( PDF ) Caracterização bioquímica das B-glucosidases do Scytalidium thermophilum

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NIVERSIDADE DE

ÃO

AULO

FFCLRP- DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA

Caracterização bioquímica das β-glucosidases

do Scytalidium thermophilum

Fabiana Fonseca Zanoelo

Tese de Doutorado apresentada a

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de

Ribeirão Preto- USP, como parte das

exigências para obtenção do Título de

Doutor em Ciências - Área de

Concentração: Biologia Comparada.

Ribeirão Preto

2005

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo

de Ribeirão Preto / USP

Zanoelo, Fabiana Fonseca

Caracterização Bioquímica das β-glucosidases do

Scytalidium thermophilum. Ribeirão Preto, 2005.

110 p. il.; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP –

rea de

concentração: Biologia Comparada.

Orientador: Jorge, João Atílio.

1. Scytalidium thermophilum 2. β-glucosidase 3. β-

glicosidase 4. termofilia

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NIVERSIDADE DE

ÃO

AULO

FFCLRP- DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA

Caracterização bioquímica das β-glucosidases

do Scytalidium thermophilum

Fabiana Fonseca Zanoelo

Orientador: Prof. Dr. João Atílio Jorge

Tese de Doutorado apresentada a

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de

Ribeirão Preto- USP, como parte das

exigências para obtenção do Título de

Doutor em Ciências - Área de

Concentração: Biologia Comparada.

Ribeirão Preto

2005

Agradecimentos

Ao Prof. João Atílio, meus sinceros agradecimentos pela

oportunidade de realização deste trabalho, orientação, tempo

dedicado, confiança e especialmente pela amizade.

À prof. Maria de Lourde e ao Prof. Hector Francisco Terenzi, pela

ajuda, colaboração e valiosas sugestões.

Aos amigos do laboratório: Karina, Giovana, Flaviana, Vanessa,

Fabrício, Alexandre, Carol, Ana Carla, Altino, Luís, Simone, Michele

pela amizade e ajuda nos momentos difíceis.

À Renata Secretária da Pós-graduação, por estar sempre disposta

a me ajudar.

À Sandra por tornar nossos dias mais “saborosos”

Ao pessoal da Secretaria: Miriam, Isabel e Carlos, pela atenção e

Ao Maurício de Oliveira e Ricardo além do apoio técnico, pela

amizade.

A Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP), e Capes pelo apoio financeiro.

À todos que de alguma forma contribuíram para que fosse

possível a realização desse trabalho.

ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS..........................................................................................i

INDICE DE TABELAS........................................................................................iv

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................vi

RESUMO.........................................................................................................viii

SUMMARY........................................................................................................xi

1.INTRODUÇÃO.................................................................................................1

1.1. A

SPECTOS GERAIS.........................................................................................1

1.2. D

IVERSIDADE DOS ORGANISMOS TERMOFÍLICOS E PRODUÇÃO DE ENZIMAS.....................3

1.3. F

UNGOS COMO ORGANISMOS TERMOFÍLICOS...........................................................4

1.4. β-

GLUCOSIDASES.........................................................................................5

1.4.1. CONDIÇÕES PARA PRODUÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES............................................8

1.4.2. MULTIESPECIFICIDADE DAS β-GLUCOSIDASES..................................................10

1.4.3. A

AÇÃO E IMPORTÂNCIA DAS β-GLUCOSIDASES.................................................12

1.5. O S

CYTALIDIUM THERMOPHILUM......................................................................13

2- OBJETIVOS.................................................................................................16

3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................17

3.1. L

INHAGEM UTILIZADA....................................................................................17

3.2. C

ONDIÇÕES DE CRESCIMENTO..........................................................................17

3.2.1. M

ANUTENÇÃO DA LINHAGEM EM MEIO SÓLIDO..................................................17

3.2.2. C

OMPOSIÇÃO DO MEIO LÍQUIDO..................................................................17

3.3. C

RESCIMENTO EM MEIO LÍQUIDO......................................................................18

3.4. O

BTENÇÃO DA MASSA MICELIAL E DO MEIO DE CULTURA............................................18

3.5. D

ETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS......................................................19

3.5.1. D

ETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDASE................................................19

3.5.2. D

ETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE β-GALACTOSIDASE E β-XILOSIDASE.........................20

3.5.3. DOSAGEM DE CELOBIASE E LACTASE.............................................................20

3.5.4. D

OSAGEM DE XILANASE, AVICELASE E CMCASE................................................20

3.5. D

OSAGEM PROTÉICA.....................................................................................21

3.5.1. D

OSAGEM COLORIMÉTRICA........................................................................21

3.5.2. D

OSAGEM ESPECTROFOTOMÉTRICA (A280nm)................................................21

3.6. P

URIFICAÇÃO DAS ENZIMAS............................................................................21

3.6.1. P

URIFICAÇÃO DA β-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR ............................................22

3.6.2. P

URIFICAÇÃO DA β-GLUCOSIDASE MICELIAL....................................................23

3.7. D

ETERMINAÇÃO DA PUREZA DAS FRAÇÕES PURIFICADAS............................................24

3.7.1. E

LETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES NÃO-DESNATURANTES

(PAGE).......................................................................................................24

3.7.2. E

LETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES DESNATURANTES (SDS-

PAGE)...........................................................................................................24

3.8. D

ETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES β-GLUCOSIDÁSICAS NO GEL DE POLIACRILAMIDA............25

3.8.1. H

IDRÓLISE DE SUBSTRATOS PRODUZINDO COMPOSTOS INSOLÚVEIS........................26

3.8.2. F

ATIAMENTO DO GEL DE POLIACRILAMIDA.......................................................26

3.9. D

ETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DAS β-GLUCOSIDASES INTRA E EXTRACELULAR......26

3.10. I

NFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS IÔNICOS SOBRE AS ATIVIDADES β-

GLUCOSIDÁSICAS DE SCYTALIDIUM THERMOPHILUM.......................................................27

3.11. D

ETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS.....................................................27

3.12. F

OCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA...........................................................................27

3.13. D

ETERMINAÇÃO DOS CARBOIDRATOS NEUTROS....................................................28

3.14. C

ROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE SÍLICA................................................28

3.15. I

MUNOENSAIO CONTRA A β-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR PURIFICADA.........................28

3.15.1. I

MUNIZAÇÃO.......................................................................................28

3.15.2.T

ESTE ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)...................................29

3.16. L

OCALIZAÇÃO SUBCELULAR POR IMUNOMICROSCOPIA.............................................30

4.-RESULTADOS..............................................................................................32

4.1. E

STUDO DAS CONDIÇÕES MAIS FAVORÁVEIS E DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES β-

GLUCOSIDÁSICAS DE SCYTALIDIUM THERMOPHILUM.......................................................32

4.1.1. C

URVA DE CRESCIMENTO DO SCYTALIDIUM VERSUS PRODUÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES...32

4.1.2. INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO NA PRODUÇÃO E EXPORTAÇÃO DAS β-

GLUCOSIDASES...............................................................................................35

4.1.3. E

FEITO REPRESSOR DA GLICOSE NA PRODUÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES DO SCYTALIDIUM

THERMOPHILUM

...............................................................................................39

4.1.4. EFEITO DA CICLO-HEXIMIDA NA PRODUÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES..........................43

4.1.5. A

NÁLISE CROMATOGRÁFICA POR TROCA IÔNICA DAS β-GLUCOSIDASES.....................45

4.2. LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DAS β-GLUCOSIDASES DE SCYTALIDIUM THERMOPHILUM..........47

4.3. P

URIFICAÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES DE SCYTALIDIUM THERMOPHILUM...........................49

4.3.1. PURIFICAÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES EXTRACELULARES........................................49

4.3.1.1. PURIFICAÇÃO DA β-GLUCOSIDASE I EXTRACELULAR.........................................50

4.3.1.2. P

URIFICAÇÃO DA β-GLUCOSIDASE II EXTRACELULAR........................................50

4.3.1.3. A

NÁLISE ELETROFORÉTICA DAS ENZIMAS PURIFICADAS....................................51

4.3.1.3.1. β-G

LUCOSIDASE I.............................................................................51

4.3.1.3.2. β-G

LUCOSIDASE II............................................................................51

4.3.2. P

URIFICAÇÃO DA β-GLUCOSIDASE MICELIAL....................................................60

4.3.2.1. A

NÁLISE ELETROFORÉTICA DA β-GLUCOSIDASE MICELIAL PURIFICADA...................64

4.3.2.2. ESTIMATIVA DA MASSA MOLECULAR...........................................................64

4.4. C

ARACTERIZAÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS...........................................67

4.4.1. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E PH NA ATIVIDADE DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS DE

SCYTALIDIUM THERMOPHILUM..............................................................................67

4.4.2. E

STABILIDADE TÉRMICA DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS......................................68

4.4.3. EFEITO DE ÍONS E EDTA SOBRE A ATIVIDADE DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS.......72

4.4.4. ESPECIFICIDADE AO SUBSTRATO DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS......................72

4.4.5. E

FEITO DE ÁLCOOIS NA ATIVIDADE DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS....................76

4.4.6. EFEITO DE AÇÚCARES NA ATIVIDADE DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS..................76

4.4.7. E

FEITO DA GLICOSE, XILOSE E CELOBIOSE NA ATIVIDADE DAS β-GLUCOSIDASES

PURIFICADAS

..................................................................................................79

4.4.8. D

ETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCAR DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS.................84

4.4.9. F

OCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS............................84

4.4.9. PARÂMETROS CINÉTICOS..........................................................................86

4.4.10. C

ONSTANTES DE INIBIÇÃO DAS ENZIMAS (PLOT DE DIXON)............................... 87

4.4.11.

ESTUDO DA β-GLUCOSIDASE MICELIAL PURIFICADA FRENTE AOS SUBSTRATOS PNP-GLU E

PNP-FUC......................................................................................................87

4.5. E

STUDO DAS β-GLUCOSIDASES COMO TRANSGLUCOSIDASES....................................92

4.5.1. A

NÁLISE DOS PRODUTOS DE HIDRÓLISE DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS..............92

5. DISCUSSÃO................................................................................................98

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................110

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1

Sinergismo entre endoglucanases, celobiohidrolases e β-

lucosidases no sistema celulásico de fun

filamentosos............................................................................

Figura 2 Fotos em microscopia eletrônica de varredura do Scytalidium

thermophilum.........................................................................

Figura 3

Influência do tempo de crescimento na produção das β-

glucosidases micelial e extracelular ............................................

Figura 4 Influência da concentra

ão de avicel e celobiose na produ

ão das

β-glucosidases micelial e extracelular de Scytaldium

thermophilum..........................................................................

Figura 5

Perfil da eluição das β-glucosidases de Scytalidium thermophilum

em DEAE-celulose....................................................................

Figura 6

Perfil cromatográfico da atividade β-

lucosidase extracelular

precipitada com NH

(SO

)

e aplicada

em coluna de troca iônica

DEAE-celulose ........................................................................

Figura 7

Organograma do processo de purificação das β-

lucosidases

extracelulares de Scytalidium thermophilum................................

Figura 8

Perfil cromatográfico da atividade da β-glucosidase I (pico I DEAE-

celulose) extracelular em coluna de troca iônica CM-

celulose.....................................................

Figura 9

Perfil cromatográfico da atividade β-glucosidase II (pico II DEAE-

celulose) extracelular de Scytalidium thermophilum em coluna

filtração Sephadex G-100..........................................................

Figura 10

Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida das β-

lucosidases

extracelulares produzidas pelo Scytalidium thermophilum..............

Figura 11

Perfil eletroforético em SDS-PAGE 15% das β-

lucosidases

extracelulares produzidas pelo Scytalidium thermophilum..............

Figura 12

Determinação da massa molecular das β-

lucosidase extracelular I

e II por cromatografia de filtração Sephadex G-100.....................

Figura 13

Perfil cromatográfico da atividade β-

lucosidásica micelial

precipitada com NH

(SO

)

e aplicada em coluna de filtra

ão

Sephadex G-100 .....................................................................

Figura 14

Perfil cromatográfico da atividade β-

lucosidásica micelial em

coluna de troca iônica DEAE-

celulose..................................................................................

Figura 15

Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida da β-

lucosidase

micelial produzida pelo Scytalidium thermophilum.......................

Figura 16

Determinação da massa molecular das β-

lucosidase micelial por

cromatografia de filtração Sephadex G-100................................

Figura 17

Efeito da temperatura nas atividades das β-

lucosidases

purificadas de Scytalidium thermophilum....................................

Figura 18

Efeito do pH nas atividades das β-

lucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum........................................................

Figura 19

Estabilidade térmica das β-

lucosidases purificadas de

Scytalidium

thermophilum.............................................................

................

Figura 20

Efeito da glicose e xilose nas atividades das β-

lucosidases

purificadas de Scytalidium thermophilum.....................................

Figura 21

Efeito da celobiose nas atividades das β-glucosidases purificadas

de Scytalidium thermophilum....................................................

Figura 22

Efeito da xilose na atividade celobiásica das β-

lucosidases

purificadas de Scytalidium thermophilum....................................

Figura 23

Focalização Isoelétrica das β-glucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum........................................................

Figura 24

Determinação dos parâmetros cinéticos (K

máx

) da β-

lucosidase

extracelular I purificada.............................................................

Figura 25

Cinética da atividade β-

lucosidásica micelial para os substratos

PNP-glu e PNP-fuc ...................................

Figura 26

Análise dos produtos de hidrólise e transglicosilação da β-

glucosidase extracelular I purificada em TLC.............

Figura 27

Análise dos produtos de hidrólise e transglicosilação da β-

glucosidase micelial purificada em TLC.......................................

Figura 28

Análise dos produtos de hidrólise e transglicosilação da β-

glucosidase micelial purificada em TLC na presença de PNP-

lu e

xilose....................................................................................

Figura 29 Localização subcelular por imunofluorescência do Scytalidium

thermophilum.........................................................................

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1

Influência das diferentes fontes de carbono na produção das β-

glucosidases de Scytaldium thermophilum...................................

Tabela 2

Influência da

licose associada a diferentes fontes de carbono na

produção da β-glucosidase micelial de Scytalidium

thermophilum..........................................................................

Tabela 3

Influência de diferentes fontes de carbono na produ

ão e

exportação da β-glucosidase micelial de Scytalidium thermophilum

pré-crescido em meio M

suplementado com

licose

1%........................................................................................

Tabela 4

Efeito da adição de ciclo-heximida aos meios de reincuba

ão na

produção da β-glucosidase micelial de Scytalidium

thermophilum..........................................................................

Tabela 5

Localização subcelular da β-glucosidase em células de Scytalidium

thermophilum crescidas em

licose como fonte de

carbono..................................................................................

Tabela 6

Localização subcelular da β-glucosidase em células de Scytalidium

thermophilum crescidas em avicel como fonte de

carbono..................................................................................

