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MARCOS ANTONIO RODRIGUES MARTINEZ
Estudo das alterações dos microssatélites D6S251 e
D6S252 no carcinoma basocelular esporádico
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de concentração: Dermatologia
Orientador: Prof. Dr. Cyro Festa Neto
São Paulo
2006
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DEDICATÓRIA
____________________________________________________________________
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À minha esposa Kátia Rocha Martinez, pelo carinho, amizade e apoio
nos momentos difíceis, além da paciência e compreensão
ao longo desses anos de cumplicidade e amor.
Aos meus queridos irmãos José Roberto e Lílian Cristina que com carinho,
amizade e incentivo, contribuíram muito para meu desenvolvimento pessoal
Aos meus queridos pais Vicente e Leonora (in memoriam)
pelos ensinamentos, princípios e pela minha existência.
AGRADECIMENTOS
__________________________________________________________
Ao Prof. Dr. Cyro Festa Neto, orientador deste trabalho, pela paciência, confiança,
amizade, entusiasmo e ensinamentos científicos essenciais para que pudesse realizá-lo.
À Profa. Dra. Itamar Romano Ruiz, do laboratório de genética do Instituto
Butantan, por sua dedicação, respeito, ensinamentos e por acreditar em mim e no
meu trabalho.
Aos Profs. Drs. Evandro Rivitti e Luiz Carlos Cucé, pela cordialidade e
oportunidade de ingresso na pós-graduação da FMUSP.
Aos Profs. Drs. José A. Sanches Jr., Valéria Aoki e Marcus Maia, pela argüição
no exame de qualificação, proporcionando-me mais ensinamentos e subsídios para o
término desta dissertação.
À Profa. Dra. Mirian Nacagami Sotto, pelo suporte financeiro e
avaliação histológica dos espécimes estudados.
Ao Prof. Dr. Luiz Henrique Camargo Paschoal, pelos ensinamentos durante a
residência médica e apoio durante a pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Eugênio Pimentel, pelo auxílio na seleção de casos e disponibilização
do centro cirúrgico para a realização das cirurgias.
À Sra. Eli Maria de Freitas Ferreira, pelo auxílio nos assuntos burocráticos.
À Dra. Sandra S. Pato, diretora do Ambulatório de especialidades Dr. Domingos
Ítalo Le Vocci, pelo apoio e compreensão durante a realização do meu trabalho.
Aos amigos dermatologistas Paulo Eduardo Trindade Filho, Jefferson Alfredo de
Barros e Daniela Presente Taniguchi pelo incentivo, amizade e coleguismo.
Aos queridos amigos Waldykson Fernando de Souza, Rogério Duque de Almeida,
Milena Abdalla e Fábio M. Monteiro por todos esses anos de amizade e convívio.
Ao Prof. Dr. Carlos D. Machado Filho, pelos ensinamentos cirúrgicos e incentivo.
A todos os médicos assistentes e residentes dos Departamentos de Dermatologia
da FMUSP e da FMABC, pelo auxílio na seleção dos pacientes e pelo convívio diário.
Aos amigos do Laboratório de Genética do Instituto Butantan; Rodrigo, Luciana,
Marcelo, Losanges, Anelise e Juliana pelo auxílio e cordialidade durante este ano
de convívio.
Ao amigo Guilherme Francisco, biólogo e pós-graduando da FMUSP pelos
ensinamentos e ajuda na realização dos PCRs e géis de poliacrilamida, além é claro,
do excelente gosto musical.
A todos os pacientes que a mim confiaram a condução de seus tratamentos além de
terem me ensinado a viver com esperança, simplicidade e otimismo.
"Alteri ne facias quod tibi fieri non vis"
“Não faça a outrem o que não desejarias que fosse feito a ti”
Esta dissertação está de acordo com:
Referências: adaptado de International Commitee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F.
Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. São
Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2004.
Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in
Index Medicus.
SUMÁRIO
____________________________________________________________________
página
Lista de abreviaturas, símbolos e siglas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 01
2. OBJETIVOS ............................................................................................. 07
3. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................. 09
3.1 Conceitos Básicos em Genética Molecular ...................................... 10
3.1.1 Microssatélites ....................................................................... 13
3.1.2 Instabilidade de microssatélites (MSI) ................................... 18
3.1.3 Implicações clínicas da MSI ................................................... 19
3.1.4 Perda de heterozigosidade (LOH) .......................................... 22
3.2 Genética molecular aplicada ao CBC .............................................. 24
4. MÉTODOS ............................................................................................... 33
4.1 Casuística ......................................................................................... 34
4.2 Métodos ............................................................................................ 39
4.2.1 Obtenção das amostras e extração do DNA ........................... 39
4.1.2 Avaliação de LOH e MSI nos microssatélites ....................... 41
5. RESULTADOS ......................................................................................... 45
5.1 Microssatélite D6S251 ..................................................................... 46
5.2 Microssatélite D6S252 ..................................................................... 49
6. DISCUSSÃO ............................................................................................ 50
7. CONCLUSÕES ........................................................................................ 58
8. ANEXOS .................................................................................................. 60
9. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 69
LISTAS
____________________________________________________________________
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
CBC carcinoma basocelular
CCNM câncer cutâneo não-melanoma
CEC carcinoma espinocelular
D direita
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTP desoxirribonucleotídeo trifosfato
Dr. doutor
E esquerda
EDTA ácido tetracético etilenodiamina
Et al. e outros
FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
GDP difosfato de guanosina
GST gene supressor de tumor
GTP trifosfato de guanosina
HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo
HNPCC câncer colo-retal hereditário sem polipose
Kb kilobases
LOH perda de heterozigosidade
mL mililitros
µL microlitros
mM milimolar
MM melanoma maligno
MMR sistema de reparo de DNA
MSI instabilidade de microssatélites
PB pares de bases
PCR reação da polimerase em cadeia
Prof. professor
PTCH gene Patched
PTCH 1 gene Patched 1
PTCH 2 gene Patched 2
RER erro de replicação
Rpm rotações por minuto
SNBC síndrome do nevo basocelular
UNESP Universidade Estadual Paulista
UV ultravioleta
UVB raios ultravioleta tipo B
USP Universidade de São Paulo
V volt
LISTA DE FIGURAS
página
Figura 1 -
Organização do material genético da célula eucariótica ..........
11
Figura 2 -
Estrutura e função dos genes ....................................................
13
Figura 3 -
Representação esquemática de um microssatélite a partir de
um cromossomo ........................................................................
15
Figura 4 -
Organização do Genoma Humano e as seqüências repetitivas .
16
Figura 5 -
Representação da localização dos microssatélites D6S251 e
D6S252 no braço longo do cromossomo seis (6q14-16) ..........
17
Figura 6 -
Modelo mostrando as mutações genéticas que ocorrem na
progressão de adenoma para carcinoma colo-retal ..................
19
Figura 7 -
Modelo para elucidação molecular da LOH .............................
23
Figura 8 -
Representação das funções dos proto-oncogenes e oncogenes
no ciclo celular .........................................................................
26
Figura 9 -
Representação das funções dos genes supressores de tumor no
ciclo celular ..............................................................................
27
Figura 10 -
Dano ao DNA produzido pela radiação ultravioleta (UV)
contida na luz solar ..................................................................
28
Figura 11 -
Representação esquemática da MSI e LOH que podem
ocorrer nos loci 6q14-16 onde estão localizados os
microssatélites D6S251 e D6S252 ...........................................
31
Figura 12 -
Organograma demonstrando a casuística final estudada de 26
CBCs para o microssatélite D6S251 e 15 CBCs para o
D6S252 .....................................................................................
35
Figura 13 -
Resolução das amostras 6 e 12 em gel de poliacrilamida onde
a MSI é representada pela seta (←) nas amostras tumorais (6t
e 12t) em comparação com os controles 6n (pele normal) e
12s (sangue/leucócitos) para o microssatélite D6S251. À
esquerda observa-se o marcador de peso molecular (100 a
200 pb ladder) ..........................................................................
46
Figura 14 -
Resolução das amostras 9, 10, 18 e 24 em gel de
poliacrilamida com LOH representada pelo asterisco (*) nas
amostras tumorais (9t, 10t, 18t e 24t) em comparação com a
pele normal (n) para o microssatélite D6S251 .........................
47
Figura 15 -
Padrões normais do microssatélite D6S251 após resolução em
poliacrilamida. Nesta figura, vemos o marcador de peso
molecular (100 – 200 pb ladder) e as amostras 2 e 26
representadas pela pele normal (n) e tumor (t) exibindo
padrões semelhantes de bandas ................................................
48
Figura 16 -
LOH e MSI nas amostras de CBC de alto e baixo risco para o
microssatélite D6S251 .............................................................
48
Figura 17 -
Padrões normais do microssatélite D6S252 após resolução em
poliacrilamida. Nesta figura, podemos ver tecido normal
sendo pele (n) e/ou sangue(s) e tumores (t) mostrando
padrões semelhantes de bandas. Vemos aqui representadas as
amostras 5, 6 e 20, além do marcador de peso molecular (M) .
49
LISTA DE TABELAS
página
Tabela 1 -
Relação entre proto-oncogene, tipo de alteração e tipo de
câncer ........................................................................................
25
Tabela 2 -
Algumas alterações na estrutura genômica do CBC e em
outros tumores cutâneos ...........................................................
30
Tabela 3 -
Amostras de CBC estudadas e excluídas, localização do
tumor e classificação histopatológica de risco para o
microssatélite D6S251 ..............................................................
37
Tabela 4 -
Amostras de CBC estudadas e excluídas, localização do
tumor e classificação histopatológica de risco para o
microssatélite D6S252 ..............................................................
38
Tabela 5 -
Lista dos primers utilizados na obtenção dos padrões de
microssatélites D6S251 e D6S252 ...........................................
42
Tabela 6 -
CBCs incluídos no estudo e que apresentaram alterações do
microssatélite D6S251 ..............................................................
47
RESUMO
____________________________________________________________________
Martinez MAR. Estudo das alterações dos microssatélites D6S251 e D6S252 no
carcinoma basocelular esporádico [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade
de Medicina, Universidade de São Paulo; 2006. 78p.
O carcinoma basocelular (CBC) é a neoplasia maligna mais comum em humanos. As
alterações genéticas que ocorrem no desenvolvimento do CBC são apenas
parcialmente compreendidas. Há muito interesse na determinação das bases
genéticas do CBC que expliquem o fenótipo localmente invasivo e o comportamento
metastático infreqüente desse tumor cutâneo. Nós investigamos a presença de
Instabilidade de microssatélites (MSI) e Perda de heterozigosidade (LOH) nos
microssatélites D6S251 e D6S252 (6q14-16) de CBCs esporádicos de alto e baixo
risco, evidenciados através de visualização da mobilidade e intensidade de bandas
obtidas pela eletroforese em gel de poliacrilamida após PCR específico em
comparação com o controle normal (pele/sangue) obtidos do mesmo paciente.
Encontramos para o microssatélite D6S251, alterações em 6 das 26 amostras de CBC
estudadas (23,07 % do total). MSI foi observada em 2 amostras de alto risco, que
corresponde a 7,69 % de todas as amostras e 15,38 % das de alto risco). LOH foi
observada em 4 amostras, que corresponde a 15,38 % do total e 30,76 % das de alto
risco). Tanto MSI como LOH ocorreram apenas em amostras de CBC de alto risco
(46,15 % das amostras de alto risco), que sugere o provável envolvimento da região
6q14 na diferenciação do CBC. Não observamos qualquer alteração do microssatélite
D6S252 nas 15 amostras estudadas em comparação com o controle. Futuros estudos
devem ser realizados com a finalidade de identificar genes relacionados ao CBC e
sua diferenciação, focando na região 6q14 onde o microssatélite D6S251 está
localizado.
