-1

4.4.2 Utilizando os fragmentos C-terminais de Ki-1/57: 6xHis-KiC (aa 122-413)

e 6xHis-KiC2 (aa151-263)

5 DISCUSSÃO 85

5.1 O ensaio de duplo híbrido em levedura pode sugerir possíveis contextos

funcionais para a proteína Ki-1/57

5.2 As proteínas Ki-1/57 e CGI-55 podem apresentar funções similares

5.3 A proteína Ki-1/57 interage com o receptor para quinase C ativada-1 91

5.4 Ki-1/57 é substrato para a proteína quinase C (PKC) ativada por PMA

5.5 A proteína Ki-1/57 interage com a proteína p53 e pode atuar como seu

repressor transcricional

5.6 Análises de dicroísmo circular da proteína Ki-1/57 99

5.7 Análises de dicroísmo circular da proteína RACK1 e de sua interação

com Ki-1/57

100

5.8 Análises de fluorescência de RACK1 e Ki-1/57

101

6 CONCLUSÕES 102

7 PERSPECTIVAS

104

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

106

Lista de figuras e tabelas

Figura 1: O sistema linfático humano

Figura 2: Uma pessoa que apresenta um aumento significativo dos linfonodos, na

região do pescoço, devido ao avanço do linfoma de Hodgkin

Figura 3: Corte histológico de um linfonodo de um paciente com linfoma de Hodgkin

Figura 4: A família de receptores TNF

Figura 5: CD30 modula a função do linfócito T citotóxico

Figura 6: Caracterização da proteína Ki-1/57 em motivos proteícos

Figura 7: Alinhamento das seqüências de aminoácidos de possíveis proteínas

ortólogas de Ki-1/57

Figura 8: Alinhamento da seqüência de aminoácidos das proteínas CGI-55,

PAIRBP1 e Ki-1/57

Figura 9: Ensaios de cristalização das proteínas recombinantes RACK1 (A-B)

e Ki-1/57 (151-263) (C)/ e Ki-1/57 (122-413) (D)

Arquitetura do núcleo e corpúsculos PML

Figura 10: Associação a possíveis contextos funcionais da proteína Ki-1/57

através da identificação de proteínas que interagem com ela, usando o sistema

duplo híbrido em levedura

Figura 11: Arquitetura do núcleo e dos corpúsculos nucleares

Figura 12: Modelo preliminar da regulação da localização subcelular da proteína

Ki-1/57 por fosforilação

Tabela 1: Proteínas que interagem com a região C - terminal da proteína

Ki-1/57 (122-413) pelo sistema duplo híbrido em levedura 76

Tabela 2: Proteínas que interagem com a região N- terminal da proteína

Ki-1/57 (1-122) pelo sistema duplo híbrido em levedura

Lista de abreviações e siglas

ACTB: Proteína actina beta;

AD: Domínio de ativação transcricional da proteína Gal4 (Activation domain);

ALEX2: Proteína com repetição Armadillo

2 (Armadillo repeat protein X chromosome,

2);

APLP1: Proteína similar a proteína amilóide precursora 1 (Amyloid-precursor-like

protein 1);

BD: Domínio de ligação a DNA da proteína Gal4 (Binding domain);

BTBD2: Proteína contendo 2 domínios BTB(POZ) (BTB (POZ) domain containing 2);

CD: Dicroísmo dircular (Circular Dicroism);

CD30: Receptor de citocina 30 (Cytokine receptor 30)

CGI-55: Proteína identificada por comparação genômica 3 (Comparative Genome

Identified 55);

CHD3: Proteína com domínios cromo-helicase e de ligação ao DNA 3 (Chromo-

domain Helicase DNA binding domain protein 3);

CIRBP: Proteína que se liga ao RNA induzida por frio (Cold Inducible RNA Binding

Protein);

CTGF: Fator de crescimento de tecido conectivo (connective tissue growth factor);

DAXX: Proteína associada a morte (Death-associated Protein);

EB-1: Proteína associada a E2a-Pbx1 (E2a-Pbx1 associated proteína);

EPS8: Substrato 8 do receptor de fator de crescimento epidermal (Epidermal growth

factor receptor pathway substrate 8) ;

Fas: Fator de apoptose (Factor of apoptosis);

FISH: Fluorescência de hibridação in situ (fluorescence in situ hybridization);

FPLC: Cromatografia líquida de proteínas por pressão;

FXR1P:Proteína relacionada com retardamento mental X-frágil (Fragile X mental

retardation-related protein 1);

HMGBCG: Proteína similar ao grupo de alta mobilidade (High-Mobility Group);

IHABP4: Proteína que se liga a hialuronato 4 (hyaluronan-binding protein 4);

IPTG: Isopropil beta-D-galactosídeo;

Ki-1/57: Antígeno Ki-1/ de 57 kDa (Ki-1 antigen of 57 KDa);

LB: Meio Luria Bertani;

ND10: Corpúsculos nucleares 10 (nuclear bodies 10);

NDUFAB1: Proteína NADH ubiquinona desidrogenase, sucomplexo alfa/beta 1

(NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, alpha/beta subcomplex, 1);

NSEP1 (YB-1): Proteína de ligação ao elemento sensível a nuclease 1 (nuclease

sensitive element binding protein 1);

p53: Proteína de tumor p53 de 53 kDa (tumor protein p53);

p73: Proteína de tumor p73 de 73 kDa (tumor protein p73);

p100: Co-ativador do fator de transcrição do vírus Epstein-Barr 2 ou EBNA-2;

PAI: Inibidor do ativador do plasminogeno (plasminogen activator inhibitor);

PAI_RBP1: Proteína que se liga ao mRNA de PAI-1 (PAI-1 mRNA- binding protein);

PCR: Reação em cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction);

PDB: Banco de dados de estrutura de proteínas (Protein Data Bank);

PEG: Polietilenoglicol;

PKC: Proteina quinase C (Protein Kinase C);

PMA: 4 α -forbol 12-miristato 13-acetato (4α-phorbol 12-myristate 13-acetate)

PML: Proteína da leucemia promielocítica (Protein of Promielocytic Leukemia);

PML NBS: Corpúsculos nucleares PML (PML nuclear bodies);

RACK-1: Proteína adaptadora para quinase C-1 (Receptor for C Kinase-1)

RPL38: Proteína ribossomal l L38 (ribosomal protein L38);

SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de duodecil-sulfato

de sódio (sodium duodecyl-sulphate polyacrylamide gel electrophoresis);

SF2/p32: Fator de splicing 2/p32;

SFRS9: Fator de splicing rico em arginina/serina (splicing factor argine/serine rich 9);

Sp100: Antígeno nuclear Sp100 (nuclear antigen Sp100);

STAT: Sinalizador e ativador da transcrição;

SUMO-1: Pequeno modificador relacionado a ubiquitina (small ubiquitin-related

modifier);

TOPORS: Proteína que se liga a topoisomerase I (topoisomerase I binding protein);

UBC9: Enzima conjugada a ubiquitina E2I (ubiquitin-conjugating enzyme E2I);

X-gal: 5-bromo-4cloro-3-indol beta-D-galactosídeo (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-

galactopyranoside);

ZFP: Proteina com dedo de zinco (Zinc finger protein );

3AT: 3-aminotriazol;

xii

RESUMO

Ki-1/57 é um antígeno humano de 57kDa reconhecido pelo anticorpo Ki-1, o qual

também reconhece CD30. Ki-1/57 se encontra no núcleo e no citoplasma sendo

fosforilado nos resíduos de serina e de treonina após a ativação das células. Quando

Ki-1/57 foi isolado da linhagem L540 de células de linfoma de Hodgkin, ela co-

imunoprecipitou com atividade quinase em resíduos de Ser/Thr. Além disso, foi

relatado que Ki-1/57 interage com o ácido hialurônico e conseqüentemente foi

denominada de “proteína intracelular que se liga a hialuronato 4” (IHABP4). Nós

usamos o sistema de duplo híbrido em levedura e encontramos que Ki-1/57 interage

especificamente com a proteína com domínios cromo-helicase e de ligação ao DNA 3

(CHD3), uma proteína nuclear envolvida em remodelagem da cromatina e regulação

da transcrição, e com RACK1 (“proteína adaptadora para quinase C ativada”). A

interação entre Ki-1/57 e seus ligantes foi confirmada por outros experimentos in vitro

e in vivo. Interessantemente, a interação entre Ki-1/57 e RACK1 foi abolida após

fosforilação da Ki-1/57 e observamos que o estímulo de células L540 e HeLa com 4 α

-forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) resulta na saída de Ki-1/57 do núcleo. Ki-1/57

também demonstrou ser um substrato para proteína quinase C (PKC) quando ativada

com PMA, e sua fosforilação foi confirmada in vitro e in vivo. Esses dados sugerem

que Ki-1/57 está associada com a via de sinalização celular de RACK1/PKC e isto

pode ser importante para a regulação de suas funções nucleares. Sua interação com

CHD3 e com outras proteínas envolvidas na regulação transcricional, tais como:

Topors, Daxx e Tip60, entre outras, sugere que Ki-1/57 pode ter uma função neste

contexto funcional. RACK1 interage com p73, um parálogo de p53, inibindo sua

ativação transcricional. Nós ainda encontramos que Ki-1/57 também interage com

p53 não fosforilada e pode inibir sua ativação transcricional. A estrutura tridimensional

da proteína Ki-1/57 é desconhecida, mas nossos estudos espectroscópicos

mostraram que a proteína Ki-1/57 é predominantemente constituída por folhas β-

pregueadas. Além disso, Ki-1/57(122-413) apagou o sinal do espectro de CD de

RACK1 entre 229-300 nm, que é característico de proteínas ricas em triptofanos, e

também diminuiu a intensidade de emissão de fluorescência de RACK1. Isso sugere

que Ki-1/57 interage com os triptofanos na superfície de RACK1.

xiii

ABSTRACT

Ki-1/57, the 57-kDa human protein antigen recognized by the CD30 antibody Ki-1, is a

cytoplasmic and nuclear protein, which is phosphorylated on serine and threonine

residues upon cell activation. When isolated from the Hodgkin’s lymphoma analogous

cell line L540 Ki-1/57 was co-immunoprecipitated with a Thr/Ser protein kinase

activity. It has been also found to interact with hyaluronic acid and has therefore been

termed intracellular hyaluronan binding protein 4 (IHABP4). We used the yeast-two-

hybrid system to identify proteins interacting with Ki-1/57 and found that Ki-1/57

engages in specific interactions with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain

protein 3 (CHD3), a nuclear protein involved in chromatin remodeling and transcription

regulation, and with the adaptor protein Receptor of Activated Kinase-1 (RACK1).

Next, we confirmed these interactions by in vitro and in vivo experiments. Interestingly,

the interaction of Ki-1/57 with RACK1 is abolished upon activation of L540 cells with

4α-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), which results in the phosphorylation of Ki-

1/57 and its exit from the nucleus. We demonstrated that Ki-1/57 also co-precipitates

with protein kinase C (PKC) when isolated from PMA activated L540 tumor cells and is

a substrate for PKC phosphorylation in vitro and in vivo. These events associate Ki-

1/57 with the RACK1/PKC pathway and may be important for the regulation of its

nuclear functions. Its interaction with chromatin remodeling factors such as CHD3 and

other proteins involved in transcriptional regulation including Topors, Daxx and Tip 60

may suggest that Ki-1/57 has also a function in this context and that this function is

subject to regulatory events involving the PKC/RACK1 signaling pathway. RACK1 also

interacts with the p53 paralogue p73. In that case, the physical binding of RACK1 to

p73 can inhibit its transcription activation function. We found out that Ki-1/57 interacts

with unphosphorylated p53 and that this binding inhibits p53 transcription activation

function. The three-dimensional structure of Ki-1/57 is still unknown but our

spectroscopic studies demonstrated that Ki-1/57 consists predominantly of β-sheets.

Binding of Ki-1/57(122-413) to RACK1 abolishes its positive ellipticity at 229-300 nm,

which is characteristic for tryptophan-rich proteins, and decreases its emission

fluorescence. This suggests that surface tryptophans of RACK1 are involved in the

interaction with Ki-1/57.

xiv

1 INTRODUÇÃO

1.1 O linfoma de Hodgkin

O linfoma de Hodgkin teve sua descrição anatômica feita em 1832 por Thomas

Hodgkin (Hodgkin, 1832). Esta enfermidade é uma forma de câncer que se origina nos

linfonodos do sistema linfático (Levine, 2002). O sistema linfático é um conjunto

composto por órgãos, tecidos que produzem células responsáveis pela imunidade e

vasos que conduzem estas células através do corpo (figura 1) (para melhor

compreensão ler: Abbas et al., 2000). Os tecidos e órgãos que compõem o sistema

linfático incluem linfonodos, timo, baço, amídalas, medula óssea e rede de vasos

linfáticos, e a linfa, um líquido claro que banha estes tecidos, e que contém proteínas e

células linfóides. Os linfonodos são encontrados em todos as partes do corpo,

principalmente no pescoço, virilha, axilas, pelve, abdômen e tórax; produzem e

armazenam leucócitos denominados linfócitos. Nos linfonodos existem três tipos de

células denominadas linfócitos, sendo elas: os linfócitos B (ou células B), os linfócitos T

(ou células T), e as células NK ("natural killer"). Cada célula realiza uma função

específica no combate a infecções, e também tem importância no combate ao câncer

(Hall, 1998). Os linfócitos B produzem anticorpos, que se ligam na superfície de certos

tipos de antígenos produzidos por bactérias, vírus e outros, e atraem e ativam células

específicas do sistema imune. Os linfócitos T ajudam a proteger o organismo contra

vírus, fungos e algumas bactérias. Também desempenham importante papel regulatório

nas funções das células B. As células NK têm como alvo as células tumorais e protegem

contra uma larga variedade de agentes infecciosos.

O Linfoma de Hodgkin (LH) pode ocorrer em qualquer faixa etária, no entanto a

incidência da doença tem dois picos: o primeiro em torno de 15-35 anos e segundo

acima dos 45 anos (MacMahon, 1957). O LH costuma atingir mais meninos e, com maior

freqüência, nos adolescentes de 15 a 19 anos de idade do que qualquer outro câncer

(Yahalom e Stratus, 2004). Sabe-se que esta doença tem maior freqüência em pessoas

com doenças imunológicas e em famílias com casamentos consangüíneos (Yahalom e

Stratus, 2004).

Estima-se que aproximadamente 38.000 a 50.000 brasileiros contrairão linfoma

por ano, no entanto, a maioria dos pacientes com linfoma de Hodgkin pode ser curada

com o tratamento atual (ABRALE-www.abrale.org.br). Dentre todos os tipos de linfomas

existentes, este é o que apresenta maior chance de cura.

O tratamento clássico para o linfoma de Hodgkin, em geral, consiste de

poliquimioterapia, com ou sem radioterapia (Hunger et al., 1994). Dependendo do estágio

da doença no momento do diagnóstico, pode-se estimar o prognóstico do paciente com o

tratamento. Para os pacientes que sofrem recaídas (retorno) da doença, estão

disponíveis alternativas, dependendo da forma do tratamento inicial empregado. As

formas empregadas usualmente, e com indicações relativamente precisas, são a

poliquimioterapia e o transplante de medula óssea (Yaholom e Straus, 2004). A

mortalidade foi reduzida em mais de 60% desde o início dos anos 70 devido aos avanços

no tratamento (ABRALE-www.abrale.org.br).

O linfoma de Hodgkin surge quando um linfócito normal, freqüentemente um

linfócito B (com aproximadamete 95% de chance de ser afetado) se transforma em uma

célula maligna, capaz de crescer descontroladamente e disseminar-se (Braeuninger et

al., 1997; Küppers et al., 2003; Berglund et al., 2003). A célula maligna começa a

proliferar nos linfonodos, e com o passar do tempo, estas células malignas podem se

disseminar para tecidos adjacentes, e, se não tratadas, podem atingir outras partes do

corpo. No linfoma de Hodgkin, os tumores disseminam-se de um grupo de linfonodos

para outros grupos de linfonodos através dos vasos linfáticos.

Os fatores de risco que contribuem para desenvolver o linfoma de Hodgkin são:

sistema imune comprometido, doenças genéticas hereditárias, infecção pelo HIV, uso de

drogas imunossupressoras e membros de famílias nas quais uma ou mais pessoas

tiveram diagnóstico da doença (Forbes e Morbis, 1970; Chakravarti et al., 1986). Um

outro importante fator de risco, o qual vem sendo bastante estudado, é a associação de

pessoas infectadas pelo vírus Epstein-Barr e a presença de alguns subtipos do linfoma

de Hodgkin nestes indivíduos (Kuze et al., 1996; Garcia et al., 2003).

O linfoma de Hodgkin pode surgir em qualquer parte do corpo, e os sintomas da

doença dependem da sua localização (Hudson e Donaldson, 2002). Caso a doença se

desenvolva-se em linfonodos que estão próximos à pele, no pescoço, axilas e virilhas, os

sintomas provavelmente incluirão a apresentação de linfonodos aumentados e indolores

nestes locais (figura 2).

Linfonodos

Baço

Timo

Medula óssea

Rede de vasos linfáticos

Linfonodos

Baço

Timo

Medula óssea

Rede de vasos linfáticos

Figura 1: O sistema linfático humano.

(figura adaptada do site: http://www.escolavesper.com.br/defesasdocorpo.htm)

Figura 2: Uma pessoa que apresenta um aumento significativo dos linfonodos, na região

do pescoço, devido ao avanço do linfoma de Hodgkin. (figura retirada do site:

http://www.healthcentral.com/mhc/img/img1225.cfm)

Quando o linfoma de Hodgkin ocorre na região do tórax, os sintomas podem ser

de tosse, "falta de ar" (dispnéia) e dor torácica. E quando se apresenta na pelve e no

abdomem, os sintomas podem ser de plenitude e distensão abdominal (Toledo, 2004).

Outros sintomas do linfoma de Hodgkin incluem febre, fadiga, sudorese noturna, perda

de peso, e prurido ("coceira na pele") (Yaholom e Straus, 2004). No entanto, o local mais

comum de envolvimento é o tórax, região também denominada mediastino.

Pode-se distinguir o linfoma de Hodgkin de outros tipos de linfoma em parte

através do exame de amostras sob microscopia. O tecido obtido por biópsia de pacientes

com linfoma de Hodgkin apresenta células mononucleadas e pequenas, denominadas de

células Hodgkin malignas e células bi- ou polinucleares, denominadas de células Reed-

Sternberg (RS) (Reed, 1902; Irsch et al., 1998) (figura 3).

As células Reed-Sternberg produzem pelo menos 12 citocinas diferentes,

incluindo interleucina-1, e Fator de Necrose tumoral (TNF) (Toledo, 2004). Estas células

também expressam constitutivamente altos níveis de Fator Nuclear Ativado Kappa Beta

(NF-kB), que mostra um importante papel na sobrevivência do tumor (Hinz et al., 2001).

Esta aberrante ativação do NF-kB está relacionada a defeitos genéticos nos genes

inibidores de NF-kB, infecção viral por Epstein Barr vírus (EBV) e estímulo por citocinas.

EBV está presente em 90% das células RS, reforçando seu importante papel no

desenvolvimento do linfoma de Hodgkin (Khanna et al., 1995).

1.2 O papel da molécula CD30 no linfoma de Hodgkin

As células malignas de Hodgkin (H) e as células Reed-Sternberg (RS) no

linfoma de Hodgkin são caracterizadas pela expressão abundante de uma proteína de

membrana do tipo I, CD30, um membro da superfamília de receptores do fator de

necrose tumoral (TNFR) que possui 120 KDa e contem seis motivos ricos em cisteínas

que se repetem no seu domínio extracelular (Younes e Kadin, 2003; Pro e Younes, 2004;

Hsu SM e Hsu PL, 1994; Dürkop et al., 1992). Assim como os receptores TNF, CD30

pode apresentar uma forma solúvel (sCD30). A molécula sCD30 possui 85 KDa e é

encontrada no sobrenadante de cultura de linhagens celulares CD30+ e em soro de

pacientes com tumores CD30+ (Stein et al., 2000; Younes e Kadin, 2003).

Interessantemente, ao contrário dos outros membros da família de receptores TNF que

disparam a sinalização para a apoptose, CD30 não apresenta o domínio de morte

(“death domain”) na cauda citoplasmática (figura 4). A cauda citoplasmática de CD30

associa-se com os fatores associados a TNFR (TNF Receptor-associated factor): TRAF1

e TRAF2, que sinalizam a ativação de NF-kB (De Young et al., 2000).

A proteína CD30 é raramente expressa em outros linfomas do tipo T ou B ou na

maioria de tecidos normais (Gruss et al., 1994). O perfil restrito da expressão de CD30

em células H-RS explica porque esta é usada como um marcador tumoral do linfoma de

Hodgkin, e sugere a possível participação de CD30 no mecanismo que conduz ao

crescimento e à sobrevivência do tumor (Su et al., 2004). A molécula CD30 se liga à

molécula CD30L (ou CD153), expressa como uma glicoproteína de membrana do tipo II

em linfócitos T ativados, linfócitos B reativos, macrófagos ativados, neutrófilos e

eosinófilos ativados (Smith et al., 1993; Nicod et al., 1997; Pinto et al., 1996; Shanebeck

et al., 1995; Wiley et al., 1996). A via de sinalização de CD30L e CD30 leva à ativação do

fator nuclear NF-kB e conduz à expressão elevada de citocinas. A interação com estes

ligantes fazem com que a célula tumoral produza citocinas e quimiocinas que irão inibir a

função do Linfócito T citotóxico. CD30 regula a expressão de CD28, Fas ligante,

perforina e granzima B, sugerindo que CD30 pode ser um modulador da função do

linfócito T citotóxico em linhagens de células deste linfoma (Bowen et al., 1993; Muta et

al., 2000) (figura 5).

(RS)

Figura 3: Corte histológico de um linfonodo de um paciente com linfoma de Hodgkin. A

presença de células de Reed-Sternberg (RS) é indicada pelas setas. (figura retirada do

site: http://researchpath.hitchcock.org/levylecture/selfasspln.html)

Extracelular

Intracelular

Domínio

de Morte

Extracelular

Intracelular

Domínio

de Morte

Extracelular

Intracelular

Domínio

de Morte

Extracelular

Intracelular

Domínio

de Morte

Figura 4: A família de receptores TNF. Estes receptores apresentam grande homologia

em seus domínios extracelulares onde se encontra uma região variável rica em cisteínas

repetidas e muitos deles apresentam um domínio de morte que induz à morte celular. O

receptor de osteoprotegerin (OPG) é um receptor solúvel que também apresenta o

domínio de morte (1). A cauda intracelular de CD30, assim como TRAIL-R3, RANK e

CD40, não apresenta o domínio intracelular de morte, diferenciando-o dos outros

membros da família TNF os quais apresentam este domínio, com exceção de TRAIL-R4

que apresenta um domínio de morte incompleto (2). (figura do artigo de Younes e Kadin,

2003).

Os níveis aumentados de CD30 solúvel são também observados em outras

condições, tais como na artrite reumatóide, no câncer de colo retal, e na infecção viral

(HIV e EBV) (Wang et al., 1997; Gerli et al., 2001), e parecem também ser

correlacionados com as respostas imunes Th1 deficiente e as respostas imunes Th2

dominantes. Um nível aumentado de CD30 solúvel pode ser um marcador em que o

tratamento com IL-2 pode ajudar a restaurar o sistema imune comprometido (Gerli et al.,

2000). Ratos deficientes para o gene CD30 mostram uma seleção negativa defeituosa no

timo (Amakawa et al., 1996), e ratos transgênicos que super expressam CD30 em

células T confirmaram o envolvimento de CD30 na seleção negativa do timo (Chiarlie et

al., 1999). Isso sugere um papel de CD30 na seleção ou na apoptose de células T no

timo (Kadin, 2000).

As células H-RS produzem quimiocinas e citocinas que podem explicar a

inflamação característica de tecidos afetados pelo linfoma de Hodgkin (Hsu et al., 1995).

Várias quimiocinas e citocinas que são produzidas conduzem a um influxo preferencial

de células-Th2 e suprimem respostas imunes do tipo Th1 (Poppema,1989). Com isto, a

inflamação causada pelo tumor não promove uma resposta anti-tumoral citotóxica. Um

outro fator importante é que a molécula CD30 pode estar associada ao estado

imunodeprimido no linfoma de Hodgkin, limitando o potencial e a ativação proliferativa

das células T (Hsu et al. 1993). Por outro lado, CD30 pode não só inibir a proliferação de

células T, mas também inibir a produção de interleucina-2 (IL-2) e a expressão de CD25

e de CD26 pelas células T (Su et al., 2004).

A molécula CD30 é um bom alvo para a terapia com anticorpo monoclonal, uma

vez que a expressão desta molécula é restrita a um pequeno número de linfócitos T e B

ativados e saudáveis (Schnell et al., 2002; Borchmann et al., 2004; Heuser et al., 2004).

Interessantemente, estas células saudáveis contribuem para a propagação do linfoma de

Hodgkin, uma vez que também expressam o CD30L. Se esta população de células

normais for eliminada com as células tumorais, isto pode ser benéfico para o paciente

(Pro e Yones, 2004).

Linfócito T Citotóxico

Citocinas

Citocinas e Quimiocinas

Reed-

Sternber

Linfócito

Figura 5: CD30 modula a função do linfócito T citotóxico. As células Reed Sternberg do

linfoma de Hodgkin não expressam CD30L ou CD40L, que são expressas por linfócitos B

reativos e normais. A interação entre estes ligantes faz com que a célula tumoral produza

citocinas e quimiocinas que inibem a função do linfócito T citotóxico. Uma vez inibido, o

linfócito T não atua sobre a célula tumoral e esta continua a se proliferar

descontroladamente sem sofrer a ação citotóxica. (figura adaptada do artigo de Pro e

Younes, 2004).

1.3 O anticorpo Ki-1 detecta CD30 e uma proteína de 57 KDa : Ki-1/57

O anticorpo monoclonal Ki-1 foi o primeiro anticorpo usado na detecção de

células de Hodgkin, reagindo com células SR e H em todos os tipos histológicos de

linfoma de Hodgkin e com uma pequena população de células grandes em tecido linfóide

normal (Schwab et al., 1982). Análises bioquímicas mostraram que o anticorpo Ki-1

reage com CD30, uma glicoproteína de membrana de 120 kDa também conhecida como

Ki-1/120. Antes de ser glicosilada CD30 apresenta uma forma intermediária de 85 kDa.

No entanto, Hansen e colaboradores observaram que este anticorpo reage com uma

outra proteína intracelular de 57 kDa que é sintetizada independentemente de CD30

(Hansen et al. 1990). Para chegar a esta conclusão, estes pesquisadores marcaram a

linhagem L540 de células de Hodgkin in vivo com metionina radioativa (

S) durante um

curto período de tempo e as moléculas que reagiram com o anticorpo Ki-1 foram

recuperadas por intervalos de tempo diferentes (“pulse chase experiment”). Eles

observaram que após 3 minutos, a molécula intracelular de 57 kDa e a molécula

precursora de CD30 de 85 kDa foram detectadas. Eles observaram que a intensidade da

banda de 57 kDa não mudou durante todos os 270 minutos do experimento, no entanto,

a banda de 85 kDa desaparece após 90 minutos, sendo substituída por uma banda de

120 kDa. Esses resultados sugerem que estes dois antígenos Ki-1/120 (CD30) e Ki-1/57

são sintetizados independentemente e que o anticorpo Ki-1 reconhece o Ki-1/57 por

reação cruzada.