Tabela 7

Purificação das β-glucosidases extracelulares de Scytalidium

thermophilum.........................................................................

Tabela 8

Purificação da β-glucosidase micelial de Scytalidium

thermophilum..........................................................................

Tabela 9

Efeito de íons metais nas β-glucosidases purificadas de Scytalidium

thermophilum..........................................................................

Tabela 10

Especificidade ao substrato das β-

lucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum.........................................................

Tabela 11

Efeito “in vitro” de álcoois nas atividades das β-

lucosidases

purificadas de Scytalidium thermophilum....................................

Tabela 12

Efeito “in vitro” de açúcares nas atividades das β-

lucosidases

purificadas de Scytalidium thermophilum..

Tabela 13

Determinação dos parâmetros cinéticos (K

e V

máx

) da β-

glucosidase extracelular I purificada.........................

Tabela 14

Parâmetros cinéticos da β-

lucosidase micelial purificada de

Scytalidium thermophilum......................................

LISTA DE ABREVIATURAS

Abs Absorbância

AE Atividade Específica

CMC Carboximetilcelulose

DEAE Dietilaminoetil

DNS Ácido- 3,5-dinitrosalicílico

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

GOD Glicose oxidase

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IgG Imunoglobulina G

kDa Kilo dalton

Ki Constante de Inibição

Constante de Michaelis Menten

0,5

Constante de afinidade aparente

OPD o-fenilenediamino diidroclorito

PAGE Gel de poliacrilmaida

PBS Solução tampão fosfato salina

PMSF Fluoreto de fenil metil sulfônico

PNP p-nitrofenol

q.s.p. Quantidade suficiente para

rpm Rotações por minuto

SDS Dodecil sulfato de sódio

Temed N,N,N’,N’- tetrametiletilenodiamina

Tris Tris-(hidroximetil)aminometano

V Volts

máx

Velocidade Máxima

V/v Volume por volume

UNIDADES

°C Grau Celcius

cm Centímetro

g Grama

mA Miliampére

mg Miligrama

ml Mililitro

min Minuto

mm Milímetro

M Molar

mM Milomolar

mU Miliunidade

ηmoles

Nanomoles

ηgrama

Nanograma

μg

Micrograma

μmoles

Micromoles

μL

Microlitro

nm Nanômetro

U Unidade de Atividade enzimática

RESUMO

A celulose é a mais abundante fonte de carbono presente na madeira e nos resíduos

agrícolas, e a sua hidrólise completa é realizada pela ação sinergística de diferentes

enzimas, como: as endo-1,4-β-D-glucanase, exo-1,4-β-glucanase e β-glucosidase ou

celobiase. O presente trabalho descreve algumas propriedades fisiológicas e

bioquímicas do sistema β-glucosidásico do fungo termofílico Scytalidium thermophilum.

Tal fungo foi isolado originalmente do solo da Índia e gentilmente cedido pelo Dr. G.

Straastma (Holanda). O meio M

favoreceu a produção das β-glucosidases. Entre os

açúcares testados como fonte de carbono, avicel e celobiose foram os melhores

indutores das β-glucosidases extracelular e micelial. Quando o fungo foi crescido em

dois estágios, observou-se inicialmente a repressão da síntese por glicose e a indução

por avicel ou celobiose. Utilizando-se ciclo-heximida, observou-se a síntese “de novo”

das proteínas. A

β-glucosidase extracelular foi purificada utilizando-se um

fracionamento protéico e uma coluna de troca-iônica DEAE-celulose, de onde foram

obtidos duas atividades enzimáticas denominadas

β-glucosidases I e II. A β-glucosidase

I foi aplicada em coluna de troca iônica CM-celulose, enquanto que a

β-glucosidase II

foi aplicada em Sephadex G-100. A

β-glucosidase I foi purificada 2 vezes com 4.0% de

recuperação, ao passo que a

β-glucosidase II foi purificada 2,4 vezes com 2.0% de

recuperação. A

β-glucosidase micelial foi purificada utilizando-se um choque térmico,

fracionamento protéico, coluna de filtração Sephadex G-100 e uma coluna troca-iônica

DEAE-celulose. Foi purificada 23 vezes com recuperação de 25%. A

β-glucosidases

extracelular I e micelial apresentaram um temperatura ótima aparente de 70 e 60°C e

um pH de 5.5 e 6.0, respectivamente. Ambas enzimas foram inibidas por Ag

e Hg

β-glucosidases extracelular I e micelial possuem um peso molecular de 40.7 kDa e

39kda (SDS-Page) e 57 kDa e 33,8 kda (Sephadex G-100), respectivamente. A β-

glucosidase extracelular I foi capaz de hidrolisar PNP-glu, PNP-xil, celobiose , xilana e

CMC, enquanto que a

β-glucosidase micelial hidrolisou PNP-glu, PNP-fuc, PNP-xil, PNP-

gal, ONPG e lactose. Ambas enzimas foram ativadas por glicerol a 1M. A β-glucosidase

extracelular I foi ativada por xilose, frutose e lactose, e se mostrou resistente a glicose

50mM, enquanto que a

β-glucosidase micelial foi ativada por glicose e xilose. β-

glucosidases extracelular I e micelial apresentaram um PI de 4.0 e 6.5,

respectivamente. Os parâmetros cinéticos estimados para a

β-glucosidase extracelular I

foram de K

4,33 e 0,342mM e V

máx

de 5,37 e 2,0μmoles/min/mg prot. para celobiose

e PNP-glu, respectivamente. O valor de Ki (Constante de Inibição) foi de 71mM para

glicose. Para a

β-glucosidase micelial, os valores de K

e V

máx

foram de 0,29mM e

13,27μmoles/min/mg prot; 0,5 mM e 7,25μmoles/min/mg prot e 1,61 mM e

4,12μmoles/min/mg prot para os substratos PNP-glu, PNP-fuc e celobiose,

respectivamente. Na presença de glicose e xilose os valores de K

e V

máx

foram de

1,26mM e 40,04 μmoles/min/mg.prot, e 1,33mM, e 30,49 μmoles/min/mg prot,

respectivamente para o PNP-glu. O valor de Ki (Constante de Inibição) foi de 1,32mM

para celobiose. A análise dos produtos de hidrólise das

β-glucosidases extracelular I e

micelial foram anlisadas em TLC, e revelaram que ambas enzimas realizam hidrólise

quando celobiose foi utilizada a 10mM, e transglicosilação quando celobiose foi utilizada

a 250mM. Os resultados aqui apresentados demonstram importante papel importante

do Scytalidium como produtor de β-glucosidase com potencial na sacarificação

enzimática da celulose.

SUMMARY

Cellulose is the most abundant carbon source found in woods and waste residues. In

nature the complete hidrolysis of cellulose occurs by the sinergistic action of several

enzymes such endo-1,4-β-D-glucanase, exo-1,4-β-glucanase e β-glucosidase or

cellobiase. The present work describe some physiological and biochemical properties of

β-glucosidase system from thermophilic fungus Scytalidium thermophilum. The fungus

was gift to Dr. Straastma (Mushroom Experimental Station, The Netherlands). The

culture medium M

enhance the production of β-glucosidase. Among carbohydrates

tested as carbon source, avicel and cellobiose were the best inducers of β-glucosidase

extracellular and mycelial. When the fungus was grown in two stages, observed the

repression by glucose, and induction by avicel or cellobiose. The presence of cyclo-

heximide inhibited the syntesis of β-glucosidase, suggesting that the enzyme produced

in the presence of indutors required “ de novo “ synthesis. Extracellular β-glucosidase

was purified using the precipitation with 75% amonium sulfate, ion exchange

cromatography column DEAE-cellulose, and were obtained two activities: β-glucosidase

extracellular I and II. The β-glucosidase I was applied to a CM-cellulose colunm, while

β-glucosidase II was applied to a Sephadex G-100 colunm. The β-glucosidase II was

purified two times and 4% yield, and the β-glucosidase II was purified 2,4 times and

2% yield. The mycelial β-glucosidase was purified using the termic treatment, a

precipitation with 75% amonium sulfate followed by Sephadex G-100 and DEAE-

cellulose. The enzyme was purified 23 time with 23% yield. The β-glucosidase

extracellular II and mycelial shown optima of temperature and pH of 60°C and 70°C,

4.4 and 6.0, respectively. Hg

and Ag

ions were strong inhibitors of β-glucosidase

extracellular I and mycelial. The molecular weight of β-glucosidase extracellular I and

mycelial was stimated as 40.7 KDa and 39KDa (SDS-PAGE) and 57kDa and 33.8 kDa

(Sephadex G-100). The β-glucosidase extracellular I hydrolyzed PNP-glu, PNP-xyl,

cellobiose,xylan and CMC, while β-glucosidase mycelial hydrolyzed PNP-fuc, PNP-xyl,

PNP-gal, ONPG and lactose. Both enzymes were activeted by glycerol 1M. The β-

glucosidase extracellular I was activeted by xylose, fructose and lactose, and show

strong at glucose 50mM. The β-glucosidase mycelial was activeted by glucose and

xylose. β-glucosidase extracellular I and mycelial shows PI 4.0 and 6.5, respectively.

The kinects studies reveled for β-glucosidase extracellular I a Km of 4,33 and 0,342mM

and Vmáx of 5,37 and 2,0μmoles/min/mg prot for cellobiose and PNP-glu, respectively.

The Ki values obtained from Dixon plots was 71mM for glucose. To β-glucosidase

mycelial the Km and and Vmáx were 0,29mM e 13,27μmoles/min/mg prot; 0,5 mM e

7,25μmoles/min/mg prot and 1,61 mM and 4,12μmoles/min/mg prot for PNP-glu, PNP-

fuc and cellobiose, respectively. Using xylose or glucose the Km and Vmáx was

1,26mM e 40,04 μmoles/min/mg.prot, and 1,33mM, e 30,49 μmoles/min/mg prot,

respectively for PNP-glu. The Ki values obtained from Dixon plots was 1,32mM using

cellobiose. The products of hydrolisis of cellobiose by the action of purified enzymes

glucosidase extracellular I and mycelial were analised in thin-layer-cromatography, and

show hydrolisis of cellobiose at 10mM,and transglycosilation reaction when cellobiose

was using at 250mM. The intrinsic biochemical and regulatory properties the β-

glucosidase system of Scytalidium support the idea that organism may be useful for

biotechnological applications.

2- OBJETIVOS

O objetivo deste trabalho está centrado no estudo fisiológico e bioquímico das β-

glucosidases (extracelular e micelial) produzidas pelo fungo termofílico Scytalidium

thermophilum, visando demonstrar que a eficiência celulolítica do organismo estaria

estritamente relacionada com as propriedades diferenciais destas enzimas. Para isso as

enzimas foram purificadas e caracterizadas em suas propriedades físico-químicas e

cinéticas. Algumas metas foram seguidas na tentativa de atingirmos o objetivo do

trabalho:

1. Estudar a produção das β-glucosidases pelo Scytalidium thermophilum

2. Purificar e caracterizar cineticamente as maiores frações com atividade β-

glucosidásica

3. Caracterizar as propriedades físico-químicas das enzimas na tentativa de explicar as

diferenças bioquímicas por ela exibidas.

4. Verificar nas β-glucosidases do Scytalidium atividade de transglicosilação, já que

essas enzimas são conhecidas por catalisarem além das reações de hidrólise, as

reações de transferência.

5. Produção de anticorpos da β-glucosidase extracelular I

6.Determinação da localização subcelular da β-glucosidase extracelular I por

imunofluorescência

3- MATERIAL E MÉTODOS

3.1. LINHAGEM UTILIZADA

Para a realização deste trabalho foi utilizado o Scytalidium thermophilum

linhagem 77.7.8, isolado do solo da Índia e gentilmente cedido pelo Dr. G. Straastma

do “Mushroom Experimental Station” (Holanda).

3.2. C

ONDIÇÕES DE CRESCIMENTO

3.2.1. MANUTENÇÃO DA LINHAGEM EM MEIO SÓLIDO

A linhagem foi mantida em laboratório em tubos de ensaio contendo 5 ml de

meio sólido, composto por 4% de farinha de aveia Quaker e 1,8% de ágar (Peralta et

al, 1990). Após a esterilização, os meios de cultura foram solidificados de forma

inclinada. Os inóculos foram feitos utilizando uma alça de platina e as culturas mantidas

a 40° C por 7 dias e posteriormente conservadas em geladeira, sendo utilizadas até 30

dias de estocagem. Os conídios formados foram colhidos por suspensão aquosa,

acrescentando-se 10ml de água destilada estéril em cada tubo estoque, raspando-se a

superfície da cultura com a alça de platina. Nessas condições, 1 ml dessa suspensão,

contendo aproximadamente 10

a 10

esporos, foi utilizado para inóculo em meio

líquido.

3.2.2. C

OMPOSIÇÃO DO MEIO LÍQUIDO

O cultivo foi realizado em frascos de Erlenmeyers com capacidade cinco vezes

maior que o do volume de meio. O meio utilizado foi o Czapek modificado, denominado

de M8, cuja composição está descrita abaixo:

NaNO3............................................ 0,2%

KH2PO4.......................................... 0,1%

KCl................................................. 0,1%

MgSO4.7H2O................................... 0,05%

FeSO4.7H2O.................................... 0,01%

ZnSO4.7H2O.................................... 0,03%

Extrato de levedura........................... 0,8%

O meio foi preparado com água destilada, o pH acertado para 6.0 e autoclavado

a 127°C e 1,5 atm por 30 minutos.

3.3. C

RESCIMENTO EM MEIO LÍQUIDO

O fungo foi então inoculado no meio de cultivo M8, com agitação constante de

100rpm com as fontes de carbono desejadas a 1%, por tempos variados conforme

indicado para cada experimento.

O crescimento foi realizado de duas formas distintas: no primeiro o fungo foi

crescido em um único estágio, onde os esporos foram adicionados ao meio para

obtenção do micélio, ou em um sistema de dois estágios, onde o fungo cresce em

condições de repressão por glicose a 1% e posteriormente os micélios são lavados

assepticamente com água bidestilada e transferidos para um novo meio de cultura com

a fonte de carbono adequada.

3.4. O

BTENÇÃO DA MASSA MICELIAL E DO MEIO DE CULTURA

A massa micelial crescida nas condições descritas anteriormente foi separada do

meio de cultivo por filtração à vácuo utilizando funil de Büchener e papel de filtro

Whatman n°1. Essa massa obtida foi então lavada com 2 volumes de água destilada e

prensada entre folhas de papel de filtro para retirar o máximo possível de água

embebida. Posteriormente, o micélio foi mantido à baixa temperatura (-12°C) para

posterior utilização. Depois de congelado, o micélio foi macerado com 2 volumes de

areia lavada no ácido, em um cadinho de porcelana até a ruptura total das células. O

macerado foi ressuspenso em determinado volume de água destilada, suficiente para

obter-se uma suspensão não muito viscosa. A areia e restos de células foram

removidos por centrifugação a 10.000rpm a 4°C por 15 minutos. O sobrenadante dessa

centrifugação foi denominado extrato bruto e utilizado como fonte de enzima

intracelular. O meio de cultura que continha a enzima extracelular solúvel também foi

conservado à baixa temperatura até sua utilização.