Descritores: carcinoma basocelular/ genética, instabilidade cromossômica, perda
de heterozigosidade, repetições de microssatélites, neoplasias cutâneas
SUMMARY
____________________________________________________________________
Martinez, MAR. Study of alterations in microsatellites D6S251 and D6S252 in
sporadic basal cell carcinoma [Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo”; 2006. 78p.
Basal cell carcinoma (BCC) is the most common human neoplasm. The genetic
alterations underlying BCC development are only partly understood. Much interest
lies in determining the genetic basis of BCC to explain the unique locally invasive
phenotype and infrequent metastatic behavior of these skin tumors. We have
analyzed microsatellites D6S251 and D6S252 (6q14-16) patterns of sporadic BCC
tumor samples using PCR-based assay. All tumor samples were divided into high-
and low-risk histological subtypes and compared to controls as normal skin and/or
leucocytes. We have encountered D6S251 alterations in 6 of 26 BCC samples
(23.07%). Microsatellite instability (MSI) was found in 2 high-risk tumor samples,
corresponding to 7.69 % of all sporadic BCC samples and 15.38 % high-risk
samples. Loss of heterozigosity (LOH) was observed in 4 BCC samples, representing
15.38 % of all BCC samples studied and 30.76% of high-risk samples. Both LOH
and MSI occurred in high-risk BCC samples (46.15% of high-risk BCC samples),
suggesting the 6q14 region could be involved in BCC differentiation. We have not
found any alteration in D6S252 microsatellite in 15 samples studied in comparison
with normal control tissues. Further studies will be carried out in the aim of
identification of related genes involved with BCC and its differentiation, particularly
focusing on the 6q14 region where microsatellite D6S251 is located.
Descriptors: basal cell carcinoma / genetics, chromosomal instability, loss of
heterozygosity, microsatellites repeats, skin neoplasms
1 INTRODUÇÃO
__________________________________________________________
INTRODUÇÃO
2
O câncer cutâneo não-melanoma (CCNM) continua sendo o mais incidente
em nosso País em ambos os sexos. Embora de baixa letalidade e apresentando altas
taxas de cura clínica, pode provocar morbidade considerável, onerando os serviços
de saúde. Por tratar-se de neoplasias malignas de bom prognóstico, é provável que
exista sub-registro devido à característica indolente e instituição de tratamento
adequado e oportuno. Por esta razão, as estimativas das taxas de incidência e dos
números esperados de casos novos de CCNM devem ser consideradas como
estimativas mínimas
1
. No Brasil estima-se uma incidência aproximada de 142 mil
novos casos de CCNM em 2005
1
.
O carcinoma basocelular (CBC) é a neoplasia maligna cutânea mais
freqüente, representando aproximadamente 75% dos CCNM no mundo ocidental
2
.
Nos Estados Unidos o CBC é o tipo de câncer mais diagnosticado, com quase um
milhão de casos estimados por ano
3
.
Os fatores de risco que contribuem para o desenvolvimento do CBC são bem
conhecidos e incluem raça, idade, gênero, exposição à radiação ultravioleta (UV) e
capacidade individual de reparação do ácido desoxirribonucléico (DNA)
4
. A
exposição excessiva ao ultravioleta B (UVB) tem sido associada ao aumento do risco
para o desenvolvimento dos cânceres cutâneos incluindo o CBC, pois pode produzir
dano ao DNA, especialmente nas pirimidinas
2
.
O papel da radiação UV no desenvolvimento dos CCNM e em especial no
CBC é crucial. Primeiro, a radiação UV causa mutações no DNA celular e a falha no
INTRODUÇÃO
3
reparo dessas alterações genéticas pode levar a um crescimento celular desordenado
e formação de tumor, sendo sua ação importante no processo de carcinogênese de
neoplasias malignas cutâneas
5
. Segundo, a radiação UV tem um grande efeito sobre
o sistema imune cutâneo, induzindo a um estado de imunossupressão local que
impede a rejeição do tumor neoformado
6
.
A transformação maligna de uma célula da camada basal da epiderme ou dos
anexos dá origem ao CBC, tumor que apresenta como principais características a
indolência e o crescimento lento, sendo localmente destrutivo e que raramente
produz metástases.
As formas esporádicas (não-herdadas) de CBC representam a maioria
absoluta dos casos diagnosticados, enquanto que as herdadas são mais raras e fazem
parte principalmente da síndrome do nevo basocelular (SNBC), com diversos
sintomas clínicos que incluem a presença de múltiplos CBCs em pacientes jovens.
O CBC possui diferenças de comportamento biológico que podem ser
explicadas pela presença de fatores intrínsecos ao próprio tumor, como o padrão de
crescimento tumoral, o potencial de recorrência e metástase, o padrão histológico e
os fatores genéticos
7
. Fatores extrínsecos, como sítio de origem, terapêutica
escolhida e estado imunológico do portador da neoplasia também podem influenciar
no comportamento biológico do CBC.
Do ponto de vista histológico, são observados padrões de crescimento
variáveis que conferem ao CBC diferenças no seu comportamento biológico.
Atualmente para o CBC, duas classificações histológicas vêm sendo sugeridas e
aceitas. Uma baseia-se no padrão de crescimento e outra na diferenciação
histológica. A classificação baseada nos padrões de crescimento tem maior
INTRODUÇÃO
4
significância biológica, e é adotada pelo Colégio Real de Patologistas do Reino
Unido. Esta classificação considera a existência dos tipos nodular, superficial,
infiltrativo, morfeiforme ou esclerodermiforme, micronodular e de padrão misto
8
.
A classificação pelo padrão de crescimento é útil no desenvolvimento do
conceito de alto e baixo risco dos subtipos histológicos de CBC. Os CBCs de alto
risco são caracterizados pela probabilidade aumentada de extensão subclínica,
excisão incompleta, comportamento agressivo de invasão local e/ou recorrência
local. Os CBCs de alto risco incluem o superficial, infiltrativo ou morfeiforme e o
micronodular
8
.
Câncer é uma doença essencialmente genética caracterizada por instabilidade
genômica e proliferação celular incontrolada. A maior parte dos cânceres,
especialmente os tumores sólidos, se desenvolvem após o acúmulo de múltiplas
lesões gênicas. A maioria dos tumores resulta de mutações causadas por alterações
na replicação do DNA, carcinógenos, ou defeitos no aparato de reparação do DNA.
Durante o processo de transformação tumoral e malignização, dá-se uma
instabilidade geral do genoma que pode resultar de mutação em genes de reparo e
outros genes
9,10
. Essa instabilidade pode ser visualizada pelas alterações nos padrões
de microssatélites.
A instabilidade genômica que ocorre em células neoplásicas tem sido alvo de
inúmeros trabalhos e sua ocorrência vem sendo demonstrada em muitas doenças de
origem genética.
Alterações no DNA repetitivo têm sido úteis em avaliações prognósticas,
como marcadores no estadiamento de tumores, e na pesquisa oncológica básica,
INTRODUÇÃO
5
fornecendo novos elementos para a compreensão do funcionamento do genoma
como um todo.
Dentre as alterações que os microssatélites podem sofrer, destacam-se dois
principais tipos: a instabilidade de microssatélites (MSI) e a perda de
heterozigosidade (LOH).
No CBC, MSI e/ou LOH foram observadas em especial no cromossomo 9. A
região 9q (9q21, 9q22
11,12
, 9q22-qter e 9p21
13
) onde estão localizados os
microssatélites D9S15, D9S50, D9S52, D9S53, D9S197, D9S287 e D9S303
demonstraram MSI e LOH com taxas variando de 20 a 75 %, o mesmo ocorrendo na
região 9p (D9S165)
14,15
.
Em um estudo realizado com CBCs esporádicos foi observada LOH em mais
de 20% nos microssatélites D4S414, D4S426 (4q32-35) e de 15 a 20 % nos
microssatélites D1S249(1q32), D3S1597(3p24), D10S541(10q22.1) e
D17S791(17q21.3)
15
.
Em trabalho prévio realizado por nosso grupo, estudamos a instabilidade
genômica num grupo de 10 CBCs (um herdado e nove esporádicos) e encontramos
60 % de MSI e 20 % de LOH para o microssatélite D6S251 e 10 % de MSI para o
microssatélite D6S252
16
, até então nunca descritos. Esse achado nos levou a
continuar estudando a região, ampliando o número de amostras. Escolhemos apenas
CBCs esporádicos (não-herdados) pois respondem por quase todos os casos de CBCs
encontrados na prática clínica, enfatizando a diferenciação histológica pois até o
presente momento não há relatos na literatura que correlacione a instabilidade
genômica (LOH e MSI) dos microssatélites D6S251 e D6S252 com os aspectos
histológicos dos CBCs.
INTRODUÇÃO
6
O presente estudo visa proporcionar uma melhor compreensão do real papel
dos microssatélites D6S251 e D6S252 na gênese e diferenciação histológica do CBC,
a neoplasia maligna mais freqüente na espécie humana.
2 OBJETIVOS
__________________________________________________________
OBJETIVOS
8
Este estudo tem por objetivo avaliar a instabilidade genômica (MSI e LOH)
dos microssatélites D6S251 e D6S252 localizados no cromossomo seis (6q14-16.2)
nos tumores de pacientes portadores de CBC esporádico através da reação em cadeia
da polimerase (PCR). As alterações encontradas serão correlacionadas à severidade e
agressividade, sugeridas pela análise dos tipos histológicos presentes nos espécimes
obtidos e incluídos neste estudo.
3 REVISÃO DA LITERATURA
__________________________________________________________
REVISÃO DA LITERATURA
10
3.1 Conceitos Básicos em Genética Molecular
Antes de conceituar o que são microssatélites e qual o seu emprego na
medicina de uma maneira geral, é importante rever alguns conceitos básicos em
genética médica, bem como resumir o histórico desse setor das ciências biológicas.
A palavra genética deriva da raiz grega gen, que significa “vir a ser”. Foi
empregada pela primeira vez em 1906, por Bateson, para designar o estudo da
hereditariedade e da variação dos seres vivos
17
.
A genética tem raízes milenares, sendo muito antigo o conhecimento da
transmissão hereditária de algumas doenças. Hipócrates, entre 460 e 377 a.C., já
fazia menção a doenças hereditárias ou familiais
18
. Apesar destas raízes milenares, a
Genética desenvolveu-se a partir de meados do século XIX e início do XX,
resultando da integração de áreas da ciência como citologia, estatística, bioquímica e
biologia molecular, permitindo novos horizontes na compreensão dos fenômenos da
hereditariedade.
O pioneiro padre agostiniano Gregor Mendel iniciou seus experimentos
genéticos em 1865, entretanto seus estudos foram retomados somente a partir de
1880, quando o mundo científico começou a entender o processo de divisão das
células somáticas e germinativas
18
, devido aos trabalhos de Flemming, Strausburger,
Waldeyer, van Beneden e Boveri
17
.
REVISÃO DA LITERATURA
11
Assim, o conhecimento sobre o comportamento das células foi cada vez mais
relacionado ao seu núcleo que contém grande parte do material genético celular. A
região granular é identificada como cromatina e durante a divisão celular, a
cromatina forma massas densas denominadas cromossomos
18
.