Usando a porção C-terminal de Ki-1/57 foram produzidos novos anticorpos

monoclonais (A26 e E230) que interagem especificamente com Ki-1/57 pelas técnicas de

"Western-blot" e imunoprecipitação (Kobarg et al., 1997). Para testar o potencial de Ki-

1/57 funcionar como marcador para doenças neoplásicas, Kobarg e colaboradores

testaram a expressão desta proteína em vários tecidos neoplásicos por

imunohistoquímica. Eles observaram que o anticorpo monoclonal A26 reage com células

tumorais em linfoma de Hodgkin, leucemia linfática de célula B, linfoma de célula T- não-

Hodgkin , carcinoma de bexiga e de próstata (Kobarg et al., 1997).

1.4 Características da Proteína Ki-1/57

A proteína Ki-1/57, mas não Ki-1/120 ou CD30, é associada com atividade

quinase e mostrou-se fosforilada em resíduos de serina e treonina quando isolada de

células L540 do linfoma de Hodgkin (Hansen et al, 1989 e Hansen et al.,1990). No

entanto, não foi encontrado nenhum domínio catalítico de quinase na seqüência de Ki-

1/57.

Análises de microscopia eletrônica demonstraram que a proteína Ki-1/57 não

está localizada apenas no citoplasma, mas também nos poros nucleares e no núcleo,

associada ao nucléolo (Rhode et al., 1992). Experimentos de marcação in vivo e de

"pulse-chase" revelaram que somente a forma citoplasmática da proteína Ki-1/57 é

fosforilada em resíduos de serina-treonina, enquanto que a forma nuclear não é

fosforilada (professor Dr. H. Lemke, comunicação pessoal).

Peptídeos derivados da digestão tríptica de Ki-1/57 foram seqüenciados e as

seqüências peptídicas resultantes foram usadas para a clonagem do cDNA parcial de Ki-

1/57, a partir da biblioteca de cDNA derivada de células L540 (Kobarg et al., 1997). O

seqüenciamento de vários clones revelou que o cDNA contém 1380 bp e compreende

aproximadamente 60% do C-terminal da proteína Ki-1/57. A tentativa de clonar o início 5´

da região do cDNA de Ki-1/57 por RT-PCR e 5´RACE inicialmente não teve sucesso

porque nesta região o cDNA de Ki-1/57 contém uma seqüência de 100 pb rica em GC

(82%) que dificulta a sua amplificação. A seqüência parcial do Ki-1/57 não revelou

nenhuma homologia significativa com outras proteínas no banco de dados.

O cDNA parcial do Ki-1/57 foi usado para mapear a localização cromossômica

do gene Ki-1/57 por FISH ("Fluorescence In Situ Hybridization"). O gene foi mapeado nas

bandas 9q22.3-q31 no braço longo do cromossomo 9 humano (Kobarg et al., 1997). Esta

região é freqüentemente afetada por deleções secundárias na leucemia aguda mielóide

do tipo M2 [translocação t(8;21)] e M3 [translocação t(15;17)] (Heim and Mitelman, 1986).

Outros pesquisadores obtiveram o cDNA inteiro que codifica a protéina Ki-1/57

(Huang et al., 2000). Estes caracterizaram este antígeno como uma proteína intracelular

que se liga a hialuronato, devido à presença de possíveis motivos de ligação a

hialuronato (R/K-X

-R/K) na sua seqüência, onde R corresponde a arginina, K a lisina e X

a qualquer aminoácido. O glicosaminoglicano hialuronato possui uma função bem

definida na matriz extracelular e na superfície das células, no entanto, há algumas

descrições de que este pode ser encontrado no citoplasma e também no núcleo da

célula, mas com função desconhecida (Furukawa e Terayama, 1979; Ripellino et al.,

1988, Grammatikakis et al., 1995; Evanko e Wight, 1999). Baseando-se neste motivo de

ligação a hialuronato, nós observamos que em uma análise aleatória de 10 proteínas

nucleares todas possuem esse motivo e, curiosamente, cinco entre estas são

extremamente ricas nesses motivos. Entre estas cinco proteínas estão: CHD3

(NM_001272.1) com 49 repetições; Topors (NM_AF098300) com 36 repetições;

Policomb2 Humana (AF013956) com 7 repetições; p53 (AAH03596) com 3 repetições e

c-Fos (K00650) com 2 repetições. Isto sugere que a maioria das proteínas nucleares

ricas em arginina e lisina são capazes de interagir com hialuronato? Esta questão ainda

está em aberta uma vez que o papel intracelular e nuclear do hialuronato ainda não foi

estudado.

Quando esse projeto foi iniciado, sabia-se muito pouco sobre as possíveis

funções da proteína Ki-1/57. Além disso, nada se sabia a respeito da estrutura da

proteína Ki-1/57.

2 OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi estudar os aspectos funcionais e estruturais

da proteína Ki-1/57 e de seus possíveis ligantes protéicos.

Para a caracterização do contexto funcional e aspectos estruturais desta

proteína os objetivos específicos foram:

1- Analisar a expressão tecido específica do mRNA que codifica a proteína Ki-1/57;

2- Identificar proteínas com as quais a proteína Ki-1/57 interage, utilizando o sistema de

duplo híbrido em levedura para;

3- Analisar a fosforilação de proteína Ki-1/57 e sua associação com a atividade de

proteína quinase quando Ki-1/57 é isolada de células humanas;

4- Analisar a localização subcelular da proteína Ki-1/57;

5- Análises espectroscópicas da proteína Ki-1/57 por dicroísmo circular (CD) e

fluorescência na presença e na ausência de possíveis ligantes.

3 RESULTADOS

3.1 Artigo I :

Characterization of a family of proteins that

interact with the C-terminal region of the

chromatin-remodeling factor CHD-3

Taíla A. Lemos, Dario O. Passos, Flávia C. Nery and Jörg Kobarg

FEBS Letters 533 (1- 3): 14-20 (2003)

3 RESULTADOS

3.2 Artigo II:

Ki-1/57 Interacts with RACK1 and Is a Substrate

for the Phosphorylation by Phorbol 12-Myristate

13-Acetate-activated activated Protein Kinase C

Flávia C. Nery, Dario O. Passos, Vera S. Garcia and Jörg Kobarg

Journal of Biological Chemistry 279(12): 11444-11455 (2004)

3 RESULTADOS

3.3 Artigo III:

Ki-1/57 interacts with p53 and interferes

negatively in its transcriptional activation

function

Flávia C. Nery, Edmilson Rui, and Jörg Kobarg

(Artigo submetido)

Ki-1/57 interacts with p53 and interferes negatively in

its transcriptional activation function

Flávia C. Nery

a,b

, Edmilson Rui

a,c

, and Jörg Kobarg

a, b, c,

Centro de Biologia Molecular Estrutural, Laboratório Nacional de Luz Síncrotron,

Rua Giuseppe Máximo Scolfaro 10.000, C.P. 6192, 13084-971 Campinas - SP, Brasil

Departamento de Genética e Evolução and

Departamento de Bioquímica,

Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil

*Corresponding author: Tel.: (55) 19-3512-1125, Fax: (55) 19-3512-1006, E-mail:

[email protected]

Abstract:

Ki-1/57 is a cytoplasmic and nuclear phospho-protein of 57 kDa and interacts with the

adaptor protein RACK1. Upon cellular activation with PMA the protein kinase C

phosphorylates Ki-1/57 on several C-terminal Thr and Ser residues and binds now

itself to this newly generated docking sites. The interaction of Ki-1/57 with RACK1

after phosphorylation on the other hand is completely abolished. Aside this Ki-1/57

also interacts with a series of nuclear proteins including CHD3, Daxx and Topors,

suggesting that it might be involved in the regulation of transcription. Here we describe

yeast two-hybrid studies that identified a total of 11 proteins interacting with Ki-1/57, all

of which interact or are functionally associated with p53 itself or other members of the

p53 family of proteins. We found that Ki-1/57 is able to interact with p53 in the yeast

two-hybrid system when the interaction was tested directly. This interaction could be

confirmed by pull down assays with purified proteins in vitro and by a co-

immunoprecipitation assay of the proteins from the human Hodgkin analogous

lymphoma cell line L540. Furthermore, we found that the in vitro phosphorylation of

p53 by PKC abolishes its interaction with Ki-1/57. Finally, we found in a transactivation

assay in yeast cells that the co-expression of Ki-1/57 inhibits the p53 dependent

expression of a beta-galactosidase reporter gene. Altogether, we identified Ki-1/57 as

a new p53 interacting protein, which can negatively influence its transactivation

function and found further support for the hypothesis that Ki-1/57 may be involved in

the regulation of transcription.

Keywords: protein-protein interaction, yeast two-hybrid system, transactivation,

cellular localization.

Abbreviations: MM, minimal medium; CHD-3, Chromobox Helicase DNA-binding

Domain protein 3; RACK1, Receptor of Activated Kinase 1; PKC, protein kinase C;

PMA, phorbol 12-acetate; PAI, plasminogen activator inhibitor; IHABP4, intracellular

hyaluronan-binding protein 4.

1. Introduction

The protein antigen Ki-1/57 was originally identified by the cross-reaction of the

first CD30 monoclonal antibody Ki-1 [1-4]. Ki-1 detected not only the 120 kDa

transmembrane protein CD30 but also the cytoplasmic and nuclear Ki-1/57 in the

malignant Hodgkin and Sternberg-Reed cells in Hodgkin lymphoma [1] and in the

Hodgkin analogous tumor cell line L540 [4]. Ki-1/57 is a phospho-protein [2, 3] and

when isolated from the L540 cells is associated with a serine/threonine protein kinase

activity [4]. Electron microscopic analyses demonstrated that the Ki-1/57 antigen is not

only located in the cytoplasm but also at the nuclear pores and in the nucleus where it

is frequently found in association with the nucleolus and other nuclear bodies [5].

Tryptic digestion of the Ki-1/57 antigen resulted in the cloning of a partial cDNA

encoding Ki-1/57 [6]. The isolated contig of 1380 bp length, encoded the C-terminal

60% of the Ki-1/57 protein. Another group cloned the full length cDNA clone [7], found

that Ki-1/57, due to its many positively charged Arg and Lys residues is able to interact

with several negatively charged macromolecules, including glycosaminoglycans and

RNA. Huang and co-workers called Ki-1/57 Intracellular hyaluronan-binding protein 4

(IHABP4) because of its binding to hyaluronat [7]. By searching for related proteins we

discovered a cDNA sequence encoding the protein CGI-55 a possible human paralog

of the Ki-1/57 protein with 40,7 % identity and 67,4 % similarity with Ki-1/57 [8].

Recent studies from our group suggest that both Ki-1/57 and CGI-55 are proteins that

could be involved in nuclear functions such as the regulation of transcription [8]. We

found that both proteins interact with the chromatin remodeling protein CHD-3 [8] and

with several other transcriptional regulators including Topors and Daxx [9].

Furthermore, we found that Ki-1/57 interacts and forms a stable complex in human

cells with the adaptor protein RACK1, which itself is physically associated with

activated PKC [9]. This interaction provided a possible explanation for the initial

observation of the association of the Ki-1/57 antigen with a Ser/Thr kinase activity. Ki-

1/57 is also able to associate with PKC and serves as its substrate for phosphorylation

in vitro and in vivo. The stable interaction of Ki-1/57 with RACK1 is abolished by the

PMA mediated PKC dependent phosphorylation of Ki-1/57 [9]. These data suggest

that the nuclear functions of Ki-1/57 could be regulated by a cytoplasmic signaling

cascade involving PKC and RACK1. Most interestingly, it has been described recently

that RACK1 has a negative regulatory function on the transcription activation function

of p73, a member of the p53 family of proteins [10].

P53 is functionally a tumor suppressor protein and belongs to the large protein

group of transcription factors. It displays its growth suppression properties by the

transcriptional regulation of gene expression. Specifically, p53 is involved in

safeguarding the genomic integrity [11], sensing of DNA damage [12], monitoring of

the G1 checkpoint of the cell cycle [13] and activation of the cellular apoptosis

program to kill cells with damaged genomes [14]. Genes controlled by p53 include p21

[15], GADD45 [13], cyclin G [16] and bax [17] among many others. The inactivation of

p53 function through mutations or by interaction with viral and altered cellular proteins

is a common event in human carcinogenesis and the majority of human cancers have

mutations in the p53 gene [18]. Among several other cellular proteins Daxx [19],

Topors [20] and MDM2 [21] have been described to directly interact with p53 or have

an influence on its function. The direct interaction of regulatory proteins with p53 can

interfere with p53 functions, like its multimerization, its transactivation function or its

sequence specific DNA binding [22]. Furthermore the function pf p53 also seems to be

tightly controlled by post-translational mechanisms, including phosphorylation and

acteylation among others [23, 24, 25]. Here, we report that the human protein Ki-1/57

interacts with several p53 interacting proteins as well as with p53 itself in the yeast

two-hybrid system. The interaction of p53 and Ki-1/57 could be confirmed by

independent assays in vitro and in vivo. We also show that Ki-1/57 negatively

influences the p53 dependent transcription and that phosphorylation of p53 blocks the

interaction with Ki-1/57 in vitro. Our results suggest that Ki-1/57 is a protein that might

be involved in transcriptional regulation processes and identify it as a new p53

interacting protein with inhibitory functions.

2- Materials and Methods

2.1. Plasmid construction, antibodies and cell culture

A pGEX plasmid containing the full length human p53 in frame with GST was

kindly provided by Dr. Gianni Del Sal (Laboratorio Nazionale CIB, Trieste, Italy). The

gene coding human p53(1-393) protein was amplified from this vector with specific

primers and inserted in frame with the Gal4 activation domain, via EcoRI and BamHI

sites, into the cloning site of the yeast expression vector pGAD424 (Clontech). The

correctness of all vector constructs was confirmed by DNA sequencing. The Ki-1/57

constructions in the yeast vectors pBTM116, pGAD424 and the bacterial vectors pET-

28a have been described previously [9]. The large T-Gal4-AD vector had been kindly

provided by Dr. M. Bucciarelli Rodrigues (UFMG, Belo Horizonte, Brasil). Antibodies

A26 [6] and Ki-1 [1] and cell culture procedures for the L540 cells have been

described previously elsewhere [26, 9].

2.2. Yeast Two-hybrid Screening and Interaction Analysis

The pBTM116-Ki-1/57(1-150) and pBTM116-Ki-1/57(122-413) vectors were

used to express the protein Ki-1/57 (C-terminal) linked to the C-terminus of LexA

DNA-binding domain peptide in Saccharomyces cerevisiae strain L40 [27, 28, 29]. A

human fetal brain cDNA library (Clontech) expressing GAL4 activation domain (AD)

fusion proteins was co-transformed separately with both recombinant pBTM116

vectors. Selection of growth of co-transformands (on –W, -L, -H culture medium

plates), β-galactosidase activity test, plasmid DNA extraction and sequencing were

performed as described [30].

2.3. Bacterial expression, protein purification and in vitro protein phosphorylation

GST-p53 protein and 6xHis-Ki-1/57 proteins were expressed in E. coli BL21-

CodonPlus-RIL (Stratagene), and purified using Glutathione-sepharose 4B

(Amersham) or Ni-NTA sepharose beads (Qiagen) according to procedures provided

by the manufacturers [30, 9]. In vitro protein phosphorylation has been described

previously [9].

2.4. In vitro binding assay and western blot analysis

1 µg of GST-p53 fusion protein was coupled to glutathione sepharose beads.

Next, 1 µg of phosphorylated or non-phosphorylated 6xHis-Ki-1/57 proteins were

incubated on and end-over-end mixer for 2 h with the GST-p53 beads and then

washed with buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl). Proteins bound to the

beads were separated by SDS-PAGE, transferred to a PDVF membrane and

visualized by immuno-chemiluminescence using a mouse anti-GST or mouse anti-

5xHis antibody and secondary anti-mouse IgG-HRP conjugate for detection.

2.5. In vivo binding assay and western blot analysis

1.0 x 10

L540 were collected and lysed in 1 ml buffer W (20 mM Tris-HCl, pH

7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1%

Triton X-100, mix of 5 protease inhibitors). Lysate was treated with DNAse (Promega)

and cleared at 14.000 x g for 15 min. Next 20 µl protein A sepharose beads

(Pharmacia) were loaded with the indicated antibodies, washed with buffer W and

incubated or not with the indicated lysates for 2 h at 4 °C. After further two washes

with buffer W the beads were re-suspended in SDS-PAGE loading buffer, boiled and

analyzed by Western blot using different monoclonal antibodies for detection. Western

blots were developed by chemiluminescence as described [30].

2.6. Analysis of protein by fluorescence microscopy

L540 and Cos7 cells were maintained at 37 ºC in 5% CO2 in Dulbecco´s

modified Eagle´s medium containing 20% or 10% heat inactivated fetal calf serum

respectively. Cells were cultured on glass cover slips for 24 h, fixed with 100%

methanol and incubated with the goat anti-p53 (C-19, Santa Cruz Biotech.) polyclonal

and mouse anti-Ki-1 monoclonal antibodies. Fluorescein-coupled anti-mouse (green)

or rhodamine-conjugated anti-goat antibodies (red) were used as secondary

antibodies. DAPI staining (blue) was used to show the position of the nuclei. Cover

slips were then mounted in 80% glycerol / 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) on cover glasses

and analyzed with a fluorescence microscope (Eclipse E600, Nikon).

2.7. Yeast one-hybrid system based transcriptional activation assay

The vector p53blue (Clontech) was generated by inserting three tandem copies

of the consensus p53 binding site via EcoRV and SalI sites into the vector pLacZi

(Clontech). This vector was linearized with ApaI and transformed into yeast strain

W303 (genotype: ade2-1/ade2-1; ura3-1/ura3-1; his3-11,15/his311,15; trp1-1/trp1-1;

leu2-3,112/leu2-3,112) for integration into its genome and generation of the yeast

reporter strain W303-p53blue, which was used for the yeast one-hybrid transcriptional

activation assay described below. Next, W303-p53blue cells were co-transformed with

the plasmid constructions indicated in Fig. 5. The degree of activation of the p53

promotor lacZ reporter construct was then assessed by an ONPG (o-nitro phenyl B-D-

galactopyranoside) liquid assay (Clontech). Briefly, equal quantities of yeast cells were

centrifuged and disrupted in Z-buffer (60 mM Na

HPO

, 40 mM NaH

, 10 mM KCl,

1 mM MgSO

) by freeze-thawing. 25 mM 2-mercaptoethanol and 10 mM ONPG (each

dissolved in Z-buffer) were added to each reaction. After 1 h at 30 °C the reaction was

stopped by adding 0.3 volumes of 1 M Na

After mixing and centrifugation the OD

of the supernatants was measured at 420 nm using a spectrophotometer. All

experiments were done in triplicate and the average value was plotted as arbitrary

units as described previously [31].

2.8. Phosphorylation of p53

For phosphorylation of p53 before In vitro binding assay, the protocols were

adjusted in order to avoid the thermal denaturation of p53 during prolonged incubation

at 30

C. p53 was phosphorylated for 10 min at 30

C with 20 mU of PKC (Promega).

Only unlabelled ATP was used for this assay. The PKC reaction (20 µl) was

performed in a buffer containing 20 mM Tris/HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.2 mM

CaCl2, 0.1 mg/ml PMA, and 10 mM ATP.

3. Results and Discussion

3.1. Yeast two-hybrid screens employing the N- and C-terminal regions of Ki-1/57

To gain functional insights via the identification of interacting proteins of Ki-1/57,

the yeast two-hybrid system [27-29] was employed, utilizing a human fetal brain cDNA

library. We performed two screens for Ki-1/57 using the construct pBTM116-Ki-

1/57(122-413) encompassing the C-terminal of Ki-1/57 and pBTM116-Ki-1/57(1-150),

spanning the N-terminal region of Ki-1/57. We sequenced a total of aprox. 100 bait

plasmids for Ki-1/57(122-413) and another 100 for Ki-1/57(1-150).

Interestingly, we identified a series of proteins interacting with both types of constructs

that are functionally associated with p53 (Table 1). In fact all identified proteins shown

in Table 1 either interact directly with p53 or with another member of the p53 protein

family (e.g. p73). Further interacting proteins that interact with several of the Ki-1/57

interacting proteins include SUMO, Topoisomerase 1 and PML. All of these proteins

are functionally interconnected and either directly or indirectly associated to the

regulation of transcription and this emphasizes the potential functional relevance of

the newly discovered interactions.

We did however not identify p53 itself in the yeast two-hybrid screen. This is

most likely due to the fact that p53 only interacts with full length Ki-1/57 (see next

section) and we used two fragments of Ki-1/57 in the two screens. However, we found

the appearance of so many p53 interacting proteins intriguing and speculated that Ki-

1/57 might also be able to interact with p53 and could be functionally associated to it.

To test this hypothesis we inserted murine (72-390) p53 (mp53) and full-length human

p53 (hp53) into the two-hybrid vectors pBTM116 or pGAD424 (see below) and tested

the interaction of Ki-1/57 and p53 in a direct assay one on one.

3.2. Test of direct interaction between Ki-1/57 and p53 in the yeast two-hybrid system

To directly test the interaction between Ki-1/57 and mp53(72-390) a series of

bait and prey construct were generated in the yeast two-hybrid system vectors

pBTM116 (lexA-DNA-binding domain) and pGAD424 (Gal4-activation domain) and co-

transformed as indicated in Fig.1. We found that only full length Ki-1/57 is capable to

interact with mp53, whereas three different deletion constructions all failed to interact

with mp53. Since two of these constructs (Ki-1/57 1-150 and Ki-1/57 122-13) were

used in our library screenings, this might explain why we did not find p53 as an

interacting protein. Interestingly, the interaction could be confirmed when the inserts

and vectors were interchanged. Ki-1/57 in fusion to either lexA or Gal4AD interacts

equally well with mp53 fused to Gal4AD or lexA, respectively (Fig.1, compare sections

3 and 4). Since the murine p53 constructs lacks the amino acids 1-72 the interaction

does not seem to involve the N-terminal domain of mp53. As controls we used empty

vector (Fig.1, section 2) and a construct of large T, which interacted as expected with

p53 (Fig.1, section 1).

We also tested all deletions and full length Ki-1/57 in pBTM116 against full-

length human p53 cloned in pGAD424 and obtained the same results as for mp53

above (data not shown). These data suggested that Ki-1/57 interacts with p53 in a

specific and reproducible manner.

3.3. In vitro confirmation of the interaction between Ki-1/57 and p53 with purified

recombinant proteins

In order to test the newly identified interaction between Ki-1/57 and p53 we

performed a series of independent control experiments. First, we carried out a pull

down assay with purified recombinant proteins that had been expressed in E. coli

(GST, GST-p53, 6xHis-Ki-1/57) to confirm the interaction between Ki-1/57 and p53 in

vitro. As shown in Fig. 2A GST-p53 or GST control protein bound to the glutathione

beads. After wash and incubation with 6xHis-Ki-1/57 protein in the supernatant the

bound protein was detected by anti-5xHis monoclonal antibody (Fig.2B).

In a parallel set of experiments we also analyzed if the in vitro phosphorylation

of either 6xHis-Ki-1/57 or p53 by PKC had any influence on the interaction of the two

proteins (Fig.2, GST-p53-P, 6xHis-Ki-1/57-P). We previously reported that the

interaction of Ki-1/57 with the adaptor protein RACK1 is abolished in vitro and in vivo

by the phosphorylation of Ki-1/57 on some C-terminal Thr and Ser residues [9]. Here

we found that the phosphorylation of Ki-1/57 does not influence its capacity to interact

with p53.

The in vitro phosphorylation of p53 on the other hand totally blocked the

interaction between p53 and Ki-1/57 as well as Ki-1/57-P. The phosphorylation of p53

can have both an inhibitory [23] as well as a stimulatory effect [21] on the DNA binding

affinity and transactivation function of p53. This depends on the kinase that acts on

p53, its target Ser, Thr or Tyr residue and its localization in one of the four principal

domains (trans-activation, DNA-binding, tetramerization and C-terminal negative

regulatory domains) of p53. The phosphorylation may positively or negatively

influence p53 interaction with the target promotor DNAs or with regulatory proteins

including UBC9 [32].

Figura 1. Only full length Ki-1/57 interacts with the mp53 in the yeast two-hybrid

assay.

(A)-(C) Direct test for interaction between mp53(72-390) and Ki-1/57 and mapping of

the regions of Ki-1/57 that interact with p53. N- and C-terminal truncations of human

Ki-1/57 were fused in frame to indicated domains in plasmids pBTM116 or pGAD424

and co-transfected into yeast L40 cells with vectors containing the fusion of mp53(72-

390) in these vectors (see table D for details). Interaction was determined by the

ability of the co-transformand cells to grow on MM,-W,-L,-H (B). Presence of "bait" and

"prey" plasmids in the co-transformed cells was controlled by growth on MM-W,-L (A).

in case of productive interaction between fusion proteins. D: Table indicating the used

vector constructions of Ki-1/57, mp53 and control fusions for the co-transfections 1-7.

Figura 2. In vitro pull down assay with recombinant immobilized GST-p53 and

6xHis-Ki-1/57 protein, but only in its non-phosphorylated form.

Briefly, glutathione sepharose beads were coupled with GST-p53 fusion protein. Next

the loaded beads were washed then incubated with the proteins: wild type 6xHis-K-

1/57 or 6xHis-Ki-1/57P, which had been previously phosphorylated in vitro by PKC.

After washing the bound proteins were analyzed by anti-GST (A) or anti-5xHis (B)

Western blots. Detected fusion proteins (GST or 6xHis-tags) are pointed out by arrows

on the left side and right side of the panels.

3.4. Co-immunoprecipitation of Ki-1/57 and p53 from human L540 cells

In order to test if Ki-1/57 and p53 can form a stable complex in human cells we

performed co-immunoprecipitation experiments with anti-Ki-1/57, anti-53 and control

antibodies. We used the human Hodgkin’s disease analogous cell line L540 [26] for

these experiments since both Ki-1/57 [9] and p53 [33] are expressed in these cells.

We found that when we immuno-precipitated p53 from the L540 cells that Ki-1/57 co-

precipitates (Fig. 3, lane 7). This co-precipitation is specific, since it does not occur

with an anti-mouse IgG control antibody (lane 3). The Ki-1/57 protein band was

identified by both analysis of the L540 lysate directly (lane 1) as well as by

immunoprecipitation with the Ki-1/57 specific antibody A26 (lane 4). Bands derived

from the antibodies heavy or light chains were controlled by running out antibodies

loaded to protein sepharose beads prior to incubation with L540 lysate (lanes 2, 4, 6).

3.5. Sub-cellular co-localization of Ki-1/57 and p53

Next we tested if p53 and Ki-1/57 co-localize in mammalian cells. We used

Cos7 cells, since they express p53 and have a similar morphology as adherent Hela

cells, which do not express p53. Cos7 cells were grown on glass cover slips, fixed and

stained with DAPI. Ki-1/57 was immunodetected with mouse anti-human A26 antibody

and sheep anti human p53 antibody. Anti mouse FITC coupled and anti sheep

rhodamine antisera were used as secondary reagents for detection. As previously

described Ki-1/57 is localized both in the cytoplasm and in the nucleus [9] and p53 is

predominantly localized in the nucleus (Fig. 4). The nuclear localization of both

proteins is confirmed by the nuclear DAPI staining. When both proteins stainings are

merged there is a clear orange colored overlap of the two labelings, especially

pronounced in the region directly underneath the nuclear envelope.