3.5. D

ETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

3.5.1. D

ETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

-GLUCOSIDASE

A atividade β-glucosidásica foi detectada através do método descontínuo

utilizando-se o substrato sintético p-nitro-fenil-β-D-glucopiranosídeo. A mistura da

reação foi constituída de 0,4 ml do substrato (2mg/ml) dissolvido em tampão McIlvaine

(1921) pH 5.0 e 0,1 ml da enzima convenientemente diluída. A mistura foi incubada a

60°C por um tempo máximo de 60 minutos e a reação bloqueada pela adição de 1 ml

de tetraborato de sódio saturado. Controles sem adição da enzima (brancos) foram

incluídos em cada experimento, determinando-se assim a hidrólise espontânea do PNP-

glu nas condições de ensaio. A concentração do p-nitrofenol liberado foi estimada

espectofotometricamente em A410nm. A unidade (U) foi definida como a quantidade de

enzima necessária para hidrolisar 1 nanomol do substrato por minuto de reação

(ηmoles/min/mL), nas condições de ensaio. A atividade específica (AE) foi definida

como número de unidades enzimáticas totais por miligrama de proteína total (U/mg

proteína).

3.5.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

-GALACTOSIDASE E

-XILOSIDASE

As atividades β-galactosidásica e β-xilosidásica foram estimadas através do uso

dos substratos sintéticos PNP-Gal (p-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo) e PNP-xil (p-

nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo), repectivamente. Os substratos foram diluídos em

tampão McIlvaine pH 5.0. Os demais passos foram idênticos aos descritos no item

anterior para a β-glucosidase.

3.5.3. D

OSAGEM DE CELOBIASE E LACTASE

A atividade de celobiase e lactase foi quantificada pela glicose liberada durante a

hidrólise dos respectivos substratos. A mistura continha 100μl da enzima e 100μl de

substrato 100mM em tampão McIlvaine pH 5.0. A mistura foi incubada a 70°C por um

período de até 30 minutos e interrompida em banho de água fervente por 3 minutos. A

glicose formada foi determinada pelo Método da glicose-oxidase (Bergmeyer & Bernt,

1974) utilizando o kit Labtest. A leitura foi feita em absorbância 550nm. Uma unidade

de enzima foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 micromol de

glicose por minuto de reação (μmoles/min/mL), nas condições de ensaio. A atividade

específica (AE) foi definida como número de unidades enzimáticas totais por miligrama

de proteína total (U/mg proteína).

3.5.4. D

OSAGEM DE XILANASE, AVICELASE E CMCASE

A atividade das enzimas foi medida pela liberação do açúcar redutor, pelo

método de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).

A mistura da reação foi constituída de 2,5 mL de solução de xilana, avicel e

CMCelulose 10mg/mL em tampão McIlvaine pH 5.0 e 2,5 mL da enzima,

convenientemente diluída. Após a incubação a 60°C, nos tempos desejados, alíquotas

de 1 mL eram retiradas e adicionadas a 1mL de DNS para interromper a reação. A

mistura foi aquecida em banho de água fervente, por 5 minutos e diluída em 10 mL de

água destilada. A leitura foi feita em absorbância 540nm. A quantidade de açúcar

redutor liberado foi estimado através de uma curva padrão. Uma unidade de enzima foi

definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 micromol de glicose por

minuto de reação (μmoles/min/mL), nas condições de ensaio.

3.5. D

OSAGEM PROTÉICA

3.5.1. D

OSAGEM COLORIMÉTRICA

As proteínas foram estimadas pelo Método de Lowry (Lowry et al., 1951)

utilizando-se soroalbumina bovina como padrão.

3.5.2. D

OSAGEM ESPECTROFOTOMÉTRICA (A280nm)

A proteína nos tubos coletados das colunas de cromatografia foi estimada a

A280nm utilizando-se o espectrofotômetro Du-7 da Beckman.

3.6. P

URIFICAÇÃO DAS ENZIMAS

3.6.1. P

URIFICAÇÃO DA

-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR

O fungo foi cultivado em Meio M8 tendo avicel 1% como fonte de carbono por 96

horas a 40°C sob agitação para obtenção da β-glucosidase extracelular. O filtrado do

meio de cultura (aproximadamente 800ml) foi dialisado contra água por 24 horas a 4°C

e em seguida liofilizado. A amostra liofilizada foi dissolvida em água e precipitada com

fracionamento protéico de 75% de sulfato de amônio “overnight”. Posteriormente

amostra foi centrifugada 20 minutos a 10.000 rpm e o precipitado obtido dialisado

contra água e em seguida contra tampão fosfato de sódio monobásico 100mM pH 6.8.

A fração foi aplicada em coluna de troca iônica DEAE- celulose ( 14cm x 1.8cm ), pré-

equilibrada com o mesmo tampão e eluída com gradiente de NaCl. Frações de 5ml

foram coletadas por tubo, sendo estas submetidas à leitura de proteína a A280nm e a

atividade de β-glucosidase.

Dessa coluna foram obtidas 2 frações de atividade β-glucosidásica, uma que não

é retida na coluna de troca iônica denominada β-glucosidase I, e outra que é eluída com

gradiente de NaCl, denominada β-glucosidase II.

3.6.1.1. P

URIFICAÇÃO DA

-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR I (PICO I DEAE-CELULOSE)

As frações que não interagiram na DEAE-celulose e que continham alta atividade

enzimática foram reunidas, dialisadas novamente contra tampão acetato de sódio

20mM pH 5.0 e aplicado em coluna de troca iônica CM-celulose ( 14 x 1.8 cm ) pré-

equilibrada com o mesmo tampão e eluída com o gradiente de NaCl( 0-0,5M ). Nas

frações obtidas foram dosadas a atividade de β-glucosidase e acompanhadas com

leituras em A280nm, e as frações que continham altas atividades enzimáticas foram

reunidas dialisadas contra água e concentradas por liofilização. O material concentrado

foi dissolvido em água destilada e conservado em congelador a –12°C. A pureza da

amostra foi analisada em gel de poliacrilamida (PAGE).

3.6.1.2. P

URIFICAÇÃO DA

-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR II (PICO II DEAE-CELULOSE)

As frações obtidas a partir da eluição com o gradiente de NaCl da DEAE-celulose

foram reunidas, dialisadas contra água, e em seguida liofilizadas. Posteriormente, o

material foi dissolvido em 4ml de tampão fosfato de sódio monobásico 100mM pH 6.0

mais 100mM de NaCl e aplicados em coluna de filtração Sephadex G-100 ( 87cm X 2cm

) pré-equilibrada com o mesmo tampão. Foram coletadas frações de 1,5 ml por tubo

nas quais foram determinadas atividade de β-glucosidase acompanhadas de leitura de

proteínas a A280nm. As frações que continham alta atividade β-glucosidásica foram

reunidas e concentradas por liofilização. O material concentrado foi dissolvido em água

destilada e conservado em congelador a –12°C.

3.6.2. PURIFICAÇÃO DA

-GLUCOSIDASE INTRACELULAR

O fungo foi cultivado em meio M8, tendo avicel 1% como fonte de carbono, por

48 horas a 40°C, com agitação constante para a obtenção da β-glucosidase intracelular.

O micélio foi macerado com areia na presença de PMSF 2mM e centrifugado como já

descrito no item 3.4. O sobrenadante obtido foi deixado 20 minutos a 50°C e em

seguida em banho de gelo (choque térmico) e centrifugado nas mesmas condições

descritas anteriormente. O sobrenadante foi precipitado com 75% de sulfato de amônio

“overnight”, e novamente centrifugado. O precipitado obtido foi ressuspendido em um

pequeno volume de tampão fosfato de sódio monobásico 100 mM pH 6.0 e 100mM de

NaCl e dialisado contra o mesmo tampão. A amostra foi aplicada em coluna de filtração

Sephadex G-100 ( 87 x 2cm ), pré-equilibrada com o mesmo tampão. A eluição foi

efetuada com o mesmo tampão, coletando-se 1,5 ml por tubo com um fluxo de

20mL/hora. Nas frações obtidas foram dosadas a atividade enzimática, seguidas de

leitura a A280nm.

As frações eluídas na Sephadex G-100, como descrito na etapa anterior, com

atividade β-glucosidásica foram reunidas, dialisadas contra tampão fosfato de sódio

100mM pH 6.8 “overnight” a 4°C, e aplicado em coluna troca iônica DEAE-celulose

equilibrada com o mesmo tampão. As proteínas retidas na coluna foram eluídas com

um gradiente linear de 0 a 1M de cloreto de sódio (NaCl). As frações coletadas foram

dosadas quanto a atividade β-glucosidásicas seguidas de leitura a A280 nm. Assim

como na β-glucosidase extracelular obtivemos dois picos de atividade, uma que não

adere a resina e outra que é eluída com gradiente de NaCl.

As frações com atividade β-glucosidásica que foram eluídas com gradiente de

NaCl ( 0-0,5M NaCl ) foram reunidas, dialisadas contra água “overnight” a 4°C e

liofilizadas. O material foi dissolvido em água destilada e conservado em congelador a –

12°C.

3.7. DETERMINAÇÃO DA PUREZA DAS FRAÇÕES PURIFICADAS

3.7.1. E

LETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES NÃO-DESNATURANTES

(PAGE).

A determinação da pureza das preparações foi feita através de corridas

eletroforéticas em géis de poliacrilamida (PAGE).

3.7.1.1. PAGE PARA PROTEÍNAS BÁSICAS

As eletroforeses em condições não-desnaturantes foram realizadas em gel

poliacrilamida conforme metodologia básica de Reisfeld (1962), para proteínas básicas.

O gel numa concentração de 6% de acrilamida foi polimerizado em placas de

vidro ( 9,5 x 8,0cm ). As amostras a serem analisadas eletroforeticamente foram

diluídas em tampão de amostra (tampão de corrida diluído 1:10), pH 4,5, verde de

metila 0,002% e glicerol 10%.

As eletroforeses foram realizadas em tampão de corrida, pH 4,5 (constituído de

3,12g de β-alanina e 0,8ml de ácido acético glacial em 1000ml de água destilada)

durante 4-5 horas, a temperatura ambiente. A corrente aplicada foi de 70mA e uma

voltagem constante de 120V, mantida até o final da corrida eletroforética.

O gel foi corado com Comassie Blue R-250 para coloração de proteínas.

3.7.1.2. PAGE

PARA PROTEÍNAS ÁCIDAS

As eletroforeses não-desnaturantes foram realizadas em gel de poliacrilamida

conforme metodologia básica de Davis (1964), para proteínas ácidas.

O gel em uma concentração de 8% de acrilamida foi polimerizado em tubos ( 0,6

x 8.0 cm ). As amostras a serem analizadas eletroforeticamente foram diluídas em

Tampão de Amostra (Tris-Base 0,065M, Azul de Bromofenol 0,002%; Glicerol 10%), pH

6.8.

As eletroforeses foram realizadas em Tampão de corrida pH 8.9 (constituído de

Tris 50mM e Glicina 36mM) durante 4-5 horas, a temperatura ambiente. A corrente

aplicada foi de 5mA por tubo mantida até o final da corrida eletroforética.

Os géis foram retirados e a revelação das proteínas foi feita com Comassie Blue

R-250 (Sigma).

3.7.2. E

LETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES DESNATURANTES (SDS-

PAGE)

A fim de se confirmar os dados obtidos através da eletroforese em gel de

poliacrilamida em condições não-desnaturantes (PAGE), também foram realizadas

eletroforeses em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE),

segundo metodologia de Laemmli (1970).

Foram utilizados géis em placa ( 9,5 cm x 8,0cm ) na concentração de 15% de

acrilamida. As amostras foram diluídas 1:1 em tampão de amostra (glicerol 10%, SDS

7%, azul de bromofenol 0,002%, β-mercaptoetanol 10% e Trizma 0,12M pH 6,75) e

aquecidas durante 5 minutos em água fervente. A eletroforese foi realizada a

temperatura ambiente na presença de Tampão Trisma 0,025M, Glicina 0,19M e SDS

0,1%, pH 8,3. Utilizou-se uma corrente de 70mA/placa e uma voltagem constante de

120V/placa.

Os géis foram retirados da placa e a revelação das proteínas foi feita com

Comassie Blue R-250 (Sigma).

3.8. D

ETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES

-GLUCOSIDÁSICAS NO GEL DE POLIACRILAMIDA

Os géis de poliacrilamida submetidos a eletroforese foram testados quanto a

presença de atividade β-glucosidase e comparados com géis corados para proteínas

com Comassie-Blue por dois métodos:

3.8.1. HIDRÓLISE DE SUBSTRATOS PRODUZINDO COMPOSTOS INSOLÚVEIS

Para detecção da atividade da β-glucosidase II, foi feito um gel de poliacrilamida

para proteínas ácidas, como descrito no item 3.7.1.2. Após a corrida, o gel foi lavado

com 25% de ácido isopropílico em tampão Mc. Ilvaine pH 5.0 por 30 minutos e três

vezes com o mesmo tampão (20 minutos cada vez).

Após esse tratamento, o gel foi mergulhado numa solução de 6-bromo-naftil-β-

D-glucopiranosídeo em tampão McIlvaine (1921) pH 5.0, com 0,07mg/ml de Fast Blue

B. Em seguida o gel foi incubado a 50°C por aproximadamente 1 hora, até o

aparecimento da banda de atividade.

3.8.2. F

ATIAMENTO DO GEL DE POLIACRILAMIDA

Para detecção da atividade da β-glucosidase extracelular II e β-glucosidase

intracelular, foram feitos géis em duplicatas (PAGE). Após a corrida um gel foi corado

para proteínas com Comassie Blue e o outro era picotado em fatias de 25mm,

macerados com o auxílio de um bastão de vidro e incubado com o substrato PNP-glu

(2m

/mL, dissolvido em tampão McIlvaine

pH 5.5) por uma hora, e a reação bloqueada com 1ml de tetraborato de sódio saturado.

A leitura feita em A410nm.

3.9. D

ETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR DAS

-GLUCOSIDASES INTRA E EXTRACELULAR

As massas moleculares das β-glucosidases purificadas foram estimadas através

de filtração em gel, utilizando-se uma coluna Sephadex G-100 ( 87 x 2,0cm ),

equilibrada com tampão fosfato de sódio monobásico 100mM pH 6.0 e NaCl 100mM. A

cromatografia foi desenvolvida com um fluxo de 20 mL/h, coletando-se 1,5 mL por

tubo. Os padrões utilizados foram: álcool desidrogenase (150kDa), soroalbumina

(66kDa), anidrase carbônica (29kDa) e citocromo C (12,5kDa).