Os cromossomos podem ser vistos como um arranjo de ácidos nucléicos e
proteínas (histonas). As histonas são solúveis em água e se associam aos
cromossomos humanos de maneira a formar os nucleossomos que garantem a
estabilidade estrutural dos cromossomos
18
(Figura 1).
Figura 1 – Organização do material genético da célula eucariótica.
REVISÃO DA LITERATURA
12
Em humanos normais, o material genético é distribuído em 46 cromossomos,
sendo 23 herdados do pai e 23 da mãe. Portanto, os seres humanos são diplóides,
pois possuem duas cópias de cada informação genética
18
.
O ácido nucléico que constitui o cromossomo é denominado DNA. O DNA é
organizado em segmentos lineares de bases nucleotídicas e seu tamanho é
comumente referido em relação aos números de bases, ou kilobases (kb). Quando
essa seqüência linear de bases representa o código da informação necessária para a
produção de uma determinada proteína é denominado gene. Portanto, o conjunto de
todos os ácidos nucléicos é denominado genoma
18
.
Estima-se que o genoma humano possui entre 80 e 150 mil genes, o que
corresponde a aproximadamente 10% do genoma. Os demais 90% do genoma são
compostos de seqüências repetitivas de DNA que alguns autores relatam como
“DNA lixo”, “lixo genético” ou “junk DNA”.
Outro aspecto importante na organização dos ácidos nucléicos que constituem
um gene de um organismo eucarionte é o fato de que parte considerável da
informação contida num gene não é diretamente relacionada ao seu produto, a
proteína. Uma grande parte dos genes contém seqüências não codificantes, ou seja, o
código não faz parte da proteína final. Tais regiões recebem o nome de íntrons,
enquanto as regiões codificantes do gene recebem o nome de éxons. A função dos
íntrons nos genes ainda não é completamente esclarecida, apesar das várias hipóteses
postuladas. Além destas, um gene ainda apresenta regiões regulatórias, responsáveis
pelo controle da sua expressão
18
. (Figura 2)
REVISÃO DA LITERATURA
13
Figura 2 – Estrutura e função dos genes
3.1.1 Microssatélites
Várias categorias diferentes de DNA repetitivo são reconhecidas. É útil
identificar se as seqüências repetitivas ou repetições estão agrupadas em um ou
alguns poucos locais ou se estão dispersas pelo genoma, intercaladas com seqüências
de cópia única ao longo do cromossomo. As seqüências repetitivas agrupadas
constituem de 10 a 15% do genoma e consistem em arranjos de várias repetições
curtas organizadas em tandem. Os diferentes tipos de tais repetições em tandem são
coletivamente chamados de DNA satélite, assim denominados porque muitas das
famílias de repetições originais em tandem podiam ser purificadas por densidade de
centrifugação do resto do genoma como frações “satélite” do DNA
19
.
REVISÃO DA LITERATURA
14
Assim as repetições tandem estão organizadas no sentido 3´ de uma
seqüência seguida da extremidade 5´ de uma outra seqüência ficando, portanto
alinhadas na mesma direção. Os DNAs satélites estão situados principalmente na
região do centrômero e contêm milhares de repetições
20
.
De acordo com a extensão da seqüência repetitiva, as repetições tandem
podem ser classificadas em: satélites, minissatélites e microssatélites
21
.
• Satélites: são as repetições mais extensas.
• Minissatélites: são compostos por repetições de 9 a 80 pares de bases
nucleotídicas (pb).
• Microssatélites: são curtas seqüências repetidas de um a seis nucleotídeos que
freqüentemente mostram polimorfismo multialélico e têm sido extensivamente
usados como marcadores genéticos. (Figura 3)
Os microssatélites podem ser compostos por um mononucleotídeo
(AAAAAAAAAAAAA), dinucleotídeos (GTGTGTGTGTGTGTGTGT),
trinucleotídeos (CAGCAGCAGCAGCAGCAG) e assim por diante, sendo a forma
(CA)n a mais comum existente
22,23
. Na figura 3 podemos observar a representação de
uma curta seqüência repetitiva trinucleotídea (TTA)
8 a partir de um cromossomo.
REVISÃO DA LITERATURA
15
Figura 3 – Representação esquemática de um microssatélite a partir de um cromossomo.
Embora os microssatélites já tenham sido considerados como junk DNA,
estas seqüências têm função no genoma, principalmente na regulação da expressão
gênica. Existem numerosos exemplos de microssatélites e minissatélites afetando a
expressão gênica de diversas maneiras, atuando como seqüências que podem ser
reconhecidas por fatores de transcrição ou também afetando a estrutura da cromatina
e a conformação do DNA
22
. Na figura a seguir temos a representação da organização
do genoma humano e das seqüências repetitivas em tandem. (Figura 4)
REVISÃO DA LITERATURA
16
Genoma
Humano
Genoma Mitocondrial
16.6Kb
37 genes
Genoma Nuclear
3300 Mb
80.000 genes
Dois Genes
rRNA
22 Genes tRNA
DNA
extragênico
Genes e
seqüências gene-
relacionadas
13 genes
codificadores
de
polipeptídeos
DNA
codificante
DNA único ou
com número
baixo de cópias
DNA
Moderado a
altamente
repetitivo
DNA
não-codificante
Repetições
em tandem
Pseudogenes Fragmentos
de Genes
Íntrons,
seqüências não
traduzidas, etc.
Or
g
anização do
Genoma
Figura 4 – Organização do Genoma Humano e as seqüências repetitivas.
Os microssatélites D6S251 e D6S252 estão localizados no braço longo do
cromossomo seis (loci 6q14-16.2)
. Ambos são compostos por seqüências repetitivas
(GT)n e possuem tamanhos variando de 144-162 pb e de 154-166 pb,
respectivamente. A figura a seguir mostra a localização dos microssatélites D6S251 e
D6S252. (Figura 5)
REVISÃO DA LITERATURA
17
Figura 5 - Representação da localização dos microssatélites D6S251 e D6S252 no
braço longo do cromossomo seis (6q14-16).
REVISÃO DA LITERATURA
18
3.1.2 Instabilidade de Microssatélites (MSI)
A natureza polimórfica dos microssatélites deve-se às altas taxas de
mutações, da ordem de 5-10 por locus por gameta. Entretanto, os microssatélites
podem originar variantes, aumentando ou diminuindo o número de repetições, isto é,
instabilidade de microssatélites (MSI). O DNA extraído de células de determinados
tumores pode apresentar alterações no número de unidades repetidas em um ou mais
microssatélites quando comparados aos mesmos microssatélites existentes em
amostras de DNA de um tecido normal do mesmo indivíduo, como aquele obtido nas
células sangüíneas
24
. Resumidamente, células tumorais podem apresentar
“impressões digitais” defeituosas em seu DNA quando comparadas aos outros
tecidos normais do organismo
21
.
A instabilidade de microssatélites depende de inúmeros parâmetros,
incluindo: número de repetições; o conteúdo da seqüência, localização cromossômica
e a capacidade de reparo do DNA durante sua replicação
23
.
3.1.3 Implicações Clínicas da MSI
Até o momento, foi apresentado que alterações genéticas acarretam o
desenvolvimento do câncer. Esse fenômeno tem sido extensivamente investigado por
vários autores, principalmente no câncer colo-retal. Esse modelo é considerado ideal
para a compreensão do processo carcinogênico, devido à progressão da pré-
malignidade para malignidade, ou seja, de adenoma para carcinoma. A grande
REVISÃO DA LITERATURA
19
maioria dos cânceres surge de uma inativação mutacional dos genes supressores e da
ativação de oncogenes
25
.
A figura a seguir (Figura 6), adaptada de Fearon e Volgestein, explica a
seqüência de mutações genéticas que ocorre na evolução para o câncer colo-retal. Os
genes mutados mais comumente envolvidos são o APC, K-RAS, DCC e o TP53
26
.
Figura 6 - Modelo mostrando as mutações genéticas que ocorrem na
progressão de adenoma para carcinoma colo-retal.
Em 1993, MSI foi observada tanto no câncer de colo-retal hereditário não-
polipose (HNPCC) quanto no câncer colo-retal esporádico, mostrando uma via
genética alternativa no desenvolvimento desse câncer
27,28
.
A definição de microssatélites bem como a definição de instabilidade de
microssatélites (MSI) já foi dada nos tópicos anteriores, sendo necessário apenas
lembrar que a verificação de instabilidade nessa região nada mais é que uma
verificação indireta de um defeito no sistema de reparo do DNA (MMR). O MMR
REVISÃO DA LITERATURA
20
humano inclui as proteínas codificadas pelos seguintes genes: hMLH1, hMLH3,
hMSH2, hMSH3, hMSH6, hPMS1 e hPMS2 e esse sistema é responsável pela
identificação e excisão de anormalidades que ocorrem durante a replicação do DNA,
anormalidade essa que pode ser representada por danos químicos e físicos ao DNA
25
.
É preciso completar que os microssatélites são regiões com um risco
particular de mutação devido o deslizamento da enzima DNA-polimerase durante a
replicação do DNA. Qualquer “erro de replicação” (RER) pode ocasionar uma
mutação pontual ou ainda, a produção de proteínas inespecíficas para a finalidade de
reparo (proteínas truncadas). É muito comum também afetar os genes que incluem ou
estão diretamente ligados à região de microssatélites como TGFBRII, ILGF, E2F-4 e
BAX
29,30
. Esses genes são raramente mutados nos tumores que não demonstraram
MSI
31
.
Outros trabalhos mostraram que em diversos tumores como, por exemplo, o
câncer colo-retal, há a identificação de vias moleculares com acúmulo paulatino de
mutações em genes fundamentais para a proliferação celular e apoptose. Esses
cânceres ainda podem demonstrar uma extensa variedade no número de
cromossomos, caracterizando dessa forma a aneuploidia e também uma extensiva
perda de material genético, chamada de perda de heterozigosidade (LOH). A grande
maioria das células cancerígenas que apresentam MSI são diplóides e não mostraram
LOH. Isso reforça o conceito que existem duas vias distintas no desenvolvimento do
câncer, uma via “supressora” postulada por Fearon e Vogelstein e outra via
“mutante” representada pela instabilidade de microssatélites
25
.
REVISÃO DA LITERATURA
21
MSI tem sido extremamente descrito em vários cânceres, e possui extrema
relevância clínica já que os tumores que seguem a via “mutante” podem comportar-
se de maneira biológica diferindo daqueles tumores que seguem a via “supressora”
25
.
Percebe-se que a aplicabilidade do estudo de MSI no HNPCC é vasta e
extremamente importante do ponto de vista clínico e esse tipo de estudo, como citado
anteriormente, passou a ser rotina na prática clínica em cânceres colo-retais.
A MSI tem sido verificada em muitos tumores sólidos. Atualmente, a
definição e a interpretação de instabilidade são reportadas na literatura de maneira
variável. Essa verificação está sendo feita principalmente em cânceres gástricos,
endometriais e ovarianos
25
.
Nos tumores gástricos, alguns autores sugerem que há uma predominância de
positividade de MSI no de antro gástrico
32
. Entretanto outros autores verificaram a
presença de MSI em toda extensão gástrica
33
. Já nos tumores ovarianos, a incidência
de MSI varia de 3 a 53% e essa variação é atribuída de acordo com os tipos e os
números de marcadores de microssatélites utilizados
34
.
Nos tumores endometriais, alguns estudos demonstram relação entre a
presença de MSI e grau histológico avançado
35
.