Figura 3. Co-immunopreciptiation of Ki-1/57 and p53 from the lysate of L540

cells.

L540 Hodgkin analogous cells were lysed. The lysate was (AL)

immunoprecipitated (IP) with the indicated antibodies against Ki-1/57, p53 or IgG

(negative control). Also run out on the gel were additional controls of the same

amounts of antibodies (A) which had not been incubated with lysate as well as lysate

itself (L). The Western blot (WB) was then developed by A26 antibody, which detects

Ki-1/57. The arrow heads indicate the Ki-1/57 protein and the asterisk the heavy and

light chains of the used antibodies.

3.6. Ki-1/57 inhibits p53 dependent transactivation of beta-galactosidase expression in

the yeast

It has been previously described that p53 is a transcriptional activator of many

different promoters [13, 15-17]. Several other proteins have been described that either

co-activate or inhibit the transactivation function of p53 most likely by physically

interacting with the p53 protein (Table 1). We wanted to test if Ki-1/57 is capable of

influencing the transcription activation function of p53 on a target promotor. Therefore,

we established a yeast one-hybrid system based transcription activation system. The

yeast strain W303 was transfected with a plasmid containing the LacZ gene (encoding

beta-galactosidase) under control of a p53 promotor region. Next, additional co-

transfections of the yeast expression plasmids (pGAD424) encoding human p53 in

fusion with the Gal4 activation domain or empty vector on the one hand and of a

second yeast expression plasmid (pBTM116) encoding full length Ki-1/57 protein

fused to the lexA DNA binding domain or empty plasmid were performed (Fig. 5). The

co-transfected yeast clones were than tested for the activation of the p53 reporter

gene encoding beta galactosidase (ONPG enzymatic assay of the beta-galactosidase

activity).

As expected, the presence of only the p53 encoding plasmid caused a relatively

strong activation of the reporter gene (Fig 5., 2 column) but remained on

approximately the same level when an empty pBTM116 had been co-transfected into

the cells (column 3). The co-transfection of a pBTM116 plamid containing the cDNA

coding for full length Ki-1/57 caused a decrease in the level of beta-galactosidase

expression by 56% in these cells (column 4). Expression of Ki-1/57 alone on the other

hand had no significant capacity to increase the p53 promotor activity (column 5)

leaving the beta-galactosidase activity on the background level observed for cells

transfected with empty pGAD424 vector (Gal4-AD, column 1) or with empty pBTM116

vector (lexA-BD, data not shown).

Figura 4. Sub-cellular localization of endogenous Ki-1/57 and p53 in Cos7 cells.

Cos7 cells were grown on glass cover slips and after 24 h were fixed with 100%

methanol and proteins were detected and analyzed on a Nikon fluorescence

microscope using the following primary antibodies: Ki-1 monoclonal mouse antibody

and goat anti-p53 monoclonal antibody. Fluorescein-coupled anti-mouse (green) or

rhodamine-conjugated anti-goat antibodies (red) were used as secondary antibodies.

DAPI staining (blue) was used to show the position of the nuclei. Superimposing the

two colors (merge) results in a yellow/orange color.

Figura 5. Ki-1/57 inhibits p53 dependent transactivation of beta-galactosidase

expression in the yeast

W303-p53blue yeast cells were transfected or co-transfected with the indicated

plasmid constructs: Gal4 (empty pGAD424 vector), LexA (empty vector pBTM116),

Gal4-p53 (pGAD424 vector containing full length human p53 cDNA), LexA-Ki-1/57

(pBTM116 vector containing full length human Ki-1/57 cDNA). Freshly grown

transfected colonies were then grown in liquid culture. After adjusting equal cell

numbers the cells were pelleted, lysed and their cell lysates were submitted to a

quantitative beta-galactosidase assay based on the OPNG reaction (see Mat. and

Meth. section for details). Each point represents the average value of three

independent experiments in arbitrary units expressing the amount of the generated

yellow reaction product. The error bar at the top of each column indicates the standard

deviation.

In conclusion, the newly identified p53 interaction partner Ki-1/57 could have a

negative regulatory role for p53. It is particularly interesting that the interaction

between Ki-1/57 and p53 is interrupted by the in vitro phosphorylation of p53 by PKC.

Previous studies had identified Ki-1/57 as protein, which interacts with RACK1 and is

a target for PMA activated PKC in vivo [9]. Since RACK1 is also functionally

associated to the p53 protein family as a negative regulator of p73 dependent

transcription [10] it is tempting to speculate that a regulatory cytoplasmic pathway

involving the proteins PKC, RACK1 and Ki-1/57 could be important for the fine

regulation of p53 function in dependence of the cells activation status. Future

investigations are required to determine Ki-1/57 exact role in relation to p53 and

whether the in vivo phosphorylation of p53 by different protein kinases has an

influence on its activity and if its functional inactivation or inhibition upon mitogenic

activation (PMA, PHA) in leukocytes might be an important step to prevent p53

dependent blockage of the cell in the interphase and allow cells to enter in mitosis.

Acknowledgements:

This work is financially supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado São Paulo (FAPESP), the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) and the Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). We

thank Drs. Hilmar Lemke (Univ. Kiel, Germany), Hinrich P. Hansen (Univ. Köln,

Germany) for critical reagents and support and Dr. Carlos H. I. Ramos and Luciana R.

Camillo for DNA sequencing support. We thank Dr. Gianni Del Sal (Laboratorio

Nazionale CIB, Trieste, Italy) for generously providing the plasmid clone encoding full-

length human p53 fused to GST (in vector pGEX). We also like to thank Eugenia R.

Camargo for technical assistance.

References

[1] Schwab, U., Stein, H., Gerdes, J., Lemke, H., Kirchner, H., Schaadt, M., and Diehl,

V. (1982). Nature 299, 65-67.

[2] Hansen, H., Lemke, H., Bredfeldt, G., Könnecke, I., and Havsteen, B. (1989). Biol.

Chem. 370, 409-416.

[3] Froese, P., Lemke, H., Gerdes, J., Havsteen, B., Schwarting, R., Hansen, H., and

Stein, H. (1987). J.Immunol. 139, 2081-2087.

[4] Hansen, H., Bredfeldt, G., Havsteen, B., and Lemke, H. (1990). Res.Immunol. 141,

13-31.

[5] Rohde, D., Hansen, H., Hafner, M., Lange, H., Mielke, V., Hansmann, M. L., and

Lemke, H. (1992). Am.J.Pathol. 140, 473-482.

[6] Kobarg, J., Schnittger, S., Fonatsch, C., Lemke, H., Bowen, M. A., Buck, F., and

Hansen, H. P. (1997). Exp.Clin.Immunogenet. 14, 273-280.

[7] Huang, L., Grammatikakis, N., Yoneda, M., Banerjee, S. D., and Toole, B. P.

(2000). J.Biol.Chem. 275, 29829-29839.

[8] Lemos, T.A., Passos, D.O., Nery, F.C., and Kobarg, J. (2003). FEBS Lett. 533, 14-

20.

[9] Nery, F. C., Passos, D.O., Garcia, V.S. and Kobarg, J. (2004). J. Biol. Chem. 279,

11444-11455.

[10] Ozaki, T. Watanabe, K-I., Nakagawa, T., Miyazaki, K., Takahashi, M., and

Nakagawara, A. (2003). Oncogene, 3231-3242.

[11] Lane, D.O. (1992). Nature 358, 15-16.

[12] Lee, S, Elenbase, B., Levine, A., and Griffith, J. (1995). Cell 81, 10130-11020.

[13] Kastan, M.B., Zhan, Q., El-Deiry, W.S., Carrier, F., Jacks, T., Walsh, W.V.,

Plunkett, B.S., Vogelstein, B., and Fornace, Jr., A.J. (1992). Cell 71, 587-597.

[14] Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sali, R., Sordat, B., and Costa, J. (1992). Proc.

Natl., Acad. Sci. USA 89, 4495-4499.

[15] El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculesco, V.E., Levy, D.B., Parsons, R., Trent, J.M.,

Lin, D., Mercer, W.E., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1993). Cell 75, 817-825.

[16] Okamoto, K. and Beach, D. (1998). J. Biol. Chem. 273, 5997-6000.

[17] Miyashita, T. and Reed, J. C. (1995). Cell 80, 293-299.

[18] Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C.C. (1991). Science 253,

49-53.

[19] Zhao, L.Y., Liu, J., Sidhu, G.S., Niu, Y., Liu, Y., Wang, F. And Daiqing, L. (2004).

J. Biol. Chem. Set. 10

, in press, manuscript M406743200.

[20] Zhou, R., Wen, H. and Ao, S.Z. (1999). Gene 235, 93-101.

[21] Dumaz, N. and Meek, D.W (1999). EMBO J 18, 7003-7010.

[22] Okamoto, T., Izumi, H., Imamura, T., Takano, H., Ise, T, Uchiumi, T., Kuwano, M.,

and Kohno, K. (2000). Oncogene 19, 6194-6202.

[23] Liu, Q., Kaneko, S., Yang, L., Feldman, R.I., Nicosia, S. V. Cheng, J., and Cheng,

J. Q. (2004). J. Biol. Chem., in press, manuscript M406802200.

[24] Gu, W. and Roeder, R. (1997). Cell 90, 595-606.

[25] Meek, D.W. (1994). Semin. Cancer Biol. 5, 203-210.

[26] Gerdes, J., Schwab, U., Lemke, H., and Stein, H. (1983). Int. J. Cancer 31, 13-20.

[27] Bartel, P. L. and Fields, S. (1995). Methods Enzymol. 254, 241-263.

[28] Vojtek, A. B. and Hollenberg, S. M. (1995). Methods Enzymol. 255, 331-342.

[29] Durfee, T., Becherer, K., Chen, P. L., Yeh, S. H., Yang, Y., Kilburn, A. E., Lee, W.

H., and Elledge, S. J. (1993). Genes Dev. 7, 555-569.

[30] Moraes, K.C.M., Quaresma, A.J,C., Maehnss, K, and Kobarg, J. (2002). Biol.

Chem. 384, 25-37.

[31] Moura, P., Rui, E., Goncalves, K.A., and Kobarg, J. (2005). Virus Res., in press.

[32] Lin, J.Y., Ohshima, T. And Shimotohno, K. (2004). FEBS Lett. 573, 15-18.

[33] Jucker, M., Schaadt, M., Diehl, V., Poppema, S., Jones, D., and Tesch, H. (1990).

Hematol. Oncol. 8, 191-204.

[34] Minty, A., Dumont, X., Kaghard, M., and Caput, D (2000). J. Biol. Chem. 275,

36316-36323.

[35] Rajendra, R., Melegaonkar, D., Pungaliya, P., Marshall, H., Rasheed, Z.,

Brownell, J., Liu, L.F., Lutzker, S., Saleem, A., Rubin, E. H. (2004). J. Biol. Chem.

279, 36440-36444.

[36] Kim, E.J., Park, J.S., and Um, S.J. (2003). Nuclei Acids Res. 31, 5356-5367.

[37] Schmidt, D. and Muller, S. (2002). Proc. Natl., Acad. Sci. USA 99, 2872-2877.

[38] Banerjee, S. And Kundu, T.K. (2003). Nuclei Acids Res. 31, 3236-3247.

[39] McKinney, K. and Prives, C. (2002). Mol. Cell. Biol. 22, 6797-6808.

[40] Legube, G., Linares, L.K., Tyteca, S., Caron, C., Scheffner, M., Chevillard-Briet,

M., and Trouche, D. (2004). J. Biol. Chem. 279, 44825-44833.

[41] Haneda, M., Kojima, E., Nishikimi, A., Hasegawa, T., Nakashima, I., and Isobe, K.

(2004). FEBS Lett. 567, 171-174.

[42] Gobert, C., Bracco, L., Rossi, F., Olivier, M., Tazi, J., Lavelle, F., Larsen, A.K. and

Riou, J.F. (1996). Biochemistry 35, 5778-5786.

3 RESULTADOS

3.4 Artigo IV:

A spectroscopic analysis of the interaction

between the human regulatory proteins RACK-1

and Ki-1/57

Flávia C. Nery, Gustavo C. Bressan,

Marcos R. Alborghetti, Taís

M. Kuniyoshi, Dario O. dos Passos,

Carlos H. I. Ramos, Beatriz G.

Guimarães, Sergio Oyama Jr and Jörg Kobarg

(Artigo submetido)

A spectroscopic analysis of the interaction between the

human regulatory proteins RACK-1 and Ki-1/57

Flávia C. Nery

a,b

, Gustavo C. Bressan

a,c

Marcos R. Alborghetti

, Taís M.

Kuniyoshi

, Dario O. Passos

a,d

Carlos H. I. Ramos

a,d

, Beatriz G. Guimarães

a,d

Sergio Oyama Jr

and Jörg Kobarg

a, b, d,

Centro de Biologia Molecular Estrutural, Laboratório Nacional de Luz

Síncrotron, Rua Giuseppe Máximo Scolfaro 10.000, C.P. 6192, 13084-971 Campinas -

SP, Brasil;

Departamento de Genética e Evolução-UNICAMP, Campinas SP, Brasil;

Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil;

Departamento de Bioquímica,

UNICAMP, Campinas, SP, Brasil and *Corresponding author: Tel.: (55) 19-3512-1125,

Fax: (55) 19-3287-7110, E-mail

Abstract:

Ki-1/57, the 57-kDa cytoplasmic and nuclear antigen recognized by the CD30 antibody

Ki-1, is associated with protein kinase activity and regulated by activation dependent

phosphorylation. In recent studies we employed the yeast two-hybrid system in order

to identify proteins interacting with Ki-1/57 and thereby get clues on its cellular

functional context. Ki-1/57 interacts with the Receptor of Activated Kinase-1 (RACK1),

a signalizing adaptor protein that binds activated PKC. Furthermore, Ki-1/57 is a

substrate for PKC phosphorylation in vitro and in vivo and co-precipitates with PKC

when isolated from PMA L540 cells. In this work, we analyze the biophysical

characteristics of the individual proteins and of the interaction between RACK-1 and

two protein fragments of Ki-1/57 (122-413, 264-413). The far-UV circular dichroism

spectrum of RACK1, a WD repeat protein, showed an unusual positive ellipticity at 229

nm. In other proteins of the WD family, an unusual positive ellipticity at 229 nm has

been attributed to surface tryptophans since the maximum could be abolished by

modification of the tryptophans with N-bromosuccinimide (NBS). Our results showed

that NBS, Ki-1/57(122-413) and Ki-1/57(264-413) can abolish this unusual positive

ellipticity of RACK1. The additive far UV-CD spectrum profiles of the Ki-1/57(122-413)

or (264-413) with RACK1 confirm that the proteins interact. In summary, the circular

dichroism and fluorescence studies implicate that the tryptophans residues of RACK1

are involved in the interaction with Ki-1/57. Furthermore, we observed that the

phosphorylation of Ki-1/57 changes its secondary structure, which might contribute to

the complete dissociation of RACK1 and Ki-1/57 upon Ki-1/57 phosphorylation by

PKC.

Keywords: RACK1, WD family, Ki-1/57, Circular Dichroism, Fluorescence,

protein phosphorylation.

Abbreviations: Luria-Bertani medium (LB), Isopropyl-1-thio-ß-D-

galactopyranoside (IPTG), N-bromosuccinimide

(NBS), 2-mercaptoethanol,

dithiothreitol (DTT), sodium

dodecyl sulfate (SDS), Protein Kinase C (PKC).

1. Introduction

Ki-1/57, the 57-kDa human protein antigen recognized by the CD30 antibody Ki-

1 in Hodgkin and Sternberg-Reed cells in Hodgkin lymphoma [1], is a cytoplasmic and

nuclear protein, which is phosphorylated on serine and threonine residues [2, 3]. When

isolated from the Hodgkin’s lymphoma analogous cell line L540, Ki-1/57 co-

immunoprecipitates with a Thr/Ser protein kinase activity [4]. Its expression in diverse

cancer cells and association with kinase activity in mitogen activated peripheral blood

cells, suggested a role in cellular activation and possibly in cell signaling [5]. In recent

studies, where the yeast two-hybrid system was used to identify proteins interacting

with Ki-1/57, we found that Ki-1/57 engages in specific interactions with the Chromatin-

Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3) [6], a nuclear protein involved in

chromatin remodeling and transcription regulation, and with the Receptor of Activated

Kinase C-1 (RACK1) [7], an adaptor protein that interacts itself with activated Protein

Kinase C (PKC) [8].

Ki-1/57 has also been termed IHABP4 because it contains many positively

charged amino acids and has been shown to interact with a series of negatively

charged macromolecules, including RNA and hyaluronan (an extracellular

glucosaminoglycan) in vitro [9]. It has not been shown yet whether such binding

actually occurs in vivo. PAI-1 mRNA-binding protein is an alternative splice variant of

CGI-55, the putative paralogue of Ki-1/57, and has been shown to specifically bind to

the mRNA of type-1 plasminogen activator inhibitor (PAI-1) [10]. This protein called

PAI-RBP1 is thought to be involved in regulation of mRNA stability.

RACK1, that interacts with Ki-1/57 but not with CGI-55, is an adaptor protein

from the WD repeat proteins family. RACK1 is involved with very diverse cellular

functions including regulation of signal transduction [11-12], pre-mRNA processing

[13], gene transcription [14], cell cycle progression [15], translation [16] and actin

cytoskeleton rearrangement [17]. RACK1 is a member of WD repeat family of proteins

that are made up od highly conserved repeating units called WD repeats [18]. Each

repeating unit consists of a core region of approximately 40 amino acids typically

bracketed by GH (glycine-histidine) and WD (tryptophan-aspartate), and a variable

region of 6-94 amino acids [18-19]. This repeating unit was first recognized in the G

protein β subunit that transduces signals across the plasma membrane [20]. Like Gβ

subunit the amino acid sequence deduced from the cDNA shows that RACK1 is made

up of seven WD repeats, but with minimal N- and C-terminal extensions, that have

been predicted to all have a similar architecture [19, 20-22]. Different from other

researchers [18], we have expressed RACK1 in Escherichia coli and were able to

purify it in large quantities in soluble form, making it suitable for structural studies and

the assessment of its biophysical properties through spectroscopic analyses.

Here we investigated the abrogation of the interaction between RACK1 e Ki-

1/57, after the phosphorylation of Ki-1/57 by PKC in vitro, using circular dichroism (CD)

and emission fluorescence spectroscopy. We observed that the RACK1 CD spectrum

shows an unusual positive ellipticity at 229 nm that it is attributed to tryptophans, since

the 229 nm maximum could be abolished by modification of these tryptophans by N-

bromosuccinimide (NBS) [23]. Other important observation is the decrease of

fluorescence emission spectrum by NBS modification [24-26]. It demonstrates that the

tryptophans are exposed in the molecule.

Furthermore, our results showed that the C- terminal amino acids 264-413 of Ki-

1/57 can abolish RACK1 mentioned unusual positive ellipticity at 229 nm, and thereby

confirming this interaction. Besides, the emission fluorescence intensity of RACK1

decreased with NBS. We observed that 0,4 mM NBS abolished the tryptophan

emission fluorescence. The same two fragments of Ki-1/57 that interacted with RACK1

also decreased the RACK1 emission fluorescence intensity. Our result seems to

indicate that Ki-1/57 could interact with surface tryptophans of RACK1.

2. Materials and Methods

2.1 Plasmid construction

Several sets of oligonucleotides were designed to allow sub-cloning of the full

cDNA and the constructs of Ki-1/57 coding the indicated regions in bacterial

expression vectors. We inserted the full cDNA of Ki-1/57 (1-413) and the constructs:

the N-Terminal Ki-1/57(1-150), C-terminal Ki-1/57(122-413), C-terminal Ki-1/57(151-

263), C-terminal Ki-1/57(264-413), into the EcoRI and BamHI sites of vector pPROEX

(Invitrogen) to obtain 6xHis-tagged proteins. The full cDNA encoding the protein

RACK1 was amplified and inserted into the NdeI and HindIII of vector pET-28a

(Novagen) to obtain the 6xHis-tagged protein.

2.2 Bacterial expression and protein purification

Ki-1/57 constructs were expressed in E. coli BL21-CodonPlus-RIL (Stratagene)

and 6xHis-RACK-1 protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) (Stratagene).

Overnight cultures of E. coli transformed with 6xHis-Ki-1/57 recombinant constructs in

pPROEX vector were diluted 1:50 in 1000 mL of fresh LB media (100 µg/mL ampicillin,

34 µg/mL cloranfenicol) and grown at 37

C until the OD

600

reached 0.7-0.8. Then we

added isoprenyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) to 1.8 mM. After a further 4 h of

growth, cells were pelleted and resuspended in 10% of the culture volume of buffer A

(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1mM PMSF). Cells

were lysed by sonication on ice. The lysis supernatant was cleared by centrifugation

and then submitted to purification on a HiTrap™ Chelating HP Column (Amersham

Biosciences). Overnight cultures of E. coli transformed with 6xHis-RACK1 recombinant

pET28a vector were diluted 1:50 in 1000 mL of fresh LB media (50 µg/mL kanamicin)

and grown at 37 °C until the OD

600

reached 0.7-0.8 and before adding IPTG to 1.8 mM,

while the temperature was lowered to 30

C. After a further 4 h of growth, cells were

pelleted and resuspended in 10% of the culture volume of buffer A (20 mM Tris-HCl,

pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT and 0.5 mM EDTA). Cells were lysed

by sonication on ice, followed by centrifugation at 6000xg for 30 min. The supernatant

was purified with 2 ml of Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) resin (QIAGEN) preequilibrated

with buffer A at about 10 mL/h. The column was washed with 50 ml of buffer A or until

the OD

280

of the flow-through was less than 0.01. The recombinant proteins were

eluted with a 20-mL linear gradient of 0-0.5 M imidazole in buffer B (20 mM Tris-HCl,

pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 % Glycerol, 0.5 mm EDTA, 0.5 mm DTT e 0.5 M Imidazole).

Fractions of 1 mL each were collected, and aliquots were analyzed by SDS-PAGE on

10%. The peak fractions containing of 6xHis-Ki-1/57 constructs and 6xHis-RACK1

recombinant proteins were dialyzed against 20 mM Tris–HCl pH 7.5, 5 % Glycerol, 1

mm DTT, 1 mM EDTA e 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and concentrated

using UltraFree4 (Millipore) by centrifugation of 3000 g and 4

C. After concentration

these protein were dialyzed against 20 mM Tris–HCl pH 7.5, 20 % Glycerol, 1 mM

DTT, 1 mM EDTA and 1 mM PMSF and analyzed by SDS–PAGE.

2.3 Far-UV circular dichroism (CD) spectroscopy

CD spectra of RACK1 or Ki-1/57 and constructs were recorded on a Jasco J-

810 spectropolarimeter with temperature controlled by a Peltier Type Control System

PFD 425S. Spectra were measured at a temperature of 25

C. Samples were

examined in 0.1 cm cubettes at a concentration of protein, 10 µM, chosen to maintain

the dynode voltage below 650 V in the wavelength region 260-200 nm or 260-205nm.

Protein concentration was determined using absorption at 280 nm and an extinction

coefficient [27], which was calculated from the composition of the protein using

‘Protparam’. The spectrum reported for each sample represents the average of 20

individual spectra for each preparation and has been corrected for baseline

contribution due to buffer (0.1 M Phosphate buffer, pH 7.5). Scanning rate was 50

nm/min with spectral band width of 1 nm and response time was two seconds. CDNN

Deconvolution software (Version 2- http://bioinformatik.biochemtech.

uni.halle.dee/cdnn) was employed for secondary structure prediction. For thermal

denaturation studies, measurements were made at fixed wavelength (229 nm), the

scan rate was varied from 1

C / min and samples were heated from 5 to 90

C (by

using scan rates of 50

C/h). The reversibility of unfolding was tested by performing

several consecutive up and down scans and by scan rate variation. Molar ellipticity

values were determined as follows: [θ](deg.cm

/dmol)=[θ-(MRW)]/[(10)(lc)], where θ

represents the displacement from the baseline value X full range in degrees, MRW

equals the mean residue weight of an amino acid, l is the path length of the cell in cm,

and c equals the concentration of protein in g/mL. All reported spectra were normalized

to molar ellipticity values in deg.cm

/dmol. For the analyses of tryptophan modification

of 6xHis-RACK1 by N-bromosuccinimide (NBS), samples were treated with 0.5 mM

NBS in buffer 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5 for 5 minutes and CD spectra

were recorded immediately afterwards [19]. Base lines were run tree times in all the

conditions mentioned above.

2.4. Fluorescence spectroscopic studies

The experiments were performed with an Aminco Bowman



Series 2 (SLM-

AMINCO) spectrofluorimeter

equipped with a 450 W lamp. Experiments using the

fluorescence

of RACK1 or Ki-1/57 constructs were carried out at 25 °C in a buffer

containing 0.1 M Phosphate (pH 7.5). The recombinant proteins were analyzed at

concentrations of 1.0 µM. The tryptophan intrinsic fluorescence was investigated with

the excitation at 295 nm

and the emission

was measured from 300 nm to 430 nm with a

spectral bandpass of 4 nm

for excitation and 4 nm for emission. For the analyses of

tryptophan modification of 6xHis-RACK1 by N-bromosuccinimide (NBS), samples were

treated with 0.5 mM NBS in buffer 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5 for 5

minutes and fluorescence spectra were recorded immediately afterwards.

3. Results

3.1-Expression and Purification of RACK1 and the Ki-1/57 constructs

To facilitate the purification of RACK1 and Ki-1/57 constructs from E. coli, we

expressed them as fusion proteins containing an N-terminal 6xHis tag. The expression

of RACK1 was induced by 1.8 mM IPTG at 30

by four hours. Purification of 6xHis-

RACK1 from the soluble fraction on Ni-NTA resin resulted in large protein quantities,

which were more than 95% pure as confirmed by SDS-PAGE (Figure 1A). This protein

was however unstable at low ionic strength or in the absence of glycerol. It remained

however soluble in the presence of 150 mM NaCl and 20% glycerol. The presence of 1

mM EDTA and 1 mM DTT further helped to prevent the formation of aggregates of this

protein. RACK1 is a monomer in solution as confirmed by gel filtration chromatography

and mass spectroscopy analyses (data not shown). The purification of 6xHis-RACK1

from 1 L of culture yielded about 3 mg of protein.

The cDNA regions encoding for four Ki-1/57 constructions: one encoding amino

acids 122-413, 264-413, 151-263 or 1-150 of Ki-1/57 were amplified by PCR and

subcloned into the pProex expression vector, downstream from the sequence coding

for a histidine tag. Recombinant vectors were than transformed into E. coli BL21 (DE3)

codonplus RIL, because some regions of Ki-1/57 sequence contain codons that are

rare in bacteria and could cause premature termination of translation or low expression

rates. Western blot analysis with an anti-4xHis antibody confirmed that all Ki-1/57

protein constructs contain the N-terminal 6xHis-tag (data not shown). The expression

of the Ki-1/57 constructs was induced by addition of 1.8 mM IPTG at 37

C by four h.