As massas moleculares das β-glucosidases foram estimadas através da

construção de um gráfico que continha na ordenada a massa molecular dos padrões, e

na abscissa a razão Ve/Vo (onde Ve= volume de eluição da coluna e Vo=”void”). O

valor de Ve de cada amostra foi considerado como sendo a somatória dos volumes das

frações coletadas desde a aplicação da amostra até a fração onde registrava-se maior

leitura em A280nm.

3.10. I

NFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS IÔNICOS SOBRE AS ATIVIDADES

GLUCOSIDÁSICAS DE SCYTALIDIUM THERMOPHILUM.

As atividades β-glucosidásicas extra e intracelulares foram ensaiadas na

presença e ausência de diferentes compostos iônicos. Foi utilizada concentração de 1 e

5mM para cada íons testado. Os ensaios foram realizados em condições ótimas de pH e

temperatura.

3.11. D

ETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS

Amostras enzimáticas extra e intracelulares purificadas foram utilizadas para a

determinação de parâmetros cinéticos utilizando-se PNP-glu, PNP-fuc e celobiose como

substratos. O cálculo das constantes cinéticas foi feito utilizando-se o Programa

Computacional Sigraf (Leone et al, 1992).

3.12. F

OCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA

A determinação do PI foi feita utilizando-se a metodologia básica de O’ Farrel et

al (1983), utilizando-se anfólitos (Pharmalyte) de pH 3-10. A concentração final do gel

foi de 6% e a focagem a 500V, durante 5 horas a temperatura ambiente. Após a

corrida, o gel foi fragmentado em fatias de 0,5 cm de espessura, as fatias deixadas por

uma noite em solução de KCl 25mM. Posteriormente, o pH foi determinado em

potenciômetro, construindo-se a curva do gradiente. O gel duplicata contendo a

amostra foi corado para proteínas com Comassie Blue R-250.

3.13. D

ETERMINAÇÃO DOS CARBOIDRATOS NEUTROS

O conteúdo de carboidrato das β-glucosidases purificadas foi estimada através da

metodologia do fenol-sulfúrico de Dubbois et al (1956), utilizando-se glicose como

padrão. Alíquotas da enzima pura contendo aproximadamente 20μg de proteína foram

diluídas a um volume de 2ml com água destilada. Em seguida, 50 μl de fenol 80% foi

adicionado e logo após 5.0 ml de ácido sulfúrico concentrado. Essa mistura foi deixada

em repouso por 10 minutos a temperatura ambiente. Após esse período, foi feita a

leitura de absorbância a 490nm. Procedimento idêntico foi conduzido com solução

padrão de glicose.

3.14. C

ROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE SÍLICA

O produto de hidrólise da celobiose pela ação das β-glucosidases purificadas, foi

analisado em camada delgada de sílica (TLC) usando a Sílica Gel 60 da Merk. O sistema

de solvente utilizado foi butanol: piridina: água (6:4:3) por volume. A revelação foi

feita com orcinol 0,2% em ácido sulfúrico: metanol (1:9) e deixado a 100°C por

aproximadamente 5 minutos.

3.15. I

MUNOENSAIO CONTRA A

-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR PURIFICADA

3.15.1. IMUNIZAÇÃO

Coelhos New Zealand foram imunizados por aplicações de injeções subcutâneas

(0,7ml) no dorso de cada animal contendo a β-glucosidase purificada diluída na

proporção de 1:1 com os Adjuvantes utilizados ou com salina 0,9%. A imunização

seguiu três etapas: na primeira utilizou-se Adjuvante de Freud Completo. Após 21 dias,

realizou-se a segunda aplicação com o Adjuvante de Freud Incompleto. Passados 21

dias, a terceira aplicação foi realizada com solução salina 0,9%. Em todas as etapas

foram utilizadas aproximadamente 300 μg/ml de proteína. Após 7 dias da última

aplicação o sangue foi coletado mediante punção cardíaca, sendo mantida a 4°C por 1

hora. O soro foi recolhido sem centrifugação e utilizado para a purificação da fração de

IgG.

Primeiramente, 17ml de soro foi mantido a 56°C por 30 minutos. Após esse

período o soro foi precipitado por adição de 8,5ml de uma solução de sulfato de amônio

saturado, deixado “overnight” a 4°C e centrifugado a 3000g por 10 minutos. O

precipitado foi ressuspenso com 8,5ml de sulfato de amônio 40% (p/v) e novamente

centrifugado nas mesmas condições descritas acima. O precipitado foi então dissolvido

em 8,5ml de salina 0,9% (p/v) mais tampão fosfato de sódio 0,02M, pH 7,5, dialisado

por 2 dias contra o mesmo tampão e aplicado em uma coluna de DEAE-celulose,

equilibrada e eluída com tampão fosfato e descrito acima, onde a fração IgG não

interage com a resina. Foi aplicado, então, um gradiente de contínuo de NaCl de 0 a 1M

em tampão fosfato, para a retirada de IgM e demais proteínas adsorvidas. A fração

contendo IgG foi dialisada contra água, liofilizada, ressuspensa em tampão PBS

(composto de NaCl 0,8% (p/v), KCl 0,02% (p/v), Na2HPO4 0,144% (p/v), KH2PO4

0,024% (p/v), pH 7.4) mais 0,1% (p/v) de BSA. Após estes procedimentos a amostra

foi filtrada (filtro Nalgene 0,45μm), e utilizada para a quantificação por teste de ELISA

dos anticorpos anti-β-glucosidase.

3.15.2.T

ESTE ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

Inicialmente, a amostra do antígeno foi quantificada pelo método de Lowry (item

3.5.1) e diluída em tampão carbonato/bicarbonato (Na2CO3 15mM e NaHCO3 35 mM

de água Milli-Q), pH 7.4. A placa de poliestireno de Corning de alta afinidade foi

sensibilizada com o antígeno diluído (máximo 30ng/poço) durante uma noite a 4°C. A

placa foi lavada 5 vezes com PBS mais Tween 20 0,05%, bloqueada com 200μl/poço de

tampão de bloqueio BSA 1% (p/v) em PBS por uma hora a 37°C, e novamente lavada.

A fração de IgG contendo os anticorpos foi diluída seriamente em log de 10 ou

log de 2 em tampão diluente (tampão de bloqueio mais Tween 20 0,05% distribuída

nos poços (100 μl/poço) excluindo-se o branco (poço 1) da reação, mantido a 4°C,

“overnight”. Após esse período a placa foi novamente lavada, e adicionou-se 100

μl/poço da solução de anticorpos conjugados à peroxidase contra imunoglobulinas de

coelhos diluído 1:1000 em tampão diluente por 1 hora, a 37°C. A placa foi novamente

lavada como descrito anteriormente. Em seguida, adicionou-se 100 μl/poço da solução

de substrato OPD (o-fenilenediamino diidroclorito) composto de 10mg do substrato

para 10ml de diluente de OPD. A placa foi coberta com papel alumínio e deixada a

temperatura ambiente de 5 a 15 minutos. A reação enzimática foi interrompida pela

adição de 50 μl/poço de solução de ácido sulfúrico 16% (v/v) e a quantificação dos

anticorpos realizada em leitor de ELISA com filtro de 490 nm.

3.16.

LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR POR IMUNOMICROSCOPIA

Para determinação da localização subcelular da β-glucosidase extracelular no

micélio de Scytalidium thermophilum, o fungo foi crescido em meio M8 suplementado

com avicel 1% por 72 horas, sob agitação constante a 40°C. Após esse período, o

micélio foi lavado com tampão PBS, incluído em “tissue freezing medium 402” e

cortados em cristato, obtendo-se secções de 10μm de espessura, as quais foram

montadas em lâminas de vidro branco gelatinizadas.

As lâminas contendo os cortes foram então lavados inicialmente em tampão PBS

com formaldeído 2% (v/v) durante 15 minutos, e em seguida com apenas PBS (5’).

Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS e glicina 100mM para bloqueios dos

sítios inespecíficos por 5 minutos, e depois em tampão PBS com BSA 1% (p/v) para

bloqueio das proteínas inespecíficas, por 5 minutos. Posteriormente, foram incubadas

com o anticorpo primário anti-β-glucosidase produzido em coelhos New Zealand,

diluídos em tampão PBS na proporção 1:1 por uma hora a temperatura ambiente. Após

a incubação as lâminas foram lavadas extensivamente com tampão PBS (6 vezes de 5

minutos cada), para retirada do excesso dos anticorpos primários e em seguida

incubados na presença de anticorpo secundário goat anti-rabbit IgG (H+L) conjugado

com o fluorocromo Alexa 488 por 30 minutos, a temperatura ambiente, em câmara

úmida, no escuro. Depois da incubação as lâminas foram novamente lavadas em

tampão PBS para a retirada do excesso de anticorpos secundários e montadas em

lamínulas com Fluormount G para observação em microscópio de fluorescência. Os

controles foram feitos sem a presença do anticorpo primário.

4- RESULTADOS

4.3. PURIFICAÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES DE SCYTALIDIUM THERMOPHILUM

Para a possível purificação das enzimas utilizamos o avicel como indutor das β-

glucosidases, já que com esta fonte de carbono obtivemos uma quantidade significativa

de atividade β-glucosidásica. Foi através da cromatografia de troca iônica (DEAE-

celulose) que distinguimos pelo menos 2 frações β-glucosidásicas do Scytalidium, tanto

no filtrado como no micélio. Dessa forma inicialmente purificamos as atividades

extracelulares, denominadas β-glucosidases extracelular I e II, e sequencialmente a β-

glucosidase micelial.

4.3.1. Purificação das

-glucosidases extracelulares

Após ter padronizado as condições ótimas de cultivo para produção das β-

glucosidases em meio M

utilizando-se avicel como fonte de carbono, as enzimas foram

purificadas até sua homogeneidade eletroforética em gel de poliacrilamida (PAGE). Na

Tabela 7 observa-se o resumo dos passos empregados na purificação das β-

glucosidases extracelular.

O processo de purificação foi obtido utilizando-se fracionamento protéico com

75% de sulfato de amônio, uma coluna de troca iônica DEAE-celulose (Figura 6). Dessa

coluna foram obtidos 2 picos de atividades, denominados β-glucosidase I (que não

interagiu com a resina) e β-glucosidase II (eluída com aproximadamente 280 mM de

NaCl). É importante ressaltar que quando inicialmente a amostra foi aplicada em DEAE-

celulose (Figura 6) foi confirmado a hipótese da existência de duas β-glucosidases. O

primeiro pico que não interagiu com a resina corresponde a 44,7% da atividade

recuperada (dados referentes a partir da precipitação com sulfato de amônio) e foi

denominado β-glucosidase I. Na segunda fração denominado β-glucosidase II obteve-se

uma recuperação de 38,5 %.

Um organograma do processo de purificação das enzimas extracelulares é

demonstrado na Figura 7.

4.3.1.1. Purificação da

-glucosidase I extracelular

O pico I da DEAE-celulose (β-glucosidase I) foi aplicada em coluna de troca

iônica CM-celulose, e interagiu fracamente com a resina nas condições utilizadas, sendo

eluída logo após o “void” da coluna (Figura 8). Nesta etapa a enzima foi purificada 2

vezes com um rendimento de 4% e uma atividade específica de 736 ηmoles/mg prot

(Tabela 7). Posteriormente a amostra foi dialisada contra água, liofilizada dissolvida em

água destilada e estocada em pequenas alíquotas a –12°C até o momento do uso.

Armazenada dessa forma a enzima foi estável por mais de 6 meses.

4.3.1.2. Purificação da

-glucosidase II extracelular

Após a β-glucosidase II (pico II DEAE-celulose) ter sido eluída com 280mM de

NaCl foi concentrada e purificada até sua homogeneidade utilizando-se uma coluna de

filtração Sephadex G-100 (Figura 9). Esta Figura mostra ainda que a enzima foi eluída

num pico de atividade logo após o “void” da coluna e distante dos picos majoritários de

proteína. Com esse procedimento a amostra foi purificada 2,4 vezes, com uma

atividade específica de 830 ηmoles/mg prot e uma recuperação de aproximadamente

2%. Assim, como a β-glucosidase I foi dialisada contra água, liofilizada dissolvida em

água destilada e estocada em pequenas alíquotas a –12°C até o momento do uso.

Nestas condições a enzima foi estável por mais de 6 meses.

4.3.1.3. Análise Eletroforética das Enzimas Purificadas

4.3.1.3.1.

-Glucosidase I

A fração purificada apresentou uma única banda em eletroforese em gel de

poliacrilamida 6% pH 4.3 (Figura 10A) e em condições desnaturantes (Figura 11). A

enzima apresentou um peso molecular de 40.7 kDa em SDS-PAGE 15% e de 57 kDa

determinado em coluna de filtração Sephadex G-100 (Figura 12), sugerindo tratar-se

de uma proteína monomérica.

A enzima homogênea foi também aplicada em gel de poliacrilamida que, após

ser submetido a corrida eletroforética foi cortado em frações de 3mm. Estas frações

foram maceradas em tampão Mc Ilaine pH 6.0 e testadas quanto a capacidade de

hidrolisar PNP-glu. Observamos, que o pico de atividade enzimática coincide com a

banda corada com Comassie Blue para proteínas (Figura 10

A).

4.3.1.3.2.

-Glucosidase II

A enzima apresentou uma única banda em PAGE 8.9 7% e SDS-PAGE 15%

(Figuras 10B e 11) e apresentou um peso molecular de 147 kDa quando determinado

em coluna de filtração Sephadex G-100 (Figura 12).

A β-glucosidase II submetida a eletroforese de poliacrilamida 7% pH 8.9, foi

testada quanto a capacidade de hidrolisar o substrato sintético 6-bromo-naftil-β-

glucopiranosídeo. Esse substrato quando hidrolisado pela enzima produz um composto

insolúvel que se deposita no gel de poliacrilamida, possibilitando a visualização e

localização da enzima após corrida eletroforética. A hidrólise do 6-bromo-naftil-β-

glucopiranosídeo produziu uma cor avermelhada, e coincide com a banda corada com

Comassie Blue para proteínas (Figura 10C).

Tabela 7: Purificação das β-glucosidases extracelulares de Scytalidium thermophilum.

Passos de

Purificação

Proteínas

Totais (mg)

Unidades

Totais (U)

Atividade

Específica

(U/mg prot.)

Purificação

(vezes)

Rendimento

(%)

Bruta liofilizada 175 60200 344 1 100

(NH

)

(75%) 27 27936 1032 3 46

DEAE-celulose

(Pico I)

β-glucosidase I

9 12500 1388 4 21

DEAE-celulose

(Pico II)

β-glucosidase II

12 10750 896 3 18

CM-celulose

β-glucosidase I

3 2430 736 2 4.0

Sephadex G-100

β-glucosidase II

1,28 1062 830 2,4 2

Condições: O fungo foi crescido em meio M

com 1% de avicel por um período de 96

horas a 40°C sob agitação constante para obtenção do filtrado extracelular.