Entretanto, no CCNM e em especial no CBC a informação a respeito de MSI
é ainda controversa. A incidência reportada em alguns estudos varia de 0 a 30%
embora, menos de 10% apresentem altas taxas de MSI
36,37
. Mais adiante
discutiremos mais acerca da instabilidade genômica que ocorre no CCNM, em
especial no CBC.
REVISÃO DA LITERATURA
22
3.1.4 Perda de Heterozigosidade (LOH)
A perda de heterozigosidade (LOH) é definida como a perda de um alelo em
um locus heterozigoto constitucional. Como exemplo, podemos citar o que ocorre
com o gene CDKN2A que codifica a proteína p16, localizado no cromossomo 9p21,
e é considerado um exemplo de inativação por LOH, ocorrendo freqüentemente em
pulmão, pele e outras formas comuns de cânceres humanos
38
.
LOH pode ocorrer de diversas maneiras (Figura 7):
• Através da perda de um alelo ou gene por uma deleção simples,
resultantes de duas quebras na dupla fita ou recombinação mitótica
dupla envolvendo o braço homólogo do cromossomo;
• Pela perda extensa de material genético, envolvendo um inteiro ou
uma porção do braço cromossômico;
• Por recombinação mitótica entre homólogos ou translocação;
• Através da perda de um cromossomo inteiro.
Entretanto, a existência de cópias múltiplas de um cromossomo pode levar a
homozigosidade
38
.
REVISÃO DA LITERATURA
23
Figura 7 - Modelo para elucidação molecular da LOH
(adaptado de Thiagaliingam et al.).
Mutações no gene TP53 podem causar instabilidade genômica e facilitar a
progressão carcinogênica. Carcinomas espinocelulares (CEC) e CBCs mostram
freqüentemente perda de fragmentos cromossômicos e LOH.
Em um estudo realizado no Instituto Butantan, foram utilizados quatro
microssatélites adjacentes ao gene patched 1 (PTCH1) e dois próximos ao gene
patched 2 (PTCH2), ambos envolvidos no desenvolvimento de CBC. Foram
analisados dez pacientes com CBC hereditários (síndrome do nevo basocelular) dos
quais quatro apresentaram LOH no microssatélite D9S180, próximo ao gene
PTCH1
39
.
REVISÃO DA LITERATURA
24
Mutações nos genes supressores de tumor PTCH1, no cromossomo 9q22-3, e
PTCH2, no cromossomo 1p33, têm sido associadas à etiologia dos CBCs
40,41,42
.
Esses genes supressores fazem parte da via de sinalização sonic hedgehog que,
quando induzida pela inativação de PTCH1 e/ou PTCH2, leva à proliferação celular.
3.2 Genética Molecular Aplicada ao CBC
Como vimos, o câncer é uma doença essencialmente genética caracterizada
por instabilidade genômica e proliferação celular incontrolada. A maior parte dos
cânceres, especialmente os tumores sólidos, se desenvolvem após o acúmulo de
múltiplas lesões gênicas, causadas por alterações na replicação do DNA,
carcinógenos, ou defeitos no aparato de reparação do DNA.
Há duas classes principais de genes que podem sofrer mutações e contribuir
para a gênese do câncer: os oncogenes e os genes supressores de tumor (GST)
3
.
Genes que atuam no sentido de estimular a divisão celular podendo levar ao
crescimento descontrolado são chamados de proto-oncogenes. Estes genes são ativos
na fase embrionária, e inativos nas células adultas. Muitos proto-oncogenes são
moléculas sinalizadoras de crescimento que ao se tornarem mutadas ficam
perpetuamente “ligadas”, gerando a amplificação dos sinais de crescimento celular,
suplantando os controles normais impostos pela homeostase celular. Oncogenes são
em geral, geneticamente dominantes, sendo que a mutação de uma cópia de proto-
oncogene é suficiente para produzir o fenótipo.São exemplos de oncogenes o N-
RAS, H-RAS e C-MYC
3,43
.
REVISÃO DA LITERATURA
25
Mutações ativadoras do gene RAS estão entre as mais comuns no câncer
humano. As proteínas ras são pequenas proteínas-G que transduzem sinais
intracelulares. Mutações no RAS freqüentemente alteram a taxa de hidrólise de
trifosfato de guanosina (GTP) em difosfato de guanosina (GDP), levando a uma
proteína ativada que impropriamente promove o crescimento e sobrevivência celular.
Há estudos que sugerem mutações do RAS em até 30% dos CBCs
3
.
A tabela 1 mostra de maneira sucinta a relação entre alguns proto-oncogenes,
tipo de alteração que pode ocorrer e o tipo de malignidade associada:
Tabela 1 - Relação entre proto-oncogene, tipo de alteração e tipo de câncer.
Proto-oncogene
Alteração no
proto-oncogene
Neoplasia Maligna
ABL Translocação Leucemia mielóide crônica
BCL-2 Translocação Linfoma de células B
CYCD-1 Translocação Câncer de mama
MYC Translocação Linfoma de Burkitt
GIP Mutação de ponto Câncer de ovário e de adrenal
K-RAS Mutação de ponto
Leucemias agudas,
câncer de tireóide e melanoma
MYC Amplificação Câncer de pulmão, mama e cervix
L-MYC Amplificação Câncer de pulmão
N-MYC Amplificação Neuroblastoma
REVISÃO DA LITERATURA
26
Na figura 8, está representada a função dos oncogenes no ciclo celular de
uma célula eucariótica.
Figura 8 – Representação das funções dos proto-oncogenes e oncogenes no ciclo celular.
Alguns genes supressores de tumor controlam o crescimento celular por
inibirem o ciclo e a divisão celular, regulando negativamente os sinais de
crescimento ou promovendo a morte celular.
REVISÃO DA LITERATURA
27
Na figura 9, exemplificamos as principais funções e mecanismos de ação dos
genes supressores de tumor.
Figura 9 – Representação das funções dos Genes Supressores de Tumor no ciclo celular.
Nos CBCs esporádicos podemos encontrar mutação no gene supressor TP53.
Este gene TP53 codifica a proteína p53, que tem sido denominada a
“guardiã” do genoma, modulando múltiplas funções celulares entre elas a transcrição
gênica, síntese e reparo de DNA, parada do ciclo celular e apoptose. Assim, a p53
percebe a lesão genotóxica e pára a divisão celular para permitir os reparos no DNA.
Entretanto, se a injúria genética é severa, a p53 pode também induzir uma resposta
apoptótica no esforço de eliminar células defeituosas e potencialmente malignas.
REVISÃO DA LITERATURA
28
Mutações no TP53 foram descritas nos CBCs, com taxas variando até 60 %. Muitas
das mutações são CC → TT ou C → T nos sítios de pirimidina, o que sugere dano
causado pela radiação UV
6
.
No desenvolvimento do CBC esporádico a radiação UV é o carcinógeno mais
importante. Além de interferir nos mecanismos imunológicos da pele, o UV induz a
formação de pontes químicas entre duas pirimidinas adjacentes, particularmente
timinas (dimerização), deslocando a posição dessas bases nitrogenadas na hélice de
DNA, impedindo o pareamento adequado com as bases da fita oposta. Mutações
pontuais induzidas pelo UV em oncogenes ou genes supressores específicos podem
estimular a proliferação celular, podendo levar à gênese do CBC (Figura 10).
Figura 10 - Dano ao DNA produzido pela radiação ultravioleta (UV) contida na luz solar. Duas
bases de timina adjacentes tornam-se covalentemente ligadas, formando um dímero de
timina. Células da pele expostas à luz solar são muito suscetíveis a esse tipo de dano ao
DNA
REVISÃO DA LITERATURA
29
O gene patched (PTCH) é outro exemplo de gene supressor de tumor
inativado tanto no CBC esporádico como no hereditário. O PTCH é o homólogo
humano do gene patched da drosófila e está localizado no lócus 9q22.3 (cromossomo
9). Foi inicialmente isolado por dois grupos independentes durante a pesquisa sobre
o gene responsável pela síndrome do nevo basocelular (SNBC). Mutações nos genes
PTCH1 (9q22-3), e PTCH2 (1p33), têm sido associadas à etiologia dos CBCs
esporádicos e herdados há mais de uma década
40,41,42
. Mutações somáticas no gene
PTCH têm sido identificadas em 20 a 30% dos CBCs esporádicos estudados.
Mutações detectadas no gene PTCH nos CBCs esporádicos também contêm
alterações nucleotídicas UV-específicas como as C→T e CC→TT. Dentre as
mutações detectadas estão: mutações nonsense, deleções e inserções, as quais levam
à produção alterada de proteínas patched
2
. Tem sido proposto que o gene PTCH
funciona como um gene “guardião”, isto é, uma célula precursora de neoplasia
adquire uma vantagem de sobrevivência com a inativação deste gene, e essa
inativação seria necessária antes da expansão clonal e posterior acúmulo de outras
lesões genéticas que levam à formação do CBC
44
.
Podemos observar representadas na tabela a seguir (Tabela 2), algumas
alterações observadas na estrutura genômica do CBC e outras malignidades cutâneas.
REVISÃO DA LITERATURA
30
Tabela 2 - Algumas alterações na estrutura genômica do CBC e em outros tumores cutâneos.
Cromossomo gene Observações Tumor
1p36 N-RAS Mutação codon 61 em 20% linhagens
metastáticas e tumor primário in vivo e in
vitro sob UV; maior freqüência de
alterações no cromossomo 1
MM
45,46,47,48
CEC
49
1p33 PTCH2 Síndrome Nevóide do Carcinoma
Basocelular; mutações
CBC
41,42
4q32-35 ING1L, SAP30 LOH em mais de 20% nos microssatélites
D4S414,D4S426
CBC
15
5q13 Não identificado Região candidata CBC
50
6 Não identificado Mutações, deleções (LOH, MSI) CBC
16
,
MM
45,46,51
9p21 MTS1 Genes supressores CDKN2a (p16) e
CDKN2b (p15)
MM
52,53
9q22.3-31 PTCH1 Síndrome do nevo basocelular; LOH
esporádico e familiar
CBC
48
11p H-RAS Aberrações cromossômicas MM
46
11q13 MYC 8% amplificação gênica
7-13% amplificação gênica
MM
49
CEC
46
12p K-RAS Aberrações cromossômicas MM
54
16q22.1 CDH E-caderina: supressor de invasão de
carcinoma epitelial
CEC
55
17p TP53 Supressor mutado em 30% de linhagens.
Mutações, substituições, microdeleções
(UV) 20-50%. Superexpressão
MM
56
CEC
56
CBC
41,56
Diferentes pesquisas demonstraram MSI em diversos tipos de câncer, como
por exemplo, em gliomas
57
e de mama
58
. No caso de câncer de pele, foram
comparados CBCs, carcinomas espinocelulares (CEC) e melanomas malignos (MM),
observando bandas extras e LOH em alguns destes casos, demonstrando assim
alterações no DNA repetitivo
13
.
No CBC, MSI e/ou LOH foram observadas em especial no cromossomo 9. A
região 9q (9q21, 9q22
11,12
, 9q222-qter e 9p21
13
) onde estão localizados os
microssatélites D9S15, D9S50, D9S52, D9S53, D9S197, D9S287 e D9S303
demonstraram MSI e LOH com taxas variando de 20 a 75%, o mesmo ocorrendo na
região 9p (D9S165)
14,15
.
REVISÃO DA LITERATURA
31
Em um estudo realizado com CBCs esporádicos foi observada LOH em mais
de 20% nos microssatélites D4S414, D4S426 (4q32-35) e de 15 a 20% nos
microssatélites D1S249(1q32), D3S1597(3p24), D10S541(10q22.1) e
D17S791(17q21.3)
15
.