Proteins in the column eluate were separated by SDS-PAGE (Fig. 1B). The purification

from 1 L of culture yielded approximately 0.5 mg of protein of constructs 6xHis-Ki-

1/57(1-150), 3 mg of protein for 6xHis-Ki-1/57(151-263), 1 mg of protein for 6xHis-Ki-

1/57(254-413) and 2 mg of protein construct 6xHis-Ki-1/57(122-413).

(

)

(

)

(

)

(

)

1 2 3 4 5 1 2 3 4

6xHisRACK1

(

)

(

)

(

)

(

)

1 2 3 4 5 1 2 3 4

6xHisRACK1

Figura 1. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of purified

6xHis-RACK1 protein and of Ki-1/57 protein fragments. Expression and purification

of 6xHis-RACK1 from BL21 (DE3) cells was shown in A: the fraction not induced with

IPTG (lane 1), the fraction induced (lane 2) and the fractions after purification (lanes 3-

5), lane 6 marker proteins. B. Expression of Ki-1/57 constructs from BL21 (DE3) codon

plus RIL cells: lane 1, C-terminal Ki-1/57 (122-413); lane 2, C-terminal Ki-1/57 (264-

413); lane 3, C-terminal Ki-1/57 (151-263) and lane 4, N-Terminal Ki-57 (1-150).

3.2- Circular Dichroism

The overall percentage of α-helices calculated from the RACK1 CD spectrum

was estimated to be less than 5% calculated from the molar ellipticity at 200-260 nm

(CDNN program). The far-UV-CD spectrum of 6xHis-RACK1 at room temperature

shows a pronounced maximum at 229 nm (Fig. 2A). In other proteins, the positive

molar ellipticity at around 230 nm has been ascribed to the presence of disulfide bonds

or interactions between aromatic residues, such as tryptophans, phenylalanines, and

tyrosines [28,29]. RACK1 has 13 tryptophans, 8 phenylalanines and 6 tyrosines. In

order to determine the source of the positive ellipticity of 6xHis-RACK1 at 229 nm, the

tryptophan residues were modified with 0.5 mM of NBS. N-Bromosuccinimide (NBS) is

a known protein reagent able to modify proteins through the oxidation of mainly

tryptophan residues. These properties make NBS a suitable reagent to selectively

block tryptophan residues. Fig. 2A shows the CD spectra of 6xHis-RACK1 before and

after treatment with NBS. Treatment with NBS completely abolishes the maximum at

229 nm, indicating that interactions between tryptophan residues may be responsible

for the maximum at 229 nm.

We observed by experiments of thermal stability of RACK1 that it was unstable

at temperatures above 45

C because the maximum at 229 nm disappears at this

temperature (data not shown). This supposed protein denaturation was irreversible.

The experiments of circular dichroism of pre-incubated RACK1 and Ki-1/57

constructs (Fig 2B) showed that the positive ellipticity at 229 nm of RACK1 disappears

in the presence of the Ki-1/57 fragments 122-413 or 264-413 (Fig. 2B and data not

shown). The experimental additive spectrum profiles of either Ki-1/57(122-413) or Ki-

1/57(264-413) together with RACK1 clearly suggest that both proteins interact. This

confirms the previously obtained interaction data from independent two-hybrid and pull-

down experiments [7], and further suggest that Ki-1/57 interacts with the surface

tryptophans of RACK1.

We observed previously that the phosphorylation of Ki-1/57 on its extreme C-

terminal, abolished the interaction with RACK1. Here we found that the

phosphorylation of Ki-1/57 does not abolish RACK1 unusual positive ellipticity at 229

nm (Fig. 2B). This shows that the phosphorylation of Ki-1/57 really prevents any

interaction with RACK1.

200 210 220 230 240 250 260

- 6000

- 5000

- 4000

- 3000

- 2000

- 1000

1000

RACK1

RACK1+Ki-1/57 (151-263)

RACK1+Ki-1/57 (122-413)

RACK1+Ki-1/57-P (122-413)

Wavelength (nm)

200 210 220 230 240 250 260

-6000

-5000

-4000

-3000

-2000

-1000

1000

RACK1

RACK1+0.5 mM NBS

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

200 210 220 230 240 250 260

- 6000

- 5000

- 4000

- 3000

- 2000

- 1000

1000

RACK1

RACK1+Ki-1/57 (151-263)

RACK1+Ki-1/57 (122-413)

RACK1+Ki-1/57-P (122-413)

Wavelength (nm)

200 210 220 230 240 250 260

-6000

-5000

-4000

-3000

-2000

-1000

1000

RACK1

RACK1+0.5 mM NBS

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

Figura 2. CD spectra from 200 to 260 nm of purified 6xHis-RACK1 and Ki-

1/57 constructs.

(A) 6xHis-RACK1 in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0 at 25

C, in the

absence and presence of 0.5 mM of NBS. (B) Ki-1/57 interference in the positive

ellipticity at 229 nm of RACK1 (see text for detailed explanation).

200 210 220 230 240 250 260

- 16000

- 14000

- 12000

- 10000

- 8000

- 6000

- 4000

- 2000

2000

Ki-1/57 (122-413)

Ki-1/57 (151-263)

Ki-1/57 (264-413)

Ki-1/57 (1-150)

200 210 220 230 240 250 260

- 16000

- 14000

- 12000

- 10000

- 8000

- 6000

- 4000

- 2000

2000

Ki-1/57 (122-413)

Ki-1/57-P (122-413)

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

Wavel engt h (nm)

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

Wavelength (nm)

200 210 220 230 240 250 260

- 16000

- 14000

- 12000

- 10000

- 8000

- 6000

- 4000

- 2000

2000

Ki-1/57 (122-413)

Ki-1/57 (151-263)

Ki-1/57 (264-413)

Ki-1/57 (1-150)

200 210 220 230 240 250 260

- 16000

- 14000

- 12000

- 10000

- 8000

- 6000

- 4000

- 2000

2000

Ki-1/57 (122-413)

Ki-1/57-P (122-413)

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

Wavel engt h (nm)

[∆]

MRW

(Deg x cm

x dmole

-1

)

Wavelength (nm)

Figura 3. CD spectra from 200 to 260 nm of purified Ki-1/57 fragments at

room temperature. (A); (B): Difference between the phosphorylated C-terminal Ki-

1/57 fragment (122-413) (-P) and its unphosphorylated form.

Furthermore, the addition of Ki-1/57(151-263), a fragment of the protein that

does not interact with RACK1 [7], did not diminish the positive molar ellipticity of

RACK1 (data not shown). This shows that only the fragment Ki-1/57(122-413) can

interact with the surface tryptophans of RACK1. An argument might be made that the

application of NBS could affect the general folding of RACK1. However, the selective

modification of RACK1 tryptophans was confirmed by other spectroscopic method.

Furthermore, the interference of both C-terminal Ki-1/57 constructs with RACK1

tryptophans was also confirmed by fluorescence studies (see below).

The overall percentage of α-helices calculated from the CD spectrum of Ki-1/57

fragments was estimated to be less than 8% calculated from the molar ellipticity at

200-260 nm (CDNN program) (Fig. 3A). In order to determine if the phosphorylation

interferes with the Ki-1/57 secondary structure we phosphorylated Ki-1/57(122-413) in

vitro with PKC as described previously [7], and used it in circular dichroism

spectroscopy experiments. We observed that phosphorylated Ki-1/57(122-413), has

about 2.3% less alpha-helical content (decreased from 9% to 6.7%) and that the

percentage of anti-parallel beta-sheet increased about 5% (increase from 31.6% to

36.5%). The minimum at 208 nm of un-phosphorylated Ki-1/57 in relation to

phosphorylated Ki-1/57 increases from -7500 to –14000 molar ellipticity (Fig. 3B). This

corroborates our hypothesis that phosphorylation may modify Ki-1/57 secondary

structure and such a change in secondary may at least contribute to the complete

abrogation of the interaction with RACK1 upon phosphorylation of Ki-1/57.

3.3- Intrinsic Fluorescence Studies

The fluorescence emission spectrum of RACK1 is typical of a tryptophan-rich

protein. When excited at 295 nm, there is a strong emission maximum at 330 nm (Fig.

4A). The effect of NBS modification on the fluorescence emission spectrum of the

RACK1 is shown in Fig. 4A. There is an increasing loss of fluorescence at gradually

increasing concentrations of NBS that corresponds to the progressive oxidation of the

tryptophans. At 0.4 mM NBS completely abolishes the tryptophan fluorescence.

Another way to characterize the influence of Ki-1/57 binding to RACK1 is to

measure the fluorescence emission upon titration of RACK1 with Ki-1/57(151-413) or

(122-413). In both cases, the binding of the Ki-1/57 constructs to RACK1 significantly

280 300 320 340 360 380 400 420 440

RACK1

RACK1 + 0.1 mM NBS

RACK1 + 0.2 mM NBS

RACK1 + 0.4 mM NBS

RACK1 + 0.8 mM NBS

Fluorescence (arbitrary numbers)

280 300 320 340 360 380 400 420 440

Ki-1/57 (122-413)

Ki-1/57 (264-413)

RACK1

RACK1 + Ki-1/57 (122-413)

RACK1 + Ki-1/57 (264-413)

Fluorescence (arbitrary numbers)

280 300 320 340 360 380 400 420 440

RACK1

RACK1 + 0.1 mM NBS

RACK1 + 0.2 mM NBS

RACK1 + 0.4 mM NBS

RACK1 + 0.8 mM NBS

Fluorescence (arbitrary numbers)

280 300 320 340 360 380 400 420 440

Ki-1/57 (122-413)

Ki-1/57 (264-413)

RACK1

RACK1 + Ki-1/57 (122-413)

RACK1 + Ki-1/57 (264-413)

Fluorescence (arbitrary numbers)

Figura 4. Fluorescence emission spectra of RACK1 and Ki-1/57.

(A) 6xHis-RACK1 was treated with different concentrations of NBS. (B) 6xHis-

RACK1 was incubated with Ki-1/57(122-413) and Ki-1/57(264-413). The samples were

excited at 295 nm and the emission was measured from 300 to 430 nm with a spectral

bandpass of 4 nm for excitation and emission.

decrease the relative fluorescence emission of RACK1. Depending on the Ki-

1/57 fragment used the decrease in fluorescence varied from 30 to 60%. Ki-1/57(264-

413) was more efficient in decreasing the RACK1 fluorescence than the larger

fragment Ki-1/57(122-413). This indicates again that both Ki-1/57 constructs interact

with the surface tryptophans of RACK1.

4. Discussion

In order to address the mechanism by which phosphorylation of Ki-1/57

abolishes the interaction with RACK1 and to test if the positive ellipticity at 229 nm of

RACK1 can be attributed to surface tryptophans we performed a spectroscopic studies

of the interaction between RACK-1 and two C-terminal Ki-1/57 constructions (264-413

and 122-413).

First, we wanted to address if phosphorylation changes the secondary structure

of Ki-1/57. We found significant and reproducible changes in the secondary structure of

Ki-1/57. The α-helices content decreases from 9% to 6.7% and the percentage of anti-

parallel beta-sheet increase 31.6% to 36.5% upon phosphorylation. Besides, the

minimum at 208 nm of un-phosphorylated Ki-1/57 in relation to phosphorylated Ki-1/57

increases from -7500 to –14000 molar ellipticity.

In a recent study, Bjorndal and collaborators showed that CD spectra of RACK1

did not show the positive ellipticity at 229 nm [30]. We believe that their protein may not

have been completely folded because different of them our CD data from RACK1

correspond well with that of spectra of other member of the WD protein family [23]. The

positive peak around 225 to 300 nm in RACK1 reflects contributions made by

tryptophan side chains located in β–strands [31-35] and it is observed in members of

the WD domain [23] WW domain families [36-38] and in proteins that do not belong

these families but show a β-propeller structure [39, 40]. Members of the the WW

domain family are small proteins with three-stranded antiparallel β-sheet topology

present a positive peak the 230 nm which disappears at 90 °C [36]. This indicates a

disruption of the tertiary structure as observed in the WD domain protein family, too.

The parameters for thermal denaturation of the WW and WD domain families are

similar. In both families the proteins start to unfold around 45 °C, probably due to

increased side chain motion of the surface set of tryptophans [23]. It also was

observed that other proteins predicted to form a beta-propeller structure, as

hemopexin, also exhibit this same positive ellipticity around the 230 nm region [38].

Since positive ellipticity signals have been noted for proteins with predominantly β-

sheet and β-turn secondary structures that contain aromatic amino acids, our data are

compatible with the presence of these elements in the RACK1 protein.

Tryptophan is an amino acid that generally exists in the hydrophobic core region

of protein. The nitrogen atom on the indole group usually forms a hydrogen bond with

other groups on the main or side chains [41]. The chemical modification of tryptophan

might affect the nearby hydrogen bond and hydrophobic microenvironment. Chemical

modification of RACK1 by tryptophan-specific reagents, such as NBS, corroborated

with our earlier results that tryptophans participate of in the binding between RACK-1

and Ki-1/57 proteins.

Another observation is that different of other members of WD domain family

RACK1 and SEC13 contain only WD-repeats with little or no amino or carboxyl

terminal extensions. This indicates that the secondary structure of these proteins can

be similar. Our date showed very similar CD spectra for RACK1 and SEC13.

We obtained the 6xHis-RACK1 in soluble form expressed in E. coli. Other

researchers have described RACK1 as insoluble protein [17] and explained their

results by a possible association of RACK1 with the membrane or insoluble fraction of

the mammalian cell. We speculate that this in vivo association with the membrane and

insoluble fraction is caused by interactions with other proteins [23].

In summary, our data demonstrate that Ki-1/57, which we previously

demonstrated to interact with RACK1, can interfere in the signals of CD and

fluorescence of its interacting protein 6xHis-RACK1. Besides, the changes in the

secondary structure of Ki-1/57 upon phosphorylation may contribute to the observed

interruption of the interaction between these proteins.

Acknowledgements:

This work is financially supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado São Paulo (FAPESP), CNPq and the LNLS. We thank Maria Eugenia R.

Camargo for technical support, Silvia Lucas Ferreira da Silva for help with CD and

fluorescence data aquisition, Dr. Nilson I. T. Zanchin and Adriana Cristina Alves for

technical support in protein purification.

References

[1] Schwab, U., Stein, H., Gerdes, J., Lemke, H., Kirchner, H., Schaadt, M., and Diehl,

V. (1982) Nature 299, 65-67

[2] Hansen, H., Lemke, H., Bredfeldt, G., Könnecke, I., and Havsteen, B. (1989) Biol.

Chem. 370, 409-416

[3] Froese, P., Lemke, H., Gerdes, J., Havsteen, B., Schwarting, R., Hansen, H., and

Stein, H. (1987) J.Immunol. 139, 2081-2087

[4] Hansen, H., Bredfeldt, G., Havsteen, B., and Lemke, H. (1990) Res.Immunol. 141,

13-31

[5] Kobarg, J., Schnittger, S., Fonatsch, C., Lemke, H., Bowen, M. A., Buck, F., and

Hansen, H. P. (1997) Exp.Clin.Immunogenet. 14, 273-280.

[6] Lemos, T.A., Passos, D.O., Nery, F.C. and Kobarg, J.(2003) FEBS Lett. 533(1-

3):14-20.

[7] Nery, F.C., Passos, D.O., Garcia, V.S., Kobarg, J. (2004) J Biol Chem.

279(12):11444-55.

[8] Ron, D., Chen, C.H., Caldwell, J., Jamieson, L., Orr, E., Mochly-Rosen, D (1994).

Proc Natl Acad Sci U S A 91(3):839-43.

[9] Huang, L., Grammatikakis, N., Yoneda, M., Banerjee, S.D., Toole, B.P. (2000) J

Biol Chem. 275(38):29829-39.

[10] Heaton, J. H., Dlakic, W. M., Dlakic, M., and Gelehrter, T. D. (2001) J.Biol.Chem.

276: 3341-3347.

[11] Chen, S., Spiegelberg, B.D., Lin, F., Dell, E.J., Hamm, H.E. (2004) J Mol Cell

Cardiol. 37(2):399-406.

[12] McCahill, A., Warwicker, J., Bolger, G. B., Houslay, M. D. and Yarwood, S. (2002)

J. Mol Pharmacol. 62(6):1261-73.

[13] Angenstein, F., Evans, A. M., Settlage, R. E.,. Moran, S. T., Ling, S-C., Klintsova,

A. Y., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. and Greenough, W. T. (2002) J. Neurosci. 22:

8827-8837.

[14] Sang, N., Severino, A., Russo, P., Baldi, A., Giordano, A., Mileo, A.M., Paggi,

M.G., De Luca, A. (2001) J Biol Chem. 276(29):27026-33.

[15] Mamidipudi, V., Zhang, J., Lee, K.C., Cartwright, C.A.(2004) Mol Cell Biol.

24(15):6788-98.

[16] Sengupta, J., Nilsson, J., Gursky, R., Spahn, C.M., Nissen, P., Frank, J. (2004)

Nat Struct Mol Biol. 11(10):957-62.

[17] Miller, L.D., Lee, K.C., Mochly-Rosen, D., Cartwright, C.A. (2004) Oncogene 23

(33): 5682-86.

[18] Garcia-Higuera, I., Thomas, T.C., Yi, F., Neer, E.J. (1996) J Biol Chem.

271(1):528-35.

[19] Sengupta, J., Nilsson, J., Gursky, R., Spahn, C.M,, Nissen, P., Frank, J. (2004).

Nat Struct Mol Biol.11(10):957-62.

[20] Fong, H.K., Hurley, J.B., Hopkins, R.S., Miake-Lye, R., Johnson, M.S., Doolittle,

R.F., Simon, M.I. (1986) Proc Natl Acad Sci U S A. 83(7):2162-66.

[21] Sondek, J., Bohm, A., Lambright, D.G., Hamm, H.E. and Sigler, P.B. (1996)

Nature 379 (6563):369-74.

[22] Lambright, D.G., Sondek, J., Bohm, A., Skiba, N.P., Hamm, H.E. and Sigler, P.B.

(1996) Nature 379(6563):311-9.

[23] Saxena, K., Gaitatzes, C., Walsh, M.T., Eck, M., Neer, E.J. and Smith, T.F. (1996)

Biochemistry. 35(48):15215-21.

[24] Williams MN. (1975). J Biol. Chem. 250(1): 322-30.

[25] Ali MS, Shenoy BC, Eswaran D, Andersson LA, Roche TE and Patel MS (1995). J

Biol Chem. 270(9):4570-4.

[26] Bandivadekar KR and Deshpande VV. (1996). Biochem J. 315 ( Pt 2):583-7.

[27] Gill, S.C. and von Hippel, P.H. (1989) Anal Biochem. 182(2):319-26.

[28] Hider, R.C., Kupryszewski, G., Rekowski, P. and Lammek, B. (1988). Biophys

Chem. 1988 Aug;31(1-2):45-51.

[29] Woody, R. W. (1978). Biopolymers 17:1451-67.

[30] Bjorndal, B., Trave, G., Hageberg, I., Lillehaug, J.R., Raae, A.J. (2003). Protein

Expr Purif. 31(1):47-55.

[31] Misenheimer TM, Huwiler KG, Annis DS and Mosher DF (2000). J Biol Chem.

275(52):40938-45.

[32] Cochran AG, Skelton NJ and Starovasnik MA (2001). Proc Natl Acad Sci U S A

98(10):5578-83.

[33] Wimley WC, Hristova K, Ladokhin AS, Silvestro L, Axelsen PH and White SH

(1998). J Mol Biol. 277(5):1091-110.

[34] Bishop CM, Walkenhorst WF and Wimley WC (2001). J Mol Biol. 309(4):975-88.

[35] Andersson D, Carlsson U and Freskgard PO. (2001). Eur J Biochem. 268(4):1118-

28.

[36] Xin Jiang, Jennifer Kowalski and Jeffery W. Kelly. (2001). Protein Science

10:1454-65

[37] Houbi Nguyen, Marcus Jäger, Alessandro Moretto, Martin Gruebele and

Jeffery W. Kelly. (

2003). Proc. Natl., Acad. Sci. USA 100(7): 3948-53.

[38] Ferguson N, Johnson CM, Macias M, Oschkinat H and Fersht A. (2001). Proc.

Natl., Acad. Sci. USA 98 (23): 13002-07.

[39] Faber, H.R., Groom, C.R., Baker, H.M., Morgan, W.T., Smith, A., Baker, E.N.

(1995). Structure 3(6):551-9.

[40] Morgan, W.T., Muller-Eberhard, U. (1974). Enzyme 17(1):108-15.

[41] Yu Y, Li R, Xu C, Ruan K Shen Y and Govindjee (2001). Physiologia Plantarum

111: 108-15.

4 RESULTADOS COMPLEMENTARES

4.1 Caracterização da proteína Ki-1/57

A proteína Ki-1/57 não possui domínios característicos descritos na literatura, no

entanto, esta proteína contém regiões ricas em arginina (aa 43-218), em ácido

glutâmico (aa 257-295) e rica em glicina (aa 184-244), segundo a análise com

programa Motif Scan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan). Além disso,

apresenta um motivo denominado HABP4_PAI-RBP1 (Huang et al., 2000, Heaton et

al., 2001), descrito em banco de dados, que no caso de Ki-1/57 se encontra entre os

aminoácidos 183-360, sendo indicado por ligar a hialuronato ou RNA. Apresenta

também um motivo de importação nuclear (RKRR- aa 55-58) e um potencial motivo

de ligação a ATP (G-X-G-XX-G-X(X)

13-22

–K) entre os aminoácidos 194-230 (Lemos et

al., 2003).

43 218184 244 257 295

1 413

183 360

194 230

55-58

Figura 6: Caracterização da proteína Ki-1/57 em motivos protéicos.

Legenda:

Motivo rico em arginina

Motivo de exportação nuclear

Motivo HABP4_PAI_RBP1

Motivo rico em glicina

Motivo rico em ácido glutâmico

Motivo de ligação a ATP

4.2 O sistema de duplo híbrido em levedura

O sistema de duplo híbrido em levedura é uma poderosa metodologia que foi

desenvolvida para identificar genes que codificam proteínas (presas) que interagem

com uma dada proteína alvo (isca) in vivo (Chien et al., 1991; Fields e Song, 1989;

Fields e Sternglanz, 1994). A base para o sistema de duplo híbrido em levedura está

na estrutura de um fator de transcrição que tem dois domínios fisicamente separados:

o domínio de ligação ao DNA (BD) e o domínio de ativação da transcrição (AD). O

domínio da ligação ao DNA se liga a uma seqüência promotora específica, que se

situa no início de um gene repórter, este por sua vez interage com o domínio de

ativação da transcrição, o qual atrai os componentes críticos do complexo de iniciação

de transcrição. No sistema de duplo híbrido o gene que codifica proteína de interesse

é fusionado ao gene que codifica o domínio de ligação ao DNA, enquanto uma

biblioteca de cDNA, a qual codifica várias proteínas potencialmente interativas a

serem testadas, é fundida ao gene que codifica o domínio de ativação de transcrição.

Quando ocorre uma interação entre a proteína de interesse e uma proteína da

biblioteca, o fator de transcrição é reconstituído e os genes repórteres que estão sob

seu controle são ativados.

Antes de iniciar com a triagem de possíveis proteínas que interagem com as

proteínas Ki-1/57 e CGI-55, um possível parólogo de Ki-1/57, como será discutido no

tópico 4.3, nós comparamos a expressão destas proteínas em diferentes tecidos por

Northern blot (Resultados: Artigo I, fig.2). Nós observamos que a proteína CGI-55 foi

predominantemente expressa em: coração, músculo esquelético, rins, placenta, fígado

e cérebro (em ordem decrescente de intensidade); a proteína Ki-1/57 é predominante

expressa em: cérebro, rins, coração e músculo esquelético (em ordem decrescente de

intensidade). A alta expressão de Ki-1/57 no cérebro sugeriu a utilização de uma

biblioteca de cérebro fetal humano para as triagens de interação proteína-proteína

pelo sistema de duplo híbrido em levedura.

4.2.1 Ensaio de duplo híbrido em levedura com a porção C-terminal de Ki-1/57

(122-413)

Depois de realizados todos os testes de auto-ativação da proteína Ki-1/57 C-

terminal (122-413), a qual o gene foi inserido no plasmídeo pBTM116 fusionado ao

domínio de ligação a DNA (BD) da proteína LexA, esta foi utilizada como “isca” para a

triagem de possíveis ligantes codificados por uma biblioteca comercial de cDNA de

cérebro fetal humano (Clontech) fusionada ao domínio de ativação (AD) de GAL4. A

interação entre Ki-1-57 C-terminal e as proteínas ligantes foi detectada pelo

crescimento em meio sem histidina e pela produção da β-Galactosidase. A

transformação da cepa L40 de Saccharomyces cerevisiae expressando o plasmídeo

“isca” com a biblioteca de cDNA, teve uma eficiência de 1,3x10

, resultando em 565

transformantes que foram capazes de crescer em meio sem histidina e entre estes

clones, 184 foram positivos para o ensaio de expressão de β-Galactosidase em papel

de filtro. Destes 184 clones, apenas 54 foram reconfirmados por co-transformação da

cepa L540 e, finalmente, 51 sequências foram obtidas e analisadas pelo programa

BLAST, levando a identificação de 11 proteínas, como apresentado na tabela 1.

Tabela 1: Proteínas que interagem com a região C - terminal da proteína Ki-1/57

(122-413) pelo sistema duplo híbrido em levedura.

KDa Proteínas Número

clones

Domínio/ função Ref.

bibliográfica

(RACK1) Receptor para quinase C

ativada (Receptor for Activated

Kinase C-1)

Repetições WD40 (WD40 repeats) / Ligam-

se à PKC ativada, ao ribossoma (levedura) e

ao RNA.

Guillemot et

al., 1989.

Ron, D. et al.,

1994.

~93

(TOPORS) Proteína que se liga a

topoisomerase I rica em argina e

serina (topoisomerase I binding,

arginine/serine-rich protein)

Domínio dedo de anel (RING finger) e região

rica em arginina e serina/ ativação

transcricional

Haluska et

al.,1999.

Zhou et al.,

1999.

~240

(CHD-3) Proteína com domínios

cromo-helicase-de-ligação ao DNA.

(Chromodomain Helicase DNA

binding protein-3)

Domínio dedos de Zinco (zinc finger ),

Domínio CHROMO: organizador e

modificador de cromatina (Chromatin

Organization Modifier), /Família das

Helicases , regulação da transcrição e

remodelagem de cromatina

Woodage et

al., 1997.

~149

(ZFP106) Proteina com dedos de

zinco 106 (Zinc finger protein 106) 3

Zinc finger, repetições WD40 (WD40

repeats) / transcrição.

Grasberger

et al., 2005.

~41

(HRMT1L2) Arginina Metil transferase

1 (Argine N-Methytransferase 1L2)

Motivo de ligação ao RNA / Modificação

pós transcricional através da metilação

de arginina de proteínas alvos.

Scott et al.,

1998.

Tabela 1: (continuação)

KDa Proteínas Número

clones

Domínio/ função Ref.

bibliográfica

~67

(PIAS-3) Proteína inibidora de STAT3

ativada (Protein inhibitor of activated

STAT3)

Domínio SAP – possível motivo de

ligação ao DNA - (bihelical)

Chung et al.,

1997.