0204060

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

N° Tubos

280nm

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Pico II

Pico I

0-0,5M NaCl

Glucosidase (A

410 nm

)

Figura 6: Perfil cromatográfico da atividade β-glucosidase extracelular precipitada com

(SO

)

e aplicada em coluna de troca iônica DEAE-celulose. A coluna

( 14 x 1,8 cm ) foi equilibrada com tampão fosfato monobásico de sódio

100mM pH 6.8 e eluída com gradiente de NaCl. Frações de 5ml foram

coletados por tubo com um fluxo de 60mL/hora. As setas indicam os tubos

selecionados para a purificação. A

280nm

(o) A

410 nm

(•).

Figura 7: Organograma do processo de Purificação das β-glucosidases extracelulares

de Scytalidium thermophilum.

Filtrado Extracelular (Bruto)

Bruta (liofilizada

)

Precipita

ão com (NH

)

DEAE-celulose

Pico I

β-glucosidase

Pico II

β-glucosidase

CM-celulose

Sephadex G-100

lucosidase II

Pico II

β-glucosidase I

Pico II

Não caracterizado

neste trabalho

0 20406080

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

N° Tubos

280nm

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Pico II

Pico I

0-1M NaCl

Glucosidase (A

410nm

)

Figura 8: Perfil cromatográfico da atividade β-glucosidase I (pico I DEAE-celulose)

extracelular em coluna de troca iônica CM-celulose. A coluna ( 13 x 1,5

cm ) foi equilibrada com tampão acetato de sódio 20mM pH 5.0 e eluída

com o mesmo tampão e gradiente de NaCl. Frações de 5ml foram

coletados por tubo com um fluxo de 50mL/hora. A

280nm (

o) A

410nm

(•). As

setas indicam as frações reunidas.

0 30 60 90 120 150 180

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

N° Tubos

280nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Glucosidase (A

410nm

)

Figura 9: Perfil cromatográfico da atividade β-glucosidase II (pico II DEAE-celulose)

extracelular de Scytalidium thermophilum em coluna Sephadex G-100. A

coluna ( 87 x 2cm ) foi equilibrada com tampão fosfato monobásico de

sódio 100mM pH 6.0 com 100 mM de NaCl. Frações de 1,5ml foram

coletados por tubo com um fluxo de 20mL/h. A

280nm

(o) A

410nm

(•). As setas

indicam as frações reunidas.

A B C

Figura 10: Perfil eltroforético em gel de poliacrilamida das β-glucosidases

extracelulares produzidas pelo Scytalidium thermophilum.

(A) PAGE 4.3 –15 μg da glucosidase I; (B) PAGE 8.9- 14μg da glucosidase

II, e (C) Atividade da glucosidase II utilizando o substrato sintético 6-

bromo-naftil-glucopiranosídeo. Os géis A e B foram corados para

proteínas com Comassie Brilhant Blue R-250.

66kDa

45kDa

36kDa

24kDa

igura 11: Perfil eletroforético em SDS-PAGE 15% da β-glucosidases extracelulares

1 2 3

produzidas pelo Scytalidium thermophilum.

Raia 1: Padrão ; Raia 2: Glucosidase I e Raia 3: Glucosidase II

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

4,0

4,2

4,4

4,6

4,8

5,0

5,2

5,4

β-glucosidase I (57 kDa)

β-glucosidase II (147 kDa)

Álcool Desidrogenase (150 kDa)

BSA (66 kDa)

Citocromo C (12,5 kDa)

Anidrase Carbônica (29 kDa)

Log Massa Molecular

Ve/Vo

igura 12: Determinação da massa molecular da β-glucosidase I e II por cromatografia

de filtração Sephadex G-100. A coluna ( 87 x 2 cm ) foi eluída com

tampão fosfato monobásico de sódio 100mM pH 6.8 com 100mM de NaCl

com um fluxo de 20mL/h coletando-se 1,5ml por tubo.

4.3.2. Purificação da

-Glucosidase Micelial

Pode-se observar na Tabela 8 a seqüência da operação empregada na purificação

da enzima. Obteve-se um rendimento de 25,3% e uma purificação de 23 vezes e uma

atividade específica de 9000ηmoles/mg prot., após a última coluna cromatográfica. É

importante ressaltar a eficiência do fracionamento protéico no processo de purificação

enzimática, visto que há uma considerável diminuição do número de proteínas totais do

extrato micelial.

A Figura 13 representa o perfil cromatográfico da β-glucosidase micelial em

Sephadex G-100, após fracionamento protéico e diálise. Nesta figura pode-se observar

que a enzima foi eluída num pico único de atividade e distante do picos maiores de

proteína. As frações contendo maiores atividades enzimáticas foram então reunidas,

dialisadas e aplicadas em coluna de troca iônica DEAE-celulose (Figura 14). Após a

eluição da amostra, com aproximadamente 230mM de NaCl pode-se confirmar a

hipótese da existência de duas β-glucosidases. A primeira atividade glucosidásica que

não interage com a resina, representa aproximadamente 15% da atividade total, e não

foi caracterizada devido seu baixo rendimento.

As frações eluídas com NaCl, indicadas pelas setas na Figura 14 foram então

reunidas, dialisadas contra água e utilizada para análise de pureza em gel de

poliacrilamida (PAGE). Posteriormente foram estocadas em pequenas alíquotas a –12°C

sendo utilizadas para caracterização físico-química.

Tabela 8: Purificação da β-glucosidase micelial de Scytalidium thermophilum.

Passos de

Purificação

Proteínas

Totais (mg)

Unidades

Totais (U)

Atividade

Específica

(U/mg prot.)

Purificação

(vezes)

Rendimento

(%)

Bruta 398,4 156500 392,8 1,0 100,0

Choque Térmico

(20’ a 50°C)

271,6 145700 536,5 1,4 93,0

(NH

)

75% 72,6 50600 697 1,8 32,3

Sepahdex G-100 10,6 51500 4858 12,4 33,0

DEAE-celulose 4,4 39600 9000 23,1 25,3

Condições: O fungo foi crescido em Meio M

com 1% de Avicel por um período de 48

horas a 40°C sob agitação constante para obtenção da massa micelial.

0 20406080100120

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

N° Tubos

280nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Glucosidase (A

410nm

)

Figura 13: Perfil cromatográfico da atividade β-glucosidásica micelial precipitada com

(SO

)

e aplicada em coluna de filtração Sephadex G-100. A coluna (

87 X 2cm ) foi equilibrada com tampão fosfato monobásico de sódio

100mM pH 6.0 com 100mM de NaCl, com fluxo de 20mL/hora. Frações de

1.5 mL foram coletadas por tubo. A

280nm

( ο ) A

410nm

( • ). As setas indicam

as frações reunidas.

0 20406080100

0,00

0,05

0,10

0,15

N° Tubos

280nm

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0-0,5M NaCl

Glucosidase (A

410nm

)

Figura 14: Perfil cromatográfico da atividade β-glucosidásica micelial em coluna de

troca iônica DEAE-celulose. A coluna ( 13 x 2 cm ) foi equilibrada com

tampão fosfato de sódio pH 6.8 100mM e eluída com o mesmo tampão e

gradiente de NaCl. Frações de 5 mL foram coletados por tubo. A

280nm

( ο )

410nm

( • ). As setas indicam as frações reunidas.

4.3.2.1. Análise eletroforética da

-Glucosidase Micelial purificada

O primeiro critério de pureza empregado foi a análise eletroforética da β-

glucosidase em gel de poliacrilamida em condições não-desnaturantes (PAGE 8.9).

Conforme observado na Figura 15A, a enzima purificada apresenta uma única banda

protéica após o gel ter sido corado para proteínas utilizando-se o corante Comassie

Blue R-250. A atividade enzimática no gel foi evidenciada após o gel ter sido picotado

em fatias de 25mm, incubado com o substrato PNP-glu por 1 noite a 50°C e,

posteriormente a reação bloqueada com tetraborato de sódio saturado, e a leitura feita

em A

410nm

. A banda protéica obtida coincide com a banda de atividade (resultados não

mostrados).

A análise de pureza também foi evidenciada em condições desnaturantes (SDS-

PAGE) em gel de poliacrilamida (Figura 15B). A enzima exibiu uma única banda em

SDS-PAGE quando corada por Comassie Blue R-250 e apresentou um peso molecular

estimado de 39kDa. Os dados obtidos em eletroforeses desnaturantes e não-

desnaturantes indicam a homogeneidade da enzima, que a partir daí pode ser

caracterizada nas suas propriedades físico-química.

4.3.2.2. Estimativa da Massa Molecular

Para estimativa da massa molecular da β-glucosidase foi empregado uma coluna

de filtração Sephadex G-100 e análise em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (como já

demonstrado no item anterior). Através da Figura 16 e 15B estimou-se a massa

molecular nativa da enzima em 33,8 kDa em coluna de filtração e 39 kDa em SDS-

PAGE, respectivamente.

66kDa

45kDa

29kDa

A B

Figura 15: Perfil eletroforética em gel de poliacrilamida da β-glucosidase micelial

produzida por Scytalidium thermophilum. (A) PAGE 8.9 8%- 13μg;; (B)

SDS-PAGE 15%: Raia 1: Padrão de Peso Molecular; Raia 2: 8 μg β-

glucosidase micelial.

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

4,0

4,2

4,4

4,6

4,8

5,0

5,2

5,4

Glucosidase Intracelular (33,8 kDa)

Citocromo C (12,5kDa)

Anidrase Carbônica (29kda)

BSA (66kDa)

Álcool Desidrogenase (150kda)

Log da Massa Molecular

Ve/Vo

Figura 16: Determinação da massa molecular da β-glucosidase micelial por

cromatografia de filtração Sephadex G-100. A coluna ( 87 x 2 cm ) foi

eluída com tampão fosfato de sódio monobásico 100mM pH 6.0 com NaCl

100mM com um fluxo de 20mL/h coletando-se 1,5 mL por tubo.

4.4. CARACTERIZAÇÃO DAS β-GLUCOSIDASES PURIFICADAS

4.4.1. Influência da temperatura e pH na atividade das

-glucosidases

purificadas de Scytalidium thermophilum

Temperatura

Para a determinação da temperatura ótima, as β-glucosidases foram incubadas

com o substrato PNP-glu em diferentes temperaturas, variando-se de 35 a 80°C

(extracelular) e 40 a 70°C (micelial). Como demonstrado na Figura 17, foi obtido uma

temperatura de 70 e 60°C para as enzimas extra I e micelial, respectivamente, para

hidrólise do PNP-glu. Em temperaturas abaixo da ótima aparente (60°C e 50°C)

observa-se que as enzimas apresentam cerca de 75-80% das suas atividades

enzimáticas. Em temperaturas superiores a temperaturas ótimas das enzimas,

observamos um rápido decréscimo das atividades β-glucosidásicas.

Como descrito em material e métodos a atividade das β-glucosidases purificadas

foi medida utilizando-se tampão McIlvaine pH 3.0 a 8.0. A atividade ótima da β-

glucosidase extracelular I foi obtida em pH 5.5 embora a enzima tenha se mostrado

relativamente estável entre os pHs 5.5-6.5 (Figura 18A) com aproximadamente 90%

da atividade enzimática. Já a atividade micelial mostrou maior eficiência na faixa de pH

de 6.0-6.5, como demonstrado na Figura 18B.

4.4.2. Estabilidade térmica das

-glucosidases purificadas

Enzimas que toleram altas temperaturas são de grande interesse, já que

possuem vantagens em processos industriais, evitando possíveis contaminações

bacterianas, além de serem facilmente armazenadas e manuseadas.

Para se determinar a estabilidade térmica das enzimas purificadas frente a

diferentes temperaturas, as amostras foram incubadas em água destilada por até 1

hora a diferentes temperaturas na ausência dos substratos. Em intervalos pré-

determinados alíquotas foram retiradas e ensaiadas em condições ótimas de

temperatura e pH.

Pode-se notar na β-glucosidase extracelular I (Figura 19A) que após 15 minutos

a 70°C, a enzima perdeu cerca de 32% da atividade e após 60 minutos apenas 6% da

atividade enzimática estava presente.

Como demonstrado na Figura 19B, observa-se a 50°C que nos 10 primeiros

minutos a β-glucosidase micelial perde cerca de 28-30% da atividade enzimática e

depois, sua atividade é mantida até 60 minutos, pelo menos. Contudo, a enzima

quando incubada na presença de tampão aumenta a sua estabilidade em

aproximadamente 40%.

30 40 50 60 70 80

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Abs 410nm

Temperatura (°C)

40 45 50 55 60 65 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Abs410nm

Temperatura (°C)

Figura 17: Efeito da temperatura nas atividades das β-glucosidase purificadas de

Scytalidium thermophilum. (A) β-glucosidase extracelular I (B) β-

glucosidase micelial. As enzimas foram convenientemente diluídas e

incubadas em diferentes temperaturas (35 a 80°C para A e 35 a 70°C para

B). As atividades foram determinadas em ensaios com até 10 minutos de

incubação.

345678

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs 410nm

345678

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Abs 410nm

Figura 18: Efeito do pH nas atividades das β-glucosidase purificadas de Scytalidium

thermophilum. (A) β-glucosidase extracelular I (B) β-glucosidase micelial.

As enzimas foram convenientemente diluídas em tampão McIlvaine (1921)

em pH de 3.0 a 8.0 a 50°C, e as atividades determinadas em ensaios com

10 minutos de incubação.

0 102030405060

100

40°C

50°C

55°C

60°C

65°C

70°C

Log Atividade Residual (%)

Tempo (min)

0 102030405060

100

40°C

45°C

50°C

55°C

55°C + Tampão

Log Atividade Residual (%)

Tempo (min)

Figura 19: Estabilidade térmica das β-glucosidases purificadas de Scytalidium

thermophilum. (A) β-glucosidase extracelular I (B) β-glucosidase micelial.

As enzimas foram dissolvidas em água em diferentes temperaturas por até

60 minutos, retirando-se alíquotas a cada 15 minutos. Após esse período a

atividade enzimática foi dosada nas condições ótimas de temperatura e pH.

4.4.3. Efeito de íons e EDTA sobre a atividade das

-glucosidases

purificadas

O efeito de diversos íons metálicos foram testados, determinando-se a atividade

β-glucosidásica numa concentração final de 1 e 5mM em associação com o substrato

PNP-glu, em condições ótimas de pH e temperatura. A Tabela 9 demonstra as

atividades relativas observadas. Dos íons testados a 1mM, a maioria não teve efeito

significativo sobre as atividades enzimáticas. No entanto, ambas enzimas (β-

glucosidases extra I e micelial) foram sensíveis aos íons AgNO

e HgCl

onde pode-se

observar uma drástica inibição das atividades enzimáticas, fato observado em muitas

enzimas estudadas (Peralta et al, 1997), que são inibidas pela presença de metais

pesados, quando adicionados ao meio de reação. Íons como CuSO

AlCl

CuCl

FeSO

CoCl

também reduziram a atividade enzimática micelial em 68, 48, 58, 76 e 60%

respectivamente, quando utilizados a 5mM.