As alterações (LOH e MSI) dos microssatélites podem de maneira indireta
evidenciar outras alterações em importantes genes adjacentes ou próximos destas
regiões. Em alguns casos de LOH, pode ter havido perda de parte do respectivo
cromossomo. Na figura a seguir procuramos mostrar de modo esquemático as
possíveis alterações que podem ocorrer nos loci 6q14-16.2, localização dos
microssatélites D6S251 e D6S252.
Figura 11 – Representação esquemática da MSI e LOH que podem ocorrer nos loci 6q14-16 onde
estão localizados os microssatélites D6S251 e D6S252.
REVISÃO DA LITERATURA
32
O microssatélite D6S251 localizado no locus 6q14 parece ser mais suscetível
a mudanças durante a proliferação desordenada que leva à formação do CBC,
abrindo a possibilidade que genes correlatos ao CBC residam nesta região
16
. Este
fato foi comprovado através do encontro de instabilidade do microssatélite D6S251
(MSI) em 60% de dez CBCs estudados sendo 9 esporádicos e um herdado
16
. Para o
D6S252 foi observada LOH em 10% dos mesmos CBCs estudados
16
. Nenhum outro
trabalho relacionando alterações dos microssatélites D6S251 ou D6S252 com o CBC
foi encontrado na literatura até o momento. Em pesquisa realizada para detecção de
LOH no braço longo do cromossomo seis (6q13-6q27) em carcinomas de mama, foi
observado com taxas variando de 11,4 a 38,9%
59
. Deleção próxima à região do
microssatélite D6S251 foi relatada somente em carcinomas de mama
60
.
4 MÉTODOS
__________________________________________________________
MÉTODOS
34
4.1 Casuística
Este trabalho foi realizado utilizando amostras de CBC e tecido normal
obtidos de pacientes portadores de CBC esporádicos (não-herdados).
Os pacientes portadores destes tumores realizavam acompanhamento nos
ambulatórios de Oncologia Cutânea e Cirurgia Dermatológica da Divisão de
Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo (HCFMUSP) no período de novembro de 2004 a abril de 2005.
As amostras de CBC e de tecido normal foram estudadas histologicamente
para confirmação diagnóstica após exérese da peça operatória.
Foi considerado tecido normal, o sangue e/ou pele com ausência de neoplasia
residual proveniente da região peritumoral utilizada para reconstrução cirurgica do
defeito gerado primariamente pela cirurgia a qual os pacientes foram submetidos.
Inicialmente foram selecionadas 32 amostras tumorais e 23 de tecido normal
(sangue/pele normal), relativas a 23 pacientes portadores de CBC submetidos a
cirurgia para exérese da neoplasia.
MÉTODOS
35
Após avaliação histologica foram selecionadas 26 amostras de CBC
esporádicos e 17 de tecido normal provenientes de 17 pacientes de ambos os sexos e
com idades variando de 46 a 89 anos. Outras 6 amostras tumorais provenientes de 6
pacientes foram excluídas pois tratavam-se de carcinoma metatípico (Figura 12).
Quatro pacientes eram portadores de mais de um CBC.
após estudo histológico das peças
32 Amostras tumorais obtidas de
pacientes portadores de CBCs
esporádicos previamente
selecionados clínica e
histologicamente (biópsia)
26 CBCs incluídos no estudo
operatórias
6 amostras excluídas após estudo
histológico das peças
operatórias
pois se tratavam de
carcinomas metatípicos
Para o microssatélite D6S251,
26 CBCs foram estudados
Para o microssatélite D6S252,
15 CBCs foram estudados
Figura 12 – Organograma demonstrando a casuística final estudada de 26
CBCs para o microssatélite D6S251 e 15 CBCs para o D6S252.
Todas as informações referentes aos pacientes, amostras, classificação
histológica, risco, resultados da PCR obtidos podem ser consultados no anexo C.
MÉTODOS
36
Optamos considerar o número de tumores obtidos e não o número de
pacientes devido ao comportamento histológico do CBC ser individualizado e a
possibilidade de utilizar um menor número de pacientes e controles.
Os CBCs incluídos no estudo foram classificados quanto ao grau de risco
histológico. Foram considerados de alto risco os seguintes subtipos histológicos:
esclerodermiforme, micronodular e as formas mistas incluindo algum desses 2
subtipos. As formas nodular, nódulo-cística e variantes foram consideradas de baixo
risco.
O tipo superficial foi considerado de baixo risco devido ao seu
comportamento clínico e biológico menos agressivo.
Para o estudo do microssatélite D6S251 utilizamos 26 CBCs, sendo 13 de
alto risco e 13 de baixo risco e para o microssatélite D6S252 utilizamos 15 CBCs,
sendo 6 de alto risco e 9 de baixo risco.
Os CBCs incluídos no estudo e suas classificações de risco histológicos são
mostrados na tabela 3 (amostras utilizadas na verificação das alterações do
microssatélite D6S251) e na tabela 4 (amostras utilizadas na verificação das
alterações do microssatélite D6S252).
MÉTODOS
37
Tabela 3 - Amostras de CBC estudadas e excluídas, localização do tumor e classificação
histopatológica de risco para o microssatélite D6S251.
CBC Localização Histopatologia Risco
01 Bucal E Nodular Baixo
02 Orelha E Nodular/ Micronodular / Esclerodermiforme Alto
03 Antebraço D Nodular/ Micronodular / Esclerodermiforme /Adenóide Alto
05 Mandibular E Sólido/Superficial Baixo
06 Sulco Nasogeniano D Nodular/Esclerodermiforme Alto
07 Epicanto E Sólido Baixo
08 Zigomática D Sólido/Cístico/Micronodular Alto
09 Malar E Sólido/Cístico/ Micronodular Alto
10 Frontal E Sólido/Nodular/ Micronodular Alto
11 Infrapalpebral D Nodular Baixo
12 Dorso Nasal Sólido/ Micronodular Alto
13 Infrapalpebral E Nodular Baixo
14 Frontal D Nodular Baixo
15 Infrapalpebral D Nodular / Micronodular Alto
16 Infrapalpebral D Nodular / Micronodular Alto
17 Antebraço D Nodular Baixo
18 Infrapalpebral D Nodular /Adenóide/Superficial Alto
19 Mandibular D Nodular/ Micronodular Alto
20 Asa Nasal D Sólido Baixo
21 Asa nasal E Sólido Baixo
22 Dorso Sólido/Superficial Baixo
23 Tórax anterior Nodular/Superficial Baixo
24 Dorso Nasal Sólido/ Micronodular Alto
25 Infrapalpebral E Sólido/ Micronodular Alto
26 Temporal E Sólido-cístico Baixo
32 Antebraço E Nodular/Superficial Baixo
MÉTODOS
38
Tabela 4 - Amostras de CBC estudadas e excluídas, localização do tumor e classificação
histopatológica de risco para o microssatélite D6S252.
CBC # Localização Histopatologia Risco
01 Bucal E Nodular Baixo
02 Orelha E Nodular / Micronodular/ Esclerodermiforme Alto
03 Antebraço D Nodular / Micronodular / Esclerodermiforme/
Adenóide
Alto
05 Mandibular E Sólido/Superficial Baixo
06 Sulco Nasogeniano
D
Nodular/ Esclerodermiforme Alto
07 Epicanto E Sólido Baixo
13 Infrapalpebral E Nodular Baixo
14 Frontal D Nodular Baixo
16 infrapalpebral D Nodular / Micronodular Alto
18 Infrapalpebral D Nodular /Adenóide/Superficial Alto
20 Asa Nasal D Sólido Baixo
21 Asa nasal E Sólido Baixo
22 Dorso Sólido/Superficial Baixo
23 Tórax anterior Nodular/Superficial Baixo
30 Dorso Nasal Sólido/Micronodular/Superficial Alto
Após avaliação clínica e confirmação e classificação histológica, o
fluxograma do trabalho foi explicado para todos os pacientes. O termo de
consentimento livre e esclarecido foi devidamente aplicado e assinado (Anexo A),
assim como informações gerais sobre o paciente e os tumores foram coletadas
(Anexo B).
MÉTODOS
39
4.2 Métodos
O estudo foi desenvolvido prospectivamente.
A seleção dos pacientes portadores de CBC foi realizada através de criterioso
exame clínico, biópsia do tumor e estudo histológico prévio, sendo que todos os
pacientes foram tratados cirurgicamente pelo autor e posteriormente acompanhados
no Ambulatório de Dermatologia do Hospital das Clínicas da FMUSP, como
previamente explicado.
Foi feita a análise das alterações (MSI e LOH) nos microssatélites D6S251 e
D6S252 nas amostras de CBC selecionadas (26 para o microssatélite D6S251 e 15
para o D6S252) em comparação com o tecido normal (controle) provenientes de 17
pacientes portadores esporádicos (não-herdados) desta neoplasia através da técnica
da PCR e posterior resolução em gel de poliacrilamida.
Toda a metodologia empregada está descrita e pormenorizada abaixo.
4.2.1 Obtenção das amostras e extração do DNA
As amostras de sangue (leucócitos), pele normal e tumor dos pacientes com
CBC foram obtidas durante as cirurgias realizadas no Hospital das Clínicas da
FMUSP.
Dez mililitros (mL) de sangue periférico foram acondicionados em tubo a
vácuo contendo EDTA (BD®) e mantido resfriado a 4ºC. Fragmentos de pele
normal e do CBC foram colocados em criotubos e acondicionados em nitrogênio
líquido imediatamente após a obtenção. Todo esse material foi encaminhado para o
MÉTODOS
40
Laboratório de Genética do Instituto Butantan em recipientes próprios para
transporte de material biológico para posterior utilização.
Para a extração do DNA, as amostras de pele normal e os tumores foram
biopulverizados individualmente em aparelho da marca Dismembrator® sendo os
produtos transferidos individualmente para tubos Corex® mantidos no gelo, cada
qual contendo 2,5 ml de solução digestiva TES (Tris-HCl 10 mM pH8.0, EDTA 10
mM, SDS 0,6 %) e Proteinase K (100 mg/ml) (Life Technologies®).
As suspensões obtidas ficaram incubadas em banho-maria a 50ºC por 2 horas,
e após esse tempo igual volume de fenol pH 7-8 foi colocado, agitando-se por
inversão durante 15 minutos. Em seguida foi adicionado igual volume de
clorofórmio/álcool isoamílico (2:1) agitando-se por mais 15 minutos.
Após centrifugação de 20 minutos a 10.000 rpm (rotor Sorvall RC-5B) e 4ºC,
o infranadante foi desprezado deixando-se a interfase. Acrescentou-se igual volume
de clorofórmio/álcool isoamílico e agitou-se por mais 15 minutos.
Após mais uma centrifugação por 20 minutos a 10.000 rpm e 4ºC, o
sobrenadante foi transferido para um novo tubo de ensaio, e o DNA foi então
precipitado com acetato de sódio 500 mM e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado.
Os materiais foram mantidos a – 20ºC overnight e depois centrifugados nas
condições anteriores, e secos a vácuo. Suspendeu-se o DNA de cada amostra em TE
tratando-os com RNase 50µg/ml, 1h, 37ºC, e novamente extraído com fenol,
conforme descrito. Os DNAs foram suspensos em água miliQ e armazenados a 4ºC.