120

(ALEX2) Proteína com repetição

Armadillo (Armadillo repeat protein X

chromosome,2 )

Segmento transmembrana e uma

repetição Armadillo (arm) /supressor de

tumor

Kurochkin et

al., 2001.

~53

(HMGBCG) Similar a proteína High-

MobilityGroup 2-Like 1 2

Domínios HMG/ fator de transcrição

Seroussi et

al., 1999.

120 (DAXX) Proteína associada à morte

(Death-associated protein)

2 Região de ligação à proteína Fas/

Apoptose e transcrição

Li et al., 2000.

Koer al., 2001.

~42

(ACTB) Actina beta 1

Domínio de Actina e Domínio ATPase

similar aos domínios de Hexoquinase e

proteínas Hsp 70.

Ng et al.,

1985.

100

(p100) um co-ativador do fator de

transcrição do vírus Epstein-Barr 2 ou

EBNA-2

1 Domínio Tudor homólogo a nuclease de

Staphylococcus e Motivo de ligação ao

RNA /coativador de STAT6 e

transcrição

Broadhurst e

Wheeler,

2001.

4.2.2 Ensaio de duplo híbrido em levedura com a porção N-terminal de Ki-1/57

(1-150)

Da mesma forma como mencionado anteriormente, nós testamos quanto

uma possível auto-ativação da proteína Ki-1/57 N-terminal (1-150). Nós observamos

que esta “isca” era capaz de crescer em meio sem histidina, no entanto, as colônias

transformadas com esta “isca” não eram capazes de crescer na presença de 3-

aminotriazol, mesmo que em concentrações mais baixas como 2 mM. A interação

entre Ki-1-57 N-terminal e as proteínas ligantes foi detectada pelo crescimento dos

clones em meio sem histidina e com 10 mM de 3-aminotriazol e pela produção da β-

Galactosidase. A transformação da cepa L40 de Saccharomyces cerevisiae

expressando este plasmídeo “isca” com a biblioteca de cDNA, teve uma eficiência de

1,2 x10

, resultando em 79 transformantes que foram capazes de crescer em meio

sem histidina e com 10 mM de 3-aminotriazol e entre estes clones, 60 clones foram

positivos para o ensaio de expressão de β-Galactosidase. Foram obtidas 39

seqüências de DNA e estas foram analisadas pelo programa BLAST. Esta análise

resultou na identificação de 20 proteínas que interagem com N-terminal de Ki-1/57 e

estão descritas na tabela 2.

Tabela 2: Proteínas que interagem com a região N- terminal da proteína Ki-1/57 (1-

122) pelo sistema duplo híbrido em levedura.

KDa Proteínas Número

clones

Domínio/ função Ref.

bibliográfica

(HRMT1L2) Proteína arginina metil

transferase1 (arginina metil

transferaseT1L2)

Motivo catalítico/ Atividade de metil-

transferase para resíduos de argina

Scott et al.,

1998

~18

(UBC9) Enzima conjugadora de

ubiquitina E2I (UBE2I: ubiquitin-

conjugating enzyme E2I )

Domínio catalítico/ degradação protéica no

proteasomo por ubiquitinação.

Watanabe et

al.,1996.

(CIRBP) Proteína que se liga ao RNA

induzida por frio (cold inducible RNA

binding protein)

Motivo de reconhecimento de RNA (RRM) /

regulação de splicing alternativo.

Nishiya et al.,

1997.

~70

(FXR1P) Proteína relacionada com

retardamento mental X-frágil (Fragile X

mental retardation-related protein 1)

Domínio KH e caixas RG/ associam com os

polissomos (60 S) e poli A de RNAm.

Siomi et al.,

1995.

~36

(YB-1 ou NSEP1) Proteína de ligação

ao elemento sensível a nuclease 1

(nuclease sensitive element binding

protein 1)

Domínio choque-frio (Cold-shock) de ligação

ao DNA-RNA / interação com elementos

regulatórios no DNA.

Didier et al.,

1988.

52.7

(BTBD2) Proteína contendo 2 domínios

BTB(POZ) (BTB (POZ) domain

containing 2)

Domínio BTB (POZ) / Interage com histona-

desacetilase.

Carim-Todd et

al., 2001.

~72

(APLP1) Proteína similar a proteína

amilóide precursora 1 (Amyloid-

precursor-like protein 1)

Domínio homólogo aos inibidores de serina

proteases/ glicoproteína associada a

membrana plasmática e envolvida na

doença de Alzheimer. APLP1 é processada

pela gama-secretase.

Lenkkeri et

al., 1998.

(NDUFAB1) Proteína NADH

desidrogenase, subcomplexo alfa/beta

1 (NADH dehydrogenase (ubiquinone)

1, alpha/beta subcomplex, 1)

Transporte de elétrons do NADH para

ubiquinona.

Loeffen et al.,

1998.

Tabela 2: (continuação)

KDa Proteínas Número

clones

Domínio/ função Ref.

bibliográfica

GADD34 Proteína de parada de

crescimento celular induzida por danos

ao DNA 34 (growth arrest and DNA-

damage-inducible 34) ou PPP1R15A /

674 aa

GADD 34 atua na proliferação celular em

melanoma, stress celular e apoptose.

Holander et

al.,1997.

106 (EB1) Proteína associada a E2a-Pbx1

(E2a-Pbx1 associated proteína)

Domínios: PTB/PID e SAM/ domínio de

ligação à fosfotirosina/ interage com

receptores após fosforilação da tirosina.

Fu et al.,1999.

(RPL38) Proteína ribossomal L38

(ribosomal protein L38)/ 189 aa

Ligação à fosfatidil-etanolamina / liga-se a

lipídeos, interage com a maquinaria de

trandução protéica.

Kenmochi et

al., 2001.

35 (RIL) Proteína reversion-induced LIM

protein / 328 aa

Domínios: PDZ, LIM e de ligação a zinco/

interação com tirosina quinase.

Bashirova et

al.,1998.

154 KIAA1883 protein 1

Domínio catalítico, fosfotransferase, quinase

Ser/Ther

NCBI

Annotation

Project.

(EPS8): Substrato 8 do receptor de

fator de crescimento epidermal

(epidermal growth factor receptor

pathway substrate 8)

Domínio de ligação à fosfotirosina, motivo

SH3/ proliferação celular

Wong et al.,

1994

(SFRS9) Fator de splicing rico em

arginina/serina 9 (splicing factor

argine/serine rich 9)

Motivo RRM / Interage com NSEP 1,

controle de hnRNP A1 por splicing

alternativo, funciona como repressor do sitio

3’de splicing.

Simarde e

Chabot, 2002.

293 Miosina IXA 1

Dominíos: associação com Ras

(RalGDS/AF-6), Miosina, ligação a ATPases,

DAG, Região ester de forbol, região de PKC

1, rico em cisteínas, ligação a GTPase e

domínio RhoGAP

NCBI

Annotation

Project.

2 (SF2/p32) Fator de splicing 2/p32 1

Motivo de ligação ao RNA/ fator protéico

essencial para pré-mRNA splicing em HeLA.

SF2 é essencial para a acurácia do splicing

e na regulação do splicing alternativo

Krainer, et al.,

1991.

73 Receptor de crescimento opióide

(Opioid Growth receptor)

Domínio efetor Rabphilin-3

/ envolvida no

transporte de vesículas sinápticas.

NCBI

Annotation

Project.

4.3 A proteína Ki-1/57 possui um parálogo humano: CGI-55 e possíveis ortólogos

em outros organismos vertebrados

Podemos observar que as seqüências de aminoácidos de possíveis ortólogos

de Ki-1/57 em diferentes mamíferos apresentam alta identidade seqüencial (Mus

musculus, Rattus norvegicus e Homo sapiens). No entanto, podemos observar que

um possível ortólogo de Ki-1/57 em aves: Gallus gallus, apresenta uma identidade

seqüencial menor, comparando-se com os mamíferos (figura 7). Dentro da espécie

humana, a proteína humana Ki-1/57 possui alta identidade com outra proteína,

chamada CGI-55, também com função desconhecida. As seqüências das proteínas

CGI-55 e de Ki-1/57 apresentam uma similaridade de aproximadamente 67 % na

seqüência de aminoácidos (40 % dos resíduos são idênticos, 27 % são similares),

segundo o programa Clustal W (Resultados: Artigo I, fig. 1; figura 8). Esta alta

similaridade sugere que estas duas proteínas humanas podem ser parálogas e podem

ter funções similares ou redundantes na célula.

Uma outra isoforma de CGI-55 é conhecida por PAI-RBP1: “PAI-1 mRNA-

binding protein”. A proteína PAI-RBP1 foi identificada originalmente como uma

proteína com afinidade para um elemento rico em AU na região 3'-não traduzida do

RNA de “plasminogen activator inhibitor” (PAI), e, possivelmente, envolvida na

relação da estabilidade desse RNAm. (Heaton et al. 2001).

As proteínas Ki-1/57, CGI-55 e PAI-RBP1 apresentam um motivo em comum

(HABP4_PAI-RBP1) no seus C-terminais. Esta seqüência é muito conservada, como

se pode observar ao alinhar as seqüências de aminoácidos destas proteínas (figura

8). No caso de Ki-1/57, esse motivo se encontra entre os aminoácidos 183-360 (figura

8).

10 20 30 40 50 60

| | | | | |

Musmusculus MKGALGSPVAAAGAAMQETFGCVVANRFHQLLDDESDPFDILREAEHRRQQQLQRKRRDE

Ratusnorvegicus MKGALGSPVAAAGAAMQETFGCVVANRFHQLLDDESDPFDILREAEHRRQQQLQRKRRDE

Homosapiens MKGALGSPVAAAGAAMQESFGCVVANRFHQLLDDESDPFDILREAERRRQQQLQRKRRDE

galusgalus MKGAMGCPVAAV---MEGSFSCTVANRFYQLLDDESDPFDNLREAERCWQQ-----RKNL

****:*.****. *: :*.*.*****:*********** *****: ** *::

Prim.cons. MKGALGSPVAAAGAAMQE2FGCVVANRFHQLLDDESDPFDILREAE2RRQQQLQRKRRDE

70 80 90 100 110 120

| | | | | |

Musmusculus AAAASGAGHRGGRSPAVASGHRPGAGGRRESQKERKSLAASGAQQPDSPGG-PQPPGQKR

Ratusnorvegicus AAAASGAGHRGGRSPAVASGHRPGAAGRRESQKERKSLAVSSAQQPDSPGG-PQPPGQKR

Homosapiens AAAAAGAGPRGGRSPAGASGHRAGAGGRRESQKERKSLPAPVAHRPDSPGGGLQAPGQKR

galusgalus SKVVARRGDPGSR----------GCATRRELQKQRKQLGTPAP---------PPQPGQKQ

: ..: * *.* *.. *** **:**.* .. . ****:

Prim.cons. AAAA2GAGHRGGRSPAVASGHRPGA2GRRESQKERKSLAA24AQQPDSPGGGPQPPGQKR

130 140 150 160 170 180

| | | | | |

Musmusculus TPRRGEQQGWNDNRGTDVVLERAERRSYREYRPYETERQADLPVEKFTDEKPVDRFDRDR

Ratusnorvegicus TPRRGEQQGWNDNRGTDVVLDRAERRSYREYRPYDTERQAESTAEKFTDEKPVDRFDRDR

Homosapiens TPRRGEQQGWNDSRGPEGMLERAERRSYREYRPYETERQADFTAEKFPDEKPGDRFDRDR

galusgalus APKQ-EECGGKDNSRAEKEHKTAWRPSFMEYLSSETESQAELTAQSLF--RPTAKLNYER

:*:: *: * :*. .: . * * *: ** . :** **: ..:.: :* ::: :*

Prim.cons. TPRRGEQQGWNDNRGT2VVLERAERRSYREYRPYETERQA2LTAEKFTDEKPVDRFDRDR

190 200 210 220 230 240

| | | | | |

Musmusculus PLRGRGGPRGGLRSKGRGGPGNRAFDSFDQRGKRDFERYSSNDK-TNRMEDSMGGCGIRP

Ratusnorvegicus PLRGRGGPRGGLRNRGRGGPGNRAFDSFDQRGKRDFERYGSSDK-ANRMEDSMGGCGVRT

Homosapiens PLRGRGGPRGGMRGRGRGGPGNRVFDAFDQRGKREFERYGGNDKIAVRTEDNMGGCGVRT

galusgalus P-RGCGRGRGGMQGRGRGGGINKSFDGFDQRGKREFGRQNDNDK----------------

* ** * ***::.:**** *: **.*******:* * ...**

Prim.cons. PLRGRGGPRGG2RGRGRGGPGNRAFDSFDQRGKR2FERYGSNDKIANRMEDSMGGCGVRT

250 260 270 280 290 300

| | | | | |

Musmusculus WGSGKDTSDTEPPAPMEETSMMEECQGTLDEESAAKVPELEVEEENQVQEMTLDEWKNLQ

Ratusnorvegicus WGSGKDTSDTEPPAPMEETSMMEECQGVLDEESASKVPELEVEEENQVQEMTLDEWKNLQ

Homosapiens WGSGKDTSDVEPTAPMEEPTVVEESQGTPEEESPAKVPELEVEEETQVQEMTLDEWKNLQ

galusgalus -------IEMELTAPMEATAKTAKSPGVSEGELLNKVAEGKPREE-VVQEMTLDEWKNLQ

: * .**** .: :. *. : * **.* : .** *************

Prim.cons. WGSGKDTSDTEP2APMEETSMMEE2QG2L2EESAAKVPELEVEEENQVQEMTLDEWKNLQ

310 320 330 340 350 360

| | | | | |

Musmusculus EQTRPKPEFNIRKPESTVPSKAVVIHKSRYRDDMVKEDYEDESHVFRKAANDITSQLEIN

Ratusnorvegicus EQTRPKPEFNIRKPESTVPSKAVVIHKSRYRDDIVKDDYEDESHVFRKAANDITSQLEIN

Homosapiens EQTRPKPEFNIRKPESTVPSKAVVIHKSKYRDDMVKDDYEDDSHVFRKPANDITSQLEIN

galusgalus QQNRPKHEFNIRRPESTVPSKAVVIHKSKYSDDIQKGELEDDYHIFRRAVNDITFQLDIN

:*.*** *****:***************:* **: * : **: *:**:..**** **:**

Prim.cons. EQTRPKPEFNIRKPESTVPSKAVVIHKS2YRDD2VKDDYED2SHVFRKAANDITSQLEIN

370 380 390 400 410

| | | | |

Musmusculus FGNLPRPGRGARGSTRGGRGRMRRTENYGPRAEVVTQDVAPNPDDPEDFPALA

Ratusnorvegicus FGNLPRPGRGARGSTRGGRGRIRRTENYGPRAEVVTQDVAPNPDDPEDFPALA

Homosapiens FGNLPRPGRGARGGTRGGRGRIRRAENNYPRAEVVMQDVAPNPDDPEDFPALS

galusgalus FGSLPRPGCGSRGAR--GRGRGRQMEETGPQPEAMVQIVAPNPDDPEDFPALT

**.***** *:**. **** *: *: *:.*.: * **************:

Prim.cons. FGNLPRPGRGARGSTRGGRGRIRRTENYGPRAEVVTQDVAPNPDDPEDFPALA

Figura 7: Alinhamento das seqüências de aminoácidos de possíveis proteínas

ortólogas de Ki-1/57. Seqüências alinhadas das espécies: Mus musculus, Rattus

norvegicus, Homo sapiens e Gallus gallus pelo program Clustal W

(www.clustaw.genome.ad.jp).

10 20 30 40 50 60

| | | | | |

CGI_55 MPGHL-----------QEGFGCVVTNRFDQLFDDESDPFEVLKAAE-------NKKKEAG

PAI_RBP1 MPGHL-----------QEGFGCVVTNRFDQLFDDESDPFEVLKAAE-------NKKKEAG

Ki_157 MKGALGSPVAAAGAAMQESFGCVVANRFHQLLDDESDPFDILREAERRRQQQLQRKRRDE

* * * **.*****:***.**:*******::*: ** ::*:.

Prim.cons. MPGHLGSPVAAAGAAMQEGFGCVVTNRFDQLFDDESDPFEVLKAAERRRQQQLNKKKEAG

70 80 90 100 110 120

| | | | | |

CGI_55 GGGVGGPGAKSATQAAAQTNSNAAGKQLRKESQKDRKNPLPPSVGVVDKKEETQPPVAFK

PAI_RBP1 GGGVGGPGAKSAAQAAAQTNSNAAGKQLRKESQKDRKNPLPPSVGVVDKKEETQPPVALK

Ki_157 AAAAAGAGPR-GGRSPAGASGHRAGAGGRRESQKERKSLPAP---VAHRPD--SPGGGLQ

.....*.*.: . ::.* :..: ** *:****:**. .* *..: : .* .::

Prim.cons. GGGVGGPGAKSA3QAAAQTNSNAAGKQLRKESQKDRKNPLPPSVGVVDKKEETQPPVALK

130 140 150 160 170 180

| | | | | |

CGI_55 KEGIRRVGRRPDQQ----LQGEGKIIDRRPERRPPRERR-FEKPLEEKGEGGEFSVDRP-

PAI_RBP1 KEGIRRIGRRPDQQ----LQGEGKIIDRRPERRPPRERR-FEKPLEEKGEGGEFSVDRP-

Ki_157 APGQKRTPRRGEQQGWNDSRGPEGMLER-AERRSYREYRPYETERQADFTAEKFPDEKPG

* :* ** :** :* :::* .***. ** * :*. : . . :*. ::*

Prim.cons. KEGIRR3GRRPDQQGWNDLQGEGKIIDRRPERRPPRERRPFEKPLEEKGEGGEFSVDRPG

190 200 210 220 230 240

| | | | | |

CGI_55 ---IIDRPIRGRGGLGRGRGGRGRGMGRG---DGFDSRGKREFDRHSGSDRSSFSHYSGL

PAI_RBP1 ---IIDRPIRGRGGLGRGRGGRGRGMGRG---DGFDSRGKREFDRHSGSDRS------GL

Ki_157 DRFDRDRPLRGRGGPRGGMRGRGRGGPGNRVFDAFDQRGKREFERYGGNDKI------AV

***:***** * ***** . *.**.******:*:.*.*: .:

Prim.cons. DRFIIDRPIRGRGGLGRGRGGRGRGMGRGRVFDGFDSRGKREFDRHSGSDRSSFSHYSGL

250 260 270 280 290 300

| | | | | |

CGI_55 KHEDKRGGSGSHNWGTVKDELTDLDQSNVTEETPEGEEHHPVADTEN--KENEVEEVKEE

PAI_RBP1 KHEDKRGGSGSHNWGTVKDELTDLDQSNVTEETPEGEEHHPVADTEN--KENEVEEVKEE

Ki_157 RTEDNMGGCGVRTWGSGKDT-SDVEPTAPMEEPTVVEESQGTPEEESPAKVPELEVEEET

: **: **.* :.**: ** :*:: : **.. ** : ..: *. * *:* :*

Prim.cons. KHEDKRGGSGSHNWGTVKDELTDLDQSNVTEETPEGEEHHPVADTENPAKENEVEEVKEE

310 320 330 340 350 360

| | | | | |

CGI_55 GPKEMTLDEWKAIQNKDRAKVEFNIRKPNEGADGQWKKGFVLHKSKSEEAHAEDSVMD--

PAI_RBP1 GPKEMTLDEWKAIQNKDRAKVEFNIRKPNEGADGQWKKGFVLHKSKSEEAHAEDSVMD--

Ki_157 QVQEMTLDEWKNLQEQTRPKPEFNIRKPESTVP---SKAVVIHKSKYRDDMVKDDYEDDS

:******** :*:: *.* *******:. . .*..*:**** .: .:*. *

Prim.cons. GPKEMTLDEWKAIQNKDRAKVEFNIRKPNEGADGQWKKGFVLHKSKSEEAHAEDSVMDDS

370 380 390 400 410 420

| | | | | |

CGI_55 HHFRKPANDITSQLEINFGDLGRPGRGGRGG-RGGRGRGGRPNRGSRTDKSSAS--APDV

PAI_RBP1 HHFRKPANDITSQLEINFGDLGRPGRGGRGG-RGGRGRGGRPNRGSRTDKSSAS--APDV

Ki_157 HVFRKPANDITSQLEINFGNLPRPGRGARGGTRGGRGRIRRAENNYPRAEVVMQDVAPNP

* *****************:* *****.*** ****** *.:.. : . **:

Prim.cons. HHFRKPANDITSQLEINFGDLGRPGRGGRGGTRGGRGRGGRPNRGSRTDKSSASDVAPDV

430

CGI_55 DDPEAFPALA

PAI_RBP1 DDPEAFPALA

Ki_157 DDPEDFPALS

**** ****:

Prim.cons. DDPEAFPALA

Figura 8: Alinhamento da seqüência de aminoácidos das proteínas CGI-55, PAIRBP1

e Ki-1/57. A caixa corresponde ao motivo “HABP4_PAI-RBP1” comum entre elas.

4.4 Ensaios de cristalização

Os ensaios de cristalização destas proteínas foram realizados por difusão de

vapor em gota sentada com reagentes das empresas Hampton Research (HR), Jena

Bioscience (JBS) e Cristal Screen (CS). Estes sistemas são compostos por diferentes

tampões de cristalização. As placas de cristalização foram mantidas a 18°C e

analisadas semanalmente. Os ensaios de cristalografia foram realizados em

colaboração com a Dra. Beatriz Gomes Guimaraes (LNLS).

4.4.1 Utilizando a proteína recombinante 6his-RACK-1

A proteína RACK1 mostrou formação cristalina do tipo agulha em várias

condições, após 24 horas da realização do ensaio (figura 9 A), na concentração final

de 10 mg/ml.

A partir de uma das condições encontradas (20% PEG 10000/20% Glicerol/

Tris.HCl, pH 8,0/ 0,1 M NaCl), onde observamos a formação de agulhas finas (figura

9A), nos realizamos um ensaio com diferentes concentrações de DTT e encontramos

que a proteína RACK-1 na presença de 5 mM DTT formou cristais maiores do que os

encontrados anteriormente e também mais espessos (figura 9 B).

4.4.2 Utilizando os fragmentos C-terminais de Ki-1/57: KiC (aa 122-413) e KiC2

(aa151-263)

A indução da expressão da proteína 6xHis-Ki-1/57 completa foi mais baixa que

a indução dos fragmentos de Ki-1/57. Desta forma, o baixo rendimento protéico

impossibilitou o uso da proteína 6xHis-Ki-1/57 completa nos experimentos de

cristalização.

Os fragmentos C-terminais de Ki-1/57: KiC (aa 122-413) e KiC2 (aa151-263)

mostraram ser mais puros e estáveis e por isso decidiu-se dar início aos ensaios de

cristalização. Em um período de 24 horas, observamos que as proteínas KiC e KiC2

mostraram formações cristalinas (rosetas). A proteína truncada KiC2 apresentou

formação cristalina nas condições; 0,1 M Tris.HCl pH 8, 5 e 2 M sulfato de amônio

(CS1/4) e 0,1 M Citrato de sódio pH 5,6; 30% PEG 4000 e 2 M acetado de amônio

(CS1/9) e a proteína truncada KiC apresentou formação cristalina na condição 0,1 M

Na Hepes pH 7,5; 5% PEG 4000 e 30% MPD e (JBS 7/C4) (figura 9C e 9D). A co-

cristalização pode ser uma necessidade neste caso, no entanto, continuaremos com a

tentativa de cristalizar as proteínas RACK1, KiC2 e KiC independentes.

Figura 9: Ensaios de cristalização das proteínas recombinantes RACK1 (A-B) e Ki-

1/57 (151-263) (C)/ e Ki-1/57 (122-413) (D). Em A, observou-se que a proteína RACK1

formou pequenas agulhas em tampão: 0,1 M Tris.HCl, pH 8, 0.1 M NaCl, 20% PEG

10.000, 20% Glicerol. Durante o refinamento observamos um aumento significativo no

tamanho das agulhas e na sua espessura, mostrado em B, cujo tampão utilizado o

mesmo utilizado em A e com 5 mM DTT. Em C, formações cristalinas foram

encontradas durante os ensaios de cristalização com a proteína KiC2 no tampão: 0,1

M Tris.HCl pH 8, 5 e 2 M Sulfato de Amônio e em D, durante o ensaio com a proteína

KiC no tampão: 0,1 M Na Hepes pH 7,5; 30% MPD e 5% PEG 4000.

5 DISCUSSÃO

5.1 O ensaio de duplo híbrido em levedura pode sugerir possíveis contextos

funcionais para a proteína Ki-1/57

Para obter informações funcionais sobre uma proteína com função

desconhecida, como a proteína Ki-1/57, existem várias diferentes abordagens e

métodos de biologia molecular. Uma delas é o sistema de duplo híbrido em levedura

(yeast two- hybrid system).

Inicialmente nós não tínhamos o gene completo que codifica a proteína Ki-1/57

e por isso, iniciamos a triagem com o fragmento Ki-1/57(122-413). Posteriormente,

nós conseguimos amplificar a região que codifica o N-terminal de Ki-1/57 e realizamos

um novo ensaio com esta região da proteína.

Com este objetivo de identificar proteínas que interagem com Ki-1/57 pelo

sistema de duplo híbrido em levedura, nós transformarmos a cepa L40 de

Saccharomyces cerevisiae com duas iscas diferentes: a)pBTM116-Ki-1/57(122-413) e

b)pBTM116-Ki-1/57(1-150) e usamos como presa uma biblioteca de cDNA de cérebro

fetal humano clonada no vetor pACT2 (Clontech) como presa. Nos ensaios de duplo

híbrido em levedura, nós identificamos 11 proteínas diferentes (tabela 1, página 79)

que interagem com Ki-1/57(122-413) e 20 proteínas diferentes que interagem com Ki-

1/57(1-150) (tabela 2, página 81). Para uma melhor compreensão das diversas

proteínas encontradas no ensaio de duplo híbrido, consulte a tabela 1 e 2.

Na triagem de proteínas que interagem com Ki-1/57 C-terminal pelo sistema de

duplo híbrido em levedura, destacaram-se as proteínas RACK1 (Receptor for

Activated Kinase –1) e CHD3 (Chromo-Helicase DNA-binding domain protein 3). Isto

porque a proteína RACK1 foi encontrada em 54% das seqüências analisadas e CHD3

porque ela além de interagir com Ki-1/57 esta também interage fortemente com a

proteína CGI-55, aparecendo em 42% das seqüências analisadas (Resultados: Artigo

I).

Interessantemente, nós encontramos a proteína HRMT1L2 (Arginina Metil-

transferase) em ambos os ensaios: com o N- e C- terminal de Ki-1/57. Sabe-se que

esta proteína é responsável pela metilação de resíduos de arginina presente em

motivos denominados por RG Box em proteínas alvo. Estes motivos estão presentes

na seqüência que codifica a proteína Ki-1/57.