Uma pequena ativação (aproximadamente 16%) foi observada para β-

glucosidase extracelular para os íons BaCl

, KCl, MnCl

e EDTA. Os valores obtidos de

íons quando utilizados a 5mM mostram que a ativação ou inibição das enzimas

purificadas apresentam propriedades distintas.

4.4.4. Especificidade ao substrato das

-glucosidases purificadas

O estudo da especificidade das β-glucosidases purificadas foi realizado testando-

se vários substratos, dentre esses substratos naturais como avicel e xilana e sintéticos

como PNP-glu (Tabela 10). Dentre os substratos testados, as enzimas foram capazes de

hidrolisar uma quantidade razoável de substratos, contudo vale ressaltar que a maioria

dos substratos testados hidrolisados pelas enzimas apresentam ligações glicosídicas do

tipo β-1,4. A β-glucosidase extracelular I foi capaz de hidrolisar substratos como PNP-

glu, PNP-xil, celobiose, xilana e CMC.

A enzima micelial hidrolisou eficientemente substratos sintéticos como PNP-glu e

PNP-fuc, e a celobiose como substrato natural. Contudo, ainda pode-se observar uma

atividade menor em relação aos substratos PNP-xil, PNP-gal, PNP-ara, ONPG, e lactose.

Tabela 9: Efeito de íons metais nas β-glucosidases purificadas de Scytalidium

thermophilum.

β-Glucosidase

extracelular I (%)

β-Glucosidase

micelial (%)

Íons 1mM 5mM 1mM 5mM

Controle 100 100 100 100

AgNO

2 0 0 0

AlCl

103 91 109 52

BaCl

101 116 118 69

CaCl

109 109 117 83

CoCl

107 93 113 40

CuCl

109 113 81 42

EDTA 113 118 103 90

FeSO

101 119 122 24

HgCl

3 0 0 0

KCl 108 111 105 85

MgCl

106 100 121 97

MnCl

95 117 119 45

Cl 115 116 113 71

ZnCl

110 104 131 53

CuSO

105 88 91 52

Condições: Os íons foram adicionados ao meio de reação na concentração final de 1 e

5mM. Os resultados são expressos em relação ao controle.

Os valores representam a média de 4 experimentos.

Tabela 10: Especificidade ao substrato das β-glucosidases purificadas de Scytalidium

thermophilum.

Substrato ( concentração) β-Glucosidase

extracelular I

(U/mg prot.)

β-Glucosidase

micelial

(U/mg prot.)

PNP-β-glucopiranosideo (2mg/ml) 862 890

PNP-β-xilopiranosideo (2mg/ml) 112 140

PNP-β-manopiranosideo (2mg/ml) ND ND

PNP-β-fucopiranosideo (2mg/ml) ND 700

PNP-α-glucosideo (2mg/ml) ND ND

ONPG (2mg/ml) ND 200

PNP-α-arabinofuranosideo (2mg/ml) ND 700

Xilana (10mg/ml) 17 ND

CMC (10mg/ml) 5 ND

Avicel (10mg/ml) ND ND

Lactose (10mg/ml) ND 900

Celobiose (10mg/ml) 412 380

Sacarose ND ND

Trealose (10mg/ml) ND ND

Maltose (10mg/ml) ND ND

Sacarose (10mg/ml) ND ND

Xilobiose (10mg/ml) ND ND

Condições: As β-glucosidases purificadas foram incubada por até 2 horas minutos nas

condições ótimas de pH e temperatura, com os diferentes substratos.

ND: não detectável pelo método utilizado.

Os valores representam a média de 4 experimentos.

4.4.5. Efeito de álcoois na atividade das

-glucosidases purificadas

A Tabela 11 demonstra os resultados de experimento no qual diferentes álcoois

foram adicionados ao meio de reação para a determinação da atividade β-glucosidásica.

Observa-se que as enzimas apresentaram a maior ativação na presença de glicerol

como aceptor (203% e 180%) para as atividades β-glucosidásicas extra I e micelial,

respectivamente.

A enzima extracelular apresentou ativação pela maioria dos álcoois testados,

com exceção do álcool isopropílico e manitol. Já para atividade micelial, a presença de

manitol ativa a enzima em 33%, enquanto metanol inibe a atividade enzimática.

4.4.6. Efeito de açúcares na atividade das

-glucosidases purificadas

A Tabela 12 mostra os resultados obtidos quando diferentes açúcares a 50mM

foram adicionados ao meio de reação contendo PNP-glu como substrato. A atividade da

β-glucosidase extracelular I foi ativada significantemente por xilose, frutose e lactose,

sendo que xilose e lactose ativaram a enzima em 40 e 80%, respectivamente. Uma

pequena ativação também foi observada na presença de celobiose. A enzima mostrou-

se resistente à glicose 50mm. Maltose e sorbose inibiram ligeiramente a atividade da β-

glucosidase extracelular I.

Para a β-glucosidase micelial, glicose e xilose foram aqueles que causaram maior

ativação enzimática, aumentando cerca de 2.0 e 1.9 vezes a atividade. Celobiose inibiu

a atividade enzimática em aproximadamente 80%. Os demais açúcares, não afetaram

significantemente a atividade enzimática sobre o PNP-glu.

Tabela 11 : Efeito “in vitro” de álcoois nas atividades das β-glucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum.

Adição (1M) β-Glucosidase

extracelular I (%)

β-Glucosidase

micelial (%)

Controle 100 100

Metanol 131 81

Etanol 123 105

Glicerol 203 180

n-Butanol 129 100

Iso-propílico 100 105

Manitol 100 133

Condições: Os álcoois foram adicionados ao meio de reação na concentração final de

1M. Os resultados são expressos em relação ao controle.

Tabela 12: Efeito “in vitro” de açúcares nas atividades das β-glucosidases purificadas

de Scytalidium thermophilum.

Adição (50mM) β-Glucosidase

extracelular I (%)

β-Glucosidase

micelial (%)

Controle 100 100

Glicose 81 204

Xilose 140 191

Manose 115 100

Frutose 133 111

Ribose 107 100

Galactose 115 123

Sorbose 84 95

Arabinose 118 97

Lactose 181 92

Celobiose 120 24

Maltose 70 113

Sacarose 125 105

Condições: Os açúcares foram adicionados ao meio de reação na concentração final de

50mM. Os resultados são expressos em relação ao controle.

4.4.7. Efeito da glicose, xilose e celobiose na atividade das

-glucosidases

purificadas

A Figura 20 demonstra os efeito do aumento da concentração de glicose e xilose

e mistura equimolar na atividade das β-glucosidases extracelular I e micelial.

A atividade da β-glucosidase extracelular I sobre o PNP-glu (Figura 20A) foi

inibida drasticamente pela presença de glicose 150mM. Em contrapartida, a reação foi

ativada em 2.0 e 1.6 vezes na presença de xilose e celobiose a 50 e 150mM,

respectivamente (Figura 20A e Figura 21A). O efeito da xilose na atividade celobiásica,

foi analisado utilizando o método da glicose oxidase, pela quantificação da glicose

liberada (GOD). Na Figura 22A, observa-se um aumento de 1.4 vezes para uma

concentração de 100-200mM de xilose.

Na Figura 20B, observa-se que glicose e xilose exibem efeito máximo na

atividade enzimática da β-glucosidase micelial em uma concentração de 150mM,

aumentando a razão de hidrólise do PNP-glu de 2.6 a 2.4 vezes, respectivamente para

xilose e glicose. Na presença de 500 e 700mM, respectivamente para xilose e glicose, a

atividade da β-glucosidase micelial contra o PNP-glu foi idêntica a reação enzimática na

ausência dos ativadores (dados não mostrados). A mistura equimolar de glicose e

xilose não exibiu efeito aditivo.

Com base nos resultados obtidos, pode-se calcular os valores de constante de

afinidade aparente K

0,5

para glicose e xilose. Foram encontrados valores de 36,69 e

43,24 mM para glicose e xilose, respectivamente.

O efeito da xilose na atividade celobiásica está demonstrada na Figura 22B.

Observa-se um aumento de 2.1 vezes para uma concentração de 100-200mM de xilose

e a atividade não foi inibida até uma concentração de 500mM (dados não mostrados).

O efeito positivo da glicose na atividade celobiásica (2.3 vezes) também foi analisado

em HPLC (dados não mostrados). A hidrólise do PNP-glu pela β-glucosidase micelial foi

inibida drasticamente por celobiose (Figura 21B), sugerindo competição entre os

substratos sintéticos e natural.

0 50 100 150 200

100

150

200

250

Atividade Relativa (%)

(mM)

25 50 75 100 125 150

100

150

200

Atividade Relativa (%)

(mM)

Figura 20: Efeito da glicose e xilose nas atividades das β-glucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum. (A) β-glucosidase extracelular (B) β-glucosidase

micelial. Símbolos: (•) glicose; ({) xilose; () mistura equimolar

0 30 60 90 120 150

100

Atividade Relativa (%)

[celobiose mM]

0 30 60 90 120 150

100

120

140

160

Atividade Relativa (%)

[ celobiose mM ]

igura 21: Efeito da celobiose nas atividades das β-glucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum. (A) β-glucosidase extracelular (B) β-glucosidase

micelial. A atividade enzimática foi dosada em Tampão McIlvaine com PNP-

glu (2mg/mL) adicionando-se diferentes concentrações de celobiose.

0 50 100 150 200

100

120

140

160

180

200

220

Atividade Relativa (%)

Xilose (mM)

0 50 100 150 200

100

120

140

160

180

200

Atividade Relativa (%)

Xilose (mM)

igura 22: Efeito da xilose na atividade celobiásica das β-glucosidases purificadas de

Scytalidium thermophilum. A atividade enzimática foi dosada em Tampão

McIlvaine (1921) e celobiose (10mg/mL), com diferentes concentrações de

xilose, utilizando-se o método da glicose oxidase. (A) β-glucosidase

extracelular (B) β-glucosidase micelial.

4.4.8. Determinação do teor de açúcar das

-glucosidases purificadas

O experimento foi realizado segundo a metodologia descrita por Dubbois et al

(1956), utilizando-se glicose como padrão.

Foi encontrado um valor estimado em 65% e 15% de açúcar presente nas β-

glucosidases extra e micelial purificadas, respectivamente.

Para confirmação dos dados de presença de açúcar nas proteínas, um

experimento em gel de poliacrilamida (PAGE) foi realizado utilizando-se tratamento com

isopropanol e coloração com bromotimol, como descritos em material e Método. Tais

resultados (dados não mostrados) evidenciaram que ambas enzimas (β-glucosidases

extra I e micelial) são glicoproteínas, e que a coloração da banda no gel é proporcional

a quantidade de açúcar presente na amostra.

4.4.9. Focalização Isoelétrica das

-glucosidases purificadas

O ponto isoelétrico das β-glucosidases foi determinado por focalização isoelétrica

em gel de poliacrilamida 6%, utilizando-se Pharmalyte de 3.0-10.0, seguindo-se a

metodologia de O’Farrel (1983). Os resultados obtidos revelaram um PI de 4.0 e 6.5,

para as β-glucosidases extra I e micelial, respectivamente (Figura 23A

e 23B).

PI=4.0

PI=6.5

A B

Figura 23: Focalização Isoelétrica das β-glucosidases purificadas de Scytalidium

thermophilum. (A) β-glucosidase extracelular I; (B) β-glucosidase micelial

4.4.9. Parâmetros Cinéticos

Após a purificação das β-glucosidases produzidas pelo Scytalidium thermophilum,

determinação de temperatura e pH ótimos, passamos a trabalhar com as constantes

cinéticas K

e V

máx

, para um maior esclarecimento das propriedades intrínsicas destas

proteínas. Os substratos utilizados foram aqueles em que as enzimas apresentaram

maior atividade (Tabela 10), PNP-glu, PNP-fuc e celobiose.

Nas Figuras 24A e 24B estão ilustradas as representações de Lineweaver Burk e

Hanes para a β-glucosidase extracelular I. A enzima apresentou valores de K

e V

máx

de 4,33 mM e 5,37 μmoles.min/mg prot e 0,342mM e 2,0 μmoles.min/mg prot

respectivamente, para celobiose e PNP-glu. A eficiência catalítica (V

máx

) da enzima

foi de 5,84 e 1,24 para PNP-glu e celobiose, respectivamente (Tabela 13).

Os valores de K

e V

máx

da β-glucosidase micelial para os substratos celobiose,

PNP-glu e PNP-fuc foram de 1,61 e 4,12 μmoles.min/mg prot., 0,29 e 13,27

μmoles.min/mgprot. e 0,5 e 7,25 μmoles.min/mg prot., respectivamente, utilizando-se

do Programa Computacional Sigraf (Leone et al, 1992) (Tabela 14). A presença de

xilose e glicose no meio de reação contendo PNP-glu como substrato, aumentou ambos

valores de K

e V

máx

(Tabela 14), encontrando-se valores de K

de 1,26 e 1,33mM e

máx

de 40,04 e 30,49 μmoles.min/mg prot. para hidrólise do PNP-glu na presença de

glicose e xilose, respectivamente. A eficiência catalítica (V

máx

) da enzima foi de

45,76, 14,5 e 2,56 e 1,24 para PNP-glu, PNP-fuc e celobiose, respectivamente. O

sumário dos valores de K

e V

máx

podem ser observados na Tabela 14.

4.4.10. Constantes de Inibição das Enzimas (Plot de Dixon)

As Tabelas 13 e 14 mostram as constantes de inibição-Plot de Dixon quando as

enzimas purificadas foram testadas com PNP-glu e glicose ou celobiose,

respectivamente.

Foram encontrados valores de K

71mM e 1.32mM, para glicose (β-glucosidase

extracelular I) e celobiose (β-glucosidase micelial), respectivamente.

4.4.11. estudo da

-glucosidase micelial purificada frente aos substratos

PNP-glu e PNP-fuc

O estudo da β-glucosidase micelial foi examinada pelo método cinético de

mistura de substratos (Thorn, 1949), usando os substratos PNP-glu e PNP-fuc nas

concentrações de 2mg/ml e uma mistura dos dois substratos. O resultado obtido na

Figura 25 mostra que a velocidade de hidrólise da mistura não foi aditiva, quando

comparada com as velocidades das reações determinadas usando um único substrato.