Quanto ao DNA do sangue (leucócitos), este foi tratado com solução para lise
das hemácias. Para cada 10 ml de sangue colocou-se 0,5 ml de EDTA 10 mM, 5,0 ml
de tampão de lise 10x e 45 ml de água, incubando 2 horas no gelo. Após
MÉTODOS
41
centrifugação por 10 min., 1000 rpm, 4ºC o pellet foi tratado com solução digestiva
conforme protocolo acima.
A integridade de todas as amostras de DNA foi verificada em gel de agarose a
1% coradas com brometo de etídio, fotografadas sob luz ultravioleta e sua
quantificação confirmada em espectrofotômetro.
4.2.2 Avaliação de LOH e MSI nos Microssatélites
Para estudo dos microssatélites D6S251 e D6S252, ambos localizados no
cromossomo 6 (6q14-16), foram realizadas reações de PCR para amplificação destes.
As reações de PCR para estes marcadores foram realizadas individualmente
em tubo Eppendorf estéril onde foram colocados 10x PCR buffer, 50 mM de MgCl
2,
10 mM de dNTP mix, 10 pMol de primer direto e reverso (MVG- Biotech®), 1
unidade de Taq DNA polimerase, 100 ng de DNA e água MilliQ autoclavada q.s.p.
50 µl de reação. Em seguida levaram-se os tubos ao termociclador (Extract Gene®),
onde foram submetidos a 40 ciclos de 94ºC 1 min., 52ºC 50s, e 72ºC 50s com 5
minutos de extensão para o D6S251 e 40 ciclos de 94ºC 45s., 53ºC 45s, e 72ºC 50s
com 5 minutos de extensão para o D6S252 .
Os primers direto e reverso utilizados para amplificação dos microssatélites
D6S251 e D6S252 constam da tabela 5.
MÉTODOS
42
Tabela 5 - Lista dos primers utilizados na obtenção dos padrões de microssatélites D6S251
e D6S252.
Cromos
somo
Observação Microssatélite Tipo de
repeat
Primers direto (D) e reverso (R)
6q14
6q16
região
repetitiva*
D6S251
D6S252
(GT)n
144-162pb
(GT)n
154-166pb
D- TTCCTAACCAGGTTTCAATG
R- ATATTTTTAAAGTAAGTTGCAC
D- ATGGCTCAGGATTCACATTG
R- TGAAAGGAAAGTCCTGCTTC
*Região repetitiva = heterocromatina constitutiva
Uma vez extraídos, os DNAs de sangue, pele normal e CBCs dos pacientes
foram devidamente quantificados em gel de agarose 1% através da comparação com
DNA de lâmbda (Gibco-BRL) em concentrações de 150, 300 e 450 ng/ul.
Para verificar se houve alterações nestes loci nos tumores em relação ao
equivalente no sangue ou pele normal, os produtos de PCRs foram colocados em gel
de agarose e visualizados sob luz UV. Após esse procedimento, o gel de
poliacrilamida a 6% disposto numa cuba eletroforética vertical V16 (Life
Technologies®) foi realizado. As amostras foram arranjadas lado a lado, estando o
produto de PCR do sangue ao lado da pele normal e esta ao lado do tumor, de
maneira a permitirem a comparação entre os resultados do mesmo paciente. O gel
continha também um marcador de peso molecular “100 bp Kb Ladder”. A
eletroforese foi realizada a 150V por cerca de 1,5 horas, usando-se tampão TEB 0.5x
para a corrida.
Após a corrida, o gel passou por um método de coloração com prata: após ser
retirado da cuba de eletroforese, foi mergulhado em um recipiente contendo 300 ml
de solução fixadora contendo 30 mL de etanol absoluto, 2,25 mL de ácido acético
glacial e água destilada, deixando em agitação por 10 minutos. Em seguida
MÉTODOS
43
adicionaram-se 10 ml de solução de nitrato de prata (50 mL de solução fixadora, 0,3
g de AgNO3 e água destilada), deixando-se novamente por 10 minutos sob agitação.
Retiraram-se as soluções, lavou-se o recipiente rapidamente com água destilada e por
fim colocou-se solução reveladora (4,5 g de NaOH a 3 %, 450 µL de formaldeído a
37 % e 150 ml de água destilada), deixando-se sobre o gel até o DNA ser corado.
No final a solução foi retirada e o gel foi fotografado sob luz branca. A partir
das fotografias obtidas dos géis, fez-se uma análise das alterações através da
contagem do número de fragmentos obtidos do sangue pele normal e dos tumores.
Foi feita também uma contagem em relação ao número de bandas perdidas e ganhas
pelo tumor em relação às bandas obtidas no sangue, tido como padrão normal do
paciente. Fragmentos no tumor que mostravam grande diferença de intensidade
quando comparados aos fragmentos idênticos obtidos no sangue, também foram
considerados.
Quando essa intensidade no tumor era pelo menos 50% maior, considerava-se
como ganho e quando menor, considerada perda.
O tamanho esperado para D6S251 foi de 144-162 pb e de 154-166 para o
D6S252. Os resultados foram analisados de maneira a verificar se no DNA tumoral
amplificado houve algum LOH, isto é, se o tumor perdeu um dos alelos
cromossômicos ou um dos cromossomos homólogos, ou se houve MSI, caracterizada
quando um dos alelos apresenta ganho ou perda dos repeats internos.
Os padrões dos microssatélites D6S251 e D6S252 de cada tumor foram
comparados com pelo menos um de seus respectivos controles (leucócitos ou pele
normal) para verificar se houve LOH e MSI. As alterações por ventura encontradas
MÉTODOS
44
nos tumores estudados foram analisadas e confrontadas com os tipos histológicos e
de risco previamente classificados.
Depois de todo o processo analítico, MSI foi considerada quando ocorreu o
aparecimento de uma banda “extra” ao fragmento amplificado e LOH foi
considerada quando houve desaparecimento de uma das bandas do material
amplificado, sempre comparando as amostras colhidas de cada paciente e
considerando o tecido normal (pele/leucócitos) como padrão de normalidade na
corrida eletroforética. Essa análise foi realizada por três observadores independentes
em momentos diferentes de realização desse estudo.
Fotografias dos géis de agarose e poliacrilamida estão disponíveis no
anexo D.
5 RESULTADOS
__________________________________________________________
RESULTADOS
46
Das amostras de CBC incluídas, foi realizada a pesquisa e avaliação da
existência de MSI e LOH em comparação com o tecido normal, com os seguintes
resultados obtidos:
5.1 Microssatélite D6S251
Foram incluídas 26 amostras de carcinomas basocelulares obtidas de
dezessete pacientes atendidos no Ambulatório de Dermatologia do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
MSI ocorreu nas amostras 6 e 12 (7,69 % do total das amostras de CBC).
Ambas pertencentes ao grupo de alto risco que corresponde a 15,38 % das mesmas
(Figura 13).
Figura 13 – Resolução das amostras 6 e 12 em gel de poliacrilamida onde a MSI é representada pela
seta (←) nas amostras tumorais (6t e 12t) em comparação com os controles 6n (pele
normal) e 12s (sangue/leucócitos) para o microssatélite D6S251. À esquerda observa-se
o marcador de peso molecular (100 a 200 pb ladder).
RESULTADOS
47
LOH foi encontrado nas amostras 9, 10,18 e 24 (15,38 % do total das
amostras de CBC). Essas 4 amostras que apresentavam LOH eram todas pertencentes
ao grupo de alto risco, o que corresponde a 30,77 % das 13 amostras de alto risco
estudadas (Figura 14).
Figura 14 – Resolução das amostras 9, 10, 18 e 24 em gel de poliacrilamida com LOH representada
pelo asterisco (*) nas amostras tumorais (9t, 10t, 18t e 24t) em comparação com a pele
normal (n) para o microssatélite D6S251.
Todas as alterações do microssatélite D6S251 (LOH e MSI) observadas e
suas devidas classificações histológica e de risco no estudo estão representadas na
tabela 6.
Tabela 6 – CBCs incluídos no estudo e que apresentaram alterações do microssatélite D6S251
CBC # Classificação Histológica Risco Alteração
D6S251
06 Nodular/esclerodermiforme Alto MSI
09 Sólido/Cístico/Micronodular Alto LOH
10 Sólido/Nodular/Micronodular Alto LOH
12 Sólido/Micronodular Alto MSI
18 Nodular/Adenóide-cístico/Superficial Alto LOH
24 Sólido/Micronodular Alto LOH
RESULTADOS
48
As outras 20 amostras de CBC estudadas apresentaram padrões de
microssatélite semelhantes aos seus respectivos controles, isto é, não apresentaram
alterações significativas (exemplos mostrados nas figura 15).
Figura 15 – Padrões normais do microssatélite D6S251 após resolução em poliacrilamida. Nesta
figura, vemos o marcador de peso molecular (100– 200 pb ladder) e as amostras 2 e 26
representadas pela pele normal (n) e tumor (t) exibindo padrões semelhantes de bandas.
MSI e LOH ocorreram em 6 das 26 amostras estudadas, o que corresponde a
23,07%. Todas as amostras que apresentaram LOH ou MSI eram do grupo de alto
risco (Figura 16).
8
6
4
2
0
10
12
14
Alto Risco Baixo Risco
Amostras
MSI
LOH
Sem Alteração
Figura 16 – LOH e MSI nas amostras de CBC de alto e baixo risco para o microssatélite D6S251.
RESULTADOS
49
5.2 Microssatélite D6S252
Para o estudo do microssatélite D6S252, foram incluídas 15 amostras de
carcinomas basocelulares esporádicos. Após a PCR e resolução em gel não houve
qualquer evidência de instabilidade genômica, ou seja, não foi observado MSI ou
LOH em nenhuma das 15 amostras estudadas. Alguns exemplos podem ser vistos na
figura abaixo:
Figura 17 – Padrões normais do microssatélite D6S252 após resolução em poliacrilamida. Nesta
figura, podemos ver tecido normal sendo pele (n) e/ou sangue(s) e tumores (t)
mostrando padrões semelhantes de bandas. Vemos aqui representadas as amostras 5,6 e
20, além do marcador de peso molecular (M).
6 DISCUSSÃO
__________________________________________________________
DISCUSSÃO
51
O Câncer é uma doença essencialmente genética caracterizada por
instabilidade genômica e descontrole da proliferação celular. A maior parte dos
cânceres, especialmente os tumores sólidos, se desenvolvem após o acúmulo de
múltiplas lesões gênicas. A maioria dos tumores resulta de alterações na replicação
do DNA causadas por carcinógenos ou por defeitos no aparato de reparação do
DNA.
Os genes correspondem a apenas 10% de todo o material genético contido nas
células humanas. Os demais 90% do genoma são compostos de seqüências
repetitivas de DNA. Entre elas estão os microssatélites
19
que são curtas seqüências
repetitivas em tandem que têm sido extensivamente utilizados como marcadores
genéticos
22,23
.
A transcrição de seqüências repetitivas instáveis pode dar origem a produtos
totalmente diversos do esperado, que podem afetar a regulação de genes nas células e
tecidos além da geração de novos alelos com aumento ou diminuição de unidades de
repetição
61,62
, contribuindo para aparecimento de um fenótipo maligno.
MSI caracteriza-se pela alteração do tamanho das repetições e muitas vezes
pode ser utilizada como evidência indireta de erros de replicação, devido sua relação
com a falha do sistema de reparo. Já a LOH representa a perda de um dos alelos,
podendo relacionar-se à perda de um locus cromossômico inteiro e que pode conter
genes importantes
63
como, por exemplo, genes supressores de tumor. Ambas tem
DISCUSSÃO
52
sido utilizadas como teste diagnóstico no estadiamento e evolução das células
tumorais, bem como na possível susceptibilidade hereditária ao tumor, podendo
ainda auxiliar em condutas posteriores de tratamento.