Analisando ambos os ensaios nós podemos agrupar as proteínas identificadas

nas seguintes classes funcionais, levando em consideração que uma única proteína

pode estar agrupada em mais de uma classe funcional (ver também figura 10):

1) 62% dos clones encontrados codificam proteínas envolvidas na regulação da

transcrição ou na ligação ao DNA: RACK1, CHD3, TOPORS, ZFP106, ZFP189,

TIP60, BTBD2, YB-1 (NSEP1), GADD34, DAXX, PIAS, p100 e HMG;

2) 51% dos clones encontrados codificam proteínas envolvidas em cascatas de

sinalização celular: RACK1, HRMT1L2, EB-1, RIL, ALEX 2, CTGF e EPS8, APLP1,

Miosina IXA e receptor de crescimento opióide (opioid growth receptor);

3) 45% dos clones encontrados codificam proteínas envolvidas em processamento de

RNA e na ligação ao RNA mensageiro ou RNA ribossômico ou polissomos: RACK1,

CIRBP, YB-1 (NSEP1), SFRS9 e SF2/p32, RPL38, p100 e FXRP;

4) 15% dos clones encontrados codificam proteínas envolvidas na degradação de

outras proteínas, no metabolismo, no citoesqueleto e na apoptose: UBC9, GADD34,

DAXX, NAPH Desidrogenase 1, Miosina IXA e ACTB.

JAK

Fator de

crescimento

TCR

CD30

(ki-1/120)

CD3

Receptores: IFN, IL5,

IL3, IFNR1 e GM-

CSF e Integrinas

ZAP

STAT

fyn

LCK

PKC

ZAP70

STAT

Proteína

adaptadora

PLCγ

P1P2

DAG InP3

Ki-1/57

Daxx

TOPORS

Proteína

adaptadora

PLCγ

P1P2

DAG

Ca+

PKC

Inativa ativa

Golgi

Ca+

PIAS3

TIP 60

ZFP 106

CHD 3

RACK 1

PKC

Ki-1/57

Fosfatase

Ki-1/57

CHD 3

TOPORS

Ki-1/57

UBC9

Ki-1/57

p53

HMG

FXRP

CIRP

NSEP1

BTBD2

RACK 1

FXRP

Ki-1/57

NSEP1

Ki-1/57

SF2/p32

SFRS9

Núcleo

Citoplasma

Extracelular

corpúsculos nucleares

Organização da

cromatina e

ligação ao DNA

ligação ao RNA e

processamento de RNA

ligação ao Polissomos

Ki-1/57

JAK

Fator de

crescimento

TCR

CD30

(ki-1/120)

CD3

Receptores: IFN, IL5,

IL3, IFNR1 e GM-

CSF e Integrinas

ZAP

STAT

fyn

LCK

PKC

fyn

LCK

PKC

ZAP70

STAT

Proteína

adaptadora

PLCγ

P1P2

DAG InP3

P1P2

DAG InP3

P1P2

DAG InP3

Ki-1/57

Daxx

TOPORS

Proteína

adaptadora

PLCγ

P1P2

DAG

P1P2

DAG

P1P2

DAG

Ca+

PKC

Inativa ativa

Golgi

Ca+

PKC

Ca+

PKC

Inativa ativa

Golgi

Ca+

Golgi

Ca+

PIAS3

TIP 60

ZFP 106

CHD 3

RACK 1

PKC

Ki-1/57

Fosfatase

Ki-1/57

CHD 3

TOPORS

Ki-1/57

UBC9

Ki-1/57

p53

HMG

FXRP

CIRP

NSEP1

BTBD2

RACK 1

FXRP

Ki-1/57

NSEP1

Ki-1/57

RACK 1

FXRP

Ki-1/57

NSEP1

Ki-1/57

SF2/p32

SFRS9

Núcleo

Citoplasma

Extracelular

corpúsculos nucleares

Organização da

cromatina e

ligação ao DNA

ligação ao RNA e

processamento de RNA

ligação ao Polissomos

Ki-1/57

Figura 10: Associação a possíveis contextos funcionais da proteína Ki-1/57

através da identificação de proteínas que interagem com ela, usando o sistema duplo

híbrido em levedura. Associamos as proteínas à três papeis funcionais: 1) regulação

da transcrição e organização da cromatina ou ligação ao DNA; 2) cascatas de

sinalização celular e 3) processamento de RNA, ligação ao RNA e aos polissomos

(vide o texto para mais detalhes).

5.2 As proteínas Ki-1/57 e CGI-55 podem apresentar funções similares

A proteína CGI-55 assim como a proteína Ki-1/57 interagem in vivo e in vitro

com a proteína CHD3 (Chromo-Helicase DNA-binding domain protein 3), como

identificado na técnica do duplo híbrido em levedura (Resultados: Artigo I). Usando-se

a seqüência que codifica a proteína CGI-55 como isca, observou-se que 42% dos

clones encontrados mostraram interagir com a região C-terminal da proteína CHD3

(Resultados: Artigo I, fig. 3). Ao realizamos o ensaio de duplo híbrido com a região C-

terminal da proteína Ki-1/57 (122-413), identificamos também a proteína CHD3, mas

desta vez em apenas 4% dos clones encontrados (Resultados: Artigo I, fig. 3). As

interações das duas proteínas CGI-55 e Ki-1/57 com CHD3 foram confirmados em

ensaios in vitro com proteínas recombinantes purificadas (CGI-55) e in vivo (CGI-55,

Ki-1/57) através de estudos de co-imunoprecipitação das proteínas recombinantes

expressas em células de insetos (Reusultados: Artigo I, fig. 5).

As proteínas CHD são membros de uma família de proteínas envolvidas na

regulação da transcrição e na remodelagem da cromatina (Woodage et al., 1997;

Tong et al., 1998). A proteína CHD3 possui na porção central um domínio

Helicase/ATPase o qual é normalmente encontrado em uma família de proteínas, as

quais estão associadas a uma vasta gama de funções, tais como: replicação,

recombinação, reparo de DNA, transcrição, processamento e reparo de RNA. Em

alguns casos estas proteínas fazem parte de um complexo que contém uma

subunidade de desacetilação de histonas que está correlacionado com a inativação da

transcrição (Ogas et al, 1999).

Nós encontramos que além de CHD3, tanto a Ki-1/57 como a CGI-55 interagem

com outras proteínas nucleares, relacionadas com a remodelagem de cromatina e a

regulação da transcrição. Estas proteínas são: TOPORS (proteína que se liga a

topoisomerase I), DAXX (proteína que se liga a Fas) e PIAS (inibidor de STAT

ativada). No entanto, como já foi mencionado, Ki-1/57 interage com várias outras

proteínas envolvidas com a regulação da transcrição: RACK1, ZFP106, ZFP189,

TIP60, BTBD2, YB-1 (NSEP1), FXR1P, UBC9, GADD34, p100 e HMG. Curiosamente,

a proteína Tip60 também possui o domínio CHROMO, encontrado em CHD3 e

envolvido na remodelagem da cromatina. Estes dados sugerem que Ki-1/57 e CGI-55

podem pertencer a uma família de proteínas com funções em comum: remodelagem

da cromatina e regulação da transcrição.

Pela análise da localização celular das proteínas CGI-55-GFP (Resultado:

Artigo I, figura 6) e Ki-1/57-GFP (dados não publicados) nós constamos que as

proteínas CGI-55 e Ki-1/57 apresentam características em comum. Ambas

apresentam um padrão granular na região nuclear e perinuclear. Isto pode sugerir que

ambas estão envolvidas na formação de corpúsculos nucleares.

Sabe-se que o núcleo de mamíferos pode conter de 10 a 30 corpúsculos entre

outras estruturas (Matera, 1999, Muratani et al., 2002) (figura 11A). Entre estes

corpúsculos estão os corpúsculos PML (ND10 ou pODs). Estes corpúsculos

correspondem a um sub-compartimento nuclear, contendo várias proteínas não-

histonas e sem a presença de cromatina ou RNA, sendo encontrados próximos a

outras estruturas nucleares tais como cromatina e os corpúsculos de Cajal (Maul et

al., 2000, Boisvert et al., 2000) (figura 11B). Os corpúsculos de PML estão envolvidos

na supressão de tumores, regulação da expressão gênica, regulação do ciclo celular e

transcrição, estrutura da cromatina, apoptose e na infecção viral (Seeler e Dejean,

1999; Reyes, 2001). Embora a proteína de PML seja essencial para a composição dos

corpúsculos de PML (Zhong et al., 1999), muitas outras proteínas estão presentes

nestes corpúculos, tais como: CHD3, Topors, Daxx e proteínas da família PIAS, Ubc9,

p53, PZLF, HMG, GADD, Sp100, SUMO1 e CBP (Seeler e Dejean, 1999; Maul et al.,

2000). A proteína CGI-55 mostrou interagir com as cinco primeiras proteínas e Ki-1/57

mostrou interagir com as dez primeiras proteínas (figura 11C). Isto pode ser uma forte

evidência de que as proteínas Ki-1/57 e CGI-55 podem estar envolvidas com a

composição ou com a função destes corpúsculos nucleares.

Corpúsculo PML

Regulação da expressão gênica

Diferenciação celular

apoptose

Parada do ciclo celular

Corpúsculo PML

Regulação da expressão gênica

Diferenciação celular

apoptose

Parada do ciclo celular

Corpúsculos

OPT (Oct1, PTF)

Corpúsculos Cajal

Cromatina

hererocromatina

Corpúsculos de

processamento de RNA

(fatores de splicing)

Corpúsculos PML

Compartimento perinuclear

Nucléolo

Nucleoplasma

Corpúsculos

OPT (Oct1, PTF)

Corpúsculos Cajal

Cromatina

hererocromatina

Corpúsculos de

processamento de RNA

(fatores de splicing)

Corpúsculos PML

Compartimento perinuclear

Nucléolo

Corpúsculos

OPT (Oct1, PTF)

Corpúsculos Cajal

Cromatina

hererocromatina

Corpúsculos de

processamento de RNA

(fatores de splicing)

Corpúsculos PML

Compartimento perinuclear

Nucléolo

Nucleoplasma

PML

SUMO 1

Daxx

p53

HMG

CHD3

CGI-55

Ki-1/57

Núcleo

TOPORS

UBC9

PIAS

Corpúsculo PML

GADD34

PML

SUMO 1

Daxx

p53

HMG

CHD3

CGI-55

Ki-1/57

Núcleo

TOPORS

UBC9

PIAS

Corpúsculo PML

GADD34

Figura 11: Arquitetura do núcleo e dos corpúsculos nucleares. A: figura

esquemática do núcleo e de seus sub-compartimentos: cromatina, nucléolo,

heterocromatina, e os corpúsculos: PML, OPT, Cajal e de processamento de RNA

(figura adaptada do site:

http://www.erin.utoronto.ca/~w3bio315/complexity%20nucleus.htm); B: a figura a

esquerda mostra um núcleo marcado com anticorpo anti-PML, mostrando os

corpúsculos PML e a esquerda uma representação esquemática deste corpúsculo

com algumas proteínas que o compõem e as funções desempenhadas (figura retirada

do artigo de Gottifredi e Prives, 2001); C: representação esquemática de várias

proteínas já foram descritas participar da formação de corpúsculos PML e sua

possível relação com as proteínas CGI-55 e Ki-1/57. As setas em azul indicam que

CGI-55 interage com as proteínas interligadas e as setas em vermelho indicam que Ki-

1/57 interage com as proteínas interligadas. No entanto, não sabemos ainda

(interrogação) se as proteínas Ki-1/57 e CGI-55 estão presentes em corpúsculos PML.

5.3 A proteína Ki-1/57 interage com o receptor para quinase C ativada-1

Através do sistema duplo híbrido em levedura, identificamos que a proteína Ki-

1/57 interage especificamente com a proteína adaptadora RACK-1 (“Receptor of

activated C kinase 1”) que está envolvida em mecanismos de transdução de sinal

envolvendo a proteína quinase C (Ron et al., 1994; Chang et al., 1998; Usacheva et

al., 2001). No entanto, a proteína CGI-55 não interagiu com RACK1 (Resultados:

Artigo II).

A proteína RACK1 foi inicialmente identificada e clonada de cDNA de fígado de

galinha e de cDNA de linfócito B humano (Guillemot et al., 1989), descrita com os

nomes C12.13 ou H12.3, respectivamente. A proteína RACK1 foi também descrita

como "Guanine nucleotide-binding protein β-subunit-like" devido a sua similaridade

seqüencial com a subunidade beta da proteína G (Ron et al., 1994). A proteína

RACK1 tem 36 kDa, consiste de 317 aminoácidos e pertence à família de proteínas

que possuem repetições internas do tipo WD (triptofano e ácido aspártico). As

repetições WD são compostas por aproximadamente 40-60 aminoácidos. Nestas

repetições, encontram-se dipeptídeos compostos por glicina e histidina (GH) entre os

resíduos 11-24 na região N-terminal. E estas terminam com triptofano e ácido

aspártico (WD) (Smith et al., 1999). Sete repetições WD são encontradas em RACK1.

A proteína RACK1 pode se ligar a várias enzimas envolvidas na sinalização celular

(Garcia-Higuera et al., 1996 ; Chang et al., 1998; Yu et al., 2000; Smith et al.,2000;

Schechtman e Rosen, 2001; Usacheva et al., 2001). Esta proteína pode ser uma

proteína de ancoragem não somente para PKC, mas também para tirosina quinases,

por exemplo a Src e para tirosina fosfatases, por exemplo a PTPµ (Schechtman e

Rosen, 2001; McCahill et al., 2002).

Várias outras funções são atribuídas às proteínas da família WD-repeat, além

da participação em transdução de sinal. Entre estas funções estão: participação em

processamento de RNA (Takagaki e Manley, 1992), como por exemplo na formação

de partículas snRNP (Angenstein et al. 2002); regulação da formação de vesículas

(Golgi) (Gerich et al., 1995); remodelagem de cromatina (Ahmad et al., 1999);

remodelagem do citoesqueleto (Hamill et al., 1998); divisão celular (Weinstein et al.,

1997, Kim et al., 1998) e morte celular (Rodriguez et al. 1999).

Uma análise estrutural dos membros da família de repetições WD mostrou que

estes apresentaram uma estrutura do tipo hélice-β (

-propeller). Entre essas proteínas

da família WD que tiveram sua estrutura terciária resolvida com o tipo β-hélices estão: a

subunidade beta da proteína G (Wall et al., 1995; Neer e Smith, 1996; Lambright et al.,

1996); envolvida em trandução de sinal; Bub3p (Wilson et al., 2005), uma proteína

envolvida no ciclo celular; Clathrin (ter Haar et al., 1998), uma proteína envolvida na

formação de vesículas; Tup1 (Sprague et al. 2000), um co-repressor transcricional;

Aip1p (Voegtli et al., 2003), uma proteína envolvida com a despolarização de filamentos

de actina e Ski8p (Madrona e Wilson, 2004), uma proteína envolvida na degradação de

RNA.

A proteína RACK1 interagiu especificamente com a porção C-terminal de Ki-

1/57 (122-413) pela técnica do duplo híbrido em levedura (Resultados: Artigo II, fig.1).

Nós testamos a interação entre RACK1 e a porção N-terminal de Ki-1/57 (aa 1-150) e

estas não interagem (Resultados: Artigo II, fig.1A). Isto indica que a mínima região de

interação de Ki-1/57 responsável por sua interação com RACK1 deve estar presente no

seu C-terminal. Por outro lado, nós não conseguimos mapear o sítio de interação de

RACK1 responsável pela ligação com Ki-1/57, pois a interação somente foi confirmada

com a proteína RACK1 completa (Resultados: Artigo II, fig.1B). Desta forma, uma vez

que as repetições WD são conhecidas como responsável pela interação proteína-

proteína, nós acreditamos que o sítio de ligação à Ki-1/57 presente na proteína RACK1

não é baseado em uma seqüência de aminoácido específica, mas em triptofanos

estruturalmente próximos.

5.4 Ki-1/57 é substrato para a proteína quinase C ativada por PMA

Experimentos anteriores com a proteína Ki-1/57 mostraram que esta proteína

quando imunoprecipitada de células humanas co-precipita com atividade quinase em

resíduos de serina e treonina (Ser/Thr) (Rhode et al., 1992). Não se conhecia, no

entanto, se Ki-1/57 seria mesmo uma quinase ou se ela está associada a alguma

quinase.

A descoberta da interação entre Ki-1/57 e RACK1, uma proteína que por sua vez

está diretamente associada com PKC ativada, sugeriu uma hipótese que resolvemos

testar: Ki-1/57 pode estar associado com PKC na sua forma ativada e Ki-1/57 pode ser

alvo da fosforilação por PKC? Desta forma, nossos experimentos tentaram elucidar o

significado da interação entre Ki-1/57-RACK1 focalizando em compreender se RACK1

atua como proteína de ancoragem para PKC e se a fosforilação interfere com esta

interação.

Ki-1/57 co-precipita RACK1 no compartimento nuclear sem indução com PMA.

Isto pode indicar que in vivo Ki-1/57 interage com RACK1 antes de ser fosforilado.

Analisando a seqüência primária da proteína Ki-1/57, nós observamos que esta

apresenta sítios potenciais de fosforilação por PKC. Ao isolamos a PKC de células

L540 ativadas com o estimulador PMA conseguimos demonstrar que Ki-1/57 é um

excelente substrato in vitro da PKC ativada (por PMA) e que Ki-1/57 é pouco

fosforilado pela PKC isolada de células não ativadas (Resultados: Artigo II, fig. 3A,

canaletas 5 e 6).

Enzimas da família proteína quinase C desempenham importantes papéis na

diferenciação celular, proliferação e apoptose (Altman and Villalba, 2002).

Naturalmente dentro das células, as proteínas PKC são alvos de ativação por DAG

(1,2- diacilglicerol) de forma reversível. No entanto, esteres de forbol sintéticos como

PMA (4α –forbol, 12-miristato, 13-acetato) podem ativar PKC de forma irreversível e

por isso são conhecidos por propagar tumores.

A família PKC consiste de várias subfamílias: PKCs convencionais,

dependentes de Ca

e DAG (cPKC: α, βI, βII e γ); PKCs novas, independentes de

e dependentes de DAG (nPKCs: δ,ε,η, e θ); PKCs atípicas, independentes de

e DAG, geralmente ativadas por PIP3 e ceramida (aPKCs: ζ e λ). Além disso,

existe uma outra subfamília de PKC conhecidas como PKCD (PKCµ, PKCν, PKCD2)

(Lint et al., 2002). Nesta subfamília, o DAG não é o único mensageiro secundário. As

PKCD podem ser também ativadas por outros estímulos, tais como: neuropeptídeos,

fator de crescimento, receptores TNF e quando ocorre a sinalização entre receptores

de células B e T.

Nós acreditamos então, que a proteína Ki-1/57 não se autofosforila, uma vez

que não apresenta nenhum domínio conservado de quinase, no entanto, é fosforilada

por PKC e, além disso, esta fosforilação é dependente da ativação por PMA. A

fosforilação é uma modificação pós traducional muito importante e pode resultar numa

mudança conformacional na proteína, influenciando, por exemplo, a interação desta

com outras proteínas. Baseando-se neste conhecimento, nós investigamos se a

fosforilação interferia positivamente ou negativamente na interação com RACK1.

Nós observamos que após a fosforilação da proteína Ki-1/57 in vitro e in vivo,

esta perde sua capacidade de interagir com RACK1 (Resultados: Artigo II, fig. 4A,

canaletas 2 e 3 e Artigo II, fig. 6, canaletas 16 e 15) e migra do núcleo para o

citoplasma (Artigo II, fig. 7A e B). Nós também investigamos se a proteína RACK1

poderia interferir na fosforilação de Ki-1/57 por PKC e observamos que não interfere

(Resultados: Artigo II, fig. 3C).

Após a dissociação da proteína RACK1, a atividade da proteína Ki-1/57 na

célula provavelmente será alterada, já que ela provavelmente interage no núcleo com

uma série de proteínas envolvidas na remodelagem da cromatina, como por exemplo,

CHD-3, entre outras.

O trânsito de Ki-1/57 entre núcleo e citoplasma foi observado tanto nas análises

de Western blot das frações citoplasmáticas e nucleares das células L540

(Resultados: Artigo II, fig. 6, canaletas 35, 36 e 39 e 40) como em estudos de

microscopia de fluorescência, onde a saída de Ki-1/57 do núcleo foi observada após

tratamento com PMA (Resultados: Artigo II, fig. 7AeB). Outro efeito da fosforilação de

Ki-1/57, após a ativação com PMA, é que esta ganha a capacidade de interagir com a

PKC-theta no núcleo e no citoplasma de maneira estável (Resultados: Artigo II, fig. 6,

canaletas 32 e 30).

Especulamos se a fosforilação de Ki-1/57 ocorreria na região responsável pela

ligação em RACK1. Para testar esta hipótese nos expressamos diferentes fragmentos

da proteína Ki-1/57: 6xHis-Ki-1/57(1-150), (151-263), (264-413), (122-413) e

submetemos à fosforilação in vitro. Observamos que os fragmentos C-terminais 6xHis-

Ki-1/57(122-413) e (264-413) foram fosforilados (Resultados: Artigo II, fig. 4B,

canaletas 4 e 5).

Para conhecer especificamente quais resíduos na proteína Ki-1/57 são alvos da

fosforilação pela PKC, nós realizamos uma predição inicial através do programa

NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/). Com o programa, nós

encontramos no fragmento C-terminal extremo (264-413) um total de 15 resíduos de

Ser e Thr com probabilidade de serem fosforilados por proteína quinase C

(Resultados: Artigo II, fig. 5A). Esses fragmentos foram usados para avaliar seu

potencial em servir como substrato de fosforilação pela PKC in vitro. Neste caso,

vimos que somente 2 dos 5 fragmentos, Ki-1/57(294-413) e Ki-1/57(346-413) foram

fosforilados (Resultados: Artigo II, fig. 5C). Interessantemente, estes mesmos

fragmentos foram também capazes de interagir ainda com RACK1, no sistema de

duplo híbrido em levedura (Resultados: Artigo II, fig. 5B).

A proteína 6xHis-Ki-1/57 (264-413) foi submetida a uma análise de fosfo-

aminoácido que revelou que principalmente Thr, mas também resíduos Ser sofrem

fosforilação (Resultados: Artigo II, fig. 5D). Baseado neste achado, nós também

fizemos uma análise dos fosfo-aminoácidos da proteína Ki-1/57 (346-413). Achamos

que esta proteína sofre fosforilação apenas em resíduos de Thr (Resultados: Artigo II,

fig.5 E). Isso sugere que dos 34 resíduos de Thr e Ser na proteína Ki-1/57 e possíveis

alvos de fosforilação por PKC, analisados pelo programa NetPhos 2.0 Server

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/), apenas T354 e T375 são fosforilados pela

PKC in vitro.

A figura 12 é uma representação esquemática do modelo proposto por nós da

via de sinalização entre Ki-1/57/RACK1/PKC a qual regula a localização subcelular de

Ki-1/57.

Estes resultados confirmam o observado por Dr. H. Lemke, onde este observou

que Ki-1/57 encontra-se no citoplasma na forma fosforilada e no núcleo desfosforilada

(dados não publicados).

Ca+

PKC

ativa

Ca+

RACK 1

PKC

ativa

PKC

ativa

Citoplasma

Extracelular

Ki-1/57

PLC

P1P2

Ca+

InP3

DAG

PKC

PMA

RACK 1

PKC

ativa

Ki-1/57

-1/57

PKC

ativa

PKC

ativa

Citoplasma

Ki-1/57

PIP2

InP3

DAG

PMA

PLCγ

PKC

Inativa

Golgi

Ca+

Ki-1/57

RACK 1

PKC

ativa

RACK 1

Núcleo

Ki-1/57

PKC

ativa

PKC

ativa

PKC

PMA

Ca+

PKC

ativa

Ca+

RACK 1

PKC

ativa

PKC

ativa

PKC

ativa

Citoplasma

Extracelular

Ki-1/57

PLC

P1P2

Ca+

InP3

DAG

PKC

PMA

RACK 1

PKC

ativa

Ki-1/57

-1/57

Ki-1/57

-1/57

PKC

ativa

PKC

ativa

Citoplasma

Ki-1/57

PIP2

InP3

DAG

PMA

PLCγ

PKC

Inativa

Golgi

Ca+

Golgi

Ca+

Ki-1/57

RACK 1

PKC

ativa

PKC

ativa

RACK 1

Núcleo

Ki-1/57

PKC

ativa

PKC

ativa

PKC

PMA

Figura 12: Modelo preliminar da regulação da localização subcelular da

proteína Ki-1/57 por fosforilação. A ativação de um receptor pode ativar a fosfolipase

C γ (PLCγ) que faz a hidrólise de PIP2 em DAG e InP3. Estes mensageiros

secundários, junto com o cálcio levam à ativação de PKC. PKC também pode ser

ativada diretamente por PMA. Quando PKC está ativa, ela se liga a RACK1. Nós

creditamos que Ki-1/57 interage com RACK1 no núcleo, é fosforilada por PKC neste

compartimento celular e, finalmente, a interação com RACK1 é interrompida. Ki-1/57

fosforilada migra do núcleo para o citoplasma e agora pode interagir diretamente com

PKC.

5.5 A proteína Ki-1/57 interage com a proteína p53 e pode atuar como seu

repressor transcricional

Nos nossos dois ensaios de duplo híbrido, onde utilizamos a porção maior C-

terminal de Ki-1/57 (122-413) e a porção N-terminal de Ki-1/57 (1-150), encontramos

11 proteínas capazes de interagir também com p53 e ou com outros membros da

família p53 (ex. p73) (Resultados: Artigo III, tabela 1), no entanto não encontramos

nenhum membro da família p53. Isto pode ser explicado pelo fato que somente a

proteína Ki-1/57 completa se mostrou capaz de interagir com p53 (Resultados: Artigo

III, fig. 1B, números 3 e 4).

A proteína p53 foi descoberta por acaso em 1979, quando esta foi

imunoprecipitada com o antígeno T, ou “Large-T”, do vírus SV40, em células

transformadas por este vírus (Oren e Rotter, 1999). Em 1980, alguns pesquisadores

descobriram que muitos cânceres possuem mutações nas quais levam a inativação de

p53 (Hofseth et al. 2004).

A proteína p53 é codificada por um gene situado no cromossomo de número

17, e seu nome é conseqüência de seu peso molecular de 53 kDa. À proteína p53 foi

atribuído um papel importante na carcinogênese (Koumenis et al., 2001). Desde

então, uma vasta literatura tem sido publicada visando definir melhor o seu papel

fisiológico. Sua principal função está relacionada à preservação da integridade do

genoma na célula. Durante o ciclo de divisão celular, a proteína p53 desempenha um

papel muito importante. A função da proteína p53 é, através de uma cascata de

reações, impedir que a célula com o DNA mutado entre em processo de mitose e

complete a divisão. Para isto, dois caminhos poderão ser seguidos: a correção da

mutação através da ativação de proteínas de reparo ou a indução da morte celular

através da apoptose (Vogelstein et al. 2000, 2004). Desta forma, a proteína p53 é uma

proteína supressora de tumor.

A proteína p53 consiste de quatro domínios: um domínio N-terminal de

transativação; um domínio central de ligação ao DNA; um domínio de oligomerização

e um domínio C-terminal básico de regulação. A estrutura do domínio de

oligomerização consiste de 2 folhas do tipo α-helices anti-paralelas e uma folha β-

sheet anti-paralela. (Levine et al., 1990; Soussi et al., 1990; Lane et al. 1990; Levine et

al., 1991; Kaelin et al., 1999).