-4 0 4 8 12 16

100

S (mM)

S/V

-2 0 2 4 6

1/V

1/s (mM)

Figura 24: Determinação dos parâmetros cinéticos (Km) da β-glucosidase extracelular

I purificada. Os ensaios foram realizados com os diferentes substratos (A:

celobiose e B: PNP-glu) em tampão M. Ilvaine pH 5.5 a 70°C.

Tabela 13: Determinação dos parâmetros cinéticos (K

e V

máx

) da β-glucosidase

extracelular I purificada.

Substrato Parâmetros Cinéticos

Adição K

(mM) V

máx

Vmáx/Km

Ki (mM)

Celobiose - 4,33 5,37 1,24

PNP-glu - 0,342 2,0 5,84

PNP-glu Glicose 71

Condições: Os ensaios foram realizados com os diferentes substratos (celobiose; PNP-

glu) em Tampão McIlvaine (1921) pH 5.5 a 70°C.

máx

está expresso em μmoles de produto (p-nitrofenol ou glucose) por min/mg

proteína.

Tabela 14: Parâmetros cinéticos da β-glucosidase micelial purificada de Scytalidium

thermophilum

Substrato Adição K

(mM) V

máx

(U mg

prot

–1

)

máx

/ K

(mM)

PNP-glu (0.15-

10mM)

- 0.29 13.27 45.76

PNP-fuc (0,15-

10mM)

0,5 7,25 14,5

Celobiose (0.5-

10mM)

- 1.61 4.12 2.56

PNP-glu (0.15-

10mM)

Glicose (80mM) 1.26 40.04 31.78

PNP-glu (0.15-

10mM)

Xilose (100mM) 1.33 30.49 22.92

PNP-glu (0.15-

10mM)

Celobiose (0.5-

15mM)

- - - 1.32

Condições: Os ensaios foram realizados com os diferentes substratos (celobiose; PNP-

glu) em Tampão McIlvaine (1921) pH 5.5 a 60°C.

máx

está expresso em μmoles de produto (p-nitrofenol ou glucose) por min/mg

proteína.

igura 25: Cinética da atividade β-glucosidásica micelial para os substratos PNP-glu

0246810

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Esperado

PNP-glu

Mistura

PNP-fuc

410nm

Tempo (min)

() e PNP-fuc (Ο) e mistura dos substratos ( ). O símbolo (+) representa

a soma dos valores de hidrólise do PNP-glu e PNP-fuc.

4.5. Estudo das

-glucosidases como transglucosidases

.5.1. Análise dos Produtos de hidrólise das

-glucosidases purificadas

β-glucosidases são conhecidas por catalisar além de reações de hidrólise,

badas por diferentes tempos e com

do substrato em altas concentrações (celobiose 250mM), as

reações de transferência, onde o resíduo de açúcar da molécula do substrato pode ser

transferido para outro aceptor hidroxílico, açúcar ou álcool. A análise dos produtos de

hidrólise das β-glucosidases purificadas de Scytalidium foram analisados em

cromatografia de camada delgada de sílica (TLC) .

Amostras das enzimas purificadas foram incu

diferentes concentrações de celobiose, na presença e ausência de glicose. As Figuras 26

e 27 demonstram os resultados obtidos. Observa-se que ambas enzimas β-glucosidases

extracelular I e micelial realizam hidrólise do substrato em concentração de 10mM,

liberando glicose como produto da reação. Contudo, β-glucosidase micelial na presença

de glicose adicionado ao meio de reação aparecem vestígios de outros produtos,

possivelmente celotriose e celotetraose, ou seja é confirmada a hipótese de que a

enzima na presença de um açúcar como aceptor realize reações de transglicosilação,

gerando outros glicosídeos. Como demonstrado na Tabela 12 a β-glucosidase

extracelular foi ativada por xilose utilizando como substrato PNP-glu. A reação quando

analisada em TLC (Figura 28) observa-se a presença de produtos gerados por reação

de transglicosilação.

Na presença

enzimas β-glucosidases extracelular I e micelial realizam facilmente reações de

transglicosilação, como pode ser observado nas Figuras 26B e 27C. Observa-se nestas

Figuras a presença de celotriose e celotetraose, como produto das reações.

Figura 26: Análise dos produtos de hidrólise e transglicosilação da β-glucosidase

ima incubada com 10mM de celobiose

extracelular purificada em TLC. O solvente utilizado foi n-butanol:piridina

água (6:4:3), e a revelação com metanol e ácido sulfúrico (9:1) e orcinol

0,2%

A- enz

B- enzima incubada com 250mM de celobiose

Figura 27: Análise dos produtos de hidrólise e transglicosilação da β-glucosidase

100mM de glicose

micelial purificada em TLC. O solvente utilizado foi n-butanol:piridina água

(6:4:3), e a revelação com metanol e ácido sulfúrico (9:1) e orcinol 0,2%

A- enzima incubada com 10mM de celobiose

B- enzima incubada com 10mM de celobiose +

C- enzima incubada com 250mM de celobiose

igura 28: Análise dos produtos de hidrólise e transglicosilação da β-glucosidase

g/mL + xilose

micelial purificada em TLC na presença de PNP-glu e xilose. O solvente

utilizado foi n-butanol:piridina água (6:4:3), e a revelação com metanol e

ácido sulfúrico (9:1) e orcinol 0,2%

A- enzima incubada com PNP-glu 2m

4.6. P DUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-β-GLUCOSIDASE EXTRACELULAR

produção de anticorpos anti-β-glucosidase foi realizada utilizando-se coelhos

New Z

.7. L

OCALIZAÇÃO “IN SITU” DA ATIVIDADE β-GLUCOSIDÁSICA

oi possível observar a imunolocalização da β-glucosidase no micélio de

Scytal

a imunolocalização da β-glucosidase no micélio de

Scytal

ealand devidamente imunizados como descrito em material e métodos, sendo a

quantificação dos anticorpos produzidos realizada por teste de ELISA em um espectro

com filtro 490nm. A titulação obtida foi igual a 1:1000.

idium thermophilum. O fungo foi crescido em meio M

suplementado com glicose

e avicel como fonte de carbono.

A figura 29, representa

idium thermophilum. O fungo quando crescido em meio suplementado com avicel

septos ao passo que em meio suplementado com glicose (B) a imunomarcação da

enzima ocorre em toda extensão da hifa e está associada a membrana celular e/ou

parede celular.

Localização subcelular por imunofluorescência da β-glucosidase do fungo

Figura 29:

Scytalidium thermophilum cultivado em meio M

por 72 horas

suplementado com glicose (B) e avicel (C). (A) controle sem marcação

com anticorpo primário anti-β-glucosidase (B) marcação por toda

extensão da hifa (C) marcação apenas nos septos.

5. DISCUSSÃO

e um modo geral os fungos tem se mostrado como uma importante fonte para

obtenç

olases são um grupo de enzimas que catalisam a clivagem das ligações

covale

lentes fontes de enzimas degradadoras

de ce

fílico Scytalidium thermophilum

gentilm

ão de enzimas, proteínas, polímeros e outros compostos de interesse

biotecnológico, que podem ser obtidos a um baixo custo. Assim, estudos que levem a

um aumento da produção desse compostos têm sido frequentemente realizados com

base na padronização de parâmetros como: tempo de cultivo, composição do meio,

fonte de carbono, temperatura e pH, já que existe uma certa escassez desse tipo de

informação.

As hidr

ntes em moléculas pela reação com a água. Entre as hidrolases estão as

proteases que degradam polipeptídeos e as celulases e amilases que degradam

polímeros de celulose e amido, respectivamente. A modificação destes polímeros

naturais são necessários às indústrias, por exemplo na produção de etanol pela

fermentação. As celulases juntamente com as β-glucosidases são utilizadas para

hidrolisar celulose até glicose, e participam eficientemente na conversão natural de

resíduos celulósicos ( Béguin & Aubert, 1994).

Os microrganismos termofílicos são exce

lulose, visto que geralmente são encontradas na decomposição biológica e

combustão espontânea de resíduos celulolíticos da natureza. Além disso, possuem

complexos enzimáticos estáveis a altas temperaturas, e pouco se tem a respeito da

fisiologia e regulação metabólica destes organismos.

Neste trabalho foi utilizado o fungo termo

ente cedido pelo Dr. Straastma (Holanda) e isolado a partir de material em

decomposição. Procuramos caracterizar fisiológica e bioquimicamente o sistema β-

glicosidásico deste fungo.

Inicialmente, foi realizado um estudo para determinação das condições de

cultivo a fim de se otimizar a produção das enzimas do complexo β-glucosidásico

produzido pelo fungo. Os maiores níveis enzimáticos foram obtidos quando o fungo foi

crescido em meio M

a 40°C sob agitação orbital de 100 rpm. Posteriormente,

parâmetros como tempo de cultivo (Figura 3) e fonte de carbono (Tabela 1) foram

analisados, já que se sabe que a produção e a excreção das β-glucosidases é

dependente da fonte de carbono empregada, bem como do pH e temperatura.

Assim sendo, os maiores níveis de atividade β-glucosidásica foram obtidos em

culturas em que o meio de cultura foi suplementado com avicel (celulose

microscristalina) e celobiose quando o fungo foi crescido em um único estágio (Tabela

1), ou inicialmente com glicose e reincubação nas diferentes fontes de carbono quando

o fungo foi crescido em dois estágios (repressão-indução-Tabela 3). Assim como muitas

β-glucosidases de diferentes microrganismos ( Peralta et al, 1990; Peralta et al, 1997;

Venturi, 2002), as β-glucosidases do Scytalidum parecem seguir o padrão de

repressão-indução para o controle da síntese das enzimas, já que avicel e celobiose

foram bons indutores das enzimas e suas sínteses foram reprimidas por glicose

(Tabelas 1, 2 e 3).

Nos experimentos em que foi utilizado ciclo-heximida, os dados sugerem que as

enzimas sejam resultantes da síntese “de novo” das proteínas, assim como observado

para Humicola grisea var thermoidea (Peralta et al, 1990). O processo de secreção das

enzimas na presença de avicel e celobiose e como ocorre a sinalização celular, ainda

permanece desconhecido. Bhatia et al (2002) propõe que a indução por celulose pode

não ser efetuada diretamente pela celobiose, mas por produtos formados após uma

reação de transglicosilação, catalisada pela própria β-glucosidase existentes em

quantidades mínimas.

A diferença das fontes de carbono sobre a produção da β-glucosidase

extracelular pode ser observada na localização enzimática subcelular (Tabelas 5 e 6) e

por imunofluorescência (Figura 31). Na presença de avicel, a enzima permanece

associada aos septos, diferentemente de quando empregada glicose, em que a enzima

fica restrita a periferia celular. Os resultados obtidos sugerem fortemente que a

distribuição enzimática é dependente da fonte de carbono empregada no meio de

cultura, e confirmam os resultados obtidos da Tabela 1.

A otimização das condições de cultivo do fungo estudado considerando a

produção das β-glucosidases, bem como a determinação fonte de carbono e tempo de

crescimento da atividade enzimática desse fungo, constituíram conhecimentos prévios

fundamentais às etapas subsequentes de desenvolvimento deste trabalho.

Para que as indústrias possam utilizar as enzimas isoladas de microrganismos

em alguns casos, elas devem antes passar por um processo de purificação. A

purificação das β-glucosidases é um pré-requisito necessário para um completo

entendimento de sua natureza e mecanismo de ação. Os métodos usados para a

purificação são espécie-específicos, assim uma metodologia usado para purificar uma

enzima de um microrganismo não é necessariamente o mais indicado para a β-

glucosidase de um outro organismo.

Inicialmente foi feito uma análise das β-glucosidases do Scytalidium em coluna

de troca iônica DEAE-celulose (Figura 5), quando o meio foi suplementado com avicel

como fonte de carbono. Em ambas culturas extracelular e micelial foram detectadas

duas atividades enzimáticas. Relatos de inúmeras formas de β-glucosidases tem sido

observado em diferentes microrganismos (Bhatia et al, 2002). Contudo, o significado

desta heterogeneidade é difícil de ser esclarecida, podendo ser resultado de

modificação do mRNA, limite de proteólise, ou variação no conteúdo de carboidrato, nos

genes estruturais e na composição do meio de cultivo (Pandey et al, 2000 Bhatia et al,

2002).

Após a análise das atividades em DEAE-celulose (Figura 5), padronizamos uma

metodologia de purificação das β-glucosidases visando caracterizá-las em termos físico-

químicos e cinético.

As frações mais abundantes nos extratos celulares e filtrados de culturas foram

purificados até sua total homogeneidade eletroforética (Tabelas 7 e 8). É importante

ressaltar que as atividades específicas finais das enzimas purificadas, são superiores

quando comparadas com as atividades específicas da maioria de outros microrganismos

descritos na literatura (Mamma et al, 2004), e marcadamente crescentes à partir do

extrato bruto.

Os resultados demonstram que ambas enzimas são glicoproteínas, com 65% e

15% para as glucosidases extra I e micelial, respectivamente. A glicosilação em

enzimas de fungos termofílicos é muito comum e têm sido relatada em diferentes

organismos. Em Chaetomium thermphilum var coprophilum (Venturi, et al 2002) foi

encontrado um valor de 73% de carboidrato para uma β-glucosidase extracelular,

enquanto que em H. grisea var thermoidea (Peralta et al, 1997) esse valor foi de 35%.

Normalmente, os carboidratos estão na forma de glicose, glucosamina, manose e

galactose (James & Lee, 1997). Estas enzimas são ricas em resíduos de serina e

treonina já que são pontos ideais de glicosilação onde os carboidratos são ligados por

ligações O-glicosídicas. A presença de açúcar na molécula confere às enzimas certa

estabilidade a desnaturação pelo calor e resistência a proteólise, além de serem

importantes na manutenção da estrutura tridimensional de várias proteínas (Eichler,

2001). Geralmente, a remoção destes carboidratos reduz a estabilidade e a atividade

da enzima. A glicosilação é uma alteração pós-traducional de grande importância que

ocorre no Complexo de Golgi, estando intimamente ligada a secreção via vesículas

secretoras. A proteína ao chegar no Complexo de Golgi pode ter três destinos:

membrana celular, lisossomos ou meio extracelular. O que determina qual o destino

para cada proteína é a marcação presente na mesma. Usualmente, as enzimas

extracelulares são sempre mais glicosiladas do que as enzimas relacionadas ao micélio

ou intracelulares.

Como pode-se observar nas Figuras (11 e 15B) as β-glucosidases extracelular (I)

e micelial purificadas de Scytalidium thermophilum migraram com apenas uma banda

protéica em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), e embora apresentem massas

moleculares tão próximas (40.7 kda e 39 kDa), com uma ordem de apenas 1.7 kda,

algumas características obtidas nos levam a acreditar de que tratam-se de proteínas

distintas. Essas enzimas são muito abundantes em fungos celulolíticos, visto que

participam da degradação natural da celulose, e já foram bem caracterizadas e

estudadas, mostrando que suas massas moleculares variam de 12 a 350 kDa (Bathia et

al, 2002).