Inúmeras alterações e mutações genéticas ocorrem em células cancerosas e
vem sendo identificadas através de vários métodos incluindo o utilizado neste
estudo.
Seqüências flanqueadoras dos microssatélites são usadas como primers para
sua amplificação através da PCR. A resolução dos produtos da PCR em gel de
poliacrilamida permite detectar ganhos ou perdas de repeats internos aos
microssatélites (MSI), bem como sua deleção (LOH).
Nós investigamos a presença de MSI e LOH nos microssatélites D6S251 e
D6S252 (6q14-16) de CBCs esporádicos de alto e baixo risco histológico,
evidenciados através de visualização da mobilidade e intensidade de bandas obtidas
pela eletroforese em gel de poliacrilamida após PCR específica em comparação com
o controle normal (pele/sangue) obtido do mesmo paciente.
Dados da literatura apontam para a incidência variável de MSI em tumores
malignos cutâneos utilizando diferentes microssatélites, a maioria deles localizados
no cromossomo 9. Menos de 5% de 137 CCNM, mostraram MSI em regiões
cromossômicas diferentes da 9p21
14
. Para o CBC, a freqüência de MSI no
cromossomo 9 não dependeu da idade de aparecimento do tumor, sendo prevalente
no cromossomo 9p, enquanto que LOH foi observado no cromossomo 9q
64
,
indicando provável envolvimento do gene PTCH.
DISCUSSÃO
53
LOH no cromossomo 9p associado à perda ou inativação do gene CDKN2A
parece ocorrer tanto no CBC quanto no CEC. Amostras de CEC exibiram LOH (52
%) em pelo menos um microssatélite, mas somente 7 % exibiram MSI neste locus
65
.
Nosso grupo, analisou quatro microssatélites próximos ao gene PTCH 1 e
dois próximos ao gene PTCH 2 de dez amostras de CBCs provenientes de doentes
portadores da SNBC (herdados). Foi observada LOH apenas no microssatélite
D9S180 (PTCH1) próximo ao gene PTCH1
39
.
O locus (6q14) onde se localiza o microssatélite D6S251 parece ser suscetível
à mudanças durante a proliferação celular que ocorre no câncer. No câncer de mama
foi relatada uma região deletada próxima a esse locus
60
.
No câncer cutâneo só existe um trabalho, realizado por nosso grupo, referente
aos microssatélites D6S251 e D6S252
16
em dez amostras de CBCs sendo 9
esporádicos e um herdado (SNBC). As alterações encontradas nessa pequena
amostra motivaram a realização do presente estudo, procurando aumentar a amostra
de CBCs e utilizando apenas CBCs esporádicos por serem mais freqüentes na prática
clínica.
Encontramos alterações em 23,07% do total de amostras para o microssatélite
D6S251 e nenhuma alteração ao estudarmos o microssatélite D6S252.
Ao estudarmos as alterações do microssatélite D6S252 observamos que das
15 amostras de CBCs utilizadas, nenhuma mostrou qualquer alteração em
comparação ao controle normal (pele/sangue).
No trabalho citado anteriormente ocorreu 10% de LOH no microssatélite
D6S252 no CBC do paciente portador da SNBC
16
. Esta aparente divergência com
relação ao presente trabalho talvez esteja relacionada ao fato da utilização de apenas
DISCUSSÃO
54
CBCs esporádicos. Naquela amostra, os dois eventos de alteração observados (MSI
E LOH) pertenciam ao CBC desse paciente portador da SNBC. Nosso achado sugere
que provavelmente não exista associação ou envolvimento do cromossomo 6q16
(D6S252) no desenvolvimento do CBC esporádico.
Por sua vez, ao estudarmos o microssatélite D6S251 (6q14), utilizamos 26
amostras de CBCs e comparamos os achados aos seus respectivos controles normais
(pele/sangue). Observamos que havia alteração em 6 das 26 amostras (23,07%).
Duas amostras mostraram MSI (7,69% do total de amostras) e quatro LOH
(15,38% do total de amostras).
O único dado de literatura relacionando o CBC a alterações no cromossomo
6q14 (D6S251), encontrou 60 % de MSI e 20 % de LOH num grupo de 10 CBCs (9
esporádicos e um herdado)
16
. Estas taxas mais baixas de MSI e mais altas de LOH
em comparação com o estudo supra citado talvez se deva, ao contrário do nosso, da
presença de um CBC herdado.
Quanto ao número de regiões instáveis, verificamos que 7,69% das amostras
de CBC foram instáveis somente para o microssatélite D6S251. Alguns autores
comentam que o fato das células apresentarem instabilidade em uma ou duas regiões,
implica em uma ineficiência do sistema de reparo e não na sua completa
inativação
66,67
. O número de regiões instáveis também poderia ser aumentado se
tivéssemos estudado um número muito maior de microssatélites.
Uma vez conhecidas as alterações genômicas encontradas nos CBCs
esporádicos procuramos correlacioná-las com o grau de agressividade dos tumores
baseados nos diferentes tipos histológicos existentes.
DISCUSSÃO
55
Utilizamos a classificação histológica de risco sugerida pelo Royal College of
Pathology do Reino Unido (modificada) que está baseada nos padrões de
crescimento tumoral e no útil conceito de baixo e alto risco para os subtipos
histológicos.
De acordo com essa classificação, CBCs de alto risco são caracterizados por
um aumento da probabilidade de extensão subclínica e/ou excisão incompleta e/ou
comportamento invasivo e agressivo local e/ou recorrência local. CBCs de alto risco
incluem os subtipos superficial, infiltrativo/esclerodermiforme e micronodular. O
CBC nodular é o principal subtipo classificado como de baixo risco, que inclui todas
as suas variantes como o CBC nodulocístico e o fibroepitelioma de Pinkus
8
.
No nosso estudo o tipo histológico CBC superficial foi colocado no grupo de
baixo risco, diferentemente da classificação acima descrita. Entendemos que sua
inclusão de alto risco só se deva a recidivas freqüentes por excisão incompleta e não
pelo seu comportamento biológico e subtipo histológico sabidamente menos
agressivo.
Das 15 amostras de CBCs utilizadas no estudo das alterações do
microssatélite D6S252 , 9 eram de baixo risco e 6 de alto risco porém nenhuma
mostrou qualquer alteração em comparação ao controle normal (pele/sangue).
Das 26 amostras de CBCs utilizadas no estudo da microssatélite D6S251
(6q14), 13 de eram de risco e 13 de baixo risco histológico. Observamos que havia
alteração em 6 das 26 amostras (23,07%) e todas ocorreram apenas nas amostras que
foram classificadas como de alto risco (46,15%).
Duas amostras mostraram MSI (7,69% do total de amostras e 15,38% das de
alto risco) e quatro LOH (15,38% do total de amostras e 30,76% das de alto risco).
DISCUSSÃO
56
Nenhuma amostra considerada de baixo risco mostrou qualquer alteração em
comparação ao controle normal.
Tanto LOH quanto MSI ocorreram apenas em amostras de CBC de alto risco
(46,15 % das amostras de CBC de alto risco estudadas).
Em relação à histologia, o subtipo nodular foi o mais freqüente nas amostras
de baixo risco. Todas as amostras de alto risco exibiam mais de um padrão
histológico (padrão misto), sendo o subtipo micronodular o mais freqüente (presente
em 12 amostras), seguido pelo esclerodermiforme (presente em 3 amostras). Logo,
todas as amostras que mostraram LOH e MSI apresentavam histologia de padrão
misto, sendo que o componente micronodular estava presente em 4 das 6 amostras
alteradas.
Não podemos inferir qualquer conclusão sobre os subtipos isolados, pois,
todas as amostras são mistas, ou seja, apresentam mais de um subtipo histológico. A
presença de vários subtipos no mesmo CBC parece conferir a essa neoplasia uma
maior agressividade local apesar da origem provir da mesma linhagem celular.
Em suma, em nosso estudo constatamos que as células do CBC são
susceptíveis a alterações genéticas do microssatélite D6S251 (6q14), especialmente
aqueles considerados de alto risco. A ocorrência de alterações no microssatélite
D6S251 em 23,07% dos CBCs estudados (46,15 % dos CBCs esporádicos de alto
risco) denota uma freqüência não desprezível de MSI e LOH neste grupo, se
compararmos com os CBCs de baixo risco e mesmo com os resultados obtidos para o
microssatélite D6S252.
Esses achados sugerem que deve existir participação ou envolvimento do
cromossomo 6q14 (D6S251) na diferenciação e gênese dos CBCs esporádicos.
DISCUSSÃO
57
Novos estudos deverão ser conduzidos a fim de verificar o real papel do locus 6q14
na diferenciação e agressividade do CBC esporádico, além de possibilitar a
identificação de genes relacionados ao CBC próximos a essa região onde o
microssatélite D6S251 está localizado.
7 CONCLUSÕES
__________________________________________________________
CONCLUSÕES
59
O estudo dos microssatélites D6S251 e D6S252 em amostras de CBC
esporádicos permitiu chegar às seguintes conclusões:
1. O microssatélite D6S252 não parece estar envolvido no desenvolvimento de
CBCs esporádicos;
2. O fato de encontrarmos 23,07% de alterações (LOH e MSI) no microssatélite
D6S251 em amostras consideradas de alto risco (46,15%) sugere que pode haver
envolvimento do cromossomo 6 (região 6q14) na diferenciação e gênese desses
CBCs esporádicos.
8 ANEXOS
__________________________________________________________
ANEXOS
61
Anexo A - Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL
1. NOME DO PACIENTE .:.................................................................................................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO : .M ( ) F ( )
DATA NASCIMENTO: ......../......../......
ENDEREÇO ................................................................... Nº ........................... APTO: .................
BAIRRO:........................................................................CIDADE ................................................
CEP:.........................................TELEFONE: DDD(..........) .........................................................
2.RESPONSÁVEL LEGAL ...............................................................................................................
NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) .....................................................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO: M ( ) F ( )
DATA NASCIMENTO.: ....../......./......
ENDEREÇO: ........................................................... Nº ................... APTO: ............................
BAIRRO........................................................CIDADE: .................................................................
CEP:..............................................TELEFONE: DDD(........)...................................................
____________________________________________________________________________________
II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA
1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA: Estudo das Alterações dos Microssatélites D6S251 e
D6S252 no carcinoma basocelular esporádico
PESQUISADOR: Cyro Festa Neto
CARGO/FUNÇÃO: Professor Assistente Doutor CRM/SP: 27716
UNIDADE DO HCFMUSP: Departamento de Dermatologia
3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:
SEM RISCO ( ) RISCO MÍNIMO ( ) RISCO MÉDIO ( )
RISCO BAIXO ( ) RISCO MAIOR ( )
(probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como conseqüência imediata ou tardia do estudo)
4. DURAÇÃO DA PESQUISA: 6 (Seis) meses.
____________________________________________________________________________________
ANEXOS
62
III - REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU
REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA CONSIGNANDO:
Você está sendo convidado(a) a participar da pesquisa sobre o Estudo das Alterações dos
Microssatélites D6S251 e D6S252 no Carcinoma Basocelular Esporádico. Se decidir participar, é
importante que leia atentamente as informações contidas neste termo a fim de compreender o seu papel
nesta pesquisa.
1. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA
Você foi selecionado(a) para participar desta pesquisa por ser portador(a) de um câncer de pele
chamado Carcinoma Basocelular. Este tipo de câncer de pele é o mais freqüente e seu aparecimento vem
crescendo muito nos últimos anos devido principalmente à exposição intensa da pele ao sol durante a
vida. O principal objetivo desta pesquisa é verificar e avaliar a existência de uma alteração genética nas
células dos pacientes portadores do Carcinoma Basocelular. Essa alteração pode ser um dos fatores
responsáveis para o aparecimento deste câncer de pele, sendo que esta pesquisa poderá ajudar os
médicos e pesquisadores a compreender melhor esta doença.
É preciso que você entenda a natureza da sua participação na pesquisa e dar o seu consentimento livre
e esclarecido por escrito.
2. PROCEDIMENTOS UTILIZADOS
Caso concorde em participar desta pesquisa, você será submetido(a) a alguns procedimentos médicos
que serão explicados a você agora.
O tratamento proposto para você é a cirurgia de remoção do câncer de pele.
Será necessária a coleta de sangue para a realização de exames pré-operatórios. Essa coleta será
realizada no laboratório do Hospital das Clínicas por profissional habilitado. É preciso que você permita
que 10 mililitros do sangue coletado sejam utilizados para estudarmos seu material genético.
A cirurgia de remoção do câncer de pele será realizada no Hospital das Clínicas por médicos
habilitados. Será preciso que você consinta que o material retirado na cirurgia seja fornecido para a
realização da pesquisa. Esse material será submetido a estudo anátomo-patológico e do seu material
genético.
Seu papel na pesquisa será o de consentir o fornecimento do material para a sua realização, o que não
prejudicará o seu tratamento. O material obtido para o estudo poderá também ser utilizado em futuras
pesquisas.
3. RISCOS RELACIONADOS A PARTICIPAÇÃO NA PESQUISA
Se concordar em participar desta pesquisa cientifica, poucos riscos estarão envolvidos. O sangue
colhido para a realização de exames pré-operatórios e fragmentos do carcinoma basocelular
removidos na cirurgia farão parte do material estudado e a manipulação destes por parte do
pesquisador não acarretará nenhum desconforto ou risco para você.
4. BENEFÍCIOS QUE PODERÃO SER OBTIDOS
A participação na pesquisa não acarretará gasto para você, sendo totalmente gratuita. O conhecimento
que você adquirir a partir da sua participação na pesquisa poderá beneficiá-lo com informações e
orientações futuras em relação ao seu problema e tratamento, propiciando um melhor conhecimento
dos fatores de risco sobre o câncer de pele. O tratamento poderá ou não trazer benefícios a você, mas
as informações obtidas por meio do estudo poderão ser importantes para a descoberta de novos fatores
envolvidos no Carcinoma Basocelular.
As consultas, exames, procedimentos relacionados ao estudo e tratamentos utilizados serão
inteiramente gratuitos.
ANEXOS
63
IV - ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO
SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO:
1. ACESSO, A QUALQUER TEMPO, ÀS INFORMAÇÕES SOBRE PROCEDIMENTOS, RISCOS
E BENEFÍCIOS RELACIONADOS À PESQUISA.
Em caso de dúvidas relacionadas a sua participação na pesquisa, você poderá a qualquer momento
entrar em contato com o pesquisador e tirar suas dúvidas. Com relação às informações sobre os
procedimentos aos quais foi ou será submetido, os médicos do Setor de Dermatologia do Hospital das
Clínicas poderão esclarecer todas as suas dúvidas e dar maiores explicações sobre os procedimentos e
tratamento.
2. LIBERDADE DE RETIRAR SEU CONSENTIMENTO E DE DEIXAR DE PARTICIPAR DO
ESTUDO, SEM PREJUÍZO À CONTINUIDADE DA ASSISTÊNCIA.
É importante que você esteja consciente de que a participação neste estudo de pesquisa é
completamente voluntária e de que você pode recusar-se a participar ou sair do estudo a qualquer
momento sem penalidades ou perda de benefícios aos quais você tenha direito de outra forma. Em
caso de você decidir retirar-se do estudo, deverá notificar ao profissional e/ou pesquisador que esteja
atendendo-o. A recusa em participar ou a saída do estudo não influenciarão seus cuidados nesta
instituição. Sua participação não é obrigatória. A qualquer momento você pode desistir de participar e
retirar seu consentimento. Sua recusa não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador ou
com o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
3. CONFIDENCIALIDADE, SIGILO E PRIVACIDADE.
Algumas informações obtidas a partir de sua participação neste estudo não poderão ser mantidas
estritamente confidenciais. Os profissionais de saúde que estarão cuidando de você, o Comitê de Ética
em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e os pesquisadores podem
precisar consultar seus registros. Você não será identificado quando o material de seu registro for
utilizado, seja para propósitos de publicação científica ou educativa. Ao assinar este consentimento
informado, você autoriza as inspeções em seus registros.
V. INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS
PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE
INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS.
Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e o endereço do pesquisador principal,
podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação, agora ou a qualquer momento. Caso
você necessite de informações adicionais, ou tenha mais perguntas sobre o estudo, por favor, ligue
para o pesquisador/assistente Dr. Marcos Antonio Rodrigues Martinez no telefone 11-6193-8873.
VI. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES:
Seu papel na pesquisa será o de consentir o fornecimento do material proveniente da cirurgia de retirada
do Carcinoma Basocelular o qual é portador, bem como de 10 mililitros de sangue para a realização da
pesquisa. Esse material poderá ser utilizado em pesquisas futuras e este consentimento também terá
validade para estas, sendo este termo de consentimento de validade temporal ilimitada. Não haverá
prejuízo ao seu tratamento que vem sendo feito no Serviço de Dermatologia do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da USP.
ANEXOS
64
VII - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO
Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi
explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa.
São Paulo, de de 200__ .
_____________________________________________ _______________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal Assinatura do pesquisador
(carimbo ou nome Legível)
ANEXOS
65
Anexo B - Informações gerais sobre os pacientes e tumores
Registro Geral : ___________ Data:___/___/____
Nome: ____________________________________________
Sexo: ( )masculino ( )feminino Escolaridade(anos): _________
Renda: _____________________
Data de Nascimento: __/__/____ Idade: _________
Profissão: ________________ Procedência: ____________________
Fototipo (Fitzpatrick): ( )I ( )II ( )III ( )IV ( )V ( )VI
Usa Filtro Solar? ( )sim ( ) não
Localização do(s) CBC(s), Tipo Histológico e Classificação de Risco:
a. ___________________________________________( )AR ( )BR
b. ___________________________________________( )AR ( )BR
c. ___________________________________________( )AR ( )BR
d. ___________________________________________( )AR ( )BR
e. ____________________________________________( )AR ( )BR
ANEXOS
66
Anexo C - Lista geral de pacientes e CBCs utilizados no estudo. Nesta tabela
constam as iniciais dos pacientes, o gênero, a idade, o fototipo
(Fitzpatrick), numeração dada para as amostras, localização dos
CBCs, subtipo histológico, risco histológico, resultados das PCRs para
os microssatélites D6S251 e D6S252.
Iniciais Gênero Idade Fototipo CBC Localização Histopatologia Risco D6S251 D6S252
LL Masculino 83 III 01 Bucal E Nodular Baixo Inalterado Inalterado
ZTS
Feminino
82 III 02 Orelha E Nodular / Micronodular /
esclerodermiforme
Alto Inalterado Inalterado
AA Masculino 62 II 03 Antebraço D Nodular / Micronodular /
esclerodermiforme /adenóide
Alto Inalterado Inalterado
AA Masculino 62 II 04 Frontal D CA Metatípico Excluído Excluído Excluído
AA Masculino 62 II 05 Mandibular E Sólido / Superficial Baixo Inalterado Inalterado
AA Masculino 62 II 06 Sulco
Nasogeniano
D
Nodular / esclerodermiforme Alto
MSI
Inalterado
AA Masculino 62 II 07 Epicanto E Sólido Baixo Inalterado Inalterado
SGA Masculino 65 IV 08 Zigomática D Sólido / Cístico /
Micronodular
Alto Inalterado Não
Realizado
SGA Masculino 65 IV 09 Malar E Sólido / Cístico /
Micronodular
Alto
LOH
Não
Realizado
ELG Feminino 89 III 10 Frontal E Sólido / Nodular/
Micronodular
Alto
LOH
Não
Realizado
DAF Masculino 60 IV 11 Iinfrapalpebra
l D
Nodular Baixo Inalterado Não
Realizado
EOC Masculino 81 III 12 Dorso Nasal Sólido / Micronodular Alto
MSI
Não
Realizado
SJR Masculino 66 II 13 Infrapalpebral
E
Nodular Baixo Inalterado Inalterado
JBA Masculino 50 III 14 Frontal D Nodular Baixo Inalterado Inalterado
JLS Feminino 55 III 15 Infra
palpalpebral
D
Nodular / Micronodular Alto Inalterado Não
Realizado
BD Masculino 61 II 16 Infra
palpalpebral
D
Nodular / Micronodular Alto Inalterado Inalterado
ERA Feminino 80 III 17 Antebraço D Nodular Baixo Inalterado Não
Realizado
HC Masculino 77 III 18 Infra
palpalpebral
D
Nodular /
Adenoide/Superficial
Alto
LOH
Inalterado
SGA Masculino 65 III 19 Mandibular D Nodular / Micronodular Alto Inalterado Não
Realizado
MAS Masculino 46 III 20 Asa Nasal D Sólido Baixo Inalterado Inalterado
MAS Masculino 46 III 21 Asa nasal E Sólido Baixo Inalterado Inalterado
MAS Masculino 46 III 22 Dorso Sólido / superficial Baixo Inalterado Inalterado
MAS Masculino 46 III 23 Tórax anterior Nodular / superficial Baixo Inalterado Inalterado
MRR Feminino 52 III 24 Dorso Nasal Sólido / Micronodular Alto
LOH
Não
Realizado
MRR Feminino 52 III 25 Infra
palpalpebral E
Sólido / Micronodular Alto Inalterado Não
Realizado
WJD Masculino 82 III 26 Temporal E Sólido-cístico Baixo Inalterado Não
Realizado
LCP Masculino 60 II 27 Retroauricular
D
Ca Metatípico Excluído Excluído Excluído
DAM Feminino 71 III 28 Dorso Nasal Ca Metatípico Excluído Excluído Excluído
AR Masculino 80 II 29 Infra
palpebral E
Ca Metatípico Excluído Excluído Excluído
MAS Masculino 46 III 30 Dorso Nasal Sólido / Micronodular /
Superficial
Alto Não
Realizado
Inalterado
AFS Masculino 59 III 31 Frontal D Ca Metatípico Excluído Excluído Excluído
ZAB Feminino 48 III 32 Antebraço E Nodular / Superficial Baixo Inalterado Não
Realizado
ANEXOS
67
Anexo D - Fotografias dos géis de agarose e poliacrilamida obtidas
durante a realização do trabalho
Gel de Agarose. Quantificação de algumas amostras de tecido normal e
CBCs estudados.
Gel de Agarose. Visualização de algumas amostras de tecido normal e
CBCs após a realização da PCR.
ANEXOS
68
Resolução em gel de poliacrilamida para o microssatélite D6S251.
Algumas amostras de tecido normal e CBCs utilizadas.
Resolução em gel de poliacrilamida para o microssatélite D6S252.
Algumas amostras de tecido normal e CBCs utilizadas (numeração por paciente).
9 REFERÊNCIAS
__________________________________________________________
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