Nós observamos que a proteína Ki-1/57 fosforilada ou não por PKC interage

igualmente com p53 in vitro pelo sistema GST-pull down. No entanto, quando a

proteína p53 foi fosforilada por PKC, a sua interação com Ki-1/57 foi interrompida

(Resultados: Artigo III, fig. 2B). Curiosamente, a proteína UBC9, a qual interage com

ambas p53 e Ki-1/57, também perde a afinidade por p53 quando esta se encontra

fosforilada (Lin et al., 2004).

Na literatura nós procuramos se no linfoma de Hodgkin a proteína p53

encontra-se mutada ou ausente. Nós observamos que muitos trabalhos relatam que

neste tipo de tumor a p53 se encontra na sua forma selvagem (Sturzenhofecker et al.,

2003; Garcia et al., 2003; Maggio et al., 2001). Desta forma, tornou-se possível utilizar

as células de linfoma de Hodgkin L540 para estudar a interação in vivo entre Ki-1/57 e

p53 (Resultados: Artigo III, fig. 3). Uma vez que confirmamos a interação entre Ki-1/57

e p53, nós ainda tínhamos que compreender qual seria a possível função desta

interação. Para testarmos a hipótese de que Ki-1/57 poderia influenciar na atividade

transcricional de p53 nós utilizamos a técnica de mono-híbrido em levedura.

Nós observamos que Ki-1/57 inibiu a atividade transcricional de p53 em mais

de 50 % (Resultados: Artigo III, fig. 5). Por outro lado, nós investigamos se a proteína

Ki-1/57 interage com a região promotora alvo de p53, o que poderia explicar a redução

na ativação. No entanto, Ki-1/57 foi incapaz de reconhecer esta região, inferindo que a

regulação ocorre diretamente com a proteína p53.

Recentemente foi associado à RACK1 à função de ser um regulador negativo

de p73, um membro da família p53 (Ozaki et al., 2003). RACK1 mostrou inibir a

atividade transcricional de p73, no entanto este mecanismo é revertido pela proteína

de retinoblastoma (pRb). Curiosamente uma outra proteína que mostrou interagir com

Ki-1/57 e também interage com p53 é a proteína YB1. Esta proteína mostrou ser

também um regulador negativo de p53. Quando a proteína YB1 é super expressa na

célula, a atividade transcricional de p53 é reduzida a níveis mínimos (Lasham et al.,

2003). Desta forma, a proteína Ki-1/57 parece estar funcionalmente associada as

proteínas: RACK1 e YB1 (NSEP1) com a mesma função de repressor transcricional

de p53.

5.6 Análises de dicroísmo circular da proteína Ki-1/57

Moléculas opticamente ativas, que possuem um centro de assimetria,

interagem com a luz circularmente polarizada e provocam alteração na polarização da

luz incidente. A técnica espectroscópica de dicroísmo circular (CD) detecta essa

alteração através da medida da diferença da absorção da luz circularmente polarizada

à direita e à esquerda após esta passar através de uma amostra (Greenfield e

Fasman,1973; Woody, 1995).

As proteínas possuem em sua estrutura dois cromóforos principais: as ligações

amídicas e as estruturas aromáticas. As primeiras são responsáveis pelo sinal

característico no comprimento de onda (λ) do ultravioleta distante (abaixo de 250 nm)

sendo amplamente utilizadas como sondas de estruturas secundárias de proteínas. As

estruturas aromáticas das proteínas são responsáveis pelo sinal no ultravioleta

próximo (entre 250-300 nm) e são utilizadas para avaliar a estrutura terciária da

proteína em questão (Woody, 1995). Considerando estas características, a técnica de

CD é utilizada para estimar a quantidade de estrutura secundária de uma determinada

proteína e avaliar mudanças conformacionais ocasionadas por ligantes, agentes

desnaturantes (acidez, uréia, cloridrato de guanidina, temperatura, etc) (Greenfield,

2004). A forma do espectro de CD de uma proteína específica depende do seu

conteúdo de estrutura secundária. Isto permite que as proporções de hélices,

estruturas beta, alças (turns) e estruturas randômicas sejam determinadas. Estudos

de sinais característicos de diferentes estruturas secundárias nos espectros de CD de

proteínas possibilitaram classificá-las em 5 classes (Levitt e Chothia, 1976): 1)

principalmente α-hélices, 2) principalmente folhas β-pregueadas, 3) α + β (regiões α e

β separadas), 4) α/β (regiões com α e β misturadas), e 5) randômica

(predominantemente desordenada).

Pelas análises dos espectros de CD, nós observamos que os fragmentos de Ki-

1/57 apresentam uma predominância de folha beta na composição de suas estruturas

secundárias (Resultados: Artigo IV, fig. 3A). Estes resultados indicam uma

predominância de estruturas do tipo folha β-pregueada anti-paralela em todos os

fragmentos analisados de acordo com o programa CDNN Deconvolution (versão 2-

Bioinformatic.biochemtech.unihalle.dee/cdnn).

No entanto, nós observamos que quando o fragmento de Ki-1/57 (122-413) foi

fosforilado in vitro e submetido às análises de CD, houve um ganho de estrutura do

tipo α-hélice e perda de estrutura do tipo folha β-pregueada anti-paralela (Resultados:

Artigo IV, fig. 3B). Desta forma, concluímos que a fosforilação de Ki-1/57 interfere na

estrutura secundária desta proteína. Isto poderia explicar nossos dados anteriores

(Nery et al., 2004) onde a proteína Ki-1/57 quando fosforilada não mais interage com

RACK1. Com estes dados podemos entender que algum tipo de mudança estrutural

pode ser a causa da interrupção desta interação.

5.7 Análises por dicroísmo circular da proteína RACK1 e de sua interação com

Ki-1/57

A proteína RACK1 possui 36 kDa e consiste de 317 aminoácidos. Esta proteína

pertence a uma família de proteínas que possuem repetições internas de aminoácidos

Trp-Asp (WD-repeats). Sete repetições WD foram encontradas em RACK1. O

espectro de CD da proteína RACK1 é indicativo de presença de folhas do tipo β-

pregueadas. A proteína RACK1 apresenta um pico de absorção com o máximo de

229-300 nm, típico de proteínas WD-repeats (Resultados: Artigo IV). Este pico é

geralmente atribuído à presença de pontes de sulfeto ou interações entre resíduos

aromáticos como triptofanos, fenilalanina e tirosinas (Saxena, K 1996; Wall et al.,

1995; Hider et al., 1988). No total, a proteína de fusão 6xHis-RACK1 contém 13

triptofanos, 8 fenilalaninas e 6 tirosinas. A proteína RACK1, assim como todas as

outras proteínas da família WD, tem muitos triptofanos e, possivelmente, o pico entre

229-230 nm é devido aos triptofanos encontrados em todas as proteínas desta família

com espectro de CD descrito na literatura.

Um trabalho descrito na literatura correlaciona o pico entre 229-230 nm aos

triptofanos expostos nesta família de proteínas, que são responsáveis por interação

proteína-proteína (Saxena et al. 1996). Neste trabalho, o pico de absorção

desapareceu quando foi adicionado N-bromosuccinimida (NBS), um reagente que

reage especificamente com triptofanos.

Para investigar se a proteína Ki-1/57 interage com os possíveis triptofanos

expostos da proteína RACK1, nós realizamos experimentos de dicroísmos circular das

100

proteínas RACK1 na presença de NBS (Resultados: Artigo IV, fig. 2A) e em complexo

com os fragmentos Ki-1/57(264-413) e (122-413) (Resultados: Artigo IV, fig. 2B). Os

nossos estudos mostraram que o NBS aboliu o pico positivo de RACK1. Além disso, a

deleção Ki-1/57(122-413) interferiu com o pico positivo de RACK1, eliminando-o. No

entanto, este mesmo fragmento fosforilado por PKC e o fragmento Ki-1/57(151-263),

que mostrou não interagir com RACK1, não foram capazes de eliminar o pico positivo

de RACK1, o que pode indicar que eles sejam ineficientes na ligação aos triptofanos

expostos de RACK1 (Resultadaos: Artigo IV, fig 2B).

5.8 Análises por emissão de fluorescência de RACK1 e Ki-1/57

O estudo espectrofotométrico por fluorescência é baseado em um fenômeno

quântico no qual um elétron de um determinado cromóforo, após absorver uma

determinada quantidade de energia, atinge um estado excitado e ao retornar ao seu

estado basal este emite parte da energia absorvida na forma de luz (Lakowicz et al.,

1983). Desta forma, a quantidade de energia emitida na forma de ondas

eletromagnéticas é relativamente inferior à energia absorvida (energia de excitação) e

o λ da luz emitida é maior do que aquele da luz absorvida. Existem três aminoácidos

em proteínas que apresentam o fenômeno de fluorescência. São eles: principalmente

triptofano, tirosina e em menor escala fenilalanina (Lakowicz et al., 1983).

101

Os resultados obtidos pela técnica de fluorescência confirmaram os dados

anteriores obtidos por CD, uma vez que a proteína Ki-1/57 parece interagir com os

triptofanos de RACK1. Os espectros de emissão de fluorescência de triptofano

(excitação em 295 nm) da proteína RACK1 foram comparados com os espectros

obtidos quando esta proteína foi incubada com os fragmentos Ki-1/57 (264-413) ou Ki-

1/57 (122-413) (Resultados: Artigo IV, fig. 4B). A proteína RACK1 apresenta 13

triptofanos (W17, W43, W83, W90, W132, W150, W170, W177, W219, W247, W259,

W291, W310) e seu espectro de fluorescência apresenta um máximo em 335 nm. A

proteína Ki-1/57 apresenta somente 3 triptofanos (W130, W241 e W296). Desta forma,

uma vez que os espectros foram obtidos na mesma concentração de proteína, o

fragmento Ki-1/57 (122-413), com 3 triptofanos, e o fragmento Ki-1/57 (264-413), com

apenas um triptofano, apresentam uma intensidade de fluorescência inferior ao

observado para RACK1 (Resultados: Artigo IV, fig. 4B).

6 CONCLUSÕES

6.1 - Os resultados do “Northern blot” indicam que a proteína Ki-1/57 apresenta uma

maior expressão em coração, músculo esquelético, rins e cérebro humano;

6.2- A proteína Ki-1/57 possui um parólogo humano, CGI-55, com o qual apresenta

uma similaridade de 67,6 % ao nível da seqüência de aminoácidos (40,7 % dos

resíduos são idênticos);

6.3- As proteínas CGI-55 e Ki-1/57 interagem com a proteína CHD3 (Chromo-Helicase

DNA-binding domain protein 3);

6.4- A proteína Ki-1/57 interage com o receptor para quinase C ativada-1 (RACK-1),

mas a proteína CGI-55 não. A interação entre Ki-1/57 e RACK1 foi confirmada por

experimento de co-imunoprecipitação e co-precipitação;

6.5- Ki-1/57 é substrato para a proteína quinase C (PKC) ativada por PMA in vitro e in

vivo. A proteína RACK1 não interfere na fosforilação de Ki-1/57 por PKC;

6.6- Após a sua fosforilação a proteína Ki-1/57 perde sua capacidade de interagir com

a proteína RACK1 in vitro e in vivo;

6.7- Quando as células L640 ou HeLa são estimuladas com PMA, a proteína Ki-1/57

migra do núcleo para o citoplasma;

6.8- O extremo C-terminal de Ki-167(366-613) é responsável pela interação com

RACK1, como observado pelos experimentos com sistema duplo híbrido em levedura

sendo fosforilado pela PKC;

102

6.9- Análises de fosfo-aminoácidos de Ki-1/57(366-613) mostraram que este

fragmento sofre fosforilação apenas em resíduos de treonina. Isso tudo sugere que

dos 34 resíduos de Thr e Ser possíveis alvos de fosforilação na proteína Ki-1/57,

apenas T366 e T376 são alvos diretos da fosforilação pela PKC in vitro.

6.10- A proteína Ki-1/57 interage com a proteína p53 pelo sistema de duplo híbrido em

levedura e em experimentos de imunoprecipitação e co-precipitação in vitro;

6.11- Nós observamos que a proteína Ki-1/57 fosforilada ou não por PKC interage

igualmente com p53 in vitro. No entanto, quando a proteína p53 foi fosforilada por

PKC a sua interação com Ki-1/57 foi interrompida;

6.12- A proteína Ki-1/57 inibiu a atividade transcricional de p53 em mais de 60 % no

ensaio de mono híbrido em levedura;

6.13- Estudos de espectroscopia de dicroísmo circular de Ki-1/57 e seus fragmentos

mostraram uma predominância de estrutura secundária do tipo folha-β pregueada e

além disso, todas as proteínas apresentaram aproximadamente 36% de regiões de

baixa complexidade estrutural (“random coil”);

6.14- O fragmento de Ki-1/57(122-613) fosforilado in vitro e submetido às análises de

CD mostrou um ganho de estrutura do tipo α-hélice e perda de estrutura do tipo folha

β-pregueada anti-paralela. Desta forma, concluímos que a fosforilação de Ki-1/57

interfere na estrutura secundária desta proteína, assim possivelmente contribuindo

com a interrupção da interação com RACK1;

6.15- O espectro de CD da proteína RACK1 é indicativo de presença de folha do tipo

β-pregueada. Além disso, esta proteína apresenta um pico positivo com máximo entre

229-300 nm, típico de proteínas da família “WD-repeat” ricas em triptofanos. Este pico

positivo de RACK1 desapareceu quando esta foi tratada com NBS e quando esta foi

complexada aos fragmentos Ki-1/57 (266-613) e Ki-1/57 (122-613). Isto sugere que Ki-

1/57 interage com os triptofanos da superfície da proteína RACK1.

103

7 PERSPECTIVAS

Neste trabalho de doutoramento foram realizados estudos funcionais da proteína

Ki-1/57, caracterizando sua interação com as proteínas RACK1 e p53. No entanto,

vários experimentos devem ser feitos ainda para melhor caracterizar o papel de Ki-

1/57 dentro da via de sinalização destas proteínas.

Uma outra abordagem foi o estudo estrutural e espectroscópico das proteínas

RACK1 e Ki-1/57. Inicialmente nós tentamos cristalizar as proteínas recombinantes:

6xHis-RACK1, 6xHis-Ki-1/57(122-613) e 6xHis-Ki-1/57(161-263). As proteínas 6xHis-

Ki-1/57(122-613) e (161-263) apresentaram uma cristalização na forma de pequenas

rosetas e a proteína 6xHis-RACK1 apresentou uma cristalização na forma de finas

agulhas. No entanto, estes resultados obtidos não possibilitaram dar início aos

experimentos de difração por raios-X e resolução de suas estruturas terciárias. Mas o

fato destas proteínas já terem apresentado uma formação cristalina pode ser uma

forte indicação que elas estão corretamente enoveladas e estamos perto de conseguir

cristais que possam ser usados em experimentos de difração de raios-X e tentar

resolver a estrutura destas proteínas. Além disso, a RACK1 possui alta identidade

seqüencial com a subunidade beta da proteína G e essa somente foi cristalizada em

complexo com as outras subunidades. Isto sugere que a co-cristalização pode ser

uma necessidade para uma formação cristalina favorável das proteínas Ki-1/57 e

RACK1 para poder dar início aos experimentos de difração de raios-X. Já os estudos

espectroscópicos foram bem sucedidos e a sua padronização possibilita novos

estudos de interação entre Ki-1/57 e outras proteínas, como por exemplo p53.

A proteína Ki-1/57 pode ser uma proteína filogeneticamente antiga, pois além de

estar presente nos vertebrados, nós podemos encontrar possíveis ortólogos em

organismos invertebrados, tais como: Drosophila melanogaster (gi:26686396),

Caenorhabditis elegans (gi:26168369), e Aedes aegypti (gi:16210666). Pouco se sabe

a respeito da função de Ki-1/57 e desta família de proteínas, no entanto, todos os

possíveis ortólogos parecem estar relacionados com o metabolismo, transporte ou

processamento de RNA. Alinhando-se a seqüência de Ki-1/57 com as proteínas de

invertebrados pelo programa ClustalW: (www.clustaw.genome.ad.jp/) nós observamos

que Ki-1/57 apresenta uma similaridade de 61,6% ao nível da seqüência de

aminoácidos com a proteína VIG de Drosophila (22,18% dos resíduos são idênticos);

104

uma similaridade de 66,9% ao nível da seqüência de aminoácidos com a proteína

HABP4 de C. elegans (26,26% dos resíduos são idênticos); uma similaridade de

67,11 % ao nível da seqüência de aminoácidos com a proteína HABP4 de A aegypti

(22,68 % dos resíduos são idênticos). Neste alinhamento retiramos os 16 aminoácidos

iniciais da proteína Ki-1/57, porque estes se diferem de todas as proteínas estudadas.

Entre os possíveis ortólogos encontrados em invertebrados, podemos dizer que a

proteína VIG de Drosophila é a melhor caracterizada (Caudy et al., 2002; Caudy et al.,

2003; Caudy e Hannon, 2004). A proteína VIG não tem nenhum domínio reconhecido,

com exceção de uma região rica em arginina e glicina denominada por “RG Box”. Esta

região é responsável por ligar a RNA e também está presente em Ki-1/57.

Interessantemente, a proteína VIG interage com as proteínas as proteínas da família X

frágil de Drosophila: dFXRP1, dFXRP2 e dFMR1 (Caudy et al., 2002) e nós

encontramos no ensaio de duplo híbrido em levedura que Ki-1/57 interage com a

proteína humana: hFXRP2. As proteínas da família X frágil são bem conservadas em

humanos e em Drosophila e estas contém dois domínios de KH e um motivo RG. O

domínio KH é essencial para ligação ao RNA em ambas as espécies: Drosophila e

humanos (Wan et al., 2000). As proteínas da família X frágil se ligam aos

poliribossomos, predominantemente na subunidade 60S do ribossomo e

desempenham um importante papel no desenvolvimento da síndrome de

retardamento mental X frágil. A proteína VIG além de se associar com várias proteínas

da família X frágil associa-se também com as proteínas RISC e Ago-2 envolvidas com

o mecanismo de silenciamento gênico através do RNA de interferência (RNAi). RNAi é

realizado por uma via endógena muito importante para o desenvolvimento normal de

muitos organismos, como em Drosophila e C. elegans. Estes organismos expressam

centenas de micro RNAs diferentes (miRNAs) com a função de suprimir a expressão

de genes endógenos. Estes miRNAS de interferência são úteis para estudar os

aspectos da maquinaria de RNAi e utilizá-la para benefício humano.

Além da proteína FXRP2, a proteína Ki-1/57 mostrou interagir com outras

proteínas que se ligam a RNA como: YB-1 (NSEP1) e CIRP, além de proteínas

envolvidas no processamento de mRNA (SFRS9 e SF2/p32) e interessantemente com

proteínas que se ligam a polissomos (RPL38, NSEP1, FXRP e RACK1). Estes dados

abrem novas hipóteses funcionais da proteína Ki-1/57: será que Ki-1/57 interage com

RNA? Será que ela está envolvida com a regulação e maturação do RNA?

105

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abbas AK, Lichtman AH e Pober JS (2000). In: Cellulas and Molecular Immunology 4

ed. W.B. Sunders company. A Harcourt Health Sciences Company: 26-33.

Ahmad A, Takami Y e Nakayama T (1999). WD repeats of the p48 subunit of chicken

chromatin assembly factor-1 required for in vitro interaction with chicken histone

deacetylase-2. J Biol Chem. 274 (23): 16646-53.

Altman A e Villalba M (2002). Protein Kinase C-theta (PKCtheta): A Key Enzyme in T

Cell Life and Death. J Biochem. 132 (6): 841-46.

Amakawa R, Hakem A, Kundig TM, et al. (1996). Impaired negative selection of T cells

in Hodgkin’s disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84: 551-62.

Angenstein F, Evans AM, Settlage RE, Moran ST, Ling SC, Klintsova AY, Shabanowitz

J, Hunt DF e Greenough WT (2002). A receptor for activated C kinase is part of

messenger ribonucleoprotein complexes associated with polyA-mRNAs in neurons. J

Neurosci. 22 (20): 8827-37.

Bashirova AA, Markelov ML, Shlykova TV, Levshenkova EV, Alibaeva RA e Frolova

EI. (1998). The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic

organization and alternative transcripts. Gene 210 (2): 239-45.

Berglund M, Flordal E, Gullander J, Lui WO, Larsson C, Lagercrantz S e Enblad G

(2003).

Molecular cytogenetic characterization of four commonly used cell lines

derived from Hodgkin lymphoma.

Cancer Genet Cytogenet. 141 (1): 43-8.

Boisvert FM, Hendzel MJ e Bazett-Jones DP (2000). Promyelocytic leukemia (PML)

nuclear bodies are protein structures that do not accumulate RNA. J Cell Biol. 148 (2):

283-92.

Borchmann P, Schnell R, Schulz H e Engert A (2004). Monoclonal antibody-based

immunotherapy of Hodgkin's lymphoma. Curr Opin Investig Drugs 5 (12): 1262-67.

Bowen MA, Olsen KJ, Cheng L, Avila D e Podack ER (1993). Functional effects of

CD30 on a large granular lymphoma cell line, YT: inhibition of cytotoxicity, regulation of

CD28 and IL-2R, and induction of homotypic aggregation. J Immunol.151: 5896-906.

Braeuninger A, Kuppers R, Strickler JG, Wacker HH, Rajewsky K e Hansmann ML

(1997).

Hodgkin and Reed-Sternberg cells in lymphocyte predominant Hodgkin

disease represent clonal populations of germinal center-derived tumor B cells. Proc

Natl Acad Sci U S A 94 (17): 9337-42.

Broadhurst, MK e Wheeler; TT (2001). The p100 coactivator is present in the nuclei of

mammary epithelial cells and its abundance is increased in response to prolactin in

culture and in mammary tissue during lactation. J Endocrinol.171 (2): 329-37.

106

Carim-Todd L, Sumoy L, Andreu N, Estivill X e Escarceller M (2001). Identification and

characterization of BTBD1, a novel BTB domain containing gene on human

chromosome 15q24. Gene 10; 262 (1-2): 275-81.

Caudy AA, Myers M, Hannon GJ e Hammond SM (2002). Fragile X-related protein and

VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev. 16 (19): 2491-96.

Caudy AA, Ketting RF, Hammond SM, Denli AM, Bathoorn AM, Tops BB, Silva JM,

Myers MM, Hannon GJ e Plasterk RH (2003). A micrococcal nuclease homologue in

RNAi effector complexes. Nature 425 (6956): 411-14.

Caudy AA e Hannon GJ (2004). Induction and biochemical purification of RNA-induced

silencing complex from Drosophila S2 cells. Methods Mol Biol. 265: 59-72.

Chang BY, Conroy KB, Machleder EM e Cartwright CA (1998). RACK1, a receptor for

activated C kinase and a homolog of the β subunit of G proteins, inhibits activity of Src

tyrosine kinases and growth of NIH 3T3 cells. Mol and Cel Biol. 18 (6): 3245-56.

Chakravarti A, Halloran SL, Bale SJ e Tucker MA (1986). Etiological heterogeneity in

Hodgkin's disease: HLA linked and unlinked determinants of susceptibility independent

of histological concordance. Genet Epidemiol. 3 (6): 407-15.

Chiarlie R, Podda A, Prolla G, Podack ER, Thorbeecke GJ e Inggirami G (1999). CD30

overexpression enhances negative selection in the thymus and mediates programmed

cell death via Bcl-2-sensitive pathway. J Immunol. 163: 194-205.

Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R. e Fields, S (1991). The two-hybrid system: a

method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest.

Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578-82.

Chung, CD, Liao J, Liu B, Rao X, Jay P, Berta P e Shuai K (1997). Specific inhibition of

Stat3 signal transduction by PIAS3. Science 278 (5344): 1803-05.

De Young, AL, Duramad, O. e Winoto, A. (2000). The TNF Receptor Family Member

CD30 is not essential for negative selection. J Immunol. 165: 6170-73.

Didier DK, Schiffenbauer J, Woulfe SL, Zacheis M e Schwartz BD (1988).

Characterization of the cDNA encoding a protein binding to the major histocompatibility

complex class II Y box. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (19): 7322-26.

Dürkop H, Latza U, Hummel M, Eitelbach F, Seed B e Stein H (1992). Molecular

cloning and expression of a new member of the nerve growth factor receptor family

that is characteristic for Hodgkin’s disease. Cell 68: 421-27.

Evanko SP e Wight TN (1999). Intracellular localization of hyaluronan in proliferating

cells. Histochem Cytochem. 47 (10): 1331-42.

Fields, S e Song, O (1989). A novel genetic system to detect protein-protein

interactions. Nature 340: 245-46.

107

Fields, S e Sternglanz, R (1994). The two-hybrid system: an assay for protein-protein

interactions. Trends Genet. 10: 286-92.

Forbes JF e Morris PJ (1970). Leucocyte antigens in Hodgkin's disease. Lancet. 2

(7678): 849-51.

Fu X, McGrath S, Pasillas M, Nakazawa S e Kamps MP (1999). EB-1, a tyrosine

kinase signal transduction gene, is transcriptionally activated in the t(1;19) subset of

pre-B ALL, which express oncoprotein E2a-Pbx1. Oncogene 18 (35):4920-29.

Furukawa K e Terayama H (1979). Pattern of glycosaminoglycans and glycoproteins

associated with nuclei of regenerating liver of rat. Biochim Biophys. Acta. 585 (4): 575-

88.

Garcia JF, Camacho FI, Morente M, Fraga M, Montalban C, Alvaro T, Bellas C,

Castano A, Diez A, Flores T, Martin C, Martinez MA, Mazorra F, Menarguez J, Mestre

MJ, Mollejo M, Saez AI, Sanchez L, Piris MA e Spanish Hodgkin Lymphoma Study

Group (2003). Hodgkin and Reed-Sternberg cells harbor alterations in the major tumor

suppressor pathways and cell-cycle checkpoints: analyses using tissue microarrays.

Blood 101 (2): 681-89.

Garcia-Higuera I, Thomas TC, Yi F e Neer EJ (1996). Intersubunit surfaces in G

protein alpha beta gamma heterotrimers. Analysis by cross-linking and mutagenesis of

beta gamma. J Biol Chem. 271 (1): 528-35.

Gerich B, Orci L, Tschochner H, Lottspeich F, Ravazzola M, Amherdt M, Wieland F e

Harter C (1995). Non-clathrin-coat protein alpha is a conserved subunit of coatomer

and in Saccharomyces cerevisiae is essential for growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 92

(8): 3229-33.

Gerli R, Pitzalis C, Bistoni O, et al. (2000). CD30

T cells in rheumatoid synovitis:

mechanisms of recruitment and functional role. J Immunol, 164: 4399-407.

Gerli R, Lunardi C, Vinante F, Bistoni O, Pizzolo G e Pitzalis C (2001). Role of CD3

cells in rheumatoid arthritis: a counter-regulatory paradigm for the Th1-driven diseases.

Trends Immunol. 22: 72-77.

Gottifredi V e Prives C (2001). P53 and PML: new partners in tumor suppression.

Trends Cell Biol. 11 (5): 184-87.

Grammatikakis N, Grammatikakis A, Yoned M, Yu Q, Nanerjje, SD e Toole BP (1995).

A novel gycosaminoglycan binding protein is the vertebrate homologue of the cell cycle

control protein Cdc37. J. Biol. Chem. 7: 270 (27): 166198-205.

Grasberger H, Ye H, Mashima H e Bell GI (2005). Dual promoter structure of ZFP106:

regulation by myogenin and nuclear respiratory factor-1. Gene 344: 143-59.