Tal como ocorre para maioria das reações químicas, a velocidade das reações

catalisadas por enzimas aumenta proporcionalmente com a temperatura, dentro de

uma faixa na qual a enzima é estável e mantém sua atividade integral. Ainda que as

reações catalisadas por enzimas pareçam muitas vezes apresentar um ótimo de

temperatura, o pico desse gráfico de atividade contra temperatura surge porque as

enzimas sendo proteínas são desnaturadas pelo calor e se tornam inativas à medida

que a temperatura é elevada além de um certo ponto. O ótimo aparente de

temperatura é assim, resultante de dois processos: o aumento usual na velocidade de

reação com a temperatura e o valor crescente de desnaturação térmica da enzima

acima de uma temperatura crítica (Lenninger, 1993). As enzimas estudadas

(glucosidase extra e micelial) apresentaram uma temperatura ótima de 70°C e 60°C,

respectivamente para hidrólise do PNP-glu (Figura 17). Acima destas temperaturas

observou-se uma rápido declínio das atividades enzimáticas. Os valores de temperatura

ótimas (70 e 60°C) são superiores aquelas obtidas para Aspergillus niger (Dan et al,

2000) e Humicola grisea var thermoidea bgl1 (Takashima et al, 1999) que

apresentaram temperatura ótima de 30 e 55°C, respectivamente. Contudo, são

inferiores do que aqueles obtidos para organismos hipertermófilos, como por exemplo

Thermatoga maritima (Gabelsberger et al,1993) e Thermatoga neapolitana (Zwerlaw et

al, 1997), com temperaturas de 90 e 95°C, respectivamente.

Um outro parâmetro analisado para classificação enzimática é seu pH ótimo, na

qual apresentam atividade ótima aparente. Sabe-se que pequenas variações no pH

podem conferir comportamentos diferentes entre proteínas de uma mesma classe. Os

valores encontrados de pH ótimos para β-glucosidase extra e micelial foram 6.0 e 5.5,

respectivamente (Figura 18). O pH ótimo aparente na região ácida, parece ser uma

característica geral das glucosidases fúngicas, como pode ser observado em Fusarium

oxysporum (Christakopoulos et al, 1994) e C. thermophilum var coprophilum (Venturi

et al, 2002).

Uma característica de grande interesse biotecnológico é a termoestabilidade,

visto que o uso de enzimas em altas temperaturas diminui uma possível contaminação

microbiana e um aumento da capacidade hidrolítica. Sendo estáveis, as enzimas são

facilmente armazenadas, manuseadas e transportadas a temperatura ambiente. A

estabilidade das enzimas foi testada frente ao substrato PNP-glu e as enzimas

extracelular e micelial apresentaram tolerâncias distintas as temperaturas testadas

(Figura 19). A uma temperatura de 65°C a β-glucosidase extracelular I é praticamente

3 vezes mais resistente em relação a β-glucosidase micelial, quando incubada num

período máximo de 60 minutos. Observa-se que o perfil da β-glucosidase micelial a

uma incubação de 55°C foi monofásico, e confirma a ausência de outras isoenzimas. As

enzimas quando incubadas na presença de tampão observa-se o aumento da

estabilidade, isso de ocorrer possivelmente devido a proteção dos sítios ativos das

enzimas pelo tampão. A β-glucosidase micelial do H. grisea var. thermoidea (Peralta et

al, 1990) apresenta uma meia vida de aproximadamente 15min a 55°C, e é inferior a

observada para a β-glucosidase micelial do Scytalidium que apresentou uma meia vida

de 22min na mesma temperatura. Este é mais um importante dado que vem para

consolidar a nossa hipótese de que o H. grisea var. thermoidea e o Scytalidium, embora

apresentem algumas características morfológicas e fisiológicas parecidas são gêneros e

espécies diferentes. E as análises bioquímicas vem para confirmar a nossa hipótese.

Várias teorias têm sido postuladas para explicar as propriedades termoestáveis

das enzimas isoladas de fungos termófilos, quando comparadas às enzimas

correspondentes de fungos mesófilos. Estas incluem fatores protecionais no interior da

célular, alto grau de hidrofobicidade e glicosilação (Koffer, 1957; Prasad & Maheswari,

1978). Dentre esses fatores o mais aceito por pesquisadores é a presença de

carboidratos na estrutura protéica (glicosilação).

Já é sabido que alguns íons como por exemplo cálcio, magnésio e manganês,

entre outros são capazes de aumentar a atividade de algumas enzimas ou são

essenciais para o funcionamento destas atuando como cofatores. No entanto, as β-

glucosidases parecem ser uma exceção, pois não necessitam obrigatoriamente de íons

metálicos para elevar sua atividade. As β-glucosidases de S. thermophilum foram

inibidas drasticamente por Ag

e Hg

, observando-se apenas vestígios de atividade

extracelular quando os íons foram utilizados a 1mM (Tabela 9). A β-glucosidase

extracelular não sofreu efeito da maioria dos íons testados. Em contrapartida a β-

glucosidase micelial é sensível a praticamente a todos os íons quando utilizados a 5mM,

destacando-se o Fe

que reduz a atividade micelial em aproximadamente 75%, e ativa

a β-glucosidase extracelular em 20%.O EDTA, agente quelante, também não mostrou

ter efeito sobre as enzimas.

A inativação enzimática pela adição de metais é bem conhecida e já foi relatada

em β-glucosidases de fungos termofílicos como H. grisea e C.thermophilum (Peralta et

al, 1990; Peralta et al, 1997; Venturi et al, 2002). A inibição é ocasionada pela

formação de complexos e/ou oxidação de resíduos específicos, e inibem de forma

irreversível a atividade enzimática. O efeito diferenciado dos íons nas atividades

enzimáticas do Scytalidium é mais um dado importante na nossa hipótese de que se

tratam de proteínas distintas.

A β-glucosidase extracelular de Scytalidium mostrou-se altamente específica

para a configuração β-anomérica das ligações glicosídicas, uma vez que os substratos

com configuração α-anomérico não foram hidrolisados (Tabela 10) e foi capaz de

hidrolisar xilana e celobiose como substrato natural. A β-glucosidase micelial, a

exemplo de outras β-glucosidases descritas na literatura, mostrou uma ampla

especificidade com respeito a β-glicosídeos (β-galactosídeo, β-glucosídeo, β-fucosídeo,

β-xilosídeo), indicando uma perda da especificidade em relação a C4 e C6 dos

substratos, e ainda hidrolisou o substrato PNP-α-arabinofuranosídeo. Além disso, foi

capaz de hidrolisar eficientemente lactose e celobiose como substratos naturais.

A relação V

máx

, o parâmetro mais eficiente com respeito a eficiência catalítica,

revelaram uma alta especificidade das enzimas extracelular e micelial por β-glucosídeo,

e devido sua ampla especificidade em relação ao substrato hidrolisado, podemos

classificá-las como β-glicosidases.

Como observado na Tabela 11, observa-se que ambas enzimas são ativadas

significantemente na presença de álcool. Essa ativação ocorre através da transferência

de resíduos glicosil para grupos hidroxil de álcoois e fenóis. Neste caso, os álcoois e

fenóis atuariam como moléculas aceptoras da metade β-glicosil formada durante a

catálise da β-glucosidase (Wallenfels & Malhotra, 1961). Caso a quebra do complexo

seja velocidade limitante, um aumento da velocidade da reação pode ser esperado se

um aceptor superior à água for adicionado ao sistema. Em muitas β-glucosidases

quando o álcool é adicionado ao sistema, reações de transglicosilção são geradas,

resultando a síntese de novos oligossacarídeos. Observou-se que ambas enzimas

tiveram suas atividades aumentadas na presença de glicerol com aumento de 2 e 1.8

vezes, para as β-glucosidases extra I e micelial, respectivamente. Em contrapartida a

atividade micelial foi reduzida em 20%na presença de metanol, enquanto que a

extracelular foi ativada em 30%. Manitol ativa a β-glucosidase micelial em 30% e não

tem efeito significativo para extracelular. Inversamente do que ocorre com metanol, o

etanol e o n-butanol ativam a β-glucosidase extracelular e não tem efeito na atividade

micelial. Em Fusarium oxysporum (Christakopoulos et al, 1994) também foi possível

observar o aumento das atividades enzimáticas quando diferentes álcoois foram

adicionados ao sistema.

As enzimas foram ativadas por alguns açúcares (Tabela 12), num fenômeno

semelhante aos obtidos na presença de álcoois. A β-glucosidase extracelular foi inibida

na presença de glicose, e ativada por celobiose, quando PNP-glu era usado como

substrato. A representação de Dixon obtida para a β-glucosidase extracelular I, sugere

que a glicose seja um inibidor competitivo, com um Ki de 71mM (Tabela 13). A β-

glucosidase extracelular foi ativada por baixas concentrações de celobiose, sugerindo a

existência de mais de um sítio catalítico. Em contrapartida, a β-glucosidase micelial

foiativada na presença de glicose e xilose, e drasticamente inibida por celobiose, com

um Ki de 1.32mM (Tabela 14). A inibição por celobiose, neste caso, pode indicar

competição entre o substrato sintético e o natural por um único sítio catalítico.

Com base nos valores de Constante de Inibição (Ki) obtidos para ambas

enzimas, observa-se que a celobiose é um inibidor muito mais potente (Ki= 1.32mM -β-

glucosidase micelial) do que a glicose (Ki = 71mM- β-glucosidase extracelular I). Dos

trabalhos publicados, poucas são as β-glucosidases produzidas por fungos filamentosos,

tolerantes a glicose, só tendo isso descrito em bactérias (Perez-Pons et al, 1995;

Zanoelo et al, 2004). Este é então, o primeiro trabalho, que descreve uma β-

glucosidase micelial de fungo termofilico ativada simultaneamente por xilose e glicose.

Os valores de focalização isoelétrica para as β-glucosidases extra I e micelial são

respectivamente 4.0 e 6.5 (Figura 23) e são compatíveis com a maioria de β-

glucosidases descritas na literatura (Bhatia et al, 2002). Esse é mais um dado

importante que vem para reforçar a nossa hipótese de que o nosso trabalho envolve β-

glucosidases distintas produzidas por um mesmo organismo, e com propriedades

diferentes das β-glucosidases do Humicola grisea var. thermoidea, que anteriormente

acreditava-se ser o Scytalidium thermophilum ( Straastma & Samson, 1993).

No que se refere a determinação dos parâmetros cinéticos, observou-se que

ambas enzimas possuem maior afinidade para o substrato sintético PNP-glu com K

máx

de 0,345mM e 2,0 μmoles/mg prot

-1

e 0,29mM e 5,37 μmoles/mg prot

-1

para as

atividades β-glucosidase extra e micelial, respectivamente. Observa-se também que a

β-glucosidase micelial hidrolisou eficientemente os substrato sintético PNP-fuc com K

máx

de 0,5mM e 7,25 μmoles/mg prot

-1

. Quando a β-glucosidase micelial foi ensaiada

com PNP-glu na presença de glicose ou xilose, observou-se um K

e V

máx

de 1,26mM e

40,04 μmoles/mg prot

-1

e 1,33mM e 30,49 μmoles/mg prot

-1

. Com base nesses

resultados, conclui-se que a enzima perde certa especificidade pelo substrato PNP-glu

embora tenha um aumento na sua velocidade de hidrólise. Esses resultados são dados

com base na eficiência catalítica (V

máx

) (Tabela 14). O valor de K

0,5

obtido para a β-

glucosidase micelial foi de 36,69 e 43,29mM, para glicose e xilose, respectivamente.

Dentre as glucosidases estudadas observa-se uma maior preferência por substratos

sintéticos com K

variando de 0,05 a 2mM (Bathia, 2002). As β-glucosidases de H.

grisea e C. thermophilum, parentes próximos do Scytalidium apresentaram K

e V

max

de 0,12 e 3,24mM, 0,76 e 3,13mM e para os substratos PNP-glu e celobiose,

respectivamente (Peralta et al, 1997; Venturi et al, 2002).

Em estudos realizados utilizando-se misturas dos substratos PNP-Glu e PNP-fuc

(Figura 25) para β-D-glucosidase micelial observou-se que os valores não foram

interacionais. Esse é um dado importante para confirmar a eficiência no processo de

purificação e a total ausência de contaminantes na amostra.

No estudo das enzimas como transglucosidases, observou-se (Figuras 26, 27 e

28) que as enzimas são capazes de sintetizar novos glicosídeos em altas concentrações

de celobiose, e hidrolise em baixas concentrações . Contudo, na presença de xilose ou

glicose (β-glucosidase micelial) a síntese desses glicosídeos é acelerada, mesmo em

baixas concentrações de celobiose. Como demonstrado por Wallenfels & Malhotra,

(1961) a síntese desses glicosídeos é resultante de reações de transglicosilações na

presença de açúcar ou álcool como aceptor. As mesmas reações foram analisadas em

HPLC e detectou-se novos glicosídeos sintetizados (dados não mostrados), contudo não

se conseguiu quantificar os produtos das reações de transglicosilação.

Com base do exposto até aqui, foi possível observar diferenças significativas

entre as β-glucosidases estudadas que vieram confirmar a nossa hipótese de que as β-

glucosidases produzidas pelo Scytalidium são proteínas distintas, e com propriedades

diferentes das produzidas pelo Humicola grisea var thermoidea (Peralta et al, 1990;

Peralta et al, 1997).

Os resultados também demonstram o importante papel do Scytalidium como

produtor efetivo de β-glucosidases com potencial na sacarificação enzimática da

celulose. A inibição das β-glucosidases por glicose é uma questão levantada por muitos

pesquisadores, uma vez que compromete a sacarificação enzimática da celulose pelo

acúmulo de celobiose. Em β-glucosidases de diversas fontes, a glicose atua como um

inibidor competitivo da enzima e poucos são os trabalhos que evidenciam um aumento

significante da atividade β-glucosidásica na presença de glicose ou xilose (Riou et al,

1998). Contudo, observou-se que a β-glucosidase micelial do Scytalidium teve um

aumento pronunciado da sua atividade na presença glicose ou xilose. Esse efeito até o

presente momento não é totalmente compreendido, mas vale ressaltar que a enzima

produzida Scytalidium possui grande interesse biotecnológico, principalmente

relacionado a conversão natural da celulose em monômeros de glicose, e produção de

combustível (etanol) por fermentação.

Além do efeito positivo da glicose na β-glucosidase micelial de Scytalidium, a

ampla especificidade e a complexidade cinética da enzima, tornam-se interessantes

estudos que direcionem para elucidação dos seus mecanismos de ação. É importante

ressaltar também a capacidade de síntese de novos glicosídeos através de reações de

transglicosilação, além da tolerância a altas temperaturas possivelmente relacionada a

presença de carboidratos na molécula.

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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