108

Greenfield NJ e Fasman GD (1973). Meth. Circular Dichroism and Optical Rotary

Dispersion of Proteins and Polypeptides. Enzymology 27: 675.

Greenfield NJ (2004). Circular Dichroism: 1-39 (in: http://www2.umdnj.edu/ cdrwjweb/

handout.pdf)

Gruss HJ, DaSilva N, Hu ZB, Uphoff CC, Goodwin RG e Drexler HG (1994).

Expression and regulation of CD30 ligand and CD30 in human leukemia-lymphoma

cell lines. Leukemia 8: 2083-94.

Guillemot F, Billault A e Auffray C (1989). Physical linkage of a guanine nucleotide-

binding protein-related gene to the chicken major histocompatibility complex. Proc Natl

Acad Sci. USA 86 (12): 4594-98.

Hall, SS (1998). The Killers that save us. In: the seventh in a series of reports about

biomedical science from Hughes Medical Institute: Arousing the fury of the immune

system p. 7-39.

Haluska P Jr, Saleem A, Rasheed Z, Ahmed F, Su EW, Liu LF e Rubin EH (1999).

Interaction between human topoisomerase I and a novel RING finger/arginine-serine

protein. Nucleic Acids 27 (12): 2538-44.

Hamill DR, Howell B, Cassimeris L e Suprenant KA (1998). Purification of a WD repeat

protein, EMAP, that promotes microtubule dynamics through an inhibition of rescue. J

Biol Chem. 27 (15) 9285-91.

Hansen H, Lemke H, Bredtfeldt G, Könnecke I e Havsteen B (1989). The Hodgkin-

associated Ki-1 antigen exists in an intracellular and a membrane-bound form. Biol.

Chem. Hoppe-Seyler 370: 409-16.

Hansen H, Bredfeldt G, Havsteen B e Lemke, H (1990): Proteinkinase activity of the

intracellular but not of the membrane-associated form of the Ki-1 antigen (CD30). Res.

Immunol. 141: 13-31

Heaton JH, Dlakic WM, Dlakic M e Gelehrter TD (2001). Identification and cDNA

cloning of a novel RNA-binding protein that interacts with the cyclic nucleotide-

responsive sequence in the Type-1 plasminogen activator inhibitor mRNA. J Biol Chem

276 (5): 3341-7.

Heim S e Mitelman F (1986). Secondary chromosome aberrations in the acute

leukemias. Cancer Genet Cytogenet 22 (4): 331-8.

Heuser C, Guhlke S, Matthies A, Bender H, Barth S, Diehl V, Abken H e Hombach A

(2004). Anti-CD30-scFv-Fc-IL-2 antibody-cytokine fusion protein that induces resting

NK cells to highly efficient cytolysis of Hodgkin's lymphoma derived tumour cells. Int J

Câncer 110 (3): 386-94.

109

Hider RC, Kupryszewski G, Rekowski P e Lammek B (1988). Origin of the positive

225-230 nm circular dichroism band in proteins. Its application to conformational

analysis. Biophys Chem. 3(1-2): 45-51.

Hinz M, Loser P, Mathas S, Krappmann D, Dorken B e Scheidereit C (2001).

Constituitive NFkappaB maintains high expression of a characteristic gene network,

including CD40, CD86, and a set of antiapoptotic genes in Hodgkin/Reed-Sternberg

cells. Blood 97: 2798-807.

Hodgkin T. (1832). On some morbid appearances of the absorbent glands and spleen.

Med Chir Trans. 17: 68-114.

Hofseth LJ, Hussain SP e Harris CC (2004). p53: 25 years after its discovery. Trends

Pharmacol Sci. 25 (4): 177-81.

Hollander MC, Poola-Kella S. e Fornace AJ Jr (2003). Gadd34 functional domains

involved in growth suppression and apoptosis. Oncogene 22 (25), 3827-32.

Hsu SM e Hsu PL. (1994). The nature of Reed-Sternberg cells: phenotype, genotype,

and other properties. Crit Rev Oncog. 5: 213-46.

Hsu SM, Lin J, Xie SS, Hsu PL e Rich S. (1993). Production of transforming growth

factor ß1 and ß2 by Hodgkin’s Reed-Sternberg cells and reactive T lymphocytes in

Hodgkin’s disease. Hum Pathol 24: 249-55.

Hsu SM, Waldron AJ, Xie SS e Hsu PL (1995). Hodgkin’s disease and anaplastic large

cell lymphoma revisited—I. Unique cytokine and cytokine receptor profile distinguished

from that of non-Hodgkin’s lymphomas. J Biomed Sci. 2: 302-13.

Huang L, Grammatikakis N, Yoneda M, Banerjee SD e Toole BP (2000). Molecular

Characterization of a Novel Intracellular Hyaluronan-binding Protein. J. Biol. Chem.

275: 29829-39.

Hudson M e Donaldson SS (2002). Hodgkin’s disease. In Pizzo PA, Poplack DG, eds.

Principles and practice of pediatric oncology. 4d ed. Philadelphia. JB Lippincott 637-60.

Hunger SP, Link MP, Donaldson SS (1994). ABVD/MOPP and low-dose involved-field

radiotherapy in pediatric Hodgkin's disease: the Stanford experience. J Clin Oncol. 12

(10): 2160-66.

Irsch J, Nitsch S, Hansmann ML, Rajewsky K, Tesch H, Diehl V, Jox A, Kuppers R,

Radbruch A (1998).

Isolation of viable Hodgkin and Reed-Sternberg cells from

Hodgkin disease tissues.

Proc Natl Acad Sci U S A 95 (17): 10117-22.

Kadin ME (2000). Regulation of CD30 antigen expression and its potential significance

for human disease. American Journal of Pathology 156 (5): 1479-84.

Kaelin WG Jr. (1999). The p53 gene family. Oncogene 18 (53): 7701-05.

110

Kenmochi N, Kawaguchi T, Rozen S, Davis E, Goodman N, Hudson TJ, Tanaka T e

Page, DC (1998). A map of 75 human ribosomal protein genes. Genome Res. 8 (5),

509-23.

Khanna R, Burrows SR e Moss DJ (1995). Immune Regulation in Epstein-Barr Virus-

Associated Diseases. Microbiological Reviews 59: 387-405.

Kim SH, Lin DP, Matsumoto S, Kitazono A e Matsumoto T (1998). Fission yeast Slp1:

an effector of the Mad2-dependent spindle checkpoint. Science 279 (5353) 1045-47.

Kobarg J, Schnittger S, Fonatsch C, Lemke H, Bowen MA, Buck F e Hansen HP

(1997). Characterization, Mapping and Partial cDNA Sequence of the 57-kD

Intracellular Ki -1 Antigen. Exp. Clin. Immunog. 14: 273-80.

Koumenis C, Alarcon R, Hammond E, Sutphin P, Hoffman W, Murphy M, Derr J, Taya

Y, Lowe SW, Kastan M, Giaccia A (2001). Regulation of p53 by Hypoxia: Dissociation

of Transcriptional Repression and Apoptosis from p53-Dependent Transactivation. Mol

Cell Biol. 21 (4): 1297-310.

Krainer AR, Mayeda A, Kozak D, Binns G. (1991). Functional expression of cloned

human splicing factor SF2: homology to RNA-binding proteins, U1 70K, and Drosophila

splicing regulators. Cell 66 (2): 383-94.

Küppers R, Klein U, Schwering I, Distler V, Brauninger A, Cattoretti G, Tu Y,

Stolovitzky GA, Califano A, Hansmann ML, Dalla-Favera R (2003). Identification of

Hodgkin and Reed-Sternberg cell-specific genes by gene expression profiling.

J Clin

Invest. 111 (4): 529-37.

Kurochkin IV, Yonemitsu N, Funahashi SI, Nomura H, Lambright DG, Sondek J, Bohm

A, Skiba NP, Hamm HE e Sigler PB (2001). ALEX1, a novel human armadillo repeat

protein that is expressed differentially in normal tissues and carcinomas. Biochem.

Biophys. Res. 280 (1): 340-47.

Kuze T, Nakamura N, Hashimoto Y, Abe M, Wakasa H (1996). Clinicopathological,

immunological and genetic studies of CD30+ anaplastic large cell lymphoma of B-cell

type; association with Epstein-Barr virus in a Japanese population.

J Pathol. 180 (3):

236-42.

Lakowicz JR, Maliwal BP, Cherek H e Balter A (1983). Rotational freedom of

tryptophan residues in proteins and peptides. Biochemistry 22 (8):1741-52.

Lambright DG, Sondek J, Bohm A, Skiba NP, Hamm HE e Sigler PB (1996). The 2.0 A

crystal structure of a heterotrimeric G protein. Nature 379 (6563): 311-19.

Lane D.P., Benchimol S. (1990). p53: oncogene or anti-oncogene? Genes Dev. 4:1-8.

Lasham A, Moloney S, Hale T, Homer C, Zhang YF, Murison JG, Braithwaite AW

eWatson J (2003). The Y-box-binding protein, YB1, is a potential negative regulator of

the p53 tumor suppressor. J Biol Chem. 278 (37): 35516-23.

111

Lemos TA, Passos DO, Nery FC e Kobarg, J. (2003). Characterization of a new family

of proteins that interact with the C-terminal region of the chromatin-remodeling factor

CHD-3. FEBS Lett 533 (1-3): 14 -20.

Lenkkeri U, Kestila M, Lamerdin J, McCready P, Adamson A, Olsen A, Tryggvason K

(1998). Structure of the human amyloid-precursor-like protein gene APLP1 at 19q13.1.

Hum Genet. 102 (2): 192-96.

Levine PH (2002). Hodgkin’s Disease. In Heath Goods

(http://healthgoods.com/Education/Health_Information/Cancer_Rates_and_Risk)

Levine AJ e Momand J (1990). Tumor suppressor genes: the p53 and retinoblastoma

sensitivity genes and gene products. Tumor suppressor genes: the p53 and

retinoblastoma sensitivity genes and gene products. Biochim. Biophys. Acta 1032:119-

136.

Levine AJ, Momand J e Finlay CA (1991). The p53 tumour suppressor gene. Nature

351:453-56.

Levitt M e Chothia C (1976). Structural patterns in globular proteins. Nature 261

(5561): 552-58.

Li H, Leo C, Zhu J, Wu JO, Park EJ e Chen, JD (2000). Sequestration and inhibition of

Daxx-Mediated Transcriptional repression by PML. Mol. Cell. Biol. 20 (5): 1784-96.

Lin JY, Ohshima T e Shimotohno K (2004). Association of Ubc9, an E2 ligase for

SUMO conjugation, with p53 is regulated by phosphorylation of p53. FEBS Lett. 573

(1-3): 15-18.

Lint JV, Rykx A, Vantus T e Vandenheede JR (2002). Molecules in focus getting to

know protein kinase D. The Intern. J. Biochem. & Cell Biol. 34 : 577-81.

Loeffen JL, Triepels RH, van den Heuvel LP, Schuelke M, Buskens CA, Smeets RJ,

Trijbels JM e Smeitink JA (1998). cDNA of eight nuclear encoded subunits of

NADH:ubiquinone oxidoreductase: human complex I cDNA characterization

completed. Biochem Biophys Res Commun 253 (2): 415-22.

MacMahon B (1957). Epidemiological evidence of the nature of Hodgkin's disease.

Câncer 10 (5): 1045-54.

Madrona AY e Wilson DK (2004). The structure of Ski8p, a protein regulating mRNA

degradation: Implications for WD protein structure. Protein Sci. 13 (6):1557-65.

Maggio E.M., Stekelenburg E., Van den Berg A., Poppema S. (2001). TP53 gene

mutations in Hodgkin lymphoma are infrequent and not associated with absence of

Epstein-Barr virus. Int J Cancer 94(1): 60-66.

112

Matera, AG. (1999). Nuclear bodies: Multifaceted subdomains of the interchromatin

space. Trends in Cell Biology 9: 302-09.

Maul GG, Negorev D, Bell P e Ishov AM (2000). Review: properties and assembly

mechanisms of ND10, PML bodies, or PODs. J Struct Biol. 129 (2-3): 278-87.

McCahill A, Warwicker J, Bolger GB, Houslay MD e Yarwood, SJ (2002). The RACK1

scaffolf protein: a dynamic cog in cell response mechanisms. Mol. Pharm. 62 (6) 1261-

73.

Muratani M, Gerlich D, Janicki SM, Gebhard M, Eils R e Spector DL (2002). Metabolic-

energy-dependent movement of PML bodies within the mammalian cell nucleus. Nat

Cell Biol. 4 (2): 106-10.

Muta H, Boise LH, Fang L e Podack ER (2000). CD30 signals integrate expression of

cytotoxic effector molecules, lymphocyte trafficking signals, and signals for proliferation

and apoptosis. J Immunol. 165: 5105-11.

Neer EJ e Smith TF (1996). G protein heterodimers: New structures propel new

questions. Cell 84: 175-78.

Nery FC, Passos DO, Garcia VS e Kobarg J. (2004). Ki-1/57 Interacts with RACK1 and

Is a Substrate for the Phosphorylation by Phorbol 12-Myristate 13-Acetate-activated

Protein Kinase C. J Biol Chem. 279(12): 11444-55.

Nery FC, Rui E e Kobarg J. (2005). Ki-1/57 interacts with p53 and interferes negatively

in its transcriptional activation function. (artigo submetido).

Nery FC, Bressan GC,

Alborghetti MR, Kuniyoshi TM, Passos

DO, Ramos CHI,

Guimarães BG., Oyama, SJr e Kobarg J. A spectroscopic analysis of the interaction

between the human regulatory proteins RACK-1 and Ki-1/57. (artigo submetido).

Ng SY, Gunning P, Eddy R, Ponte P, Leavitt J, Shows T e Kedes L (1985). Evolution

of the functional human beta-actin gene and its multi-pseudogene family: conservation

of noncoding regions and chromosomal dispersion of pseudogenes. Mol Cell Biol 5

(10): 2720-32.

Nicod LP e Isler P (1997). Alveolar macrophages in sarcoidosis coexpress high levels

of CD86 (B7.2), CD40, and CD30L. Am J Respir Cell Mol Biol 17: 91-96.

Nishiyama H, Xue JH, Sato T, Fukuyama H, Mizuno N, Houtani T, Sugimoto T e Fujita

J (1998). Diurnal change of the cold-inducible RNA-binding protein (Cirp) expression in

mouse brain. Biochem Biophys Res Commun. 245 (2): 534-38.

Ogas J, Kaufmann S, Henderson J. e Somerville C (1999). PICKLE is a CHD3

chromatin-remodeling factor that regulates the transition from embryonic to vegetative

development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA 96 (24):13839-44.

113

Oren, M. e Rotter, V. (1999). Introduction: p53- the first twenty years. Cell Mol. Life Sci.

55: 9-11.

Ozaki T, Watanabe K, Nakagawa T, Miyazaki K, Takahashi M e Nakagawara A (2003).

Function of p73, not of p53, is inhibited by the physical interaction with RACK1 and its

inhibitory effect is counteracted by pRB. Oncogene 22 (21): 3231-42.

Pinto A, Aldinucci D, Gloghini A, et al. (1996). Human eosinophils express functional

CD30 ligand and stimulate proliferation of a Hodgkin’s disease cell line. Blood 3299-

305.

Poppema S (1989). The nature of the lymphocytes surrounding Reed-Sternberg cells

in nodular lymphocyte predominance and in other types of Hodgkin’s disease. Am J

Pathol 135: 351-57.

Pro, B e Younes, A (2004). New Molecular Targets for Treatment of Lymphoma. Curr.

Oncol. Rep. 6: 360-68.

Reed D.M. (1902). On the pathological changes in Hodgkin’s disease, with special

reference to its relation to turberculosis. Johns Hopkins Hosp. Rep. 10: 133-196.

Rego EM, Wang ZG, Peruzzi D, He LZ, Cordon-Cardo C, Pandolfi PP (2001). Role of

promyelocytic leukemia (PML) protein in tumor suppression. J Exp Med. 193 (4): 521-

29.

Reyes, JC. (2001). PML and COP1 – two proteins with much in common.

TRENDS in Biochem. Sci. 26: 18-20.

Rhode D, Hansen H, Hafner M, Lange H, Mielke V, Hansmann M-L e Lemke H (1992).

Cellular localizations and processing of the two molecular forms of the Hodgkin-

associated Ki-1 (CD30) antigen. Am. J. Path. 40: 473-82.

Ripellino JA, Bailo M, Margolis RU e Margolis RK (1988). Light and electron

microscopic studies on the localization of hyaluronic acid in developing rat cerebellum.

Cell Biol. 106 (3): 845-55.

Rodriguez A, Oliver H, Zou H, Chen P, Wang X e Abrams JM (1999). Dark is a

Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved

death pathway. Nat. Cell Biol. 1 (5): 272-79.

Ron D, Chen C-H, Caldwell J, Jamieson L e Orr E (1994). Cloning of an intracellular

receptor for protein kinase C: a homolog of the b subunit of G protein. Proc. Natl. Acad

Sci. USA 91: 839-43.

Ruthardt M, Orleth A, Tomassoni L, Puccetti E, Riganelli D, Alcalay M, Mannucci R,

Nicoletti I, Grignani F, Fagioli M e Pelicci PG (1998). The acute promyelocytic

leukaemia specific PML and PLZF proteins localize to adjacent and functionally distinct

nuclear bodies. Oncogene 16 (15):1945-53.

114

Saxena K, Gaitatzes C, Walsh MT, Eck M, Neer EJ, Smith TF (1996). Analysis of the

physical properties and molecular modeling of Sec13: A WD repeat protein involved in

vesicular traffic. Biochemistry 35 (48):15215-21.

Schechtman, D. and Rosen, D. M. (2001). Adaptor proteins in protein kinase C-

mediated signal transduction. Oncogene 20: 6339-47.

Schnell R, Borchmann P, Schulz H e Engert A (2002). Current strategies of antibody-

based treatment in Hodgkin's disease. Ann Oncol 13 (1):57-66.

Schwab U, Stein H, Gerdes J, Lemke H, Kirchner H, Schaadt M e Diehl V (1982).

Production of a monoclonal antibody specific for Hodgkin and Sternberg-Reed cells of

Hodgkin's disease and a subset of normal lymphoid cells. Nature 299 (5878): 65-67.

Scott HS, Antonarakis SE, Lalioti MD, Rossier C, Silver PA, Henry MF e Smith TF

(1998). Identification and characterization of two putative human arginine

methyltransferases (HRMT1L1 and HRMT1L2). Genomics 48 (3): 330-40.

Seeler JS e Dejean A (1999). The PML nuclear bodies: actors or extras? Curr Opin

Genet Dev. 9 (3): 362-67.

Seroussi E, Kedra D, Kost-Alimova M, Sandberg-Nordqvist AC, Fransson I, Jacobs JF,

Fu Y, Pan HQ, Roe BA, Imreh S, Dumanski JP. (1999) TOM1 genes map to human

chromosome 22q13.1 and mouse chromosome 8C1 and encode proteins similar to the

endosomal proteins HGS and STAM. Genomics 57 (3): 380-88.

Shanebeck KD, Maliszewski CR, Kennedy MK, et al. (1995). Regulation of murine B

cell growth and differentiation by CD30 ligand. Eur J Immunol. 25: 2147-53.

Simard MJ, Chabot B. (2002). SRp30c is a repressor of 3' splice site utilization. Mol

Cell Biol. 22 (12): 4001-10.

Siomi MC, Siomi H, Sauer WH, Srinivasan S, Nussbaum RL, Dreyfuss G (1995).

FXR1, an autosomal homolog of the fragile X mental retardation gene. EMBO J. 14

(11): 2401-08.

Smith CA, Gruss HJ, Davis T, Anderson D, Farrah T, Baker E, Sutherland GR,

Brannan CI, Copeland NG, Jenkins NA, et al. (1993). CD30 antigen, a marker for

Hodgkin’s lymphoma, is a receptor whose ligand defines an emerging family of

cytokines with homology to TNF. Cell 73: 349-60.

Smith TF, Gaitatzes C, Saxena K e Neer EJ (1999). The WD repeat: a common

architecture for diverse functions. Trends Biochem Sci. 24 (5):181-85.

Smith PR, de Jesus O, Turner D, Hollyoake M, Karstegl CE, Griffin BE, Karran L,

Wang Y, Hayward SD e Farrell PJ (2000). Structure and coding content of CST

(BART) family RNAs of Epstein-Barr virus. J Virol 74 (7): 3082-92.

115

Soussi T., Caron De Fromentel C e May P. (1990). Structural aspects of the p53

protein in relation to gene evolution. Oncogene 5: 945-52.

Sprague ER, Redd MJ, Johnson AD e Wolberger C (2000). Structure of the C-terminal

domain of Tup1, a corepressor of transcription in yeast. EMBO J. 19 (12): 3016-27.

Stein H, Foss HD, Durkop H, Marafioti T, Delsol G, Pulford K, Pileri S, Falini B (2000).

CD30(+) anaplastic large cell lymphoma: a review of its histopathologic, genetic, and

clinical features.

Blood 96 (12): 3681-95.

Sturzenhofecker B., Schlott T., Quentin T., Kube D., Jung W., Trumper L. (2003).

Abundant expression of spliced HDM2 in Hodgkin lymphoma cells does not interfere

with p14 (ARF) and p53 binding. Leuk Lymphoma 44(9): 1587-96.

Su CC, Chiu

HH, Chang

CC, Chen

JC e Hsu

SM (2004). Cancer Research 64 (6):

2148-52.

Takagaki Y e Manley JL (1992). Human polyadenylation factor is a G protein beta-

subunit homologue. J Biol Chem. 267 (33): 23471-74.

ter Haar E, Musacchio A, Harrison SC e Kirchhausen T (1998). Atomic structure of

clathrin: a beta propeller terminal domain joins an alpha zigzag linker. Cell 95 (4): 563-

73.

Toledo JS (2004). Hodgkin’s disease. Orphanet Encyclopedia

(http://www.orpha.net/data/patho/GB/uk-hodgk.pdf), p. 1-4.

Tong JK, Hassig CA, Schnitzler GR, Kingston RE, Schreiber SL (1998). Chromatin

deacetylation by an ATP-dependent nucleosome remodelling complex. Nature 395

(6705): 917-21.

Usacheva A, Smith R, Minsshall R, Baida G, Seng S, Crozer E e Colamonici O.

(2001). The WD motif-containing protein receptor for activated protein kinase C

(RACK1) is required for recruitment and activation of signal transducer and activator of

transcription 1 through the type 1 Interferon receptor. The J. Biol. Chem. 276 (22):

22948-53.

Utsugi M, Dobashi K, Ishizuka T, Masubuchi K, Shimizu Y, Nakazawa T e Mori M.

(2003). C-Jun-NH2-terminal kinase mediates expression of connective tissue growth

factor induced by transforming growth factor-beta1 in human lung fibroblasts. Am J

Respir Cell Mol Biol. 28 (6): 754-61.

Voegtli WC, Madrona AY e Wilson DK (2003). The structure of Aip1p, a WD repeat

protein that regulates Cofilin-mediated actin depolymerization. J Biol Chem. 278 (36):

34373-79.

Vogelstein B e Kinzler KW (2004). Cancer genes and the pathways they control. Nat

Med. 10(8): 789-99.

116

Vogelstein B, Lane D, Levine AJ (2000). Surfing the p53 network. Nature 408 (6810):

307-10.

Wall MA, Coleman DE, Lee E, Iniguez-Lluhi JA, Posner BA, Gilman AG e Sprang SR

(1995). The structure of the G protein heterotrimer Gi alpha 1 beta 1 gamma 2. Cell 83

(6): 1047-58.

Wan L, Dockendorff TC, Jongens TA e Dreyfuss G (2000). Characterization of dFMR1,

a Drosophila melanogaster Homolog of the Fragile X Mental Retardation Protein

Molec. and Cell. Biol. 20 (22): 8536-47.

Wang G, Hansen H, Tatsis E, Csernok E, Lemke H, Gross WL (1997). High plasma

levels of the soluble form of CD30 activation molecule reflect disease activity in

patients with Wegener's granulomatosis. Am J Med.102 (6): 517-23.

Watanabe TK, Fujiwara T, Kawai A, Shimizu F, Takami S, Hirano H, Okuno S, Ozaki

K, Takeda S, Shimada Y, Nagata M, Takaichi A, Takahashi E, Nakamura Y e Shin S.

(1996). Cloning, expression, and mapping of UBE2I, a novel gene encoding a human

homologue of yeast ubiquitin-conjugating enzymes which are critical for regulating the

cell cycle. Cytogenet Cell Genet.72 (1): 86-89.

Weinstein J (1997). Cell cycle-regulated expression, phosphorylation, and degradation

of p55Cdc. A mammalian homolog of CDC20/Fizzy/slp1. J Biol Chem. 272(45):28501-

11.

Wiley SR, Goodwin RG e Smith CA (1996). Reverse signaling via CD30 ligand. J

Immunol. 157: 3635-39.

Wilson DK, Cerna D e Chew E (2005). The 1.1 A

structure of the spindle checkpoint

protein Bub3p reveals functional regions. J Biol Chem. (paper in press).

Wong WT, Carlomagno F, Druck T, Barletta C, Croce CM, Huebner K, Kraus MH e Di

Fiore PP (1994). Evolutionary conservation of the EPS8 gene and its mapping to

human chromosome 12q23-q24. Oncogene 9 (10): 3057-61.

Woodage T, Basrai MA, Baxevanis AD, Hieter P, Collins FS (1997). Characterization

of the CHD family of proteins. Proc Natl Acad Sci. U S A. 94 (21): 11472-77

Woody RW (1995). Circular Dichroism. Methods Enzymol. 246: 34-71.

Yaholom, J e Straus, D (2004). Hodgkin’s disease in Cancer Management: a

multidisciplinary approach, 8th Edition, chapter 32 p. 651-72.

Younes A e Kadin ME (2003). Emerging Applications of the tumor necrosis factor

family of ligands and receptors in cancer therapy. J. Clinical Oncology 21 (18): 3526-

34.

117

Yu, L.; Gaitatzes, C.; Neer, E. and Smith, T. F. (2000) Thirty-plus functional families

from a single motif. Protein Science 9: 2470-76.

Zhong S, Hu P, Ye TZ, Stan R, Ellis NA, Pandolfi PP (1999). A role for PML and the

nuclear body in genomic stability. Oncogene 18 (56): 7941-47.

***************************************************************************************************

Lista de endereços eletrônicos na rede mundial de computadores (Internet):

***************************************************************************************************

ABRALE: www.abrale.org.br

BLAST: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST /

CDNN Deconvolution (versão 2): Bioinformatik.biochemtech.uni-halle.dee/cdnn

ClustalW: www.clustaw.genome.ad.jp/

Motif Scan:

http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan

NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov

PDB: www.pdbbeta.rcsb.org/pdb/Welcome.do

NetPhos 2.0 Server: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/

PredictProtein: www.cubic.bioc.Columbia.edu/predictprotein/

ProtParam Tool: www.ca.expasy.org/toos/protparam.html

PSORT II prediction: (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)

Swiss-Model: www.expasy.ch/swiss-mod/SWISS-MODEL.html

http://www.escolavesper.com.br/defesasdocorpo.html

http://www.healthcentral.com/mhc/img/img1225.cfm

http://researchpath.hitchcock.org/levylecture/selfasspln.html

http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN_pars

118

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